KR20210096843A - 남천 추출물을 이용한 항염 및 항알레르기 활성을 갖는 피부외용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 남천 추출물을 이용한 피부외용 조성물에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 남천 추출물을 함유하여 항염 및 알레르기성 피부질환을 예방 또는 개선할 수 있으며 주름개선 및 피부재생 효과가 우수한 항염 및 항알레르기 활성을 갖는 피부외용 조성물에 관한 것이다.

Description

남천 추출물을 이용한 항염 및 항알레르기 활성을 갖는 피부외용 조성물{composition for skin external application having Nandina domestica extract}

본 발명은 남천 추출물을 이용한 피부외용 조성물에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 남천 추출물을 함유하여 항염 및 알레르기성 피부질환을 예방 또는 개선할 수 있으며 주름개선 및 피부재생 효과가 우수한 항염 및 항알레르기 활성을 갖는 피부외용 조성물에 관한 것이다.

최근 산업발달 및 생활패턴의 변화로 인한 외인성 피부질환이 크게 증가하고 있다. 특히 최근 생활환경이 변화함에 따라 자동차, 공장으로부터 내뿜어지는 매연이 많아지고 있다. 매연은 가스형태뿐 아니라 미세먼지(PM10), 초미세먼지(PM25) 등 분진형태로도 도시에 존재한다. DPM(Diesel Particulate Matter)은 호흡기뿐 아니라, 피부에도 안 좋은 영향을 미치게 된다.

구체적으로, 미세먼지로 인하여 피부세포에서의 사이토카인의 과발현을 통해 염증이 일어나 홍반, 아토피, 건선, 여드름 등 염증성 질환이 심화되기도 하고, 경피의 수분 손실이 심해져 피부장벽이 손상이 되고, 손상된 피부장벽을 통해 DPM가 더욱 많이 침투가 가능해 지게 된다. 깊숙이 침투된 DPM은 진피층에서의 콜라겐손실을 가져와 피부 탄력 저하를 야기하기도 한다. 특히나 TCDD같은 다이옥신류는 염소성 피부염등의 질병을 야기하기도 한다.

그리고 1형 과민반응이라고도 불리는 알레르기는 일상에서 노출되는 물질에 대해 생체 내에서 면역체계가 과도하게 반응하여 유발된다. 이 알레르기를 유발하는 물질인 항원(알러젠)이 호흡기, 소화기, 피부를 통해 체내로 들어오면 조직 속의 비만세포(mast cell) 표면의 수용체(FcεRI)에 부착되어 있는 IgE 항체와 결합하게 되고, 이에 따라 비만세포의 탈과립현상(degranulation)을 통해 히스타민을 분비하여 즉각적으로 초기 알레르기 반응을 유발한다. 이어서 류코트리엔(leukotriene) 및 다양한 사이토카인(cytokine) 등이 비만세포로부터 분비되어 조직 손상, 염증반응과 같은 알레르기 후기반응을 유발한다.

최근 기존 화학 약품의 부작용을 최소화하기 위하여, 염증성 또는 알레르기서 피부질환에 효과가 있는 천연물을 찾고자 하는 노력이 활발해지고 있는데, 예컨데 대한민국 공개특허 제10-2006-0035140호에는 식물 추출물을 함유하는 피부 외용제 조성물이 개시되어 있고, 대한민국 공개특허 제10-2010-0059305호에는 자실자 추출물 함유 피부외용제 조성물이 개시되어 있다.

한편, 남천(Nandina domestica Thunb)은 미나리아재비목(Ranunculales) 매자나무과(Berberidaceae) 식물로 일명 남촉목(南燭木) 또는 남천촉(南天燭), 천축자(天竺子), 천촉자(天燭子), 남죽자(南竹子), 남천죽(南天竹), 홍파자(紅杷子)이라고 한다. 남천은 중국 남방 지역, 일본, 인도, 한국 남부 지방 등 국가에 분포하여 흔히 볼 수 있는 늘푸른떨기나무이다. 나무 높이는 1.00~3.00m 정도까지 자랄 수 있으며, 잎은 광택이 있고, 가죽 같은 촉감이 있다.

남천의 잎은 남천죽엽이라고 하며, 백일해, 혈뇨, 타박상을 치료효과를 나타낸다. 겨울철에는 푸른색 잎은 빨간색으로 변하고 봄에 되며 다시 푸른색으로 변한다. 남천의 열매는 장과로 둥글고 0.50 ~ 1.00cm 정도로 10월 달에 익으며 홍색으로 바뀐다. 남천 열매는 민간에서 남천실(南天實) 또는 남천(南天), 남천죽자(南天竹子)이라고 하며 약재로서 사용되며, 명목, 지해, 청간의 효능을 가지고 있고, 진해약으로 염폐, 해수, 일본에서 만성 기침, 매독, 자궁출혈, 천식, 백일해 등의 치료에 사용되는 것으로 알려져 있다.

이러한 다양한 효능을 가지고 있는 남천을 소재로 이용한 피부외용제는 아직까지 알려진 바 없다.

대한민국 공개특허 제10-2006-0035140호: 식물 추출물을 함유하는 피부 외용제 조성물 대한민국 공개특허 제10-2010-0059305호: 자실자 추출물 함유 피부외용제 조성물

본 발명은 상기의 문제점을 개선하고자 창출된 것으로서, 우수한 항염 및 항알레르기 활성을 갖는 남천 추출물을 이용하여 염증성 및 알레르기성 피부질환을 예방 또는 개선할 수 있으며 주름개선 및 피부재생 효과가 우수한 피부외용 조성물을 제공하는 데 그 목적이 있다.

상기의 목적을 달성하기 위한 본 발명의 남천 추출물을 이용한 항염 및 항알레르기 활성을 갖는 피부외용 조성물은 남천(Nandina domestica Thunb)으로부터 추출한 남천 추출물을 함유한다.

상기 남천 추출물은 상기 남천에 물, 탄소수 1 내지 4의 저급 알코올, 다가 알코올 또는 이들의 혼합물로부터 선택된 적어도 어느 하나의 추출용매를 가하여 추출한다.

상기 남천 추출물은 상기 남천의 잎으로부터 추출한다.

상기 남천 추출물은 상기 남천의 잎에 에탄올을 가해 20 내지 30℃에서 60 내지 80시간 동안 추출한다.

상기 남천 추출물은 항산화 활성을 갖는다.

상기 남천 추출물은 피부 주름개선 효과를 갖는다.

상기 남천 추출물은 피부세포 재생효과를 갖는다.

상기 남천 추출물은 항염 활성을 갖는다.

상기 남천 추출물은 항알레르기 활성을 갖는다.

긴털비름(Amaranthus hybridus)의 발효물로부터 추출한 긴털비름 발효추출물을 더 함유한다.

상기 긴털비름 발효추출물은 긴털비름 100중량부에 대하여 당 10 내지 30중량부를 혼합하고 발효균주를 첨가한 후 20 내지 40℃에서 20 내지 60일 동안 발효시킨 발효물을 진공추출하여 수득한다.

상술한 바와 같이 본 발명의 피부외용 조성물은 남천의 잎이나 줄기, 열매로부터 추출한 남천 추출물을 함유하여 피부에 자극 없이 안전하게 사용할 수 있으며 염증성 및 알레르기성 피부질환을 예방 또는 개선할 수 있다.

또한, 본 발명의 피부외용 조성물은 항산화 활성 및 주름개선 및 피부재생 효과가 우수하여 염증성 및 알레르기성 피부질환의 예방과 개선을 위한 약학 조성물 또는 기능성 화장료 조성물로 유용하게 활용될 수 있다.

도 1은 남천의 열매(NDF), 줄기(NDB), 잎(NDL)으로부터 추출물을 추출하는 과정을 나타낸 블록도이고,
도 2는 NDF, NDB, NDL 추출물의 총 폴리페놀 함량을 나타낸 그래프이고,
도 3은 NDF, NDB, NDL 추출물의 총 플라보노이드 함량을 나타낸 그래프이고,
도 4는 NDF, NDB, NDL 추출물의 프리라디칼 활성을 나타낸 그래프이고,
도 5는 NDF, NDB, NDL 추출물의 HaCaT 세포에 대한 독성시험결과를 나타낸 그래프이고,
도 6은 NDF, NDB, NDL 추출물의 HDFn 세포에 대한 독성시험결과를 나타낸 그래프이고,
도 7은 NDF, NDB, NDL 추출물의 RAW 264.7 세포에 대한 독성시험결과를 나타낸 그래프이고,
도 8은 NDF, NDB, NDL 추출물의 MC/9 세포에 대한 독성시험결과를 나타낸 그래프이고,
도 9는 HDFn 세포에서 NDF, NDB, NDL 추출물의 MMP-1의 발현을 나타낸 그래프이고,
도 10은 RAW 264.7 세포에서 NDF 추출물에 의한 NO 억제율을 나타낸 그래프이고,
도 11은 RAW 264.7 세포에서 NDB 추출물에 의한 NO 억제율을 나타낸 그래프이고,
도 12는 RAW 264.7 세포에서 NDL 추출물에 의한 NO 억제율을 나타낸 그래프이고,
도 13은 RAW 264.7 세포에서 NDL 추출물에 의한 ERK, JNK and p38 MAP kinase의 인산화 영향을 나타낸 결과이고,
도 14는 RAW 264.7 세포에서 NDL 추출물에 의한 IL-6의 발현을 나타낸 그래프이고,
도 15는 RAW 264.7 세포에서 NDL 추출물에 의한 IL-1β의 발현을 나타낸 그래프이고,
도 16은 MC/9 세포에서 NDL 추출물에 의한 TNF-의 생성을 나타낸 그래프이고,
도 17은 HaCaT 세포에서 NDL 추출물에 의한 TARC의 발현을 나타낸 그래프이고,
도 18은 HaCaT 세포에서 NDL 추출물에 의한 RANTES의 발현을 나타낸 그래프이고,
도 19는 MC/9 세포에서 NDL 추출물에 의한 histamine의 생성을 나타낸 그래프이고,
도 20은 HDFn 세포에서 NDL 추출물에 의한 세포 증식결과를 나타낸 그래프이다.

이하, 본 발명의 바람직한 실시 예에 따른 남천 추출물을 이용한 항염 및 항알레르기 활성을 갖는 피부외용 조성물에 대하여 구체적으로 설명한다.

본 발명의 피부외용 조성물는 남천 추출물을 유효성분으로 함유한다. 여기서 '유효성분'이란 단독으로 활성을 나타내거나 그 자체는 활성이 없는 담체(carrier)와 함께 활성을 나타내는 성분을 의미한다.

남천 추출물은 남천(Nandina domestica Thunb)으로부터 추출하여 수득할 수 있다.

남천(Nandina domestica Thunb)은 미나리아재비목 매자나무과의 식물로 일명 남촉목(南燭木) 또는 남천촉(南天燭), 천축자(天竺子), 천촉자(天燭子), 남죽자(南竹子), 남천죽(南天竹), 홍파자(紅杷子)이라고 한다. 남천은 중국 남방 지역, 일본, 인도, 한국 남부 지방 등 국가에 분포하여 흔히 볼 수 있는 늘푸른떨기나무이다. 나무 높이는 1.00~3.00m 정도까지 자랄 수 있으며, 잎은 광택이 있고, 가죽 같은 촉감이 있다.

남천의 잎은 남천죽엽이라고 하며, 백일해, 혈뇨, 타박상을 치료효과를 나타낸다. 겨울철에는 푸른색 잎은 빨간색으로 변하고 봄에 되며 다시 푸른색으로 변한다. 남천의 열매는 장과로 둥글고 0.50~1.00cm 정도로 10월 달에 익으며 홍색으로 바뀐다. 남천 열매는 민간에서 남천실(南天實) 또는 남천(南天), 남천죽자(南天竹子)이라고 하며 약재로서 사용되며, 명목, 지해, 청간의 효능을 가지고 있고, 진해약으로 염폐, 해수, 일본에서 만성 기침, 매독, 자궁출혈, 천식, 백일해 등의 치료에 사용되는 것으로 알려져 있다.

본 발명에서 남천은 다양한 부위를 이용할 수 있으나 바람직하게는 남천의 잎, 줄기, 열매 중에서 선택된 어느 하나의 부위를 이용한다. 특히 바람직하게는 남천의 잎을 이용한다.

남천 추출물은 남천에 추출용매를 가하여 수득할 수 있다. 이때 추출용매로 물, 탄소수 1 내지 4의 저급 알코올, 다가 알코올 또는 이들의 혼합물로부터 선택된 적어도 어느 하나를 이용할 수 있다.

탄소수 1 내지 4의 저급 알코올로 메탄올, 에탄올 등을 이용할 수 있고, 다가 알코올로 부틸렌글리콜 및 프로필렌글리콜, 펜틸렌글리콜 등을 이용할 수 있다. 그리고 혼합물로는 물 및 저급 알코올의 혼합물, 물 및 다가 알코올의 혼합물, 저급 알코올 및 다가 알코올의 혼합물, 또는 물 및 저급알코올 및 다가 알코올의 혼합물을 이용할 수 있다.

