KR20210084278A

KR20210084278A - 암 치료용 면역 항암 조성물

Info

Publication number: KR20210084278A
Application number: KR1020200181143A
Authority: KR
Inventors: 이중환; 이종욱; 김진우
Original assignee: 인터올리고 주식회사
Priority date: 2019-12-27
Filing date: 2020-12-22
Publication date: 2021-07-07
Also published as: WO2021132936A1; EP4083210A1; US20230055235A1; JP2023509902A; AU2020414184A1; CN114981435A

Abstract

PD-L1에 특이적으로 결합하거나 PD-L1에 특이적으로 결합하여 PD-1과 PD-L1의 상호작용을 억제할 수 있는, 서열번호 1, 2, 10, 또는 18의 핵산 서열을 포함하는, 압타머 또는 이의 기능성 단편에 관한 것이다.

Description

암 치료용 면역 항암 조성물{Immunotherapeutic composition for treating cancer}

본 발명은 압타머를 포함하는 면역 치료용 조성물에 관한 것이다.

암은 전 세계적으로 사망의 주요 원인 중 하나로 알려져 있다. 외과적인 절제 및 통상적인 화학요법이 일반적으로 사용되지만, 수술은 높은 재발률 및 부작용을 가지고 있고, 화학요법은 해결해야 할 임상적 문제점들이 존재한다. 따라서 암 환자를 치료하기 위한 새로운 방법 및 수단을 개발하여 환자의 생존 기간을 늘리는 것이 필요하다.

면역 항암제는 최근 크게 주목을 받고 있는 새로운 항암 치료 방법으로 인체의 면역체계를 활성화시켜 면역세포가 암세포를 공격하여 항암 효과를 얻는 치료법이다. 현재 시판이 허가된 면역 항암제들은 주로 면역관문억제제 (immune checkpoint inhibitor)가 대부분을 차지하고 있다. 인체의 면역 세포 중 하나인 T세포는 암세포 표면에 발현된 종양특이항원의 작용으로 활성화되고 암세포를 인식, 공격, 사멸시킨다. 암세포는 이런 T세포 공격을 회피하는 메커니즘으로 다양한 면역관문 단백질들을 이용한다. 이를테면 암세포에 발현된 PD-L1(programmed death-ligand 1) 단백질은 T세포에 발현되는 PD-1(programmed cell death protein 1) 단백질과 결합하여 T세포를 불활성화 시키는 억제 신호를 전달함으로써 T세포의 공격을 회피하게 된다. 면역관문억제제들은 여러 종류의 면역관문 단백질들간의 결합을 차단하는 방법으로 암세포의 면역회피 기작을 저해함으로써 T세포를 활성화시켜 암세포를 제거한다. 현재 사용되고 있는 면역관문억제제의 타겟으로는 CTLA-4, PD-1 그리고 PD-L1등이 있으며 이들의 신호전달을 저해하는 항체기반 항암제들인 여보이, 옵티보, 티센트릭 등이 이 범주에 속한다. (Ott et al. (2013) Clin Cancer Res 19: 5300-5309)

바이오마커는 암을 포함한 질병의 병적 상태, 진행 상황을 구분하거나 치료 반응을 예측하는데 객관적으로 사용이 가능한 단백질이나, DNA, RNA, 대사물질 등을 의미한다. 특히 특정 약물에 대한 반응군과 비반응군을 구별하고 치료효과를 모니터링할 수 있는 바이오마커의 개발 및 진단은 최근 개발되고 있는 신규 항암제 치료의 성패를 구분하는 매우 중요한 요소가 되고 있다. 이것은 새로운 항암제들이 암의 특정한 분자 생물학적 변화를 공격하는 방법을 이용한다는 과학적 측면뿐만 아니라 기존 화학 요법에 비해 너무 높은 약가로 인해 환자의 치료 효과를 예측하는 것이 경제적 측면에서 매우 중요한 요소로 부각되었기 때문이다.

일부 면역관문억제제의 경우 암 환자의 생체 조직을 이용 면역학적 방법으로 암 조직의 타겟 단백질 발현을 조사하는 동반진단이 필수적으로 수행되어야만 한다. 하지만 이 단백질의 발현여부와 치료 효과 사이의 상관 관계가 분명하지 않은 문제점도 이미 지적되고 있다. 이는 동반진단에 사용되는 면역학적 방법의 민감도, 바이오마커의 유효성 등 다양한 원인에서 기인할 수 있다. 따라서 다양한 방법의 고 민감도의 진단방법 개발이 많이 연구되고 있으나 아직 뚜렷한 성과는 나타나고 있지 않다. (Havel et al. (2019) Nat Rev Cancer 19: 133-150)

압타머는 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 갖는 분자이고, 분자 내 수소결합에 의해 특정 3차원 구조를 갖을 수 있으며, 이러한 3차원의 공간적 구조를 통해 표적에 특이적으로 결합할 수 있다. 압타머는 표적에 특이적이기 때문에, 일부 압타머는 표적 물질의 기능을 억제할 수 있고, 표적에 결합함으로써 세포 내 신호 전달 경로를 차단할 수 있기 때문에 표적을 특이적으로 억제하기 위한 핵산 약제로서 주목을 받아왔다.

압타머는 SELEX (systematic evolution of ligands by exponential enrichment)를 통해 선별될 수 있다. 압타머는 특정 3차원 구조를 형성하여 표적에 결합될 수 있으며, 높은 친화성, 높은 특이성, 합성의 용이성을 가지고 있을 뿐 아니라 면역원성이 없거나 낮은 장점을 갖는다. 일부 압타머는 표적 물질에 결합할 뿐만 아니라, 표적 물질의 기능을 억제할 수 있기 때문에, 질환 치료의 관점에서 다양한 적용이 가능하다. 현재까지 FDA에서는 VEGF에 특이적으로 결합하는 핵산 압타머인 pegaptanib sodium이 노화 관련 황반변성의 치료제로서 허가되었다. 또한, 종양 치료 분야에서 VEGF, PDGF, 뉴클레오린(nucleolin) 등을 표적으로하는 압타머가 암 치료를 목표로 하는 임상에 진입한 바 있다. (Dunn et al. (2017) Nat Rev Chem 1: 76, Ng et al. (2006) Nat Rev Drug Discovery 5:123-132)

한국등록특허 제2138447호

본 발명은 암을 면역 요법으로 치료하기 위한 압타머를 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은 암세포를 검출할 수 있는 압타머를 제공하는 것을 다른 목적으로 한다.

1. PD-L1(programmed death-ligand 1)에 특이적으로 결합하거나 PD-L1에 특이적으로 결합하여 PD-1(programmed cell death protein 1)과 PD-L1의 상호작용을 억제할 수 있는, 서열번호 1, 2, 10, 또는 18의 핵산 서열을 포함하는, 압타머 또는 이의 기능성 단편.

2. 항목 1에 있어서, 상기 기능성 단편은 서열번호 3 내지 9, 및 11 내지 17 중 어느 하나인, 압타머 또는 이의 기능성 단편.

3. 서열번호 1, 2, 10, 및 18로 구성된 군으로부터 선택된 핵산 서열을 포함하는 압타머 또는 이의 기능성 단편을 하나 이상 포함하는, 암 치료용 약학 조성물.

4. 항목 3에 있어서, 상기 기능성 단편은 서열번호 3 내지 9, 및 11 내지 17 중 어느 하나인, 약학 조성물.

5. 항목 3에 있어서, 상기 기능성 단편은 서열번호 3, 4, 5, 6, 7, 9, 11, 12, 14 또는 16인, 약학 조성물.

6. 항목 3에 있어서, 상기 암은 PD-L1이 과발현된, 약학 조성물.

7. 항목 3에 있어서, 상기 암은 전립선암, 담낭암, 간내 담도암, 담도암, 구강암, 인두암, 후두암, 설암, 십이지장암, 안종양, 종격동암, 부비동암, 신우암, 심장암, 교모세포종, 신경모세포종, 간암, 골암, 췌장암, 피부암, 두경부암, 유방암, 폐암, 피부 또는 안내 악성 흑색종, 신장암, 자궁암, 난소암, 결장암, 직장암, 항문 부위 암, 대장암, 위암, 고환암, 나팔관 암종, 자궁 내막 암종, 자궁 경부 암종, 질 암종, 외음부암, 비호지킨림프종, 식도암, 소장암, 내분비계암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신샘암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 소아암, 림프구성 림프종, 방광암, 요관암, 신장 골반 암종, 중추 신경계 (CNS) 암, 원발성 CNS 림프종, 종양 혈관 신생, 척추암, 뇌간 신경 교종 , 뇌하수체 선종, 카포시 육종, 표피 암, 편평 상피 세포 암, 다발성 골수종, B-세포 림프종, 호지킨 림프종, 급성 골수성 림프종, 만성 골수성 백혈병, 만성 림프성 백혈병, 여포성 림프종, 미만성 거대 B-세포 림프종, 버킷 림프종, 면역성 대세포 림프종, 전구 B-림프모구 림프종, 맨틀 세포 림프종, 급성 림프모구 림프종, 균상식육종, 역형성 대세포 림프종, 급성 골수성 백혈병, 급성 림프성 백혈병, 간모세포종, 망막모세포종, 복막암, 뇌종양, 흉선암, T-세포 림프종 또는 전구체 T-림프모구 림프종인, 약학 조성물.

8. 항목 3에 있어서, 상기 압타머 또는 상기 기능성 단편의 5' 말단, 3' 말단 또는 양 말단에 저분자 유기화합물, 핵산, 단백질 및 방사선 동위원소 중 적어도 하나가 결합되어 있는, 약학 조성물.

9. 서열번호 1, 2, 10, 및 18로 구성된 군으로부터 선택된 핵산 서열을 포함하는 압타머 또는 이의 기능성 단편을 하나 이상 포함하는, 암세포 검출용 조성물.

10. 항목 9에 있어서, 상기 기능성 단편은 서열번호 3 내지 9, 및 11 내지 17 중 어느 하나인, 검출용 조성물.

11. 항목 9에 있어서, 상기 기능성 단편은 서열번호 3, 4, 5, 6, 7, 9, 11, 12, 14 또는 16인, 검출용 조성물.

12. 항목 9에 있어서, 상기 암세포는 PD-L1이 과발현된 세포인, 검출용 조성물.

13. 항목 9에 있어서, 상기 암은 전립선암, 담낭암, 간내 담도암, 담도암, 구강암, 인두암, 후두암, 설암, 십이지장암, 안종양, 종격동암, 부비동암, 신우암, 심장암, 교모세포종, 신경모세포종, 간암, 골암, 췌장암, 피부암, 두경부암, 유방암, 폐암, 피부 또는 안내 악성 흑색종, 신장암, 자궁암, 난소암, 결장암, 직장암, 항문 부위 암, 대장암, 위암, 고환암, 나팔관 암종, 자궁 내막 암종, 자궁 경부 암종, 질 암종, 외음부암, 비호지킨림프종, 식도암, 소장암, 내분비계암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신샘암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 소아암, 림프구성 림프종, 방광암, 요관암, 신장 골반 암종, 중추 신경계 (CNS) 암, 원발성 CNS 림프종, 종양 혈관 신생, 척추암, 뇌간 신경 교종 , 뇌하수체 선종, 카포시 육종, 표피 암, 편평 상피 세포 암, 다발성 골수종, B-세포 림프종, 호지킨 림프종, 급성 골수성 림프종, 만성 골수성 백혈병, 만성 림프성 백혈병, 여포성 림프종, 미만성 거대 B-세포 림프종, 버킷 림프종, 면역성 대세포 림프종, 전구 B-림프모구 림프종, 맨틀 세포 림프종, 급성 림프모구 림프종, 균상식육종, 역형성 대세포 림프종, 급성 골수성 백혈병, 급성 림프성 백혈병, 간모세포종, 망막모세포종, 복막암, 뇌종양, 흉선암, T-세포 림프종 또는 전구체 T-림프모구 림프종인, 검출용 조성물.

