KR20210022717A

KR20210022717A - 식도의 점막하 유체 쿠션으로 방광 ecm 하이드로겔의 사용

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Publication number: KR20210022717A
Application number: KR1020217002120A
Authority: KR
Inventors: 스티븐 프란시스 바디락; 린지 타미코 살딘; 후안 디에고 나란조 구티에레즈
Original assignee: 유니버시티 오브 피츠버그 - 오브 더 커먼웰쓰 시스템 오브 하이어 에듀케이션
Priority date: 2018-06-21
Filing date: 2019-06-20
Publication date: 2021-03-03
Also published as: EP3810213A4; US20210268148A1; CA3103973A1; JP2021527518A; CN115671410A; CN112334164A; JP2024060076A; AU2019288591A1; WO2019246447A1; CN112334164B; EP3810213A1

Abstract

대상의 식도 부위에서 고유근으로부터 점막 및 점막하를 분리하는 방법이 개시된다. 이러한 방법은 식도의 부위에서 점막하와 아래에 존재하는 고유근 사이에 쿠션을 형성하기 위해 방광 세포외 기질(ECM) 하이드로겔을 포함하는 약학적 조성물을 대상의 식도 부위에 점막하 주사하는 것을 포함하며, 여기서 ECM 하이드로겔은 다음과 같은 특징을 갖는다: a) 약 37 ℃의 온도에서 20 분 미만의 50 % 겔화 시간; b) 식도로의 주입에 적합한 유동 점도; 및 c) 약 10 내지 약 400 Pascal (Pa)의 경도.

Description

식도의 점막하 유체 쿠션으로 방광 ECM 하이드로겔의 사용

관련 출원의 교차 참조

본 출원은 전체가 본 명세서에 참조로 포함된 2018년 6월 21일에 출원된 미국 가출원 번호 62/688,191의 이익을 주장한다.

분야

이것은 내시경 절제술(endoscopic resection), 특히 식도(esophagus)의 고유근(muscularis propria)으로부터 점막(mucosa) 및 점막하(submucosa)를 분리하기 위한 점막하 쿠션으로서 방광 기질(urinary bladder matrix) 세포외 기질(ECM) 하이드로겔(hydrogel)의 사용과 관련된다.

내시경 검사(Endoscopy)는 침습적 수술을 사용하지 않고 내시경(endoscope)이라고 하는 도구를 사용하여 속이 빈 장기 또는 체강(cavity)를 검사할 수 있는 과정(procedure)이다. 내시경 검사는 출혈 혈관의 소작(cauterization), 폴립(polyp), 선종(adenoma) 및 작은 종양(tumor)의 제거, 생검 수행(biopsie) 또는 이물질 제거와 같은 외과적 과정에 사용할 수 있다. 내시경술은 위장관(gastrointestinal tract), 호흡기(respiratory tract), 귀(ear), 요로(urinary tract), 여성 생식계(female reproductive system)에서와 정상적으로 폐쇄된 체강인 복강(abdominal cavity) 또는 골반강(pelvic cavity)(복강경(laparoscopy)), 관절내부(interior of a joint)(관절경(arthroscopy)) 및 흉부(chest)의 장기(흉강경(thoracoscopy) 및 종격 내시경(mediastinoscopy))에서 작은 절개(incision)를 통해 수행할 수 있다. 내시경은 진단 또는 치료 목적으로, 일반적으로 도구(예: 겸자(forcep), 수술용 전기칼(electrosurgical knife), 내시경 주사 바늘 또는 가위)의 통과를 가능하게 하거나 생체 시료의 제거를 용이하게 하는 하나 이상의 작업 채널(working channel)이 있는 속이 빈 기관 또는 부분(예를 들면 식도(esophagus))의 내부를 시각화(visualizin)하기 위한 빛이 나는(illuminated), 일반적으로 광섬유의 유연하거나 단단한 관형 도구이다. 원위 부분(distal portion)에 적절한 램프와 영상 장치가 포함되어 있으며 입, 항문, 귀, 코와 같은 신체의 자연 발생 개구부를 통해 삽입하거나 작은 수술 절개를 통해 삽입할 수 있다.

