KR20210062051A - 이중 작용 CD1d 면역글로불린 - Google Patents

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Abstract

현 발명은 면역학 분야에 관련되며, 좀 더 특별히 인간 CD1d에 결합하는 결합 잔기 및/또는 면역 글로불린 분야에 관련되는 것으로, 자연 살상 T-세포 (natural killer T-cells) 및 감마-델타 T-세포 (gamma-delta T-cells)를 포함하는, CD1d- 제한적인 T 세포의 강화된 활성화 및 감소된 활성화, 및 CD1d를 발현하는 세포의 기능을 조절하는 것과 같은 CD1d-중개하는 생물학적 기능을 수정하는 항체 및 이의 단편을 포함한다. 본 발명은 또한 CD1d 및 감마-델타 TCR 및/또는 종양 타겟에 결합하는 이중-, 삼중-, 또는 다중-특이성 면역글로불린에 관한 것이다. 본 발명은 더 나아가 그러한 단일-, 이중-, 및 삼중-, 또는 다중-특이성 결합 잔기 및/또는 면역글로불린의 질환 또는 장애 치료에서의 약학적 제제 및 용도에 관한 것이다.

Description

이중 작용 CD1d 면역글로불린
본 발명은 면역학 분야에 관한 것으로, 특히 자연 살상 T-세포 (natural killer T cell) (NKT) 및 감마(γ)-델타(δ) T 세포를 포함하는, CD1d-제한적인 T 세포 (CD1d-restricted T-cells)의 활성화 및 차단, 및 CD1d를 발현하는 세포의 기능 조절을 하는 것과 같은 CD1d-매개하는 생물학적 기능을 수정하는 항체 또는 이의 단편을 포함하는, 인간 CD1d에 결합하는 결합분자 및/또는 면역글로불린 분야에 관한 것이다. 본 발명은 또한 CD1d 및 γδ T 세포 수용체 (TCR) 및/또는 종양 타겟에 결합하는 이중-, 삼중-, 또는 다중-특이 결합 분자 및/또는 면역글로불린에 관련된다. 본 발명은 더 나아가, 약학적 제제 및 그러한 단일-, 이중-, 삼중-, 또는 다중-특이 결합 분자 및/또는 면역글로불린의 질환 또는 장애의 치료에 사용하는 것과 관련된다.
CD1d는 당단백질 계 (CD1a, CD1b, CD1c, CD1d 및 CD1e) CD1 (분화 클러스터 1) (cluster of differentiation 1) 의 한 구성원이며 및 항원 표시 세포 (antigen presenting cells) (APC)를 포함하는, 여러 가지 세포 표면에 발현된다. 이들은 클래스 IMHC (Class I MHC) 단백질과 관련되는, 비-고전적인 MHC 단백질이며, T 세포 아군 (subgroup)에 지질 항원 표시에 관련된다. 인간에게서는 CD1d는, 또한, R3G1으로도 알려진 CD1D에 의해 암호화된다. CD1d를 표시하는 APC에는 B-세포, 수지상 세포 (dendritic cells)(예를 들어, 림프절에서), 및 단핵세포 (monocytes)가 포함된다. CD1d는 또한, 다른 여러 세포 형 (cell type), 예를 들어, 간, 췌장, 피부, 신장, 자궁, 결막 (conjunctiva), 부고환 (epididymis), 흉선 (thymus) 및 tonsil (편도선)에 의해 발현된다(Canchis et al. (1992) Immunology 80:561).
CD1d를 통해 활성화/자극되는 세포에는 CD1d 제한적인 자연 살상 T 세포 (NKT 세포)가 포함된다. NKT 세포는 T 세포와 자연 살상 세포 둘 다의 성질을 공유하는 이질적인 집단의 T 세포이다. NKT 세포는 NK 세포와 전형적으로 연관된 다양한 분자 마커는 물론, 알파 (α)/베타 (β) T-세포 수용체 (TCR)를 발현하는 T-세포의 서브셋트 (subset)이다.
타입 1 또는 불변하는 NKT (invariant NKT)(iNKT) 세포는 가장 잘 연구된 군의 NKT 세포이며 이들의 T-세포 수용체들은 다양성에서 아주 더 제한적이라는 점에서 ('불변')('invariant') 전통적인 αβ-T 세포와는 다르다. 이들 불변체는, 또한, 다른 CD1d-제한적인, NKT (타입 II NKT)도, APC에 존재하는 CD1d 분자에 의해 제시되는, 지질, 당지질, 설파티드 (sulfatides), 인지질, 리포펩티드 (lipopeptides), 소수성 펩티드 (hydrophobic peptides) 및/또는 양성 알파-헤릭스 펩티드 (amphipathic α-helical peptides)와 같은, 몇 가지 항원들 (자체 또는 외부의)을 인식한다 (Enrico Girardi et al. (2016) J Biol Chem. 291(20): 10677). (항원-제시하는) CD1d 및 TCR 사이의 상호작용은 인터페론-감마 (interferon-γ), 종양 괴사 인자-알파 (tumor necrosis factor-α), 및 IL-4, IL-5 및 IL- 13 와 같은 인터루킨 (interleukins)과 같은 Th1- 및/또는 Th2-유사 사이토카인을 포함하는, 사이토카인의 방출을 촉발한다.
α-갈락토실세레마이드 (α-galactosylceramide), KRN7000, 는 시험관 및 생체 내에서 NKT 세포 활성화에서 지질-결합하는 CD1d의 가장 잘 연구된 리간드이다. 다른 리간드들에는 이소글로보트리헥소실세레마이드 (isoglobotrihexosylceramide) (생쥐 iNKT 세포용), (미생물-유래) 글라이쿠로노실세레마이드 (glycuronosylceramides), α-C-갈락토실세레마이드 (α-C-galactosylceramides), 트레이톨 세레마이드 (threitol ceramide), 및 라이소포스파디딜콜린 (lysophophatidylcholine) 및 라이소스핑고마에린 (lysosphingomyelin) 과 같은 다양한 (인간 및 비 인간) 당지질 (glycolipids) 이 포함 된다 (Fox et al (2009) PLOS Biology 7:10:e1000228).
iNKT 세포의 중요한 역할은 자가면역 (autoimmune), 알러지 (allergic), 항미생물 (antimicrobial), 및 항종양 면역 반응 (antitumor immune responses) 조절에서 입증되었다 (van der Vliet et al. (2004) Clin Immunol 112(1): 8). 생리학적으로, NKT-세포는, 다발성 골수종 세포에서 세포 죽음의 유도를 포함하는, 상황에 따라 다양한 기전을 통해 (Yue et al. (2010) J Immunol 184: 268), 항종양, 자가면역, 및 항-독성물질 반응을 포함하는 면역반응을 증강 또는 억제할 수 있다. (불변하는) NKT-세포가 관여될 수 있는 컨디션에는 중증근무력증 (myasthenia gravis), 마른버짐 (psoriasis), 궤양성 대장염 (ulcerative colitis), 원발 쓸개관 간경화 (primary biliary cirrhosis), 대장염 (colitis), 자가면역 간염 (autoimmune hepatitis), 동맥경화증 (atherosclerosis), 및 천식(asthma)을 포함하는, 자가면역 또는 염증성 질환이 포함된다. 사이토카인 방출 이외에, 포퍼린 (perforin) 방출, 그랜자임 (granzyme) 방출 및 세포 죽음과 같은, 세포 용해의 결과가 되는 NKT 세포 이펙터(effector)의 기능은, 암에서와 같은 NKT 세포가 연루되는 컨디션에서도 또한 해당할 수 있다.
이들의 T 세포 수용체 (T cell receptor) (TCR) 용도 및 항원 특이성에 근거하여, CD1d-제한적인 NKT 세포는 두 개의 주요 서브세트 (subset)로 나뉜다: 표준 불변이적인 TCR α-체인 (canonical invariant TCR α-chain)을 사용하고 α-갈락토실세레마이드 (α-galactosylceramide) (α-GalCer)를 인식하는 타입 I NKT 세포 (type I NKT cells), 및 좀 더 다양한 αβ-TCR 레파토리 (repertoire)를 사용하고 및 α-GalCer를 인식하지 않는 타입 II NKT (type II NKT cells). 그 외에, 비-표준적인 αβ-TCR들을 (non-canonical αβ-TCRs) 사용하는 α-GalCer-반응성의 NKT 세포 및 γδ- 또는 δ/αβ-TCR들을 사용하는 CD1d-제한적인 T 세포가 동정 되었으며, CD1d-제한적인 T 세포들 간에 더 많은 다양성을 보여준다 (Macho-Fernandez and Brigl (2015) Front Immunol 6:362).
타입 I NKT 세포 (Type I NKT Cells)
1997년 카와노 (Kawano) 및 동료들에 의한 첫 번째 CD1d-제시하는 항원, α-갈락토실세레마이드 (α-galactosylceramide) (α-GalCer), 의 발견은 우리가 NKT 세포 생물학, 특히 타입 I 또는 불변적인 NKT (invariant NKT) (iNKT) 세포를 이해하는데 몇 가지 중요한 단계를 진전시키게 하였다 (Kawano et al. (1997) Science 278:1626). 타입 I NKT 세포는 생쥐에서 불변의 Vα14Jα18 TCR α-체인 및 인간에서 Vα24Jα18 을 발현하며, TCR β-체인들 (생쥐에서 Vβ8, Vβ7, Vβ2 및 인간에서 전형적으로 Vβ11) 의 제한적인 레파토리와 쌍을 이룬다. 타입 I NKT 세포는 평형 상태 (steady state) 에서도 매우 자동활성적일 수 있으며 및 활성화 마커 CD69, CD44, 및 CD122 (IL-2R β-체인)의 높은 표면 수준 및 림프절로 돌아오는 원천 T (na
Figure pct00001
ve T)세포에 의해 발현되는 마커, CD62L의 낮은 발현을 가지면서 활성화된/기억적인 표현형을 보일 수 있다 (Bendelac et al (1992) J Exp Med 175:731　; Matsuda et al. (2000) J Exp Med 192:741). 야생형 (WT) 생쥐에 비교하여 타입 I NKT 세포-결핍된 Jα18-/- 생쥐에서 자동으로 종양이 즉시 성장함을 보여준 것과 같이, 타입 I NKT 세포는 자연 항-종양 반응에 중요하게 기여한다 (Smyth et al. (2000) J Exp Med 191:661; Swann et al (2009) Blood 113:6382; Bellone et al (2010) PLoS One 5:e8646). 더 나아가, α-GalCer에 의한 타입 I NKT 세포의 활성화는 이의 IFN-γ-생산 및 이어지는 수지상 세포 (dendritic cells) (DC) 및 NK 세포의 활성화를 통해 혈액암 및 고형 종양에 대해 강력한 효과를 제공한다 (Smyth et al (2002) Blood 99:1259; Berzofsky and Terabe (2008) J Immunol 180:3627). 반면에, 설파티드-활성화된 (sulfatide-activated) 타입 II NKT 세포들은 α-GalCer에 따른 반응, 사이토카인 분비 및 확장 측면에서, 타입 I NKT 세포의 활성화를 상쇄시켜 (Ambrosino et al (2007) J Immunol 179:5126) 항-종양 면역을 억제한다 (Terabe et al (2000) Nat Immunol 1:515; Terabe et al (2005) J Exp Med 202:1627; Renukaradhya et al (2008) Blood 111:5637). 더 나아가, 이들의 IL-13 생산은, TNF-α와 조합하여, 골수-유래 억제 세포 (myeloid-derived suppressor cells) (MDSC)에 의한 TGF-β 분비의 상향 조절을 초래하며, 및 감소된 세포독성 T 세포 활성의 결과를 가져온다 (Terabe et al (2003) J Exp Med 198:1741).
타입 II NKT 세포 (Type II NKT Cells)
Vα14-Jα18 재배열 (rearrangement) 을 발현하지 않고 및 α-GalCer를 인식하지 않는 CD1d-제한적인 T 세포는 남은 CD4+ T 세포 중에서 MHC II-결핍된 생쥐에서 처음 서술되었다 (Cardell Set al (1995) J Exp Med 182:993). 그로부터 다양한 NKT (diverse NKT) (dNKT), 타입 II NKT (type II NKT), 또는 변이 NKT (variant NKT) (vNKT) 세포로 불리는, 생쥐 및 인간 둘 다에서 발견된, 이 NKT 집단은 좀 더 이질적인 TCR 레파토리를 보여 준다. 몇 가지 증거가 타입 II NKT 세포는, 때때로 타입 I NKT 세포에 반대하는 역할로, 일련의 범위의 면역 반응에 기여하고 및 조절할 수 있음을 제시한다.
γδ T 세포
αβ TCR들을 가진 CD1d-제한적인 T 세포 이외에, γδ TCR들을 발현하는 CD1d-제한적인 T 세포가 최근에 생쥐와 인간 둘 다에서 서술되었다. 이들의 Vδ-체인 발현에 따라, 인간 γδ T 세포는 두 가지 주 집단으로 나뉠 수 있다: Vδ2+ 및 "비-Vδ2" 서브세트로, 후자는 그 중에서도, Vδ1+γδ T 세포 및 덜 흔한 Vδ3+γδ T 세포를 포함한다 (McVay et al (1999) Crit Rev Immunol 19:431; Vantourout and Hayday (2013) Nat Rev Immunol 13:88). Vδ1+γδ T 세포는 주로 조직에 존재하며 및 피부 내 및 점막 표면에서 발견되며, 반면에, Vδ2+γδ T 세포는 인간 혈액에서 우세하게 존재한다. αβ T 세포에 비교하여, γδ T 세포에 의해 인식되는 항원 타입 및 γδ TCR 인식에서 항원 제시의 역할과 기능은 훨씬 덜 분명하다. 흥미롭게도, 어떤 γδ T 세포는 최근 직접적으로 CD1d-제시하는 지질 항원을 인식하는 것이 발견되었다 (Hayday and Vantourout (2013) Immunity 39:994). 2013년에, 울드리치 등은 ((Uldrich et al (2013) Nature Immunol 14: 1137)) GalCer를 포함하는, 선택적인 당 지질 항원과 조합하여 CD1d를 인식하는 γδ-T 세포 집단을 동정하였다. 이 T 세포들은 CD1d-제한적인 Vδ1+ T 세포로 불린다. 이론에 얽매임이 없이, Vδ1+ T 세포는 효과적인 항-암 반응에 역효과를 낼 수 있는 염증 반응을 낼 수 있다고 믿는다.
상기 제시된 이유 때문에, CD1d-매개하는 효과의 조절은 잠재적인 치료적 유익성이 있다. 시험관 및 생체 내 둘 다에서, CD1d에 특이적으로 결합하고 및/또는 상호작용할 수 있는 결합 분자가 현재 필요한 상황이다. 특히 결합하고 및/또는 이것에만 국한하지 않으나, NKT-세포 활성화와 같은 CD1d가 관여하는 생물학적 기능들을 조절하는 (활성화 또는 억제) 그러한 결합 분자가 필요하다. 그러한 결합 분자는, 예를 들어, CD1d-매개하는 기능이 역할을 하는 여러 다양한 질병에서 유익함을 보여줄 수 있다.
본 발명가들은 CD1d 리간드 필요없이, iNKT 세포 (타입 I NKT)를 특이적으로 활성화하는 1D12 또는 VHH 12로 지정한, 단일 도메인 항체를 이전에 동정한 바 있다 (WO2016122320). 현 발명은 1D12가 iNKT 세포를 활성화할 수 있을 뿐만 아니라, 동시에 CD1d-제한적인 Vδ1+ T 세포의 활성화를 차단할 수 있음을 최초로 보여준다. 이 관찰은 현재 1D12 가 CD1d-제한적인 Vδ1+ T 세포의 활성화에 의해 원인이 되고, 유지되고 및/또는 전파되는 질환의 치료에 사용될 수 있다는 사실을 유도한다. 전문가는 이러한 특별한 사용은 1D12에만 국한하지 않고, 기능적으로 및/또는 구조적으로 1D12 과 비슷한 어떤 항체에도 적용된다는 것을 주지할 것이다.
첫 번째 관점에서, 본 발명은 CD1d-제한적인 Vδ1+ T 세포의 활성화에 의해 원인이 되고, 유지되고 및/또는 전파되는 질환의 치료에 사용을 위한, CD1d 분자에 결합하는 데 있어 단일 도메인 항체 1D12 (서열번호 4) 와 경쟁할 수 있는 첫 번째 결합 잔기를 포함하는 결합 분자를 제공한다.
두 번째 관점에서, 본 발명은 CD1d 분자에 결합하는 데 있어 항체 1D12 (서열번호 4) 와 경쟁할 수 있는 첫 번째 결합 잔기를 포함하고 및 Vγ9Vδ2-TCR에 특이적으로 결합할 수 있는 두 번째 결합 잔기를 포함하는 결합 분자를 제공하며, 여기서 결합 분자는 Vγ9Vδ2 T 세포를 활성화할 수 있다. 본 발명자들은 이중 특이적인 (bispecific) CD1d/Vγ9Vδ2-TCR 항체는 iNKT 세포 및 Vγ9Vδ2-T 세포의 탈과립(degranulation)를 유도할 수 있고 및 CD1d-발현하는 종양세포의 성장을 조절할 수 있음을 보여 주었다. 더 나아가, 생쥐 다발성 골수종 (multiple myeloma) 모델에서, 이중 특이적인 CD1d/Vγ9Vδ2-TCR 항체를 iNKT 세포 및 γδ T 세포 둘 다에 주입하는 것은 항체 없이 iNKT 세포 및 γδ T 세포 혼합물 단독에 비교하여 생존을 상당히 지속시켰다.
더 나아간 관점에서, 본 발명은 본 발명의 두 번째 관점에 따르고 및 약학적으로 허용할 만한 부형제의 조성물을 제공한다.
좀 더 나아간 관점에서, 본 발명은 이들을 필요로하는 개체에게 본 발명에 따른 결합 분자를 투여하는 것을 포함하는 질환 또는 장애를 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명의 더 나아간 관점 및 실시예들이 하기에 서술된다.
도 1. 불변 자연 살상 T 세포 (invariant natural killer T) (iNKT)의 활성화 및 억제를 중개하는 항-CD1d VHH. iNKT CD25 발현 및 인터페론-γ (interferon γ)(IFN-γ) 생산은 iNKT 세포를 항-CD1d VHH 1D12 (100 nM) 로 또는 1D22 (1000 nM)로 조합하거나 또는 아니게 하여 운반체 대조군 (vehicle) 또는 αGalCer 로 펄스 시킨 (pulsed) CD1d-감염시킨 헬라 세포 (HeLa cells) 로 24-시간 동안 동시 배양 후에 측정되었다. iNKT 세포 IFNγ 생산의 현저한 증가 (1D12에 의한) 또는 감소 (1D22에 의한) (C 및 D) 이외에, CD25 발현으로 보여 준 대로 iNKT의 1D12에 의한 현저한 활성화 (A) 또는 1D22에 의한 억제를 보여주는 대표적인 점-플롯 (dot-plot). 데이터는 다른 공여자로부터 얻은 iNKT로 3-4 개별 실험의 평균 + SD, **P<0.01, ***P < 0.001 를 나타내고, 터키의 포스트 혹 테스트 (Turkey's post hoc test)로 변이를 원-웨이 분석 (one-way analysis)으로 분석하였다.
도 2. Vδ1-sulf-CD 1d 상호작용이 항-CD1d VHH 1D12에 의해 방해되고 및 1D22에 의해 감소 된다. 내부적인 또는 설파티드 로드된 (sulfatide loaded) CD1d-PE 테트라머들을 PBS (대조군), 1D12 또는 1D22 (4:1 VHH:CD1d 비율)와 배양하고 그 후 테트라머들은 CD3-APC와 조합으로 Jurkat-Vδ1 세포를 (최종 농도 테트라머 2 μg/ml) 염색하는데 사용되었다. 테트라머 결합은 1D12에 의해 방해되고 1D22에 의해 감소 된다 (A). C1R-CD1d 세포는 DMSO 대조군 또는 설파티드 (sulfatide) (25 μg/ml) 와 함께 배양시키고 그 후 배지 또는 항-CD1d VHH가 1000 또는 100 nM로 첨가되고 및 30분 동안 배양되었다. 그 다음 Jurkat-Vδ1 세포가 첨가되고 및 동시-배양액은 추가로 24시간 동안 배양되고 그 후 CD69 발현이 유동 세포분석 (flow cytometry)으로 측정되었다 (B). N=3.
도 3. VHH를 타겟팅하는 이중 특이적인 CD1d 및 Vγ9Vδ2-TCR에 의한 iNKT 세포 및 Vγ9Vδ2-T 세포의 이중 활성화로서 주효 세포 (effector cell) 탈과립 (degranulation) 및 빠른 종양세포 용해의 결과를 가져온다. CD1d-발현하는 CCRF-CEM 세포는 iNKT 세포나 또는 Vγ9Vδ2-T 세포 또는 둘 다와 배지 자체만, 단일가 1D12 또는 이중 특이적인 1D12-5C8 존재하에서 작동제 (effector) 대 타겟 (target 의 비율이 1:2로 배양시켰다. 1D12 존재하에서 iNKT 세포의 탄탄한 탈과립 (CD107a 발현으로 표시된 대로)이 관찰되었으나, 이중 특이적인 VHH의 존재하에서는 단지 iNKT 세포 및 Vγ9Vδ2-T 세포의 동시 탈과립이 보였다 (A). 따라서, 살아있는 CCRF-CEM 세포에서 현저한 감소가 관찰되었다 (B). 데이터는 다른 공여자로부터 얻은 NKT/ Vγ9Vδ2-T로 실험한 각 3개의 평균+SD를 나타낸다.
