KR20210084512A - Jak 억제제로서 2-아자비시클로 헥산 화합물 - Google Patents

Jak 억제제로서 2-아자비시클로 헥산 화합물 Download PDF

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KR20210084512A
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세라밴스 바이오파마 알앤디 아이피, 엘엘씨
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Abstract

본 발명은 JAK 억제제로서 유용한, 하기 화학식 1의 화합물 또는 이의 약학적으로-허용 가능한 염을 제공한다:
Figure pct00029
.
본 발명은 또한 상기 화합물을 포함하는 약학적 조성물, 상기 화합물을 사용하여 JAK 억제제에 순응하는 질환을 치료하는 방법, 및 상기 화합물을 제조하는데 유용한 방법을 제공한다.

Description

JAK 억제제로서 2-아자비시클로 헥산 화합물
본 발명은 염증성 질환, 구체적으로 안구 질환 (ocular diseases) 치료에 유용한 JAK 키나제 억제제 화합물에 관한 것이다. 본 발명은 또한 이러한 화합물을 포함하는 약학적 조성물, 이러한 화합물을 사용하여 안구 질환을 치료하는 방법, 및 상기 화합물을 제조하는데 유용한 방법에 관한 것이다.
사이토킨 (cytokines)은 케모킨 (chemokines), 인터페론 (interferons), 인터루킨 (interleukins), 림포킨 (lymphokines) 및 종양 괴사 인자 (tumour necrosis factor)를 포함하는 세포간 신호전달 분자 (intercellular signaling molecules)이다. 사이토킨은 정상적인 세포 성장 및 면역조절에 중요하지만, 면역-매개 질환을 유발하고, 악성 세포의 성장에 관여한다. 다수의 사이토킨의 수준 상승은 많은 질환 또는 병태, 구체적으로 염증을 특징으로 하는 질환의 병리 (pathology)에 관련되어 있다. 질환에 관련된 다수의 사이토킨은 티로신 키나제의 Janus 패밀리 (Janus family of tyrosine kinase: JAK)에 의존하는 신호전달 경로를 통해 작용하고, 이는 전사 인자의 STAT (Signal Transducer and Activator of Transcription) 패밀리를 통해 신호를 전달한다.
상기 JAK 패밀리는 4개의 구성원인, JAK1, JAK2, JAK3 및 티로신 키나제 2 (tyrosine kinase 2: TYK2)를 포함한다. 사이토킨의 JAK-의존성 사이토킨 수용체로의 결합은 수용체의 이량체화 (dimerization)를 유도하여, JAK 키나제 상에 티로신 잔기의 인산화 (phosphorylation)를 초래하여, JAK 활성화에 영향을 준다. 인산화 JAK는 다양한 STAT 단백질과 결합 및 인산화하고, 이는 이량체화, 세포 핵 내에 내재화, 및 유전자 전사를 직접 조절하여, 다른 효과들 중에서 염증성 질환과 관련된 하류 효과 (downstream effect)를 유도한다. 상기 JAK는 통상 사이토킨 수용체와 결합하여 호모다이머 (homodimers) 또는 헤테로다이머 (heterodimers)로 쌍을 이룬다. 특정 사이토킨은 특정 JAK 페어링 (pairing)과 관련이 있다. 상기 JAK 패밀리 중 4개의 구성원들 각각은 염증과 관련된 사이토킨들 중 적어도 하나의 신호전달에 관련되어 있다.
포도막염 (uveitis), 당뇨 망막병증 (diabetic retinopathy), 당뇨 황반 부종 (diabetic macular edema), 안구건조증 (dry eye disease), 연령-관련 황반 변성 (age-related macular degeneration), 망막 정맥 폐쇄 (retinal vein occlusion) 및 아토피성 각막결막염 (atopic keratoconjunctivitis)을 포함하는 다수의 안구 질환에서 염증이 중요한 역할을 한다. 포도막염은 다수의 안구내 염증성 병태를 포함하고, 종종 자가면역으로, 알려져 있는 감염성 유발인자 없이 발생한다. 이러한 병태는 미국에서 약 2백만 명의 환자에게 영향을 미치는 것으로 추정된다. 일부 환자에서, 포도막염과 관련된 만성 염증은 조직 파괴를 초래하므로, 이는 미국에서 실명 (blindness)의 5번째 주요 원인이다. JAK-STAT 경로를 통해 신호를 전달하는 포도막염 환자의 눈에서 증가된 사이토킨으로는 IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-23 및 IFN-γ를 포함한다. (Horai and Caspi, J Interferon Cytokine Res, 2011, 31, 733-744; Ooi et al, Clinical Medicine and Research, 2006, 4, 294-309). 포도막염에 대한 기존의 요법은 종종 차선책이며, 많은 환자가 거의 제어되지 않는다. 스테로이드가 종종 효과적이지만, 백내장 및 안압 증가/녹내장과 관련이 있다.
당뇨 망막병증 (DR)은 망막의 혈관 손상으로 인해 발생한다. 당뇨병 환자들 중에 시력 손실의 가장 흔한 원인이다. 혈관 형성뿐만 아니라 염증 경로가 상기 질환에서 중요한 역할을 한다. 종종, DR은 당뇨병 환자에서 시력 손실의 가장 빈번한 원인인 당뇨 황반 부종 (DME)으로 진행될 것이다. 상기 병태는 미국에서만 약 150만 명의 환자에게 영향을 미치는 것으로 추정되며, 이 중 약 20%는 질환이 양쪽 눈에 영향을 주었다. IL-6과 같은 JAK-STAT 경로를 통해 신호를 전달하는 사이토킨뿐만 아니라 JAK-STAT 경로 신호전달에 의해 생성이 일부 유도되는 IP-10 및 MCP-1 (대안으로서 CCL2라고 함)과 같은 다른 사이토킨이 DR/DME와 관련된 염증에서 역할을 하는 것으로 여겨진다 (Abcouwer, J Clin Cell Immunol, 2013, Suppl 1, 1-12; Sohn et al., American Journal of Opthalmology, 2011, 152, 686-694; Owen and Hartnett, Curr Diab Rep, 2013, 13, 476-480; Cheung et al, Molecular Vision, 2012, 18, 830-837; Dong et al, Molecular Vision, 2013, 19, 1734-1746; Funatsu et al, Ophthalmology, 2009, 116, 73-79). DME에 대한 기존의 요법은 차선책이며: 유리체내 항-VEGF 치료는 일부 환자에서만 유효하고, 스테로이드는 백내장 및 안압 증가와 관련이 있다.
안구건조증 (DED)은 미국에서 대략 5백만 명의 환자에게 영향을 미치는 다인자성 질환 (multifactorial disorder)이다. 안구 표면 염증이 상기 질환의 발생 및 전파에 중요한 역할을 하는 것으로 여겨진다. IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6 및 IFN-γ와 같은 사이토킨의 수준이 DED 환자의 안구액에서 증가하는 것으로 알려져 있고 (Stevenson et al, Arch Ophthalmol, 2012, 130, 90-100), 상기 수준은 종종 질환 중증도와 관련이 있다. 연령-관련 황반 변성 및 아토피성 각막결막염이 또한 JAK-의존성 사이토킨과 관련이 있는 것으로 사료된다.
망막 정맥 폐쇄 (RVO)는 매우 만연한 시각 장애 질환이다. 망막 혈류의 폐쇄는 망막 혈관구조 손상, 출혈 및 조직 허혈을 초래할 수 있다. RVO에 대한 원인이 다인자성임에도 불구하고, 혈관 및 염증 매개인자 모두가 중요한 것으로 밝혀졌다 (Deobhakta et al, International Journal of Inflammation, 2013, article ID 438412). IL-6 및 IL-13과 같은 JAK-STAT 경로를 통해 신호를 전달하는 사이토킨뿐만 아니라 JAK-STAT 경로 신호전달에 의해 생성이 일부 유도되는 MCP-1과 같은 다른 사이토킨이 RVO 환자의 안구 조직에서 증가된 수준으로 검출되었다 (Shchuko et al, Indian Journal of Ophthalmology, 2015, 63(12), 905-911). 많은 RVO 환자는 광응고 (photocoagulation)에 의해 치료되며, 이는 본질적으로 파괴적 요법 (destructive therapy)이다. 항-VEGF 제제가 또한 사용되지만, 이는 일부 환자에서만 유효하다. 눈에서 염증 수준을 감소시키는 스테로이드 약제 (트리암시놀론 아세토나이드 (Triamcinolone acetonide) 및 덱사메타손 (dexamethasone) 이식물)가 또한 소정의 RVO 형태의 환자에서 유익한 결과를 제공하는 것으로 밝혀졌지만, 이들은 또한 백내장 및 안압 증가/녹내장을 유발하는 것으로 나타났다.
안구 질환 치료를 위한 강력한 범-JAK (pan-JAK) 억제제가 여전히 필요하다.
일 양상에서, 본 발명은 염증성 안구 질환 치료에 유용한 JAK 억제제 화합물을 제공한다.
구체적으로, 일 양상에서, 본 발명은 하기 화학식의 화합물 (이후, 화합물 1), 또는 이의 약학적으로-허용 가능한 염을 제공한다:
Figure pct00001
본 발명은 또한 화합물 1 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 및 약학적으로-허용 가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.
일 양상에서, 본 발명은 포유동물에서 안구 질환을 치료하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 상기 포유동물에게 본 발명의 화합물 1 또는 약학적 조성물을 투여하는 단계를 포함한다. 일 양상에서, 상기 안구 질환은 포도막염, 당뇨 망막병증, 당뇨 황반 부종, 안구건조증, 연령-관련 황반 변성, 망막 정맥 폐쇄 및 아토피성 각막결막염으로 구성된 그룹으로부터 선택된다. 구체적으로, 상기 안구 질환은 당뇨 황반 부종 또는 포도막염이다.
개별 및 구별되는 양상에서, 본 발명은 또한 화합물 1을 제조하는데 유용한, 본원에 기재된 합성 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 의학적 요법에 사용하기 위한 본원에 개시된 바와 같은 화합물 1 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염뿐만 아니라 안구 질환 치료용 제제 (formulation) 또는 약제 (medicament)의 제조에 있어서 본 발명의 화합물의 용도를 제공한다.
본원에서 화학 구조는 ChemDraw 소프트웨어 (PerkinElmer, Inc., Cambridge, MA)에서 구현되는 바와 같이 IUPAC 규정에 따라 명명된다.
더욱이, 본 발명의 화합물의 구조에서 테트라히드로이미다조피리딘 모이어티 중 이미다조 부분은 토토머 형태로 존재한다. 상기 화합물은 하기와 같이 동등하게 나타낼 수 있다:
Figure pct00002
IUPAC 규정에 따라, 이들 표현은 상기 테트라히드로이미다조피리딘 부분의 원자들의 넘버링이 상이하여 발생한다. 따라서 이러한 구조는 ((1S,5R)-2-아자비시클로[3.1.0]헥산-1-일)(2-(6-(2-에틸-5-플루오로-4-히드록시페닐)-4-플루오로-1H-인다졸-3-일)-3,4,6,7-테트라히드로-5H-이미다조[4,5-c]피리딘-5-일)메타논으로 명명된다. 또한 이는 하기와 같이 명명될 수 있다: ((1S,5R)-2-아자비시클로[3.1.0]헥산-1-일)(2-(6-(2-에틸-5-플루오로-4-히드록시페닐)-4-플루오로-1H-인다졸-3-일)-1,4,6,7-테트라히드로-5H-이미다조[4,5-c]피리딘-5-일)메타논. 구조들이 특정 형태로 개시되거나 또는 명명되더라도, 본 발명은 또한 이의 토토머를 포함하는 것으로 이해될 것이다.
본 발명의 화합물은 또한 여러 염기성 기를 함유하므로, 상기 화합물들은 유리 염기 또는 다양한 염 형태, 예컨대 일-양성자화 (mono-protonated) 염 형태, 이-양성자화 (di-protonated) 염 형태 또는 이들의 혼합물로 존재할 수 있다. 이러한 모든 형태들은 달리 명시하지 않는 한 본 발명의 범위 내에 포함된다.
본 발명은 또한 화학식 1의 동위원소-표지된 (isotopically-labeled) 화합물, 즉 원자를 이와 동일한 원자 번호를 갖지만 원자량이 자연 상태에서 우세하게 존재하는 원자량과는 다른 원자로 대체시키거나 또는 강화시킨 화학식 1의 화합물을 포함한다. 화학식 1의 화합물로 혼입될 수 있는 동위원소의 예는 2H, 3H, 11C, 13C, 14C, 13N, 15N, 15O, 17O, 18O 및 18F를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 특히 관심이 있는 화합물은 삼중수소 (tritium) 또는 탄소-14가 강화된 화학식 1의 화합물이며, 이들 화합물은 예를 들어 조직 분포 연구에 사용될 수 있다. 또한, 특히 관심이 있는 화합물은 특히 대사작용 부위에서 이중수소 (deuterium)가 강화된 화학식 1의 화합물이며, 이들 화합물은 더 큰 대사 안정성 (metabolic stability)을 가질 것으로 기대된다. 또한, 특히 관심이 있는 화합물은 11C, 18F, 15O 및 13N과 같은 양전자 방출 동위원소 (positron emitting isotope)가 강화된 화학식 1의 화합물이며, 이들 화합물은 예를 들어 양전자 방출 단층촬영 (Positron Emission Tomography, PET) 연구에 사용될 수 있다.
정의
본 발명의 다양한 양상 및 구체예를 포함하는 본 발명을 기재할 때, 이하의 정의를 따른다:
용어 "치료적으로 유효한 양 (therapeutically effective amount)"은 치료를 필요로 하는 환자에게 투여될 때 치료 효과를 달성하는데 충분한 양을 의미한다.
용어 "치료하는 (treating)" 또는 "치료 (treatment)"는 환자 (특히, 인간)에서 치료될 의학적 병태, 질환 또는 장애 (예: 호흡기 질환)를 예방, 개선 또는 억제하거나; 또는 의학적 병태, 질환 또는 장애의 증상을 완화시키는 것을 의미한다.
용어 "약학적으로 허용 가능한 염 (pharmaceutically acceptable salt)"은 환자 또는 포유동물 예컨대 인간에게의 투여가 허용 가능한 염 (예: 해당 용량 용법 (dosage regime)에 대해 허용 가능한 포유동물 안전성을 갖는 염)을 의미한다. 대표적인 약학적으로 허용 가능한 염은 아세트산, 아스코르브산, 벤젠설폰산, 벤조산, 캄포설폰산, 시트르산, 에탄설폰산, 에디실산 (edisylic acid), 푸마르산, 겐티스산 (gentisic acid), 글루콘산, 글루코론산, 글루탐산, 힙푸르산 (hippuric acid), 히드로브롬산, 염산, 이세티온산 (isethionic acid), 락트산, 락토비온산 (lactobionic acid), 말레산, 말산, 만델산, 메탄설폰산, 무신산 (mucic acid), 나프탈렌설폰산, 나프탈렌-1,5-디설폰산, 나프탈렌-2,6-디설폰산, 니코틴산, 질산, 오로트산 (orotic acid), 파모산 (pamoic acid), 판토텐산, 인산, 숙신산, 황산, 타르타르산, p-톨루엔설폰산 및 자이나포산 (xinafoic acid) 등의 염을 포함한다.
용어 "이의 염 (salt thereof)"은 산의 수소가 양이온 예컨대 금속 양이온 또는 유기 양이온 등으로 대체되는 경우 형성된 화합물을 의미한다. 예를 들어, 상기 양이온은 화학식 1의 화합물의 양성자화된 형태, 즉 하나 이상의 아미노기가 산에 의해 양성자화된 형태일 수 있다. 전형적으로, 상기 염은 약학적으로 허용 가능한 염이고, 이는 환자에게 투여하기 위한 것이 아닌 중간체 화합물의 염에는 요구되지 않는다.
용어 "아미노-보호기 (amino-protecting group)"는 아미노 질소에서 원하지 않는 반응을 방지하는데 적합한 보호기를 의미한다. 대표적인 아미노-보호기는 포르밀; 아실기, 예를 들어 알카노일기, 예컨대 아세틸 및 트리-플루오로아세틸; 알콕시카보닐기, 예컨대 tert-부톡시카보닐 (Boc); 아릴메톡시카보닐기, 예컨대 벤질옥시카보닐 (Cbz) 및 9-플루오레닐메톡시카보닐 (Fmoc); 아릴메틸기, 예컨대 벤질 (Bn), 트리틸 (Tr) 및 1,1-디-(4'-메톡시페닐)메틸; 실릴기, 예컨대 트리메틸실릴 (TMS), tert -부틸디메틸실릴 (TBDMS), [2-(트리메틸실릴)에톡시]메틸 (SEM); 등을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
다수의 보호기, 및 이들의 도입 및 제거는 T. W. Greene and P.G.M. Wuts, Protecting Groups in Organic Synthesis, Third Edition, Wiley, New York에 기재되어 있다.
일반 합성 절차
화합물 1 및 이의 중간체는 상업적으로-입수 가능하거나 또는 통상적으로-제조된 개시 물질 및 시약을 사용하여 하기 일반적 방법 및 절차에 따라 제조될 수 있다. 또한, 산성 또는 염기성 원자 또는 관능기를 갖는 화합물이 사용될 수 있거나 또는 달리 지시하지 않는 한 염으로 제조될 수 있다 (일부 경우에, 특정 반응에서 염의 사용은 상기 반응을 수행하기 전에 통상적인 절차를 사용하여 상기 염을 비-염 (non-salt)의 형태, 예컨대 유리 염기로의 전환을 필요로 할 것이다).
본 발명의 특정 구체예가 하기 절차에서 개시 또는 서술될 수 있지만, 당업자라면 본 발명의 다른 구체예 또는 양상이 또한 이러한 절차를 사용하거나 또는 이들 당업자에게 알려져 있는 다른 방법, 시약 및 개시 물질을 사용하여 제조될 수 있다는 것을 알 수 있을 것이다. 구체적으로, 화합물 1은 다양한 공정 경로에 의해 제조될 수 있고, 여기서 반응물들이 상이한 순서로 조합되어, 최종 생성물을 생성하는 도중에 상이한 중간체를 제공할 수 있다는 것을 이해할 것이다.
화합물 1의 제조는 첨부된 실시예에서 상세하게 서술된다. 주요 단계가 반응식 1에 요약되어 있다. RA는 히드록실일 수 있으며, 이 경우 화합물 7- PG는 중간체 6과, HATU, HOBT 등과 같은 활성화 시약의 존재하에 전형적인 아미드 결합 형성 조건하에 결합한다. 대안으로서, RA는 Cl과 같은 이탈기일 수 있다.
Figure pct00003
화합물 6을 화합물 7- PG와 결합시킨 후에, 보호기 "PG"를 제거하여 화합물 1을 제공한다. 상기 보호기는 상기 정의된 바와 같은 아미노-보호기로부터 선택될 수 있다. 예를 들어, PG는 Boc-보호기일 수 있고, 이 경우에 탈보호는 TFA 또는 HCl과 같은 강산의 존재하에 수행될 수 있다.
중간체 3은 실험 섹션에 기재된 바와 같이 제조될 수 있다. 주요 보호된 중간체 5의 대체 제조 방법은 하기 반응식 2에 예시되어 있다.
Figure pct00004
브로모인다졸 알데히드 8은 벤질 보호된 이민 화합물 2와 반응하여 중간체 9를 제공할 수 있다. 상기 반응은 전형적으로 아황산 수소 나트륨 (sodium bisulfite)의 존재하에 약 130℃ 내지 약 140℃의 온도에서 약 1 내지 약 6시간 동안 또는 반응이 실질적으로 완료될 때까지 수행된다. 화합물 9는 수소화붕소나트륨 (sodium borohydride)과 같은 환원제를 사용하여 환원시켜서 화합물 10을 제공하고, 이는 보호된 페닐트리플루오로보레이트 11과 전형적인 Suzuki-Miyaura 커플링 조건하에 조합하여 중간체 5를 제공한다. 상기 반응은 전형적으로 높은 온도에서 팔라듐 촉매의 존재하에 수행된다. 상기 반응식 2에서 트리플루오로보레이트 칼륨 염으로 나타내는 Suzuki 파트너 11은 해당하는 보로네이트 (하기 제조예 1에서 중간체 1-5)를 이플루오르화 수소 칼륨과 반응시켜서 중간체 11을 제공함으로써 제조될 수 있다. 대안으로서, 상기 보로네이트 중간체는 트리플루오로보레이트 11 대신에 사용될 수 있다.