내시경술은 위장관에 널리 적용된다. 예를 들어, 내시경술을 사용하여 위장강(gastrointestinal cavity)을 덮고 있는 점막을 검사하고 염증 조직, 폴립, 가성 폴립(pseudo-polyp), 톱니 모양의 병변(serrated lesion), 선종, 궤양(ulceration), 이형성증(dysplasia), 전 종양(pre-neoplastic)과 종양의 형성 및 종양과 같은 크고 작은 병리학적 병변(pathological lesion)을 감지할 수 있다. 내시경술은 생검과 병리학적 병변(폴립, 선종, 이형성증, 바렛씨 이형성증(Barrett's dysplasia) 전 종양 및 종양의 형성 및 종양)의 제거에 사용될 수 있다. 외과적 개입에는 병리학적 병변을 제거하기 위해 위장 내시경에서 일반적으로 사용되는 두 가지 유형의 내시경 절제술이 포함된다: 내시경 점막 절제술(endoscopic mucosal resection, EMR) 및 내시경 점막하 박리술(endoscopic submucosal dissection, ESD). 이 두 가지 기술은 림프절 전이(lymph-node metastasis)의 위험을 최소화하는 위장 폴립, 선종, 이형성증, 바렛씨 이형성증 및 초기 단계 암의 최소 침습적 치료를 허용한다. 식도에서 내시경술에 사용되는 물질에 대한 필요성이 남아 있다.

본 발명의 전술한 특징, 다른 특징 및 이점은 첨부된 도면을 참조하여 진행되는 여러 실시예의 다음의 상세한 설명으로부터 더욱 명백해질 것이다.

대상의 식도 부위에서 고유근으로부터 점막 및 점막하를 분리하는 방법이 이 출원에 개시된다. 이들 방법은 다음을 포함한다: 방광 세포외 기질(ECM) 하이드로겔을 포함하는 약학적 조성물을 대상의 식도 부위에 점막하 주사하여 식도에서 점막하와 아래에 존재하는 고유근 사이에 쿠션을 형성하며, 여기서 ECM 하이드로겔은 다음과 같은 특징을 갖는다 a) 약 37 ° C의 온도에서 20 분 미만의 50 % 겔화 시간; b) 식도로의 주입에 적합한 유동 점도(flow viscosity); 및 c) 약 10 내지 약 400 파스칼 (Pa)의 경도(stiffness). 상기 방법은 식도 부위에서 하부 고유근으로부터 점막과 점막하를 분리한다. 이 방법은 또한 대상의 식도 부위에서 염증을 억제할 수 있다.

대상의 식도 부위에서 고유근으로부터 점막 및 점막하를 분리하는 방법이 또한 본 출원에 개시되어 있다. 이러한 방법은 식도에서 점막하와 하부 고유근 사이에 쿠션을 형성하기 위해 방광 세포외 기질(ECM) 하이드로겔을 포함하는 약학적 조성물을 대상의 식도 부위 내로 점막하 주사하는 것을 포함한다. 이 방법은 식도 부위에서 하부 고유근으로부터 점막과 점막하를 분리한다. 이 방법은 또한 대상의 식도 부위에서 염증을 억제할 수 있다.

일부 실시예에서, 분리 방법은 내시경 점막 절제술(endoscopic mucosal resection) 또는 내시경 점막하 박리술(endoscopic submucosal dissection)을 포함한다.

도1A-1C. 점막하 유체 쿠션으로 ECM의 생체 내(In-vivo) 사용. EMR이 이미 수행된 가시적(visible) 영역이 있는 점막하 유체 쿠션으로 방광 세포외 기질(UBM-ECM) 하이드로겔 사용(A). 점막하 유체 쿠션(submucosal fluid cushion, SFC)으로 제거된 식도 조직은 제거된 식도 점막 부위에 겔이 존재하는 것을 보여준다(B). 점막의 전체 원주가 절제된 전체 원주 EMR의 결과(C).
도 2A 및 2B. 방광의 단면도(cross-sectional view)이다. 방광 점막하(UBS) ECM 하이드로겔은 방광의 D- 점막하 조직(tunica submucosa)(근막 점막(muscularis mucosa) 및 점막하 조직(tunica submucosa))을 포함하는 방광 점막하(urinary bladder submucosa) 에서 제조된다(A). 방광 기질(UBM) ECM 하이드로겔은 B- 상피 기저막(epithelial basement membrane)과 방광의 C-고유막(tunica propria)를 포함하는 UBM에서 제조된다(B). L은 내강(lumen)의 위치를 나타낸다. 이들 도면은 미국 특허 제 6,576,265 호 (본 출원에 참조로 포함됨)로부터 채택된 것이다.
도 3A-3C. UBM 유동 점도(A), UBM 타임 스윕(time sweep)(B) 및 UBM 50 % 겔화시간(C)의 유동학 데이터(Rheology data).

본 출원에는 식도 내시경(esophageal endoscopy)에서 병적 병변(pathological lesion)을 제거하기 위해 일반적으로 사용되는, 예를 들면 EMR 및 ESD와 같은 임의의 내시경 절제술에서 식도의 고유근으로부터 점막 및 점막하를 분리하기 위한 점막하 쿠션으로서 방광 세포외 기질(ECM) 하이드로겔의 용도가 개시되어 있다. 상기 방광 ECM 하이드로겔은 UBM ECM 하이드로겔 또는 UBS ECM 하이드로겔일 수 있다.

