KR20210091207A - 신속한 pcr 방법 - Google Patents

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KR20210091207A
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루크 티. 다움
제럴드 더블유. 피셔
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롱혼 백신즈 앤드 다이어그나스틱스, 엘엘씨
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Abstract

미생물 서열을 qPCR에 의해 신속하고 비용-효율적으로 분석하기 위한 보강된 방법을 개시한다. 이러한 방법은 항생제, 화학요법 또는 다른 화학적 화합물에 대해 내성 또는 민감성을 부여하는 원인 유전자와 같이 특정 유전자의 대립유전자 변형, SNP 및 유전자 변형을 식별한다. 적절한 게놈 영역을 선택함으로써, 주요 항생제에 대해 내성을 부여하는 돌연변이를 qPCR에 의해 동정할 수 있다. 또한, 본 방법은 샘플에서 이종-내성 균주, 예를 들어 돌연변이 및 야생형 뉴클레오티드 둘다를 포함하는 균주 집단을 동정할 수 있다. 돌연변이 영역에 효과적으로 결합하는 적절한 것을 선택함으로써, 내성 부여 돌연변이를 식별할 수 있다. 본 방법은 인플루엔자 바이러스와 같은 바이러스 물질, 결핵 박테리아와 같은 박테리아 물질 및 암 세포로부터 유래된 서열에 대해 유용하다.

Description

신속한 PCR 방법
관련 출원에 대한 참조
본 출원은 2019년 8월 5일자 미국 가출원번호 62/882,831, 2018년 11월 30일자 미국 가출원 번호 62/773,566 및 2018년 11월 9일자 미국 가출원번호 62/758,173에 대해 우선권을 주장하며, 이들 각각은 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 구체적으로 포함된다.
발명의 기술 분야
본 발명은 신속한 PCR 방법에 의해 게놈의 유전자 변형을 식별하기 위한 도구, 조성물 및 방법, 보다 상세하게는 유기체의 약물 민감성을 신속하게 식별하기 위한 고 성능 핵산 분석법에 관한 것이다.
마이코박테리움 투베르쿨로시스 (Mycobacterium tuberculosis, MTB)는, 결핵의 원인 물질로서, 이환율과 사망률이, 특히 HIV 감염 환자들에서 현저한, 전염성이 높은 세균성 병원체이다. 1997년 이래로, 결핵은 남아프리카에서 주요 사망 원인으로 남아있으며, 이들 국가에서 증가하고 있는 HIV 유행과 통계학적으로 연관되어 있다. 아울러, 활동형 MTB 환자에 대한 효과적인 치료 조치가 다약제 내성 (MDR) 및 광역 약물-내성 (XDR) 임상 분리주의 사례 증가로 인해 악화되고 있다.
MTB 및 HIV 둘다가 유행하고 있는 전세계 많은 자원 부족 지역에서는 현미경 검사가 MTB를 진단하기 위한 기초로 남아있다. 그러나, MTB를 보유한 다수의 HIV 감염 환자들은 스미어 검사에서 음성이고, 현미경 검사는 항생제 내성에 대한 정보를 제공하지 않는다. 다약제 내성 (MDR) 및 광역 약물-내성 균주 (XDR)의 출현은 표준적인 MTB 치료 용법을 무력하게 만든다. 한 실험에 따르면, 남아프리카에서 HIV에 감염된 TB 환자들 중 약 20%가 MDR MTB이다. 신속한 MTB 검출과 효과적인 치료 개시가 전파를 줄이고 치료 경과를 개선하는데 있어 중요하다. 세페이드의 유전자 엑스퍼트 (Xpert)의 출시로 MTB 진단이 개선되었고, 리팜핀 내성의 증거를 제시할 수 있게 되었지만, 다른 약물에 대한 정보는 제공되지 않는다. 또한, 여러 현미경 검사 실험실에서는 자원이 부족한 환경에서 Xpert 검사를 수행하는 것 역시 실현 불가능하다. qPCR을 위해 객담 시료를 중앙으로 효율적으로 이송할 수 있다면, 고도로 훈련된 인력과 중앙 또는 지역 실험실에서 이용가능한 기반 시설을 활용할 수 있는 기회가 제공된다.
MDR 결핵 균주는 제1선 항생제인 리팜핀 (RIF) 및 이소니아지드 (INH)에 내성이고, XDR MTB 균주는 RIF 및 INH 둘다에 내성일 뿐 아니라 임의의 플루오로퀴놀론과 제1선 주사용 항생제 약물 (예, 아미카신, 카나마이신 또는 카프레오마이신)에도 내성을 나타낸다. 전체 MTB 사례들 중 약 6%가 MDR 균주이고, 남아프리카에서는 매년 더 많은 XDR 사례 %가 계속적으로 보고되고 있다. 표준 MTB 균주에 감염된 환자들 중 7%만 감염되지만, 사망률은 MDR 결핵의 거의 50%까지 증가하고 있다. 항생제 내성 MTB 균주의 출현은, 신속하고 매우 정확한 진단이, 특히 아프리카 개발도상국에서 당장 필요하다는 것을 분명하게 보여준다. 또한, 인구 이동도 약물 내성 균주에 대한 지리적 감시와 추적을 더욱 시급하게 만든다.
MDR 균주에 대해 배양에 기반한 약물 감수성 검사 (DST)가 표준으로 간주되지만, 특히 자원이 제한적인 국가에서는, 시간이 많이 걸리고 (수주에서 수개월), 기술적으로 어렵고, 비용이 매우 많이 든다. 예를 들어, BACTEC MGIT 960 (Becton Dickinson Microbiology System, Silver Sparks NV, USA)은 박테리아의 산소 소비를 측정하는 자동화된 연속 배양-기반의 모니터링 시스템으로서, 균주의 수종의 항생제 감수성에 대해 이용가능한 준비된 키트를 사용해 DST를 수행할 수 있다. BACTEC MGIT 960으로 수득한 DST 결과는 신뢰할 수 있으며 재현가능하지만, 독자 생존 가능하고 잠재적으로 감염성인 배양물을 '수일 내지 수주' 취급하여야 하거나 또는 결과를 입수할 수 있을 때까지 기다려야 하며, 전문 실험실 시설과 기기 및 소모품으로 인해 비용이 많이 든다.
최근 수년간, MTB 약물 내성을 확인하기 위한 몇가지 핵산-기반의 분석법들이 개발되었다. 가장 대중적인 상업적으로 이용가능한 진단 분석법 중 한가지는 Hain LifeScience 사의 GenoType MTBDRplus Line Probe Assay (LPA)이다. 이 검사는 핵산 추출, PCR 증폭, 프로브 혼성화 및 알칼라인 포스파타제 반응을 통한 측면 스트립 (lateral strip) 상에서의 비색 가시화를 수반한다. LPA는 민감하고 특이적인 것으로 입증되었지만, 몇가지 단점을 가지고 있다. 내성을 부여하는 많은 돌연변이들이 아직까지 발굴되지 않아, 모든 내성-관련 돌연변이에 대한 LPA의 민감도가 100%에 이르지 못할 가능성이 크다. LPA의 또 다른 내재된 한계는 내성 균주와 감수성 균주 혼합물이 포함된 샘플 집단을 검출하지 못한다는 것이다.
새로운 MTB 약물 내성에 대한 실시간 지리학적 감시가 보다 적절한 치료 전략 (예, 약물, 항생제, 화학제)을 가능케 할 것이다. 현재, GenoType® MTBDRplus LPA와 같이 이용가능한 분자적 방법 및 서열분석에는 특수한 고가의 장치가 필요하며, 아울러 결과를 수일 내에 입수할 수 없다. 아울러, 다른 미생물과 세포 돌연변이, 그리고 주요 유전자 돌연변이에 대한 신속한 검출 역시도 중요하다. 따라서, 예를 들어, MDR 관련 유전자와 같이 주요 유전자를 qPCR 유전자 분석하기 위한 신속하고, 표준화되고, 비용-효율적인 프로토콜이 요구되고 있다.
