KR20210043483A - 후천성 면역 결핍 증후군(hiv/aids)을 치료하기 위한 가용성 cd24의 사용 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 CD24 단백질을 이를 필요로 하는 피험자에게 투여함으로써 HIV-1/AIDS를 치료, 완화, 최소화 또는 예방하는 방법에 관한 것이다. 또한, HIV-1/AIDS를 치료하기 위한 약물의 제조에서 CD24 단백질의 용도가 본원에 제공된다. 또한, 약학적으로 허용 가능한 양의 CD24 단백질을 포함하는 약학적 조성물이 제공된다.

Description

후천성 면역 결핍 증후군(HIV/AIDS)을 치료하기 위한 가용성 CD24의 사용 방법

본 발명은 후천성 면역 결핍 증후군(Acquired immune deficiency syndrome)(HIV/AIDS)을 치료하기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다.

HIV-1/AIDS는 글로벌 건강의 가장 큰 위협 중 하나이다. 비록 cART/HAART가 검출 가능한 수준하에서 혈장 바이러스 부하(viral load)를 효과적으로 경감하고 유지할 수 있고, 부분적으로 면역 시스템을 재구성할 수 있지만, 적합한 면역 복원 없이 환자의 약 20%가 또한 존재한다[Kelley et al., 2009]. 만성 면역 활성화(면역 시스템의 지속적 및 비정상적인 활성화의 상태)는 병원성 HIV-1/SIV 감염의 특성일뿐만 아니라, cART 상의 HIV-1-감염된 개체에서 손상된 면역 재구성과 관련하는 질병 진행의 강한 독립적인 예측 변수이다[Pallikkuth et al., 2013]. 한편으로, 만성 면역 활성화 및 염증은 면역 세포의 진행을 가속시키고, 성장 및 분열의 사이클을 통해 면역성 노화로 이들을 몰아넣는다[Deeks SG., et al., 2009]. 다른 한편으로, 진행중인 만성 면역 활성화 및 염증은 악순환을 형성하며, 염증성 조직 미세환경의 형성을 증대시켜 최종적으로 HIV-1 감염된 환자에게 유해한 신체 전체에 걸쳐 문제를 야기할 수 있다[Younas M et al., 2016; Rajasuriar et al., 2015]. 시간에 따라, 지속적인 높은 수준의 염증 및 만성 면역 활성화는 장기를 손상시킬 수 있고, 또한 암, 심혈관, 간, 및 신장 질환을 포함하는 심각한 비-AIDS 병태에 대한 고위험을 나타내는 염증-관련 질환으로 이어질 수 있다[Deeks et al., 2013; Rajasuriar et al., 2015]. 요즘에는, cART뿐만 아니라, 차단 사이토카인 생산 및 기능은 만성 면역 활성화 및 염증을 관리하기 위한 항-염증 약물 및 면역억제제를 포함하여 글로벌 건강을 개선 시키고 HIV-1 면역 치료를 위한 중요한 전략이다[Rajasuriar et al., 2013]. 또한, 만성 면역 활성화 및 염증의 조절은 다른 감염성 질환의 효과적인 치료에서 중요한 역할을 한다[Hsu et al., 2016]. 많은 원인은, 예를 들어, 바이러스 복제, 동시 감염 또는 기회 감염성 병원체, 및 미생물 전위의 생성물과 같이, HIV-1/SIV 감염에서 만성 면역 활성화 및 염증에 기여하는 것으로 보고되었다[Paiardini et al., 2013]. 이러한 원인을 표적으로 하는 치료 전략이 개발되었으며, 이는 예를 들어, AIDS 환자 또는 SIV-감염된 동물에 대해 불균일한 효과를 갖는 발간시클로비르(valganciclovir), 항-LPS 항체, 탄산 세벨라머(Sevelamer carbonate)이다[Hunt et al., 2011; Kristoff et al., 2014; Sandler et al., 2014]. 따라서, 만성 면역 활성화를 제어함으로써 HIV-1/AIDS를 치료하는데 대해 큰 미충족 의학적 요구가 남아 있다.

본 발명의 요약

본원은 CD24 단백질을 이를 필요로 하는 피험자에게 투여함으로써 HIV-1/AIDS를 치료, 완화, 최소화 또는 예방하는 방법을 제공한다. 또한, 본원은 HIV-1/AIDS를 치료하기 위한 약물의 제조에서 CD24 단백질의 용도를 제공한다. CD24 단백질은 성숙한 인간 CD24 폴리펩타이드 또는 이의 변이체를 포함할 수 있다. 성숙한 인간 CD24 폴리펩타이드는 서열 식별 번호 1 또는 2에 표시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다. CD24 단백질은 인간 CD24의 세포외 도메인 중 임의의 것 또는 모두를 포함할 수 있다. CD24 단백질은 단백질을 발현하는 세포로부터 분비를 가능하게 하기 위해 서열 식별 번호 4에 표시된 아미노산 서열을 가질 수 있는 신호 서열을 포함할 수 있다. 신호 펩타이드 서열은 다른 막관통 또는 분비된 단백질 상에서 발견되는 것, 또는 당업계에 공지된 기존의 신호 펩타이드로부터 변형된 것일 수 있다. CD24 단백질은 가용성일 수 있고 및/또는 글리코실화될 수 있다. CD24 단백질은 진핵 단백질 발현 시스템을 사용하여 생산될 수 있으며, 이는 중국 햄스터 난소 세포주 또는 복제-결함 레트로바이러스 벡터에 포함된 벡터를 포함할 수 있다. 복제 결함 레트로바이러스 벡터는 진핵 세포의 게놈 내로 안정적으로 통합될 수 있다.

CD24 단백질은 CD24 단백질의 N-또는 C-말단에 융합될 수 있는 단백질 태그를 포함할 수 있다. 단백질은 포유동물 면역글로불린(Ig) 단백질의 일부를 포함할 수 있다. Ig 단백질의 일부는 Ig 단백질의 Fc 영역일 수 있고, Ig 단백질은 인간일 수 있다. Fc 영역은 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 또는 IgA의 힌지 영역 및 CH2 및 CH3 도메인을 포함할 수 있다. Fc 영역은 또한 IgM의 힌지 영역 및 CH2, CH3 및 CH4 도메인을 포함할 수 있다. CD24 단백질은 서열 식별 번호 5, 6, 8, 9, 11 또는 12에 표시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다. CD24 단백질의 아미노산 서열은 또한 서열 식별 번호 5, 6, 8, 9, 11 또는 12에 표시된 서열로 이루어질 수 있다.

또한, CD24를 이를 필요로 하는 피험자에게 투여함으로써 만성 염증 및 HIV 바이러스 부하를 제어하는 방법이 본원에 기재되어 있다. CD24Fc가 손상-관련 분자 패턴(DAMPs) 및 시글렉(Siglecs)과 상호작용하여 염증을 약화함에 따라, 확립된(established) 시미안 면역 결핍 바이러스(simian immunodeficiency virus)(SIV) 감염을 가진 중국 붉은 털 짧은 꼬리 원숭이(Chinese rhesus macaques)(ChRMs)를 보호할 수 있다는 것이 밝혀졌다. 이러한 결과는 DAMPs에 대한 선천성 면역 반응의 음성 조절을 강화하는 것이 HIV-감염된 환자를 치료하기 위한 새로운 접근법을 제공한다는 것을 입증한다. 이들 관찰을 입증하기 위해, CD24Fc의 효과는 또한, HIV-감염된 인간화 마우스에서 시험 되고, 데이터는 CD24Fc가 인간 T 세포의 염증성 사이토카인 및 면역 활성화의 생성을 유의하게 감소시킨다는 것을 입증한다. 또한, CD24Fc는 HIV-감염된 마우스에서 인간 줄기세포의 조혈을 상당히 증가시킨다.

