JP2022519082A

JP2022519082A - 新規ｃｄ４０結合抗体

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Publication number: JP2022519082A
Application number: JP2021544622A
Authority: JP
Inventors: ヨハネス・イェレ・ファン・デル・フリート; イリス・デ・ヴェールト; タニヤ・デニス・デ・グライル; ポール・パレン; アロン・フィリップ・カテル; ジョルジュ・ローデヴェイク・シェフェール
Original assignee: ラヴァ・セラピューティクス・ベー・フェー
Priority date: 2019-02-01
Filing date: 2020-01-30
Publication date: 2022-03-18
Also published as: CA3128148A1; BR112021015238A8; AU2020216250A1; BR112021015238A2; MX2021009285A; US20220135694A1; CN113993893A; KR20210141466A; EP3917960A1; WO2020159368A1; SG11202108141VA

Abstract

本発明は、ヒトCD40に結合することができる新規抗体に、及びヒトCD40に結合することができ、ヒトVγ9Vδ2 T細胞受容体に結合することができる新規多重特異性抗体に関する。本発明は、本発明の抗体を含む医薬組成物に、及び医学的処置のための本発明の抗体の使用に更に関する。

Description

CD40は、Bリンパ球、樹状細胞、単球、内皮細胞、線維芽細胞、造血前駆細胞、血小板及び基底上皮細胞を含む、多数の細胞種上に存在する共刺激性受容体である。CD40リガンド(CD40L)のCD40への結合は、細胞種及び微小環境に依存して、様々な異なる生物学的効果を産生する細胞内シグナル伝達経路を活性化する。CD40/CD40L結合は、粥状動脈硬化、移植片拒絶、凝固、感染制御及び自己免疫において役割を果たす。また、B細胞悪性腫瘍及び固形腫瘍を含む多くの腫瘍細胞は、CD40を発現し、そのため、CD40は、がん治療の潜在的標的になっている(Vonderheide (2007) Clin Cancer Res 13:1083)。

CD40アゴニスト薬及びCD40アンタゴニスト薬の両方が、がん治療のために検討されている。CD40アゴニストが、2倍の理論的根拠により、主に選択されている。第1に、CD40アゴニストは、宿主抗原提示細胞を活性化することによって、免疫刺激を誘発することができ、それは、その後、腫瘍を対象とするT細胞応答を駆動して、腫瘍細胞死を引き起こす。第2に、CD40連結は、CD40を発現する腫瘍に対する直接的な腫瘍細胞傷害性を与えることができる(Vonderheide (2007) Clin Cancer Res 13:1083)。Taiら (2005) Cancer Res 65:5898は、多発性骨髄腫に対するヒトアンタゴニスト抗CD40抗体(ルカツムマブ(lucatumumab)、CHIR-12.12又はHCD 122)の抗腫瘍活性を説明している。進行したリンパ腫を有する再発/難治性患者における中程度の活性が見出された(Fanalaら (2014) Br J Haematol 164:258)。様々なアンタゴニストCD40抗体が、自己免疫疾患のための潜在的処置として調査されている(Schwabeら (2018) J Clin Pharmacol、8月16)。

WO2015156673 WO2007059782 WO2010134666 WO2014081202 WO2013157953 WO2009080254 WO2009058383 WO2012023053 WO2010111625 WO2010059315

Vonderheide (2007) Clin Cancer Res 13:1083 Taiら (2005) Cancer Res 65:5898 Fanalaら (2014) Br J Haematol 164:258 Schwabeら (2018) J Clin Pharmacol、8月16 Huehlsら (2015) Immunol Cell Biol 93:290 Ellerman (2019) Methods、154:102 de Bruinら (2017) Oncoimmunology 7(1):e1375641 Engelbertsら (2020) Ebiomedicine 52:102625 Canfield及びMorrison (1991) J Exp Med 173:1483 Birdら、Science 242、423～426(1988) Hustonら、PNAS USA 85、5879～5883(1988) Hamers-Castermanら (1993) Nature 363:446 Rooversら (2007) Curr Opin Mol Ther 9:327 Krahら (2016) Immunopharmacol Immunotoxicol 38:21 Choitia及びLesk (1987) J. Mol. Biol. 196:901 Kabatら (1991) Sequence of protein of immunological interest、第5版 NIH公報 www.abysis.org (UCL) Wranikら J. Biol. Chem. 2012、287(52):43331～9、doi:10.1074/jbc.M112.397869. Epub 2012 11月1 Bostromら 2009. Science 323、1610～1614 LaFleurら MAbs. 2013 3～4月;5(2):208～18 Doppalapudi, V.R.ら 2007. Bioorg. Med. Chem. Lett. 17、501～506 Lewisら Nat Biotechnol. 2014 2月;32(2):191～8 Dimasiら J Mol Biol. 2009 10月30;393(3):672～92 Pearceら Biochem Mol Biol Int. 1997 9月;42(6):1179 Blankenship JWら AACR第100回年次会議2009(概要5465番) Lawrence FEBS Lett. 1998 4月3;425(3):479～84 Zhuら Immunol Cell Biol. 2010 8月;88(6):667～75 Hmilaら、FASEB J. 2010 Harlowら、Antibodies: A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、N.Y.、1988 Colliganら編、Current Protocols in Immunology、Greene Publishing Assoc及びWiley InterScience N. Y.、(1992、1993) Muller、Meth. Enzymol. 92、589～601(1983) E. Meyers及びW. Miller、Comput. Appl. Biosci 4、11～17(1988) Obergら (2014) Cancer Res 74:1349 Neumanら (2016) J Med Prim 45:139 Roweら、Handbook of Pharmaceutical Excipients、2012 6月、ISBN 9780857110275 de Bruinら (2016)、Clin Immunol 169:128～138 Lamerisら (2016)、Immunology 149(1)111～21 Masterson (2002) Blood 100:701 Rooversら (2007) Cancer Immunol Immunother 56(3):303～317 Hallaertら (2008)、Blood 112(13):5141～9 Thijssenら (2015)、Haematologica 100(8):e302～6 Pellat-Deceunynckら (1994) Blood 84:2597

顕著な進歩がなされている一方で、今日までに医学的使用に承認されているCD40抗体はなく、治療的に有効であるが、それでも毒性が許容可能である新規CD40抗体についての要求がまだ存在している。

本発明は、CD40ベースの治療のための新規抗体を提供する。CD40結合領域が、Vγ9Vδ2 T細胞受容体を結合し、したがってVγ9Vδ2 T細胞を係合することができる結合領域と組み合わせられた二重特異性抗体を構築した。驚くべきことに、二重特異性抗体は、CD40刺激に拮抗し、初代慢性リンパ球性白血病(CLL:chronic lymphocytic leukemia)細胞及び初代多発性骨髄腫(MM:multiple myeloma)細胞の死滅を効率的に媒介することができた。死滅は、CLL細胞がCD40Lにより刺激された場合でさえも有効であった。更に、二重特異性抗体は、CLL細胞を、CLLの処置において使用されるBcl-2ブロッカーであるベネトクラクスに感受性にした。

腫瘍標的結合特異性及びT細胞結合特異性を有する二重特異性T細胞係合抗体は、当該技術分野において説明されており、例えば、Huehlsら (2015) Immunol Cell Biol 93:290;Ellerman (2019) Methods、154:102;de Bruinら (2017) Oncoimmunology 7(1):e1375641及びWO2015156673を参照されたい。しかしながら、結果は、腫瘍標的毎に顕著に変化する。例えば、T細胞標的(CD3)結合部分が、8つの様々なB細胞標的(CD20、CD22、CD24、CD37、CD70、CD79b、CD138及びHLA-DR)に対する結合部分と組み合わせられたある研究では、様々な腫瘍標的をターゲティングする二重特異性抗体は、細胞傷害能において強い変動を示し、細胞傷害性は、抗原発現レベルと相関しないことが分かった。例えば、HLA-DR又はCD138をターゲティングするCD3ベースの二重特異性抗体は、中程度～高いHLA-DR及びCD138発現レベルにもかかわらず、細胞傷害性を誘導することができなかった(Engelbertsら (2020) Ebiomedicine 52:102625)。

第1の態様では、本発明は、ヒトCD40に結合することができる第1の抗原結合領域とヒトVγ9Vδ2 T細胞受容体に結合することができる第2の抗原結合領域とを含む多重特異性抗体を提供する。

第2の態様では、本発明は、ヒトCD40に結合することができる第1の抗原結合領域を含む抗体であって、ヒトCD40への結合について、配列番号13で示される配列を有する抗体と競合し、且つ/又はヒトCD40への結合について、配列番号14で示される配列を有する抗体と競合する、抗体を提供する。

更なる態様では、本発明は、本発明の抗体を含む医薬組成物、医学的処置における本発明の抗体の使用に、及び本発明の抗体を産生するための核酸構築物、発現ベクターに、並びにそのような核酸構築物又は発現ベクターを含む宿主細胞に関する。