14. 항목 9에 있어서, 상기 압타머 또는 상기 기능성 단편의 5' 말단, 3' 말단 또는 양 말단에 형광 표지, 라만 산란 표지, 효소 표지, 적외선 표지 및 방사선 표지 중 적어도 하나가 결합되어 있는, 검출용 조성물.

본 발명에 따른 압타머를 포함하는 조성물은 암을 치료하거나, 암의 증상을 완화시키거나, 암을 예방할 수 있다.

본 발명에 따른 압타머를 포함하는 조성물은 암세포를 검출할 수 있고, 특히 PD-L1이 과발현된 암세포를 검출할 수 있다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 압타머의 타겟 단백질에 대한 결합력을 측정한 결과이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 압타머의 PD-1/PD-L1 결합의 억제 활성 및 항-PD-L1 항체의 PD-1/PD-L1 결합의 억제 활성을 확인한 결과이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 압타머의 PD-1/PD-L1 결합의 억제 활성을 확인한 결과이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 압타머의 PD-1/PD-L1 결합의 억제 활성을 확인한 결과이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 압타머의 PD-1/PD-L1 결합의 억제 활성 및 항-PD-L1 항체의 PD-1/PD-L1 결합의 억제 활성을 확인한 결과이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 압타머의 PD-1/PD-L1 결합의 억제 활성 및 항-PD-L1 항체의 PD-1/PD-L1 결합의 억제 활성을 확인한 결과이다.

이제 본 발명은 첨부된 도면을 참조로 하기에서 더욱 충분히 기술될 것이며, 그러나 본 발명의 전부가 아닌 단지 일부의 구체예가 예시된다. 실제로, 이들 발명은 많은 다양한 형태로 구체화될 수 있으며, 본원에 제시된 구체예로 제한되는 것으로 해석되어서는 안된다. 본 명세서 및 첨부된 청구범위에 사용되는 단수 형태는 달리 명확하게 지시하지 않는 한 복수한 대상을 포함한다.

압타머는 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 (ssDNA, RNA, 변형된 DNA 또는 변형된 RNA)로서, 이러한 압타머는 특정 3차원 구조를 갖고, 표적 물질에 높은 결합력과 높은 특이성을 나타낸다. 이런 특징은 단백질로 이루어진 항체와 유사한 기능이지만, 압타머는 체내 투여 시 항체에 비해 낮은 면역원성을 보이는 것이 보고되어져 있다. 또, 생물학적으로 제조되는 항체와 다르게 화학적으로 합성되는 압타머는 시험관 내에서 변형이 쉬우며 생산 배치간 차이를 최소화하기 수월하여 항체에 비해 의약품 개발 및 대량 생산에 유리한 이점이 있다. 한편 압타머는 항체에 비해 높은 안정성을 갖기 때문에 제품 생산시 보존에 용이한 장점을 가지고 있다.

이러한 압타머는 표적에 특이적으로 결합하기 때문에, 일부 압타머는 표적 물질의 기능을 저해하거나 표적 물질에 결합하여 세포의 신호 전달을 차단하기도 한다. 특히, 종양 치료에 있어서, VEGF, PDGF, 또는 뉴클레오린을 표적으로 하는 압타머는 임상 연구 파이프라인에 포함되며, 이는 핵산 압타머의 종양 치료에서의 기대를 반영한다.

특히 본 발명에 따른 압타머는 PD-L1(programmed death-ligand 1)에 특이적으로 결합하거나 PD-L1에 특이적으로 결합하여 PD-1(programmed cell death protein 1)과 PD-L1의 상호작용을 억제할 수 있는, 서열번호 1, 2, 10, 또는 18의 핵산 서열을 포함하며, 상기 서열번호 1, 2, 10, 또는 18의 기능성 단편일 수 있다.

본 발명에서 기능성 단편은 압타머 모체의 표적 물질에 대한 결합능이 증진되거나, 유지되거나, 실질적으로 표적 물질에 대한 결합능을 갖는 5' 및/또는 3' 말단이 일부 결실된 단편을 의미한다. 예를 들어, PD-L1에 결합하고 길이가 74mer인 압타머 모체가 있을 때, 5' 및/또는 3' 말단이 결실된 73mer 내지 20mer 길이의 압타머이면서 PD-L1에 대한 결합능을 갖는 압타머를 기능성 단편으로 지칭한다.

압타머는 통상적인 스크리닝 방법인 SELEX (systematic evolution of ligands by exponential enrichment) 방법에 의해 선별될 수 있다. 비록 SELEX 방법은 핵산 압타머를 스크리닝하기 위한 방법이지만, 실제로 유용한 압타머를 스크리닝하는 것은 당해 기술 분야에서 여전히 난해한 것으로 남아있고, 특정 암을 치료하는 데에 효과적인 압타머 기반 의약품의 시판이 허가된 사례는 아직 없다.

압타머를 선별하기 위한 일반적인 SELEX 방법을 이하에서 설명한다. 그러나 통상의 기술자는 당해 기술 분야에 알려진 지식을 바탕으로 각 단계를 추가, 변형, 또는 삭제하고 사용할 수 있다.

단일 가닥 DNA 중앙부에 통상 40~60개의 연속적인 임의 서열이 그리고 5' 번 말단에 바이오틴이 결합할 수 있도록 단일 가닥 DNA 라이브러리를 준비한다. 비-표적과 결합시켜서 음성 선별한다. 더욱 구체적으로, 단일 가닥 DNA 라이브러리를 비-표적을 위치시킨 반응 탱크에 넣어서 단일 가닥 DNA 라이브러리를 비-표적과 혼합한다. 여기에서, 비-표적은, 예를 들어, 혈장내에 풍부한 단백질일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 비-종양 조직에서 발현되는 타겟 단백질과 유사한 구조의 단백질이 사용될 수 있다. 단일 가닥 라이브러리와 비-표적 사이의 결합 반응이 일어나는 동안, 이 비-표적에 특이적인 단일 가닥 DNA 라이브러리의 단일 가닥 DNA 서열이 결합한다. 이 구체예에서, 결합 반응은, 예를 들어, 1분 내지 60분, 또는 약 30분 동안 진행된다.

그 후, 비-표적을 자성 비드에 고정하여 비-표적에 결합하지 않는 단일 가닥 DNA 서열을 분리한다. 더욱 구체적으로, 세척하여 준비한 히스티딘 태그 결합이 가능한 자성 비드를 비-표적 단백질과 단일 가닥 DNA 라이브러리의 혼합물과 반응시킨다. 결합 반응은, 예를 들어, 1분 내지 60분, 또는 약 15분 동안 진행된다. 비-표적 단백질에 결합하지 않는 단일 가닥 DNA 서열은 자성 비드에 결합하지 않은 채로 남아 있기 때문에 상등액을 분리함으로서 분리할 수 있다.

비-표적에 결합하지 않는 단일 가닥 DNA를 표적과 결합시켜 양성 선별을 수행한다. 더욱 구체적으로, 비-표적 단백질에 결합하지 않는 단일 가닥 DNA 서열을 표적 단백질이 있는 반응 탱크에 넣고 혼합한다. 단일 가닥 DNA 서열과 표적 단백질의 반응이 일어나는 동안, 표적 단백질에 특이성을 갖는 단일 가닥 DNA 서열은 표적 단백질에 결합한다. 이 구체예에서, 결합 반응은, 예를 들어, 1분 내지 60분, 또는 약 30분 동안 진행된다.

그 후, 자성 비드에 고정한 표적을 세척하여 표적에 대한 결합력이 낮거나 표적에 결합하지 않는 단일 가닥 DNA 서열을 제거한다. 더욱 구체적으로, 표적 단백질과 단일 가닥 DNA 서열의 결합을 유도한 혼합액에 자성 비드를 첨가하여 표적 단백질의 태그를 이용하여 자성 비드에 고정한다. 이 타겟 단백질이 고정된 자성 비드에 세척 완충액을 반응 탱크에 주입하고 자성 비드를 세척한다. 세척 단계 동안, 표적 단백질에 결합하는 단일 가닥 DNA 서열은 자성 비드에 결합된 채로 남아있기 때문에, 표적 단백질에 결합하지 않는 단일 가닥 DNA 서열을 제거할 수 있다. 일 구체예에서, 세척 단계는 1회, 또는 필요에 따라 복수 회 수행될 수 있다.

단일 가닥 DNA 서열이 결합된 표적을 가열하거나 수산화나트륨 용액을 처리하여 단일 가닥 DNA 서열을 분리시킨다. 일 구체예에서, 가열 온도는, 예를 들어, 이에 제한되는 것은 아니나, 92℃, 95℃ 또는 98℃일 수 있다. 수산화나트륨 처리시 농도는 1 mM 내지 30 mM 사이의 농도에서 선택될 수 있다. 분리된 단일 가닥 DNA 서열은 표적 단백질에 특이적이므로, 표적 단백질에 특이적인 압타머라 할 수 있다.

분리된 단일 가닥 DNA 서열을 증폭시킨다. 일 구체예에서, 분리된 단일 가닥 DNA를 증폭시키는 방법은, 예를 들어, PCR일 수 있고, 여기서 분리된 단일 가닥 DNA 서열을 주형으로 하여 5' 프라이머, 3' 프라이머를 이용하여 수행될 수 있다.

일 구체예에서, 상기 과정을 통해 얻어진 PCR 산물을 복수 회에 걸쳐 선별한다. 더욱 구체적으로, 수득한 PCR 산물을 다음 단계의 선별에 대한 단일 가닥 DNA 라이브러리로서 사용하고, 상기 단계들을 표적 단백질에 대한 더 높은 특이성을 갖는 단일 가닥 DNA 서열을 선별하기 위해 반복한다. 선별 과정을 수 회 반복한 후, 수득한 PCR 산물을 클로닝하고 DNA 서열 분석하여 표적 단백질에 대한 높은 특이성을 갖는 압타머를 수득한다.

본 발명의 다른 실시예에 따른 SELEX 방법을 이하에서 설명한다. 그러나 통상의 기술자는 당해 기술 분야에 알려진 지식을 바탕으로 각 단계를 추가, 변형, 또는 삭제하고 사용할 수 있다.

단일 가닥 DNA 중앙부에 통상 40~60개의 연속적인 임의 서열이 위치할 수 있도록 단일 가닥 DNA 라이브러리를 준비한다. 비-표적 질환 조직 절편과 결합시켜서 음성 선별한다. 더욱 구체적으로, 단일 가닥 DNA 라이브러리를 비-표적 질환 조직 절편을 위치시킨 반응 탱크에 넣어서 단일 가닥 DNA 라이브러리를 비-표적 질환 조직 절편과 혼합한다. 여기에서, 비-표적 질환 조직 절편은, 예를 들어, 정상 조직 절편일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 비-종양 조직 절편이 비-표적 질환 조직 절편으로서 사용될 수 있다. 단일 가닥 라이브러리와 비-표적 질환 조직 절편 사이의 결합 반응이 일어나는 동안, 비-표적 질환 조직 절편에 특이적인 단일 가닥 DNA 라이브러리의 단일 가닥 DNA 서열이 비-표적 질환 조직 절편에 결합한다. 이 구체예에서, 결합 반응은, 예를 들어, 1분 내지 60분, 또는 약 30분 동안 진행된다.

