CN112543643A - 使用可溶性cd24用于治疗获得性免疫缺陷综合征（hiv/aids）的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及通过将CD24施用于有需要的受试者以治疗、减轻、最小化或预防HIV‑1/AIDS的方法。还提供了CD24蛋白在制备用于治疗HIV‑1/AIDS的药物中的用途。此外，提供了包含药学上可接受量的CD24蛋白的药物组合物。

Description

使用可溶性CD24用于治疗获得性免疫缺陷综合征(HIV/AIDS) 的方法

发明领域

本发明涉及用于治疗获得性免疫缺陷综合征(HIV/AIDS)的组合物和方法。

发明背景

HIV-1/AIDS是全球健康的最大威胁之一。尽管长时间的cART/HAART可以有效地减轻血浆病毒载量并将其维持在可检测的水平以下，并部分重建免疫***，但也有约20％的患者没有适当的免疫重建[Kelley et al.,2009]。慢性免疫激活(免疫***的持续和异常激活的状态)不仅是致病性HIV-1/SIV感染的特征，而且还是疾病进展的强有力的独立预测因子，其与cART中的HIV-1感染者的免疫重建受损有关[Pallikkuth et al.,2013]。一方面，慢性免疫激活和炎症会加速免疫细胞的进程，并驱使其通过生长和***的周期而进入免疫衰老[Deeks SG.,et al.,2009]。另一方面，持续的慢性免疫激活和炎症形成恶性循环，促进炎症组织微环境的形成，并最终导致整个身体的问题，这些对HIV-1感染的患者是有害的[Younas M et al.,2016；Rajasuriar et al.,2015]。随着时间的推移，持续的高水平炎症和慢性免疫激活会损害器官并导致炎症相关疾病，这也给严重的非AIDS疾病(包括癌症、心血管、肝脏和肾脏疾病)带来了高风险[Deeks et al.,2013；Rajasuriar et al.,2015]。如今，cART以及阻断细胞因子的产生和功能，包括用于控制慢性免疫激活和炎症以改善整体健康状况的抗炎药物和免疫抑制剂，是HIV-1免疫疗法的重要策略[Rajasuriaret al.,2013]。此外，慢性免疫激活和炎症的调节在其他传染病的有效治疗中起着重要作用[Hsu et al.,2016]。据报道，许多原因可导致HIV-1/SIV感染中的慢性免疫激活和炎症，例如病毒复制，共感染或机会病原体的产生以及微生物移位的产物[Paiardini et al.,2013]。已经开发出针对这些原因的治疗策略，例如缬更昔洛韦(valganciclovir)、抗LPS抗体和碳酸司维拉姆(Sevelamer carbonate)，它们对AIDS患者或SIV感染的动物的效果参差不齐[Hunt et al.,2011；Kristoff et al.,2014；Sandler et al.,2014]。因此，通过控制慢性免疫激活来治疗HIV-1/AIDS的医疗需求仍然很大。

发明概述

本文提供了通过向有需要的受试者施用CD24蛋白来治疗、减轻、最小化或预防HIV-1/AIDS的方法。本文还提供了CD24蛋白在制备用于治疗HIV-1/AIDS的药物中的用途。CD24蛋白可包含成熟的人CD24多肽或其变体。成熟的人CD24多肽可包含SEQ ID NO：1或2所示的氨基酸序列。CD24蛋白可包含人CD24的任何或全部胞外结构域。CD24蛋白可包含信号序列，其可以具有SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列，以允许从表达该蛋白的细胞中分泌。信号肽序列可以是在其他跨膜或分泌蛋白上发现的一种，或者是从本领域已知的现有信号肽修饰的一种。CD24蛋白可以是可溶的和/或可以是糖基化的。可以使用真核蛋白表达***产生CD24蛋白，所述真核蛋白表达***可以包含中国仓鼠卵巢细胞系中含有的载体或复制缺陷型逆转录病毒载体。复制缺陷型逆转录病毒载体可以稳定地整合到真核细胞的基因组中。

CD24蛋白可以包含蛋白标签，其可以融合在CD24蛋白的N-末端或C-末端。该蛋白质可以包含哺乳动物免疫球蛋白(Ig)蛋白的一部分。Ig蛋白的一部分可以是Ig蛋白的Fc区，并且Ig蛋白可以是人的。Fc区可包含IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或IgA的铰链区以及CH2和CH3结构域。Fc区还可包含IgM的铰链区以及CH2、CH3和CH4结构域。CD24蛋白可包含SEQ IDNO：5、6、8、9、11或12所示的氨基酸序列。CD24蛋白的氨基酸序列还可以由SEQ ID NO：5、6、8、9、11或12所示的序列组成。

本文进一步描述了通过向有需要的受试者施用CD24来控制慢性炎症和HIV病毒载量的方法。由于CD24Fc与危险相关分子模式(DAMP)和Siglecs相互作用以减轻炎症，因此表明它可以保护具有已建立的猿猴免疫缺陷病毒(SIV)感染的中华猕猴(ChRM)。这些结果表明，加强对DAMP的先天免疫应答的负调控为治疗HIV感染的患者提供新的方法。为了证实这些观察结果，还测试了CD24Fc对HIV感染的人源化小鼠的作用，数据表明CD24Fc显著降低了炎症性细胞因子的产生和人T细胞的免疫激活。此外，CD24Fc显著增加了HIV感染小鼠中人类干细胞的造血作用。

附图简述

附图1A-1C显示了全长CD24融合蛋白，CD24Fc(本文也称为CD24Ig)(SEQ ID NO：5)的氨基酸组成。加下划线的26个氨基酸是CD24的信号肽(SEQ ID NO：4)，其在从表达该蛋白的细胞分泌的过程中被切除，因此从该蛋白的加工形式(SEQ ID NO：6)中缺失。序列的粗体部分是融合蛋白中使用的成熟的CD24蛋白的胞外结构域(SEQ ID NO：2)。为了避免免疫原性，在成熟的CD24蛋白中通常存在的最后一个氨基酸(A或V)已从构建体中缺失。非下划线的，非粗体字母是IgG1 Fc的序列，包括铰链区以及CH1和CH2结构域(SEQ ID NO：7)。图1B显示了CD24^VFc的序列(SEQ ID NO：8)，其中成熟的人CD24蛋白(粗体)是SEQ ID NO：1的缬氨酸多态性变体。图1C显示了CD24^AFc的序列(SEQ ID NO：9)，其中成熟的人CD24蛋白(粗体)是SEQ ID NO：1的丙氨酸多态性变体。图1B和图1C中融合蛋白的各个部分如图1A中标记，且变体缬氨酸/丙氨酸氨基酸用双下划线标出。

图2显示了来自小鼠(SEQ ID NO：3)和人(SEQ ID NO：2)的成熟的CD24蛋白之间的氨基酸序列变异。潜在的O-糖基化位点以粗体显示，N-糖基化位点用下划线标出。

图3A-C.CD24IgG1(CD24Fc)的药代动力学WinNonlin房室模型分析。空心圆代表3只小鼠的平均值，而线条是预测的药代动力学曲线。图3A.i.v.注射1mg CD24IgG1。图3Bs.c.注射1mg CD24IgG1(CD24Fc)。图3C.通过曲线下面积(AUC)、半衰期和最大血液浓度测量的血液中抗体总量的比较。注意总体而言，s.c.注射液的AUC和Cmax约为i.v.注射液的80％。尽管差异在统计学上不显著。

图4A-B.CD24-Siglec G(10)相互作用区分PAMP和DAMP。图4A.宿主对PAMP的响应不受CD24-Siglec G(10)相互作用的影响。图4B.CD24-Siglec G(10)相互作用抑制宿主对DAMP的响应，其可能通过与Siglec G/10相关的SHP-1。

图5A-C.CD24Fc与Siglec 10和HMGB1结合并激活Siglec G，其是人Siglec10的小鼠同源物。图5A.CD24Fc-Siglec 10相互作用的亲和力测定。图5B.CD24Fc以阳离子依赖性方式与HMGB-1特异性相互作用。在存在或不存在阳离子螯合剂EDTA的情况下，将CD24Fc与HMGB1在0.1mM的CaCl₂和MgCl₂中温育。用蛋白G-珠子将CD24Fc下拉，并通过蛋白质印迹法(Western blot)确定HMGB1、CD24Fc或对照Fc的量。图5C.CD24-Fc通过诱导酪氨酸磷酸化(中图)并与SHP-1(上图)结合来激活小鼠SiglecG。Siglec G的量显示在下图中。用1μg/ml的CD24-Fc、对照Fc或媒介物(PBS)对照刺激CD24^-/-脾细胞30分钟。然后对Siglec G进行免疫沉淀，并用抗磷酸酪氨酸或抗SHP-1进行探测。

图6A-B.CD24Fc抑制抗CD3激活的人T细胞的TNF-α和IFN-γ产生。在存在或不存在CD24Fc的情况下，用抗CD3刺激人PBML 4天，并通过ELISA测量细胞培养上清液中释放的IFN-γ和TNF-α的量。显示的数据是一式三份的平均值。误差线，SEM。

图7A-B.CD24抑制人巨噬细胞的炎症性细胞因子产生。图7A.CD24的ShRNA沉默导致自发产生TNF-α、IL-1β和IL-6。用编码加扰的(scrambled)或两个独立的CD24shRNA分子的慢病毒载体转导THP1细胞。通过与PMA(15ng/ml)培养4天，转导的细胞分化为巨噬细胞。洗去PMA和非贴壁细胞后，将细胞再培养24小时以通过细胞因子珠阵列测量炎症性细胞因子。图7B.除了最后的24小时内将给定浓度的CD24Fc或对照IgG Fc添加至巨噬细胞外，与图7A相同。图7A所示的数据是来自三个独立实验的平均值和S.D.，而图7B中的数据代表至少3个独立实验。

图8A-E.CD24Fc保护中华猕猴免受SIVmac239感染引起的AIDS。图8A实验时间表图。图8B.媒介物(左)或CD24Fc(中)处理后SIVmac239感染的猴子体重减轻。该研究的汇总数据显示在右图中。图8C-E.CD24Fc保护SIVmac239感染的猴子免于消耗综合征(图8C)、腹泻(图8D)和AIDS发病率和死亡率(图8E)。对照组(黑色)、CD24Fc处理组(灰色)。利用Bonferroni多重比较检验通过两次重复测量ANOVA确定图8B(右)中统计学显著性，使用配对t检验确定图8C-E中统计学显著性。

图9A-D.CD24Fc能够延迟血浆病毒载量的升高并降低前病毒载量。图9A.对照和CD24F处理的猴子的血浆病毒载量。分析中仅包括在32周研究期内幸存的猴子。图9B.除了将病毒载量标准化为处理前水平(其人为地定义为1.0)之外，与(图9A)相同。图9C.处理前后的前病毒载量动态。图9D.组织中的前病毒载量。对照组(黑色)，CD24Fc处理组(灰色)。利用Bonferroni多重比较检验使用两次重复测量ANOVA确定图9A-C中统计学显著性。使用学生t检验确定统计学显著性。

图10A-D.CD24Fc能够减轻肠道中的炎症。图10A.接受CD24Fc(灰色)或媒介物对照(黑色)处理的SIVmac239感染的猴子的直肠中促炎因子的转录水平。GAPDH的水平用作内部对照。图10B.回肠(n＝11)、结肠(n＝10)和直肠(n＝10)中的粒细胞浸润基于免疫荧光确定的MPO+细胞数量。显示的数据是平均值和S.D.，每个数据点是至少5个高功率视野计数的平均值。对照组(黑色)，CD24Fc处理组(灰色)。图10C.来自对照或CD24Fc处理的猴子的H&E染色切片的代表性图像。图10D.病理学评分的汇总数据。对照组(黑色)，CD24Fc处理组(灰色)。使用学生t检验确定图10A、B和D中统计学显著性。

图11A-D.CD24Fc处理降低HIV-1病毒载量，并保护CD4+T细胞免于急性HIV感染的人源化小鼠脾脏的损耗。图11A.在感染后第1、8和15天以5mg/kg通过腹膜内施用CD24Fc或不施用的情况下，CD24Fc处理对R3A感染的小鼠血浆HIV-1载量的影响。图11B.数据显示了使用或不使用CD24Fc的R3A感染小鼠外周血中CD4+T细胞的百分比。图11C-D.总计数据显示了终止时使用或不使用CD24Fc，R3A感染的小鼠的脾脏中CD4+T细胞的绝对数量(图11C)和总人类淋巴细胞(图11D)。数据显示为平均值且s.e.m.*P<0.05，**P<0.01(双尾未配对学生t检验的分析)。