본 발명은 현행 전략 및 설계와 관련된 문제점을 극복하고, 약물 내성 검사를 위한 신속한 qPCR 기법을 쉽고 단순화하기 위한 도구, 조성물 및 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예는 유기체 게놈의 표적 서열에서 유전자 변형을 신속하게 검출하는 방법에 관한 것이다. 본 방법은, 표적 서열에 걸쳐있는 핵산 프라이머 쌍을 제공하는 단계로서, 표적 서열이 게놈의 보존된 영역을 포함하는 것인, 단계; 핵산 프로브 2종을 제공하는 단계로서, 각각의 프로브가 표적 서열에 혼성하고, 각각의 프로브가 각각의 5'-말단 및/또는 3'-말단에 차별적으로 표지되고, 하나의 프로브의 서열이 다른 프로브의 서열과 뉴클레오티드 하나 차이를 가지는, 단계; 상기한 핵산 프라이머 쌍과 2종의 핵산 프로브를 상기한 표적 서열과 조합하여, 혼합물을 형성하는 단계; 이 혼합물에 대해 중합효소 연쇄 반응 (PCR)을 수행하는 단계; 표지물질을 검출하는 단계; 및 검출된 각 표지물질의 양 차이에 의해 표적 서열에서 유전자 변형의 존재를 확인하는 단계를 포함한다. 바람직하게는, 유기체는 마이코박테리움과 같은 박테리아, 인플루엔자와 같은 바이러스, 진균 또는 포유류를 포함한다. 바람직하게는, 표적 서열은 유기체에 약물 내성을 부여하는 유전자 또는 게놈의 단편 (segment)을 포함한다. 마이코박테리아의 경우, 유전자는 rpoB 유전자를 포함하고, 프로브의 서열은 rpoB 유전자의 531번 아미노산 위치에서 차이를 가지거나, 또는 유전자는 katG 유전자를 포함하고, 프로브의 서열은 katG 유전자의 315번 아미노산 위치에서 차이를 가진다. 인플루엔자 바이러스의 경우, 바람직하게는, 표적 서열은 유기체에 약물 내성을 부여하는 유전자 또는 게놈의 단편을 포함하고, 유전자는 발록사비르 마르복실 (baloxavir marboxil)에 대해 약물 내성을 부여하는 예방성 항원 유전자이며, 이 경우 프로브는 예방성 항원 유전자의 38번 아미노산 위치에서 차이를 가진다. 또한, 유전자는 오셀타미비르 (oseltamivir)에 대해 약물 내성을 부여하는 뉴라미다제 유전자이며, 여기서 뉴라미다제 유전자는 N1 유전자이고, 프로브는 N1 유전자의 275번 아미노산 위치에서 차이를 가지며, 뉴라미다제 유전자는 N2 유전자이고, 프로브는 N2 유전자의 292번 아미노산 위치에서 차이를 가진다. 바람직하게는, 보존된 영역은 뉴클레오티드 약 100개 내지 약 300개 길이이다. 핵산 프라이머 쌍은 GC 함유율이 각각 약 65%이고, 바람직하게는 혼합물은 DMSO 또는 TCEP와 같은 환원제를 약 0.01 mM 내지 약 500 mM 농도로 또는 바람직하게는 약 1.0 mM 내지 약 50 mM 농도로 포함한다.
바람직하게는, 프로브는 예를 들어, FAM, JOE, ROX, VIC, ABY, JUN, TAMRA, NED, TET, HEX, PET 또는 이들의 조합과 같이 형광단으로 차별적으로 표지된다. 바람직하게는, PCR은 변성 후 어닐링 및 연장을 제공하는 온도 순환을 포함하는 qPCR이며, 양성 대조군 및/또는 음성 대조군을 더 포함한다. 바람직하게는, 온도 순환은 약 15℃ 내지 약 25℃ 다음으로 약 50℃ 내지 약 80℃가 후속되는 다중 사이클링을 포함한다. 바람직하게는, 하나의 프로브는 야생형 표적 서열을 포함하고, 다른 하나의 프로브는 돌연변이된 서열 또는 SNP를 포함한다. 바람직하게는, 우세적으로 검출되는 표지물질은 프로브 하나의 5'-말단에 부속된 표지물질이거나, 우세적으로 검출되는 표지물질은 다른 프로브의 5'-말단에 부속된 표지물질이거나, 또는 각각의 프로브의 5'-말단에 부속된 표지물질들은 실질적으로 동일한 수준으로 검출된다. 검출되는 표지물질은 주로 각 프로브의 5'-말단에 부속된 표지물질이거나, 또는 검출되는 표지물질은 주로 각각의 프로브의 3'-말단에 부속된 표지물질이다. 바람직하게는, 본 방법은 8시간 이하, 4시간 이하 또는 2시간 이하 동안 수행된다.
바람직하게는, 본 방법은 포유류에서 유전자 질환 또는 장애와 관련된 대립유전자와 같은 유전자 변형을 검출한다. 바람직하게는, 약물 내성을 부여하는 돌연변이는 항생제 또는 화학요법에 내성을 부여하는 돌연변이이다. 바람직하게는, 유전자 질환 또는 장애는 효소의 발현 또는 발현 부재, 면역 시스템 작동, 감염에 대한 B 세포 또는 T 세포 반응 구축 또는 약물 내성 또는 민감성을 포함한다. 바람직하게는, 본 방법은 복수의 여러가지 혼합물들에 대해 동시에 수행되며, 예를 들어 유기체는 마이코박테리움이고, 본 방법은 다약제 내성을 가진 동일 유기체에서 복수의 유전자 변형을 또는 서로 다른 약물 내성 프로파일을 가진 각각의 여러가지 유기체들에서 복수의 유전자 변형을 검출한다.
바람직하게는, 본 방법은 병원체의 존재 또는 암성 조직의 존재를 표시하며, 여기서 병원체는 바이러스, 박테리아, 진균 또는 기생충 중 하나 이상을 포함한다. 바람직하게는, 바이러스는 DNA 바이러스, RNA 바이러스, (+) 또는 (-) 단일 가닥 바이러스, 이중 가닥 바이러스, 오르토믹소바이러스, 파라믹소바이러스, 레트로바이러스, 플라비바이러스, 필로바이러스, 렌티바이러스, 인플루엔자 바이러스, 인간 면역결핍 바이러스, 간염 바이러스 또는 에볼라 바이러스 중 하나 이상이다. 바람직하게는, 박테리아는 마이코박테리움 투베르쿨로시스 (Mycobacterium tuberculosis), 클렙시엘라 sp. (Klebsiella sp .), 클로스트리듐 sp. (Clostridium sp.), 에셰리키아 sp. (Escherichia sp .)(예, E. coli), 슈도모나스 sp. (Pseudomonas sp .)(예, 슈도모나스 에어루지노사 (P. aeruginosa)), 네이세리아 sp.(Neisseria sp .)(네이세리아 고노레아 (N. gonorrhoeae)), 프란시셀라 튤라렌시스 (Francisella tularensis), 예르시니아 페스티스 (Yersinia pestis) 또는 비브리오 콜레라 (Vibrio cholera)이다. 바람직하게는, 기생충은 플라스모듐 sp. (Plasmodium sp.)(예, 플라스모듐 팔시파리움 (P. falciparium); 말라리아), 네마토아드 (nematoad), 톡소플라스마 sp. (Toxoplasma sp .)(예, 톡소플라스마 곤디 (T. gondii)이고, 바람직하게는 게놈은 환자의 체액 및/또는 조직으로부터 수득된다. 바람직하게는, 생물학적 샘플은 분자 이송 매질 중에 제공되고, 분자 이송 매질은, 세포의 세포용해, 단백질 변성, 뉴클레아제 불활성화, 병원체 사멸 및 핵산 분배 방지를 달성하기에 충분한 함량으로 함께 존재하는, 카오트로프 (chaotrope), 디터전트, 환원제, 킬레이트제, 완충제 및 알코올을 포함한다. 바람직하게는, 정량적인 중합효소 연쇄 반응은, 중합효소 및 선택적으로 역전사 효소; dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP를 등량으로 포함하는 데옥시뉴클레오티드 트리포스페이트 믹스; 킬레이트제, 삼투압제 (osmolarity agent), 알부민, 마그네슘 염 및 완충제를 포함하는, 수성 혼합물에서 수행된다.
본 발명의 다른 구현예는 본 발명의 방법에 의해 식별된 항-미생물 화합물을 이용해 하나 이상의 미생물 균주 또는 혈청형에 의해 유발되는 질환 또는 장애를 치료하는 방법에 관한 것이다. 바람직하게는, 치료는 본원에 개시된 방법으로부터 수득되는 정보로부터 결정된 요법을 통한 질환 또는 장애의 원인 물질인 특정 병원체의 표적 사멸을 포함한다. 바람직하게는, 확인된 정보는 효과적인 치료학적 용량을 결정한다.
본 발명의 다른 구현예는, 바람직하게는 본원에 기술된 방법에 따른 PCR 서열분석 및 분석을 위한 화학제, 프라이머 및 중합효소 중 하나 이상의 함유한, 시약 용기 (reagent vessel)를 포함하는 키트를 포함한다. 분석할 샘플은, 바람직하게는 샘플에 존재하는 모든 병원체를 사멸시키고, 샘플내 뉴클레아제를 불활성화하고, 이송 및 후속 조작 (예를 들어, PrimeStore™)에서 샘플 안전을 보장하는 핵산의 무결성 (integrity) 및 서열 충실도 (fidelity)를 유지하기에 충분한 화학적 성분들을 함유한, 시약 용기에 혼합한다. 키트는 약물 내성과 관련있는 것으로 알려진 특정 유기체의 특정 서열을 표적화하는 복수의 프라이머 쌍들을 포함한다. 추출 핵산은, 바람직하게는, 예를 들어, qPCR 분석과 같은 핵산 검사를 용이하게 실시할 수 있는, 예를 들어 PrimeMix™과 같은, 다른 화학적 시약 조성물과 조합한다. 키트는 양성 대조군 서열, 음성 대조군 서열 및/또는 병원체의 존재를 특정하는 특정한 표적 서열에 (바람직한 고 또는 저 엄격 혼성화 조건 하에) 특이적으로 혼성하는 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 구현예 및 장점들이 후술한 설명에서 일부 기술되며, 부분적으로는 이러한 설명으로부터 명확해질 수 있거나 또는 본 발명을 실시함으로써 학습할 수 있다.
도 1 HN878 MTB를 이용한 qPCR에 의한 KatG 이소니아지드 내성 평가.
도 2 혼성-균주를 이용한 qPCR에 의한 KatG 이소니아지드 내성 평가.
도 3 환자 분리주 16종에 대한 평가.
약물 내성과 같은 대립유전자 변형과 관련된 유전자 서열을 신속하게 분석하는 것은 수많은 질환 및 장애를 성공적으로 치료하기 위한 주요한 과제이다. 통상적인 기법은 감염성 물질을 함유할 것으로 의심되는 생물학적 물질을 배양하고 다양한 화합물에 대한 검사를 요하는 것으로, 고도로 훈련된 인력과 고가의 장치가 필요하다. 검사 소요 시간도 환자에 대한 효과적인 치료 개시를 지연시킨다.