용어(Terms)

달리 명시되지 않는 한, 기술적인 용어는 통상적인 사용법에 따라 사용된다. 분자 생물학에서의 공통적인 용어들의 정의는 Benjamin Lewin, Genes V, published by Oxford University Press, 1994 (ISBN 0-19-854287-9); Kendrew et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, published by Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0-632-02182-9); and Robert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, published by VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8)에서 찾아 볼 수 있다.

본 개시의 다양한 실시예의 검토를 촉진시키기 위하여, 특정 용어들에 대한 다음 설명이 제공된다:

산성 프로테아제(Acid Protease): 펩타이드 결합을 절단하는 효소로서, 이 효소는 산성 pH에서 펩타이드 결합을 절단하는 활성이 증가한다. 예를 들어, 산성 프로테아제는 펩신 및 트립신을 포함하지만 이에 국한되지는 않는다.

바렛씨 식도(Barrett’s Esophagus): 일반적으로 식도의 아래쪽(원위) 부분의 식도 세포의 비정상적인 변화(화생(metaplasia) 또는 이형성증(dysplasia)). 바렛씨 식도는 식도의 정상적인 중층편형상피 내벽(stratified squamous epithelium lining)이 배상세포(goblet cell)를 가진 단순한 원주 상피로 대체될 때 진단된다. 바렛씨 식도는 위식도 역류 질환 (gastroesophageal reflux disease, GERD)으로 치료를 받는 환자의 5 ~ 15 %에서 발견되지만 바렛씨 식도 환자의 대규모 하위 그룹에는 증상이 없다. 바렛씨 식도는 식도 선암과 밀접한 관련이 있으며 전암 상태로 간주된다. 바렛씨 식도의 주요 원인은 역류식도염으로 인한 만성적인 산에의 노출에 대한 적응으로 간주된다. 생체검사 후, 바렛씨 식도의 세포는 네 가지 일반 범주로 분류된다: 비이형성(non-dysplastic), 저도 이형성(low-grade dysplasia), 고도 이형성(high-grade dysplasia) 및 명백한 상피성암(frank carcinoma).

염기(Base): pH가 7보다 큰 화합물 또는 화합물의 용액. 예를 들어, 염기는 알칼리 수산화물 또는 알칼리 수산화물의 수용액을 포함하지만 이에 국한되지는 않는다. 특정 실시예에서, 염기는 NaOH 또는 PBS에 있는 NaOH이다.

분쇄하다(Comminute) (분쇄 (comminution) 및 분쇄하는 (comminuting)): 빻고(grinding), 섞고(blending), ??고(shredding), 절편으로 하고 (slicing), 갈고 (milling), 자르고(cutting), ??는(shredding) 것을 포함하되 이에 국한 되지 않는, 큰 입자들을 작은 입자들로 감소 시키는 공정. 세포외 기질(ECM)은 수화물 형태(hydrate form), 냉동(frozen), 공기-건조(air-dried), 동결건조(lyophilized), 분말(powdered), 쉬트-형태(sheet-form)를 포함하지만 이에 국한되지 않는 어느 형태로 있는 동안에 분쇄될 수 있다.

진단(Diagnosis): 신호(sign), 증상(symptom) 및 여러 가지 검사 결과들에 의해 질병을 동정하는 과정. 이 과정을 통해 도달하는 결론은 또한 "진단" (a diagnosis)이라고 불린다. 보통 수행되는 검사의 형태에는 혈액 검사(blood test), 의학적 이미징(medical imaging), 및 생체검사(biopsy)가 포함된다.

분리(Dissection): 예를 들어 수술 과정에서 조직을 분리하거나 절단하는 과정.

내시경 주사 바늘 또는 내시경 주사 바늘 카테터(Endoscopic injection needles or endoscopic injection needle catheters): 일반적으로 길고(예를 들어, 최대 약 230cm) 슬라이드 가능하게 배치된 원위(distal) 주사 바늘을 가지는 내부 주사 튜브가 있는 긴 카테터를 포함하는 장치. 일반적으로, 근위 작동 핸들은 카테터 및 주사 튜브에 결합되어 하나를 상대적으로 다른 하나에 이동시킨다. 바늘은 집어 넣을 수 있다. 주사 튜브에 대한 유체의 접근은 일반적으로 핸들의 루어 커넥터(luer connector)를 통해 제공된다.

내시경 주사 바늘은 일반적으로 내시경의 카테터를 통해 주사 부위로 전달된다. 내강이 손상되지 않도록 보호하기 위해 주입 바늘 장치의 핸들을 조작하여 장치를 내시경에 삽입하기 전에 원위 주사 바늘을 카테터의 내강으로 빼낸다. 내시경 주사 바늘 장치의 원위 말단이 주사 부위에 위치할 때, 핸들을 조작하여 주사 바늘을 카테터의 내강에서 말단으로 이동시킨다. 일부 실시예에서, 가장 원위 위치로 전진할 때, 주사 바늘의 노출된 부분은 길이가 약 4-6 mm일 수 있다.