따라서, 일 방법 양상에서, 본 발명은 화학식 1의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 제조하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 화학식 6의 화합물을 화학식 7- PG의 화합물과 반응시키는 단계, 보호기 PG를 제거하는 단계, 및 선택적으로 화학식 1의 약학적으로-허용 가능한 염을 제조하여, 화학식 1의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 제공하는 단계를 포함한다.
약학적 조성물
화합물 1 및 이의 약학적으로-허용 가능한 염은 전형적으로 약학적 조성물 또는 제제의 형태로 사용된다. 이러한 약학적 조성물은 유익하게는 경구, 흡입, 안 주사 (optical injection), 국소 (경피 포함), 직장, 비강 및 비경구 투여 방식을 포함하지만, 이에 한정되지 않는 허용 가능한 임의의 투여 경로로 환자에게 투여될 수 있다.
따라서, 이의 조성물 양상들 중 하나에서, 본 발명은 약학적으로-허용 가능한 담체 또는 부형제, 및 화합물 1을 포함하는 약학적 조성물에 관한 것으로서, 여기서 상기에 정의된 바와 같이, "화합물 1"은 화합물 1 또는 이의 약학적으로-허용 가능한 염을 의미한다. 선택적으로, 이러한 약학적 조성물은 원한다면 다른 치료제 및/또는 제제화제 (formulating agents)를 함유할 수 있다. 조성물 및 이의 용도를 논의하는 경우, 화합물 1은 본원에서 "활성제 (active agent)"로도 언급될 수 있다.
일부 양상에서, 본 개시내용은 화합물 1 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 및 약학적으로-허용 가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 일부 양상에서, 상기 약학적 조성물은 안구 적용에 적합하다. 일부 양상에서, 상기 조성물은 안구에 주사하기에 적합하다. 일부 양상에서, 상기 조성물은 유리체내 (intravitreal) 주사에 적합하다. 일부 양상에서, 상기 조성물은 현탁액 (suspension)이다. 일부 양상에서, 상기 조성물은 결정성 현탁액이다.
본 발명의 약학적 조성물은 전형적으로 화합물 1을 치료적으로 유효한 양으로 함유한다. 그러나 당업자는 약학적 조성물이 벌크 (bulk) 조성물과 같이 치료적으로 유효한 양보다 더 많이 함유하거나, 또는 치료적으로 유효한 양을 달성하기 위해 다회 투여 목적으로 디자인된 개별 단위 용량 (individual unit dose)과 같이 치료적으로 유효한 양보다 더 적게 함유할 수 있다는 것을 알 것이다.
전형적으로, 이러한 약학적 조성물은 약 0.01 내지 약 95 중량% (% by weight)의 활성제; 예를 들어 약 0.05 내지 약 30 중량%; 및 약 0.1 내지 약 10 중량%의 활성제를 함유할 것이다.
임의의 기존의 담체 또는 부형제가 본 발명의 약학적 조성물에 사용될 수 있다. 특정 담체 또는 부형제, 또는 담체들 또는 부형제들의 조합의 선택은 특정 환자 또는 의학적 병태 또는 질병 상태의 타입을 치료하기 위해 사용되는 투여 방식에 좌우될 것이다. 이와 관련하여, 특정 투여 방식에 적합한 약학적 조성물의 제조는 약제학 분야에 통상의 기술을 가진 자의 범위 내에 있다. 또한, 본 발명의 약학적 조성물에 사용되는 담체들 또는 부형제들은 상업적으로 입수 가능하다. 추가적인 예시로서, 통상적인 제제화 기술은 Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th Edition, Lippincott Williams & White, Baltimore, Maryland (2000); and H.C. Ansel et al., Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, 7th Edition, Lippincott Williams & White, Baltimore, Maryland (1999)에 기재되어 있다.
약학적으로 허용 가능한 담체로 제공될 수 있는 물질들의 대표적인 예는 하기를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다: 당 예컨대 락토스, 글루코스 및 수크로스; 전분 예컨대 옥수수 전분 및 감자 전분; 셀룰로스 예컨대 미정질 셀룰로스 및 이의 유도체 예컨대 나트륨 카복시메틸 셀룰로스, 에틸 셀룰로스 및 셀룰로스 아세테이트; 트라가칸트 분말 (powdered tragacanth); 맥아 (malt); 젤라틴; 탈크; 부형제 예컨대 코코아 버터 및 좌제 왁스 (suppository waxes); 오일 예컨대 땅콩유, 면실유, 홍화씨유, 참깨유, 올리브유, 옥수수유 및 대두유; 글리콜 예컨대 프로필렌 글리콜; 폴리올 예컨대 글리세린, 소르비톨, 만니톨 및 폴리에틸렌 글리콜; 에스테르 예컨대 에틸 올레에이트 및 에틸 라우레이트; 아가 (agar); 완충제 예컨대 수산화마그네슘 및 수산화알루미늄; 알긴산; 발열성물질-제거수 (pyrogen-free water); 등장성 식염수; 링거액; 에틸 알콜; 인산염 완충 용액; 및 약학적 조성물에 사용되는 다른 무독성 적합성 물질.
약학적 조성물은 전형적으로 활성제를 약학적으로-허용 가능한 담체 및 하나 이상의 선택적 성분들과 철저하게 (thoroughly) 및 친밀하게 (intimately) 혼합 (mixing) 또는 블렌딩 (blending)하여 제조된다. 그 다음에 수득된 균일하게 블렌딩된 혼합물은 기존의 절차 및 장비를 사용하여, 정제 (tablets), 캡슐 (capsules), 환제 (pills) 등으로 성형 또는 로딩될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 바람직하게 단위 제형 (unit dosage form)으로 패키징 (package)된다. 용어 "단위 제형 (unit dosage form)"은 환자에게 투여하기에 적합한 물리적으로 분리된 단위를 지칭하고, 즉 각 단위는 원하는 치료 효과를 발휘하도록 계산된 미리 결정된 양의 활성제를 단독으로 또는 하나 이상의 추가적인 단위와 조합하여 함유한다. 예를 들어, 이러한 단위 제형은 캡슐, 정제, 환제 및 유사물, 또는 안구 또는 비경구 투여에 적합한 단위 패키지일 수 있다.
일 구체예에서, 본 발명의 약학적 조성물은 경구 투여에 적합하다. 경구 투여에 적합한 약학적 조성물은 캡슐, 정제, 환제, 로젠지 (lozenge), 카쉐 (cachet), 드라제 (dragee), 산제 (powder), 과립제 (granule); 또는 수성 또는 비-수성 액체 중의 용액 또는 현탁액; 또는 수중유 (oil-in-water) 또는 유중수 (water-in-oil) 액체 에멀젼; 또는 엘릭서제 (elixir) 또는 시럽제 등의 형태일 수 있고; 각각은 활성 성분으로서 화합물 1의 미리 결정된 양을 함유한다.
고체 제형으로 (즉, 캡슐, 정제, 환제 등으로) 경구 투여를 의도하는 경우, 본 발명의 약학적 조성물은 전형적으로 활성제 및 하나 이상의 약학적으로-허용 가능한 담체를 포함할 것이다. 선택적으로, 이러한 고체 제형은 하기를 포함할 수 있다: 충전제 (filler) 또는 증량제 (extender), 예컨대 전분, 미정질 셀룰로스, 락토스, 제2 인산칼슘, 수크로스, 글루코스, 만니톨, 및/또는 규산 (silicic acid); 결합제, 예컨대 카복시메틸셀룰로스, 알기네이트, 젤라틴, 폴리비닐 피롤리돈, 수크로스 및/또는 아카시아; 보습제 (humectants), 예컨대 글리세롤; 붕해제, 예컨대 크로스카멜로스 나트륨, 아가-아가 (agar-agar), 탄산칼슘, 감자 또는 타피오카 전분, 알긴산, 소정의 실리케이트, 및/또는 탄산나트륨; 용액 지연제, 예컨대 파라핀; 흡수 촉진제, 예컨대 4차 암모늄 화합물; 습윤제, 예컨대 세틸 알콜 및/또는 글리세롤 모노스테아레이트; 흡수제, 예컨대 카올린 (kaolin) 및/또는 벤토나이트 (bentonite) 클레이; 활택제, 예컨대 탈크, 스테아르산 칼슘, 스테아르산 마그네슘, 고체 폴리에틸렌 글리콜, 라우릴 황산 나트륨, 및/또는 이들의 혼합물; 착색제; 및 완충제.
이형제, 습윤제, 코팅제, 감미제, 풍미제 및 방향제, 보존제 및 산화방지제가 또한 본 발명의 약학적 조성물 중에 존재할 수 있다. 약학적으로-허용 가능한 산화방지제의 예는 하기를 포함한다: 수-용해성 산화방지제, 예컨대 아스코르브산, 시스테인 염산염, 황산 수소 나트륨, 메타비설페이트 나트륨 (sodium metabisulfate), 아황산 나트륨 및 유사물; 지용성 산화방지제, 예컨대 아스코르빌 팔미테이트, 부틸화 히드록시아니솔, 부틸화 히드록시톨루엔, 레시틴, 프로필 갈레이트 (gallate), 알파-토코페롤 및 유사물; 및 금속-킬레이트제, 예컨대 시트르산, 에틸렌디아민 테트라아세트산, 소르비톨, 타르타르산, 인산 및 유사물. 정제, 캡슐, 환제 및 유사물용 코팅제는 장용성 코팅에 사용되는 것, 예컨대 셀룰로스 아세테이트 프탈레이트, 폴리비닐 아세테이트 프탈레이트, 히드록시프로필 메틸셀룰로스 프탈레이트, 히드록시프로필 메틸셀룰로스, 메타크릴산, 메타크릴산 에스테르 코폴리머, 셀룰로스 아세테이트 트리멜리테이트, 카복시메틸 에틸 셀룰로스, 히드록시프로필 메틸 셀룰로스 아세테이트 숙시네이트 및 유사물을 포함한다.
본 발명의 약학적 조성물은 또한 예로서, 다양한 비율의 히드록시프로필 메틸 셀룰로스; 또는 다른 폴리머 매트릭스, 리포솜 (liposomes) 및/또는 마이크로스피어 (microsphere)를 사용하여, 활성제의 방출이 지연 또는 제어되도록 제제화될 수 있다. 더욱이, 본 발명의 약학적 조성물은 불투명화제 (opacifying agent)를 선택적으로 함유할 수 있고, 선택적으로 지연된 방식으로, 위장관의 소정의 부분에서만 또는 상기에서 우선적으로 활성 성분을 방출하도록 제제화될 수 있다. 사용될 수 있는 포매 (embedding) 조성물의 예로는 폴리머 물질 및 왁스를 포함한다. 상기 활성제는 또한 적합하다면 전술된 부형제들 중 하나 이상을 갖는, 마이크로-캡슐화 형태 (micro-encapsulated form)일 수 있다.
경구 투여에 적합한 액체 제형은 예로서, 약학적으로-허용 가능한 에멀젼, 마이크로에멀젼, 용액, 현탁액, 시럽제 및 엘릭서제를 포함한다. 액체 제형은 전형적으로 활성제 및 불활성 희석제, 가령, 예를 들어 물 또는 기타 용매, 가용화제 및 유화제, 예컨대 에틸 알콜, 이소프로필 알콜, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알콜, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸렌 글리콜, 오일 (특히, 면실유, 땅콩유, 옥수수유, 배아유, 올리브유, 피마자유 및 참깨유), 올레산, 글리세롤, 테트라히드로푸릴 알콜, 폴리에틸렌 글리콜 및 소르비탄의 지방산 에스테르, 및 이들의 혼합물을 포함한다. 대안으로서, 소정의 액체 제제는 예를 들어 분무 건조에 의해 분말로 전환될 수 있고, 이는 기존의 절차에 의해 고체 제형을 제조하는데 사용된다.
현탁액은 활성 성분에 추가하여, 현탁화제, 가령 예를 들어 에톡실화 이소스테아릴 알콜, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 및 소르비탄 에스테르, 미정질 셀룰로스, 알루미늄 메타히드록사이드, 벤토나이트, 아가-아가 및 트라가칸트, 및 이들의 혼합물을 함유할 수 있다.
화합물 1은 또한 비경구로 (예: 정맥내, 피하, 근육내 또는 복강내 주사로) 투여될 수 있다. 비경구 투여의 경우, 활성제는 전형적으로 예로서, 멸균 수성 용액, 식염수, 저분자량 알콜 예컨대 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 식물성 오일, 젤라틴, 에틸 올레에이트와 같은 지방산 에스테르 등을 포함하는 비경구 투여에 적합한 비히클 (vehicle)과 혼합된다. 비경구 제제는 또한 하나 이상의 산화방지제, 가용화제, 안정화제, 보존제, 습윤제, 유화제, 완충제 또는 분산제를 함유할 수 있다. 이들 제제는 멸균 주사용 매질, 살균제, 여과, 조사, 또는 열을 사용하여 무균 상태로 만들 수 있다.
화합물 1은 또한 안구 주사를 위해 멸균 수성 현탁액 또는 용액으로 제제화될 수 있다. 이러한 수성 제제에 포함될 수 있는 유용한 부형제는 폴리소르베이트 80, 셀룰로스 폴리머 예컨대 카복시메틸셀룰로스, 히드록시프로필 메틸셀룰로스, 메틸셀룰로스, 염화칼륨, 염화칼슘, 염화나트륨, 염화마그네슘, 아세트산 나트륨, 시트르산 나트륨, 히스티딘, α-α-트레할로스 2수화물, 수크로스, 폴리소르베이트 20, 히드록시프로필-β-시클로덱스트린, 염화 벤잘코늄, 암버라이트 (Amberlite) IRP-69, 폴리옥시에틸렌 글리콜 에테르 (라우릴, 스테아릴 및 올레일), 에틸렌디아민테트라 아세트산 나트륨 염, 나트륨 타우로콜레이트, 사포닌 및 크레모포 (cremophor) EL, 폴리카보필-시스테인, 크산탄 검, 겔란 검, 히알루론산, 리포솜 및 인산나트륨을 포함한다. 투과 증진제, 계면활성제, 담즙산 (bile acids), 시클로덱스트린 예컨대 2-히드록시프로필-β-시클로덱스트린 및 킬레이트제가 상기 제제에 포함될 수 있다. 활성제와 복합체를 형성할 수 있는 능력을 갖는, 친수성 외부면과 친유성 내부면을 갖는 원통형 올리고뉴클레오티드가 또한 상기 제제에 포함될 수 있다. 벤질 알콜은 보존제로 제공될 수 있고, 염화나트륨은 강장도 (tonicity)를 조정하기 위해 포함될 수 있다. 또한, 염산 및/또는 수산화나트륨이 pH 조정을 위해 상기 용액에 부가될 수 있다. 안구 주사를 위한 수성 제제는 보존제 없이 (preservative-free) 제조될 수 있다.
상기 안구용 제제는 활성 성분을 안구로 지속 방출시킬 수 있다. 상기 안구용 제제는 에멀젼 (수중유 또는 유중수), 현탁액 또는 연고로서 제제화될 수 있다. 상기 현탁액 제제는 화합물 1 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 결정형, 예를 들어 결정형 1 또는 결정형 2, 또는 비결정 상태로 함유할 수 있다.
화합물 1은 또한 점안약 투여를 위해 또는 유리체내 이식물로서 적합하게 제제화될 수 있다. 상기 이식물은 약물을 일정한 치료적 수준으로 전달할 수 있다. 보유 이식물 (reservoir implants)은 전형적으로 실리콘, 에틸렌 비닐 아세테이트 (EVA) 또는 폴리비닐 알콜 (PVA)과 같은 비반응성 물질로 둘러싸인 펠렛화된 약물 코어로 제조된다; 이들 이식물은 비생분해성 (nonbiodegradable)이고, 약물을 몇 개월에서 1년까지 지속적으로 전달할 수 있다. 매트릭스 이식물 (matrix implants)이 또한 사용될 수 있다. 이들은 전형적으로 1일 내지 6개월의 기간 동안 약물의 로딩 용량 (loading dose)을 전달하고 이어서 테이퍼링 용량 (tapering doses)을 전달하는데 사용된다. 이들은 가장 일반적으로 코폴리머 폴리-락트산 (PLA) 및/또는 폴리-락틱-글리콜산 (PLGA)으로부터 제조되며, 이는 물과 이산화탄소로 분해된다. 이온영동 (Iontophoresis)이 또한 사용될 수 있다. 이는 조직에 이온화된 약물의 침투를 증진시키기 위해 소량의 전류를 적용하는 비침습적 기법이다.
세포-기반 전달 시스템인 ECT (Encapsulated cell technology)가 또한 치료제를 안구로 전달하는데 사용될 수 있다. 전형적으로, 유전자 변형된 세포를 반투과성 막의 중공 튜브로 패키징하고, 이는 면역-세포 진입을 방지하고, 영양물질 및 치료 분자는 상기 막을 통해 자유롭게 확산되도록 한다. 상기 폴리머 섹션의 두 말단을 밀봉하고, 티타늄 루프를 고정 말단에 배치하고, 이를 편평 부분 (pars plana)에 이식하고, 공막 (sclera)에 고정시킨다.
화합물 1이 안구 뒤쪽으로 전달되도록 하는 임의의 형태로 제제화될 수 있다. 전달 방식의 예가 문헌에 알려져 있다 (Kuno et al, Polymers, 2011, 3, 193-221, del Amo et al, Drug Discovery Today, 2008, 13, 135-143, Short, Toxicologic Pathology, 2008, 36, 49-62). 이러한 전달 방식은 이에 한정되는 것은 아니지만, 맥락막위 공간을 통해 맥락막 및 망막으로 전달할 수 있는 맥락막위 (suprachoroidal) 전달, 테논낭하 (sub-Tenon) 전달, 안구 주위 (peri-ocular) 전달, 콘택트 렌즈 (contact lenses), 눈물점 마개 (punctal plugs) 및 공막 마개 (scleral plugs)를 포함한다. 화합물 1은 또한 안구 주위 (periocular), 공막위 (suprascleral), 안구후 (retrobulbar), 눈 둘레 (peribulbar) 또는 결막하 (subconjunctival) 주사로 전달될 수 있다.
화합물 1은 에멀젼, 폴리머 마이크로스피어 또는 나노스피어, 리포솜, 마이크로입자 또는 나노입자, 마이크로스피어, 미셀 (micelles) 또는 덴드리머 (dendrimers)로서 전달될 수 있다. 생분해성 및 생체적합성 폴리머, 예컨대 폴리악티드 (polyactide) 및 PLGA가 사용될 수 있다. 화합물 1은 캡슐화될 수 있다.
또한, 화합물 1은 피부에 국소 투여를 위해 연고 또는 크림으로 제제화될 수 있다. 연고 제제는 전형적으로 맑은 오일 또는 그리스 (greasy) 물질의 베이스를 갖는 반고체 제제이다. 연고 제제에 사용하기에 적합한 오일 물질은 바셀린 (바셀린 젤리 (petroleum jelly)), 밀납 (beeswax), 코코아 버터, 셰어 버터 (shea butter) 및 세틸 알콜을 포함한다. 연고는 선택적으로 원한다면 연화제 (emollients) 및 투과 증진제 (penetration enhancers)를 추가로 포함할 수 있다.