도 1A-C는 전장 CD24 융합 단백질의 아미노산 조성, CD24Fc(본원에서, CD24Ig로도 지칭됨)(서열 식별 번호 5)를 나타낸다. 밑줄 친 26개의 아미노산은 CD24의 신호 펩타이드(서열 식별 번호 4)이며, 이는 단백질을 발현하는 세포로부터의 분비 동안 절단되고, 따라서 단백질의 가공된 버전으로부터 누락된다(서열 식별 번호 6). 서열의 굵은 체 부분은 융합 단백질(서열 식별 번호 2)에서 사용된 성숙한 CD24 단백질의 세포 외 도메인이다. 성숙한 CD24 단백질에 통상적으로 존재하는 마지막 아미노산(A 또는 V)은 면역원성을 피하기 위해 구조물로부터 삭제되었다. 밑줄이 없는, 굵지 않은 글자는 힌지 영역 및 CH1 및 CH2 도메인(서열 식별 번호 7)을 포함하는 IgG1 Fc의 서열이다. 도 1B는 성숙한 인간 CD24 단백질(굵은 체)이 서열 식별 번호 1의 발린 다형성 변이체인 CD24^vFc(서열 식별 번호 8)의 서열을 나타낸다. 도 1C는 성숙한 인간 CD24 단백질(굵은 체)이 서열 식별 번호 1의 알라닌 다형성 변이체인 CD24^AFc(서열 식별 번호 9)의 서열을 나타낸다. 도 1B 및 1C의 융합 단백질의 다양한 부분은 도 1A에서와 같이 표시되어 있고, 변이체 발린/알라닌 아미노산은 이중 밑줄로 표시되어 있다.
도 2는 마우스(서열 식별 번호 3) 및 인간(서열 식별 번호 2)으로부터의 성숙한 CD24 단백질 사이의 아미노산 서열 변이를 나타낸다. 잠재적인 O-글리코실화 부위는 굵게 표시되고, N-글리코실화 부위는 밑줄이 그어져 있다.
도 3A-C. CD24IgG1(CD24Fc)의 약물 동역학의 윈논린(WinNonlin) 구획 모델링 분석. 열린 원은 평균 3마리의 마우스의 평균을 나타내고, 선은 예측된 약물 동역학적 곡선이다. 도 3A. 1mg CD24IgG1의 정맥 내(i.v.) 주사. 도 3B. 1mg CD24IgG1(CD24Fc)의 피하(s.c.) 주사. 도 3C. 곡선 하 면적(AUC), 반감기 및 최대 혈중 농도에 의해 측정된 바와 같이 혈중 항체의 총량의 비교. 전체적으로, 피하 주사의 AUC 및 Cmax는 정맥 내 주사의 약 80%이지만, 그 차이는 통계적으로 유의하지는 않는다.
도 4A-B. CD24-시글렉 G(10) 상호작용은 PAMP와 DAMP 사이를 구별한다. 도 4A. PAMP에 대한 숙주 반응은 CD24-시글렉 G(l0) 상호작용에 의해 영향을 받지 않았다. 도 4B. CD24-시글렉 G(10) 상호작용은 아마도 시글렉 G/10-관련 SHP-1을 통해 DAMP에 대한 숙주 반응을 억제한다.
도 5A-C. CD24 Fc는 시글렉 10 및 HMGB1에 결합하고, 시글렉 G, 인간 시글렉 10의 마우스 상동체를 활성화 시킨다. 도 5A. CD24Fc-시글렉 10 상호작용의 친화성 측정. 도 5B. CD24Fc는 특히 양이온-의존성 방식으로 HMGB-1과 상호작용한다. CD24Fc를 양이온 킬레이터(chelator) EDTA의 존재 또는 부재하에 0.1mM의 CaCl₂ 및 MgCl에서 HMGB1과 함께 배양하였다. CD24Fc는 단백질 G-비드로 풀다운(pull down)되고, HMGB1, CD24Fc 또는 대조군 Fc의 양은 웨스턴 블롯에 의해 결정된다. 도 5C. CD24Fc는 티로신 인산화(중간 패널)을 유도하고 SHP-1(상부 패널)과의 결합을 유도함으로써 마우스 시글렉 G를 활성화 시킨다. 시글렉 G의 양을 하부 패널에 나타낸다. CD24 ^-l- 비장 세포를 1㎍/ml의 CD24Fc, 대조군 Fc 또는 비히클(PBS) 대조군으로 30분 동안 자극하였다. 이어서, 시글렉 G를 면역 침강시키고 항-인산-티로신 또는 항-SHP-1로 탐침 하였다.
도 6A-B. CD24Fc는 항-CD3 활성화된 인간 T 세포에 의한 TNF-α 및 IFN-γ의 생성을 억제한다. 인간 PBML을 CD24Fc의 존재 또는 부재하에 4일 동안 항-CD3으로 자극하고, 세포 배양물의 상층액에서 방출된 IFN-γ 및 TNF-α의 양을 ELISA로 측정하였다. 도시된 데이터는 3회의 평균이다. 에러 바(bars), SEM.
도 7A-B. CD24는 인간 대식세포에 의한 염증성 사이토카인 생성을 억제한다. 도 7A. CD24의 shRNA 사일런싱은 TNF-α, IL-1β 및 IL-6의 자발적인 생성을 유도한다. THP1 세포는 스크램블(scrambled) 또는 2개의 독립적인 CD24 shRNA분자를 인코딩하는 렌티바이러스 벡터로 형질도입되었다. 형질도입된 세포를 PMA(15ng/㎖)로 4일 동안 배양하여 대식세포로 분화시켰다. PMA 및 비-부착성 세포를 세척한 후, 세포를 사이토카인 비드 어레이에 의해 염증성 사이토카인의 측정을 위해 또 다른 24시간 동안 배양하였다. 도 7B. 주어진 농도의 CD24Fc 또는 대조군 IgG Fc를 마지막 24시간에 대식세포에 첨가한 것을 제외하고는, 도 7A의 경우와 같다. 도 7A에 도시된 데이터는 3회의 독립적인 실험으로부터 평균 및 표준편차(S.D.)인 반면, 도 7B의 데이터는 적어도 3회의 독립적인 실험의 대표적인 것이다.
도 8A-E. CD24Fc는 SIVmac239 감염에 의해 야기된 AIDS로부터 중국 붉은 털 짧은 꼬리 원숭이를 보호한다. 도 8A. 실험 스케줄의 다이어그램. 도 8B. 비히클(좌측) 또는 CD24Fc(중간) 치료 후 SIVmac239-감염된 원숭이의 중량 손실. 연구로부터의 요약 데이터가 우측 패널에 도시되어 있다. 도 8C-E. CD24Fc는 소모성 증후군(도 8C), 설사(도 8D) 및 AIDS 이환율 및 사망률(도 8E)에 대해 SIVmac239-감염된 원숭이를 보호한다. 대조군(흑색), CD24Fc 치료 그룹(회색). 도 8B(우측)에서의 통계적 유의성은 본페로니(Bonferroni)의 다중 비교 시험으로 ANOVA를 투-웨이 반복 측정에 의해 결정하였고, 도 8C-8E에서의 통계적 유의성은 쌍체(Paired) t-검정을 사용하여 측정하였다.
도 9A-D. CD24Fc는 혈장 바이러스 부하의 상승을 지연시키고, 프로바이러스 부하를 감소시킬 수 있다. 도 9A. 대조군- 및 CD24Fc-치료된 원숭이에서 혈장 바이러스 부하. 32주 연구 기간 동안 생존한 원숭이만이 분석에 포함되었다. 도 9B. 바이러스 부하가 인위적으로 1.0으로 정의되는 전-치료 수준으로 정규화된 것을 제외하고는, 도 9A의 경우와 같다. 도 9C. 치료 전 및 후에 프로바이러스 부하의 역학. 도 9D. 조직 내 프로바이러스 부하. 대조군(흑색), CD24Fc 치료 그룹(회색). 도 9A-C의 통계적 유의성은 본페로니의 다중 비교 시험으로 투-웨이 반복 측정 ANOVA를 이용하여 결정하였다. 통계적 유의성은 스튜던트 t-검정을 사용하여 결정하였다.
도 10A-D. CD24Fc는 소화관(Gut)에서 염증을 감소시킬 수 있다. 도 10A. CD24Fc(회색) 또는 비히클 대조군(흑색)의 치료를 받은 SIVmac239 감염된 원숭이의 직장에서의 전염증성 인자의 전사체 수준. GAPDH의 수준을 내부 대조군으로 사용하였다. 도 10B. MPO+ 세포의 수를 기준으로 하여 회장(n=11), 결장(n=10) 및 직장(h=10)에서의 과립구 침윤은 면역 형광에 의해 결정했다. 나타낸 데이터는 평균 및 표준편차이다. 각각의 데이터 포인트는 계수된 적어도 5개의 하이-파워 필드의 평균이다. 대조군(흑색), CD24Fc-치료된 그룹(회색). 도 10C. 대조군- 또는 CD24Fc-치료된 원숭이로부터 H&E 염색된 부분의 대표적인 이미지. 도 10D. 병리학적 스코어의 요약 데이터. 대조군(흑색), CD24Fc 치료된 그룹(회색). 도 10A, B 및 D의 통계적 유의성은 스튜던트 t-검정을 사용하여 결정하였다.
도 11A-D. CD24Fc는 HIV-1 바이러스 부하를 감소시키고, 급성 HIV 감염을 갖는 인간화 마우스의 비장에서의 고갈로부터 CD4+ T 세포를 보호한다. 도 11A. 감염 후 l, 8 및 15일째에 5mg/kg으로 복강 내 주사(i.p.)로 투여된 CD24Fc를 갖거나 갖지 않은 R3A 감염된 마우스에서 혈장 HIV-1 부하에 대한 CD24Fc 치료의 효과. 도 11B. 요약 데이터는 CD24Fc를 갖거나 갖지 않는 R3A 감염된 마우스의 말초 혈액에서 CD4+ T 세포의 백분율을 나타내었다. 도 11C-D. 종결에서 CD24Fc를 갖거나 갖지 않는 R3A 감염된 마우스의 비장에서 CD4+ T 세포(도 11C) 및 총 인간 림프구(도 11D)의 절대 수를 나타내는 데이터 요약. 데이터는 평균 및 측정의 표준 오차(standard error of measurement)(s.e.m.) *P<0.05, **P<0.01(양측 비쌍체 스튜던트 t-검정의 분석)로 나타냈다.
도 12A-C. CD24Fc 치료는 만성 HIV 감염을 가지는 인간화 마우스에서 HIV-1 복제를 감소시켰다. 도 12A. 혈장 HIV-1 부하 상에서 CD24Fc 치료(감염 후 7주에서 시작하여 6주 동안 매주 5mg/kg)의 효과. P 값이 도시되어 있다. 데이터는 평균 및 s.e.m. *P<0.05(양측 비쌍체 스튜던트 t-검정의 분석)로 나타냈다. 도 12B. 대표적인 도트 플롯(dot plot)은 각각 모의(mock), HIV-1, CD24Fc 치료를 받은 HIV-1 및 cART 치료를 받은 HIV-1을 포함하는 4개의 그룹에서의 림프절 및 비장으로부터 CD3+CD8- T 세포에 의한 p24 발현을 나타낸다. 숫자는 p24+ 세포 서브세트의 백분율을 나타낸다. 도 12C. 요약 데이터는 도 12B로부터의 4개의 그룹에서의 p24+ T 세포 서브세트의 비율을 나타낸다. 각 도트는 하나의 마우스를 나타낸다. P 값은 <0.05(양측 비쌍체 스튜던트 t-검정의 분석)로 나타난다.
도 13A-13B. CD24Fc 치료는 만성 HIV 감염을 가지는 인간화 마우스에서 나이브(naive) T 세포 비율을 상당히 증가시켰다. 도 13A. 대표적인 도트 플롯은 모의, HIV-1, CD24Fc 치료를 받은 HIV-1, 및 cART 치료를 받은 HIV-1을 포함하는 4개의 그룹에서 나이브 및 메모리 CD4+ 및 CD8+ T 세포 서브세트의 분포를 나타낸다. 숫자는 세포 서브세트의 백분율을 나타낸다. 도 13B. 요약 데이터는 4개의 그룹에서 CD4+ 및 CD8+ 메모리 T 세포 서브세트의 백분율을 나타내었다. 데이터는 평균 및 s.e.m. *P<0.05, **P<0.01 및 ***P<0.001(양측 비쌍체 스튜던트 t-검정 의분석)로 나타냈다.
도 14A-B. CD24Fc 치료는 만성 HIV 감염을 가지는 인간화 마우스에서 T 세포의 과-활성화를 상당히 감소시켰다. 도 14A. 대표적인 도트 플롯은 각각 모의, HIV-1, CD24Fc 치료를 받은 HIV-1, 및 cART 치료를 받은 HIV-1을 수용하는 4개 그룹의 인간화 마우스에서의 CD4+ 및 CD8+ T 세포 모두 상에서 CD38 및 HLA-DR의 발현을 나타낸다. 숫자는 CD38- 및 HLA-DR-발현 세포 서브세트의 백분율을 나타낸다. 도 14B. 요약 데이터는 4개의 그룹에서 CD38+HLA-DR+ CD4 및 CD8 T 세포의 백분율을 나타낸다. 데이터는 평균 및 s.e.m. *P<0.05, **P<0.01 및 ***P<0.001(양측 비쌍체 스튜던트 t-검정의 분석)로 나타냈다.
도 15A-D. 시험관 내(in vitro) 및 생체 내(in vivo)에서 HIV-1-유도된 전-염증성 사이토카인 생성을 차단하였다. THP-l 세포를 CD24Fc를 갖거나 갖지 않은 R3A 스톡(stock)으로 3일 동안 감염시켰다. 이어서, 세포를 pre-IL-1β 및 IL6 mRNA의 RT-PCR을 위해 수집하고, 상청액을 IL-1β의 ELISA을 위해 수집하였다. 도 15A. CD24Fc는 시험관 내에서 THP 단핵구 세포에 의한 HIV R3A-유도된 IL-1β 생성을 억제하였다. 도 15B. CD24Fc는 pre-IL-1β 및 IL6 mRNA의 생성을 억제하였다. 데이터는 평균 및 S.E.M. 모의와 비교하여 **P<0.01 및 R3A와 비교하여 ##P<0.01(양측 쌍체 스튜던트 t-검정의분석)으로 나타냄. 도 15C. R3A-감염된 인간화 마우스에서 CD24Fc 치료(5mg/kg)의 다이어그램(각 그룹에 대해 n=3). 도 15D. 요약 데이터는 IL-6, IL-8, IFN-γ 및 IL-17a를 포함하는 R3A 급성 감염의 1-3 wpi 에서의 혈장의 전-염증성 사이토카인 수준을 나타낸다. 데이터는 평균 및 s.e.m. 시간에 따라 R3A와 비교하여 *P<0.05로 나타냈다.
도 16. CD24Fc는 만성 HIV-1 감염을 가지는 인간화 마우스의 생체 내에서 HSCs의 증식을 구제한다. 각각 모의 마우스(n=4)의 CD34⁺ HSCs, HIV-1-감염된 마우스(n=5) 및 CD24Fc 치료를 받은 HIV-1-감염된 마우스(n=4)에서 발생하는 콜로니-형성 단위의 요약. CD24Fc는 감염 후 7주에서 시작하여 6주 동안 매주 5mg/kg으로 복강 내 주사에 의해 투여되었다. 에러 바(bars), s.e. *p<0.05(양측 비쌍체 스튜던트 t-검정의 분석). CFU-GM, 콜로니-형성 단위-과립구, 대식세포. CFU-E, 콜로니-형성 단위-적혈구(erythroid). CFU-GEMM, 콜로니-형성 단위-과립구, 적혈구, 대식세포, 거핵구.
도 17은 인간 피험자에서 PK 평가 가능한 집단에 대한 치료에 의한 평균 혈장 CD24Fc 농도(±SD)의 플롯을 나타낸다. PK=약물 동역학; SD=표준 편차.
도 18은 PK 평가 가능한 집단에 대한 CD24Fc C_max 대 용량의 용량 비례 플롯을 나타낸다.
도 19는 PK 평가 가능한 집단에 대한 투여량에 대한 CD24Fc AUC_{0 -42d} 대 용량의 용량 비례 플롯을 나타낸다.
도 20은 PK 평가 가능한 집단에 대한 CD24Fc AUC_{0 - inf} 대 용량의 용량 비례 플롯을 나타낸다.

본 발명자들은 놀랍게도, CD24의 가용성 형태가 HIV-1/AIDS를 치료하는 데 대해 매우 효과적이라는 것을 발견하였다. 효과는 DAMPs을 통해 매개 될 수 있다. 패턴 인식은 각각 PAMPs 및 DAMPs로 불리는 병원체-관련 및 조직 손상-관련 분자 패턴 모두에 의해 촉발된 염증 반응에 관여한다. 본 발명자들은 최근 연구들은 DAMPs에 대한 악화된 숙주 반응이 염증성 및 자가면역 질환의 발병에서 일부 역할을 할 수 있다는 것을 입증하였다. DAMPs는 동물 모델에서, 염증성 사이토카인의 생성 및 자가면역 질환을 촉진하는 것으로 밝혀졌으며, 결과적으로, HMGB1 및 HSP90과 같은 DAMPs의 억제제는 결과적으로 류마티스성 관절염(RA)을 개선시키는 것으로 밝혀졌다(4-6). TLRs, RAGE-R, DNGR(Clec9A에 의해 인코드 됨) 및 민클(Mincle)은 다양한 DAMPs에 의해 개시된 염증을 매개하는 역할을 하는 수용체인 것으로 밝혀졌다(2, 7-14).

본 발명자들의 최근 연구는 CD24-시글렉 G 상호작용이 DAMPs에 대한 선천성 면역성과 PAMPs로부터의 선천성 면역성을 식별한다는 것을 입증하였다(15, 16). 시글렉 단백질은 다양한 시알산-함유 구조를 인식하는 막-관련 면역글로불린(Ig) 슈퍼 패밀리 구성원이다. 대부분의 시글렉은 염증 반응의 주요 조절기를 제어하기 위해 SHP-1, -2 및 Cbl-b와 결합하는 세포 내 면역-티로신 억제 모티프(ITIM)를 갖는다. 본 발명자들은 CD24를 시글렉, 특히, 마우스의 시글렉 G 및 인간의 시글렉 10에 대한 첫 번째 천연 리간드로서 보고하였다(15). 시글렉 G는 시알릴화 CD24와 상호작용하여 SHP-1/2 시그널링 메커니즘(15)을 통해 HMGB1과 같은 DAMPs에 대한 TLR-매개 숙주 반응을 억제한다(15).

인간 CD24는 CD24 유전자에서 240 염기쌍의 오픈-리딩 프레임(open-reading frame)에 의해 인코드 되는 작은 GPI-고정(anchored)분자이다(28). 80개의 아미노산 중, 처음 26개는 신호 펩타이드를 구성하고, 마지막 23개는 절단을 위한 신호로서 작용하여 GPI 꼬리의 부착을 가능하게 한다. 결과적으로, 성숙한 인간 CD24분자는 단지 31개의 아미노산만을 갖는다. 31개의 아미노산 중 하나는 인간 집단 중에서 다형성이다. 오픈-리딩 프레임의 뉴클레오타이드 170에서의 C에서 T로의 전이는 알라닌(A)을 발린(V)으로 치환시킨다. 이 잔기는 절단 부위에 대해 아주 가까운 N-말단에 있고, 교체가 비보존적이기 때문에, 이들 두 대립유전자는 세포 표면 상에서 상이한 효율로 발현될 수 있다. 실제로, cDNA에 의한 형질감염 연구는 CD24^V 대립유전자가 세포 표면 상에서 보다 효율적으로 발현된다는 것을 입증하였다(28). 이와 일치하여, CD24^{v /v} PBL은 특히 T 세포 상에서 더 높은 수준의 CD24를 발현하였다.

본 발명자들은 CD24가 조직 또는 기관 손상의 결과로서 방출되는 세포 DAMPs에 대한 숙주 반응을 음성적으로 조절한다는 것을 입증하였으며, 적어도 2개의 중첩 메커니즘은 이러한 활성을 설명할 수 있다. 먼저, CD24는 HSP70, HSP90, HMGB1 및 뉴클레오린을 포함하는 여러 DAMPs에 결합하여 숙주 반응을 억제한다. 이를 위해, CD24는 그들의 수용체, TLR 또는 RAGE와의 상호작용을 방지하기 위해 염증성 자극을 포착(trap) 할 수 있는 것으로 추정된다. 둘째, 간 괴사의 아세트아미노펜-유도된 마우스 모델을 사용하고 염증을 보장함으로써, 본 발명자들은 그의 수용체, 시글렉 G와 상호작용을 통해, CD24가 조직 손상에 대한 숙주 반응에 대해 강력한 음성 조절을 제공함을 입증하였다. 이러한 활성을 달성하기 위해, CD24는 시그날 G에 의한 시그널링을 결합하여 자극할 수 있고, 이에 의해 시글렉 G-관련 SHP1은 음성 조절을 촉발시킨다. 두 메커니즘은 모두 더 강한 염증 반응을 나타내는 유전자의 표적화된 돌연변이를 갖는 마우스와 같이 협력하여 작용할 수 있다. 사실상, CD24 ^-l- 또는 시글렉 G ^-l- 마우스로부터 골수에서 배양된 DC는 HMGB1, HSP70 또는 HSP90 중 어느 하나로 자극될 때 더 높은 수준의 염증성 사이토카인을 생성하였다. 본 발명자들의 지식에 따르면, CD24는 DAMPs에 의해 촉발된 염증을 차단할 수 있는 유일한 억제 DAMP 수용체이고, 조직 손상에 대한 숙주 염증 반응을 구체적으로 표적하는 약물이 현재 이용 가능하지 않다. 또한, 본 발명자들은 RA, MS 및 GvHD의 마우스 모델을 사용하여 DAMP-매개 자가면역 질환을 완화 시키기 위한 외인성 가용성 CD24 단백질의 능력을 입증하였다.