내시경 점막 절제술(Endoscopic Mucosal resection, EMR): 위장(gastrointestinal, GI) 관의 표면층(점막 및 점막하)에 국한된 고착성 또는 편평한 신생물(neoplasm)을 제거하기 위해 개발된 내시경 기술이다. 점막과 점막하는 하부 고유근으로부터 절제된다. 내시경 점막하 박리술(endoscopic submucosal dissection, ESD)은 위장관과 같은 더 큰 병변을 제거하기 위해 특별히 개발된 내시경 기술을 의미하며, 여기서 점막과 점막하는 위장관의 다른 층으로부터 분리된다. EMR과 ESD는 일반적으로 점막하와 하부 고유근 사이의 표적 병변 아래에 물질을 주사하여 쿠션 역할을 하고 점막하와 상부 점막을 상승시킨다. EMR을 사용하여 스네어(snare)로 상승된 병변을 제거하고 흡입을 통해 작은 컵으로 이동한다. ESD를 사용하면 병변 아래의 점막하를 특수 나이프로 분리하여 점막하와 상부 점막을 분리한다. ESD는 치료 의도를 가진 EMR로 가능한 것보다 더 크고 잠재적으로 더 깊은 병변을 제거할 수 있다. EMR과 ESD는 모두 장기의 점막하 평면에 물질을 주사하여 촉진되며, 이는 상부 점막을 하부 고유근으로부터 효과적으로 분리하고 동시에 인접한 식도 점막 위로 점막을 상승시킨다. 이러한 층 분리와 영향을 받은 조직의 상승은 외과의가 관심있는 조직을 분리(isolate), 파악(grasp) 및 제거(remove)하는데 도움이 된다.

세포외 기질(Extracellular Matrix, ECM): 조직과 기관의 비세포(non-cellular) 성분. 천연 ECM(포유류 및 인간과 같은 다세포 유기체에서 발견되는 ECM)은 콜라겐(collagens), 엘라스틴(elastins), 라미닌(laminins), 글라이코스아미노글라이칸(glycosaminoglycans), 프로테오글라이칸(proteoglycans), 항미생물제(antimicrobials), 화학유인물(chemoattractants), 싸이토카인(cytokines), 및 성장 인자(growth factors)를 포함하되 제한적이지 않은 구조적 및 비구조적 생체분자들의 혼합물로 일반적으로 다른 조직과 기관 사이의 특정 구성이 다르다. 포유류에서는, ECM은 종종 건조 중량 기준으로 약 90%의 다양한 형태의 콜라겐(collaagen)을 포함한다. ECM으로 구성된 생물학적 스캐폴드(Biologic scaffold)는 ECM 뒤에 남겨진 주어진 조직이나 기관에서 세포를 제거하여 만들 수 있다. ECM의 조성 및 구조는 조직의 근원(source)에 따라 다르다. 예를 들어, 소장 점막하(small intestine submucosa) (SIS), 방광 기질(urinary bladder matrix) (UBM), 식도(esophagus) (E), 및 간 기질 ECM(liver stroma ECM)은 각 조직마다 필요로 하는 독특한 세포적인 영역(cellular niche) 때문에 이들의 전체적인 구조 및 조성이 각각 다르다. 온전한 "세포외 기질(extracellular matrix)" 및 " 온전한 ECM(intact ECM)"은 바이오스캐폴드(bioscaffold)는 용해되지 않은 세포외 기질로 구성되고, 3차원 미세 구조를 유지하며, 콜라겐, 엘라스틴, 라미닌, 글라이코스아미노글라이칸, 프로테오글라이칸, 항미생물제, 화학유인물, 싸이토카인, 및 성장 인자를 포함하지만 여기에 설명된 바와 같이 분쇄된(comminuted) ECM에 제한적이지 않은 구조적 및 비구조적 생체분자들의 활성을 유지하고 있다.

ECM 내의 생체 분자의 활성은 화학적으로 또는 기계적으로, 예를 들어 화학적 또는 효소적 가교(cross-linking) 및/또는 ECM 투석(dialyzing)에 의해 변경될 수 있다. 온전한 ECM은 본질적으로 효소로 소화, 교차 결합 및 / 또는 투석되지 않으며, 이는 ECM이 소화, 투석 및 / 또는 교차 결합 과정을 거치지 않았거나 용해 전에 ECM을 보관 및 취급하는 동안 자연적으로 발생하는 조건이 아님을 의미한다. 따라서, 투석된 ECM (본 출원에 설명된 사용에서 ECM의 겔화 및 기능적 특성에 실질적으로 영향을 미치지 않는 사소한 방식을 제외하고)은 "온전한"것으로 간주되지 않는다.