크림 제제는 전형적으로 정제수를 포함하는, 오일상과 수성상을 포함하는 에멀젼으로 제조될 수 있다. 크림 제제의 성분은 하기를 포함할 수 있다: 오일 베이스, 예컨대 바셀린, 미네랄 오일, 식물성 및 동물성 오일, 및 트리글리세리드; 크림 베이스, 예컨대 라놀린 알콜, 스테아르산, 및 세토스테아릴 알콜; 겔 베이스, 예컨대 폴리비닐 알콜; 용매, 예컨대, 프로필렌 글리콜 및 폴리에틸렌 글리콜; 유화제, 예컨대 폴리소르베이트, 스테아레이트, 예컨대 글리세릴 스테아레이트, 옥틸히드록시스테아레이트, 폴리옥실 스테아레이트, PEG 스테아릴 에테르, 이소프로필 팔미테이트 및 소르비탄 모노스테아레이트; 안정화제, 예컨대 폴리사카라이드 및 아황산 나트륨; 연화제 (즉 보습제), 예컨대 중간쇄 (medium chain) 트리글리세리드, 이소프로필 미리스테이트 및 디메티콘; 강화제 (stiffening agents), 예컨대 세틸 알콜 및 스테아릴 알콜; 항미생물제, 예컨대 메틸파라벤, 프로필파라벤, 페녹시에탄올, 소르브산, 디아졸리디닐 우레아, 및 부틸화 히드록시아니솔; 투과 증진제, 예컨대 N-메틸피롤리돈, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 모노라우레이트 및 유사물; 및 킬레이트제, 예컨대 에데트산 2나트륨.
대안으로서, 본 발명의 약학적 조성물은 흡입 투여를 위해 제제화된다. 흡입 투여에 적합한 약학적 조성물은 전형적으로 에어로졸 또는 분말의 형태일 것이다. 이러한 조성물은 일반적으로 잘 알려져 있는 전달 장치, 예컨대 정량식 흡입기 (metered-dose inhaler), 건조 분말 흡입기, 네뷸라이저 (nebulizer) 또는 유사한 전달 장치를 사용하여 투여된다.
가압된 용기 (pressurized container)를 사용하여 흡입 투여하는 경우, 본 발명의 약학적 조성물은 전형적으로 활성 성분 및 적절한 분사제, 예컨대 디클로로디플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄, 이산화탄소 또는 다른 적절한 기체를 포함할 것이다. 또한, 상기 약학적 조성물은 화합물 1 및 분말 흡입기에 사용하기에 적합한 분말을 포함하는 캡슐 또는 카트리지 (예를 들어 젤라틴으로 만들어짐)의 형태일 수 있다. 적합한 분말 베이스는 예로서 락토스 또는 전분을 포함한다.
하기 비-제한적인 예는 본 발명의 대표적인 약학적 조성물을 예시한다.
정제 경구용 고체 제형
화합물 1 또는 이의 약학적으로-허용 가능한 염을 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈 및 크로스카멜로스 나트륨과 4:5:1:1의 비율로 건식 블렌딩하고, 정제로 압축하여, 예를 들어 정제 당 5 mg, 20　mg 또는 40 mg의 활성제를 갖는 단위 제형을 제공한다.
캡슐 경구용 고체 제형
화합물 1 또는 이의 약학적으로-허용 가능한 염을 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈 및 크로스카멜로스 나트륨과 4:5:1:1의 비율로 습식 과립화에 의해 조합하고, 젤라틴 또는 히드록시프로필 메틸셀룰로스 캡슐로 로딩하여, 예를 들어 캡슐 당 5 mg, 20　mg 또는 40 mg의 활성제를 갖는 단위 제형을 제공한다.
액체 제제
화합물 1 (0.1%), 물 (98.9%) 및 아스코르브산 (1.0%)을 포함하는 액체 제제는, 본 발명의 화합물을 물과 아스코르브산의 혼합물에 부가하여 형성한다.
장용 코팅된 경구용 제형
화합물 1을 폴리비닐 피롤리돈을 함유하는 수용액에 용해시키고, 미정질 셀룰로스 또는 슈거 비드 (sugar beads) 상에 1:5 w/w의 활성제:비드의 비율로 분무 코팅하고, 그 다음에 아크릴산 코폴리머를 포함하는 장용 코팅제를 중량이 약 5% 증량되도록 적용한다. 상기 장용 코팅된 비드를 젤라틴 또는 히드록시프로필 메틸셀룰로스 캡슐로 로딩하여 예를 들어 캡슐 당 30　mg의 활성제를 갖는 단위 제형을 제공한다.
장용 코팅된 경구용 제형
Eudragit-L® 및 Eudragit-S®의 조합, 또는 히드록시프로필 메틸셀룰로스 아세테이트 숙시네이트를 포함하는 장용 코팅제를 전술한 정제 경구용 제형 또는 캡슐 경구용 제형에 적용한다.
안구 주사용 수성 제제
각 mL의 멸균 수성 현탁액은 5 mg 내지 50 mg의 화합물　1, 강장도를 위한 염화나트륨, 보존제로서 0.99% (w/v)의 벤질 알콜, 0.75%의 카복시메틸셀룰로스 나트륨 및 0.04%의 폴리소르베이트를 포함한다. pH를 5 내지 7.5로 조정하기 위해 수산화나트륨 또는 염산이 포함될 수 있다.
안구 주사용 수성 제제
멸균 무-보존제 수성 현탁액은 10 mM 인산나트륨, 40 mM 염화나트륨, 0.03% 폴리소르베이트 20 및 5% 수크로스 중에 화합물 1을 5 mg/mL 내지 50 mg/mL로 포함한다.
국소 투여용 연고 제제
화합물 1을 바셀린, C8-C10 트리글리세리드, 옥틸히드록시스테아레이트 및 N-메틸피롤리돈과, 0.05 중량% 내지 5 중량%의 활성제를 함유하는 조성물을 제공하는 비율로 조합한다.
국소 투여용 연고 제제
화합물 1을 화이트 바셀린 (white petrolatum), 프로필렌 글리콜, 모노- 및 디-글리세리드, 파라핀, 부틸화 히드록시톨루엔 및 에데테이트 칼슘 2나트륨과, 0.05 중량% 내지 5 중량%의 활성제를 함유하는 조성물을 제공하는 비율로 조합한다.
국소 투여용 연고 제제
화합물 1을 미네랄 오일, 파라핀, 프로필렌 카보네이트, 화이트 바셀린 및 화이트 왁스 (white wax)와 조합하여 0.05 중량% 내지 5 중량%의 활성제를 함유하는 조성물을 제공한다.
국소 투여용 크림 제제
미네랄 오일을 화합물 1, 프로필렌 글리콜, 이소프로필 팔미테이트, 폴리소르베이트 60, 세틸 알콜, 소르비탄 모노스테아레이트, 폴리옥실 (polyoxyl) 40 스테아레이트, 소르브산, 메틸파라벤 및 프로필파라벤과 조합하여 오일상을 형성하고, 이를 정제수와 전단 블렌딩 (shear blending)에 의해 조합하여 0.05 중량% 내지 5 중량%의 활성제를 함유하는 조성물을 제공한다.
국소 투여용 크림 제제
화합물 1, 벤질 알콜, 세틸 알콜, 시트르산 무수물, 모노 및 디-글리세리드, 올레일 알콜, 프로필렌 글리콜, 나트륨 세토스테아릴 설페이트, 수산화나트륨, 스테아릴 알콜, 트리글리세리드 및 물을 포함하는 크림 제제는 0.05 중량% 내지 5 중량%의 활성제를 함유한다.
국소 투여용 크림 제제
화합물 1, 세토스테아릴 알콜, 이소프로필 미리스테이트, 프로필렌 글리콜, 세토마크로골 (cetomacrogol) 1000, 디메티콘 360, 시트르산, 시트르산 나트륨 및 정제수와, 보존제로서 이미두레아 (imidurea), 메틸파라벤 및 프로필파라벤을 포함하는 크림 제제는 0.05 중량% 내지 5 중량%의 활성제를 함유한다.
건조 분말 조성물
미분화된 화합물 1 (1 g)을 분쇄된 락토스 (25 g)와 블렌딩한다. 그 다음에 상기 블렌딩한 혼합물은 도스 (dose)당 화합물 1을 약 0.1 mg 내지 약 4 mg으로 제공하기에 충분한 양으로 박리형 블리스터 팩 (peelable blister pack)의 개별 블리스터에 로딩한다. 상기 블리스터의 내용물은 건조 분말 흡입기를 사용하여 투여된다.
정량식 흡입기용 조성물
탈염수 (200 mL)에 레시틴 (0.2 g)을 용해시켜서 제조된 용액 중에 미분화된 화합물 1 (10 g)을 분산시킨다. 수득된 현탁액을 분무 건조하고, 그 다음에 미분화하여 약 1.5 μm 미만의 평균 직경을 갖는 입자를 포함하는 미분화된 조성물을 형성한다. 그 다음에 상기 미분화된 조성물을 정량식 흡입기로 투여하는 경우, 도스 당 화합물 1을 약 0.1 mg 내지 약 4 mg으로 제공하기에 충분한 양으로 상기 미분화된 조성물을 가압된 1,1,1,2-테트라플루오로에탄을 함유하는 정량식 흡입기 카트리지에 로딩한다.
네뷸라이저용 조성물
화합물 1 (25 mg)을 1.5-2.5 당량의 염산을 함유하는 용액에 용해시키고, 그 다음에 pH를 3.5 내지 5.5로 조정하기 위한 수산화나트륨 및 3 중량%의 글리세롤을 부가한다. 모든 성분들이 용해될 때까지 상기 용액을 잘 교반한다. 상기 용액은 네뷸라이저 장치를 사용하여, 도스 당 화합물 1을 약　0.1 mg 내지 약 4 mg으로 제공하도록 투여한다.
유용성
화합물 1이 JAK 패밀리 효소인 JAK1, JAK2, JAK3 및 TYK2의 강력한 억제제인 것으로 밝혀졌다.
안구 질환
많은 안구 질환이 JAK-STAT 경로에 의존하는 염증유발 사이토킨 (proinflammatory cytokines)의 증가와 관련이 있는 것으로 밝혀졌다. 화합물 1은 4개의 JAK 효소 모두에서 강력한 억제를 나타내기 때문에, 이는 JAK를 통해 신호를 전달하는 다수의 사이토킨 (예: IL-6, IL-2 및 IFN-γ)의 신호전달 및 병원성 효과를 강력하게 억제할 뿐만 아니라 JAK-STAT 경로 신호전달에 의해 생성이 유도되는 다른 사이토킨 (예: MCP-1 및 IP-10)의 증가를 방지할 것으로 기대된다.
분석 섹션에 예시된 바와 같이, 화합물 1은 사이토킨 증가의 하류 효과의 억제를 기록하는 분석법을 포함하는, 세포 분석법에서 활성을 나타내었다.
또한, 화합물 1의 유리체내 투여는 래트 (rat)의 망막/맥락막 조직에서 IL-6 유도된 pSTAT3의 상당한 억제를 입증하였다.
유의한 전신 수준 없이 안구 JAK 억제는 전신-유발 유해 효과 없이 안구에서 강력한, 국소 항-염증 활성을 초래할 것으로 기대된다. 따라서, 화합물 1은 포도막염, 당뇨 망막병증, 당뇨 황반 부종, 안구건조증, 연령-관련 황반 변성, 망막 정맥 폐쇄 및 아토피성 각막결막염을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아닌 다수의 안구 질환에서 유익할 것으로 기대된다.
구체적으로, 포도막염 (Horai and Caspi, J Interferon Cytokine Res, 2011, 31, 733-744), 당뇨 망막병증 (Abcouwer, J Clin Cell Immunol, 2013, Suppl 1, 1-12), 당뇨 황반 부종 (Sohn et al., American Journal of Opthalmology, 2011, 152, 686-694), 안구건조증 (Stevenson et al, Arch Ophthalmol , 2012, 130, 90-100), 망막 정맥 폐쇄 (Shchuko et al, Indian Journal of Ophthalmology, 2015, 63(12), 905-911) 및 연령-관련 황반 변성 (Knickelbein et al, Int Ophthalmol Clin, 2015, 55(3), 63-78)은 JAK-STAT 경로를 통해 신호를 전달하는 소정의 염증유발 사이토킨 증가를 특징으로 한다. 따라서, 화합물 1은 관련된 안구 염증 완화 및 질병 진행 역전 또는 이들 질환의 증상 완화를 제공할 수 있을 것으로 기대된다.
일 양상에서, 그러므로, 본 발명은 포유동물에서 안구 질환을 치료하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 화합물 1 또는 이의 약학적으로-허용 가능한 염, 및 약학적 담체를 포함하는 약학적 조성물을 상기 포유동물의 안구에 투여하는 단계를 포함한다. 일 양상에서, 상기 안구 질환은 포도막염, 당뇨 망막병증, 당뇨 황반 부종, 안구건조증, 연령-관련 황반 변성, 망막 정맥 폐쇄 또는 아토피성 각막결막염이다. 일 양상에서, 상기 방법은 화합물 1을 유리체내 주사로 투여하는 단계를 포함한다.
염증성 피부 질환
염증성 피부 질환, 예컨대 아토피성 피부염은 JAK-STAT 경로에 의존하는 염증유발 사이토킨, 구체적으로 IL-4, IL-5, IL-10, IL-13 및 IFNγ의 증가와 관련이 있다. 그러므로 화합물 1은 아토피성 피부염, 원형탈모증 (alopecia areata), 백반증 (vitiligo), 피부 T 세포 림프종 (cutaneous T cell lymphoma), 결절성 가려움발진 (prurigo nodularis), 편평태선 (lichen planus), 원발성 국소 피부 아밀로이드증 (primary localized cutaneous amyloidosis), 물집유사천포창 (bullous pemphigoid), 이식편대 숙주 질환의 피부 증상, 유사천포창 (pemphigoid), 원반모양 루푸스 (discoid lupus), 고리육아종 (granuloma annulare), 목덜미단순태선 (lichen simplex chronicus), 외음부/음낭/항문주위 소양증, 경화태선 (lichen sclerosus), 대상포진신경통후 가려움 (post herpetic neuralgia itch), 모공 편평 태선 (lichen planopilaris) 및 탈모털집염 (foliculitis decalvans)을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아닌 다수의 피부 염증성 또는 소양성 병태에 유익할 것으로 기대된다. 구체적으로, 원형탈모증 (Xing et al., Nat Med . 2014 Sep;20(9):1043-9), 백반증 (Craiglow et al, JAMA Dermatol . 2015 Oct;151(10):1110-2), 피부 T 세포 림프종 (Netchiporouk et al., Cell Cycle. 2014;13(21):3331-5), 결절성 가려움발진 (Sonkoly et al., J Allergy Clin Immunol. 2006 Feb;117(2):411-7), 편평태선 (Welz-Kubiak et al., J Immunol Res. 2015;2015:854747), 원발성 국소 피부 아밀로이드증 (Tanaka et al., Br J Dermatol. 2009 Dec;161(6):1217-24), 물집유사천포창 (Feliciani et al., Int J Immunopathol Pharmacol . 1999 May-Aug;12(2):55-61) 및 이식편대 숙주 질환의 피부 증상 (Okiyama et al., J Invest Dermatol. 2014 Apr;134(4):992-1000)은 JAK 활성화를 통해 신호를 전달하는 소정의 사이토킨 증가를 특징으로 한다. 따라서, 화합물 1은 이들 사이토킨에 의해 유발된 관련 피부 염증 또는 소양증을 완화시킬 수 있을 것으로 기대된다.
일 양상에서, 그러므로, 본 발명은 포유동물 (예: 인간)에서 염증성 피부 질환을 치료하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 화합물 1 또는 이의 약학적으로-허용 가능한 염, 및 약학적 담체를 포함하는 약학적 조성물을 상기 포유동물의 피부에 적용하는 단계를 포함한다. 일 양상에서, 상기 염증성 피부 질환은 아토피성 피부염이다.
화합물 1은 또한 그람 양성 항생제, 예컨대 무피로신 (mupirocin) 및 푸시드산 (fusidic acid)과 병용하여 사용되어, 염증성 피부 질환을 치료할 수 있다. 일 양상에서, 그러므로, 본 발명은 포유동물에서 염증성 피부 질환을 치료하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 화합물 1 및 그람 양성 항생제를 상기 포유동물의 피부에 적용하는 단계를 포함한다. 다른 양상에서, 본 발명은 화합물 1 또는 이의 약학적으로-허용 가능한 염, 그람 양성 항생제, 및 약학적으로-허용 가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.
호흡기 질환
JAK-STAT 경로를 통해 신호를 전달하는 사이토킨, 구체적으로 IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-11, IL-13, IL-23, IL-31, IL-27, 흉선 기질상 림포포이에틴 (TSLP), 인터페론-γ (IFNγ) 및 과립구-마크로파지 콜로니-자극 인자 (GM-CSF)는 또한 천식 염증 및 다른 염증성 호흡기 질환과 관련이 있다. 상기에 기재된 바와 같이, 화합물 1이 JAK1, JAK2, JAK3 및 TYK2 효소의 강력한 억제제인 것으로 밝혀졌고, 또한 세포 분석법에서 염증유발 사이토킨의 강력한 억제를 입증하였다.
JAK 억제제의 항-염증 활성은 천식의 전임상 모델에서 강력하게 입증되었다 (Malaviya et al., Int Immunopharmacol , 2010, 10, 829,-836; Matsunaga et al., Biochem and Biophys Res Commun , 2011, 404, 261-267; Kudlacz et al., Eur J Pharmacol, 2008, 582, 154-161). 따라서, 화합물 1은 염증성 호흡기 장애, 구체적으로 천식 치료에 유용할 것으로 기대된다. 폐의 염증 및 섬유증은 천식 이외의 다른 호흡기 질환 예컨대 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD), 낭성 섬유증 (CF), 폐렴, 간질성 폐 질환 (특발성 폐 섬유증 포함), 급성 폐 손상, 급성 호흡 곤란 증후군, 기관지염, 폐기종 및 폐쇄세기관지염의 특징이다. 그러므로, 화합물 1은 또한 만성 폐쇄성 폐 질환, 낭성 섬유증, 폐렴, 간질성 폐 질환 (특발성 폐 섬유증 포함), 급성 폐 손상, 급성 호흡 곤란 증후군, 기관지염, 폐기종, 폐쇄세기관지염 및 사르코이드증 치료에 유용할 것으로 기대된다.
일 양상에서, 그러므로, 본 발명은 포유동물 (예: 인간)에서 호흡기 질환을 치료하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 상기 포유동물에게 화합물 1 또는 이의 약학적으로-허용 가능한 염을 투여하는 단계를 포함한다.
일 양상에서, 상기 호흡기 질환은 천식, 만성 폐쇄성 폐 질환, 낭성 섬유증, 폐렴, 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD), 낭성 섬유증 (CF), 폐렴, 간질성 폐 질환 (특발성 폐 섬유증 포함), 급성 폐 손상, 급성 호흡 곤란 증후군, 기관지염, 폐기종, 폐쇄세기관지염 또는 사르코이드증이다. 다른 양상에서, 상기 호흡기 질환은 천식 또는 만성 폐쇄성 폐 질환이다.
추가의 양상에서, 상기 호흡기 질환은 폐 감염, 연충 감염 (helminthic infection), 폐 동맥 고혈압 (pulmonary arterial hypertension), 사르코이드증, 림프관평활근종증 (lymphangioleiomyomatosis), 기관지확장증 (bronchiectasis) 또는 침윤성 폐 질환 (infiltrative pulmonary disease)이다. 또 다른 양상에서, 상기 호흡기 질환은 약물-유발 폐렴 (drug-induced pneumonitis), 진균 유발 폐렴 (fungal induced pneumonitis), 알레르기성 기관지폐 아스페르길루스증 (allergic bronchopulmonary aspergillosis), 과민성 폐렴 (hypersensitivity pneumonitis), 다발혈관염을 동반한 호산구성 육아종증 (eosinophilic granulomatosis with polyangiitis), 특발성 급성 호산구성 폐렴 (idiopathic acute eosinophilic pneumonia), 특발성 만성 호산구성 폐렴 (idiopathic chronic eosinophilic pneumonia), 과호산구성 증후군 (hypereosinophilic syndrome), 뢰플러 증후군 (Loeffler syndrome), 폐쇄세기관지염 기질화 폐렴 또는 면역-체크포인트-억제제 유발 폐렴 (immune-checkpoint-inhibitor induced pneumonitis)이다.