TLRs(toll like receptors) 및/또는 NLRs(Nod-like receptors)를 개별적으로 또는 다른 자극제와 함께 촉발함으로써, DAMPs는 괴사, 파이롭토시스(pyroptosis), 아폽토시스(apoptosis) 및 손상 후 2차 괴사 동안 방출(release)된다. 이들 DAMPs는 강력한 선천성 면역 반응을 유도할 수 있고, 따라서 적어도 부분적으로 만성 면역 활성화 및 전신 염증에 기여한다[Lotze et al., 2005; Chen et al., 2011]. 그들은 멸균 염증을 유지하는데 병원성 역할을 가질 수 있고, 또한, 외상, 만성 염증성 질환, 자가면역 질환 및 암과 같은 질병의 중요한 역할을 할 수 있다[Venereau et al., 2016; Shin et al., 2015; Kang et al., 2015]. 중요하게, 괴사, 파이롭토시스, 세포 사멸 및 손상은 HIV 감염 및 AIDS 동안 빈번하게 발생한다. 염색 세포로부터의 가용성 인자는 세포 손상에 반응하여 전신성 면역 활성화에 기여하는 것으로 제안되어 왔으며, 또한 미생물 전좌, 세포 사멸 및 면역 활성화에 연결되어 있다[Trøseid et al., 2011]. HIV-1 감염된 환자에서 HMGB1, HSP70 및 자가-반응성 항체(Abs)와 같은 DAMPs의 수준이 증가하며, 비록 cART가 DAMPs의 수준을 감소시킬 수 있지만, 이들을 정상 수준으로 되돌릴 수 없다는 것이 입증되었다[Nowak et al., 2007; Anraku et al., 2012]. 자가-반응성 Abs는 나이브 CD4+ T 및 면역 세포의 빠른 손실과 연관되며, 높은 수준은 또한 질병의 급속한 진행과 관련된다[Trøseid et al., 2010; Kocsis et al., 2003; Anraku et al., 2012; Espigares et al., 2006; Agnew et al., 2003; Rawson et al., 2007; Kuwata et al., 2009]. HMGB1은 TLR 신호 경로를 통해 박테리아 생성물과의 복합체에서 면역 활성화를 촉진할 수 있고, HMGB1의 높은 수준은 높은 바이러스 부하와 연관된다[Trøseid et al., 2013]. HMGB1 및 LPS는 HIV-1 진행자(progressor)에서 CD8+ T 세포 상의 CD38 밀도와 적당히 상관된다[Trøseid et al., 2013]. 이들 데이터에 기초하여, 본 발명자들은 DAMPs가 HIV-1 감염된 환자의 면역 활성화 및 염증에 중요한 역할을 할 것이며, 그들을 표적화 하는 어떤 약물도 HIV-1/AIDS 치료에 사용된 적이 없었다는 것을 인정하였다.

다양한 TLRs 및 NLRs를 발현하는 대식세포는 식세포 작용, 항원 제시 및 사이토카인 방출 기능을 갖는 선천적 면역 세포이다. PAMPs 및 DAMPs에 의해 촉발, 또는 자극제에 의해 활성화된 후, 타입 1 대식세포(M1)는 다량의 전염증성 사이토카인을 방출하고, 이는 면역 활성화를 유도할 수 있으며, 전신 염증 및 활성화는 세포 사멸을 유도한다. 다른 한편으로는, 타입 2 대식세포(M2)는 높은 식세포 활성을 가지며, 다량의 염증성 사이토카인을 생성하여 조직 복구에 참여한다. HIV-1 감염에서, 아폽토시스, 2차 괴사 및 잠재적으로 파이롭토시스를 겪은 바이러스 감염된 CD4+ T 세포는 높은 전-염증성 국소 환경을 생성하는 전-염증성 사이토카인, 바이러스 복제의 생성물 및 미생물 전좌의 생성물을 방출한다. 이는 치료되지 않은 AIDS 환자에서 관찰되는 바와 같이, 대식세포를 더 많은 염증성 M1 표현형 쪽으로 분극화시킨다[Sattentau and Stevenson, et al]. 따라서, 대식세포 분극화, 염증, 조직 손상 및 최종적으로 질병 진행 중에 악순환이 존재한다. 따라서, 대식세포의 염증 활성을 차단하는 것은 HIV-1/AIDS의 진행을 치료 및 예방하기 위한 전략이다.

본 발명자들은 CD24 단백질의 가용성 형태가 DAMPs에 의해 촉발된 대식세포의 전염증성 활성을 차단할 수 있고, 지연된 체중 감소, 감소된 소모성 증후군 및 설사를 포함하는 AIDS 또는 사멸에 대해 보호할 수 있음을 입증하였다. 가용성 CD24 단백질은 또한 혈장 바이러스 부하의 증가를 지연시킬 수 있고, CD4+ T 세포 수 및 T 세포 서브세트의 현저한 변화를 회복하지 않고 PBMC, 골수 및 직장에서 프로바이러스성 부하를 억제할 수 있다. 본 발명자들은 또한 가용성 CD24 단백질이 소화관 염증을 억제하고 CD8+ T 세포 활성화를 감소시킬 수 있음을 발견하였다. 마지막으로, 본 발명자들은 효과적인 가용성 CD24 단백질 치료가 CD8+ T 세포에서의 HLA-DR 발현의 중간 하향-조절 및 sCDl4 수준의 효과적인 조절과 상관된다는 것을 발견하였다.

1. 정의

본원에서 사용된 용어는 단지 특정 실시 양태를 설명하기 위한 것이며, 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 본 명세서 및 첨부된 청구항에서 사용되는 바와 같이, 단수 형태 "하나(a)", "하나(an)", 및 "그(the)"는 문맥상 명백히 달리 지시하지 않는 한 복수의 지시 대상을 포함한다.

본원에서 수치 범위의 인용을 위해, 동일한 정도의 정밀도를 갖는 그 사이에 있는 각각의 중간 숫자가 명시적으로 고려된다. 예를 들어, 6-9의 범위에 대해, 6 및 9 이외 숫자 7 및 8이 고려되며, 그리고 6.0-7.0의 범위에 대해, 숫자 6.0, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9 및 7.0이 명시적으로 고려된다. 또한, 리스트에 나열된 숫자에 의해 한정된 종점을 갖는 범위는 명시적으로 고려된다. 예를 들어, 리스트 1, 2, 3 및 4는 1-2, 2-3, 3-4, 1-4, 1-3 및 2-4의 범위를 한정한다. 달리 언급되지 않는 한, 종점은 이러한 범위에 포함된다.

"펩타이드" 또는 "폴리펩타이드"는 아미노산의 연결된 서열이며, 천연, 합성, 또는 천연 및 합성의 변형 또는 조합일 수 있다.

"실질적으로 동일한"은 제1 및 제2 아미노산 서열이 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290 또는 300개 아미노산의 영역 대해 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%인 것을 의미할 수 있다.

질병으로부터 동물의 보호를 언급할 때, "치료" 또는 "치료하는"은 질병의 예방, 억제, 억압 또는 완전히 제거하는 것을 의미한다. 질병을 예방하는 것은 본 발명의 조성물을 질병의 발병 전에 동물에게 투여하는 것을 포함한다. 질병을 억제하는 것은 본 발명의 조성물을 질병의 유도 후 그러나 이의 임상적 출현 전에 동물에게 투여하는 것을 포함한다. 질병의 억압은 본 발명의 조성물을 질병의 임상적 출현 후에 동물에게 투여하는 것을 포함한다.

"변이체"는 아미노산의 삽입, 결실 또는 보존적 치환에 의해 아미노산 서열에서 상이하지만 적어도 하나의 생물학적 활성을 보유하는 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 의미할 수 있다. "생물학적 활성"의 대표적인 예는 톨-유사 수용체에 결합하고 특정 항체에 의해 결합 되도록 하는 능력을 포함한다. 변이체는 또한, 적어도 하나의 생물학적 활성을 보유하는 아미노산 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 단백질을 의미할 수 있다. 아미노산의 보존적 치환, 즉 유사한 특성(예를 들어, 친수성 및 하전된 영역의 정도 및 분포)의 상이한 아미노산으로 아미노산을 대체하는 것은 당업계에서 전형적으로 작은 변화를 수반하는 것으로 인식된다. 이들 작은 변화는 당업계에서 이해되는 바와 같이, 아미노산의 수치요법 지수(hydropathic index)를 고려함으로써 부분적으로 확인될 수 있다. Kyte et al., J. Mol. Biol. 157:105-132 (1982). 아미노산의 수치요법 지수는 이의 소수성 및 전하의 고려에 기초한다. 유사한 수치요법 지수의 아미노산이 치환될 수 있고 여전히 단백질 기능을 보유할 수 있다는 것이 당업계에 공지되어 있다. 일 측면에서, ±2의 수치요법 지수를 갖는 아미노산이 치환된다. 아미노산의 친수성은 또한 생물학적 기능을 보유하는 단백질을 초래하는 치환을 나타내기 위해 사용될 수 있다. 펩타이드와 관련하여 아미노산의 친수성을 고려하면, 그 펩타이드의 가장 큰 국소 평균 친수성을 계산할 수 있는데, 이는 항원성 및 면역원성과 잘 상관되는 것으로 보고된 유용한 척도이다. 미국 특허 제4,554,101호는 본원에 참고로 완전히 포함되어 있다. 유사한 친수성 값을 갖는 아미노산의 치환은 당업계에서 이해되는 바와 같이, 생물학적 활성, 예를 들어 면역원성을 보유하는 펩타이드를 초래할 수 있다. 치환은 서로 ±2 이내의 친수성 값을 갖는 아미노산으로 수행될 수 있다. 아미노산의 소수성 지수 및 친수성 값 둘 다는 그 아미노산의 특정 측쇄에 의해 영향을 받는다. 이러한 관찰과 일치하게, 생물학적 기능과 양립할 수 있는 아미노산 치환은 소수성, 친수성, 전하, 크기 및 다른 특성에 의해 밝혀진 바와 같이 아미노산의 상대적인 유사성, 특히 이들 아미노산의 측쇄에 의존하는 것으로 이해된다.

2. CD24

성숙한 CD24 폴리펩타이드 또는 이의 변이체를 포함할 수 있는 CD24 단백질이 본원에 제공된다. 성숙한 CD24 폴리펩타이드는 CD24의 세포 외 도메인(ECD)에 상응한다. 성숙한 CD24 폴리펩타이드는 인간 또는 다른 포유동물로부터 유래된 것일 수 있다. 상기한 바와 같이, 성숙한 인간 CD24 폴리펩타이드는 31개의 아미노산 길이이며, 그의 C-말단 말단에서 가변 알라닌(A) 또는 발린(V) 잔기를 갖는다.

SETTTGTSSNSSQSTSNSGLAPNPTNATTK(V/A)(서열 식별 번호 1)

C-말단 발린 또는 알라닌은 면역원성일 수 있고 CD24 단백질로부터 생략될 수 있으며, 이는 이의 면역원성을 감소시킬 수 있다. 따라서, CD24 단백질은 C-말단 아미노산이 결여된 인간 CD24의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.

SETTTGTSSNSSQSTSNSGLAPNPTNATTK(서열 식별 번호 2)

마우스 및 인간으로부터 성숙한 CD24 단백질의 아미노산 서열에서 상당한 서열 변이에도 불구하고, 이들은 기능적으로 동일한데, 이는 인간 CD24Fc가 마우스에서 활성인 것으로 밝혀졌기 때문이다. 인간 CD24 ECD의 아미노산 서열은 마우스 단백질(39% 동일성; Genbank 기탁 번호 NP_033976)에 의한 일부 서열 보존을 나타낸다. 그러나 CD24 ECD가 종에 따라 길이가 단지 27-31개의 아미노산이고, 시글렉 10/G와 같은 일부 그의 수용체(들)에 대한 결합이 당단백질의 시알산 및/또는 갈락토오스당에 의해 매개 되기 때문에 동일성 백분율이 높지 않다는 것은 놀라운 것은 아니다. 인간 시글렉-lO의 세포 외 도메인들(GenBank 기탁 번호 AF310233)과 그의 뮤린 상동체 시글렉-G((GenBank 기탁 번호 NP_766488) 수용체 단백질들 사이의 아미노산 서열 동일성은 63%이다(도 2). 주로 C-말단 및 글리코실화 부위가 풍부한 곳에서의 마우스와 인간 CD24 사이의 서열 보존의 결과로서, 성숙한 CD24 단백질의 상당한 변이가 CD24 단백질을 사용하여 견딜 수 있으며, 특히, 이들 변이가 C-말단에서 보존된 잔기에 영향을 미치지 않거나 마우스 또는 인간 CD24로부터의 글리코실화 부위에 영향을 미치지 않는 경우에 그러하다. 따라서, CD24 단백질은 성숙한 뮤린 CD24의 아미노산 서열을 포함할 수 있다:

NQTSVAPFPGNQNISASPNPTNATTRG(서열 식별 번호 3).