위내시경(Esophagogastroduodenoscopy) (EGD) 또는 상부 위장관 내시경(Upper Gastrointestinal Endoscopy): 위장관의 상부에서 십이지장까지 시각화하는 진단 내시경술이다. "식도 내시경(esophageal endoscopy)"은 식도를 시각화하는 임의의 내시경술이다. 내시경은 때때로 EGD 또는 상부 위장관 내시경의 일부로 수행될 수 있다. 명시적으로 언급하지 않는 한 이 용어는 상호 배타적이지 않는다.

겔화(Gelation): 솔(sol)에서 겔(gel)이 형성되는 것.

위식도 역류 질환(Gastroesophageal Reflux Disease, GERD): 위산 함유물이 위에서 식도로 역류하여 발생하는 점막 손상의 만성 증상. GERD는 보통 위장의 위쪽(근접 부분)을 닫힌 상태로 유지하는 하부 식도 괄약근(sphincter)의 비정상적 이완, 식도로부터의 위의 역류 장애(impaired expulsion), 또는 열공 탈장(hiatal hernia) 등의 위와 식도 사이의 장벽 변화에 의해 발생한다. 이 변화는 영구적이거나 또는 일시적일 수 있다.

유동 점도(Flow Viscosity): 전단 응력 또는 인장 응력에 의한 점진적 변형에 대한 유체의 저항 측정. 점도는 다른 속도로 움직이는 유체에서 유체의 두 표면 사이의 상대 운동에 반대하는 유체의 속성이다. 유체가 튜브를 통과할 때 유체를 구성하는 입자는 일반적으로 튜브 축 근처에서 더 빠르게 이동하고 벽 근처에서 더 느리게 이동한다. 유체가 계속 움직이도록 입자층 사이의 마찰을 극복하려면 응력(튜브의 두 끝 사이의 압력 차이와 같은)이 필요하다. 주어진 속도 패턴에 대해 필요한 응력은 유체의 점도에 비례한다. 점도는 점도계(viscometer)와 유량계(rheometer)로 측정된다. 점도는 파스칼 초 (Pa * s)로 측정할 수 있다. 20 ° C의 물의 점도는 1.002mPa * s이다.

하이드로겔(Hydrogel): 친수성 고분자 사슬의 네트워크로, 때로는 물이 분산매인 콜로이드겔(colloidal gel)로 발견된다. 하이드로겔은 흡수성이 높은 천연 또는 합성 고분자 네트워크다. 하이드로겔은 또한 천연 조직과 유사한 유연성을 가지고 있다. 용어 "방광 ECM 하이드로겔(urinary bladder ECM hydrogel)"은 방광 기질(UBM, urinary bladder matrix) 및 방광 점막하(UBS, urinary bladder submucosa) 하이드로겔을 포함한다.

염증(Inflammation): 조직 손상에 의해 유발되는 국소 반응. 염증은 정상적인(건강한) 상황에서 그러한 조직 부위 내에서 발견되는 그러한 세포의 수를 초과하는 숫자로 모든 종류의 백혈구의 조직 공간, 단위 또는 부위로의 출현 또는 이동을 특징으로 한다. 염증은 병원체, 손상된 세포 또는 자극제와 같은 유해한 자극에 대한 혈관 조직의 복잡한 생물학적 반응에 의해 조정된다.

등장 완충 용액(Isotonic Buffered Solution): pH7.2에서 7.8 사이로 완충되고 등장 환경을 촉진하기 위해 균형잡힌 염 농도를 갖는 용액.

저도 이형성증 및 고도 이형성증 및 대사(Low Grade Dysplasia and High Grade Dysplasia and Metaplasia): 병리학적 상태는 비정상적인 세포 형태를 특징으로 하지만 세포 유형은 여전히 편평 상피(squamous epithelium)로 인식할 수 있다. 일반적으로 식도 이형성증에서는 식도의 내부 관벽 세포(internal lining cell)에 정점 점액(apical mucin)이 없다. 낮은 배율에서는 이러한 영역은 관련되지 않은 영역에 비해 더 과염색성(hyperchromatic)으로 보일 수 있다.

고도 이형성증의 경우 세포 형태의 변화가 더 두드러 지지만 세포는 여전히 기술적으로 편평 상피의 한 유형이다.

세포가 편평 상피 세포에서 흔히 입방형(cuboidal) 또는 원주형(columnar)인 샘세포(glandular cell)와 같은 다른 세포 유형으로 변할 때, 그 과정을 화생(metaplasia)이라고 한다. 화생의 경우, 식도의 샘(glandular) 구조의 왜곡이 일반적으로 존재하며 표시될 수 있다. 그것은 크립트(crypts)의 가지(branching)와 측면 버딩(lateral budding), 점막 표면의 융모의 배열, 또는 "서로 마주하고 있는(back-to-back)" 샘의 소공질 패턴(cribriform pattern)을 형성하기 위한 상피의 샘내 가교(intraglandular bridging)로 구성되어 있다. 점막 표면에 핵의 "라운딩 업(rounding up)"으로 특징되는 핵 극성(nuclear polarity)이 상실된 비정상적인 상피가 있으며, 서로 핵의 일관된 관계(consistent relationship)가 없다.