本発明の更なる態様及び実施形態を、以下に説明する。

抗CD40 VHHは、CD40発現細胞に結合する。(A)WT(黒色ヒストグラム)及びCD40をトランスフェクトした(白色ヒストグラム)HEK293T細胞上のCD40発現。(B)CD40陰性WT又はCD40をトランスフェクトしたHEK293T細胞を、V12t(1μM)、V15t(1μM)、V19t(1μM)又は媒体対照とインキュベートし、続いてMycタグをフローサイトメトリーによって検出した。3回の独立実験で得た代表的なヒストグラムを示す。抗CD40 VHHは、初代CLL細胞に結合する。(A)初代CLL細胞上のCD40発現(黒色ヒストグラム:非染色対照、灰色ヒストグラム:CD40-PE染色)。5つの試験した試料の代表的なヒストグラムを示す。(B)初代CLL細胞(n=5)を、V12t(1μM)、V15t(1μM)、V19t(1μM)又は媒体対照とインキュベートし、続いてMycタグをフローサイトメトリーによって検出した。データは、平均値及び平均値の標準誤差(SEM:standard error of mean)を表す。*P<0.05(B:反復測定一元配置分散分析、続いてVHHなしと比較したダネットの事後検定)。抗CD40 VHHは、CD40のアゴニストではない。初代CLL細胞(n=6)を、示される濃度の抗CD40 VHH、rmCD40L(100ng/mL)又は媒体対照を伴って48時間培養し、フローサイトメトリーによって解析した。媒体対照と比較した(A)生存率、(B)CD86及び(C)CD95発現。データは、平均値及びSEMを表す。*P<0.05(A～C:一元配置分散分析、続いて媒体対照と比較したダネットの事後検定)。一価のVHH V15t及びV19tは、CD40刺激に拮抗する。初代CLL細胞(n=6)を、一価の抗CD40 VHH又は媒体対照と30分間プレインキュベートし、その後、組換え多量体CD40L(100ng/mL)の存在下で48時間培養し、フローサイトメトリーによって解析した。媒体対照と比較した(A)生存率、(B)CD86及び(C)CD95発現。データは、平均値及びSEMを表す。*P<0.05、***P<0.001、****P<0.0001。(A～C:一元配置分散分析、続いて媒体対照と比較したダネットの事後検定)。 V19S76K-5C8は、CD40発現細胞に結合する。CD40陰性WT又はCD40をトランスフェクトしたHEK293T細胞を、V19S76K-5C8(1μM)又は媒体対照とインキュベートし、結合したbsVHHを、抗ラマIgG重鎖及び軽鎖抗体を使用してフローサイトメトリーによって検出した。3回の独立実験で得た代表的なヒストグラムを示す。 V19S76K-5C8は、CD40⁺及びVγ9Vδ2⁺細胞に結合する。細胞株を、V19S76K-5C8又は媒体対照とインキュベートし、結合したbsVHHを、抗ラマIgG重鎖及び軽鎖抗体を使用してフローサイトメトリーによって検出した。(A)バープロット及び(B)健康なドナー由来のVγ9Vδ2-T細胞株へのV19S76K-5C8結合の非線形回帰解析(n=3)。(C)バープロット及び(D)健康なドナー由来のCD40⁺CII細胞株へのV19S76K-5C8結合の非線形回帰解析(n=3)。(A、C)データは、平均値及びSEMを表す;(B、D):データは、平均値(記号)、範囲(エラーバー)、Kd(垂線)及び95%信頼区間(網掛け領域)を表す。*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001。(A、C:反復測定一元配置分散分析、続いてbsVHHを伴わない条件と比較したダネットの事後検定;B、D:非線形回帰解析)。 V19S76K-5C8は、CD40のアゴニストではない。初代CLL細胞(n=6)を、示される濃度のV19S76K-5C8、rmCD40L(100ng/mL)又は媒体対照を伴って48時間培養し、フローサイトメトリーによって解析した。媒体対照と比較した(A)CD80、(B)CD86及び(C)CD95発現。データは、平均値及びSEMを表す。*P<0.05。(A～C:反復測定一元配置分散分析、続いて媒体対照と比較したダネットの事後検定)。 V19S76K-5C8は、CD40のアンタゴニストである。初代CLL細胞(n=6)を、示される濃度のV19S76K-5C8又は媒体対照と30分間プレインキュベートし、その後、組換え多量体CD40L(100ng/mL)の存在下で48時間培養し、フローサイトメトリーによって解析した。媒体対照と比較した(A)CD80、(B)CD86及び(C)CD95発現。データは、平均値及びSEMを表す。*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001、****P<0.0001。(A～C:反復測定一元配置分散分析、続いて媒体対照と比較したダネットの事後検定)。 V19S76K-5C8は、初代CLL細胞をベネトクラクスに感受性にする。初代CLL細胞を、V19S76K-5C8(1000nM)又は媒体対照と30分間プレインキュベートし、その後、組換え多量体CD40L(100ng/mL)の存在下で48時間培養した。(A)その後、細胞を、ベネトクラクス(ABT-199)を伴って24時間培養し、生存率をフローサイトメトリーによって測定した(n=6)。(B)48時間後、Bcl-xL発現をフローサイトメトリーによって解析した(n=3)。特異的溶解を:(ABT-199で処理した細胞における細胞死%)-(非処理細胞における細胞死%)/(非処理細胞における生細胞%)*100として計算した。データは、平均値及びSEMを表す。***P<0.001、****P<0.0001。(A:二元配置分散分析、続いて条件を媒体対照と比較するダネットの事後検定、B:反復測定一元配置分散分析、続いて媒体対照と比較したダネットの事後検定)。 V19S76K-5C8は、Vγ9Vδ2-T細胞を活性化する。拡張したVγ9Vδ2-T細胞(n=3)を、V19S76K-5C8及びCD40⁺CII標的細胞と1:1の比で、ブレフェルジン(Brefeldin)A、モネンシン(monensin)及び抗CD107aの存在下において4時間培養して、フローサイトメトリーによって脱顆粒及び細胞内サイトカイン産生を測定した。Vγ9Vδ2-T細胞による(A)CD107a、(B)IFN-γ、(C)TNF-α及び(D)IL-2発現。データは、平均値及びSEMを表す。*P<0.05。(A～D:反復測定一元配置分散分析、続いて標的を伴う、bsVHHの非存在下(0pM)での条件と比較したダネットの事後検定)。 V19S76K-5C8は、CD40⁺細胞に対する細胞傷害性を向上させる。CD40⁺ CII標的細胞を、拡張したVγ9Vδ2-T細胞と1:1の比でV19S76K-5C8の存在下において一晩培養し、生存率をフローサイトメトリーによって測定した(n=5)。bsVHHで誘導した細胞傷害性の(A)バープロット及び(B)非線形回帰解析。細胞死を、(処理細胞における細胞死%)-(非処理細胞における細胞死%)/(非処理細胞における生細胞%)*100を計算することによって、Vγ9Vδ2-T細胞を伴わない条件でのバックグラウンド細胞死について補正する。(A)データは、平均値及びSEMを表す;(B)データは、平均値(記号)、範囲(エラーバー)、Kd(垂線)及び95%信頼区間(網掛け領域)を表す。*P<0.05、**P<0.01。(A:反復測定一元配置分散分析、続いてVγ9Vδ2-T細胞を伴う、bsVHHの非存在下(0nM)での条件と比較したダネットの事後検定;B:非線形回帰解析)。 V19S76K-5C8細胞傷害性は、CD40特異的である。CD40陰性WT又はCD40をトランスフェクトしたHEK293T標的細胞のいずれかを、拡張したVγ9Vδ2-T細胞と1:1の比でV19S76K-5C8の存在下において一晩培養した。生存率をフローサイトメトリーによって測定した(n=3)。細胞死を、(処理細胞における細胞死%)-(非処理細胞における細胞死%)/(非処理細胞における生細胞%)*100を計算することによって、Vγ9Vδ2-T細胞を伴わない条件でのバックグラウンド細胞死について補正する。データは、平均値及びSEMを表す。****P<0.0001。(混合効果分析及びCD40をトランスフェクトした細胞をWTに対して比較するシダックの事後検定、混合効果分析及びCD40をトランスフェクトした細胞をWTに対して比較するシダックの事後検定)。 V12-5C8t、V15-5C8t及びV19-5C8tは、初代CLL細胞に対する細胞傷害性を向上させる。CLL標的細胞を、拡張したVγ9Vδ2-T細胞と1:1の比で二重特異性VHHの存在下において一晩培養し、生存率をフローサイトメトリーによって測定した(n=3)。細胞死を、(処理細胞における細胞死%)-(非処理細胞における細胞死%)/(非処理細胞における生細胞%)*100を計算することによって、Vγ9Vδ2-T細胞を伴わない条件でのバックグラウンド細胞死について補正する。データは、平均値及びSEMを表す。*P<0.05。(二元配置分散分析、続いて各VHHの平均値を互いのVHHと比較するテューキーの事後検定)。 V19S76K-5C8は、CD40で刺激したCLL細胞に対して有効である。CLL PBMC試料(n=3)を、照射した3T3又はCD40L⁺-3T40L線維芽細胞上で72時間培養した。その後、細胞を、媒体対照、健康なドナー由来の拡張したVγ9Vδ2-T細胞(1:1の比)、健康なドナー由来の拡張したVγ9Vδ2-T細胞(1:1の比)及びV19S76K-5C8(100nM)、又はベネトクラクス(ABT-199、10nM)と一晩培養した(n=3)。生存率を、フローサイトメトリーによって測定した。細胞死を、(処理細胞における細胞死%)-(非処理細胞における細胞死%)/(非処理細胞における生細胞%)*100を計算することによって、Vγ9Vδ2-T細胞を伴わない条件でのバックグラウンド細胞死について補正する。データは、平均値及びSEMを表す。***P<0.001。(二元配置分散分析、続いて3T3で刺激したCLL細胞と3T40Lで刺激したCLL細胞との間の各処理条件を比較するシダックの事後検定)。 V19S76K-5C8は、CLL患者からの自家Vγ9Vδ2-T細胞を活性化する。CLL患者からのPBMCを、CD19⁺ CLL細胞の枯渇によってT細胞について富化し、その後、CD19⁺ CLL細胞(1:1の比)及びV19S76K-5C8(10nM)、又は媒体対照と、ブレフェルジンA、モネンシン及び抗CD107aの存在下で16時間共培養して、フローサイトメトリーによって(A)IFN-γ、(B)TNF-α、(C)IL-2の産生及び(D)脱顆粒を測定した(n=7)。データは、平均値及びSEMとして表す。*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001。(A～D:対応のあるt検定)。 V19S76K-5C8は、自家CLL細胞の溶解を誘導する。CD3⁺細胞及びCD19⁺細胞を、同じCLL患者のPBMCから単離し、V19S76K-5C8(10nM)又は媒体対照と10:1の比で一晩培養した。生存CLL細胞を、計数ビーズを使用して、フローサイトメトリーによって定量した(n=2 CLL患者)。**P<0.01。(対応のあるt検定)。 V19S76K-5C8は、初代多発性骨髄腫に対して活性である。(A)抗CD40 PE抗体、クローンMAB89、Beckman Couter社、IM1936Uを使用して検出される、初代MM細胞上のCD40発現の例。4人のドナーの代表的なヒストグラム(B)MM患者の骨髄を、健康なドナー由来のVγ9Vδ2-T細胞の存在下又は非存在下で1:1(Vγ9Vδ2-T:血漿細胞)の比において、V19S76K-5C8(10pM又は10nM)の非存在下又は存在下にて一晩培養した。生存血漿細胞を、計数ビーズを使用して、フローサイトメトリーによって定量した(n=5)。(C、D)MM患者の骨髄からの単核細胞を、V19S76K-5C8(VHH;10nM)、アミノビスホスホネート(ABP;10μMゾレドロン酸(陽性対照))又は媒体対照を伴って、ブレフェルジン、モネンシン及び抗CD107aの存在下で一晩培養して、フローサイトメトリーによって(C)サイトカイン産生及び(D)脱顆粒を測定した(n=6)。データは、平均値及びSEMとして表す。*P<0.05、**P<0.01。(B～D:反復測定一元配置分散分析、続いて抗体を伴わない条件と比較したダネットの事後検定)。二重特異性抗CD40-Vδ2 VHHは、in vivoで生存を延長する。免疫不全NSGマウスを、-1日目に照射し、0日目に2.5*10⁶個のMM.1s細胞を移植した(i.v.)。マウスは、7、14及び21日目にPBS又はヒトVγ9Vδ2-T細胞(1*10⁷個の細胞;両方ともi.v.)、続いてPBS又はV19S76K-5C8(VHH;5mg/kg;両方ともi.p.)を、9日目に開始して毎週2回受容した。(A)処置スケジュールの概略図。(B)マウス生存のカプラン・マイヤー分析(対照:n=6;V19S76K-5C8(VHH):n=6、Vγ9Vδ2-T細胞:n=8、Vγ9Vδ2-T細胞+V19S76K-5C8(VHH):n=8)。殺した際の(C)骨髄(BM:bone marrow)及び(D)形質細胞腫におけるMM.1s細胞(ヒトCD45⁺CD38⁺細胞)上でのCD40発現。(E)腫瘍注入時の個々の体重と比較した7週間の処置後の体重。**P<0.01、***P<0.001。データは、平均値及びSDとして表す。(B:マンテル・コックスのログランク検定、続いてホルム・シダックの事後検定、C:一元配置分散分析、続いて対照マウスと比較したダネットの事後検定、D:対応のないt検定)。

定義
「ヒトCD40」という用語は、本明細書で使用される場合、配列番号24で示される、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー5(UniProtKB-P25942(TNR5_HUMAN))、イソ型Iとしても公知の、CD40タンパク質を指す。

「ヒトVδ2」という用語は、本明細書で使用される場合、T細胞受容体デルタ可変部2(UniProtKB-A0JD36(A0JD36_HUMAN)は、Vδ2配列の例を与える)であるTRDV2タンパク質を指す。

「ヒトVγ9」という用語は、本明細書で使用される場合、T細胞受容体ガンマ可変部9(UniProtKB-Q99603_HUMANは、Vγ9配列の例を与える)であるTRGV9タンパク質を指す。

「抗体」という用語は、有意な期間、例えば、少なくとも約30分間、少なくとも約45分間、少なくとも約1時間、少なくとも約2時間、少なくとも約4時間、少なくとも約8時間、少なくとも約12時間、約24時間若しくはそれよりも長い、約48時間若しくはそれよりも長い、約3、4、5、6、7若しくはそれよりも長い日数等、又は任意の他の関連する機能上定義される期間(例えば、抗原への抗体結合と関連付けられる生理応答を誘導、促進、向上及び/若しくはモジュレートするのに十分な時間、並びに/又は抗体がエフェクター活性を動員するのに十分な時間)の半減期で、典型的な生理的条件下において抗原に特異的に結合する能力を有する免疫グロブリン分子、免疫グロブリン分子の断片又はそれらのいずれかの誘導体を指すことを意図する。抗原と相互作用する抗原結合領域(又は抗原結合ドメイン)は、免疫グロブリン分子の重鎖及び軽鎖の両方の可変領域を含み得るか、又はシングルドメイン抗原結合領域、例えば、重鎖可変領域のみであってもよい。抗体の定常領域は、存在する場合、免疫グロブリンの、免疫系の様々な細胞(例えば、エフェクター細胞及びT細胞)及び補体活性化の古典的経路の第1の成分であるC1q等の補体系の成分を含む宿主組織又は因子への結合を媒介し得る。しかしながら、一部の実施形態では、抗体のFc領域は、不活性になるように改変されており、「不活性」とは、少なくとも、任意のFcγ受容体に結合すること、FcRのFc媒介架橋結合を誘導すること、又は個々の抗体の2つのFc領域を介した標的抗原のFcR媒介架橋結合を誘導することができないFc領域を意味する。更なる実施形態では、不活性Fc領域は、加えて、C1qに結合することができない。一実施形態では、抗体は、234位及び235位における突然変異(Canfield及びMorrison (1991) J Exp Med 173:1483)、例えば、234位のLeuからPheへの突然変異及び235位のLeuからGluへの突然変異を含有する。別の実施形態では、抗体は、234位のLeuからAlaへの突然変異、235位のLeuからAlaへの突然変異及び329位のProからGlyへの突然変異を含有する。別の実施形態では、抗体は、234位のLeuからPheへの突然変異、235位のLeuからGluへの突然変異及び265位のAspからAlaを含有する。

上記に示される通り、抗体という用語は、本明細書で使用される場合、別に言明しない限り、又は文脈によって明確に否定されない限り、抗原に特異的に結合する能力を保持する抗体の断片を含む。抗体の抗原結合機能は、全長抗体の断片によって行われ得ることが示されている。「抗体」という用語内に包含される結合断片の例には、(i)Fab'又はFab断片、すなわち、VL、VH、CL及びCH1ドメインからなる一価の断片、又はWO2007059782において説明される一価の抗体;(ii)F(ab')2断片、すなわち、ヒンジ領域においてジスルフィド架橋によって連結された2つのFab断片を含む二価の断片;(iii)本質的にVH及びCH1ドメインからなるFd断片;並びに(iv)本質的に抗体のシングルアームのVL及びVHドメインからなるFv断片が含まれる。更に、Fv断片の2つのドメイン、VL及びVHは、別々の遺伝子によってコードされるが、それらは、組換え法を使用して、それらが、VL及びVH領域が対になって一価の分子(単鎖抗体又は単鎖Fv(scFv)として公知、例えば、Birdら、Science 242、423～426(1988)及びHustonら、PNAS USA 85、5879～5883(1988)を参照されたい)を形成する単一のタンパク質鎖として作製されることを可能にする合成リンカーによって接合してもよい。そのような単鎖抗体は、文脈によって別のように示されない限り、抗体という用語内に包含される。そのような断片は、一般的に、抗体の意味に含まれるが、それらは、集合的に、各々独立して、本発明の独特の特色であり、様々な生物学的特性及び有用性を示す。また、抗体という用語は、別に特定されない限り、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体(mAb)、キメラ抗体及びヒト化抗体、並びに任意の公知の技法、例えば、酵素切断、ペプチド合成及び組換え技法によって提供された抗体断片を含む。