인간 CD24 ECD의 아미노산 서열은 마우스보다 시노몰구스 원숭이 단백질(52% 동일성; UniProt 기탁 번호 UniProtKB-I7GKK1)에 의한 더 많은 서열 보존을 나타낸다. 다시 한번, ECD가 이들 종에서 길이가 단지 29-31개의 아미노산이고, 그의 수용체(들)에 결합하는 당 잔기의 역할로 인해 동일성 백분율이 더 높지 않다는 것을 고려하면, 이것은 놀라운 것이 아니다. 시노몰구스 시글렉-lO 수용체의 아미노산 서열은 결정되지 않았지만, 인간과 붉은 털 원숭이 시글렉-10(GenBank 기탁 번호 XP 001116352) 단백질 사이의 아미노산 서열 동일성은 89%이다. 따라서, CD24 단백질은 또한, 성숙한 시노몰구스(또는 붉은 털) 원숭이 CD24의 아미노산 서열을 포함할 수 있다:

TVTTSAPLSSNSPQNTSTTPNPANTTTKA(서열 식별 번호 10)

CD24 단백질은 가용성일 수 있다. CD24 단백질은 단백질을 발현하는 세포로부터 분비를 가능하게 하는 N-말단 신호 펩타이드를 추가로 포함할 수 있다. 신호 펩타이드 서열은 아미노산 서열 MGRAMVARLGLGLLLLALLLPTQIYS(서열 식별 번호 4)를 포함할 수 있다. 대안적으로, 신호 서열은 다른 막 관통 또는 분비 단백질 상에서 발견되는 것, 또는 당업계에 공지된 기존의 신호 펩타이드로부터 변형된 것 중 임의의 것일 수 있다.

a. 융합

CD24 단백질은 그의 N- 또는 C-말단에서 단백질 태그에 융합될 수 있으며, 이는 인간 또는 마우스 또는 다른 종으로부터 유래할 수 있는 포유동물 Ig 단백질의 부분을 포함할 수 있는 단백질 태그이다. 이 부분은 Ig 단백질의 Fc 영역을 포함할 수 있다. Fc 영역은 Ig 단백질의 힌지 영역, CH2, CH3 및 CH4 도메인 중 적어도 하나를 포함할 수 있다. Ig 단백질은 인간 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 또는 IgA일 수 있고, Fc 영역은 Ig의 힌지 영역, 및 CH2 및 CH3 도메인을 포함할 수 있다. Fc 영역은 인간 면역글로불린 G1(IgG1) 동종형 서열 식별 번호 7을 포함할 수 있다. Ig 단백질은 또한 IgM일 수 있고, Fc 영역은 IgM의 힌지 영역 및 CH2, CH3 및 CH4 도메인을 포함할 수 있다. 단백질 태그는 단백질의 정제를 돕는 친화성 태그, 및/또는 기능성 단백질의 용해도 및 회수를 향상시키는 용해도-향상 태그일 수 있다. 단백질 태그는 또한 CD24 단백질의 원자가를 증가시킬 수 있다. 단백질 태그는 또한 GST, His, FLAG, Myc, MBP, NusA, 티오레독신(thioredoxin)(TRX), 작은 유비퀴틴(ubiquitin)-유사 개질제(SUMO), 유비퀴틴(Ub), 알부민, 또는 카멜리드(Camelid) Ig를 포함할 수 있다. 융합 단백질을 제조하고 융합 단백질을 정제하는 방법은 당업계에 공지되어 있다.

전임상 연구에 기초하여, 실시예에서 동정된 융합 단백질 CD24Fc의 구성을 위해, GPI 신호 절단 부위 전에 최종 다형성 아미노산이 결여되어 있는, 30개의 아미노산의 절단된 형태의 천연 CD24분자(즉, 서열 식별 번호 2를 갖는 성숙한 CD24 단백질)가 사용되었다. 성숙한 인간 CD24 서열은 인간 IgG1 Fc 도메인(서열 식별 번호 7)에 융합된다. 전장 CD24Fc 융합 단백질은 서열 식별 번호 5(도 1A)에 제공되고, 세포로부터 분비되는 CD24Fc 융합 단백질의 가공된 버전(즉, 절단된 신호 서열이 결여된)이 서열 식별 번호 6에 제공된다. IgG1 Fc에 융합된 성숙한 CD24의 가공된 다형성 변이체(즉, 서열 식별 번호 1을 갖는 성숙한 CD24 단백질)는 서열 식별 번호 11 또는 12에 표시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다.

b. 생산

CD24 단백질은 크게 글리코실화될 수 있고, 면역 세포의 공동자극 및 손상-관련 분자 패턴분자(damage-associated molecular patten)(DAMP)와의 상호작용과 같은 CD24의 기능에 관여할 수 있다. CD24 단백질은 진핵 발현 시스템을 사용하여 제조될 수 있다. 발현 시스템은 예를 들어 중국 햄스터 난소(CHO) 세포와 같은 포유동물 세포에서의 벡터로부터의 발현을 수반할 수 있다. 시스템은 또한 진핵 세포를 감염시키는데 사용될 수 있는 복제-결함 레트로바이러스 벡터와 같은 바이러스 벡터일 수 있다. CD24 단백질은 또한 세포 게놈에 통합된 벡터의 일부 또는 벡터로부터 CD24 단백질을 발현하는 안정 세포주로부터 생산될 수 있다. 안정 세포주는 통합된 복제-결함 레트로바이러스 벡터로부터 CD24 단백질을 발현할 수 있다. 발현 시스템은 GPEx^TM일 수 있다.

c. 약학적 조성물

CD24 단백질은 약학적으로 허용 가능한 양의 CD24 단백질을 포함할 수 있는 약학적 조성물에 함유될 수 있다. 약학적 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 약학적 조성물은 용매를 포함할 수 있으며, 이는 연장된 기간에 걸쳐 CD24 단백질를 안정하게 유지할 수 있다. 용매는 PBS 일 수 있으며, 이는 -20℃(-15 ~ -25℃)에서 CD24 단백질을 적어도 66개월 동안 안정하게 유지할 수 있다. 용매는 다른 약물과 조합하여 CD24 단백질을 수용할 수 있다.

약학적 조성물은 주사 또는 연속 주입을 포함하지만 이에 제한되지 않는 비경구 투여를 위해 제제화될 수 있다. 주사를 위한 제제는 유성 또는 수성 비히클 중의 현탁액, 용액 또는 유제의 형태일 수 있고, 현탁제, 안정화제 및 분산제를 포함하지만 이에 제한되지 않는 제제화제를 함유할 수 있다. 조성물은 또한 멸균 수사용 증류수를 포함하지만 이에 제한되지 않는 적합한 비히클로 재구성하기 위한 분말 형태로 제공될 수 있다.

약학적 조성물은 또한 이식 또는 근육 내 주사에 의해 투여될 수 있는 데포 제제로서 제제화될 수 있다. 조성물은 적합한 중합체성 또는 소수성 물질(예를 들어, 허용 가능한 오일 중의 유제), 이온 교환 수지, 또는 난용성 유도체(예를 들어, 난용성 염으로서)로 제제화될 수 있다. 피하 주사와 같은 제제는 루푸스와 같은 투양 지시(indication) 및 그의 관련된 징후 및 합병증에 특히 관련될 수 있다.

d. 용량

CD24 단백질의 용량은 궁극적으로 허용 가능한 독성 및 임상적 효능을 갖는 용량을 결정하기 위해 임상 시험을 통해 결정될 수 있다. 초기 임상 용량은 설치류 및 비-인간 영장류에서 약물 동역학 및 독성 연구를 통해 추정될 수 있다. CD24 단백질의 용량은 irAEs 또는 GvHD 및 투여 경로에 대한 원하는 효과에 따라, 0.01mg/kg 내지 1000mg/kg일 수 있고, 1 내지 500mg/kg일 수 있다. CD24 단백질은 정맥 내 주사 또는 피하, 벽 내(즉, 공동 또는 기관의 벽 내), 또는 복강 내 주사에 의해 투여될 수 있고, 용량은 10-1000mg, 10-500mg, 10-240mg, 10-120mg, 또는 10, 30, 60, 120 또는 240mg일 수 있고, 여기서 피험자는 인간이다.

3. 치료 방법

a. HIV/AIDS

CD24 단백질을 이를 필요로 하는 피험자에게 투여함으로써 후천성 면역 결핍 증후군(HIV/AIDS)을 완화 또는 치료하는 방법이 본원에 제공된다. CD24 단백질은 HIV/AIDS가 발생할 위험이 있는 피험자에게 투여될 수 있다. CD24 단백질은 HIV/AIDS를 예방하거나 또는 HIV/AIDS의 임상적 징후가 출현하기 전에 예방적으로 사용될 수 있다. CD24 단백질은 또한 임상 증상이 진단된 후에 HIV/AIDS를 치료하도록 치료적으로 투여될 수 있다.

또 다른 실시 양태에서, CD24 단백질은 HIV/AIDS와 관련된 염증을 감소 또는 차단하는데 사용될 수 있으며, 이는 DAMPs에 의해 촉발된 대식세포의 전염증성 활성을 저지, 소화관 염증을 감소, CD8+ T 세포 활성화 감소, sCDl4 수준 조절 및 CD8+ T 세포에서 HLA-DR 발현을 하향 조절하는 것 중 하나 이상을 포함할 수 있다.

다른 실시 양태에서, CD24 단백질은 HIV/AIDS의 영향을 감소 또는 최소화하는데 사용될 수 있으며, 이는 체중 감소, 소모성 증후군 및 설사 중 하나 이상일 수 있다.

또 다른 실시 양태에서, CD24 단백질은 혈장 바이러스 부하의 증가를 지연시키고, CD4+ T 세포 수 및 T 세포 서브세트의 현저한 변화의 복원 없이 PBMC, 골수 및 직장 중 하나 이상에서 프로바이러스 부하를 억제하는 데 사용될 수 있다. 또한, 본원에 기술된 용도 또는 치료를 위한 약물의 제조에 있어서 CD24 단백질의 용도가 제공된다.

b.투여

약학적 조성물의 투여 경로는 비경구일 수 있다. 비경구 투여는 정맥 내, 동맥 내, 복강 내, 피하, 근육 내, 경막 내, 관절 내 및 직접 주사를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 약학 조성물은 인간 환자, 고양이, 개, 대동물, 또는 조류에 투여될 수 있다. 조성물은 하루에 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12회 투여될 수 있다.

c. 복합 치료

HIV/AIDS 진행과 관련된 만성 면역 활성화 및 염증은 HIV-1 치료에 대한 가장 큰 자원자(challenges) 중 2종류이다[Appay et al., 2008]. 비록 성공적인 cART가 혈장 바이러스 부하를 비감지 수준까지 억제할 수 있지만, 만성 면역 활성화 및 염증은 여전히 소멸되지 않고 질병 및 사멸을 정의하는 비-AIDS와 밀접하게 관련된다[Rajasuriar et al., 2015]. 현재, 다양한 종류의 면역억제제((프레드비소네(Predbisone), 미코페놀레이트(mycophenolate), 사이클로소린(Cyclosorine), 시롤리무스/라파마이신(Sirolimus/rapamycin)), 항염증 약물((아스피린(aspirin), 셀레콕시브(Celecoxib),클로로퀴닌(Chloroquine),하이드록시클로로퀴닌(Hydroxychloroquine),펜톡시플라인(Pentoxifyline),살라살레이트(Salsalate),아달리뮤맙(Adalimumab),인프릭시마브/에타너셉트(Infliximab/etanercept))[Rajasuriar et al., 2013] 및 스타틴((아토르바스타틴(Atorvastatin), 플루바스타틴(fluvastatin), 로바스타틴(lovastatin),피타바스타틴(pitavastatin), 프라바스타틴(pravastatin), 로수바스타틴(rosuvastatin), 심바스타틴(simvastatin))은 임상 또는 동물에서 항-만성 면역 활성화 및 염증 효과에 대해 시험 되었지만[Eckard et al.,2015], 그들 효과는 상이한 부작용과 관련되었다. 특히 면역 억제제와 같은 비-특이적 약물은 기회 감염에 대한 높은 위험성을 갖는 바이러스 로딩(loading), 만성 면역 활성화 및 염증에 대한 가변 효과를 가지며; 비-스테로이드계 항-염증성 약물은 항-만성 면역 활성화 및 심혈관 질환의 높은 위험에 대한 효과를 가지며; 염증, 면역 활성화 및 면역 노화를 조절하는 이점을 갖는 스타틴은 또한, 심부전, 근육통, 횡문근육변성, 정신 및 신경학적 증상 및 암의 높은 위험을 나타낸다[Ravnskov et al., 2006; Rajasuriar et al., 2013]. 그러나, 항-TNF-α 항체와 같은 매우 특이적인 투여를 갖는 면역 치료는 보다 효과적이며 보다 적은 부작용을 갖는다[Tabb et al., 2013]. 따라서, 치료의 특이성을 향상시키는 것은 더 높은 내성 및 더 적은 부작용을 갖는 치료의 효능을 개선시킬 수 있다. 따라서, 본원에 기재된 CD24 단백질은 본원에 기재된 치료 방법에서 이들 다른 치료법 중 임의의 것과 조합하여 투여될 수 있다.