추출의 일 예로 남천에 대하여 추출용매를 중량비로 2 내지 20배로 가한 후 10 내지 150℃에서 2 내지 100시간 동안 열수추출, 냉침 또는 온침 추출 방법으로 추출할 수 있다. 추출의 구체적 일 예로 남천의 잎에 에탄올을 10배로 가해 20 내지 30℃에서 60 내지 80시간 동안 추출하여 남천 추출물을 수득할 수 있다.

그리고 상술한 추출방법 외에도 환류냉각추출, 초음파 추출방법 등을 이용하여 추출할 수 있다. 또한, 통상적인 정제 과정을 거친 추출물도 포함한다. 예컨대, 일정한 분자량 컷-오프 값을 갖는 한외여과막을 이용한 분리, 다양한 크로마토그래피에 의한 분리 등, 추가적으로 실시된 다양한 정제 방법을 통해 얻어진 활성 분획도 추출물에 포함되는 것이다.

또한, 추출용매를 이용하여 추출한 추출물을 여과, 감압농축 또는 동결건조, 분무건조 방식 등을 통해 분말 형태로 얻을 수 있음은 물론이다.

본 발명은 피부외용 조성물 총 중량에 대하여 남천 추출물을 0.01 내지 10중량% 함유할 수 있다.

남천 추출물은 우수한 항염 및 항알레르기 활성을 갖는다. 또한, 남천 추출물은 항산화 활성이 우수하고, 피부 주름개선 및 피부세포 재생효과를 갖는다. 따라서 남천 추출물을 함유하는 본 발명의 피부외용 조성물은 염증성 피부질환 또는 알레르기성 피부질환을 예방 또는 개선하고, 치료할 수 있는 약학 조성물의 형태로 제공될 수 있다.

본 발명의 피부외용 조성물은 약학적으로 허용가능한 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 함유하여 다양한 제형으로 형성될 수 있다. 가령, 피부외용 조성물은 크림, 젤, 패취, 분무제, 연고제, 경고제, 로션제, 리니멘트제, 파스타제 또는 카타플라스마제 중에서 선택된 어느 하나일 수 있다.

알레르기성 피부질환으로는 과민증, 알러지성비염, 천식, 알러지성 결막염, 알러지성 피부염, 아토피성 피부염, 알러지성 접촉성 피부염, 두드러기, 곤충 알러지, 식품알러지 또는 약품 알러지 등을 예로 들 수 있다. 그리고 염증성 피부질환으로 급·만성 습진, 접촉성 피부염, 아토피성 피부염, 지루성 피부염, 만성단순태선, 간찰진, 박탈 피부염, 구진상 두드러기, 건선, 일광 피부염 및 여드름 등일 수 있다.

본 발명의 피부외용 조성물의 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 바람직한 효과를 위해서는 남천 추출물은 1일 0.0001 내지 100㎎/㎏으로, 바람직하게는 0.001 내지 10㎎/㎏으로 투여되는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다.

또한, 본 발명의 피부외용 조성물은 피부의 주름개선 및 피부세포 재생효과를 갖는 화장료 조성물의 형태로 제공될 수 있다. 이 경우 화장수, 로션, 크림, 에센스, 팩, 파우더, 메이컵베이스, 파운데이션, 바디오일, 바디로션, 클렌징오일, 클렌징폼, 헤어오일, 헤어샴프 및 헤어린스, 비누 중에서 선택된 어느 하나의 제형으로 형성될 수 있다.

한편, 본 발명은 다른 예로 남천 추출물과 함께 긴털비름 발효추출물을 함유할 수 있다. 긴털비름 발효추출물은 긴털비름을 발효시킨 발효물로부터 추출하여 수득할 수 있다.

긴털비름(Amaranthus hybridus)은 비름과에 속하는 한해살이 식물이다. 긴털비름은 잎 또는 전초를 이용할 수 있다.

긴털비름를 발효시키기 위한 방법으로서, 긴털비름 100중량부에 대하여 당 10 내지 30중량부를 혼합하고 발효균주 0.01 내지 1.0중량부를 첨가한 후 20 내지 40℃에서 20 내지 60일 동안 발효시킨다. 당으로 당밀이나 설탕을 이용할 수 있다. 그리고 발효균주로 아스퍼질러스 오리자에(Aspergillus oryzae)를 이용할 수 있다. 발효가 완료되면 발효물에 물을 가해 긴털비름 발효추출물을 추출한다. 추출의 일 예로 저온에서 진공추출하는 방법을 이용할 수 있다. 가령, 진공저온추출기에 물 100중량부에 대하여 발효물 10 내지 50중량부를 투입한 후 진공(100 내지 200torr) 조건하에서 60 내지 80℃로 4 내지 10시간 동안 진공추출한다. 진공저온추출 후 여과하여 긴털비름 발효추출물을 얻을 수 있다.

긴털비름 발효추출물은 항산화 활성이 우수하여 피부외용 조성물의 기능성을 더욱 향상시킬 수 있다. 우수한 항산화 활성은 피부개선 및 주름방지에 도움을 줄 수 있다. 특히 긴털비름 발효추출물은 남천 추출물과 더해져 남천 추출물이 갖는 항산화 활성을 크게 향상시킨다.

긴털비름 발효추출물을 함유할 경우, 본 발명의 피부외용 조성물는 전체 총 중량에서 남천 추출물을 0.01 내지 10중량%, 긴털비름 발효추출물 0.1 내지 5중량%를 함유할 수 있다.

이하, 본 발명의 내용을 실시예 및 실험을 통하여 구체적으로 설명한다. 이는 본 발명을 보다 상세하게 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 권리 범위를 하기의 실시예로 한정하는 것은 아니다.

(실시 예: 남천 추출물 추출)

1. 재료 준비

(1)남천 준비

2016년 11월에 광주광역시에서 직접 채취한 남천(Nandina domestica Thunb; 광주광역시, 대한민국)을 열매, 줄기, 잎으로 부위를 나누어 준비하였다. 실험에 사용된 식물 표본은 ㈜코씨드바이오팜(충청북도, 청주)표본실에서 보관하였다.

(2)실험재료

Dulbecco's modified eagle's medium (DMEM), Phenicillin-streptomycin (PS), Trypsin-EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid), Fetal bovine serum (FBS), Trypan bule, Phosphate buffered saline (PBS), Ham’nutrient mixture F-12 (F-12)는 Gibco (Rockville, MD, U.S.A.)에서 구입하였다. 6-well plate, 24-well plate, 96-well plate, Subculture plate는 SPL (Korea), L-ascorbic acid, 1,1-diphenyl-2-picryl hydrazyl (DPPH), Thiazolyl blue tetrazolium bromide (MTT), Dimethyl sulfoxide (DMSO), Lipopolysaccharide (LPS), Nordihydroguaiaretic acid (NDGA), Etanol, Dexamethasone, Adenosine, Monoclonal anti-β-actin antibody produced in mouse, Compound 48/80, Histamine, Agarose, PMA, T-stim, 2-mercap-toethanol andL-glutamine, Quercetin, Gallic acid, Folin-Ciocaleu reagent 는 sigma (St. Louis, MO, U.S.A.)에서 구입하였다. TNF-α, IFN-γ, RANTES ELISA kit, TARC ELISA kit, Histamine 등 ELISA kit는 R&D Systems사 (Minneapolis, U.S.A.)에서 구입하였다. Anti-rabbit lgG HRP-linked antibody, p44/42 MAPK (Erk1/2) antibody, SAPK/JNK antibody, p38 MAPK antibody, Phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) (Thr202/Tyr204) antibody, Phospho-SAPK/JNK (Thr183/Tyr185) antibody, and Phospho-p38 MAP Kinase (Thr180/Tyr182) antibody, RIPA는 Cell Signaling Technology, Inc. (Danvers, U.S.A.)에서 구입하였다. MMP-1 (SB12e): sc-58377는 Santa Cruz Biotechnology, Inc. (California, Co., U.S.A.)에서 구입하였다. Goat anti-Mouse lgG (H+L) secondary antibody HRP는 ThermoFisher SCIENTIFIC (Waltham, Co., U.S.A.)에서 구입하였다. Bicinchoninic acid assay kit, SDS-PAGE gel (BioRad, U.S.A.)에서 구입하였다. Enhanced chemiluminescence는 (Amersham Pharmacia Biotech, U.S.A.), Griess는 (Promega, Madison, U.S.A.), Competitive-Enzyme linked ImmunoSorbent assay: ELISA는 (ALPCO Diagnostics, NH, U.S.A.), RT PreMix kit, PCR PreMix kit는 (Bioneer, Korea)에서 구입하였다. AlCl₃*?*H₂O, Acetonitrile, Methanol, Na₂CO₃은 DAEJUNG (DAEJUNG CHEMICALS & METALS Co., Korea)에서 구입하였다.

사용된 기기는 Soxhlet (Wise Therm, korea), High speed refrigerated centrifuge (SUPRA, 21K, korea), Rotary evaporator (EYELA, SB-1200, Co., Japan), Microwave oven (LG, Korea), Voltex-1 (동서과학, Korea), CO₂ incubator (New Brunswick, U.S.A.), Micro centrifuge (Micro 12) (Hanil, Korea), Inverted microscope (NIKON, Japan), UVB 조사기 (U.S.A.), Clean bench (Vision scientific, Korea), Autoclave (Sanyo, Japan), Micro-pipet (Gilson, France), Water bath (Vision scientific, Korea), Vortex mixer (Vision scientific, Korea), Spectrophotometer (Shimazue, Japan), Centrifuge (Sigma, U.S.A.), Plate shaker (Lab-Line, U.S.A.), Micro plate reader (Molecular devices, U.S.A.), High speed refrigerated centrifuge (Hanil, Korea), Rotary evaporator (Heidolph Germany)，Series rotary evaporator (EYELA, Japan), Chemi-Doc (Atto, U.S.A.), Speed Vac (Servant, U.S.A.)를 사용하였다.

2. 남천 추출물 추출

남천의 열매(Nandina domestica Thunb fruit, 이하 NDF라 함), 줄기(Nandina domestica Thunb branches, 이하 NDB라 함), 잎(Nandina domestica Thunb leaf, 이하 NDL이라 함)으로부터 각각 추출물을 추출하였다.

실험에 사용할 NDF, NDB, NDL는 물로 깨끗하게 씻고 열풍건조기에 50℃에서 24시간 동안 건조한 후 각각 30g씩 분쇄기(HBL-3500S, ELEXION, Korea)로 분쇄하여 농도 70%(w/w) 에탄올을 중량비로 10배 가한 후 72시간 동안 상온(25℃)에 침지하여 추출하였다. 추출한 후 각각 추출물은 400mesh 여과지로 1차 여과한 후 1000 rpm에서 15min 동안 원심분리하여 상층액을 whatman No. 2 여과지로 2차 여과하였다. 여과된 NDF, NDB, NDL 추출물은 Rotary evaporator로 통해서 감압 농축하여 시료로 이용하였다. NDF 추출물 수율은 18.50%, NDB 추출물 수율은 10.20%, DNL 추출물 수율은 24.30%였다.

위의 남천 추출물의 추출과정은 도 1에 블록도로 나타내었다.

<실험예>

1. 실험방법

(1)총 폴리페놀 함량 측정

총 폴리페놀함량은 널리 사용되고 있는 Folin-Denis 방법(Folin & Denis, 1912)으로 측정하였다. 시료는 정제수에 1,000.00mg/ml로 완전히 용해시켜 여과 후 시료로 이용하였다. 먼저 각 well에 시료 샘플 20.00μl에 2N Folin-Ciocaleu 시약 20.00μl를 추가하며 혼합하였다. 5min 동안 방치한 후, 20.00% Na₂CO₃ 100.00μl를 넣고 그 상태에서 30min 동안 상온에서 방치하였다. Gallic acid는 15.63, 31.25, 62.50, 125.00 및 250.00 mg/ml 되도록 희석하며, 각 시료샘플 및 표준품의 흑광도 측정 방법은 micro plate reader로 730nm의 파장에서 흡광도를 측정하였다. 총 폴리페놀 함량은 작성한 표준곡선 mg/g gallic acid equivalents(GAE) 단위 계산하였다. 각 시료는 최소 3번 반복 실험하여 평균값을 구하였다.

(2)총 플라보노이드함량 측정

총 플라보노이드 함량을 측정하기 위해, 각 시료는 EtOH에 1,000.00mg/ml 되도록 녹이고 표준품 Quercetin는 7.81, 15.63, 31.25, 62.50mg/ml로 희석하였다. 각 well에 시료를 20.00μl에 EtOH 80.00μl를 놓고 2.00% AlCl₃ ·6H₂O 100.00μl를 추가하며 5min 동안을 상온에 방치한 후 micro plate reader를 사용하여 430nm의 파장에서 흡광도를 측정하였다. 총 플라보노이드 함량은 작성한 Quercetin 표준곡선 mg/g Quercetin equivalents(QE) 단위로 따라서 계산하였다. 각 시료는 최소 3번 반복 실험하여 평균값을 구하였다.