도 4. 이중 특이적인 1D12-5C8 은 iNKT 및 Vγ9Vδ2-T 세포 확장을 지지하고 및 종양 성장 조절을 유도한다. iNKT, Vγ9Vδ2-T, 또는 이들의 혼합 (2:3 비율)을 배지만 또는 이중 특이적인 1D12-5C8 존재하에서 작동제 대 타겟 1:10의 비율로 MM.1s-CD1d 세포와 배양시켰다. iNKT 세포 확장의 명확한 유도가 관찰되었으나, 그러나 Vγ9Vδ2-T 확장은 단지 1D12-5C8 및 iNKT 세포 존재하에서만 관찰되었다 (A). 주목할만하게도, 종양 성장은 1D12-5C8 존재하에서 억제되었다 (B). 데이터는 다른 공여자로부터 얻은 iNKT/ Vγ9Vδ2-T 쌍으로 실험한 각 3개 실험의 평균+SD를 나타낸다.
도 5. 항-CD1d VHH1D22은 아닌, 항-CD1d VHH 및 항-CD1d 51.1 mAb 가 1D12-5C8 이중 특이적인 VHH 의 결합을 방해한다. CD1d 감염된 다발성 골수종 세포 (MM.1s)는 PBS (음성 대조군, NC), 항-CD1d VHH (1000 nM) 또는 항-CD1d mAb) (100 nM) 와 45분 동안 배양시켰고 그 후 PBS (NC) 또는 바이오티닐화된 1D12-5C8 이중 특이적인 VHH (biotinylated 1D12-5C8 bispecific VHH) (100 nM)를 첨가시키고 및 30분 동안 추가로 더 배양시켰다. 대대적인 세척 후에 샘플은 스트랩타비딘-APC (straptavidin-APC)로 염색시키고 및 유동 세포분석으로 분석하였다. 데이터는 3번의 개별 실험의 평균 + SD, ****P < 0.0001, 을 나타내고, 터키의 포스트 혹 테스트 (Turkey's post hoc test)로 변이를 투-웨이 분석 (two-way analysis)으로 계산하였다.
도 6. 이중 특이적인 항체 1D12-5 C8는 iNKT 및/또는 γδ T 세포의 존재하에서 생쥐 다발성 골수종에서 생존을 증진한다. 패널 A는 항체 1D12-5C8 및/또는 iNKT 세포 투여의 생존에서의 효과를 보여준다. 패널 B는 항체 1D12-5C8 및/또는 γδ T 세포 투여의 효과를 보여준다. 패널 C는 항체 1D12-5C8 및/또는 iNKT 및 γδ T 세포의 혼합 ("mix의") 의 투여 효과를 보여준다.
상기 서술한 대로, 첫 번째 주 관점에서, 본 발명은 CD1d-제한적인 Vδ1+ T 세포의 활성화에 의해 원인이 되고, 유지되고 및/또는 전파되는 장애의 치료에 사용을 위한, CD1d 분자에 결합하는 데 있어 단일 도메인 항체 1D12 (서열번호 4) 와 경쟁할 수 있는 첫 번째 결합 잔기를 포함하는 결합 분자를 제공한다.
"CD1d-제한적인 Vδ1+ T 세포의 활성화에 의해 원인이 되고, 유지되고 및/또는 전파되는 장애"는 CD1d-제한적인 Vδ1+ T 세포 활성이 질환 또는 장애를 시작하고, 유지하고 또는 악화시키거나, 또는 질환 또는 장애의 예후 또는 진전에 부정적인 영향 (negative impact)을 주는 질환 또는 장애이다. 부정적인 영향은 Vδ1+ T-세포의 활성이 없을 경우와 비교하여 CD1d-제한적인 Vδ1+ T 세포의 활성 때문에 질환이 지속되고, 악화되거나, 또는 덜 약화되는 것을 의미한다. 바람직하게는, 부정적인 영향은 활성화된 Vδ1+ T-세포의 (항-)염증 효과 때문이다. 그러한 장애 또는 질환은 특별히 타입 1 헬퍼 T (type 1 helper T)(Th1) 세포 반응을 요구하고 및 세포의 타입 2 헬퍼 T (type 2 helper T)(Th2) 세포 반응에 의해 부정적으로 영향을 받는 그러한 질환들을 포함한다. "Th1" 및 "Th2" 세포 명칭은 이 분야 기술에서 잘 알려졌으며 및 Th1 세포는 세포 내 박테리아 및 바이러스와 같은, 세포 내 미생물 군에 대해 지배적으로 활성적이라고 일반적으로 믿으며, 반면에, Th2 세포는 원생동물 (protozoa)과 같은, 세포 외 미생물 군과 싸우기 위하여 체액 면역 체계 (humoral immune system)(B 세포, 호산구 등)를 지배적으로 활성화한다고 일반적으로 믿는다. 더 나아가, Th1 세포는 종양세포 죽이는 것을 촉진하며, 반면에 Th2 세포는 그러한 활성에 반대작용을 한다.
CD1d-제한적인 Vδ1+ T 세포 활성에 의해 장애가 일어나고, 유지되고 및/또는 전파되는 한 실시예는 CD1d-제한적인 말초 T 세포 림프종 (peripheral T cell lymphoma)(PTCL (Bachy et al (2016) J Exp Med 213 No. 5: 841)) 이다. 바람직한 실시예에서, 본 발명에 따른 용도를 위한 결합 분자가 제공되며, CD1d-제한적인 말초 T 세포 림프종 (CD1d-restricted peripheral T cell lymphoma) (PTCL), CD1d+ T-세포 급성 림프모구 백혈병 (CD1d+ T-cell acute lymphoblastic leukemia) (ALL), CD1d+ 림프종 (CD1d+ lymphoma), CD1d+ 만성림프성 백혈병 (CD1d+ chronic lymphocytic leukemia)(CLL), CD1d+ 급성 골수성 백혈병 (CD1d+ acute myelogenous leukemia) (AML), 및 CD1d+ 외투 세포 림프종 (CD1d+ mantle cell lymphoma)과 같은 혈액학적 악성종양 치료를 위한 용도, 바람직하게는 CD1d-제한적인 Vδ1+ PTCL (CD1d-restricted Vδ1+ PTCL)의 치료를 위한 용도의 결합분자를 제공한다.
본 발명에 따른 "결합 분자 (binding molecule)"는 어느 종류의 결합 분자가 될 수 있으며, 예를 들어, 본 발명에 의해 정의된 대로 첫 번째 결합 잔기를 포함하거나 또는 첫 번째 잔기로 구성되는 복합체인 한, 복합체가 될 수 있다, 바람직하게, 결합 분자는 폴리펩티드, 좀 더 바람직하게는 항체이다. 어떤 실시예에서 결합 분자는 인간 CD1d에 결합에서 1D12 (서열 번호 4) 와 경쟁할 수 있는 단지 첫 번째 잔기로 만 구성될 수 있다. 다른 실시예에서 결합 분자는 인간 CD1d에 결합에서 1D12 와 경쟁할 수 있는 첫 번째 잔기 및 라벨 (label)로 구성될 수 있다. 또한, 좀 더 나아간 실시예에서 결합 분자는 인간 CD1d에 결합에서 1D12 와 경쟁할 수 있고, 약학적으로 활성이 있는 제제 및/또는 다른 결합 잔기 (들)와 연결된 첫 번째 잔기를 포함할 수 있다. 그러므로 결합 분자는 단일 결합 잔기 또는 두 개, 세 개 또는 네 개의 결합 잔기와 같은 다중 결합 잔기를 포함할 수 있다. 바람직한 실시예에서, 결합 분자는, 바람직하게는 두 개의 다른 에피톱에 결합할 수 있는, 두 개의 결합 분자를 포함한다. 바람직하게는 에피톱들은 다른 타겟 (단백질)에 있다.
"항체 (antibody)" 라는 용어는 여기서 사용된 대로 면역글로불린 분자, 면역글로불린 분자의 한 단편, 또는 이중 하나의 유도체를 의미하려는 것이며, 이는 전형적인 생리적인 컨디션 하에서, 적어도 약 30분, 적어도 약 45분, 적어도 약 1시간, 적어도 약 2시간, 적어도 약 4시간, 적어도 약 8시간, 적어도 약 12시간, 약 24시간 또는 그 이상, 약 48시간 또는 그 이상, 약 3, 4, 5, 6, 7일 또는 그 이상, 등과 같은 상당한 시간의 반감기를 가지고, 또는 그 외 다른 상응하는 기능적으로-정의 된 기간 동안 ((항원에 결합하는 항체와 연관된 생리적 반응을 유도하고, 촉진하고, 강화하고, 및/또는 조절하는데 충분한 시간 및/또는 항체가 이펙터 활성 (effector activity)을 모집하기에 충분한 시간과 같은)) 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 갖추고 있다. 항원과 상호 작용하는 결합 부위는 (또는 결합 도메인) 면역글로불린 분자의 중쇄 및 경쇄 둘 다의 가변 부위를 포함한다. 항체 (Abs)의 고정 부위는 면역글로불린이 숙주 조직 또는, 면역계 (주효 세포 또는 T 세포와 같은)의 여러 다양한 세포들 및 보완성 활성화 (complement activation) 의 전형적인 경로에서 첫 번째 성분인 C1q와 같은 보완 시스템 (complement system)의 성분을 포함하는, 인자들에의 결합을 중개할 수 있다. 어떤 실시예에서, 그러나, 항체의 Fc 부위는 불활성화 (inert) 되도록 수정되었으며, "불활성화 (inert)"는 적어도 어떤 Fcγ 수용체에도 결합할 수 없고, Fc-중개하는 FcRs의 크로스-링킹 (cross-linking)을 유도할 수 없거나, 또는 항체와 같은 개별 단백질들의 두 개의 Fc 부위를 통해 타겟 항원의 FcR-매개하는 크로스-링킹을 유도할 수 없는 Fc 부위를 의미한다. 더 나아간 실시예에서, 불활성화 Fc 부위는 추가로 C1q에 결합할 수 없다. 한 실시예에서, 항체는 234 및 235 위치에 돌연변이를 포함한다 (Canfield and Morrison (1991) J Exp Med 173:1483)), 예를 들어 234 위치에서 Leu가 Phe으로 변이되고 및 235 위치에서 Leu 가 Glu로 변이된다. 다른 실시예에서, 항체는 234 위치에서 Leu가 Ala로 변이되고, 236 위치에서 Leu가 Ala로 변이되고 및 329 위치에서 Pro가 Gly로 변이된다.
상기 제시된 대로, 여기서 사용된 대로 항체란 용어는, 달리 언급되거나 또는 문맥상 명백하게 반대되지 않는 한, 항원에 결합하는 것과 같은, 특이적으로 상호작용하는 능력을 보유하고 있는 항체의 단편을 포함한다. 항체의 항원-결합하는 기능은 전장 항체의 단편에 의해 수행될 수 있음이 보였다. "항체"라는 용어 내에 포함되는 결합 단편의 예시들에는 (i) Fab' 또는 Fab 단편, VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 구성된 단일가 단편 (monovalent fragment) 또는 WO2007059782에 서술된 대로의 단일가 항체; (ii) F(ab')2 단편들, 힌지 부위 (hinge region)에서 이황화 브리지 (disulfide bridge)에 의해 연결된 두 개의 Fab 단편을 포함하는 이중가 단편 (bivalent fragments); (iii)기본적으로 VH 및 CH1 도메인으로 구성된 Fd 단편; 및 (iv) 기본적으로 항체의 단일 팔 (single arm)의 VL 및 VH 도메인으로 구성된 Fv 단편을 포함한다. 더 나아가, Fv 단편의 두 개의 도메인, VL 및 VH는 별개의 유전자에 의해 암호화되지만, 이들은, 재조합 방법을 사용하여, VL 및 VH 부위가 단일가 분자를 (단일 체인 항체 또는 단일 체인 Fv (scFv)로서 알려진)), 예를 들어, Bird et al., Science 242, 423-426 (1988) and Huston et al., PNAS USA 85, 5879-5883 (1988) 참조)) 형성하도록 쌍이 된 단일 단백질 체인으로서 만들어질 수 있게 하는 합성 링커 (synthetic linker)에 의해 결합 될 수 있다. 그러한 단일 체인 항체는 (single chain antibodies) 달리 기록되거나 또는 문맥에서 분명히 제시되지 않는 한 항체란 용어 내에 포함된다. 비록 그러한 단편들이 일반적으로 항체란 의미 내에 포함되지만, 이들은 총괄하여 및 각각 독립적으로 현 발명의 고유한 특징이며, 다른 생물학적 성질 및 용도를 보여준다. 현 발명의 문맥에서 이들 및 다른 유용한 항체 단편들이 더 나아가 여기서 논의된다. 항체란 용어는, 달리 명시하지 않는 한, 다클론 항체 (polyclonal antibodies), 단일클론 항체 (monoclonal antibodies) (mAbs), 키메릭 항체 (chimeric antibodies) 및 인간화 항체 (humanized antibodies), 및 효소적인 분열 (enzymatic cleavage), 펩티드 합성, 및 재조합 기술과 같은 어떤 알려진 기술에 의해 제공되는 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 유지하고 있는 항체 단편 (항원-결합 단편)을 포함한다는 것을 이해하여야 한다. 그렇게 생성된 항체는 어떠한 아이소타입 (isotype) 도 소유할 수 있다.
"면역글로불린 중쇄 (immunoglobulin heavy chain)", "면역글로불린의 중쇄 (heavy chain of an immunoglobulin)" 또는 "중쇄 (heavy chain)" 란 용어는 여기서 사용된 대로, 면역글로불린의 체인 (chain) 중 하나를 의미하고자 한다. 중
쇄는 전형적으로 면역글로불린의 아이소타입을 정의하는 중쇄 가변 부위 (heavy chain variable region) (여기서 VH 로 축약) 및 중쇄 고정 부위 (여기서 CH 로 축약) 로 구성된다. 중쇄 고정 부위는 전형적으로 세 개 도메인, CH1, CH2, 및 CH3로 구성된다. 중쇄 고정 부위는 더 나아가 힌지 부위 (hinge region)를 포함한다. 여기서 사용된 대로 "면역글로불린 (immunoglobulin)" 이란 용어는 이황화 결합 (disulfide bond)에 의해 모두 4개가 잠재적으로 상호-연결된, 두 쌍의 폴리펩티드 체인, 한 쌍의 경쇄 ((light (L) chains)) 및 한 쌍의 중쇄 ((heavy (H) chains)) 로 구성된, 구조적으로 당단백질과 관련된 부류를 의미하려는 의도이다. 면역글로불린 (예를 들어, IgG) 의 구조 내에, 두 개의 중쇄는 이황화 결합을 통해 소위 말하는 "힌지 부위 (hinge region)" 에서 서로 연결된다. 중쇄에 동일하게, 각 경쇄는 전형적으로 몇 가지 부위로 구성된다; 경쇄 가변 부위 (여기서 VL로 축약) 및 경쇄 고정 부위 (여기서 CL로 축약). 경쇄 고정 부위는 전형적으로 하나의 도메인, CL로 구성된다. 더 나아가, VH 및 VL 부위는 더 나아가, 뼈대 부위 (framework regions) (FRs) 라고 불리는, 좀 더 보수적인 부위로 간격이 되어 있는, 상보성 결정 부위 (complementarity determining regions) (CDRs) 라고도 또한, 불리는, 고도 변이성 부위들로 (또는 서열에서 고도변이 될 수 있고 및/또는 구조적으로 정의된 루프를 형성할 수 있는 고도 변이 부위), 다시 나누어질 수 있다. 각 VH 및 VL은 전형적으로 3개의 CDRs 및 4개의 FRs로 구성되며, 아미노-말단으로부터 카복시-말단으로 다음의 순서로 정렬된다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. CDR 서열은, 예를 들어 초이티아 및 레스크 (Choitia and Lesk (1987) J. Mol. Biol. 196:901) 또는 카벳 등 ((Kabat et al. (1991) Sequence of protein of immunological interest, fifth edition. NIH publication))이 제공한 방법과 같은 여러 가지 방법을 사용하여 결정될 수 있다. CDR 결정을 위한 다양한 벙법들 및 아미노산 번호 매김은 www.abysis.org (UCL)에서 비교될 수 있다.
여기서 사용한 대로 "아이소타입 (isotype)" 이란 용어는, 면역글로불린 아류 ((sub)class)) (예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgD, IgA, IgE, 또는 IgM) 또는 중쇄 고정 부위 유전자에 의해 암호화되는 IgG1m(za) 및 IgG1m(f) [서열 번호 407])와 같은, 이들의 어떠한 알로 타입 (allotype)을 의미한다. 그러므로 한 실시예에서, 항체는 IgG1 부류의 면역글로불린의 중쇄 또는 이의 어느 알로 타입을 포함한다. 더 나아가, 각 중쇄 아이소타입은 카파 (κ)나 또는 람다 (λ) 경쇄와 합쳐질 수 있다.
여기서 사용한 대로, "키메릭 항체 (chimeric antibody)" 라는 용어는, 가변 부위가 비-인간 종 (예를 들어, 쥐과로부터 유래) 으로부터 유래하고 및 고정 부위는, 인간과 같은, 다른 종으로부터 유래한 항체를 의미한다. 키메릭 항체들은 항체 조작 (antibody engineering)으로 생성될 수 있다. "항체 조작 (antibody engineering)" 은 다른 종류의 항체 수정에 사용되는 일반적인 용어이며, 및 이는 이 분야 기술 전문가에게는 잘-알려진 과정이다. 그러므로 키메릭 항체는 유전적으로 조작된 재조합 항체가 될 수 있다. 어떤 키메릭 항체는 유전적으로 또는 효소적으로 둘 다 조작될 수 있다. 키메릭 항체 제조는 이 분야 전문가의 지식 내에 있으며, 및 그러므로, 현 발명에 따른 키메릭 항체의 제조는 여기에서 서술된 방법보다 다른 방법에 의해 수행될 수 있다. 치료적 용도의 키메릭 단일클론 항체는 항체 면역성을 감소시키기 위하여 개발된다. 이들을 전형적으로, 관심 있는 항원에 특이적인, 비-인간 (예를 들어, 쥐) 가변 부위, 및 인간 고정 항체 중쇄 및 경쇄 도메인을 함유한다. 키메릭 항체의 문맥에서 사용된 대로, "가변 부위 (variable region)" 또는 "가변 도메인 (variable domains)" 이란 용어는 CDRs 및 면역글로불린의 중쇄 및 경쇄 둘 다의 뼈대 부위 (framework regions)를 포함하는 부위를 의미한다.
여기서 사용한 대로, "인간화 항체 (humanized antibody)"는 유전적으로 조작된 비-인간 항체를 의미하며, 이는 인간 항체 고정 도메인 및 인간 가변 도메인과 높은 수준의 서열 상동성이 포함되도록 수정된 비-인간 가변 도메인을 포함한다. 이는 6개의 비-인간 항체 상보성-결정 부위 (complementarity-determining regions) (CDRs)를 이식하여 얻을 수 있고, 이는 상동성이 있는 인간 수용체 뼈대 부위 (framework region) (FR)에, 항원 결합 부위를 함께 형성한다. 모체 항체의 결합 친화력 및 특이성을 전적으로 재구성하기 위하여, 모체 항체 (즉, 비-인간 항체)로부터의 뼈대 잔기 (framework residues)를 인간 뼈대 부위 ((역-돌연변이 (back-mutations)) 로 치환이 필요할 수도 있다. 구조적 상동성 모형화는 항체의 결합 성질에 중요한 뼈대 부위 내에서의 아미노산 잔기를 동정하는데 도움이 될 수 있다. 그러므로 인간화 항체는 비-인간 CDR 서열, 비-인간 아미노산 서열에 선택적으로 하나 또는 그 이상의 아미노산 역-돌연변이를 포함하는 주로 인간 뼈대 부위, 및 완전히 인간 고정 부위를 포함할 수 있다. 선택적으로, 친화력 및 생화학적 성질과 같은, 바람직한 성질을 갖는 인간화 항체를 얻기 위하여, 반드시 역-돌연변이일 필요는 없으나, 추가적인 아미노산 수정이 적용될 수 있다. 비-인간 기원한 항체의 아미노산 서열은 인간 기원한 항체로부터의 아미노산과 뚜렷이 다르며, 및 그러므로 비-인간 기원한 항체는 인간 환자에 투여할 때는 잠재적으로 면역성이 있다. 그러나 비-인간 기원한 항체임에도, 이의 CDR 조각은 항체가 이의 타겟 항원에 결합할 수 있게 하는 책임이 있으며 및 인간화는 항체의 특이성 및 결합 친화력을 유지하는 목표를 가진다. 그러므로 비-인간 치료 항체의 인간화는 사람에서 이의 면역성을 최소화하기 위하여 수행되며 그동안 그러한 인간화 항체는 동시에 비-인간 기원한 항체의 특이성 및 결합 친화력을 유지한다.
