KR20210076144A - 재조합 콜라겐의 국소 제제 - Google Patents

Abstract

본 개시내용은 피부의 견고성, 탄력성, 명도, 보습, 촉각적 질감 또는 시각적 질감을 개선하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 비자연 발생의 단축형 콜라겐 분자를 피부에 국소 적용하는 것을 포함한다.

Description

재조합 콜라겐의 국소 제제

상호참조

본 출원은 2019년 4월 1일에 출원된 미국 가출원 제62/827,662호를 우선권으로 주장하며, 상기 가출원은 그 전체가 참조로 본원에 포함되어 있다.

콜라겐 및 유사 단백질은 생물권에서 가장 풍부한 단백질이다. 콜라겐은 동물의 피부, 결합 조직과 뼈 및 다른 조직에서 발견되는 구조 단백질이다. 인간에서, 신체에 존재하는 콜라겐의 양은 총 단백질의 대략 1/3이며, 피부의 건조 중량의 약 3/4를 차지한다.

천연 콜라겐의 구조는 3개의 폴리펩타이드 가닥이 함께 나선형 코일을 형성하는 삼중 나선일 수 있다. 개별 폴리펩타이드 가닥은 GLY-X-Y로 지정되는 반복적인 삼중항(triplet) 아미노산 서열로 구성된다. X 및 Y는 임의의 아미노산일 수 있으며, 첫 번째 아미노산은 글리신이다. 아미노산 프롤린 및 하이드록시프롤린이 콜라겐에서 고농도로 발견된다. 가장 흔한 삼중항은 콜라겐에서 삼중항의 대략 10.5%를 차지하는 글리신-프롤린-하이드록시프롤린(Gly-Pro-Hyp)이다.

젤라틴은 특정(예컨대, 천연) 콜라겐의 부분적 가수분해에 의해 수득되는 생성물이다. 전형적으로, 젤라틴은 산 가수분해, 알칼리 가수분해, 및 효소 가수분해에 의해 생산되거나 콜라겐을 수용액에서 열에 노출시킴으로써(예컨대, 동물의 뼈 및 피부를 끓임으로써, 생선 비늘을 끓임으로 등) 생산된다.

젤라틴은 화장품, 식품, 의약품, 의료 장치, 사진 필름, 접착제, 결합제 등을 포함하는 많은 제품에서 사용된다. 젤라틴의 물리적 및 화학적 특성은 특정 용도에 맞게 조정된다. 이러한 물리적/화학적 특성은 겔 강도, 융점 온도, 점도, 색상, 탁도, pH, 등전점 등을 포함한다.

특정 구현예에서, 본원에는 다양한 폴리펩타이드, 이러한 폴리펩타이드를 포함하는 조성물, 및 이러한 폴리펩타이드 및/또는 이의 조성물을 사용하는 방법이 있다. 특정 구현예에서, 이러한 폴리펩타이드는 본원에 기재된 천연 콜라겐과 같은 천연 콜라겐에 비해 단축된 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 것과 같은 비천연 및/또는 재조합 폴리펩타이드를 포함한다. 특정 경우, 이러한 폴리펩타이드는 "단축형 콜라겐"으로서 본원에 기술된다. 특정 구현예에서, 폴리펩타이드는 천연 인간 콜라겐의 하나 이상의(예컨대, 2개 이상의) 단축형 아미노산 서열을 포함한다. 다른 특정 구현예에서, 폴리펩타이드는 천연 해파리 콜라겐의 하나 이상의(예컨대, 2개 이상의) 단축형 아미노산 서열을 포함한다. 일 양태에서, 피부(예컨대, 인간과 같은 개체의 피부)에 이점을 제공하는(예컨대, 견고성, 탄력성, 명도, 보습, 촉각적 질감, 또는 시각적 질감을 증가시키는) 방법이 제공된다. 일부 구현예에서, 방법은 본원에 기재된 폴리펩타이드(예컨대, 본원에 기재된 바와 같은 비자연 발생의 단축형 콜라겐) 또는 제제(예컨대, 비자연 발생의 단축형 콜라겐과 같은 폴리펩타이드를 포함하는 것)를 피부에 국소 적용하는 것을 포함한다.

특정 양태에서, 피부에 존재하는 선 또는 주름을 감소시키거나 피부의 홍반을 감소시키는 방법이 제공된다. 일부 구현예에서, 방법은 본원에 기재된 폴리펩타이드(예컨대, 본원에 기재된 바와 같은 비자연 발생의 단축형 콜라겐), 또는 이의 제제를 피부에 국소 적용하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 비자연 발생의 단축형 콜라겐과 같은 본원에 기재된 폴리펩타이드를 포함하는 제제가 또한 본원에 제공된다.

특정 경우, 본원에 기재된 폴리펩타이드(예컨대, 단축형 콜라겐)는 피부의 견고성, 탄력성, 명도, 보습, 촉각적 질감, 및/또는 시각적 질감을 증가시키는 데 유용하다. 일부 경우, 본원에 기재된 폴리펩타이드(예컨대, 단축형 콜라겐)는 피부에 존재하는 선 또는 주름을 감소시키거나 피부의 홍반을 감소시키는 데 유용하다. 특정 구현예에서, 폴리펩타이드(예컨대, 단축형 콜라겐)는 단축형 해파리 콜라겐(예컨대, 자연 발생의 해파리 콜라겐의 단축형 아미노산 서열)이거나 이를 포함한다. 다른 특정 구현예에서, 폴리펩타이드(예컨대, 단축형 콜라겐)는 단축형 인간 콜라겐(예컨대, 자연 발생의 인간 콜라겐의 단축형 아미노산 서열)이거나 이를 포함한다.

일부 구현예에서, 폴리펩타이드(예컨대, 단축형 콜라겐)(예컨대, 본원에 개시된 방법에 유용함)는 천연(예컨대, 인간 또는 해파리(Hydrozoan)) 콜라겐에 비해 단축형 아미노산 서열이거나 이를 포함한다. 일부 경우, 이러한 폴리펩타이드는 본원에서 비자연 발생 콜라겐으로 지칭된다. 특정 구현예에서, 비자연 발생 콜라겐은 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 7, 서열번호 10, 서열번호 12, 서열번호 14, 서열번호 16, 서열번호 18, 서열번호 20, 서열번호 22, 서열번호 24, 서열번호 25, 서열번호 27, 및/또는 서열번호 29의 아미노산 서열, 또는 이의 상동체(예컨대, 이와 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 98% 서열 동일성을 가짐)이거나 이를 포함한다. 보다 특정 구현예에서, 비자연 발생 콜라겐은 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 7, 서열번호 10, 서열번호 12, 서열번호 14, 서열번호 16, 서열번호 18, 서열번호 20, 서열번호 22, 서열번호 24, 서열번호 25, 서열번호 27, 또는 서열번호 29의 아미노산 서열, 또는 이의 상동체(예컨대, 이와 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 98% 서열 동일성을 가짐)이다.

특정 구현예에서, 조성물이 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 이러한 조성물은 본원에 기재된 임의의 폴리펩타이드(예컨대, 단축형 또는 비천연 콜라겐)를 포함한다. 일 양태에서, 임의의 적합한 양, 예컨대 0.005% 내지 30% w/w와 같은 본원에 제공된 임의의 폴리펩타이드(예컨대, 단축형 또는 비자연 발생 콜라겐)를 포함하는 조성물이 제공된다. 조성물은 부형제, 국소 담체, 또는 보존제를 포함하는 적어도 하나의 추가 성분을 추가로 포함할 수 있다.

특정 구현예에서, 본원에 제공된 조성물은 국소 조성물, 예컨대 국소 투여 또는 사용을 위해 제제화되고/되거나 적합한 조성물이다. 일 양태에서, 국소 조성물을 피부에 국소 투여하는 단계를 포함하는, 개체의 피부에 이점(예컨대, 본원에 기재된 바와 같음)을 제공하는 것과 같은 방법이 본원에 제공된다. 특정 구현예에서, 국소 조성물은 피부 손상을 감소시키거나, 손상된 피부의 회복을 촉진하거나, 또는 피부 세포에 의한 콜라겐의 생산을 자극하기 위한 방법에 사용된다. 특정 구현예에서, 국소 조성물은 피부에서 엘라스틴 생산을 증가, 촉진, 자극, 또는 증가시키기 위한 방법에 사용된다.

일 양태는 콜라겐 또는 콜라겐을 포함하는 조성물을 대상체의 피부에 적용하기 위한 방법을 제공한다.

본원에 논의된 바와 같이, 일부 구현예에서, 본원에 제공된 폴리펩타이드는 천연(예컨대, 인간 또는 해파리(Hydrozoan)) 콜라겐에 비해 단축형 아미노산 서열이거나 이를 포함한다. 특정 구현예에서, 이러한 폴리펩타이드는 단축형 콜라겐(예컨대, 천연 콜라겐에 비해 하나 이상의 단축형 아미노산 서열을 포함함)이다. 일부 구현예에서, 단축형 콜라겐은 해파리 콜라겐 또는 인간 콜라겐이다. 다양한 구현예에서, 콜라겐은 C-말단에서 단축되거나, N-말단에서 단축되거나, 내부에서 단축되거나, 또는 C-말단과 N-말단 모두에서 단축된다(예컨대, 천연 콜라겐에 비해). 일 구현예에서, 콜라겐은 C-말단과 N-말단 모두에서 단축된다(예컨대, 천연 콜라겐에 비해). 특정 구현예에서, 본원에 제공된 폴리펩타이드는 C-말단, N-말단에서의 단축, 및/또는 하나 이상의 내부 단축을 포함하는 것과 같은 임의의 적합한 단축의 단축형 콜라겐이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 콜라겐의 단축은 유익한 결과(예컨대, 천연 콜라겐에 비해 개선된 결과 및/또는 천연 콜라겐에 비해 추가 이점)를 달성하고/거나 콜라겐의 하나 이상의 유익한 측면을 유지하면서 콜라겐의 길이를 단축시키는 데 적합하다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 폴리펩타이드는 콜라겐의 하나 이상의 국소 이점을 유지하기 위한 것과 같은 방식으로 단축형 콜라겐이거나 이를 포함한다.

일부 구현예에서, 단축형 콜라겐(이의 아미노산 서열)(예컨대, 본원에 제공된 폴리펩타이드의)은 C-말단에서 임의의 적합한 수의 아미노산 잔기, 예컨대 최대 10개, 10 내지 800개, 10 내지 700개, 10 내지 500개, 10 내지 400개, 10 내지 300개, 50 내지 800개, 50 내지 700개, 50 내지 600개, 50 내지 500개, 50 내지 400개 등이 단축된다. 특정 구현예에서, 단축형 콜라겐(이의 아미노산 서열)(예컨대, 본원에 제공된 폴리펩타이드의)은 N-말단에서 임의의 적합한 수의 아미노산 잔기, 예컨대 최대 10개, 10 내지 900개, 10 내지 800개, 10 내지 700개, 10 내지 500개, 10 내지 400개, 10 내지 300개, 50 내지 800개, 50 내지 700개, 50 내지 600개, 50 내지 500개, 50 내지 400개 등이 단축된다. 일부 구현예에서, 단축형 콜라겐(이의 아미노산 서열)(예컨대, 본원에 제공된 폴리펩타이드의)은 내부에서 임의의 적합한 수의 아미노산 잔기, 예컨대 최대 10개, 10 내지 900개, 10 내지 800개, 10 내지 700개, 10 내지 500개, 10 내지 400개, 10 내지 300개, 50 내지 800개, 50 내지 700개, 50 내지 600개, 50 내지 500개, 50 내지 400개 등이 단축된다. 특정 구현예에서, 단축형 콜라겐(이의 아미노산 서열)(예컨대, 본원에 제공된 폴리펩타이드의)은 C-말단에서 10 내지 800개 아미노산이 단축되고/되거나 N-말단에서 10 내지 800 개 아미노산이 단축된다. 또 다른 구현예에서, 단축형 콜라겐(이의 아미노산 서열)(예컨대, 본원에 제공된 폴리펩타이드의)은 10 내지 900 개 아미노산 길이, 10 내지 800 개 아미노산 길이, 10 내지 700 개 아미노산 길이, 10 내지 600 개 아미노산 길이, 10 내지 500 개 아미노산 길이, 10 내지 400 개 아미노산 길이, 10 내지 300 개 아미노산 길이, 10 내지 200 개 아미노산 길이, 10 내지 100 개 아미노산 길이, 10 내지 50 개 아미노산 길이, 50 내지 800 개 아미노산 길이, 50 내지 700 개 아미노산 길이, 50 내지 600 개 아미노산 길이, 50 내지 500 개 아미노산 길이, 50 내지 400 개 아미노산 길이, 50 내지 300 개 아미노산 길이, 50 내지 200 개 아미노산 길이, 또는 50 내지 100 개 아미노산 길이이다.

특정 구현예에서, 인간(예컨대, 인간 21형) 콜라겐의 아미노산 서열이거나 이를 포함하는 폴리펩타이드가 본원에 제공된다. 특정 구현예에서, 단축형 인간 콜라겐은 단축형 인간 21형 콜라겐이다. 다양한 구현예에서, 단축은 본원에 제공된 임의의 개시내용에 따른다. 특정 구현예에서, 개시된 단축형 인간 21형 콜라겐은 서열번호 16(또는 서열번호 16의 아미노산 서열에 대해 적어도 80% 서열 동일성, 적어도 85% 서열 동일성, 적어도 90% 서열 동일성, 적어도 95% 서열 동일성, 적어도 98% 서열 동일성, 또는 본원에 제공된 다른 서열 동일성을 갖는 것과 같은 이의 상동체)이다. 다양한 구현예에서, 이러한 폴리펩타이드는 본원에 제공된 임의의 조성물, 제제, 또는 방법에서 제공된다.

특정 구현예에서, 해파리(Hydrozoan) 콜라겐의 아미노산 서열이거나 이를 포함하는 폴리펩타이드가 본원에 제공된다. 다양한 구현예에서, 단축은 본원에 제공된 임의의 개시내용에 따른다. 특정 구현예에서, 개시된 단축형 해파리 콜라겐은 서열번호 5(또는 서열번호 5의 아미노산 서열에 대해 적어도 80% 서열 동일성, 적어도 85% 서열 동일성, 적어도 90% 서열 동일성, 적어도 95% 서열 동일성, 적어도 98% 서열 동일성, 또는 본원에 제공된 다른 서열 동일성을 갖는 것과 같은 이의 상동체)이다. 다양한 구현예에서, 이러한 폴리펩타이드는 본원에 제공된 임의의 조성물, 제제, 또는 방법에서 제공된다.

특정 구현예에서, 개체 또는 이의 피부에 이점을 제공하기 위해서와 같이, 폴리펩타이드(예컨대, 본원에 기재된 단축형 콜라겐이거나 이를 포함함)를 개체의 피부에 투여하는 단계를 포함하는 방법이 본원에 제공된다. 일부 경우, 피부에 제공되는 이점은 피부의 견고성 개선, 피부의 탄력성 개선, 피부의 보습 개선, 피부의 질감 개선, 피부의 명도 개선, 피부의 주름 감소, 피부의 홍반 감소, 피부에서 콜라겐 생산 개선, 피부에서 엘라스틴 생산 개선 또는 증가, 피부에 대한 항산화 보호, 피부의 발적 감소, 또는 다른 이점, 또는 본원에 기재된 것과 같은 이점의 조합이다. 다양한 경우에, 피부 특징의 개선, 또는 본원에 제공된 방법에 의해 제공된 이점은 기구의 사용에 의해 또는 임상의에 의한 평가에 의해서와 같은 임의의 적합한 방식으로 결정된다. 일 양태에서, 피부의 견고성을 증가시키는 방법으로서, 피부의 견고성은 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 70%, 또는 75% 증가되는 것인 방법이 제공된다. 일 구현예에서, 피부의 견고성은 큐토미터(cutometer)를 사용하여 측정된다.

또 다른 양태는 피부의 탄력성을 증가시키는 방법으로서, 피부의 견고성은 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 70%, 또는 75% 증가되는 것인 방법을 제공한다. 일 구현예에서, 피부의 탄력성은 큐토미터를 사용하여 측정된다.

또 다른 양태에서, 피부의 보습을 증가시키는 방법으로서, 피부의 보습은 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 70%, 또는 75% 증가하는 것인 방법이 제공된다. 일 구현예에서, 피부 보습은 코르네오미터(corneometer)에서 측정된다.

일 양태에서, 피부의 견고성이 증가되는 피부의 견고성을 증가시키는 방법이 제공된다. 일 구현예에서, 피부의 견고성은 전문 임상 채점자에 의해 결정된다.

일 양태에서, 피부의 탄력성이 증가되는 피부의 탄력성을 증가시키는 방법이 제공된다. 일 구현예에서, 피부의 탄력성은 전문 임상 채점자에 의해 결정된다.

일 양태에서, 피부의 명도가 증가되는 피부의 명도를 증가시키는 방법에 제공된다. 일 구현예에서, 피부의 명도는 전문 임상 채점자에 의해 결정된다.

또 다른 양태에서, 피부의 촉각적 질감이 증가되는 피부의 촉각적 질감을 증가시키는 방법이 제공된다. 일 구현예에서, 피부의 촉각적 질감은 전문 임상 채점자에 의해 결정된다.

일 양태에서, 피부의 시각적 질감이 증가되는 피부의 시각적 질감을 증가시키는 방법이 제공된다. 일 구현예에서, 피부의 시각적 질감은 전문 임상 채점자에 의해 결정된다.

일 양태에서, 피부에 존재하는 선 또는 주름이 감소되는 피부에 존재하는 선 또는 주름을 감소시키는 방법이 제공된다. 일 구현예에서, 피부에 존재하는 선 또는 주름의 양은 전문 임상 채점자에 의해 결정된다.

일 양태에서, 피부의 홍반이 감소되는 피부의 홍반을 감소시키는 방법이 제공된다. 일 구현예에서, 피부의 홍반은 전문 임상 채점자에 의해 결정된다.

또 다른 양태는 피부 세포에서 콜라겐 생산을 자극하는 방법을 제공한다. 일 구현예에서, 방법은 비자연 발생의 단축형 콜라겐 또는 비자연 발생의 단축형 콜라겐을 포함하는 제제를 피부에 적용하는 단계를 포함한다. 일 구현예에서, 단축형 해파리 콜라겐 또는 단축형 인간 콜라겐은 콜라겐 생산을 자극한다. 특정 구현예에서, 단축형 인간 콜라겐은 서열번호 16의 단축형 인간 21형 콜라겐이다. 또 다른 특정 구현예에서, 단축형 해파리 콜라겐은 서열번호 5의 단축형 해파리 콜라겐이다.

또 다른 양태는 피부 세포에서 콜라겐 생산을 자극하는 방법으로서, 피부 내의 콜라겐은 적어도 1%, 적어도 2%, 적어도 3%, 적어도 4%, 적어도 5%, 적어도 6%, 적어도 7%, 적어도 8%, 적어도 9%, 또는 적어도 10% 증가하는 것인 방법을 제공한다.

단축형 콜라겐과, 물, 오일, 글리세레스-8 에스테르, 글리세린, 코코넛 알칸, 하이드록시에틸 아크릴레이트/나트륨 아크릴로일디메틸 타우레이트 공중합체, 펜틸렌 글리콜, 이나트륨 EDTA, 카프릴릴 글리콜, 클로르페네신 및 페녹시에탄올로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 추가 성분을 포함하는 국소 제제가 개시된다. 일 구현예에서, 단축형 콜라겐은 단축형 해파리 콜라겐 또는 단축형 인간 콜라겐이다. 또 다른 구현예에서, 단축형 콜라겐은 단축형 인간 21형 콜라겐이다. 본원에 개시된 또 다른 구현예는 콜라겐을 포함하고 식물성 오일을 추가로 포함하는 국소 제제이다. 일 구현예에서, 식물성 오일은 올리브 오일이다.

본 발명의 신규한 특징은 첨부된 청구범위에 구체적으로 제시되어 있다. 본 발명의 특징 및 이점은 본 발명의 원리가 이용되는 예시적인 구현예를 제시하는 다음의 상세한 설명, 및 첨부된 도면을 참조하여 더 잘 이해될 것이다:
도 1은 섬유아세포에서의 콜라겐 1형 단백질 분비에 대한 본원에 제공된 예시적인 폴리펩타이드(단축형 인간 콜라겐 아미노산 서열 포함)의 효과를 예시한다.
도 2a는 본원에 제공된 예시적인 폴리펩타이드(단축형 인간 콜라겐 아미노산 서열 포함)로 처리된 섬유아세포에서의 콜라겐 1형 mRNA의 발현을 예시한다.
도 2b는 본원에 제공된 예시적인 폴리펩타이드(단축형 인간 콜라겐 아미노산 서열 포함)로 처리된 섬유아세포에서의 엘라스틴 mRNA의 발현을 예시한다.
도 2c는 본원에 제공된 예시적인 폴리펩타이드(단축형 인간 콜라겐 아미노산 서열 포함)로 처리된 섬유아세포에서의 피브로넥틴 mRNA의 발현을 예시한다.
도 3은 본원에 제공된 예시적인 폴리펩타이드(단축형 인간 콜라겐 아미노산 서열 포함)로 처리된 인간 1차 케라티노사이트에서의 IL-1a의 발현을 예시한다.
도 4는 본원에 제공된 예시적인 폴리펩타이드(단축형 인간 콜라겐 아미노산 서열 포함)의 항산화 능력을 예시한다.
도 5는 본원에 제공된 예시적인 폴리펩타이드(단축형 인간 콜라겐 아미노산 서열 포함)로 처리된 UVB 조사된 케라티노사이트의 생존율을 예시한다.
도 6은 본원에 제공된 예시적인 폴리펩타이드(단축형 인간 콜라겐 아미노산 서열 포함)로 처리한 후 피부 탄력성을 예시한다.
도 7은 본원에 제공된 예시적인 폴리펩타이드(단축형 인간 콜라겐 아미노산 서열 포함)로 처리한 후 피부 콜라겐 함량을 예시한다.
도 8은 본원에 제공된 예시적인 폴리펩타이드(단축형 인간 콜라겐 아미노산 서열 포함)로 처리한 후 피부 발적의 정량화를 예시한다.
도 9는 본원에 제공된 예시적인 폴리펩타이드(단축형 인간 콜라겐 아미노산 서열 포함)로 처리한 후 피부 주름의 정량화를 예시한다.
도 10은 본원에 제공된 예시적인 폴리펩타이드(단축형 해파리 콜라겐 아미노산 서열 포함)로 처리된 인간 피부 조직 모델에 의한 콜라겐 1형 단백질 분비를 예시한다.
도 11은 본원에 제공된 예시적인 폴리펩타이드(단축형 해파리 콜라겐 아미노산 서열 포함)로 처리한 후 케라티노사이트에서의 UVB 유도된 TT 이량체를 예시한다.
도 12는 본원에 제공된 예시적인 폴리펩타이드(단축형 해파리 콜라겐 아미노산 서열 포함) 처리와 함께 UVB 조사 후 케라티노사이트 생존율을 예시한다.
도 13은 도시 분진 및 본원에 제공된 예시적인 폴리펩타이드(단축형 해파리 콜라겐 아미노산 서열 포함)로 처리될 때의 세포 생존율을 예시한다.
도 14는 본원에 제공된 예시적인 폴리펩타이드(단축형 해파리 콜라겐 아미노산 서열 포함)로 처리한 후 UVB에 의해 유도된 IL-1a의 상대적 발현을 예시한다.
도 15는 본원에 제공된 예시적인 폴리펩타이드(단축형 해파리 콜라겐 아미노산 서열 포함)의 항산화 능력을 예시한다.
도 16은 본원에 제공된 예시적인 폴리펩타이드(단축형 해파리 콜라겐 아미노산 서열 포함)로 처리한 후 피부 보습을 예시한다.
도 17은 본원에 제공된 예시적인 폴리펩타이드(단축형 해파리 콜라겐 아미노산 서열 포함)로 처리한 후 피부 탄력성을 예시한다.

하기 설명에서, 본 개시내용의 다양한 구현예의 완전한 이해를 제공하기 위해 특정 세부사항이 제시된다. 그러나, 당업자는 본 개시내용이 이러한 세부사항 없이 실시될 수 있음을 이해할 것이다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "약"은 일반적으로 ±10%를 지칭한다.

용어 "구성되는"은 "포함하고 제한되는"을 의미한다. 일반적으로, "포함하는"의 개시는 "구성되는"의 개시를 포함한다.