(3)Free radical 소거 활성

DPPH 시약을 MeOH에 녹이고 NDF, NDB, NDL 시료는 각각 100.00mg/ml이 되도록 DMSO에 녹인 후 MeOH를 사용해서 희석하였다. 시료와 시료용매 각각 3.00, 10.00, 30.00, 100.00μl로 희석하여 실험을 진행하였다. DPPH군은 시료와 DPPH 180.00μl를 혼합하고 MeOH군은 시료와 MeOH 180.00μl를 혼합하였다.

10min 동안 상온에서 반응 시킨 후 microplate reader를 이용하여 565nm에서 흡광도를 측정하였다. Positive control은 500.00μM L-ascorbic acid를 사용하였다.

(4)피부 생리활성 효능 평가

가. 세포배양

-HaCaT 세포 배양조건

인간 각질 형성 세포(ATCC^® PCS-200-011^™, Primary Epidermal Keratinocytes, HaCaT, U.S.A.)는 미국 세포주 은행에서 분양을 받아서 시험을 진행하였다. 인간 각질 형성 세포는 DMEM에 10.00% FBS, 1.00% PS를 첨가하여 만든 배지를 사용하였다. CO₂ incubator는 37℃, 5.00% CO₂, full humidity 조건을 설정하여 배양하였다.

-HDFn 세포 배양조건

섬유아세포(ATCC PCS-201-010^™, Human Dermal Fibroblast neonatal, HDFn, U.S.A.)는 미국 세포주 은행에서 분양을 받아서 시험에 사용했다. HDFn 사용된 배지는 F-12과 DMEM를 각 1:3 비율로 혼합하였고 10.00% Fetal bovine serum(FBS), 1.00% phenicillin-streptomycin(PS)를 첨가하여 사용하였다. CO₂ incubator에 37℃, 5.00% CO₂, full humidity조건에 배양하였다.

-MC/9 세포 배양조건

비만세포(ATCC^® CRL-8306^™, Mus musculus, mouse, MC/9, U.S.A.)는 미국 세포주　은행에서 분양받아 시험에 사용하였다. 배지는 10.00% FBS, 10.00% T-stim,　0.05mM 2-mercap-toethanol and 2.00mM L-glutamine 및 100.00μg/ml streptomycin이 함유된 DMEM를 사용하였으며, CO₂ incubator에 37℃, 5.00% CO₂, full humidity 조건에서 배양하였다.

-RAW 264.7 세포 배양조건

대식세포(ATCC TIB-71^™, Mus musculus, mouse, RAW 264.7, U.S.A.)는 미국 세포주 은행에서 분양받아 시험에 이용하였다. 배지는 10.00% FBS를 첨가한 DMEM를 사용하였으며, CO₂ incubator에 37℃, 5.00% CO₂, full humidity조건으로 배양하였다.

나. 세포독성 실험

-HaCaT 세포

HaCaT 세포를 계수하여 1 ×10⁵cells/ml이 되도록 96-well plate에 분주하고 세포를 안정화시켰다. NDF, NDB, NDL 추출물을 DMSO에 용해하여 100.00mg/ml 될 수 있도록 제조하였다. 각 시료는 0.20μm filter를 사용하여 제균 처리한 후 사용하였다. NDF, NDB, NDL 추출물은 농도별로 샘플을 희석하여 처리하고 24hrs 동안 반응시켰다. 양성대조군 Dexamethasone는 0.10, 1.00μM로 2hrs 전 처리하였다. TNF-α + IFN-γ 10.00 mg/ml를 처리하고 24 hrs동안 반응시켰다. 5.00mg/ml의 MTT 용액을 각 well당 20.00 μl씩 첨가하여 37℃ 배양기에서2~3hrs 반응시킨 후, 상층액을 모두 제거하였다. 생성된 formazan을 용해하기 위해 DMSO를 각 well 100.00μl씩 DMSO를 사용하고 micro plate reader를 이용하여 550 nm에서 흡광도를 측정하였다.

-HDFn 세포

HDFn 세포를 계수하여 1 ×10⁵ cells/well이 되도록 24-well plate에 분주하고 세포를 안정화시켰다. 24hrs 안정화 시킨 후, NDF, NDB, NDL 추출물을 DMSO에 녹인 후 시료 100.00mg/ml 될 수 있도록 제조하였다. 각 시료는 0.20μm filter를 사용하며 제균하여 사용하였다. NDF, NDB, NDL 추출물은 10.00% FBS 함유된 DMEM로 통해서 10.00, 30.00, 100.00μg/ml 3개 샘플을 희석하여 작은 농도부터 처리하였다. 24hrs 후 MTT 용액을 이용하여 세포독성을 확인하였다. MTT 용액을 각 well당 50.00μl씩 첨가하여 2~ 3hrs 후 배지를 제거하고 생성된 formazan을 용해하기 위해 350μl의 DMSO를 사용하고 micro plate reader을 이용하여 550nm에서 흡광도를 측정하였다.

-RAW 264.7 세포

RAW 264.7 세포를 계수하여 4 ×10⁵ cells/ml로 96-well plate에 분주하고, 2 hrs 동안 세포 안정화시켰다. NDF, NDB, NDL 추출물을 DMSO에 용해하여 100.00 mg/ml 될 수 있도록 제조하였다. 각 시료는 0.20μm filter를 사용하여 제균 처리한 후 사용하였다. NDF, NDB, NDL 추출물은 10.00, 30.00, 100.00μg/ml로 2.00 μl로 처리하고 24 hrs 동안 반응시켰다. 5.00mg/ml의 MTT 용액을 각 well당 10.00 μl씩 첨가하여 37℃ 배양기에서 2 ~ 3 hrs 반응시킨 후 상층액을 모두 제거하였다. 생성된 formazan을 용해하기 위해 DMSO를 각 well당 100.00 μl씩 DMSO를 사용하고 Micro plate reader를 이용하여 550nm에서 흡광도를 측정하였다.

-MC/9 세포

MC/9 비만세포를 계수하여 2 ×10⁵ cells/ml로 96-well plate에 분주하고 세포를 안정화시켰다. NDL를 DMSO에 용해하여 100.00mg/ml 될 수 있도록 제조하였다. 각 시료는 0.20μm filter를 사용하여 제균 처리한 후 사용하였다. NDL은 50.00, 100.00, 200.00μg/ml로 2.00μl로 처리하고 24 hrs 동안 반응시켰다. 5.00 mg/ml의 MTT 용액을 각 well당 10.00μl씩 첨가하여 37℃ 배양기에서 2 ~ 3 hrs 반응시킨 후 상층액을 모두 제거하였다. 생성된 formazan을 용해하기 위해 DMSO를 각 well 100.00μl씩 DMSO를 사용하고 Micro plate reader를 이용하여 550nm에서 흡광도를 측정하였다.

다. 주름 개선 효과

Western blot를 통한 HDFn 세포 내 MMP-1의 발현을 측정하였다. 세포는 4 ×10⁵ cells/well로 6-well plate에 분주한 후 37℃, 5.00% CO₂ 배양기에서 over night 안정화시켰다. 배지를 제거하여 37℃ 따뜻한 PBS 1.00ml로 2번씩 washing하여 각 well당 2.00ml씩 PBS로 채우고 7.00cm 높이에 UVB 15min 동안 조사하였다. 15 min 후에 cell 상태를 확인하여 PBS를 제거하며 2.00% FBS함유된 배지를 2.00ml씩 넣고 NDF, NDB, NDL 추출물은 30.00, 100.00 μg/ml로, 양성대조군 adenosine는 100.00 μg/ml로 처리하며 6 hrs 반응을 시킨 후, 세포의 protein를 분리하였다. 세포를 aspirator로 supernatant를 제거하고 완충 용액 인산 원충 식염수 1 x PBS 1.00 ml를 사용하여 세척 후 제거하였다. 다시 1 x PBS를 1.50ml씩 각 well에 추가하고 cell scraper로 긁어서 1.50ml tube에 수득하고 vortex mixer를 사용하여 세포를 침전시켰다. Supernatant를 제거한 후 1 x RIPA를 각 tube에 100.00μl씩 넣고 vortex 세포를 용해하였다. Tube를 얼음에 30min 동안 넣고 10min씩 반응을 시켰다. 30min 후에 12,000 rpm, 15 min 동안, 4℃에서 원심분리하고 supernatant를 수득하였다. 단백질 정량 실험은 bicinchoninic acid assay kit을 사용하여 수득한 상층액을 정량하였다. 20.00μg의 단백질을 8.00% SDS-PAGE gel에서 전기영동을 하였다. 크기에 따라서 분리된 단백질은 polyvinylidene fluoride(PVDF) membrane에 이동한 후 1 x TBST에 5.00% skim milk 제조하여 1hr 실온에 흔들면서 blocking 단계를 진행하였다. 1 hr 후에 1 x TBST로 10min씩 5희 세척하였다. MMP-1의 1차 항체를 1: 800로, β-actin 1차 항체를 1 : 2500로 4℃에서 O/N로 흔들면서 well plate에 고정시켰다. 항체가 고정된 well plate를 4℃에서 꺼내서 실온에 3 hrs 반응시키고 1 x TBST로 10min씩 5회 세척하였다. Goat anti-Mouse lgG(H+L) secondary antibody HRP 2차 antibody는 1 : 3000로 5.00% skim milk에 희석하여 실온에서 흔들면서 반응시켰다. 2 hrs 후에 1 x TBST로 10min씩 5회 세척하였다. Enhanced chemiluminescence를 사용하여 밴드를 확인하며 imageJ 1.47 software를 이용하여 밴드를 수치화하였다.

라. 항염 효과

-NO 생성량

RAW 264.7 세포는 4 ×10⁵ cells/ml로 96-well plate에 분주한 후 2 hrs 뒤 세포를 안정화시키고, 96-well plate에 시료를 처리하였다. NDF, NDB, NDL 추출물은 10.00, 30.00, 100.00 μg/ml로 2.00 μl씩 전 처리하였다. 양성대조군 NDGA는 20.00 uM로 처리하였다. 2 hrs 후 LPS는 1.00 μg/ml로 2.00 μl씩 처리하였다. 24 hrs 동안 배양한 후 상층액 100.00 μl에 Griess 시약(griess A : B = 1 : 1) 100.00 μl를 첨가해주고 540nm에서 흡광도를 측정하였다. Giress 시약은 0.10% N-Cl-haphthyl ethylene diamine 및 1.00% sulfanilamide로 시험 전에 제조하여 사용하였다.

-ERK, JNK and p38 MAP kinase의 발현량

Western blot를 통한 RAW 264.7 세포 내 ERK, JNK and p38 MAP kinase의 발현량을 확인하였다. 세포는 4 ×10⁵ cells/well로 6-well plate에 분주한 후 37℃, 5.00% CO₂ 배양기에서 하룻밤 동안 안정화시켰다. NDL　시료는 30.00, 100.00 μg/ml로 전 처리하고 2hrs후 LPS는 1.00μg/ml로 처리하며 15 min 반응을 시킨 후 세포 protein를 분리하였다. 세포를 aspirator로 supernatant를 제거하고 완충 용액 인산 원충 식염수 1x PBS 1.00 ml를 사용하여 세척 후 제거하였다. 다시 1 ×PBS를 1.50ml씩 각 well에 추가하고 cell scraper로 긁어 1.50ml tube에 수득하고 vortex mixer를 사용하여 원심분리 하였다. Supernatant를 제거한 후 1 ×RIPA를 각 tube에 100.00μl씩 넣고 피펫으로 cell를 불어주며 vortex로 용해시켰다. Tube를 얼음에 30 min 동안 넣고 10 min 씩 반응을 시켰다. 30 min 후에 12,000 rpm, 15 min 동안, 4℃에 원심분리하고 supernatant를 수득하였다. 단백질 정량 실험은 bicinchoninic acid assay kit을 사용하여 수득한 상층액을 정량하였다. 20.00μg의 단백질을 8.00% SDS-PAGE gel에서 전기영동을 하였다. 크기 따라서 분리된 단백질은 polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane에 이동한 후 1 x TBST에 5.00% skim milk 제조하여 1 hr 동안 실온에서 흔들면서 blocking 단계를 진행하였다. 1 hr 후에 1 x TBST로 10min 씩 5회 세척하였다. p44/42 MAPK (Erk1/2) antibody, SAPK/JNK antibody, p38 MAPK antibody, phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2)　(Thr202/Tyr204) antibody, phospho-SAPK/JNK (Thr183/Tyr185) antibody, and phospho-p38 MAP Kinase (Thr180/Tyr182) antibody의 1차 항체를 1 : 1000로 4℃에서 O/N로 흔들면서 well plate에 고정시켰다. 항체가 고정된 well plate를 4℃에서 꺼내서 실온에 1 hr 반응시키고 1 x TBST로 10 min씩 5회 세척하였다. Anti-rabbit lgG HRP-linked antibody 2차 antibody는 1:3000로 5.00% skim milk에 희석하여 실온에서 흔들면서 반응을 시켰다. 2 hrs후에 1 x TBST로 10 min씩 5회 세척하였다. Enhanced chemiluminescence를 사용하여 밴드를 확인하며 imageJ 1.47 software를 이용하여 밴드를 수치화하였다.