한 관점에서, 현 발명은 적어도 여기서 서술된 어느 관점 또는 실시예에 따른 결합 분자의 결합 잔기를 포함하고, 및 첫 번째 결합 부위보다 다른 하나 또는 그 이상의 타겟에 결합하는 하나 또는 그 이상의 결합 잔기를 포함하는 다중 특이성 항체 (multispecific antibody) 와 관련된다. 그러한 다중 특이성 항체는 이중 특이성 (bispecific), 삼중 특이성 (trispecific), 또는 사중 특이성 (tetraspecific) 항체일 수 있다.
"다중 특이성 항체 (multispecific antibody)"란 용어는, 적어도 세 개와 같은, 적어도 두 개의 다른 전형적으로 비-중복 에피톱의 특이성을 가진 항체를 의미한다. 그러한 에피톱은 같은 또는 다른 타겟에 있을 수 있다. 만약 에피톱이 다른 타겟에 있다면, 그러한 타겟은 같은 세포에 또는 다른 세포나 또는 세포 유형에 있을 수 있다.
"이중 특이성 항체 (bispecific antibody)" 란 용어는 적어도 두 개의 다른, 전형적으로 비-중복 에피톱의 특이성을 가진 항체를 의미한다. 그러한 에피톱은 같은 또는 다른 타겟에 있을 수 있다. 만약 에피톱이 다른 타겟에 있다면, 그러한 타겟은 같은 세포에 또는 다른 세포나 또는 세포 유형에 있을 수 있다. 한 실시예에서, 이중 특이성 항체는 첫 번째 및 두 번째 중쇄를 포함한다.
현 발명에서 사용될 수 있는 이중 특이성 항체 (bispecific antibody) 분자의 실시예에는 (i) 다른 항원-결합 부위를 포함하는 두 개의 팔 (arm)을 가진 단일 항체, (ii) 예를 들어, 추가의 펩티드 링커로 나란히 연결된 두 개의 scFvs를 통해, 두 개의 다른 에피톱에 특이성을 갖는 단일 체인 항체; (iii) 각 경쇄 및 중쇄가 짧은 펩티드 연결을 통해 두 개의 가변부위를 나란히 함유하고 있는, 이중-변이-도메인 항체 (dual-variable- domain antibody) (DVD-IgTM); (iv) 화학적으로-연결된 이중 특이성 (Fab')2 단편; (v) 두 개의 단일 체인 디아바디 (single chain diabodies)의 융합으로 각 타겟 항원에 대하여 두 개의 결합 부위를 갖는 4가의 이중 특이성 항체의 결과를 보이는, 탠드앱(TandAb®); (vi) 디아바디 (diabody)와 조합된 scFvs로 다 중가 분자 (multivalent molecule)의 결과가 되는, 프랙시바디 (flexibody); (vii) 단백질 키나아제 A (Protein Kinase A) 에 있는 "이량체화 및 도킹 도메인 (dimerization and docking domain)" 에 근거하고, Fabs 에 적용될 때, 하나의 다른 Fab 단편에 연결된 두 개의 동일한 Fab 단편으로 구성된 3가의 이중 특이성 결합 단백질을 생산할 수 있는, 소위 "덕-앤-록 분자 (dock and lock" molecule) (Dock-and-Lock®)라고 불리는 분자; (viii) 예를 들어, 인간 Fab-팔 (Fab-arm)의 양쪽 끝에 융합된 두 개의 scFvs 포함하는 소위 스코피온 분자 (Scorpion molecule)라 불리는 분자; 및 (ix) 디아바디 (diabody)를 포함한다.
다른 부류의 이중 특이성 항체의 실시예에는 이것에만 국한하지 않으나 (i) 이질적이량체화 (heterodimerization) 하게 하는, 상보성 CH3 도메인 (complementary CH3 domains)을 갖는 IgG-유사 분자; (ii) 분자의 두 측면이 적어도 두 개의 다른 항체의 Fab 단편 또는 Fab 단편의 일부를 포함하는, 재조합 IgG-유사 이중 타겟하는 분자; (iii) 전장 IgG 항체가 추가의 Fab 단편 또는 Fab 단편의 일부에 융합된, IgG 융합 분자; (iv) 단일 체인 Fv 분자 또는 안정화된 디아바디가 중쇄 고정-도메인, Fc-부위 또는 이의 일부에 융합된, Fc 융합 분자; (v) 다른 Fab-단편들이 서로 융합되고, 중쇄 고정-도메인, Fc-부위 또는 이의 일부에 융합된, Fab 융합 분자; 및 (vi) 다른 단일 체인 Fv 분자 또는 다른 디아바디들 또는 다른 중-쇄 항체 ((예를 들어, 도메인 항체들, 나노바디 (Nanobodies®)) 가 서로 융합되거나 또는 다른 단백질 또는 중쇄-고정-도메인, Fc-부위 또는 이의 일부분에 융합된 운반체 분자에 융합된, ScFv- 및 디아바디-근거한 및 중쇄 항체 ((예를 들어, 도메인 항체들, 나노바디 (Nanobodies®)) 를 포함한다.
상보성 CH3 도메인 분자를 가진 IgG-유사 분자의 실시예에는 이것에만 국한하지 않으나 트리오맵 (Triomab®) (Trion Pharma/Fresenius Biotech), 노브즈-인투-홀즈 (Knobs-into-Holes) (Genentech), 크로스맵스 (CrossMAbs) (Roche) 및 정전기적으로-맞는 것 (ectrostatically-matched) (Amgen, Chugai, Oncomed), LUZ-Y (Genentech, Wranik et al. J. Biol. Chem. 2012, 287(52): 43331-9, doi: 10.1074/jbc.M112.397869. Epub 2012 Nov 1), 디그-바디 및 피그-바디 (DIG-body and PIG-body) (Pharmabcine, WO2010134666, WO2014081202), 줄기 교환 조작된 도메인 바디 (Strand Exchange Engineered Domain body) (SEEDbody)(EMD Serono), 바이클로닉스 (Biclonics) (Merus, WO2013157953), Fc△Adp (Regeneron), 이중 특이성 IgG1 및 IgG2 (bispecific IgG1 and IgG2 ) (Pfizer/Rinat), 아지메트릭 스케폴드 (Azymetric scaffold) (Zymeworks/Merck,), mAb-Fv (Xencor), 이가 이중 특이성 항체 (bivalent bispecific antibodies) (Roche, WO2009080254) 및 두오바디 분자( DuoBody® molecules) (Genmab)를 포함한다.
재조합 IgG-유사 이중 타겟팅 분자의 실시예에는 이것에만 국한하지 않으나 이중 타겟팅 (DT)-Ig ((Dual Targeting (DT)-Ig)) (GSK/Domantis, WO2009058383), 투-인-원 항체 (Two-in-one Antibody) (Genentech, Bostrom, et al 2009. Science 323, 1610-1614), 크로스-링크된-Mabs (Cross-linked Mabs) (Karmanos Cancer Center), mAb2 (F-Star), 지바디TM (ZybodiesTM) (Zyngenia, LaFleur et al. MAbs. 2013 Mar-Apr;5(2):208-18), 공통 경쇄로 접근 (approaches with common light chain), κλ바디 (κλBodies) (NovImmune, WO2012023053) 및 코빅스-바디 (CovX-body®) (CovX/Pfizer, Doppalapudi, V.R., et al 2007. Bioorg. Med. Chem. Lett. 17,501-506) 가 포함된다.
IgG 융합 분자의 실시예에는 이것에만 국한하지 않으나 이중 가변 도메인 (DVD)-IgTM ((Dual Variable Domain (DVD)-IgTM)) (Abbott), 이중 도메인 이중 헤드 항체 (Dmual domain double head antibodies) (Unilever; Sanofi Aventis), IgG-유사 이중 특이적 (IgG-like Bispecific) (ImClone/Eli Lilly, Lewis et al. Nat Biotechnol. 2014 Feb;32(2):191-8), Ts2Ab (MedImmune/AZ, Dimasi et al. J Mol Biol. 2009 Oct 30;393(3):672-92) 및 BsAb (Zymogenetics, WO2010111625), HERCULES (Biogen Idec), scFv 융합 (scFv fusion) (Novartis), scFv 융합 (scFv fusion) (Changzhou Adam Biotech Inc) 및 TvAb (Roche)가 포함된다.
Fc 융합 분자의 실시예에는 이것에만 국한하지 않으나 scFv/Fc 융합 (scFv/Fc Fusions) (Academic Institution, Pearce et al Biochem Mol Biol Int. 1997 Sep;42(6):1179), 스코피온 (SCORPION) (Emergent BioSolutions/Trubion, Blankenship JW, et al. AACR 100th Annual meeting 2009 (Abstract #5465); Zymogenetics/BMS, WO2010111625), 이중 친화력 재타겟팅 기술 (Dual Affinity Retargeting Technology) (Fc-DARTTM) (MacroGenics) 및 이중(ScFv)2-Fab ((Dual(ScFv)2-Fab)) (National Research Center for Antibody Medicine - China)가 포함된다.
Fab 융합 이중 특이적 항체의 실시예에는 이것에만 국한하지 않으나 F(ab)2 (Medarex/AMGEN), 이중-작용 또는 Bis-Fab (Dual-Action or Bis-Fab) (Genentech), 덕-앤-록 (Dock-and-Lock®) (DNL) (ImmunoMedics), 이가 이중 특이적 (Bivalent Bispecific) (Biotecnol) 및 Fab-Fv (UCB-Celltech)가 포함된다.
ScFv-, 디아바디-근거한 및 도메인 항체들의 실시예에는 이것에만 국한하지 않으나 이중 특이성 T 세포 잉게이져 (Bispecific T Cell Engager) (BiTE®) (Micromet, 텐덤 디아바디 (Tandem Diabody) (Tandab) (Affimed), 이중 친화력 재타겟팅 기술 (dual Affinity Retargeting Technology) (DARTTM) (MacroGenics), 단일-체인 디아바디 (Single-chain Diabody) (Academic, Lawrence FEBS Lett. 1998 Apr 3;425(3):479-84), TCR-유사 항체 (TCR-like Antibodies) (AIT, ReceptorLogics), 인간 혈청 알부민 ScFv 융합 (Human Serum Albumin ScFv Fusion) (Merrimack, WO2010059315) 및 콤바디 분자 (COMBODY molecules) (Epigen Biotech, Zhu et al. Immunol Cell Biol. 2010 Aug;88(6):667-75), 이중 타겟팅 나노바디 (dual targeting nanobodies®) (Ablynx, Hmila et al., FASEB J. 2010), 이중 타겟팅 중쇄 뿐인 도메인 항체 (dual targeting heavy chain only domain antibodies) 를 포함한다.
현 발명의 문맥에서 "결합 잔기 (binding moiety)"는 한 잔기, 바람직하게는 폴리펩티드, 좀 더 바람직하게는 타겟에 특이적으로 결합할 수 있는, 항체다. 결합 잔기는, 예를 들어: 단일 클론 항체와 같은 온전한 면역글로불린을 포함할 수 있다. 다른 한편으로는, 결합 잔기는, 이것에만 국한하지 않으나, Fab, F(ab'), F(ab')2, Fv, dAb, Fd, 보완성 결정 부위 (complementarity determining region) (CDR) 단편, 단일 체인 항체 (single chain antibody) (scFv), 이가 단일 체인 항체 (divalent single chain antibody), 단일 체인 파지 항체 (single chain phage antibody), 이중 특이성 이중 체인 항체 (bispecific double chain antibody), 트리아바디 (triabody), 테트라바디 (tetrabody), 단일 도메인 항체 (single domain antibody) (nanobody®), 타겟에 특이적으로 결합하기에 충분한 적어도 하나의 아미노산을 함유하는 폴리 펩티드 ((poly)peptide) 및 플라스틱 항체와 같은, 인공 면역글로불린 단편 (Hoshino et al (2008) J Am Chem Soc 130(46):15242) 을 포함하는, 항원-결합하는 기능적 단편을 포함할 수 있다. 바람직한 실시예에서, 현 발명의 결합 잔기는 단일 도메인 항체이다. 바람직하게는, 현 발명의 결합 잔기는 세 개의 중쇄 CDRs을 포함한다.
여기서 사용된 대로 "특이적으로 결합하다 (specifically binds)"는 예를 들어 BIAcore 3000 장비에서 표면 플라스몬 공명 (surface plasmon resonance) (SPR) 기술로 항원을 리간드로서 사용하고 및 결합 잔기 또는 결합 분자를 피분석물로서 측정했을 때, 결합 잔기 또는 결합 분자가 미리 결정된 항원 또는 타겟 (예를 들어 인간 CD1d) 에 전형적으로 KD가 약 10-6 M 또는 미만, 예를 들어, 10-7 M 또는 미만, 약 10-8 M 또는 미만과 같은, 약 10-9 M 또는 미만과 같은, 약 10-10 M 또는 미만, 또는 약 10-11 M 또는 더 미만에 해당하는 친화력을 가지고 결합함을 의미하고, 및 미리 결정된 항원 또는 가깝게- 연관된 항원이 아닌 비-특이적인 항원 ((예를 들어, BSA, 카제인 (casein))에 결합하는 친화력이 적어도 100배 낮은 것과 같은 10-배 낮게, 예를 들어 적어도 10,000배 낮은 것과 같은 적어도 1000배 낮게, 예를 들어 적어도 100,000배 낮은 KD에 해당하는 친화력을 가지고 미리 결정된 항원에 결합함을 의미한다. 친화력이 더 낮은 정도는 결합 잔기 또는 결합 분자의 KD에 의존하며, 그래서 결합 잔기 또는 결합 분자의 KD가 매우 낮을 때 (즉, 결합 잔기 또는 결합 분자가 매우 특이적일 때), 비-특이적인 항원에 대한 친화력보다 항원에 대한 친화력의 정도가 더 낮은 정도는 적어도 10,000배 일 수 있다. 여기서 사용된 대로 "KD" (M) 란 용어는, 항원과 결합 잔기 또는 결합 분자 사이의 특별한 상호 작용의 해리 평형 항수 (dissociation equilibrium constant) 를 의미한다.
언급된 대로, 상기 서술된 결합 잔기는 인간 CD1d에의 결합에 단일 도메인 항체 1D12와 경쟁할 수 있다. 현 발명의 문맥에서, "경쟁 (competition)" 또는 "경쟁할 수 있는 (able to compete)" 또는 "경쟁하다 (compete)" 는 특정한 결합 분자 (예를 들어, CD1d 항체)가 결합 파트너에 결합하는 다른 분자의 존재하에서 (예를 들어, 다른 CD1d 항체) 특정한 결합 파트너에 (예를 들어, CD1d) 결합하는 경향에 있어서 어떤 검출될 만한 의미 있는 감소를 의미한다. 전형적으로, 경쟁은 예를 들어, 두 개 또는 그 이상의 경쟁하는 결합 분자 또는 잔기의 충분한 양을 사용하여 ELISA 분석 또는 유동 세포 분석에 의해 결정된 대로 다른 CD1d 결합 분자 또는 잔기의 존재가 원인이 되어, CD1D 결합 분자 또는 잔기 결합에서 적어도 약 50%와 같은, 예를 들어, 적어도 약 75%, 적어도 90% 감소와 같은, 적어도 약 25% 감소를 의미한다. 경쟁적 억제에 의한 결합 특이성을 결정하는 추가적인 방법들은 예를 들어 하로 등 ((Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1988)), 콜리간 등 (Colligan et al., eds., Current Protocols in Immunology, Greene Publishing Assoc, and Wiley InterScience N. Y., (1992, 1993)), 및 뮬러 ((Muller, Meth. Enzymol. 92, 589-601 (1983)) 에서 찾을 수 있다. 바람직하게, 현 발명의 결합 분자는 적어도 항체 1D12와 같은 CD1d 에피톱의 일부 또는 인접 부위에 (in the vicinity of) 결합하며, 좀 더 바람직하게는 1D12 와 같은 에피톱 또는 1D12의 에피톱과 겹치는 에피톱에 결합한다. 항체와 같은, 결합 분자의 에피톱을 측정하는 방법은 이 분야 기술에서 알려졌다. "인접한 (in the vicinity of)" 이란 의미는 결합 분자가 적어도 1D12의 CD1d에의 결합을 입체적으로 방해하도록 CD1d에 결합함을 의미한다. 현 발명의 결합 분자는 1D12와 같은 또는 다른 CDR 서열을 포함할 수 있다. 좀 더 바람직한 실시예에서, 현 발명의 결합 분자는 1D12와 동일한 CDR1 (서열 번호 1), CDR2 (서열 번호 2) 및 CDR3 (서열 번호 3) 서열을 포함한다. 가장 바람직한 실시예에서, 현 발명의 결합 분자는 1D12의 그것과 똑같은 서열 (서열 번호 4)을 포함하거나 또는 서열 번호 85에 제시한 서열을 포함한다.
상기 서술된 대로, 더 나아간 주요 관점에서, 본 발명은 CD1d 분자에 결합하는 데 있어 1D12 (서열 번호 4에 제시된 항체)와 경쟁할 수 있는 첫 번째 결합 잔기를 포함하고 및 Vγ9Vδ2-TCR에 특이적으로 결합할 수 있는 두 번째 결합 잔기를 포함하는 결합 분자를 제공한다. "Vγ9Vδ2-TCR에 특이적으로 결합 (Specifically binds to a Vγ9Vδ2-TCR)" 은 결합 분자가 Vγ9Vδ2-TCR에 결합하나, 결합 분자가 다른 서브유닛 없이는 별개의 서브유닛 중 하나에, 즉 Vγ9 체인 단독에 또는 Vδ2 체인 단독에 결합하는 것을 제외하지 않음을 의미한다. 예를 들어, 여기 표 2에서 볼 수 있는 대로, 항체 5C8은 Vγ9Vδ2-TCR에 결합하는 항체이나, Vδ2 체인이 홀로 발현될 때는 Vδ2 체인에 또한 결합한다.
바람직한 실시예에서, 결합 분자는 Vγ9Vδ2-TCR의 Vδ2 체인에 결합한다. 더 나아가, 바람직하게, 결합 분자는 이의 자연적인 리간드와는 독립적으로 Vγ9Vδ2 T 세포를 활성화 시킬 수 있다. 본 발명은 이중 특이적인 면역글로불린-복합체 (bispecific immunoglobulin-complex)를 포함하는 그러한 결합 분자는 Vδ1+ T 세포를 억제할 수 있고 및 (Vγ9)Vδ2+ T 세포를 활성화하게 한다는 통찰력을 제공한다. Vγ9Vδ2 T 세포의 활성화는 많은 질환의 치료에 유익하다. Vδ2 TCR 체인 특이 면역글로불린은 Vγ9 TCR 체인 특이 면역글로불린보다 바람직하다, 왜냐하면 Vγ9는, 예를 들어, Vδ1 TCR 체인과 짝을 이룰 수 있어, 잠재적으로 역효과적인 γδ-T 세포를 끌어 들이고 및 활성화 시키는 결과를 가져오기 때문이다.
"첫 번째 (first)" 및 두 번째 (second)" 결합 잔기는 결합 분자 내에서 이들의 방향/위치를 의미하는 것은 아니다, 즉 N- 또는 C-말단에 관한 한 아무 의미가 없다. 첫 번째 (first)" 및 두 번째 (second)" 란 용어는 단지 청구항 및 서술에서 두 개의 다른 결합 잔기를 정확하게 및 일정하게 언급하는데 사용할 뿐이다. 한 바람직한 실시예에서, 첫 번째 결합 잔기 및 두 번째 결합 잔기는 하나 또는 그 이상의 아마이드 결합 (amide bond(s))을 통해, 바람직하게는 링커, 좀 더 바람직하게는 아미노산 GGGS (서열 번호 83)을 포함하는 링커를 통해 서로 커플 된다. 펩티드 링커 (GGGGS)를 통해 연결된 첫 번째 및 두 번째 결합 잔기를 포함하는 본 발명에 따른 결합 분자의, 비-제한적인, 두 실시예는 표 1 (서열번호 84 및 서열 번호 87) 에 보여준다. "전장 항체 (full-length antibody)" 란 용어는 여기서 사용될 때는, 그 아이소타입의 야생형 항체에서 정상적으로 발견되는 그것에 해당하는 모든 중쇄 및 경쇄 고정 및 가변 도메인을 함유하는 항체를 의미한다.