图12A-C.CD24Fc处理减少患有慢性HIV感染的人源化小鼠的HIV-1复制。图12A.CD24Fc处理(从感染后第7周开始，每周5mg/kg，持续6周)对血浆HIV-1载量的影响。显示了P值。数据显示为平均值且s.e.m.*P<0.05(双尾未配对学生t检验的分析)。图12B.代表性的点状图显示了在分别包括mock、HIV-1、具有CD24Fc处理的HIV-1和具有cART处理的HIV-1的4组中来自***和脾脏的CD3+CD8-T细胞的p24表达。数字显示p24+细胞亚群的百分比。图12C.总计数据显示图12B的4组中p24+T细胞亚群的比例。每个点代表一只小鼠。P值显示<0.05(双尾未配对学生t检验的分析)。

图13A-B.CD24Fc处理显著增加患有慢性HIV感染的人源化小鼠的初始型T细胞比例。图13A.代表性的点状图表明在包括mock、HIV-1、具有CD24Fc处理的HIV-1和具有cART处理的HIV-1的4组中初始型和记忆CD4+和CD8+T细胞亚群的分布。数字显示细胞亚群的百分比。图13B.汇总数据表明了4组中CD4+和CD8+记忆T细胞亚群的百分比。数据显示为平均值且s.e.m.*P<0.05，**P<0.01且***P<0.001(双尾未配对学生t检验的分析)。

图14A-B.CD24Fc处理显著减少患有慢性HIV感染的人源化小鼠中T细胞的过度活化。图14A.代表性的点状图表明分别接受mock、HIV-1、具有CD24Fc处理的HIV-1和具有cART的HIV-1的4组人源化小鼠的CD4+和CD8+T细胞亚群上CD38和HLA-DR的表达。数字显示CD38-和HLA-DR表达细胞亚群的百分比。图14B.汇总数据表明4组中CD38+HLA-DR+CD4和CD8T细胞的百分比。数据显示为平均值和s.e.m.*P<0.05，**P<0.01且***P<0.001(双尾未配对学生t检验的分析)。

图15A-D.CD24Fc处理在体外和体内阻断HIV-1诱导的促炎细胞因子的产生。将THP-1细胞用含或不含CD24Fc的R3A储备液感染3天。然后收集细胞用于pre-IL-1β和IL6mRNA的RT-PCR，并收集上清液用于IL-1β的ELISA。图15A.CD24Fc抑制由THP单核细胞在体外HIV R3A诱导的IL-1β产生。图15B.CD24Fc抑制pre-IL-1β和IL6mRNA的产生。数据显示为平均值S.E.M.且与mock相比**P<0.01，且与R3A相比##P<0.01(双尾配对学生t检验的分析)。图15C.在R3A感染的人源化小鼠中，CD24Fc处理(5mg/kg)的图示(每组n＝3)。图15D.汇总数据表明R3A急性感染在1-3wpi时血浆的促炎细胞因子水平，包括IL-6、IL-8、IFN-γ和IL-17a。数据显示为平均值和s.e.m.且与相应时间的R3A相比*P<0.05。

图16.CD24Fc处理拯救患有慢性HIV-1感染的人源化小鼠体内HSC的增殖。mock小鼠(n＝4)、HIV-1感染的小鼠(n＝5)和CD24Fc处理的HIV-1感染的小鼠(n＝4)分别的CD34+HSC形成的集落形成单位的汇总数据。CD24Fc通过腹膜内施用，从感染后第7周开始，以每周5mg/kg的剂量连续6周。误差线，s.e.*P<0.05(双尾未配对学生t检验的分析)。CFU-GM，集落形成单位-粒细胞，巨噬细胞。CFU-E，集落形成单位-红系细胞(erythroid)。CFU-GEMM，集落形成单位-粒细胞，红系细胞，巨噬细胞，巨核细胞。

图17显示了通过人受试者中PK可评估群体的治疗的平均血浆CD24Fc浓度(±SD)的图。PK＝药代动力学；SD＝标准偏差。

图18显示了PK可评估群体的CD24Fc C_max与剂量的剂量比例图。

图19显示了PK可评估群体的CD24Fc AUC0-42d与剂量的剂量比例图。

图20显示了PK可评估群体的CD24Fc AUC_0-inf与剂量的剂量比例图。

发明详述

发明人已经惊奇地发现，CD24的可溶形式对治疗HIV-1/AIDS是高度有效的。该作用可以通过DAMP介导。模式识别涉及由病原体相关和组织损伤相关分子模式(分别称为PAMP和DAMP)触发的炎症反应。发明人已经认识到，最近的研究表明，对DAMP的加剧的宿主反应可能在炎性和自身免疫性疾病的发病机理中起作用。发现DAMP促进炎性细胞因子和自身免疫疾病的产生并在动物模型中产生，并因此发现DAMP的抑制剂(诸如HMGB1和HSP90)改善类风湿性关节炎(RA)(4-6)。TLR、RAGE-R、DNGR(由Clec9A编码)和Mincle已显示是负责介导通过多种DAMP引发的炎症的受体(2,7-14)。

发明人最近的工作证明了CD24-Siglec G相互作用区分DAMP与PAMP的先天免疫(15,16)。Siglec蛋白是膜结合的免疫球蛋白(Ig)超家族成员，其识别多种含唾液酸的结构。大多数Siglec具有与SHP-1、-2和Cbl-b相关的细胞内免疫酪氨酸抑制基序(ITIM)，以控制炎症反应的关键调节因子。发明人已经报道CD24是小鼠中Siglec、尤其是Siglec G和人中Siglec 10的第一自然配体(15)。Siglec G与唾液酸化的CD24相互作用以经由SHP-1/2信号传导机制抑制TLR介导的对DAMP如HMGB1的宿主反应(15)。

人CD24是由CD24基因中240个碱基对的开放阅读框编码的小GPI锚定分子(28)。在这80个氨基酸中，前26个构成信号肽，而后23个用作裂解信号，以允许GPI尾部附着。结果，成熟的人CD24分子仅具有31个氨基酸。这31个氨基酸之一是人群体中多态的。开放阅读框的核苷酸170处的C到T的转变导致丙氨酸(A)被缬氨酸(V)取代。由于该残基位于切割位点的紧邻N端，并且由于置换是非保守的，因此这两个等位基因可能在细胞表面以不同的效率表达。事实上，用cDNA进行转染的研究表明，CD24^v等位基因在细胞表面上更有效地表达(28)。与此相一致，CD24^v/v PBL表达更高水平的CD24，尤其是在T细胞上。

发明人已经证明CD24负调节宿主对由于组织或器官损伤而释放的细胞DAMP的应答，并且至少两种重叠的机制可以解释该活性。首先，CD24与几种DAMP结合，包括HSP70、HSP90、HMGB1和核仁素，并抑制宿主对这些DAMP的应答。为此，假定CD24可以捕获炎症刺激，以防止与其受体TLR或RAGE相互作用。其次，使用对乙酰氨基酚诱导的小鼠肝坏死模型并确保炎症，发明人证明了CD24通过与其受体Siglec G相互作用，为宿主对组织损伤的反应提供了强有力的负调控。为了实现该活性，CD24可以通过Siglec G结合并刺激信号传导，其中与Siglec G相关的SHP1触发负调控。这两种机制可协同作用，因为具有任一基因的靶向突变的小鼠引起强得多的炎症反应。实际上，当用HMGB1、HSP70或HSP90刺激时，从CD24^-/-或Siglec G^-/-小鼠的骨髓中培养的DC产生更高水平的炎症细胞因子。据发明人所知，CD24是唯一能够抑制由DAMP触发的炎症的抑制性DAMP受体，并且目前没有特异性靶向宿主对组织损伤的炎症反应的药物。此外，本发明人已经使用RA、MS和GvHD的小鼠模型证明了外源可溶性CD24蛋白减轻DAMP介导的自身免疫病的能力。

通过单独或与其他刺激物复合触发TLRs(toll样受体)和/或NLRs(Nod样受体)，DAMP在细胞凋亡和损伤后在坏死、细胞焦亡(pyroptosis)、继发性坏死过程中释放。这些DAMP可以驱动有效的先天免疫响应，因此至少部分地促进了慢性免疫激活和全身性炎症[Lotze et al.,2005；Chen et al.,2011]。它们在维持无菌炎症中可能具有致病作用，并且在诸如创伤、慢性炎症性疾病，自身免疫疾病和癌症等疾病中也起着重要作用[Venereauet al.,2016；Shin et al.,2015；Kang et al.,2015]。重要的是，在HIV感染和AIDS期间经常发生坏死、细胞焦亡、细胞死亡和损伤。已经提出了来自垂死细胞的可溶性因子有助于响应细胞损伤的全身性免疫激活，并且还与微生物移位，细胞死亡和免疫激活有关[

et al.,2011]。在HIV-1感染的患者中，已证明诸如HMGB1、HSP70等DAMP和自身反应性抗体(Ab)的水平会增加，尽管cART可能会降低DAMP的水平，但它们无法将其恢复到正常水平[Nowak et al.,2007；Anraku et al.,2012]。自身反应性抗体与初始型CD4+T和免疫细胞的快速丧失有关，而高的水平也与疾病的迅速进展有关[

et al.,2010；Kocsis etal.,2003；Anraku et al.,2012；Espigares et al.,2006；Agnew et al.,2003；Rawson etal.,2007；Kuwata et al.,2009]。HMGB1可以通过TLR信号通路与细菌产物复合促进免疫激活，而高水平的HMGB1与高病毒载量相关[

et al.,2013]。HMGB1和LPS都与HIV-1进展者中CD8+T细胞上的CD38密度适度相关[

et al.,2013]。基于这些数据，发明人认识到，DAMPs可能在HIV-1感染患者的免疫激活和炎症中起重要作用，并且还没有靶向它们的药物用于HIV-1/AIDS治疗。

表达各种TLR和NLR的巨噬细胞是重要的先天免疫细胞，具有吞噬作用、抗原呈递和细胞因子释放功能。在被PAMP和DAMP触发或被刺激物激活后，1型巨噬细胞(M1)释放大量促炎性细胞因子，从而导致免疫激活、***性炎症和激活诱导的细胞死亡。另一方面，2型巨噬细胞(M2)具有高吞噬活性，会产生大量的抗炎细胞因子并参与组织修复。在HIV-1感染中，受病毒感染的CD4+T细胞正在经历凋亡、继发性坏死和潜在的细胞焦亡，释放出促炎性细胞因子，病毒复制产物和微生物移位产物，从而形成高度促炎性局部环境。如在未经处理的AIDS患者中观察到的，这会使巨噬细胞偏向更具炎症性的M1表型[Sattentau andStevenson,et al]。因此，在巨噬细胞极化、炎症、组织损伤以及最终疾病进展之间存在恶性循环。因此，阻断巨噬细胞的炎性活性是治疗和预防HIV-1/AIDS进展的策略。

发明人已经证明，CD24蛋白的可溶形式可以阻断由DAMP触发的巨噬细胞的促炎活性，并防止AIDS或死亡，包括延迟体重减轻，降低消耗综合征和腹泻。可溶性CD24蛋白还可以延迟血浆病毒载量的增加并抑制PBMC、骨髓和直肠中的前病毒载量，而不会恢复CD4+T细胞数量和T细胞亚群的显著变化。发明人进一步发现可溶性CD24蛋白可以抑制肠道炎症并降低CD8+T细胞活化。最后，发明人发现有效的可溶性CD24蛋白处理与sCD14水平的有效控制和CD8+T细胞中HLA-DR表达的适度下调有关。

1.定义

本文所使用的术语仅出于描述特定实施方案的目的，而并非旨在是限制性的。如说明书和所附权利要求书中所使用的，单数形式“一”、“一个”和“该”包括复数对象，除非上下文另外明确指出。

对于在此的数值范围列举，明确地考虑了它们之间具有相同精确度的每个中间数字。例如，对于6-9的范围，除了6和9外，数字7和8也可以考虑；对于6.0-7.0的范围，明确考虑数字6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9和7.0。另外，明确考虑了具有由列表中列举的数字定义的端点的范围。例如，列表1、2、3和4定义了1-2、2-3、3-4、1-4、1-3和2-4的范围。除非另有说明，否则端点包括在这样的范围内。

“肽”或“多肽”是氨基酸的连接序列，并且可以是天然的、合成的或天然和合成的修饰或组合。

“基本相同”可以表示第一和第二氨基酸序列在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290或300个氨基酸的区域至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％。

当提到保护动物免受疾病侵害时，“治疗”或“处理”是指预防、抑制、遏制或完全消除疾病。预防疾病包括在疾病发作之前向动物施用本发明的组合物。抑制疾病包括在诱导疾病之后但在其临床出现之前向动物施用本发明的组合物。遏制疾病包括在疾病的临床出现后向动物施用本发明的组合物。