-Cytokine의 생성량

RAW 264.7를 이용하여 RT-PCR를 통한 세포 내 cytokine의 발현을 측정하였다. 세포는 4 ×10⁵ cells/well로 6-well plate에 분주한 후 37℃, 5.00% CO₂ 배양기에서 하룻밤 안정화시켰다. NDL추출물 시료는 30.00, 100.00μg/ml로, 양성대조군 NDGA은 20.00 uM로 전 처리하고 2 hrs 후 LPS는 1.00 μg/ml로 처리하며 4 hrs 반응을 시킨 세포 RNA를 분리하였다. 먼저 세포를 aspirator로 supernatant를 제거하고 완충 용액 인산 원충 식염수 1 ×PBS 1.00 ml를 사용하여 세척 후 제거하였다. 다시 1 ×PBS를 1.50ml씩 각 well에 추가하고 cell scraper로 긁어서 1.50ml tube에 수득하고 vortex mixer를 사용하여 세포를 용해시켰다. Supernatant를 제거한 후 trizol 시약을 800.00 μl사용해서 세포를 용해시키고 chloroform 용액 200.00 μl넣고 상온에 5 min 동안 침지하고 4℃ 12,000 rpm에서 15 min 원심분리하여 맨 위에 상층액을 얻었다. 같은 양의 isopropanol를 첨가하고 혼합한 후 4℃ 12,000 rpm에서 15 min 원심분리하여 상충액을 제거하고 70.00% EtOH를 800.00 μl넣고 4℃ 12,000 rpm에서 15 min 원심분리하여 상층액을 제거하였다. RNA를 투명할 때까지 건조한 후 DEPC DW 35.00 μl씩 넣고 30 min 동안 RNA를 용해시키고 정량하였다. β-actin를 확인하기 위해 분리된 total RNA를 RT PreMix kit를 통해서 cDNA를 만들고 하기 표 1에 제시하는 각 primer와 PCR PreMix kit를 이용하여 95℃에서 5 min 반응시킨 후, 94℃에서 30sec denaturation시키고, 54℃에서 30sec annealing시킨 다음 72℃에서 1min extention시키는 cycle을 25회 반복한 뒤 마지막 extension은 72℃에서 5 min 수행하였다. 다른 조건을 바꾸지 않고 IL-1β는 54℃에서 28cycle, IL-6는 60℃에서 30cycle annealing시켰다. PCR 반응이 끝난 후 2.00% agarose gel에 7.00μl씩을 넣고 25min 동안 전기영동하고 UV를 사용하고 반응 결과를 분석하였다.

Primer	Sense Anti-sense	Sequences
IL-6 (230bp)	Sense	5`- AGC CAG AGT CCT TCA GAG AGA-3`
	Anti-sense	5`- TAA CGC ACT AGG TTT GCC GAG-3`
IL-1β (563bp)	Sense	5`- ATG GCA ATG TTC CTG AAC TCA ACT-3`
	Anti-sense	5`- CAG GAC AGG TAT AGA TTC TTT CCT TT-3`
β-actin (349bp)	Sense	5`- TGG AAT CCT GTG GCA TCC ATG AAA C-3`
	Anti-sense	5`- TAA AAC GCA GCT CAG TAA CAG TCC G-3`

MC/9 세포를 이용하여 cytokine assay 통해서 TNF-α를 측정하였다. 세포는 2 ×10⁵ cells/ml로 96-well plate에 분주한 후 96-well plate에 NDL 추출물은 50.00, 100.00, 200.00μg/ml로, 양성대조군 dexamethasone는 0.10, 1.00 μM로 30 min 전 처리하였다. PMA(20.00nM)/A23187 (0.50μM)을 처리하고 5 hrs 반응시켰다. 상층액을 얻어 cytokine assay 실시하여 제조사의 실험 방법을 따라서 450nm에서 흡광도를 측정하였다.

마. 항알레르기 효과

-Chemokine 생성량

HaCaT 세포는 5 ×10⁴ cells/well로 96-well plate에 분주한 후 하룻밤 세포의 안정화를 확인하고 96-well plate에 NDF, NDB, NDL 추출물은 50.00, 100.00, 200.00 μg/ml로, 양성대조군 Dexamethasone는 0.10, 1.00 μM로 2 hrs 전 처리하였다. TNF-α + IFN-γ10.00 mg/ml를 처리하고 24 hrs 반응을 시켰다. 상층액을 얻어 RANTES ELISA Kit, TARC ELISA Kit를 이용하여 제조사의 실험 방법을 따라서 450nm에서 흡광도를 측정하였다.

-Histamine 생성량

Histamine 생성량 측정은 박 등의 연구방법(박광현 등, 2011)을 참고하여, 실험 진행하였다. 시료를 15min 동안 전 처리하고 Compound 48/80 (6.00μg/ml)으로 15 min 동안 자극하였다. 세포배양 상층액 중에 있는 히스타민 정량은 면역흡착 정량법(Competitive-Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay: ELISA)를 이용하였다. 시료는 1,500rpm으로 3min 동안 원심분리한 후 각 반응 군에서 동일한 용량의 상층액을 취하여 Speed Vac에서 저온 건조시킨 후 100.00 μl의 PBS로 재용해하여 이용하였으며, 정량키트의 공급자 매뉴얼에 기록된 방법에 의거하여 실험을 실시하였다.

바. 피부세포 재생 효과

HDFn는 1 ×10⁴ cells/well로 96-well plate에 분주한 후 하룻밤 세포를 안정화시켰다. 다음 날 배지를 0.20% FBS 함유된 배지로 바꾸고 시료를 처리하였다. NDF, NDB, NDL 추출물은 10.00, 30.00, 100.00μg/ml로 2.00μl씩 처리하였다. 24 hrs, 48 hrs 반응하여 MTT시약 30.00 μl씩 처리하여 3 hrs 후부터 확인하여 550nm에 흡광도를 측정하며 결과를 분석하였다.

(5)통계분석

실험은 3회 반복하여 실시하였으며 데이터 분석을 위하여 Excel program을 사용하였고 mean±standard deviation(S.D.)로 나타내었으며, 통계적 유의성은 Student's t-test법을 사용하여 ＊p < 0.05의 경우 통계적으로 유의성이 있는 것으로 판정하였다.

2. 실험결과

(1)추출수율

70.00% 에탄올을 이용하여 추출한 결과, 하기 표 2와 같이 NDF 추출물의 수율은 18.50%, NDB 추출물 수율은 10.20%, NDL 추출물 수율은 24.30%로 나타났다.

추출물	Total Yield (%)
NDF	18.50%
NDB	10.20%
NDL	24.30%

Total yield(%) = (sample extract weight/sample dry weight) ×100%

(2)총 폴리페놀 함량

폴리페놀은 다양한 식물 중에서 광범위하게 존재하고 있으며, 다양한 분자구조와 분자량을 가지고 있는 물질이다. 이 폴리페놀성 물질은 phenolic hydroxyl(OH)을 포함하기 때문에, 다른 거대 분자나 단백질과 쉽게 결합할 수 있어서 항염, 항산화 등 여러 종류의 생리활성을 가지고 있다. 폴리페놀은 Free radical에 의한 DNA 손상, 단백질 변성, 지질 과산화 등의 산화적 영향으로 발병되는 피부노화 및 심혈관질환 등에 대해서 보호하는 역할을 수행한다.

도 2를 참조하면, 총 폴리페놀의 함량은 NDL 추출물에서 85.82±0.05 mg/g로 가장 높은 폴리페놀을 함유되어있는 것으로 나타났고, NDF, NDB 추출물은 각각 67.93±0.09, 44.52±0.03 mg/g로 나타났다.

진의 논문을 보면 와송은 70.00% 에탄올 추출물에서 24.14mg/g으로 나타났고 다른 용매 추출한 추출물 보다 가장 높은 폴리페놀을 함유하는 것으로 관찰되었다(진동혁 등, 와송추출물의 총 페놀, 플라보노이드 함량 및 항산화 활성 비교. 한국환경과학회지; 25(5), 695-703. 2016). 송 등 논문을 보면 조릿대 에탄올 추출물 총 폴리페놀함량은 41.46mg/g으로 나타났고 열수 추출물과 비교하면 높은 폴리페놀함량을 확인하였다(송원영 등, 조릿대 추출물의 용매별 항산화 및 항염증 활성. 농업생명과학연구; 49(3), 145-154. 2015). 박의 논문 내용을 보면 마치현 70.00% 에탄올 추출물의 총 폴리페놀 결과를 보면 34.14 ±0.28 μg/mg으로 나타났다(박소라 등, 마치현 열수 및 에탄올 추출물의 항산화 활성. 대한본초학회지; 32(4), 39-46. 2017).

위의 논문의 결과와 비교하였을 때 NDF, NDB, NDL 추출물에서 측정한 폴리페놀 함량은 매우 높은 것으로 확인되었다.

(3)총 플라보노이드 함량

대표적인 항산화 물질인 플라보노이드는 Ｃ₁₅ 화합물로 2개의 페닐 고리가 3개의 탄소와 결합되어 있다. 플라보노이드와 그 배당체는 인체에서 다양한 생리활성을 가지고 있으며, 그 중류는 Chalcones, flavones, flavonols, isoflavonoids 등으로 구분된다.

플라보노이드는 폴리페놀계 화합물의 일종으로 자연에서 폭넓게 분포하고 있는 이차 대사체의 일 종이며 식물과 채소 등의 뿌리, 줄기, 잎, 꽃, 열매 등에 함유되어있으며, 과일류, 곡물 등에도 대량적으로 함유되어 있는 것으로 알려져 있다.

플라보노이드는 식물의　성장, 분화, 착색에 연관되어 자외선에 대한 방어 작용, 병원 미생물 대한 방어 작용, 효소 활성 조절 효과 등 여러 기능을 가지고 있다. 플라보노이드는 다양한 약리활성 효과로 항염, 항산화, 항알레르기 효과 및 순환기계 질환의 예방, 지질저하, 면역증강 작용을 나타낸다. 플라보노이드는 내부의 존재하는 여러 화합물과 쉽게 결합이 가능한 히드록실기(-OH)를 가지고 있기 때문에 항산화 작용을 나타낸다.

실험은 표준물질로 Quercetin으로 사용하며 7.81, 15.63, 31.25, 62.50 mg/ml로 작성하는 표준 검량 곡선을 통해서 플라보노이드화합물을 정량하였다.

NDF, NDB, NDL를 1000.00mg/ml에 함유된 총 플라보노이드 함량을 정량한 결과 도 3에 나타난 바와 같이 NDF, NDB, NDL 추출물은 각각 2.37±0.00, 5.05±0.01, 12.96±0.02 mg/g인 것으로 확인되었으며, 그 중에 NDL 추출물에서 가장 많은 플라보노이드가 함유되어 있는 것으로 나타났다.

박 등의 논문에서 70.00% 에탄올 마치현 추출물의 총 플라보노이드 양은 4.40 ±0.22μg/mg으로 나타났다(박소라 등, 마치현 열수 및 에탄올 추출물의 항산화 활성. 대한본초학회지; 32(4), 39-46. 2017). 이 등의 논문에 독활 70.00% 에탄올 추출물 제조한 시료의 플라보노이드 함량은 4.54 mg/g로 나타났다(이성규 등, 독활 에탄올추출물의 항산화 및 항염증 활성. 한국자연치유학회지; 4(1), 10-14. 2015). 이와 비교하면 NDL 추출물은 마치현의 2.9배, 독활의 2.8배 정도 더 높은 농도의 플라보노이드 함량을 나타내었다. 따라서 위의 논문의 결과와 비교하였을 때 NDF, NDB, NDL 추출물에서 플라보노이드의 함량은 높게 나타난 것으로 확인하였다.

(4)프리라디칼 소거 활성

프리라디칼(Free radical) 특히 ROS는 생명체 내에서 전자운반 중 불안전한 환원현상을 일으키거나 cytokine 등의 여러 단계 대사과정에 생성된다. 또한 산화질소, 오존, 스모그, 흡연과 자외선 등 환경적 오염에 의해서도 끊임없이 생성할 수 있다. hydrogen peroxide, hydroxyl radical, superoxide radical, singlet oxygen 등의 ROS로 다양하게 존재하는 프리라디칼은 세포막을 파괴하여 단백질을 변성시키고, 지질 과산화, DNA를 손상시킨다. 여러 산화에 의해 생성된 물질은 산화적 스트레스(oxidative stress)의 유발을 통하여 노화와 관련된 생리적 장애 및 암, 당뇨병, 동맥경화, 심장질환 등 각종 질환들도 일으킨다고 알려지고 있다.

NDF, NDB and NDL 추출물의 프리라디칼 소거 활성을 확인하기 위해 3.00, 10.00, 30.00, 100.00μg/ml의 4개 농도로 희석하여 실험을 실시하였다.