현 발명의 문맥에서 "Vγ9Vδ2 T 세포를 활성화할 수 있는 (able to activate Vγ9Vδ2 T cells)" 은 Vγ9Vδ2 T 세포가 본 발명에 따른 결합 분자의 존재하에서, 특히 CD1d를 발현하는 타겟 세포의 존재하에서, 활성화되는 것을 의미한다. 바람직하게 Vγ9Vδ2 T 세포의 활성화는 유전자 발현 및/또는 (표면) 마커 발현 (예를 들어, CD25, CD69, 또는 CD107a와 같은 활성화 마커) 및/또는 분비 단백질 ((예를 들어, 사이토카인 (cytokines) 또는 케모카인 (chemokines)) 프로화일을 통해서 측정될 수 있다. 바람직한 실시예에서, 결합 분자는 Vγ9Vδ2 T에 의해서 활성화를 유도할 수 있고 (예를 들어, CD69의 상향 조절 및 CD25 발현) 결과적으로 탈과립화 (degranulation) (실시예 3 에서; CD107a 발현의 증가로 표시) 및 사이토카인 생산 (예를 들어, TNFα, IFNγ)을 유도할 수 있다. 바람직하게 Vγ9Vδ2 T 세포 활성화는 생체 내에서, 특히 본 발명에 따른 결합 분자가 투여된 인간 신체에서 일어나며 그 인간 신체는 Vγ9Vδ2 T 및 바람직하게는 CD1d+ 타겟 세포를 포함한다. 바람직하게는, 현 발명의 결합 분자는, 실시예 3 에서 서술된 에세이에 사용되었을 때, Vγ9Vδ2 T 세포에서 CD107a의 발현을 적어도 10%, 더 바람직하게는 적어도 20%, 좀 더 바람직하게는 적어도 40%, 가장 바람직하게는 90%로 증가시킬 수 있으며, 여기서 예를 들어, 10%는 총 세포 수의 10%가 CD107a 양성임을 의미한다. 다른 실시예에서, 본 발명의 결합 분자의 존재하에서, CD107a에 대해 양성인 세포의 수는 2-배와 같은 1.5-배, 예를 들어, 5-배, 증가한다.
비슷하게, iNKT 세포에 대해, 현 발명의 문맥에서 "활성화할 수 있는 (able to activate)" 은 iNKT 세포가 결합 분자 존재하에서 또는 본 발명에 따른 결합 분자의 사용에서, 특히 CD1 분자 존재하에서, 바람직하게는 세포 표면에 CD1d 분자의 존재하에서, 다르게 행동함을 의미한다. CD25 (실시예 1), CD69, CD107a (실시예 3) 와 같은 마커, 또는 IFNy (실시예 1), TNFα, IL-2 와 같은 사이토카인 (cytokines) / 케모카인 (chemokines) 이 iNKT 세포가 활성화되었는지를 결정하기 위하여 사용된다. 바람직하게 iNKT 세포의 활성화는 생체 내, 특히 본 발명에 따른 결합 분자가 투여된 인간 신체에서 일어나며 그 인간 신체는 iNKT 세포 및 바람직하게는 CD1d+ 타겟 세포를 포함한다. CD1d+ 타겟 세포는 정상 CD1d-발현하는 세포가 아닌 질환 병원성에 기여하는 CD1d+ 세포를 의미한다. 바람직하게는 현 발명의 결합 분자는, 실시예 3 에서 서술된 에세이에 사용되었을 때, iNKT 세포에서 CD107a 발현을 적어도 20%, 좀 더 바람직하게는 적어도 30%, 가장 바람직하게는 적어도 40%까지 증가시킬 수 있으며, 여기서 예를 들어, 10%는 총 세포 수의 10%가 CD107a 양성임을 의미한다. 다른 실시예에서, 본 발명의 결합 분자의 존재하에서, CD107a에 대해 양성인 세포의 수는 2-배와 같은 1.5-배, 예를 들어, 5-배, 증가한다. 더 나아가, 바람직하게 현 발명의 결합 분자는, 실시예 1에서 서술된 에세이에서 사용되었을 때, FACS에서 알로피코시아닌 (APC)-접합 된 CD25 ((allophycocyanin (APC)-conjugated CD25))를 사용하여 유동 세포분석에서 평균 형광 강도로 측정한 대로, "운반체 (vehicle)" 대조군에 비교하여 iNKT 세포에서 CD25의 발현을 적어도 10배, 좀 더 바람직하게는 적어도 20배, 가장 바람직하게는 적어도 30배 증가시킬 수 있다. 바람직하게는, 현 발명의 결합 분자는, 실시예 1에서 서술된 에세이에서 사용되었을 때, iNKT 세포에 의해 IFNy 발현을 적어도 2 배 또는 적어도 3-배와 같은, 적어도 1.5 배 증가시킬 수 있다.
이중 특이성 (또는 다중 특이성) 결합 분자는 바람직하게 Th1 타입 반응을 유도한다. 바람직한 실시예에서, 본 발명에 따른 첫 번째 및 두 번째 결합 잔기를 포함하는 결합 분자는 의약품으로 용도를 위하여, 바람직하게는 종양의 치료를 위하여 제공된다. 현 발명의 문맥상 내에서 종양은: 한 곳에서이거나 (예를 들어, 고형 종양) 또는 인간 신체에 분포된 (예를 들어, 전이), 비정상적인 조직의 덩어리를 의미한다. 그 이외에, 비정상적인 조직의 덩어리는 또한 전파된 종양 (예를 들어, 혈액학적 종양)을 언급함을 의미한다. 종양은 또한 염증의 고전적인 징후이다. 그러나 그러한 염증 (비-암적인) 종양 및 다른 비-악성 종양은 여기에서의 정의에 포함되지 않는다. 바람직한 실시예에서, 종양은 암이며, 특히 사망의 원인이 되는 잠재력을 가진 그런 것이다. 종양의 치료는 위치 및 종양의 유형에 특이적이다. 양성 종양은 때로는 무시될 수 있거나, 또는 수술을 통해 크기가 감소 (de bulked) 될 수 있거나 또는 전부 제거될 수 있다. 악성 또는 어떤 양성 종양을 위해, 선택은 화학요법치료, 방사성 치료 및 수술이 포함된다. 조혈 및 림프 조직 종양 (소위 혈액 종양)에는 그중에서도 ALL, A ML, CL, 소림프구 림프종(small lymphocytic lymphoma) (SLL), 만성 골수성 백혈병 (chronic myelogenous leukemia) (CML) 및 급성 단구성 백혈병(acute monocytic leukemia) (AMoL)과 같은 백혈병, 호치킨스 림프종 (Hodgkin's lymphomas) 및 비-호치킨스 림프종 (Non-Hodgkin's lymphomas)과 같은 림프중 (lymphomas), 및 골수종 (myelomas)을 또한 포함하고 및 함유한다.
바람직한 실시예에서, 본 발명에 따른 용도를 위하여, 본 발명에 따른 첫 번째 결합 잔기를 포함하는 결합 분자, 또는 첫 번째 및 두 번째 결합 잔기를 포함하는 결합 분자가 제공되며, 여기서 결합 분자는 Vδ1 T 세포 활성화를 감소시킬 수 있다. 이 문맥에서 Vδ1 T 세포 활성화를 감소시키는 것은 Vδ1 T 세포가 본 발명에서 정의 한 대로 결합 분자에 결합한 CD1d 분자에서 더는 이의 리간드를 인식할 수 없음을 의미한다. 그러한 감소한 Vδ1 T 세포 활성화는, 예를 들어, Vδ1+ T 세포에서 활성화 마커 CD69의 발현을 측정하여 결정할 수 있다. 더 낮은 CD69 발현 수준은 덜 활성화된 Vδ1+ T 세포, 예를 들어, 실시예 2 에서 사용된 저켓 세포 (Jurkat cells) 에서 관찰된다. 특히 Vδ1+ 종양 세포의 맥락에서 사용될 때, 차단은 본 발명에 따른 결합 분자의 존재는 종양 세포 성장 및/또는 생존력에 부정적 영향을 준다는 의미이다. 바람직하게, 저켓 세포에서 CD69 발현은, 실시예 2에서 서술된 대로의 에세이에서 검사 되었을 때 "운반체 (vehicle)" 대조군에 비교하여, 본 발명의 결합 분자에 의해 2-배 미만과 같은, 5-배 미만 증가한다.
바람직하게, 본 발명에 따른 용도의 결합 분자는 iNKT 세포를 활성화 시킬 수 있다. 이전에 언급한 대로, 본 발명자들은 1D12가, α-가락토실세레마이드(α-galactosylceramide)와 같은, iNKT 세포의 외부 리간드의 존재 여부와 상관없이, iNKT 세포를 활성화할 수 있음을 보였다. 현 발명은 더 나아가 Vδ1+ T 세포에 의한 CD1d의 인식은 그러한 결합 분자에 의해 차단될 수 있고 및 본 발명에 따른 결합 분자에 두 번째 결합 잔기의 존재는 Vδ2+ T 세포의 활성화를 할 수 있게 한다는 통찰력을 제공한다. 그러한 삼중 활성 결합 분자는, 즉 CD1d-제한적인 Vδ1+ T 세포 (CD1d-restricted Vδ1+ T cell) 활성화의 감소를 할 수 있고 및 iNKT 세포를 활성화할 수 있고, 및 동시에 Vδ2+ T 세포의 활성화를 하게 하는 분자는, Th1-타입 (Th1-type) 항-종양 반응 쪽으로 기울어진 반응의 미세-환경을 만든다. Vδ1+ T 세포 활성화의 감소, NKT 세포를 활성화, 및 Vδ2+ T 세포의 활성화는 종양-공격적인 미세-환경 쪽으로 협력 작용하여 종양-세포 살상을 효과적으로 촉진한다.
본 발명에 따른 결합 분자는 그러므로 Vδ1+ T 세포의 활성화를 감소시키고 및 iNKT 세포를 활성화할 뿐만 아니라, 또한 γδ-T 세포에 Vγ9Vδ2-TCR의 응집을 (clustering) 통하여 Vδ2+ T의 결합 및 활성화하는 것과 같이 수정이 될 수 있다. 이를 위해, 두 번째 결합 잔기가 본 발명에 따른 결합 분자 내에 포함된다. 이 두 번째 결합 잔기는 Vγ9Vδ2-TCR, 바람직하게는 Vδ2 체인에 결합할 수 있다. TCR의 Vδ2 체인 또는 Vγ9 체인에 결합하는, 그러한 몇 가지 항체들이 WO2015156673에 서술되었으며 및 표 1 및 표 2에 묘사되었다. 더 나아간 관점에서, 본 발명은 이를 요구하는 개체를 치료하는 방법을 제공하며, 첫 번째 및 두 번째 결합 잔기를 포함하는 본 발명에 따른 첫 번째 결합 분자를 개체에 투여를 포함하며, 여기서 이전에 정의한 대로의 CD1d에는 결합하는 결합 잔기를 포함하지만, Vγ9Vδ2-TCR에 결합하는 결합 잔기는 포함하지 않는 두 번째 결합 분자와 조합하여, 첫 번째 잔기는 CD1d에 결합하고 및 두 번째 결합 잔기는 Vγ9Vδ2-TCR에 결합한다. 그러한 조합 치료 (복합 치료)는 특히 만약 첫 번째 및 두 번째 결합 분자가 매우 다른 농도에서 효과를 가질 때 유용할 수 있다. 예를 들어, 높은 농도에서 차단하는 CD1d 항체의 과량은 γδ-T 세포를 낮은 농도에서 활성화하는 CD1d/ Vγ9Vδ2 항체와 조합할 수 있다.
(표 1)
VHH (CDR), TCR 체인의 정의, 및 본 발명에 따른 결합 분자 내에 포함된 여러 VHHs의 서열.
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005
Figure pct00006
Figure pct00007
(표 2)
WO2015156673로부터: Vγ9 또는 Vδ2 체인을 발현하는 (비 Vδ2 또는 Vγ9 체인과 각각 쌍을 이루는), 완전한 Vγ9Vδ2 TCR을 발현하는, 또는 Vγ9Vδ2 TCR 체인 어느 것도 발현하지 않는 γδ T-세포에의 VHHs 결합. "-" 는 평균 형광 지수 (Mean Fluorescence Index) (MFI) 1.5 이하를 표시하고, "+/-"는 MFI 1.5 에서 4.5 사이를 표시하고, "+"는 MFI 4.6에서 20 사이를 표시하고 및 "++" 는 MFI 20 이상을 표시한다.
Figure pct00008
그러므로 더 나아가 본 발명에 따른 결합 분자가 제공되거나, 또는 본 발명에 따른 결합 분자의 용도가 제공되며, 여기서 두 번째 결합 잔기는 단일 도메인 항체 (single domain antibody) 5E3 (서열 번호 59), 6H1 (서열 번호 60), 5G3 ( 서열 번호 61), 5C1 (서열 번호 62), 5D3 (서열 번호 63), 6E3 (서열 번호 64), 6H4 (서열 번호 65), 6C1 (서열 번호 66), 6H3 (서열 번호 67), 6G3 (서열 번호 68), 5C8 (서열 번호 69), 5F5 (서열 번호 70), 6A1 (서열 번호 71), 6E4 (서열 번호 72), 5C7 (서열 번호 73), 5D7 (서열 번호 74), 5B11 (서열 번호 75), 또는 6C4 (서열 번호 76) 로 Vγ9Vδ2-TCR에 결합하는 것을 경쟁할 수 있고, 바람직하게는 단일 도메인 항체 5E3 (서열 번호 59), 6H1 (서열 번호 60), 5G3 ( 서열 번호 61), 5C1 (서열 번호 62), 5D3 (서열 번호 63), 6E3 (서열 번호 64), 6H4 (서열 번호 65), 6C1 (서열 번호 66), 6H3 (서열 번호 67), 6G3 (서열 번호 68), 5C8 (서열 번호 69), 5F5 (서열 번호 70), 6A1 (서열 번호 71), 6E4 (서열 번호 72) 로 Vγ9Vδ2-TCR에 결합하는 것을 경쟁할 수 있다. 바람직하게는, 두 번째 결합 잔기는 같은 또는 부분적으로 겹치는, 좀 더 바람직하게는 결합잔기 5E3, 6H1, 5G3, 5C1, 5D3, 6E3, 6H4, 6C1, 6H3, 6G3, 5C8, 5F5, 6A1, 6E4, 5C7, 5D7, 5B11 또는 6C4에 의해 인식되는, 바람직하게는 결합 잔기 5E3, 6H1, 5G3, 5C1, 5D3, 6E3, 6H4, 6C1, 6H3, 6G3, 5C8, 5F5, 6A1, 또는 6E4에 의해 인식되는 대로, 같은 에피톱 서열에 결합한다.
본 발명에 따른 결합 분자 또는 본 발명에 따른 결합 분자의 용도에 대해 어떤 실시예에서, 첫 번째 결합 잔기 또는 두 번째 잔기 또는 둘 다는 단일 도메인 항체 (single domain antibodies) 이다. 단일 도메인 항체 ((sdAb, 또한 나노바디(Nanobody)®, 또는 VHH 라고도 불린다)) 는 이 분야 전문가에게는 잘 알려졌다. 단일 도메인 항체는 단일 CDR1, 단일 CDR2 및 단일 CDR3를 포함한다. 단일 도메인 항체의 실시예에는 중쇄 만의 항체의 가변 단편, 자연적으로 경쇄를 포함하지 않는 항체, 전통적인 항체로부터 유래한 단일 도메인 항체, 및 조작된 항체 (engineered antibodies)가 있다. 단일 도메인 항체는 생쥐, 인간, 낙타, 리마, 상어, 염소, 토끼 및 소를 포함하는 어느 종으로부터 유래할 수 있다. 예를 들어, 자연적으로 존재하는 VHH 분자는 낙타 (camel), 단봉낙타 (dromedary), 알파카 (alpaca) 및 과나코 (guanaco)와 같은 낙타과 종에서 얻은 항체로부터 유도될 수 있다.
전체 항체와 마찬가지로, 단일 도메인 항체는 특정한 항원에 선택적으로 결합할 수 있다. 단일 도메인 항체는 면역글로불린 체인의 가변 도메인만, 즉, CDR1, CDR2 및 CDR3 및 뼈대 부위 (framework regions) 만, 함유할 수 있다. 분자량 단지 약 12-15 kDa으로, 단일 도메인 항체는, 두 개의 중쇄 및 두 개의 경쇄 또는 Fab 단편 (53 kDa) 까지 구성된 보통의 항체 (150-160 kDa) 보다 더욱 훨씬 작으며, 하나의 경쇄 및 중쇄의 일부로 구성된다. 단일 도메인 항체의 형태 (format) 는 이의 타겟에 결합했을 때 입체적 방해가 덜하다는 장점을 가지고 있다.
바람직한 실시예에서, 본 발명에 따른 결합 분자 또는 본 발명에 따른 용도를 위한 결합 분자가 제공되며, 여기서 첫 번째 결합 잔기는 CDR1 서열 GSMFSDNVMG (서열 번호 1), CDR2 서열 TIRTGGSTNYADSVKG (서열 번호 2), 및/또는 CDR3 서열 TIPVPSTPYDY (서열 번호 3), 또는 그런 서열 어느 것을 포함하며, 여기서, 독립적으로 아미노산 어느 것, 바람직하게는 최대 아미노산 4개, 좀 더 바람직하게 최대로 3개, 좀 더 바람직하게는 최대로 2개, 가장 바람직하게 최대 1개가 치환되었고, 바람직하게는 표 3에 따르게 보존적으로 치환되었다.
더 나아간 바람직한 실시예에서, 본 발명에 따른 결합 분자 또는 본 발명에 따른 용도를 위한 결합 분자가 제공되며, 여기서 첫 번째 결합 잔기는 서열 번호 4에 제시된 서열 또는 서열 번호 85에 제시된 서열을 포함한다.
(표 3)
보존적 아미노산 치환
Figure pct00009
바람직한 실시예에서, 본 발명에 따른 결합 분자 또는 본 발명에 따른 용도를 위한 결합 분자가 제공되며, 여기서 두 번째 결합 잔기는 각 VHH에 대하여 표 1에 보여준 서열과 조합하여 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열은 포함한다. 좀 더 특이적으로, 두 번째 결합 잔기는 서열 번호 5에 따른 CDR 1 서열, 서열 번호 6에 따른 CDR 2 서열 및/또는 서열 번호 7에 따른 CDR 3 서열; 또는 서열 번호 8에 따른 CDR 1 서열, 서열 번호 9에 따른 CDR 2 서열 및/또는 서열 번호 10에 따른 CDR 3 서열; 또는 서열 번호 11에 따른 CDR 1 서열, 서열 번호 12에 따른 CDR 2 서열 및/또는 서열 번호 13에 따른 CDR 3 서열; 또는 서열 번호 14에 따른 CDR 1 서열, 서열 번호 15에 따른 CDR 2 서열 및/또는 서열 번호 16에 따른 CDR 3 서열; 또는 서열 번호 17에 따른 CDR 1 서열, 서열 번호 18에 따른 CDR 2 서열 및/또는 서열 번호 19에 따른 CDR 3 서열; 또는 서열 번호 20에 따른 CDR 1 서열, 서열 번호 21에 따른 CDR 2 서열 및/또는 서열 번호 22에 따른 CDR 3 서열; 또는 서열 번호 23에 따른 CDR 1 서열, 서열 번호 24에 따른 CDR 2 서열 및/또는 서열 번호 25에 따른 CDR 3 서열; 또는 서열 번호 26에 따른 CDR 1 서열, 서열 번호 27에 따른 CDR 2 서열 및/또는 서열 번호 28에 따른 CDR 3 서열; 또는 서열 번호 29에 따른 CDR 1 서열, 서열 번호 30에 따른 CDR 2 서열 및/또는 서열 번호 31에 따른 CDR 3 서열; 또는 서열 번호 32에 따른 CDR 1 서열, 서열 번호 33에 따른 CDR 2 서열 및/또는 서열 번호 34에 따른 CDR 3 서열; 또는 서열 번호 35에 따른 CDR 1 서열, 서열 번호 36에 따른 CDR 2 서열 및/또는 서열 번호 37에 따른 CDR 3 서열; 또는 서열 번호 38에 따른 CDR 1 서열, 서열 번호 39에 따른 CDR 2 서열 및/또는 서열 번호 40에 따른 CDR 3 서열; 또는 서열 번호 41에 따른 CDR 1 서열, 서열 번호 42에 따른 CDR 2 서열 및/또는 서열 번호 43에 따른 CDR 3 서열; 또는 서열 번호 44에 따른 CDR 1 서열, 서열 번호 45에 따른 CDR 2 서열 및/또는 서열 번호 46에 따른 CDR 3 서열; 또는 서열 번호 47에 따른 CDR 1 서열, 서열 번호 48에 따른 CDR 2 서열 및/또는 서열 번호 49에 따른 CDR 3 서열; 또는 서열 번호 50에 따른 CDR 1 서열, 서열 번호 51에 따른 CDR 2 서열 및/또는 서열 번호 52에 따른 CDR 3 서열; 또는 서열 번호 53에 따른 CDR 1 서열, 서열 번호 54에 따른 CDR 2 서열 및/또는 서열 번호 55에 따른 CDR 3 서열; 또는 서열 번호 56에 따른 CDR 1 서열, 서열 번호 57에 따른 CDR 2 서열 및/또는 서열 번호 58에 따른 CDR 3 서열; 또는 이런 서열들 어느 것이나 포함하고, 여기서, 독립적으로, 어느 아미노산, 바람직하게는 최대로 4개 아미노산, 좀 더 바람직하게는, 최대로 3개, 좀 더 바람직하게는, 최대로 2개, 가장 바람직하게는 최대 1개가 표 3 에 따라 보존적으로 치환되었다.