“变体”可以意指通过氨基酸的***、缺失或保守取代而在氨基酸序列上不同，但是保留至少一种生物学活性的肽或多肽。“生物学活性”的代表性例子包括与toll样受体结合并被特异性抗体结合的能力。变体也可以意指具有与保留至少一种生物学活性的氨基酸序列的参照蛋白质基本相同的氨基酸序列的蛋白质。氨基酸的保守取代，即用具有相似性质(例如，亲水性、带电区域的程度和分布)的不同氨基酸取代氨基酸，在本领域通常被认为涉及微小的变化。如本领域所理解的，这些微小的变化可以部分地通过考虑氨基酸的亲水指数来鉴定。Kyte et al.,J.Mol.Biol.157:105-132(1982)。氨基酸的亲水指数基于对其疏水性和电荷的考虑。在本领域中已知具有相似亲水指数的氨基酸可以被取代并且仍然保留蛋白质功能。一方面，亲水指数为±2的氨基酸被取代。氨基酸的亲水性也可用于揭示使蛋白质保留生物学功能的取代基。考虑肽中氨基酸的亲水性可以计算出该肽的最大局部平均亲水性，这是一种据报道与抗原性和免疫原性很好地相关的有用方法。美国专利号4,554,101，通过引用完全并入本文。如本领域所理解的，具有相似亲水性值的氨基酸的取代可以导致肽保留生物学活性，例如免疫原性。可用亲水性值彼此在±2之内的氨基酸进行取代。氨基酸的疏水性指数和亲水性值均受该氨基酸的特定侧链影响。与该观察一致，与生物学功能相容的氨基酸取代应理解为取决于氨基酸的相对相似性，尤其是那些氨基酸的侧链，如疏水性、亲水性、电荷、大小和其他属性所揭示的。

2.CD24

本文提供了CD24蛋白，其可以包含成熟的CD24多肽或其变体。成熟的CD24多肽对应于CD24的胞外结构域(ECD)。成熟的CD24多肽可以来自人或另一种哺乳动物。如上所述，成熟的人CD24多肽长31个氨基酸，并在其C末端具有可变的丙氨酸(A)或缬氨酸(V)残基：

SETTTGTSSNSSQSTSNSGLAPNPTNATTK(V/A)(SEQ ID NO:1)。

C-末端缬氨酸或丙氨酸可以是免疫原性的，并且可以从CD24蛋白中省略掉，从而降低其免疫原性。因此，CD24蛋白可包含缺少C端氨基酸的人CD24的氨基酸序列：

SETTTGTSSNSSQSTSNSGLAPNPTNATTK(SEQ ID NO:2)。

尽管来自小鼠和人的成熟CD24蛋白的氨基酸序列有相当大的序列变异，但它们在功能上是等效的，因为已显示人CD24Fc在小鼠中具有活性。人CD24ECD的氨基酸序列显示出与小鼠蛋白的一些序列保守性(39％同一性；Genbank登录号NP_033976)。然而，并不奇怪，同一性百分比不会更高，因为CD24ECD的长度仅为27-31个氨基酸(取决于物种)，并且与其一些受体(例如Siglec 10/G)结合，其通过糖蛋白的唾液酸和/或半乳糖介导。人Siglec-10(GenBank登录号AF310233)与其鼠类同系物Siglec-G(GenBank登录号NP_766488)受体蛋白的细胞外结构域之间的氨基酸序列同一性为63％(图2)。由于小鼠和人CD24之间主要在C端和糖基化位点的丰度上序列保守，因此使用CD24蛋白可以耐受成熟的CD24蛋白的显著变异，特别是如果那些变异不影响C末端的保守残基或不影响小鼠或人CD24的糖基化位点。因此，CD24蛋白可以包含成熟的鼠CD24的氨基酸序列：

NQTSVAPFPGNQNISASPNPTNATTRG(SEQ ID NO:3)。

与小鼠相比，人CD24ECD的氨基酸序列与食蟹猴蛋白显示出更多的序列保守性(52％相同；UniProt登录号UniProtKB-I7GKK1)。同样，这并不令人惊讶，因为同一性百分比不更高，因为在这些物种中ECD的长度仅为29-31个氨基酸，并且糖残基与其受体结合具有作用。食蟹猴Siglec-10受体的氨基酸序列尚未确定，但人和恒河猴Siglec-10(GenBank登录号XP_001116352)蛋白之间的氨基酸序列同一性为89％。因此，CD24蛋白还可包含成熟食蟹猴(或恒河猴)CD24的氨基酸序列：

TVTTSAPLSSNSPQNTSTTPNPANTTTKA(SEQ ID NO:10)

CD24蛋白可以是可溶的。CD24蛋白可进一步包含N端信号肽，以允许从表达该蛋白的细胞分泌。信号肽序列可包含氨基酸序列MGRAMVARLGLGLLLLALLLPTQIYS(SEQ ID NO:4)。或者，信号序列可以是在其他跨膜或分泌的蛋白质上发现的那些信号序列，或者是由本领域已知的现有信号肽修饰的那些信号序列。

a.融合

CD24蛋白可以在其N或C末端与蛋白标签融合，该蛋白标签可以包含哺乳动物Ig蛋白的一部分，其可以是人或小鼠或来自其他物种。该部分可以包含Ig蛋白的Fc区。Fc区可包含Ig蛋白的铰链区、CH2、CH3和CH4结构域中的至少一个。Ig蛋白可以是人IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或IgA，并且Fc区可以包含Ig的铰链区以及CH2和CH3结构域。Fc区可包含人免疫球蛋白G1(IgG1)同种型SEQ ID NO：7。Ig蛋白也可以是IgM，并且Fc区可以包含铰链区和IgM的CH2、CH3和CH4结构域。蛋白标签可以是有助于蛋白质纯化的亲和标签，和/或可以增强功能性蛋白质的溶解度和回收率的溶解度增强标签。蛋白标签还可以增加CD24蛋白的化合价。蛋白标签还可以包含GST、His、FLAG、Myc、MBP、NusA、硫氧还蛋白(TRX)、小泛素样修饰剂(SUMO)、泛素(Ub)、白蛋白或骆驼Ig。制备融合蛋白和纯化融合蛋白的方法是本领域众所周知的。

根据临床前研究，为了构建在实施例中鉴定的融合蛋白CD24Fc，已经使用了30个氨基酸的天然CD24分子的截短形式，其在GPI信号切割位点之前缺少最终的多态性氨基酸(即具有SEQ ID NO：2的成熟的CD24蛋白)。成熟的人CD24序列与人IgG1 Fc结构域融合(SEQID NO：7)。全长CD24Fc融合蛋白提供在SEQ ID NO：5中(图1)，而在SEQ ID NO：6中提供从细胞分泌的CD24Fc融合蛋白的加工版本(即，缺少被切割的信号序列)。与IgG1 Fc融合的成熟CD24(即具有SEQ ID NO：1的成熟的CD24蛋白)的经加工的多态性变体可以包含SEQ ID NO：11或12所示的氨基酸序列。

b.生产

CD24蛋白可被高度糖基化，并可参与CD24的功能，例如免疫细胞的共刺激以及与损伤相关分子模式分子(DAMP)的相互作用。可以使用真核表达***制备CD24蛋白。表达***可需要在哺乳动物细胞(如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞)中从载体表达。该***也可以是病毒载体，例如可用于感染真核细胞的复制缺陷型逆转录病毒载体。CD24蛋白也可以由稳定的细胞系产生，该细胞系从已经整合到细胞基因组中的载体或载体的一部分表达CD24蛋白。稳定的细胞系可以从整合的复制缺陷型逆转录病毒载体表达CD24蛋白。表达***可以是GPEx^TM。

c.药物组合物

CD24蛋白可以包含在药物组合物中，该药物组合物可以包含药学上可接受量的CD24蛋白。药物组合物可以包含药学上可接受的载体。药物组合物可以包含溶剂，其可以在延长的时期内保持CD24蛋白稳定。溶剂可以是PBS，其可在-20℃(-15至-25℃)下保持CD24蛋白稳定至少66个月。该溶剂可能够容纳与另一种药物组合的CD24蛋白。

可以将药物组合物配制用于肠胃外施用，包括但不限于通过注射或连续输注。用于注射的制剂可以是在油性或水性媒介物中的悬浮液、溶液或乳剂的形式，并且可以包含配制剂，其包括但不限于悬浮剂、稳定剂和分散剂。组合物也可以以粉末形式提供，以与合适的媒介物重构，所述媒介物包括但不限于无菌的无热原水。

药物组合物也可以配制成贮库(depot)制剂，其可以通过植入或肌内注射施用。组合物可以用合适的聚合或疏水材料(例如，作为在可接受的油中的乳液)、离子交换树脂或作为微溶的衍生物(例如，作为微溶的盐)配制。皮下注射制剂可与狼疮及其相关临床表现和并发症等适应症特别相关。

d.剂量

CD24蛋白的剂量可以最终通过临床试验确定，以确定具有可接受的毒性和临床功效的剂量。可以通过在啮齿动物和非人类灵长类动物中的药代动力学和毒性研究来估计初始临床剂量。CD24蛋白的剂量可以是0.01mg/kg至1000mg/kg，并且可以是1至500mg/kg，这取决于对irAEs或GvHD的所需的效果和给药途径。可以通过静脉内输注或皮下、壁内(即腔或器官壁内)或腹膜内注射来施用CD24蛋白，并且剂量可以为10-1000mg、10-500mg、10-240mg、10-120mg或10、30、60、120或240mg，其中受试者是人类。

3、治疗方法

a.HIV/AIDS

本文提供了通过向需要其的受试者施用CD24蛋白来减轻或治疗获得性免疫缺陷综合征(HIV/AIDS)的方法。可以将CD24蛋白施用于患有或有发展HIV/AIDS风险的受试者。CD24蛋白可以预防性地用于预防HIV/AIDS，或可以在HIV/AIDS出现的临床症状之前使用。在诊断出临床症状后，也可以治疗性地施用CD24蛋白来治疗HIV/AIDS。

在另一个实施方案中，CD24蛋白可以用于减少或阻断与HIV/AIDS有关的炎症，其可以包含以下一种或更多种：抑制由DAMP触发的巨噬细胞的促炎活性，减少肠道炎症，降低CD8+T细胞活化，控制sCD14水平，和下调CD8+T细胞中的HLA-DR表达。

在另一个实施方案中，CD24蛋白可以用于减少或最小化HIV/AIDS的影响，其可以是体重减轻、消耗综合征和腹泻中的一种或更多种。

在又一个实施方案中，CD24蛋白可用于延迟血浆病毒载量的增加并抑制PBMC、骨髓和直肠中的一种或多种的前病毒载量，而不恢复CD4+T细胞数量和T细胞亚群的显著变化。还提供了CD24蛋白在制备用于本文所述用途或治疗的药物中的用途。

b.施用

药物组合物的施用途径可以是肠胃外的。肠胃外施用包括但不限于静脉内、动脉内、腹膜内、皮下、肌内、鞘内、关节内和直接注射。可以将药物组合物施用于人类患者、猫、狗、大型动物或禽类。该组合物每天可施用1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12次。

c.联合治疗

与HIV/AIDS进展相关的慢性免疫激活和炎症是HIV-1治疗的两个最大挑战[Appayet al.,2008]。尽管成功的cART可以将血浆病毒载量抑制到无法检测的水平，但是慢性免疫激活和炎症仍然没有消除，并且与非艾滋病定义的疾病和死亡密切相关[Rajasuriar etal.,2015]。目前，各种免疫抑制剂(***(Predbisone)、霉酚酸酯(mycophenolate)、环孢霉素(Cyclosorine)、西罗莫司(Sirolimus)/雷帕霉素(rapamycin))，抗炎药(阿司匹林、塞来昔布(Celecoxib)、氯喹(Chloroquine)、羟化氯喹(Hydroxychloroquine)、己酮可可碱(Pentoxifyline)、水杨酰水杨酸(Salsalate)、阿达木单抗(Adalimumab)英夫利昔单抗(Infliximab)/依那西普(etanercept))[Rajasuriar et al.,2013]，和他汀类药物(阿托伐他汀(Atorvastatin)、氟伐他汀(fluvastatin)、洛伐他汀(lovastatin)、匹伐他汀(pitavastatin)、普伐他汀(pravastatin)、瑞舒伐他汀(rosuvastatin)、辛伐他汀(simvastatin))已在临床或动物中进行了抗慢性免疫激活和炎症作用的测试[Eckard etal.,2015]，但其作用与不同副作用密切相关。尤其是非特异性药物，例如免疫抑制剂，对病毒载量，慢性免疫激活和炎症具有可变的影响，具有高风险的机会感染。非甾体类抗炎药对抗慢性免疫激活有影响，并具有患心血管疾病的高风险；他汀类药物具有控制炎症、免疫激活和免疫衰老的优势，也存在心力衰竭、肌痛、横纹肌溶解，精神和神经***症状以及癌症的高风险[Ravnskov et al.,2006；Rajasuriar et al.,2013]。然而，高度特异性施用的免疫疗法(例如抗TNF-α抗体)更有效且副作用更少[Tabb et al.,2013]。因此，增强治疗的特异性可以改善治疗效果，具有更高的耐受性和更低的副作用。因此，本文所述的CD24蛋白可以与本文所述的治疗方法中的任何这些其他疗法组合施用。