도 4를 참조하면, 양성대조군인 ascorbic acid은 500.00uM에서는 free radical 소거 활성이 91.41±0.21%로 나타났다. 그리고 NDF 추출물은 농도에 따라 2.46±1.93, 14.88±4.02, 39.97±5.98, 89.69±0.79%로 농도 의존적으로 증가하는 것으로 나타났다. 그리고 NDB 추출물은 농도에 따라 1.45±0.33, 5.51±1.78, 15.12±4.15, 53.34±8.44%로 농도 의존적으로 증가하는 것으로 나타났으며, NDL 추출물은 농도에 따라 6.87±0.12, 20.73±1.86, 46.61±1.99, 90.87±1.13% 농도 의존적으로 증가를 나타내었다.

실험군은 대조군에 비하여 모든 농도에서 유의성 있게 증가하여 free radical 소거 활성에 효능이 있는 것으로 확인되었다. 이중 NDL 추출물에서 농도 의존적으로 다른 시료에 비하여 상대적으로 높은 효능을 확인하여 항산화 활성이 가장 우수한 것으로 확인되었다.

이의 논문에서 독활 70.00% 에탄올 추출물의 free radical 소거 활성과 천연 항산화제 L-ascorbic acid 측정한 결과는 독활 에탄올 추출물 10.00, 50.00, 100.00μg/ml에서 각각 3.16%, 20.53%, 63.16%의 free radical 소거 활성을 확인하였다(이성규 등, 독활 에탄올추출물의 항산화 및 항염증 활성. 한국자연치유학회지; 4(1), 10-14. 2015). 진 등의 논문에 보면 블랙 초크베리 70.00% 에탄올 추출물이 0.40, 0.60 mg/ml에 92.49 ±0.07%, 93.50 ±0.07%의 소거 활성이 나타났다(진동혁 등, 블랙 초크베리 추출물의 항산화 활성 및 아질산염 소거 활성. 한국환경과학회지; 25(4), 567-577. 2016).

위의 논문결과와 비교하면 NDF, NDB과 NDL 추출물 모두 free radical 소거능이 우수한 것으로 나타났으며, 농도 의존적으로 높을수록 free radical 소거 활성 증가하는 것으로 나타났다. 또한 대조군과 비교하였을 때 유의성 있는 증가를 확인하였다. 특히 NDL 추출물의 4개 농도에서는 유의성 있는 증가를 나타내어 높은 항산화 효과가 있는 것으로 보이며, 이는 좋은 천연 항산화제로 활용될 수 있는 것으로 기대된다.

(5)세포독성

-HaCaT cell

HaCaT cell, HDFn cell, RAW 264.7 cell, MC/9 cell을 이용하여 NDF, NDB과 NDL 추출물의 세포독성을 확인하였다. 세포독성 실험을 통해서 시료의 안전한 사용농도를 확인할 수 있으며 독성이 나타나지 않는 범위에서 실험을 진행하였다.

인간 각질형성세포주인 HaCaT를 자극하면 TARC의 생성을 증가시켜서 아토피　피부염에 대한 영향을 줄 수 있다. 또한 HaCaT에 TNF-α + IFN-γ를 사용해서 알레르기 반응 유도하여 중요한 표적물질인 RANTES 같은 chemokine의 형성 억제 효과를 검증하기 위해 실험을 실시하였다.

도 5를 참조하면, NDF 추출물은 50.00, 100.00, 200.00μg/ml에서 90.49±5.24, 103.26±5.83, 93.50±8.92%의 세포생존율을 나타내었고, NDB 추출물은 50.00, 100.00, 200.00μg/ml에서 93.97±3.89, 90.39±2.17, 97.17±7.59%의 세포생존율을 나타내었으며, NDL 추출물은 50.00, 100.00, 200.00μg/ml에서 100.08±3.44, 92.21±3.06, 94.11±9.54%의 세포생존율을 나타내었다.

통계프로그램으로 실험군과 대조군을 비교하였을 때 차이가 없는 것으로 확인되어 200.00μg/ml까지 처리한 HaCaT세포에 유의적인 차이를 나타내지 않아 독성이 없는 것으로 나타났다.

-HDFn cell

피부섬유아세포는 자외선에 조사되면 ROS에 의해 matrix metalloproteinases (MMPs)를 생성한다. 사람 피부 섬유아세포인 HDFn은 주로 MMP-1 발현 억제 효과, Type I procollagen 합성능 실험에 많이 사용된다.

도 6을 참조하면, NDF 추출물은 10.00, 30.00, 100.00μg/ml에서 103.08±0.38, 100.62±0.28, 104.39±0.39%의 세포생존율을 나타내었고, NDB 추출물은 10.00, 30.00, 100.00μg/ml에서 100.81±0.37, 105.60±0.54, 103.67±0.80%의 세포생존율을 나타내었으며, NDL 추출물은 10.00, 30.00, 100.00μg/ml에서 104.27±0.78, 99.58±0.65, 101.40±0.49%의 세포생존율을 나타내었다.

실험군과 대조군을 비교하였을 때 100.00μg/ml까지 처리한 HDFn세포에서 유의적인 차이가 나타나지 않아 독성이 없는 것으로 판단되었다.

-RAW 264.7 cell

마우스의 대식세포 세포주인 RAW 264.7는 염증반응에 핵심적인 역할을 담당한다. 대식세포에 LPS로 자극해주면 염증반응을 조절해 주는 염증 전사인자들을 활성화시켜서 NO, cytokine, MAPKs 등 염증에 관한 물질을 생산한다.

도 7을 참조하면, NDF 추출물은 10.00, 30.00, 100.00μg/ml에서 102.05±18.59, 104.08±19.22, 108.64±22.11%의 세포생존율을 나타내었고, NDB 추출물은 10.00, 30.00, 100.00μg/ml에서 95.63±18.33, 95.17±17.05, 94.27±20.88%의 세포생존율을 나타내었으며, NDL 추출물은 10.00, 30.00, 100.00 μg/ml에서 94.34±19.25, 96.64±20.39, 108.79±26.98%의 세포생존율을 나타내었다.

실험군과 대조군을 비교하였을 때 100.00μg/ml까지 처리한 RAW 264.7 세포에서 유의적인 차이를 나타내지 않아 독성이 없는 것으로 판단되었다.

-MC/9 cell

실험동물　쥐의　mast　cell인 MC/9 세포는 피부, 림프관 주위 등 생체조직에 널리 분포되어 있다. 비만세포는 알레르기 반응에 중요한 역할을 하고 있으며 활성화 되면 탈과립이 유도되어 세포내 과립에 저장되는 histamine 등 지질 매개물질과 cytokine 등 여러 종류의 화학적 매개물질을 생성한다.

도 8을 참조하면, NDL 추출물은 50.00, 100.00, 200.00μg/ml에서 113.61±13.46, 110.42±2.49, 100.68±2.47%의 세포생존율을 나타내었다. 이에 따라 MC/9 세포에 독성이 없는 것으로 확인되었다.

(6)주름 개선 효과

피부 노화는 자연노화, 외인성 노화로 2종류로 구분되어진다. 이중 외인성노화는 자외선으로 인한 피부노화로 광노화라고 한다. 태양광선 중 자외선은 살균 작용, 비타민 D 합성 등의 효과를 나타내지만, 피부에 과도한 자외선이 자주 노출되면, 피부 안에 도달하여 피부를 자극하고 섬유아세포 및 각질형성세포에 작용하여 ROS를 유발하게 되고, MMPs를 생성하게 된다.

MMPs는 섬유아세포 및 각질형성세포 등 피부에 있는 세포들로부터 분비되는 세포 외 기질(extracellular matrix, ECM)과 기저막(basement membrane, BM) 단백질 성분을 분해에 관련하는 효소의 총칭으로 구체적인 기능과 구조에 따라 interstitial collagenase, gelatinase, stromelysin, membrane-type MMPs로 나뉜다.

MMPs는 피부 구성 물질 glycosaminoglycane(GAG), elastin, collagen, hyaluronic acid의 생산력을 감소시킨다. MMPs는 다양한 원인으로 발현이 증가하여 결합조직에 손상을 주어 깊은 주름을 형성한다. MMPs중에 MMP-1은 진피에 있는 콜라겐을 분해하는 효소로 피부 노화에 영향을 미친다. 진피층은 90.00%이상 콜라겐으로 구성되어 있으며, 그중에 type Ⅰ 콜라겐은 총 콜라겐의 80.00% 이상을 차지하고 있고, type Ⅲ 콜라겐은 약 15.00%를 자지하고 있다. 콜라겐의 주요 역할은 결합조직의 결합력 및 저항력, 세포간의 접착지탱, 세포들 분할 및 분화 과정을 유도한 피부구조를 견고하게 도움을 준다. 이러한 여러 가지 역할 때문에 콜라겐이 감소하게 되면, 주름형성 탄력저하등 피부 노화 형상이 나타난다.

현재 노화작용을 늦추기 위해 여러 가지 약물을 적용하여 사용하고 있으며, 일반적으로 사용되는 주름 개선 약물이나 치료제는 대표적으로 비타민 C 및 그 유도체, 비타민 A 및 그 유도체 retinol 그리고 다양한 항산화제 및 retinyl palmitate, epigallocatechin gallate, adenosine 등을 사용하고 있다.

이에 주름개선 효과를 알아보기 위해 HDFn을 이용한 NDF, NDB and NDL 추출물의 MMP-1 발현량 저해 효과 실험을 실시하였다.

도 9를 참조하면, UV를 15min 동안 HDFn에 조사한 결과, 양성대조군인 adenosine 100.00μg/ml에서는 66.33%의 MMP-1 저해가 나타났다. 그리고 NDF 추출물은 30.00, 100.00μg/ml에서는 MMP-1 저해 효과가 나타나지 않았다. NDB 추출물은 30.00, 100.00μg/ml에서 9.11%, 43.78%의 MMP-1 저해 효과를 나타내었고, 100.00μg/ml에서 유의성이 있는 저해효과를 나타내었다. NDL 추출물은 100.00μg/ml에서만 67.04%의 유의성 있는 MMP-1 저해 효과를 나타내어, 양성대조군 adenosine과 비슷한 저해효과를 갖는 것으로 확인되었다.

황 등 논문에 따르면 HDFn에서 MMP-1의 발현 실험 중에 대조군과 비하여 초석잠 에탄올 추출물 처리한 실험군은 50.00, 100.00, 200.00μg/ml에서 각각 6.40%, 8.00%, 9.70% MMP-1의 발현을 유의적으로 감소시켰고, 양성대조군 ascorbic acid는 100.00μg/ml에서 16.70%로 유의적으로 감소하는 것을 확인하였다(황지연 등, 체피부섬유아세포에서 초석잠 에탄올 추출물의 주름형성 억제 효능. 대한미용학회지;11(4). 293-301. 2015).

위 논문과 비교하면 NDL 추출물에서 100.00μg/ml의 농도에서 67.04%의 MMP-1 억제효과를 확인하였다. 이는 NDL 추출물이 MMP-1 발현억제로 주름개선 효과가 있는 것으로 추측할 수 있다.

(7) 항염 효과

생체에서 나타나는 염증 반응은 외부로부터 여러 종류의 감염, 바이러스, 박테리아, 화학적 물질, 물리적 자극으로 인한 손상받은 부위를 회복시킬 때 일어나는 일종 생물체의 보호 및 방어 반응이다. 염증 반응 지속적으로 나타내면 만성 염증 질환, 과민성 알레르기 질환, 아토피성 피부염, 피부노화 등 다양한 질환을 유발하게 된다. 염증 유발 물질이 침입할 때 대식세포는 신속하게 다양한 cytokine등을 분비한다. 그중 염증과 관여하는 대표적인 cytokine은 interleukin-1β(IL-1β), tumornecrosis factor-α(TNF-α) 그리고 interleukin-6(IL-6)가 있다. 비만세포는 상피세포 아래층과 결합조직에 존재하고 있으며, 비만세포의 과립이 히스타민을 포함하고 있다.

LPS는 그람음성 세균의 외막 구성성분 중 하나로 오래전부터 자극물질로 많이 사용하고 있는 당지질로, 염증 반응 대표적인 세포 실험 중 하나는 RAW 264.7에 소량의 LPS 염증 유발 물질을 처리하면, 활성화된 다양한 아라키돈산 대사산물, 활성산소, cytokine, NO등을 생산 및 방출하게 된다.

-NO 생성량

NO는 인체 내부에 방어 기능을 담당할 뿐만 아니라 신호 전달 기능, 혈관 확장 및 신경 독성 등 여러 가지의 생리적 기능을 수행하고 있다. 염증반응에 대표적인 매개체인 NO는 강한 자유라디칼이다. 외부 자극물질이 신체에 공격할 때, 세균이 몸에 침입할 때 사람이 스스로 보호하기 위해 NO를 많이 분비하게 되며, 과하게 생성되면 조직의 손상과 염증 현상을 초래하여 면역 체계의 이상을 나타나게 되는 것으로 알려져 있다. 뿐만 아니라 염증 현상이 더 심각해지면 과민성 알레르기 질환, 만성 염증 질환, 아토피성 피부염, 피부노화 등 질환이 나타난다.