내성 유전자 서열을 신속하게 특정하기 위한 qPCR 프로토콜은 놀랍게도 정확성과 속도 둘다를 제공하고, 최소 비용으로 적절한 환자 치료를 거의 즉각적으로 개시할 수 있게 하는 것으로, 밝혀졌다. 본 발명은, 하나의 생물학적 샘플에 대해 복수의 변형을 동시에 검출하는 것을 포함하는, 포유류 세포와 같은 세포 및/또는 마이코박테리아 및 인플루엔자 바이러스와 같은 감염성 미생물에서 핵산의 대립유전자 변형을 분석하기 위한 프로토콜을 포함한다. 약물 내성의 MTB를 개선되고 보다 신속하게 검출하는 것은 자원이 적은 지역에서 중요하다. 본 방법은 마이코박테리움 투베르쿨로시스에서 항생제 내성을 부여하는 것으로 공지된 게놈 영역을 유전자 검출하는데 적용된다. 이러한 영역은, 비-제한적으로, 리팜핀 (rifampin), 이소니아지드 (isoniazid), 피라진아미드 (pyrazinamide), 플루오로퀴놀론 (fluoroquinolone), 델라마니드 (delamanid), 베다퀼린 (bdeaquiline) 및 리네졸리드 (linezolid)에 대해 내성을 부여하는 유전자 좌를 포함한다.
특히, 본 발명의 방법은 샘플 또는 포유류 세포를 이용해 효소 활성, 박테리아, 바이러스, 진균 또는 기생충의 게놈에서 약물 내성, 및 질환 또는 장애에 걸린 것으로 의심되는 환자로부터 수득한 생물학적 샘플의 핵산을 확인하기 위한, 한 단계 대립유전자 변형 분석을 제공해준다. 검출되는 변형은 미생물의 게놈에 기인한 약물 내성 및/또는 민감성과 관련한 변형, 포유류 세포의 효소 활성의 존재 및/또는 부재, 단일 뉴클레오티드 다형성 (SNP), 질환 및 장애와 관련된 핵산 마커, 다약제 내성 대립유전자 및 또한 복수의 여러가지 요인에 기인한 변형을 포함한다. 바람직하게는, 본 방법은 감염성 물질을 함유한 생물학적 샘플에서 약물 내성과 관련된, 감염된 세포 및/또는 감염성 미생물에 기인할 수 있는, 하나 이상의 핵산 변형을 동정한다.
이러한 신속하고, 표준화된, 비용-효율적인 프로토콜을 통해, DNA, RNA, 단백질 및/또는 펩타이드 서열의 하나 이상의 변형을 가진 돌연변이를 식별할 수 있다. 샘플 서열이 RNA인 경우, 샘플내 대상 RNA 서열은 전형적으로 PCR 분석을 위해 DNA로 역전사한다. 바람직하게는, 미생물에 항생제 내성을 제공하는 하나 이상의 유전자 돌연변이를 식별 및 특정한다. 본 발명의 방법으로 식별되는 바람직한 돌연변이는 아미노산 코딩 영역 내 하나 이상의 부위, 전사 프로모터 또는 종결 부위, 정지 또는 개시 코돈, 비-코딩 영역 내 부위, 스플라이스 정션 부위, 변형 부위, 전사 또는 번역 인자 결합 또는 인지 부위, 3차원 구조에 기여하는 하나 이상의 부위, 또는 이들의 조합에 위치한다. 바람직한 분석 대상 유전자는 제1선 및 제2선 MTB 약물 내성과 관련있는 MTB 유전자를 포함한다. MTB-관련 유전자에 대한 바람직한 예로는, 예를 들어, rpoB (리팜핀), katG 및 inhA (이소니아지드), gyrA 및 gyrB (플루오로퀴놀론), pncA 및 panD (PZA 또는 피라진아미드) 및 rrs(16s) (아미노글리코시드, 아미카신 (amikacin), 카나마이신 (kanamycin), 카프레오마이신 (capreomycin), 스트렙토마이신) 및 rspL (스트렙토마이신) (인플루엔자 항-바이러스제에 대해 바람직한 유전자)를 포함한다. 인플루엔자 항-바이러스제에 대해 바람직한 유전자: 오셀타미비르-뉴라미나다제 및 발록시비르-중합효소 산성 단백질. 본 방법은, MTB와 같이, 특히 다약제 내성 (MDR) 또는 광역 약물 내성 (XDR) 균주를 비롯해, 인플루엔자 치료에 사용되는 항-바이러스 약물 및 박테리아 감염의 치료에 사용되는 항-박테리아 약물에 대해 민감성 또는 내성을 지시하는 표적 서열에 대해 설계될 수 있다.
바람직하게는, 본 방법은 환자로부터 생물학적 샘플을 수득하는 것에 관한 것이다. 샘플 물질은 액체, 고체 또는 액체와 고체의 혼합물일 수 있으며, 바람직하게는, 예를 들어, 혈액 샘플, 조직 샘플, 혼성 조직 샘플, 타액, 인후 면봉 검출물 (throat swabs), 생검 조직 및 이들의 조합일 수 있다. 샘플은, 바람직하게는, 즉각적인 멸균을 제공하고, 안전한 취급과 전세계 비-냉장 수송을 허용하고, 후속적인 핵산 검사를 위해 샘플 내 핵산의 무결성을 유지시키는, 예를 들어, PRIMESTORE™ (LonghornVaccines and Diagnostics, LLC; Bethesda, MD)과 같은, 분자 이송 매질 중에 수집된다. 바람직하게는, 분자 이송 매질에 투입된 샘플의 핵산은, 수일, 수주, 수개월 또는 그 이상의 기간 동안 분자 이송 매질 중에서 보관시, 서열 충실성 (sequence fidelity) 또는 구조 완전성을 상실하지 않는다.
핵산 물질은 후속적인 중합효소 연쇄 반응 (PCR)을 위해 생물학적 샘플로부터 추출하고, 여기에 핵산 프라이머 쌍, 동일한 대상 표적 서열을 실질적으로 각각 함유한 핵산 프로브 2종 및 PCR 반응용 성분 혼합물을 첨가한다.
프라이머 쌍은, 동일한 대상 표적 서열, 바람직하게는 핵산의 보존된 영역에 걸쳐 있으며 의심되는 대립유전자 변형을 포함하는 서열을 가진 것으로 선택된다. 대상 표적 서열 및/또는 생성되는 증폭산물은 바람직하게는 뉴클레오티드 약 50 내지 약 1,000개 길이이며, 바람직하게는 약 100 내지 약 500개 길이, 바람직하게는 약 100 내지 약 400개 길이, 바람직하게는 약 100 내지 약 300개 길이, 더 바람직하게는 약 100 내지 약 200개 길이이다.
핵산 프로브 2종은 각각 대상 표적 서열과 동일한 서열을 실질적으로 포함하지만, 표적 서열과 뉴클레오티드 5개 이하, 바람직하게는 4개 이하, 바람직하게는 3개 이하, 바람직하게는 2개 이하, 바람직하게는 1개 차이를 가진다. 프로브 서열들은 서로 실질적으로 중첩되거나, 표적 서열만 중첩되거나, 또는 표적 서열과 차이가 있는 뉴클레오티드(들)를 제외하고는 동일할 수 있다. 프로브 서열은, 바람직하게는, 여러가지 혼성화 강도에도 표적 서열에 혼성하고, 바람직하게는 PCR에 의해 생성될 수 있는 증폭산물의 크기보다 더 작다. 바람직한 프로브 쌍은 SNP, 유전자 이상 (genetic abnormality) 또는 돌연변이를 포함하는 대립유전자 변형을 포함한다. 바람직하게는, 프로브는 항생제 또는 치료학적 화합물에 대해 내성을 부여하는 서열을 포함하는데, 프로브 하나는 야생형 서열을 포함하고 다른 프로브는 돌연변이된 서열을 포함하며, 여기서 야생형 또는 돌연변이가 내성의 원인이다.
프로브는 이들 각각의 5' 말단, 3' 말단 및/또는 이들 둘다에서 차별적으로 표지된다. 표지물질은 예를 들어 색, 염료, 이온화 또는 비-이온화 방사선, 공명, 전기 신호, 효소 활성 또는 이들의 조합과 같이 검출가능한 신호를 제공하는 임의의 식별가능한 태그를 포함한다. 바람직하게는, 표지물질은 표적 서열에의 프로브 혼성화를 입체적으로 간섭하지 않는다. 염료는, 예를 들어, 변형된 뉴클레오티드 또는 단백질, 화학적 모이어티, 핵산 또는 단백질 염료, 접합된 염료, 형광 발색단 및/또는 이들의 조합을 포함한다. 바람직한 형광 발색단은, 예를 들어, 로다민의 형광단 유도체 (TRITC), 쿠마린 및 시아닌, 또한 FAM (카르복시플루오레세인), JOE, ROX, VIC, ABY, JUN, TAMRA, NED, TET, HEX, PET 및 이들의 조합을 포함한다.