이러한 복합 치료는 고활성 항레트로바이러스 치료(highly active antiretroviral theraphy)(HAART) 및/또는 복합 항레트로바이러스 치료(combined antiretroviral theraphy)(cART)를 포함한다. ART의 예는 엔트리 억제제, 뉴클레오시드/뉴클레오타이드 역전사효소 억제제(NRTIs), 비-뉴클레오시드 역전사효소 억제제(NNRTIs), 인테그라제 억제제(또한, 인테그라제 핵 스트랜드 전달 억제제 또는 INSTIs로도 알려짐) 및 프로테아제 억제제를 포함한다. 마르비록(Marviroc) 및 엔퓨비르티드(enfuvirtide)와 같은 엔트리 억제제(또는 융합 억제제)는, HIV의 CCR5 및 CXCR4 또는 gp41과 같은 몇몇 표적 중 하나를 차단함으로써 숙주 세포에 결합, 즉 HIV-1의 융합 및 진입을 방해한다. NRTIs는 지도부딘(zidovudine), 아바카비르(abacavir), 라미부딘(lamivudine), 엠트리시타빈(emtricitabine) 및 테노포비르(tenofovir)와 같은 뉴클레오시드 및 뉴클레오타이드 유사체이며, 이는 역전사를 억제하고 따라서 숙주 세포 게놈으로의 통합을 억제한다. 또한, NNRTIs는 역전사효소를 억제하지만, 효소의 알로스테릭 부위(allosteric site)에 결합함으로써 그렇게 한다. NNRTIs는 네비라핀(nevirapine), 에파비렌즈(efavirenz), 에트라비린(etravirine) 및 릴피비린(rilpivirine)을 포함한다. 바이러스 효소 인테그라제는 감염된 세포의 DNA에 바이러스 DNA의 통합을 담당한다. 따라서, 랄테그라비르(raltegravir), 엘비테그라비르(elvitegravir) 및 도루테그라비르(dolutegravir)와 같은 인테그라제 억제제는 바이러스 복제에 있어서 이 단계를 방지한다. 프로테아제 억제제는 gag 및 gag/pol 전구 단백질의 절단을 방지함으로써 숙주 세포로부터 쌈틈(budding)시 성숙한 비리온을 생산하는데 필요한 바이러스 프로테아제 효소를 차단하며, 로피마비르(lopinavir), 인디나비르(indinavir), 넬피나비르(nelfinavir), 암프레나비르(amprenavir), 리토나비르(ritonavir), 다루나비르(darunavir) 및 아타자나비르(atazanavir)를 포함한다. CD24 단백질과 복합하여 사용될 수 있는 ART의 고정된 용량 복합의 예는 콤비비르(Combivir)(라미부딘(lamivudine)+지도부딘(zidovudine), GlaxoSmithKline), 카레트라(Kaletra)(로피나비르(lopinavir)+리토나비르(ritonavir), Abbott Laboratories), 트리지비르(Trizivir)(아바카비르(abacavir)+라미부딘(lamivudine)+지도부딘(zidovudine), GlaxoSmithKline), 에피지콤/키벡사(Epizicom/Kivexa)(아바카비르(abacavir)+라미부딘(lamivudine),GraxoSmithKline), 트루바다(Truvada)(테노포비르 디소프록실 푸마레이트(tenofovir disoproxil fumarate)+엠트리시타빈(emtricitabine), Gilead Sciences), 아트리프라(Atripla)(엠트리시타빈(emtricitabine)+테노포비르 디소프록실 푸마레이트(tenofovir disoproxil fumarate)+ 에파비렌즈(efavirenz), Gilead Sciences and Bristol-Myers Squibb), 콤프레라/에비프레라(Complera/Eviplera)(엠트리시타빈(emtricitabine)+릴피비린(rilpivirine)+테노포비르 디소프록실 푸마레이트(tenofovir disoproxil fumarate), Gilead Sciences and Janssen Therapeutics), 스트리빌드(Stribild)(엘비테그라비르(elvitegravir)+코비시스타트(cobicistat)+엠크리시타빈(emtricitabine)+테노포비르 디소프록실 푸마레이트(tenofovir disoproxil fumarate), Gilead Sciences), 트리우메크(Triumeq)(아바카비르(abacavir)+도루테그라비르(dolutegravir)+라미부딘(lamivudine), ViiV Healthcare),에보타즈(Evotaz)(아타자나비르(atazanavir)+코비시스타트(cobicistat, Bristol-Myers Squibb), 프레즈코빅스(Prezcobix)(다루나비르(darunavir)+코비시스타트(cobicistat, Janssen Therapeutics), 두트레비스(Dutrebis)(라미부딘(lamivudine)+ 랄테그라비르(raltegravir), Merck & Co.), 젠보야(Genvoya)(엘비테그라비르(elvitegravir)+코비시스타트(cobicistat)+엠트리시타빈(emtricitabine)+테노포비르 아라페나미드 푸마레이트(tenofovir alafenamide fumarate), Gilead Sciences) 및 데스코비(Descovy)(엠트리시타빈(emtricitabine)+테노포비르 아라페나미드 푸마레이트(tenofovir alafenamide fumarate), Gilead Sciences)를 포함한다. 다른 복합 치료는 발간시클로비르(valganciclovir), 항-LPS 항체 및 세베라머 카보네이트(Sevelamer carbonate)를 포함한다.

CD24 단백질은 다른 치료와 동시에 또는 기계적으로 규칙적이게 투여될 수 있다. 본원에 사용된 용어 "동시의" 또는 "동시에"는 CD24 단백질 및 다른 치료가 48시간, 바람직하게는 24시간, 더욱 바람직하게는 12시간, 더욱더 바람직하게는 6시간, 가장 바람직하게는 3시간 이내에 투여된다는 것을 의미한다. 본원에 사용된 용어 "기계적으로 규칙적이게"는 반복 투여에 대해 다른 치료와 상이한 시간 및 특정 빈도로 제제의 투여를 의미한다.

CD24 단백질은 약 120시간, 118시간, 116시간, 114시간, 112시간, 110시간, 108시간, 106시간, 104시간, 102시간, 100시간, 98시간, 96시간, 94시간, 92시간, 90시간, 88시간, 86시간, 84시간, 82시간, 80시간, 78시간, 76시간, 74시간, 72시간, 70시간, 68시간, 66시간, 64시간, 62시간, 60시간, 58시간, 56시간, 54시간, 52시간, 50시간, 48시간, 46시간, 44시간, 42시간, 40시간, 38시간, 36시간, 34시간, 32시간, 30시간, 28시간, 26시간, 24시간, 22시간, 20시간, 18시간, 16시간, 14시간, 12시간, 10시간, 8시간, 6시간, 4시간, 3시간, 2시간, 1시간, 55분, 50분, 45분, 40분, 35분, 30분, 25분, 20분, 15분, 10분, 9분, 8분, 7분, 6분, 5분, 4분, 3분, 2분 및 1분을 포함하는 다른 치료 이전에 임의의 시점에서 투여될 수 있다. CD24 단백질은 약 120시간, 118시간, 116시간, 114시간, 112시간, 110시간, 108시간, 106시간, 104시간, 102시간, 100시간, 98시간, 96시간, 94시간, 92시간, 90시간, 88시간, 86시간, 84시간, 82시간, 80시간, 78시간, 76시간, 74시간, 72시간, 70시간, 68시간, 66시간, 64시간, 62시간, 60시간, 58시간, 56시간, 54시간, 52시간, 50시간, 48시간, 46시간, 44시간, 42시간, 40시간, 38시간, 36시간, 34시간, 32시간, 30시간, 28시간, 26시간, 24시간, 22시간, 20시간, 18시간, 16시간, 14시간, 12시간, 10시간, 8시간, 6시간, 4시간, 3시간, 2시간, 1시간, 55분, 50분, 45분, 40분, 35분, 30분, 25분, 20분, 15분, 10분, 9분, 8분, 7분, 6분, 5분, 4분, 3분, 2분 및 1분을 포함하는 CD24 단백질의 두 번째 치료 이전에 임의의 시점에서 투여될 수 있다.

CD24 단백질은 약 l분, 2분, 3분, 4분, 5분, 6분, 7분, 8분, 9분, 10분, 15분, 20분, 25분, 30분, 35분, 40분, 45분, 50분, 55분, 1시간, 2시간, 3시간, 4시간, 6시간, 8시간, 10시간, 12시간, 14시간, 16시간, 18시간, 20시간, 22시간, 24시간, 26시간, 28시간, 30시간, 32시간, 34시간, 36시간, 38시간, 40시간, 42시간, 44시간, 46시간, 48시간, 50시간, 52시간, 54시간, 56시간, 58시간, 60시간, 62시간, 64시간, 66시간, 68시간, 70시간, 72시간, 74시간, 76시간, 78시간, 80시간, 82시간, 84시간, 86시간, 88시간, 90시간, 92시간, 94시간, 96시간, 98시간, 100시간, 102시간, 104시간, 106시간, 108시간, 110시간, 112시간, 114시간, 116시간, 118시간 및 120시간을 포함하는 다른 처리 후에 임의의 시점에서 투여될 수 있다. CD24 단백질은 약 120시간, 118시간, 116시간, 114시간, 112시간, 110시간, 108시간, 106시간, 104시간, 102시간, 100시간, 98시간, 96시간, 94시간, 92시간, 90시간, 88시간, 86시간, 84시간, 82시간, 80시간, 78시간, 76시간, 74시간, 72시간, 70시간, 68시간, 66시간, 64시간, 62시간, 60시간, 58시간, 56시간, 54시간, 52시간, 50시간, 48시간, 46시간, 44시간, 42시간, 40시간, 38시간, 36시간, 34시간, 32시간, 30시간, 28시간, 26시간, 24시간, 22시간, 20시간, 18시간, 16시간, 14시간, 12시간, 10시간, 8시간, 6시간, 4시간, 3시간, 2시간, 1시간, 55분, 50분, 45분, 40분, 35분, 30분, 25분, 20분, 15분, 10분, 9분, 8분, 7분, 6분, 5분, 4분, 3분, 2분 및 1분을 포함하는 이전의 CD24 치료 전후 임의의 시점에서 투여될 수 있다.

실시예 1

마우스에서 CD24 약물 동역학

1mg의 CD24Fc(CD24Fc)를 나이브 C57BL/6 마우스에 주사하고, 각 시점에서 3마리의 마우스로 상이한 시점(5분, 1시간, 4시간, 24시간, 48시간, 7일, 14일 및 21일)에서 혈액 샘플을 수집하였다. 혈청을 1:100으로 희석하고, 포획 항체로서 정제된 항-인간 CD24(3.3㎍/ml) 및 검출 항체로서 페록시다아제 접합된 염소 항-인간 IgG Fc(5㎍/ml)를 사용하여 샌드위치 ELISA를 사용하여 CD24Fc의 수준을 검출하였다. 도 3a에 도시된 바와 같이, CD24Fc의 붕괴 곡선(decay curve)은 단백질의 전형적인 2 상 붕괴를 나타냈다. 첫 번째 생체 분포 단계는 12.4시간의 반감기를 가졌다. 두 번째 단계는 중앙 구획으로부터 1차 제거의 모델을 따른다. 두 번째의 반감기는 9.54일이었고, 이는 생체 내 항체의 반감기와 유사하다. 이들 데이터는 융합 단백질이 혈류에서 매우 안정하다는 것을 시사한다. 융합 단백질을 피하 주사한 다른 연구에서, 9.52일의 거의 동일한 반감기가 관찰되었다(도 3b). 더욱 중요하게는, CD24Fc가 혈액에서 피크 수준에 도달하는데 약 48시간이 걸렸지만, AUC에 의해 측정된 바와 같이, 혈액에서 융합 단백질의 총량은 어느 주사 경로에서도 실질적으로 동일하였다. 따라서, 치료적 관점에서, 상이한 주사 경로를 사용하는 것은 약물의 치료 효과에 영향을 미치지 않아야 한다. 이러한 관찰은 영장류 독성 및 임상 시험을 위한 실험 설계를 크게 단순화시켰다.

실시예 2

조직 손상에 대한 숙주 반응에서 CD24- 시글렉 10 상호작용

거의 20년 전에, Matzinger는 대중적으로 위험 이론으로 불리는 것을 제안하였다. 본질적으로, 그녀는 면역 시스템이 숙주에서 위험을 감지할 때 턴 온(turn on) 된다고 주장했다. 비록 위험의 본질은 당시에 잘 정의되지 않았지만, 손상-관련 분자 패턴에 대해, 괴사가 DAMP로 불리는, 열-충격 단백질 및 HMGB1과 같은 세포 내 성분의 방출과 관련이 있는 것으로 확인되었다. DAMP는 염증성 사이토카인 및 자가면역 질환의 생성을 촉진하는 것으로 밝혀졌다. 동물 모델에서, HMGB1 및 HSP90의 억제제는 RA를 개선시키는 것으로 밝혀졌다. DAMP의 관여는 DAMP에 대한 숙주 반응에 대한 음성 조절이 RA 치료에 대해 탐구될 수 있다는 전망을 높였다.

아세트아미노펜-유도된 간 괴사를 사용하여 염증을 보장함으로써, 시글렉 G 상호작용을 통해, CD24가 조직 손상에 대한 숙주 반응을 위한 강력한 음성 조절을 제공한다는 것이 관찰되었다. CD24는 조혈 세포 및 다른 조직 줄기세포에서 광범위하게 발현되는 GPI 고정 분자이다. 다발성 경화증, 전신 홍반성 루푸스, RA 및 거대 세포 관절염을 포함하는 인간의 다양한 자가면역 질환의 유전적 분석은 CD24 다형성 및 자가면역 질환의 위험 사이에 유의미한 연관성을 나타내었다. 시글렉 G는 시알산 함유 구조를 인식하는 능력에 의해 정의되는 I-렉틴 패밀리의 구성원이다. 시글렉 G는 CD24 상의 시알산 함유 구조를 인지하고 수지상 세포에 의한 염증성 사이토카인의 생성을 음성적으로 조절한다. CD24와 상호작용할 수 있는 능력에 있어서, 인간 시글렉 10 및 마우스 시글렉 G는 기능적으로 동등하다. 그러나 마우스와 인간 동족체 사이에 1 대 1 상관관계가 있는지는 불명확하다. 메커니즘은 완전히 밝혀져 있지만, 시글렉 G-관련 SHP1은 음성 조절에 관여할 가능성이 있다. 이들 데이터는 CD24-시글렉 G/10 상호작용이 DAMP로부터의 병원체-관련 분자 패턴(pathogen-associated molecular pattern)(PAMP) 식별에서 결정적인 역할을 할 수 있는 새로운 모델로 이어진다(도 4).

적어도 2개의 중첩 메커니즘은 CD24의 기능을 설명할 수 있다. 첫째, 다양한 DAMP에 결합함으로써, CD24는 염증성 자극을 포착하여 TLR 또는 RAGE와의 상호작용을 방지할 수 있다. 이 개념은 CD24가 HSP70, 90, HMGB1 및 뉴클레오린을 포함하는 여러 DAMP 분자와 관련된다는 관찰에 의해 뒷받침된다. 둘째로, 아마도 DAMP와 관련된 후, CD24는 시글렉 G에 의한 시그널링을 자극할 수 있다. 두 메커니즘 모두는 어느 쪽이든 더 강한 염증 반응이 장착된 유전자의 표적화된 돌연변이를 갖는 마우스로서 협력하여 작용할 수 있다. 사실상, CD24-/- 또는 시글렉 G-/- 마우스로부터 골수에서 배양된 DC는 HMGB1, HSP70 또는 HSP90으로 자극될 때 훨씬 더 높은 염증성 사이토카인을 생성하였다. 대조적으로, LPS 및 PolyI:C와 같은 PAMP에 대한 반응에서 어떠한 효과도 발견되지 않았다. 이들 데이터는 선천성 면역 시스템이 조직 손상으로부터 병원체를 구별하기 위한 메커니즘만을 제공했을 뿐만 아니라, 질환에 대한 잠재적 치료 표적으로서 CD24 및 시글렉 G는 조직 손상과 관련된다는 것을 시사한다.