RAW 264.7 대식세포로 NDF, NDB와 NDL 추출물의 NO 억제율 실험결과를 도 10 내지 12에 각각 나타내었다. 도 10은 NDF 추출물의 실험결과이고, 도 11은 NDB의 실험결과이고, 도 12는 NDL의 실험결과이다.

도 10을 참조하면, 양성 대조군 NDGA는 20.00μM에 84.36±2.43%로 나타났다. 그리고 NDF 추출물은 10.00, 30.00, 100.00μg/ml에서 100.02±1.67, 99.90±1.56, 99.68±1.58%의 NO 생성율을 나타내었다.

도 11을 참조하면, NDB 추출물은 10.00, 30.00, 100.00μg/ml에서 103.20±1.28, 102.61±1.63, 99.01±1.77%의 NO 생성율을 나타내었다.

도 12를 참조하면, NDL 추출물은 10.00, 30.00, 100.00μg/ml에서 97.00±1.07, 90.90±1.29, 59.55±1.45%의 NO 생성율을 나타내었다. NDL 추출물의 경우 농도 30.00, 100.00μg/ml에서 21.90%, 97.35%의 NO 생성 저해율을 보였으며, 이는 유의성 있는 저해효과를 갖는 것으로 확인되었다. 이에 따라서 항원인 LPS로 통해서 유도된 NO 생성량이 NDL 추출물 시료 처리한 실험군에서 감소하는 것을 보이고 양성대조군에 비하여 NDL 추출물 100.00μg/ml 일때 약 2.50 배의 NO 저해율이 확인되며 유의성 있는 감소를 확인하였다.

김 등 논문의 결과를 따르면 LPS로 전 처리한 RAW 264.7 cell에 구멍갈파래 에탄올 추출물 0.10, 1.00, 10.00, 50.00, 100.00μg/ml로 처리하여 NO생성량 나타낸 결과는 농도 의존적으로 유의하게 감소하였고, 특히 50.00 μg/ml 이후부터 대조군과 비교할 때 34.00% 이상의 저해활성 확인하였다(김민지 등, LPS로 유발한 대식세포의 염증반응과 마우스 귀 부종에 대한 구멍갈파래 에탄올 추출물의 항염증 효과. Microbiol. Biotechnol. Lett; 44(4), 479-487. 2016). 안 등 논문에서 붉나무 가지 물과 70.00% 에탄올 추출한 추출물의 NO 저해 능력을 확인하기 위해 LPS로 염증반응 유발하여 20.00, 50.00, 100.00μg/ml로 처리한 후 NO는 시료 농도 의존적으로 감소하여 100.00μg/ml에서 약 30.00% 이상의 NO 생성량이 감소되었다(안대성 등, 붉나무 가지 추출물의 항노화 및 항염증 효과. 대한미용학회지; 13(2), 103-111. 2017).

위의 논문과 비교하면 NDL 추출물 100.00μg/ml에 97.35%의 유의성 있는 NO 생성량 저해 효과를 확인하였다. 이는 타 추출물과 유사한 결과를 나타내어 NO 생성량 저해에 효과적임을 알 수 있었다.

-ERK, JNK and p38 MAP kinase 발현량

MAP kinase는 염증반응에 관련된 신호전달기전으로 세포의 성장, 분화와 연관되어 었다. LPS, cytokine과 같은 물질이 대식세포에 자극을 줄 때, nuclear factor-κB(NF-κB) 염증반응 조절하는 전사인자를 활성화 시키게 되면 COX-2, iNOS 등 단백질 발현이 증가하여 prostaglandin(PG)E₂와 NO 그리고 염증성 cytokine 등 염증 매개물질을 생성하여 염증을 나타낸다. 염증 반응을 유발하며 피부세포를 자극하여 결합조직에 손상을 주어 피부주름과 피부노화에도 영향을 준다.

NF-κB의 활성은 MAPKs에 의해 조절되며 MAPKs는 염증반응 나타날 때 세포내핵 안쪽으로 이동하게 되어 신호전달을 통해서 인산화 된다.

ERK은 전형적으로 세포의 성장, 증식, 분화 및 사멸을 조절하며, 세포의 생존능을 유지하고 증진시키는 세포내 필수적인 kinase로 알려져 있다. ERK 신호전달 경로는 MAPKKK 단계로부터 MAPKK(MEK1, MEK2)를 거쳐 ERK1/2에 도달하는 세단계의 순차적으로 염증성 인자 활성반응을 일으킨다.

JNK는 자외선 조사, 열 충격, 삼투압 불균형 그리고 염증성 cytokine 등의 세포 stress 때문에 활성화되며, 세포의 증식, 분화, 사멸과 연관되어 있다. JNK는 activator protein (AP)-1의 증가 및 c-Jun 인산화를 통해 염증반응을 조절하는 것으로 알려져 있다. JNK 신호전달 경로는 MAPKKK부터 MAPKK(MEK4, MEK7)를 거처 JNK1/2/3의 순서로 염증반응을 일으킨다.

p38 MAPK는 환경적 stress, 외부 자극, 병원체 및 염증성 cytokine에 의해 활성화되며, 염증반응의 중심적인 조절자인 p38 MAPK은 백혈구의 이동과 축적을 유도하는 역할을 가지고 있다. 또한 Metalloproteinase, TNF-α, IL-6와 NO의 발현을 조절할 수 있다. p38 MAPK 신호전달 경로는 MAPKKK부터 MAPKK(MEK3, MKK6)를 거처 p38 MAPK의 순서로 염증 반응을 나타낸다.

남천 추출물은 염증조절 인자를 조절함으로써 피부의 염증을 억제하여 피부세포의 자극에 대한 결합조직의 손상을 최소화함으로써 피부주름과 노화에 개선에 영향을 미칠것으로 본다.

MAPKs 인산화 발현량을 확인하기 위해 10.00, 30.00, 100.00μg/ml로 실험을 실시한 결과를 도 13에 나타내었다.

도 13을 참조하면, LPS를 처리한 실험군에 유도된 MAPKs 인산화 및 처리하지 않는 군에 비하여 인산화를 나타냈고, NDL 추출물에 의하여 ERK, p38, JNK 인산화 발현량이 모두 감소하는 것을 확인하였다.

김 등 논문결과를 보면, LPS로 처리한 RAW 264.7 cell에 감태 70.00% 에탄올 추출물 100.00, 300.00, 500.00μg/ml로 시료를 처리하여 MAP kinase family인 ERK, p38, JNK의 인산화 모든 농도 의존적으로 억제되는 것을 확인하였다(김미경 등, 대식세포에서 감태 에탄올 추출물의 NF-κB/MAPK 신호전달 억제를 통한 항염증 효과. 한국키틴키토산학회지; 21(4), 236-241. 2016). 김 등 논문에 산딸기 잎 70.00% 에탄올 추출물 25.00, 50.00, 100.00 μg/ml로 실험한 결과는 LPS를 자극으로 인해 증가된 인산화는 산딸기 잎 추출물에 의해서 농도 따라서 억제된 것을 확인하였다(김대용, 2016). 이에 NDL 추출물이 감태, 산딸기 잎 추출물에 비하여 저농도에서 ERK, p38 MAPK, JNK의 인산화 저해로 염증 반응을 억제한다는 결과를 확인하여 타추출물 보다 항염작용이 높음을 확인하였다.

-Cytokine 생성량

Cytokine는 면역세포에서 분비되는 단백질로, 면역반응이 일어날 때 염증반응 매개인자로 정상적 조직에도 발현된다. IL-6와 IL-1β, TNF-α와 같이 pro-inflammatory cytokine이 과도하게 분비되면, NO과 PGE2의 발현에 영향을 주어 각종 심각한 조직손상 또한 전신의 염증 반응을 일어킨다. 아토피 피부염은 가장 대표적인 알레르기성 질환으로 도시화가 진행됨에 따라 발병율이 계속 증가하고 있다. 주로 피부 건조증, 소양감을 있는 만성적인 재발성 염증성 피부질환으로 장기간의 치료에도 불구하고 어려운 난치성 질환으로 사람의 삶에 매우 많은 영향을 미치는 것으로 알려져 있다.

IL-6는 급성기 반응, 조혈 작용 그리고 면역반응을 조절하는 pleiotropic effect를 가지고 있다. 감염, 외상, stress등 자극을 받을 때 IL-6는 급성기 단백질 합성을 촉진하여 혈청 내 수치도 급속히 증가하게 되고, 백혈구 증가, 혈소판 증가하며 피브리노겐, 림프구 활성, 아밀로이드 전구기 단백질, C-반응성 단백질을 만들 뿐만 아니라 B세포의 분화 및 성장에도 연관성이 있다.

IL-1β는 T세포의 활성화를 시키고, 단핵구, 림프구 등의 세포 염증부위 침윤을 증가시키게 되어, 피부세포 재생에 영향을 준다.

TNF-α는 비만세포 또는 T임파구에서 생성되어 병원성 미생물 침입할 때 방어 작용을 수행하는 cytokine이다. 하지만 다량의 TNF-α를 생성하게 되면 피부 알레르기 발현　부위에서 비만세포가 분비되어 피부조직에서 염증반응을 촉진시킨다

NDL 추출물의 IL-6 및 IL-1β 발현량 확인한 결과를 도 14 및 도 15에 나타내었다.

도 14를 참조하면, IL-6 발현량이 양성대조군 NDGA는 19.59%로 나타났으며, NDL 추출물은 농도 의존적으로 30.00μg/ml부터 12.34%, 19.37%로 유의적으로 감소하였다. NDL 추출물 100.00μg/ml에서 양성대조군 NDGA과 유사한 저해 효과를 갖는 것으로 확인하였다.

도 15를 참조하면, IL-1β발현량이 양성대조군 NDGA는 19.35%로 나타났으며, NDL 추출물은 30.00μg/ml부터 22.59%, 89.13%로 유의적으로 감소하였다. 100.00 μg/ml에서 양성대조군 NDGA 보다 4.60배 더 높은 저해 효과를 갖는 것으로 확인되었다.

NDL 추출물의 TNF-α 발현량 확인한 결과를 도 16에 나타내었다. 도 16을 참조하며, 양성대조군 dexamethasone은 0.10, 1.00μM에서 농도 의존적으로 46.87±1.85, 44.18±1.82% 생성율을 확인하였으며 45.37%, 49.55%의 억제를 나타내었다. NDL 추출물은 농도 의존적으로 62.85±3.54, 61.76±3.98, 57.99±1.20%의 생성율을 확인하였으며, 200.00 μg/ml에서 28.06%의 유의적인 억제를 나타내었다.

이 등 논문을 보면 세신 에탄올 추출물 1.00, 10.00, 100.00μg/ml로 처리하여 IL-6, IL-1β및 TNF-α의 생성량은 농도 의존적으로 감소되는 것을 확인하였다(이옥진 등, 세신 주정추출물이 LPS로 유발된 RAW 264.7 Cell의 염증 및 항산화 반응에 미치는 영향. 한방재활의학과학회지; 24(3), 99-110. 2014). 정 등의 논문에서 좁은잎천선과나무잎 70.00% 에탄올 추출물 25.00, 50.00, 100.00μg/ml로 처리하여 IL-6, IL-1β 및 TNF-α의 생성량은 농도 의존적으로 감소되는 것을 확인하였다(정용환 등, 좁은잎천선과나무(Ficus erecta var. sieboldii) 잎 추출물이 대식세포 RAW 264.7 세포에서 미치는 항산 화 및 항염증 효과. 한국자원식물학회지; 31(4), 303-311. 2018).

위의 논문결과와 비교시 NDL 추출물도 이와 유사한 농도에서 염증과 관련된 cytokine를 효과적으로 억제하는 것으로 나타나 항염작용에 효과적임을 확인하였다.

(8)항알레르기 효과

-Chemokine 생성량

알레르기성 질환은 유병률이 계속 증가하여 유년기에 특히 높게 나타나며, 현대사회의 중요한 질병중 하나이다. 이로 인하여 알레르기 질환에 효과적인 물질을 개발하기 위해 많은 연구가 진행되고 있고, 그 중에 RANTES, TARC 등 같은 chemokine는 아토피환자 혈액에서도 많이 검출되어 알레르기반응에 중요한 표적물질로 연구되고 있다.

Chemokine은 백혈구의 이동 및 활성화를 조절하는 작용을 수행하며 조직적의 염증세포의 침윤도 조절할 수 있다. T helper(Th) 2 면역세포는 CC chemokine receptor type 4(CCR4)를 발현하고 CC chemokine인 macrophage-derived chemokine (MDC/CCL22) 및 thymus and activation regulated chemokine(TARC/CCL17)는 CCR4 수용체로 통해서 선택적으로 발현된다. MDC/CCL22은 keratinocyte 그리고 epithelial 세포에서 분비된다. TARC/CCL17은 흉선에서 분비하여 endothelial 세포, monocyte-derived dendritic 세포 또한 keratinocyte에서 생성된다. Th2-type chemokine에 속하는 MDC/CCL22 및 Th1-type chemokine은 regulated on activation normal T-cell expression andsecreted(RANTES/CCL5)는 아토피성 피부염 그리고 염증성 알레르기 질환에 관련해서 많이 검출된 pro-inflammatory chemokine이다. 또한 Th1 type의 chemokine은 수지상 세포, T세포, 자연살해세포(natural killer cells), 단핵구, 호염구 및 호산구에서 화학 주성의 활성을 매개한다.