PCR 반응을 위한 구성성분들의 혼합물은, 바람직하게는, 완충제, 마그네슘 염과 같은 염, 열-안정적인 중합효소 (예, Taq 중합효소), 데옥시뉴클레오티드 트리포스페이트 혼합물 (예, dATP, dTTP, dCTP, dGTP를 대략 등량으로 포함하는 dNTP들) 및 뉴클레아제-비함유 물을 포함한다. 바람직하게는, 이 혼합물은 상업적으로 이용가능한 PCR-레디 혼합물인 PRIMEMIX™ (Longhorn Vaccines and Diagnostics, LLC; Bethesda, MD)를 포함한다. 또한, PCR은, 표적 서열이 RNA를 포함하고 핵산 검사를 위해 DNA로 전사하는, RT-PCR (역전사효소-PCR)을 수반할 수 있다.
대상 서열에서 GC 함유율이 높을 (약 65% 이상) 경우, 필수적인 높은 변성 온도로 인해 PCR 분석 민감도가 특히 문제일 수 있다. 이 경우, 비-통상적인 환원제가 함유된 PCR 완충제가 이러한 문제를 해결하는 것으로, 놀랍게도 확인되었다. 그 환원제는, 예를 들어, 2-머캅토에탄올(β-ME), 트리스(2-카르복시에틸) 포스핀 (TCEP), 다이티오트레이톨 (DTT), 포름아미드, 다이메틸설폭사이드 (DMSO) 또는 이들의 임의 조합을 포함한다. PCR 혼합물에서 환원제의 바람직한 농도는 약 0.01 mM 내지 약 500 mM, 더 바람직하게는 약 1.0 mM 내지 약 50 mM이고, 보다 더 바람직하게는 TCEP는 최종 농도 약 4.5 mM로 존재한다.
PCR은 특정 샘플 핵산, 프라이머 및/또는 프로브를 수용하기 위해 표준 프로토콜 또는 변형된 프로토콜에 따라 수행된다. 모든 서열은 공지되어 있거나 또는 쉽게 결정되므로, 당해 기술 분야의 당업자라면 검출할 대립유전자 변형에 바람직한 적절한 온도 순환 온도 및 시간을 결정할 수 있다. 표준 PCR 조건은 변성 및 어닐링 후 프라이머 연장으로 이루어진 사이클 약 20 내지 약 40회, 바람직하게는 30회를 포함한다. 온도 순환은, 약 20초 내지 약 50초 동안 약 70℃ 내지 약 98℃에서의 변성과, 이후 약 20초 내지 약 1분간 약 40℃ 내지 약 65℃에서의 어닐링 후, 약 30초 내지 약 5분 이상 동안의 약 60℃ 내지 약 80℃에서의 연장을 포함한다. 표준 PCR의 변형은, 특정 샘플 핵산, 프라이머 및/또는 프로브에 대한, 바람직한 변성, 어닐링 및 연장에 대해서, 당해 기술 분야의 당업자에 의해 결정되는 적절할 수 있는, 대략적인 사이클링 및 대략적인 온도를 포함한다. 바람직하게는, 본 발명의 PCR은 변성한 이후에 거의 동시적인 어닐링과 연장을 포함한다.
각 표지물질의 양을 결정할 수 있는 정량적인 중합효소 연쇄 반응 (qPCR)이 바람직하다. PCR과 같은 qPCR 기법을 이용해, DNA의 단편, 즉 증폭산물을 증폭한다. 바람직하게는, qPCR은 각각의 연속적인 사이클이 끝나면 형광측정기에 의해 실시간으로 검출할 수 있는 내부, 형광 표지된 프라이머의 사용을 포함한다. 실시간 PCR 장치는 지루한 겔 전기영동 방식으로 PCR 증폭산물을 가시화할 필요가 없고, NGS에 비해 매우 신속하다 (예, qPCR의 경우 1-2시간 대비 표준 PCR 및 겔을 이용한 가시화를 이용한 경우 4-6시간). 아울러, qPCR의 민감도는, 적어도 부분적으로 실시간 형광측정기에서의 높은 민감성 검출 한계로 인해, PCR 증폭산물을 가시화하기 위한 에티듐 브로마이드 또는 기타 인터칼레이팅 염료를 이용한 표준적인 증폭산물 가시화와 대조적으로, 통상적인 PCR보다 우수하다. 따라서, 질환을 검출하기 위한 qPCR 방식은 배양 방법에 비해 특히 유용하다. 아울러, qPCR은 가능한 환자 가까이에서 사용할 수 있어, 개발도상국에서 유용하다. PCR 후 표지물질을, 바람직하게는 정량적으로 또는 상대적으로 또는 베이스라인 판독값과 비교해 검출하고, 각 표지 물질의 존재, 바람직하게는 양을 검출한다.
PCR 증폭 중에 프로브 하나 또는 다른 프로브가 바람직하게는 표적 서열에 결합할 것이다. 선택 온도에서 가장 강하게 어닐링하는 프로브는 온도 순환 중에 절단되어, 프로브에 기인한 표지물질을 검출할 수 있다. 예를 들어, 형광단으로 표지된 프로브의 경우, 절단된 프로브는 실시간 형광측정기에 의해 검출되는 형광을 방출할 것이며, 절단되지 않은 프로브는 소광되어 형광을 방출하지 않을 것이다. 각 프로브별 표지물질이 다르므로, 가장 강하게 혼성한 프로브를 쉽게 검출한다. 그 프로브가 야생형 서열을 포함한다면, 분석 중인 게놈 표적 서열은 야생형인 것으로 결정된다. 절단된 프로브가 돌연변이된 서열을 포함하는 경우에는, 분석 중인 게놈 표적 서열은 돌연변이 서열로 결정된다.
절단 전 및 절단 후 검출가능하게 남아있는 표지물질의 경우, 절단된 프로브와 비-절단 프로브는 필요에 따라 크로마토그래피, 전기영동, 질량분광측정, 친화성, 여과, 원심분리 (예, 스핀 컬럼) 또는 이의 조합 또는 당해 기술 분야의 당업자들에게 잘 알려진 기타 방법들에 의해 분리하고, 각 표지물질의 상대적인 양을 결정할 수 있다.
아울러, 정량적인 평가를 통해 또한 동일한 유기체에서 복수의 여러가지 대립유전자 변형의 존재를 검출할 수 있을 것이며, 또는 복수의 유기체들로부터 유래된 핵산이 존재하고 검사하는 경우에 대립유전자 변형의 존재를 결정할 수 있을 것이다. 예를 들어, 변형의 일정 비율이 야생형이고 또 다른 비율이 돌연변이일 경우, 각 표지물질의 양은 이러한 각각의 비율을 반영할 것이다.
본원에 기술된 바와 같은 방법에 의해 결정된 대립유전자 변형을 분석함으로써, 환자의 즉각적인 치료로부터 효과적인 약물 요법을 선택할 수 있다. 이는 효과적인 치료, 바람직하게는 아울러 유효량을 동정하기 위해 질병에 걸린 세포를 배양하고 다양한 약물 요법에 노출시켜야 하는 통상적인 분석을 능가하는 현저한 진전을 제공해준다. 따라서, 단회 PCR 분석 후, 효과적인 치료를 시작할 수 있다. 바람직하게는, 분석은 6시간 이하, 더 바람직하게는 4시간 이하, 보다 더 바람직하게는 2시간 이하로 수행된다.
본원에 기술된 방법은, 1) 대상 돌연변이에 대해 상동적일 수 있는, 2) 돌연변이를 함유하지 않는 서열 (일반적으로 야생형 서열로서 언급됨)에 상동적일 수 있는, 3) 야생형 서열과 돌연변이 서열을 포함하는 서열 집단일 수 있는, 서열 집단들에서 표적 서열내 유전자 변형을 검출할 수 있게 해준다. 이 방법은, 예를 들어, 본래 진핵생물, 원핵생물 또는 진균인 유전자를 비롯한, 유전 물질로서 DNA 또는 RNA를 함유한 유기체를 포함하여, 임의의 게놈의 임의 영역을 검출할 수 있다. 바람직한 예에서, 본 방법을 이용해, 예를 들어 바이러스, 박테리아, 진균 감염과 관련있는 미생물과 같이 질환 유발 미생물 또는 유기체로부터 DNA 또는 RNA에서 돌연변이를 검출한다.
본 발명에 개시된 방법에 따라 평가할 수 있는 질환 유발 유기체로는 박테리아, 바이러스, 진균 및 기생충과 같은 여러가지 균주들, 또는 이들의 조합을 포함한다. 예시적인 유기체로는, 비-제한적으로, DNA 바이러스, RNA 바이러스, (+) 또는 (-) 단일 가닥 바이러스, 이중 가닥 바이러스, 오르토믹소바이러스, 파라믹소바이러스, 모르빌리바이러스 (예. 루벨로라 (Rubeola)), 레트로바이러스, 플라비바이러스, 필로바이러스 (예, 에볼라, 마르버그), 렌티바이러스, 한타 바이러스, 헤르페스 바이러스 (예, VZV, HSV I, HSV II, EBV), 간염 바이러스 (예, A, B, C, non-A, non-B), 아르보바이러스 (예, 지카바이러스), 뎅기열바이러스, 라사 (Lassa) 바이러스, 한타바이러스, 인플루엔자 바이러스 (예, H5N1, H1N1, H2N5, H7N9), 호흡기 세포융합 바이러스, HIV 또는 에볼라 바이러스 등이 있다. 또한, 예시적인 유기체로는, 비-제한적으로, 살모넬라 sp. (Salmonella sp.), 스타필로코커스 sp. ( Staphylococcus sp.), 스트렙토코커스 sp. (Streptococcus sp.), 마이코박테리아 (Mycobacteria) (예, 마이코박테리움 투베르쿨로시스 (M. tuberculosis), 마이코박테리움 레프라이 (M. leprae), 마이코박테리움 스메그마티스 (M. smegmatis), 마이코박테리움 보비스 (M. bovis), 바실러스 안트라시스 (Bacillus anthracis), 플라스모듐 (Plasmodium) (예, 플라스모듐 팔시파룸 (Plasmodium falciparum)), 쉬스토소미아시스 (Shistosomiasis) (예, 쉬스토소마 만소니 (Schistosoma mansoni)), 프란시셀라 툴라렌시스 (Francisella tularensis), 클로스트리듐 디피실 (Clostridium difficile), 메닌고코칼 감염 (Meningococcal infection), 슈도모나스 감염, 예르시니아 페스티스 (Yersinia pestis) 및 비브리오 콜레라 (Vibrio cholerae) 등이 있다. 바람직하게는, 본 발명의 방법은, 약물 내성 또는 민감성을 나타내는, 인플루엔자 바이러스 및 마이코박테리움 투베르쿨로시스 (MTB)의 서열을 검출하는데 특수한 용도를 가진다.