本発明の抗体の一部の実施形態では、第1の抗原結合領域若しくは抗原結合領域又はその両方は、シングルドメイン抗体である。シングルドメイン抗体(sdAb、Nanobody(登録商標)又はVHHとも呼ばれる)は、当業者に周知であり、例えば、Hamers-Castermanら (1993) Nature 363:446、Rooversら (2007) Curr Opin Mol Ther 9:327及びKrahら (2016) Immunopharmacol Immunotoxicol 38:21を参照されたい。シングルドメイン抗体は、シングルCDR1、シングルCDR2及びシングルCDR3を含む。シングルドメイン抗体の例は、重鎖のみの抗体の可変断片、天然に軽鎖を含まない抗体、従来型抗体に由来するシングルドメイン抗体、及び操作された抗体である。シングルドメイン抗体は、マウス、ヒト、ラクダ、ラマ、サメ、ヤギ、ウサギ及びウシを含む任意の種に由来し得る。例えば、天然のVHH分子は、ラクダ科の種において、例えば、ラクダ、ヒトコブラクダ、アルパカ及びグアナコにおいて生じさせた抗体に由来し得る。抗体全体と同様に、シングルドメイン抗体は、特異的抗原に選択的に結合することができる。シングルドメイン抗体は、免疫グロブリン鎖の可変ドメインのみ、すなわち、CDR1、CDR2及びCDR3並びにフレームワーク領域を含有し得る。

「免疫グロブリン」という用語は、本明細書で使用される場合、4つ全てが潜在的にジスルフィド結合によって相互接続される2対のポリペプチド鎖、1対の軽(L)鎖及び1対の重(H)鎖からなる、構造的に関連する糖タンパク質のクラスを指すことを意図する。「免疫グロブリン重鎖」、「免疫グロブリンの重鎖」又は「重鎖」という用語は、本明細書で使用される場合、免疫グロブリンの鎖の1つを指すことを意図する。重鎖は、典型的に、重鎖可変領域(本明細書でVHと略される)、及び免疫グロブリンのアイソタイプを規定する重鎖定常領域(本明細書でCHと略される)からなる。重鎖定常領域は、典型的に、3つのドメイン、CH1、CH2及びCH3からなる。重鎖定常領域は、ヒンジ領域を更に含む。免疫グロブリン(例えば、IgG)の構造内で、2つの重鎖は、ヒンジ領域においてジスルフィド結合を介して相互接続される。重鎖と等しく、各軽鎖は、典型的に、いくつかの領域;軽鎖可変領域(VL)及び軽鎖定常領域(CL)からなる。更に、VH及びVL領域は、フレームワーク領域(FR:framework region)と呼ばれる、より保存された領域により散在される、相補性決定領域(CDR:complementarity determining region)とも呼ばれる超可変性の領域(又は配列が超可変であり得る超可変領域、及び/若しくは構造的に規定されたループを形成する超可変領域)に細分され得る。各VH及びVLは、典型的に、アミノ末端からカルボキシ末端まで以下の順序で配置された3つのCDR及び4つのFR:FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4からなる。CDR配列は、様々な方法、例えば、Choitia及びLesk (1987) J. Mol. Biol. 196:901又はKabatら (1991) Sequence of protein of immunological interest、第5版 NIH公報によって提供される方法の使用によって決定され得る。CDR決定及びアミノ酸番号付けのための様々な方法は、www.abysis.org (UCL)において比較することができる。

「アイソタイプ」という用語は、本明細書で使用される場合、免疫グロブリン(サブ)クラス(例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgD、IgA、IgE又はIgM)又はその任意のアロタイプ、例えば、重鎖定常領域遺伝子によってコードされるIgG1m(za)及びIgG1m(f)を指す。各重鎖アイソタイプは、カッパ(κ)又はラムダ(λ)軽鎖のいずれかと組み合わせることができる。本発明の抗体は、任意のアイソタイプを所有し得る。

「全長抗体」という用語は、本明細書で使用される場合、そのアイソタイプの野生型抗体において通常見出されるドメインに対応する全ての重鎖及び軽鎖定常及び可変ドメインを含有する抗体を指す。

「キメラ抗体」という用語は、可変領域が非ヒト種に由来し(例えば、げっ歯類に由来し)、定常領域が、異なる種、例えば、ヒトに由来する抗体を指す。キメラ抗体は、遺伝子工学によって生成され得る。治療適用のためのキメラモノクローナル抗体は、抗体免疫原性を低減するように開発される。

「ヒト化抗体」という用語は、ヒト抗体定常ドメイン、及びヒト可変ドメインへの高レベルの配列相同性を含有するように改変された非ヒト可変ドメインを含有する遺伝子操作した非ヒト抗体を指す。これは、共に抗原結合部位を形成する6つの非ヒト抗体相補性決定領域(CDR)の、相同性ヒトアクセプターフレームワーク領域(FR)上へのグラフト化によって達成することができる。親抗体の結合親和性及び特異性を完全に再構成するために、親抗体(すなわち、非ヒト抗体)からのフレームワーク残基の、ヒトフレームワーク領域への置換(逆突然変異)が必要とされ得る。構造相同性モデリングは、抗体の結合特性に重要なフレームワーク領域におけるアミノ酸残基を特定することを補助し得る。したがって、ヒト化抗体は、非ヒトCDR配列と、主に、任意選択により非ヒトアミノ酸配列への1つ又は複数のアミノ酸逆突然変異を含むヒトフレームワーク領域と、任意選択により、完全なヒト定常領域とを含み得る。任意選択により、必ずしも逆突然変異ではない追加のアミノ酸改変は、好ましい特徴、例えば、親和性及び生化学特性を有するヒト化抗体を得るために導入され得る。非ヒト治療用抗体のヒト化は、ヒトにおけるその免疫原性を最小限にするために行われ、一方で、そのようなヒト化抗体は、同時に、非ヒト起源の抗体の特異性及び結合親和性を維持する。

「多重特異性抗体」という用語は、少なくとも2つの異なる、例えば、少なくとも3つの、典型的に非重複の、エピトープについて特異性を有する抗体を指す。そのようなエピトープは、同じ標的抗原上、又は異なる標的抗原上にあり得る。エピトープが、異なる標的上にある場合、そのような標的は、同じ細胞又は異なる細胞若しくは細胞種上にあり得る。

「二重特異性抗体」という用語は、2つの異なる、典型的に非重複の、エピトープについて特異性を有する抗体を指す。そのようなエピトープは、同じ又は異なる標的上にあり得る。エピトープが、異なる標的上にある場合、そのような標的は、同じ細胞又は異なる細胞若しくは細胞種上にあり得る。

様々なクラスの二重特異性抗体の例には、(i)ヘテロ二量体化を強いる相補性CH3ドメインを有するIgG様分子;(ii)組換えIgG様二重ターゲティング分子であって、分子の2つの側各々が、少なくとも2つの異なる抗体のFab断片又はFab断片の部分を含有する、分子;(iii)全長IgG抗体が、余分のFab断片又はFab断片の部分に融合されている、IgG融合分子;(iv)単鎖Fv分子又は安定化ディアボディが、重鎖定常ドメイン、Fc領域又はその部分に融合されている、Fc融合分子;(v)異なるFab断片が共に融合され、重鎖定常ドメイン、Fc領域又はその部分に融合されている、Fab融合分子;並びに(vi)異なる単鎖Fv分子又は異なるディアボディ又は異なる重鎖抗体(例えば、ドメイン抗体、Nanobodies(登録商標))が、互いに、又は重鎖定常ドメイン、Fc領域若しくはその部分に融合されている別のタンパク質若しくは担体分子に融合されている、ScFv及びディアボディベースの抗体、並びに重鎖抗体(例えば、ドメイン抗体、Nanobodies(登録商標))が含まれるが、これらに限定されない。

相補性CH3ドメイン分子を有するIgG様分子の例には、トリオマブ(Triomab)(登録商標)(Trion Pharma社/Fresenius Biotech社)、ノブ・イントゥ・ホール(Knobs-into-Holes)(Genentech社)、CrossMAb(Roche社)及び静電適合(Amgen社、中外、Oncomed社)、LUZ-Y(Genentech社、Wranikら J. Biol. Chem. 2012、287(52):43331～9、doi:10.1074/jbc.M112.397869. Epub 2012 11月1)、DIGボディ及びPIGボディ(Pharmabcine社、WO2010134666、WO2014081202)、鎖交換操作ドメインボディ(SEEDbody:Strand Exchange Engineered Domain body)(EMD Serono社)、バイクロニクス(Biclonics)(Merus社、WO2013157953)、FcΔAdp(Regeneron社)、二重特異性IgG1及びIgG2(Pfizer社/Rinat社)、Azymetricスキャフォールド(Zymeworks社/Merck社)、mAb-Fv(Xencor社)、二価二重特異性抗体(Roche社、WO2009080254)及びDuoBody(登録商標)分子(Genmab社)が含まれるが、これらに限定されない。

組換えIgG様二重ターゲティング分子の例には、二重ターゲティング(DT:Dual Targeting)-Ig(GSK社/Domantis社、WO2009058383)、トゥー・イン・ワン(Two-in-one)抗体(Genentech社、Bostromら 2009. Science 323、1610～1614)、架橋結合Mabs(Karmanos Cancer Center)、mAb2(F-Star社)、ZybodiesTM(Zyngenia社、LaFleurら MAbs. 2013 3～4月;5(2):208～18)、共通の軽鎖を有する手法、κλボディ(NovImmune社、WO2012023053)及びCovX-body(登録商標)(CovX社/Pfizer社、Doppalapudi, V.R.ら 2007. Bioorg. Med. Chem. Lett. 17、501～506)が含まれるが、これらに限定されない。

IgG融合分子の例には、二重可変ドメイン(DVD:Dual Variable Domain)-Ig(Abbott社)、二重ドメイン二ヘッド抗体(Unilever社;Sanofi Aventis社)、IgG様二重特異性(ImClone社/Eli Lilly社、Lewisら Nat Biotechnol. 2014 2月;32(2):191～8)、Ts2Ab(MedImmune社/AZ社、Dimasiら J Mol Biol. 2009 10月30;393(3):672～92)及びBsAb(Zymogenetics社、WO2010111625)、HERCULES(Biogen Idec社)、scFv融合(Novartis社)、scFv融合(Changzhou Adam Biotech Inc社)及びTvAb(Roche社)が含まれるが、これらに限定されない。

Fc融合分子の例には、ScFv/Fc融合物(Academic Institution、Pearceら Biochem Mol Biol Int. 1997 9月;42(6):1179)、SCORPION(Emergent BioSolutions社/Trubion社、Blankenship JWら AACR第100回年次会議2009(概要5465番);Zymogenetics社/BMS社、WO2010111625)、二重親和性リターゲティング技術(Dual Affinity Retargeting Technology)(Fc-DARTTM)(MacroGenics社)及び二重(ScFv)2-Fab(抗体薬国立研究センター-中国)が含まれるが、これらに限定されない。

Fab融合二重特異性抗体の例には、F(ab)2(Medarex社/AMGEN社)、Dual-Action又はBis-Fab(Genentech社)、ドック・アンド・ロック(Dock-and-Lock)(登録商標)(DNL)(ImmunoMedics社)、二価二重特異性(Biotecnol社)及びFab-Fv(UCB-Celltech社)が含まれるが、これらに限定されない。

ScFvベース、ディアボディベースの抗体、及びドメイン抗体の例には、二重特異性T細胞係合子(BiTE(登録商標))(Micromet社)、タンデムディアボディ(Tandab)(Affimed社)、二重親和性リターゲティング技術(DARTTM)(MacroGenics社)、単鎖ディアボディ(Academic社、Lawrence FEBS Lett. 1998 4月3;425(3):479～84)、TCR様抗体(AIT社、ReceptorLogics社)、ヒト血清アルブミンScFv融合物(Merrimack社、WO2010059315)及びCOMBODY分子(Epigen Biotech社、Zhuら Immunol Cell Biol. 2010 8月;88(6):667～75)、二重ターゲティングナノボディ(登録商標)(Ablynx社、Hmilaら、FASEB J. 2010)、二重ターゲティング重鎖のみドメイン抗体が含まれるが、これらに限定されない。

抗原への抗体結合の文脈において、「結合する」又は「特異的に結合する」という用語は、抗体の所定の抗原又は標的(例えば、ヒトCD40又はVδ2)への結合を指し、それへの結合は、典型的に、例えば、本明細書中の実施例で説明されるようにフローサイトメトリーを使用して決定した場合、約10^-6M若しくはそれ未満、例えば、10^-7M若しくはそれ未満、例えば、約10^-8M若しくはそれ未満、例えば、約10^-9M若しくはそれ未満、約10^-10M若しくはそれ未満、又は約10^-11M若しくは更にそれ未満のK_Dに対応する親和性による。或いは、見かけのK_D値は、例えば、BIAcore 3000機器において表面プラズモン共鳴(SPR:surface plasmon resonance)技術によって使用して、抗原をリガンドとして、及び結合部分又は結合分子を分析物として使用して決定することができる。特異的結合とは、抗体が、所定の抗原又は密接に関連する抗原以外の非特異的抗原(例えば、BSA、カゼイン)への結合についてのその親和性よりも、少なくとも10倍低い、例えば、少なくとも100倍低い、例えば、少なくとも1,000倍低い、例えば、少なくとも10,000倍低い、例えば、少なくとも100,000倍低いK_Dに対応する親和性により所定の抗原に結合することを意味する。親和性がより低い程度は、結合部分又は結合分子のK_Dに依存するので、結合部分又は結合分子のK_Dが、非常に低い(すなわち、結合部分又は結合分子が非常に特異的である)場合、抗原についての親和性が、非特異的抗原についての親和性よりも低い程度は、少なくとも10,000倍であり得る。「K_D」(M)という用語は、本明細書で使用される場合、抗原と結合部分又は結合分子との間の特定の相互作用の解離平衡定数を指す。