HaCaT세포를 사용해서 chemokine 지표성분 생성량 확인하기 위해 NDL 추출물은 50.00, 100.00, 200.00μg/ml 농도로 실험을 실시하였다. HaCaT에서 TNF-α + IFN-γ10.00 ng/ml을 처리하였다.

chemokine 지표성분인 TARC의 생성량은 도 17에 나타내었고, RANTES의 생성량은 도 18에 나타내었다.

도 17을 참조하면, 양성대조군 dexamethasone는 농도 0.10, 1.00μM에서 75.41 ±7.73, 19.90 ±5.73%의 생성량을 나타냈으며, 이는 24.59%, 80.09%로 감소하는 것으로 확인되었다. NDL 추출물은 농도 50.00, 100.00, 200.00μg/ml에서 25.00 ±21.86, 12.00 ±8.25, -26.40 ±4.72%로 나타났고, 이는 농도 의존적으로 TARC 생성량을 유의성 있게 75.01%, 87.98%, 126.35%로 감소시켰다. 이러한 결과는 NDL 추출물의 알레르기 반응의 표적 물질의 감소를 나타낸 것이다.

도 18을 참조하면, 양성 대조군 dexamethasone는 농도 0.10, 1.00μM에서 47.40 ±0.61, 25.50 ±1.74%의 생성량을 나타냈으며, 이는 52.59%, 74.48%로 감소하는 것이다. 그리고 NDL 추출물은 농도 50.00, 100.00, 200.00μg/ml에서 73.10 ±8.31, 80.60 ±1.39, 59.20 ±2.66%의 생성량을 나타냈으며, 이는 유의성 있게 26.94%, 19.40%, 40.77%로 감소한 결과이다. 이에 TNF-α + IFN-γ로 통해서 유도된 RANTES 생성량이 NDL 처리한 실험군에서 유의성 있게 감소하는 것을 확인하였으며, 이는 알레르기 반응의 표적물질의 감소를 나타낸다.

선행연구를 보면 임 등의 논문에 박하 100.00% 메탄올 추출한 추출물로 실험한 결과는 최대농도 50.00μg/ml에서 TNF-α와 IFN-γ 처리한 실험군과 대조군을 비교하여, 한국산 및 중국산 박하 추출물의 모든 농도에서 농도 의존적으로 RANTES 생성량을 현저히 억제시키는 것을 확인하였다(임혜선 등, 한국산과 중국산 박하의 항염증 효과에 관한 비교연구. 생약학회지; 43(3), 231-238. 2012). 서 등의 논문을 보면 오매 70.00% 에탄올 추출물 실험한 결과는 HaCaT cell에 TNF-α 및 IFN-γ 처리하여 TARC 및 RNATES의 발현을 증가하는 것을 확인하고 양성대조군에 유전자의 발현은 유의적으로 감소하였다. 오매추출물 처리한 후 TARC 및 RNATES의 발현은 농도 의존적으로 억제되며, 양성대조군과 비하여 유의성 있는 결과를 확인하였다(서창섭 등, 오매의 다성분 동시분석 및 항알러지 효과. 생약학회지; 43(4), 279-285. 2012). 강의 실험을 보면 감태 에탄올 추출물로 실험한 결과는 HaCaT 에서 TNF-α/IFN-γ 처리하여 자극을 준 다음에 TARC의 발현량이 약 7배로 증가하였다. 감태 에탄올 추출물 31.30, 62.50, 125.00 μ로 처리한 후 TARC의 발현량이 농도의존적으로 억제하는 것을 확인하였다. 이러한 결과는 NDL는 염증반응을 억제하는 효과와 알레르기 반응의 표적물질인 chemokine 생성 저해 효과를 확인하였다(강나래 등, 피부각질형성세포에서 TNF-α/IFN-γ로 유도된 염증반응에 대한 감태 에탄올 추출물의 억제 효과. 한국키틴키토산학회지; 22(2), 82-88. 2017).

-Histamine 생성 억제 효과

알레르기는 피부나 점막, 호흡기 등을 통해 침입하는 외부물질에 대한 체내의 과민반응으로 인해 나타나는 질병이다. 과민 반응으로 인해 인체의 기능에 여러 가지 문제를 일으키며 만성화될 수 있는 것이 특징이다.

알레르기 질환은 4가지 유형으로 분류할 수 있으며, 이 중 제1형 과민반응은 널리 알려져 있는 알레르기 반응으로 음식이나 환경 알레르기원에 의해 일어난다. 그중에 아토피성 피부염 및 알레르기성 비염 등 알레르기 질환들이 포함되어 있다. 비만세포는 즉시형 과민반응으로 넓은 부위에 존재하며 아토피 피부염 같은 염증반응의 피부 병변에 관련된 주요 세포중 하나이다. 아토피 피부염은 Immunoglobulin E(IgE)항체와 비만세포 및 호염구 세포에 의해 일어난다. 비만세포 및 호염구의 표면에 존재하는 IgE 수용체에 알레르기원과 IgE 복합체가 결합하면, 비만세포는 활성화 되며, 다양한 protease나 histamine물질들을 분비하여, 다양한 염증 유발물질인 cytokine을 생산 분비하게 되는데, 여기에는 IL-6, TNF-α등이 포함되어 있다. Histamine은 비만세포의 탈과립에 분비되는 물질중에서 제일 많이 알려져 있으며 즉식형 과민반응과 관련된 중요한 인자들 중의 하나이다.

아토피 피부염은 유전적인 요소와 환경적인 요소 모두 연관되어 복합적인 질환으로 인식되어 발병 기전은 불확실 하지만, 면역학적 측면에 보면 비만 세포, T 세포, 랑게르한스세포, 호상구 등과 같은 세포들과 cytokine, immunoglobulin등과 같은 인자들이 연관되어 있다고 알려져 있다.

아토피 자극 유발물질로 사용되는 Compound 48/80은 비만세표 내의 칼슘성분의 수준을 증가해 주고 아나필락시 반응을 유발할 때 가장 많이 사용되는 것이다.

MC/9 세포를 사용해서 histamine 생성량이 확인하기 위해 NDL 추출물을 50.00, 100.00, 200.00 μg/ml 농도로 실험을 실시하였다.

도 19를 참조하면, Compound 48/80 처리한 실험군은 대조군에 비하여 유의한 증가를 나타내었고, NDL 추출물은 50.00, 100.00, 200.00μg/ml에서 58.48±11.94, 53.13±8.70, 23.59±10.07%의 histamine 생성율을 보였다. 이는 Histamine유리 수준이 농도 의존적으로 41.52%, 46.87%, 76.43% 유의적인 억제를 나타내었다. 이러한 결과는 NDL 추출물이 비만세포에서 histamine 유리 억제하는 효과를 나타내므로 아토피성 피부염의 조절 및 개선에 도움을 줄 수 있는 기능성이 있다는 것을 보여주는 결과이다.

(9)피부세포 재생 효과

각종 환경 오염물질, 자외선 조사 등 외부 요소 및 stress, 영양결핍, 나이의 증가 등 인체 내재요소에 따라서 피부세포들이 손상된다. 피부가 상처를 받으면 정상적인 상처치유 과정은 4 단계로 구성되어 있다. 즉, 지혈과정, 염증과정, 증식과정, 상처 수축과정으로 거치지만 각 단계에서 불균형이 나타나면 상처치유가 늦어지게 되고, 상처 치유 후 흉터가 남는다. 상처를 발생할 때 섬유아세포는 상처부위 쪽으로 이동 및 증식하며 상처 부위를 수축 시키면서 진피층에 세포외 기질인 교원질 등을 합성해주는 역할을 수행하기 때문에 섬유아세포의 증식은 매우 중요하다. 반면, 세포의 증식이 원활하지 않으면 피부에 주름을 생기고 탄력을 손실되면서 각질화 문제를 유발한다. 이와 같은 이유로 천연물의 유효성분들은 섬유아세포의 증식과 콜라겐의 생성을 촉진해주고 주름의 예방도 효과적이고 노화 현상까지도 지연할 수 있다.

HDFn 섬유아세포를 사용해서 NDL 추출물의 세포 재생 효과를 확인하기 위해 10.00, 30.00, 100.00μg/ml로 실험을 실시하였다. 0.20% FBS 함유된 배지에 시료를 처리하여 24 hrs, 48 hrs 후 후실험 결과를 확인하였다.

도 20을 참조하면, 24 hrs에 나타나는 결과는 NDL 추출물 10.00, 30.00, 100.00μg/ml 농도에서 1.20±11.38, 12.76±5.15, 41.54±2.89%의 세포 증식을 나타내었다. NDL 추출물은 농도 100.00μg/ml에서 대조군에 비하여 유의성 있는 증가를 나타내었다. 그리고 농도 의존적으로 세포 증식효과를 확인하였다. 48 hrs에 나타나는 결과에서 NDL 추출물은 10.00, 30.00, 100.00μg/ml에서 3.32±12.42, 34.22±11.52, 66.11±6.45%의 세포 증식을 나타내었다. NDL 추출물은 농도 30.00, 100.00μg/ml에서 농도 의존적으로 대조군에 비하여 유의성 있는 세포 증식효과를 나타내었다.

박 등의 논문에서는 생강나무 물 추출물 200.00μg/ml에 처리한 실험군은 대조군과 비교하면 33.80%의 세포생존율을 확인 되어 세포증식이 유의하게 증가하는 것을 나타났다(박금주 등, 생강나무 추출물의 광노화에 의한 주름형성 억제 효과. 대한화장품학회지; 35(4), 317-323. 2009). 장 등의 논문에 70.00% 주정로 추출한 인삼추출물은 100.00 μg/ml로 처리할 때 실험군은 대조군에 비하면 농도 의존적으로 섬유아세포의 증식 효과를 확인하였다(장정화 등, Hairless Mice에서 UVB로 유도된 피부손상에 인삼추출물(Ginseol K-b1)이 미치는 영향. 동아시아 식생활학회지; 22(2), 224-230. 2012). 김 등의 논문에서 마 에탄올 냉침, 온침 추출물로 처리하였을 때 냉침추출물 200.00 mg/ml 처리할 때 9.70%로 나타냈고, 온침추출물 200.00 mg/ml에 14.00%로 더 높은 증식률을 나타내었다(김대성 등, 마의 항노화 및 피부 보습 효과. 동의생리병리학회지; 25(3), 425-430, 2011).

이와 같은 결과는 논문 결과와 비교하여 NDL추출물이 세포재생에 대한 효과가 저농도에서 높게 나타나고, 세포 재생에 효과적인 것을 확인하였으며, 이러한 결과는 피부 재생에 효과적인 것으로 보인다.

3. 결론

(1)70.00%의 에탄올로 추출한 NDF 추출물의 수율은 18.50%, NDB 추출물의 수율은 10.20%, NDL 추출물의 수율은 24.30%로 나타났다.

(2)총 폴리페놀 함량은 농도 1000.00 mg/ml에서 NDF, NDB, NDL 추출물 각각 67.93, 44.52, 85.82 mg/g으로 확인하였다.

(3)총 플라보노이드 함량은 농도 1000.00mg/ml에서 NDF, NDB, NDL 추출물 각각 2.37, 5.05, 12.96 mg/g으로 나타났다.

(4)항산화 실험 결과는 NDF, NDB, NDL 추출물 모두 농도 의존적으로 증가하는 것으로 나타났다. 10.00μg/ml에부터 free radical 소거 활성이 유의성 있게 나타났다. 특히 NDF, NDL 추출물은 농도 100.00μg/ml에서 양성대조군인 Ascorbic acid 과 대등한 효능을 갖는 것으로 확인되었다.

(5)주름을 형성에 영향을 주는 주요인자인 MMP-1에 대한 발현억제 효과는 NDB 추출물은 농도 30.00μg/ml에서 9.11%, 100.00μg/ml에서 43.78%의 MMP-1 저해효과를 나타냈으며, 농도 100.00μg/ml에서 유의성 있게 감소하였다. NDL 추출물은 농도 100.00μg/ml에서 67.04%의 MMP-1 저해 효과를 갖는 것으로 확인되었고, 양성대조군 Adenosine 100.00 μg/ml과 유사한 저해 효과로 확인되었다.