본 발명은 또한 포유동물에서 천식을 치료하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 상기 포유동물에게 화합물 1 또는 이의 약학적으로-허용 가능한 염 및 약학적으로-허용 가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물을 투여하는 단계를 포함한다.
화합물 1 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 또한 호산구성 폐 질환을 치료하는데 유용할 수 있을 것으로 기대된다. 호산구성 기도 염증은 호산구성 폐 질환으로 집합적으로 불리는 질환의 특징적인 특성이다 (Cottin et al., Clin. Chest. Med ., 2016, 37(3), 535-56). 호산구성 질환 (eosinophilic disease)은 IL-4, IL-13 및 IL-5 신호전달과 관련이 있다. 호산구성　폐　질환은 감염 (구체적으로 연충 감염), 약물-유발 폐렴 (예를 들어 치료 약물 예컨대 항생제, 페니토인 (phenytoin) 또는　l-트립토판에 의한 유발), 진균-유발 폐렴 (예: 알레르기성 기관지폐 아스페르길루스증), 과민성 폐렴 및 다발혈관염을 동반한 호산구성　육아종증 (이전에 척-스트라우스 증후군 (Churg-Strauss syndrome)으로 알려져 있음)을 포함한다. 알려져 있지 않은 병인의 호산구성　폐　질환으로는 특발성 급성　호산구성　폐렴, 특발성 만성　호산구성　폐렴, 과호산구성　증후군 및 뢰플러 증후군을 포함한다.
화합물 1 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 또한 PAH를 치료하는데 유용할 수 있다. IL-6 유전자의 다형 (polymorphism)은 IL-6의 수준 증가 및 폐 동맥 고혈압 (PAH)의 발생 위험 증가와 관련이 있다 (Fang et al., J Am Soc Hypertens., 2017, 11(3), 171-177). PAH에서 IL-6의 역할을 입증하여, IL-6 수용체 사슬 gp130의 억제로 PAH의 래트 모델에서 상기 질환을 개선하였다 (Huang et al., Can J Cardiol ., 2016, 32(11), 1356.e1-1356.e10).
화합물 1 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 또한 비-알레르기성 폐 질환 예컨대 사르코이드증 및 림프관평활근종증을 치료하는데 유용할 수 있다. 사이토킨 예컨대 IFNγ, IL-12 및 IL-6은 광범위한 비-알레르기성 폐 질환 예컨대 사르코이드증 및 림프관평활근종증과 관련이 있다 (El-Hashemite et al., Am. J. Respir. Cell Mol. Biol ., 2005, 33, 227-230, and El-Hashemite et al., Cancer Res., 2004, 64, 3436-3443).
화합물 1 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 또한 만성 호중구성 염증과 관련이 있는 질환인 기관지확장증 및 침윤성 폐 질환을 치료하는데 유용할 수 있다. 소정의 사이토킨은 호중구성 염증과 관련이 있다 (예: IL-6, IFNγ).
병리학적 T 세포 활성화는 다수의 호흡기 질환의 병인에 있어서 중요하다. 자가반응성 T 세포는 폐쇄세기관지염 기질화 폐렴 (또한, COS라고 함)에서 역할을 한다. COS와 유사하게, 폐 이식 거부 반응의 병인은 이식된 공여자 폐에 의한 수혜자 T 세포의 비정상적인 T 세포 활성화와 관련이 있다. 폐 이식 거부 반응은 초기에 원발성 이식 기능장애 (PGD), 기질화 폐렴 (OP), 급성 거부 반응 (AR) 또는 림프구성 세기관지염 (LB)으로 발생할 수 있거나, 또는 폐 이식 후 수년 후에 만성 폐 동종이식 기능장애 (CLAD)로 발생할 수 있다. CLAD는 이전에 폐쇄세기관지염 (BO)으로 알려졌지만, 현재는 BO, 제한성 CLAD (rCLAD 또는 RAS) 및 호중구성 동종이식 기능장애를 포함한 다양한 병리학적 증상을 가질 수 있는 증후군으로 간주된다. 만성 폐 동종이식 기능장애 (CLAD)는 이식된 폐가 점진적으로 기능을 손실하게 되므로 폐 이식 수혜자의 장기 관리에 있어서 주요 과제이다 (Gauthier et al., Curr Transplant Rep., 2016, 3(3), 185-191). CLAD는 치료에 잘 반응하지 않으므로, 이러한 병태를 예방 또는 치료할 수 있는 효과적인 화합물이 여전히 필요하다. IFNγ 및 IL-5와 같은 몇몇 JAK-의존성 사이토킨은 CLAD 및 폐 이식 거부 반응에서 상향 조절된다 (Berastegui et al, Clin. Transplant. 2017, 31, e12898). 더욱이, JAK-의존성 IFN 신호전달의 하류인 CXCL9 및 CXCL10과 같은 CXCR3 케모킨의 높은 폐 수준은 폐 이식 환자에서 더 나쁜 결과와 관련이 있다 (Shino et al, PLOS One, 2017, 12 (7), e0180281). JAK 억제는 신장 이식 거부 반응에 효과적인 것으로 밝혀졌다 (Vicenti et al., American Journal of Transplantation, 2012, 12, 2446-56). 그러므로 화합물 1은 폐 이식 거부 반응 및 CLAD를 치료 또는 예방하는데 효과적일 가능성이 있다. 폐 이식 거부 반응의 기초로 설명된 유사한 T 세포 활성화 이벤트는 또한 조혈 줄기세포 이식 후에 발생할 수 있는 폐 이식편대 숙주 질환 (GVHD)의 주요 동인으로 간주된다. CLAD와 유사하게, 폐 GVHD는 결과가 극도로 좋지 않은 만성 진행성 병태이며, 현재 승인된 치료법이 없다. 구제 요법 (salvage therapy)으로 전신 JAK 억제제인 룩솔리티닙을 투여받은 스테로이드-불응성 급성 또는 만성 GVHD 환자 95명을 대상으로 한 후향적 다기관 조사 연구에서, 폐 GVHD 환자를 포함한 대부분의 환자에서 룩솔리티닙에 대한 완전 또는 부분 반응이 입증되었다 (Zeiser et al, Leukemia, 2015, 29, 10, 2062-68). 최근에는 면역-체크포인트 억제제 사용이 증가하면서 또 다른 T 세포 매개 폐 질환인, 면역-체크포인트 억제제 유발 폐렴이 나타났다. 이들 T 세포 자극제로 치료를 받은 암 환자에서, 치명적인 폐렴이 발생할 수 있다. 화합물 1 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 이러한 취약한 중증 호흡기 질환에 대한 신규한 치료를 제시할 가능성을 갖는다.
위장관 질환
JAK 억제제로서, 화합물 1 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 또한 다양한 다른 질환에 유용할 수 있다. 화합물 1 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 이에 한정되는 것은 아니지만, 염증성 장 질환, 궤양성 대장염 (직장구불창자염 (proctosigmoiditis), 전대장염 (pancolitis), 궤양성 직장염 (ulcerative proctitis) 및 좌측 대장염 (left-sided colitis)), 크론병, 콜라겐성 대장염, 림프구성 대장염, 베체트병 (Behcet's disease), 복강병 (celiac disease), 면역 체크포인트 억제제 유발 대장염, 돌창자염 (ileitis), 호산구성 식도염 (eosinophilic esophagitis), 이식편대 숙주 질환-관련 대장염 및 감염성 대장염을 포함하는 다양한 염증성 위장관 적응증에 유용할 수 있다. 궤양성 대장염 (Reimund et al., J Clin Immunology, 1996, 16, 144-150), 크론병 (Woywodt et al., Eur J Gastroenterology Hepatology, 1999, 11, 267-276), 콜라겐성 대장염 (Kumawat et al., Mol Immunology, 2013, 55, 355-364), 림프구성 대장염 (Kumawat et al., 2013), 호산구성 식도염 (Weinbrand-Goichberg et al., Immunol Res, 2013, 56, 249-260), 이식편대 숙주 질환-관련 대장염 (Coghill et al., Blood, 2001, 117, 3268-3276), 감염성 대장염 (Stallmach et al., Int J Colorectal Dis, 2004, 19, 308-315), 베체트병 (Zhou et al., Autoimmun Rev, 2012, 11, 699-704), 복강병 (de Nitto et al., World J Gastroenterol, 2009, 15, 4609-4614), 면역 체크포인트 억제제 유발 대장염 (예: CTLA-4 억제제-유발 대장염; (Yano et al., J Translation Med, 2014, 12, 191), PD-1- 또는 PD-L1-억제제-유발 대장염), 및 돌창자염 (Yamamoto et al., Dig Liver Dis, 2008, 40, 253-259)은 소정의 염증유발 사이토킨 수준의 증가를 특징으로 한다. 다수의 염증유발 사이토킨이 JAK 활성화를 통해 신호를 전달하기 때문에, 화합물 1 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 염증을 완화시키고, 증상 완화를 제공할 수 있다. 구체적으로, 화합물 1 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 궤양성 대장염의 완화 유도 및 유지, 및 크론병, 면역 체크포인트 억제제 유발 대장염 및 이식편대 숙주 질환에서 위장관 유해 효과 치료에 유용할 수 있다. 일 양상에서, 그러므로, 본 발명은 포유동물 (예: 인간)에서 염증성 위장관 질환을 치료하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 상기 포유동물에게 화합물 1 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 또는 약학적으로-허용 가능한 담체 및 화합물 1 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 약학적 조성물을 투여하는 단계를 포함한다.
기타 질환
화합물 1 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 또한 다른 질환 예컨대 다른 염증성 질환, 자가면역 질환 또는 암 치료에 유용할 수 있다.
화합물 1 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 관절염, 류마티스 관절염, 소아 류마티스 관절염, 이식 거부 반응, 안구 건조증, 건선성 관절염, 당뇨병, 인슐린 의존성 당뇨병, 운동 신경 질환, 골수이형성 증후군, 통증, 근육 감소증, 악액질, 패혈성 쇼크, 전신성 홍반 루푸스, 백혈병, 만성 림프구성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 급성 림프구성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 강직성 척추염, 골수섬유증, B-세포 림프종, 간세포 암종, 호지킨병, 유방암, 다발성 골수종, 흑색종, 비-호지킨 림프종, 비소세포 폐암, 난소 투명 세포 암종, 난소 종양, 췌장 종양, 진성 적혈구증가증, 쇼그렌 증후군, 연조직 육종, 육종, 비장 비대증, T-세포 림프종 및 지중해 빈혈증 (thalassemia major) 중 하나 이상을 치료하는데 유용할 수 있다.
병용 요법
화합물 1 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 질환을 치료하기 위해 동일한 기전 또는 상이한 기전으로 작용하는 하나 이상의 활성제와 병용하여 사용될 수 있다. 상이한 활성제들이 개별의 조성물 또는 동일한 조성물로 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있다. 병용 요법에 유용한 활성제의 부류로는 이에 한정되는 것은 아니지만, 항-혈관형성, 스테로이드, 항-염증성, 혈장 칼리크레인 (kallikrein) 억제제, 태반 성장 인자 리간드 억제제, VEGF-A 리간드 억제제, 안지오포이에틴 (angiopoietin) 리간드-2 억제제, 단백질 티로신 포스파타제 베타 억제제, Tek 티로신 키나제 수용체 자극제, 칼시뉴린 (calcineurin) 억제제, VEGF 리간드 억제제, mTOR 복합 1 억제제, mTOR 억제제, IL-17 길항제, 칼모듈린 (calmodulin) 조절제, FGF 수용체 길항제, PDGF 수용체 길항제, VEGF 수용체 길항제, TNF 알파 리간드 억제제, TNF 결합제, 프로테오글리칸 (proteoglycan) 4 자극제, VEGF-C 리간드 억제제, VEGF-D 리간드 억제제, CD126 길항제, 보체 캐스케이드 (complement cascade) 억제제, 글루코코르티코이드 효능제, 보체 C5 인자 억제제, 카나비노이드 (cannabinoid) 수용체 길항제, 스핑고신-1-포스페이트 수용체-1 조절제, 스핑고신-1-포스페이트 수용체-3 조절제, 스핑고신-1-포스페이트 수용체-4 조절제, 스핑고신-1-포스페이트 수용체-5 조절제, 아세트알데히드 데히드로게나제 억제제, Flt3 티로신 키나제 억제제, Kit 티로신 키나제 억제제, 단백질 키나제 C 억제제, 부신피질자극 호르몬 리간드, 기질 세포-유래 인자 1 리간드 억제제, 면역글로불린 G1 효능제; 인터루킨-1 베타 리간드 억제제, 뮤신 자극제; 핵 인자 카파 B 조절제, 세포독성 T-림프구 단백질-4 자극제, T 세포 표면 당단백질 CD28 억제제, 지질단백질 리파제 자극제; PPAR 알파 효능제, 아데노신 A3 수용체 효능제, 안지오텐신 II 수용체 길항제, VEGF 수용체 길항제, 인터페론 베타 리간드, SMAD-2 조절제; TGF 베타 1 리간드 억제제, 소마토스타틴 (somatostatin) 수용체 효능제, IL-2 수용체 알파 서브유닛 억제제, VEGF-B 리간드 억제제, 티모신 (thymosin) 베타 4 리간드, 안지오텐신 II AT-1 수용체 길항제, CCR2 케모킨 길항제, 막 구리 아민 옥시다제 억제제, CD11a 길항제, ICAM-1 억제제, 인슐린-유사 성장 인자 1 길항제, 칼리크레인 억제제, 푸코실트란스퍼라제 6 자극제, GDP 푸코스 신테타제 조절제, GHR 유전자 억제제, IGF1 유전자 억제제, VEGF-1 수용체 길항제, 알부민 효능제, IL-2 길항제, CSF-1 길항제; PDGF 수용체 길항제, VEGF-2 수용체 길항제, mTOR 억제제, PPAR 알파 효능제, Rho GTPase 억제제, Rho 결합된 단백질 키나제 억제제, 보체 C3 억제제, EGR-1 전사 인자 억제제, 핵 에리트로이드 2-관련 인자 조절제, 핵 인자 카파 B 억제제, 인테그린 알파-V/베타-3 길항제, 에리트로포이에틴 수용체 효능제, 글루카곤-유사 펩티드 1 효능제, TNFRSF1A 유전자 자극제, 안지오포이에틴 리간드-2 억제제, 알파-2 안티플라스민 (antiplasmin) 억제제, 콜라겐 길항제, 피브로넥틴 억제제, 라미닌 길항제, 플라스민 (plasmin) 자극제, 신경 성장 인자 리간드, FGF1 수용체 길항제, FGF3 수용체 길항제, itk 티로신 키나제 억제제, Lck 티로신 키나제 억제제, Ltk 티로신 키나제 수용체 억제제, PDGF 수용체 알파 길항제, PDGF 수용체 베타 길항제, 단백질 티로신 키나제 억제제, VEGF-3 수용체 길항제, 막 구리 아민 옥시다제 억제제, 소마토스타틴 2 수용체 효능제, 소마토스타틴 4 수용체 효능제, 소마토스타틴 5 수용체 효능제, 단백질 키나제 C 알파 억제제, 단백질 키나제 C 베타 억제제, 단백질 키나제 C 델타 억제제 단백질 키나제 C 엡실론 억제제 단백질 키나제 C 에타 (eta) 억제제, 단백질 키나제 C 세타 (theta) 억제제, 안키린 (ankyrin) 조절제, 뮤신 자극제, P2Y2 퓨리노셉터 (purinoceptor) 효능제, 갭 정션 (gap junction) 알파-1 단백질 억제제, CCR3 케모킨 길항제; 에오탁신 (eotaxin) 리간드 억제제, 아밀로라이드 (amiloride) 민감성 나트륨 채널 억제제, PDGF 수용체 길항제, 단백질 티로신 키나제 억제제, 망막 색소 상피 단백질 억제제, 매트릭스 메탈로프로테아제 (matrix metalloprotease) 억제제, PDGF 수용체 길항제, PDGF 수용체 베타 길항제, PDGF-B 리간드 억제제, 성장 호르몬 수용체 길항제, 세포 부착 분자 억제제, 인테그린 조절제, CXCR4 케모킨 길항제, 코일형 코일 도메인 (coiled coil domain) 함유 단백질 억제제, Hsp 90 조절제, Rho 결합된 단백질 키나제 억제제, VEGF 유전자 억제제, 엔도글린 (endoglin) 억제제, CCR3 케모킨 길항제, maxi K 칼륨 채널 조절제, maxi K 칼륨 채널 자극제, PGF2 알파 효능제, 프로스타노이드 (prostanoid) 수용체 효능제, 전압 게이트 (voltage gated) 클로라이드 채널 2 조절제, 보체 C5a 수용체 길항제, 이노신 모노포스페이트 데히드로게나제 억제제, 인터루킨 18 리간드 억제제, TRP 양이온 채널 M8 자극제, CNTF 수용체 효능제, TRPV1 유전자 억제제, 데옥시리보뉴클레아제 I 자극제, IRS1 유전자 억제제, Rho 결합된 단백질 키나제 억제제, 폴리 ADP 리보스 폴리머라제 1 억제제, 폴리 ADP 리보스 폴리머라제 2 억제제, 폴리 ADP 리보스 폴리머라제 3 억제제, 바닐로이드 (vanilloid) VR1 효능제, NFAT5 유전자 자극제, 뮤신 자극제, Syk 티로신 키나제 억제제, 알파 2 아드레노셉터 (adrenoceptor) 효능제, 시클로옥시게나제 억제제, 아밀로이드 단백질 침착 억제제, 글리코겐 신타제 키나제-3 억제제, PARP 자극제, tau 침착 억제제, DDIT4 유전자 억제제, 헤모글로빈 합성 조절제, 인터루킨-1 베타 리간드 억제제, TNF 길항제, KCNQ 전압-게이트 칼륨 채널 자극제, NMDA 수용체 길항제, 시클로옥시게나제 1 억제제, 시클로옥시게나제 억제제, 5-HT 1a 수용체 효능제, 칼슘 채널 억제제, FGF-2 리간드 조절제, 포스포이노시티드 (phosphoinositide) 3-키나제 억제제, CD44 길항제, 히알루로니다제 (hyaluronidase) 조절제, 히알루론산 효능제, IL-1 길항제, 타입 I IL-1 수용체 길항제, 보체 인자 P 억제제, 튜불린 (tubulin) 길항제, 베타 아밀로이드 길항제, IL2 유전자 자극제, I-카파 B 키나제 베타 억제제, 핵 인자 카파 B 조절제, 플라스미노겐 활성인자 억제제 1 억제제, FGF-2 리간드, 프로테아제 조절제 및 코르티코트로핀 (corticotropin) 조절제를 포함한다.