실시예 3

CD24Fc는 HMGB1 , 시글렉 10과 상호작용하여 시글렉 G와 SHP -1 사이의 회합(association)을 유도한다

CD24Fc와 시글렉 10 사이의 상호작용을 측정하기 위해, CD24F는 CHIP 상에 고정화되었고, 상이한 농도의 시글렉-lOFc의 결합을 측정하기 위해 바이아코어(Biacore)를 사용하였다. 도 5a에 도시된 바와 같이, CD24Fc는 1.6x10^-7M의 Kd로 시글렉 10과 결합한다. 이는 대조군 Fc 보다 lOO-배 더 높은 친화성이다. CD24Fc와 HMGB1 사이의 상호작용은 CD24Fc-결합 단백질 G 비드를 사용한 풀 다운 실험에 이어 항-IgG 또는 항-HMGB1로 웨스턴 블롯에 의해 확인되었다. 이들 데이터는 Fc는 아니나 CD24Fc는 HMGB1에 결합하며, 이러한 결합은 양이온-의존적임을 입증한다(도 5b). CD24Fc가 시글렉 G의 작용제인지를 결정하기 위해, 인간 시글렉 10의 마우스 대응물, CD24-/-비장 세포를 CD24Fc, 대조군 Fc 또는 비히클(PBS) 대조군으로 30분 동안 자극하였다. 이어서, 시글렉 G를 면역 침강시키고, 항-인산-티로신 또는 항-SHP-1로 탐침 하였다. 도 5c에 도시된 바와 같이, CD24Fc는 시글렉 G의 상당한 인산화와, 적응성 및 선천성 면역 모두에 대해 잘 알려진 억제제인 SHP-1의 회합을 유도하였다.

CD24Fc의 시험관 내(in vitro) 효능 연구.

인간 T 세포에 의한 염증성 사이토카인의 생성에 대한 CD24Fc의 영향을 연구하기 위해, 인간 PBML에서의 성숙한 T 세포를 항-CD3 항체(OKT3), 즉, 상이한 농도의 CD24Fc 또는 인간 IgG1 Fc의 존재하에 T 세포 수용체의 통상적으로 사용되는 효능제에 의해 활성화 시켰다. 4일 후에, 상청액을 수집하고 IFN-γ 및 TNF-α의 생성을 효소-연결된 면역흡착분석(Enzyme-linked immunosorbent assay)(ELISA)에 의해 측정하여 활성화를 확인하였다. 도 6에서 그 결과는 2개의 상이한 제조 로트로부터의 CD24Fc는 대조군 IgG Fc 대조군과 비교하여 활성화된 인간 PBML로부터 IFN-γ 및 TNF-α 생성을 유의적으로 감소시킨다는 것이 입증되었다. 또한, CD24Fc를 첨가한 경우, 사이토카인 생성은 용량-의존적 방식으로 억제되었다. 따라서, CD24Fc는 시험관 내에서 항-CD3 유도된 인간 PBML 활성화를 억제할 수 있다. 이 연구는 CD24Fc의 작용 메커니즘이 T 세포 활성화의 억제를 통한 것일 수 있다는 것을 나타냈을뿐만 아니라, 약물 효능 및 안정성 시험에 대한 신뢰성 있는 생물학적 검정을 확립시켰다.

CD24Fc가 인간 세포주에서 염증성 사이토카인의 생성을 조절하는지 여부를 결정하기 위해, 인간 급성 단핵구 백혈병 THP1 세포주에서 CD24를 먼저 RNAi를 사용하여 침묵시킨 후, 이들을 PMA로 치료함으로써 대식세포 내로의 분화를 유도하였다. 도 7a에 도시된 바와 같이, CD24 침묵은 실질적으로 TNFα, IL-1β 및 IL-6의 생성을 증가시켰다. 이들 데이터는 염증성 사이토카인의 생성을 제한하는 내인성 인간 CD24에 대한 필수적인 역할을 입증한다. 중요하게는, CD24Fc는 CD24-침묵된 세포주에서 TNFα뿐만 아니라 IL-1β 및 IL-6의 억제를 복원했다(도 7b). 이들 데이터는 인간 세포의 염증 반응에서 CD24의 관련성을 증명할 뿐만 아니라, CD24Fc 의 생물학적 활성을 평가하기 위한 간단한 분석을 제공한다.

함께 취합하면, 이들 데이터는 CD24Fc가 적응성 및 선천적 자극에 의해 촉발된 사이토카인 생성을 억제할 수 있다는 것을 입증한다. 그러나 약물은 선천적 이펙터에 의한 사이토카인 생성을 감소시키는데 훨씬 더 효과적이기 때문에, 예방적 기능을 위한 주요 메커니즘은 이식 초기 단계에서 조직 손상에 의해 촉발된 염증의 방지인 것으로 간주 되었다.

실시예 4

CD24 및 SIV의 방지

CD24Fc는 SIV -감염된 붉은 털 원숭이를 보호한다. 감염 후 8, 8.5, 9.5, 30, 30.5 및 31주째에 비히클 대조군 또는 CD24Fc(12.5mg/kg)로 두 그룹의 SIV-감염된 중국 붉은 털 짧은 꼬리 원숭이(ChRMs)를 치료하였다(도 8A). (DAI) 감염 후 체중을 0일 및 그 후 56, 107, 155, 189, 209 및 223일째에 측정하였다. 56 DAI에 대한 중량 손실이 도 8B에 도시되어 있다. SIV-감염된 원숭이 중량에 대한 CD24Fc의 매우 유의미한 영향이 관찰되었다. 대조군에서, 10% 넘는 중량 손실률은 155, 189, 209 및 231 DAI에서 25%(1/4), 75%(3/4), 75%(3/4) 및 100%(4/4)이었다. 107 DAI에서, 대조군의 한 마리 원숭이는 15%(15.66%)를 넘는 중량 손실을 가졌고 119 DAI에서 사망했으며 2마리의 대조군 피험자는 25%(29.11% 및 43.68%)를 넘는 중량 손실을 가졌다. CD24Fc 치료된 그룹에서, 155, 189, 209 및 231 DAI 동안 10% 넘는 중량 손실을 갖는 원숭이의 빈도는 이들 날짜에 각각 0(0/6), 33.33%(2/6), 20%(1/5) 및 20%(1/5)이었다. 치료 시작시 가장 낮은 CD4+ T 수를 갖는 한 마리의 피험자는 207 DAI에서 사망했다. AIDS 소모성 증후군에 대한 기준으로 적어도 체중 10%의 손실을 사용하여, CD24Fc 치료는 AIDS 소모성 증후군(P=0.0l73)을 유의미하게 감소 시켰다(도 8C).

설사는 위장장애 및 기회 감염과 관련된 HIV-1/AIDS에서 다른 일반적인 증상이다. 원숭이의 건강 상태를 매일 체크 하여 기록하였다. 2일 동안 지속적인 설사가 관찰되었다면, 진단을 확인하고 원숭이를 페니실린으로 치료하였다. 치료 3일 후에 증상이 완화되지 않았을 경우, 세렉트린(selectrin)을 사용하고 페니실린의 용량을 증가시켰다. 1주일 치료 후에 증상이 지속되는 경우, 이는 난치성 설사로서 진단되었다. 도 8D에 도시된 바와 같이, 대조군에서, 3마리의 원숭이는 난치성 설사를 가졌고, 이들 중 한 마리는 2주 후에 난치성 설사로 사망했고, 나머지는 25%를 넘는 중량 손실을 가졌다. CD24Fc 그룹에 할당된 원숭이는 치료 전에 설사를 가졌으나 신속하게 회복되었다. 2마리의 원숭이는 CD24Fc 치료 후 4주째에 설사가 발생하였지만, 곧 회복되었다. 따라서, CD24Fc는 난치성 설사 발생으로부터 모든 원숭이를 보호하였다. 로그-랭크(log-rank) 시험을 사용하여, CD24Fc와 대조군 사이에서 설사율의 통계학적으로 유의미한 차이가 발견되었다(P=0.0046). 소모성 증후군 및 난치성 설사는 AIDS에서 가장 일반적인 증후군이기 때문에, 증상의 어느 하나 또는 둘 모두를 갖는 피험자는 AIDS에 굴복한 것으로 간주되었다. 카플란 마이어 분석(Kaplan Meier analysis)을 사용하여, CD24Fc에 의한 AIDS에 대한 통계적으로 유의미한 보호가 발견되었다(P=0.0ll2)(도 8E).

CD24Fc는 PBMC , 골수 및 소화관에서 혈장 바이러스 부하의 증가 및 프로바이러스 부하를 감소시킨다. 바이러스 복제에 대한 CD24Fc의 효과를 평가하기 위해, 혈장에서의 바이러스 부하 및 조직에서의 프로바이러스 부하를 검출하였다. SIV 감염은 혈장 바이러스 부하의 급속한 상승에 이어 신속하게 뒤따르는 가장 낮은 수준으로 떨어지는 바이러스 부하에 의해 특징지어진다. 바이러스 복제 후 염증 약화의 영향을 연구하기 위한 목표가 주로 대조군하에 있었기 때문에, 바이러스 역가가 최저 수준에 있을 때, 감염 후 8주째에 치료를 개시하였다. 예상한 바와 같이, 혈장 바이러스 부하는 대조군에서 점진적으로 증가하였다. 놀랍게도, 바이러스 부하에서 매우 적은 증가가 CD24Fc 치료된 그룹에서 관찰되었으며, 이는 전-치료 수준과 비교할 때 26 및 30주째에서 바이러스 부하에서의 현저한 감소를 초래한다(도 9A). 감염 후 8주째와 비교할 때(1.0으로 정규화), 대조군(32.68±13.45)(P=0.00l; 도 9B)에서 관찰된 것보다 상당히 낮은 감염 후 30주째에 CD24Fc 치료군(8.79±4.54)에서의 바이러스 부하의 최대 증가가 관찰되었다. 또한, CD24Fc는 시험된 모든 시점에서 PBMC에서 감소된 프로바이러스 부하를 갖는 것으로 나타났지만(도 9C), 이 감소는 통계적으로 유의미하지 않다. 조직 프로바이러스 부하가 비교되는 경우, CD24Fc 치료 그룹은 주요 바이러스 저장소인 것으로 알려진 골수(P=0.0004)에서 상당히 더 낮은 수준을 가졌다(도 9D).

CD24Fc는 장관(intestinal track)에서 염증을 감소시킬 수 있다. 염증에 대한 CD24Fc의 효과는 SIV-감염된 원숭이에서 염증 인자의 발현을 사용하여 평가하였다. 예상외로, CD24Fc는 종방향 분석에서 PBMCs에서 IFN-α, TNF-α, IL-6, IFN-γ, IDO 및 IL-1β 발현에 영향을 미치지 않았다. 따라서, 염증성 사이토카인의 전신 감소는 CD24Fc의 치료 효과를 설명 못 할 수 있다. 내부 기관의 염증 반응에 대한 CD24Fc의 영향을 다루기 위해, SIV 감염 후 30주째(30, 30.5 및 31주째에 12.5mg/kgx3)에서 CD24Fc 치료의 또 다른 라운드를 개시하고, 감염 후 32주째에 원숭이를 안락사시켜 장관에서 염증성 사이토카인의 전사체 및 병리 상태를 분석하였다. IFN-α, TNF-α, IL-6, IFN-γ, IDO 또는 IL-1β 발현에 대한 CD24Fc의 효과는 비장, 골수, 장간막 LN, 서혜부(inguinal) LN 또는 회장 LCs에서 관찰되지 않았다(데이터는 나타내지 않음). 그러나, CD24Fc 치료는 직장에서 TNF-α, IFN-γ, IDO 및 IL-1β의 발현을 약화시켰다(도 10A). 이들 결과는 CD24Fc 치료가 소화관 염증을 선택적으로 억압할 수 있다는 것을 내포한다. 이러한 데이터를 확증하기 위해, 회장, 결장 및 직장에서 MPO 발현의 면역 형광 염색을 통해 과립구 침윤을 분석하였다. 비록 MPO 양성 세포가 대조군 또는 CD24Fc 치료 그룹으로부터의 개체의 모든 절편에서 검출되었지만, CD24Fc 치료된 그룹은 대조군보다 직장 및 결장에서 상당한 더 적은 수의 MPO+ 세포를 가졌다(도 10B).

염증성 세포 침윤, 상피 변화 및 점막 구조는 소화관 병리학에 대한 3가지 주요 카테고리로서 정의되었다[83][Geboes et al., 2000]. 일반적으로, 백혈구 밀도 및 백혈구 침윤의 확장은 염증성 세포 침윤에 대한 2가지 기준이다. 상피 변화는 음와(crypt) 상피 세포 비대증, 배상 세포(goblet cell)의 손실뿐만 아니라 음와염(cryptitis) 및 음와 농염(crypt abscess)을 포함한다. 점막 구조는 궤양, 불규칙적인 음와 또는 과립화 조직의 존재에 기초하여 등급을 매겼다. 장관으로부터의 절편의 조직병리학적 분석을 수행하고, 절편을 이중 맹검 방식으로 스코어링 하였다. H&E 염색의 대표적인 이미지가 도 10C에 도시되어 있으며, 요약 스코어는 도 10D에 제시되어 있다. 소장, 결장 및 직장의 조직학적 검사는 온전한 상피 벽의 파괴, 회장 절편의 내강으로의 선상 상피 세포의 분리(도 l0Ca), 결장 절편에서의 마킹된 호중구, 대식세포 및 호산구(eosinophil) 침윤을 가지는 상피 간 또는 상피 내 농양 형성(도 lOCb), 근육혈관 주위 림프구성 침윤(도 10Cd) 및 직장 절편에서 간질성 부종(도 lOCe)을 나타내었다. 병리학적 변화는 대조군 SIV-감염된 그룹에서 심각한 염증을 입증하였다. 대조적으로, CD24Fc 치료된 그룹은 회장에서 온화한 상피 분리만을 나타내었다(도 lOCf). 결장 절편에서 음와염 또는 음와 농염은 CD24Fc 처리된 그룹으로부터 존재하지 않았지만, 음와성 비대증이 존재하였다(도 lOCg). 직장 근육층 및 최소 간질 부종(도 10Ci)에서 최소 림프구 침윤이 있었다. 병리 스코어를 종합할 때, CD24Fc는 SIV-감염된 원숭이에서 소화관 염증을 극적으로 감소시킨다는 것이 명백하다.

결론적으로, 이들 데이터는 CD24Fc가 대장 염증, 면역 활성화를 감소시킬 수 있으며 SIV 특이적 CD4+ T 세포 반응 및 T 세포 증식을 조절할 수 있으며, CD24Fc 투여는 SIV 감염된 동물에 유익할 수 있음을 시사한다. 또한, 이 연구는 HIV-1 감염의 발병기전에서 DAMPs의 중요성을 강조하고, DAMPs에 의해 촉발된 선천성 면역 반응 차단이 HIV-1/AIDS의 제어/치료를 위한 면역 치료 전략이고, CD24Fc가 AIDS 치료를 위한 잠재적인 치료제라는 것을 입증한다.