또한, 본 발명은, 특정 유전자의 발현 및/또는 발현 수준을 확인하여 약물 또는 치료학적 민감성 및 내성을 포유류 세포에서 확인하기 위해 이용할 수 있는, 암 또는 세포 악성과 관련된 대립유전자 변형을 검출하는 것에 관한 것이다.
아래 실시예들은 본 발명의 구현예들을 예시하지만, 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 간주되어서는 안된다.
실시예 1
민감한 실시간 PCR을 이용한 MTB 검출 및 후속적인 신속한 qPCR을 이용한 내성 유전자 검출을 개선하는 능력은 자원이 부족한 지역에서 특히 중요하다. PS-MTM은 MTB를 빠르게 사멸시키고 DNA를 주위 온도 및 그 이상의 온도에서 유지하기 때문에, 시료를 실시간 PCR 및 서열분석을 위해 효율적으로 이송하여, 약물 내성 균주의 검출을 개선하고 환자 요법을 최적화할 수 있다. 이전의 연구들에서 qPCR 분석 내성 돌연변이를 동정하기 위해, MDR 및 XDR이 존재하는 국가로부터 미국으로 유입되는 환자들에서 MDR 균주를 서열분석하는 것이 유익하다는 것이 확인된 바 있다. 예를 들어, 환자의 시료에서 이종-내성 (heteroresistance)과 같이 한가지 집단보다 많은 수의 집단을 검출하는 능력은 추가적인 이점을 제공해준다. 이종-내성 특정화는, 특히 주요 항생제들에 내성인 MTB 부분 집단들이 우세한 환자 균주가 된다면, 환자 관리에 있어 중요하다. 본 실시예는 지방 클리닉에 지원을 제공하기 위해 중앙 및 지역 실험실로 객담 시료를 효율적으로 운반할 수 있는 가능성을 입증해준다. 특히, 아프리카 지방 환경에서, 빠르게 변화하는 내성 패턴에서 이동 인구의 역할과 역학을 이해하는 것이 TB를 치료하고 근절하는데 중요하다. 추가적인 교육 인력이나 사회 기반 시설을 투입하지 않고도, 지방의 환자 객담 시료를 고도로 훈련된 인력과 최신 qPCR 장치를 갖춘 실험실로 이송하여, MTB 환자 관리 감시 및 연구를 지원할 수 있다.
MTB의 약물 내성 유전자를 특정화하는 것이 결핵 (TB)을 적절하게 치료하는데 중요하다. 분자 검출 및 새로운 분석들이 약물 내성 TB를 진단하고 치료를 개선하기 위한 새로운 도구를 빠르게 제공해주고 있다.
표 1에 나타낸 바와 같이, qPCR을 이용해, PrimeStore® MTM (PS-MTM) 중에 수집하여, 주위 온도에서 남아프리카에서 미국으로 이송한 시료로부터 직접 MTB rpoB 및 katG 약물 내성 유전자를 특정화하였다.
Figure pct00001
이들 유전자는 제1선 약물인 리팜피신과 이소니아지드 각각에 대해 내성을 부여한다. 이러한 작업의 의의는 단순히 약물 내성을 검출 것뿐 아니라 내성을 결정할 수 있고 따라서 치료를 시작할 수 있다는 것이다. 한가지 중요한 요소는 생물 표본으로부터 고 품질의 DNA를 수득하고 유지하는 것이다. 이는, 표본을 신속하고 중앙 집중된 방식으로 고 성능 처리할 수 있는 잘 알려지고 널리 인정되는 분자 이송 매질인 PRIMESTORE에서 표본을 수집 및 이송함으로써, 달성하였다.
게놈의 특정 영역을 표적화하는 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 선택하였다. 프라이머는, 대상 유전자에서 특정 영역을 증폭하도록 정방향 및 역방향의 방향성을 가진다. 정방향 및 역방향 프라이머 서열에 대해 선택된 영역은, 프라이머가 보존된 영역으로부터 설계되고, 바람직하게는 변이 서열을 함유하지 않도록 선택한다. 각 프라이머는 연속적인 PCR 사이클 중에 혼성하였을 때 특정 파장에서 신호를 방출하는 특정 형광단으로 5' 말단을 표지하였다. 다양한 지역, 기생지역 (niche), 시간 및 숙주로부터 수집한 박테리아의 서열을 이용해, 표적 프라이머 서열에서 동질성 수준을 평가할 수 있다.
정방향 프라이머와 역방향 프라이머에 의해 정의되는 영역에서의 결합은 2개의 프로브 서열에 의해 확인된다. 이들 프로브는 뉴클레오티드 하나 (예, A, T, C, G)를 제외하고는 상동적이며, 서로 부분적으로 중첩되거나 또는 중첩되지 않을 수 있다. 야생형 서열이 존재하는 경우, 야생형 서열을 가진 프로브가 결합해 하나의 프라이머의 연장을 방해하고, 다른 것은 방해하지 않는다. 돌연변이 서열이 존재하는 경우, 돌연변이 서열을 가진 프로브가 결합하여 다른 프라이머의 연장을 방해한다.
표지된 프라이머들과 2개의 프로브는 분자 이송 매질 내에 첨가하였다. PrimeMix™ 및 qPCR 분석을 수행하였다. 분석의 특성은 단일 뉴클레오티드 다형성 (SNP)의 유전자형을 식별할 수 있다는 것이다. 이 방법은 특정 표적을 증폭 및 검출하기 위해 5' 뉴클레아제 분석을 이용할 수 있다. 2가지 프로브 타입이 존재하므로, 최적의 특이성을 가진 프로브가 결합할 것이며, 그래서 서열에 어닐링하여 프라이머 연장을 막고, 온도 순환 중에 절단될 것이다. 절단 현상은 실시간 형광측정기로 검출되지만, 다른 프로브는 비-절단된 채 남아있어 형광 신호는 소광된다. 따라서, 하나의 분석에서 2개의 프로브로 특정 SNP를 검출할 수 있다.
도 1-3에 나타낸 바와 같이, 이러한 방법을 이용해 마이코박테리움 투베르쿨로시스 (MTB)에 감염된 환자의 임상 분리주 16종에서 유전자 변형을 검출하였다. 대립유전자 변형은 특정 항생제에 대해 내성을 부여하는 것으로 알려져 있다. 각 분리주의 약물 민감성은 기존에 공지되어 있지 않으며, 이들 모두 차세대 서열분석 (NGS)으로 서열분석하여 정확한 대립유전자 변형을 확인하였다. 이들 도에서 확인되는 바와 같이, 민감성 및 내성 균주 둘다가 동정되었을 뿐 아니라 이종-내성을 보이는 혼재형 균주도 동정되었다. 이 방법은 MTB에서 항생제 내성을 결정하는 현행 기술을 능가하는 실질적인 개선을 보여주었다. 가장 널리 사용되는 항생제 내성 결정 방법은 세포 배양물 분석에 의해 이루어진다. 약물 내성 TB 균주를 동정하기 위한 표준은 종종 자동화된 BACTEC™ MGIT™ 960 시스템 (Becton Dickinson, Silver Sparks NV, USA)을 사용해 수행되는, 배양에 기반한 약물 감수성 검사 (DST)이다. 그러나, 배양에 기반한 DST는 시간이 소요되고 (예, 수주 내지 수개월), 잠재적으로 감염성 균주를 증식시켜야 하며, 특히 자원이 한정적인 국가에서는 비용이 매우 많이 든다. 또한, 자동화된 배양에는 훈련된 인력이 필요하며, 정기적인 고가의 장치 관리가 요구된다. 반면, PCR (예, qPCR)을 이용한 유전자 분석에 의한 약물 내성 검사는 최소한의 샘플 준비, 최소한의 장치 및 비용으로 빨리 검출할 수 있다. Illumina MiSeq 플랫폼은 운영 당 전체 MTB 게놈 최대 24개를 서열분석할 수 있으며, 평균적으로 재현가능한 커버리지 범위는 약 30배이다. qPCR 장치는 유지 및 교육이 거의 필요하지 않으며, 10년 이상 사용되어 왔으며, 전세계적으로 이용가능하다.