此类组合疗法包括抗逆转录病毒疗法(ART)，包括高活性抗逆转录病毒疗法(HAART)和/或组合抗逆转录病毒疗法(cART)。ART的实例包括进入抑制剂、核苷/核苷酸逆转录酶抑制剂(NRTI)、非核苷逆转录酶抑制剂(NNRTI)、整合酶抑制剂(也称为整合酶核链转移抑制剂或INSTI)和蛋白酶抑制剂。进入抑制剂(或融合抑制剂)(例如马拉维若(Maraviroc)和恩夫韦地(enfuvirtide))通过阻断几种靶标(例如HIV的CCR5和CXCR4或gp41)之一，干扰HIV-1的结合、融合和进入宿主细胞。NRTI是核苷和核苷酸类似物，例如齐多夫定(zidovudine)、阿巴卡韦(abacavir)、拉米夫定(lamivudine)、恩曲他滨(emtricitabine)和替诺福韦(tenofovir)，其抑制逆转录并因此整合到宿主细胞基因组中。NNRTI还抑制逆转录酶，但通过与该酶的变构位点结合来抑制。NNRTI包括奈韦拉平(nevirapine)、依法韦伦(efavirenz)、依曲韦林(etravirine)和利匹韦林(rilpivirine)。病毒酶整合酶负责将病毒DNA整合到感染细胞的DNA中。因此，整合酶抑制剂，例如雷特格韦(raltegravir)、埃替格韦(elvitegravir)和杜鲁格韦(dolutegravir)可以阻止病毒复制这一步骤。蛋白酶抑制剂通过防止gag和gag/pol前体蛋白的裂解，阻断从宿主膜出芽时产生成熟病毒体所必需的病毒蛋白酶，包括洛匹那韦(lopinavir)、茚地那韦(indinavir)、奈非那韦(nelfinavir)、安普那韦(amprenavir)、利托那韦(ritonavir)、达芦那韦(darunavir)和阿扎那韦(atazanavir)。可以与CD24蛋白组合使用的ART固定剂量组合的示例包括可比韦(Combivir)(拉米夫定(lamivudine)+齐多夫定(zidovudine)，葛兰素史克(GlaxoSmithKline))、克力芝(Kaletra)(洛匹那韦(lopinavir)+利托那韦(ritonavir)，雅培(Abbott Laboratories))、三协唯(Trizivir)(阿巴卡韦(abacavir)+拉米夫定(lamivudine)+齐多夫定(zidovudine)，葛兰素史克)、Epzicom/克为滋(Kivexa)(阿巴卡韦+拉米夫定，GlaxoSmithKlinezz0)、特鲁瓦达(Truvada)(富马酸替诺福韦二吡呋酯(tenofovir disoproxil fumarate)+恩曲他滨(emtricitabine)，Gilead Sciences)、立普妥(Atripla)(恩曲他滨+富马酸替诺福韦二吡呋酯+依法韦伦，Gilead Sciences和Bristol-Myers Squibb)、康普莱(Complera)/Eviplera(恩曲他滨+利匹韦林+富马酸替诺福韦二吡呋酯，Gilead Sciences和Janssen Therapeutics)、Stribild(埃替格韦+可比司他(cobicistat)+恩曲他滨+富马酸替诺福韦二吡呋酯，Gilead Sciences)、绥美凯(Triumeq)(阿巴卡韦+杜鲁格韦+拉米夫定，ViiV Healthcare)、Evotaz(阿扎那韦+可比司他，Bristol-Myers Squibb)、Prezcobix(达芦那韦+可比司他，Janssen Therapeutics)、Dutrebis(拉米夫定+雷特格韦，Merck&Co.)、Genvoya(埃替格韦+可比司他+恩曲他滨+富马酸丙酚替诺福韦(tenofovir alafenamide fumarate)，Gilead Sciences)和达可挥(Descovy)(恩曲他滨+富马酸丙酚替诺福韦，Gilead Sciences)。其他组合疗法包括缬更昔洛韦(valganciclovir)，抗LPS抗体和碳酸司维拉姆(Sevelamer carbonate)。

CD24蛋白可与其他治疗同时或规律地施用。如本文所用，术语“同时的”或“同时地”是指在彼此的48小时内，优选24小时内，更优选12小时内，再更优选6小时内，最优选3小时内或更短时间内施用CD24蛋白和其他治疗。如本文所用，术语“规律地(metronomically)”是指在与其他治疗不同的时间并且相对于重复施用以一定频率施用药剂。

可以在另一种治疗之前的任何时间点施用CD24蛋白，包括约120小时、118小时、116小时、114小时、112小时、110小时、108小时、106小时、104小时、102小时、100小时、98小时、96小时、94小时、92小时、90小时、88小时、86小时、84小时、82小时、80小时、78小时、76小时、74小时、72小时、70小时、68小时、66小时、64小时、62小时、60小时、58小时、56小时、54小时、52小时、50小时、48小时、46小时、44小时、42小时、40小时、38小时、36小时、34小时、32小时、30小时、28小时、26小时、24小时、22小时、20小时、18小时、16小时、14小时、12小时、10小时、8小时、6小时、4小时、3小时、2小时、1小时、55分钟、50分钟、45分钟、40分钟、35分钟、30分钟、25分钟、20分钟、15分钟、10分钟、9分钟、8分钟、7分钟、6分钟、5分钟、4分钟、3分钟、2分钟和1分钟。可以在第二次CD24蛋白治疗之前的任何时间点施用CD24蛋白，包括约120小时、118小时、116小时、114小时、112小时、110小时、108小时、106小时、104小时、102小时、100小时、98小时、96小时、94小时、92小时、90小时、88小时、86小时、84小时、82小时、80小时、78小时、76小时、74小时、72小时、70小时、68小时、66小时、64小时、62小时、60小时、58小时、56小时、54小时、52小时、50小时、48小时、46小时、44小时、42小时、40小时、38小时、36小时、34小时、32小时、30小时、28小时、26小时、24小时、22小时、20小时、18小时、16小时、14小时、12小时、10小时、8小时、6小时、4小时、3小时、2小时、1小时、55分钟、50分钟、45分钟、40分钟、35分钟、30分钟、25分钟、20分钟、15分钟、10分钟、9分钟、8分钟、7分钟、6分钟、5分钟、4分钟、3分钟、2分钟和1分钟。

可以在另一种治疗后的任何时间点施用CD24蛋白，包括约1分钟、2分钟、3分钟、4分钟、5分钟、6分钟、7分钟、8分钟、9分钟、10分钟、15分钟、20分钟、25分钟、30分钟、35分钟、40分钟、45分钟、50分钟、55分钟、1小时、2小时、3小时、4小时、6小时、8小时、10小时、12小时、14小时、16小时、18小时、20小时、22小时、24小时、26小时、28小时、30小时、32小时、34小时、36小时、38小时、40小时、42小时、44小时、46小时、48小时、50小时、52小时、54小时、56小时、58小时、60小时、62小时、64小时、66小时、68小时、70小时、72小时、74小时、76小时、78小时、80小时、82小时、84小时、86小时、88小时、90小时、92小时、94小时、96小时、98小时、100小时、102小时、104小时、106小时、108小时、110小时、112小时、114小时、116小时、118小时和120小时。可以在前一次CD24治疗之后的任何时间点施用CD24蛋白，包括约120小时、118小时、116小时、114小时、112小时、110小时、108小时、106小时、104小时、102小时、100小时、98小时、96小时、94小时、92小时、90小时、88小时、86小时、84小时、82小时、80小时、78小时、76小时、74小时、72小时、70小时、68小时、66小时、64小时、62小时、60小时、58小时、56小时、54小时、52小时、50小时、48小时、46小时、44小时、42小时、40小时、38小时、36小时、34小时、32小时、30小时、28小时、26小时、24小时、22小时、20小时、18小时、16小时、14小时、12小时、10小时、8小时、6小时、4小时、3小时、2小时、1小时、55分钟、50分钟、45分钟、40分钟、35分钟、30分钟、25分钟、20分钟、15分钟、10分钟、9分钟、8分钟、7分钟、6分钟、5分钟、4分钟、3分钟、2分钟和1分钟。

实施例1

在小鼠中的CD24药代动力学

将1mg CD24Fc(CD24Fc)注入未免疫的C57BL/6小鼠中，并在不同时间点(5分钟、1小时、4小时、24小时、48小时、7天、14天和21天)采集血样，其中每个时间点3只小鼠。血清以1：100稀释，并使用夹心ELISA检测CD24Fc的水平，使用纯化的抗人CD24(3.3μg/ml)作为捕获抗体，过氧化物酶偶联的山羊抗人IgG Fc(5μg/ml)作为检测抗体。如图3a所示。CD24Fc的衰减曲线显示了蛋白质的典型双相衰减。第一生物分布阶段的半衰期为12.4小时。第二阶段遵循从中央隔室进行一阶消除的模型。第二阶段的半衰期为9.54天，其与体内抗体相似。这些数据表明融合蛋白在血流中非常稳定。在另一项将融合蛋白皮下注射的研究中，观察到几乎相同的9.52天半衰期(图3b)。更重要的是，尽管CD24Fc大约需要48小时才能达到血液中的峰值水平，但通过AUC测得的血液中融合蛋白的总量在任一种注射途径下都基本相同。因此，从治疗的角度，不同的注射途径不应影响药物的治疗效果。这种观察大大简化了灵长类动物毒性和临床试验的实验设计。

实施例2

宿主对组织损伤反应中的CD24-Siglec 10相互作用

大约二十年前，马特辛格(Matzinger)提出了通常被称为的危险理论。从本质上讲，她认为免疫***在感知到宿主的危险时就会打开。尽管当时危险的性质还没有很好的定义，但是已经确定坏死与细胞内组分如HMGB1和热休克蛋白的释放有关，这些组分被称为DAMP，危险相关的分子模式。发现DAMP促进炎性细胞因子和自身免疫疾病的产生。在动物模型中，发现HMGB1和HSP90抑制剂可改善RA。DAMP的参与提出了对于RA疗法可以探索宿主对DAMP响应的负调节的前景。

使用对乙酰氨基酚诱导的肝坏死并确保炎症，已观察到通过相互作用Siglec G，CD24为宿主对组织损伤的响应提供了强有力的负调控。CD24是GPI锚定分子，在造血细胞和其他组织干细胞中广泛表达。对人类多种自身免疫性疾病的遗传分析，包括多发性硬化症、***性红斑狼疮、RA和巨细胞关节炎，表明CD24多态性与自身免疫性疾病风险之间存在显著关联。Siglec G是I-lectin家族的成员，由其识别包含唾液酸的结构的能力定义。SiglecG识别CD24上含有唾液酸的结构，并通过树突状细胞负调节炎症细胞因子的产生。就其与CD24相互作用的能力而言，人类Siglec 10和小鼠Siglec G在功能上是等效的。但是，尚不清楚小鼠和人类同源物之间是否存在一一对应的关系。尽管该机制尚待充分阐明，但与Siglec G相关的SHP1可能参与了负调控是合理的。这些数据导致了一个新模型，其中CD24-Siglec G/10相互作用可能在区分病原体相关分子模式(PAMP)与DAMP方面起关键作用(图4)。

至少两种重叠机制可以解释CD24的功能。首先，通过与多种DAMP结合，CD24可以捕获炎性刺激，以防止其与TLR或RAGE相互作用。CD24与包括HSP70、90，HMGB1和核仁蛋白在内的数个DAMP分子相关的观察结果支持了这一观点。其次，也许在与DAMP结合后，CD24可能会刺激Siglec G的信号传导。这两种机制可协同作用，因为具有任一基因的靶向突变的小鼠引起强得多的炎症反应。实际上，当用HMGB1、HSP70或HSP90刺激时，从CD24-/-或SiglecG-/-小鼠的骨髓中培养的DC产生高得多的炎症细胞因子。相反，在它们对PAMP例如LPS和PolyI：C的反应中未发现作用。这些数据不仅提供了先天免疫***区分病原体与组织损伤的机制，而且还表明CD24和Siglec G是与组织损伤相关的疾病的潜在治疗靶标。