실시예 5

인간화 마우스에서 HIV 감염의 CD24 치료

CD24Fc 치료는 HIV-1 바이러스 부하를 감소시키고, 급성 HIV 감염을 가지는 마우스의 비장에서의 고갈로부터 CD4+ T 세포를 보호한다. 먼저, CD24Fc 치료가 인간화 마우스로 급성 HIV-1 감염에서의 HIV-1 복제 및 면역-발병기전에 영향을 미치는지를 조사하였다. 도 11A에 도시된 바와 같이, 비히클-치료된 그룹에서, R3A 복제는 감염 후 1주(week post-infection)(wpi)에서 lxl0⁶ copies/ml로 신속하게 증가 되었고, 이후 2-3 wpi에서 10⁸ copies/ml로 점진적으로 증가 되었다. CD24Fc 치료된 그룹에서, 첫 번째 주에서의 R3A 증가는 영향을 받지 않았다. 그러나 2 및 3 wpi에서 더 이상의 증가는 관찰되지 않았다. 그럼에도 불구하고, CD24Fc 치료는 CD3⁺ T 세포 중에서 CD4 T 세포 빈도의 감소를 중단시키지 못했다(도 11B). 특히, CD24Fc 치료는 3 wpi에서 마우스의 종결에 비장에서 CD4⁺ T 세포의 수를 상당히 증가시켰다(도 11C). 이러한 CD4⁺ T 세포 수의 증가는 인간화 마우스의 비장에서 총 인간 림프구의 증가에 상응한다(도 11D). 이들 데이터는 CD24Fc가 HIV-1 바이러스 부하를 감소시키고 급성 HIV 감염을 가지는 인간화 마우스의 비장에서의 고갈로부터 CD4⁺ T 세포를 보호하는 잠재력을 갖는다는 것을 나타낸다.

CD24Fc 치료는 만성 HIV 감염을 가지는 인간화 마우스에서 HIV-1 복제를 감소시켰다. 다음으로, CD24Fc 치료가 JR-CSF 감염 후 인간화 마우스에서 만성 HIV-1 복제에 영향을 미치는지를 조사하였다. 이들 마우스에서의 혈장 HIV-1 부하는 연속적으로 검출되었고, HIV-1 감염의 개시 이후로 HIV-1 부하가 혈장에서 지속적으로 증가되었음을 발견하였다. 예상된 바와 같이, 복합 항레트로바이러스 치료(cART)는 혈장 HIV-1 부하를 검출 불가능한 수준으로 완전히 억제하였다. CD24Fc 치료는 혈장 HIV-1 부하의 증가를 제한할 수 있었고, 따라서 HIV-1 감염된 마우스와 비교하여 치료된 마우스에서 HIV-1 부하의 상당히 낮은 수준을 유도하였다(도 12A). 마우스가 종결되었을 때, CD4+ T 세포에 의한 p24 발현은 다양한 림프 조직에서 추가로 검출되었다(도 12B). CD24Fc 치료는 p24-발현 세포의 백분율을 5배 넘게 감소시키는 것으로 관찰되었다. 또한, 예상한 바와 같이, cART는 훨씬 더 효과적이었고, 10- 내지 20-배 감소를 유발한다(도 12B). 그룹당 6-7 마우스를 포함하는 연구로부터의 조합한 데이터는 비장 및 림프절에서 p24-발현 세포의 현저한 감소를 추가로 확인하였다(도 12C). 이들 데이터는 CD24Fc 치료가 인간화 마우스에서 만성 HIV-1 복제를 억제하는 것으로 나타났다.

CD24Fc 치료는 만성 HIV-1 감염을 가지는 인간화 마우스에서 나이브 T-세포 구획을 보충하였다. CD4 T 세포 서브세트에 대한 CD24Fc 치료의 효과는 나이브 T 세포에 대한 마커로서 CCR7 및 CD45RA를 사용하여 HIV-1 감염을 가지는 인간화 마우스에서 시험하였다(도 13A). 대조군 Ig-치료된 마우스에서, HIV-1 감염은 CD45RA⁺CCR7⁺ 나이브 T 세포의 비율을 상당히 감소시키고 CD4 및 CD8 T 세포 모두에서 CD45RA-CCR7-이펙터 메모리 T 세포 서브세트의 비율을 증가시켰다. 중요한 것은, CD24Fc 치료가 HIV-1 감염을 가지는 인간화 마우스의 비장에서 CD4 및 CD8 T 세포 서브세트의 편위(skew)를 현저하게 역전시켰다. 놀랍게도, CD24Fc는 만성적으로 감염된 마우스에서 나이브 T 세포의 병원성 손실을 예방하는 데 있어서 cART와 거의 같이 효과적이었다(도 13B).

CD24Fc 치료는 만성 HIV-1 감염을 가지는 인간화 마우스에서 생체 내에서의 면역 과다-활성화를 감소시켰다. CD24Fc 치료가 HIV-1-유도된 면역 발병기전을 구하는 잠재력을 갖는지를 추가로 조사하였다. 면역 과다-활성화는 만성 HIV-1 감염을 가지는 인간에서 질병 진행의 전형적인 특징(hall mark)인 것으로 입증되었다. 따라서, CD4 및 CD8 T 세포의 활성화는 다양한 림프 조직에서 검출되었다(도 14A). HIV-1-감염된 환자와 유사하게, HIV-1 감염은 모의 마우스와 비교하여 인간화 마우스의 림프절, 비장 및 골수에서 CD38+HLA-DR+ CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포의 비율을 상당히 증가시켰다. cART는 예상한 바와 같이, HIV-1 감염을 가지는 이들 마우스에서 시험 된 모든 림프 조직에서 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 활성화를 거의 정상 수준으로 크게 감소시켰다. 중요하게는, CD24Fc 치료는 HIV-1 감염 동안 림프절에서 CD4+ T 세포의 활성화를 상당히 감소시키고, 림프절 및 비장으로부터 CD8+ T 세포를 활성화 시켰다(도 14B). 이들 데이터는 CD24Fc가 지속적인 HIV-1 감염에 의해 유도된 면역 과다-활성화 및 염증을 제한할 가능성을 갖는다는 것을 보여준다.

CD24Fc 치료는 시험관 내 및 생체 내에서 HIV-1 유도된 전-염증성 사이토카인 생성을 차단한다. CD24Fc가 전-염증성 사이토카인을 감소시킬 수 있는지를 시험하였다. 도 15A에 도시된 바와 같이, 시험관 내에서, R3A 감염은 전-염증성 사이토카인 IL-1β 단백질을 유도하였으며, 이 유도는 CD24Fc에 의해 크게 차단 되었다(도 15A). 마찬가지로, CD24Fc는 IL6 및 Pro-IL-1β mRNA를 또한, 상당히 감소 시켰다(도 15B). 급성 HIV-1 감염에서 T 세포 활성화 및 전-염증성 사이토카인에 대한 CD24Fc 치료의 효과를, 도 15C에 다이어그램 된 바와 같이, 추가로 시험하였다. 중요하게는, CD24Fc 치료는 혈장 IL-6, IL-8, IFN-γ 및 IL-17a(도 15D)를 유의적으로 억제하였다(도 15D).

CD24Fc 치료는 지속적인 HIV-1 감염에 의해 유도된 조혈 억제를 구한다. 마지막으로, HIV-1 감염 동안 BM 조혈 억제에 대한 CD24Fc 치료의 효과를 평가하였다. Lin-CD34+ 세포를 과립구/대식세포(GM), 적혈구(E) 및 과립구/적혈구/대식세포/거핵구(GEMM) 서브세트를 포함하는, 콜로니-형성 분석을 위해 정제하였다. 그 결과, CD24Fc 치료는 또한 HIV-1 감염 단독과 비교하여, 개별적으로 각각의 콜로니 유형뿐만 아니라 전체 집단의 CFU 활성을 상당히 향상시킨다는 것을 입증 한다(도 16).

실시예 6

인간에서 CD24 약물 동역학

이 실시예는 인간에서 CD24 단백질의 약물 동역학의 분석을 나타낸다. 이는 건강한 남성 및 여성 성인 피험자에서 CD24Fc의 안전성, 내성 및 PK를 평가하기 위한 1 상, 무작위, 이중-맹검, 위약-제어, 단일 상승 용량 연구로부터 도출되었다. 8명의 피험자의 5개의 코호트에서 총 40명의 피험자를 이 연구에 등록하였다. 각 코호트에서 8명의 피험자 중 6명은 연구 약물을, 2명의 피험자는 위약(0.9% 염화나트륨, 식염수)을 받았다. 첫 번째 코호트는 10mg으로 투여되었다. 후속 코호트는 30mg, 60mg, 120mg 및 240mg의 CD24Fc 또는 매칭 위약을 투여받았고, 각각의 이전 코호트에 대한 안전성 및 내성 데이터를 검토할 수 있도록 적어도 3주 간격을 두고 투여되었다. 적절한 안전성 및 내성이 입증된 경우에만, 새로운 코호트의 피험자에게 다음 더 높은 용량을 투여하는 것이 허용되었다.

각 코호트에서, 초기 2명의 피험자는 1일째에 1 연구 약물 수용자 1명 및 1 위약 수용자 1명 이였다. 제3 내지 제5 및 제6 내지 제8 피험자는 7일 후에 투여하였다(서브그룹 사이에 최소 24시간 간격). 각 피험자는 동일한 서브그룹에서 적어도 1시간 간격을 두고 투여되었다. 필요한 경우, 피험자의 나머지의 투약은 그 코호트에서 제1 또는 제2 서브그룹과 관련된 투여-후 기간 동안 발생할 수 있는 임의의 중대한 안전성 문제를 검토하는 동안 지연되었다. 후속 코호트는 이전 코호트 후 적어도 3주에 투여되었다.

스크리닝 기간:

스크리닝 방문(방문 1)은 활성 치료 기간의 시작 전 21일까지 발생하였다. 사전 동의를 제공한 후, 피험자는 적격성에 대한 스크리닝 절차를 거쳤다.

처리 기간:

피험자를 -1일째(방문 2)에 임상 약리학 유닛 (CPU)에 입원시켰고, 무작위 치료 기간은 최소 10시간 밤새 금식 후 1일째에 시작하였다. 피험자를 단일 용량으로서 CD24Fc 또는 위약으로의 치료에 무작위로 할당하였다. 피험자는 4일째 아침까지 갇혀 있었다.

후속 조치:

모든 피험자는 후속 방문(방문 3, 방문 4, 방문 5, 방문 6 및 방문 7)을 위해 7일, 14일, 21일, 28일 및 42일(±1일)에 CPU로 돌아왔다. 방문 7은 모든 피험자에 대한 최종 방문이었다.

치료 기간: 각 피험자에 대해 총 연구 기간은 최대 63일이었다. 1일째에 단일-용량 투여가 발생했다.

피험자 수:

계획: 40명 피험자

스크리닝: 224명 피험자

무작위: 40명 피험자

완료: 39명 피험자

중단: 1명 피험자

포함을 위한 진단 및 주요 기준: 이 연구를 위한 집단은 18kg/m² 내지 30kg/m²까지의 체질량 지수를 가지는 18 내지 55세까지의 건강한 남성과 여성이었다.

조사 제품 및 비교기 정보:

CD24Fc: IV 주입을 통해 투여되는 10mg, 30mg, 60mg, 120mg 또는 240mg의 단일 용량; 로트 번호: 09MM-036. CD24Fc는 인간 CD24의 성숙 서열 및 인간 면역 글로불린 G1(IgG1Fc)의 결정화 가능한 영역으로 이루어진 완전 인간화된 융합 단백질이었다. CD24Fc는 IV 투여를 위해 무균, 투명, 무색, 방부제가 없는 수용액으로서 공급되었다. CD24Fc를 10mg/mL의 농도 및 pH 7.2의 단일 용량 주사 용액으로 제제화하였다. 각각의 CD24Fc 바이알은 16mgL±0.2mL의 CD24Fc에 160mg의 CD24Fc, 5.3mg의 염화나트륨, 32.6mg의 인산나트륨 이염기성 칠수화물 및 140mg의 인산나트륨 일염기성 일수화물을 함유하였다. CD24Fc를 클로로부틸 고무마개 및 알루미늄 플립-오프 씰과 함께 투명한 붕규산 유리 바이알에 공급하였다.

IV 주입을 통해 투여되는 매칭 위약(0.9% 염화나트륨, 식염수); 로트 번호: P296855, P311852, P300715, P315952.

치료 의도(intent-to-treat)(ITT) 집단은 적어도 1회 용량의 연구 약물을 받은 모든 피험자로 구성되었다. ITT 집단은 피험자 정보 및 안전성 평가를 위한 주요 분석 집단이었다.

임상 실험실 평가(화학, 혈액학 및 소변 검사)는 치료 및 방문에 의해 요약되었다. 기준선(baseline)으로부터의 변화도 요약되었다. 활력 징후(혈압, 심박수, 호흡 수 및 온도)를 치료 및 시점으로 요약하였다. 기준선으로부터의 변화도 요약되었다. 모든 신체검사 데이터가 나열되었다. 심전도 매개변수 및 기준선으로부터의 변화가 요약되었다. 전반적인 해석이 나열되었다.

혈장 CD24Fc 농도

도 17에 도시된 바와 같이, CD24Fc의 평균 혈장 농도는 투여된 CD24Fc의 용량에 비례하여 증가하였다. 120mg을 제외한 모든 용량 그룹에 대해, CD24Fc의 최대 평균 혈장 농도는 투여-후 1시간에 도달하였다. 120mg 그룹에 대한 CD24Fc의 최대 평균 혈장 농도는 투여-후 2시간에 도달하였다. 42일째(984시간)까지, 모든 그룹에 대한 CD24Fc의 평균 혈장 농도는 최대 평균 혈장 농도의 2% 내지 4%로 감소하였다.

표 1은 PK 평가 가능한 집단에 대해 치료에 의한 혈장 CD24Fc PK 매개 변수를 요약한 것이다.

[표 1] 치료에 의한 혈장 CD24Fc 약물 동역학 매개 변수의 요약 - PK 평가 가능 집단

혈장 CD24Fc 용량 비례 분석

도 18은 PK 평가 가능한 집단에 대한 CD24Fc C_max 대 용량의 용량 비례 플롯을 나타낸다. 도 19는 PK 평가 가능한 집단에 대한 CD24Fc AUC_{0 -42d} 대 용량의 용량 비례 플롯을 나타낸다. 도 20은 PK 평가 가능한 집단에 대한 CD24Fc AUC_{0 - inf} 대 용량의 용량 비례 플롯을 나타낸다. 표 2는 용량 비례의 파워 분석을 보여준다.

C_max 기울기 추정치는 90% CI가 1.105 내지 1.210인 1.172이었다. AUC_{0 -42d} 기울기 추정치는 90% CI가 1.027 내지 1.148인 1.088이었다. AUC_{0 - inf} 기울기 추정치는 90% CI가 1.026 내지 1.1인 1.087이었다.