(6)NO 생성량이 NDL 추출물에서 감소하는 것을 확인하였으며 양성대조군과 비교시 100.00μg/ml일 때 약 2.50배의 NO 생성량 저해율을 나타내었다. MAPKs 인산화 발현량을 확인한 결과, NDL 추출물의 농도에 따라서 ERK, p38 MAPK, JNK 인산화 모두 발현량이 감소되는 것을 확인하였다. NDL 추출물의 IL-6 및 IL-1β의 발현량 감소 효능은 농도 30.00μg/ml부터 유의성 있게 나타났다. IL-6는 농도 100.00μg/ml에서 19.37%로 나타나 양성대조군 NDGA 20.00uM과 유사한 감소를 확인하였다. IL-1β는 농도 100.00μg/ml에서 89.13%로 나타났고, 양성대조군 NDGA 20.00 μM보다 4.60배 높은 감소를 확인하였다. TNF-α는 농도 200.00μg/ml에서 유의성 있는28.06%의 억제율을 확인하였다.

(7)항알레르기 효과를 평가하기 위하여 수행한 chemokine 생성저해 효과에서, TNF-α + IFN-γ에 의해서 유도된 TARC 생성량은 NDL 추출물 농도 50μg/ml에서 75.01%, 100μg/ml에서　87.98%, 200μg/ml에서 126.35%의 저해효과를 나타내어 양성대조군 보다 더 우수한 감소효과를 갖는 것으로 확인되었다. RANTES 생성량은 NDL 추출물 농도 50μg/ml에서 26.94%, 100μg/ml에서 19.40%, 200μg/ml에서 40.77%의 저해 효과를 나타내었다. Histamine 생성량 확인한 결과는 NDL 추출물 농도 50.00μg/ml에서 58.48%, 100.00μg/ml에서 53.13%, 200.00μg/ml에서 23.59%의 histamine 생성율을 확인하였다. Histamine유리 수준이 농도 의존적으로 41.52%, 46.87%, 76.43% 억제하는 것을 확인하였다.

(8) 세포 재생실험 결과는 24 hrs에 NDL 추출물 농도 100.00μg/ml에서 41.54%로 유의하게 세포 증식율을 확인하였다. 48 hrs에 NDL 추출물 농도 30.00μg/ml에서 34.22%, 100.00μg/ml에서 66.11%로 유의한 결과를 확인하였다.

이상의 실험결과를 종합하여 볼때, 남천 추출물은 항산화 효과, 항염 효과, 항알레르기 효과, 주름 개선 효과 그리고 세포 재생 효과가 우수함을 확인하였다. 따라서 남천 추출물이 함유된 피부외용 조성물는 항산화 효과, 주름 개선 효과 그리고 세포 재생 효과가 있어서 피부의 노화를 억제하고, 피부를 개선하며, 피부의 탄력성을 증가시키는 등 우수한 기능성을 갖는다.

(실시 예:피부외용 조성물 제조)

1. 피부외용 조성물 제조

남천 추출물과 긴털비름 발효추출물을 이용하여 로션제 형태의 피부외용 조성물을 제조하였다.

남천 추출물은 상술한 실험에 사용된 남천 추출물(NDL)을 이용하였다. 그리고 긴털비름 발효추출물은 아래와 같은 방법으로 추출하였다.

긴털비름 잎 100g에 대하여 당밀 20g을 혼합하고 발효균주로 아스퍼질러스 오리자에(Aspergillus oryzae)를 0.2g 첨가한 후 30℃에서 40일 동안 발효시켰다. 그리고 발효된 발효물에 물 300g을 가한 후 진공(150torr)하에서 70℃로 6시간 동안 진공추출하였다. 진공추출 후 400mesh 여과지로 1차 여과한 후 1000rpm에서 15min 동안 원심분리하여 상층액을 whatman No. 2 여과지로 2차 여과하여 긴털비름 발효추출물을 얻었다.

제 1시험샘플은 세테아릴알코올 1.0중량%, 글리세릴스테아레이트 1.6중량%, 비즈왁스 0.5중량%, 하이드로제네이티드 레시틴 0.5중량%, 네오펜틸글라이콜디카프레이트 3.0중량%, 하이드로제네이트드폴리데센 4.0중량%, 카프릭트리글리세라이드 2.0중량%, 사이클로펜타실록산 5.0중량%, 토코페릴아세테이트 0.2중량%, 디메치콘 0.3중량%, 프로필파라벤 0.1중량%, 트리소듐이디티에이 0.02중량%, 메칠파라벤 0.2중량%, 글리세린 6.5중량%, 디프로필렌글라이콜 4.5중량%, 잔탄검 0.03중량%, 카보머 0.16중량%, 포타슘하이드록사이드 0.071중량%, 페녹시에탄올 0.2중량%, 디포타슘글리시리제이트 0.1중량%, 남천 추출물 5.0중량%, 잔량의 정제수를 배합하여 제조하였다.

그리고 제 2시험샘플은 세테아릴알코올 1.0중량%, 글리세릴스테아레이트 1.6중량%, 비즈왁스 0.5중량%, 하이드로제네이티드 레시틴 0.5중량%, 네오펜틸글라이콜디카프레이트 3.0중량%, 하이드로제네이트드폴리데센 4.0중량%, 카프릭트리글리세라이드 2.0중량%, 사이클로펜타실록산 5.0중량%, 토코페릴아세테이트 0.2중량%, 디메치콘 0.3중량%, 프로필파라벤 0.1중량%, 트리소듐이디티에이 0.02중량%, 메칠파라벤 0.2중량%, 글리세린 6.5중량%, 디프로필렌글라이콜 4.5중량%, 잔탄검 0.03중량%, 카보머 0.16중량%, 포타슘하이드록사이드 0.071중량%, 페녹시에탄올 0.2중량%, 디포타슘글리시리제이트 0.1중량%, 남천 추출물 5.0중량%, 긴털비름 발효추출물 3.0중량%, 잔량의 정제수를 배합하여 제조하였다.

그리고 대조샘플은 세테아릴알코올 1.0중량%, 글리세릴스테아레이트 1.6중량%, 비즈왁스 0.5중량%, 하이드로제네이티드 레시틴 0.5중량%, 네오펜틸글라이콜디카프레이트 3.0중량%, 하이드로제네이트드폴리데센 4.0중량%, 카프릭트리글리세라이드 2.0중량%, 사이클로펜타실록산 5.0중량%, 토코페릴아세테이트 0.2중량%, 디메치콘 0.3중량%, 프로필파라벤 0.1중량%, 트리소듐이디티에이 0.02중량%, 메칠파라벤 0.2중량%, 글리세린 6.5중량%, 디프로필렌글라이콜 4.5중량%, 잔탄검 0.03중량%, 카보머 0.16중량%, 포타슘하이드록사이드 0.071중량%, 페녹시에탄올 0.2중량%, 디포타슘글리시리제이트 0.1중량%, 잔량의 정제수를 배합하여 제조하였다.

2. 항산화활성 측정

각 피부외용 조성물 샘플의 항산화 활성을 측정하였다. 항산화 활성은 Blois의 방법을 변형하여 측정하였다. 샘플 시료 2mL에 0.2mM의 DPPH(1,1-diphenyl-2-picryl hydrazyl)용액 2mL를 혼합한 후 30분간 방치한 다음 517nm에서 흡광도를 측정하였다. 라디칼 소거 활성능은 시료 첨가구와 무첨가구의 흡광도 감소율로 나타내었다. 라디칼 소거 활성능은 다음과 같은 식에 의해 계산하여 그 결과를 하기 표 3에 나타내었다. 라디칼소거활성능(%) = (1-시료첨가구의 흡광도/무첨가구의 흡광도)×100

구분	라디칼소거활성능(%)
제1시험샘플	49.5±0.65
제2시험샘플	65.4±0.90
대조샘플	23.7±0.81

상기 표 3의 결과를 참조하면, 제 1 및 제 2시험샘플은 대조샘플에 비해 라디칼소거활성능이 훨씬 더 높게 나타났다. 이는 남천추출물을 첨가한 경우 항산화 효과를 높일 수 있음을 의미한다. 그리고 제 1시험샘플과 제 2시험샘플을 비교시, 제 2시험샘플의 라디칼소거활성능이 더 높게 나타났다. 남천추출물을 단독으로 사용하는 경우보다 긴털비름 발효추출물을 함께 사용하는 경우 항산화 효과가 더 우수한 것으로 확인되었다. 이는 남천추출물과 긴털비름 발효추출물이 더해지는 시너지 효과에 의해 항산화활성을 크게 향상시킨 결과로 추정된다.

3. 피부테스트 실험

피부 자극 정도를 알아보기 위해 제 1시험샘플 및 제 2시험샘플을 이용하여 피부 테스트를 실시하였다. 피부 테스트를 위해 총 20명의 남녀(평균연령 46세)의 등 부위에 시료를 함유한 특수한 첩포(IQ chamber,Chemotechnique, Sweden)를 붙인 후 24시간이 경과하여 떼어내고 30분 후 판독하는 표준화된 안전성 평가방법인 24h single epicutaneous patch test로 수행하였다. 피부의 반응정도는 홍반, 부종, 가피 및 얕은 궤양 등에 관한 ICDRG(international contact dermatitis research group) 평가 기준표에 의해 1~4점으로 결정하여 총 평균값으로 기록하였다. 피부테스트 실험결과를 하기 표 4에 나타내었다.

피부자극의 개연성은 평균평점기준으로 전체 피시험자의 20%인 4명 이상에서 피부반응 2 이상의 반응이 있는 경우로 약 평균평점 45 이상인 경우이다(ICDRG score index 0~15: 피부 자극 없음, 15~25: 피부 자극이 없는 수준의 미약한 홍반, 25~45: 경미한 홍반과 부종으로 추가 확인시험 필요, >45:피부자극의 개연성이 있음).

구분	피부자극도
제1시험샘플	＜1.5
제2시험샘플	＜1.5

상기의 표 4의 결과로부터, 2종의 샘플들 모두 피시험자들에게 유의한 피부자극을 일으킬만한 홍반이나 부종반응을 나타내지 않은 것으로 확인되었다. 따라서 본 발명의 피부외용 조성물은 피부에 자극 없이 안전하게 사용할 수 있음을 확인할 수 있었다.

이상, 본 발명은 일 실시 예를 참고로 설명되었으나 이는 예시적인 것에 불과하며, 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 이로부터 다양한 변형 및 균등한 실시 예가 가능하다는 점을 이해할 것이다. 따라서 본 발명의 진정한 보호 범위는 첨부된 청구범위에 의해서만 정해져야 할 것이다.

Claims (11)

1. 남천(Nandina domestica Thunb)으로부터 추출한 남천 추출물을 함유하는 것을 특징으로 하는 남천 추출물을 이용한 항염 및 항알레르기 활성을 갖는 피부외용 조성물.
2. 제 1항에 있어서, 상기 남천 추출물은 상기 남천에 물, 탄소수 1 내지 4의 저급 알코올, 다가 알코올 또는 이들의 혼합물로부터 선택된 적어도 어느 하나의 추출용매를 가하여 추출한 것을 특징으로 하는 남천 추출물을 이용한 항염 및 항알레르기 활성을 갖는 피부외용 조성물.
3. 제 1항에 있어서, 상기 남천 추출물은 상기 남천의 잎으로부터 추출한 것을 특징으로 하는 남천 추출물을 이용한 항염 및 항알레르기 활성을 갖는 피부외용 조성물.
4. 제 3항에 있어서, 상기 남천 추출물은 상기 남천의 잎에 에탄올을 가해 20 내지 30℃에서 60 내지 80시간 동안 추출한 것을 특징으로 하는 남천 추출물을 이용한 항염 및 항알레르기 활성을 갖는 피부외용 조성물.
5. 제 1항에 있어서, 상기 남천 추출물은 항산화 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 남천 추출물을 이용한 항염 및 항알레르기 활성을 갖는 피부외용 조성물.
6. 제 1항에 있어서, 상기 남천 추출물은 피부 주름개선 효과를 갖는 것을 특징으로 하는 남천 추출물을 이용한 항염 및 항알레르기 활성을 갖는 피부외용 조성물.
7. 제 1항에 있어서, 상기 남천 추출물은 피부세포 재생효과를 갖는 것을 특징으로 하는 남천 추출물을 이용한 항염 및 항알레르기 활성을 갖는 피부외용 조성물.
8. 제 1항에 있어서, 상기 남천 추출물은 항염 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 남천 추출물을 이용한 항염 및 항알레르기 활성을 갖는 피부외용 조성물.
9. 제 1항에 있어서, 상기 남천 추출물은 항알레르기 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 남천 추출물을 이용한 항염 및 항알레르기 활성을 갖는 피부외용 조성물.
10. 제 1항에 있어서, 긴털비름(Amaranthus hybridus)의 발효물로부터 추출한 긴털비름 발효추출물을 더 함유하는 것을 특징으로 하는 남천 추출물을 이용한 항염 및 항알레르기 활성을 갖는 피부외용 조성물.
11. 제 10항에 있어서, 상기 긴털비름 발효추출물은 긴털비름 100중량부에 대하여 당 10 내지 30중량부를 혼합하고 발효균주를 첨가한 후 20 내지 40℃에서 20 내지 60일 동안 발효시킨 발효물을 진공추출하여 수득한 것을 특징으로 하는 남천 추출물을 이용한 항염 및 항알레르기 활성을 갖는 피부외용 조성물.

Images