그 후, 비-표적 질환 조직 절편을 세척하여 비-표적 질환 조직 절편에 결합하지 않는 단일 가닥 DNA 서열을 분리한다. 더욱 구체적으로, 세척 완충액을 반응 탱크에 주입하고 비-표적 질환 조직 절편을 세척한다. 세척 단계 동안, 비-표적 질환 조직 절편에 결합하는 단일 가닥 DNA 서열은 비-표적 질환 조직 절편에 결합된 채로 남아있기 때문에, 비-표적 질환 조직 절편에 결합하지 않는 단일 가닥 DNA 서열을 분리할 수 있다.

비-표적 질환 조직 절편에 결합하지 않는 단일 가닥 DNA를 표적 질환 조직과 결합시켜 양성 선별을 수행한다. 더욱 구체적으로, 비-표적 질환 조직 절편에 결합하지 않는 단일 가닥 DNA 서열을 표적 질환 조직 절편이 있는 반응 탱크에 넣고, 비-표적 질환 조직 절편에 결합하지 않은 단일 가닥 DNA 서열을 표적 질환 조직 절편과 혼합한다. 단일 가닥 DNA 서열과 표적 질환 조직 절편의 반응이 일어나는 동안, 표적 질환 조직 절편에 특이성을 갖는 단일 가닥 DNA 서열은 표적 질환 조직 절편에 결합한다. 이 구체예에서, 결합 반응은, 예를 들어, 1분 내지 60분, 또는 약 30분 동안 진행된다.

그 후, 표적 질환 조직 절편을 세척하여 표적 질환 조직 절편에 대한 결합력이 낮거나 표적 질환 조직 절편에 결합하지 않는 단일 가닥 DNA 서열을 제거한다. 더욱 구체적으로, 세척 완충액을 반응 탱크에 주입하고 표적 질환 조직 절편을 세척한다. 세척 단계 동안, 표적 질환 조직 절편에 결합하는 단일 가닥 DNA 서열은 표적 질환 조직 절편에 결합된 채로 남아있기 때문에, 표적 질환 조직 절편에 결합하지 않는 단일 가닥 DNA 서열을 제거할 수 있다. 일 구체예에서, 세척 단계는 1회, 또는 필요에 따라 복수 회 수행될 수 있다.

단일 가닥 DNA 서열이 결합된 표적 질환 조직 절편을 가열하여 단일 가닥 DNA 서열을 분리시킨다. 일 구체예에서, 가열 온도는, 예를 들어, 이에 제한되는 것은 아니나, 92℃, 95℃ 또는 98℃일 수 있다. 분리된 단일 가닥 DNA 서열은 표적 질환 조직 절편에 특이적이므로, 표적 질환에 특이적인 압타머라 할 수 있다.

일 구체예에서, 상기 과정을 통해 얻어진 PCR 산물을 복수 회에 걸쳐 선별한다. 더욱 구체적으로, 수득한 PCR 산물을 다음 단계의 선별에 대한 단일 가닥 DNA 라이브러리로서 사용하고, 상기 단계들을 표적 질환 조직 절편에 대한 더 높은 특이성을 갖는 단일 가닥 DNA 서열을 선별하기 위해 반복한다. 선별 과정을 수 회 반복한 후, 수득한 PCR 산물을 클로닝하고 DNA 서열 분석하여 표적 질환에 대한 높은 특이성을 갖는 압타머를 수득한다.

본 발명의 용어 "핵산", "핵산 분자", "올리고뉴클레오티드" 및 "폴리뉴클레오티드"는 상호교환적으로 사용되고, 단일 가닥 형태나 이중 가닥 나선(helix)으로의 리보뉴클레오사이드(아데노신, 구아노신, 우리딘 또는 시티딘; "RNA 분자") 또는 데옥시리보뉴클레오사이드(데옥시아데노신, 데옥시구아노신, 데옥시티민, 데옥시시티딘 또는 핵산 유도체; "DNA 분자")의 인산 에스테르의 중합체 형태 또는 포스포로티오에이트(phosphorothioate) 및 티오에스테르와 같은 이의 임의의 인산 에스테르 유사체 또는 이의 유도체를 지칭한다. 여기서 핵산 유도체는 5-(N-벤질카르복시아미드)-2′ 데옥시유리딘 (Bz-dU) 또는 5-(N-(1-나프틸메틸)카르복시아미드)-2'-데옥시유리딘 (Nap-dU)일 수 있으며, 당해 기술 분야에서 공지되거나, 통상의 지식을 가진 자에 의해 압타머의 활성이 저해되지 않는 범위에서 변형된 형태일 수 있다. 용어 핵산 분자, 및 특히 DNA 또는 RNA 분자는 상기 분자의 일차 및 이차 구조만을 지칭하며 어느 특정 삼차 형태에 제한하지는 않는다. 따라서, 이 용어는 그 중에서도 선형 또는 환형 DNA 분자(예컨대, 제한효소 단편), 플라스미드, 초나선형(supercoiled) DNA 및 염색체로 발견되는 이중 가닥 DNA를 포함한다. 특정 이중 가닥 DNA 분자의 구조를 논할 때, 서열을 전사되지 않은 DNA 가닥(즉, mRNA에 일치하는 서열을 갖는 가닥)을 따라 5'에서 3' 방향으로만 제시하는 일반적인 규약에 따라 본 명세서에 서열이 기술될 수 있다.

올리고뉴클레오티드는, 예컨대, 바이오틴 또는 Cy3와 같은 표지(label)가 공유 결합된 Biotin-뉴클레오티드 또는 Cy3-뉴클레오티드로 표지화될 수 있다. 표지된 올리고뉴클레오티드는 표적의 존재를 검출하는 프로브로 사용될 수 있다. 올리고뉴클레오티드(이 중 하나 또는 모두가 표지화될 수 있음)는 핵산의 전장 또는 단편을 클로닝하기 위해, DNA 서열분석을 위해, 또는 핵산의 존재를 검출하기 위해, PCR 프라이머로 사용될 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 또한 DNA 분자와 삼중 나선(triple helix)을 형성하는데 사용될 수 있다. 일반적으로, 올리고뉴클레오티드는 합성적으로, 바람직하게는 핵산 합성기 상에서 제조된다. 따라서, 올리고뉴클레오티드는 티오에스테르 결합 등과 같은 비-자연적으로 발생하는 포스포에스테르 유사체 결합을 이용하여 제조될 수 있다.

본 발명의 용어 “항암”, 또는 “암 예방 또는 치료”란 암을 예방하거나 치료하는 행위를 포함하며, “치료하다”, “치료하는” 및 "치료"는 본 발명의 압타머 투여에 의해 암의 증세가 호전되거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 의미하고, "예방하다", "예방하는", 및 "예방"은 동물에서 하나 이상의 질환의 발생의 감소를 지칭한다. 상기 예방은 완전한, 예컨대, 대상에서의 증상이 완전히 없어질 수 있다. 상기 예방은 또한 대상에서의 증상의 발생이 본 발명이 없으면 발생했을 것보다 적은 것과 같은, 부분적일 수 있다.

본 발명의 용어 "중합효소 연쇄 반응"은 PCR로 축약되며 특정 핵산 서열을 효소적으로 증폭시키는 시험관 내(in vitro) 방법을 지칭한다. PCR은 세 가지 단계: 표적 분자의 가닥을 분리시키기 위한 주형 핵산의 변성(denaturation), 단일 가닥의 PCR 올리고뉴클레오티드 프라이머를 상기 주형 핵산에 결합시키는 것(annealing), 및 상기 결합된 프라이머의 DNA 중합효소에 의한 확장(extension)을 포함하는 각 싸이클을 갖는, 반복된 일련의 온도 싸이클을 포함한다. PCR은 표적 분자의 존재를 검출하는 수단 및 정량적 또는 반정량적 조건하에서 이용 가능한 핵산 내에서의 표적 분자의 상대적 양을 결정하기 위한 수단을 제공한다.

본 발명은 유효량의 하나 이상의 PD-L1에 특이적으로 결합하는 압타머를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이고, 선택적으로 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 첨가제와 조합될 수 있다.

본 발명 약학 조성물에 포함되는 상기 압타머 또는 이의 기능성 단편은 5' 말단, 3' 말단, 또는 양 말단에 저분자 유기화합물, 핵산, 단백질 및 방사선 동위원소 중 적어도 하나가 추가 결합될 수 있다.

상기 저분자 유기화합물, 핵산, 단백질 및 방사선 동위원소는 상기 압타머 또는 이의 기능성 단편의 5' 말단, 3' 말단, 또는 양 말단에 직접 결합될 수도 있고, 링커로 결합될 수도 있다.

상기 압타머 또는 이의 기능성 단편의 타겟에 대한 특이적 결합에 기반하여, 상기 저분자 유기화합물, 핵산, 단백질 및 방사선 동위원소 중 적어도 하나가 결합된 상기 압타머 또는 이의 기능성 단편은 암 치료 효과를 나타낼 수 있다.

예컨대, 상기 압타머 또는 이의 기능성 단편의 PD-L1에 대한 특이적 결합에 기반하여 상기 저분자 유기화합물, 핵산, 단백질 및 방사선 동위원소가 결합된 상기 압타머 또는 이의 기능성 단편은 PD-L1이 과발현된 암의 치료 효과를 나타낼 수 있다.

압타머 또는 이의 기능성 단편에 결합될 수 있는 상기 저분자 유기화합물, 핵산, 단백질 및 방사선 동위원소는 상기 압타머 또는 이의 기능성 단편에 결합되어 우수한 암 치료 효과를 나타낼 수 있는 것이면 그 종류는 제한되지 않는다.

압타머 또는 이의 기능성 단편에 결합될 수 있는 상기 저분자 유기화합물, 핵산, 단백질 및 방사선 동위원소는 PD-L1이 과발현된 암의 치료를 위해 사용되는 공지의 물질일 수 있다.

저분자 유기화합물은, 항암제 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 것을 사용할 수 있다. 저분자 유기화합물은 예를 들어, 이에 제한되는 것은 아니나, 파클리탁셀, 모노메틸 오리스타틴 E(MMAE), 모노메틸 오리스타틴 F(MMAF), 시타라빈, 젬시타빈, 메이탄시네, 메르탄신, 칼리키아미신, 독소루비신, 듀오카르마이신, 피롤로벤조디아제핀(PBD), 7-에칠-10-하이드록시-캠프토테신, 튜불리신 유사체(Tubulysin analog), 5-아자싸이티딘, 5-플루오로우라실, 악티노마이신 D 및 이들의 유도체로부터 선택될 수 있다.

핵산은, 예를 들어, mRNA, siRNA, shRNA, miRNA 및 다른 압타머로부터 선택될 수 있다.

단백질은, 예를 들어 알렘투주맙, 베바시주맙, 세툭시맙, 젬투주맙, 이브리투모맙, 파니투무맙, 리툭시맙, 토시투모맙, 및 트라스투주맙 등의 치료적 항체이거나 그 단편으로부터 선택될 수 있다.