实施例3

CD24Fc与HMGB1、Siglec 10相互作用并诱导Siglec G和SHP-1之间的缔合。

为了测量CD24Fc和Siglec 10之间的相互作用，将CD24Fc固定在CHIP上，并使用Biacore来测量不同浓度的Siglec-10Fc的结合。如图5a所示，CD24Fc以1.6x10^-7M的Kd与Siglec 10结合。这比对照Fc高100倍的亲和力。CD24Fc和HMGB1之间的相互作用通过使用CD24Fc结合的蛋白G珠的下拉实验，然后用抗IgG或抗HMGB1进行蛋白质印迹进行证实。这些数据证明CD24Fc而不是Fc结合至HMGB1，并且该结合是阳离子依赖性的(图5b)。为了确定CD24Fc是否是人类Siglec 10的小鼠对应物Siglec G的激动剂，用CD24Fc、对照Fc或媒介物(PBS)对照刺激了CD24-/-脾细胞30分钟。然后对Siglec G进行免疫沉淀，并用抗磷酸酪氨酸或抗SHP-1进行探测。如图5c所示，CD24Fc诱导了Siglec G的实质性磷酸化和SHP-1的结合，SHP-1是公知的适应和先天免疫两者的抑制剂。

CD24Fc的体外功效研究。

为了研究CD24Fc对人T细胞产生炎性细胞因子的影响，在不同浓度CD24Fc或人IgG1 Fc的存在下通过抗CD3抗体(OKT3)激活人PBML中的成熟T细胞，该抗体是T细胞受体的常用激动剂。4天后，收集上清液，并通过酶联免疫吸附测定(ELISA)测量IFN-γ和TNF-α的产生以确认激活。图6的结果证明与对照IgG Fc对照相比，来自两个不同生产批次的CD24Fc显著降低了来自活化的人PBML的IFN-γ和TNF-α的产生。另外，当添加CD24Fc时，以剂量依赖的方式抑制细胞因子的产生。因此，CD24Fc可以在体外抑制抗CD3诱导的人PBML活化。这项研究不仅表明CD24Fc的作用机理可以是通过抑制T细胞活化，而且还建立了可靠的生物测定方法，用于药物效力和稳定性测试。

为了确定CD24Fc是否调节人类细胞系中炎性细胞因子的产生，首先使用RNAi使人类急性单核细胞白血病THP1细胞系中的CD24沉默，然后通过用PMA处理将其诱导分化为巨噬细胞。如图7a所示，CD24沉默显著增加了TNFα、IL-1β和IL-6的产生。这些数据证明了内源性人CD24在限制炎症细胞因子产生中的重要作用。重要的是，CD24Fc恢复了对CD24沉默的细胞系中TNFα(图7B)以及IL-1β和IL-6的抑制。这些数据不仅证明了CD24在人类细胞炎症反应中的相关性，而且还提供了一种简单的测定方法来评估CD24Fc的生物学活性。

综上所述，这些数据证明CD24Fc能够抑制由适应性和先天性刺激触发的细胞因子产生。然而，由于该药物在减少先天效应子产生的细胞因子方面更为有效，因此认为其预防功能的主要机制是预防移植初期由组织损伤触发的炎症。

实施例4

CD24与SIV的预防

CD24Fc保护SIV感染的猕猴。在感染后第8、8.5、9.5、30、30.5和31天，用媒介物对照或CD24Fc(12.5mg/kg)处理两组SIV感染的中华猕猴(ChRM)，并在整个研究过程中监测免疫激活(图8A)。在第0天和然后在感染后56、107、155、189、209和223天(DAI)测量体重。相对于56DAI的体重减轻示于图8B。观察到CD24Fc对SIV感染的猴子体重有非常显著的影响。在对照组中，在155、189、209和231DAI时，体重减轻比率超过10％分别为25％(1/4)、75％(3/4)、75％(3/4)和100％(4/4)。在107DAI时，对照组中的一只猴子体重减轻超过15％(15.66％)并在119DAI时死亡，而两名对照受试者具有体重减轻超过25％(29.11％和43.68％)。在CD24Fc处理组中，在155、189、209和231DAI期间在这些日期体重减轻超过10％的猴子的频率分别为0(0/6)、33.33％(2/6)、20％(1/5)和20％(1/5)。在207DAI在处理开始时，具有最低CD4+T计数的一名受试者死亡。使用体重减轻至少10％作为AIDS消耗综合征的基础，CD24Fc处理显著降低了AIDS消耗综合征(P＝0.0173)(图8C)。

腹泻是HIV-1/AIDS的另一种常见症状，与胃肠道功能障碍和机会性感染有关。每天检查猴子的健康状况并记录。如果观察到两天连续腹泻，则确诊且猴子接受青霉素治疗。如果治疗3天后症状仍未缓解，则使用复方新诺明(selectrin)，并增加青霉素的剂量。如果在一周的治疗后，症状持续，则被诊断为顽固性腹泻。如图8D所示，在对照组中，三只猴子患有顽固性腹泻，且其中一只在2周后死于顽固性腹泻，而其他的体重减轻了25％以上。分配给CD24Fc组的猴子在治疗前有腹泻，但很快就康复。两只猴子在CD24Fc处理后第4周发展为腹泻，但很快就康复。因此，CD24Fc保护所有猴子免于发展为顽固性腹泻。使用时序检验，发现CD24Fc与对照组之间的腹泻率存在统计学上的显著差异(P＝0.0046)。由于消耗综合征和顽固性腹泻是AIDS中最常见的综合征，因此具有一种或两种症状的受试者被认为已被AIDS压垮。使用Kaplan Meier分析，发现CD24Fc对AIDS具有统计学上显著的保护作用(P＝0.0112)(图8E)。

CD24Fc延迟了血浆病毒载量的升高和降低了PBMC、骨髓和肠道中的前病毒载量。为了评估CD24Fc对病毒复制的影响，检测了血浆中的病毒载量和组织中的前病毒载量。SIV感染的特征在于血浆病毒载量迅速上升，随后病毒载量迅速降至最低水平。由于目标是研究病毒复制后减轻炎症的影响在很大程度上得到控制，在感染后8周开始治疗，此时病毒滴度最低。如预期的那样，对照组的血浆病毒载量逐渐增加。令人惊讶的是，在CD24Fc处理的组中观察到病毒载量增加很少，导致在26周和30周时与治疗前水平相比病毒载量显著降低(图9A)。与感染后8周相比(标准化为1.0)，在感染后30周时观察到CD24Fc处理组的病毒载量最大增加(8.79±4.54)，其显著低于对照组中观察到的(32.68±13.45)(P＝0.001；图9B)。此外，在所有测试的时间点，CD24Fc也显示降低了PBMC中的前病毒载量(图9C)，尽管这种降低在统计学上不显著。当比较组织前病毒载量时，CD24Fc处理组在骨髓中水平显著较低(P＝0.0004)，其已知是主要病毒库(图9D)。

CD24Fc可以降低肠道的炎症。使用SIV感染的猴子中炎症因子的表达来评估CD24Fc对炎症的作用。出乎意料的是，在纵向分析中，CD24Fc对PBMC中的IFN-α、TNF-α、IL-6、IFN-γ、IDO和IL-1β表达没有影响。因此，炎性细胞因子的全身性降低可能不能解释CD24Fc的治疗作用。为了解决CD24Fc对内部器官炎症反应的影响，在SIV感染后30周开始另一轮CD24Fc处理(在30、30.5和31周12.5mg/kgx3)，并在感染32周后对猴子实施安乐死以分析肠道炎性细胞因子的转录本和病理。在脾脏、骨髓、肠系膜LN、腹股沟LN或回肠LC中未观察到CD24Fc对IFN-α、TNF-α、IL-6、IFN-γ、IDO或IL-1β表达的影响(数据未显示)。然而，CD24Fc处理减弱了直肠中TNF-α、IFN-γ、IDO和IL-1β的表达(图10A)。这些结果提示CD24Fc处理可以选择性地抑制肠道炎症。为了证实这些数据，通过回肠、结肠和直肠中MPO的表达的免疫荧光染色分析了粒细胞的浸润。尽管在对照组或CD24Fc处理组的个体的所有切片中均检测到MPO阳性细胞，但是与对照组相比，CD24Fc处理组在直肠和结肠中具有明显较低的MPO+细胞数量(图10B)。

炎症细胞浸润，上皮改变和粘膜结构被定义为肠道病理学的三个主要类别[83][Geboes et al.,2000]。通常，白细胞密度和白细胞浸润的扩展是炎症细胞浸润的两个标准。上皮变化包括隐窝上皮细胞增生、杯状细胞丢失以及隐窝炎和隐窝脓肿。基于溃疡、不规则隐窝或肉芽组织的存在对粘膜结构进行分级。对肠道切片进行组织病理学分析，并以双盲方式对切片进行评分。H&E染色的代表性图像在图10C中显示，且在图10D中示出了总计分数。小肠、结肠和直肠的组织学检查显示完整的上皮屏障破裂，在回肠切片中腺体上皮细胞脱离管腔(图10Ca)，在结肠切片中具有明显的嗜中性粒细胞、巨噬细胞和嗜酸性粒细胞浸润的上皮内和上皮内脓肿形成(图10Cb)，在直肠切片中有肌层血管周围淋巴细胞浸润(图10Cd)和间质性水肿(图10Ce)。病理变化表明在对照SIV感染组中具有严重炎症。相反，CD24Fc处理组在回肠中仅显示轻度上皮脱离(图10Cf)。尽管存在隐性增生，但来自CD24Fc处理组的结肠切片中没有隐窝炎或隐窝脓肿(图10Cg)。直肠肌层中淋巴细胞浸润最少且间质性水肿最少(图10Ci)。综合病理评分，很明显，CD24Fc可显著降低SIV感染猴子的肠道炎症。

总之，这些数据表明CD24Fc能够降低大肠炎症、免疫激活并调节SIV特异性CD4+T细胞应答和T细胞增殖，并且CD24Fc的施用可以对SIV感染的动物有益。这项研究还强调了DAMP在HIV-1感染发病机制中的重要性，并证明阻断DAMP触发的先天免疫应答是控制/治疗HIV-1/AIDS的免疫治疗策略，而CD24Fc是用于AIDS治疗的潜在治疗剂。

实施例5

CD24治疗人源化小鼠的HIV感染。

CD24Fc处理减少HIV-1病毒载量并在急性HIV感染小鼠脾脏中保护CD4+T细胞免于 损耗。首先研究了CD24Fc处理是否会影响人源化小鼠急性HIV-1感染中的HIV-1复制和免疫发病机制。如图11A所示，在媒介物处理组中，R3A复制在感染后1周(wpi)迅速增加至1x10⁶拷贝/ml，然后在2-3wpi时逐渐增加至10⁸拷贝/ml。在CD24Fc处理组中，第一周的R3A增加不受影响。但是，在2和3wpi时未观察到进一步的增加。然而，CD24Fc处理并未中止CD3+T细胞中CD4T细胞频率的降低(图11B)。值得注意的是，在3wpi小鼠终止时，CD24Fc处理显著增加了脾脏中CD4⁺T细胞的数量(图11C)。CD4⁺T细胞数量的这种增加对应于人源化小鼠的脾脏中总人类淋巴细胞的增加(图11D)。这些数据表明，CD24Fc具有降低HIV-1病毒载量并保护CD4⁺T细胞免于急性HIV感染人源化小鼠脾脏中损耗的潜力。

CD24Fc处理降低了慢性HIV感染的人源化小鼠中的HIV-1复制。接下来，研究了CD24Fc处理是否影响JR-CSF感染后人源化小鼠中的慢性HIV-1复制。连续检测了这些小鼠的血浆HIV-1载量，发现自HIV-1感染开始以来血浆中HIV-1载量持续增加。如预期的那样，联合抗逆转录病毒疗法(cART)将血浆HIV-1载量完全抑制到无法检测的水平。与HIV-1感染的小鼠相比，CD24Fc处理能够限制血浆HIV-1载量的增加，从而导致在处理的小鼠中HIV-1载量的水平显著降低(图12A)。当小鼠被终止时，在各种淋巴组织中进一步检测到CD4+T细胞的p24表达(图12B)。观察到CD24Fc处理将p24表达细胞的百分比降低了5倍以上。再次，正如预期的那样，cART显得更加有效，导致降低了10到20倍(图12B)。来自每组涉及6-7只小鼠的研究的组合数据进一步证实了脾脏和***中p24表达细胞的显著降低(图12C)。这些数据表明CD24Fc处理抑制人源化小鼠中的慢性HIV-1复制。