예방 또는 치료(Preventing or treating): 질병 억제(Inhibiting)는 예를 들어 염증으로 인한 질병과 같은 질병에 걸릴 위험이 있는 사람에서 질병의 부분적 또는 전체적인 발달을 억제하는 것을 의미한다. 식도 선암 위험이 있는 사람의 예로는 바렛씨 식도 또는 GERD가 있는 사람이 있다. 질병 과정을 억제하는 것은 질병의 발병을 예방하는 것을 포함한다. "치료(treatment)"는 질병이 발병한 후, 질병 또는 병리학적 상태의 징후 또는 증상을 개선하는 치료적 중재를 의미한다.

전단 응력(Sheer Stress): 재료 단면과 동일 평면상 응력(stress coplanar)의 구성 요소. 전단 응력은 단면에 평행한 힘 벡터(force vector) 구성 요소에서 발생한다. 평균 전단 응력을 계산하는 공식은 단위 면적당 힘이다.

여기서 T = 전단 응력, F = 적용된 힘, A = 적용된 힘 벡터에 평행한 면적을 가진 재료의 단면적.

협착(Stricture): 삼키는데 어려움을 일으키는 식도가 좁아 지거나 조여지는 현상. 식도 협착의 증상으로는 속쓰림(heartburn), 입안의 쓴맛(bitter taste) 또는 산미(acid taste), 질식(choking), 기침(coughing), 숨가쁨(shortness of breath), 잦은 트림(burping) 또는 딸꾹질(hiccup), 통증(pain) 또는 삼킴 곤란(trouble swallowing), 토혈(vomiting blood) 및 / 또는 체중 감소(weight loss)가 있다. 식도의 협착은 위식도 역류 질환(gastroesophageal reflux disease), 식도염(esophagitis), 기능 장애 하부 식도 괄약근(dysfunctional lower esophageal sphincter), 무질서한 운동성(disordered motility), 잿물 섭취(lye ingestion) 또는 열공 탈장(hiatal hernia)으로 인해 발생할 수 있다. 식도 수술 및 레이저 요법 또는 광역학 요법과 같은 기타 치료 후에 협착이 형성될 수 있다. 그 부위가 치유되는 동안 흉터가 형성되어 조직이 당겨지고 조여져 삼키기가 어려워진다. 협착은 염증의 결과일 수 있다. 바륨 삼킴 검사(barium swallow test) 또는 상부 위장 내시경 검사를 사용하여 식도 협착을 진단할 수 있다.

경도(stiffness): 물체 또는 유체의 단단함. ECM의 경도는 경도 구배(durotaxis)에서 세포의 이동을 안내하는데 중요하다. 경도는 제곱 미터(square meter)당 1 뉴턴인 Pascal (Pa) 단위로 측정할 수 있다.

치료제(therapeutic agent): 일반적인 의미로 사용되며 치료제(treating agent), 예방제(prophylactic agent) 및 대체제(replacement agent)를 포함한다. "치료(treatment)"또는 "치료하는(treating)"는 UBM 또는UBS하이드로겔과 같은, 방광ECM 하이드로겔과 같은 물질을 임의의 질병 증상을 어느 정도 감소, 억제 또는 완화하거나, 질병 진행을 늦추거나, 질병 퇴행을 유발하기에 충분한 양으로 환자에게 제공하는 것을 의미한다. 특정 실시예에서, 질환의 치료는 환자가 질환의 증상을 나타내기 전에 시작될 수 있다. 개시된 방법은 식도 염증을 억제하고/하거나 식도 염증의 효과를 완화시킨다.

치료적으로 유효한 양(Therapeutically effective amount): 방광 ECM 하이드로겔과 같은 조성물의 "치료적으로 유효한 양"은 환자에게 투여될 때 감소되는 진전의 감소 또는 질병 퇴행과 같은 증상 개선의 치료적 이점을 제공하는데 효과적인 양을 의미한다. 방광 ECM 하이드로겔의 양은 식도의 점막하 조직에 주사될 때 겔을 형성하고 하부 고유근으로부터 상부 점막을 분리하는 것과 같이 치료되는 대상에서 원하는 효과를 달성하기에 충분하다면 치료적으로 효과적이다. 점막하 쿠션을 형성하기 위한 유효량은 적용되는 제제, 치료 대상, 고통의 중증도 및 유형, 및 투여 방식에 따라 달라진다.