방사선 동위원소는, 예를 들어, 이에 제한되는 것은 아니나, ³²P, ⁶⁷Cu, ⁸⁹Sr, ⁹⁰Y, ^99mTc, ⁹⁹MO, ¹¹¹In, ¹³¹I, ¹⁵³Sm, ¹⁶⁶Ho, ¹⁷⁷Lu, ¹⁸⁶Re, ¹⁸⁸Re, ¹⁹⁸Au, ²¹¹At, ²¹²Bi, ²¹³Bi, ²²³Ra 및 ²²⁵Ac로부터 선택될 수 있다.

다른 유효 성분과 조합되어 사용될 때, 본 발명에 따른 약학 조성물은 동시에 또는 시간 간격을 두고 투여될 수 있도록 별도로 제형화되거나, 단일 조성물로서 제제화될 수 있다.

본 발명의 조성물은 매일 1회, 하루 2회, 2일에 1회, 3일에 1회, 4일에 1회, 5일에 1회, 6일에 1회, 7일에 1회, 2주에 1회, 3주에 1회, 4주에 1회, 2달에 1회, 6개월에 1회 또는 1년에 1회 투여될 수 있으나, 투여 간격은 환자의 필요에 따라 조절될 수 있다. 더 긴 투여 간격을 위하여, 서방형 제형이 사용될 수 있다.

본 발명의 조성물은 암을 치료하는 데에 사용될 수 있다. 본 발명의 일 구체예에서, 본 발명에 따른 조성물은 2주, 3주, 1달, 2달, 3달, 4달, 5달, 6달, 1년, 2년, 3년, 4년, 5년, 10년, 또는 15년을 초과하는 기간 동안 투여될 수 있고, 일 실시예에서는 환자의 수명 동안 투여될 수 있다. 본 발명의 일 구체예에서, 환자의 질환의 경과를 모니터링하여 이에 맞게 투여량을 조절할 수 있다. 통상의 기술자는 본 발명에 따른 조성물이 치료받을 환자의 상태, 중증도, 적용될 섭생, 사용되는 약물의 약동학적 특징 및 환자에 따라 약학적 유효량을 결정할 수 있을 것이다.

종양을 제거하기 위하여 외과적 절제 수술이 수행될 수 있는데, 본 발명의 조성물은 절제술 전에, 또는 후에 투여될 수 있다. 일부 구체예에서 본 발명에 따른 조성물은 절제술 수행 전 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 주 또는 그 초과의 기간 전에, 또는 절제술 수행 후 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 주 또는 그 초과의 기간 후에 환자에 투여될 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 다양한 투약 형태(dosage form)로 투여될 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서, 본 발명의 압타머를 포함하는 약학적 조성물을 구강, 직장, 비경구, 비강 또는 경피 투여, 또는 흡입에 의한 또는 좌약에 의한 투여에 적합한 형태로 제형화될 수 있다.

상기 투여방법은 특별히 이에 제한되는 것은 아니지만, 경구 또는 비경구 투여 방법이라면 어느 것이나 사용 가능하고, 전신 투여 또는 국소 투여가 가능하지만, 전신 투여가 더 바람직하며, 비경구 투여가 가장 바람직하다. 환자의 체내로의 투여는 바람직하게는 정맥 투여이다.

본 발명의 약학 조성물은 당업자에 의해 공지의 방법으로 제제화하는 것이 가능하다. 예를 들면, 필요에 따라서 물 또는 그 외의 약학적으로 허용되는 액과의 무균성 용액, 또는 현탁액제의 주사제 형태로 비경구적으로 사용할 수 있다. 예를 들면, 약학적으로 허용되는 담체 또는 매체, 구체적으로는, 멸균수나 생리 식염수, 식물유, 유화제, 현탁제, 계면활성제, 안정제, 부형제, 비히클(vehicle), 방부제, 결합제 등과 적당 조합하여, 일반적으로 인정된 제약 실시에 요구되는 단위 용량 형태로 혼화함으로써 제제화할 수 있다. 상기 제제에 있어서 유효 성분량은 지시받은 범위의 적당한 용량을 얻을 수 있도록 하는 것이다.

또한, 주사를 위한 무균 조성물은 주사용 증류수와 같은 부형액을 이용해 통상의 제제 실시에 따라 처방할 수가 있다. 주사용의 수용액으로서는, 예를 들면 생리 식염수, 포도당이나 그 외의 보조약을 포함한 등장용액, 예를 들면 D-소르비톨, D-만노스, D-만니톨, 염화 나트륨을 들 수 있어 적당한 용해 보조제, 예를 들면 알코올, 구체적으로는 에탄올, 폴리 알코올, 예를 들면 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 비이온성 계면활성제, 예를 들면 폴리소르베이트 80(TM), HCO-50으로 병용할 수 있다. 유성액으로서는 참기름, 콩기름을 들 수 있어 용해 보조제로서 안식향산벤질, 벤질 알코올과 병용할 수 있다.

주사제형의 예로서는 예를 들면, 정맥내 주사, 동맥내 주사, 선택적 동맥내 주사, 근육내 주사, 복강내 주사, 피하주사, 종양내 주사, 뇌실내 주사, 뇌내 주사, 골수액강내 주사 등에 의해 투여할 수가 있지만, 바람직하게는 정맥내 주사이다.

또한, 완충제, 예를 들면 인산염 완충액, 초산나트륨 완충액, 무통화제, 예를 들면, 염산 프로카인, 안정제, 예를 들면 벤질 알코올, 페놀, 산화 방지제와 배합할 수 있다. 조제된 주사액은 통상, 적당한 앰플에 충전시킨다.

현탁액 및 유탁액은, 담체로서, 예를 들어, 천연 검, 한천, 알긴산 나트륨, 펙틴, 메틸셀룰로스, 카복시메틸셀룰로스, 또는 폴리비닐알코올을 함유할 수 있다. 근육 내 주사를 위한 현탁액 또는 용액은, 활성 화합물과 함께, 약학적으로 허용되는 담체, 예를 들어, 멸균수, 올리브 오일, 에틸 올레에이트, 글리콜, 예를 들어, 프로필렌 글리콜, 및 필요하다면 적합한 양의 리도카인 염산염을 함유할 수 있다.

본 발명에 따른 약학 조성물은 약학적으로 허용되는 담체를 더 포함할 수 있다. "약학적으로 허용되는 담체"는 희석제, 보조제, 부형제 또는 비이클(vehicle)로서 본 발명의 압타머를 투여할 때 사용되며, 국가 관리기관의 승인을 받거나, 동물, 보다 구체적으로는 인간에게 사용하기 위한 일반적으로 알려진 약전에 등재되어 있는 것이다. 이러한 약제학적 담체는 물이나 오일과 같은 액상일 수도 있고, 상기 오일은 석유, 동물, 식물 또는 합성물 유래 오일을 포함하며 피넛오일, 대두유, 미네랄 오일, 참기름 등과 같은 오일이 해당한다. 약학적으로 허용되는 담체는 염수(saline), 아카시아 검, 젤라틴, 전분 페이스트, 탈크, 케라틴, 콜로이드실리카, 우레아 등이 있다. 환자에게 투여되었을 때, 본 발명의 화합물 및 약제학적으로 허용가능한 담체는 바람직하게는 무균질(sterile)이다. 염 용액, 액상 덱스트로스 및 글리세롤 용액 또한 액상 담체, 특히 주사 가능한 용액으로서 이용될 수 있다. 적합한 약제학적 담체는 글루코스, 락토오스, 수크로스, 글리세롤 모노스테아레이트, 소듐 클로라이드, 글리세롤, 프로필렌, 글리콜, 물 및 에탄올과 같은 첨가제를 포함할 수도 있다. 본 발명의 조성물은, 필요에 따라서 미량의 습윤제나 유상화제, pH 완충제를 포함할 수 있다. 본 발명의 조성물은 용액, 에멀젼, 서방형 제제 또는 그 밖의 사용에 적합한 제형을 취할 수 있다.

본 발명에 따른 유효 성분은 요망되는 질환을 치료하면서 부작용 또는 심각한 독성을 야기하지 않도록, 약학적 유효량을 환자에 전달하기에 충분한 양의 약학적으로 허용되는 담체 또는 희석제에 함유되어 있을 수 있다.

경구용 조성물은 일반적으로 불활성 희석제 또는 식용 가능한 담체를 포함한다. 이들은 젤라틴 캡슐 또는 압착된 타블렛 형태일 수 있다. 경구제 치료적 투여를 위하여 활성 물질 또는 이의 전구체는 부형제와 조합되어 타블렛 형태, 구내정, 또는 캡슐의 형태로 사용될 수 있다. 약학적으로 허용되는 결합제 및/또는 애주번트는 조성물의 일부로서 포함될 수 있다.

정제, 알약, 캡슐, 구내정 등은 미정질 셀룰로오스, 검 트래거캔스 또는 젤라틴과 같은 결합제; 녹말 또는 락토오스와 같은 부형제; 알긴산 또는 옥수수 전분과 같은 분산제; 마그네슘 스테아레이트와 같은 윤활제; 콜로이드성 실리콘 다이옥사이드와 같은 활택제; 수크로오스 또는 사카린과 같은 감미제; 또는 페퍼민트, 메틸 살리실레이트 또는 오렌지 향미제와 같은 향미제를 포함할 수 있다. 단위 투여형이 캡슐일 때, 본원에서 논의되는 물질 외에도, 지방산 오일과 같은 액상 담체를 포함할 수 있다. 또한, 단위 투여형은 투여형의 물성을 변화시키기 위하여 설탕이나 셀락과 같은 다른 다양한 물질을 포함할 수 있다.

본 발명에 적합한 경구 투여 제형은 소정의 활성 성분을 함유하는 캡슐, 정제; 분말 또는 과립; 수성 액체 또는 비 수성 액체 상의 현탁액; 또는 수중유 액상 에멀전 또는 유중수 에멀전; 또는 환약일 수 있다.

정제는 선택적으로 하나 이상의 보조제와 함께 압축 또는 몰딩을 통해 제조될 수 있다. 압축된 정제는 분말 또는 과립에서 활성 성분을 적합한 기계에서 압축되어 제조될 수 있고, 선택적으로 결합제, 윤활제, 불활성 희석제, 보존제, 계면 활성제 또는 분산제와 혼합될 수 있다. 몰딩된 정제는 불활성 액체 희석제로 적셔진 분말 물질의 혼합물을 적합한 장치로 몰딩하여 제조할 수 있다. 정제는 선택적으로 코팅될 수 있고 활성 성분이 느리게 제공되도록 제형화될 수 있다.

본 발명의 활성 성분은 엘릭서제, 분산액, 시럽, 웨이퍼, 츄잉검과 같은 형태로 투여될 수 있다. 시럽은 활성 성분 외에도 수크로오스 또는 프룩토오스와 같은 감미제, 및 보존제, 염료, 및 조미료를 더 포함할 수 있다.

안구로, 비경구적으로, 내피로, 피하로, 또는 국소적 적용을 위해, 용액 또는 현탁액은 주입을 위해 물과 같은 살균수, 식염수, 고정유, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 다른 합성 용매; 벤질 알코올 또는 메틸 파라벤과 같은 항균제; 아스코르브산 또는 소듐 바이설파이트와 같은 항산화제; 에틸렌디아민테트라아세트산과 같은 킬레이트제; 아세테이트, 시트레이트 또는 포스페이트와 같은 완충액; 및 소금 또는 덱스트로오스와 같은 긴장제를 포함할 수 있다.