CD24Fc处理补充了患有慢性HIV-1感染的人源化小鼠的初始型T细胞部分。使用CCR7和CD45RA作为初始型T细胞的标志物，在具有HIV-1感染的人源化小鼠中测试了CD24Fc处理对CD4T细胞亚群的作用(图13A)。在对照Ig处理的小鼠中，HIV-1感染显著降低了CD4和CD8T细胞中CD45RA⁺CCR7⁺初始型T细胞的比例，并增加了CD45RA^-CCR7^-效应记忆T细胞亚群的比例。重要的是，CD24Fc处理显著逆转了HIV-1感染的人源化小鼠脾脏中CD4和CD8T细胞亚群的倾斜。显著地，CD24Fc在预防慢性感染的小鼠中的初始型T细胞的致病性丧失方面几乎与cART一样有效(图13B)。

CD24Fc处理降低具有慢性HIV-1感染的人源化小鼠体内的免疫过度激活。进一步研究了CD24Fc处理是否具有缓解HIV-1诱导的免疫发病机制的潜力。免疫过度激活已被证明是慢性HIV-1感染人类疾病进展的标志。因此，在各种淋巴组织中检测到CD4和CD8T细胞的活化(图14A)。与HIV-1感染的患者相似，与mock小鼠相比，HIV-1感染显著增加了人源化小鼠***、脾脏和骨髓中CD38+HLA-DR+CD4+T细胞和CD8+T细胞的比例。正如预期的那样，cART在所有HIV-1感染的小鼠中测试的所有淋巴组织中都将CD4+和CD8+T细胞的激活程度大大降低至接近正常水平。重要的是，在HIV-1感染期间，CD24Fc处理也显著降低了***中的CD4+T细胞的活化以及来自***和脾的活化的CD8+T细胞的活化(图14B)。这些数据表明CD24Fc具有限制由持续性HIV-1感染引起的免疫过度激活和炎症的潜力。

CD24Fc处理在体外和体内阻断HIV-1诱导的促炎性细胞因子的产生。测试了CD24Fc是否能够降低促炎细胞因子。如图15A所示，在体外，R3A感染诱导促炎性细胞因子IL-1β蛋白，并且该诱导在很大程度上被CD24Fc消除(图15A)。同样，CD24Fc也显著降低IL6和Pro-IL-1βmRNA(图15B)。如图15C所示，进一步测试了CD24Fc处理对急性HIV-1感染中T细胞活化和促炎细胞因子的影响。重要的是，CD24Fc处理显著抑制血浆IL-6、IL-8、IFN-γ和IL-17a(图15D)。

CD24Fc处理拯救持续性HIV-1感染引起的血抑制。最后，评估了CD24Fc处理对HIV-1感染期间BM造血抑制的影响。纯化Lin-CD34+细胞用于集落形成测定，包括粒细胞/巨噬细胞(GM)、红系细胞(E)和粒细胞/红系细胞/巨噬细胞/巨核细胞(GEMM)亚群。结果表明，与单独的HIV-1感染相比，CD24Fc处理也显著增强了总群体以及每个集落类型的CFU活性(图16)。

实施例6

在人体中的CD24药代动力学

本实施例显示了CD24蛋白在人体内的药代动力学分析。这源自于I期、随机、双盲、安慰剂对照、单次上升剂量研究，以评估健康男性和女性成年受试者中CD24Fc的安全性、耐受性和PK。这项研究共纳入了5个组，共40位受试者，每组8位受试者。每个组的8位受试者中有6位接受了研究药物，而2位受试者接受了安慰剂(0.9％氯化钠，盐水)。第一组的剂量为10mg。随后的组接受30mg、60mg、120mg和240mg的CD24Fc或相匹配的安慰剂，并至少间隔3周给药，以便回顾每个先前组的安全性和耐受性数据。仅在证明足够的安全性和耐受性后，才允许对新的受试者组再施用下一次的较高剂量。

在每个组中，最初的2名受试者在第1天为1名研究用药接受者和1名安慰剂接受者。在第7天后对第3至5名受试者和第6至8名受试者进行给药(亚组之间至少间隔24小时)。在同一亚组中，每位受试者至少间隔1小时。如有必要，延迟其余受试者的给药，直至对在该组中涉及第一或第二亚组的给药后期间可能出现的任何重大安全性问题进行审查。随后的组在前一个组之后至少3周给药。

筛选期：

筛选访问(第1次访问)在有效治疗期开始之前至多21天进行。提供知情同意后，受试者应进行资格筛选程序。

治疗期：

受试者在第-1天(第2次访问)进入临床药理学部门(CPU)，并且随机治疗期间从过夜禁食至少10小时后的第1天开始。将受试者随机分配为单剂量CD24Fc或安慰剂治疗。受试者一直被限制到第4天早上。

随访：

所有受试者在第7天、第14天、第21天、第28天和第42天(±1天)返回CPU，进行随访(第3次访问、第4次访问、第5次访问、第6次访问和第7次访问)。第7次访问是所有受试者的最后一次访问。

治疗持续时间：每个受试者的总研究持续时间长达63天。单剂量施用在第1天进行。

受试者数量：

计划：40位受试者

已筛选：224位受试者

随机：40位受试者

已完成：39位受试者

已中断：1位受试者

诊断和纳入的主要标准：该研究的人群为年龄在18至55岁(含18和55岁)之间的健康男性和女性，体重指数在18kg/m²至30kg/m²(含18kg/m²至30kg/m²)之间。

研究产品和比较者信息：

CD24Fc：通过静脉输注施用药的单剂量10mg、30mg、60mg、120mg或240mg；批号：09MM-036。CD24Fc是完全人源化的融合蛋白，其由人CD24的成熟序列和人免疫球蛋白G1(IgG1Fc)的片段可结晶区组成。CD24Fc以无菌、透明、无色、不含防腐剂的水溶液形式提供，用于静脉注射施用。CD24Fc配制成单剂量注射溶液，浓度为10mg/mL，pH值为7.2。每个CD24Fc小瓶在16mL±0.2mL CD24Fc中包含160mg CD24Fc、5.3mg氯化钠、32.6mg磷酸氢二钠七水合物和140mg磷酸二氢钠一水合物。将CD24Fc装在透明的带有氯丁基橡胶塞和铝翻转密封件的硼硅玻璃小瓶中。

通过静脉输注施用匹配的安慰剂(0.9％氯化钠，盐水)；批号：P296855、P311852、P300715、P315952。

意向治疗(ITT)人群包括接受至少1剂研究药物的所有受试者。ITT人群是受试者信息和安全性评估的主要分析人群。

通过治疗和访问总结了临床实验室评估(化学、血液学和尿液分析)。还总结了从基线的变化。通过治疗和时间点总结了生命体征(血压、心率、呼吸频率和体温)。还总结了从基线的变化。列出所有身体检查数据。总结了心电图参数和基线的变化。列出了总体解释。

血浆CD24Fc浓度

如图17所示，CD24Fc的平均血浆浓度与所施用的CD24Fc的剂量成比例地增加。对于除120mg以外的所有剂量组，在给药后1小时达到CD24Fc的最大平均血浆浓度。对于120mg组给药后2小时达到CD24Fc的最大平均血浆浓度。到第42天(984小时)，所有组的CD24Fc平均血浆浓度已降至最大平均血浆浓度的2％至4％之间。

表1总结了通过对PK可评估人群进行治疗的血浆CD24Fc PK参数。

表1 治疗–PK可评估人群的血浆CD24Fc药代动力学参数汇总

血浆CD24Fc剂量比例分析

图18示出了PK可评估群体的CD24Fc C_max与剂量的剂量比例图。图19示出了PK可评估群体的CD24Fc AUC_0-42d与剂量的剂量比例图。图20示出了PK可评估群体的CD24FcAUC_0-inf与剂量的剂量比例图。表2显示了剂量比例的功效分析。

表2 剂量比例的功效分析：血浆CD24Fc药代动力学参数–PK可评估群体

C_max斜率估计值为1.172，90％CI为1.105至1.240。AUC_0-42d斜率估计值为1.088，90％CI为1.027至1.148。AUC_0-inf斜率估计值为1.087，90％CI为1.026至1.1。

药代动力学结论

血浆CD24Fc的C_max和AUC与在小鼠、猴和人中施用的剂量成比例增加。血浆CD24Fc在1.01和1.34小时之间达到T_max。血浆CD24Fc的t_1/2在280.83至327.10小时之间。

实施例7

CD24能够用于治疗移植物对抗宿主病

本实施例证明了CD24可以通过负调节宿主对细胞DAMP的响应来治疗或预防GvHD，而不影响移植细胞的移植物抗宿主(GVL)作用。异源HSCT后，NK细胞可以增强移植并介导移植物抗白血病，但是在HSCT之后由自然重构的NK细胞介导的移植物抗白血病的效力是有限的。临床前研究表明，NK细胞的激活会上调激活受体的表达并增强杀伤能力(Shah et al2015)。然后在一项临床试验中对此进行了测试，该试验研究了在具有超高风险实体瘤的儿童和年轻人中，在HLA匹配、T细胞耗竭的非清髓性外周血干细胞移植后，供体来源的活化NK细胞(aNK-DLI)的过继转移。aNK-DLI表现出强大的杀伤能力，并显示高水平的激活受体表达。然而，在9个移植接受者中，有5个在aNK-DLI后经历了急性移植物抗宿主病(GVHD)，在3名受试者中观察到4级GVHD。相对匹配的同胞供体接受者，GVHD在匹配的无关供体中更常见，并且与较高的供体CD3嵌合现象相关。鉴于在这种情况下T细胞剂量低于GVHD所需的阈值，可以得出结论，aNK-DLI促进了观察到的急性GVHD，其可能是通过增加潜在的T细胞同种异体反应性。因此，本文所述的CD24蛋白可用于治疗或阻碍动物中的GvHD。

参考文献

1.Munoz LE,Janko C,Schulze C,Schorn C,Sarter K,Schett G,HerrmannM.Autoimmunity and chronic inflammation-two clearance-related steps in theetiopathogenesis of SLE.Autoimmun Rev.2010；10(1):38-42.Epub 2010/09/08.doi:10.1016/j.autrev.2010.08.015.PubMed PMID:20817127.

2.Urbonaviciute V,Furnrohr BG,Meister S,Munoz L,Heyder P,De MarchisF,Bianchi ME,Kirschning C,Wagner H,Manfredi AA,Kalden JR,Schett G,Rovere-Querini P,Herrmann M,Voll RE.Induction of inflammatory and immune responsesby HMGB1-nucleosome complexes:implications for the pathogenesis of SLE.J ExpMed.2008；205(13):3007-18.PubMed PMID:19064698.

3.Wen Z,Xu L,Chen X,Xu W,Yin Z,Gao X,Xiong S.Autoantibody inductionby DNA-containing immune complexes requires HMGB1with the TLR2/microRNA-155pathway.Journal of Immunology.2013；190(11):5411-22.Epub 2013/04/26.doi:10.4049/jimmunol.1203301.PubMed PMID:23616573.

4.Andersson U,Harris HE.The role of HMGB1in the pathogenesis ofrheumatic disease.Biochim Biophys Acta.1799(1-2):141-8.PubMed PMID:20123076.

5.Ostberg T,Kawane K,Nagata S,Yang H,Chavan S,Klevenvall L,Bianchi M,Harris HE,Andersson U,Palmblad K.Protective targeting of HMGB1 in aspontaneous arthritis model.Arthritis Rheum.2010；62:2963-72.PubMed PMID:20533288.

6.Rice JW,Veal JM,Fadden RP,Barabasz AF,Partridge JM,Barta TE,DuboisLG,Huang KH,Mabbett SR,Silinski MA,Steed PM,Hall SE.Small molecule inhibitorsof Hsp90 potently affect inflammatory disease pathways and exhibit activityin models of rheumatoid arthritis.Arthritis Rheum.2008；58(12):3765-75.PubMedPMID:19035474.

7.Ahrens S,Zelenay S,Sancho D,Hanc P,Kjaer S,Feest C,Fletcher G,Durkin C,Postigo A,Skehel M,Batista F,Thompson B,Way M,Reis e Sousa C,SchulzO.F-actin is an evolutionarily conserved damage-associated molecular patternrecognized by DNGR-1,a receptor for dead cells.Immunity.2012；36(4):635-45.Epub 2012/04/10.doi:S1074-7613(12)00126-4[pii]10.1016/j.immuni.2012.03.008.PubMed PMID:22483800.

8.Yamasaki S,Ishikawa E,Sakuma M,Hara H,Ogata K,Saito T.Mincle is anITAM-coupled activating receptor that senses damaged cells.Nat Immunol.2008；9(10):1179-88.Epub 2008/09/09.doi:ni.1651[pii]10.1038/ni.1651.PubMed PMID:18776906.