本発明の文脈において、「競合」又は「競合することができる」又は「競合する」とは、結合パートナーに結合する別の分子(例えば、異なるCD40抗体)の存在下において特定の結合分子(例えば、CD40抗体)が特定の結合パートナー(例えば、CD40)に結合する傾向における、任意の検出可能に有意な低減を指す。典型的に、競合とは、例えば、十分な量の2つ又はそれよりも多い競合分子、例えば抗体を使用するELISA分析又はフローサイトメトリーによって決定される、別の分子、例えば、抗体の存在によって引き起こされる、結合における少なくとも約25パーセント低減、例えば、少なくとも約50パーセント、例えば、少なくとも約75パーセント、例えば、少なくとも90パーセント低減を意味する。競合阻害によって結合特異性を決定するための追加の方法は、例えば、Harlowら、Antibodies: A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、N.Y.、1988;Colliganら編、Current Protocols in Immunology、Greene Publishing Assoc及びWiley InterScience N. Y.、(1992、1993);及びMuller、Meth. Enzymol. 92、589～601(1983)において見出すことができる。一実施形態では、本発明の抗体は、抗体V15若しくはV19としてCD40上の同じエピトープに、且つ/又は抗体5C8若しくは6H4としてVδ2上の同じエピトープに結合する。結合分子、例えば、抗体のエピトープを決定するための方法は、当該技術分野において公知である。

「第1」及び「第2」の抗原結合領域という用語は、本明細書で使用される場合、抗体におけるそれらの配向/位置について言及しない、すなわち、それは、N末端又はC末端についての意味を有しない。「第1」及び「第2」という用語のみは、正確に、一貫して、特許請求の範囲及び説明において2つの異なる抗原結合領域を指すために働く。

「Vγ9Vδ2-TCRに結合することができる」とは、結合分子が、Vγ9Vδ2-TCRに結合することができることを意味するが、結合分子が、別々のサブユニットのうちの1つに他のサブユニットの非存在下において、すなわち、Vγ9鎖単独に、又はVδ2鎖単独に結合することを除外しない。例えば、抗体5C8は、Vγ9Vδ2-TCRに結合するが、また、Vδ2鎖が単独で発現している場合Vδ2鎖に結合する抗体である。

「配列同一性%」とは、本明細書で使用される場合、最適整列のために導入される必要があるギャップの数及び各ギャップの長さを考慮に入れた、異なる配列によって共有される同一のヌクレオチド又はアミノ酸の位置の数を指す(すなわち、同一性%=同一の位置の数/位置の総数X100)。2つのヌクレオチド又はアミノ酸配列間の同一性パーセントは、例えば、ALIGNプログラム(2.0版)に組み込まれているE. Meyers及びW. Miller、Comput. Appl. Biosci 4、11～17(1988)のアルゴリズムを使用して、PAM120重み残基表、12のギャップ長ペナルティ及び4のギャップペナルティを使用して決定することができる。

本発明の更なる態様及び実施形態
上記に説明される通り、第1の主要な態様では、本発明は、ヒトCD40に結合することができる第1の抗原結合領域とヒトVγ9Vδ2-T細胞受容体に結合することができる第2の抗原結合領域とを含む多重特異性抗体に関する。

一実施形態では、多重特異性抗体は、二重特異性抗体である。別の実施形態では、第1の抗原結合領域は、シングルドメイン抗体である。別の実施形態では、第2の抗原結合領域は、シングルドメイン抗体である。更なる実施形態では、第1の抗原結合領域及び第2の抗原結合領域は、シングルドメイン抗体である。

一実施形態では、第1の抗原結合領域及び第2の抗原結合領域は、ペプチドリンカー、例えば、1～20個のアミノ酸、例えば、1～10個のアミノ酸、例えば、2、3、4、5、6、7、8又は10個のアミノ酸の長さを有するリンカーを介して互いに共有結合している。一実施形態では、ペプチドリンカーは、配列番号21で示される配列GGGGSを含むか、又はそれからなる。

多重特異性抗体の一実施形態では、第1の抗原結合領域は、第2の抗原結合領域のN末端に位置する。

一実施形態では、多重特異性抗体は、CD40に一価で結合し、ヒトVγ9Vδ2 T細胞受容体に一価で結合する。

本発明の多重特異性抗体の一実施形態では、多重特異性抗体は、ヒトCD40のアゴニストではない。CD40アゴニズムは、抗体の、CD40発現細胞、例えばCLL患者からの初代細胞上のCD80、CD86及び/又はCD95の発現レベルを増大させる能力を決定することによって試験することができる。そのようなアッセイは、本明細書中の実施例8において説明されるように行うことができる。一実施形態では、CLL患者からの初代細胞上のCD80の発現は、抗体が非存在である対照と比較して、抗体の存在下で10%未満、例えば、5%未満増大する。別の実施形態では、CLL患者からの初代細胞上のCD86の発現は、抗体が非存在である対照と比較して、抗体の存在下で10%未満、例えば、5%未満増大する。更なる実施形態では、CLL患者からの初代細胞上のCD95の発現は、抗体が非存在である対照と比較して、抗体の存在下で10%未満、例えば、5%未満増大する。

本発明の多重特異性抗体の更なる実施形態では、多重特異性抗体は、ヒトCD40のアンタゴニストである。CD40に対するアンタゴニスト効果は、例えば、抗体の、CD40発現細胞、例えば、CLL患者からの初代細胞におけるCD40LによるCD40の活性化を阻害する能力を試験することによって決定することができる。そのようなアッセイは、本明細書中の実施例9において説明されるように行うことができる。一実施形態では、十分な濃度のCD40Lの存在下でのCLL患者からの初代細胞上のCD80の発現は、抗体が非存在である対照と比較して、抗体の存在下で20%未満、例えば、10%未満増大する。一実施形態では、十分な濃度のCD40Lの存在下でのCLL患者からの初代細胞上のCD86の発現は、抗体が非存在である対照と比較して、抗体の存在下で20%未満、例えば、10%未満増大する。一実施形態では、十分な濃度のCD40Lの存在下でのCLL患者からの初代細胞上のCD95の発現は、抗体が非存在である対照と比較して、抗体の存在下で20%未満、例えば、10%未満増大する。

更なる実施形態では、多重特異性抗体は、ヒトCD40発現細胞、例えば、CLL患者からの初代細胞をベネトクラクスに感受性にすることができる。抗体によるCLL患者からの初代細胞のベネトクラクスについての感作は、抗体の存在下又は非存在下における様々な濃度のベネトクラクスの存在下での初代細胞生存率を決定することによって評定することができる。そのようなアッセイは、本明細書中の実施例10において説明されるように行うことができる。一実施形態では、100nMのベネトクラクス濃度における特異的細胞死は、本明細書中の実施例10において説明されるようにアッセイした場合、抗体が非存在である対照と比較して、抗体の存在下で少なくとも10%、例えば、少なくとも20%高い。

更なる実施形態では、多重特異性抗体は、例えば、本明細書中の実施例7において説明されるように試験した場合、200nM未満、例えば、100nM未満、例えば、50nM未満、例えば、20nM未満、例えば、5～15nMのKdでCD40⁺ CII細胞に結合する。

更なる実施形態では、多重特異性抗体は、ヒトCD40への結合について、配列番号13で示される配列を有する抗体と競合し(すなわち、競合することができ)、且つ/又はヒトCD40への結合について、配列番号14で示される配列を有する抗体と競合する。

更なる実施形態では、多重特異性抗体は、ヒトCD40上の、配列番号13で示される配列を有する抗体と同じエピトープに結合するか、又はヒトCD40上の、配列番号14で示される配列を有する抗体と同じエピトープに結合する。

更なる実施形態では、第1の抗原結合領域は、
・配列番号1で示されるVH CDR1配列、配列番号2で示されるVH CDR2配列、及び配列番号3で示されるVH CDR3配列、又は
・配列番号4で示されるVH CDR1配列、配列番号5で示されるVH CDR2配列、及び配列番号6で示されるVH CDR3配列
を含む。

一実施形態では、第1の抗原結合領域は、ヒト化されている。別の実施形態では、第1の抗原結合領域は、
・配列番号13で示される配列若しくは配列番号14で示される配列、又は
・配列番号13で示される配列との少なくとも90%、例えば、少なくとも92%、例えば、少なくとも94%、例えば、少なくとも96%、例えば、少なくとも98%の配列同一性を有する配列、若しくは配列番号14で示される配列との少なくとも90%、例えば、少なくとも92%、例えば、少なくとも94%、例えば、少なくとも96%、例えば、少なくとも98%の配列同一性を有する配列
を含むか、又はそれからなる。

上記に説明される通り、本発明の多重特異性抗体は、ヒトVγ9Vδ2-T細胞受容体に結合することができる第2の抗原結合領域を含む。一実施形態では、多重特異性抗体は、ヒトVγ9Vδ2 T細胞を活性化することができる。Vγ9Vδ2 T細胞の活性化は、遺伝子発現及び/若しくは(表面)マーカー発現(例えば、活性化マーカー、例えば、CD25、CD69又はCD107a)並びに/又は分泌タンパク質(例えば、サイトカイン又はケモカイン)プロファイルを通して測定することができる。好ましい実施形態では、多重特異性抗体は、活性化(例えば、CD69及び/又はCD25発現のアップレギュレーション)を誘導することができ、Vγ9Vδ2 T細胞による、CD107a発現における増大によって表される脱顆粒(実施例11を参照されたい)及びサイトカイン産生(例えば、TNFα、IFNγ)をもたらす。好ましくは、本発明の多重特異性抗体は、CD107aについて陽性の細胞数を、少なくとも1.5倍、例えば、少なくとも2倍、例えば、少なくとも5倍増大させることができる。

更なる実施形態では、多重特異性抗体は、慢性リンパ球性白血病患者からのヒトCD40発現細胞の死滅を媒介することができる。慢性リンパ球性白血病患者からのヒトCD40発現細胞の死滅は、例えば、本明細書中の実施例12において説明されるように決定することができる。一実施形態では、本発明の多重特異性抗体は、本明細書中の実施例12で説明されるアッセイにおいて決定すると、10pMの濃度において、25%超、例えば、30%超の特異的細胞死を媒介することができる。更なる実施形態では、多重特異性抗体は、本明細書中の実施例12において説明されるようにアッセイした場合、1～20pM、例えば、5～10pMの50%効果濃度を有する。

更なる実施形態では、多重特異性抗体は、CD40Lで刺激した、慢性リンパ球性白血病患者からのCD40発現細胞の死滅を媒介することができる。CD40Lで刺激した、慢性リンパ球性白血病患者からのCD40発現細胞の死滅は、例えば、本明細書中の実施例15において説明されるように決定することができる。一実施形態では、本発明の多重特異性抗体は、本明細書中の実施例15で説明されるアッセイにおいて決定すると、10nMの濃度において、25%超、例えば、50%超の特異的細胞死を媒介することができる。

更なる実施形態では、多重特異性抗体は、多発性骨髄腫患者からのヒトCD40発現細胞の溶解を媒介することができる。多発性骨髄腫患者からのヒトCD40発現細胞の溶解は、例えば、本明細書中の実施例18において説明されるように決定することができる。一実施形態では、本発明の多重特異性抗体は、本明細書中の実施例18で説明されるアッセイにおいて決定すると、10nMの濃度において、25%超、例えば、40%超の特異的細胞溶解を媒介することができる。

本発明の多重特異性抗体の一実施形態では、多重特異性抗体は、ヒトVδ2に結合することができる。Vδ2は、Vγ9Vδ2-TCRのデルタ鎖である。別の実施形態では、多重特異性抗体は、ヒトVγ9に結合することができる。Vγ9は、Vγ9Vδ2-TCRのガンマ鎖である。Vδ2又はVγ9に結合するいくつかのそのような抗体は、WO2015156673において説明されており、それらの抗原結合領域、少なくともそのCDR配列は、本発明の多重特異性抗体に組み込むことができる。Vγ9Vδ2-TCR結合領域が由来し得る抗体の他の例は、TCR Vγ9抗体7A5(ThermoFisher社)(Obergら (2014) Cancer Res 74:1349)、並びに抗体B1.1(ThermoFisher社)及び5A6.E9(ATCC HB 9772)(両方とも、Neumanら (2016) J Med Prim 45:139において説明されている)である。

一実施形態では、多重特異性抗体は、例えば、本明細書中の実施例7において説明されるように試験した場合、100nM未満、例えば、50nM未満、例えば、20nM未満、例えば、10nM未満、例えば、0.5～2.5nMのKdでVγ9Vδ2⁺ T細胞に結合する。

一実施形態では、多重特異性抗体は、ヒトVδ2への結合について、配列番号17で示される配列を有する抗体と競合するか、又はヒトVδ2への結合について、配列番号18で示される配列を有する抗体と競合する。更なる実施形態では、多重特異性抗体は、ヒトVδ2上の、配列番号17で示される配列を有する抗体と同じエピトープに結合するか、又はヒトVδ2上の、配列番号18で示される配列を有する抗体と同じエピトープに結合する。

本発明の多重特異性抗体の一実施形態では、第2の抗原結合領域は、配列番号7で示されるVH CDR1配列、配列番号8で示されるVH CDR2配列、及び配列番号9で示されるVH CDR3配列を含むか、又は配列番号10で示されるVH CDR1配列、配列番号11で示されるVH CDR2配列、及び配列番号12で示されるVH CDR3配列を含む。

本発明の多重特異性抗体の別の実施形態では、第2の抗原結合領域は、配列番号10で示されるVH CDR1配列、配列番号11で示されるVH CDR2配列、及び配列番号12で示されるVH CDR3配列を含む。

本発明の多重特異性抗体の一実施形態では、第2の抗原結合領域は、ヒト化されている。

更なる実施形態では、第2の抗原結合領域は、
・配列番号17で示される配列、若しくは
・配列番号17で示される配列との少なくとも90%、例えば、少なくとも92%、例えば、少なくとも94%、例えば、少なくとも96%、例えば、少なくとも98%の配列同一性を有する配列、又は
・配列番号25、26、27、28、29、30、31、32、33及び34からなる群から選択される配列
を含むか、又はそれからなる。