좀 더 바람직하게, 두 번째 결합 잔기는 서열 번호 5에 따른 CDR 1 서열, 서열 번호 6에 따른 CDR 2 서열 및/또는 서열 번호 7에 따른 CDR 3 서열; 또는 서열 번호 8에 따른 CDR 1 서열, 서열 번호 9에 따른 CDR 2 서열 및/또는 서열 번호 10에 따른 CDR 3 서열; 또는 서열 번호 11에 따른 CDR 1 서열, 서열 번호 12에 따른 CDR 2 서열 및/또는 서열 번호 13에 따른 CDR 3 서열; 또는 서열 번호 14에 따른 CDR 1 서열, 서열 번호 15에 따른 CDR 2 서열 및/또는 서열 번호 16에 따른 CDR 3 서열; 또는 서열 번호 17에 따른 CDR 1 서열, 서열 번호 18에 따른 CDR 2 서열 및/또는 서열 번호 19에 따른 CDR 3 서열; 또는 서열 번호 20에 따른 CDR 1 서열, 서열 번호 21에 따른 CDR 2 서열 및/또는 서열 번호 22에 따른 CDR 3 서열; 또는 서열 번호 23에 따른 CDR 1 서열, 서열 번호 24에 따른 CDR 2 서열 및/또는 서열 번호 25에 따른 CDR 3 서열; 또는 서열 번호 26에 따른 CDR 1 서열, 서열 번호 27에 따른 CDR 2 서열 및/또는 서열 번호 28에 따른 CDR 3 서열; 또는 서열 번호 29에 따른 CDR 1 서열, 서열 번호 30에 따른 CDR 2 서열 및/또는 서열 번호 31에 따른 CDR 3 서열; 또는 서열 번호 32에 따른 CDR 1 서열, 서열 번호 33에 따른 CDR 2 서열 및/또는 서열 번호 34에 따른 CDR 3 서열; 또는 서열 번호 35에 따른 CDR 1 서열, 서열 번호 36에 따른 CDR 2 서열 및/또는 서열 번호 37에 따른 CDR 3 서열; 또는 서열 번호 38에 따른 CDR 1 서열, 서열 번호 39에 따른 CDR 2 서열 및/또는 서열 번호 40에 따른 CDR 3 서열; 또는 서열 번호 41에 따른 CDR 1 서열, 서열 번호 42에 따른 CDR 2 서열 및/또는 서열 번호 43에 따른 CDR 3 서열; 또는 서열 번호 44에 따른 CDR 1 서열, 서열 번호 45에 따른 CDR 2 서열 및/또는 서열 번호 46에 따른 CDR 3 서열, 또는 이런 서열들 어느 것이나 포함하고, 여기서, 독립적으로, 어느 아미노산, 바람직하게는 최대로 4개 아미노산, 좀 더 바람직하게는, 최대로 3개, 좀 더 바람직하게는, 최대로 2개, 가장 바람직하게는 최대 1개가 표 3 에 따라 보존적으로 치환되었다.
바람직한 실시예에서, 특이적으로 CD1d에 결합할 수 있는 결합 잔기를 포함하는 본 발명에 따른 용도를 위한 결합 분자가 제공되고, 여기서 첫 번째 결합 잔기는 서열 번호 1에 따른 CDR1 서열, 서열 번호 2에 따른 CDR2 서열 및 서열 번호 3에 따른 CDR3 서열을 포함한다.
바람직한 실시예에서, 특이적으로 CD1d에 결합할 수 있는 첫 번째 결합 잔기를 포함하고 및 특이적으로 Vγ9Vδ2-TCR에 결합할 수 있는 두 번째 결합 잔기를 포함하는 본 발명에 따른 결합분자가 제공되고, 여기서
첫 번째 결합 잔기는 서열 번호 1에 따른 CDR1 서열, 서열 번호 2에 따른 CDR2 서열 및 서열 번호 3에 따른 CDR3 서열을 포함하고, 및
두 번째 결합 잔기는 서열 번호 5에 따른 CDR 1 서열, 서열 번호 6에 따른 CDR 2 서열 및/또는 서열 번호 7에 따른 CDR 3 서열; 또는 서열 번호 8에 따른 CDR 1 서열, 서열 번호 9에 따른 CDR 2 서열 및/또는 서열 번호 10에 따른 CDR 3 서열; 또는 서열 번호 11에 따른 CDR 1 서열, 서열 번호 12에 따른 CDR 2 서열 및/또는 서열 번호 13에 따른 CDR 3 서열; 또는 서열 번호 14에 따른 CDR 1 서열, 서열 번호 15에 따른 CDR 2 서열 및/또는 서열 번호 16에 따른 CDR 3 서열; 또는 서열 번호 17에 따른 CDR 1 서열, 서열 번호 18에 따른 CDR 2 서열 및/또는 서열 번호 19에 따른 CDR 3 서열; 또는 서열 번호 20에 따른 CDR 1 서열, 서열 번호 21에 따른 CDR 2 서열 및/또는 서열 번호 22에 따른 CDR 3 서열; 또는 서열 번호 23에 따른 CDR 1 서열, 서열 번호 24에 따른 CDR 2 서열 및/또는 서열 번호 25에 따른 CDR 3 서열; 또는 서열 번호 26에 따른 CDR 1 서열, 서열 번호 27에 따른 CDR 2 서열 및/또는 서열 번호 28에 따른 CDR 3 서열; 또는 서열 번호 29에 따른 CDR 1 서열, 서열 번호 30에 따른 CDR 2 서열 및/또는 서열 번호 31에 따른 CDR 3 서열; 또는 서열 번호 32에 따른 CDR 1 서열, 서열 번호 33에 따른 CDR 2 서열 및/또는 서열 번호 34에 따른 CDR 3 서열; 또는 서열 번호 35에 따른 CDR 1 서열, 서열 번호 36에 따른 CDR 2 서열 및/또는 서열 번호 37에 따른 CDR 3 서열; 또는 서열 번호 38에 따른 CDR 1 서열, 서열 번호 39에 따른 CDR 2 서열 및/또는 서열 번호 40에 따른 CDR 3 서열; 또는 서열 번호 41에 따른 CDR 1 서열, 서열 번호 42에 따른 CDR 2 서열 및/또는 서열 번호 43에 따른 CDR 3 서열; 또는 서열 번호 44에 따른 CDR 1 서열, 서열 번호 45에 따른 CDR 2 서열 및/또는 서열 번호 46에 따른 CDR 3 서열; 또는 서열 번호 47에 따른 CDR 1 서열, 서열 번호 48에 따른 CDR 2 서열 및/또는 서열 번호 49에 따른 CDR 3 서열; 또는 서열 번호 50에 따른 CDR 1 서열, 서열 번호 51에 따른 CDR 2 서열 및/또는 서열 번호 52에 따른 CDR 3 서열; 또는 서열 번호 53에 따른 CDR 1 서열, 서열 번호 54에 따른 CDR 2 서열 및/또는 서열 번호 55에 따른 CDR 3 서열; 또는 서열 번호 56에 따른 CDR 1 서열, 서열 번호 57에 따른 CDR 2 서열 및/또는 서열 번호 58에 따른 CDR 3 서열을 포함한다.
한 실시예에서, CD1d에 특이적으로 결합할 수 있는 결합 잔기를 포함하는 결합 분자를 CD1d-제한적인 Vδ1+T-세포 활성화에 의해 원인이 되고, 유지되고 및/또는 전파되는 질환, 바람직하게는 CD1d-제한적인 Vδ1+ 말초 T 세포 림프종의, 치료에 사용되는 용도를 제공하며, 여기서 첫 번째 결합 잔기는 서열 번호 1에 따른 CDR1 서열, 서열 번호 2에 따른 CDR2 서열 및 서열 번호 3에 따른 CDR3 서열을 포함한다.
한 실시예에서, 본 발명은 CD1d에 특이적으로 결합할 수 있는 첫 번째 결합 잔기를 포함하고 및 Vγ9Vδ2-TCR에 특이적으로 결합할 수 있는 두 번째 결합 잔기를 포함하는 결합분자를, CD1d-제한적인 Vδ1+T-세포 활성화에 의해 원인이 되고, 유지되고 및/또는 전파되는 질환의 치료에 사용하는 용도, 바람직하게는 CD1d-제한적인 Vδ1+ 말초 T 세포 림프종의 치료에 사용한는 용도에 관한 것이며, 여기서
첫 번째 결합 잔기는 서열 번호 1에 따른 CDR1 서열, 서열 번호 2에 따른 CDR2 서열 및 서열 번호 3에 따른 CDR3 서열을 포함하고, 및
두 번째 결합 잔기는 서열 번호 5에 따른 CDR 1 서열, 서열 번호 6에 따른 CDR 2 서열 및/또는 서열 번호 7에 따른 CDR 3 서열; 또는 서열 번호 8에 따른 CDR 1 서열, 서열 번호 9에 따른 CDR 2 서열 및/또는 서열 번호 10에 따른 CDR 3 서열; 또는 서열 번호 11에 따른 CDR 1 서열, 서열 번호 12에 따른 CDR 2 서열 및/또는 서열 번호 13에 따른 CDR 3 서열; 또는 서열 번호 14에 따른 CDR 1 서열, 서열 번호 15에 따른 CDR 2 서열 및/또는 서열 번호 16에 따른 CDR 3 서열; 또는 서열 번호 17에 따른 CDR 1 서열, 서열 번호 18에 따른 CDR 2 서열 및/또는 서열 번호 19에 따른 CDR 3 서열; 또는 서열 번호 20에 따른 CDR 1 서열, 서열 번호 21에 따른 CDR 2 서열 및/또는 서열 번호 22에 따른 CDR 3 서열; 또는 서열 번호 23에 따른 CDR 1 서열, 서열 번호 24에 따른 CDR 2 서열 및/또는 서열 번호 25에 따른 CDR 3 서열; 또는 서열 번호 26에 따른 CDR 1 서열, 서열 번호 27에 따른 CDR 2 서열 및/또는 서열 번호 28에 따른 CDR 3 서열; 또는 서열 번호 29에 따른 CDR 1 서열, 서열 번호 30에 따른 CDR 2 서열 및/또는 서열 번호 31에 따른 CDR 3 서열; 또는 서열 번호 32에 따른 CDR 1 서열, 서열 번호 33에 따른 CDR 2 서열 및/또는 서열 번호 34에 따른 CDR 3 서열; 또는 서열 번호 35에 따른 CDR 1 서열, 서열 번호 36에 따른 CDR 2 서열 및/또는 서열 번호 37에 따른 CDR 3 서열; 또는 서열 번호 38에 따른 CDR 1 서열, 서열 번호 39에 따른 CDR 2 서열 및/또는 서열 번호 40에 따른 CDR 3 서열; 또는 서열 번호 41에 따른 CDR 1 서열, 서열 번호 42에 따른 CDR 2 서열 및/또는 서열 번호 43에 따른 CDR 3 서열; 또는 서열 번호 44에 따른 CDR 1 서열, 서열 번호 45에 따른 CDR 2 서열 및/또는 서열 번호 46에 따른 CDR 3 서열; 또는 서열 번호 47에 따른 CDR 1 서열, 서열 번호 48에 따른 CDR 2 서열 및/또는 서열 번호 49에 따른 CDR 3 서열; 또는 서열 번호 50에 따른 CDR 1 서열, 서열 번호 51에 따른 CDR 2 서열 및/또는 서열 번호 52에 따른 CDR 3 서열; 또는 서열 번호 53에 따른 CDR 1 서열, 서열 번호 54에 따른 CDR 2 서열 및/또는 서열 번호 55에 따른 CDR 3 서열; 또는 서열 번호 56에 따른 CDR 1 서열, 서열 번호 57에 따른 CDR 2 서열 및/또는 서열 번호 58에 따른 CDR 3 서열을 포함한다.
좀 더 바람직한 실시예에서, 두 번째 결합 잔기는 서열 번호 59 - 76, 86 또는 88, 또는 이들 서열 어느 것으로부터 선택된 서열을 포함하고, 여기서, 독립적으로, 어느 아미노산, 바람직하게는 최대 20 아미노산, 좀 더 바람직하게 최대 15, 좀 더 바람직하게 최대 10, 좀 더 바람직하게 최대 5, 좀 더 바람직하게 최대 4, 좀 더 바람직하게 최대 3, 좀 더 바람직하게 최대 2, 가장 바람직하게 1개 아미노산이 치환되었으며, 바람직하게 표 3에 따라 보존적으로 치환되었다.
가장 바람직한 실시예에서, 두 번째 결합 잔기는 서열 번호 59 - 72, 86 또는 88, 또는 이들 서열 어느 것으로부터 선택된 서열을 포함하고, 여기서, 독립적으로, 어느 아미노산, 바람직하게는 최대 20 아미노산, 좀 더 바람직하게 최대 15, 좀 더 바람직하게 최대 10, 좀 더 바람직하게 최대 5, 좀 더 바람직하게 최대 4, 좀 더 바람직하게 최대 3, 좀 더 바람직하게 최대 2, 가장 바람직하게 1개 아미노산이 치환되었으며, 바람직하게 표 3에 따라 보존적으로 치환되었다.
더 나아간 바람직한 실시예에서, 첫 번째 결합 잔기는 서열 번호 85에서 제시된 서열을 포함하고 및 두 번째 결합 잔기는 서열 번호 86에서 제시된 서열을 포함한다.
더 나아간 바람직한 실시예에서, 첫 번째 결합 잔기는 서열 번호 85에서 제시된 서열을 포함하고 및 두 번째 결합 잔기는 서열 번호 88에서 제시된 서열을 포함한다.
더 나아간 바람직한 실시예에서, 결합 분자는 서열 번호 87에 제시된 서열을 포함하거나 또는 서열로 구성된다.
CDR1, CDR2 및 CDR3 서열 또는 뼈대 부위 (framework regions)는 종 (species) 간에 교환될 수 있다. 예를 들어, 라마 면역글로불린 (llama immunoglobulin) 분자로부터, CDR 서열은 선택될 수 있으며 및 라마 CDR 서열로부터 유래한 특이성을 가지는 인간 면역글로불린 분자를 얻기 위하여, 인간 면역글로불린 분자에 있는 CDR 서열과 교환될 수 있다. 이는 본래의 라마 뼈대 서열을 함유하는 항체에 비교하여 인간 서열은 인간에게 덜 면역성일 수 있으므로 유리할 수 있다. 그러한 서열의 교환은 인간화로서 알려졌다. 그러므로 본 발명에 의해 제공된 대로의 면역글로불린 분자는 인간 유래 면역글로불린 서열을 가지거나 또는, 이것에만 국한하지 않으나: 낙타과 (camelid), 라마 (llama), 상어 (shark)와 같은 다른 동물로부터 유래한 면역글로불린 서열을 가질 수 있으며, 및 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열은 인간 CD1d 결합을 제공하기 위하여 본 발명에 따른 CDR 서열로 대치될 수 있다. 다른 말로, 본 발명에 따른 결합 분자는 여기서 공개되는 대로의 CDR을 가진 인간화된 단일-도메인 항체를 포함할 수 있다. 예를 들어, 단일-도메인 항체는 인간 뼈대 서열 및 여기서 공개되는 대로의 CDR을 가질 수 있다.
본 발명은 그러므로 iNKT 세포를 활성화할 수 있으며 및 동시에 Vδ1+ T 세포 활성화를 감소하는 결합 분자를 제공한다. 바람직한 실시예에서, 본 발명에 따른 결합 분자 또는 본 발명에 따른 용도를 위한 결합 분자가 제공되며, 결합 분자는 더 나아가 종양-타겟 하는 잔기를 포함한다. 종양-타겟 하는 잔기는 결합 잔기를 포함하며, 특별히 종양 항원에 결합할 수 있다. 바람직하게, 결합 분자는 또한 Vγ9Vδ2-TCR에 결합할 수 있는 결합 잔기를 포함하며 및 표1에 묘사된 VHH 어느 것과도 Vγ9Vδ2-TCR에 대한 결합에 경쟁을 할 수 있다.