9.Cavassani KA,Ishii M,Wen H,Schaller MA,Lincoln PM,Lukacs NW,Hogaboam CM,Kunkel SL.TLR3 is an endogenous sensor of tissue necrosis duringacute inflammatory events.Journal of Experimental Medicine.2008；205(11):2609-21.PubMed PMID:18838547.

10.Ivanov S,Dragoi AM,Wang X,Dallacosta C,Louten J,Musco G,Sitia G,Yap GS,Wan Y,Biron CA,Bianchi ME,Wang H,Chu WM.A novel role for HMGB1 inTLR9-mediated inflammatory responses to CpG-DNA.Blood.2007；110(6):1970-81.Epub 2007/06/06.doi:blood-2006-09-044776[pii]10.1182/blood-2006-09-044776.PubMed PMID:17548579；PMCID:1976374.

11.Sims GP,Rowe DC,Rietdijk ST,Herbst R,Coyle AJ.HMGB1 and RAGE ininflammation and cancer.Annu Rev Immunol.28:367-88.PubMed PMID:20192808.

12.van Beijnum JR,Buurman WA,Griffioen AW.Convergence andamplification of toll-like receptor(TLR)and receptor for advanced glycationend products(RAGE)signaling pathways via high mobility group B1(HMGB1).Angiogenesis.2008；11(1):91-9.PubMed PMID:18264787.

13.Warger T,Hilf N,Rechtsteiner G,Haselmayer P,Carrick DM,Jonuleit H,von Landenberg P,Rammensee HG,Nicchitta CV,Radsak MP,Schild H.Interaction ofTLR2 and TLR4 ligands with the N-terminal domain of Gp96 amplifies innate andadaptive immune responses.The Journal of biological chemistry.2006；281(32):22545-53.PubMed PMID:16754684.

14.Zhang Q,Raoof M,Chen Y,Sumi Y,Sursal T,Junger W,Brohi K,Itagaki K,Hauser CJ.Circulating mitochondrial DAMPs cause inflammatory responses toinjury.Nature.2010；464(7285):104-7.Epub 2010/03/06.doi:nature08780[pii]10.1038/nature08780.PubMed PMID:20203610；PMCID:2843437.

15.Chen GY,Tang J,Zheng P,Liu Y.CD24 and Siglec-10 selectivelyrepress tissue damage-induced immune responses.Science.2009；323(5922):1722-5.doi:10.1126/science.1168988.PubMed PMID:19264983；PMCID:PMC2765686.

16.Chen GY,Chen X,King S,Cavassani KA,Cheng J,Zheng X,Cao H,Yu H,QuJ,Fang D,Wu W,Bai XF,Liu JQ,Woodiga SA,Chen C,Sun L,Hogaboam CM,Kunkel SL,Zheng P,Liu Y.Amelioration of sepsis by inhibiting sialidase-mediateddisruption of the CD24-SiglecG interaction.Nat Biotechnol.2011；29(5):428-35.doi:10.1038/nbt.1846.PubMed PMID:21478876；PMCID:PMC4090080.

17.Chen W,Han C,Xie B,Hu X,Yu Q,Shi L,Wang Q,Li D,Wang J,Zheng P,LiuY,Cao X.Induction of Siglec-G by RNA viruses inhibits the innate immuneresponse by promoting RIG-I degradation.Cell.2013；152(3):467-78.Epub 2013/02/05.doi:10.1016/j.cell.2013.01.011.PubMed PMID:23374343.

18.Goris A,Maranian M,Walton A,Yeo TW,Ban M,Gray J,Dubois B,CompstonA,Sawcer S.CD24 Ala/Val polymorphism and multiple sclerosis.Journal ofneuroimmunology.2006.PubMed PMID:16631259.

19.Otaegui D,Saenz A,Camano P,Blazquez L,Goicoechea M,Ruiz-MartinezJ,Olaskoaga J,Emparanza JA,Lopez de Munain A.CD24 V/V is an allele associatedwith the risk of developing multiple sclerosis in the Spanishpopulation.Multiple sclerosis(Houndmills,Basingstoke,England).2006；12(4):511-4.Epub 2006/08/12.PubMed PMID:16900767.

20.Wang L,Lin S,Rammohan K,Liu Z,Liu J,Liu R-H,Guinther N,Zhou Q,WangT,Zheng X,Birmingham DJ,Rovin BH,Herbert LA,Wu Y,Lynn DJ,Cooke G,Yu CY,ZhengP,Liu Y.A di-nucleotide deletion in CD24 confers protection againstautoimmune diseases.Plos Genetics.2007；3:e49.

21.Zhou Q,Rammohan K,Lin S,Robinson N,Li O,Liu X,Bai XF,Yin L,Scarberry B,Du P,You M,Guan K,Zheng P,Liu Y.CD24 is a genetic modifier forrisk and progression of multiple sclerosis.Proc Natl Acad Sci U S A.2003；100(25):15041-6.doi:10.1073/pnas.2533866100.PubMed PMID:14657362；PMCID:PMC299898.

22.Sanchez E,Abelson AK,Sabio JM,Gonzalez-Gay MA,Ortego-Centeno N,Jimenez-Alonso J,de Ramon E,Sanchez-Roman J,Lopez-Nevot MA,Gunnarsson I,Svenungsson E,Sturfelt G,Truedsson L,Jonsen A,Gonzalez-Escribano MF,Witte T,Alarcon-Riquelme ME,Martin J.Association of a CD24 gene polymorphism withsusceptibility to systemic lupus erythematosus.Arthritis Rheum.2007；56(9):3080-6.Epub 2007/09/01.doi:10.1002/art.22871.PubMed PMID:17763438.

23.Sanchez E,Fernandez-Gutierrez B,Gonzalez-Gay MA,Balsa A,Garcia A,Rodriguez L,Pascual-Salcedo D,Gonzalez-Escribano MF,Martin J.Investigatingthe role of CD24 gene polymorphisms in rheumatoid arthritis.Annals of therheumatic diseases.2008；67(8):1197-8.Epub 2008/07/16.doi:10.1136/ard.2007.084475.PubMed PMID:18621973.

24.Rueda B,Miranda-Filloy JA,Martin J,Gonzalez-Gay MA.Association ofCD24 gene polymorphisms with susceptibility to biopsy-proven giant cellarteritis.The Journal of rheumatology.2008；35(5):850-4.Epub 2008/04/03.PubMedPMID:18381780.

25.Lee YH,Bae SC.Association between functional CD24 polymorphismsand susceptibility to autoimmune diseases:A meta-analysis.Cell Mol Biol(Noisy-le-grand).2015；61(8):97-104.Epub 2016/01/01.PubMed PMID:26718436.

26.Bokers S,Urbat A,Daniel C,Amann K,Smith KG,Espeli M,NitschkeL.Siglec-G deficiency leads to more severe collagen-induced arthritis andearlier onset of lupus-like symptoms in MRL/lpr mice.Journal of immunology(Baltimore,Md:1950).2014；192(7):2994-3002.Epub 2014/03/07.doi:10.4049/jimmunol.1303367.PubMed PMID:24600033.

27.Wigren M,Nilsson J,Kaplan MJ.Pathogenic immunity in systemic lupuserythematosus and atherosclerosis:common mechanisms and possible targets forintervention.Journal of internal medicine.2015；278(5):494-506.Epub 2015/02/28.doi:10.1111/joim.12357.PubMed PMID:25720452；PMCID:PMC4550575.

28.Kay R,Rosten PM,Humphries RK.CD24,a signal transducer modulating Bcell activation responses,is a very short peptide with a glycosylphosphatidylinositol membrane anchor.Journal of immunology(Baltimore,Md:1950).1991；147(4):1412-6.Epub 1991/08/15.PubMed PMID:1831224.

29.Perry D,Sang A,Yin Y,Zheng YY,Morel L.Murine models of systemiclupus erythematosus.Journal of biomedicine&biotechnology.2011；2011:271694.Epub 2011/03/16.doi:10.1155/2011/271694.PubMed PMID:21403825；PMCID:PMC3042628.

30.Ge Y,Jiang C,Sung SS,Bagavant H,Dai C,Wang H,Kannapell CC,CathroHP,Gaskin F,Fu SM.Cgnz1 allele confers kidney resistance to damage preventingprogression of immune complex-mediated acute lupus glomerulonephritis.J ExpMed.2013；210(11):2387-401.Epub 2013/10/09.doi:10.1084/jem.20130731.PubMedPMID:24101379；PMCID:PMC3804943.

1.Agnew LL,Kelly M,Howard J,et al.Altered lymphocyte heat shockprotein 70 expression in patients with HIV disease.AIDS.2003,17(13):1985-8

2.Allers K,Fehr M,Conrad K,et al.Macrophages accumulate in the gutmucosa of untreated HIV-infected patients.J Infect Dis.2014,209(5):739-48

3.Anraku I,Rajasuriar R,Dobbin C,et al.Circulating heat shock protein60 levels are elevated in HIV patients and are reduced by anti-retroviraltherapy.PLoS One.2012,7(9):e45291

4.Appay V,Sauce D.Immune activation and inflammation in HIV-1infection:causes and consequences.J Pathol.2008,214(2):231-41

5.Bai XF,Liu JQ,Liu X,et al.The heat-stable antigen determinespathogenicity of self-reactive T cells in experimental autoimmuneencephalomyelitis.J Clin Invest.2000,105(9):1227-32

6.Bretz NP,Salnikov AV,Doberstein K,et al.Lack of CD24 expression inmice reduces the number of leukocytes in the colon.Immunol Lett.2014,161(1):140-8

7.Carl JW Jr,Liu JQ,Joshi PS,et al.Autoreactive T cells escape clonaldeletion in the thymus by a CD24-dependent pathway.J Immunol.2008,181(1):320-8

8.Chase A,Zhou Y,Siliciano RF.HIV-1-induced depletion of CD4+T cellsin the gut:mechanism and therapeutic implications.Trends Pharmacol Sci.2006,27(1):4-7

9.Chen GY,Chen X,King S,et al.Amelioration of sepsis by inhibitingsialidase-mediated disruption of the CD24-SiglecG interaction.NatBiotechnol.2011,29(5):428-35

10.Chen GY,Tang J,Zheng P,Liu Y.CD24 and Siglec-10 selectivelyrepress tissue damage-induced immune responses.Science.2009,323:1722-5

11.Chen W,Han C,Xie B,et al.Induction of Siglec-G by RNA virusesinhibits the innate immune response by promotingRIG-I degradation.Cell.2013,152(3):467-78

12.Conrad K,Epple HJ,Schürmann D,et al.Macrophages accumulate in thegut mucosa of untreated HIV-infected patients.J Infect Dis.2014,209(5):739-48

13.Deeks SG,Lewin SR,Havlir DV.The end of AIDS:HIV infection as achronic disease.Lancet.2013,382(9903):1525-33

14.Deeks SG.Immune dysfunction,inflammation,and accelerated aging inpatients on antiretroviral therapy.Top HIV Med.2009,17(4):118-23

15.Ding Y,Guo Z,Liu Y,et al.The lectin Siglec-G inhibits dentriticcell cross-presentation by impairing MHC class I-peptide complexformation.Nat Immunol.2016,17(10):1167-75.