약물 동역학적 결론

혈장 CD24Fc의 C_max 및 AUC는 마우스, 원숭이 및 인간에서 투여된 용량에 비례하여 증가하였다. 혈장 CD24Fc는 1.01과 1.34시간 사이에 T_max에 도달했다. 혈장 CD24Fc의 t_1/2는 280.83 내지 327.10시간 범위였다.

실시예 7

CD24는 이식 대 숙주 질환을 치료하는데 사용될 수 있다

이 실시예는 CD24가 이식된 세포의 이식편 대 숙주(graft versus host)(GVL) 효과에 영향을 주지 않으면서, 세포 DAMPs에 대한 숙주 반응을 음성적으로 조절하는 것에 의해 GvHD를 치료 또는 예방할 수 있음을 입증한다. NK 세포는 동종이계 HSCT에 따라 이식편-대-백혈병을 매개하고 이식을 향상시킬 수 있지만, HSCT에 따라 NK 세포를 자연적으로 재구성하는 것에 의해 매개되는 이식편-대-백혈병의 효능은 제한된다. 전임상 연구는 NK 세포의 활성화가 활성화 수용체 발현을 상향조절하고 사멸 능력을 증강 시킨다는 것을 입증한다(Shah et al 2015). 이어서, 이는 초고-위험 고형 종양을 갖는 어린이 및 청년에서 HLA-매칭된, T-세포-고갈된 비골수성 말초 혈액 줄기세포 이식에 따른 공여자-유도된 활성화된 NK 세포(aNK-DLI)의 입양 전달을 연구하는 임상 시험에서 시험 되었다. aNK-DLI는 강력한 사멸 능력을 입증하였고, 높은 수준의 활성화 수용체 발현을 나타내었다. 그러나 9명의 이식 수용자 중 5명은, 3명의 피험자에서 관찰되는 등급 4 GVHD를 갖는, aNK-DLI에 따른 급성 이식편-대-숙주 질환(GVHD)을 경험하였다. GVHD는 매칭된 비친척 공여자 대 매칭된 형제 공여자 수용체에서 더욱 일반적이며, 더 높은 공여자 CD3 키메리즘(chimerism)과 관련되었다. T-세포 용량이 이 설정에서 GVHD에 대해 요구되는 임계치 미만이었던 것을 고려하면, aNK-DLI가 근원적인 T-세포 동종이식편반응을 증강 시키는 것에 의해 가능성이 있는, 관찰된 급성 GVHD에 기여했었다는 것으로 결론지었다. 따라서, 본원에 기재된 CD24 단백질은 동물에서 GvHD를 치료 또는 예방하는데 사용될 수 있다.

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University of North Carolina at Chapel Hill Institute of Biophysics, Chinese Academy of Sciences Kunming Institute of Zoology, Chinese Academy of Sciences Liu, Yang Zheng, Pan Su, Lishan Zheng, Yong-Tang Zhang, Liguo <120> METHODS OF USE OF SOLUBLE CD24 FOR TREATING ACQUIRED IMMUNE DEFICIENCY SYNDROME (HIV/AIDS) <130> 060275.0504.01PC00 <150> 62/638,772 <151> 2018-03-05 <160> 12 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 31 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> VARIANT <222> (31)...(31) <223> Valine or Alanine <400> 1 Ser Glu Thr Thr Thr Gly Thr Ser Ser Asn Ser Ser Gln Ser Thr Ser 1 5 10 15 Asn Ser Gly Leu Ala Pro Asn Pro Thr Asn Ala Thr Thr Lys Xaa 20 25 30 <210> 2 <211> 30 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Ser Glu Thr Thr Thr Gly Thr Ser Ser Asn Ser Ser Gln Ser Thr Ser 1 5 10 15 Asn Ser Gly Leu Ala Pro Asn Pro Thr Asn Ala Thr Thr Lys 20 25 30 <210> 3 <211> 27 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 3 Asn Gln Thr Ser Val Ala Pro Phe Pro Gly Asn Gln Asn Ile Ser Ala 1 5 10 15 Ser Pro Asn Pro Thr Asn Ala Thr Thr Arg Gly 20 25 <210> 4 <211> 26 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Met Gly Arg Ala Met Val Ala Arg Leu Gly Leu Gly Leu Leu Leu Leu 1 5 10 15 Ala Leu Leu Leu Pro Thr Gln Ile Tyr Ser 20 25 <210> 5 <211> 287 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Fusion protein <400> 5 Met Gly Arg Ala Met Val Ala Arg Leu Gly Leu Gly Leu Leu Leu Leu 1 5 10 15 Ala Leu Leu Leu Pro Thr Gln Ile Tyr Ser Ser Glu Thr Thr Thr Gly 20 25 30 Thr Ser Ser Asn Ser Ser Gln Ser Thr Ser Asn Ser Gly Leu Ala Pro 35 40 45 Asn Pro Thr Asn Ala Thr Thr Lys Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His 50 55 60 Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val 65 70 75 80 Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr 85 90 95 Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu 100 105 110 Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 115 120 125 Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser 130 135 140 Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 145 150 155 160 Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile 165 170 175 Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro 180 185 190 Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu 195 200 205 Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 210 215 220 Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser 225 230 235 240 Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg 245 250 255 Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu 260 265 270 His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 275 280 285 <210> 6 <211> 261 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Fusion protein <400> 6 Ser Glu Thr Thr Thr Gly Thr Ser Ser Asn Ser Ser Gln Ser Thr Ser 1 5 10 15 Asn Ser Gly Leu Ala Pro Asn Pro Thr Asn Ala Thr Thr Lys Pro Lys 20 25 30 Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu 35 40 45 Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr 50 55 60 Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val 65 70 75 80 Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val 85 90 95 Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser 100 105 110 Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu 115 120 125 Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala 130 135 140 Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro 145 150 155 160 Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln 165 170 175 Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala 180 185 190 Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr 195 200 205 Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu 210 215 220 Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser 225 230 235 240 Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser 245 250 255 Leu Ser Pro Gly Lys 260 <210> 7 <211> 231 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 1 5 10 15 Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 20 25 30 Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 35 40 45 Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp 50 55 60 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr 65 70 75 80 Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 85 90 95 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu 100 105 110 Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 115 120 125 Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys 130 135 140 Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 145 150 155 160 Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 165 170 175 Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 180 185 190 Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser 195 200 205 Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 210 215 220 Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 225 230 <210> 8 <211> 288 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Fusion protein <400> 8 Met Gly Arg Ala Met Val Ala Arg Leu Gly Leu Gly Leu Leu Leu Leu 1 5 10 15 Ala Leu Leu Leu Pro Thr Gln Ile Tyr Ser Ser Glu Thr Thr Thr Gly 20 25 30 Thr Ser Ser Asn Ser Ser Gln Ser Thr Ser Asn Ser Gly Leu Ala Pro 35 40 45 Asn Pro Thr Asn Ala Thr Thr Lys Val Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr 50 55 60 His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser 65 70 75 80 Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg 85 90 95 Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro 100 105 110 Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala 115 120 125 Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val 130 135 140 Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 145 150 155 160 Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr 165 170 175 Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu 180 185 190 Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys 195 200 205 Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser 210 215 220 Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp 225 230 235 240 Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser 245 250 255 Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 260 265 270 Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 275 280 285 <210> 9 <211> 288 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Fusion protein <400> 9 Met Gly Arg Ala Met Val Ala Arg Leu Gly Leu Gly Leu Leu Leu Leu 1 5 10 15 Ala Leu Leu Leu Pro Thr Gln Ile Tyr Ser Ser Glu Thr Thr Thr Gly 20 25 30 Thr Ser Ser Asn Ser Ser Gln Ser Thr Ser Asn Ser Gly Leu Ala Pro 35 40 45 Asn Pro Thr Asn Ala Thr Thr Lys Ala Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr 50 55 60 His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser 65 70 75 80 Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg 85 90 95 Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro 100 105 110 Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala 115 120 125 Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val 130 135 140 Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 145 150 155 160 Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr 165 170 175 Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu 180 185 190 Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys 195 200 205 Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser 210 215 220 Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp 225 230 235 240 Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser 245 250 255 Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 260 265 270 Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 275 280 285 <210> 10 <211> 29 <212> PRT <213> Macaca fascicularis <400> 10 Thr Val Thr Thr Ser Ala Pro Leu Ser Ser Asn Ser Pro Gln Asn Thr 1 5 10 15 Ser Thr Thr Pro Asn Pro Ala Asn Thr Thr Thr Lys Ala 20 25 <210> 11 <211> 262 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Fusion protein <400> 11 Ser Glu Thr Thr Thr Gly Thr Ser Ser Asn Ser Ser Gln Ser Thr Ser 1 5 10 15 Asn Ser Gly Leu Ala Pro Asn Pro Thr Asn Ala Thr Thr Lys Val Pro 20 25 30 Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu 35 40 45 Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp 50 55 60 Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp 65 70 75 80 Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly 85 90 95 Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn 100 105 110 Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp 115 120 125 Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro 130 135 140 Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu 145 150 155 160 Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn 165 170 175 Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile 180 185 190 Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr 195 200 205 Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys 210 215 220 Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys 225 230 235 240 Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu 245 250 255 Ser Leu Ser Pro Gly Lys 260 <210> 12 <211> 262 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Fusion protein <400> 12 Ser Glu Thr Thr Thr Gly Thr Ser Ser Asn Ser Ser Gln Ser Thr Ser 1 5 10 15 Asn Ser Gly Leu Ala Pro Asn Pro Thr Asn Ala Thr Thr Lys Ala Pro 20 25 30 Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu 35 40 45 Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp 50 55 60 Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp 65 70 75 80 Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly 85 90 95 Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn 100 105 110 Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp 115 120 125 Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro 130 135 140 Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu 145 150 155 160 Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn 165 170 175 Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile 180 185 190 Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr 195 200 205 Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys 210 215 220 Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys 225 230 235 240 Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu 245 250 255 Ser Leu Ser Pro Gly Lys 260

Claims (30)

1. CD24 단백질을 이를 필요로 하는 피험자에게 투여하는 것을 포함하는, 후천성 면역 결핍 증후군(HIV/AIDS)을 치료하는 방법.
2. 제1 항에 있어서,
   상기 CD24 단백질은 성숙한 인간 CD24 폴리펩타이드 또는 이의 변이체를 포함하는, 방법.
3. 제2 항에 있어서,
   상기 성숙한 인간 CD24 폴리펩타이드는 서열 식별 번호 1 또는 2에 표시된 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
4. 제2 항에 있어서,
   상기 CD24 단백질은 단백질 태그를 더 포함하며, 상기 단백질 태그는 상기 CD24 단백질의 N-말단 또는 C-말단에 융합되는, 방법.
5. 제4 항에 있어서,
   상기 단백질 태그는 포유동물 면역글로불린(Ig) 단백질의 Fc 영역을 포함하는, 방법.
6. 제5 항에 있어서,
   상기 Ig 단백질이 인간인, 방법.
7. 제6 항에 있어서,
   상기 Fc 영역은 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 또는 IgA의 힌지 영역 및 CH2 및 CH3 도메인을 포함하는, 방법.
8. 제6 항에 있어서,
   상기 Fc 영역은 IgM의 힌지 영역 및 CH2, CH3 및 CH4 도메인을 포함하는, 방법.
9. 제7 항에 있어서,
   상기 CD24 단백질은 서열 식별 번호 6, 11 또는 12에 표시된 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
10. 제9 항에 있어서,
    상기 CD24 단백질의 아미노산 서열이 서열 식별 번호 6, 11 또는 12에 표시된 서열로 구성되는, 방법.
11. 제1 항 내지 제10 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 CD24 단백질은 진핵 단백질 발현 시스템을 사용하여 생산되는, 방법.
12. 제11 항에 있어서,
    상기 발현 시스템이 중국 햄스터 난소 세포주 또는 복제-결함 레트로바이러스 벡터에 포함된 벡터를 포함하는, 방법.
13. 제12 항에 있어서,
    상기 복제-결함 레트로바이러스 벡터는 진핵 세포의 게놈 내로 안정적으로 통합되는, 방법.
14. 제1 항 내지 제13 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 CD24 단백질은 가용성인, 방법.
15. 제1 항 내지 제14 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 CD24 단백질은 글리코실화되는, 방법.
16. 피험자에서 HIV-1/AIDS를 치료하기 위한 약물의 제조에서 CD24 단백질의 용도.
17. 제16 항에 있어서,
    상기 CD24 단백질은 성숙한 인간 CD24 폴리펩타이드 또는 이의 변이체를 포함하는, 용도.
18. 제17 항에 있어서,
    상기 성숙한 인간 CD24 폴리펩타이드는 서열 식별 번호 1 또는 2에 표시된 아미노산 서열을 포함하는, 용도.
19. 제18 항에 있어서,
    상기 CD24 단백질은 단백질 태그를 더 포함하며, 상기 단백질 태그는 상기 CD24 단백질의 N-말단 또는 C-말단에 융합되는, 용도.
20. 제19 항에 있어서,
    상기 단백질 태그는 포유동물 면역글로불린(Ig) 단백질의 Fc 영역을 포함하는, 용도.
21. 제20 항에 있어서,
    상기 Ig 단백질은 인간인, 용도.
22. 제21 항에 있어서,
    상기 Fc 영역은 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 또는 IgA의 힌지 영역 및 CH2 및 CH3 도메인을 포함하는, 용도.
23. 제21 항에 있어서,
    상기 Fc 영역은 IgM의 힌지 영역 및 CH2, CH3 및 CH4 도메인을 포함하는, 용도.
24. 제22 항에 있어서,
    상기 CD24 단백질은 서열 식별 번호 6, 11 또는 12에 표시된 아미노산 서열을 포함하는, 용도.
25. 제24 항에 있어서,
    상기 CD24 단백질의 아미노산 서열은 서열 식별 번호 6, 11 또는 12에 표시된 서열로 구성되는, 용도.
26. 제16 항 내지 제25 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 CD24 단백질은 진핵 단백질 발현 시스템을 사용하여 생산되는, 용도.
27. 제26 항에 있어서,
    상기 발현 시스템이 중국 햄스터 난소 세포주 또는 복제-결함 레트로바이러스 벡터에 포함된 벡터를 포함하는, 용도.
28. 제27 항에 있어서,
    상기 복제-결함 레트로바이러스 벡터는 진핵 세포의 게놈 내로 안정적으로 통합되는, 용도.
29. 제16 항 내지 제28 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 CD24 단백질은 가용성인, 용도.
30. 제16 항 내지 제29 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 CD24 단백질은 글리코실화되는, 용도.

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