본 출원에 개시된 방법에서 사용되는 방광 ECM 하이드로겔은 의학적 및 수의학적 환경에서 모두에서 적용된다. 따라서, 일반 용어 "대상(subject)"또는 "환자(patient)"는 인간 또는 다른 영장류, 개, 고양이, 말 및 소와 같은 수의학적 대상을 포함하지만 이에 제한되지 않는 모든 동물을 포함하는 것으로 이해된다.

방광 ECM(Urinary Bladder ECM): 모든 포유류의 방광에서 추출한 세포외 기질. 이 용어에는 방광 기질(urinary bladder matrix, UBM) ECM 및 방광 점막하(urinary bladder submucosa, UBS) ECM이 포함된다. 방광의 벽은 다음과 같은 층으로 구성된다: 내강(luminal)에서부터 내강에서 먼(abluminal) 측면까지의 두께 단면에 나열된 점막(tunica mucosa)(전이 상피층(transitional epithelium layer) 및 고유막(tunica propria)을 포함), 점막하층, 최대 3 개의 근육층 및 외막(adventitia)(느슨한 결합 조직층). UBS는 내강에서 먼 근육층으로부터 박리된 방광 점막하 조직 및 척추 동물 방광의 분절의 점막의 적어도 내강 부분을 포함하는 조직 조성물로부터 제조된다(본 출원에 참고로 포함된 미국 특허 번호 5,554,389 참조). UBM ECM은 방광 상피 기저막(urinary bladder epithelial basement) 및 기저막(basement membrane) 바로 아래에 있는 고유막으로부터 제조된다(본 출원에 참고로 포함된 미국 특허 번호 6,576,265 참조).

달리 설명하지 않는 한, 본 출원에서 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 개시 내용이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 단수 용어 "a", "an"및 "the"는 문맥이 달리 명시하지 않는 한 복수 대상을 포함한다. 유사하게, "또는(or)"이라는 단어는 문맥이 달리 명시하지 않는 한 "와(and)"를 포함하도록 의도된다. 핵산 또는 폴리펩타이드에 대해 제공된 모든 염기 크기 또는 아미노산 크기 및 모든 분자량(molecular weight) 또는 분자 질량 값(molecular mass value)은 근사치이며 설명을 위해 제공된 것임을 추가로 이해해야 한다. 본 출원에 기재된 것과 유사하거나 동등한 방법 및 물질이 본 개시 내용의 실시 또는 시험에 사용될 수 있지만, 적합한 방법 및 물질이 아래에 기재된다. 용어 "구성하다(comprises)"는 "포함하다(includes)"를 의미한다. 용어 "약(about)"은 5 % 이내를 나타낸다. 본 출원에 언급된 모든 간행물, 특허 출원, 특허 및 기타 참고 문헌은 그 전체가 참고로 포함된다. 상충되는 경우 용어 설명을 포함해서 본 설명이 통제된다. 또한 재료, 방법 및 예는 예시일 뿐이며 제한하려는 의도가 아니다.

방광 세포외 기질(ECM) 하이드로겔

(Urinary Bladder Extracellular Matrix (ECM) Hydrogels)

방광 ECM 하이드로겔의 제조 방법은 예를 들어 미국 특허 번호 8,361,503, 미국 특허 번호 6,576,265 및 미국 특허 번호 5,554,389에 개시되어 있다. 하이드로겔을 생성하는 임의의 방법을 사용하여 본 명세서에 개시된 방법에서 사용되는 방광 ECM 하이드로겔을 생성할 수 있다. 추가 방법은 예를 들어 미국 특허 번호 4,902,508; 4,956,178; 5,281,422; 5,352,463; 5,372,821; 5,554,389; 5,573,784; 5,645,860; 5,771,969; 5,753,267; 5,762,966; 5,866,414; 6,099,567; 6,485,723; 6,576,265; 6,579,538; 6,696,270; 6,783,776; 6,793,939; 6,849,273; 6,852,339; 6,861,074; 6,887,495; 6,890,562; 6,890,563; 6,890,564; 및 6,893,666은 ECM과 관련되어 있다. ECM은 방광에서 유래된다. 특정 실시예에서, 방광 ECM은 척추 동물로부터 예를 들면 인간, 원숭이, 말, 돼지, 소 및 양을 포함하되 이에 국한되지 않는 포유 동물로부터 분리된다. 포유류는 수의학적 동물일 수 있다. 특정 비제한적 예에서, 방광 ECM은 돼지 또는 인간이다. 일부 실시예에서, ECM은 방광 ECM의 기저막 부분을 포함한다. 특정 실시예에서, 방광 ECM은 기저막의 적어도 일부를 포함한다. 다른 실시예에서, ECM은 세포 배양으로부터 수확된다. 방광 ECM의 준비에 사용되는 근원 조직은 매우 다양한 방법으로 수확될 수 있으며, 일단 수확되면 수확된 조직의 다양한 부분을 사용할 수 있다. 방광 ECM 하이드로겔은 UBM 또는 UBS ECM 하이드로겔일 수 있다(도2A 및 2B 참조).