화합물 1과 병용하여 사용될 수 있는 특정 활성제는 이에 한정되는 것은 아니지만, 라나델루맙 (lanadelumab), 아플리베르셉트 (aflibercept), RG-7716, AKB-9778, 시클로스포린 (ciclosporin), 베바시주맙 (bevacizumab), 에베롤리무스 (everolimus), 세쿠키누맙 (secukinumab), 플루오시놀론 아세토나이드, RP-101, 스쿠알라민 락테이트 (squalamine lactate), 재조합 인간 루브리신 (lubricin), OPT-302, 사릴루맙 (sarilumab), 덱사메타손, 에쿨리주맙 (eculizumab), 핀골리모드 (fingolimod), 아달리무맙 (adalimumab), 레프록살랍 (reproxalap), 미도스타우린 (midostaurin), 코르티코트로핀, 올랍테세드 페골 (olaptesed pegol), 카나키누맙 (canakinumab), 레코플라본 (recoflavone), 아바타셉트 (abatacept), 페노피브레이트 (fenofibrate), 피클리데노손 (piclidenoson), 옵레겐 (OpRegen), 칸데사르탄 (candesartan), 골리무맙 (golimumab), 페갑타닙 (pegaptanib), 인터페론-베타, 디시테르티드 (disitertide), 옥트레오티드 아세테이트, 아네코르테이브 (anecortave), 바실릭시맙 (basiliximab), 맥락막위 트리암시놀론 아세토나이드 (suprachoroidal triamcinolone acetonide), RGN-259, 디플루프레드네이트 (difluprednate), HL-036, 아바신캅타드 페골 나트륨 (avacincaptad pegol sodium), 이르베사르탄 (irbesartan), 프로파게르마늄 (propagermanium), 트리암시놀론 아세토나이드, 아지트로마이신 (azithromycin), BI-1467335, 리피테그라스트 (lifitegrast), 로테프레드놀 에타보네이트 (loteprednol etabonate), 테프로투무맙 (teprotumumab), KVD-001, TZ-101, 아테시도르센 (atesidorsen), Nov-03, 베바시주맙 (bevacizumab), AVA-101, RU-101, 보클로스포린 (voclosporin), 보롤라닙 (vorolanib), 시롤리무스 (sirolimus), 콜린 페노피브레이트 (choline fenofibrate), VX-210, APL-2, CPC-551, 엘라미프레티드 (elamipretide), SF-0166, 시비네티드 (cibinetide), 엘라미프레티드 (elamipretide), 리라글루티드 (liraglutide), EYS-606, 네스바쿠맙 (nesvacumab), 아플리베르셉트 (aflibercept), 오크리플라스민 (ocriplasmin), 필고티닙 (filgotinib), 세네게르민 (cenegermin), 아디포셀 (adipocell), 브롤루시주맙 (brolucizumab), 라니비주맙 (ranibizumab), 아플리베르셉트 (aflibercept), 파델리포르핀 포토다이나믹 요법 (padeliporfin photodynamic therapy), 파조파닙 (pazopanib), ASP-8232, 벨도레오티드 (veldoreotide), 소트라스타우린 (sotrastaurin), 아비시파르 페골 (abicipar pegol), 디콰포솔 (diquafosol) 4나트륨, HCB-1019, 콘베르셉트 (conbercept), 베르틸리무맙 (bertilimumab), SHP-659, THR-317, ALK-001, PAN-90806, 인터페론 알파-2b, 플루오시놀론 (fluocinolone), 수니티닙 말레이트 (sunitinib malate), 에믹수스타트 (emixustat), hI-con1, TB-403, 미노사이클린 (minocycline), MA09-hRPE 세포, 페그플레라닙 (pegpleranib) 나트륨, 페그비소만트 (pegvisomant), 루미네이트 (luminate), 부릭사포 (burixafor), H-1129, 카로툭시맙 (carotuximab), AXP-1275, 라니비주맙 (ranibizumab), 이소프로필 우노프로스톤 (isopropyl unoprostone), 테시돌루맙 (tesidolumab), 장용-코팅된 미코페놀레이트 나트륨, 타데키니그 알파 (tadekinig alfa), 트리암시놀론 아세토나이드, 시클로스포린 (cyclosporine), ST-266, AVX-012, NT-501-ECT, 티바니시란 (tivanisiran), 베르테포르핀 (verteporfin), 도르나제 알파 (dornase alfa), 아가니르센 (aganirsen), 리파수딜 (ripasudil), 루카파립 (rucaparib) 포스페이트, 주캅사이신 (zucapsaicin), 테트라티오몰리브데이트, 디클로페낙 (diclofenac), LHA-510, AGN-195263, 타크롤리무스 (tacrolimus), 레바미피드 (rebamipide), R-348, 브리모니딘 타르트레이트 (brimonidine tartrate), 비조미틴 (vizomitin), T-89, LME-636, BI-1026706, 리멕솔론 (rimexolone), 토브라마이신 (tobramycin), TOP-1630, 탈라포르핀 (talaporfin), 브롬페낙 (bromfenac) 나트륨, 트리암시놀론 아세토나이드, 다부네티드 (davunetide), 로테프레드놀 에타보네이트 (loteprednol etabonate), XED-60, EG-미로틴 (Mirotin), APD-209, 아데노비르 (adenovir), PF-04523655, 히드록시카바마이드 (hydroxycarbamide), 나바메펜트 (navamepent), 레티날라민 (retinalamin), CNTO-2476, 라니비주맙 (ranibizumab), 플루피르틴 (flupirtine), B27PD, S-646240, GLY-230, 히드랄라진 (hydralazine), 네파페낙 (nepafenac), DexNP, 트레할로스, 히알루론산, 덱사메타손-Ca 지속-방출 데포 (dexamethasone-Ca sustained-release depot), 날루조탄 (naluzotan), 히알루로니다제, 히알루론산 나트륨, 이수나킨라 (isunakinra), 소마토스타틴, CLG-561, OC-10X, UCA-002, 재조합 인간 표피 성장 인자, 페미롤라스트 (pemirolast), VM-100, MB-11316, 일나트륨 알파 루미놀 (luminol), 라니비주맙 (ranibizumab), IMD-1041, LMG-324, HE-10, 신히알루로네이트 (cinhyaluronate) 나트륨, BDM-E, 중간엽 전구세포, 디설피람 (disulfiram), CTC-96, PG-101, 베이푸슈 (Beifushu), 키모트립신 (chymotrypsin)을 포함한다.
또한, 본원에서는 화합물 1 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 및 하나 이상의 다른 치료제를 포함하는 약학적 조성물이 제공된다. 상기 치료제는 상기에 명시된 활성제 부류 및 상기에 기재된 특정 활성제 목록으로부터 선택될 수 있다. 일부 구체예에서, 상기 약학적 조성물은 안구 전달에 적합하다. 일부 구체예에서, 상기 약학적 조성물은 액체 또는 현탁액 조성물이다.
또한, 일 방법 양상에서, 본 발명은 포유동물에서 질환 또는 장애를 치료하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 상기 포유동물에게 화합물 1 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 및 하나 이상의 다른 치료제를 투여하는 단계를 포함한다.
병용 요법으로 사용하는 경우, 상기 활성제는 단일 약학적 조성물로 제제화될 수 있거나, 또는 상기 활성제는 동시에 또는 개별 시점에서, 동일한 투여 경로 또는 상이한 투여 경로로 투여되는 개별 조성물로 제공될 수 있다. 이러한 조성물은 개별로 포장될 수 있거나 또는 키트로서 함께 포장될 수 있다. 상기 키트 내에 2개 이상의 치료제를 동일한 투여 경로 또는 상이한 투여 경로로 투여할 수 있다.
실시예
하기 합성 및 생물학적 실시예는 본 발명을 예시하기 위해 제공되며, 어느 방식으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것으로 해석되지 않는다. 하기 실시예에서, 다음의 약어들은 달리 지시하지 않는 한 하기 의미를 갖는다. 하기에 정의되지 않은 약어는 이들의 일반적으로 허용되는 의미를 갖는다.
ACN = 아세토니트릴
Boc = tert-부톡시카보닐
DCC = 디시클로헥실카보디이미드
DIPEA = N,N-디이소프로필에틸아민
DMAc = 디메틸아세트아미드
DMF = N,N-디메틸포름아미드
DMSO = 디메틸 설폭시드
EtOAc = 에틸 아세테이트
HATU = N,N,N ',N'-테트라메틸-O-(7-아자벤조트리아졸-1-일)우로늄 헥사플루오로포스페이트
LDA = 리튬 디이소프로필아미드
min = 분
MTBE = 메틸 tert-부틸 에테르
NBS = N-브로모숙신이미드
NMP = N-메틸-2-피롤리돈
RT = 실온
THF = 테트라히드로푸란
비스(피나콜레이토)디보론 = 4,4,5,5,4',4',5',5'-옥타메틸-[2,2']비[[1,3,2]디옥사보롤라닐]
Pd(dppf)Cl2-CH2Cl2 = 디클로로메탄과 디클로로(1,1'-비스(디페닐포스피노)-페로센)-디팔라듐(II) 복합체
시약 및 용매는 상업 공급자 (Aldrich, Fluka, Sigma 등)로부터 구입하여, 추가 정제 없이 사용하였다. 반응 혼합물의 진행은 박층 크로마토그래피 (TLC), 분석용 고성능 액체 크로마토그래피 (분석용 HPLC) 및 질량 분광분석법에 의해 모니터링하였다. 반응 혼합물은 각각의 반응에서 구체적으로 기재된 바와 같이 워크업 (work up)하였고; 통상 이들은 추출 및 다른 정제 방법 예컨대 온도- 및 용매-의존성 결정화, 및 침전에 의해 정제하였다. 또한, 반응 혼합물은 전형적으로 C18 또는 BDS 컬럼 패킹 및 기존의 용리제를 사용하여, 컬럼 크로마토그래피 또는 분취용 HPLC에 의해 관례적으로 정제하였다. 전형적인 분취용 HPLC 조건은 하기에 기재되어 있다.
반응 생성물의 특성 분석은 질량 및 1H-NMR 분광법에 의해 관례적으로 수행하였다. NMR 분석을 위해, 시료를 중수소화 용매 (예: CD3OD, CDCl3 또는 d 6-DMSO)에 용해시키고, 표준 관찰 조건하에 Varian Gemini 2000 기기 (400 MHz)로 1H-NMR 스펙트럼을 수득하였다. 화합물의 질량 분광계 확인은 자동정제 시스템에 결합된, Applied Biosystems (Foster City, CA) 모델 API 150 EX 기기 또는 Waters (Milford, MA) 3100 기기로 전자분무 이온화 방법 (ESMS)에 의해 수행하였다.
분취용 HPLC 조건
컬럼: C18, 5　μm. 21.2 x 150 mm 또는 C18, 5 μm 21 x 250 또는 C14, 5 μm 21 x 150 mm
컬럼 온도: 실온
유속: 20.0 mL/분
이동상: A = 물 + 0.05% TFA
B = ACN + 0.05% TFA,
주입 부피: (100-1500 μL)
검출기 파장: 214 nm
조 화합물 (crude compounds)을 1:1의 물:아세트산에 약 50 mg/mL로 용해시켰다. 2.1 x 50 mm C18 컬럼을 사용하여 4분 분석용 스케일 테스트 실행을 수행한 후에, 상기 분석용 스케일 테스트 실행의 %B 체류에 기반한 구배로 100 μL 주입을 사용하여 15분 또는 20분 분취용 스케일 실행을 수행하였다. 정확한 구배는 시료 의존적이었다. 최적의 분리를 위해 21 x 250 mm C18 컬럼 및/또는 21 x 150 mm C14 컬럼으로 밀착된 불순물이 있는 시료를 체크하였다. 원하는 생성물을 함유하는 분획물을 질량 분광분석법으로 확인하였다.
제조예 1: 2 -(4-( 벤질옥시 )-2-에틸-5- 플루오로페닐 )-4,4,5,5- 테트라메틸 -1,3,2-디옥사보롤란 (1-5)
Figure pct00005
(a) 2-(벤질옥시)-4-브로모-1-플루오로벤젠 (1-2)
2개의 반응을 병렬로 수행하고, 워크업을 위해 조합하였다. ACN (5 L) 중 5-브로모-2-플루오로페놀 (1-1) (850 g, 4.5 mol), 벤질 브로마이드 (837 g, 4.9 mol) 및 탄산칼륨 (923 g, 6.7 mol)의 혼합물을 20℃에서 12시간 동안 교반하였다. 상기 반응들을 조합 및 농축시키고, 물 (8 L)로 희석하고, EtOAc (3 x 3 L)로 추출하였다. 유기층을 분리하고, 브라인 (3 L)으로 세척하고, 황산나트륨에서 건조하고, 농축시켰다. 조 생성물을 실리카겔 패드 (3:1의 석유 에테르:EtOAc로 용출)를 통해 정제하여, 표제의 중간체 (1.83 kg, 73% 수율)를 백색 고체로 제공하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.38-7.46 (m, 5H), 7.15 (dd, J = 7.6, 2.0 Hz, 1H), 6.98-7.15 (m, 1H), 5.12 (s, 2H).
(b) 2-(벤질옥시)-4-에틸-1-플루오로벤젠 (1-3)
6개의 반응을 병렬로 수행하고, 워크업을 위해 조합하였다. THF (100 mL) 중 이전 단계의 생성물 (200 g, 711 mmol)의 용액에 탄산칼륨 (197 g, 1.4 mol)을 부가하였다. 상기 반응 혼합물을 질소로 3회 퍼지하고, 그 다음에 Pd(dppf)Cl2-CH2Cl2 (11.6 g, 14.2 mmol)를 부가하였다. 상기 반응 혼합물을 0℃로 냉각하고, 디에틸아연 (1 M, 1.07 L)을 적가하고, 상기 반응 혼합물을 70℃에서 1시간 동안 교반하였다. 상기 반응들을 조합하고, 20℃로 냉각하고, 물 (7 L)로 천천히 부었다. 상기 혼합물에 aq. 4 M HCl을 pH 6까지 부가하였다. 유기층을 분리하고, 수성상을 EtOAc (3 x 2 L)로 추출하였다. 조합한 유기층을 브라인 (5 L)으로 세척하고, 황산나트륨에서 건조하고, 농축시키고, 실리카겔 패드 (50:1의 석유 에테르:EtOAc로 용출)를 통해 정제하여 표제의 중간체 (900 g, 92% 수율)를 밝은 황색 오일로 제공하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.29-7.43 (m, 5H), 6.94-6.97 (m, 1H), 6.82 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 6.70 (m, 1H), 5.09 (s, 2H), 2.52-2.58 (m, 2H), 1.17 (t, J = 7.6 Hz, 3H).
(c) 1-(벤질옥시)-4-브로모-5-에틸-2-플루오로벤젠 (1-4)
4개의 반응을 병렬로 수행하고, 조합하였다. ACN (1 L) 중 2-(벤질옥시)-4-에틸-1-플루오로벤젠 (1-3) (293 g, 1.3 mol)의 용액에 NBS (249 g, 1.4 mol)를 20℃에서 조금씩 부가하였다. 상기 반응 혼합물을 20℃에서 2시간 동안 교반하였다. 상기 반응 혼합물들을 조합 및 농축시켰다. 잔류물을 물 (5 L)로 희석하고, EtOAc (2 x 5 L)로 추출하였다. 유기상을 브라인 (4 L)으로 세척하고, 무수 황산나트륨에서 건조하고, 여과 및 진공하에 농축시켰다. 조 생성물을 실리카겔 크로마토그래피 (석유 에테르:EtOAc 100:1 - 10:1로 용출)로 정제하여 표제의 중간체 (1.4 kg, 89% 수율)를 밝은 황색 오일로 제공하였다. 1H　NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.29-7.38 (m, 5H), 7.2 (d, J = 10.4 Hz, 1H), 6.8 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 5.06 (s, 2H), 2.6 (q, J = 7.6 Hz, 2 H), 1.1 (t, J = 7.6 Hz, 3H).
(d) 2-(4-(벤질옥시)-2-에틸-5-플루오로페닐)-4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란 (1-5)
7개의 반응을 병렬로 수행하고, 워크업을 위해 조합하였다. 디옥산 (2 L) 중 이전 단계의 생성물 (200 g, 647 mmol)의 용액에 아세트산칼륨 (190 g, 1.9　mol), 비스(피나콜레이토)디보론 (181 g, 712 mmol) 및 Pd(dppf)Cl2-CH2Cl2 (10.6 g, 12.9　mmol)를 질소하에 20℃에서 부가하였다. 상기 혼합물을 120℃에서 2시간 동안 교반하였다. 상기 반응 혼합물을 조합하고, 농축시키고, 물 (5 L)로 희석하고, EtOAc (3　x　4 L)로 추출하였다. 조합한 유기상을 무수 황산나트륨으로 건조하고, 여과 및 진공에서 농축시켰다. 조 생성물을 실리카겔 크로마토그래피 (석유 에테르:EtOAc 1:0 - 5:1로 용출됨)로 정제하여 표제의 화합물 (1.35 kg, 84% 수율)을 백색 고체로 제공하였다. 1H　NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.33-7.51 (m, 6H), 6.82 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 5.17 (s, 2H), 2.85 (q, J = 7.6 Hz, 2H), 1.33 (s, 12H), 1.15 (t, J = 7.6 Hz, 3H).
제조예 2: 1 - 벤질 -4-이미노-1,4- 디히드로피리딘 -3- 아민 (2)
Figure pct00006
ACN (3 L) 중 피리딘-3,4-디아민 (400 g, 3.67 mol)의 용액에 벤질 브로마이드 (596 g, 3.49 mol)를 0℃에서 조금씩 부가하고, 상기 반응 혼합물을 30분 동안, 그 다음에 20℃에서 12시간 동안 교반하고, 여과하였다. 필터 케이크 (filter cake)를 ACN (500 mL)으로 세척하고, 건조하여 표제 화합물의 HBr 염 (600 g, 2.14 mol, 58% 수율)을 백색 분말로 제공하였다. 1H　NMR (400 MHz, MeOD) δ 7.83 (d, J = 5.6 Hz, 1H), 7.64 (s, 1H), 7.32-7.40 (m, 5H), 6.76 (d, J = 6.8 Hz, 1H), 5.28 (s, 2H).
제조예 3: 6 -(4-( 벤질옥시 )-2-에틸-5- 플루오로페닐 )-4- 플루오로 -1 H - 인다졸 -3-카브알데히드 (3)
Figure pct00007
(a) 1-(4-브로모-2,6-디플루오로페닐)-2,2-디에톡시에탄-1-온 (3-1)
9개의 반응을 병렬로 수행하고, 워크업을 위해 조합하였다. THF (700 mL) 중 1-브로모-3,5-디플루오로벤젠 (100 g, 518 mmol)의 용액을 탈기시키고, 질소로 3회 퍼지하였다. 그 다음에 2 M LDA (311 mL)를 -70℃에서 부가하고, 상기 반응 혼합물을 -70℃에서 0.5시간 동안 질소하에 교반하였다. THF (200 mL) 중 에틸 2,2-디에톡시아세테이트 (96　g, 544 mmol)의 용액을 -70℃에서 질소 하에 적가하고, 상기 반응 혼합물을 1시간 동안 교반하였다. 상기 반응들을 조합하고, 포화된 빙 (ice) 염화암모늄 (10 L)에 조금씩 붓고, EtOAc (3 x 3 L)로 추출하였다. 유기층을 분리하고, 브라인 (5 L)으로 세척하고, 황산나트륨에서 건조하고, 농축시키고, 실리카겔 크로마토그래피 (석유 에테르 EtOAc 1:0 - 100:1로 용출)로 정제하여 표제의 화합물 (1.26 kg, 84% 수율)을 황색 오일로 제공하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.12 (d, J = 7.2 Hz, 2H), 5.15 (s, 1H), 3.61-3.7 (m, 4H), 1.2 (t, J = 7.2 Hz, 6H).
(b) 1-(4'-(벤질옥시)-2'-에틸-3,5,5'-트리플루오로-[1,1'-비페닐]-4-일)-2,2-디에톡시에탄-1-온 (3-2)
5개의 반응을 병렬로 수행하고, 워크업을 위해 조합하였다. 에탄올 (150 mL) 및 톨루엔 (1.5 L) 중 1-(4-브로모-2,6-디플루오로페닐)-2,2-디에톡시에탄-1-온 (3-1) (189 g, 586 mmol)의 혼합물에 물 (150 mL), 탄산나트륨 (84.8 g, 800 mmol) 및 2-(4-(벤질옥시)-2-에틸-5-플루오로페닐)-4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란 (1-5) (190 g, 533 mmol)을 20℃에서 부가하였다. 현탁액을 진공하에 탈기시키고, 질소로 수회 퍼지하였다. Pd(dppf)Cl2-CH2Cl2 (13 g, 16 mmol)를 부가하고, 상기 반응 혼합물을 질소로 수회 퍼지하고, 120℃에서 2시간 동안 교반하였다. 상기 반응들을 조합하고, 20℃로 냉각하고, 물 (5 L)로 붓고, EtOAc (3 x 4 L)로 추출하였다. 조합한 유기층을 브라인 (5 L)으로 세척하고, 황산나트륨에서 건조하고, 여과하고, 농축시키고, 실리카겔 크로마토그래피 (석유 에테르:EtOAc 100:1 - 5:1로 용출)로 정제하여 표제의 중간체 (880 g, 70% 수율)를 황색 오일로 제공하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.36-7.48 (m, 5H), 6.94-6.96 (m, 2H), 6.86-6.92 (m, 2H), 5.29 (s, 1H), 5.19 (s, 2H), 3.67-3.77 (m, 4H), 2.52 (q, J = 7.6 Hz, 2H), 1.25 (t, J = 6.8 Hz, 6H), 1.07 (t, J = 7.2 Hz, 3H).