용어 "본질적으로 구성되는"은 조성물, 방법, 또는 구조가 추가 성분, 단계, 및/또는 부분을 포함할 수 있지만, 추가 성분, 단계, 및/또는 부분이 청구된 조성물, 방법, 또는 구조의 기본적이고 신규한 특징을 실질적으로 변경하지 않는 경우에만 그러하다는 것을 의미한다. 일반적으로, "포함하는"의 개시는 "본질적으로 구성되는"의 개시를 포함한다.

본원에 사용된 바와 같이, 단수 형태 "a", "an" 및 "the"는 문맥이 달리 명확하게 나타내지 않는 한 복수 언급을 포함한다. 예를 들어, 용어 "화합물" 또는 "적어도 하나의 화합물"은 이의 혼합물을 포함하는 복수의 화합물을 포함할 수 있다.

이 문서 전체에서, 본 개시내용의 다양한 구현예은 범위 형식으로 제시될 수 있다. 범위 형식의 기재는 단지 편의성과 간결성을 위한 것으로 이해되어야 하며, 본 개시내용의 범위에 대한 유연성이 없는 제한으로 해석되지 않아야 한다. 따라서, 범위의 기재는 모든 가능한 하위 범위뿐만 아니라 상기 범위 내의 개별 수치를 명시적으로 개시한 것으로 간주되어야 한다. 예를 들어, 1 내지 6과 같은 범위의 기재는 1 내지 3, 1 내지 4, 1 내지 5, 2 내지 4, 2 내지 6, 3 내지 6 등과 같은 명시적으로 개시된 하위 범위뿐만 아니라 상기 범위 내의 개별 숫자, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 및 6을 갖는 것으로 간주되어야 한다. 이는 범위의 폭에 관계없이 적용된다.

본원에 수치 범위가 표시되는 경우, 표시된 범위 내의 임의의 언급된 숫자(분수 또는 정수)를 포함하는 것을 의미한다. 문구 첫 번째 표시 숫자 및 두 번째 표시 숫자 "사이의 범위" 및 제1 표시 숫자 "내지" 제2 표시 숫자의 "범위"는 본원에서 상호교환적으로 사용되고 첫 번째 표시 숫자 및 두 번째 표시 숫자와 그 사이의 모든 분수 및 정수를 포함하는 것을 의미한다.

본원에 사용된 바와 같이 용어 "콜라겐" 또는 "콜라겐 유사"는, 일부 경우, 하나 이상의 콜라겐 또는 콜라겐 유사 폴리펩타이드와 결합하여 4차 구조를 형성할 수 있는 (예컨대, 단량체성) 폴리펩타이드를 지칭한다. 콜라겐의 비제한적인 예는 인간 21형 알파 1 콜라겐(예컨대, 서열번호 31), 인간 1형, 알파 2 콜라겐(예컨대, 서열번호 32), 및 해파리(Hydrozoan) 콜라겐(예컨대, 서열번호 33)을 포함한다. 일부 경우, 콜라겐은 젤라틴을 제조하기 위해 산, 염기, 또는 열로 처리될 수 있다. 천연 콜라겐의 4차 구조는, 전형적으로 3개의 폴리펩타이드로 구성된 삼중 나선이지만, 본원에 제공된 "단축형 콜라겐" 또는 "단축형 콜라겐"을 포함하는 폴리펩타이드는 이러한 4차 구조를 갖거나 갖지 않을 수 있고 반드시 이러한 4차 구조를 갖는 것은 아니라는 것에 유의해야 한다. 특정 경우, 천연 콜라겐을 형성하는 3개의 폴리펩타이드 중에서, 2개는 일반적으로 동일하며 이들은 알파 사슬로 지정된다. 3번째 폴리펩타이드는 베타 사슬로 지정된다. 특정 경우, 전형적인 천연 콜라겐은 AAB로 지정될 수 있으며, 여기서 콜라겐은 2개의 알파("A") 가닥 및 하나의 베타("B") 가닥으로 구성된다. 특정 경우, 본원에 제공된 "단축형 콜라겐"을 포함하는 폴리펩타이드는 이러한 구조적 요소를 갖거나 갖지 않을 수 있다. 용어 "콜라겐" 또는 "콜라겐 유사"는 알파 사슬 폴리펩타이드, 베타 사슬 폴리펩타이드, 또는 알파 및 베타 사슬 폴리펩타이드 모두를 지칭할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "프로콜라겐"은 일반적으로 자연 발생 콜라겐으로 가공될 수 있는, 세포에 의해 생산된 폴리펩타이드를 지칭한다.

본원에 사용된 바와 같이 용어 "발현 벡터" 또는 "벡터"는 일반적으로 외인성 유전자의 발현을 지시할 수 있는 핵산 어셈블리를 지칭한다. 발현 벡터는 외인성 유전자, 제한 엔도뉴클레아제 부위, 하나 이상의 선택 마커를 코딩하는 핵산, 및 재조합 기술의 실행에 유용한 다른 핵산에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함할 수 있다.

본원에 사용된 바와 같이 용어 "섬유아세포"는 일반적으로 프로콜라겐 및 다른 구조적 단백질을 합성하는 세포를 지칭한다. 섬유아세포는 신체에 널리 분포되며, 피부, 결합 조직 및 다른 조직에서 발견된다.

용어 "형광 단백질"은 일반적으로 외인성 폴리뉴클레오타이드의 발현의 리포터로서 사용되는 유전 공학 기술에 사용될 수 있는 단백질을 지칭한다. 단백질은 자외선 또는 청색 광에 노출되면 형광을 발하고 밝은 가시 광선을 방출한다. 녹색 광을 방출하는 단백질은 녹색 형광 단백질(GFP)을 포함하고, 적색 광을 방출하는 단백질은 적색 형광 단백질(RFP)을 포함한다.

본원에 사용된 바와 같이 용어 "젤라틴"은 일반적으로 산, 염기 또는 열에 대한 노출에 의해 추가로 가공된 콜라겐을 지칭한다. 일부 경우, 젤라틴 용액은 식품, 화장품, 의약품, 산업 제품, 의료 제품, 실험실 배양 성장 배지, 및 많은 다른 응용에 사용되는 가역성 겔을 형성한다.

본원에 사용된 바와 같이 용어 "유전자"는 일반적으로 특정 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 지칭하며, 이는 코딩 영역 단독을 지칭할 수 있거나 코딩 서열에 선행하는(5' 비코딩 서열) 그리고 후행하는(3' 비코딩 서열) 조절 서열을 포함할 수 있다.

용어 "히스티딘 태그"는 일반적으로 재조합 폴리펩타이드 상의 2-30개의 연속적인 일련의 히스티딘 잔기를 지칭한다.

용어 "숙주 세포"는 일반적으로 도입된 외인성 폴리뉴클레오타이드를 발현하도록 조작된 세포를 지칭한다.

용어 "케라티노사이트"는 일반적으로 피부의 표피 층에서 발견되는 케라틴을 생산하는 세포를 지칭한다.

본원에 사용된 바와 같이 용어 "락타마제"는 일반적으로 락탐(사이클릭 아미드) 모이어티를 함유하는 항생제를 가수분해하는 효소를 지칭한다. "베타-락타마제" 또는 "β-락타마제"는 β-락탐 모이어티를 함유하는 항생제를 가수분해하는 효소이다.

본원에 사용된 바와 같이 용어 "비자연 발생"은 자연에서 정상적으로 발견되지 않는 유전자, 폴리펩타이드, 또는 단백질, 예를 들어 콜라겐을 지칭한다. 비자연 발생 콜라겐은 재조합적으로 제조될 수 있다. 비자연 발생 콜라겐은 재조합 콜라겐일 수 있다. 일 구현예에서, 비자연 발생 콜라겐은 단축형 콜라겐이다. 다른 비자연 발생 콜라겐 폴리펩타이드는 키메라성 콜라겐을 포함한다. 키메라성 콜라겐은 콜라겐 폴리펩타이드의 일부가 제2 콜라겐 폴리펩타이드의 일부와 인접하는 폴리펩타이드이다. 예를 들어, 인간 콜라겐의 일부와 인접한 해파리 콜라겐의 일부를 포함하는 콜라겐 분자는 키메라성 콜라겐이다. 또 다른 구현예에서, 비자연 발생 콜라겐은 분비 태그, 히스티딘 태그, 녹색 형광 단백질, 프로테아제 단축 부위, GEK 반복, GDK 반복, 및/또는 베타-락타마제와 같은 추가 아미노산을 포함하는 융합 폴리펩타이드를 포함한다.

일반적으로, 특정 아미노산 서열을 갖는 것과 같은 본원에 제공된 콜라겐 또는 단축형 콜라겐의 개시는 정확한 아미노산 서열 및 이의 상동체를 갖거나 포함하는 폴리펩타이드를 포함한다. 일부 경우, 본원에 제공된 아미노산 서열의 상동체는 더 길거나 더 짧은 서열을 가질 수 있고, 이러한 아미노산 서열의 하나 이상의 아미노산 잔기의 치환을 가질 수 있다. 이러한 상동체는, 예컨대 본원에 제공된 양으로, 언급된 서열과 특정 서열 동일성을 갖는다. 예컨대, 퍼센트 동일성을 평가하기 위한, 서열 동일성은 비제한적으로 니들만-분쉬(Needleman-Wunsch) 알고리즘(예컨대, www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/nucleotide.html에서 이용가능한 EMBOSS Needle aligner 참조, 선택적으로 기본 설정을 가짐), BLAST 알고리즘(예컨대, blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi에서 이용가능한 BLAST 정렬 도구 참조, 선택적으로 기본 설정을 가짐), 또는 스미스-워터맨(Smith-Waterman) 알고리즘(예컨대, www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_water/nucleotide.html에서 이용가능한 EMBOSS Water aligner 참조, 선택적으로 기본 설정을 가짐)을 포함하는, 임의의 적합한 정렬 알고리즘에 의해 측정될 수 있다. 최적 정렬은 기본 파라미터를 포함하는 선택된 알고리즘의 임의의 적합한 파라미터를 사용하여 평가될 수 있다. 일부 경우, 비자연 발생 콜라겐은 본원에 개시된 서열에 대해 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 가질 수 있다.

용어 "프로테아제 단축 부위"는 일반적으로 특정 프로테아제에 의해 단축되는 아미노산 서열을 지칭한다.

용어 "분비 태그" 또는 "신호 펩타이드"는 일반적으로 숙주 세포의 세포 기구를 모집하여 발현된 단백질을 숙주 세포의 특정 위치 또는 세포 기관 내로 수송하는 아미노산 서열을 지칭한다.

용어 "단축형 콜라겐"은 일반적으로 전장 콜라겐의 하나 이상의 부분이 존재하지 않는 전장 콜라겐보다 작은 단량체성 폴리펩타이드를 지칭한다. 콜라겐 폴리펩타이드는 전장 콜라겐 폴리펩타이드의 C-말단에서 단축되거나, N-말단에서 단축되거나, 내부 부분(들)의 제거에 의해 단축되거나(예컨대, 내부 단축), 또는 C-말단과 N-말단 모두에서 단축된다. 비제한적인 구현예에서, 단축형 인간 콜라겐은 서열번호 16에 따른 아미노산 서열, 또는 이의 상동체를 포함할 수 있다. 또 다른 비제한적인 예에서, 단축형 해파리 콜라겐은 서열번호 5에 따른 아미노산 서열, 또는 이의 상동체를 포함할 수 있다. 일반적으로, 본원에 제공된 단축형 콜라겐은 천연 또는 전장 콜라겐과 유사하거나 실질적으로 유사한 기능을 갖고/거나 이점(예컨대, 본원에 제공된 바와 같음)을 제공할 수 있다. 일부 경우, 본원에 제공된 단축형 콜라겐은 천연 또는 전장 콜라겐과 비교하여 개선되거나 증가된 기능 및/또는 이점(예컨대, 본원에 제공된 바와 같음)을 가질 수 있다.

아미노산 위치와 관련하여 사용되는 경우, "단축"은 상기 아미노산 위치를 포함한다. 예를 들어, 전장 단백질의 아미노산 위치 100에서의 N-말단 단축은 전장 단백질의 N-말단으로부터 100 개의 아미노산의 단축을 의미한다(즉, 단축된 단백질은 전장 단백질의 아미노산 위치 1 내지 100이 없음). 유사하게, 전장 단백질(1000 개의 아미노산 전장 단백질 가정)의 아미노산 위치 901에서의 C-말단 단축은 C-말단으로부터 100 개의 아미노산의 단축을 의미한다(즉, 단축된 단백질은 전장 단백질의 아미노산 위치 901 내지 1000이 없음). 유사하게, 아미노산 위치 101 및 200에서의 내부 단축은 전장 단백질의 100 개의 아미노산의 내부 단축을 의미한다(즉, 단축된 단백질은 전장 단백질의 아미노산 위치 101 내지 200이 없음).

일부 구현예에서, 세포 배양물은 염화 암모늄, 황산 암모늄, 염화 칼슘, 아미노산, 황산 철(II), 황산 마그네슘, 펩톤, 인산 칼륨, 염화 나트륨, 인산 나트륨, 및 효모 추출물 중 하나 이상을 추가로 포함할 수 있다.

숙주 박테리아 세포는 연속적으로 또는 불연속적으로; 배치 공정, 유가 공정 또는 반복 유가 공정으로 배양될 수 있다.

일반적으로, 신호 서열은 발현 벡터의 구성요소일 수 있거나, 그것은 벡터 내로 삽입되는 외인성 유전자의 일부일 수 있다. 선택된 신호 서열은 숙주 세포에 의해 인식 및 가공되는(예컨대, 신호 펩티다제에 의해 단축되는) 것일 수 있다. 외인성 유전자의 천연 신호 서열을 인식 및 가공하지 않는 박테리아 숙주 세포의 경우, 신호 서열은 임의의 일반적으로 알려진 박테리아 신호 서열에 의해 대체될 수 있다. 일부 구현예에서, 재조합적으로 생산된 폴리펩타이드는 DsbA 신호 서열을 사용하여 원형질막주위 공간으로 표적화될 수 있다(Dinh and Bernhardt, J Bacteriol, Sept. 2011, 4984-4987).

일 양태에서, 숙주 세포에 의해 생산된 비자연 발생 콜라겐이 제공된다. 비자연 발생 콜라겐은 해파리 콜라겐 또는 인간 콜라겐일 수 있다. 비자연 발생 콜라겐은 단축형 콜라겐일 수 있다. 단축은 내부 단축(예컨대, 내부 부분의 단축), 콜라겐의 N-말단 부분에서의 단축, 콜라겐의 C-말단 부분에서의 단축, 또는 C-말단과 N-말단 모두에서의 단축일 수 있다. 콜라겐은 50 개의 아미노산 내지 1000 개의 아미노산, 50 개의 아미노산 내지 950 개의 아미노산, 50 개의 아미노산 내지 900 개의 아미노산, 50 개의 아미노산 내지 850 개의 아미노산, 50 개의 아미노산 내지 800 개의 아미노산, 50 개의 아미노산 내지 850 개의 아미노산, 50 개의 아미노산 내지 800 개의 아미노산, 50 개의 아미노산 내지 750 개의 아미노산, 50 개의 아미노산 내지 700 개의 아미노산, 50 개의 아미노산 내지 650 개의 아미노산, 50 개의 아미노산 내지 600 개의 아미노산, 50 개의 아미노산 내지 650 개의 아미노산, 50 개의 아미노산 내지 500 개의 아미노산, 50 개의 아미노산 내지 450 개의 아미노산, 50ㅍ 아미노산 내지 400 개의 아미노산, 50 개의 아미노산 내지 350 개의 아미노산, 50 개의 아미노산 내지 300 개의 아미노산, 50 개의 아미노산 내지 250 개의 아미노산, 50 개의 아미노산 내지 200 개의 아미노산, 50 개의 아미노산 내지 150 개의 아미노산, 또는 50 개의 아미노산 내지 100 개의 아미노산의 단축에 의해 단축될 수 있다. 또 다른 구현예에서, 콜라겐은 약 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 또는 1000 개의 아미노산에 의해 단축될 수 있다. 비자연 발생 콜라겐은 폴리뉴클레오타이드 서열의 일부 또는 본원에 개시된 전체 폴리뉴클레오타이드 서열에 의해 코딩될 수 있다.

본원에 개시된 단축형 콜라겐은 전장 콜라겐에 비해 단축을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 단축형 콜라겐은 전장 인간 21형 알파 1 콜라겐에 비해 단축을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 단축형 콜라겐은 전장 인간 1형 알파 2 콜라겐에 비해 단축을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 단축형 콜라겐은 전장 해파리(Hydrozoan) 콜라겐에 비해 단축을 포함한다. 전장 콜라겐의 비제한적인 예는 하기 표 1에 제공되어 있다.

표 1. 전장 콜라겐 아미노산 서열

일부 경우, 본원에 기재된 바와 같은 단축형 콜라겐은 서열번호 31의 아미노산 위치 1 및 548 사이; 아미노산 위치 1 및 553 사이; 아미노산 위치 1 및 558 사이; 아미노산 위치 1 및 563 사이; 아미노산 위치 1 및 568 사이; 또는 아미노산 위치 1 및 573 사이의 임의의 아미노산 위치에 N-말단 단축을 포함할 수 있다. 일부 경우, 본원에 기재된 바와 같은 단축형 콜라겐은 서열번호 31의 아미노산 위치 726 및 957 사이; 아미노산 위치 731 및 957 사이; 아미노산 위치 736 및 957 사이; 아미노산 위치 741 및 957 사이; 아미노산 위치 746 및 957 사이; 아미노산 위치 751 및 957 사이; 또는 아미노산 위치 756 및 957 사이의 임의의 아미노산 위치에 C-말단 단축을 포함할 수 있다. 일부 경우, 본원에 기재된 바와 같은 단축형 콜라겐은 N-말단 단축 및 C-말단 단축 모두를 포함할 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 단축형 콜라겐은 서열번호 31의 아미노산 위치 1 및 548 사이; 아미노산 위치 1 및 553 사이; 아미노산 위치 1 및 558 사이; 아미노산 위치 1 및 563 사이; 아미노산 위치 1 및 568 사이; 또는 아미노산 위치 1 및 573 사이의 임의의 아미노산 위치에 N-말단 단축; 및 아미노산 위치 726 및 957 사이; 아미노산 위치 731 및 957 사이; 아미노산 위치 736 및 957 사이; 아미노산 위치 741 및 957 사이; 아미노산 위치 746 및 957 사이; 아미노산 위치 751 및 957 사이; 또는 아미노산 위치 756 및 957 사이의 임의의 아미노산 위치에 C-말단 단축을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 본원에 개시된 단축형 콜라겐은 서열번호 31의 아미노산 위치 558에 N-말단 단축; 및 서열번호 31의 아미노산 위치 746에 C-말단 단축을 포함할 수 있다.

일부 경우, 본원에 기재된 바와 같은 단축형 콜라겐은 서열번호 32의 아미노산 위치 1 및 401 사이; 아미노산 위치 1 및 406 사이; 아미노산 위치 1 및 411 사이; 아미노산 위치 1 및 416 사이; 아미노산 위치 1 및 421 사이; 아미노산 위치 1 및 426 사이; 또는 아미노산 위치 1 및 431 사이의 임의의 아미노산 위치에 N-말단 단축을 포함할 수 있다. 일부 경우, 본원에 기재된 바와 같은 단축형 콜라겐은 서열번호 32의 아미노산 위치 585 및 1366 사이; 아미노산 위치 590 및 1366 사이; 아미노산 위치 595 및 1366 사이; 아미노산 위치 600 및 1366 사이; 아미노산 위치 605 및 1366 사이; 아미노산 위치 610 및 1366 사이; 아미노산 위치 615 및 1366 사이; 또는 아미노산 위치 620 및 1366 사이의 임의의 아미노산 위치에 C-말단 단축을 포함할 수 있다. 일부 경우, 본원에 기재된 바와 같은 단축형 콜라겐은 N-말단 단축 및 C-말단 단축 모두를 포함할 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 단축형 콜라겐은 서열번호 32의 아미노산 위치 1 및 401 사이; 아미노산 위치 1 및 406 사이; 아미노산 위치 1 및 411 사이; 아미노산 위치 1 및 416 사이; 아미노산 위치 1 및 421 사이; 아미노산 위치 1 및 426 사이; 또는 아미노산 위치 1 및 431 사이의 임의의 아미노산 위치에 N-말단 단축; 및 서열번호 32의 아미노산 위치 585 및 1366 사이; 아미노산 위치 590 및 1366 사이; 아미노산 위치 595 및 1366; 아미노산 위치 600 및 1366 사이; 아미노산 위치 605 및 1366 사이; 아미노산 위치 610 및 1366 사이; 아미노산 위치 615 및 1366 사이; 또는 아미노산 위치 620 및 1366 사이의 임의의 아미노산 위치에 C-말단 단축을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 본원에 제공된 바와 같은 단축형 콜라겐은 서열번호 32의 아미노산 위치 416에 N-말단 단축; 및 서열번호 32의 아미노산 위치 605에 C-말단 단축을 포함할 수 있다.

일부 경우, 본원에 기재된 바와 같은 단축형 콜라겐은 서열번호 32의 아미노산 위치 1 및 101 사이; 아미노산 위치 1 및 106 사이; 아미노산 위치 1 및 111 사이; 아미노산 위치 1 및 116 사이; 아미노산 위치 1 및 121 사이; 또는 아미노산 위치 1 및 126 사이의 임의의 아미노산 위치에 N-말단 단축을 포함할 수 있다. 일부 경우, 본원에 기재된 바와 같은 단축형 콜라겐은 서열번호 32의 아미노산 위치 276 및 1366 사이; 아미노산 위치 281 및 1366 사이; 아미노산 위치 286 및 1366 사이; 아미노산 위치 291 및 1366 사이; 아미노산 위치 296 및 1366 사이; 아미노산 위치 301 및 1366 사이; 또는 아미노산 위치 306 및 1366 사이의 임의의 아미노산 위치에 C-말단 단축을 포함할 수 있다. 일부 경우, 본원에 기재된 바와 같은 단축형 콜라겐은 N-말단 단축 및 C-말단 단축 모두를 포함할 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 단축형 콜라겐은 서열번호 32의 아미노산 위치 1 및 101 사이; 아미노산 위치 1 및 106 사이; 아미노산 위치 1 및 111; 아미노산 위치 1 및 116 사이; 아미노산 위치 1 및 121; 또는 아미노산 위치 1 및 126 사이의 임의의 아미노산 위치에 N-말단 단축; 및 서열번호 32의 아미노산 위치 276 및 1366 사이; 아미노산 위치 281 및 1366 사이; 아미노산 위치 286 및 1366 사이; 아미노산 위치 291 및 1366 사이; 아미노산 위치 296 및 1366 사이; 아미노산 위치 301 및 1366 사이; 또는 아미노산 위치 306 및 1366 사이의 임의의 아미노산 위치에 C-말단 단축을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 본원에 제공된 바와 같은 단축형 콜라겐은 서열번호 32의 아미노산 위치 111에 N-말단 단축; 및 서열번호 32의 아미노산 위치 291에 C-말단 단축을 포함할 수 있다.

일부 경우, 본원에 기재된 바와 같은 단축형 콜라겐은 서열번호 33의 아미노산 위치 16 및 240 사이; 아미노산 위치 16 및 245 사이; 아미노산 위치 16 및 250 사이; 아미노산 위치 16 및 255 사이; 아미노산 위치 16 및 260 사이; 아미노산 위치 16 및 265 사이; 아미노산 위치 6 및 255 사이; 아미노산 위치 11 및 255 사이; 아미노산 위치 21 및 255 사이; 아미노산 위치 26 및 255 사이; 아미노산 위치 31 및 255 사이; 아미노산 위치 21 및 250 사이; 아미노산 위치 21 및 245 사이; 아미노산 위치 26 및 250 사이; 아미노산 위치 26 및 245 사이; 아미노산 위치 31 및 250; 또는 아미노산 위치 31 및 245 사이의 임의의 아미노산 위치에 내부 단축을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 단축형 콜라겐은 서열번호 33의 아미노산 위치 16 및 255에 내부 단축을 포함할 수 있다.