일 구체예에서, 이식제 및 마이크로캡슐화된 전달계를 포함하는 서방형 제제와 같이, 활성 성분이 신체 내에서 빠르게 제거되는 것을 방지하기 위한 담체와 함께 제조될 수 있다. 생분해성, 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리안하이드라이드, 폴리글리콜산, 콜라겐, 아텔로콜라겐, 폴리오르쏘에스테르, 폴리락트산, 및 PLGA(poly(lactic-co-glycolic acid))와 같은 생적합성 중합체를 사용할 수 있다. 이러한 제형을 제조하는 방법은 통상의 기술자에게 잘 알려져 있다.

통상의 기술자는 정제 외에 다른 제형 역시 유효 성분을 느리게 또는 제어된 속도로 방출하기 위해 사용될 수 있음을 이해할 것이다. 이러한 제제는, 예를 들어, 캡슐, 과립, 및 겔-캡일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

리포좀화한 현탁액 역시 약학적으로 허용되는 담체이다. 이들은 당해 기술 분야에서 알려진 방법에 따라 제조될 수 있다.

본 발명에 따른 압타머를 이용하여 치료할 수 있는 암은, 전립선암, 담낭암, 간내 담도암, 담도암, 구강암, 인두암, 후두암, 설암, 십이지장암, 안종양, 종격동암, 부비동암, 신우암, 심장암, 교모세포종, 신경모세포종, 간암, 골암, 췌장암, 피부암, 두경부암, 유방암, 폐암, 피부 또는 안내 악성 흑색종, 신장암, 자궁암, 난소암, 결장암, 직장암, 항문 부위 암, 대장암, 위암, 고환암, 나팔관 암종, 자궁 내막 암종, 자궁 경부 암종, 질 암종, 외음부암, 비호지킨림프종, 식도암, 소장암, 내분비계암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신샘암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 소아암, 림프구성 림프종, 방광암, 요관암, 신장 골반 암종, 중추 신경계 (CNS) 암, 원발성 CNS 림프종, 종양 혈관 신생, 척추암, 뇌간 신경 교종 , 뇌하수체 선종, 카포시 육종, 표피 암, 편평 상피 세포 암, 다발성 골수종, B-세포 림프종, 호지킨 림프종, 급성 골수성 림프종, 만성 골수성 백혈병, 만성 림프성 백혈병, 여포성 림프종, 미만성 거대 B-세포 림프종, 버킷 림프종, 면역성 대세포 림프종, 전구 B-림프모구 림프종, 맨틀 세포 림프종, 급성 림프모구 림프종, 균상식육종, 역형성 대세포 림프종, 급성 골수성 백혈병, 급성 림프성 백혈병, 간모세포종, 망막모세포종, 복막암, 뇌종양, 흉선암, T-세포 림프종 및 전구체 T-림프모구 림프종, 및 상기 암의 임의의 조합을 포함한다. 본 발명은 전이성 암의 치료에도 적용 가능하다.

본 발명의 일 실시예에서는 PD-L1이 과발현되는 암세포를 검출하기 위한 조성물을 제공한다. 상기 조성물은 서열번호 1, 2, 10, 및 18로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나의 핵산 서열을 포함하는 압타머 또는 이의 기능성 단편을 하나 이상 포함한다.

상기 압타머 또는 이의 기능성 단편은 PD-L1이 과발현되는 암세포를 검출하기 위해서, 예를 들어 5' 말단, 3' 말단 또는 양 말단에 연결한 검출 표지를 더 포함할 수 있다. 이러한 검출 표지는, 예를 들어, 형광 표지, 라만 산란 표지, 효소 표지, 적외선 표지, 또는 방사선 표지를 사용할 수 있다.

즉, 상기 압타머 또는 이의 기능성 단편의 5' 말단, 3' 말단, 또는 양 말단에 검출 표지, 예컨대 형광 표지, 라만 산란 표지, 효소 표지, 적외선 표지 및 방사선 표지에서 선택된 적어도 하나가 추가 결합될 수 있다.

검출 표지는 상기 압타머 또는 이의 기능성 단편의 5' 말단, 3' 말단 또는 양 말단에 직접 결합될 수도 있고, 링커로 결합될 수도 있다.

상기 압타머 또는 이의 기능성 단편의 타겟에 대한 특이적 결합에 기반하여, 검출 표지가 결합된 상기 압타머 또는 이의 기능성 단편은 우수한 타겟 검출 효과를 나타낼 수 있다.

예컨대, 상기 압타머 또는 이의 기능성 단편의 PD-L1에 대한 특이적 결합에 기반하여 검출 표지가 결합된 상기 압타머 또는 이의 기능성 단편은 PD-L1이 과발현된 암 세포를 효과적으로 검출할 수 있다.

형광 표지는, 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 것을 사용할 수 있다. 형광 표지는, 예를 들어, 이에 제한되는 것은 아니나, 그린 플루오레센트 프로틴(GFP), 형광 단백질, 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC), 6-카르복시플루오로세인-아미노헥실, 플루오레세인 유도체, Alexa Fluor 350, Alexa Fluor 405, Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 647, Alexa Fluor 750, 로다민, 6-카르복시테트라메틸로다민, 피코에리트린(PE), 피코시아닌(PC), PC5, PC7, Cy 색소, Cy3, Cy3.5, Cy5, Cy5.5, Cy7, TexasRed, 알로피코시아닌(APC), 아미노메틸쿠마린아세테이트(AMCA), Marina Blue, Cascade Blue, Cascade Yellow, Pacific Blue, SPRD, 테트라메틸로다민이소티오시아네이트(TRITC), R110, mC1B, CellTracker 색소, CFSE, JC-1, PKH, DCFH-DA, DHR, FDA, Calcein AM, 니트로벤조옥사디아졸(NBD)기, 디메틸아미노술포닐벤조옥사디아졸기, acridine(Acd), dansyl(Dns), 7-디메틸아미노쿠마린-4-아세틱아시드(DMACA), 5-((2-아미노에틸)아미노)나프탈렌-1-술포닉아시드(EDANS), 나프탈렌, 안트라센 및 프로토포르피린 9 등 시판되고 있는 올리고뉴클레오티드 고상합성 서비스로 도입할 수 있는 형광단일 수 있다.

또한, 형광 물질의 근방에 해당 형광 물질이 발하는 형광 에너지를 흡수하는 ??쳐(소광 물질)가 추가로 결합되어 있을 수 있다. 이러한 실시 형태에 있어서는, 검출 반응 시에 형광 물질과 ??쳐가 분리하여 형광이 검출된다.

효소 표지의 예로서는, β갈락토시다아제, β글루코시다아제, 알칼리포스파타아제, 퍼옥시다아제, 말산 탈수소 효소일 수 있다. 또한, 발광 기질로서, 루미놀, 루미놀 유도체, 루시페린, 루시게닌 등을 표지제로서 사용할 수 있다.

라만 산란 표지는, 상기 형광 표지된 압타머의 5' 말단, 3' 말단, 또는 양 말단에 금속 표면과 결합능을 갖는 치환기를 이용할 수 있으며, 예를 들어, 이에 제한되는 것은 아니나, 티올(SH)기, 알킬아미노기, 방향족 아미노기, 카르복실기를 도입하고, 이것을 예를 들어, 금 나노 입자 표면에 흡착시킴으로써 당해 압타머 흡착 금속 입자로부터 발해지는 증강 라만 산란광을 검출함으로써 세포 인식을 행하는 것이다. 이 경우, 특별히 한정되는 것은 아니지만, 금속 나노 입자로서, 금, 은, 구리, 철, 규소, 양자 도트 등을 사용할 수 있다.

방사선 표지는, 압타머의 5' 말단, 3' 말단, 또는 상보적인 서열의 형태로 결합할 수 있는 방사선 동위 원소를 이용할 수 있으며, 예를 들면, 이에 제한되는 것은 아니나, ¹²³I,¹²⁴I, ¹²⁵I, ¹³¹I, ⁶⁴Cu, ⁶⁷Cu, ⁸⁹Zr, ⁹⁰Y, ¹⁵³Sm, ¹⁷⁷Lu, ¹⁸⁶Re, ¹⁸⁸Re, ¹¹¹In, ^99mTc, ³²P, ³⁵S, ¹⁸F, ⁶⁷Ga, ²⁰¹Tl를 도입할 수 있다. 타겟에 대한 특이적 결합에 기반한 방사선 표지 압타머는 우수한 민감도를 나타내며, 분자영상기기를 위한 방사선 의약품으로 사용할 수 있다.

실시예

실시예 1. 압타머의 제조

1.1 PD-L1 특이적 압타머 선별

중앙부에 40개의 연속적인 임의의 염기 서열을 갖고, 양 말단에는 각각 5' 프라이머 및 3' 프라이머 결합부위를 갖는 핵산 라이브러리로부터 PD-L1 단백질에 특이적인 압타머를 SELEX (Systematic Evolution of Ligands by EXponential Enrichment) 방법을 이용하여 선별하였다:

1.1.1 SELEX를 위한 변형핵산 포함 라이브러리의 제작

먼저, 단일가닥 핵산 라이브러리 주형은 DNA 자동합성기를 이용하여 5' 프라이머 결합부위 앞쪽에 바이오틴을 연결하여 합성하였고 [Biotin-GGCTGGTGGTGTGGCTG-N(40)- CAGGCAGACGGTCACTC(서열번호 20)], PAGE 정제 후 실험에 사용하였다 (트라이링크, 미국).

변형핵산 5-(N-벤질카르복시아미드)-2′ 데옥시유리딘 (Bz-dU) 또는 5-(N-(1-나프틸메틸)카르복시아미드)-2'-데옥시유리딘 (Nap-dU)이 포함된 핵산 라이브러리를 제작하기 위해 라이브러리 주형의 바이오틴과 결합하는 스트렙타비딘 단백질로 표면개질된 레진에 고정하였다. 구체적으로, 5M NaCl 용액에 라이브러리 주형과 500μL 레진 (써모사이언티픽, 미국)을 섞어 실온에서 한 시간동안 반응하여 고정화하였다. NaCl로 세척한 레진에 20μM 5' primer (GAGTGACCGTCTGCCTG(서열번호 21))와, 0.5mM dNTP(ATP, GTP, CTP, Nap-dUTP 또는 Bz-dUTP), 0.25U/μL KOD XL DNA polymerase, 120mM Tris-HCl pH7.8, 1X KOD buffer, 0.1mg/ml BSA을 첨가하여 70℃에서 2 시간동안 효소반응을 진행하여 변형핵산이 포함된 이중 가닥 DNA를 제조하였다. 여기에 20mM NaOH 이용하여 이중 가닥DNA를 변성시켜 레진과 ssDNA를 분리한 뒤, 80mM HCl 용액으로 중화하고, Amicon ultra-15 (머크밀리포어, 미국)를 이용 농축한 후 UV spectrophotometer로 정량하여 최종적으로 변형 핵산이 포함된 단일 가닥 라이브러리를 제작하였다.

1.1.2 면역 항암 표적단백질에 특이적인 압타머의 선발

SELEX용 표적 단백질은 재조합단백질 중 히스티딘 태그 (6xHis-tag)이 포함된 단백질 (알엔디, 미국)을 실험에 사용하였다. 표적 단백질은 코발트로 표면개질되어 단백질의 His-tag과 결합하는 자성 비드(magnetic bead)인 Dynabead (써모사이언티픽, 미국)를 이용하여 비드에 고정하였다. 구체적으로, selection buffer (40mM HEPES, 102mM NaCl, 5mM KCl)에 녹아 있는 타겟 단백질과 20 μg의 자성비드를 써모믹서 (Thermomixer; 에펜도르프, 독일)에서 25℃, 1200rpm, 30분간 반응시킨 후 외부 자석을 이용하여 selection buffer로 세척하여 비드에 고정하여 준비하였다.