本発明の多重特異性抗体の一実施形態では、第1の抗原結合領域は、
・配列番号1で示されるVH CDR1配列、配列番号2で示されるVH CDR2配列、及び配列番号3で示されるVH CDR3配列、又は
・配列番号4で示されるVH CDR1配列、配列番号5で示されるVH CDR2配列、及び配列番号6で示されるVH CDR3配列
を含み、第2の抗原結合領域は、配列番号7で示されるVH CDR1配列、配列番号8で示されるVH CDR2配列、及び配列番号9で示されるVH CDR3配列を含む。

本発明の多重特異性抗体の別の実施形態では、第1の抗原結合領域は、
・配列番号1で示されるVH CDR1配列、配列番号2で示されるVH CDR2配列、及び配列番号3で示されるVH CDR3配列、又は
・配列番号4で示されるVH CDR1配列、配列番号5で示されるVH CDR2配列、及び配列番号6で示されるVH CDR3配列
を含み、第2の抗原結合領域は、配列番号10で示されるVH CDR1配列、配列番号11で示されるVH CDR2配列、及び配列番号12で示されるVH CDR3配列を含む。

上記に説明される通り、更なる主要な態様では、本発明は、ヒトCD40に結合することができる第1の抗原結合領域を含む抗体であって、ヒトCD40への結合について、配列番号13で示される配列を有する抗体と競合し、且つ/又はヒトCD40への結合について、配列番号14で示される配列を有する抗体と競合する、抗体に関する。

一実施形態では、抗体は、ヒトCD40上の、配列番号13で示される配列を有する抗体と同じエピトープに結合するか、又はヒトCD40上の、配列番号14で示される配列を有する抗体と同じエピトープに結合する。

また更なる実施形態では、第1の抗原結合領域は、
・配列番号13で示される配列若しくは配列番号14で示される配列、又は
・配列番号13で示される配列との少なくとも90%、例えば、少なくとも92%、例えば、少なくとも94%、例えば、少なくとも96%、例えば、少なくとも98%の配列同一性を有する配列、若しくは配列番号14で示される配列との少なくとも90%、例えば、少なくとも92%、例えば、少なくとも94%、例えば、少なくとも96%、例えば、少なくとも98%の配列同一性を有する配列
を含むか、又はそれからなる。

更なる実施形態では、第1の抗原結合領域は、シングルドメイン抗体である。別の実施形態では、抗体は、単一特異性抗体、例えば、一価の抗体である。更なる実施形態では、抗体は、ヒトCD40又はVδ2ではない抗原に結合する第2の抗原結合領域を含む。

更なる実施形態では、抗体は、ヒトCD40のアゴニストではない。言及される通り、CD40アゴニズムは、抗体の、CD40発現細胞、例えばCLL患者からの初代細胞上のCD80、CD86及び/又はCD95の発現レベルを増大させる能力を決定することによって試験することができる。そのようなアッセイは、本明細書中の実施例4において説明されるように行うことができる。一実施形態では、CLL患者からの初代細胞上のCD80の発現は、抗体が非存在である対照と比較して、抗体の存在下で10%未満、例えば、5%未満増大する。別の実施形態では、CLL患者からの初代細胞上のCD86の発現は、抗体が非存在である対照と比較して、抗体の存在下で10%未満、例えば、5%未満増大する。更なる実施形態では、CLL患者からの初代細胞上のCD95の発現は、抗体が非存在である対照と比較して、抗体の存在下で10%未満、例えば、5%未満増大する。

更なる実施形態では、抗体は、ヒトCD40のアンタゴニストである。言及される通り、CD40に対するアンタゴニスト効果は、例えば、抗体の、CD40発現細胞、例えば、CLL患者からの初代細胞におけるCD40LによるCD40の活性化を阻害する能力を試験することによって決定することができる。そのようなアッセイは、本明細書中の実施例5において説明されるように行うことができる。一実施形態では、十分な濃度のCD40Lの存在下でのCLL患者からの初代細胞上のCD80の発現は、抗体が非存在である対照と比較して、抗体の存在下で20%未満、例えば、10%未満増大する。一実施形態では、十分な濃度のCD40Lの存在下でのCLL患者からの初代細胞上のCD86の発現は、抗体が非存在である対照と比較して、抗体の存在下で20%未満、例えば、10%未満増大する。一実施形態では、十分な濃度のCD40Lの存在下でのCLL患者からの初代細胞上のCD95の発現は、抗体が非存在である対照と比較して、抗体の存在下で20%未満、例えば、10%未満増大する。

更なる実施形態では、抗体は、ヒトCD40発現細胞、例えば、CLL患者からの初代細胞をベネトクラクスに感受性にすることができる。抗体によるCLL患者からの初代細胞のベネトクラクスについての感作は、抗体の存在下又は非存在下における様々な濃度のベネトクラクスの存在下での初代細胞生存率を決定することによって評定することができる。そのようなアッセイは、本明細書中の実施例10において説明されるように行うことができる。一実施形態では、100nMのベネトクラクス濃度における特異的細胞死は、本明細書中の実施例10において説明されるようにアッセイした場合、抗体が非存在である対照と比較して、抗体の存在下で少なくとも10%、例えば、少なくとも20%高い。

本発明の抗体は、典型的に、組換えで、すなわち、好適な宿主細胞における抗体をコードする核酸構築物の発現、続いて産生された組換え抗体の細胞培養物からの精製によって産生される。核酸構築物は、当該技術分野において周知の標準の分子生物学的技法によって産生することができる。構築物は、典型的に、発現ベクターを使用して宿主細胞に導入される。好適な核酸構築物及び発現ベクターは、当該技術分野において公知である。抗体の組換え発現に好適な宿主細胞は、当該技術分野において周知であり、CHO、HEK-293、Expi293F、PER-C6、NS/0及びSp2/0細胞を含む。

したがって、更なる態様では、本発明は、本発明による抗体、例えば、本発明による多重特異性抗体をコードする核酸構築物に関する。一実施形態では、構築物は、DNA構築物である。別の実施形態では、構築物は、RNA構築物である。

更なる態様では、本発明は、本発明による抗体、例えば、本発明による多重特異性抗体をコードする核酸構築物を含む発現ベクターに関する。

更なる態様では、本発明は、本発明による抗体、例えば、本発明による多重特異性抗体をコードする核酸構築物を含む宿主細胞、又は本発明による抗体、例えば、本発明による多重特異性抗体をコードする核酸構築物を含む発現ベクターに関する。

更なる態様では、本発明は、本発明による抗体、例えば、本発明による多重特異性抗体と薬学的に許容される賦形剤とを含む医薬組成物に関する。

抗体は、従来技法、例えば、(Roweら、Handbook of Pharmaceutical Excipients、2012 6月、ISBN 9780857110275)で開示される技法に従って薬学的に許容される賦形剤と配合され得る。薬学的に許容される賦形剤及び任意の他の担体、希釈剤又は補助剤は、抗体及び選択された投与様式に好適であるべきである。医薬組成物の賦形剤及び他の成分についての好適性は、本発明の選択された抗体又は医薬組成物の所望の生物学的特性に対する有意な負の影響の欠如(例えば、抗原結合に対して実質的な影響よりも少ない(10%又はそれよりも少ない相対的阻害、5%又はそれよりも少ない相対的阻害等))に基づいて決定される。医薬組成物は、希釈剤、充填剤、塩、緩衝液、洗剤(例えば、非イオン性洗剤、例えば、Tween-20又はTween-80)、安定化剤(例えば、糖又はタンパク質非含有アミノ酸)、保存剤、組織固定液、可溶化剤及び/又は医薬組成物への包含に好適な他の材料を含み得る。更なる薬学的に許容される賦形剤には、任意及び全ての好適な溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌及び抗真菌剤、等張剤、抗酸化物質及び吸収遅延剤、並びに本発明の抗体と生理的に適合性であるその他同種類のものが含まれる。

更なる態様では、本発明は、医薬としての使用のための、本明細書中で定義される本発明の抗体、例えば、本明細書中で定義される本発明の多重特異性抗体に関する。

本発明による多重特異性抗体は、Vγ9Vδ2 T細胞による、腫瘍細胞、特に、CD40陽性腫瘍細胞の死滅に有益な微小環境を作出することを可能にする。

したがって、更なる態様では、本発明は、がん、例えば、慢性リンパ球性白血病、多発性骨髄腫、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、濾胞性リンパ腫、頭頸部がん、膵がん、卵巣がん、肺がん、乳がん、結腸がん、前立腺がん、B細胞リンパ腫/白血病、バーキットリンパ腫又はB細胞急性リンパ芽球性白血病の処置における使用のための、本明細書中で定義される本発明の抗体、例えば、本明細書中で定義される本発明の多重特異性抗体に関する。好ましい実施形態では、本発明は、慢性リンパ球性白血病の処置における使用のための、本明細書中で定義される本発明の抗体、例えば、本明細書中で定義される本発明の多重特異性抗体に関する。別の好ましい実施形態では、本発明は、多発性骨髄腫の処置における使用のための、本明細書中で定義される本発明の抗体、例えば、本明細書中で定義される本発明の多重特異性抗体に関する。

別の実施形態では、本発明の抗体は、自己免疫疾患の処置において使用される。

一部の実施形態では、抗体は、単独治療として投与される。しかしながら、また、本発明の抗体は、組合せ治療において投与され、すなわち、処置される疾患又は状態に関連する他の治療剤と組み合わせられ得る。一実施形態では、抗体は、Bcl-2ブロッカー、例えば、ベネトクラクスと組み合わせて使用される。

同様に、更なる態様では、本発明は、本発明による抗体、例えば、本発明の多重特異性抗体の、それを必要とするヒト対象への投与を含む、疾患を処置する方法に関する。一実施形態では、疾患は、がんである。

「処置」又は「処置すること」とは、症状又は疾患状態を緩和する、改善する、抑止する、根絶する(治癒させる)又は予防する目的による、有効量の本発明による抗体の投与を指す。「有効量」とは、必要な投与量において、必要な期間中に、所望の治療結果を達成するのに有効な量を指す。ポリペプチド、例えば、抗体の有効量は、個体の疾患段階、年齢、性別及び体重、並びに抗体の、個体において所望の応答を誘発する能力等の因子によって変動し得る。また、有効量は、抗体の任意の毒性又は有害効果よりも、治療的に有益な効果がまさっている量である。本発明の抗体の有効量についての例示的、非限定的な範囲は、約0.1～100mg/kg、例えば、約0.1～50mg/kg、例えば、約0.1～20mg/kg、例えば、約0.1～10mg/kg、例えば、約0.5、約0.3、約1、約3、約5又は約8mg/kgである。投与は、任意の好適な経路によって行うことができるが、典型的には、非経口、例えば、静脈内、筋内又は皮下である。

(実施例1)
VHHの生成
序文
ヒトCD40に特異的に結合する一価のVHHを生成した。その後、これらのVHHを、二重特異性抗CD40-抗Vγ9Vδ2 TCR VHHを生成するために使用した。

材料及び方法
一価のVγ9Vδ2-TCR特異的VHHの生成
Vγ9Vδ2-T細胞受容体のVδ2鎖に結合するVγ9Vδ2-TCR特異的VHH 5C8(配列番号17)を、以前に生成した(de Bruinら (2016)、Clin Immunol 169:128～138)(WO2015156673)。

一価のCD40特異的VHHの生成
ラマ免疫化
CD40特異的VHHを、以前に説明されるように(de Bruinら (2016)、Clin Immunol 169:128～138、Lamerisら (2016)、Immunology 149(1)111～21)生成した。2頭のラマ(ラマ・グラマ(llama glama))を50*10⁶個のMUTZ-3 DC(例えば、Masterson (2002) Blood 100:701を参照されたい)細胞により1週間の間隔で6回免疫化した。

VHHファージライブラリーの構築
RNAを、最後の免疫化の1週間後に得た末梢血リンパ球から単離し、cDNAに転写し、Ig重鎖コード遺伝子増幅に使用した(Rooversら (2007) Cancer Immunol Immunother 56(3):303～317)。ファージライブラリーを、VHHコード遺伝子の、断片をコードするMycタグ及びHis6タグを含有するファージミドベクターpUR8100へのライゲーション、並びに線維状バクテリオファージ上でのディスプレイのための大腸菌(E. coli)TG1への次なる形質転換により構築した。

CD40特異的VHHの富化及び選択
CD40特異的VHHをディスプレイするファージについて富化するために、多選択ラウンドを行った。プレートを、IgG1-Fcタグ付けしたヒトCD40(71174、BPS Bioscience社、San Diego、CA、米国)でコーティングした。ファージを、1%ウシ血清アルブミン、1%乳汁、0.05%Tween 20及びヒトIgG(0.625mg/mL)を含有するPBSによりブロックし、その後、CD40でコーティングしたプレートに結合させた。溶離したファージを使用して、指数関数的に増殖している大腸菌TG1に感染させた。

2回のそのようなラウンド後、ELISAベースのスクリーニングを行って、ヒトIgへの結合ではなく、ヒトCD40への結合について選択した。この目的のために、プレートを、IgG1-Fcタグ付けしたヒトCD40又はヒトIgのいずれかでコーティングし、形質転換したTG1からの周辺質の抽出物とインキュベートした。結合した抽出物を、マウス由来の抗Mycタグ抗体(05-274、Merck社、Kenilworth、NJ、米国)及びHRPをコンジュゲートしたウサギ由来抗マウスIgG抗体との逐次的インキュベーションにより検出した。選択されたクローンのDNA配列解析は、3つの異なるCD40特異的VHH配列を実証した。コードされるアミノ酸配列は、本明細書中の配列表で示される。配列番号13は、V19 VHH配列を示し、配列番号14は、V15 VHH配列を示し、配列番号35は、V12 VHH配列を示す。