도 5에 나타낸 바와 같이, 다약제 내성 결핵 (MDR-TB)의 치료에 사용되는 주요 항생제 2종인 리팜핀과 이소니아지드에 대해 내성을 부여하는 것으로 알려진 돌연변이를 신속하게 검출하기 위해, 2가지 MTB 약물 내성 분석을 설계하였다. 리팜핀의 경우, 가장 만연한 돌연변이 (S-531-L)를 rpoB 유전자에서 표적으로 하였다. 이소니아지드의 경우, 이소니아지드에 대해 내성을 부여하는 것으로 알려진, S-315-T 돌연변이를 포함하는 katG 유전자의 영역을 이용하였다.
본 실시예에서, 프라이머 세트는 katG 유전자 좌의 100-200 bp 영역을 증폭시키는데 특이적이며, S-315-T 돌연변이 영역에 포괄하는 민감하고 특이적인 PCR에 대해 최적화되고 개발된 것이다. 프라이머 용융 온도는 당해 기술 분야의 당업자들에게 공지되어 있거나 또는 쉽게 결정되며, PCR 어닐링 단계와 연장 단계를 단일 온도 및 지정된 기간으로 병합할 수 있도록 온도 순환 매개변수들에 대해 결정된 Tm이다. 따라서, 온도 순환은 1) 변성, 2) 어닐링 및 3) 연장을 포함하는 전형적인 3-단계 공정이 아니라, 온도 순환이 단순 변성, 조합된 어닐링/연장으로 이루어진 2-단계 방식이다.
프라이머 쌍의 내부는 뉴클레오티드 하나 차이를 가진 프로브 서열이다. 프로브 하나는 야생형 서열을 반영하고, 다른 프로브는 돌연변이 서열을 반영한다. 각각의 프라이머는 특정 파장에서 형광을 방출하는 형광단으로 표지된다. 형광단으로는, 예를 들어, FAM, VIC, TAMRA, NED 또는 이들의 조합을 포함한다.
PCR 증폭 사이클링은 선택 프라이머와 프로브를 사용해 수행한다. 프로브, 야생형 또는 돌연변이 프로브는, 바람직하게는 샘플 웰에서 표적 서열의 집단에 따라 표적 서열에 결합한다. 샘플에 내성 부여 서열이 존재하는 경우, 돌연변이 프로브가 야생형 프로브에 비해 선호적으로 어닐링될 것이다. 가장 강하게 어닐링된 프로브는 온도 순환 중에 절단되어, 각각의 형광단이 실시간 형광측정기로 검출되는 형광을 방출하는데 반해, 어닐링되지 않은 프로브의 형광단은 소광된다. 형광은 운영 개시하기 전 각 형광단의 초기 베이스라인 판독값에 비해 더 강하다. 형광의 엔드포인트 차이는 2시간 이하에서 검출된다. 이 방법은, 인간 숙주에서 MTB 감염에 대한 것이므로, 항생제 이소니아지드에 대한 내성 또는 민감성이 결정되는 것으로 확인되었으며, 수주 내지 수개월 걸릴 수 있는 이소니아지드 내성을 확인하기 위한 전통적인 배양법에 비해 현저한 개선을 나타내었다.
1) 야생형, 2) 돌연변이, 및 3) 돌연변이 서열과 야생형 서열 1:1 비율에 대한 합성 표적을 이용해 엔드포인트에서 결정된 증폭을 확인하였다. 양성 대조군과 음성 대조군 둘다 야생형으로 확인된 HN878 MTB를 가지고 있어, 이소니아지드 민감성이었다 (도 1-3 참조)
실시예 2
qPCR을 임상 분리주 16종에서 수행하여, (i) 리팜피신, (ii) 이소니아지드, (iii) 플루오로퀴놀론, (iv) 아미노글리코시드, (v) 피라진아미드에 대한 내성 또는 민감성 검사를 실시하였다. 결과는 표 2에 나타낸다.
Figure pct00002
실시예 3
최근 수년 동안, 차세대 서열분석 (NGS)이 다약제 내성 (MDR)을 부여하는 마이코박테리움 투베르쿨로시스 (MTB) 돌연변이를 유전자 특정화하기 위한 선택 방법으로서 부상하였다. 그러나, NGS는 비용이 많이 들고, 힘든 샘플 준비 과정, 고도로 훈련된 생물학적 및 생물공학적 인력 및 매우 복잡한 실험을 요한다. 본 발명자들은 리팜핀 및 이소니아지드 각각에 대해 내성을 부여하는 rpoB 유전자 및 katG 유전자에서 높은 유병률을 보이는 돌연변이를 검출하기 위해, 간단하고 신속한 qPCR 대립유전자 식별 방법을 개발하였다. 이러한 분석에서는 16가지의 표현형을 가진 다약제 내성 (MDR) 남아프리카 임상 분리주를 사용해 평가하였으며, NGS에 의해 식별된 돌연변이와 비교하였다.
돌연변이 S-450-L 및 D-435-L을 표적으로 하는 2가지 rpoB 분석과, S-315-T에 특이적인 katG 분석을 설계하였으며, ABI-7500 장치에서 표적화된 DNA 대조군을 이용해 최적화하였다. 초기 최적화 후, 분리주 16종 각각으로부터 총 0.1 mL MGIT 배양물을 PrimeStore® 1.5 mL이 수용된 튜브로 옮기고, 분석을 위해 주위 온도 하에 프리토리아에서 텍사스 샌안토니오로 이송하였다. qPCR에 의해 검출된 돌연변이를 MiSeq NGS에 의해 수득한 결과와 비교하였다.
이들 rpoB 분석 표적을 이용해, 분리주 16종 중 15종에서 내성-부여 돌연변이가 식별되었다 (94%; 12종 (75%)은 S-450-L이었고, 3종 (19%)은 D-435-L이었음). 이들 15종에서, NGS에 의해 qPCR 결과가 검증되었다. qPCR에 의해 '야생형'으로 검사된 분리주 1종은, NGS에서 본 분석 표적에 포함되지 않는 rpoBQ-423-K 돌연변이를 보유하고 있는 것으로 확인되었다. NGS에 의해 식별된 이소니아지드 내성 분리주 (69%)는 katG 유전자에 S-315-T 돌연변이를 가지고 있었으며, 이는 또한 katG qPCR 분석으로 검출되었다.
이들 데이터는, 이러한 빠른 qPCR 방식이 환자 분리주에서 리팜핀 및 이소니아지드 내성을 정확하게 검출하였음을 보여준다 (표 3). NGS에 의해 식별된 분리주 1종은 rpoB 유전자에 Q-423-K 돌연변이를 가지고 있었으며, 이 돌연변이는 유병률은 낮지만 리팜핀 내성-부여 돌연변이인 것으로 언급된 바 있다. Q-423-K 표적 분석 및 기타 유병률이 낮은 리팜핀 및 이소니아지드 내성 qPCR 분석은 현재 개발 중에 있다. 신속한 MDR-TB qPCR 검출은 특히 고전적인 배양 DST 또는 복잡한 NGS 방법을 이용할 수 없는 자원이 부족한 지역에서 기대되는 방법이다.
Figure pct00003
실시예 4
결핵으로 추정되는 사례의 품질이 좋지 않은 기침 표본 (n=61)을 배양하였으며, 면봉을 사용해 PrimeStore 분자 이송 매질 (PS-MTM)로 채취함으로써 이송된 샘플에 대해 MTB/RIF (Xpert)를 성공적으로 수행하였다. 마이코박테리움 투베르쿨로시스는 13종에서 배양되었고 (21.3%), Xpert에서는 양성 15종 (24.2%)이 기록되었으며, 이종 10종이 일치하였다. PS-MTM 샘플에 대한 RT-PCR에서는 민감도 개선이 확인되었으며; Xpert에서 양성 3종이, 배양에서 5종이 누락되었으며, 3종이 더 검출되어, 총 양성은 21종 (34.4%)이었다.
실험실 처리에 적합하지 않은 임상 시료는 결핵 진단 기회를 놓친다. 최근 전세계 결핵 (TB) 비율에 대한 보고에서, 세계 보건 기구는 활동형 TB 사례가 축소 보고되는 것에 대해 우려를 표명하였다. 추정 비율과 비교해, 사례의 약 30%는 매년 검출되지 않고 있다. 활동성 TB 사례를 축소 진단하게 되는 요인은 시료의 적은 양 또는 좋지 않은 품질로 인한 시료의 GeneXpert MTB/RIF (Xpert) 처리 거부이다. 남아프리카에서, 부피 5 ml 미만의 기침 시료는 품질이 좋지 않은 것으로 간주되며 (예, 혈액이 섞인, 타액 및 음식물이 섞인 샘플), 분석에 적합하지 않다. 본 실험의 목적은, 일상적인 처리 요건을 충족하지 못하는 샘플을 마이코박테리움 투베르쿨로시스 검출을 위해 최적화할 수 있음을 입증하는 것이다.
본 실험은, 실시간 PCR 및 Xpert를 비롯한 대부분의 PCR 기반의 분석 플랫폼에서 처리하기 전에, 분자 이송 매질 (MTM)로 투입되는 소량의 객담 샘플이, 통상적인 방식에서 누락될 수 있는 추가적인 사례들을 검출할 수 있음을, 특히 확인하기 위해 설계하였다. PrimeStore-MTM (PS-MTM Longhorn Vaccines and Diagnostics, LLC; Bethesda, MD)은, 분석을 위해 DNA를 보존하면서, 통상적으로 사용되는 추출 키트와 혼용가능하며 마이코박테리움 투베르쿨로시스를 불활성화하는 것으로 입증되어 있다. PS-MTM에 투입하면, 바실러스의 세포벽이 파괴 및 불활성화되고, DNA는 용액으로 방출된다. 또한, 수득되는 혼합물을 주위 온도 하에 용이하게 시료 이송가능하게 해준다. 마이코박테리움 투베르쿨로시스가 섞인 연속 희석 PS-MTM 샘플을 PBS 중의 연속 희석물과 비교하였다. PS-MTM은 PBS 샘플과 비교해 100 cfu/ml 이하의 희석에서 Xpert에 의한 마이코박테리움 투베르쿨로시스의 검출을 개선하였으며, 즉 Xpert 효율이 증가하였다.