합성된 변형핵산 포함 라이브러리를 selection buffer에 넣고 95℃부터 37℃까지 10초씩 반응시키면서 서서히 온도를 낮추어 핵산 라이브러리의 삼차구조 형성을 유도하였다. 음성 선별을 위하여 위 반응액에 protein competition buffer (10μM prothrombin, 10μM casein, 0.1%(w/v) 알부민)를 혼합한 뒤, 자성 비드 20 μg에 첨가하여 써모믹서를 이용하여 37℃, 1200rpm, 10분간 반응시킨 후 상등액을 상기 표적 단백질이 고정된 Dynabead에 옮겨 압타머 선발을 실시하였다. 구체적으로, 음성 선별을 마친 변형핵산 라이브러리를 표적 단백질 고정 자성비드와 써모믹서에서 37℃, 1200rpm, 1시간 반응을 시켰다. Selection buffer로 DNA와 타겟 단백질-자성비드 결합체를 5번 세척한 후, 2mM NaOH 용액을 첨가하여 표적 단백질에 결합한 DNA pool를 회수한 뒤 8mM HCl 용액으로 중화하였다.

표적 단백질에 결합한 DNA pool을 다음 round의 SELEX에 사용하기 위해 QPCR (quantitative PCR, CFX real time PCR detection system; 바이오라드, 미국)을 이용하여 증폭하였다. SELEX 과정에서 회수한 DNA pool에 QPCR buffer [(5' primer (GAGTGACCGTCTGCCTG(서열번호 21)), 3' primer (Biotin-GGCTGGTGGTGTGGCTG(서열번호 22)), 1X KOD buffer, KOD XL 효소, 1mM dNTP]를 혼합하여, 96℃ 15초, 55℃ 10초, 68℃ 30분 조건으로 1 cycle, 그리고 96℃ 15초, 72℃ 1 분 조건으로 30 cycle을 반복하여 타겟 단백질에 결합되었던 DNA pool을 증폭한 이중 가닥 올리고 DNA를 제조하였다.

QPCR을 통하여 만들어진 이중 가닥 올리고 DNA를 25μl streptavidin Myone 자성비드 (써모사이언티픽, 미국)와 상온에서 10분간 혼합하여 고정하고 20mM NaOH 용액을 첨가하여 anti-sense 가닥을 제거한 후 상기 변형 핵산 포함 라이브러리 제조와 같은 방법으로 변형된 핵산을 포함하는 DNA pool을 효소를 이용하여 합성, 다음 round에 사용하였다. 상기의 SELEX round는 총 8회 수행하였다.

1.1.3 SLEX DNA pool의 결합력 (Kd) 측정

타겟 단백질과 SELEX round가 진행된 DNA pool의 결합력을 알아보기 위하여 filter binding assay을 수행하였다. 먼저 수행된 6 round와 8 round의 DNA pool의 말단을 α-³²P ATP (퍼킨 알머, 미국)와 TdT (Terminal deoxynucleotidyltransferase; 뉴잉글랜드바이오랩, 미국)를 이용하여 표지 하였다. SELEX 과정을 통하여 얻어진 올리고 DNA 1μM, 0.25μL α-³²P ATP, 0.25μL TdT, 및 NEB buffer4 조건에서 37℃에서 30분간 반응시키고, 70℃에서 10분간 처리하여, TdT 효소를 불활성화시켰다. 표지된 올리고 DNA pool은 Micro spin G50 column (지이헬스케어, 미국)을 이용하여 정제 후 DNA pool 20,000cpm을 100μL selection buffer에 넣고 95℃에서부터 1초에 0.1℃씩 37℃까지 천천히 냉각시켰다. Selection buffer를 이용하여 타겟 단백질을 serial dilution한 뒤, 상기 가열 및 냉각시킨 표지된 올리고 DNA pool 30μL를 각각 첨가하여 37℃에서 30분간 반응시켰다. Nylon membrane (지이헬스케어, 미국)에 표지된 올리고 DNA와 타겟 단백질의 혼합물을 각각 2μL씩 spotting 한 뒤 zorbax resin (애질런트, 미국) 5.5μL를 첨가하였다. 그리고 미리 selection buffer 50μL로 적셔 놓은 Durapore filter (밀리포어, 미국)에 넣고 진공으로 용액을 제거 후, membrane filter를 100μL의 selection buffer로 세척하였다. Filter plate를 image plate에 16시간 노출시킨 뒤 FLA-5100 (후지필름, 일본)으로 image를 정량화하였다. 이렇게 얻어진 타겟 단백질과 SELEX DNA pool간의 결합 친화력을 표 1에 나타내었다. 결합 친화력은 상기 filter binding assay를 통하여 얻어진 값을 시그마플롯 11 분석 소프트웨어 (시스탯소프트웨어, 미국)를 이용하여 구하였으며, 표 1 중 Bmax는 input 대비 결합한 압타머의 비율을 나타낸 것이고, Kd (dissociation constant)는 친화력을 나타낸다.

Target protein	PD-L1
	Bz lib	6R Bz	8R Bz	Nap lib	6R Nap	8R Nap
Bmax	0.02	0.00	0.30	0.09	0.25	0.14
Kd	0.71	3.53	1.61	0.64	3.08	0.74

변형 핵산 Bz-dU가 포함된 라이브러리를 이용한 SELEX 6 round를 제외하고 나머지 3개 샘플 모두에서 강한 결합력이 관찰되었다.

1.1.4 SLEX DNA pool의 염기 서열 분석

결합력이 확인된 SELEX round DNA pool 가운데 변형핵산 Bz-dU의 8 round 샘플을 5' 프라이머와 (5' primer GAGTGACCGTCTGCCTG(서열번호 21)), 3' 프라이머 (GGCTGGTGGTGTGGCTG(서열번호 22))를 이용하여 PCR 과정을 통해 증폭 후 TOPO TA Cloning kit (써모사이언티픽, 미국)을 이용하여 클로닝하여, E.coli TOP10 세포에 형질전환시켰다. 한천 배지에 자란 단일 콜로니로부터 클로닝한 PCR 산물의 삽입 여부를 RCA 키트 (엔지노믹스, 한국)를 이용하여 확인한 후 단일서열이 삽입된 클론의 RCA 샘플을 이용하여 BigDye terminator cycle sequencing kit (써모사이언티픽, 미국)와 모세관 전기영동법으로 염기서열 분석 (솔젠트, 한국)을 실시하여 SELEX를 통해 농축된 DNA pool에 존재하는 50개의 DNA 분자서열을 최종 확인하였다.

1.1.5 클론 압타머의 생합성 및 결합력 측정

분석이 완료된 50개의 염기 서열을 Multalin web site를 이용하여 분석하고, 발현빈도가 가장 많은 5개의 압타머 서열을 선발하였다 (표 2, 클론 서열). 선발된 5개 압타머는 염기서열 분석에 사용되었던 이중 가닥 DNA를 주형으로 5' 프라이머(GAGTGACCGTCTGCCTG(서열번호 21))와 바이오틴 결합 3' 프라이머(Biotin-GGCTGGTGGTGTGGCTG(서열번호 22))를 이용하여 상기의 DNA pool 결합력 측정 방법과 동일한 방법으로 압타머를 생합성한 후 타겟 단백질에 대한 결합력을 측정하였다 (도 1). 그 결과 4개의 서열에서 0.18 ~ 1.36nM의 해리 상수 (Kd)를 보이는 우수한 결합력을 가진 압타머가 선발되었다 (표 3).

이름 (서열번호)	서열 (5'-> 3') 5:Bz-dU	길이(mer)
PL001 (서열번호 1)	GAGTGACCGTCTGCCTGA5GAAAAG55555GA55G5ACC55AG5GCAC5CAACAG5GCAGCCACACCACCAGCC	74
PL002 (서열번호 2)	GAGTGACCGTCTGCCTG5G5A5GCCGCACGA5CGCCC5A5555GCGAG555AC5CACAGCCACACCACCAGCC	73
PL010 (서열번호 10)	GAGTGACCGTCTGCCTG55AAGCGGC5AAG55555GA55G5ACC55AG5GCCC55ACCAGCCACACCACCAGCC	74
PL028 (서열번호 18)	GAGTGACCGTCTGCCTG5G5A5GCCGCACGA5CGCCC5A5555GCGAG555AAC5GACAGCCACACCACCAGCC	74
PL029 (서열번호 19)	GAGTGACCGTCTGCCTGCCA555CC5GC55GC5C55CC5CC555A55555CACC555CAGCCACACCACCAGCC	74

Target protein	PD-L1
이름	PL029 (#5)	PL028 (#4)	PL010 (#3)	PL002 (#2)	PL001 (#1)	Bz Lib
Bmax	0.10	0.06	0.06	0.05	0.07	0.02
Kd (nM)	243.08	1.36	0.93	0.18	1.10	0.52

1.1.6 압타머의 합성

5개의 클론 서열을 이용하여 변형 핵산인 Bz-dU가 포함된 압타머를 합성하였다 (표 2). 압타머는 MerMade 12 (바이오오토메이션, 미국)를 이용하여 일반적인 DNA 자동합성 방법으로 합성하였다. 합성된 압타머는 HPLC 정제를 거쳐 실험에 사용하였다.

1.1.7 압타머의 PD-1/PD-L1 결합 저해력 측정

합성 압타머의 PD-1/PD-L1 결합 저해는 세포 기반 테스트를 실시하여 측정하였다.

세포 수준에서의 PD-1/PD-L1 결합 저해는 다음의 키트를 이용하였다. 세포 기반 PD-1/PD-L1 결합 저해 테스트 (프로메가, 미국)는 luciferase repoter를 기반한 어세이 방법으로 PD-1과 luciferase 유전자가 발현되어 있는 Jurkat effector 세포와 TCR activator 및 PD-L1이 발현되어 있는 CHO-K1 세포를 혼합한 후 여기에 저해제 (압타머 또는 중화항체)를 처리하여 배양하는 방법으로 세포 단계에서의 PD-1/PD-L1 결합 저해 활성을 테스트하였다. 이 시스템은 저해 활성이 증가할수록 형광 시그널이 증가되도록 설계되어 있는 세포기반 저해활성 측정방법으로 양성 대조군으로는 시판중인 PD-L1 중화항체를 이용하였다.

먼저 클론 서열를 이용하여 합성된 5개 압타머의 저해 활성은 도 2에 표시된 바와 같다. 세포 기반 저해 활성을 측정한 결과 합성된 다섯개의 압타머 중 PL029를 제외한 4개의 압타머에서 PL-1/PD-L1 결합 저해를 확인하였다.

1.2 PD-L1 특이적 압타머 기능성 단편

1.2.1 PD-L1 특이적 압타머 기능성 단편의 제조

실시예 1.1에서 PD-1/PD-L1 결합 저해 활성을 나타내는 것으로 확인된 압타머인 PL001 (74mer)의 서열을 이용하여 기능성 단편을 제조하였다. PL001 압타머의 양 말단부터 길이를 줄여 최소 길이에서 클론 서열과 유사하거나 더 나은 저해 활성을 나타내는 압타머 선발을 실시하였다. PL001의 5' 말단과 3'말단을 각각 절단하면서 50mer, 46mer, 45mer, 40mer 및 24mer 길이의 압타머를 생성하였다 (각각 PL016, PL017, PL018, PL019, PL020 및 PL009; 표 4).