일부 경우, 단축형 콜라겐은 하기 표 2에 제공된 임의의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 일부 경우, 단축형 콜라겐은 하기 표 2에 제공된 임의의 아미노산 서열로 구성될 수 있다. 일부 경우, 단축형 콜라겐은 하기 표 2에 제공된 임의의 아미노산 서열로 본질적으로 구성될 수 있다. 특정 구현예에서, 비자연 발생 콜라겐은 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 7, 서열번호 10, 서열번호 12, 서열번호 14, 서열번호 16, 서열번호 18, 서열번호 20, 서열번호 22, 서열번호 24, 서열번호 25, 서열번호 27, 및 서열번호 29 중 어느 하나의 아미노산 서열이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 단축형 콜라겐은 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 7, 서열번호 10, 서열번호 12, 서열번호 14, 서열번호 16, 서열번호 18, 서열번호 20, 서열번호 22, 서열번호 24, 서열번호 25, 서열번호 27, 및 서열번호 29 중 어느 하나와 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 98% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.

표 2. 단축형 콜라겐의 비제한적인 예

일부 경우, 단축형 콜라겐은 100 내지 300개 아미노산, 150 내지 250개 아미노산, 160 내지 250개 아미노산, 160 내지 220개 아미노산, 170 내지 200개 아미노산, 180 내지 190개 아미노산, 또는 185 내지 190 개 아미노산 길이일 수 있다.

일부 구현예에서, 비자연 발생 콜라겐은 분비 태그를 포함하는 아미노산 서열을 추가로 포함할 수 있다. 분비 태그는 콜라겐을 숙주 세포의 원형질막주위 공간으로 인도할 수 있다. 특정 구현예에서, 신호 펩타이드는 DsbA, PelB, OmpA, TolB, MalE, lpp, TorA, Hy1A, DegP, 또는 제2 분비 태그의 일부에 융합된 하나의 분비 태그의 일부를 포함하는 하이브리드 분비 태그로부터 유래된다. 일 양태에서, 분비 태그는 비자연 발생 콜라겐에 부착될 수 있다. 또 다른 양태에서, 분비 태그는 비자연 발생 콜라겐으로부터 단축될 수 있다.

일부 구현예에서, 비자연 발생 콜라겐은 히스티딘(또는 폴리히스티딘) 태그를 포함한다. 특정 구현예에서, 히스티딘 태그 또는 폴리히스티딘 태그는 콜라겐에 부착된 2 내지 20개의 히스티딘 잔기의 서열이거나 이를 포함한다. 다양한 구현예에서, 히스티딘 태그는 2 내지 20개의 히스티딘 잔기, 5 내지 15개의 히스티딘 잔기, 5 내지 18개의 히스티딘 잔기, 5 내지 16개의 히스티딘 잔기, 5 내지 15개의 히스티딘 잔기, 5 내지 14개의 히스티딘 잔기, 5 내지 13개의 히스티딘 잔기, 5 내지 12개의 히스티딘 잔기, 5 내지 11개의 히스티딘 잔기, 5 내지 10개의 히스티딘 잔기, 6 내지 12개의 히스티딘 잔기, 6 내지 11개의 히스티딘 잔기, 또는 7 내지 10개의 히스티딘 잔기를 포함한다. 히스티딘 태그는 니켈 기반 크로마토그래피 매질을 이용하는 크로마토그래피 방법에 의해 단백질의 정제에 유용할 수 있다. 예시적인 형광 단백질은 녹색 형광 단백질(GFP) 또는 적색 형광 단백질(RFP)을 포함한다. 형광 단백질은 당업계에 널리 알려져 있다. 일 구현예에서, 비자연 발생 콜라겐은 GFP 및/또는 RFP를 포함한다. 일 구현예에서, 수퍼폴더 GFP는 비자연 발생 콜라겐에 융합된다. 수퍼폴더 GFP는 불량하게 폴딩된 폴리펩타이드에 융합될 때에도 적절하게 폴딩되는 GFP일 수 있다. 일 양태에서, 히스티딘 태그는 비자연 발생 콜라겐에 부착될 수 있다. 또 다른 양태에서, 히스티딘 태그는 비자연 발생 콜라겐으로부터 단축될 수 있다.

일부 구현예에서, 비자연 발생 콜라겐은 프로테아제 단축 부위를 추가로 포함한다. 프로테아제 단축 부위는 재조합적으로 생산된 콜라겐을 단축하여 폴리펩타이드의 하나 이상의 부분을 제거하는 데 유용할 수 있다. 제거될 수 있는 폴리펩타이드의 부분은 분비 태그, 히스티딘 태그, 형광 단백질 태그, 및/또는 베타-락타마제를 포함한다. 프로테아제는 엔도프로테아제, 엑소프로테아제, 세린 프로테아제, 시스테인 프로테아제, 트레오닌 프로테아제, 아스파르틱 프로테아제, 글루타믹 프로테아제, 및 메탈로프로테아제를 포함할 수 있다. 예시적인 프로테아제 단축 부위는 트롬빈, TEV 프로테아제, 인자 Xa, 엔테로펩티다제, 및 라이노바이러스 3C 프로테아제에 의해 단축되는 아미노산을 포함한다. 일 양태에서, 단축 태그는 비자연 발생 콜라겐에 부착된다. 또 다른 양태에서, 단축 태그는 적절한 프로테아제에 의해 비자연 발생 콜라겐으로부터 제거된다.

일부 구현예에서, 비자연 발생 콜라겐은 베타-락타마제인 효소를 추가로 포함한다. 베타-락타마제는 선택 마커로서 유용할 수 있다. 일 양태에서, 베타-락타마제는 비자연 발생 콜라겐에 부착된다. 또 다른 양태에서, 베타-락타마제는 비자연 발생 콜라겐으로부터 단축된다.

본원에 제공된 하나 이상의 폴리펩타이드를 포함하는 (예컨대, 국소) 조성물 또는 제제가 본원의 특정 구현예에서 제공된다. 일부 구현예에서, 조성물은 임의의 적합한 양(예컨대, 개체 또는 세포에 제공되거나 투여될 때 이점을 제공하기에 적합한 양)과 같이 본원에 제공된 폴리펩타이드의 임의의 적합한 양을 제공한다. 일부 특정 구현예에서, 조성물은 개체의 피부에 (예컨대, 국소) 투여될 때 개체의 피부에 유익한 효과를 제공하기에 적합한 양을 포함한다. 특정 구현예에서, 조성물은 본원에 제공된 바와 같은 0.001% 내지 30% w/w의 폴리펩타이드(또는 비자연 발생 콜라겐)를 포함한다. 보다 특정 구현예에서, 조성물은 본원에 제공된 바와 같은 0.001% 내지 20% w/w의 폴리펩타이드(또는 비자연 발생 콜라겐), 본원에 제공된 바와 같은 0.001% 내지 10% w/w의 폴리펩타이드(또는 비자연 발생 콜라겐), 본원에 제공된 바와 같은 0.001% 내지 5% w/w의 폴리펩타이드(또는 비자연 발생 콜라겐), 본원에 제공된 바와 같은 0.001% 내지 2% w/w의 폴리펩타이드(또는 비자연 발생 콜라겐), 본원에 제공된 바와 같은 0.001% 내지 1% w/w의 폴리펩타이드(또는 비자연 발생 콜라겐), 본원에 제공된 바와 같은 0.001% 내지 0.5% w/w의 폴리펩타이드(또는 비자연 발생 콜라겐), 및 본원에 제공된 바와 같은 0.001% 내지 0.2% w/w의 폴리펩타이드(또는 비자연 발생 콜라겐)를 포함한다.

일 양태에서, 비자연 발생 콜라겐을 포함하는 조성물은 개인 관리 제품(예컨대, 화장품)일 수 있다. 일부 구현예에서, 조성물은 국소 투여용으로 제제화된다. 조성물은 인간 사용에 적합한 다른 화장품 성분을 함유할 수 있다. 개인 관리 제품은 인간 피부 또는 모발에 대한 자외선 손상을 예방하거나 치료하는 데 유용할 수 있다. 개인 관리 제품은 피부의 견고성, 탄력성, 명도, 보습, 촉각적 질감 또는 시각적 질감을 증가시키고/거나 콜라겐 생산을 자극하는 데 유용할 수 있다. 개인 관리 제품은 피부의 발적을 감소시키는 데 유용할 수 있다. 개인 관리 제품은 피부 또는 모발에 적용될 수 있다. 조성물은, 예를 들어, 마스크, 피부 클렌저, 예컨대 비누, 클렌징 크림, 클렌징 로션, 페이셜 클렌저, 클렌징 밀크, 클렌징 패드, 페이셜 워시, 페이셜 및 바디 크림 및 보습제, 페이셜 세럼, 페이셜 및 바디 마스크, 페이셜 토너 및 미스트, 아이 크림 및 아이 트리트먼트, 각질제거제, 립밤 및 립스틱, 헤어 샴푸, 헤어 컨디셔너 및 바디 샴푸, 헤어 및 두피 세럼, 헤어 미스트 및 스프레이, 아이 섀도우, 컨실러, 마스카라 및 다른 색조 화장품을 포함한다.

비자연 발생 콜라겐을 포함하는 조성물은 국소 담체 또는 보존제를 포함하는 적어도 하나의 추가 성분을 추가로 포함할 수 있다. 국소 담체는 리포솜, 생분해성 미세캡슐, 로션, 스프레이, 에어로졸, 더스팅 파우더, 생분해성 중합체, 미네랄 오일, 트리글리세라이드 오일, 실리콘 오일, 글리세린, 글리세린 모노스테아레이트, 알콜, 유화제, 액체 석유, 백색 바셀린, 프로필렌 글리콜, 폴리옥시에틸렌, 폴리옥시프로필렌, 왁스, 소르비탄 모노스테아레이트, 폴리소르베이트, 세틸 에스테르 왁스, 세테아릴 알콜, 2-옥틸도데칸올, 벤질 알콜, 사이클로메티콘, 사이클로펜타실록산 및 물로 이루어진 군으로부터 선택된 국소 담체를 포함할 수 있다. 보존제는 토코페롤, 디아이오도메틸-p-톨릴설폰, 2-브로모-2-니트로프로판-1,3-디올, 시스 이성질체 1-(3-클로로알릴)-3,5,7-트리아자-1-아조니아아다만탄 클로라이드, 글루타르알데히드, 4,4-디메틸 옥사졸리딘, 7-에틸바이사이클로옥사졸리딘, 페녹시에탄올, 부틸렌 글리콜, 1,2 헥산디올, 메틸 파라벤, 소르브산, 게르마벤 II(Germaben II), 로즈마리 추출물, 및 EDTA로 이루어진 군으로부터 선택된 보존제를 포함할 수 있다.

또한 본원의 특정 구현예에서, 피부 손상을 감소시키고, 손상된 피부의 회복을 촉진하고, UV 손상으로부터 피부를 보호하고/거나, 도시 분진에 대한 노출의 영향으로부터 피부 세포를 보호하는 방법이 제공된다. 또 다른 구현예에서, 피부의 견고성, 탄력성, 명도, 보습, 촉각적 질감, 또는 시각적 질감을 증가시키고/거나 콜라겐 생산을 자극하는 방법이 제공된다. 방법은 비자연 발생 콜라겐을 포함하는 조성물을 대상체의 피부에 적용하는 단계를 포함할 수 있다. 특정 이론이나 메커니즘에 구속되지 않고, 조성물에서의 콜라겐은 UV 손상으로부터 보호함으로써 피부 손상을 감소시킬 수 있다. 일부 경우, 조성물에서의 콜라겐은 세포의 생존율을 증가시킴으로써 손상된 피부의 회복을 촉진할 수 있다. 일부 경우, 조성물에서의 콜라겐은 피부에 적용될 때 프로콜라겐 합성을 증가시킴으로써, 및/또는 피부 세포의 생존율을 촉진함으로써, 피부 손상을 감소시키고/거나 세포의 회복을 촉진할 수 있다. 일부 경우, 콜라겐은 티민-티민(TT) 이량체 형성의 형성을 감소시킨다.

본원에 제공된 방법은 본원에 제공된 단계에 의해서와 같이, 방법에 표시된 처리를 위한 조성물의 용도를 포함한다. 구현예에서, 본 개시내용은 피부 손상을 감소시키고, 손상된 피부의 회복을 촉진하고, UV 손상으로부터 피부를 보호하고/거나, 도시 분진에 대한 노출의 영향으로부터 피부 세포를 보호하기 위한(예컨대, 본원에 제공된 조성물을 대상체의 피부에 투여함으로써와 같이) 방법에서 본원에 제공된 조성물(예컨대, 단축형 콜라겐 또는 단축형 콜라겐을 포함하는 제제)의 용도를 제공한다. 구현예에서, 본 개시내용은 피부의 견고성, 탄력성, 명도, 보습, 촉각적 질감, 또는 시각적 질감을 증가시키고/거나 콜라겐 생산을 자극하는 방법에서 본원에 제공된 조성물(예컨대, 단축형 콜라겐 또는 단축형 콜라겐을 포함하는 제제)의 용도를 제공한다.

일부 구현예에서, 본원에 제공된 바와 같은 단축형 콜라겐은 콜라겐 I형의 섬유아세포 및/또는 케라티노사이트 생산을 자극할 수 있다(예컨대, 실시예 4 및 실시예 6 참고). 일부 경우, 프로콜라겐 I형 C-펩타이드의 수준(콜라겐 생산에 대한 판독값)이 측정될 수 있다. 일부 경우, 시험관내 MatTek 전체 두께 인간 피부 조직 모델이 프로콜라겐 I형 C-펩타이드 수준을 평가하는 데 사용될 수 있다(예컨대, 실시예 6 참조). 일부 경우, 콜라겐 I형 수준은 효소-결합 면역흡착 분석(ELISA)에 의해 측정되거나 결정될 수 있다. 일부 경우, 본원에 제공된 바와 같은 단축형 콜라겐은 처리되지 않은 세포, 레티놀로 처리된 세포, 및/또는 비타민 B3으로 처리된 세포보다 더 높은 수준으로 콜라겐 I형의 생산을 자극할 수 있다.

일부 구현예에서, 본원에 제공된 바와 같은 단축형 콜라겐은 세포외 매트릭스 유전자의 섬유아세포 과발현을 자극할 수 있다(예컨대, 실시예 4 참고). 일부 경우, 세포외 매트릭스 유전자의 수준은 RNA 시퀀싱에 의해 측정될 수 있다. 일부 경우, 본원에 제공된 바와 같은 단축형 콜라겐은 콜라겐 I형 유전자(COL1A), 엘라스틴 유전자(ELN), 및 피브로넥틴 유전자(FN1) 중 하나 이상의 섬유아세포 과발현을 자극할 수 있다. 일부 경우, 본원에 제공된 단축형 콜라겐으로 처리된 섬유아세포에 의해 생산된 세포외 매트릭스 유전자의 수준은 처리되지 않은 섬유아세포, 또는 레티놀로 처리된 섬유아세포보다 더 높은 수준일 수 있다. 일부 경우, 본원에 제공된 단축형 콜라겐으로 처리된 섬유아세포에 의해 생산된 세포외 매트릭스 유전자의 수준은 비타민 C로 처리된 섬유아세포와 유사하거나 더 높을 수 있다.

일부 구현예에서, 본원에 제공된 바와 같은 단축형 콜라겐은 UVB 광으로 조사된 케라티노사이트의 염증을 감소시킬 수 있다(예컨대, 실시예 4 및 실시예 6 참고). 일부 경우, 케라티노사이트는 UVB 광으로 조사된 다음, 본원에 제공된 바와 같은 단축형 콜라겐으로 처리될 수 있다. 일부 경우, 염증은 UVB 조사된 케라티노사이트에 의해 생산된 IL-1α의 수준을 측정함으로써(예컨대, ELISA에 의해) 측정될 수 있다. 일부 경우, UVB 조사된 케라티노사이트는 처리되지 않은 케라티노사이트보다 본원에 제공된 단축형 콜라겐으로 처리될 때 더 낮은 수준의 IL-1α를 생산할 수 있다.

일부 구현예에서, 본원에 제공된 바와 같은 단축형 콜라겐은 UVB 광으로 조사된 케라티노사이트의 생존율을 증가시킬 수 있다(예컨대, 실시예 4 참고). 일부 경우, 케라티노사이트는 본원에 제공된 단축형 콜라겐으로 전처리(UVB 조사 전) 및 후처리(UVB 조사 후)될 수 있다. 일부 경우, 세포 생존율은 MTT 대사 비색 분석을 사용하여 측정될 수 있다. 일부 경우, 본원에 제공된 단축형 콜라겐으로 처리된 케라티노사이트는 처리되지 않은 케라티노사이트보다 UVB 조사 후에 더 큰 세포 생존율을 나타낼 수 있다.

일부 구현예에서, 본원에 제공된 바와 같은 단축형 콜라겐은 UVB 광에 노출 후 케라티노사이트에서 DNA 손상을 감소시킬 수 있다(예컨대, 실시예 6 참고). 일부 경우, DNA 손상은 티민 이량체(TT-이량체)의 수준을 측정함으로써 평가될 수 있다. 비제한적인 예에서, OxiSelect UV 유도된 DNA 손상 ELISA 키트는 TT-이량체 수준을 측정하는 데 사용될 수 있다. 일부 경우, 본원에 제공된 단축형 콜라겐으로 처리된 UVB 조사된 케라티노사이트는 처리되지 않은 케라티노사이트보다 더 낮은 수준의 TT-이량체를 나타낼 수 있다.

일부 구현예에서, 본원에 제공된 바와 같은 단축형 콜라겐은 항산화 능력을 가질 수 있다(예컨대, 실시예 4 및 실시예 6 참고). 일부 경우, 산소 라디칼 흡수 능력(oxygen radical absorbance capacity, ORAC) 분석은 단축형 콜라겐의 산화 능력을 측정하는 데 사용될 수 있다. 비제한적인 예에서, 0.1% 용액 형태의 단축형 콜라겐은 적어도 10 μM 트롤록스(Trolox, 비타민 E) 당량(TE), 적어도 50 μM TE, 적어도 100 μM TE, 적어도 150 μM TE, 적어도 160 μM TE, 적어도 170 μM TE, 적어도 180 μM TE, 적어도 190 μM TE, 또는 적어도 200 μM TE의 항산화 특성을 가질 수 있다.

일부 구현예에서, 본원에 제공된 바와 같은 단축형 콜라겐은 처리되지 않은 세포와 비교하여 도시 분진 오염에 노출된 케라티노사이트의 세포 생존율을 증가시킬 수 있다(예컨대, 실시예 6 참고). 일부 경우, 세포 생존율은 MTT 대사 비색 분석에 의해 측정될 수 있다.

일부 구현예에서, 본원에 제공된 단축형 콜라겐을 대상체의 얼굴에 국소 투여하는 것은 기저선과 비교하여 처리 후 1주, 2주, 4주, 8주 이상에 얼굴 피부 탄력성 증가를 초래할 수 있다(예컨대, 실시예 5 및 실시예 7 참고). 일부 경우, 얼굴 피부 탄력성은 큐토미터에 의해 측정될 수 있다.

일부 구현예에서, 본원에 제공된 단축형 콜라겐을 대상체의 얼굴에 국소 투여하는 것은 기저선과 비교하여 처리 후 1주, 2주, 4주, 8주 이상에 얼굴 피부 콜라겐 함량의 증가를 초래할 수 있다(예컨대, 실시예 5 참고). 일부 경우, 얼굴 피부 콜라겐 함량은 시아스코프(SIAscope)에 의해 측정될 수 있다.

일부 구현예에서, 본원에 제공된 단축형 콜라겐의 국소 투여는 기저선과 비교하여 처리 후 1주, 2주, 4주, 8주 이상에 얼굴 피부 발적(홍반)의 감소를 초래할 수 있다(예컨대, 실시예 5 참고). 일부 경우, 얼굴 피부 발적(홍반)은 맹검 임상 채점자에 의해 채점될 수 있다(예컨대, 표 4에 제공된 바와 같은 5점 순서 척도를 사용하여).

일부 구현예에서, 본원에 제공된 단축형 콜라겐의 국소 투여는 기저선과 비교하여 처리 후 1주, 2주, 4주, 8주 이상에 얼굴 주름의 감소를 초래할 수 있다(예컨대, 실시예 5 참고). 일부 경우, 얼굴 주름은 맹검 임상 채점자에 의해 채점될 수 있다.

일부 구현예에서, 본원에 제공된 단축형 콜라겐의 국소 투여는 기저선과 비교하여 처리 후 1주, 2주, 4주, 8주 이상에 얼굴 피부 수분 증가를 초래할 수 있다(예컨대, 실시예 7 참고). 일부 경우, 본원에 제공된 단축형 콜라겐의 국소 투여는 해양 콜라겐의 국소 투여와 비교하여 얼굴 피부 수분 증가를 초래할 수 있다. 일부 경우, 피부 보습은 코르네오미터(corneometer)에 의해 측정될 수 있다.

본 개시내용의 일 양태는 비자연 발생 콜라겐을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다. 폴리뉴클레오타이드는 해파리 또는 인간으로부터의 콜라겐을 코딩할 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는 전장 또는 단축형 콜라겐을 코딩할 수 있다. 다양한 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 11, 서열번호 13, 서열번호 15, 서열번호 17, 서열번호 19, 서열번호 21, 서열번호 23, 서열번호 26, 서열번호 28, 또는 서열번호 30 중 어느 하나에 따른 폴리뉴클레오타이드, 또는 이의 상동체(예컨대, 이와 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 98% 서열 동일성을 가짐)를 포함할 수 있다. 일부 경우, 폴리뉴클레오타이드는 코돈 최적화될 수 있다(예컨대, 숙주 세포에서의 발현을 위해).

또 다른 양태에서, 본 개시내용은 콜라겐 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다. 콜라겐 융합 단백질은 콜라겐과 함께 분비 태그, 히스티딘 태그, 형광 단백질 태그, 프로테아제 단축 부위, 베타-락타마제 및/또는 GEK 아미노산 삼량체 반복 및/또는 GDK 아미노산 삼량체 반복을 포함할 수 있다.

일 양태에서, 콜라겐 코딩 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터는 숙주 세포를 형질전환하고 폴리뉴클레오타이드를 발현하는 데 사용될 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는 숙주 유기체를 선택제의 존재 하에 성장시키는 효소를 코딩하는 핵산을 추가로 포함할 수 있다. 선택제는 갈락토스 함유 당을 포함하는 당 또는 암피실린, 히그로마이신, G418 등을 포함하는 항생제를 포함할 수 있다. 선택제에 내성을 부여하는 데 사용될 수 있는 효소는 β-갈락토시다제 또는 β-락타마제를 포함한다.

일 양태에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드를 발현하는 숙주 세포가 제공된다. 숙주 세포는 그람 음성 박테리아 세포, 그람 양성 박테리아 세포, 효모 세포, 곤충 세포, 포유동물 세포, 식물 세포, 또는 외인성 폴리뉴클레오타이드를 발현하는 데 사용되는 임의의 다른 세포를 포함하는 임의의 숙주 세포일 수 있다. 예시적인 그람 음성 숙주 세포는 E. coli이다.

탄소, 질소, 및 무기 포스페이트 공급원 외에 임의의 바람직하거나 필요한 보충제는 또한 단독으로서 또는 복합 질소 공급원과 같은 또 다른 보충제 또는 배지와의 혼합물로서 적절한 농도로 포함될 수 있다. 특정 구현예에서, 배지는 염화 암모늄, 황산 암모늄, 염화 칼슘, 카사미노산, 황산 철(II), 황산 마그네슘, 펩톤, 인산 칼륨, 염화 나트륨, 인산 나트륨, 및 효모 추출물로부터 선택된 하나 이상의 성분을 추가로 포함한다.

베타-락타마제는 원핵 세포에서 락탐 항생제에 대한 내성을 부여하는 효소이다. 전형적으로 베타-락타마제가 박테리아 숙주 세포에서 발현될 때, 발현된 베타-락타마제 단백질은 또한 베타-락타마제 단백질을 원형질막주위 공간으로 유도하는 표적화 서열(분비 태그)을 포함한다. 베타-락타마제는 이들이 원형질막주위 공간으로 운반되지 않는 한 기능하지 않는다. 효소를 원형질막주위 공간으로 표적화하는 독립적인 분비 태그를 사용하지 않고 원형질막주위 공간에 표적화된 베타-락타마제가 제공된다. 원형질막주위 분비 태그가 GFP, 콜라겐, 또는 GFP/콜라겐 키메라와 같은 단백질의 N-말단에 추가된 융합 단백질을 생성함으로써, 천연 분비 태그가 없는 베타-락타마제의 기능성은 N-말단 융합 단백질의 완전한 번역 및 분비를 선택하는 데 사용될 수 있다. 이 접근법을 사용하여, DsbA-GFP-콜라겐-베타-락타마제 융합은 번역 및 분비를 선호하는 표적 콜라겐에서 단축 생성물을 선택하는 데 사용될 수 있다.