종양 항원들은 면역 반응, 특히 T-세포 매개하는 면역 반응을 일으키는 종양 세포에 의해 생산되는 단백질이다. 본 발명의 항원 결합 잔기의 선택은 치료할 특정 유형의 암에 따를 것이다. 종양 항원은 이 분야 기술에서 잘 알려졌으며 및 예를 들어, 신경교종-관련된 항원 (glioma-associated antigen), 암 배아 항원 (carcinoembryonic antigen) (CEA), EGFRvIII, 인터루킨-11 수용체 알파 (Interleukin-11 receptor alpha) (IL-l lRα), 인터루킨-13 수용체 서브유닛 알파-2 (Iknterleukin-13 receptor subunit alpha-2) (IL-13Ra 또는 CD213A2), 상피 성장 인자 수용체 (epidermal growth factor receptor) (EGFR), B7H3 (CD276), Kit (CD117), 카보닉 안하이드라제 (carbonic anhydrase)(CA-IX), CS-1 (또한, CD2 서부세트 1 으로도 불림), 뮤신 1 (Mucin 1), 세포 표면 연관된 (MUC1) ((cell surface associated) (MUC1)), BCMA, 브레이크포인트 클러스터 부위 (breakpoint cluster region (BCR) 및 아벨슨 쥐 과 백혈병 바이러스 암 유전자 호모로그 1 (Abelson murine leukemia viral oncogene homolog 1) (Abl)로 구성된 암 유전자 융합 단백질 bcr-abl, 수용체 타이로신-단백질 키나아제 (Receptor tyro sine-protein kinase ERBB2) (HER2/neu), β-인간 융모성 고나도트로핀 (β-human chorionic gonadotropin), 알파 태아 단백질 (alphafetoprotein) (AFP), 악성 림프종 키나아제 (anaplastic lymphoma kinase) (ALK), CD19, CD123, 사이클린 B1 (cyclin Bl), 렉틴-반응성 AFP (lectin-reactive AFP), Fos-관련된 항원 1 (Fos-related antigen 1), 아드레노셉토 베타 3 (adrenoceptor beta 3) (ADRB3), 타이로글로불린 (thyroglobulin), 타이로시나제 (tyrosinase); 에프린 타입-A 수용체 2 (ephrin type-A receptor 2) (EphA2), 아드벤스드 글라이케이션 앤드프로다트 수용체 (Receptor for Advanced Glycation Endproducts) (RAGE-1), 신장 유비퀴터스 1 (renal ubiquitous 1) (RU1), 신장 유비퀴터스 2 (renal ubiquitous 2) (RU2), 시노바이알 사르코마 (synovial sarcoma), X 브레이크 포인트 2 (X breakpoint 2) (SSX2), A 키나아제 앵커 단백질 4 (A kinase anchor protein 4) (AKAP-4), 림프구-특이 단백질 타이로신 키나아제 (lymphocyte-specific protein tyrosine kinase) (LCK), 프로아크로신 결합 단백질 sp32 (proacrosin binding protein sp32) (OY-TES1), 페에드 박스 단백질 Pax-5 (Paired box protein Pax-5) (PAX5), T 세포 3에 의해 인식되는 편평 세포 카르시노마 항원 (Squamous Cell Carcinoma Antigen Recognized By T Cells 3) (SART3), C-타입 렉틴-유사 분자-1 (C-type lectin-like molecule- 1) (CLL-1 또는 CLECL1), 후코실 GM1 (fucosyl GM1), 글로보H 글라이코세라미이드의 헥사삭카라이드 부분 (hexasaccharide portion of globoH glycoceramide) (GloboH), MN-CA IX, 상피세포 부착 분자 (Epithelial cell adhesion molecule) (EPCAM), EVT6-AML, 트란스글루타미네이즈 5 (transglutaminase 5) (TGS5), 인간 텔로머레이즈 역전사효소 (human telomerase reverse transcriptase) (hTERT), 폴리시알릭 에시드 (polysialic acid), 태반-특이 1 (placenta-specific 1) (PLAC1), 장 카복실 에스테라제 (intestinal carboxyl esterase), 루이스 Y 항원 (LewisY antigen), 시아릴 루이스 부착 분자 (sialyl Lewis adhesion molecule) (sLe), 림프구 항원 (lymphocyte antigen 6 complex, 로커스 K 9 (locus K 9) (LY6K), 변이된 열 쇼크 70-2 단백질 (heat shock protein 70-2 mutated) (mut hsp70-2), M-CSF, 조류 v-myc (v-myc avian), 골수세포증 바이러스 암유전자 신경 아세포종 유래 호모로그 (myelocytomatosis viral oncogene neuroblastoma derived homolog (MYCN), 라스 호모로그 부류 멤버 C (Ras Homolog Family Member C) (RhoC), 타이로시네이즈-관련 단백질 2 (Tyrosinase-related protein 2) (TRP-2), 사이토크롬 P450 1B1 (Cytochrome P450 1B1) (CYP1B1), CCCTC-결합 인자 (CCCTC-Binding Factor) (징크-핑거 단백질)-유사 (BORIS 또는 임프린트 부위 조절자의 형제) (((Zinc Finger Protein)-Like (BORIS or Brother of the Regulator of Imprinted Sites)), 프로테아제 (prostase), 전립선-특이 항원 (prostate- specific antigen) (PSA), 페어드 박스 단백질 Pax-3 (paired box protein Pax-3) (PAX3), 전립선 산 포스파타아제 (prostatic acid phosphatase) (PAP), 암/고환 항원-1 (Cancer/testis antigen 1) (NY-ESO-1), 암/고환 항원-2 (Cancer/testis antigen 2) (LAGE-la), LMP2, 신경 세포 부착 분자 (neural cell adhesion molecule) (NCAM), 종양 단백질 p53 (tumor protein p53) (p53), p53 돌연변이 (p53 mutant), 렛 사르코마 (Ras) 변이체 ((Rat sarcoma) (Ras) mutant)), 당 단백질 100 (glycoprotein 100) (gplOO), 프로스테인 (prostein), OR51E2, 팬낵신 3 (pannexin 3) (PANX3), 전립선-특이 세포막 항원 (pro state- specific membrane antigen) (PSMA), 전립선 줄기세포 항원 (prostate stem cell antigen) (PSCA), 고 분자량-흑색종-연관된 항원 (high molecular weight-melanoma-associated antigen) (HMWMAA), 간염 A 바이러스 세포 수용체 1 (Hepatitis A virus cellular receptor 1) (HAVCRl), 혈관 내피 성장인자 수용체 2 (vascular endothelial growth factor receptor 2) (VEGFR2), 혈소판-유래한 성장 인자 수용체 베타 (Platelet-derived growth factor receptor beta) (PDGFR-beta), 레구메인 (legumain), 인간 파필로마 바이러스 E6 (human papilloma virus E6) (HPV E6), 인간 파필로마 바이러스 E7 (human papilloma virus E7) (HPV E7), 서바이빈 (survivin), 텔로메라제 (telomerase), 정자 단백질 17 (sperm protein 17) (SPA17), 단계-특이적인 배아 항원-4 (Stage- specific embryonic antigen-4) (SSEA-4), 타이로시네이즈 (tyrosinase), TCR 감마 얼터네이트 리딩 프레임 단백질 (TCR Gamma Alternate Reading Frame Protein) (TARP), 윌름즈 종양 단백질 (Wilms tumor protein (WT1), 전립선-육종 종양 항원-1 (prostate-carcinoma tumor antigen-1) (PCTA-1), 세포사멸의 흑색종 억제제 (melanoma inhibitor of apoptosis) (ML-IAP), MAGE, 흑색종-연관된 항원-1 (Melanoma-associated antigen 1) (MAGE- Al), 흑색종 암 고환 항원-1 (melanoma cancer testis antigen-1) (MAD-CT-1), 흑색종 암 고환 항원-2 (melanoma cancer testis antigen-2) (MAD- CT-2), T 세포 1에 의해 인식되는 흑색종 항원 (melanoma antigen recognized by T cells 1) (MelanA/MARTl), X-항원 부류 (X Antigen Family), 멤버 1A (Member 1A) (XAGE1), 변이된 연장 인자 2 (elongation factor 2 mutated) (ELF2M), ERG (TMPRSS2 ETS 융합 유전자), N-아세틸 글루코사미닐-트란스페라제 V (N-Acetyl glucosaminyl-transferase V) (NA17), 호중구-엘라스타제 (neutrophil elastase), 사르코마 전 좌 브레이크포인트 (sarcoma translocation breakpoints), 유선 분화 항원 (mammary gland differentiation antigen) (NY-BR-1), 에프린 B2 (ephrinB2), CD20, CD22, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44v6, CD97, CD171, CD179a, 안드로겐 수용체 (androgen receptor), 인슐린 성장인자 (insulin growth factor) (IGF)-I, IGF-II, IGF-I 수용체 (IGF-I receptor), 갱글리오사이드 GD2 (ganglioside GD2) (GD2), o-아세틸-GD2 갱글리오사이드 (o-acetyl-GD2 ganglioside) (OAcGD2), 갱글리오사이드 GD3 (ganglioside GD3) (aNeu5Ac(2-8)aNeu5Ac(2-3)bDGalp(l-4)bDGlcp(l-l)Cer), 갱글리오사이드 GM3 (ganglioside GM3) (aNeu5Ac(2-3)bDGa3p(l-4)bDGlcp(l-l)Cer), G-단백질-커플 된 수용체 부류 C 그룹 5, 멤버 D) (G protein-coupled receptor class C group 5, member D) (GPRC5D), G-단백질-커플 된 수용체 20 (G protein-coupled receptor 20) (GPR20), 크로모좀 X 오픈 리딩 프레임 61 (chromosome X open reading frame 61) (CXORF61), 엽산 수용체 (folate receptor) (FRα), 엽산 수용체 베타 (folate receptor beta), 수용체 타이로신 키나아제-유사 오펀 수용체 1 (Receptor tyrosine kinase-like orphan receptor 1) (ROR1), Fms-유사 타이로신 키나아제-3 (Fms-Like Tyrosine Kinase 3) (Flt3), 종양-연관된 당단백질 72 (Tumor-associated glycoprotein 72) (TAG72), Tn 항원 (Tn antigen) ((TN Ag 또는 (GalNAca-Ser/Thr)), 안지오포에틴-결합 세포 표면 수용체 2 (angiopoietin-binding cell surface receptor 2) (Tie 2), 종양 내피 마커 1 (tumor endothelial marker 1) (TEM1 또는 CD248), 종양 내피 마커 7-관련된 (tumor endothelial marker 7- related) (TEM7R), 클라우딘 6 (claudin 6) (CLDN6), 갑상선 자극 호르몬 수용체 (thyroid stimulating hormone receptor) (TSHR), 유로플라킨 2 (uroplakin 2) (UPK2), 메소텔린 (mesothelin), 프로테아제 세린 21 (Protease Serine 21) )(테스티신 (Testisin) 또는 PRSS21)), 상피 성장 인자 수용체 (epidermal growth factor receptor) (EGFR), 섬유아세포 활성화 당백질 알파 (fibroblast activation protein alpha) (FAP), 후각 수용체 51E2 (Olfactory receptor 51E2) (OR51E2), ETS 전 좌-변이 유전자 6, 크로모좀 12p에 위치한 (ETS translocation-variant gene 6, located on chromosome 12p) (ETV6-AML), CD79a; CD79b; CD72; 백혈구-연관된 면역글로불린-유사 수용체 1 (Leukocyte-associated immunoglobulin-like receptor 1 (LAIR1); IgA 수용체의 Fc 단편 (Fc fragment of IgA receptor) (FCAR 또는 CD89); 백혈구 면역글로불린-유사 수용체 아류 A 멤버 2 (Leukocyte immunoglobulin-like receptor subfamily A member 2) (LILRA2); CD300 분자-유사 부류 멤버 f (CD300 molecule-like family member f) (CD300LF); C-타입 렉틴 도메인 부류 12 멤버 A (C-type lectin domain family 12 member A) (CLEC12A); 골수 기질 세포 항원 2 (bone marrow stromal cell antigen 2) (BST2); EGF-유사 모듈 -함유하는 뮤신-유사 호르몬 수용체-유사 2 (EGF-like module- containing mucin-like hormone receptor-like 2) (EMR2); 림프구 항원 75 (lymphocyte antigen 75) (LY75); 글라이피칸-3 (Glypican-3) (GPC3); Fc 수용체-유사 5 (Fc receptor-like 5) (FCRL5); 면역글로불린 람다-유사 폴리펩티드 1 (immunoglobulin lambda-like polypeptide 1) (IGLL1); 엽산 수용체 (folate receptor) (FRα); 메소텔린 (mesothelin); EGFR 변이체 III (EGFR variant III) (EGFRvIII); B-세포 성숙 항원 (B-cell maturation antigen) (BCMA); GD2; CLL-1; CA-IX; MUC1; HER2; 및 이의 어느 조합이 포함된다. 한 바람직한 실시예에서, 종양 항원은 엽산 수용체 (folate receptor) (FRα), 메소텔린 (mesothelin), EGFRvIII, IL-13Ra, CD123, CD19, CD33, BCMA, GD2, CLL-1, CA-IX, MUC1, HER2, 및 이의 어느 조합으로 구성된 군으로부터 선택된다. 한 실시예에서, 종양 타겟하는 잔기는 PD-L1, EGFR, CD40, Her2, PSMA, MUC-1, CEA, c-met, CD19, CD20, BCMA, Her3, AFP, CAIX, 또는 CD38에 특이적으로 결합하는 면역글로불린이다.
이미 언급한 대로, 본 발명에 따른 결합 분자는 예를 들어, iNKT 세포 및 Vγ9Vδ2 T 세포에 의해, 종양 세포를 살상하는 데 유익한 미세 환경을 만들 수 있게 한다. 본 발명에 따른 첫 번째 결합 잔기 및 두 번째 결합 잔기를 포함하는 결합 분자가 종양 치료의 용도로 그러므로 제공된다. 그러한 결합 분자는 CD1d+ 종양에 대해서 효과적일 뿐만 아니라, 또한 그 자체가 CD1d를 발현하지는 않으나 (부분적으로) 종양 환경에서 CD1d+ 억제적인 세포 ((예를 들어, MDSCs 또는 종양-연관된 대식세포 (tumour-associated macrophages) (TAMs))에 의존하는 종양에 대하여도 효과적이다. 바람직하게 종양은, T 세포 림프종 (T cell lymphoma), 다발성 골수종 (multiple myeloma), 급성 골수성 백혈병 (acute myeloid leukemia), 급성 림프아구 백혈병 (acute lymphoblastic leukemia), 만성 림프구 백혈병 (chronic lymphocytic leukemia), 만성 골수성 백혈병 (chronic myeloid leukemia), 맨틀 세포 림프종 (mantle cell lymphoma), B 세포 림프종 (B cell lymphoma), 매캐한 골수종 (smoldering myeloma), 비-호츠킨스 림프종 (non-Hodgkin lymphoma), 호츠킨스 림프종 (Hodgkin lymphoma), 골수 단핵구 백혈병 (myelomonocytic leukemias), 림프 형질세포성 림프종 (lymphoplasmacytic lymphoma), 털 세포 백혈병 (hairy cell leukemia), 및 지라 주변영역 림프종 (splenic marginal zone lymphoma) 과 같은 혈액학적 악성종양, 또는 신장 세포 암종 (renal cell carcinoma), 흑색종 (melanoma), 결장 암종 (colorectal carcinoma), 머리 및 목 암 (head and neck cancer), 유방암 (breast cancer), 전립선암 (prostate cancer), 폐암 (lung cancer), 췌장암 (pancreatic cancer), 위-식도암 (gastro-esophageal cancer), 작은창자 암종 (small bowel carcinoma), 중추 신경계 종양 (central nervous system tumors), 수모세포종 (medulloblastomas), 간세포 암종 (hepatocellular carcinoma), 난소암 (ovarian cancer), 신경교종 (glioma), 신경아세포종 (neuroblastoma), 요로 상피 암종 (Urothelial carcinomas), 방광암 (bladder cancer), 육종 (sarcoma), 음경암 (penile cancer), 기저 세포 암종 (basal cell carcinoma), 메르켈 세포 암 (merkel cell carcinoma), 신경 내분비 암종 (neuroendocrine carcinoma), 신경 내분비 종양 (neuroendocrine tumors), 알려지지 않은 일차 암종 (carcinoma of unknown primary) (CUP), 흉선종 (thymoma), 외음부 암 (vulvar cancer), 자궁경부 암종 (cervical carcinoma), 고환 암 (testicular cancer), 담관암종 (cholangiocarcinoma), 충수 암 (appendicular carcinoma), 중피종 (thelioma), 팽대부성암 (ampullary carcinoma), 항문암 (anal cancer), 및 융모막 암종 (choriocarcinoma) 과 같은 고형 종양으로부터 선택된다.
약학적 조성물, 투여량, 투여 방식 및 치료 방법
더 나아간 주 관점에서, 본 발명은,
CD1에 결합하는 데 있어서 항체 1D12와 경쟁할 수 있는 첫 번째 결합 잔기를 포함하고 및 Vγ9Vδ2-TCR에 특이적으로 결합할 수 있는 두 번째 결합 잔기를 포함하는, 항체와 같은, 결합 분자를 포함하고, 여기서 결합 분자는 Vγ9Vδ2 T 세포를 활성화할 수 있고, 및
약학적으로 허용할만한 부형제를 포함하는,
약학적 조성물과 관련된다.
항체와 같은, 폴리펩티드는 약학적으로 허용할 만한 담체 또는 희석제는 물론 다른 알려진 어느 아주번트 (adjuvants) 및 부형제와 함께 (Rowe et al., Handbook of Pharmaceutical Excipients, 2012 June, ISBN 9780857110275) 에서 공개된 것과 같은 전통적인 기술에 따라 제조될 수 있다. 약학적으로 허용할 만한 담체 또는 희석제는 물론 다른 알려진 어느 아주번트 (adjuvants) 및 부형제는 폴리펩티드 또는 항체 및 선택된 투여 방식에 적합하여야 한다. 약학적 조성물의 담체 및 다른 성분에 대한 적합성은 선택된 화합물 또는 현 발명의 약학적 조성물의 바람직한 생물학적 성질에 대한 의미 있는 부정적 효과가 없는 것에 근거하여 결정된다 ((예를 들어, 항원 결합시 상당한 효과보다 적은, (10% 또는 미만 상대적 억제, 5% 또는 미만 상대적 억제, 등). 약학적 조성물은 또한 희석제 (diluents), 충전제 (fillers), 염 (salts), 버퍼 (buffers), 세제 (detergents) (예를 들어, 트윈-20 (Tween-20) 또는 트윈-80 (Tween-80)과 같은 비 이온성 세제), 안정제 (stabilizers) (예를 들어, 설탕 또는 단백질-없는 아미노산), 방부제 (preservatives), 조직 고정제 (tissue fixatives), 용해제 (solubilizers), 및/또는 약학적 조성물에 포함되기에 적절한 재료)를 포함할 수 있다. 더 나아가 약학적으로 허용할 만한 부형제 및 담체에는 어느 및 모든 적절한 용매, 분산 배지 (dispersion media), 코팅제, 항 박테리아 및 항 곰팡이 제제, 등장성 제제 (isotonicity agents), 항산화제 (antioxidants) 및 흡수-지연 제제 (absorption-delaying agents), 및 현 발명의 결합 분자와 생리적으로 호환될 수 있는 비슷한 것이 포함된다.
본 발명은 여기서 정의한 대로의 결합 분자를 이를 요구하는 개체에 투여를 포함하여 질환 또는 장애를 치료하는 방법을 제공한다. 한 실시예에서, 개체는 인간이다. 본 발명의 방법은 효과적인 양의 결합 분자의 투여가 관여한다. "치료 (Treatment)" 또는 "치료하는 (treating)"은 증상 또는 질병의 상태를 편안하게 하거나, 완화하거나, 정지하거나, 또는 근절하기 위한 목적으로 현 발명에 따른 치료적으로 활성이 있는 폴리펩티드의 효과적인 양을 투여하는 것을 의미한다. "효과적인 양 (effective amount)" 또는 "치료적으로 효과적인 양 (therapeutically effective amount)은 바람직한 치료적 결과를 달성하기 위하여, 그 용량에서 및 필요한 시간의 기간에 효과적인 양을 의미한다. 항체와 같은, 폴리펩티드의 치료적으로 효과적인 양은 질병 단계, 개체의 나이, 성별, 및 몸무게 및 개체에서 요구되는 반응을 끌어내기 위한 항체의 능력과 같은 인자들에 따라 변할 수 있다. 치료적으로 효과적인 양은 또한 치료적으로 유익한 효과가 항체 또는 항체 부분의 어느 독성 있는 또는 치명적인 효과보다 더 큰 그런 것이다.
투여는 어느 적절한 경로에 의해 수행될 수 있으나, 그러나 전형적으로 정맥으로, 근육 내로 또는 피하와 같은, 비경구일 것이다. 결합 분자를, 예를 들어, 항체, 위한 효과적인 용법 및 용량 레지맨 (dosage regimens)은 치료할 질환 또는 컨디션에 의존하며 및 이분야 전문가에 의해 결정될 수 있다.
현 발명의 항체와 같은, 결합 분자는, 또한 조합 치료로 (combination therap), 즉 치료될 질환 또는 컨디션과 관련 있는 다른 치료적 제제와 조합으로, 투여될 수 있다. 따라서, 한 실시예에서, 항체-함유하는 의약품은, 세포독성, 화학요법치료 또는 혈관형성억제 제제와 같은, 하나 또는 그 이상의 더 나아간 치료 제제와 조합을 위한 것이다. 그러한 조합된 투여는 동시, 별도 또는 순차적일 수 있다. 그러므로 더 나아간 실시예에서, 현 발명은 암과 같은 질병을 치료하거나 또는 예방하는 방법을 제공하며, 이 방법은 이를 요구하는 개체에 치료적으로 효과 있는 양의 결합 분자 또는 현 발명의 약학적 조성물을, 방사성 치료요법 및/또는 수술과 조합하여 투여함을 포함한다.
본 발명의 추가 관점 및 실시예 (Further aspects and embodiments of the invention
더 나아간 관점에서, 본 발명은 CD1d 분자에 특이적으로 결합할 수 있는 첫 번째 결합 잔기를 포함하는 결합 분자를 제공하며, 여기서 결합 분자는 Vδ1 T 세포 활성화를 감소할 수 있으며 및 iNKT 세포를 활성화할 수 있고, CD1d-제한적인 Vδ1+T-세포 활성화에 의해 원인이 되고, 유지되고 및/또는 전파되는 장애의 치료에 사용을 위한 것이며, 바람직하게는 CD1d-제한적인 Vδ1+ 말초 T 세포 림프종의 치료에 사용을 위한것이다.
좀 더 나아간 관점에서, 본 발명은 CD1d 분자에 특이적으로 결합할 수 있는 첫 번째 결합 잔기를 포함하고 및 Vγ9Vδ2-TCR에 특이적으로 결합할 수 있는 두 번째 결합 잔기를 포함하는 결합 분자를 제공하며, 여기서 결합 분자는 Vδ1 T 세포 활성화를 감소할 수 있으며, iNKT 세포를 활성화할 수 있고, 및 Vγ9Vδ2 T 세포를 활성화할 수 있다.
더 나아간 관점에서, 본 발명은 CD1d 분자에 결합하는데 단일 도메인 항체 1D12와 경쟁할 수 있는 첫 번째 결합 잔기를 포함하는 항체에 관련한 것으로, CD1d-제한적인 Vδ1+T-세포 활성화에 의해 원인이 되고, 유지되고 및/또는 전파되는 장애의 치료에 사용을 위한 것이며, 바람직하게는 CD1d-제한적인 Vδ1+ 말초 T 세포 림프종의 치료에 사용을 위한 것이다. 바람직하게는, 이 항체는 Vδ1 T 세포 활성화를 감소할 수 있으며 및/또는 iNKT 세포를 활성화할 수 있다.
더 나아간 관점에서, 본 발명은, CD1d 분자에 결합하는데 1D12와 경쟁할 수 있는 첫 번째 결합 잔기를 포함하고 및 Vγ9Vδ2-TCR에 특이적으로 결합할 수 있는 두 번째 결합 잔기를 포함하는, 이중 특이적인 항체와 같은, 항체에 관련되며, 여기서 결합 분자는 Vγ9Vδ2 T 세포를 활성화할 수 있다. 바람직하게, 이 항체는 Vδ1 T 세포 활성화를 감소할 수 있고 및/또는 iNKT 세포를 활성화할 수 있다. 바람직하게, 첫 번째 및/또는 두 번째 결합 잔기는 단일 도메인 항체이다.
본 발명의 결합 분자를 제조하는 방법
폴리펩티드, 특히 항체와 같은, 본 발명의 결합 분자는, 전형적으로 재조합 적으로, 즉 적절한 숙주 세포에서 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 구조물의 발현에 의하고, 이어서 생산된 재조합 폴리펩티드를 세포 배양액으로부터 정제하여, 생산된다. 핵산 구조물은 이 분야 기술에서 잘-알려진 표준 분자 생물학적 기술에 의해 생산될 수 있다. 구조물은 전형적으로 벡터 (vector)를 사용하여 숙주 세포에 도입된다. 적절한 핵산 구조물, 벡터는 이 분야 기술에 알려졌다. 항체와 같은, 폴리펩티드의 재조합 발현을 위한 적절한 숙주 세포는 이 분야 기술에 잘-알려졌으며, 및 CHO, HEK-293, Expi293F, PER-C6, NS/0 및 Sp2/0 세포가 포함된다.