VHH産生及び精製
3つの選択された一価のVHH並びにMycタグ及びHis6タグをコードする遺伝子セグメントを、pcDNA5ベクターに再クローニングし、これを使用して、HEK293T細胞にトランスフェクトした。VHHタンパク質を、高速タンパク質液体クロマトグラフィーを使用する逐次的サイズ排除、NiベースのHisタグ選択及びイミダゾールベースの溶出によりHEK293T上清から精製した。3つの異なるVHHタンパク質を、V19t(配列番号15)、V15t(配列番号16)及びV12t(配列番号36)と呼び、ここで、「t」は、VHHがC末端Mycタグ及びHis6タグを含有することを示す。VHH完全性及び純度を、SDS-PAGEゲルにおけるクーマシーブルー染色及び抗Mycタグ抗体を使用するウェスタンブロッティングにより確認した。VHHを、Nanodrop分光光度計を使用して定量した。

二重特異性構築物の生成
二重特異性VHH構築物V19-5C8t(配列番号19)、V15-5C8t(配列番号20)及びV12-5C8t(配列番号37)を生成するために、抗Vδ2-TCR-VHH(C末端)(配列番号17)を、Gly₄Serリンカー(配列番号21)を伴って抗CD40-VHH(N末端)に接合した。Mycタグ及びHis6タグを含有する二重特異性VHHを、上記に説明されるようにHEK293Tトランスフェクションによって産生した。VHHタンパク質を、Talon樹脂上の固定イオン親和性クロマトグラフィー(635503、Clontech社、Mountain View、CA、米国)、続いてイミダゾールベースの溶出を使用して上清から精製した。

V19S76K-5C8の生成
V19t VHHのフレームワーク領域3における推定上の糖鎖付加部位を特定し、その後、関連するセリン(76位)がリジンに変更された新しいVHH(V19S76Kt)(配列番号22)を産生及び精製した。

二重特異性V19S76K-5C8t VHHを、上記に説明されるように構築した。TagのないV19S76K(配列番号23)を、UPE社(Utrecht、オランダ)により上記に説明されるように生成した。

(実施例2)
一価のVHHは、CD40をトランスフェクトした細胞に結合する
序文
一価の抗CD40 VHHの、CD40発現細胞に特異的に結合する能力を試験した。

材料及び方法
細胞株
野生型(WT:wildtype)又はヒトCD40をトランスフェクトした胚腎臓細胞株HEK293Tを、10%ウシ胎児血清(F7524、Merck社、Kenilworth、NJ、米国)、200mM L-グルタミン(25030-123、Thermo Fisher Scientific社)、0.05mMβ-メルカプトエタノール(M6250、Merck社)及び10,000U/mLペニシリン/ストレプトマイシン(15140-122、Thermo Fisher Scientific社)を補充したダルベッコ変法イーグル培地(41965-039、Thermo Fisher Scientific社、Waltham、MA、米国)(以下、完全DMEMと呼ぶ)中で増殖させた。

VHH結合
CD40をトランスフェクトした細胞上のCD40発現を、PEをコンジュゲートした抗CD40抗体(IM1936U、Beckman Coulter社、Brea、CA、米国)との4℃で20分間のインキュベーションにより確認した。VHH結合を評定するために、細胞を、100nM V15t、100nM V19t又は媒体対照と37℃で30分間インキュベートした。結合したVHHを、マウス抗Mycタグ抗体(05-274、Merck社)及びAF488をコンジュゲートしたヤギ抗マウス抗体(A-11001、Thermo Fisher Scientific社)との4℃で20分間の逐次的インキュベーションにより検出した。

フローサイトメトリー
試料を、FACSCantoサイトメーター(BD Biosciences社、Franklin Lakes、NJ、米国)で測定し、Flowjo MacV10により解析した。

結果
WT及びCD40をトランスフェクトしたHEK293T細胞を使用して、一価の抗CD40 VHHの結合を試験した。CD40発現を、CD40をトランスフェクトした細胞について確認した(図1A)。V19t、V15t及びV12tは、Mycタグの検出によって実証されるように、CD40発現細胞に結合した(図1B)。対照的に、抗CD40 VHHは、CD40陰性WT HEK293T細胞に結合しなかった。

更に、V19tにおける糖鎖付加部位の突然変異(S76K突然変異)は、CD40への結合能を損なわなかった(Table 1(表2)を参照されたい)。

Table 1(表2):V19tにおける糖鎖付加部位の突然変異は、CD40への結合能を損なわない。CD40をトランスフェクトしたHEK293T細胞を、示される濃度のV19t又はV19S76Ktとインキュベートし、続いて、Mycタグを、フローサイトメトリーによって検出した。2回の実験で得た蛍光強度の平均幾何平均値を示す。

結論
抗CD40 VHH V19t及びV15tは、細胞表面で発現したCD40に特異的に結合し、V19tの結合親和性は、V19S76Ktにおいて保持された。

(実施例3)
一価のVHHは、初代CLL細胞に結合する
序文
初代慢性リンパ球性白血病(CLL)細胞は、細胞表面上でCD40を発現する。したがって、抗CD40 VHHの初代CLL細胞への結合を試験した。

材料及び方法
患者材料
末梢血(PB:peripheral blood)単核球(PBMC:peripheral blood mononuclear cell、≧95% CD5⁺CD19⁺)を、以前に説明されるように(Hallaertら (2008)、Blood 112(13):5141～9)、非処置CLL患者からのPB試料から単離し、凍結保存した。研究は、アムステルダムUMCの医学倫理委員会によって承認された。全ての対象からの書面のインフォームドコンセントを得た。解凍した細胞を、10%ウシ胎児血清(F7524、Merck社)、200mM L-グルタミン(25030-123、Thermo Fisher Scientific社)、0.05mMβ-メルカプトエタノール(M6250、Merck社)及び10.000U/mLペニシリン/ストレプトマイシン(15140-122、Thermo Fisher Scientific社)を補充したイスコフ変法ダルベッコ培地(IMDM:Iscove's Modified Dulbecco's Medium;12440-053、Thermo Fisher Scientific社)(以下、完全IMDMと呼ぶ)中で維持した。

VHH結合及びフローサイトメトリー
初代CLL細胞上のCD40発現を確認し、VHH結合を実施例2で説明されるように試験した。

結果
初代CLL細胞は、CD40を均一に発現した(図2A)。抗CD40 VHHは、試験した全ての試料において初代CLL細胞に明らかに結合したが、V15t及びV19tは、V12tよりも高い結合強度を有した(図2B)。

結論
抗CD40 VHHは、初代CLL細胞に結合する。

(実施例4)
一価のVHHは、CD40アゴニストではない
序文
CD40の、その同族リガンドCD40Lへの結合は、様々な生物学的応答を引き起こし得る。初代CLL細胞においてCD40刺激により誘導された効果は、細胞増殖、並びに共刺激性分子(すなわち、CD86)及びFas受容体(CD95)の発現の増大を含む。抗CD40 VHHの、CD40刺激を誘導する能力を、初代CLL細胞において試験した。

材料及び方法
患者材料
非処置CLL患者からのPBMC(≧90% CD5⁺CD19⁺)を、実施例3で説明されるように得、凍結保存した。解凍した細胞を、完全IMDM中で維持した。

アゴニスト活性
VHHのCD40への結合がアゴニスト効果を有するかどうかを評定するために、初代CLL PBMCをVHH、媒体対照又は組換え多量体CD40リガンド(rmCD40L;100ng/mL、Bioconnect社)の存在下で48時間培養した。

フローサイトメトリー
48時間後、細胞を回収し、洗浄し、AF700をコンジュゲートした抗CD19抗体(557921)、FITCをコンジュゲートした抗CD80抗体(6109965)、APCをコンジュゲートした抗CD86抗体(555660、全てBD Biosciences社)、PEをコンジュゲートした抗CD5抗体(12-0059-42、Thermo Fisher Scientific社)及びPECy7をコンジュゲートした抗CD95抗体(305621、Biolegend社、San Diego、CA、米国)と、4℃で20分間インキュベートした。或いは、48時間後、細胞を回収し、生存率をMitotracker Orange(37℃で25分間のインキュベーション)及びTo-pro-3(室温で10分間のインキュベーション;両方ともThermo Fisher Scientific社)を使用して測定した。試料を、FACSCantoサイトメーター(BD Biosciences社)で測定し、Flowjo MacV10により解析した。

結果
rmCD40Lは、生存率並びにCD86及びCD95の発現における増大によって実証される通り、CD40刺激を有効に誘導した(図3A～図3C)。他方で、抗CD40 VHH V19t、V15t及びV12tは、試験した様々な濃度においてこれらの効果のいずれも誘導しなかった。

結論
一価の抗CD40 VHHは、CD40のアゴニストではない。

(実施例5)
一価のVHHは、CD40刺激と拮抗する
序文
CD40L結合は、CD40刺激を誘導し得る。CD40L及び抗CD40 VHHの両方は、CD40に結合し得るので、抗CD40 VHHがCD40Lで誘導されたCD40刺激を妨げ得るかどうかを試験した。

材料及び方法
患者材料
非処置CLL患者からのPBMC(≧90% CD5⁺CD19⁺)を、実施例2で説明されるように得、凍結保存した。解凍した細胞を、完全IMDM中で維持した。

アンタゴニスト活性
VHHがCD40刺激と拮抗するかどうかを試験するために、初代CLL PBMCをVHH又は媒体対照と37℃で30分間プレインキュベートし、続いて、rmCD40L(100ng/mL)の存在下で48時間培養した。

フローサイトメトリー
48時間後、細胞を、実施例4で説明されるように、フローサイトメトリーによって解析した。

結果
rmCD40Lは、生存率並びにCD86及びCD95の発現における増大によって実証される通り、CD40刺激を有効に誘導した(図4A～図4C)。V15t又はV19tのいずれかとのプレインキュベーションは、用量依存的様式でCD40刺激を妨げた。しかしながら、V12tは、CD40Lで誘導した効果を遮断しなかった。

結論
一価の抗CD40 VHH V15t及びV19tは、CD40刺激と拮抗する。

(実施例6)
二重特異性VHH抗体は、CD40をトランスフェクトした細胞に結合する
序文
二重特異性抗CD40-抗Vγ9Vδ2-TCR VHH構築物V19S76K-5C8の、CD40発現細胞に特異的に結合する能力を試験した。

材料及び方法
VHH生成
二重特異性抗CD40-抗Vγ9Vδ2-TCR VHH V19S76K-5C8を、実施例1で説明されるように生成した。

細胞株
野生型(WT)又はヒトCD40をトランスフェクトした胚腎臓細胞株HEK293Tを、完全DMEM中で増殖させた。

VHH結合
VHH結合を評定するために、細胞を、V19S76K-5C8(1μM)又は媒体対照と37℃で30分間インキュベートした。結合したVHHを、FITCをコンジュゲートしたヤギ抗ラマIgG重鎖及び軽鎖抗体(A160-100F、Bethyl Laboratories Inc.社、Montgomery、TX、米国)との4℃で20分間のインキュベーションにより検出した。

フローサイトメトリー
48時間後、細胞を、実施例2で説明されるように、フローサイトメトリーによって解析した。

結果
V19S76K-5C8は、CD40発現HEK293T細胞に結合するが、CD40陰性WT HEK293T細胞には結合しない(図5)。

結論
二重特異性抗CD40-抗Vγ9Vδ2 TCR VHH V19S76K-5C8は、細胞表面に発現したCD40に特異的に結合する。

(実施例7)
二重特異性VHH抗体は、CD40⁺及びVγ9Vδ2⁺細胞に結合する
序文
二重特異性抗CD40-抗Vγ9Vδ2 TCR VHH V19S76K-5C8の、CD40⁺及びVγ9Vδ2⁺細胞に結合する能力を試験した。

材料及び方法
細胞株
CLL由来細胞株CIIを、完全IMDM中で増殖させた。精製したVγ9Vδ2-T細胞株を、以前に説明されるように(de Bruinら (2017)、Oncoimmunology 7(1):e1375641)生成した。簡潔に説明すると、Vδ2⁺-T細胞を、抗マウスIgGマイクロビーズ(Miltenyi Biotec社、Bergisch Gladbach、ドイツ)と組み合わせた、FITCをコンジュゲートした抗Vδ2 TCR(2257030、Sony社、San Jose、CA)を使用して健康なドナー(HD:healthy donor)PBMCから単離し、2人のHDからのPBMC、JY細胞、IL-7(10U/mL)、IL-15(10ng/mL、R&D Systems社)及びフィトヘマグルチニン(PHA:phytohaemagglutinin;R30852801、Thermo Fisher Scientific社)からなる照射済みフィーダーミックスを毎週伴って培養した。Vγ9Vδ2-T細胞株の純度を、90%超で維持した。

VHH結合
VHH結合を、実施例6で説明されるように試験した。

結果
V19S76K-5C8は、1.2nMの見かけのKdによりVγ9Vδ2⁺細胞に結合する(図6A及び図6B)。同様に、V19S76K-5C8は、フローサイトメトリーによって決定すると、10.9nMの見かけのKdによりCD40⁺ CII細胞に結合する(図6C及び図6D)。

結論
二重特異性抗CD40-抗Vγ9Vδ2 TCR VHH V19S76K-5C8は、CD40⁺細胞及びVγ9Vδ2⁺細胞の両方に結合する。

(実施例8)
二重特異性VHH抗体は、CD40アゴニストではない
序文
一価の抗CD40 VHH V19tは、CD40刺激を誘導しない。V19を二重特異性VHH V19S76K-5C8に組み込んだ場合も、CD40刺激が起こらないかどうかを、初代CLL細胞を使用して試験した。

材料及び方法
患者材料、アゴニスト活性及びフローサイトメトリー
VHHの結合がアゴニスト効果を有するかどうかを評定するために、初代CLL PBMCを、示される濃度のV19S76K-5C8、媒体対照又はrmCD40Lを伴って48時間培養し、実施例4で説明されるようにフローサイトメトリーによって解析した。