기침 시료 69종을 수집하였으며, 프레토리아의 스티브 비코 병원의 국립 보건 실험실 서비스 (NHLS) TB 실험실에 접수하였다. 육안 검사에서 확인된 바와 같이, 샘플 65종은 품질이 좋이 않은 것으로 판단되었다. 시료에 대한 NHLS 정의에 따라 이는 처리에 적합하지 않았다. 음식물 입자와 같은 이물질, 주로 혈액이 섞인, 타액으로 보이는 샘플 (부피 2 ml 미만)(객담 컵의 바닥부로부터 반월판까지 액체 높이를 측정하여 결정함, 높이 1 cm는 지역 TM 클리닉에서 사용되는 객담 채취용 스크류 마개가 부속된 입구가 넓은 50 ml 컵에서 유체 약 1 ml임)을 선별하였다.
표 4는 품질-불량 범주 분류를 나타낸 것으로, 분류된 시료 대부분이 본래 타액이었음을 보여준다 (50/65 = 76.9%).
Figure pct00004
일상적인 NIILS 실험실 처리의 일환으로서, 시료는 MGIT에서 마이코박테리아를 배양하여 분리주의 종을 결정하였다. 마이코박테리아 투베르쿨로시스 유기체는 13/65로 배양되었고, 마이코박테리아 아비움 (M. avium)은 2종에서, 마이코박테리아 포르투이툼 (M. fortuitum)은 1종에 배양되었다. 시료 49종에서는 배양되지 않았다. 아울러, 시료 65종 모두 NHLS 실험실에서 일상적인 Xpert에 투입하였다. 표 4에 나타낸 바와 같아, 시료의 약 1/3 (22/65 = 33.8%)은 품질 불량으로 인해 분석할 수 없었다. 남아있는 시료 43종으로부터 결과를 기록하였다.
분자 이송 매질 중에 수집된 샘플에 대한 Xpert는 본 실험에서 다음과 같은 시료 65종 모두에 대해 수행하였다: 면봉으로 각각의 표본 컵에서 5회 휘저어 (오염되지 않은 표본), 1.5 ml PrimeStore-MTM (Longhorn Vaccines and Diagnostics, San Antonio, TX)으로 옮기기 위한 샘플 소량 (0.05 - 0.2 ml)을 수집하였다. 면봉은 PS-MTM 중에서 10초간 볼텍싱 처리하여, 포획된 물질을 용액으로 회전시키고, 면봉을 제거한 다음 용액을 실온에서 30분간 세워 두어 세포용해 및 DNA 방출이 이루어지도록 하였다. 5 Xpert MTB/RIF (Cepheid, USA)에 의한 셋-업 및 샘플 분석을 다음과 같이 수행하였다: PS-MTM 튜브로부터, 표본 0.7 ml을 Xpert MTB/RIF 샘플 완충제 1.4 ml (Cepheid, 2:1 비율, v/v)에 투입하여, 10-20회 볼텍싱하고, 실온에서 15분간 간헐적으로 흔들어 주면서 세워 두었다. 6 이 혼합물로부터, 2 ml을 Xpert MTB/RIF 버전 4 카트리지에 첨가하여, 분석하였다.
처리한 시료 65종 중에서, 64종은 유효한 결과를 나타내었으며, 하나는 오류 메시지를 나타내었다 (표 4).
배양법과 Xpert에서 결과가 일치하지 않은 대상 전체에 대해 마이코박테리아 투베르쿨로시스를 검출하기 위한 RT-PCR 증폭을 수행하였다 (PS-MTM Xpert 및 NFILS routine Xpert 결과). TB 삽입 서열 (IS) 611 0 영역의 보존된 영역을 표적으로 하는 프라이머, 완충제, 염 및 효소로 이루어진 혼합물 PrimeMix MTB 컴플렉스 (Longhorn Vaccines and Diagnostics, LLC; Bethesda, MD)를 앞서 기술된 바와 같이 사용하였다. PrimeMix 15 ㎕ 및 추출 DNA 5를 함유한 최종 부피 20 pL에서 LightCycler® 480 Instrument (Roche Life Science, Indiana, USA)를 사용해 실시간 증폭을 실시하였다. 온도 순환 조건은 95℃에서 5분 후, 95℃에서 15초로 이루어진 사이클 40회, 그리고 후속적으로 60℃에서 32초로 구성되었다. 장치 분석을 위해, 0.1 베이스라인 역치를 적용하였다.
샘플은 사이클 역치 (CT) 값이 38 이하이면 양성으로, CT가 38-40이면 불확실 (indeterminate)로, 증폭 신호가 관찰되지 않으면 음성으로 분류하였다. 정량 분석에서는, 각 샘플을 2세트로 검사하여 평균 CT를 구하였다. 추출 및 실시간 증폭 양성 및 음성 대조군으로 마이코박테리아 투베르쿨로시스 참조 균주 H37Rv를 사용하였다.
비-결핵 분리주가 포함된 표본 (n=3)과 PS-MTM 샘플의 Xpert 처리에서 오류로 판단된 표본의 결과는 제외시킨 후, 최종 데이터 시리즈는 표본 65개 중 61개에 대한 결과를 포함하였다.
본 실험에 포함된 배양 표본 61종 중, 13종 (21.3%)은 배양 검사에서 양성이었으며, 이중 7종 (53.8%)은 일상적인 Xpert 검사에서도 검출되었고, 2종은 음성으로 판정되었으며, 4종은 품질 불량 및/또는 표본 부피 미달로 인해 처리되지 않았다 (표 5). 또한, 마이코박테리아 투베르쿨로시스 DNA는 전체 음성 표본들 중 3종에서 검출되었다. PS-MTM Xpert에서는 배양 양성 중 10/13 (76.9%)이 식별되었고, 동일한 7종이 일상적인 Xpert에서 양성으로 확인되었다 (표 5).
Figure pct00005
데이터 세트에는 배양 음성의 품질 불량 표본 48종이 포함되었다. PS-MTM Xpert를, 일상적인 Xpert를 수행하지 않은 표본 22종을 비롯한 전체에 대해 수행하였으며, 양성 5건이 검출되었다. 일상적인 Xpert에서는, PS-MTM Xpert 분석 및 배양에서 음성으로 기록된 처리된 표본 26종으로부터 양성이 추가로 3종 검출되었다.
PS-MTM Xpert는 배양 양성 표본에서 3/13을 검출하지 못하였다. 결과를 추가로 분석하기 위해, 배양 (양성 또는 음성) 결과와 일치하지 않는 표본 11종 모두 (PS-MTM 또는 루틴)에 대해 RT-PCR을 수행하였다. RT-PCR에서는 이들 11종 모두 양성으로 검증되었다.
요컨대, 마이코박테리아 투베르쿨로시스는 품질 불량 표본에서 13/61 (21.3%)으로 배양되었으며, PS-MTM 샘플의 핵산 증폭 검사 (Xpert 또는 RT-PCR)에서는 동일한 13종과, 추가로 8종이 검출되었다 (즉, 21/61 또는 34.4%).
Xnert MTB/RIF에 제공되는 다른 이송 매질/완충제가 첨가된 타액 또는 혈액이 섞인 표본에 대한 이전의 연구들 역시 마이코박테리아 투베르쿨로시스 검출 강화를 제공하였다. PS-MTM을 이용한 결과는 이러한 접근을 검증하지만, 아울러 RT-PCR 검출이 Xpert 보다, 심지어 배양법보다 우수하다는 것도 보여준다. 검출 민감도가 크게 증가한다.
배양법에서 음성이 RT-PCR에서 양성으로 확인되는 불일치는, 표본에 생존가능하지 않은 바실러스가 존재하는 것을 반영하는 것일 수 있으므로, 임상 의사 결정에 이용할 수 없다. 품질 불량 표본 샘플을 PS-MTM로 스크리닝하고 RT-PCR에 의해 배치-분석하고, 양성 결과를 추적 분석해 참여 환자에 대해 추가적인 임상 조사를 실시하는 것이 제안된다. 대안책은, 품질이 불량한 표본을 모두 거부하고, 검사를 위해 객담을 추적 수집하는 것으로, 이는 진단에 불필요한 비용과 시간을 추가로 발생시킨다. 첫번째 기회를 놓치게 되면 종종 결핵 사례 누락으로 이어져, 결핵 전파가 계속되는 결과를 초래한다.
본 발명의 다른 구현예들 및 용도는 본원에 기술된 본 발명의 상세 내용 및 실시를 고려하여 당해 기술 분야의 당업자들에게 자명할 것이다. 모든 간행물, 미국 및 외국 특허 및 특허 출원을 포함하여 본원에 인용된 모든 참조문헌들은 구체적이고 전체적으로 본 명세서에 원용에 의해 포함된다. 용어 "포함하는"은 사용되는 모든 경우에 용어 "구성되는" 및 "필수적으로 구성되는"을 내포하는 것으로 의도된다. 또한, 용어 "포함하는", "비롯하여" 및 "함유하는"은 제한적인 것으로 의도되지 않는다. 상세한 설명 및 예들은 단순히 예로서 간주되며 발명의 진정한 범위 및 사상은 첨부된 청구항에 의해 규정되는 것으로 의도된다.