또 다른 구현예는 본원에 제공된 바와 같은 폴리펩타이드(또는 비자연 발생 콜라겐)를 생산하는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 방법은 배양 배지에 폴리펩타이드 또는 "콜라겐"을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 숙주 세포를 접종하는 단계, 숙주 세포를 배양하는 단계, 및 숙주 세포로부터 폴리펩타이드(또는 비자연 발생 콜라겐)를 단리하는 단계를 포함한다.

폴리펩타이드(또는 단백질)의 발효 제조 방법이 제공된다. 방법은

(a) 재조합 그람 음성 박테리아 세포를 마그네슘 염을 포함하는 배지에서 배양하는 단계로서, 배지 내의 마그네슘 이온의 농도는 적어도 약 6 mM이고, 박테리아 세포는 단백질을 코딩하는 외인성 유전자를 포함하는 것인 단계;

(b) 배지로부터 단백질을 채취하는 단계

를 포함한다.

박테리아는 표적 단백질을 생산하기 위해 임의의 적합한 방식으로, 예컨대, 예를 들어, WO 제05/021772호에 기재된 바와 같이 연속적으로 또는 배치 공정(배치 배양)으로 또는 유가 또는 반복된 유가 공정으로 불연속적으로 배양될 수 있다. 일부 구현예에서, 단백질 생산은 대규모로 수행된다. 다양한 대규모 발효 절차는 재조합 단백질의 생산에 이용가능하다. 대규모 발효는 적어도 1,000 리터의 용량, 바람직하게는 약 1,000 내지 100,000 리터의 용량을 갖는다. 일부 경우, 발효기는 교반기 임펠러를 사용하여 산소 및 영양소, 특히 글루코스(바람직한 탄소/에너지원)를 분배한다. 소규모 발효는 일반적으로 부피 용량이 대략 20 리터 이하인 발효기에서의 발효를 지칭한다.

표적 단백질의 축적을 위해, 숙주 세포는 표적 단백질의 축적에 충분한 조건 하에서 배양될 수 있다. 이러한 조건은, 예컨대, 세포에 의한 단백질 발현 및 축적을 허용하는 온도, 영양소, 및 세포 밀도 조건을 포함한다. 더욱이, 이러한 조건은 당업자에게 공지된 바와 같이, 세포가 전사, 번역, 및 단백질을 하나의 세포 구획으로부터 분비된 단백질을 위한 또 다른 구획으로 통과시키는 기본적인 세포 기능을 수행할 수 있는 조건일 수 있다.

임의의 적합한 박테리아 세포가 본원에 제공된 방법에서 선택적으로 이용된다. 박테리아 세포는 임의의 적합한 온도에서 배양될 수 있다. 특정 구현예에서, 박테리아 세포는 E. coli 세포이다. E. coli 성장을 위해, 예를 들어, 전형적인 온도는 약 20℃ 내지 약 39℃의 범위이다. 일 구현예에서, 온도는 약 20℃ 내지 약 37℃의 범위이다. 또 다른 구현예에서, 온도는 약 30℃이다. 일 구현예에서, 전환되지 않은 상태 또는 전환된 상태의 숙주 세포는 하나의 온도에서 배양되고 상이한 온도로 전환되어 단백질 생산을 유도할 수 있다. 숙주 세포는 세포를 증식시키기 위해 먼저 하나의 온도에서 배양된 다음, 단백질 생산을 유도하기 위해 세포는 더 낮은 온도에서 배양될 수 있다. 첫 번째 온도는 약 23℃, 24℃, 25℃, 26℃, 27℃, 28℃, 29℃, 30℃, 31℃, 32℃, 33℃, 34℃, 35℃, 36℃ 또는 37℃일 수 있다. 두 번째 온도는 약 20℃, 21℃, 22℃, 23℃, 24℃, 25℃, 26℃, 27℃, 28℃, 29℃, 30℃, 31℃, 32℃, 33℃, 34℃, 35℃ 또는 36℃일 수 있다. 두 번째 온도에서의 배양은 1시간 및 100시간 사이, 5시간 및 90시간 사이, 5시간 및 80시간 사이, 5시간 및 80시간 사이, 5시간 및 70시간, 10시간 및 70시간 사이, 15시간 및 70시간 사이, 15시간 및 65시간 사이, 15시간 및 60시간 사이, 20시간 및 60시간 사이, 20시간 및 55시간 사이, 20시간 및 50시간 사이, 24시간 및 50시간 사이, 24시간 및 48시간 사이, 30시간 및 50시간 사이, 30시간 및 45시간 사이, 또는 30시간 및 40시간 사이에서 수행될 수 있다.

배양 배지의 pH는 주로 숙주 유기체에 따라 약 5-9의 임의의 pH일 수 있다. E. coli의 경우, pH는 약 6.0 내지 약 7.4, 약 6.2 내지 약 7.2, 약 6.2 내지 약 7.0, 약 6.2 내지 약 6.8, 약 6.2 내지 약 6.6, 약 6.4 또는 약 6.5일 수 있다.

유전자 발현의 유도를 위해, 전형적으로 세포는 특정 광학 밀도, 예컨대, 약 1.1의 OD600이 달성될 때까지 배양될 수 있고, 이 시점에 유도가 시작되어(예컨대, 유도제의 첨가에 의해, 억제제, 저해제, 또는 배지 성분의 고갈에 의해 등) 표적 단백질을 코딩하는 외인성 유전자의 발현을 유도한다. 일부 구현예에서, 외인성 유전자의 발현은, 예컨대, 이소프로필-β-d-1-티오갈락토피라노사이드, 락토스, 아라비노스, 말토스, 테트라사이클린, 안하이드로테트라사이클린, 바브리신(vavlycin), 자일로스, 구리, 아연 등으로부터 선택된 유도제에 의해 유도될 수 있다. 유전자 발현의 유도는 또한 발효 동안 용존 산소 수준을 감소시킴으로써 달성될 수 있다. 세포 증식 동안 발효의 용존 산소 수준은 10% 내지 30%일 수 있다. 유전자 발현을 유도하기 위해, 용존 산소 수준은 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 또는 0% 미만으로 감소될 수 있다. 생리학적 상태 또는 전환된 상태의 숙주 세포에서, 단백질 생산은 본원에 개시된 바와 같은 발효의 온도를 낮춤으로써 유도될 수 있다.

실시예

실시예 1. 단축형 콜라겐의 생산

240개의 내부 아미노산의 단축(전장 해파리 콜라겐(서열번호 33)에 비해)을 갖는 해파리 콜라겐을 코딩하는, E. coli에서의 발현에 최적화된, 코돈 최적화된 DNA 서열을 합성하고 발현하였다. DNA 서열이 하기 서열번호 1에 나타나 있다. 서열번호 1에서, DsbA 분비 태그는 뉴클레오타이드 1-72에 의해 코딩되고, 서열번호 2의 아미노산 1-24를 코딩한다. 9개의 히스티딘 잔기를 포함하는 히스티딘 태그는 서열번호 1의 뉴클레오타이드 73-99에 의해 코딩되고, 서열번호 2의 아미노산 25-33을 코딩한다. 링커는 서열번호 1의 뉴클레오타이드 100-111에 의해 코딩되고 서열번호 2의 아미노산 34-37을 코딩한다. 트롬빈 단축 부위는 서열번호 1의 뉴클레오타이드 112-135에 의해 코딩되고, 서열번호 2의 아미노산 38-45를 코딩한다. 단축형 콜라겐은 서열번호 1의 뉴클레오타이드 136-822에 의해 코딩되고, 서열번호 2의 아미노산 46-274를 코딩한다.

단축형 콜라겐은 전장 해파리 콜라겐(서열번호 33)의 대략 54%이고, 하기 서열번호 2에 개시되어 있다.

DsbA 분비 태그, 히스티딘 태그, 링커 및 트롬빈 단축 부위가 없는 단축형 해파리 콜라겐을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드가 서열번호 3에 개시되어 있다.

DsbA 분비 태그, 히스티딘 태그, 링커 및 트롬빈 단축 부위가 없는 단축형 해파리 콜라겐 아미노산 서열이 서열번호 4에 개시되어 있다.

서열번호 1의 폴리뉴클레오타이드를 코돈 최적화하고, Gen9 DNA(현재 Ginkgo Bioworks) 내부 합성에 의해 합성하였다. pET28 벡터 및 서열번호 1 사이의 오버랩은 30 내지 40 bp 길이로 설계되었고, 효소 PrimeSTAR® GXL 중합효소(www.clontech.com/US/Products/PCR/GC_Rich/PrimeSTAR_GXL_DNA_Polymerase?sitex=10020:22372:US)를 사용한 PCR을 사용하여 첨가되었다. 이후, 개방된 pET28a 벡터 및 삽입 DNA(서열번호 1)를 SGI Gibson Assembly®(us.vwr.com/store/product/17613857/gibson-assembly-hifi-1-step-kit-synthetic-genomics-inc)를 사용하여 최종 플라스미드로 함께 조립하였다. 이후, 플라스미드 서열을 Eurofins Genomics(www.eurofinsgenomics.com)를 통한 Sanger 시퀀싱을 통해 확인하였다.

형질전환된 세포를 최소 배지에서 배양하고, 50:50의 세포 대 글리세롤의 비율로 글리세롤과 함께 1.5 ml 분취물로 동결시켰다. 이 동결된 배양물의 하나의 바이알을 37℃, 200 rpm에서 밤새 50 ml의 최소 배지에서 회복시켰다. 세포를 300 ml의 최소 배지로 옮기고, 6-9시간 동안 성장시켜 5-10의 OD600에 도달시켰다.

생물반응기를 2.7 L의 최소 배지 + 글루코스로 준비하고, 300 ml의 OD600의 5-10 배양물을 첨가하여 출발 부피를 3 L로 조정하였다. 교반, 공기, 및 산소를 함유하는 캐스캐이드를 사용하여 용존 산소를 20% 포화로 유지하면서 세포를 28℃, pH 7에서 성장시켰다. pH는 28% w/w 수산화 암모늄 용액을 사용하여 제어하였다. 40 g/L의 초기 볼루스가 13시간쯤에 고갈되면 DO-stat 기반 공급 알고리즘을 사용하여 유가 방식으로 발효를 실행하였다. 24-26시간의 초기 성장 후, OD600은 100 초과에 도달하였다. 이 시점에서, 300 mL의 500 g/L 수크로스를 첨가하고, 온도를 25℃로 낮추었다. 1 mM IPTG를 사용하여 단백질 생산을 위해 고밀도 배양을 유도하였다. 발효를 추가 20-24시간 동안 지속하고, 60분 동안 9000 rcf, 15℃에서 벤치 탑 원심분리를 사용하여 세포를 채취하였다. 원심분리로부터 회수된 세포 펠렛을 2x 완충제 대 1x 세포의 중량 대 중량 비율로 pH 8에서 0.5 M NaCl 및 0.1 M KH2PO4를 함유하는 완충제에 재현탁시켰다.

채취된 세포를 2회 통과로 14,000 psi 압력에서 균질화기에서 파괴하였다. 생성된 슬러리는 다른 단백질과 함께 콜라겐 단백질을 함유하였다.

발효를 25℃ 내지 28℃ 범위의 다양한 온도에서 수행하였다. 일부 발효의 경우, 발효 온도를 일정한 온도로 유지시키고, 발효가 완료된 직후(5-10의 OD600) 콜라겐을 정제하였다. 다른 발효의 경우, 발효 온도를 원하는 시간 동안 유지시키고, 5-10의 OD600의 세포 밀도에 도달하면, 온도를 낮추어 단백질 생산을 유도하였다. 전형적으로, 온도를 28℃에서 25℃로 낮추었다. 25℃에서의 발효를 40-60시간 동안 지속한 후, 콜라겐을 단리하였다.

콜라겐은 균질화된 세포 브로쓰의 산 처리에 의해 정제되었다. 또한, 산 처리는 원심분리 및 상기 기재된 완충제에 재현탁 후 생물반응기로부터 회수된 비균질화된 전체 세포에서 수행되었다. 균질화된 슬러리 또는 재현탁된 전체 세포의 pH를 6 M 염산을 사용하여 pH 3으로 낮추었다. 산성화된 세포 슬러리를 혼합하면서 4℃에서 밤새 인큐베이션한 다음, 원심분리하였다. 산성화된 슬러리의 상층액을 폴리아크릴아미드 겔에서 시험하였고 출발 펠렛과 비교하여 상대적으로 높은 양의 콜라겐을 함유하는 것으로 밝혀졌다. 이렇게 수득된 콜라겐 슬러리는 염이 높았다. 부피 및 염을 감소시키기 위해, 각각 0.1 m2의 한외여과 카세트를 갖는 EMD 밀리포어 접선 유동 여과 시스템(Millipore Tangential Flow Filtration system)을 사용하여 농축 및 정용여과 단계를 수행하였다. 총 여과 면적은 2개의 카세트를 동시에 사용하여 0.2 m2이다. TFF 단계에서 5x의 부피 감소 및 19x의 염 감소가 달성되었다. 최종 콜라겐 슬러리를 SDS-PAGE 겔에서 러닝시켜 콜라겐의 존재를 확인하였다. 이 슬러리를 다중-트레이 동결건조기를 사용하여 3일 동안 건조시켜 흰색의 푹신한 콜라겐 분말을 수득하였다.

균질화된 세포 브로쓰 또는 비균질화된 세포로부터 수득된 정제된 단축형 콜라겐을 SDS-PAGE 겔 상에서 분석하였고, 두껍고 분명한 밴드가 27 킬로달톤의 예상된 크기에서 관찰되었다. 정제된 콜라겐을 또한 질량분석법에 의해 분석하였고, 27 킬로달톤 단백질이 해파리 콜라겐인 것으로 확인되었다.

전장 및 단축형 콜라겐의 대안적인 정제 방법이 하기에 제공되어 있다.

발효 브로쓰를 0.3-0.5% w/v의 폴리 에틸이민(PEI)과 혼합하였다. PEI와 15분 인큐베이션 후, 발효 브로쓰를 9000 rcf에서 15분 동안 원심분리하여 콜라겐 단백질을 함유한 상층액을 회수하였다. 세포를 함유하는 펠렛을 버리고, PEI 처리된 콜라겐 함유 상층액을 나트륨 벤토나이트(0.2% 최종 w/v)(Wyopure®, Wyoming Bentonite)와 혼합하고 원심분리하였다. 벤토나이트 함유 펠렛을 버리고, 상층액을 회수하였다.

벤토나이트 처리된 상층액을 5 kDa 카세트를 사용한 접선 유동 여과 시스템(TFF)(EMD Millipore) 상에서 3-6배로 농축시켰다. 콜라겐은 투과물 스트림에서 거의 손실 없이 유지되었다. 염을 제거하기 위해, 농축 단계로부터의 잔류물을 동일한 TFF 설정을 사용하여 정용여과하였다. 단백질 용액의 최종 전도도는 < 10 밀리시멘스(milliSiemens)였다. 전형적인 전도도는 400 마이크로시멘스 내지 1.5 밀리시멘스였다. 고농축된 콜라겐 용액은 4 밀리시멘스에 가까운 더 높은 전도도를 가지고 있었다. 당업자는 콜라겐의 농도에 따라 10 밀리시멘스보다 높은 전도도가 관찰될 수 있음을 이해할 것이다. 다음으로, 탈염 및 농축된 단백질을 W-L 9000 10 x 40 과립화된 수지(Carbon Activated Corporation)를 사용하여 활성탄으로 처리하였다. 5% w/v의 탄소 수지를 콜라겐 함유 단백질 공급물과 혼합하고, 가볍게 교반하면서 45-50℃에서 혼합하였다. 탄소 처리된 슬러리를 규조토(Sigma Aldrich)와 같은 여과 보조제의 존재 또는 부재하에 에르텔 필터 프레스 패드 M-953(Ertel Filter Press Pad M-953, Ertel Alsop)를 댄 부흐너(Buchner) 깔대기를 사용하여 여과하였다. 여과 후, 콜라겐 용액을 0.2 마이크론 필터를 통해 여과한 후 나트륨 벤토나이트(0.2% w/v 최종)(Wyopure®, Wyoming Bentonite)로 1 내지 몇 시간 처리하고, 9000 rcf에서 15-30분 동안 원심분리하여 매우 순수하고, 투명하며, 미립자가 없는 콜라겐 용액을 수득하였다. 내독소 단백질의 제거를 원하는 경우, 단백질을 Sartobind-Q(Sartorius-Stedim)와 같은 크로마토그래피 필터를 통과시켜 내독소 단백질을 특이적으로 제거하였다.

정제된 콜라겐을 SDS-PAGE 겔에서 분석하였고, 두껍고 분명한 밴드가 30 킬로달톤에서 관찰되었다. 크기의 상향 이동은 콜라겐 분자의 구조 및 높은 글리신/프롤린 아미노산 함량 때문이다. 정제된 콜라겐을 또한 질량 분석법에 의해 분석하였고, 30 킬로달톤 단백질은 단축형 콜라겐인 것으로 확인되었다.

단축형 콜라겐을 Agilent 1100 시리즈 HPLC를 사용하여 HPLC에 의해 추가로 분석하였다. 컬럼은 4.6 mm의 내부 직경, μM 입자 크기 및 1000 옹스트롬 공극 크기를 갖는 50 mm Agilent PLRP-S 역상 컬럼이었다.

샘플을 HPLC 등급수 중의 0.04% 아지드화 나트륨 용액에 1:1 희석함으로써 제조하였다. 희석 후, 생성된 혼합물을 0.45 μm 필터를 통해 여과하여 HPLC 컬럼을 막을 수 있는 임의의 큰 입자를 제거하였다. 분석을 위해, 샘플을 약 4.5의 pH에서 HPLC 등급수 중의 20 mM 아세트산 암모늄으로 적절하게 희석한다. 샘플을 혼합한 후, 300 μL 마이크로바이알로 옮긴 다음, 이를 오토샘플러에 넣었다. HPLC를 작동시키는 소프트웨어인 ChemStation을 사용하여, 샘플 유속, 컬럼 온도, 이동상 유속, 이동상 조성 등과 같은 분석 파라미터를 변경할 수 있다. 한 가지 예시적이지만 비제한적인 분석에서, 파라미터는 1 mL/분의 샘플 유속, 80℃의 컬럼 온도, 60-70 bar의 컬럼 압력, 0.2% 트리플루오로아세트산을 갖는 97.9% 물/1.9% 아세토니트릴의 이동상 조성; 214.4 nm의 분석용 UV 파장, 10 μL의 주입 부피, 및 10분의 샘플 실행 시간이었다.

이러한 조건 하에서, 서열번호 5의 단축형 해파리 콜라겐은 약 5.4분의 용리 시간을 갖는다. ChemStation은 용리 피크의 피크 면적을 정량화하고 피크 면적을 단백질 농도와 직접 관련시키는 보정 곡선을 사용하여 단백질 농도를 계산한다. 보정 곡선은 0.06 mg/mL 내지 1.00 mg/mL의 콜라겐 농도 범위를 함유하도록 연속 희석된 공지된 콜라겐 용액을 사용하여 생성된다.

His 태그-링커-트롬빈 단축 부위가 없는 단축형 콜라겐

His 태그, 링커, 및 트롬빈 단축 부위가 없는 단축형 해파리 콜라겐이 하기에 개시되어 있다. 이 콜라겐을 코딩하는 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열이 서열번호 6에 제공되어 있다. 아미노산 서열은 서열번호 7에 개시되어 있다. DsbA 분비 태그는 서열번호 6의 뉴클레오타이드 1-72에 의해 코딩되며, 서열번호 7의 아미노산 1-24를 코딩한다. 단축형 콜라겐 서열은 서열번호 6의 뉴클레오타이드 73-639에 의해 코딩되며, 서열번호 7의 아미노산 25-213을 코딩한다.

His 태그, 링커 및 트롬빈 단축 부위가 없는 단축형 해파리 콜라겐을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드가 서열번호 8에 개시되어 있다.

His 태그, 링커, 및 트롬빈 단축 부위가 없는 단축형 해파리 콜라겐이 서열번호 5에 개시되어 있다.

DsbA 분비 태그-His 태그-링커-트롬빈 단축 부위 및 GFP 베타- 락타마제 융합을 갖는 단축형 콜라겐(버전 1):

DsbA 분비 태그-His 태그-링커-트롬빈 단축 부위 및 GFP 베타-락타마제 융합을 갖는 해파리 콜라겐이 하기에 개시되어 있다. 이 콜라겐을 코딩하는 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열이 서열번호 9에 제공되어 있다. 아미노산 서열은 서열번호 10에 개시되어 있다. DsbA 분비 태그는 서열번호 9의 뉴클레오타이드 1-72에 의해 코딩되며, 서열번호 10의 아미노산 1-24를 코딩한다. His 태그는 서열번호 9의 뉴클레오타이드 73-99에 의해 코딩되며, 서열번호 10의 아미노산 25-33의 9개의 히스티딘 태그를 코딩한다. 링커는 서열번호 9의 뉴클레오타이드 100-111에 의해 코딩되며, 서열번호 10의 아미노산 34-37을 코딩한다. 트롬빈 단축 부위는 서열번호 9의 뉴클레오타이드 112-135에 의해 코딩되며, 서열번호 10의 아미노산 38-45를 코딩한다. 링커를 갖는 녹색 형광 단백질(GFP)은 서열번호 9의 뉴클레오타이드 136-873에 의해 코딩되며, 서열번호 10의 아미노산 46-291을 코딩한다. 단축형 콜라겐 서열은 서열번호 9의 뉴클레오타이드 874-1440에 의해 코딩되며, 서열번호 10의 아미노산 292-480을 코딩한다. 링커를 갖는 베타-락타마제는 서열번호 9의 뉴클레오타이드 1441-2232에 의해 코딩되며, 서열번호 10의 아미노산 481-744를 코딩한다. 베타-락타마제는 폴리펩타이드가 독립적인 분비 태그를 갖지 않았음에도 불구하고 원형질막주위 공간에 적절하게 표적화되었다. DsbA 분비 태그는 전체 전사체(DsbA 분비 태그-His 태그-링커-트롬빈 단축 부위 및 GFP 베타-락타마제 융합 단백질을 갖는 단축형 콜라겐)를 원형질막주위 공간으로 인도하였고, 베타-락타마제는 적절하게 기능하였다.

서열번호 9의 폴리뉴클레오타이드를 여러 개의 DNA 단편을 조립하여 제작하였다. 콜라겐 함유 서열을 코돈 최적화하고 Gen9 DNA(현재 Ginkgo Bioworks) 내부 합성에 의해 합성하였다. GFP를 또한 Gen9에 의해 합성하였다. 베타-락타마제를 효소 PrimeSTAR® GXL 중합효소(www.clontech.com/US/Products/PCR/GC_Rich/PrimeSTAR_GXL_DNA_Polymerase?sitex=10020:22372:US)를 갖는 PCR을 사용하여 플라스미드 pKD46(cgsc2.biology.yale.edu/Strain.php?ID=68099)으로부터 합성하였다. pET28 벡터, GFP, 콜라겐, 및 베타-락타마제 사이의 오버랩은 30 내지 40 bp 길이로 설계되었고, 효소 PrimeSTAR® GXL 중합효소를 갖는 PCR을 사용하여 추가되었다. 이후, 개방된 pET28a 벡터 및 삽입물을 SGI Gibson Assembly®(us.vwr.com/store/product/17613857/gibson-assembly-hifi-1-step-kit-synthetic-genomics-inc)를 사용하여 최종 플라스미드로 함께 조립하였다. 이후, 플라스미드 서열을 Eurofins Genomics(www.eurofinsgenomics.com)를 통한 Sanger 시퀀싱을 통해 확인하였다.

형질전환된 세포를 최소 배지에서 배양하고, 50:50의 세포 대 글리세롤의 비율로 글리세롤과 함께 1.5 ml 분취물로 동결시켰다. 이 동결된 배양물의 하나의 바이알을 37℃, 200 rpm에서 밤새 50 ml의 최소 배지에서 회복시켰다. 세포를 300 ml의 최소 배지로 옮기고, 6-9시간 동안 성장시켜 5-10의 OD600에 도달시켰다.