結果
rmCD40Lは、CD80、CD86及びCD95の発現における増大によって実証されるように、CD40刺激を有効に誘導した(図7A～図7C)。対照的に、試験したV19S76K-5C8濃度のいずれも、CD80、CD86又はCD95の発現を増大させなかった。

結論
二重特異性抗CD40-抗Vγ9Vδ2 TCR VHH V19S76K-5C8は、CD40のアゴニストではない。

(実施例9)
二重特異性VHH抗体は、CD40刺激に拮抗する
序文
一価の抗CD40 VHH V19tは、CD40Lで誘導されたCD40刺激によって誘導された効果を妨げる。CD40アンタゴニスト活性が二重特異性V19S76K-5C8形式で保持されるかどうかを、初代CLL細胞を使用して試験した。

材料及び方法
患者材料、アンタゴニスト活性及びフローサイトメトリー
VHHの結合がアンタゴニスト効果を有するかどうかを評定するために、初代CLL PBMCを、V19S76K-5C8又は媒体対照とプレインキュベートし、その後、rmCD40Lを伴って48時間培養し、実施例5で説明されるようにフローサイトメトリーによって解析した。

結果
rmCD40Lは、CD80、CD86及びCD95のより高い発現をもたらし、これはCD40刺激を示した(図8A～図8C)。V19S76K-5C8とのプレインキュベーションは、用量依存的様式でCD40刺激の効果を妨げた。

結論
二重特異性抗CD40-抗Vγ9Vδ2 TCR VHH V19S76K-5C8は、アンタゴニストCD40活性を保持する。

(実施例10)
二重特異性VHH抗体は、初代CLL細胞をベネトクラクスに感受性にする
序文
CD40刺激は、初代CLL細胞の、抗アポトーシスタンパク質Bcl-2の阻害剤であるベネトクラクス(ABT-199)への抵抗性をもたらす(Thijssenら (2015)、Haematologica 100(8):e302～6)。これは、おそらく、抗アポトーシスタンパク質Bcl-xLのアップレギュレーションによってもたらされる。V19S76K-5C8は、CD40刺激に拮抗するので、V19S76K-5C8の、CD40で誘導されたベネトクラクス抵抗性を元に戻す能力を試験した。

材料及び方法
患者材料、アンタゴニスト活性及びベネトクラクス感受性
初代CLL PBMCを、V19S76K-5C8(1000nM)又は媒体対照とプレインキュベートし、その後、rmCD40Lを伴って48時間培養し、実施例8で説明されるようにフローサイトメトリーによって解析した。Cytofix/Cytoperm試薬(554722、BD Biosciences社)を、細胞内Bcl-xLの検出のために使用した(13835S、Cell Signaling社、Danvers、MA、米国)。48時間後、細胞を、示される濃度のベネトクラクス(Bioconnect社、Huissen、オランダ)を伴って24時間培養した。

生存率測定及びフローサイトメトリー
生存率を、実施例4で説明されるように測定した。細胞を、実施例2で説明されるようにフローサイトメトリーによって解析した。

結果
ベネトクラクスは、刺激していない初代CLL細胞において用量依存的様式で細胞死を誘導した(図9A)。rmCD40Lにより刺激した初代CLL細胞は、ベネトクラクスに、より感受性が低かった。しかしながら、rmCD40Lに加えてV19S76K-5C8を伴って培養した細胞は、刺激していないCLL細胞と同じくらいベネトクラクスに感受性であった。このことは、rmCD40L刺激に際して増大するが、rmCD40Lに先行してV19S76K-5C8インキュベーションが行われた場合、非刺激レベルに戻るBcl-xL発現と相関した(図9B)。

結論
二重特異性抗CD40-抗Vγ9Vδ2 TCR VHH V19S76K-5C8は、初代CLL細胞をベネトクラクスに感受性にする。

(実施例11)
二重特異性VHH抗体はVγ9Vδ2-T細胞を活性化する
序文
二重特異性抗CD40-抗Vγ9Vδ2 TCR VHH V19S76K-5C8は、標的細胞上のCD40及びVγ9Vδ2-T細胞受容体の両方に結合し得る。V19S76K-5C8の、CD40⁺細胞の存在下でVγ9Vδ2-T細胞を活性化する能力を試験した。

材料及び方法
細胞株
CD40⁺ CII細胞及びVγ9Vδ2-T細胞を、実施例7で説明されるように増殖させた。

サイトカイン及び脱顆粒アッセイ
Vγ9Vδ2-T細胞株を、V19S76K-5C8又は媒体対照と37℃で30分間インキュベートした。続いて、Vγ9Vδ2-T細胞を、CII細胞と1:1の比で、ブレフェルジンA(10μg/mL;B7651、Merck社)、GolgiStop(554724)及びPECy7をコンジュゲートした抗CD107a(561348、両方ともBD Biosciences社)の存在下で4時間共培養した。その後、細胞を洗浄し、表面染色を、固定可能生存率染料(Fixable Viability Dye)eFluor506(65-0866-14)、AF700をコンジュゲートした抗CD3抗体(56-0038-82、両方ともThermo Fisher Scientific社)及びFITCをコンジュゲートした抗Vγ9-TCR抗体(IM1463、Beckman Coulter社)により行った。Cytofix/Cytoperm試薬(554722)を、BUV395をコンジュゲートした抗IFN-γ(563563)、BV650をコンジュゲートした抗TNF-α(563418、全てBD Biosciences社)及びPE/Dazzle594をコンジュゲートした抗IL-2(500343、Biolegend社)による細胞内サイトカインの検出のために使用した。

フローサイトメトリー
試料を、LSRFortessaサイトメーター(BD Biosciences社)で測定し、Flowjo MacV10により解析した。

結果
Vγ9Vδ2-T細胞は、単独で、又はCII細胞と培養した場合、ほとんど脱顆粒しなかった(図10A)。しかしながら、V19S76K-5C8及びCD40⁺ CII細胞の両方が、存在する場合、Vγ9Vδ2-T細胞の大多数が脱顆粒した。V19S76K-5C8は、CD40⁺ CII細胞が存在しない場合、このレベルの脱顆粒を誘導しなかった。同様のパターンは、IFN-γ、TNF-α及びIL-2産生について観察された(図10B～図10D)。

結論
二重特異性抗CD40-抗Vγ9Vδ2 TCR VHH V19S76K-5C8は、CD40⁺細胞の存在下でVγ9Vδ2-T細胞を活性化する。

(実施例12)
二重特異性VHH抗体は、CD40⁺細胞への細胞傷害性を向上させる
序文
二重特異性抗CD40-抗Vγ9Vδ2 TCR VHH V15-5C8t及びV19-5C8は、CD40及びVγ9Vδ2-T細胞の両方に結合する。二重特異性VHHが、CD40⁺標的細胞への細胞傷害性も誘導するかどうかを試験した。

材料及び方法
VHH生成
二重特異性V15-5C8t及びV19S76K-5C8 VHHを、実施例1で説明されるように生成した。

細胞株
CD40⁺ CII細胞及びVγ9Vδ2-T細胞を、実施例7で説明されるように増殖させた。

細胞傷害性アッセイ
CII標的細胞を、カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル(CFSE:carboxyfluorescein succinimidyl ester;C1157、Thermo Fisher Scientific社)で標識し、VHH又は媒体対照と37℃で30分間インキュベートした。その後、標的細胞を、Vγ9Vδ2-T細胞株と1:1の比で一晩共培養した。

生存率測定及びフローサイトメトリー
生存率を、実施例4で説明されるように測定した。

結果
Vγ9Vδ2-T細胞は、少量のCII標的細胞のみを溶解した(図11A)。CII標的細胞の溶解は、V19S76K-5C8が添加された場合、用量依存的様式で顕著に増大した。同様の結果は、V15-5C8t及びV12-5C8tで得られたが、V12-5C8tは、あまり強くなかった(データは示していない)。V19S76K-5C8の50%効果濃度は、9.1pMであった(図11B)。

結論
二重特異性抗CD40-抗Vγ9Vδ2 TCR VHHは、CD40⁺細胞への細胞傷害性を向上させる。

(実施例13)
二重特異性VHH細胞傷害性はCD40特異的である
序文
二重特異性抗CD40-抗Vγ9Vδ2 TCR VHH V19S76K-5C8は、CD40⁺標的細胞への細胞傷害性を増大させる。向上した細胞傷害性のCD40への特異性を試験した。

材料及び方法
細胞株
野生型(WT)又はヒトCD40をトランスフェクトしたHEK293T細胞を、実施例2で説明されるように増殖させた。Vγ9Vδ2-T細胞を、実施例7で説明されるように増殖させた。

細胞傷害性アッセイ
細胞傷害性実験、生存率測定及びフローサイトメトリーを、実施例12で説明されるように行った。

結果
Vγ9Vδ2-T細胞は、WT及びCD40をトランスフェクトしたHEK293T細胞の両方の約20%を溶解した(図12)。V19S76K-5C8の添加は、CD40をトランスフェクトしたHEK293T細胞の溶解を強く向上させたが、CD40陰性WT HEK293T細胞の溶解は向上させなかった。V19S76K-5C8は、Vγ9Vδ2-T細胞なしでは、WT又はCD40をトランスフェクトしたHEK293T細胞のいずれかの溶解を誘導しなかった。

結論
二重特異性抗CD40-抗Vγ9Vδ2 TCR VHH V19S76K-5C8は、CD40特異的様式で細胞傷害性を向上させる。

(実施例14)
二重特異性VHH抗体は、初代CLL細胞に対する細胞傷害性を向上させる
序文
二重特異性抗CD40-抗Vγ9Vδ2 TCR VHH V15-5C8t、V19-5C8t及びV12-5C8tは、CD40⁺標的細胞の細胞傷害性を向上させ、ここで、初代CLL細胞への細胞傷害性に対する効果を評定した。

材料及び方法
患者材料及び細胞株
初代CLL細胞を、実施例3で説明されるように得、凍結保存し、解凍した。Vγ9Vδ2-T細胞を、実施例7で説明されるように増殖させた。

結果
Vγ9Vδ2-T細胞は、少量の初代CLL細胞を溶解し(図13)、それは、V12-5C8t(100nM;45.3%±4.0)によって、並びに特に、V15-5C8t(70.5%±7.3)及びV19-5C8t(68.5%±7.9)によって明らかに向上した。

結論
二重特異性抗CD40-抗Vγ9Vδ2 TCR VHHは、初代CLL細胞への細胞傷害性を向上させる。

(実施例15)
二重特異性VHH抗体はCD40で刺激したCLL細胞に対して有効である
序文
二重特異性抗CD40-抗Vγ9Vδ2 TCR VHH V19S76K-5C8は、初代CLL細胞への細胞傷害性を増大させる。CD40刺激は、初代CLL細胞の、様々な薬物、例えば、ベネトクラクス(ABT-199;Thijssenら (2015)、Haematologica 100(8):e302～6)への抵抗性を増大させる。したがって、CD40で刺激した初代CLL細胞の、V19S76K-5C8で誘導した細胞傷害性への感受性を評定した。

材料及び方法
患者材料及び細胞株
初代CLL細胞を、実施例3で説明されるように得、凍結保存し、解凍した。WT 3T3線維芽細胞又はヒトCD40Lをトランスフェクトした3T3線維芽細胞(3T40L)を、完全IMDM中で増殖させた。Vγ9Vδ2-T細胞を、実施例7で説明されるように増殖させた。

CD40刺激
初代CLL細胞を、照射した3T3又は3T40L線維芽細胞上で72時間培養して、CD40刺激を誘導した。

細胞傷害性アッセイ
その後、細胞を回収し、実施例10で説明されるようにベネトクラクス(10nM)を伴って、又は実施例12で説明されるようにVγ9Vδ2-T細胞及びV19S76K-5C8と一晩培養した。生存率測定及びフローサイトメトリーを、実施例10で説明されるように行った。

結果
ベネトクラクスは、刺激していないCLL細胞の大多数において細胞死を誘導したが、3T40Lで誘導したCD40刺激は、CLL細胞のベネトクラクスへの抵抗性を増大させた(図14)。対照的に、V19S76K-5C8は、刺激していないCLL細胞及びCD40で刺激したCLL細胞において同程度まで細胞傷害性を誘導した。

結論
二重特異性抗CD40-抗Vγ9Vδ2 TCR VHH V19S76K-5C8は、CD40で刺激したCLL細胞に対して有効である。

(実施例16)
二重特異性VHH抗体は、CLL患者からの自家Vγ9Vδ2-T細胞を活性化する
序文
二重特異性抗CD40-抗Vγ9Vδ2 TCR VHH V19S76K-5C8は、CD40⁺細胞が存在する場合、Vγ9Vδ2-T細胞株を活性化する。V19S76K-5C8の、CLL患者自身のCLL細胞の存在下で患者からのVγ9Vδ2-Tを活性化する能力を試験した。

材料及び方法
患者材料
CLL患者からのPBMCを、実施例3で説明されるように得、凍結保存し、解凍した。

サイトカイン及び脱顆粒アッセイ
CLL PBMCから、磁気ビーズを使用してCD19⁺ CLL細胞を部分的に枯渇させた(130-050-301、Miltenyi Biotec社。CD19枯渇後、PBMCのうちの±50%がCD19⁺であった)。その後、PBMCを、V19S76K-5C8(10nM)又は媒体対照を伴って、ブレフェルジンA、GolgiStop及び抗CD107aの存在下で一晩培養して、実施例11で説明されるようにサイトカイン産生及び脱顆粒を測定した。実施例11とは対照的に、表面染色は、PEをコンジュゲートした抗Vγ9-TCR(2256535、Sony社)、並びにFITCをコンジュゲートしたヤギ抗ラマIgG-重鎖及び軽鎖抗体(A160-100F、Bethyl Laboratories Inc.社)を含んだ。