(c) 6-(4-(벤질옥시)-2-에틸-5-플루오로페닐)-3-(디에톡시메틸)-4-플루오로-1H-인다졸 (3-3)
4개의 반응을 병렬로 수행하고, 워크업을 위해 조합하였다. THF (2 L) 중 이전 단계의 생성물 (220 g, 466 mmol)의 용액에 히드라진 일수화물 (47.6 g, 931 mmol)를 20℃에서 부가하였다. 상기 반응 혼합물을 100℃에서 12시간 동안 교반하였다. 4개의 반응들을 조합하고, 20℃로 냉각하고, 농축시켰다. 잔류물을 EtOAc (5 L)에 용해시키고, 0.1 M HCl (2 x 1.5 L)로 세척하였다. 조합한 유기층을 브라인 (1.5 L)으로 세척하고, 황산나트륨에서 건조하고, 여과 및 농축시켜서 표제의 중간체 (900 g, 조질)를 황색 검 (gum)으로 제공하고, 이는 다음 단계에서 바로 사용되었다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.36-7.48 (m, 5H), 6.94-6.96 (m, 2H), 6.86-6.92 (m, 2H), 5.29 (s, 1H), 5.19 (s, 2H), 3.67-3.77 (m, 4H), 2.52 (q, J = 7.6 Hz, 2H), 1.25 (t, J = 6.8 Hz, 6H), 1.07 (t, J = 7.2 Hz, 3H).
(d) 6-(4-(벤질옥시)-2-에틸-5-플루오로페닐)-4-플루오로-1H-인다졸-3-카브알데히드 (3)
3개의 반응을 병렬로 수행하고, 워크업을 위해 조합하였다. 아세톤 (1.5 L) 중 이전 단계의 생성물 (300 g, 643 mmol)의 용액에 4 M HCl (16　mL)을 20℃에서 적가하고, 상기 반응 혼합물을 20℃에서 0.17시간 동안 교반하였다. 상기 반응들을 조합하고, 농축시키고, MTBE (1 L)로 희석하고, 여과하였다. 필터 케이크를 MTBE (2 x 300 mL)로 세척하고, 감압하에 건조하여 표제의 중간체 (705 g, 조질)를 황색 고체로 제공하고, 이는 다음 단계에서 바로 사용되었다. C23H18F2N2O2에 대한 (m/z): [M+H]+ 계산치 393.13 실측치 393.1. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ) δ 14.51 (s, 1H), 10.17 (d, J = 3.6 Hz, 1H), 7.50 (d, J = 7.2 Hz, 2H), 7.40-7.42 (m, 4H), 7.24 (d, J　=　8.4 Hz, 1H), 7.15 (d, J = 12.4 Hz, 1H), 7.06 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 5.25 (s, 2H), 2.52-2.53 (m, 2H), 1.03 (t, J = 7.6 Hz, 3H).
제조예 4: 5 - 벤질 -2-(6-(4-( 벤질옥시 )-2-에틸-5- 플루오로페닐 )-4- 플루오로 -1 H -인다졸-3-일)-5 H -이미다조[4,5-c]피리딘 (4)
Figure pct00008
4개의 반응을 병렬로 수행하고, 워크업을 위해 조합하였다. DMF (1.1 L) 중 제조예 3의 생성물인 6-(4-(벤질옥시)-2-에틸-5-플루오로페닐)-4-플루오로-1H-인다졸-3-카브알데히드 (3) (172 g, 440 mmol)의 용액에, 아황산 수소 나트륨 (68.6 g, 659 mmol) 및 1-벤질-4-이미노-1,4-디히드로피리딘-3-아민 (2) (136 g, 484 mmol)을 20℃에서 부가하고, 상기 반응 혼합물을 150℃에서 2시간 동안 교반하였다. 4개의 반응들을 조합하고, 상기 반응 혼합물을 감압하에 농축시켰다. 잔류물을 물 (10 L)에 붓고, 여과하였다. 필터 케이크를 감압하에 건조하여 표제의 중간체 (990 g, 조질)를 황색 고체로 제공하고, 이는 정제 없이 바로 사용되었다. C35H27F2N5O에 대한 (m/z):　[M+H]+ 계산치 572.2 실측치 572.3.
제조예 5: 5 - 벤질 -2-(6-(4-( 벤질옥시 )-2-에틸-5- 플루오로페닐 )-4- 플루오로 -1 H -인다졸-3-일)-4,5,6,7-테트라히드로-1 H -이미다조[4,5-c]피리딘 (5)
Figure pct00009
3개의 반응을 병렬로 수행하고, 워크업을 위해 조합하였다. 메탄올 (1.5 L) 및 THF (1 L) 중 제조예 4의 생성물인 5-벤질-2-(6-(4-(벤질옥시)-2-에틸-5-플루오로페닐)-4-플루오로-1H-인다졸-3-일)-5H-이미다조[4,5-c]피리딘 (4) (330 g, 577 mmol)의 혼합물에 수소화붕소나트륨 (267 g, 6.9 mol)를 20℃에서 조금씩 부가하고, 상기 반응 혼합물을 20℃에서 24시간 동안 교반하였다. 3개의 반응들을 조합하고, 상기 반응 혼합물을 물 (10 L)에 부가하고, 10분 동안 교반하고, 여과하였다. 여과물을 EtOAc (2 x 5 L)로 추출하고, 조합한 유기상을 무수 황산나트륨으로 건조하고, 여과하고, 진공하에 농축시켰다. 조 생성물을 EtOAc (2 L)로 희석하고, 30분 동안 교반하고, 여과하였다. 필터 케이크를 MTBE (3 x 200 mL)로 세척하여 표제의 중간체 (275 g, 28% 수율)를 밝은 황색 고체로 제공하였다. C35H31F2N5O에 대한 (m/z):　[M+H]+ 계산치 576.25 실측치 576.3. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ) δ 7.50-7.52 (m, 2H), 7.35-7.43 (m, 7H), 7.23-7.25 (m, 3H), 7.15 (d, J = 12.0 Hz, 1H), 6.81 (d, J = 12.0 Hz, 1H), 5.25 (s, 2H), 3.72 (s, 2H), 3.43 (br. s, 2H), 2.78 (br. s, 2H), 2.66 (br. s, 2H), 2.55 (q, 2H), 1.04 (t, J　=　7.6　Hz, 3H).
제조예 6: 5 -에틸-2- 플루오로 -4-(4- 플루오로 -3-(4,5,6,7- 테트라히드로 -1 H -이미다조[4,5-c]피리딘-2-일)-1 H -인다졸-6-일)페놀 (6)
Figure pct00010
5개의 반응을 병렬로 수행하고, 워크업을 위해 조합하였다. THF (500 mL) 및 메탄올 (500 mL) 중 제조예 5의 생성물인 5-벤질-2-(6-(4-(벤질옥시)-2-에틸-5-플루오로페닐)-4-플루오로-1H-인다졸-3-일)-4,5,6,7-테트라히드로-1H-이미다조[4,5-c]피리딘 (5) (55 g, 95.5 mmol)의 혼합물에 탄소상 팔라듐 (15 g, 9.6 mmol) 및 aq. 12 M HCl (10 mL)을 부가하였다. 현탁액을 진공하에 탈기시키고, 수소로 수회 퍼지하고, 수소 (50 psi)하에 50℃에서　12시간 동안 교반하였다. 상기 반응들을 조합하고, 상기 반응 혼합물을 여과하였다. 여과물을 진공하에 농축시켜서 표제 중간체의 HCl 염 (150 g, 조질)을 황백색 (off-white) 고체로 제공하였다. C21H19F2N5O에 대한 (m/z):　[M+H]+ 계산치 396.16 실측치 396.2. 1H NMR (400　MHz, MeOD) δ 7.43 (s, 1H), 7.07 (d, J = 11.6 Hz, 1H), 6.97 (d, J = 11.6 Hz, 1H), 6.91 (d, J　= 8.8 Hz, 1H), 4.57 (s, 2H), 3.74 (s, 2H), 3.24 (s, 2H), 2.55 (q, J = 7.6 Hz, 2H), 1.08 (t, J = 7.6 Hz, 3H).
실시예 1: (1S,5R)-2-아자비시클로[3.1.0]헥산-1-일(2-(6-(2-에틸-5-플루오로-4-히드록시페닐)-4-플루오로-1H-인다졸-3-일)-6,7-디히드로-3H-이미다조[4,5-c]피리딘-5(4H)-일)메타논 (1)
Figure pct00011
DMF (0.5 ml) 중 5-에틸-2-플루오로-4-(4-플루오로-3-(4,5,6,7-테트라히드로-3H-이미다조[4,5-c]피리딘-2-일)-1H-인다졸-6-일)페놀 (21.4 mg, 0.054 mmol) (6) 및 (1s,5r)-2-(tert-부톡시카보닐)-2-아자비시클로[3.1.0]헥산-1-카복실산 (24.6 mg, 0.108 mmol)의 혼합물에, HATU (45.3 mg, 0.119 mmol) 및 DIPEA (0.076 ml, 0.433 mmol)를 부가하고, 수득된 용액을 실온에서 16시간 동안 교반하였다. 상기 반응 혼합물에 MeOH (2.00 ml) 및 물 (0.500 ml)을 부가한 다음에, 수산화리튬 (7.78 mg, 0.325 mmol)을 부가하고, 상기 용액을 65℃에서 1시간 동안 교반하였다. 그 다음에 상기 용액을 농축시키고, TFA (0.500 ml)를 잔류물에 부가하였다. 수득된 용액을 실온에서 30분 동안 교반한 다음에 농축시켰다. 그 다음에 조 생성물을 분취용 HPLC (0.1% TFA를 가진 물 구배 중 5-65% 아세토니트릴, Zorbax Bonus-RP 컬럼)로 정제하여, 표제 화합물의 TFA 염 (19.4 mg, 57% 수율)을 제공하였다. C27H26F2N6O2에 대한 (m/z):　[M+H]+ 계산치 505.18 실측치 505.2. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ) δ 13.62 (s, 1H), 12.44 (s, 1H), 9.92 (s, 1H), 7.21 (s, 1H), 7.03 (d, J = 11.9 Hz, 1H), 6.90 (d, J = 9.1 Hz, 1H), 6.82 (d, J = 11.3 Hz, 1H), 4.59 (m, 2H), 3.96 (m, 1H), 3.79 (m, 1H), 3.27 (m, 1H), 2.89 (m, 1H), 2.72 (m, 2H), 2.47 (q, J = 7.5 Hz, 2H), 2.06 (m, 2H), 1.92 (m, 1H), 1.30 (m, 2H), 1.00 (t, J = 7.5, 3H).
제조예 7: 1 -( 벤질옥시 )-4- 브로모 -5-에틸-2- 플루오로벤젠
Figure pct00012
(a) 5-에틸-2-플루오로페놀
건조 테트라히드로푸란 (800 mL) 중 화합물 5-브로모-2-플루오로페놀 (80 g, 419 mmol)의 혼합물을 탈기시키고, 질소로 3회 퍼징하였고, Pd(t-Bu3P)2 (4.28 g, 8.38 mmol)를 부가하였다. 디에틸아연 (114 g, 921 mmol)을 25℃에서 상기 혼합물에 적가하고, 상기 반응 혼합물을 50℃에서 질소하에 12시간 동안 교반하고, 빙수 (1 L)에 천천히 부었다. EtOAc (350 mL)를 부가하고, 상기 반응 혼합물을 20분 동안 교반하고, 여과하였다. 필터 케이크를 EtOAc (3 x 500 mL)로 세척하였다. 조합한 유기층을 브라인 (600 mL)으로 세척하고, 황산나트륨에서 건조하고, 농축시키고, 실리카겔 크로마토그래피로 정제하여 표제 중간체 (85 g, 조질)를 황색 오일로 수득하였다.
(b) 2-(벤질옥시)-4-에틸-1-플루오로벤젠
ACN (850 mL) 중 이전 단계의 생성물 (85 g, 606 mmol)의 용액에, 벤질 브로마이드 (124 g, 728 mmol) 및 K2CO3 (126 g, 909 mmol)을 부가하였다. 상기 반응 혼합물을 25℃에서 12시간 동안 교반하고, 물 (1 L)에 붓고, EtOAc (4 x 500 mL)로 추출하였다. 조합한 유기층을 브라인 (600 mL)으로 세척하고, 황산나트륨에서 건조하고, 농축시키고, 실리카겔 크로마토그래피로 정제하여 표제 중간체 (100 g)를 황색 오일로서 수득하였다.
(c) 1-(벤질옥시)-4-브로모-5-에틸-2-플루오로벤젠
ACN (1.0 L) 중 이전 단계의 생성물 (100 g, 434 mmol)의 용액에, N-브로모숙신이미드 (85 g, 477 mmol)를 조금씩 부가하였다. 상기 반응 혼합물을 25℃에서 5시간 동안 교반하고, 물 (1.3 L)에 붓고, EtOAc (3 x 500mL)로 추출하였다. 조합한 유기층을 브라인 (800 mL)으로 세척하고, 황산나트륨에서 건조하고, 농축시키고, 실리카겔 크로마토그래피로 정제하여 표제 화합물 (83 g)을 황색 오일로 수득하였다. 1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ (ppm) 7.27-7.43 (m, 6H), 6.86 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 5.10 (s, 2H), 2.64 (q, J = 7.6 Hz, 2H), 1.15 (t, J = 7.2 Hz, 1H).
제조예 8: 2 -(4-( 벤질옥시 )-2-에틸-5- 플루오로페닐 )-4,4,5,5- 테트라메틸 -1,3,2-디옥사보롤란
Figure pct00013
디옥산 (830 mL) 중 제조예 7의 화합물 (83 g, 268 mmol), 비스(피나콜레이토)디보론 (102 g, 402 mmol) 및 KOAc (79.0 g, 805 mmol)의 혼합물을 탈기시키고, 질소로 3회 퍼지하고, Pd(dppf)Cl2 (3.93 g, 5.37　mmol)를 부가하였다. 상기 반응 혼합물을 질소하에 120℃에서 4시간 동안 교반하였다. 상기 혼합물을 25℃로 냉각시키고, 물 (1L)에 붓고, EtOAc (3 x 500 mL)로 추출하였다. 조합한 유기층을 브라인 (800 mL)으로 세척하고, 황산나트륨에서 건조하고, 실리카겔 크로마토그래피로 정제하였다. 생성물을 메탄올 (200 mL)로 세척하고, 여과하고, 필터 케이크를 건조하여 표제 화합물 (65 g)을 백색 고체로 수득하였다. 1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ (ppm) 7.26-7.42 (m, 5H), 6.74 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 5.08 (s, 2H), 2.76 (q, J = 7.2 Hz, 2H), 1.25 (s, 12 H), 1.06 (t, J = 7.6 Hz, 3H).
제조예 9: 1 - 벤질 -4-이미노-1,4- 디히드로피리딘 -3- 아민
Figure pct00014
ACN (17.0 L) 중 피리딘-3,4-디아민 (200 g, 1.8 mol)의 용액에 벤질 브로마이드 (306 g, 1.79 mol)를 부가하고, 상기 반응 혼합물을 15℃에서 12시간 동안 교반하고, 여과하고, 필터 케이크를 진공하에 건조하여 표제 화합물 (250 g)을 백색 고체로 수득하였다. 1H NMR (d 6-DMSO, 400 MHz) δ (ppm) 8.02 (dd, J　=7.2, 1.6 Hz, 1H), 7.66 (s, 1H), 7.34-7.41 (m, 5H), 6.79 (d, J = 6.8 Hz, 1H), 5.62 (s, 2H), 5.36 (s, 2H).
제조예 10: 5 - 벤질 -2-(6- 브로모 -1 H - 인다졸 -3-일)-5 H - 이미다조[4,5-c]피리딘
Figure pct00015
(a) 6-브로모-1H-인다졸-3-일-카브알데히드
물 (1 L) 중 NaNO2 (704 g, 10.2 mol)의 용액을 10℃에서 아세톤 (7 L) 중 6-브로모-1H-인돌 (400 g, 2.0 mol)의 용액에 적가하였다. 상기 반응 혼합물을 10℃에서 30분 동안 교반하고, 수성 3M HCl (437 mL)을 격렬하게 교반하면서 천천히 부가하고, 내부 온도를 10 내지 25℃로 유지하였다. 상기 용액을 20℃에서 3시간 동안 교반하고, 온도를 35℃ 이하로 유지하면서 농축시켰다. 고형물을 여과에 의해 수집하였다. 필터 케이크를 1:2의 석유 에테르:MTBE (800 mL)로 세척하였다. 고형물을 여과에 의해 수집하고, 진공하에 건조하여 표제 중간체 (450 g)를 흑갈색 고체로 수득하였다. 1H NMR (CH3OD, 400　MHz) δ (ppm) 7.77 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 7.69 (s, 1H), 7.22 (dd, J = 8.4, 2.4 Hz, 1H), 5.70 (s, 1H).
(b) 5-벤질-2-(6-브로모-1H-인다졸-3-일)-5H-이미다조[4,5-c]피리딘
DMF (750 mL) 중 6-브로모-1H-인다졸-3-일-카브알데히드 (150.0 g, 666 mmol) 및 1-벤질-4-이미노-1,4-디히드로피리딘-3-아민 (127.5 g, 639.9 mmol)의 교반된 용액에 NaHSO3 (83.2 g, 799.9 mmol)를 넣고, 상기 반응 혼합물을 140℃에서 6시간 동안 교반하고, 물 (3.5 L)에 부었다. 침전물을 여과하고, 물 (1 L)로 세척하여 표제 화합물 (180 g)을 흑갈색 고체로 수득하였다. 1H　NMR (d 6-DMSO, 400 MHz) δ (ppm) 8.69 (s, 1H) 8.71 (d, J = 7.2 Hz, 1H) 8.37 (d, J = 8.4 Hz, 1H) 8.07 (d, J = 6.4 Hz, 1H) 7.97 (s, 1H) 7.38-7.43(m, 3H) 7.50-7.54 (m, 4H) 5.87 (s, 2H).
제조예 11: 5 - 벤질 -2-(6- 브로모 -1 H - 인다졸 -3-일)-4,5,6,7- 테트라히드로 -1 H -이미다조[4,5-c]피리딘
Figure pct00016
MeOH (200 mL) 및 THF (1 L) 중 5-벤질-2-(6-브로모-1H-인다졸-3-일)-5H-이미다조[4,5-c]피리딘 (23.0 g, 56.9 mmol)의 용액에 NaBH4 (12.9 g, 341.3 mmol)를 조금씩 부가하고, 상기 반응 혼합물을 50℃에서 2시간 동안 교반하였다. 아세트산 (10 eq)을 부가하고, 용액을 농축 건조하고, 실리카겔 크로마토그래피 (30g의 실리카, 0.1% TEA를 갖는 0-10% MeOH/DCM)로 정제하여, 표제 화합물 (6.0g)을 수득하였다. 1H　NMR (d 6-DMSO, 400 MHz) δ (ppm) 8.24 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.77 (s, 1H), 7.28 - 7.37 (m, 7H), 3.74 (s, 2H), 3.48 (br.s, 2H), 2.80 (s, 2H), 2.66 (s, 2H).