생물반응기를 2.7 L의 최소 배지 + 글루코스로 준비하고, 300 ml의 OD600의 5-10 배양물을 첨가하여 출발 부피를 3 L로 조정하였다. 교반, 공기, 및 산소를 함유하는 캐스캐이드를 사용하여 용존 산소를 20% 포화로 유지하면서 세포를 28℃, pH 7에서 성장시켰다. pH를 28% w/w 수산화 암모늄 용액을 사용하여 제어하였다. 40 g/L의 초기 볼루스가 13시간쯤에 고갈되면 DO-stat 기반 공급 알고리즘을 사용하여 유가 방식으로 발효를 실행하였다. 24-26시간의 초기 성장 후, OD600은 100 초과에 도달하였다. 이 시점에서, 300 mL의 500 g/L 수크로스를 첨가하고, 온도를 25℃로 감소시켰다. 1 mM IPTG를 사용하여 단백질 생산을 위해 고밀도 배양을 유도하였다. 발효를 추가 20-24시간 동안 지속하고, 60분 동안 9000 rcf, 15℃에서 벤치 탑 원심분리를 사용하여 세포를 채취하였다. 원심분리로부터 회수된 세포 펠렛을 2x 완충제 대 1x 세포의 중량 대 중량 비율로 pH 8에서 0.5 M NaCl 및 0.1 M KH2PO4를 함유하는 완충제에 재현탁시켰다.

채취된 세포를 2회 통과로 14,000 psi 압력에서 균질화기에서 파괴하였다. 생성된 슬러리는 다른 단백질과 함께 콜라겐 단백질을 함유하였다.

콜라겐은 원심분리 및 상기 기재된 완충제에서 재현탁 후 생물반응기로부터 회수된 비균질화된 전체 세포의 산 처리에 의해 정제되었다. 재현탁된 현탁액의 pH를 6 M 염산을 사용하여 3으로 낮추었다. 산성화된 세포 슬러리를 혼합하면서 4℃에서 밤새 인큐베이션한 다음, 원심분리하였다. 이후, pH를 10 N NaOH를 사용하여 9로 상승시키고, 슬러리의 상층액을 폴리아크릴아미드 겔에서 시험하였고 출발 펠렛과 비교하여 상대적으로 높은 양의 콜라겐을 함유하는 것으로 밝혀졌다. 이렇게 수득된 콜라겐 슬러리는 염이 높았다. 부피 및 염을 감소시키기 위해, 각각 0.1 m2의 한외여과 카세트를 갖는 EMD 밀리포어 접선 유동 여과 시스템을 사용하여 농축 및 정용여과 단계를 수행하였다. 총 여과 면적은 2개의 카세트를 동시에 사용하여 0.2 m2이다. TFF 단계에서 5x의 부피 감소 및 19x의 염 감소가 달성되었다. 최종 콜라겐 슬러리를 SDS-PAGE 겔에서 런닝시켜 콜라겐의 존재를 확인하였다. 이 슬러리를 다중-트레이 동결건조기를 사용하여 3일 동안 건조시켜 흰색의 푹신한 콜라겐 분말을 수득하였다.

정제된 콜라겐-GFP-베타-락타마제 융합 단백질을 SDS-PAGE 겔 상에서 분석하였고, 90 킬로달톤의 명백한 분자량에서 런닝하는 것으로 관찰되었다. 융합 단백질의 예상 크기는 85 kDa이다. 90 kDa 밴드는 질량 분석법에 의해 정확한 콜라겐 융합 단백질인 것으로 확인되었다.

DsbA 분비 태그-His 태그-링커-트롬빈 단축 부위 및 GFP 베타- 락타마제 융 합을 갖는 단축형 콜라겐(버전 2):

DsbA 분비 태그-His 태그-링커-트롬빈 단축 부위 및 GFP 베타-락타마제 융합을 갖는 해파리 콜라겐이 하기에 개시되어 있다. 이 콜라겐을 코딩하는 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열이 서열번호 11에 제공되어 있다. 아미노산 서열은 서열번호 12에 개시되어 있다. DsbA 분비 태그는 서열번호 11의 뉴클레오타이드 1-72에 의해 코딩되며, 서열번호 12의 아미노산 1-24를 코딩한다. His 태그는 서열번호 11의 뉴클레오타이드 73-99에 의해 코딩되며, 서열번호 12의 아미노산 25-33의 9개의 히스티딘 태그를 코딩한다. 링커는 서열번호 11의 뉴클레오타이드 100-111에 의해 코딩되며, 서열번호 12의 아미노산 34-37을 코딩한다. 트롬빈 단축 부위는 서열번호 11의 뉴클레오타이드 112-135에 의해 코딩되며, 서열번호 12의 아미노산 38-45를 코딩한다. 링커를 갖는 녹색 형광 단백질(GFP)은 서열번호 11의 뉴클레오타이드 136-873에 의해 코딩되며, 서열번호 12의 아미노산 46-291을 코딩한다. 단축형 콜라겐 서열은 서열번호 11의 뉴클레오타이드 874-1440에 의해 코딩되며, 서열번호 12의 아미노산 292-480을 코딩한다. 링커를 갖는 베타-락타마제는 서열번호 11의 뉴클레오타이드 1441-2232에 의해 코딩되며, 서열번호 12의 아미노산 481-744를 코딩한다.

실시예 2. 인간 콜라겐

단축형 인간 콜라겐 21형 알파 1

His 태그, 링커, 및 트롬빈 단축 부위가 없는 단축형 인간 콜라겐 21형 알파 1(전장 인간 21형 알파 1 콜라겐(서열번호 31)에 비해 단축됨)이 하기에 개시되어 있다. 이 콜라겐을 코딩하는 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열 및 아미노산 서열은 하기에 개시되어 있다. DsbA 분비 태그는 서열번호 13의 뉴클레오타이드 1-72에 의해 코딩되며, 서열번호 14의 아미노산 1-24를 코딩한다. 단축형 콜라겐 서열은 서열번호 13의 뉴클레오타이드 73-633에 의해 코딩되며, 서열번호 14의 아미노산 25-211을 코딩한다.

이 콜라겐을 코딩하는 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 13에 제공되어 있다.

아미노산 서열이 서열번호 14에 개시되어 있다.

DsbA 분비 태그 콜라겐이 없는 단축형 인간 콜라겐 21형 알파 1을 코딩하는 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열이 서열번호 15에 제공되어 있다.

DsbA 분비 태그가 없는 단축형 인간 콜라겐 21형 알파 1의 아미노산 서열이 서열번호 16에 개시되어 있다.

서열번호 13의 폴리뉴클레오타이드를 트위스트 바이오사이언스(Twist Bioscience)에 의해 합성하였다. pET28 벡터 및 서열번호 15 및 서열번호 16 사이의 오버랩은 20 내지 30 bp 길이로 설계되었고, 효소 PrimeSTAR® GXL 중합효소(www.takarabio.com/products/pcr/gc-rich-pcr/primestar-gxl-dna-polymerase)를 갖는 PCR을 사용하여 추가되었다. 이후, 개방된 pET28a 벡터 및 삽입 DNA(서열번호 13)를 In-Fusion Cloning(www.takarabio.com/products/cloning/in-fusion-cloning)을 사용하여 최종 플라스미드로 함께 조립하였다. 이후, 플라스미드 서열을 Genewiz(www.genewiz.com/en)를 통한 Sanger 시퀀싱을 통해 확인하였다.

형질전환된 세포를 최소 배지에서 배양하고, 50:50의 세포 대 글리세린의 비율로 식물성 글리세린과 함께 1.5 ml 분취물로 동결시켰다. 이 동결된 배양물의 하나의 바이알을 37℃, 200 rpm에서 밤새 50 ml의 최소 배지에서 회복시켰다. 세포를 300 ml의 최소 배지로 옮기고, 6-9시간 동안 성장시켜 5-10의 OD600에 도달시켰다.

본 실시예 및 본 출원 전반에 사용된 최소 배지는 다음과 같이 제조한다:

1) DI 물에서의 농도로 5 L의 550 g/kg 글루코스 시럽(VWR, 제품 #97061-170)을 오토클레이브한다.

2) 3946 mL의 DI 물에서 오토클레이브한다:

20 g(NH₄)₂HPO₄.(VWR, 제품 # 97061-932);

66.5 g KH₂PO₄.(VWR, 제품 # 97062-348);

22.5 g H₃C₆H₅O₇.(VWR, 제품 #BDH9228-2.5KG);

8.85 g MgSO₄.7H₂O.(VWR, 제품 # 97062-134);

10 mL의 1000x 미량 금속 제제(표 3).

오토클레이브 후,

118 g의 (1)을 (2)에 첨가하고;

5 mL의 25 mg/mL 카나마이신 설페이트(VWR-V0408)를 첨가하고;

28% NH₄OH(VWR, 제품 #BDH3022)를 사용하여 pH를 6.1로 조정한다.

표 3. 미량 금속 제제

발효를 25℃ 내지 28℃ 범위의 다양한 온도에서 수행하였다. 일부 발효의 경우, 발효의 온도를 일정한 온도로 유지시키고, 발효가 완료된 직후 콜라겐을 정제하였다. 다른 발효의 경우, 발효 온도를 원하는 시간 동안 유지시키고, 10-20의 OD600의 세포 밀도에 도달하면, 온도를 낮추어 단백질 생산을 유도하였다. 전형적으로, 온도를 28℃에서 25℃로 낮추었다. 25℃에서의 발효를 40-60시간 동안 지속하였다.

콜라겐을 다음과 같이 정제하였다: 발효 브로쓰의 pH를 5-50% 황산을 사용하여 3-3.5로 감소시켰다. 이후, 세포를 원심분리를 사용하여 분리하였다. 산성화된 브로쓰의 상층액을 폴리아크릴아미드 겔에서 시험하였고 출발 펠렛과 비교하여 상대적으로 높은 양의 콜라겐을 함유하는 것으로 밝혀졌다. 이렇게 수득된 콜라겐 슬러리는 염이 높았다. 부피 및 염을 감소시키기 위해, 각각 0.1 m2의 한외여과 카세트를 갖는 EMD 밀리포어 접선 유동 여과 시스템을 사용하여 농축 및 정용여과 단계를 수행하였다. 총 여과 면적은 2개의 카세트를 동시에 사용하여 0.2 m2이었다. TFF 단계에서 5x의 부피 감소 및 19x의 염 감소가 달성되었다. 최종 콜라겐 슬러리를 SDS-PAGE 겔에서 런닝시켜 콜라겐의 존재를 확인하였다.

정제된 콜라겐을 SDS-PAGE 겔 상에서 분석하였고, 두껍고 분명한 밴드가 25 킬로달톤의 예상된 크기에서 관찰되었다. 콜라겐 역가 및 순도의 정량화를 역상 및 크기 배제 HPLC 크로마토그래피를 사용하여 수행하였다. 역가는 일반적으로 리터당 3 내지 8 그램이다. 정제된 콜라겐을 또한 질량 분석법에 의해 추가로 분석하였고, 인간 21형 콜라겐의 공개된 서열과 일치하는 것으로 확인되었다.

단축형 인간 콜라겐 1형 알파 2(1)

His 태그, 링커, 및 트롬빈 단축 부위가 없는 단축형 인간 콜라겐 1형 알파 2(전장 인간 콜라겐 1형 알파 2(서열번호 32)에 비해 단축됨)가 하기에 개시되어 있다. 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열 및 아미노산 서열은 하기에 개시되어 있다. DsbA 분비 태그는 서열번호 17의 뉴클레오타이드 1-72에 의해 코딩되며, 서열번호 18의 아미노산 1-24를 코딩한다. 단축형 콜라겐 서열은 서열번호 17의 뉴클레오타이드 73-636에 의해 코딩되며, 서열번호 18의 아미노산 25-212를 코딩한다.

이 콜라겐을 코딩하는 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열이 서열번호 17에 제공되어 있다.

아미노산 서열이 서열번호 18에 개시되어 있다.

DsbA 분비 태그가 없는 단축형 인간 콜라겐 1형 알파 2(1)의 핵산 서열이 서열번호 19에 개시되어 있다.

DsbA 분비 태그가 없는 단축형 인간 콜라겐 1형 알파 2(1)의 아미노산 서열이 서열번호 20에 개시되어 있다.

단축형 인간 콜라겐 1형 알파 2(2)

His 태그, 링커, 및 트롬빈 단축 부위가 없는 단축형 인간 콜라겐 1형 알파 2(전장 인간 콜라겐 1형 알파 2(서열번호 32)에 비해 단축됨)가 하기에 개시되어 있다. 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열 및 아미노산 서열은 하기에 개시되어 있다. DsbA 분비 태그는 서열번호 21의 뉴클레오타이드 1-72에 의해 코딩되며, 서열번호 22의 아미노산 1-24를 코딩한다. 단축형 콜라겐 서열은 서열번호 21의 뉴클레오타이드 73-609에 의해 코딩되며, 서열번호 22의 아미노산 25-203을 코딩한다.

이 콜라겐을 코딩하는 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열이 서열번호 21에 제공되어 있다.

아미노산 서열이 서열번호 22에 개시되어 있다.

DsbA 분비 태그가 없는 단축형 인간 콜라겐 1형 알파 2(2)의 핵산 서열이 서열번호 23에 개시되어 있다.

DsbA 분비 태그가 없는 단축형 인간 콜라겐 1형 알파 2(2)의 아미노산 서열이 서열번호 24에 개시되어 있다.

서열번호 13, 17, 또는 21의 폴리뉴클레오타이드를 본원에 기재된 바와 같은 벡터 pET28a에 서브클로닝하여 형질전환 벡터를 제조하였다. 숙주 세포를 벡터로 형질전환시키고, 폴리뉴클레오타이드를 실시예 1에 기재된 바와 같이 발현시켰다.

발효가 완료된 후, 단축형 인간 콜라겐을 실시예 2에 개시된 절차를 사용하여 발효 브로쓰로부터 정제하였다. 정제된 단축형 인간 콜라겐을 실시예 2에 개시된 바와 같은 SDS-PAGE 및 HPLC를 사용하여 분석하였다.

3개의 모든 단축형 인간 콜라겐은 SDS-PAGE 분석에서 예상된 분자량에서 러닝하였다. HPLC를 사용하여 단축형 인간 콜라겐을 분석할 때, 실시예 1의 해파리 콜라겐을 사용한 표준 곡선을 이용하였다. 인간 콜라겐의 체류 시간은 해파리 콜라겐과 약간 상이하였다. 서열번호 16의 체류 시간은 5.645분이고, 서열번호 20의 체류 시간은 5.631분이었으며, 서열번호 24는 2개의 피크에서 런닝하였고, 체류 시간은 5.531 및 5.7분이었다.

DsbA 분비 및 FLAG 태그를 갖는 단축형 인간 콜라겐 1형 알파 2 단축 5

DsbA 분비 및 FLAG 태그를 갖는 단축형 인간 콜라겐 1형 알파 2 단축 5의 아미노산 서열이 서열번호 25에 개시되어 있다. DsbA 분비 태그는 서열번호 26의 뉴클레오타이드 1-57에 의해 코딩되며, 아미노산 서열은 서열번호 25의 아미노산 1-19이다. 콜라겐 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 26의 뉴클레오타이드 58-657이며, 아미노산 서열은 서열번호 25의 아미노산 20-219이다. FLAG 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 26의 뉴클레오타이드 658-684이며, 아미노산 서열은 서열번호 25의 아미노산 220-228이다.

DsbA 분비 및 FLAG 태그를 갖는 단축형 인간 콜라겐 1형 알파 2 단축 5의 핵산 서열이 서열번호 26에 개시되어 있다.

서열번호 26의 폴리뉴클레오타이드를 벡터 pET28a 내로 서브클로닝하고, 숙주 E. coli 세포에서 발현시키고, 단축형 콜라겐을 본원에 기재된 바와 같이 정제하였다. 정제된 콜라겐은 SDS-PAGE 상에서 분명한 밴드를 생성하였고, 항-FLAG 웨스턴은 약 100 킬로달톤에서 관찰되었다. 이 단백질의 발현의 부재하에 겔 상의 상기 위치에 나타나는 기존 밴드는 없었다.

DsbA 분비 및 FLAG 태그를 갖는 단축형 인간 콜라겐 1형 알파 2 단축 6

DsbA 분비 및 FLAG 태그를 갖는 단축형 인간 콜라겐 1형 알파 2 단축 6의 아미노산 서열이 서열번호 27에 개시되어 있다. DsbA 분비 태그는 서열번호 28의 뉴클레오타이드 1-57에 의해 코딩되며, 아미노산 서열은 서열번호 27의 아미노산 1-19이다. 콜라겐 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 28의 뉴클레오타이드 58-657이며, 아미노산 서열은 서열번호 27의 아미노산 20-219이다. FLAG 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 28의 뉴클레오타이드 658-684이며, 아미노산 서열은 서열번호 27의 아미노산 220-228이다.

DsbA 분비 및 FLAG 태그를 갖는 단축형 인간 콜라겐 1형 알파 2 단축 6의 핵산 서열이 서열번호 28에 개시되어 있다.

서열번호 28의 폴리뉴클레오타이드를 벡터 pET28a 내로 서브클로닝하고, 숙주 E. coli 세포에서 발현시키고, 단축형 콜라겐을 본원에 기재된 바와 같이 정제하였다. 정제된 콜라겐은 SDS-PAGE 상에서 분명한 밴드를 생성하였고, 항-FLAG 웨스턴은 약 25 킬로달톤에서 관찰되었다. 이 단백질의 부재하에 겔 상의 상기 위치에 나타나는 기존 밴드는 없었다.

DsbA 분비 및 FLAG 태그를 갖는 단축형 인간 콜라겐 1형 알파 2 단축 7

DsbA 분비 및 FLAG 태그를 갖는 단축형 인간 콜라겐 1형 알파 2 단축 7의 아미노산 서열은 서열번호 29에 개시되어 있다. DsbA 분비 태그는 서열번호 30의 뉴클레오타이드 1-57에 의해 코딩되고, 아미노산 서열은 서열번호 29의 아미노산 1-19이다. 콜라겐 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 30의 뉴클레오타이드 58-759이고, 아미노산 서열은 서열번호 29의 아미노산 20-253이다. FLAG 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 30의 뉴클레오타이드 760-786이고, 아미노산 서열은 서열번호 29의 아미노산 254-262이다.

DsbA 분비 및 FLAG 태그를 갖는 단축형 인간 콜라겐 1형 알파 2 단축 7의 핵산 서열은 서열번호 30에 개시되어 있다.

서열번호 30의 폴리뉴클레오타이드를 벡터 pET28a 내로 서브클로닝하고, 숙주 E. coli 세포에서 발현시키고, 단축형 콜라겐을 본원에 기재된 바와 같이 정제하였다. 정제된 콜라겐은 SDS-PAGE 상에서 분명한 밴드를 생성하였고, 항-FLAG 웨스턴은 약 30 킬로달톤에서 관찰되었다. 이 단백질의 발현의 부재하에 겔 상에 상기 위치에 나타내는 기존 밴드는 없었다.

실시예 3. 단축형 인간 21형 콜라겐의 인간 임상 연구

단축형 인간 21형 콜라겐(서열번호 16)을 함유하는 국소 피부관리 제품의 효과를 결정하기 위해 인간 대상체를 사용하여 임상 연구를 수행한다. 조사를 임상시험 관리 기준의 미국 및 국제 표준(U.S. and International standards of Good Clinical Practice, FDA 및 ICH 지침) 및 적용가능한 정부 규정에 따라 수행한다.

물, 올리브 오일 글리세레스-8 에스테르, 글리세린, 코코넛 알칸, 하이드록시에틸 아크릴레이트/나트륨 아크릴로일디메틸 타우레이트 공중합체, 펜틸렌 글리콜, 이나트륨 EDTA, 카프릴릴 글리콜, 클로르페네신, 페녹시에탄올로 구성된 베이스 제제(대조군 제제)를 제조한다. 단축형 인간 21형 콜라겐을 함유하는 제제는 0.1% w/w 콜라겐을 함유하는 국소 제제를 제조하기 위해 충분한 콜라겐을 첨가함으로써 제조된다.

자격 및 효능에 대한 전문가 등급 평가

시각 아날로그 척도(VAS)는 직접 측정될 수 없는 다양한 증상, 주관적 특징 또는 태도의 강도 또는 빈도를 측정하기 위해 임상 조사에서 일반적으로 사용된다. VAS는 신뢰할 수 있는 척도이며 단순 순서 척도보다 작은 변화에 더 민감하다(A. Paul-Dauphin, F. Guillemin, J. Virion and S. Briancon, "Bias and precision in visual analog scales: A randomized controlled trial," American Journal of Epidemiology, vol. 150, no. 10, pp. 1117-27, 1999). VAS 항목에 응답할 때, 전문 채점자는 2개의 종점 또는 앵커(anchor) 응답 사이의 선(line, 10 cm)을 따라 위치를 표시함으로써 진술에 대한 이들의 동의 수준을 명시한다. 단순 VAS는 10 cm 수평선의 끝이 왼쪽(최고)부터 오른쪽(최악)으로 향하는 극한 한계로서 정의되는 효능 파라미터를 평가하는 데 사용된다. 광노화의 징후는 하기와 같이 분류될 수 있다: 경증=1-3.9 cm, 중등도=4-6.9 cm, 중증=7-10 cm.

하기 VAS가 사용되었다:

순서 척도는 주어진 속성의 품질에 직접적으로 그리고 객관적으로 숫자를 부여한다. 순서 척도 항목에 응답할 때, 전문 채점자는 설정된 등급 또는 수준을 선택함으로써 진술에 대한 이들의 동의 수준을 명시한다.

각 대상체의 얼굴 피부 발적(홍반)의 외관은 기저선에 자격 검증을 위해 하기 5점 순서 척도를 사용하여 전문 채점자에 의해 평가된다(표 4). 자격이 있는 경우, 각각의 대상체는 2주, 4주, 6주 및 8주에 추가적인 홍반 평가를 겪을 것이다.

표 4. 홍반 평가를 위한 5점 순서 척도

코르네오미터 CM 820(Courage + Khazaka, Germany)은 가깝게 배치된 한 쌍의 전극으로 피부에 교류를 인가하고 전기용량(capacitance)을 측정함으로써 피부 표면의 상대적인 보습 정도를 측정한다. 피부의 수분 함량의 변화는 전기용량 회로의 전도도를 변화시킨다.

코르네오미터는 단지 약 1초의 측정 시간으로 보습 수준의 작은 변화를 재현성 있게 검출할 수 있다. 측정 깊이는 작으며(대략 10-20 μm의 각질층), 이는 평가가 더 깊은 피부층에 의해 영향을 받지 않게 한다.

모든 대상체는 기저선, 초기 적용 직후, 및 2주, 4주, 및 8주에 얼굴을 코르네오미터로 측정한다. 측정은 3회 반복으로 수행되고 각 시점에 대해 평균화될 것이다. 측정 위치는 각 시점에 평가 일관성을 위해 얼굴 지도 상에 기록된다.

큐토미터 MPA 580(Courage + Khazaka, Germany)은 피부 표면에 흡입을 적용하고, 피부를 탐침의 구멍 내로 끌어당기고, 광학 측정 시스템을 사용하여 침투 깊이를 결정함으로써 피부의 점탄력성 특성을 측정한다.

음압에 의해 흡입되는 피부의 저항(견고성) 및 그의 원래의 위치로 돌아가는 능력(탄력성)이 계산되어 곡선으로 표시된다. 큐토미터 출력은 R0(Uf, 견고성), R2(Ua/Uf, 총 탄력성), R5(Ur/Ue, 순 탄력성), R7(Ur/Uf, 탄력성 부분) 및 R9(R3[last max amp]-R0[Uf], 피로)를 포함하는 측정 곡선의 상이한 부분의 많은 파라미터를 포함한다.

모든 대상체는 기저선, 초기 적용 직후, 및 2주, 4주, 및 8주에 왼쪽 또는 오른쪽 뺨에서 큐토미터 측정을 수행한다(준비된 무작위화 코드에 따라). 피부 탄력성은 R5(Ur/Ue) 및 R2(Ua/Uf) 파라미터를 사용하여 보고된다. 피부가 더 탄력성이 될수록, 이 값은 증가할 것이다. 피부 견고성은 R0(Uf) 파라미터를 사용하여 보고된다. 피부가 더 견고해질수록, 이 값은 감소할 것이다. 평가 위치는 방문 사이의 측정의 일관성을 위해 각 대상체마다 얼굴 지도 상에 기록된다.