Claims (48)

  1. 유기체 게놈의 표적 서열에서 유전자 변형을 신속하게 검출하는 방법으로서,
    표적 서열에 걸쳐있는 핵산 프라이머 쌍을 제공하는 단계로서, 상기 표적 서열이 게놈의 보존 영역을 포함하는, 단계;
    핵산 프로브 2종을 제공하는 단계로서, 각각의 프로브가 상기 표적 서열에 혼성하고, 하나의 프로브의 서열이 다른 프로브의 서열과 뉴클레오티드 하나 차이를 가지고, 각각의 프로브가 각각의 5'-말단 및/또는 3'-말단에서 차별적으로 표지된 것인, 단계;
    상기 핵산 프라이머 쌍과 상기 핵산 프로브 2종을 상기 표적 서열과 조합하여, 혼합물을 형성하는 단계;
    상기 혼합물에 대해 중합효소 연쇄 반응 (PCR)을 수행하는 단계;
    표지물질을 검출하는 단계; 및
    검출된 각 표지물질의 양 차이에 의해 표적 서열에서 유전자 변형의 존재를 확인하는 단계
    를 포함하는 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 유기체가 박테리아, 바이러스, 진균 또는 포유류를 포함하는, 방법.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 유기체가 마이코박테리아를 포함하는, 방법.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 표적 서열이 상기 유기체에 약물 내성을 부여하는 유전자 또는 게놈의 단편을 포함하는, 방법.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 유전자가 rpoB 유전자 또는 katG 유전자를 포함하는, 방법.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 유전자가 rpoB 유전자를 포함하고, 상기 프로브의 서열이 rpoB 유전자의 531번 아미노산 위치에서 차이가 있는, 방법.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 유전자가 katG 유전자를 포함하고, 상기 프로브의 서열이 katG 유전자의 315번 아미노산 위치에서 차이가 있는, 방법.
  8. 제2항에 있어서,
    상기 유기체가 인플루엔자 바이러스를 포함하는, 방법.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 표적 서열이 상기 유기체에 약물 내성을 부여하는 유전자 또는 게놈의 단편을 포함하는, 방법.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 유전자가 발록사비르 마르복실 (baloxavir marboxil)에 대해 약물 내성을 부여하는 예방성 항원 유전자인, 방법.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 프로브가 상기 예방성 항원 유전자의 38번 아미노산 위치에서 차이가 있는, 방법.
  12. 제9항에 있어서,
    상기 유전자가 오셀타미비르 (oseltamivir)에 약물 내성을 부여하는 뉴라미다제 유전자인, 방법..
  13. 제12항에 있어서,
    상기 뉴라미다제 유전자가 N1 유전자이고, 상기 프로브가 N1 유전자의 275번 아미노산 위치에서 차이가 있는, 방법.
  14. 제12항에 있어서,
    상기 뉴라미다제 유전자가 N2 유전자이고, 상기 프로브가 N2 유전자의 292번 아미노산 위치에서 차이가 있는, 방법.
  15. 제1항에 있어서,
    상기 보존된 영역이 뉴클레오티드 약 100개 내지 약 300개 길이인, 방법.
  16. 제1항에 있어서,
    상기 핵산 프라이머 쌍이 각각 약 65%의 GC 함유율을 가지는, 방법.
  17. 제16항에 있어서,
    상기 혼합물이 환원제를 포함하는, 방법.
  18. 제17항에 있어서,
    상기 환원제가 DMSO 또는 TCEP를 약 0.01 mM 내지 약 500 mM 농도로 포함하는, 방법.
  19. 제18항에 있어서,
    상기 농도가 약 1.0 mM 내지 약 50 mM인, 방법.
  20. 제1항에 있어서,
    상기 프로브가 형광단으로 차별적으로 표지된, 방법.
  21. 제20항에 있어서,
    상기 형광단이 FAM, JOE, ROX, VIC, ABY, JUN, TAMRA, NED, TET, HEX, PET 또는 이들의 조합을 포함하는, 방법.
  22. 제1항에 있어서,
    상기 PCR 반응의 양성 대조군 및/또는 음성 대조군을 더 포함하는, 방법.
  23. 제1항에 있어서,
    상기 PCR이 qPCR을 포함하는, 방법.
  24. 제23항에 있어서,
    상기 qPCR이 변성 후 어닐링 및 연장을 지원하는 온도 순환을 포함하는, 방법.
  25. 제24항에 있어서,
    상기 온도 순환이 약 15℃ 내지 약 25℃ 다음으로 약 50℃ 내지 약 80℃가 후속되는 다중 사이클을 포함하는, 방법.
  26. 제1항에 있어서,
    상기 프로브 하나는 야생형 표적 서열을 포함하는, 방법.
  27. 제26항에 있어서,
    상기 우세적으로 검출되는 표지물질이 상기 프로브 하나의 5'-말단에 부속된 표지물질인, 방법.
  28. 제26항에 있어서,
    상기 우세적으로 검출되는 표지물질이 다른 프로브의 5'-말단에 부속된 표지물질인, 방법.
  29. 제26항에 있어서,
    상기 각각의 프로브의 5'-말단에 부속된 표지물질들이 실질적으로 동일한 양으로 검출되는, 방법.
  30. 제1항에 있어서,
    상기 검출되는 표지물질이 주로 각 프로브의 5'-말단에 부속된 표지물질인, 방법.
  31. 제1항에 있어서,
    상기 검출되는 표지물질이 주로 각각의 프로브의 3'-말단에 부속된 표지물질인, 방법.
  32. 제1항에 있어서,
    8시간 이하로 수행되는, 방법.
  33. 제32항에 있어서,
    4시간 이하로 수행되는, 방법.
  34. 제33항에 있어서,
    2시간 이하로 수행되는, 방법.
  35. 제1항에 있어서,
    상기 유기체가 포유류이고,
    상기 유전자 변형이 유전자 질환 또는 장애와 관련된 대립유전자를 포함하는, 방법.
  36. 제35항에 있어서,
    상기 유전자 질환 또는 장애가 효소의 발현 또는 발현 부재, 면역 시스템 작동, 감염에 대한 B 세포 또는 T 세포 반응 구축 또는 약물에 대한 내성 또는 민감성을 포함하는, 방법.
  37. 제1항에 있어서,
    상기 방법이 복수의 여러가지 혼합물들에 대해 동시에 수행되는, 방법.
  38. 제37항에 있어서,
    상기 유기체가 마이코박테리움이고,
    상기 방법이 복수의 유전자 변형을 검출하는, 방법.
  39. 제38항에 있어서,
    검출되는 복수의 유전자 변형이 다약제 내성을 가진 마이코박테리움을 지시하는, 방법.
  40. 제38항에 있어서,
    검출되는 복수의 유전자 변형이 각각 서로 다른 약물 내성 프로파일을 가진 복수의 여러가지 마이코박테리움을 지시하는, 방법.
  41. 제1항에 있어서,
    병든 세포는 병원체의 존재 또는 암성 조직의 존재를 지시하는, 방법.
  42. 제2항에 있어서,
    상기 병원체가 바이러스, 박테리아, 진균 또는 기생충 중 하나 이상을 포함하는, 방법.
  43. 제3항에 있어서,
    상기 바이러스가 DNA 바이러스, RNA 바이러스, (+) 또는 (-) 단일 가닥 바이러스, 이중 가닥 바이러스, 오르토믹소바이러스, 파라믹소바이러스, 레트로바이러스, 아르보바이러스, 지카바이러스, 플라비바이러스, 필로바이러스, 렌티바이러스, 인플루엔자 바이러스, 인간 면역결핍 바이러스, 간염 바이러스 또는 에볼라 바이러스 중 하나 이상인, 방법.
  44. 제3항에 있어서,
    상기 박테리아가 마이코박테리움 투베르쿨로시스 (Mycobacterium tuberculosis), 플라스모듐 팔시파룸 (Plasmodium falciparum), 프란시셀라 튤라렌시스 (Francisella tularensis), 예르시니아 페스티스 (Yersinia pestis) 또는 비브리오 콜레라 (Vibrio cholera)인, 방법.
  45. 제1항에 있어서,
    상기 게놈이 환자의 체액 및/또는 조직으로부터 수득되는, 방법.
  46. 제1항에 있어서,
    생물학적 샘플이 분자 이송 매질 중에 제공되고,
    상기 분자 이송 매질이, 세포의 세포용해, 단백질 변성, 뉴클레아제 불활성화, 병원체 사멸 및 핵산 분해 방지를 달성하기에 충분한 함량으로 함께 존재하는, 카오트로프 (chaotrope), 디터전트, 환원제, 킬레이트제, 완충제 및 알코올을 포함하는, 방법.
  47. 제1항에 있어서,
    약물 내성을 투여하는 돌연변이가 항생제 또는 화학요법에 대해 내성을 부여하는 돌연변이인, 방법.
  48. 제1항에 있어서,
    정량적인 중합효소 연쇄 반응이, 중합효소 및 선택적으로 역전사효소; dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP를 대략 등량으로 포함하는 데옥시뉴클레오티드 트리포스페이트 믹스; 킬레이트제, 삼투압제 (osmolarity agent), 알부민, 마그네슘 염 및 완충제를 포함하는, 수성 혼합물 중에서 수행되는, 방법.
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