실시예
재료
세포주 (Cell lines)
CD1d로 안정적으로 형질 도입된, 인간 엡스타인-바 (Epstein-Barr) 바이러스-형질전환된 B-림프모구 세포 주 (B-lymphoblast cell line) C1R, 및 인간 세포 주 JY 는 10% (v/v) 태아 소 혈청 (fetal calf serum) (catalogue no. SV30160.03; HyClone GE Healthcare, Chalfont, St Giles, UK), 0.05 mm β-머르캅토에탄올 (β-mercaptoethanol), 100 IU/ml 소듐 페니실린 (sodium penicillin), 100 μg/ml 스트렙토마이신 설페이트 (streptomycin sulphate) 및 2.0 mm l-글루타민 (l-glutamine) (catalogue no. 10378-016; Life Technologies, Carlsbad, CA)으로 보충된 이스코브의 수정된 둘베코의 배지 (Iscove's modified Dulbecco's medium) (catalogue no.12-722F; Lonza, Basel, Switzerland)에 길렀다. CD1d로 안정적으로 형질 도입된, 인간 자궁경부 선암 세포 주 (human cervical adenocarcinoma cell line) HeLa, 는 10% (v/v) 태아 소 혈청 (fetal calf serum), 0.05 mm β-머르캅토에탄올 (β-mercaptoethanol), 100 IU/ml 소듐 페니실린 (sodium penicillin), 100 μg/ml 스트렙토마이신 설페이트 (streptomycin sulphate) 및 2.0 mm l-글루타민 (l-glutamine)으로 보충된 둘베코의 수정된 배지 이글의 배지 (Dulbecco's modified Eagle's medium) (catalogue no. BE12-709F; Lonza) 에서 배양되었다. mcherry/luc를 갖거나 또는 갖지 않고 및 CD1d로 안정적으로 형질 도입된 인간 골수종 세포 주 MM.1s (human myeloma cell line MM.1s), 인간 급성 T-림프모구 백혈병 세포 주 CCRF-CEM (human acute T-lymphoblastic leukemia cell line CCRF-CEM), Vδ1 설파티드-CD1d 제한된 TCR (Vδ1 sulfatide-CD1d restricted TCR)로 형질도입된 인간 급성 T 세포 백혈병 세포 주 저켓 (human acute T cell leukemia cell line Jurkat), 및 인간 급성 골수성 백혈구 세포주 (human acute myeloid leukemia cell lines) MOLM-13 및 NOMO-1 은 10% (v/v) 태아 소 혈청 (fetal calf serum), 0.05 mm β-머르캅토에탄올 (β-mercaptoethanol), 100 IU/ml 소듐 페니실린 (sodium penicillin), 100 μg/ml 스트렙토마이신 설페이트 (streptomycin sulphate) 및 2.0 mm l-글루타민 (l-glutamine)으로 보충된 RPMI1640 (catalogue no. BE12-115F; Lonza) 배지에서 배양되었다. CCRF-CEM 및 MM1.s 유전적 성질은 PCR-단일-위치-기술 (PCR-single-locus-technology)로 결정 되었으며 및 발표된 DNA-프로파일과 동일한 것으로 나타났다. 세포들은 마이코플라스마-음성으로 검사되었고 및 유동 세포 분석으로 자주 순도 ((감염체 (transfectants))가 검사되었다.
유동 세포분석 및 단일클론 항체 (Flow cytometry and monoclonal antibodies)
하기의 항체가 본 연구에 사용되었다: 플루오레세인 아이소시아네이트 (fluorescein isothiocyanate) (FITC) 접합 된 Vδ2, FITC CD69, 피코에리트린 (phycoerythrin) (PE) 및 알로피코시아닌 (allophycocyanin) (APC) 접합 된 CD25 (catalogue nos 555432 및 #340907), 및 APC CD3는 BD 바이오사이언스 (BD Biosciences) (Franklin Lakes, NJ)로부터 구입하였다. 피코에리트린-시아닌 7-접합 된 Vα24 (Pkhycoerythrin-Cyanine 7-conjugated Vα24)(catalogue no. PN A66907) 및 Vβ11 PE (catalogue no. IM2290)은 베크만 컬터 (Beckman Coulter) (Brea, CA)로 부터 구입하였다. 7-아미노액티노마이신 D (7-AAD)는 시그마 (Sigma)(St Louis, MO)로부터 구입하였으며, PE Vγ9 는 바이오레젠드 (Biolegend) (San Diego, USA)로부터, PE CD107a 는 밀테니 (Miltenyi) (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany)로부터 및 FITC 아넥신 V (FITC annexin V)는 VPS 디아그노스틱스 (VPS Diagnostics) (Hoever, the Netherlands) (catalogue no. A700)로부터 구입했다. 테트라머는 자체로 (in house) 만들어졌다. 유동 세포 분석 염색 (Flow cytometry staining)은 달리 구체화되지 않는 한, FACS 버퍼 ((0.1% BSA 및 0.02% 소듐 아자이드 (sodium azide)로 보충된 PBS)) 에서 30분 동안 4°에서 수행되었다. 샘플은 FACS 포르테사 (FACS Fortessa) (BD Biosciences)에서 분석되었다.
DC, iNKT 및 Vγ9Vδ2-T 세포주 제조 (Generation of DC, iNKT and Vγ9Vδ2-T cell lines)
moDC 및 일차 인간 iNKT 및 γδ T 세포 (primary human iNKT and γδ T cells) 는 이전에 서술된 대로 제조되었다 ((De Bruin et al (2016) Clin Immunol 169:128)). 간략하게, 단핵세포는 말초 혈액 단핵 세포로부터 CD14 마이크로비드 (CD14 MicroBeads) (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany)의 사용으로 분리되었으며 및 1000 U/ml 과립구-마크로파지 콜로니-자극 인자 (granulocyte-macrophage colony-stimulating factor) (Sanofi Leukine, Bridgewater, NJ) 및 20 ng/ml IL-4 (catalogue no. 204-IL/CF; R&D Systems, Minneapolis, MN) 존재하의 완전한 RPMI-1640 배지에서 5-7일 동안 배양되었으며 및 이어서 100 ng/ml αGalCer (catalogue no. KRN7000; Funakoshi, Tokyo, Japan) 존재하에서 또는 없이 100 ng/ml 리포폴리삭카라이드 (lipopolysaccharide) (LPS) (catalogue no. L6529; Sigma) 로 48-72 시간 동안 성숙시켰다. iNKT 세포는 건강한 자원자의 말초 혈액 단핵 세포로부터 자석 비드 분류 (magnetic bead sorting)를 사용하여 정제되었으며, 및 1% 인간 AB 혈청 (human AB serum), 10 U/ml IL-7 (catalogue no. 207-IL/CF; R&D Systems) 및 10 ng/ml IL-15 (catalogue no. 34-8159; eBioscience)로 보충된 예셀 배지 (Yssel's medium)에서 성숙된α-GalCer-로드된 moDC (α-GalCer-loaded moDC )로 매주 자극 시켰다. γδT 세포는 건강한 자원자의 말초 혈액 단핵 세포로부터 자석 비드 분류 (magnetic bead sorting)를 사용하여 정제되었으며, 및 1% 인간 AB 혈청 (human AB serum), 100 U/ml IL-2 (BioVision, Mountain View, California, USA) 10 U/ml IL-7 및 10 ng/ml IL-15로 보충된 예셀 배지 (Yssel's medium)에서 파미드로네이트 (pamidronate) (10 μM) (PCH, Pharmachemie BV, Haarlem, The Netherlands) 로드된 moDC ((pamidronate (10 μM)-loaded moDC))로 매주 자극 시켰다. 다른 한편으로, γδ T 세포는 매주 방사선 조사된 주입 세포 (irradiated feeders cells) (두 공여자의 1x106 혼합된 PBMCs 및 0.1x106 JY 세포), 10 IU/mL rhIL-7, 10 μg/mL rhIL-15 및 50 ng/mL PHA로 상기에 서술된 대로 보충된 RPMI-1640 배지에서 자극 시켰다. 배양 밀도에 따라, 배양된 세포는 나누어지고 및 신선한 배양 배지가 첨가되었다. 순수한 (> 95% Vα24+ Vβ11+ 또는 Vγ9+ Vδ2+) iNKT 및 γδT 세포가 실험을 위해 사용되었다.
항-CD1d 및 항-γδTCR 특이 VHH 제조 (Generation of anti-CD1d and anti-γδTCR specific VHH)
항-CD1d 및 항-γδTCR 특이 VHH는 이전에 서술된 대로 동정 되고 및 제조되었다 (Lameris R et al (2016) Immunology 149(1):111; De Bruin et al (2016) Clin Immunol 169:128). 태그-없는 1D12 (Tag-less 1D12), 1D22 및 1D12-5C8는 UPE (Utrecht, the Netherlands)로 생산되었다.
생체 내 이종 이식된(xenograft) 생쥐 다발성 골수종 (MM) 모델 ((In vivo xenograft mouse multiple myeloma (MM) model))
전파된 MM 모델 (disseminated MM model)은 CD1d+ MM 세포를 NOD 스키드 감마 (NOD scud gamma) (NSG) 생쥐에 정맥 주입으로 형성되었다. 여성 18-26-주-령 NSG 생쥐 (Charles River)에 2.5x106 MM.1s.mcherry/luc.CD1d 세포를 꼬리 정맥을 통해 정맥 (i.v.) 주사하기 24시간 전에 2 Gy로 방사성 조사시켰다 (0 일). 7, 14, 및 21일에 1x107 인간 iNKT 세포 (human iNKT cells), 인간 γδ T 세포 (human γδ T cells) 또는 이의 혼합 (1:1 비율)가 i.v.로 주사되었다. 생쥐는 2-주마다 복강으로 (intraperitoneally) (i.p.) PBS 또는 이중 특이성 항체 1D12-5C8 (bispecific antibody 1D12-5C8) (100 μg/생쥐)로 주사되었다. 생쥐는 미리-정해진 인간 최종-지점에 도달하였을 때 안락사시켰다 (euthanized). 동물 실험은 Dutch Central Authority for Scientific Procedures on Animals (CCD)에 의해 허가되었다.
실시예 1
iNKT 세포 활성화 조절 (Modulation of iNKT cell activation)
1D12 및 1D22이 iNKT 세포 활성화를 자극하거나 또는 억제하는 능력을 평가하기 위하여, 5Х104 Hela-CD1d 세포를 96-웰 조직 배양 플레이트의 각 웰에 접종하고 및 운반체 대조군 (vehicle control) (DMSO 0.01%) 또는 100ng/ml αGalCer로 하룻밤 동안 펄스 시켰다 (pulsed). 세포는 그 후 PBS로 세척하고 및 배지로, 또는 항-CD1d 특이 VHH로 제시된 농도에서 1시간 동안 배양하였다. 이어서, 5Х104의 순수한 및 휴지상태의 iNKT를 각 웰에 첨가하였다. 24시간 후에, 배양 상등액을 CBA (BD Biosciences)로 사이토카인 생산 (유도 또는 억제)에 대해 분석하였으며 반면에 iNKT 세포는 수집되고 및 유동세포 분석으로 CD25 발현에 대해 분석되었다. 도 1 에서 볼 수 있는 대로, 우리는 iNKT 세포 활성화 및 사이토카인 생산을 완전히 차단하고 (P < 0.0001) 및 그러므로 CD1d-α-GalCer 복합체 인식을 차단하는 항- CD1d VHH (anti-CD1d VHH) (클론 1D22)를 동정하였다. 이와는 아주 반대로 항-CD1d VHH 클론 1D12는 외부적으로 첨가된 글라이코리피드 Ag (glycolipid Ag) 없이도 CD1d-제한적인 iNKT 세포 활성화를 강화시키는 것을 발견했다 (도 1 a 및 c) (P < 0.0001).
실시예 2
저켓-Vδ1 세포 활성화 조절 (Modulation of Jurkat-Vδ1 cell activation)
iNKT 세포는 CDd1의 F' 포켓 가장자리에 정박하는 것으로 알려졌으며 이는 좀 더 A' 포켓 쪽으로 정박하는 설파티드-CD1d 제한적인 Vδ1-T 세포(sulfatide-CD1d restricted Vδ1-T cell)와는 반대이다. 우리는 그러므로 1D12 및 1D22의 설파티드-CD1d 제한적인 Vδ1-T 세포에 대한 효과를 평가하였다. 저켓-Vδ1 세포 (Jurkat-Vδ1 cell) 활성화에 대한 1D12 및 1D22의 효과를 평가하기 위하여, 1Х105 C1R-CD1d 세포를 96-웰 조직 배양 플레이트의 각 웰에 접종하고 및 운반체 대조군 (vehicle control) (DMSO 0.05%) 또는 25 μg/ml 설파티드 (sulfatide)로 2시간 동안 펄스 시켰다 (pulsed). 세포는 그 후 배지와 함께, 또는 항-CD1d-특이 VHH (anti-CD1d specific VHH)와 함께 100 nM (묘사되지 않음)) 또는 1000 nM로 1시간 동안 배양시켰다. 이어서, 5Х104 저켓-Vδ1 (Jurkat-Vδ1) 이 각 웰에 첨가되었다. 24시간 후에 저켓-Vδ1 세포는 수집되고 및 유동세포 분석으로 CD69 발현에 대해 분석되었다. 도 2B에서 볼 수 있는 대로, 동시-배양 동안에 1D12의 첨가는 Vδ1-저켓 (Vδ1-Jurkat)의 활성화를 완전히 폐지 시켰으며, 반면에 1D22는 활성화 마커 CD69의 발현에 대하여 단지 제한적인 영향만 보였다. 100 nM 또는 1000 nM와 함께 배양은 비슷한 결과를 보였다 (데이터 보여지지 않음).
저켓-Vδ1 세포에서 1D12 및 1D22의 CD1d-테트라머 (CD1d-tetramer) 결합에 대한 효과를 평가하기 위하여, 내부유래 또는 설파티드-로드된 CD1d-PE 테트라머 (sulfatide-loaded CD1d-PE tetramer)를 PBS (대조군), 1D12 또는 1D22 (VHH:CD1d 비율 약 4:1) 로 30분 동안 실온에서 배양시키고 그 후 테트라머를 저켓-Vδ1 세포에 (최종 농도 테트라머 2 μg/ml) CD3-APC 와 함께 첨가시키고 및 45분 동안 섭씨 4도에서 배양시켰다. 데이터는 유동세포 분석으로 분석되었다. 설파티드-로드된 CD1d 테트라머 (sulfatide-loaded CD1d tetramers)를 1D12와 배양하는 것은 저켓-Vδ1 세포에의 결합을 완전히 방해하며, 반면에 1D22는 단지 제한적인 효과만 갖는다 (도 2A). 이들 데이터는 특이적인 CD1d 제한적인 T-세포 (specific CD1d restricted T-cells)의 반응력을 조절하는 항-CD1d VHH (anti-CD1d VHH)의 능력을 지지하며, 이는 넓은 범위의 CD1d-제한적인 T-세포 (CD1d-restricted T-cells)의 CD1d-TCR 상호작용을 차단하는, 51.1 mAb와 같은, 알려진 Ab (Nambiar et al. (2015) MAbs 7:638; Migalovich Sheikhet et al. (2018) Front Immunol 9:753) 와 분명히 반대된다.
실시예 3
이중 특이성 항-CD1d-항-Vγ9Vδ2 TCR VHH에 의한 iNKT 및 Vγ9Vδ2-T 세포의 이중 활성화 (Dual activation of iNKT and Vγ9Vδ2-T cells by a bispecific anti-CD1d-anti-Vγ9Vδ2 TCR VHH)
이전에, 잘 규명된 항-Vγ9Vδ2-TCR VHH 가 항-종양 치료 목적을 위해 종양-관련된 항원에 특이적인 VHHs에 융합되었었다. CD1d가 다양한 (혈액학적) 악성종양 및 종양 연관된 마크로파지 (macrophages) 및 골수-유래 된 억제 세포 (suppressor cell)에 발현되고 및 그러므로 항-암 치료 타겟으로서 사용될 수 있다. 1D12-5 C8가 iNKT 및 Vγ9Vδ2-T-세포의 이중 활성화를 유도하여 종양 타겟 용해의 결과를 이루는 능력이 있는지를 평가하기 위하여, 1Х105 CCRF-CEM 세포를 5Х104 iNKT 세포, 5Х104 Vγ9Vδ2-T 세포 또는 5Х104 혼합된 iNKT/Vγ9Vδ2-T (1:1 비율)와 함께 배지 단독, 단일가 1D12 (monovalent 1D12) 또는 이중 특이성 1D12-5C8 (bispecific 1D12-5C8) 존재하에서 배양시켰다. 4시간 후에 주효 세포의 탈과립화를 CD107a 발현으로 측정하였으며 및 유동 세포 분석 (flow cytometry) 으로 분석하였다. 타겟 세포에 대한 세포독성을 평가하기 위하여, 16시간 동시-배양 후에 살아 있는 CRF-CEM 세포 ((아넥신 V (Annexin V) 및 7-AAD 음성))를 유동 세포 분석 세포 숫자 세기 비드 (cell counting beads)를 사용하여 정량하였다.
1D12-5C8의 iNKT 및 Vγ9Vδ2-T 확장 및 종양 성장 조절을 지지하는 능력을 결정하기 위하여, 같은 공여자로부터 새롭게 분리된 iNKT 및 Vγ9Vδ2-T 세포를 1주일 동안 확장시켰다. 5Х104 MM.1s-CD1d 세포를 이어서 배지와 함께 또는 1D12-5C8 (50 nM)와 함께 30분 동안 배양하고 이 이후에 iNKT, Vγ9Vδ2-T 세포 또는 이들의 혼합 (2:3 비율)을 10:1 타겟:주효 세포 비율로 첨가하였다. 살아 있는 MM.1s-CD1d (또는 MOLM-13 또는 NOMO-1), iNKT 및 Vγ9Vδ2-T 세포(7-AAD 음성)를 7일 후에 유동 세포 분석 세포 숫자 세기 비드 (cell counting beads)를 사용하여 정량하였다.
도 3a에서 볼 수 있는 것과 같이, iNKT 및 Vγ9Vδ2-T 세포의 왕성한 동시 탈과립화는 1D12-5C8 존재하에서만 관찰되었다. 더욱이, 주효 세포 (effector cell) 활성화는 살아있는 종양 세포의 현저한 감소의 결과가 되었다 (도 3b).
생체 내에서 바람직하지 않은 주효 세포 대비 타겟 비율은 보통 종양 성장을 조정하기 위하여 종양 타겟하는 주효 세포의 확장을 요구한다. 이중 특이성 1D12-5C8 VHH가 주효 세포 확장 및 종양 조정 (tumor control)을 그러한 환경에서 유도할 수 있는지를 조사하기 위하여, MM.1s-CD1d 세포를 1D12-5C8와 함께 배양하고, 이 이후에 iNKT, Vγ9Vδ2-T 세포 또는 이의 혼합을 주효 세포 (effector) 대 타겟 (target) 비율 1:10으로 첨가하였다. 1D12-5C8가 확장을 유도하고 및 종양 성장을 조정하는 능력은 동시-배양 7일 후에 이들 세포의 유동 세포 분석 정량으로 평가되었다. 도 4a에서 볼 수 있는 대로, iNKT의 확장은 이중 특이성 구조물 (bispecific construct) 존재하에서 관찰되었다. 그러나 Vγ9Vδ2-T 세포는 단지 iNKT 세포 및 이중 특이성 구조물 둘 다의 존재하에서 확장을 보였다. 더욱이, 굉장한 종양 성장 조정은 주효 세포와 조합으로 이중 특이성 구조물에 의해 유도되었다 (도 4b). 비슷하게, 종양 성장 조정 (tumor growth control) 및 주효 세포 확장 (effector cell expansion)이 급성 골수성 백혈병 종양 세포 주 MOLM-13 및 NOMO-1에서 관찰되었으며 이는 강력한 항-종양 효능 및 이 이중 특이성 항-CD1d-항-Vγ9Vδ2-TCR VHH의 광범위한 응용성을 강조한다.
실시예 4.
1D12 및 1D12-5C8의 결합경쟁 (Binding competition of 1D12 and 1D12-5C8)
1D12 결합이 1D12-5C8 결합을 방해하는지를 평가하기 위하여, 1Х105 MM1s-CD1d 세포를 PBS (음성 대조군, NC), 1D12 (1000 nM), 1D22 (1000 nM) 또는 항-CD1d mAb 51.1 (100 nM) 와 45분 동안 배양시키고, 이 이후에 PBS (NC) 또는 NHS-바이오틴 (ThermoFischer Scientific Inc., Waltham, MA) 연결된 1D12-5C8 (100 nM)를 추가 30분 동안 섭씨 4도에서 첨가하였다. 심도있는 세척 후에 샘플은 스트랩타비딘-APC (streptavidin-APC) (eBioscience, San Diego, CA) 로 염색시키고 및 유동 세포분석으로 분석되었다.
1D12 및 1D12-5C8 사이의 경쟁을 평가하기 위하여, CD1d 발현하는 MM 세포를 순차적으로 PBS, 1D12, 1D22 (1D12-5C8 결합을 방해하지 않아야 한다) 또는 항-CD1d mAb 51.1)로 배양시키고 이어서 바이오티닐화된 1D12-5C8 (biotinylated 1D12-5C8)로 배양시켰다. 1D12-5C8가 CD1d와 복합체를 이루는 능력은 그 후 유동세포 분석으로 스트랩타비딘-APC (streptavidin-APC) 결합을 분석하여 결정하였다. 도 5 에서 볼 수 있듯이, 1D22가 아닌, 1D12 또는 항-CD1d mAb 51.1의 사전-배양은 1D12-5C8 결합을 크게 감소시켰다.