COSMETRICS™ 시아스코프(Astron Clinica, Toft, UK)는 분광광도 피내 분석(SIA), 또는 발색단 맵핑을 사용하는 비침습성 광학 피부 이미징 기기이다. 기술은 피부경검법(dermatoscopy) 및 접촉 리미턴스 분광광도법(contact remittance spectrophotometry)의 독특한 조합을 기반으로 한다. 하드웨어는 노트북에 부착된 휴대용 이미징 프로브로 구성된다. 유닛은 피부 표면과 접촉하여 배치되며, 고강도 LED가 가시 스펙트럼 및 작은 범위의 근적외선 스펙트럼에 이르는 400 내지 1000 nm의 이산형 파장으로서 피부를 조사한다. 각 파장에 대해 디지털 이미지를 캡처한다. 3개의 파라미터 발색단 지도가 하기 파라미터 각각에 대해 하나씩 최대 2 mm 깊이 및 11 mm 원주까지 검색된다: 표피 멜라닌, 표피 헤모글로빈 및 진피 콜라겐.

이 연구를 위해, 진피 콜라겐은 기저선 및 2주, 4주, 및 8주에 준비된 무작위화 코드에 따라, 왼쪽 또는 오른쪽 뺨에서 측정될 것이다. 평가 위치는 방문 사이의 측정 일관성을 위해 각 대상체마다 얼굴 지도 상에 기록될 것이다.

DermaScan C USB(Cortex Technology ApS, Hadsund, Denmark)는 소형 고해상도 초음파 스캐너이다. 이미지 명확성 및 선명도를 위해 선형 스캐닝, 고정밀 작동 및 실제 위치 감지를 제공하는 20 MHz, 고해상도 60 x 150 μm, 13 mm 침투 프로브가 사용된다.

기기는 cyberDERM 사(Broomall, PA, USA)에 의해 제공된다. 모든 대상체는 기저선 및 2주, 4주, 및 8주에 얼굴에서 초음파 평가를 수행한다. 평가 위치는 각 방문시 동일하며, 얼굴 지도에 기록될 것이다. 초음파 스캔의 획득시, 이들은 피부 두께(밀도)의 분석을 위해 cyberDERM 사로 전송된다.

모든 임상 사진 촬영은 연구 기간 동안 고품질 이미지의 재현성을 보장하기 위해 IRSI의 SOP에 따라 수행된다. 이미징은 무광의 검은색 벽이 있는 지정된 사진실에서 수행되며, 모든 천연 광은 차단된다. 임상 사진 촬영을 위해 대상체를 준비시키기 위해, 대상체는 귀걸이, 목걸이, 및 임의의 얼굴 보석을 포함하는 모든 보석류를 제거해야 한다. 숙련된 기술자는 조명이 켜진 확대 루프(magnification loop) 하에서 대상체를 검사하여 잔류 색조 화장품 또는 피부관리 제품이 얼굴, 눈, 또는 입술에 보이지 않는다는 것을 확인한다. 대상체에게 검은색 망토와 검은색 머리띠가 제공되며, 현장에서 모든 머리가 깔끔하게 뒤로 당겨지고 가려지도록 지시받는다.

Clarity™ 2D 연구 시스템 Ti(Clarity)(BrighTex Bio-Photonics(BTBP), San Jose CA, USA)는 고품질 전체 얼굴 전면, 좌측면, 및 우측면 이미지를 캡처한다. 시스템 내의 3개의 카메라는 생중계 디스플레이 및 재현성을 위해 기준 이미지에 대한 자동 얼굴 정렬 체크를 사용하여 동시에 16비트로 18개의 메가픽셀 SLR 이미지를 캡처할 수 있다.

다중 스펙트럼 조명(확산 백색광, 교차 편광, 청색 및 평행 편광)은 피부 표면층 위와 아래의 피부 상태를 보여준다. 시스템은 피부 특징 인식을 사용하여 자동화된 피부 분할 및 영역 맵핑을 적용하여 후속 피부 분석을 허용한다. 이미지는 색소침착, 표면아래 색소침착, 광채, 피부색, 발적, 주름, 피부 질감, 공극, 여드름 및/또는 입술과 관련된 속성에 대해 분석된다.

모든 대상체는 기저선 및 2주, 4주, 및 8주에 표준 광 및 평행 편광에서 캡처된 전면, 왼쪽, 및 오른쪽 얼굴 이미지를 갖는다.

주관적인 설문조사는 스폰서가 대상체들의 피부, 시험 제품, 및 그의 효과에 대한 의견을 판단할 수 있게 한다. 질문은 개방형 응답뿐만 아니라 5점 척도로 진술에 대한 대상체의 동의를 구할 것이다.

14명의 여성 대상체가 등록된다. 포함 기준은 일반 건강이 양호한 피츠패트릭(Fitzpatrick) 피부 III형을 갖는 백인 여성 대상체이며, 등록시 35세 내지 65세의 연령이다. 포함 기준은 또한 기저선에 전문 채점자에 의해 결정될 때 얼굴에 다음의 노화의 징후를 포함한다: a) 선/주름에 대해 10 cm 척도에서 ≥ 2 cm ≤ 6의 스코어; 및 b) 얼굴 발적(홍반)에 대해 5점 순서 척도에서 ≥1 ≤3의 스코어. 표 5는 연구 참가자의 인구통계를 개시한다.

표 5. 인구통계

2주 처리 후 선/주름, 견고성(시각), 탄력성(촉각), 명도, 질감/유연(촉각), 질감/부드러움(시각) 및 홍반에 대한 전문 임상 채점자 평가 결과가 표 6에 나타나 있다. 시험된 모든 특징은 개선되었다. 명도, 질감/유연(촉각), 질감/부드러움(시각) 및 홍반에 대한 스코어는 통계학적 유의성으로 개선되었다.

표 6. 전문가 임상 채점자 평가 - 단항(Monadic), 기저선과의 비교

코르네오미터 및 큐토미터를 사용한 보습, 견고성 및 탄력성의 기기 평가가 표 7에 나타나 있다. 피부 보습, 견고성, 및 탄력성의 개선은 통계학적으로 유의하였다. 또한, 표 7은 분광광도 피내 분석(SIA)에 의해 입증된 바와 같이 피부 세포에 의한 콜라겐 생산의 자극을 보여준다.

표 7. 기기 평가 - 단항, 기저선과의 비교

결과는 단축형 인간 21형 콜라겐이 피부의 탄력성, 명도, 보습, 촉각적 질감, 또는 시각적 질감의 통계학적으로 유의한 개선을 나타낸다는 것을 입증한다. 또한, 결과는 단축형 인간 21형 콜라겐이 가시적인 선 또는 주름의 통계학적으로 유의한 감소뿐만 아니라 홍반의 유의한 감소를 나타낸다는 것을 보여준다.

실시예 4. 피부 세포에서 단축형 인간 21형 콜라겐의 시험관내 연구

단축형 인간 21형 알파 1 콜라겐은 콜라겐 I형의 섬유아세포 생산을 자극한다

인간 피부 섬유아세포 및 케라티노사이트에 대한 단축형 인간 21형 콜라겐의 효과를 평가하기 위해 일련의 시험관내 실험을 수행하였다. 첫 번째 실험에서, 인간 1차 섬유아세포를 콜라겐 I형 단백질 분비에 대해 평가하였다. 섬유아세포를 0.03%의 서열번호 16에 따른 폴리펩타이드와 함께 48시간 동안 배양하였다. 배양 상층액을 효소 결합 면역흡착 분석(ELISA)에 의해 총 분비된 콜라겐 I형 단백질에 대한 판독값인 프로콜라겐 I형 C-펩타이드에 대해 분석하였다. 도 1에 나타낸 바와 같이, 서열번호 16의 폴리펩타이드로 처리된 세포는 처리되지 않은 세포(도 1; "A") 또는 레티놀로 처리된 세포(도 1; "C")보다 더 높은 수준의 콜라겐 I형(도 1; "B")을 분비하였다.

단축형 인간 21형 알파 1 콜라겐은 세포외 매트릭스 단백질에 대한 유전자의 섬유아세포 생산을 자극한다

RNA 시퀀싱을 수행하여 글로벌 유전자 발현을 분석하였다. 노출 48시간 후, 섬유아세포를 0.03%의 서열번호 16에 따른 폴리펩타이드와 함께 인큐베이션하였다. 이러한 섬유아세포는 배지 단독에서 인큐베이션된 세포보다 더 높은 수준의 몇 개의 세포외 매트릭스 유전자를 발현하였다. 도 2a에 나타낸 바와 같이, 서열번호 16에 따른 폴리펩타이드로 처리된 섬유아세포(도 2a; "C")는 처리되지 않은 세포(도 2a; "A") 또는 레티놀로 처리된 섬유아세포(도 2a; "B")에 비해 콜라겐 I형 유전자(COL1A)를 상향조절하였다. 이러한 응답은 비타민 C로 처리된 섬유아세포(도 2a; "D")와 유사하였다. 도 2b에 나타낸 바와 같이, 서열번호 16의 폴리펩타이드로 처리된 섬유아세포(도 2b; "B")는 처리되지 않은 세포(도 2b; "A"), 및 다양한 해양 콜라겐(도 2b; "C", "D", "E", 및 "F")에 비해 엘라스틴 유전자(ELN)를 상향조절하였다. 도 2c에 나타낸 바와 같이, 서열번호 16의 폴리펩타이드로 처리된 섬유아세포(도 2c; "B")는 처리되지 않은 세포(도 2c; "A"), 레티놀(도 2c; "C"), 및 비타민 C(도 2c; "D")에 비해 피브로넥틴 유전자(FN1)를 상향조절하였다.

단축형 인간 21형 알파 1 콜라겐은 UVB 광으로 조사된 케라티노사이트의 염증을 감소시킨다.

인간 1차 케라티노사이트에 40 mJ/cm² UVB 광을 조사한 다음, 0.1%의 서열번호 16의 폴리펩타이드를 24시간 동안 처리하였다. 전염증성 사이토카인 IL-1a의 수준을 ELISA에 의해 결정하였다. 도 3에 나타낸 바와 같이, 서열번호 16의 폴리펩타이드로 처리된 UVB 조사된 케라티노사이트(도 3; "B")는 처리되지 않은 UVB 조사된 케라티노사이트(도 3; "A")와 비교하여 더 낮은 수준의 IL-1α를 발현하였다.

단축형 인간 21형 알파 1 콜라겐은 항산화 능력을 갖는다 .

서열번호 16의 폴리펩타이드의 항산화 잠재력을 산소 유리 라디칼 흡수 능력(ORAC) 분석을 사용하여 평가하였다. ORAC 분석은 제품의 항산화 능력을 측정하기 위해 형광 판독값을 사용하는 무세포 분석이다. 데이터는 트롤록스(Trolox, 비타민 E) 당량으로 보고된다. 도 4에 나타낸 바와 같이, 서열번호 16의 폴리펩타이드의 0.1% 용액은 190 μM 트롤록스와 동등한 항산화 특성을 가지고 있었다.

단축형 인간 21형 알파 1 콜라겐은 UVB 광으로 조사된 케라티노사이트의 세포 생존율을 증가시킨다.

UVB 조사된 케라티노사이트에 대한 서열번호 16의 폴리펩타이드의 처리의 효과를 추가로 평가하기 위해, 조사 전 및 조사 후 처리로 실험을 수행하였다. 인간 1차 케라티노사이트에 0.1%의 서열번호 16의 폴리펩타이드를 24시간 동안 전처리하고, 40 mJ/cm² UVB 광을 조사한 다음, 0.1%의 서열번호 16의 폴리펩타이드를 추가 24시간 동안 다시 처리하였다. 세포 생존율을 MTT 대사 비색 분석을 사용하여 평가하였다. 도 5에 나타낸 바와 같이, 서열번호 16의 폴리펩타이드로 처리된 UVB 조사된 케라티노사이트(도 5; "B")는 이러한 처리가 없는 UVB 조사된 케라티노사이트(도 5; "A")보다 더 높은 세포 생존율을 나타내었다.

실시예 5. 단축형 인간 21형 콜라겐의 인간 임상 연구.

단축형 인간 21형 알파 1 콜라겐의 국소 적용은 얼굴 피부 탄력성 증가와 관련된다

임상 연구(n=15명의 대상체)에서, 대상체는 1주 휴식 기간 동안 무단백질 베이스 페이셜 세럼을 사용한 후, 0.1%의 서열번호 16의 폴리펩타이드를 함유하는 국소 페이셜 세럼을 사용하였다. 서열번호 16의 폴리펩타이드의 국소 적용은 큐토미터를 사용하여 측정된 바와 같이 피부 탄력성 증가와 관련되었다. 도 6에 나타낸 바와 같이, 대상체의 100%는 기저선(도 6; "A")과 비교하여 2주(도 6; "B") 및 4주(도 6; "C")에 피부 탄력성의 증가를 갖는 개선을 나타내었다.

인간 21형 알파 1 콜라겐의 국소 적용은 얼굴 피부 콜라겐 함량 증가와 관련된다

임상 연구(n=15 대상체)에서, 대상체는 1주 휴식 기간 동안 무단백질 베이스 페이셜 세럼을 사용한 후, 0.1%의 서열번호 16의 폴리펩타이드를 함유하는 국소 페이셜 세럼을 8주 동안 사용하였다. 서열번호 16의 폴리펩타이드의 국소 적용은 시아스코프(SIAscope)에 의해 측정된 바와 같이 피부 콜라겐 함량 증가와 관련되었다. 도 7에 나타낸 바와 같이, 피부 콜라겐 함량은 기저선(도 7; "A")과 비교하여 2주(도 7; "B") 및 8주(도 7; "C")에 증가하였다.

인간 21형 알파 콜라겐의 국소 적용은 얼굴 피부 발적의 감소와 관련된다

임상 연구(n=15명의 대상체)에서, 대상체는 1주 휴식 기간 동안 무단백질 베이스 페이셜 세럼을 사용한 후, 0.1%의 서열번호 16의 폴리펩타이드를 함유하는 국소 페이셜 세럼을 8주 동안 사용하였다. 도 8에 나타낸 바와 같이, 서열번호 16의 폴리펩타이드의 국소 적용은 기저선(도 8; "A")과 비교하여 4주(도 8; "B") 및 8주(도 8; "C")에 피부 발적의 감소와 관련되었다.

인간 21형 알파 1 콜라겐의 국소 적용은 얼굴 주름의 감소와 관련된다

임상 연구(n=15명의 대상체)에서, 대상체는 1주 휴식 기간 동안 무단백질 베이스 페이셜 세럼을 사용한 후, 0.1%의 서열번호 16의 폴리펩타이드를 함유하는 국소 페이셜 세럼을 8주 동안 사용하였다. 도 9에 나타낸 바와 같이, 서열번호 16의 폴리펩타이드의 국소 적용은 기저선(도 9; "A")과 비교하여 4주(도 9; "B") 및 8주(도 9; "C")에 얼굴 주름의 감소와 관련되었다.

실시예 6. 피부 세포에서 단축형 해파리 콜라겐의 시험관내 연구

단축형 해파리 콜라겐은 콜라겐 I형 단백질의 피부 세포 생산을 자극한다

인간 피부 섬유아세포 및 케라티노사이트에 대한 단축형 해파리 콜라겐의 효과를 평가하기 위해 일련의 시험관내 실험을 수행하였다. 섬유아세포 및 케라티노사이트를 함유하는 시험관내 전체 두께 인간 피부 조직 모델(MatTek)을 서열번호 5의 폴리펩타이드로 48시간 동안 처리한 후 콜라겐 I형 분비에 대해 평가하였다. 그리고 나서, 조직 모델을 세정하고 또 다른 48시간(96시간 시점) 동안 신선한 배지와 함께 인큐베이션하였다. 배양 상층액을 프로콜라겐 I형 C-펩타이드(총 분비된 콜라겐 I형 단백질에 대한 판독값)에 대해 ELISA에 의해 분석하였다. 도 10에 나타낸 바와 같이, 서열번호 5(도 10; "A")의 폴리펩타이드로 처리된 조직 모델은 처리되지 않은 조직 모델(도 10; "B") 또는 양성 대조군인 비타민 B3으로 처리된 조직 모델(도 10; "C")보다 더 높은 수준의 콜라겐 I형을 분비하였다.

단축형 해파리 콜라겐은 UVB 광에 노출 후 케라티노사이트에서 DNA 손상을 감소시킨다

추가 연구에서, 인간 1차 케라티노사이트에게 25 mJ/cm² UVB 광을 조사한 다음, 0.03%의 서열번호 5의 폴리펩타이드를 갖는 배지에서 밤새 인큐베이션하였다. 세포로부터 DNA를 추출하고 OxiSelect UV 유도된 DNA 손상 ELISA 키트를 사용하여 티민 이량체(DNA 손상의 지표)의 수준을 분석하였다. 도 11에 나타낸 바와 같이, 서열번호 5의 폴리펩타이드로 처리된 세포(도 11; "B")는 처리되지 않은 세포(도 11; "A")보다 더 낮은 수준의 티민 이량체, 및 따라서 더 적은 DNA 손상을 나타내었다.

단축형 해파리 콜라겐은 UVB 광으로 조사된 케라티노사이트의 세포 생존율을 증가시킨다

인간 1차 케라티노사이트에 40 mJ/cm2 UVB 광을 조사한 다음, 0.03%의 서열번호 5의 폴리펩타이드를 갖는 배지에서 48시간 동안 인큐베이션하였다. 세포 생존율을 MTT 대사 비색 분석을 사용하여 평가하였다. 도 12에 나타낸 바와 같이, 서열번호 5의 폴리펩타이드로 처리된 UVB 조사된 케라티노사이트(도 12; "B")는 처리되지 않은 UVB 조사된 케라티노사이트(도 12; "A")보다 더 높은 세포 생존율을 나타내었다.

단축형 해파리 콜라겐은 도시 분진 오염에 노출된 케라티노사이트의 세포 생존율을 증가시킨다

도시 분진으로부터의 보호를 시험하기 위해, 인간 1차 케라티노사이트에 서열번호 5의 폴리펩타이드를 24시간 동안 전처리한 다음, 2 mg/ml 도시 분진(NIST 1649B)에 24시간 동안 노출시켰다. 세포 생존율을 MTT 대사 비색 분석을 사용하여 평가하였다. 도 13에 나타낸 바와 같이, 서열번호 5의 폴리펩타이드로 전처리된 케라티노사이트(도 13; "B")는 도시 분진에 노출된 처리되지 않은 케라티노사이트(도 13; "A")보다 도시 분진 노출 후 더 높은 세포 생존율을 나타내었다.

단축형 해파리 콜라겐은 UVB 광으로 조사된 케라티노사이트의 염증을 감소시킨다

시험관내 전체 두께 인간 피부 조직 모델(MatTek)을 이용한 추가 연구에서, MatTek 조직 모델에게 300 mJ/cm² UVB 광을 조사한 다음, 서열번호 5의 폴리펩타이드를 24시간 동안 처리하였다. 전염증성 사이토카인 IL-1α의 수준을 ELISA에 의해 결정하였다. 도 14에서 볼 수 있는 바와 같이, 서열번호 5의 폴리펩타이드로 처리된 조직 모델(도 14; "A")은 처리되지 않은 UVB 조사된(도 14; "B") 대조군 조직 모델과 비교하여 더 낮은 수준의 IL-1α를 나타내었다.

단축형 해파리 콜라겐은 항산화 능력을 갖는다

서열번호 5의 폴리펩타이드를 또한 ORAC 분석에서 평가하였다. 도 15에 나타낸 바와 같이, 서열번호 5의 폴리펩타이드의 0.1% 용액은 193 μM 트롤록스와 동등한 항산화 특성을 가지고 있었다.

실시예 7. 단축형 해파리 콜라겐의 인간 임상 연구

단축형 해파리 콜라겐의 국소 적용은 얼굴 피부 수분의 증가와 관련된다

임상 연구(n=18명의 대상체)에서, 대상체는 0.05%의 서열번호 5의 폴리펩타이드를 함유하는 국소 페이셜 크림을 2주 동안 사용하였다. 도 16에 나타낸 바와 같이, 서열번호 5의 폴리펩타이드의 국소 적용은 기저선(도 16; "A1")과 비교하여 1주(도 16; "A2") 및 2주(도 16; "A3")에 피부 보습 증가와 관련되었다. 서열번호 5의 폴리펩타이드의 국소 적용은 또한 기저선(도 16; "B1")에서의 해양 콜라겐의 국소 적용에 비해 1주(도 16; "B2"), 및 2주(도 16; "B3")에 피부 보습 증가를 입증하였다.

단축형 해파리 콜라겐의 국소 적용은 얼굴 피부 탄력성의 증가와 관련된다

임상 연구(n=18명의 대상체)에서, 대상체는 0.05%의 서열번호 5의 폴리펩타이드를 함유하는 국소 페이셜 크림을 2주 동안 사용하였다. 도 17에 나타낸 바와 같이, 서열번호 5의 폴리펩타이드의 국소 적용은 기저선(도 17; "A")과 비교하여, 1주(도 17; "B") 및 2주(도 17; "C")에 큐토미터를 사용하여 측정된 바와 같이 피부 탄력성 증가와 관련되었다.

본원에 개시된 구현예는 본원에 광범위하게 기재되고 이하에 청구된 구조, 방법, 또는 다른 특징으로부터 벗어나지 않으면서 다른 특정 형태로 구현될 수 있다. 기재된 구현예는 모든 측면에서 제한적이지 않고 단지 예시적인 것으로 간주되어야 한다. 청구범위의 의미 및 균등 범위에 속하는 모든 변화는 그의 범위 내에 포괄되어야 한다.