이름 (서열번호)	서열 (5'-> 3') 5:Bz-dU	길이(mer)
PL016 (서열번호 11)	GCCTGA5GAAAAG55555GA55G5ACC55AG5GCAC5CAACAG5GCAGCC	50
PL017 (서열번호 12)	GCCTGA5GAAAAG55555GA55G5ACC55AG5GCAC5CAACAG5GC	46
PL018 (서열번호 13)	A5GAAAAG55555GA55G5ACC55AG5GCAC5CAACAG5GCAGCC	45
PL019 (서열번호 14)	A5GAAAAG55555GA55G5ACC55AG5GCAC5CAACAG5G	40
PL020 (서열번호 15)	55GA55G5ACC55AG5GCAC5CAA	24
PL009 (서열번호 9)	AAG55555GA55G5ACC55AG5GC	24

1.2.2 압타머의 PD-1/PD-L1 결합 저해력 측정

합성 단편 압타머의 PD-1/PD-L1 결합 저해는 정제 단백질 기반 테스트를 실시하여 측정하였다. 정제 단백질 기반 PD-1/PD-L1 결합 저해 테스트 (비피에스, 미국)는 HRP (horseradish peroxidase)기반 ELISA법으로 수행하였다. 먼저 제품 설명서에 따라 정제된 PD-L1 단백질을 96 well plate에 고정한 후 총 3회에 걸쳐 Immuno Buffer 1으로 각 well을 세척하여 결합되지 않은 PD-L1 단백질을 제거하였다. 압타머를 실험 농도별로 selection buffer에 준비하여 95℃에서부터 1초에 0.1℃씩 37℃까지 천천히 냉각시켰다. 이 압타머 5μL를 PD-L1 단백질이 고정된 well에 첨가하고, 설명서에 따라 준비한 20 μL의 Biotin 결합 PD-1 단백질을 각 well에 다시 첨가하였다. 각 well을 Immuno Buffer 1으로 다시 3회 세척한 후 설명서에 따라 blocking buffer에 희석한 Streptavidin-HRP 100 μL를 첨가한 후 1시간 동안 반응을 진행하였다. 상층액을 제거한 well에 HRP 기질의 혼합물을 100 μL첨가 한 후 luminometer를 이용하여 형광의 세기를 측정하여, PD-1/PD-L1의 결합 저해를 측정하였다. IC₅₀ (50% 저해 농도)는 온라인 툴 (https://www.aatbio.com/tools/ic50-calculator)을 이용하여 계산하였다.

이름 (서열번호)	PL016 (서열번호 11)	PL017 (서열번호 12)	PL018 (서열번호 13)	PL019 (서열번호 14)	PL020 (서열번호 15)	PL009 (서열번호 9)	PL001 (서열번호 1)
IC₅₀ (nM)	3.3	4.0	>120	15.3	>120	4.6	6.0

합성된 모체 압타머 PL001과 6개의 단편 압타머들의 결합력을 조사한 결과 표 5 및 도 3에 도시된 바와 같이, 클론 서열 PL001에서 우수한 저해활성을 나타냄을 확인할 수 있었다. 또 이 클론 서열의 단편인 PL016, PL017 및 PL009에서도 모체와 유사하거나 개선된 저해활성을 확인할 수 있었다.

1.3 PD-L1 특이적 압타머 기능성 단편

1.3.1 PD-L1 특이적 압타머 기능성 단편의 제조

더 작은 길이의 단편에서 PD-1/PD-L1 결합 저해 활성이 더 우수한 압타머를 스크리닝하기 위하여 실시예 1.1에서 PD-1/PD-L1 결합 저해 활성을 나타내는 것으로 확인된 압타머인 PL001 (74mer)의 서열을 이용하여 기능성 단편을 더 제조하였다. PL001의 5' 말단과 3'말단을 각각 절단하면서 34mer, 29mer, 23mer, 및 22mer 길이의 압타머를 생성하였다 (각각 PL003, PL004, PL021, 및 PL022; 표 6).

이름 (서열번호)	서열 (5'-> 3') 5:Bz-dU	길이(mer)
PL003 (서열번호 3)	GCCTGA5GAAAAG55555GA55G5ACC55AG5GC	34
PL004 (서열번호 4)	A5GAAAAG55555GA55G5ACC55AG5GC	29
PL021 (서열번호 16)	AAG55555GA55G5ACC55AG5G	23
PL022 (서열번호 17)	AG55555GA55G5ACC55AG5G	22

1.3.2 압타머의 PD-1/PD-L1 결합 저해력 측정

실시예 1.2.2에서 기재된 방법과 동일한 방법으로 실시예 1.3.1의 표 6에 기재된 압타머 PD-1/PD-L1 결합 저해 활성을 측정하였다.

이름 (서열번호)	PL003 (서열번호 3)	PL004 (서열번호 4)	PL021 (서열번호 16)	PL022 (서열번호 17)	PL001 (서열번호 1)
IC₅₀ (nM)	6.3	7.0	27.7	>120	10.5

그 결과, 표 7 및 도 4에 도시된 바와 같이, PL003 및 PL004에서 모체 압타머인 PL001보다 우수한 저해활성을 나타냄을 확인할 수 있었다.

1.4 PD-L1 특이적 압타머 기능성 단편

1.4.1 PD-L1 특이적 압타머 기능성 단편의 제조

PD-1/PD-L1 결합 저해 활성이 더 우수한 다양한 압타머를 스크리닝하기 위하여 실시예 1.1의 PL002의 5' 말단 및 3' 말단을 절단한 압타머인 PL005, PL006, PL007 및 PL008을 제조하였다 (표 8).

이름 (서열번호)	서열 (5'-> 3') 5:Bz-dU	길이(mer)
PL002 (서열번호 2)	GAGTGACCGTCTGCCTG5G5A5GCCGCACGA5CGCCC5A5555GCGAG555AC5CACAGCCACACCACCAGCC	73
PL005 (서열번호 5)	GCCTG5G5A5GCCGCACGA5CGCCC5A5555GCGAG555AC5CACAGCC	49
PL006 (서열번호 6)	5G5A5GCCGCACGA5CGCCC5A5555GCGAG555AC5CA	39
PL007 (서열번호 7)	A5GCCGCACGA5CGCCC5A5555GCGAG555AC	33
PL008 (서열번호 8)	CCGCACGA5CGCCC5A5555GCGAG55	27

1.4.2 압타머의 PD-1/PD-L1 결합 저해력 측정

실시예 1.2.2에서 기재된 방법과 동일한 방법으로 실시예 1.4.1의 표 8에 기재된 압타머의 PD-1/PD-L1 결합 저해 활성을 측정하였다 (도 5). 이 테스트의 양성 대조군으로는 시판중인 PD-L1 중화항체를 이용하였다.

그 결과, 표 9 및 도 5에 도시된 바와 같이, PL007에서 모체 압타머인 PL002보다 우수한 저해활성을 나타냄을 확인할 수 있었고, PL006, 및 PL005에서 그 다음으로 높은 PD-1/PD-L1 결합 저해 활성을 나타냄을 확인하였다.

이름 (서열번호)	PL002 (서열번호 2)	PL005 (서열번호 5)	PL006 (서열번호 6)	PL007 (서열번호 7)	PL008 (서열번호 8)	Anti-PDL1
IC₅₀ (nM)	31.3	12.6	9.6	4.7	>120	1.2

실시예 1.1.7에서 기재된 방법과 동일한 방법으로 세포기반 시스템을 이용하여 실시예 1.4.1의 표 8에 기재된 4개 압타머 기능성 단편 (PL005, PL006, PL007, PL008)에 대한 저해 활성을 테스트하여 도 6의 결과를 얻었다. 상대적으로 길이가 긴 PL005와 PL006에서 저해 활성이 확인되었으며 특히 PL005의 경우 50 nM 처리군에서 양성 대조군으로 이용된 PD-L1 항체와 통계적으로 차이가 없는 유사한 저해 활성 나타내었다. 더 길이가 작은 PL007의 경우 정제 단백질 시스템에서는 가장 낮은 IC₅₀값을 나타내었으나 세포기반 시스템에서는 상대적으로 약한 저해 활성을 나타내었다.

하기 표 10은 본 발명에 기재된 압타머 서열을 나타낸다.

이름 (서열번호)	서열 (5'-> 3') 5:Bz-dU	길이(mer)
PL001 (서열번호 1)	GAGTGACCGTCTGCCTGA5GAAAAG55555GA55G5ACC55AG5GCAC5CAACAG5GCAGCCACACCACCAGCC	74
PL002 (서열번호 2)	GAGTGACCGTCTGCCTG5G5A5GCCGCACGA5CGCCC5A5555GCGAG555AC5CACAGCCACACCACCAGCC	73
PL003 (서열번호 3)	GCCTGA5GAAAAG55555GA55G5ACC55AG5GC	34
PL004 (서열번호 4)	A5GAAAAG55555GA55G5ACC55AG5GC	29
PL005 (서열번호 5)	GCCTG5G5A5GCCGCACGA5CGCCC5A5555GCGAG555AC5CACAGCC	49
PL006 (서열번호 6)	5G5A5GCCGCACGA5CGCCC5A5555GCGAG555AC5CA	39
PL007 (서열번호 7)	A5GCCGCACGA5CGCCC5A5555GCGAG555AC	33
PL008 (서열번호 8)	CCGCACGA5CGCCC5A5555GCGAG55	27
PL009 (서열번호 9)	AAG55555GA55G5ACC55AG5GC	24
PL010 (서열번호 10)	GAGTGACCGTCTGCCTG55AAGCGGC5AAG55555GA55G5ACC55AG5GCCC55ACCAGCCACACCACCAGCC	74
PL016 (서열번호 11)	GCCTGA5GAAAAG55555GA55G5ACC55AG5GCAC5CAACAG5GCAGCC	50
PL017 (서열번호 12)	GCCTGA5GAAAAG55555GA55G5ACC55AG5GCAC5CAACAG5GC	46
PL018 (서열번호 13)	A5GAAAAG55555GA55G5ACC55AG5GCAC5CAACAG5GCAGCC	45
PL019 (서열번호 14)	A5GAAAAG55555GA55G5ACC55AG5GCAC5CAACAG5G	40
PL020 (서열번호 15)	55GA55G5ACC55AG5GCAC5CAA	24
PL021 (서열번호 16)	AAG55555GA55G5ACC55AG5G	23
PL022 (서열번호 17)	AG55555GA55G5ACC55AG5G	22
PL028 (서열번호 18)	GAGTGACCGTCTGCCTG5G5A5GCCGCACGA5CGCCC5A5555GCGAG555AAC5GACAGCCACACCACCAGCC	74
PL029 (서열번호 19)	GAGTGACCGTCTGCCTGCCA555CC5GC55GC5C55CC5CC555A55555CACC555CAGCCACACCACCAGCC	74

예를 들어, 청구항 구성 목적을 위해, 이하 기재되는 청구항은 어떤 식으로든 이의 문자 그대로의 언어보다 좁게 해석되어선 안 되고, 따라서 명세서로부터의 예시적 구현예가 청구항으로 읽혀서는 안 된다. 따라서, 본 발명은 예시로서 기재되었고, 청구항의 범위에 대한 제한이 아님이 이해되어야 한다. 따라서, 본 발명은 하기 청구항에 의해서만 제한된다. 본 출원에 인용된 모든 간행물, 발행된 특허, 특허 출원, 서적 및 저널 논문은 이들의 전체내용이 참조로서 본원에 각각 포함된다.