실시예 5
생체 내 이종 이식된 생쥐 다발성 골수종 (MM) 모델 ((In vivo xenograft mouse multiple myeloma (MM) model))
이중 특이성 CD1d/Vδ2 결합 항체 1D12-5C8 의 항-종양 효능이 생체 내 모델에서 연구되었으며 여기서 생쥐는 전파성 MM 모델 (disseminated MM model)을 확립하기 위하여 정맥으로 MM.1s.mCherry/luc.CD1d 세포가 접종되었으며 이어서 1D12-5C8 와 조합으로 또는 조합하지 않고 종양 접종 후 7일에 인간 iNKT 세포로, 인간 γδ T 세포로, 또는 이들의 혼합으로 세 번 정맥 주입하였다. 2주 마다 1D12-5C8 단독의 i.p. 용법은 효과가 없었었던 (생존 중앙값 47일 대비 49.5일, P>0,05) 반면에, 1D12-5C8 및 iNKT 세포의 조합 처치는 iNKT 단독에 비교하여 (생존 중앙값 58.5일) 생존을 의미 있게 (p<0.0001) 연장 시켰으며 모든 생쥐가 연구 종료시(90일) 생존하였다. 인간 γδ T 세포만으로의 처치에 비교하여, 인간 γδ T 세포 및 1D12-5C8 의 처치는 생존 중앙값을 48일에서 60일로 증가시키는 경향을 보였다 (p=0.16). 2주 마다 i.p 용법의 1D12-5C8 와 함께 iNKT 세포 및 γδ T 세포 둘 다의 주입은 항체 없는 세포 혼합 만의 주입과 비교하여(생존 중앙값 55일) 생존을 의미 있게 연장 시켰으며 연구 종료 시(90일)에 7/8 생쥐가 생존하였다 (p>0.0001).
<110> LAVA Therapeutics <120> Dual acting CD1d immunoglobulin <130> P6079101PCT <160> 88 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> antibody sequence <400> 1 Asp Asn Val Met Gly 1 5 <210> 2 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> antibody sequence <400> 2 Thr Ile Arg Thr Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly 1 5 10 15 <210> 3 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> antibody sequence <400> 3 Thr Ile Pro Val Pro Ser Thr Pro Tyr Asp Tyr 1 5 10 <210> 4 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> antibody sequence <400> 4 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Met Phe Ser Asp Asn 20 25 30 Val Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val 35 40 45 Ala Thr Ile Arg Thr Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu 65 70 75 80 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Ser Gly Gly Met Thr Asp His Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Ala Phe Ala Gly Asp Ile Pro Tyr Gly Ser Ser Trp Tyr Gly 100 105 110 Asp Pro Thr Thr Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val 115 120 125 Ser Ser 130 <210> 75 <211> 124 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> antibody sequence <400> 75 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Ser Ser Thr Phe 20 25 30 Ser Met Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Arg Lys Glu Arg Glu Phe Val 35 40 45 Ala Ala Ile Asn Trp Ser Gly Gly Ser Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Ser Asp Arg Phe Ala Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Arg Arg Gly Gly Ile Tyr Tyr Ser Thr Gln Asn Asp Tyr Asp 100 105 110 Tyr Trp Gly Gln Gly 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Val Tyr Trp Tyr Arg Glu Arg Pro Gly Glu 50 55 60 Val Ile Gln Phe Leu Val Ser Ile Ser Tyr Asp Gly Thr Val Arg Lys 65 70 75 80 Glu Ser Gly Ile Pro Ser Gly Lys Phe Glu Val Asp Arg Ile Pro Glu 85 90 95 Thr Ser Thr Ser Thr Leu Thr Ile His Asn Val Glu Lys Gln Asp Ile 100 105 110 Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Glu Ala Gln Gln Glu Leu Gly Lys 115 120 125 Lys Ile Lys Val Phe Gly Pro Gly Thr Lys Leu Ile Ile Thr Asp Lys 130 135 140 Gln Leu Asp Ala Asp Val Ser Pro Lys Pro Thr Ile Phe Leu Pro Ser 145 150 155 160 Ile Ala Glu Thr Lys Leu Gln Lys Ala Gly Thr Tyr Leu Cys Leu Leu 165 170 175 Glu Lys Phe Phe Pro Asp Val Ile Lys Ile His Trp Glu Glu Lys Lys 180 185 190 Ser Asn Thr Ile Leu Gly Ser Gln Glu Gly Asn Thr Met Lys Thr Asn 195 200 205 Asp Thr Tyr Met Lys Phe Ser Trp Leu Thr Val Pro Glu Lys Ser Leu 210 215 220 Asp Lys Glu His Arg Cys Ile Val Arg His Glu Asn Asn Lys Asn Gly 225 230 235 240 Val Asp Gln Glu Ile Ile Phe Pro Pro Ile Lys Thr Asp Val Ile Thr 245 250 255 Met Asp Pro Lys Asp Asn Cys Ser Lys Asp Ala Asn Asp Thr Leu Leu 260 265 270 Leu Gln Leu Thr Asn Thr Ser Ala Tyr Tyr Met Tyr Leu Leu Leu Leu 275 280 285 Leu Lys Ser Val Val Tyr Phe Ala Ile Ile Thr Cys Cys Leu Leu Arg 290 295 300 Arg Thr Ala Phe Cys Cys Asn Gly Glu Lys Ser 305 310 315 <210> 78 <211> 292 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 78 Met Gln Arg Ile Ser Ser Leu Ile His Leu Ser Leu Phe Trp Ala Gly 1 5 10 15 Val Met Ser Ala Ile Glu Leu Val Pro Glu His Gln Thr Val Pro Val 20 25 30 Ser Ile Gly Val Pro Ala Thr Leu Arg Cys Ser Met Lys Gly Glu Ala 35 40 45 Ile Gly Asn Tyr Tyr Ile Asn Trp Tyr Arg Lys Thr Gln Gly Asn Thr 50 55 60 Met Thr Phe Ile Tyr Arg Glu Lys Asp Ile Tyr Gly Pro Gly Phe Lys 65 70 75 80 Asp Asn Phe Gln Gly Asp Ile Asp Ile Ala Lys Asn Leu Ala Val Leu 85 90 95 Lys Ile Leu Ala Pro Ser Glu Arg Asp Glu Gly Ser Tyr Tyr Cys Ala 100 105 110 Cys Asp Thr Leu Gly Met Gly Gly Glu Tyr Thr Asp Lys Leu Ile Phe 115 120 125 Gly Lys Gly Thr Arg Val Thr Val Glu Pro Arg Ser Gln Pro His Thr 130 135 140 Lys Pro Ser Val Phe Val Met Lys Asn Gly Thr Asn Val Ala Cys Leu 145 150 155 160 Val Lys Glu Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Arg Ile Asn Leu Val Ser Ser 165 170 175 Lys Lys Ile Thr Glu Phe Asp Pro Ala Ile Val Ile Ser Pro Ser Gly 180 185 190 Lys Tyr Asn Ala Val Lys Leu Gly Lys Tyr Glu Asp Ser Asn Ser Val 195 200 205 Thr Cys Ser Val Gln His Asp Asn Lys Thr Val His Ser Thr Asp Phe 210 215 220 Glu Val Lys Thr Asp Ser Thr Asp His Val Lys Pro Lys Glu Thr Glu 225 230 235 240 Asn Thr Lys Gln Pro Ser Lys Ser Cys His Lys Pro Lys Ala Ile Val 245 250 255 His Thr Glu Lys Val Asn Met Met Ser Leu Thr Val Leu Gly Leu Arg 260 265 270 Met Leu Phe Ala Lys Thr Val Ala Val Asn Phe Leu Leu Thr Ala Lys 275 280 285 Leu Phe Phe Leu 290 <210> 79 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> antibody sequence <400> 79 Asn Ala Met Gly 1 <210> 80 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> antibody sequence <400> 80 Val Ile Ser Ser Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly 1 5 10 15 <210> 81 <211> 10 <212> PRT 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Leu Val Gln Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Met Phe Ser Asp Asn 20 25 30 Val Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val 35 40 45 Ala Thr Ile Arg Thr Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Arg 85 90 95 His Thr Ile Pro Val Pro Ser Thr Pro Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu 115 120 125 Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu 130 135 140 Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Pro Phe Ser Asn Tyr Ala Met Gly Trp 145 150 155 160 Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala Ala Ile Ser 165 170 175 Trp Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe 180 185 190 Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn 195 200 205 Ser Pro Lys Pro Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Ala Gln 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Ala Ser Gly Arg Pro Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val 35 40 45 Ser Ala Ile Ser Trp Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Gln Phe Ser Gly Ala Asp Tyr Gly Phe Gly Arg Leu Gly Ile 100 105 110 Arg Gly Tyr Glu Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val 115 120 125 Ser Ser 130 <210> 87 <211> 254 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> antibody sequence <400> 87 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Met Phe Ser Asp Asn 20 25 30 Val Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val 35 40 45 Ala Thr Ile Arg Thr Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Arg 85 90 95 His Thr Ile Pro Val Pro Ser Thr Pro Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu 115 120 125 Leu Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu 130 135 140 Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Pro Phe Ser Asn Tyr Ala Met Ser Trp 145 150 155 160 Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ser Ala Ile Ser 165 170 175 Trp Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe 180 185 190 Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn 195 200 205 Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Gln Phe 210 215 220 Ser Gly Ala Asp Tyr Gly Phe Gly Arg Leu Gly Ile Arg Gly Tyr Glu 225 230 235 240 Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 245 250 <210> 88 <211> 130 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> antibody sequence <400> 88 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Pro Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val 35 40 45 Ser Ala Ile Ser Trp Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Gln Phe Ser Gly Ala Asp Tyr Gly Phe Gly Arg Leu Gly Ile 100 105 110 Arg Gly Tyr Glu Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val 115 120 125 Ser Ser 130

Claims (19)

  1. CD1d 분자에 결합하는 데 있어 서열 번호 4에 제시된 단일 도메인 항체와 경쟁할 수 있는 첫 번째 결합 잔기(moiety)를 포함하는 결합 분자로서, CD1d-제한적인 Vδ1+ T 세포의 활성화에 의해 야기되고, 유지되고 및/또는 전파되는 질환의 치료에 사용을 위한, 바람직하게는 CD1d-제한적인 Vδ1+ 말초 T 세포 림프종(peripheral T cell lymphoma)의 치료에 사용을 위한, 결합 분자(binding molecule).
  2. CD1d 분자에 결합하는 데 있어 서열 번호 4에 제시된 단일 도메인 항체와 경쟁할 수 있는 첫 번째 결합 잔기를 포함하고 Vγ9Vδ2-TCR에 특이적으로 결합할 수 있는 두 번째 결합 잔기를 포함하는 결합 분자로서, 상기 결합 분자는 Vγ9Vδ2 T 세포를 활성화할 수 있는, 결합분자.
  3. 제2항에 있어서, 의약품(medicament)으로 사용하기 위한, 결합 분자.
  4. 제2항에 있어서, 종양 치료에 사용하기 위한, 결합 분자.
  5. 제1항, 제3항 또는 제4항에 따른 사용을 이한 결합 분자 또는 제2항에 따른 결합분자로서, 상기 결합 분자는 Vδ1 T 세포 활성화를 감소시킬 수 있는, 결합 분자.
  6. 제1항 또는 제3항 내지 제5항의 어느 한 항에 따른 사용을 위한 결합 분자, 또는 제2항 또는 제5항에 따른 결합 분자로서, 상기 결합 분자는 iNKT 세포를 활성화시킬 수 있는, 결합 분자.
  7. 제1항 또는 제3항 내지 제6항의 어느 한 항에 따른 사용을 위한 결합 분자, 또는 제2항, 제5항, 또는 제6항에 따른 결합 분자로서, 상기 결합 분자는 서열 번호 4에 제시된 항체와 같이 CD1d의 같은 에피톱에 결합하는, 결합 분자.
  8. 제3항 또는 제4항에 따른 사용을 위한 결합분자, 또는 제2항, 또는 제5항 내지 제7항에 따른 결합 분자로서, 상기 두 번째 결합 잔기는 Vγ9Vδ2-TCR에 결합하는 데 있어 서열 번호 59 내지 76 중 어느 하나에 따른 서열을 가진 단일 도메인 항체와 경쟁할 수 있고, 바람직하게는 상기 두 번째 잔기가 서열 번호 59 내지 76 중 어느 하나에 따른 서열을 가진 단일 도메인 항체와 같은 에피톱에 결합하는, 결합 분자.
  9. 제1항 또는 제3항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 사용을 위한 결합 분자, 또는 제2항 또는 제5항 내지 제8항의 어느 항에 따른 결합 분자로서, 상기 첫 번째 및/또는 두 번째 결합 잔기는 항체의 결합 잔기인, 결합 분자.
  10. 제2항에 따른 결합 분자로서, 상기 결합 분자는 서열 번호 4 에 제시된 항체와 같은 CD1d 에피톱에 결합하고, 여기서 결합 분자는 iNKT 세포를 활성화할 수 있으며 및 상기 첫 번째 및 두 번째 결합 잔기들은 항체의 결합 잔기들인, 결합분자.
  11. 제1항 또는 제3항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 사용을 위한 결합 분자, 또는 제2항 또는 제5항 내지 제10항의 어느 항에 따른 결합 분자로서, 상기 첫 번째 및/또는 두 번째 결합 잔기는 단일 도메인 항체인, 결합 분자.
  12. 제1항 또는 제3항 내지 제9항 또는 제11항 중 어느 한 항에 따른 사용을 위한 결합 분자, 또는 제2항, 또는 제5항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 결합 분자로서, 상기 첫 번째 결합 잔기가 서열 번호 1에 따른 CDR1 서열, 서열 번호 2에 따른 CDR2 서열 및/또는 서열 번호 3에 따른 CDR3 서열을 포함하거나, 또는 임의의 서열, 여기서는 독립적으로 임의의 아미노산이, 바람직하게 최대로 4개의 아미노산, 좀 더 바람직하게 최대 3개의, 좀 더 바람직하게 최대 2개의, 가장 바람직하게 최대 1개의 아미노산이 표 3에 따라 보존적으로 치환된 서열을 포함하는, 결합분자.
  13. 제1항 또는 제3항 내지 제9항 또는 제12항 중 어느 한 항에 따른 사용을 위한 결합 분자, 또는 제2항, 또는 제5항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 결합 분자로서, 상기 첫 번째 결합 잔기가 서열 번호 85에 제시된 서열을 포함하는, 결합 분자.
  14. 제3항 내지 제9항 또는 제11항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 사용을 위한 결합 분자, 또는 제2항, 또는 제5항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 결합 분자로서, 상기 두 번째 결합 잔기는 서열 번호 5에 따른 CDR1 서열, 서열 번호 6에 따른 CDR2 서열 및/또는 서열 번호 7에 따른 CDR3 서열; 또는 서열 번호 8에 따른 CDR1 서열, 서열 번호 9에 따른 CDR2 서열 및/또는 서열 번호 10에 따른 CDR3 서열; 또는 서열 번호 11에 따른 CDR1 서열, 서열 번호 12에 따른 CDR2 서열 및/또는 서열 번호 13에 따른 CDR3 서열; 또는 서열 번호 14에 따른 CDR1 서열, 서열 번호 15에 따른 CDR2 서열 및/또는 서열 번호 16에 따른 CDR3 서열; 또는 서열 번호 17에 따른 CDR1 서열, 서열 번호 18에 따른 CDR2 서열 및/또는 서열 번호 19에 따른 CDR3 서열; 또는 서열 번호 20에 따른 CDR1 서열, 서열 번호 21에 따른 CDR2 서열 및/또는 서열 번호 22에 따른 CDR3 서열; 또는 서열 번호 23에 따른 CDR1 서열, 서열 번호 24에 따른 CDR2 서열 및/또는 서열 번호 25에 따른 CDR3 서열; 또는 서열 번호 26에 따른 CDR1 서열, 서열 번호 27에 따른 CDR2 서열 및/또는 서열 번호 28에 따른 CDR3 서열; 또는 서열 번호 29에 따른 CDR1 서열, 서열 번호 30에 따른 CDR2 서열 및/또는 서열 번호 31에 따른 CDR3 서열; 또는 서열 번호 32에 따른 CDR1 서열, 서열 번호 33에 따른 CDR2 서열 및/또는 서열 번호 34에 따른 CDR3 서열; 또는 서열 번호 35에 따른 CDR1 서열, 서열 번호 36에 따른 CDR2 서열 및/또는 서열 번호 37에 따른 CDR3 서열; 또는 서열 번호 38에 따른 CDR1 서열, 서열 번호 39에 따른 CDR2 서열 및/또는 서열 번호 40에 따른 CDR3 서열; 또는 서열 번호 41에 따른 CDR1 서열, 서열 번호 42에 따른 CDR2 서열 및/또는 서열 번호 43에 따른 CDR3 서열; 또는 서열 번호 44에 따른 CDR1 서열, 서열 번호 45에 따른 CDR2 서열 및/또는 서열 번호 46에 따른 CDR3 서열; 또는 서열 번호 47에 따른 CDR1 서열, 서열 번호 48에 따른 CDR2 서열 및/또는 서열 번호 49에 따른 CDR3 서열; 또는 서열 번호 50에 따른 CDR1 서열, 서열 번호 51에 따른 CDR2 서열 및/또는 서열 번호 52에 따른 CDR3 서열; 또는 서열 번호 53에 따른 CDR1 서열, 서열 번호 54에 따른 CDR2 서열 및/또는 서열 번호 55에 따른 CDR3 서열; 또는 서열 번호 56에 따른 CDR1 서열, 서열 번호 57에 따른 CDR2 서열 및/또는 서열 번호 58에 따른 CDR3 서열; 또는 그러한 임의의 서열, 여기서는 독립적으로 임의의 아미노산이, 바람직하게 최대로 4개의 아미노산, 좀 더 바람직하게 최대 3개의, 좀 더 바람직하게 최대 2개의, 가장 바람직하게 최대 1개의 아미노산이 표 3에 따라 보존적으로 치환된 서열을 포함하는, 결합분자.
  15. 제3항 내지 제9항 또는 제11항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 사용을 위한 결합 분자, 또는 제2항, 또는 제5항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 결합 분자로서, 상기 두 번째 결합 잔기는 서열 번호 86 또는 서열 번호 88에 제시된 서열을 포함하는, 결합 분자.
  16. 제3항 내지 제9항 또는 제11항 내지 제15항 중 어느 한 항에 따른 사용을 위한 결합 분자, 또는 제2항, 또는 제5항 내지 제15항 중 어느 한 항에 따른 결합 분자로서, 상기 결합 분자는 서열 번호 87에 제시된 서열을 포함하는, 결합 분자.
  17. 제1항, 제3항 내지 제9항 또는 제11항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 사용을 위한 결합 분자, 또는 제2항, 또는 제5항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 결합 분자로서, 종양을 타겟하는 잔기를 더 포함하는, 결합 분자.
  18. 제4항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따른 사용을 위한 결합 분자로서, 상기 종양은, T 세포 림프종 (T cell lymphoma), 다발성 골수종 (multiple myeloma), 급성 골수성 백혈병 (acute myeloid leukemia), 급성 림프아구 백혈병 (acute lymphoblastic leukemia), 만성 림프구 백혈병 (chronic lymphocytic leukemia), 맨틀 세포 림프종 (mantle cell lymphoma), B 세포 림프종 (B cell lymphoma), 매캐한 골수종 (smoldering myeloma), 호츠킨스 림프종 (Hodgkin lymphoma), 골수 단핵구 백혈병 (myelomonocytic leukemias), 림프 형질세포성 림프종 (lymphoplasmacytic lymphoma), 털 세포 백혈병 (hairy cell leukemia), 및 지라 주변영역 림프종 (splenic marginal zone lymphoma) 과 같은 혈액학적 악성종양, 또는 신장 세포 암종 (renal cell carcinoma), 흑색종 (melanoma), 결장 암종 (colorectal carcinoma), 머리 및 목 암 (head and neck cancer), 유방암 (breast cancer), 전립선암 (prostate cancer), 폐암 (lung cancer), 췌장암 (pancreatic cancer), 위-식도암 (gastro-esophageal cancer), 작은창자 암종 (small bowel carcinoma), 중추 신경계 종양 (central nervous system tumors), 수모세포종 (medulloblastomas), 간세포 암종 (hepatocellular carcinoma), 난소암 (ovarian cancer), 신경교종 (glioma), 신경아세포종 (neuroblastoma), 요로 상피 암종 (Urothelial carcinomas), 방광암 (bladder cancer), 육종 (sarcoma), 음경암 (penile cancer), 기저 세포 암종 (basal cell carcinoma), 메르켈 세포 암 (merkel cell carcinoma), 신경 내분비 암종 (neuroendocrine carcinoma), 신경 내분비 종양 (neuroendocrine tumors), 알려지지 않은 일차 암종 (carcinoma of unknown primary) (CUP), 흉선종 (thymoma), 외음부 암 (vulvar cancer), 자궁경부 암종 (cervical carcinoma), 고환 암 (testicular cancer), 담관암종 (cholangiocarcinoma), 충수 암 (appendicular carcinoma), 중피종 (thelioma), 팽대부성암 (ampullary carcinoma), 항문암 (anal cancer), 및 융모막 암종 (choriocarcinoma) 과 같은 고형 종양으로부터 선택되는, 결합 분자.
  19. 제2항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따른 항체와 같은, 결합분자 및 약학적으로 허용가능한 부형제(excipient)를 포함하는 약학적 조성물.

















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