SEQUENCE LISTING <110> GELTOR, INC. <120> TOPICAL FORMULATIONS OF RECOMBINANT COLLAGENS <130> 57607-705.601 <140> PCT/US2020/025934 <141> 2020-03-31 <150> 62/827,662 <151> 2019-04-01 <160> 47 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 825 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 1 atgaaaaaga tttggctggc gctggctggt ttagttttag cgtttagcgc atcggcggcg 60 cagtatgaag atcaccatca ccaccaccac catcaccact ctggctcgag cctggtgccg 120 cgcggcagcc atatgggtcc gcagggtgtt gttggtgcag atggtaaaga cggtaccccg 180 ggtgaaaaag gagaacaggg acgtacaggt gcagcaggta aacagggcag cccgggtgcc 240 gatggtgccc gtggcccgct gggtagcatt ggtcagcagg gtgcaagagg cgaaccgggc 300 gatccgggta gtccgggcct gcgtggtgat acgggtctgg ccggtgttaa aggcgttgca 360 ggtccttcag gtcgtccagg tcaaccgggt gcaaatggtc tgccgggtgt taatggtcgt 420 ggcggtctgg aacgtggtct ggcaggaccg ccgggtcctg atggtcgccg cggtgaaacg 480 ggttcaccgg gtattgccgg tgccctgggt aaaccaggtc tggaaggtcc gaaaggttat 540 cctggtctgc 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Ala Gly Pro Ser Gly Arg Pro Gly Gln 115 120 125 Pro Gly Ala Asn Gly Leu Pro Gly Val Asn Gly Arg Gly Gly Leu Glu 130 135 140 Arg Gly Leu Ala Gly Pro Pro Gly Pro Asp Gly Arg Arg Gly Glu Thr 145 150 155 160 Gly Ser Pro Gly Ile Ala Gly Ala Leu Gly Lys Pro Gly Leu Glu Gly 165 170 175 Pro Lys Gly Tyr Pro Gly Leu Arg Gly Arg Asp Gly Thr Asn Gly Lys 180 185 190 Arg Gly Glu Gln Gly Glu Thr Gly Pro Asp Gly Val Arg Gly Ile Pro 195 200 205 Gly Asn Asp Gly Gln Ser Gly Lys Pro Gly Ile Asp Gly Ile Asp Gly 210 215 220 Thr Asn Gly Gln Pro Gly Glu Ala Gly Tyr Gln Gly Gly Arg Gly Thr 225 230 235 240 Arg Gly Gln Leu Gly Glu Thr Gly Asp Val Gly Gln Asn Gly Asp Arg 245 250 255 Gly Ala Pro Gly Pro Asp Gly Ser Lys Gly Ser Ala Gly Arg Pro Gly 260 265 270 Leu Arg <210> 3 <211> 689 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 3 gtccgcaggg tgttgttggt gcagatggta aagacggtac cccgggtgaa aaaggagaac 60 agggacgtac aggtgcagca ggtaaacagg gcagcccggg 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Gly Pro Leu Gly Ser Ile Gly Gln Gln 35 40 45 Gly Ala Arg Gly Glu Pro Gly Asp Pro Gly Ser Pro Gly Leu Arg Gly 50 55 60 Asp Thr Gly Leu Ala Gly Val Lys Gly Val Ala Gly Pro Ser Gly Arg 65 70 75 80 Pro Gly Gln Pro Gly Ala Asn Gly Leu Pro Gly Val Asn Gly Arg Gly 85 90 95 Gly Leu Glu Arg Gly Leu Ala Gly Pro Pro Gly Pro Asp Gly Arg Arg 100 105 110 Gly Glu Thr Gly Ser Pro Gly Ile Ala Gly Ala Leu Gly Lys Pro Gly 115 120 125 Leu Glu Gly Pro Lys Gly Tyr Pro Gly Leu Arg Gly Arg Asp Gly Thr 130 135 140 Asn Gly Lys Arg Gly Glu Gln Gly Glu Thr Gly Pro Asp Gly Val Arg 145 150 155 160 Gly Ile Pro Gly Asn Asp Gly Gln Ser Gly Lys Pro Gly Ile Asp Gly 165 170 175 Ile Asp Gly Thr Asn Gly Gln Pro Gly Glu Ala Gly Tyr Gln Gly Gly 180 185 190 Arg Gly Thr Arg Gly Gln Leu Gly Glu Thr Gly Asp Val Gly Gln Asn 195 200 205 Gly Asp Arg Gly Ala Pro Gly Pro Asp Gly Ser Lys Gly Ser Ala Gly 210 215 220 Arg Pro Gly Leu Arg 225 <210> 5 <211> 189 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 5 Gly Pro Gln Gly Val Val Gly Ala Asp Gly Lys Asp Gly Thr Pro Gly 1 5 10 15 Asn Ala Gly Gln Lys Gly Pro Ser Gly Glu Pro Gly Ser Pro Gly Lys 20 25 30 Ala Gly Ser Ala Gly Glu Gln Gly Pro Pro Gly Lys Asp Gly Ser Asn 35 40 45 Gly Glu Pro Gly Ser Pro Gly Lys Glu Gly Glu Arg Gly Leu Ala Gly 50 55 60 Pro Pro Gly Pro Asp Gly Arg Arg Gly Glu Thr Gly Ser Pro Gly Ile 65 70 75 80 Ala Gly Ala Leu Gly Lys Pro Gly Leu Glu Gly Pro Lys Gly Tyr Pro 85 90 95 Gly Leu Arg Gly Arg Asp Gly Thr Asn Gly Lys Arg Gly Glu Gln Gly 100 105 110 Glu Thr Gly Pro Asp Gly Val Arg Gly Ile Pro Gly Asn Asp Gly Gln 115 120 125 Ser Gly Lys Pro Gly Ile Asp Gly Ile Asp Gly Thr Asn Gly Gln Pro 130 135 140 Gly Glu Ala Gly Tyr Gln Gly Gly Arg Gly Thr Arg Gly Gln Leu Gly 145 150 155 160 Glu Thr Gly Asp Val Gly Gln Asn Gly Asp Arg Gly Ala Pro Gly Pro 165 170 175 Asp Gly Ser Lys Gly Ser Ala Gly Arg Pro Gly Leu Arg 180 185 <210> 6 <211> 642 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 6 atgaaaaaga tttggctggc gctggctggt ttagttttag cgtttagcgc atcggcggcg 60 cagtatgaag atggtccgca gggtgttgtt ggtgcagatg gtaaagacgg taccccgggt 120 aatgcaggtc agaaaggtcc gtcaggtgaa cctggcagcc ctggtaaagc aggtagtgcc 180 ggtgagcagg gtccgccggg caaagatggt agtaatggtg agccgggtag ccctggcaaa 240 gaaggtgaac gtggtctggc aggaccgccg ggtcctgatg gtcgccgcgg tgaaacgggt 300 tcaccgggta ttgccggtgc cctgggtaaa ccaggtctgg aaggtccgaa aggttatcct 360 ggtctgcgcg gtcgtgatgg taccaatggc aaacgtggcg aacagggcga aaccggtcca 420 gatggtgttc gtggtattcc gggtaacgat ggtcagagcg gtaaaccggg cattgatggt 480 attgatggca ccaatggtca gcctggcgaa gcaggttatc agggtggtcg cggtacccgt 540 ggtcagctgg gtgaaacagg tgatgttggt cagaatggtg atcgcggcgc accgggtccg 600 gatggtagca aaggtagcgc cggtcgtccg ggtttacgtt aa 642 <210> 7 <211> 213 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 7 Met Lys Lys Ile Trp Leu Ala Leu Ala Gly Leu Val Leu Ala Phe Ser 1 5 10 15 Ala Ser Ala Ala Gln Tyr Glu Asp Gly Pro Gln Gly Val Val Gly Ala 20 25 30 Asp Gly Lys Asp Gly Thr Pro Gly Asn Ala Gly Gln Lys Gly Pro Ser 35 40 45 Gly Glu Pro Gly Ser Pro Gly Lys Ala Gly Ser Ala Gly Glu Gln Gly 50 55 60 Pro Pro Gly Lys Asp Gly Ser Asn Gly Glu Pro Gly Ser Pro Gly Lys 65 70 75 80 Glu Gly Glu Arg Gly Leu Ala Gly Pro Pro Gly Pro Asp Gly Arg Arg 85 90 95 Gly Glu Thr Gly Ser Pro Gly Ile Ala Gly Ala Leu Gly Lys Pro Gly 100 105 110 Leu Glu Gly Pro Lys Gly Tyr Pro Gly Leu Arg Gly Arg Asp Gly Thr 115 120 125 Asn Gly Lys Arg Gly Glu Gln Gly Glu Thr Gly Pro Asp Gly Val Arg 130 135 140 Gly Ile Pro Gly Asn Asp Gly Gln Ser Gly Lys Pro Gly Ile Asp Gly 145 150 155 160 Ile Asp Gly Thr Asn Gly Gln Pro Gly Glu Ala Gly Tyr Gln Gly Gly 165 170 175 Arg Gly Thr Arg Gly Gln Leu Gly Glu Thr Gly Asp Val Gly Gln Asn 180 185 190 Gly Asp Arg Gly Ala Pro Gly Pro Asp Gly Ser Lys Gly Ser Ala Gly 195 200 205 Arg Pro Gly Leu Arg 210 <210> 8 <211> 570 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 8 ggtccgcagg gtgttgttgg tgcagatggt aaagacggta ccccgggtaa tgcaggtcag 60 aaaggtccgt caggtgaacc tggcagccct ggtaaagcag gtagtgccgg tgagcagggt 120 ccgccgggca aagatggtag taatggtgag ccgggtagcc ctggcaaaga aggtgaacgt 180 ggtctggcag gaccgccggg tcctgatggt cgccgcggtg aaacgggttc accgggtatt 240 gccggtgccc tgggtaaacc aggtctggaa ggtccgaaag gttatcctgg tctgcgcggt 300 cgtgatggta ccaatggcaa acgtggcgaa cagggcgaaa ccggtccaga tggtgttcgt 360 ggtattccgg gtaacgatgg tcagagcggt aaaccgggca ttgatggtat tgatggcacc 420 aatggtcagc ctggcgaagc aggttatcag ggtggtcgcg gtacccgtgg tcagctgggt 480 gaaacaggtg atgttggtca gaatggtgat cgcggcgcac cgggtccgga tggtagcaaa 540 ggtagcgccg gtcgtccggg tttacgttaa 570 <210> 9 <211> 2232 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 9 atgaaaaaga tttggctggc gctggctggt ttagttttag cgtttagcgc atcggcggcg 60 cagtatgaag atcaccatca ccaccaccac catcaccact ctggctcgag cctggtgccg 120 cgcggcagcc atatgtctgg ctcgagcagt aaaggtgaag aactgttcac cggtgttgtt 180 ccgatcctgg ttgaactgga tggtgatgtt aacggccaca aattctctgt tcgtggtgaa 240 ggtgaaggtg atgcaaccaa cggtaaactg accctgaaat tcatctgcac taccggtaaa 300 ctgccggttc catggccgac tctggtgact accctgacct atggtgttca gtgtttttct 360 cgttacccgg atcacatgaa gcagcatgat ttcttcaaat ctgcaatgcc ggaaggttat 420 gtacaggagc gcaccatttc tttcaaagac gatggcacct acaaaacccg tgcagaggtt 480 aaatttgaag gtgatactct ggtgaaccgt attgaactga aaggcattga tttcaaagag 540 gacggcaaca tcctgggcca caaactggaa tataacttca actcccataa cgtttacatc 600 accgcagaca aacagaagaa cggtatcaaa gctaacttca aaattcgcca taacgttgaa 660 gacggtagcg tacagctggc ggaccactac cagcagaaca ctccgatcgg tgatggtccg 720 gttctgctgc cggataacca ctacctgtcc acccagtcta aactgtccaa agacccgaac 780 gaaaagcgcg accacatggt gctgctggag ttcgttactg cagcaggtat cacgcacggc 840 atggatgaac tctacaaatc tggcgcgccg ggcggtccgc agggtgttgt tggtgcagat 900 ggtaaagacg gtaccccggg taatgcaggt cagaaaggtc cgtcaggtga acctggcagc 960 cctggtaaag caggtagtgc cggtgagcag ggtccgccgg gcaaagatgg tagtaatggt 1020 gagccgggta gccctggcaa agaaggtgaa cgtggtctgg caggaccgcc gggtcctgat 1080 ggtcgccgcg gtgaaacggg ttcaccgggt attgccggtg ccctgggtaa accaggtctg 1140 gaaggtccga aaggttatcc tggtctgcgc ggtcgtgatg gtaccaatgg caaacgtggc 1200 gaacagggcg aaaccggtcc agatggtgtt cgtggtattc cgggtaacga tggtcagagc 1260 ggtaaaccgg gcattgatgg tattgatggc accaatggtc agcctggcga agcaggttat 1320 cagggtggtc gcggtacccg tggtcagctg ggtgaaacag gtgatgttgg tcagaatggt 1380 gatcgcggcg caccgggtcc ggatggtagc aaaggtagcg ccggtcgtcc gggtttacgt 1440 cacccagaaa cgctggtgaa agtaaaagat gctgaagatc agttgggtgc acgagtgggt 1500 tacatcgaac tggatctcaa cagcggtaag atccttgaga gttttcgccc cgaagaacgt 1560 tttccaatga tgagcacttt taaagttctg ctatgtggcg cggtattatc ccgtattgac 1620 gccgggcaag agcaactcgg tcgccgcata cactattctc agaatgactt ggttgagtac 1680 tcaccagtca cagaaaagca tcttacggat ggcatgacag taagagaatt atgcagtgct 1740 gccataacca tgagtgataa cactgcggcc aacttacttc tgacaacgat cggaggaccg 1800 aaggagctaa ccgctttttt gcacaacatg ggggatcatg taactcgcct tgatcgttgg 1860 gaaccggagc tgaatgaagc cataccaaac gacgagcgtg acaccacgat gcctgtagca 1920 atggcaacaa cgttgcgcaa actattaact ggcgaactac ttactctagc ttcccggcaa 1980 caattaatag actggatgga ggcggataaa gttgcaggac cacttctgcg ctcggccctt 2040 ccggctggct ggtttattgc tgataaatct ggagccggtg agcgtgggtc tcgcggtatc 2100 attgcagcac tggggccaga tggtaagccc tcccgtatcg tagttatcta cacgacgggg 2160 agtcaggcaa ctatggatga acgaaataga cagatcgctg agataggtgc ctcactgatt 2220 aagcattggt aa 2232 <210> 10 <211> 743 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 10 Met Lys Lys Ile Trp Leu Ala Leu Ala Gly Leu Val Leu Ala Phe Ser 1 5 10 15 Ala Ser Ala Ala Gln Tyr Glu Asp His His His His His His His His 20 25 30 His Ser Gly Ser Ser Leu Val Pro Arg Gly Ser His Met Ser Gly Ser 35 40 45 Ser Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu Val 50 55 60 Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn 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gacggcaaca tcctgggcca caaactggaa tataacttca actcccataa cgtttacatc 600 accgcagaca aacagaagaa cggtatcaaa gctaacttca aaattcgcca taacgttgaa 660 gacggtagcg tacagctggc ggaccactac cagcagaaca ctccgatcgg tgatggtccg 720 gttctgctgc cggataacca ctacctgtcc acccagtcta aactgtccaa agacccgaac 780 gaaaagcgcg accacatggt gctgctggag ttcgttactg cagcaggtat cacgcacggc 840 atggatgaac tctacaaatc tggcgcgccg ggcggtccgc agggtgttgt tggtgcagat 900 ggtaaagacg gtaccccggg taatgcaggt cagaaaggtc cgtcaggtga acctggcagc 960 cctggtaaag caggtagtgc cggtgagcag ggtccgccgg gcaaagatgg tagtaatggt 1020 gagccgggta gccctggcaa agaaggtgaa cgtggtctgg caggaccgcc gggtcctgat 1080 ggtcgccgcg gtgaaacggg ttcaccgggt attgccggtg ccctgggtaa accaggtctg 1140 gaaggtccga aaggttatcc tggtctgcgc ggtcgtgatg gtaccaatgg caaacgtggc 1200 gaacagggcg aaaccggtcc agatggtgtt cgtggtattc cgggtaacga tggtcagagc 1260 ggtaaaccgg gcattgatgg tattgatggc accaatggtc agcctggcga agcaggttat 1320 cagggtggtc gcggtacccg tggtcagctg ggtgaaacag gtgatgttgg tcagaatggt 1380 gatcgcggcg caccgggtcc ggatggtagc aaaggtagcg ccggtcgtcc gggtttacgt 1440 cacccagaaa cgctggtgaa agtaaaagat gctgaagatc agttgggtgc acgagtgggt 1500 tacatcgaac tggatctcaa cagcggtaag atccttgaga gttttcgccc cgaagaacgt 1560 tttccaatga tgagcacttt taaagttctg ctatgtggcg cggtattatc ccgtattgac 1620 gccgggcaag agcaactcgg tcgccgcata cactattctc agaatgactt ggttgagtac 1680 tcaccagtca cagaaaagca tcttacggat ggcatgacag taagagaatt atgcagtgct 1740 gccataacca tgagtgataa cactgcggcc aacttacttc tgacaacgat cggaggaccg 1800 aaggagctaa ccgctttttt gcacaacatg ggggatcatg taactcgcct tgatcgttgg 1860 gaaccggagc tgaatgaagc cataccaaac gacgagcgtg acaccacgat gcctgtagca 1920 atggcaacaa cgttgcgcaa actattaact ggcgaactac ttactctagc ttcccggcaa 1980 caattaatag actggatgga ggcggataaa gttgcaggac cacttctgcg ctcggccctt 2040 ccggctggct ggtttattgc tgataaatct ggagccggtg agcgtgggtc tcgcggtatc 2100 attgcagcac tggggccaga tggtaagccc tcccgtatcg tagttatcta cacgacgggg 2160 agtcaggcaa ctatggatga acgaaataga cagatcgctg agataggtgc ctcactgatt 2220 aagcattggt aa 2232 <210> 12 <211> 743 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 12 Met Lys Lys Ile Trp Leu Ala Leu Ala Gly Leu Val Leu Ala Phe Ser 1 5 10 15 Ala Ser Ala Ala Gln Tyr Glu Asp His His His His His His His His 20 25 30 His Ser Gly Ser Ser Leu Val Pro Arg Gly Ser His Met Ser Gly Ser 35 40 45 Ser Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu Val 50 55 60 Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Arg Gly Glu 65 70 75 80 Gly Glu Gly Asp Ala Thr Asn Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile Cys 85 90 95 Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr Leu 100 105 110 Thr Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys Gln 115 120 125 His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu Arg 130 135 140 Thr Ile Ser Phe Lys Asp Asp Gly Thr Tyr Lys Thr Arg Ala Glu Val 145 150 155 160 Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly Ile 165 170 175 Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu 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tttaaaggtg aagcaggttc accgggtgca 180 cctggtcagg atggcacccg tggtgaaccg ggtattccgg gatttccggg taatcgtggc 240 ctgatgggtc agaaaggtga aattggtccg cctggtcagc agggtaaaaa aggcgcaccg 300 ggtatgccag gactgatggg ttcaaatggc agtccgggtc agccaggcac accgggttca 360 aaaggtagca aaggcgaacc tggtattcag ggtatgcctg gtgcaagcgg tctgaaaggc 420 gagccaggtg ccaccggttc tccgggtgaa ccaggttata tgggtctgcc aggtatccaa 480 ggcaaaaaag gtgataaagg taatcagggc gaaaaaggca ttcagggcca gaaaggcgaa 540 aatggccgtc agggtattcc aggccagcag ggcatccagg gtcatcatgg tgcaaaaggt 600 gaacgtggtg aaaagggcga accaggtgtt cgttta 636 <210> 14 <211> 211 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 14 Met Lys Lys Ile Trp Leu Ala Leu Ala Gly Leu Val Leu Ala Phe Ser 1 5 10 15 Ala Ser Ala Ala Gln Tyr Glu Asp Ala Gly Phe Pro Gly Leu Pro Gly 20 25 30 Pro Ala Gly Glu Pro Gly Arg His Gly Lys Asp Gly Leu Met Gly Ser 35 40 45 Pro Gly Phe Lys Gly Glu Ala Gly Ser Pro Gly Ala Pro Gly Gln Asp 50 55 60 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gtattccggg atttccgggt aatcgtggcc tgatgggtca 180 gaaaggtgaa attggtccgc ctggtcagca gggtaaaaaa ggcgcaccgg gtatgccagg 240 actgatgggt tcaaatggca gtccgggtca gccaggcaca ccgggttcaa aaggtagcaa 300 aggcgaacct ggtattcagg gtatgcctgg tgcaagcggt ctgaaaggcg agccaggtgc 360 caccggttct ccgggtgaac caggttatat gggtctgcca ggtatccaag gcaaaaaagg 420 tgataaaggt aatcagggcg aaaaaggcat tcagggccag aaaggcgaaa atggccgtca 480 gggtattcca ggccagcagg gcatccaggg tcatcatggt gcaaaaggtg aacgtggtga 540 aaagggcgaa ccaggtgttc gttaa 565 <210> 16 <211> 187 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 16 Ala Gly Phe Pro Gly Leu Pro Gly Pro Ala Gly Glu Pro Gly Arg His 1 5 10 15 Gly Lys Asp Gly Leu Met Gly Ser Pro Gly Phe Lys Gly Glu Ala Gly 20 25 30 Ser Pro Gly Ala Pro Gly Gln Asp Gly Thr Arg Gly Glu Pro Gly Ile 35 40 45 Pro Gly Phe Pro Gly Asn Arg Gly Leu Met Gly Gln Lys Gly Glu Ile 50 55 60 Gly Pro Pro Gly Gln Gln Gly Lys Lys Gly Ala Pro Gly Met Pro Gly 65 70 75 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ggttttccgg gtcctaaagg tccgaccggt gatccgggta aaaatggtga taaaggtcat 360 gcaggtctgg caggcgcacg cggtgcacct ggtccggatg gtaataatgg tgcacagggt 420 ccaccgggtc cgcagggtgt tcaaggtggt aaaggcgaac agggtcctgc cggtcctccg 480 ggttttcagg gactgcctgg tccgagcggt cctgcgggtg aagttggtaa acctggtgaa 540 cgcggtctgc atggtgaatt tggcctgcct gggcctgcag gtccgcgtgg cgaacgtggt 600 ccgccaggtg aaagcggtgc agcaggtccg acaggttaa 639 <210> 18 <211> 212 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 18 Met Lys Lys Ile Trp Leu Ala Leu Ala Gly Leu Val Leu Ala Phe Ser 1 5 10 15 Ala Ser Ala Ala Gln Tyr Glu Asp Met Gly Pro Pro Gly Ser Arg Gly 20 25 30 Ala Ser Gly Pro Ala Gly Val Arg Gly Pro Asn Gly Asp Ala Gly Arg 35 40 45 Pro Gly Glu Pro Gly Leu Met Gly Pro Arg Gly Leu Pro Gly Ser Pro 50 55 60 Gly Asn Ile Gly Pro Ala Gly Lys Glu Gly Pro Val Gly Leu Pro Gly 65 70 75 80 Ile Asp Gly Arg Pro Gly Pro Ile Gly Pro Ala Gly Ala Arg Gly Glu 85 90 95 Pro Gly Asn Ile Gly Phe Pro 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aggtctggca 300 ggcgcacgcg gtgcacctgg tccggatggt aataatggtg cacagggtcc accgggtccg 360 cagggtgttc aaggtggtaa aggcgaacag ggtcctgccg gtcctccggg ttttcaggga 420 ctgcctggtc cgagcggtcc tgcgggtgaa gttggtaaac ctggtgaacg cggtctgcat 480 ggtgaatttg gcctgcctgg gcctgcaggt ccgcgtggcg aacgtggtcc gccaggtgaa 540 agcggtgcag caggtccgac aggttaa 567 <210> 20 <211> 188 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 20 Met Gly Pro Pro Gly Ser Arg Gly Ala Ser Gly Pro Ala Gly Val Arg 1 5 10 15 Gly Pro Asn Gly Asp Ala Gly Arg Pro Gly Glu Pro Gly Leu Met Gly 20 25 30 Pro Arg Gly Leu Pro Gly Ser Pro Gly Asn Ile Gly Pro Ala Gly Lys 35 40 45 Glu Gly Pro Val Gly Leu Pro Gly Ile Asp Gly Arg Pro Gly Pro Ile 50 55 60 Gly Pro Ala Gly Ala Arg Gly Glu Pro Gly Asn Ile Gly Phe Pro Gly 65 70 75 80 Pro Lys Gly Pro Thr Gly Asp Pro Gly Lys Asn Gly Asp Lys Gly His 85 90 95 Ala Gly Leu Ala Gly Ala Arg Gly Ala Pro Gly Pro Asp Gly Asn Asn 100 105 110 Gly Ala Gln Gly Pro 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cggtagtgat ggtagcgttg gtccggttgg tccagcgggt 480 ccgattggta gcgcaggtcc accgggtttt ccaggcgcac cgggtccgaa aggtgaaatt 540 ggtgcagttg gtaatgcagg ccctgccggt ccagcaggac cgcgtggtga agttggcctg 600 cctggtctgt aa 612 <210> 22 <211> 203 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 22 Met Lys Lys Ile Trp Leu Ala Leu Ala Gly Leu Val Leu Ala Phe Ser 1 5 10 15 Ala Ser Ala Ala Gln Tyr Glu Asp Gly Phe Gln Gly Pro Ala Gly Glu 20 25 30 Pro Gly Glu Pro Gly Gln Thr Gly Pro Ala Gly Ala Arg Gly Pro Ala 35 40 45 Gly Pro Pro Gly Lys Ala Gly Glu Asp Gly His Pro Gly Lys Pro Gly 50 55 60 Arg Pro Gly Glu Arg Gly Val Val Gly Pro Gln Gly Ala Arg Gly Phe 65 70 75 80 Pro Gly Thr Pro Gly Leu Pro Gly Phe Lys Gly Ile Arg Gly His Asn 85 90 95 Gly Leu Asp Gly Leu Lys Gly Gln Pro Gly Ala Pro Gly Val Lys Gly 100 105 110 Glu Pro Gly Ala Pro Gly Glu Asn Gly Thr Pro Gly Gln Thr Gly Ala 115 120 125 Arg Gly Leu Pro Gly Glu Arg Gly Arg Val Gly Ala Pro Gly Pro Ala 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atcgcggtga gacaggtccg 540 tcaggaccag tgggccctgc tggcgcagtc ggtccgcgcg ggccgagtgg ccctcagggt 600 attcgtggcg ataaagggga accgggcgaa aaagggccgc ggggtctgcc aggcctgggt 660 gactacaaag acgacgacga caaataa 687 <210> 27 <211> 228 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 27 Met Lys Lys Ile Trp Leu Ala Leu Ala Gly Leu Val Leu Ala Phe Ser 1 5 10 15 Ala Ser Ala Lys Gly His Asn Gly Leu Gln Gly Leu Pro Gly Ile Ala 20 25 30 Gly His His Gly Asp Gln Gly Ala Pro Gly Ser Val Gly Pro Ala Gly 35 40 45 Pro Arg Gly Pro Ala Gly Pro Ser Gly Pro Ala Gly Lys Asp Gly Arg 50 55 60 Thr Gly His Pro Gly Thr Val Gly Pro Ala Gly Ile Arg Gly Pro Gln 65 70 75 80 Gly His Gln Gly Pro Ala Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly 85 90 95 Pro Pro Gly Val Ser Gly Gly Gly Tyr Asp Phe Gly Tyr Asp Gly Asp 100 105 110 Phe Tyr Arg Ala Asp Gln Pro Arg Ser Ala Pro Ser Leu Arg Pro Lys 115 120 125 Asp Tyr Glu Val Asp Ala Thr Leu Lys Ser Leu Asn Asn Gln Ile Glu 130 135 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gaagttgatg caaccctgaa aagcctgaat 420 aatcagattg aaacactgct gacaccggaa ggtagccgta aaaatccggc ccgtacctgt 480 cgtgatctgc gtctgagcca cccggaatgg agcagcggtt attattggat tgatccgaat 540 caaggttgta ccatggatgc aattaaagtt tattgtgatt ttagcacagg tgaaacatgt 600 atccgtgcac agccggaaaa tattccggcc aaaaattggt atcgtagtag caaagatggt 660 gactacaaag acgacgacga caaataa 687 <210> 29 <211> 262 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 29 Met Lys Lys Ile Trp Leu Ala Leu Ala Gly Leu Val Leu Ala Phe Ser 1 5 10 15 Ala Ser Ala Tyr Glu Val Asp Ala Thr Leu Lys Ser Leu Asn Asn Gln 20 25 30 Ile Glu Thr Leu Leu Thr Pro Glu Gly Ser Arg Lys Asn Pro Ala Arg 35 40 45 Thr Cys Arg Asp Leu Arg Leu Ser His Pro Glu Trp Ser Ser Gly Tyr 50 55 60 Tyr Trp Ile Asp Pro Asn Gln Gly Cys Thr Met Asp Ala Ile Lys Val 65 70 75 80 Tyr Cys Asp Phe Ser Thr Gly Glu Thr Cys Ile Arg Ala Gln Pro Glu 85 90 95 Asn Ile Pro Ala Lys Asn Trp Tyr Arg Ser Ser Lys Asp Lys Lys His 100 105 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Gln Gly Met Pro Gly Ala Ser Gly Leu 660 665 670 Lys Gly Glu Pro Gly Ala Thr Gly Ser Pro Gly Glu Pro Gly Tyr Met 675 680 685 Gly Leu Pro Gly Ile Gln Gly Lys Lys Gly Asp Lys Gly Asn Gln Gly 690 695 700 Glu Lys Gly Ile Gln Gly Gln Lys Gly Glu Asn Gly Arg Gln Gly Ile 705 710 715 720 Pro Gly Gln Gln Gly Ile Gln Gly His His Gly Ala Lys Gly Glu Arg 725 730 735 Gly Glu Lys Gly Glu Pro Gly Val Arg Gly Ala Ile Gly Ser Lys Gly 740 745 750 Glu Ser Gly Val Asp Gly Leu Met Gly Pro Ala Gly Pro Lys Gly Gln 755 760 765 Pro Gly Asp Pro Gly Pro Gln Gly Pro Pro Gly Leu Asp Gly Lys Pro 770 775 780 Gly Arg Glu Phe Ser Glu Gln Phe Ile Arg Gln Val Cys Thr Asp Val 785 790 795 800 Ile Arg Ala Gln Leu Pro Val Leu Leu Gln Ser Gly Arg Ile Arg Asn 805 810 815 Cys Asp His Cys Leu Ser Gln His Gly Ser Pro Gly Ile Pro Gly Pro 820 825 830 Pro Gly Pro Ile Gly Pro Glu Gly Pro Arg Gly Leu Pro Gly Leu Pro 835 840 845 Gly Arg Asp Gly Val Pro Gly Leu Val Gly Val Pro Gly Arg Pro Gly 850 855 860 Val Arg Gly Leu Lys Gly Leu Pro Gly Arg Asn Gly Glu Lys Gly Ser 865 870 875 880 Gln Gly Phe Gly Tyr Pro Gly Glu Gln Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly 885 890 895 Pro Glu Gly Pro Pro Gly Ile Ser Lys Glu Gly Pro Pro Gly Asp Pro 900 905 910 Gly Leu Pro Gly Lys Asp Gly Asp His Gly Lys Pro Gly Ile Gln Gly 915 920 925 Gln Pro Gly Pro Pro Gly Ile Cys Asp Pro Ser Leu Cys Phe Ser Val 930 935 940 Ile Ala Arg Arg Asp Pro Phe Arg Lys Gly Pro Asn Tyr 945 950 955 <210> 32 <211> 1366 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 32 Met Leu Ser Phe Val Asp Thr Arg Thr Leu Leu Leu Leu Ala Val Thr 1 5 10 15 Leu Cys Leu Ala Thr Cys Gln Ser Leu Gln Glu Glu Thr Val Arg Lys 20 25 30 Gly Pro Ala Gly Asp Arg Gly Pro Arg Gly Glu Arg Gly Pro Pro Gly 35 40 45 Pro Pro Gly Arg Asp Gly Glu Asp Gly Pro Thr Gly Pro Pro Gly Pro 50 55 60 Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Leu Gly Gly Asn Phe Ala Ala Gln 65 70 75 80 Tyr Asp Gly Lys Gly Val Gly Leu Gly Pro Gly Pro Met Gly Leu Met 85 90 95 Gly Pro Arg Gly Pro Pro Gly Ala Ala Gly Ala Pro Gly Pro Gln Gly 100 105 110 Phe Gln Gly Pro Ala Gly Glu Pro Gly Glu Pro Gly Gln Thr Gly Pro 115 120 125 Ala Gly Ala Arg Gly Pro Ala Gly Pro Pro Gly Lys Ala Gly Glu Asp 130 135 140 Gly His Pro Gly Lys Pro Gly Arg Pro Gly Glu Arg Gly Val Val Gly 145 150 155 160 Pro Gln Gly Ala Arg Gly Phe Pro Gly Thr Pro Gly Leu Pro Gly Phe 165 170 175 Lys Gly Ile Arg Gly His Asn Gly Leu Asp Gly Leu Lys Gly Gln Pro 180 185 190 Gly Ala Pro Gly Val Lys Gly Glu Pro Gly Ala Pro Gly Glu Asn Gly 195 200 205 Thr Pro Gly Gln Thr Gly Ala Arg Gly Leu Pro Gly Glu Arg Gly Arg 210 215 220 Val Gly Ala Pro Gly Pro Ala Gly Ala Arg Gly Ser Asp Gly Ser Val 225 230 235 240 Gly Pro Val Gly Pro Ala Gly Pro Ile Gly Ser Ala Gly Pro Pro Gly 245 250 255 Phe Pro Gly Ala Pro Gly Pro Lys Gly Glu Ile Gly Ala Val Gly Asn 260 265 270 Ala Gly Pro Ala Gly Pro Ala Gly Pro Arg Gly Glu Val Gly Leu Pro 275 280 285 Gly Leu Ser Gly Pro Val Gly Pro Pro Gly Asn Pro Gly Ala Asn Gly 290 295 300 Leu Thr Gly Ala Lys Gly Ala Ala Gly Leu Pro Gly Val Ala Gly Ala 305 310 315 320 Pro Gly 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Gly Pro Pro Gly Pro Gln Gly Val Gln Gly Gly Lys Gly 530 535 540 Glu Gln Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Phe Gln Gly Leu Pro Gly Pro 545 550 555 560 Ser Gly Pro Ala Gly Glu Val Gly Lys Pro Gly Glu Arg Gly Leu His 565 570 575 Gly Glu Phe Gly Leu Pro Gly Pro Ala Gly Pro Arg Gly Glu Arg Gly 580 585 590 Pro Pro Gly Glu Ser Gly Ala Ala Gly Pro Thr Gly Pro Ile Gly Ser 595 600 605 Arg Gly Pro Ser Gly Pro Pro Gly Pro Asp Gly Asn Lys Gly Glu Pro 610 615 620 Gly Val Val Gly Ala Val Gly Thr Ala Gly Pro Ser Gly Pro Ser Gly 625 630 635 640 Leu Pro Gly Glu Arg Gly Ala Ala Gly Ile Pro Gly Gly Lys Gly Glu 645 650 655 Lys Gly Glu Pro Gly Leu Arg Gly Glu Ile Gly Asn Pro Gly Arg Asp 660 665 670 Gly Ala Arg Gly Ala Pro Gly Ala Val Gly Ala Pro Gly Pro Ala Gly 675 680 685 Ala Thr Gly Asp Arg Gly Glu Ala Gly Ala Ala Gly Pro Ala Gly Pro 690 695 700 Ala Gly Pro Arg Gly Ser Pro Gly Glu Arg Gly Glu Val Gly Pro Ala 705 710 715 720 Gly Pro Asn Gly Phe Ala Gly Pro Ala Gly Ala Ala Gly Gln Pro Gly 725 730 735 Ala Lys Gly Glu Arg Gly Ala Lys Gly Pro Lys Gly Glu Asn Gly Val 740 745 750 Val Gly Pro Thr Gly Pro Val Gly Ala Ala Gly Pro Ala Gly Pro Asn 755 760 765 Gly Pro Pro Gly Pro Ala Gly Ser Arg Gly Asp Gly Gly Pro Pro Gly 770 775 780 Met Thr Gly Phe Pro Gly Ala Ala Gly Arg Thr Gly Pro Pro Gly Pro 785 790 795 800 Ser Gly Ile Ser Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Ala Gly Lys Glu 805 810 815 Gly Leu Arg Gly Pro Arg Gly Asp Gln Gly Pro Val Gly Arg Thr Gly 820 825 830 Glu Val Gly Ala Val Gly Pro Pro Gly Phe Ala Gly Glu Lys Gly Pro 835 840 845 Ser Gly Glu Ala Gly Thr Ala Gly Pro Pro Gly Thr Pro Gly Pro Gln 850 855 860 Gly Leu Leu Gly Ala Pro Gly Ile Leu Gly Leu Pro Gly Ser Arg Gly 865 870 875 880 Glu Arg Gly Leu Pro Gly Val Ala Gly Ala Val Gly Glu Pro Gly Pro 885 890 895 Leu Gly Ile Ala Gly Pro Pro Gly Ala Arg Gly Pro Pro Gly Ala Val 900 905 910 Gly Ser Pro Gly Val Asn Gly Ala Pro Gly Glu Ala Gly Arg Asp Gly 915 920 925 Asn Pro Gly Asn Asp Gly Pro Pro Gly Arg Asp Gly Gln Pro Gly His 930 935 940 Lys Gly Glu Arg Gly Tyr Pro Gly Asn Ile Gly Pro Val Gly Ala Ala 945 950 955 960 Gly Ala Pro Gly Pro His Gly Pro Val Gly Pro Ala Gly Lys His Gly 965 970 975 Asn Arg Gly Glu Thr Gly Pro Ser Gly Pro Val Gly Pro Ala Gly Ala 980 985 990 Val Gly Pro Arg Gly Pro Ser Gly Pro Gln Gly Ile Arg Gly Asp Lys 995 1000 1005 Gly Glu Pro Gly Glu Lys Gly Pro Arg Gly Leu Pro Gly Leu Lys 1010 1015 1020 Gly His Asn Gly Leu Gln Gly Leu Pro Gly Ile Ala Gly His His 1025 1030 1035 Gly Asp Gln Gly Ala Pro Gly Ser Val Gly Pro Ala Gly Pro Arg 1040 1045 1050 Gly Pro Ala Gly Pro Ser Gly Pro Ala Gly Lys Asp Gly Arg Thr 1055 1060 1065 Gly His Pro Gly Thr Val Gly Pro Ala Gly Ile Arg Gly Pro Gln 1070 1075 1080 Gly His Gln Gly Pro Ala Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro 1085 1090 1095 Gly Pro Pro Gly Val Ser Gly Gly Gly Tyr Asp Phe Gly Tyr Asp 1100 1105 1110 Gly Asp Phe Tyr Arg Ala Asp Gln Pro Arg Ser Ala Pro Ser Leu 1115 1120 1125 Arg Pro Lys Asp Tyr Glu Val Asp Ala Thr Leu Lys Ser Leu Asn 1130 1135 1140 Asn Gln Ile Glu Thr Leu Leu Thr 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Lys Gly Pro Ser Gly Asp Arg Gly Asp Arg 180 185 190 Gly Glu Arg Gly Val Pro Gly Gln Thr Gly Ser Ala Gly Asn Val Gly 195 200 205 Glu Asp Gly Glu Gln Gly Gly Lys Gly Val Asp Gly Ala Ser Gly Pro 210 215 220 Ser Gly Ala Leu Gly Ala Arg Gly Pro Pro Gly Ser Arg Gly Asp Thr 225 230 235 240 Gly Ala Val Gly Pro Pro Gly Pro Thr Gly Arg Ser Gly Leu Pro Gly 245 250 255 Asn Ala Gly Gln Lys Gly Pro Ser Gly Glu Pro Gly Ser Pro Gly Lys 260 265 270 Ala Gly Ser Ala Gly Glu Gln Gly Pro Pro Gly Lys Asp Gly Ser Asn 275 280 285 Gly Glu Pro Gly Ser Pro Gly Lys Glu Gly Glu Arg Gly Leu Ala Gly 290 295 300 Pro Pro Gly Pro Asp Gly Arg Arg Gly Glu Thr Gly Ser Pro Gly Ile 305 310 315 320 Ala Gly Ala Leu Gly Lys Pro Gly Leu Glu Gly Pro Lys Gly Tyr Pro 325 330 335 Gly Leu Arg Gly Arg Asp Gly Thr Asn Gly Lys Arg Gly Glu Gln Gly 340 345 350 Glu Thr Gly Pro Asp Gly Val Arg Gly Ile Pro Gly Asn Asp Gly Gln 355 360 365 Ser Gly Lys Pro Gly Ile Asp Gly Ile Asp Gly Thr Asn Gly Gln Pro 370 375 380 Gly Glu Ala Gly Tyr Gln Gly Gly Arg Gly Thr Arg Gly Gln Leu Gly 385 390 395 400 Glu Thr Gly Asp Val Gly Gln Asn Gly Asp Arg Gly Ala Pro Gly Pro 405 410 415 Asp Gly Ser Lys Gly Ser Ala Gly Arg Pro Gly Leu Arg 420 425 <210> 34 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic His tag <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(30) <223> This sequence may encompass 2-30 residues <400> 34 His His His His His His His His His His His His His His His His 1 5 10 15 His His His His His His His His His His His His His His 20 25 30 <210> 35 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic His tag <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(20) <223> This sequence may encompass 2-20 residues <400> 35 His His His His His His His His His His His His His His His His 1 5 10 15 His His His His 20 <210> 36 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic His tag <220> <221> MISC_FEATURE 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Claims (48)