<110> INTEROLIGO CORPORATION <120> Immunotherapeutic composition for treating cancer <130> 20P12036 <150> KR 10-2019-0176287 <151> 2019-12-27 <160> 22 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 74 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PL001 <220> <221> modified_base <222> (1)..(74) <223> n is 5-(N-benzylcarboxyamide)-2'-deoxyuridine <400> 1 gagtgaccgt ctgcctgang aaaagnnnnn ganngnaccn nagngcacnc aacagngcag 60 ccacaccacc agcc 74 <210> 2 <211> 73 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PL002 <220> <221> modified_base <222> (1)..(73) <223> n is 5-(N-benzylcarboxyamide)-2'-deoxyuridine <400> 2 gagtgaccgt ctgcctgngn angccgcacg ancgcccnan nnngcgagnn nacncacagc 60 cacaccacca gcc 73 <210> 3 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PL003 <220> <221> modified_base <222> (1)..(34) <223> n is 5-(N-benzylcarboxyamide)-2'-deoxyuridine <400> 3 gcctgangaa aagnnnnnga nngnaccnna gngc 34 <210> 4 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PL004 <220> <221> modified_base <222> (1)..(29) <223> n is 5-(N-benzylcarboxyamide)-2'-deoxyuridine <400> 4 angaaaagnn nnnganngna ccnnagngc 29 <210> 5 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PL005 <220> <221> modified_base <222> (1)..(49) <223> n is 5-(N-benzylcarboxyamide)-2'-deoxyuridine <400> 5 gcctgngnan gccgcacgan cgcccnannn ngcgagnnna cncacagcc 49 <210> 6 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PL006 <220> <221> modified_base <222> (1)..(39) <223> n is 5-(N-benzylcarboxyamide)-2'-deoxyuridine <400> 6 ngnangccgc acgancgccc nannnngcga gnnnacnca 39 <210> 7 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PL007 <220> <221> modified_base <222> (1)..(33) <223> n is 5-(N-benzylcarboxyamide)-2'-deoxyuridine <400> 7 angccgcacg ancgcccnan nnngcgagnn nac 33 <210> 8 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PL008 <220> <221> modified_base <222> (1)..(27) <223> n is 5-(N-benzylcarboxyamide)-2'-deoxyuridine <400> 8 ccgcacganc gcccnannnn gcgagnn 27 <210> 9 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PL009 <220> <221> modified_base <222> (1)..(24) <223> n is 5-(N-benzylcarboxyamide)-2'-deoxyuridine <400> 9 aagnnnnnga nngnaccnna gngc 24 <210> 10 <211> 74 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PL010 <220> <221> modified_base <222> (1)..(74) <223> n is 5-(N-benzylcarboxyamide)-2'-deoxyuridine <400> 10 gagtgaccgt ctgcctgnna agcggcnaag nnnnnganng naccnnagng cccnnaccag 60 ccacaccacc agcc 74 <210> 11 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PL016 <220> <221> modified_base <222> (1)..(50) <223> n is 5-(N-benzylcarboxyamide)-2'-deoxyuridine <400> 11 gcctgangaa aagnnnnnga nngnaccnna gngcacncaa cagngcagcc 50 <210> 12 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PL017 <220> <221> modified_base <222> (1)..(46) <223> n is 5-(N-benzylcarboxyamide)-2'-deoxyuridine <400> 12 gcctgangaa aagnnnnnga nngnaccnna gngcacncaa cagngc 46 <210> 13 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PL018 <220> <221> modified_base <222> (1)..(45) <223> n is 5-(N-benzylcarboxyamide)-2'-deoxyuridine <400> 13 angaaaagnn nnnganngna ccnnagngca cncaacagng cagcc 45 <210> 14 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PL019 <220> <221> modified_base <222> (1)..(40) <223> n is 5-(N-benzylcarboxyamide)-2'-deoxyuridine <400> 14 angaaaagnn nnnganngna ccnnagngca cncaacagng 40 <210> 15 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PL020 <220> <221> modified_base <222> (1)..(24) <223> n is 5-(N-benzylcarboxyamide)-2'-deoxyuridine <400> 15 nnganngnac cnnagngcac ncaa 24 <210> 16 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PL021 <220> <221> modified_base <222> (1)..(23) <223> n is 5-(N-benzylcarboxyamide)-2'-deoxyuridine <400> 16 aagnnnnnga nngnaccnna gng 23 <210> 17 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PL022 <220> <221> modified_base <222> (1)..(22) <223> n is 5-(N-benzylcarboxyamide)-2'-deoxyuridine <400> 17 agnnnnngan ngnaccnnag ng 22 <210> 18 <211> 74 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PL028 <220> <221> modified_base <222> (1)..(74) <223> n is 5-(N-benzylcarboxyamide)-2'-deoxyuridine <400> 18 gagtgaccgt ctgcctgngn angccgcacg ancgcccnan nnngcgagnn naacngacag 60 ccacaccacc agcc 74 <210> 19 <211> 74 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PL029 <220> <221> modified_base <222> (1)..(74) <223> n is 5-(N-benzylcarboxyamide)-2'-deoxyuridine <400> 19 gagtgaccgt ctgcctgcca nnnccngcnn gcncnnccnc cnnnannnnn caccnnncag 60 ccacaccacc agcc 74 <210> 20 <211> 74 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> template sequence <220> <221> variation <222> (17)..(56) <223> n is g,a,c or t <400> 20 ggctggtggt gtggctgnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnncag 60 gcagacggtc actc 74 <210> 21 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5' primer <400> 21 gagtgaccgt ctgcctg 17 <210> 22 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3' primer <400> 22 ggctggtggt gtggctg 17

Claims

PD-L1(programmed death-ligand 1)에 특이적으로 결합하거나 PD-L1에 특이적으로 결합하여 PD-1(programmed cell death protein 1)과 PD-L1의 상호작용을 억제할 수 있는, 서열번호 1, 2, 10, 또는 18의 핵산 서열을 포함하는, 압타머 또는 이의 기능성 단편.
제1항에 있어서, 상기 기능성 단편은 서열번호 3 내지 9, 및 11 내지 17 중 어느 하나인, 압타머 또는 이의 기능성 단편.
서열번호 1, 2, 10, 및 18로 구성된 군으로부터 선택된 핵산 서열을 포함하는 압타머 또는 이의 기능성 단편을 하나 이상 포함하는, 암 치료용 약학 조성물.
제3항에 있어서, 상기 기능성 단편은 서열번호 3 내지 9, 및 11 내지 17 중 어느 하나인, 약학 조성물.
제3항에 있어서, 상기 기능성 단편은 서열번호 3, 4, 5, 6, 7, 9, 11, 12, 14 또는 16인, 약학 조성물.
제3항에 있어서, 상기 암은 PD-L1이 과발현된, 약학 조성물.
제3항에 있어서, 상기 암은 전립선암, 담낭암, 간내 담도암, 담도암, 구강암, 인두암, 후두암, 설암, 십이지장암, 안종양, 종격동암, 부비동암, 신우암, 심장암, 교모세포종, 신경모세포종, 간암, 골암, 췌장암, 피부암, 두경부암, 유방암, 폐암, 피부 또는 안내 악성 흑색종, 신장암, 자궁암, 난소암, 결장암, 직장암, 항문 부위 암, 대장암, 위암, 고환암, 나팔관 암종, 자궁 내막 암종, 자궁 경부 암종, 질 암종, 외음부암, 비호지킨림프종, 식도암, 소장암, 내분비계암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신샘암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 소아암, 림프구성 림프종, 방광암, 요관암, 신장 골반 암종, 중추 신경계 (CNS) 암, 원발성 CNS 림프종, 종양 혈관 신생, 척추암, 뇌간 신경 교종 , 뇌하수체 선종, 카포시 육종, 표피 암, 편평 상피 세포 암, 다발성 골수종, B-세포 림프종, 호지킨 림프종, 급성 골수성 림프종, 만성 골수성 백혈병, 만성 림프성 백혈병, 여포성 림프종, 미만성 거대 B-세포 림프종, 버킷 림프종, 면역성 대세포 림프종, 전구 B-림프모구 림프종, 맨틀 세포 림프종, 급성 림프모구 림프종, 균상식육종, 역형성 대세포 림프종, 급성 골수성 백혈병, 급성 림프성 백혈병, 간모세포종, 망막모세포종, 복막암, 뇌종양, 흉선암, T-세포 림프종 또는 전구체 T-림프모구 림프종인, 약학 조성물.
제3항에 있어서, 상기 압타머 또는 상기 기능성 단편의 5' 말단, 3' 말단, 또는 양 말단에 저분자 유기화합물, 핵산, 단백질 및 방사선 동위원소 중 적어도 하나가 결합되어 있는, 약학 조성물.
서열번호 1, 2, 10, 및 18로 구성된 군으로부터 선택된 핵산 서열을 포함하는 압타머 또는 이의 기능성 단편을 하나 이상 포함하는, 암세포 검출용 조성물.
제9항에 있어서, 상기 기능성 단편은 서열번호 3 내지 9, 및 11 내지 17 중 어느 하나인, 검출용 조성물.
제9항에 있어서, 상기 기능성 단편은 서열번호 3, 4, 5, 6, 7, 9, 11, 12, 14 또는 16인, 검출용 조성물.
제9항에 있어서, 상기 암세포는 PD-L1이 과발현된 세포인, 검출용 조성물.
제9항에 있어서, 상기 암은 전립선암, 담낭암, 간내 담도암, 담도암, 구강암, 인두암, 후두암, 설암, 십이지장암, 안종양, 종격동암, 부비동암, 신우암, 심장암, 교모세포종, 신경모세포종, 간암, 골암, 췌장암, 피부암, 두경부암, 유방암, 폐암, 피부 또는 안내 악성 흑색종, 신장암, 자궁암, 난소암, 결장암, 직장암, 항문 부위 암, 대장암, 위암, 고환암, 나팔관 암종, 자궁 내막 암종, 자궁 경부 암종, 질 암종, 외음부암, 비호지킨림프종, 식도암, 소장암, 내분비계암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신샘암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 소아암, 림프구성 림프종, 방광암, 요관암, 신장 골반 암종, 중추 신경계 (CNS) 암, 원발성 CNS 림프종, 종양 혈관 신생, 척추암, 뇌간 신경 교종 , 뇌하수체 선종, 카포시 육종, 표피 암, 편평 상피 세포 암, 다발성 골수종, B-세포 림프종, 호지킨 림프종, 급성 골수성 림프종, 만성 골수성 백혈병, 만성 림프성 백혈병, 여포성 림프종, 미만성 거대 B-세포 림프종, 버킷 림프종, 면역성 대세포 림프종, 전구 B-림프모구 림프종, 맨틀 세포 림프종, 급성 림프모구 림프종, 균상식육종, 역형성 대세포 림프종, 급성 골수성 백혈병, 급성 림프성 백혈병, 간모세포종, 망막모세포종, 복막암, 뇌종양, 흉선암, T-세포 림프종 또는 전구체 T-림프모구 림프종인, 검출용 조성물.
제9항에 있어서, 상기 압타머 또는 상기 기능성 단편의 5' 말단, 3' 말단, 또는 양 말단에 형광 표지, 라만 산란 표지, 효소 표지, 적외선 표지 및 방사선 표지 중 적어도 하나가 결합되어 있는, 검출용 조성물.