제조예 12: 5 - 벤질 -2-(6-(4-( 벤질옥시 )-2-에틸-5- 플루오로페닐 )-1 H - 인다졸 -3-일)-4,5,6,7-테트라히드로-1 H -이미다조[4,5-c]피리딘
Figure pct00017
(a) tert-부틸 5-벤질-2-(6-브로모-1-(tert-부톡시카보닐)-1H-인다졸-3-일)-4,5,6,7-테트라히드로-1H-이미다조[4,5-c]피리딘-1-카복실레이트
2개의 반응을 병렬로 수행하였다. DCM (1 L) 중 5-벤질-2-(6-브로모-1H-인다졸-3-일)-4,5,6,7-테트라히드로-1H-이미다조[4,5-c]피리딘 (80 g, 196 mmol), 디-tert-부틸 디카보네이트 (128 g, 587.8 mmol, 135 mL) 및 TEA (79.3 g, 784 mmol, 109 mL)의 현탁액을 20℃에서 12시간 동안 교반하였다. 상기 2개의 반응 현탁액들을 조합하고, 농축 건조하고, 실리카겔 크로마토그래피 (석유 에테르:EtOAc 10:1 - 0:1)로 정제하여 표제 중간체 (170.0 g)를 수득하였다.
(b) 5-벤질-2-(6-브로모-1H-인다졸-3-일)-4,5,6,7-테트라히드로-1H-이미다조[4,5-c]피리딘
2개의 반응을 병렬로 수행하였다. DCM (400 mL) 중 이전 단계의 생성물 (85 g, 140 mmol) 및 MeOH 중 4M HCl (400 mL)의 용액을 25℃에서 12시간 동안 교반하였다. 상기 반응 혼합물들을 조합하고, 농축 건조하고, DCM (250 mL)을 교반하면서 부가하고, 상기 반응 혼합물을 30분 동안 교반하고, 여과하였다. 필터 케이크를 DCM (2 x 20 mL)으로 세척하고, 건조하여 표제 화합물 (85 g)을 황백색 고체로 수득하였다.
(c) 5-벤질-2-(6-(4-(벤질옥시)-2-에틸-5-플루오로페닐)-1H-인다졸-3-일)-4,5,6,7-테트라히드로-1H-이미다조[4,5-c]피리딘
85개의 반응을 병렬로 수행하였다. 이전 단계의 생성물 (1.0 g, 2.5 mmol), 2-(4-(벤질옥시)-2-에틸-5-플루오로페닐)-4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란 (873 mg, 2.5 mmol) 및 Pd(PPh3)4 (227 mg, 196. μmol)를 물 (4 mL) 및 디옥산 (10 mL)의 혼합물에 용해시켰다.　 반응 바이알을 질소로 2분 동안 버블링하고, Na2CO3 (779 mg, 7.4 mmol)를 질소하에 빠르게 부가하였다. 상기 반응 혼합물을 130℃에서 1.5시간 동안 가열하였다. 상기 85개의 반응 혼합물들을 조합하고, 감압하에 농축시켰다. 잔류물을 DCM (500 mL)에 용해시키고, 실리카겔 크로마토그래피 (150 g의 실리카, DCM:THF (6:1 내지 3:1)로 용출시킴)로 정제하여 표제 화합물 (50 g)을 황백색 고체로 제공하였다.
제조예 13: 5 -에틸-2- 플루오로 -4-(3-(4,5,6,7- 테트라히드로 -1 H - 이미다조[4,5-c]피리딘 -2-일)-1 H -인다졸-6-일)페놀
Figure pct00018
MeOH (500 mL) 중 5-벤질-2-(6-(4-(벤질옥시)-2-에틸-5-플루오로페닐)-1H-인다졸-3-일)-4,5,6,7-테트라히드로-1H-이미다조[4,5-c]피리딘 (44.5 g, 79.8 mmol), Pd(OH)2/C (25 g, 2.7 mmol, 50% 순도) 및 TFA (44.5 g, 390 mmol, 28.9mL)의 혼합물을 수소 (50 Psi)하에 4시간 동안 교반하고, 여과하였다. Pd(OH)2/C (25 g, 2.7 mmol, 50% 순도)를 여과물에 부가하고, 수득된 현탁액을 수소 (50 Psi)하에 25℃에서 12시간 동안 교반하였다. 상기 현탁액을 5.5 g의 규모로 이전 반응의 현탁액과 조합하고, 여과하였다. 필터 케이크를 20:1의 MeOH:TFA (2 x 200 mL)로 세척하였다. 조합한 여과물을 농축시키고, MeOH 중 4 M HCl (200 mL)을 상기 잔류물에 교반하면서 부가하였다. 수득된 현탁액을 농축시키고, MeOH (80 mL)로 슬러리화하고, 30분 동안 교반하였다. 백색 고형물이 침전되었다. 상기 고형물을 여과하고, 필터 케이크를 MeOH (2 x 10 mL)로 세척하고, 진공하에 건조하여 표제 화합물의 HCl 염 (24.8 g)을 황백색 고체로 수득하였다. C21H20FN5O에 대한 (m/z):　[M+H]+ 계산치 378.17 실측치 378.1. 1H　NMR (d 6-DMSO, 400 MHz) δ (ppm) 8.23 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.59 (s, 1H), 7.35 (d, J = 11.2 Hz, 1H), 6.90 - 6.97 (m, 2H), 4.57 (s, 2H), 3.72 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 3.22 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 2.51 (q, J = 7.6 Hz, 2H), 1.04 (t, J = 7.6 Hz, 3H).
실시예 2: ((1S,5R)-2-아자비시클로[3.1.0]헥산-1-일)(2-(6-(2-에틸-5-플루오로-4-히드록시페닐)-1H-인다졸-3-일)-1,4,6,7-테트라히드로-5H-이미다조[4,5-c]피리딘-5-일)메타논 C-1
Figure pct00019
5-에틸-2-플루오로-4-(3-(4,5,6,7-테트라히드로-1H-이미다조[4,5-c]피리딘-2-일)-1H-인다졸-6-일)페놀 (4.0 g, 10.60 mmol), (1s,5r)-2-(tert-부톡시카보닐)-2-아자비시클로[3.1.0]헥산-1-카복실산 (3.61 g, 15.90 mmol) 및 DIPEA (7.40 ml, 42.4 mmol)를 DMF (60 ml)에 용해시킨 다음에, HATU (8.06 g, 21.20 mmol)를 부가하고, 상기 반응 혼합물을 실온에서 24시간 동안 교반하였다. 그 다음에 히드라진 (0.665 ml, 21.20 mmol)을 부가하여 원하지 않는 부산물을 절단한 다음에, 상기 반응 혼합물을 약 20 ml로 농축시켰다. 그 다음에 상기 용액을 200 mL의 물에 적하하여 생성물을 침전시킨 다음에, 이를 여과로 수집하고 진공하에 건조하였다. 수득된 고형물을 디옥산 (40 ml) 및 물 (8 ml)에 용해시킨 다음에, 디옥산 중 염산, 4M (40 ml, 160 mmol)을 부가하고, 상기 반응 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 그 다음에 상기 용액을 동결시키고, 동결건조하고, 수득된 고형물을 분취용 HPLC (5-70% 아세토니트릴/물 구배, C18 컬럼)로 정제하여 표제 화합물의 TFA 염 (2.69 g, 42% 수율)을 제공하였다. C27H27FN6O2에 대한 (m/z):　[M+H]+ 계산치 487.55 실측치 487.7. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ) δ 13.15 (s, 1H), 12.42 (s, 1H), 9.79 (s, 1H), 8.29 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.34 (s, 1H), 7.07 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 6.99 (d, J = 11.9 Hz, 1H), 6.88 (d, J = 9.1 Hz, 1H), 4.51 (m, 2H), 3.92 (m, 2H), 3.99 (m, 1H), 2.65 (m, 3H), 2.47 (q, J = 7.5 Hz, 2H), 1.89 (m, 1H), 1.72 (m, 2H), 0.98 (t, J = 7.5 Hz, 3H), 0.89 (m, 2H).
생물학적 분석
화합물 1을 하기 하나 이상의 생물학적 분석에서 특성 규명하였다.
분석 1: 생화학적 JAK 키나제 분석
4개의 LanthaScreen JAK 생화학적 분석 패널 (JAK1, 2, 3 및 Tyk2)을 통상의 키나제 반응 버퍼 (50 mM HEPES, pH 7.5, 0.01% Brij-35, 10 mM MgCl2 및 1 mM EGTA)에서 수행하였다. 재조합 GST-태그된 JAK 효소 및 GFP-태그된 STAT1 펩티드 기질은 Life Technologies로부터 입수하였다.
계열 희석된 화합물을 4개의 JAK 효소들 각각 및 기질과 함께 화이트 384-웰 마이크로플레이트 (Corning)에서 주위 온도에서 1시간 동안 사전-인큐베이션하였다. 이어서 ATP를 부가하여 1% DMSO로 총 부피 10 μl의 키나제 반응을 개시하였다. JAK1, 2, 3 및 Tyk2에 대한 최종 효소 농도는 각각 4.2 nM, 0.1 nM, 1 nM 및 0.25 nM이고; 사용된 상응하는 Km ATP 농도는 25 μM, 3 μM, 1.6 μM 및 10 μM 이며; 4개 분석 모두에 대해 기질 농도는 200 nM이다. 키나제 반응을 주위 온도에서 1시간 동안 진행시킨 후에, TR-FRET 희석 버퍼 (Life Technologies) 중 EDTA (10mM 최종 농도) 및 Tb-항-pSTAT1 (pTyr701) 항체 (Life Technologies, 2 nM 최종 농도)의 10 μL 제제를 부가하였다. 상기 플레이트를 주위 온도에서 1시간 동안 인큐베이션한 후에, EnVision 리더 (Perkin Elmer)에서 판독하였다. 방출 비율 신호 (520nm/495nm)를 기록하고 이를 활용하여 DMSO 및 배경 대조군에 기반하여 억제 퍼센트 값을 계산하였다.
용량-반응 분석을 위해, 억제 퍼센트 데이터를 화합물 농도에 대해 플로팅하고, IC50 값을 Prism 소프트웨어 (GraphPad Software)를 사용하여 4-파라미터 로버스트 적합 모델 (4-parameter robust fit model)로부터 결정하였다. 결과는 pIC50 (IC50의 음의 로그)으로 표시한 후에, Cheng-Prusoff 방정식을 사용하여 pKi (해리 상수, Ki의 음의 로그)로 변환시켰다.
화합물 1은 하기 효소 효능을 나타내었다.
Figure pct00020
분석 2: Tall-1 T 세포에서 IL-2 자극된 pSTAT5의 억제
인터루킨-2 (IL-2) 자극된 STAT5 인산화 억제에 대한 시험 화합물의 효능을 AlphaLisa를 사용하여 Tall-1 인간 T 세포주 (DSMZ)에서 측정하였다. IL-2는 JAK1/3을 통해 신호를 전달하기 때문에, 본 분석은 JAK1/3 세포 효능의 척도를 제공한다.
인산화된 STAT5를 AlphaLISA SureFire Ultra pSTAT5 (Tyr694/699) 키트 (PerkinElmer)를 통해 측정하였다. Tall-1 세포주로부터의 인간 T 세포를 15% 열불활성화된 우태아 혈청 (FBS, Life Technologies), 2mM 글루타맥스 (Glutamax) (Life Technologies), 25mM HEPES (Life Technologies) 및 1X Pen/Strep (Life Technologies)가 보충된 RPMI (Life Technologies)에서 37℃, 5% CO2 가습 인큐베이터에서 배양하였다. 화합물을 DMSO에서 계열 희석하고, 빈 웰에 음향적으로 (acoustically) 분배하였다. 분석 배지 (10% FBS (ATCC)가 보충된 페놀 레드-프리 DMEM (Life Technologies))를 분배하고 (4 μL/웰), 플레이트를 900rpm으로 10분 동안 진탕하였다. 세포를 분석 배지 (4 μL/웰)에 45,000 세포/웰로 시딩하고, 37℃, 5% CO2에서 1시간 동안 인큐베이션한 다음, IL-2 (R&D Systems; 최종 농도 300 ng/mL)를 예열된 분석 배지 (4 μL)에 30분 동안 부가하였다. 사이토킨 자극 후에, 1x PhosStop 및 Complete 정제 (Roche)를 함유하는 6 ul의 3x AlphaLisa 용해 버퍼 (PerkinElmer)로 세포를 용해시켰다. 상기 용해물을 실온 (RT)에서 900 rpm으로 10분 동안 진탕하였다. pSTAT5 AlphaLisa 키트 (PerkinElmer)를 통해 인산화된 STAT5를 측정하였다. 새롭게 제조된 수용체 비드 혼합물을 녹색 필터된 <100 룩스 광 하에서 용해물 (5 μL)에 분배하였다. 플레이트를 900 rpm으로 2분 동안 진탕하고, 간단히 침강시키고, 실온의 어두운 곳에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 공여체 비드를 녹색 필터된 <100 룩스 광 하에서 분배하였다 (5 μL). 플레이트를 900 rpm으로 2분 동안 진탕하고, 간단히 침강시키고, 실온의 어두운 곳에서 밤새 인큐베이션하였다. 녹색 필터된 <100 룩스 광 하에서 EnVision 플레이트 r 리더 (plate r reader) (PerkinElmer)를 사용하여 689 nm에서 여기 및 570 nm에서 방출로 발광 (luminescence)을 측정하였다.
IL-2에 반응하여 시험 화합물의 억제 효능을 결정하기 위해, pSTAT5에 결합된 비드의 평균 방출 세기를 인간 T 세포주에서 측정하였다. 신호 세기 대 화합물 농도의 억제 곡선의 분석으로부터 IC50 값을 결정하였다. 데이터는 pIC50 (음의 십진 로그 IC50) 값 (평균 ± 표준 편차)으로 표시하였다. 화합물 1은 본 분석에서 pIC50 값이 7.8을 나타내었다.
분석 3: 세포 JAK 효능 분석: BEAS -2B 세포에서 IL-13 자극된 pSTAT6의 억제
AlphaScreen JAKI 세포 효능 분석을 BEAS-2B 인간 폐 상피 세포 (ATCC)에서 인터루킨-13 (IL-13, R&D Systems) 유도 STAT6 인산화를 측정하여 수행하였다. 항-STAT6 항체 (Cell Signaling Technologies)를 AlphaScreen 수용체 비드 (Perkin Elmer)에 접합시키고, 항-pSTAT6 (pTyr641) 항체 (Cell Signaling Technologies)는 EZ-Link 설포-NHS-비오틴 (Thermo Scientific)을 사용하여 비오티닐화 (biotinylated)하였다.
BEAS-2B 세포를 37℃에서 5% CO2 가습 인큐베이터에서, 10% FBS (Hyclone), 100 U/mL 페니실린, 100 μg/mL 스트렙토마이신 (Life Technologies) 및 2 mM GlutaMAX (Life Technologies)가 보충된 50% DMEM/50% F-12 배지 (Life Technologies)에서 성장시켰다. 분석 1 일차에, 세포를 25μL 배지를 가진 화이트 폴리-D-리신-코팅된 384-웰 플레이트 (Corning)에 7,500 세포/웰의 밀도로 시딩하고, 상기 인큐베이터에서 밤새 부착시켰다. 분석 2 일차에, 상기 배지를 제거하고, 시험 화합물의 용량-반응을 함유하는 12 μL의 분석 버퍼 (Hank's Balanced Salt Solution/HBSS, 25 mM HEPES 및 1 mg/mL 우혈청 알부민/BSA)로 교체하였다. 화합물을 DMSO에서 계열 희석하고, 그 다음에 배지에서 1000배 더 희석시켜서, 최종 DMSO 농도를 0.1%로 하였다. 세포를 시험 화합물과 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하고, 그 후 12μl의 예열된 IL-13 (분석 버퍼 중 80 ng/mL)을 자극을 위해 부가하였다. 37℃에서 30분 동안 인큐베이션한 후에, 상기 분석 버퍼 (화합물 및 IL-13을 함유)를 제거하고, 10μL의 세포 용해 버퍼 (25 mM HEPES, 0.1% SDS, 1% NP-40, 5 mM MgCl2, 1.3 mM EDTA, 1 mM EGTA 및 Roche Diagnostics의 Complete Ultra mini 프로테아제 억제제 및 PhosSTOP 보충)를 부가하였다. 상기 플레이트를 주위 온도에서 30분 동안 진탕시킨 후에, 검출 시약을 부가하였다. 비오틴-항-pSTAT6 및 항-STAT6 접합된 수용체 비드의 혼합물을 먼저 부가하고, 주위 온도에서 2시간 동안 인큐베이션하고, 그 다음에 스트렙타비딘 (streptavidin) 접합된 공여체 비드 (Perkin Elmer)를 부가하였다. 최소 2시간 인큐베이션 후에, 상기 분석 플레이트를 EnVision 플레이트 리더에서 판독하였다. AlphaScreen 발광 신호를 기록하고, 이를 활용하여 DMSO 및 배경 대조군에 기반하여 억제 퍼센트 값을 계산하였다.
용량-반응 분석을 위해, 억제 퍼센트 데이터를 화합물 농도에 대해 플로팅하고, IC50 값은 Prism 소프트웨어를 사용하여 4-파라미터 로버스트 적합 모델로부터 결정하였다. 결과는 또한 IC50 값의 음의 로그값인, pIC50으로 표시될 수 있다. 화합물 1은 본 분석에서 pIC50 값이 8을 나타내었다.
분석 4: 세포 JAK 효능 분석: 인간 PBMC에서 IL-2/항-CD3 자극된 IFNγ의 억제
인터루킨-2 (IL-2)/항-CD3 자극된 인터페론 감마 (IFNγ) 억제에 대한 시험 화합물의 효능을 인간 전혈 (Stanford Blood Center)로부터 단리된 인간 말초혈액 단핵 세포 (PBMC)에서 측정하였다. IL-2는 JAK를 통해 신호를 전달하기 때문에, 본 분석은 JAK 세포 효능의 척도를 제공한다.
(1) 인간 말초혈액 단핵 세포 (PBMC)는 ficoll 구배를 사용하여 건강한 인간 공여자의 전혈로부터 단리하였다. 37℃, 5% CO2 가습 인큐베이터에서 10% 열불활성화된 우태아 혈청 (FBS, Life Technologies), 2 mM 글루타맥스 (Life Technologies), 25 mM HEPES (Life Technologies) 및 1X Pen/Strep (Life Technologies)이 보충된 RPMI (Life Technologies)에서 세포를 배양하였다. 세포를 배지 (50 μL) 중에 200,000 세포/웰로 시딩하고, 1시간 동안 배양하였다. 화합물을 DMSO에서 계열 희석하고, 그 다음에 배지에서 500-배 (2x 최종 분석 농도까지)로 더 희석하였다. 시험 화합물 희석물 (100　μL/웰)을 세포에 부가하고, 37℃, 5% CO2에서 1시간 동안 인큐베이션하고, 그 다음에 예열된 분석 배지 (50　μL)에 IL-2 (R&D Systems; 최종 농도 100 ng/mL) 및 항-CD3 (BD Biosciences; 최종 농도 1 μg/mL)을 24시간 동안 부가하였다.
(2) 사이토킨 자극 후에, 세포를 500 g으로 5분 동안 원심분리하고, 상등액을 꺼내고, -80℃로 동결시켰다. IL-2/항-CD3에 반응하는 시험 화합물의 억제 효능을 결정하기 위해, 상등액 중 IFNγ 농도를 ELISA (R&D Systems)를 통해 측정하였다. IC50 값은 IFNγ 농도 대 화합물 농도의 억제 곡선 분석으로부터 결정하였다. 데이터는 pIC50 (음의 십진 로그 IC50) 값으로 표시하였다. 화합물 1은 본 분석에서 pIC50 값이 6.7을 나타내었다.
분석 5: 세포 JAK 효능 분석: CD4+ T 세포에서 IL-2 자극된 pSTAT5의 억제
인터루킨-2 (IL-2)/항-CD3 자극된 STAT5 인산화 억제에 대한 시험 화합물의 효능을 인간 전혈 (Stanford Blood Center)로부터 단리된 인간 말초혈액 단핵 세포 (PBMC) 중 CD4-양성 (CD4+) T 세포에서 유세포 분석을 사용하여 측정하였다. IL-2는 JAK를 통해 신호를 전달하기 때문에, 본 분석은 JAK 세포 효능의 척도를 제공한다.