1. 비자연 발생의 단축형(truncated) 콜라겐을 피부에 국소 적용하는 것(예컨대, 단축형 콜라겐은 자연 발생의 인간 또는 해파리 콜라겐과 같은 자연 발생 콜라겐의 아미노산 서열에 비해 단축형 아미노산 서열이거나 이를 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드임)을 포함하는, 피부의 견고성, 탄력성, 명도, 보습, 촉각적 질감, 콜라겐 함량, 엘라스틴 함량, 발적 감소, 또는 시각적 질감을 증가시키는 방법.
2. 비자연 발생의 단축형 콜라겐을 피부에 국소 적용하는 것(예컨대, 단축형 콜라겐은 자연 발생의 인간 또는 해파리 콜라겐과 같은 자연 발생 콜라겐의 아미노산 서열에 비해 단축형 아미노산 서열이거나 이를 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드임)을 포함하는, 피부에 존재하는 선 또는 주름을 감소시키거나 피부의 홍반을 감소시키는 방법.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 비자연 발생의 단축형 콜라겐은 인간 콜라겐 또는 해파리 콜라겐인 방법.
4. 제1항 또는 제3항에 있어서, 단축형 콜라겐은 인간 콜라겐인 방법.
5. 제3항에 있어서, 인간 콜라겐은 C-말단에서 단축되거나, N-말단에서 단축되거나, 내부에서 단축되거나, 또는 C-말단과 N-말단 모두에서 단축된 것인 방법.
6. 제5항에 있어서, 인간 콜라겐은 C-말단과 N-말단 모두에서 단축된 것인 방법.
7. 제6항에 있어서, 콜라겐은 C-말단에서 10 내지 800 개의 아미노산이 단축되고/되거나 N-말단에서 10 내지 800 개의 아미노산이 단축된 것인 방법.
8. 제3항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 단축형 콜라겐은 10 내지 900 개 아미노산 길이, 10 내지 800 개 아미노산 길이, 10 내지 700 개 아미노산 길이, 10 내지 600 개 아미노산 길이, 10 내지 500 개 아미노산 길이, 10 내지 400 개 아미노산 길이, 10 내지 300 개 아미노산 길이, 10 내지 200 개 아미노산 길이, 10 내지 100 개 아미노산 길이, 10 내지 50 개 아미노산 길이, 50 내지 800 개 아미노산 길이, 50 내지 700 개 아미노산 길이, 50 내지 600 개 아미노산 길이, 50 내지 500 개 아미노산 길이, 50 내지 400 개 아미노산 길이, 50 내지 300 개 아미노산 길이, 50 내지 200 개 아미노산 길이, 또는 50 내지 100 개 아미노산 길이인 방법.
9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 콜라겐은 단축형 인간 21형 콜라겐인 방법.
10. 제9항에 있어서, 단축형 인간 21형 콜라겐은 서열번호 16인 방법.
11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 피부의 견고성은 큐토미터(cutometer)를 사용하여 측정될 때 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 70% 또는 75% 증가하는 것인 방법.
12. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 피부의 탄력성은 큐토미터에서 측정될 때 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 70% 또는 75% 증가하는 것인 방법.
13. 제12항에 있어서, 피부의 탄력성은 처리 1주 후에 큐토미터에서 측정될 때 적어도 8% 증가하는 것인 방법.
14. 제12항에 있어서, 피부의 탄력성은 처리 2주 후에 큐토미터에서 측정될 때 적어도 25% 증가하는 것인 방법.
15. 제12항에 있어서, 피부의 탄력성은 처리 2주 후에 큐토미터에서 측정될 때 적어도 30% 증가하는 것인 방법.
16. 제12항에 있어서, 피부의 탄력성은 처리 4주 후에 큐토미터에서 측정될 때 적어도 100% 증가하는 것인 방법.
17. 제13항 또는 제16항에 있어서, 비자연 발생의 단축형 콜라겐은, 0.1% w/w의 비자연 발생의 단축형 콜라겐을 포함하는 페이셜 세럼으로서 피부에 적용되는 것인 방법.
18. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 피부의 보습은 코르네오미터(corneometer)에서 측정될 때 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 70% 또는 75% 증가하는 것인 방법.
19. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 피부의 견고성은 전문 임상 채점자에 의해 결정될 때 개선되는 것인 방법.
20. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 피부의 탄력성은 전문 임상 채점자에 의해 결정될 때 개선되는 것인 방법.
21. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 피부의 명도는 전문 임상 채점자에 의해 결정될 때 개선되는 것인 방법.
22. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 피부의 콜라겐 함량은 시아스코프(SIAscope)에서 측정될 때 적어도 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 또는 15% 증가되는 것인 방법.
23. 제22항에 있어서, 피부의 콜라겐 함량은 2주 후에 적어도 5% 증가되는 것인 방법.
24. 제22항에 있어서, 피부의 콜라겐 함량은 2주 후에 적어도 7% 증가되는 것인 방법.
25. 제22항에 있어서, 피부의 콜라겐 함량은 4주 후에 적어도 9% 증가되는 것인 방법.
26. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 피부의 촉각적 질감은 전문 임상 채점자에 의해 결정될 때 개선되는 것인 방법.
27. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 피부의 시각적 질감은 전문 임상 채점자에 의해 결정될 때 개선되는 것인 방법.
28. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 피부에 존재하는 선 또는 주름은 전문 임상 채점자에 의해 결정될 때 감소되는 것인 방법.
29. 제28항에 있어서, 피부에 존재하는 선 또는 주름은 전문 임상 채점자에 의해 결정될 때 적어도 10% 감소되는 것인 방법. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 피부의 홍반은 전문 임상 채점자에 의해 결정될 때 감소되는 것인 방법.
30. 제29항에 있어서, 피부의 홍반은, 국소 적용 2주 후에 전문 임상 채점자에 의해 결정될 때 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 또는 45% 감소되는 것인 방법.
31. 제29항에 있어서, 피부의 홍반은, 국소 적용 4주 후에 전문 임상 채점자에 의해 결정될 때 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 45%, 50%, 또는 55% 감소되는 것인 방법.
32. 비자연 발생의 단축형 콜라겐을 피부에 국소 적용하는 것을 포함하는, 피부 세포에서 콜라겐 생산을 자극하는 방법.
33. 제32항에 있어서, 비자연 발생의 단축형 콜라겐은 인간 콜라겐인 방법.
34. 제33항에 있어서, 인간 콜라겐은 C-말단에서 단축되거나, N-말단에서 단축되거나, 내부에서 단축되거나, 또는 C-말단과 N-말단 모두에서 단축된 것인 방법.
35. 제34항에 있어서, 인간 콜라겐은 C-말단과 N-말단 모두에서 단축된 것인 방법.
36. 제35항에 있어서, 콜라겐은 C-말단에서 10 내지 800 개의 아미노산이 단축되고/되거나 N-말단에서 10 내지 800 개의 아미노산이 단축된 것인 방법.
37. 제33항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 단축형 콜라겐은 10 내지 900 개 아미노산 길이, 10 내지 800 개 아미노산 길이, 10 내지 700 개 아미노산 길이, 10 내지 600 개 아미노산 길이, 10 내지 500 개 아미노산 길이, 10 내지 400 개 아미노산 길이, 10 내지 300 개 아미노산 길이, 10 내지 200 개 아미노산 길이, 10 내지 100 개 아미노산 길이, 10 내지 50 개 아미노산 길이, 50 내지 800 개 아미노산 길이, 50 내지 700 개 아미노산 길이, 50 내지 600 개 아미노산 길이, 50 내지 500 개 아미노산 길이, 50 내지 400 개 아미노산 길이, 50 내지 300 개 아미노산 길이, 50 내지 200 개 아미노산 길이, 또는 50 내지 100 개 아미노산 길이인 방법.
38. 제32항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 콜라겐은 단축형 인간 21형 콜라겐인 방법.
39. 제38항에 있어서, 단축형 인간 21형 콜라겐은 서열번호 16인 방법.
40. 제32항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 피부 내의 콜라겐이 적어도 1%, 적어도 2%, 적어도 3%, 적어도 4%, 적어도 5%, 적어도 6%, 적어도 7%, 적어도 8%, 적어도 9%, 또는 적어도 10% 증가하는 것인 방법.
41. 제32항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 피부 내의 콜라겐이 적어도 1%, 적어도 2%, 적어도 3%, 적어도 4%, 적어도 5%, 적어도 6%, 적어도 7%, 적어도 8%, 적어도 9%, 또는 적어도 10% 증가하는 것인 방법.
42. 단축형 인간 21형 콜라겐과, 물, 오일 글리세레스-8 에스테르, 글리세린, 코코넛 알칸, 하이드록시에틸 아크릴레이트/나트륨 아크릴로일디메틸 타우레이트 공중합체, 펜틸렌 글리콜, 이나트륨 EDTA, 카프릴릴 글리콜, 클로르페네신 및 페녹시에탄올로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 추가 성분을 포함하는 국소 제제.
43. 제42항에 있어서, 단축형 인간 21형 콜라겐은 서열번호 16인 국소 제제.
44. 제42항 또는 제43항에 있어서, 오일은 식물성 오일, 바람직하게는 올리브 오일인 국소 제제.
45. 제43항 또는 제44항에 있어서, 상기 단축형 인간 21형 콜라겐은 인간 1차 섬유아세포에 적용될 때, 해양 콜라겐이 인간 1차 섬유아세포에 적용될 때보다 높은 수준으로 엘라스틴 발현을 상향조절하는 것인 국소 제제.
46. 단축형 해파리 콜라겐과, 물, 오일 글리세레스-8 에스테르, 글리세린, 코코넛 알칸, 하이드록시에틸 아크릴레이트/나트륨 아크릴로일디메틸 타우레이트 공중합체, 펜틸렌 글리콜, 이나트륨 EDTA, 카프릴릴 글리콜, 클로르페네신 및 페녹시에탄올로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 추가 성분을 포함하는 국소 제제.
47. 제46항에 있어서, 단축형 해파리는 서열번호 5인 국소 제제.
48. 제46항 또는 제47항에 있어서, 오일은 식물성 오일, 바람직하게는 올리브 오일인 국소 제제.

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