結果
CLL患者からのVγ9Vδ2-T細胞は、V19S76K-5C8を伴う培養後に、サイトカインIFN-γ(図15A)、TNF-α(図15B)及びIL-2(図15C)を産生した。同様に、V19S76K-5C8は、CD107a発現によって測定すると、Vγ9Vδ2-T細胞脱顆粒を誘導した(図15D)。

結論
二重特異性抗CD40-抗Vγ9Vδ2 TCR VHH V19S76K-5C8は、CLL患者からの自家Vγ9Vδ2-T細胞を活性化する。

(実施例17)
二重特異性VHH抗体は、自家Vγ9Vδ2-T細胞によってCLL細胞の細胞傷害性を誘導する
序文
二重特異性抗CD40-抗Vγ9Vδ2 TCR VHH V19S76K-5C8は、CLL患者からの自家Vγ9Vδ2-T細胞を活性化する。これが、自家CLL細胞の溶解も引き起こすかどうかを決定した。

細胞傷害性アッセイ
CD3⁺細胞を、磁気ビーズを使用してCLL PBMCから単離して(純度≧93%;130-050-101、Miltenyi Biotec社)、同時にVγ9Vδ2-T細胞について富化した。CD19⁺ CLL細胞を、磁気ビーズを使用して同じ試料から単離した(純度≧93%;130-050-301、Miltenyi Biotec社)。CD3⁺細胞を、CD19⁺ CLL細胞と10:1の比で、V19S76K-5C8(10nM)又は媒体対照を伴って一晩培養した。

フローサイトメトリー
試料を、固定可能生存率染料eF780(65-0865-14)、PerCPeF710をコンジュゲートした抗CD3抗体、PEをコンジュゲートした抗CD5抗体(12-0059-42、全てThermo Fisher Scientific社)及びFITCをコンジュゲートした抗CD20抗体(A07772、Beckman Coulter社)とインキュベートした。その後、生存CLL細胞を、FACSCantoサイトメーター(BD Biosciences社)で計数ビーズ(01-1234-42、Thermo Fisher Scientific社)を使用して定量した。

結果
V19S76K-5C8を伴う培養後、生存していたCLL細胞は、媒体対照を伴う培養よりもより少なく(図16)、V19S76K-5C8が誘導したCLL細胞の溶解を示した。

結論
二重特異性抗CD40-抗Vγ9Vδ2 TCR VHH V19S76K-5C8は、自家Vγ9Vδ2-T細胞によってCLL細胞の細胞傷害性を誘導する。

(実施例18)
二重特異性VHHは初代多発性骨髄腫に対して活性である
CD40は、初代多発性骨髄腫(MM)細胞上でも発現し(Pellat-Deceunynckら (1994) Blood 84:2597)(図17A)、CD40刺激は、MM細胞の増殖を含む様々な生物学的効果を発揮するので、私たちは、MM患者からの初代骨髄試料におけるV19S76K-5C8の有効性を評定した。二重特異性VHHの存在下で一晩培養した場合、健康なドナー由来のVγ9Vδ2-T細胞は、初代MM細胞を溶解した(図17B)。

更に、V19S76K-5C8を伴う培養に際して、これらの患者の骨髄に存在するVγ9Vδ2-T細胞は誘発されて、炎症促進性サイトカインIFN-γ及びTNF-αを産生した(図17C)。同様に、MM患者からの骨髄単核細胞に存在するVγ9Vδ2-T細胞は、二重特異性VHH V19S76K-5C8を伴う培養後に脱顆粒した(図17D)。

合わせると、これらの結果は、V19S76K-5C8は、初代MMに対して活性であり、自家骨髄由来Vγ9Vδ2-T細胞を活性化することができることを示す。

(実施例19)
二重特異性VHHは、異種移植片モデルにおいて腫瘍成長を妨げる
二重特異性VHHの、in vivoでの腫瘍増殖に対する効果を研究するために、免疫不全NSGマウスに、ヒト多発性骨髄腫細胞株であるMM.1sの細胞を注入した。腫瘍細胞を成長させ、1週間生着させ、その後、マウスは、ヒトVγ9Vδ2-T細胞又はPBSのいずれかの3回の毎週のi.v.注射の第1回目、続いてV19S76K-5C8又はPBSの毎週2回のi.p.注射を受容した(図18A)。V19S76K-5C8単独も、Vγ9Vδ2-T細胞単独も、全生存期間を有意に改善しなかった。対照的に、V19S76K-5C8及びVγ9Vδ2-T細胞の両方で処置したマウスは、有意に長く生存し、対照群の47日に対して80日の全生存期間中央値であった(図18B)。

殺した際に、CD40発現は、対照マウスの骨髄よりも、V19S76K-5C8及びVγ9Vδ2-T細胞の両方で処置したマウスの骨髄において悪性細胞上で有意に低かった(図18C)。同様の傾向は、巨視的に特定された形質細胞腫における悪性血漿細胞について観察された(図18D)。

V19S76K-5C8及びVγ9Vδ2-T細胞の両方で処置したマウスは、7週間の処置後にそれらの初期体重を保持していた(図18E)。

結論として、二重特異性VHHは、MM in vivoモデルにおいてVγ9Vδ2-T細胞依存的様式で生存を改善する。

Claims

ヒトCD40に結合することができる第1の抗原結合領域とヒトVγ9Vδ2 T細胞受容体に結合することができる第2の抗原結合領域とを含む多重特異性抗体。
二重特異性抗体である、請求項1に記載の多重特異性抗体。
前記第1の抗原結合領域が、シングルドメイン抗体である、請求項1又は2に記載の多重特異性抗体。
前記第2の抗原結合領域が、シングルドメイン抗体である、請求項1から3のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。
前記第1の抗原結合領域及び第2の抗原結合領域が、ペプチドリンカーを介して共有結合している、請求項1から4のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。
前記ペプチドリンカーが、配列番号21で示される配列を含むか、又はそれからなる、請求項5に記載の多重特異性抗体。
前記第1の抗原結合領域が、前記第2の抗原結合領域のN末端に位置する、請求項1から6のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。
CD40に一価で結合し、ヒトVγ9Vδ2 T細胞受容体に一価で結合する、請求項1から7のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。
ヒトCD40のアゴニストではない、請求項1から8のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。
ヒトCD40のアンタゴニストである、請求項1から9のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。
ヒトCD40発現細胞をベネトクラクスに感受性にすることができる、請求項1から10のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。
ヒトCD40への結合について、配列番号13で示される配列を有する抗体と競合し、且つ/又はヒトCD40への結合について、配列番号14で示される配列を有する抗体と競合する、請求項1から11のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。
ヒトCD40上の、配列番号13で示される配列を有する抗体と同じエピトープに結合するか、又はヒトCD40上の、配列番号14で示される配列を有する抗体と同じエピトープに結合する、請求項1から12のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。
前記第1の抗原結合領域が、
・配列番号1で示されるVH CDR1配列、配列番号2で示されるVH CDR2配列、及び配列番号3で示されるVH CDR3配列、又は
・配列番号4で示されるVH CDR1配列、配列番号5で示されるVH CDR2配列、及び配列番号6で示されるVH CDR3配列
を含む、請求項1から13のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。
前記第1の抗原結合領域が、ヒト化されている、請求項1から14のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。
前記第1の抗原結合領域が、
・配列番号13で示される配列若しくは配列番号14で示される配列、又は
・配列番号13で示される配列との少なくとも90%、例えば、少なくとも92%、例えば、少なくとも94%、例えば、少なくとも96%、例えば、少なくとも98%の配列同一性を有する配列、若しくは配列番号14で示される配列との少なくとも90%、例えば、少なくとも92%、例えば、少なくとも94%、例えば、少なくとも96%、例えば、少なくとも98%の配列同一性を有する配列
を含むか、又はそれからなる、請求項1から15のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。
ヒトVγ9Vδ2 T細胞を活性化することができる、請求項1から16のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。
慢性リンパ球性白血病患者からのヒトCD40発現細胞、及び/又は多発性骨髄腫患者からのヒトCD40発現細胞の死滅を媒介することができる、請求項1から17のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。
CD40Lで刺激した、慢性リンパ球性白血病患者からのヒトCD40発現細胞の死滅を媒介することができる、請求項1から18のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。
ヒトVδ2に結合することができる、請求項1から19のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。
ヒトVδ2への結合について、配列番号17で示される配列を有する抗体と競合するか、又はヒトVδ2への結合について、配列番号18で示される配列を有する抗体と競合する、請求項1から20のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。
ヒトVδ2上の、配列番号17で示される配列を有する抗体と同じエピトープに結合するか、又はヒトVδ2上の、配列番号18で示される配列を有する抗体と同じエピトープに結合する、請求項1から21のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。
前記第2の抗原結合領域が、配列番号7で示されるVH CDR1配列、配列番号8で示されるVH CDR2配列、及び配列番号9で示されるVH CDR3配列を含むか、又は配列番号10で示されるVH CDR1配列、配列番号11で示されるVH CDR2配列、及び配列番号12で示されるVH CDR3配列を含む、請求項1から22のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。
前記第2の抗原結合領域が、ヒト化されている、請求項1から23のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。
前記第2の抗原結合領域が、
・配列番号17で示される配列、若しくは
・配列番号17で示される配列との少なくとも90%、例えば、少なくとも92%、例えば、少なくとも94%、例えば、少なくとも96%、例えば、少なくとも98%の配列同一性を有する配列、又は
・配列番号25、26、27、28、29、30、31、32、33及び34からなる群から選択される配列
を含むか、又はそれからなる、請求項1から24のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。
前記第1の抗原結合領域が、
・配列番号1で示されるVH CDR1配列、配列番号2で示されるVH CDR2配列、及び配列番号3で示されるVH CDR3配列、又は
・配列番号4で示されるVH CDR1配列、配列番号5で示されるVH CDR2配列、及び配列番号6で示されるVH CDR3配列
を含み、前記第2の抗原結合領域が、配列番号7で示されるVH CDR1配列、配列番号8で示されるVH CDR2配列、及び配列番号9で示されるVH CDR3配列を含む、請求項1から25のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。
ヒトCD40に結合することができる第1の抗原結合領域を含む抗体であって、ヒトCD40への結合について、配列番号13で示される配列を有する抗体と競合し、且つ/又はヒトCD40への結合について、配列番号14で示される配列を有する抗体と競合する、抗体。
ヒトCD40上の、配列番号13で示される配列を有する抗体と同じエピトープに結合するか、又はヒトCD40上の、配列番号14で示される配列を有する抗体と同じエピトープに結合する、請求項27に記載の抗体。
前記第1の抗原結合領域が、
・配列番号1で示されるVH CDR1配列、配列番号2で示されるVH CDR2配列、及び配列番号3で示されるVH CDR3配列、又は
・配列番号4で示されるVH CDR1配列、配列番号5で示されるVH CDR2配列、及び配列番号6で示されるVH CDR3配列
を含む、請求項27又は28に記載の抗体。
前記第1の抗原結合領域が、
・配列番号13で示される配列若しくは配列番号14で示される配列、又は
・配列番号13で示される配列との少なくとも90%、例えば、少なくとも92%、例えば、少なくとも94%、例えば、少なくとも96%、例えば、少なくとも98%の配列同一性を有する配列、若しくは配列番号14で示される配列との少なくとも90%、例えば、少なくとも92%、例えば、少なくとも94%、例えば、少なくとも96%、例えば、少なくとも98%の配列同一性を有する配列
を含むか、又はそれからなる、請求項27から29のいずれか一項に記載の抗体。
前記第1の抗原結合領域が、シングルドメイン抗体である、請求項27から30のいずれか一項に記載の抗体。
単一特異性抗体、例えば、一価の抗体である、請求項27から31のいずれか一項に記載の抗体。
ヒトCD40又はVδ2ではない抗原に結合する第2の抗原結合領域を含む、請求項27から31のいずれか一項に記載の抗体。
請求項9から11で定義される特性のうちの1つ又は複数を有する、請求項27から33のいずれか一項に記載の抗体。
請求項1から26のいずれか一項に記載の多重特異性抗体、又は請求項27から34のいずれか一項に記載の抗体と、薬学的に許容される賦形剤とを含む医薬組成物。
医薬としての使用のための、請求項1から26のいずれか一項に記載の多重特異性抗体、又は請求項27から34のいずれか一項に記載の抗体。
がんの処置における使用のための、請求項1から26のいずれか一項に記載の多重特異性抗体、又は請求項27から34のいずれか一項に記載の抗体。
慢性リンパ球性白血病、多発性骨髄腫、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、濾胞性リンパ腫、頭頸部がん、膵がん、卵巣がん、肺がん、乳がん、結腸がん、前立腺がん、B細胞リンパ腫/白血病、バーキットリンパ腫又はB細胞急性リンパ芽球性白血病の処置における使用のための、請求項1から26のいずれか一項に記載の多重特異性抗体、又は請求項27から34のいずれか一項に記載の抗体。
慢性リンパ球性白血病又は多発性骨髄腫の処置における使用のための請求項1から26のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。
請求項36から39のいずれか一項に規定の使用のための、請求項1から26のいずれか一項に記載の多重特異性抗体、又は請求項27から34のいずれか一項に記載の抗体であって、前記使用が、Bcl-2ブロッカー、例えば、ベネトクラクスとの組合せである、多重特異性抗体又は抗体。
請求項1から26のいずれか一項に記載の多重特異性抗体、又は請求項27から34のいずれか一項に記載の抗体の、それを必要とするヒト対象への投与を含む、疾患を処置する方法。
前記疾患が、がんである、請求項41に記載の方法。
請求項1から26のいずれか一項に記載の多重特異性抗体、又は請求項27から34のいずれか一項に記載の抗体をコードする核酸構築物。
請求項43に記載の核酸構築物を含む発現ベクター。
請求項43に記載の核酸構築物、又は請求項44に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。