CD4+ T 세포는 피코에리트로빌린 (phycoerythrobilin: PE) 접합된 항-CD4 항체 (Clone RPA-T4, BD Biosciences)를 사용하여 확인하고, Alexa Fluor 647 접합된 항-pSTAT5 항체 (pY694, Clone 47, BD Biosciences)를 사용하여 STAT5 인산화를 검출하였다.
(1) 상기 분석 4의 문단 (1)의 프로토콜을 따르지만, IL-2/항-CD3에 의한 사이토킨 자극은 24시간이 아닌 30분 동안 수행하였다.
(2) 사이토킨 자극 후에, 세포를 37℃, 5% CO2에서 예열된 고정 용액 (200 μL; BD Biosciences)으로 10분 동안 고정시키고, DPBS 버퍼 (1 mL, Life Technologies)로 2회 세척하고, 4℃에서 30분 동안 빙냉한 Perm 버퍼 III (1000 μL, BD Biosciences)에 재현탁하였다. 세포를 DPBS 중 2% FBS (FACS 버퍼)로 2회 세척하고, 그 다음에 실온의 어두운 곳에서 60분 동안 항-CD4 PE (1:50 희석) 및 항-CD3 항-CD3 Alexa Fluor 647 (1:5 희석)을 함유하는 FACS 버퍼 (100 μL)에 재현탁하였다. 인큐베이션 후에, 세포를 LSRII 유세포 분석기 (BD Biosciences)를 사용하여 분석하기 전에 FACS 버퍼에서 2회 세척하였다. IL-2/항-CD3에 반응하는 시험 화합물의 억제 효능을 결정하기 위해서, pSTAT5의 중간값 형광 세기 (median fluorescent intensity: MFI)를 CD4+ T 세포에서 측정하였다. IC50 값은 MFI 대 화합물 농도의 억제 곡선 분석으로부터 결정하였다. 데이터는 pIC50 (음의 십진 로그 IC50) 값으로 표시하였다. 화합물 1은 본 분석에서 pIC50 값이 7.7을 나타내었다.
분석 6: 세포 JAK 효능 분석: 인간 PBMC에서 IL-6 자극된 CCL2 ( MCP - 1)의 억제
인터루킨-6 (IL-6) 자극된 CCL2 (MCP-1) 생성 억제에 대한 시험 화합물의 효능을 인간 전혈 (Stanford Blood Center)로부터 단리된 인간 말초혈액 단핵 세포 (PBMC)에서 측정하였다. IL-6은 JAK를 통해 신호를 전달하기 때문에, 본 분석은 JAK 세포 효능의 원위 척도 (distal measure)를 제공한다.
(1) 상기 분석 4의 문단 (1)의 프로토콜을 시험 화합물과의 인큐베이션까지 따랐다. 본 분석에서, 시험 화합물을 웰로 부가하고 인큐베이션한 후에, 예열된 분석 배지 (50　μL) 중 IL-6 (R&D Systems; 최종 농도 10 ng/ml)을 부가하였다.
(2) 48시간 동안 사이토킨 자극 후에, 세포를 500 g으로 5분 동안 원심분리하고, 상등액을 꺼내고, -80℃에서 동결하였다. IL-6에 반응하는 시험 화합물의 억제 효능을 결정하기 위해서, 상등액 중 CCL2 (MCP-1) 농도를 ELISA (R&D Systems)를 통해 측정하였다. IC50 값은 CCL2/MCP-1의 농도 대 화합물 농도의 억제 곡선 분석으로부터 결정하였다. 데이터는 pIC50 (음의 십진 로그 IC50) 값으로 표시하였다. 화합물 1은 본 분석에서 pIC50 값이 6.5를 나타내었다.
분석 7: 약력학적 분석: 래트에서 IL6-유도된 pSTAT3의 억제
시험 화합물의 단회 유리체내 투여로 IL-6 유도된 pSTAT3을 억제하는 능력을 래트의 망막/맥락막 균질물에서 측정하였다.
10 mg/mL의 목표 농도를 얻기 위해, 화합물 1을 1% HPMC E5 + 15% HPβCD, pH7에 용해시켜서 용액 제제를 제조하였다. 암컷 Lewis 래트에게 비히클, 비히클 + 래트 IL-6 (Peprotech; 0.5 μg) 또는 IL-6 + 화합물의 조합 (0.5 μg의 IL-6 및 45 μg의 화합물 1)을 유리체내 (IVT) 투여하였다 (안구 당 5 μL). 상기 IVT 주사하고 1시간 후에 안구 조직을 절개하였다. 망막/맥락막 조직을 균질화하고, AlphaLisa (PerkinElmer)를 사용하여 pSTAT3 수준을 측정하였다. IL-6-유도된 pSTAT3의 억제 퍼센트는 비히클 및 IL-6 그룹과 비교하여 계산하였다.
화합물 1의 45 μg 투여로 망막/맥락막 균질물에서 IL-6-유도된 pSTAT3을 84% 만큼 억제하였다.
분석 8: 마우스에서 폐 및 혈장 약동학
혈장 및 폐 중 화합물 1의 농도 및 이의 비율을 하기 방식으로 결정하였다. Charles River Laboratories의 BALB/c 마우스를 본 분석에서 사용하였다. 화합물 1을 0.324 mg/mL의 농도로 시트레이트 버퍼 (pH 4) 중 20% 프로필렌 글리콜에서 용액으로 제제화하였다. 50 μL의 용액 제제를 구강 흡인 (oral aspiration)에 의해 마우스의 기관 (trachea)으로 도입하였다. 투여 후 다양한 시점 (0.167, 2, 6 시간)에서, 심장 천자를 통해 혈액 시료를 꺼내고, 온전한 폐를 마우스로부터 절제하였다. 혈액 시료를 4℃에서 대략 12,000 rpm으로 4분 동안 원심분리하여 (Eppendorf centrifuge, 5804R) 혈장을 수집하였다. 폐를 패드로 건조시키고, 칭량하고, 0.6 mL의 멸균수 중에 균질화하였다. 혈장 및 폐 중 화합물 1의 농도는 LC-MS 분석에 의해 시험 매트릭스에서 표준 곡선으로 구축된 분석용 표준에 대해 결정하였다. 43.5 μg hr/g의 폐 AUC (0-6hr)로 폐에서의 노출이 지속되는 것을 확인하였다. 폐 대 혈장 비율은 폐 AUC (μg hr/g) 대 혈장 AUC (μg　hr/mL)의 비율로서 결정하였다 (여기서 AUC는 통상적으로 시험 화합물 농도 대 시간의 곡선하 면적으로 정의된다). 상기 폐 대 혈장 AUC 비율은 59.6이었고, 이는 혈장에 비해 폐 노출이 높음을 강조한다.
분석 9: 키놈 스크린 ( Kinome Screen) 및 GINI 계수
화합물 1 및 C-1을 다른 키나제에 대해 이들의 선택성 프로파일 (selectivity profile)을 평가하기 위해 스크리닝하였다.
키나제-태그된 T7 파지 균주를 BL21 균주 유래의 대장균 (E. coli) 숙주에서 24-웰 블록에서 병렬로 성장시켰다. 대장균을 로그-단계 (log-phase)로 성장시키고, 동결된 스톡으로부터의 T7 파지로 감염시키고 (감염 다중도 = 0.4), 32℃에서 진탕하면서 용균될 때까지 (90-150분) 인큐베이션하였다. 상기 용균물을 원심분리하고 (6,000 x g), 여과하여 (0.2μm) 세포 조직파편 (cell debris)을 제거하였다. 나머지 키나제를 HEK-293 세포에서 생성하였고, 후속하여 qPCR 검출을 위해 DNA로 태그하였다.
키나제 분석을 위한 친화성 수지 (affinity resins)를 생성하기 위해 스트렙타비딘-코팅된 자기 비드를 비오티닐화 소분자 리간드로 실온에서 30분 동안 처리하였다. 리간드화된 비드를 과량의 비오틴으로 차단하고, 차단 버퍼 (SeaBlock (Pierce), 1% BSA, 0.05% Tween 20, 1 mM DTT)로 세척하여 결합되지 않은 리간드를 제거하고 비-특이적 파지 결합을 감소시켰다. 1x 결합 버퍼 (20% SeaBlock, 0.17x PBS, 0.05% Tween 20, 6 mM DTT)에서 키나제, 리간드화된 친화성 비드 및 시험 화합물을 조합하여 결합 반응을 조립하였다. 시험 화합물을 100% DMSO에서 40x 스톡으로 준비하고, 바로 희석하여 분석하였다. 모든 반응은 폴리프로필렌 384-웰 플레이트에서 최종 부피 0.04 ml로 수행하였다. 상기 분석 플레이트를 실온에서 진탕하면서 1시간 동안 인큐베이션하고, 친화성 비드는 세척 버퍼 (1x PBS, 0.05% Tween 20)로 세척하였다. 그 후에 상기 비드를 용출 버퍼 (1x PBS, 0.05% Tween 20, 0.5 μM 비-비오티닐화 친화성 리간드) 중에 재현탁하고, 실온에서 진탕하면서 30분 동안 인큐베이션하였다. 상기 용출물 중에 키나제 농도는 qPCR로 측정하였다.
화합물을 1 μM로 스크리닝하고, 하기 표 2 및 3에서 1차 스크리닝 결합 상호작용에 대한 결과를 "억제 %" (=100-((시험 화합물 신호-양성 대조군 신호)/((음성 대조군 신호)-(양성 대조군 신호))X100)로 보고하고, 여기서 음성 대조군은 DMSO이고, 양성 대조군은 대조군 화합물이다.
Figure pct00021
Figure pct00022
화합물 1은 화합물 C-1보다 EPHB6, KIT, PAK4, SRC, CDK7 및 CDK9에 대한 결합 억제가 유의하게 더 낮은 것으로 밝혀졌다. 화합물 1은 또한 몇 가지 다른 키나제에 대한 결합 억제가 더 낮았다.
화합물 1 및 C-1 모두를 35개의 상이한 키나제에 대해 스크리닝하였다. Gini 계수를 화합물들 모두에 대해 결정하였다. 화합물 1은 GINI 계수가 0.60이고, 화합물 C-1은 GINI 계수가 0.46이었다. 상기 Gini 계수는 키나제 패널에 대한 화합물의 선택성을 나타내기 위해 사용하였다 (Graczyk, J. Med . Chem ., 2007, 50, 5773-5779). 숫자가 더 클수록 더 선택적인 화합물에 해당한다.
화합물 1 및 화합물 C-1 사이의 유일한 구조적 차이는 코어 상에 플루오로 기가 존재하는 것이다. 이러한 구조적 차이가 상기 화합물의 키놈 선택성 (kinome selectivity)에 중요한 영향을 미치는 것으로 나타났다.
분석 10: 세포 생존력 분석
CellTiter-Glo 발광 세포 생존력/세포독성 분석을 정상 성장 조건하에 BEAS-2B 인간 폐 상피 세포 (ATCC)에서 수행하였다.
37℃, 5% CO2 가습 인큐베이터에서, 10% FBS (Hyclone), 100 U/mL 페니실린, 100 μg/mL 스트렙토마이신 (Life Technologies) 및 2 mM GlutaMAX (Life Technologies)가 보충된 50% DMEM/50% F-12 배지 (Life Technologies)에서 세포를 성장시켰다. 분석 1일 차에, 세포를 25 μL 배지를 가진 화이트 384-웰 조직 배양 플레이트 (Corning)에 500 세포/웰의 밀도로 시딩하고, 상기 인큐베이터에서 밤새 부착시켰다. 분석 2일 차에, 시험 화합물의 용량-반응을 함유하는 5 μL의 배지를 부가하고, 37℃에서 48시간 동안 인큐베이션하였다. 그 다음에 30 μL의 CellTiter-Glo 검출 용액 (Promega)을 부가하고, 오비탈 쉐이커 (orbital shaker)에서 5분 동안 혼합하고, EnVision 리더에서 판독하기 전에 추가 10분 동안 인큐베이션하였다. 발광 신호를 기록하고, 퍼센트 DMSO 대조군 값을 계산하였다.
용량-반응 분석을 위해, 퍼센트 DMSO 대조군 데이터를 화합물 농도에 대해 플로팅하고, 각 데이터 점을 연결하는 선에 의해 용량-반응 곡선을 유도하였다. 각 곡선이 15% 억제 임계값을 교차하는 농도를 CC15로 정의하였다.
본 분석에서 더 높은 CC15 값을 나타내는 시험 화합물은 세포독성을 유발할 가능성이 적을 것으로 기대된다.
화합물 1은 pCC15 < 5를 나타내고 (CC15 > 10 μM에 해당함), 화합물 C-1은 pCC15가 5.8을 나타내었다 (CC15 1.58 μM에 해당함). 그러므로, 화합물 1은 본 분석에 기반하여 화합물 C-1보다 세포독성을 유발할 가능성이 유의하게 더 낮다.
화합물 1 및 화합물 C-1 사이의 유일한 구조적 차이는 코어 상에 플루오로 기가 존재하는 것이다. 이러한 구조적 차이가 상기 화합물의 세포 독성에 중요한 영향을 미치는 것으로 나타났다.
분석 10: 세포 JAK 효능 분석: 1차 인간 망막 미세혈관 내피 세포에서 IL-6 트랜스-신호전달 자극된 p- STAT3의 억제
IL-6 트랜스-신호전달 (IL6 + sIL6Rα)-유도된 STAT3 인산화 억제에 대한 시험 화합물의 세포 효능을 1차 인간 망막 미세혈관 내피 세포 (human retinal microvascular endothelial cell: HRMEC)에서 측정하였다. IL-6 트랜스-신호전달 (trans-signaling)은 IL-6 수용체 베타 (gp130)에 의해 매개되고, 이는 JAK 효소에 세포내 결합된다. gp130 결합 및 이량체화 후에, JAK가 활성화되고, STAT3를 바로 인산화한다. 따라서, 본 분석은 JAK 세포 효능의 척도를 제공한다. HRMEC (Cell Systems, Kirkland WA)를 웰당 1x104 세포의 밀도로 Attachment FactorTM (Cell Systems, Kirkland WA)로 코팅된 멸균 조직 배양 처리된 평면-바닥 96-웰 분석 플레이트에 플레이팅하였다. HRMEC 배양물을, 10% 우태아 혈청, Culture BoostTM 성장 인자 및 BacOff® 항생제 (Cell Systems, Kirkland WA)가 보충된 배양 배지에서 37℃, 95% 습도, 5% CO2에서 3일 동안 성장시켰다. 상기 시험 화합물을 DMSO에서 계열 희석한 다음에, 완전 배양 배지에서 1.11x 최종 분석 농도로 제조하였다. 세포를 90 μL의 1.11x 시험 화합물과 함께 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션한 다음에, 예열된 분석 배지 중 10 μL의 10x IL-6/sIL6Rα (PeproTech, Inc.; 최종 농도 500 pM IL-6, 5 nM sIL6Rα)를 30분 동안 부가하였다. 자극 후에, 상등액을 꺼내고, 세포 물질을 포스파타제 억제제 (PhosSTOPTM, Roche)가 함유된 50 μL 용해 버퍼 (AlphaLISA® SureFire® Ultra TM assay kit, PerkinElmer)에 수집하고, 분석할 때까지 -80℃에서 저장하였다. 상기 시험 화합물의 억제 효능을 결정하기 위해, 제조자의 지침에 따라 AlphaLISA® SureFire® Ultra TM p-STAT3 (Tyr705) 분석 키트 (PerkinElmer)를 사용하여 p-STAT3의 수준을 측정하였다. IC50 값은 % p-STAT3 알파 신호 대 시험 화합물 농도의 억제 곡선으로부터 결정하였다 (GraphPad Prism 7.0으로 수행된 곡선 맞춤). 데이터는 pIC50 (음의 log10(시험 화합물 농도))으로 표시하였다. 화합물 1은 3회의 독립적 실험에서 pIC50이 6.3 ± 0.1로 나타났다.
본 발명은 특정 양상 또는 구체예를 참조하여 서술되었지만, 당업자라면 본 발명의 진정한 사상 및 범위를 벗어나지 않고 다양한 변경이 이루어질 수 있거나 균등물로 대체될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 또한, 적용 가능한 특허 법령 및 규정에 의해 허용되는 한, 본원에 인용된 모든 간행물, 특허 및 특허 출원은 각각의 문헌이 개별적으로 본원에 참조로 통합된 것과 동일한 정도로 그 전문이 본원에 참조로 통합된다.

Claims (19)

  1. 하기 화학식의 화합물 또는 이의 약학적으로-허용 가능한 염:
    Figure pct00023
    .
  2. 하기 화학식의 화합물:
    Figure pct00024
    .
  3. 청구항 1 또는 2의 화합물 및 약학적으로-허용 가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물.
  4. 청구항 3에 있어서, 상기 조성물은 안구에 적용하기에 적합한 약학적 조성물.
  5. 청구항 4에 있어서, 상기 조성물은 유리체내 (intravitreal) 주사에 적합한 약학적 조성물.
  6. 청구항 5에 있어서, 상기 조성물은 현탁액 (suspension)인 약학적 조성물.
  7. 하기 화학식 1의 화합물 또는 이의 약학적으로-허용 가능한 염을 제조하는 방법으로서:
    Figure pct00025

    (a) 하기 화학식 6의 화합물을 하기 화학식 7- PG의 화합물과 반응시켜서 하기 화합물 1-PG를 제공하는 단계:
    Figure pct00026
    ,
    Figure pct00027

    여기서 RA는 히드록실 또는 이탈기이고, PG는 아미노-보호기임,
    Figure pct00028
    ;
    (b) 상기 화합물 1- PG를 탈보호하는 단계; 및
    (c) 선택적으로 약학적으로-허용 가능한 염을 제조하여, 화학식 1의 화합물 또는 이의 약학적으로-허용 가능한 염을 제공하는 단계를 포함하는 방법.
  8. 청구항 7에 있어서, 상기 RA는 히드록실인 방법.
  9. 청구항 8에 있어서, 상기 화합물 6 및 화합물 7- PG 간 반응이 HATU의 존재하에 수행되는 방법.
  10. 청구항 7에 있어서, 상기 PG는 Boc인 방법.
  11. 청구항 1 또는 2에 있어서, 포유동물의 안구 질환 (ocular disease) 치료에 사용하기 위한 화합물.
  12. 청구항 11에 있어서, 상기 안구 질환은 포도막염 (uveitis), 당뇨 망막병증 (diabetic retinopathy), 당뇨 황반 부종 (diabetic macular edema), 안구건조증 (dry eye disease), 연령-관련 황반 변성 (age-related macular degeneration), 망막 정맥 폐쇄 (retinal vein occlusion) 및 아토피성 각막결막염 (atopic keratoconjunctivitis)으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 화합물.
  13. 청구항 12에 있어서, 상기 안구 질환은 당뇨 황반 부종 또는 포도막염인 화합물.
  14. 포유동물에서 안구 질환 치료용 약제 제조에 있어서, 청구항 1 또는 2에 청구된 화합물의 용도.
  15. 청구항 14에 있어서, 상기 안구 질환은 포도막염, 당뇨 망막병증, 당뇨 황반 부종, 안구건조증, 연령-관련 황반 변성, 망막 정맥 폐쇄 및 아토피성 각막결막염으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 용도.
  16. 청구항 15에 있어서, 상기 안구 질환은 당뇨 황반 부종 또는 포도막염인 용도.
  17. 포유동물에서 안구 질환을 치료하는 방법으로서,
    청구항 1 또는 2의 화합물 및 약학적으로-허용 가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물을 상기 포유동물의 안구에 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  18. 청구항 17에 있어서, 상기 안구 질환은 포도막염, 당뇨 망막병증, 당뇨 황반 부종, 안구건조증, 연령-관련 황반 변성, 망막 정맥 폐쇄 및 아토피성 각막결막염으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 방법.
  19. 청구항 18에 있어서, 상기 안구 질환은 당뇨 황반 부종 또는 포도막염인 방법.
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