16.Doitsh G,Galloway NL,Geng X,et al.Cell death by pyroptosis drivesCD4 T-cell depletion in HIV-1 infection.Nature.2014,505(7484):509-14

17.Eckard AR,McComsey GA.The role of statins in the setting of HIVinfection.Curr HIV/AIDS Rep.2015,12(3):305-12

18.Espigares E,Bueno A,Hernández J,et al.Levels of HSP70 in HIV(+)patients in different viroimmunological states.J Med Virol.2006,78(3):318-23

19.Hahne M,Wenger RH,Vestweber D,Nielsen PJ.The heat-stable antigencan alter very late antigen 4-mediated adhesion.J Exp Med.1994 Apr 1；179(4):1391-5

20.Hsu DC,Sereti I.Serious Non-AIDS Events:Therapeutic Targets ofImmune Activation and Chronic Inflammation in HIV Infection.Drugs.2016,76(5):533-49

21.Hunt PW,Martin JN,Sinclair E,et al.Valganciclovir reduces T cellactivation in HIV-infected individuals with incomplete CD4+T cell recovery onantiretroviral therapy.J Infect Dis.2011,203(10):1474-83

22.Kang JW,Kim SJ,Cho HI,Lee SM.DAMPs activating innate immuneresponses in sepsis.Ageing Res Rev.2015,24(Pt A):54-65

23.Kelley CF,Kitchen CM,Hunt PW,et al.Incomplete peripheral CD4+cellcount restoration in HIV-infected patients receiving long-term antiretroviraltreatment.Clint Infect Dis.2009,48:787-794

24.Kim TS,Gorski SA,Hahn S,et al.Distinct dendritic cell subsetsdictate the fate decision between effector and memory CD8(+)T celldifferentiation by a CD24-dependent mechanism.Immunity.2014,40(3):400-13

25.Kocsis J,Prohászka Z,BíróA,et al.Elevated levels of antibodiesagainst 70 kDa heat shock proteins in the sera of patients with HIVinfection.J Med Virol.2003,71(4):480-2；

26.Kristiansen G,Sammar M,Altevogt P.Tumour biological aspects ofCD24,a mucin-like adhesion molecule.J Mol Histol.2004,35(3):255-62；

27.Kristoff J,Haret-Richter G,Ma D,et al.Early microbialtranslocation blockade reduces SIV-mediated inflammation and viralreplication.J Clin Invest.2014,124:2802-2806

28.Kuwata T,Nishimura Y,Whitted S,et al.Association of progressiveCD4(+)T cell decline in SIV infection with the induction of autoreactiveantibodies.PLoS Pathog.2009,5(4):e1000372

29.Lee KM,Ju JH,Jang K,et al.CD24 regulates cell proliferation andtransforming growth factorβ-induced epithelial to mesenchymal transitionthrough modulation of integrinβ1stability.Cell Signal.2012,24(11):2132-42

30.Li D,Zheng L,Jin L,et al.CD24 polymorphisms affect risk andprogression of chronic hepatitis B virus infection.Hepatology.2009,50(3):735-42

31.Li O,Chang X,Zhang H,et al.Massive and destructive T cell responseto homeostatic cue in CD24-deficient lymphopenic hosts.J Exp Med.2006,203(7):1713-20

32.Liu Y,Jones B,Aruffo A,et al.Heat-stable antigen is acostimulatory molecule for CD4 T cell growth.J Exp Med.1992,175(2):437-45

33.Lotze MT,Tracey KJ.High-mobility group box 1 protein(HMGB1):nuclear weapon in the immune arsenal.Nat Rev Immunol.2005,5(4):331-42

34.Malnati MS,Scarlatti G,Gatto F,et al.A universal real-time PCRassay for the quantification of group-M HIV-1 proviral load.Nat Protoc.2008,3(7):1240-8

35.Nowak P,Barqasho B,

A.Elevated plasma levels of highmobility group box protein 1 in patients with HIV-1 infection.AIDS.2007,21(7):869-71

36.Paiardini M,Müller-Trutwin M.HIV-associated chronic immuneactivation.Immunol Rev.2013,254:78-101

37.Pallikkuth S,Micci L,Ende ZS,et al.Maintenance of Intestinal Th17Cells and Reduced Microbial Translocation in SIV-infected Rhesus MacaquesTreated with Interleukin(IL)-21.PLoS Pathog.2013,9(7):1003471

38.Rahman ZS.Impaired clearance of apoptotic cells in germinalcenters:implications for loss of B cell tolerance and induction ofautoimmunity.Immunol Res.2011,51(2-3):125-33

39.Rajasuriar R,Wright E,Lewin SR.Impact of antiretroviral therapy(ART)timing on chronic immune activation/inflammation and end-organdamage.Curr Opin HIV AIDS.2015,10(1):35-42

40.Rajasuriar R,Khoury G,Kamarulzaman A,et al.Persistent immuneactivation in chronic HIV infection:do any interventions work？.AIDS.2013,27(8):1199-208

41.Ravnskov U,Rosch PJ,Sutter MC,Houston MC.Should we lowercholesterol as much as possible？BMJ.2006,3；332(7553):1330-2

42.Rawson PM,Molette C,Videtta M,et al.Cross-presentation of caspase-cleaved apoptotic self antigens in HIV infection.Nat Med.2007,13(12):1431-9

43.Sandler NG,Zhang X,Bosch RJ,et al.Sevelamer does not decreaselipopolysaccharide or soluble CD14 levels but decreases soluble tissuefactor,low-density lipoprotein(LDL)cholesterol,and oxidized LDL cholesterollevels in individuals with untreated HIV infection.J Infect Dis.2014,210:1549-54

44.Sattentau QJ,Stevenson M.Macrophages and HIV-1:An UnhealthyConstellation.Cell Host Microbe.2016 Mar 9；19(3):304-10.

45.Shin JJ,Lee EK,Park TJ,Kim W.Damage-associated molecular patternsand their pathological relevance in diabetes mellitus.Ageing Res Rev.2015,24(Pt A):66-76.

46.Shive CL,Jiang W,Anthony DD,Lederman MM.Soluble CD14 is anonspecific marker of monocyte activation.AIDS.2015,29(10):1263-5.

47.Steele AK,Lee EJ,Manuzak JA,et al.Microbial exposure alters HIV-1-induced mucosal CD4+ T cell death pathways Ex vivo.Retrovirology.2014,11:14

48.Sun H,Pan Y,Wu R,et al.CD24 Ala57Val polymorphism is associatedwith spontaneous viral clearance in theHCV-infected Chinese population.LiverInt.2015,35(3):786-94

49.Tabb B,Morcock DR,Trubey CM,et al.Reduced inflammation andlymphoid tissue immunopathology in rhesus macaques receiving anti-tumornecrosis factor treatment during primary simian immunodeficiency virusinfection.J Infect Dis.2013,207(6):880-92

50.Tian RR，Zhang MX，Zhang LT，et al.High immune activation andabnormal expression of cytokine contribute to death of SHIV89.6-infectedChinese rhesus macaques.Archives of virology.Arch Virol.,2015,160(8):1953-66

51.

M,

A,Nowak P.High mobility group box protein-1 inHIV-1 infection.Curr HIV Res.2011,9(1):6-10.

52.

M,Nowak P,

J,et al.Elevated plasma levels oflipopolysaccharide and high mobility group box-1 protein are associated withhigh viral load in HIV-1 infection:reduction by 2-year antiretroviraltherapy.AIDS.2010,24(11):1733-7

53.

M,Lind A,Nowak P,et al.Circulating levels of HMGB1 arecorrelated strongly with MD2 in HIV-infection:possible implication for TLR4-signalling and chronic immune activation.Innate Immun.2013,19(3):290-7

54.Venereau E,De Leo F,Mezzapelle R,et al.HMGB1 as biomarker and drugtarget.Pharmacol Res.2016,111:534-44

55.Williams LA,McLellan AD,Summers KL,et al.Identification of a noveldendritic cell surface antigen defined by carbohydrate specific CD24 antibodycross-reactivity.Immunology.1996,89(1):120-5

56.Xia HJ,Zhang GH,Ma JP,et al.Dendritic cell subsets dynamics andcytokine production in SIVmac239-infected Chinese rhesus macaques.2010,Retrovirology.7:102

57.Younas M,Psomas C,Reynes J,Corbeau P.Immune activation in thecourse of HIV-1infection:Causes,phenotypes and persistence under therapy.HIVMed.2016,(2):89-10

序列表

<110> 肿瘤免疫股份有限公司

北卡罗来纳查佩尔山大学

中国科学院生物物理研究所

中国科学院昆明动物研究所

<120> 使用可溶性CD24用于治疗获得性免疫缺陷综合征（HIV/AIDS）的方法

<130> 060275.0504.01PC00

<150> 62/638,772

<151> 2018-03-05

<160> 12

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

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<212> PRT

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<220>

<221> 变体

<222> (31)...(31)

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<213> 智人

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<212> PRT

<213> 小家鼠

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<212> PRT

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180 185 190

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Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser

245 250 255

Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala

260 265 270

Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

275 280 285

<210> 10

<211> 29

<212> PRT

<213> 食蟹猕猴

<400> 10

Thr Val Thr Thr Ser Ala Pro Leu Ser Ser Asn Ser Pro Gln Asn Thr

1 5 10 15

Ser Thr Thr Pro Asn Pro Ala Asn Thr Thr Thr Lys Ala

20 25

<210> 11

<211> 262

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 融合蛋白

<400> 11

Ser Glu Thr Thr Thr Gly Thr Ser Ser Asn Ser Ser Gln Ser Thr Ser

1 5 10 15

Asn Ser Gly Leu Ala Pro Asn Pro Thr Asn Ala Thr Thr Lys Val Pro

20 25 30

Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu

35 40 45

Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp

50 55 60

Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp

65 70 75 80

Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly

85 90 95

Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn

100 105 110

Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp

115 120 125

Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro

130 135 140

Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu

145 150 155 160

Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn

165 170 175

Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile

180 185 190

Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr

195 200 205

Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys

210 215 220

Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys

225 230 235 240

Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu

245 250 255

Ser Leu Ser Pro Gly Lys

260

<210> 12

<211> 262

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 融合蛋白

<400> 12

Ser Glu Thr Thr Thr Gly Thr Ser Ser Asn Ser Ser Gln Ser Thr Ser

1 5 10 15

Asn Ser Gly Leu Ala Pro Asn Pro Thr Asn Ala Thr Thr Lys Ala Pro

20 25 30

Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu

35 40 45

Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp

50 55 60

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65 70 75 80

Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly

85 90 95

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100 105 110

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115 120 125

Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro

130 135 140

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145 150 155 160

Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn

165 170 175

Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile

180 185 190

Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr

195 200 205

Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys

210 215 220

Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys

225 230 235 240

Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu

245 250 255

Ser Leu Ser Pro Gly Lys

260

Claims (30)

1.治疗HIV/AIDS的方法，包括将CD24蛋白施用于有需要的受试者。

2.权利要求1的方法，其中所述CD24蛋白包含成熟的人CD24多肽或其变体。

3.权利要求2的方法，其中所述成熟的人CD24多肽包含SEQ ID NO：1或2所示的氨基酸序列。

4.权利要求2的方法，其中所述CD24蛋白进一步包含蛋白标签，其中所述蛋白标签融合在所述CD24蛋白的N-末端或C-末端。

5.权利要求4的方法，其中所述蛋白标签包含哺乳动物免疫球蛋白(Ig)蛋白的Fc区。

6.权利要求5的方法，其中所述Ig蛋白是人的。

7.权利要求6的方法，其中所述Fc区包含IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或IgA的铰链区以及CH2和CH3结构域。

8.权利要求6的方法，其中所述Fc区包含IgM的铰链区以及CH2、CH3和CH4结构域。

9.权利要求7的方法，其中所述CD24蛋白包含SEQ ID NO：6、11或12所示的氨基酸序列。

10.权利要求9的方法，其中所述CD24蛋白的氨基酸序列由SEQ ID NO：6、11或12所示的序列组成。

11.权利要求1-10中任一项的方法，其中所述CD24蛋白是使用真核蛋白表达***产生的。

12.权利要求11的方法，其中所述表达***包含中国仓鼠卵巢细胞系中含有的载体或复制缺陷型逆转录病毒载体。

13.权利要求12的方法，其中所述复制缺陷型逆转录病毒载体稳定地整合到真核细胞的基因组中。

14.权利要求1-13中任一项的方法，其中所述CD24蛋白是可溶的。

15.权利要求1-14中任一项的方法，其中所述CD24蛋白是糖基化的。

16.CD24蛋白在制备用于在受试者中治疗HIV-1/AIDS的药物中的用途。

17.权利要求16的用途，其中所述CD24蛋白包含成熟的人CD24多肽或其变体。

18.权利要求17的用途，其中所述成熟的人CD24多肽包含SEQ ID NO：1或2所示的氨基酸序列。

19.权利要求18的用途，其中所述CD24蛋白进一步包含蛋白标签，其中所述蛋白标签融合在所述CD24蛋白的N-末端或C-末端。

20.权利要求19的用途，其中所述蛋白标签包含哺乳动物免疫球蛋白(Ig)蛋白的Fc区。

21.权利要求20的用途，其中所述Ig蛋白是人的。

22.权利要求21的用途，其中所述Fc区包含IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或IgA的铰链区以及CH2和CH3结构域。

23.权利要求21的用途，其中所述Fc区包含IgM的铰链区以及CH2、CH3和CH4结构域。

24.权利要求22的用途，其中所述CD24蛋白包含SEQ ID NO：6、11或12所示的氨基酸序列。

25.权利要求24的用途，其中所述CD24蛋白的氨基酸序列由SEQ ID NO：6、11或12所示的序列组成。

26.权利要求16-25中任一项的用途，其中所述CD24蛋白是使用真核蛋白表达***产生的。

27.权利要求26的用途，其中所述表达***包含中国仓鼠卵巢细胞系中含有的载体或复制缺陷型逆转录病毒载体。

28.权利要求27的用途，其中所述复制缺陷型逆转录病毒载体稳定地整合到真核细胞的基因组中。

29.权利要求16-28中任一项的用途，其中所述CD24蛋白是可溶的。

30.权利要求16-29中任一项的用途，其中所述CD24蛋白是糖基化的。

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