미국 특허 제 8,361,503 호(본 출원에 참고로 포함됨)에 개시된 바와 같이, 돼지 방광 ECM과 같은 방광 ECM은 외과용 핸들(scalpel handle)과 축축한 거즈로 세로로 닦는 동작(longitudinal wiping motion)을 하여 방광 조직을 마모시켜서(abrading) 장막(tunica serosa), 근층(tunica muscularis), 점막하조직(tunica submucosa)을 포함하는 내강에서 먼 층을 제거함으로써 제조된다. 조직 분절의 외전 후, 점막(tunica mucosa)의 내강 부분은 동일한 닦는 동작을 사용하여 하부 조직에서 박리한다. 이러한 조직이 제거된 후 생성된 ECM은 고유판(tunica lamina propria)과 위에 놓인 기저막으로 구성된다. 본 출원에 참고로 포함 된 미국 특허 제 6,893,666 호는 또한 방광, 피부, 식도 및 소장으로부터 ECM의 생산을 개시한다.

한 실시예에서, ECM은 수확된 돼지 방광으로부터 분리되어 방광 기질(UBM)을 제조한다. 과도한 결합 조직과 잔류 소변이 방광에서 제거된다. 장막(tunica serosa), 외근층(tunica muscularis externa), 점막하 조직(tunica submucosa) 및 대부분의 근막 점막(muscleis mucosa)은 기계적 마모(mechanical abrasion)(위 참조) 또는 효소 치료(enzymatic treatment), 수화(hydration) 및 마모(abrasion)의 조합으로 제거할 수 있다. 이러한 조직의 기계적 제거는 세로로 닦는 동작(longitudinal wiping motion)을 사용하여 마모에 의해 수행되어 외층(특히 내강에서 먼 평활근층) 및 점막(tunica mucosa)의 내강 부분(상피층)까지 제거할 수 있다. 이러한 조직의 기계적 제거는 예를 들어 Adson-Brown 겸자 및 Metzenbaum 가위로 장간막 조직(mesenteric tissue)을 제거하고 외과용 핸들 또는 축축한 거즈로 싼 다른 단단한 물체로 세로로 닦는 동작을 사용하여 근층(tunica muscularis)과 점막하조직(tunica submucosa)을 닦아내어 수행된다. 또한, 점막(tunica mucosa)의 상피 세포는 예를 들어 고삼투압 식염수를 포함하되 이에 국한되지 않는 탈상피화 용액에 조직을 담가서 해리될 수 있다. 생성된 UBM은 점막(tunica mucosa) 및 인접한 고유막(tunica propria)의 기저막(basement membrane)을 포함하며, 이는 과산화아세트산(peracetic acid)으로 추가 처리되고 동결 건조되고 분말화된다(미국 특허 번호 8,361,503 참조).

일부 실시예에서, 상피 세포(epithelial cell)는 10 분 내지 4 시간 범위의 기간 동안, 예를 들어 1.0 N염분의 고삼투압 식염수(hypertonic saline)는 포함하되 국한되지 않는 탈상피화 용액에 조직을 먼저 담가서 박리될 수 있다. 고삼투암 식염수 용액에 노출되면 하부 기저막에서 상피세포를 효과적으로 제거할 수 있다. 초기 박리 절차 후 남은 조직은 상피 기저막과 상피 기저막에서 내강으로부터 먼 조직층을 포함한다. 이 조직은 다음으로 상피 기저막이 아닌 대부분의 내강에서 먼 조직을 제거하기 위해 추가 치료를 받는다. 외부 장막(outer serosal), 외막(adventitial), 평활근 조직(smooth muscle tissue), 점막하 조직(tunica submucosa) 및 대부분의 근막 점막 (muscularis mucosa)은 기계적 마모 또는 효소 처리, 수화 및 마모의 조합에 의해 나머지 탈상피 조직에서 제거된다.

상업적으로 입수 가능한 방광 ECM 제제는 또한 본 출원에 기재된 방법, 장치 및 조성물에 사용될 수 있다. 상업적으로 이용 가능한 제제는 MATRISTEM UBM ™ (Acell Corporation; Jessup, Md.)을 포함하지만 이에 국한되지 않는다.

방광 ECM은 과산화아세트산에 대한 노출을 포함하되 이에 국한되지 않는 여러 표준 기술로 소독(disinfection)될 수 있다. 방광 ECM은 저선량 감마선, 가스 플라즈마 살균, 산화 에틸렌 처리, 초임계 CO₂ 또는 전자빔 처리로 살균될 수 있다. 보다 일반적으로 ECM의 소독은 0.1 % (v / v)과 아세트산, 4 % (v / v) 에탄올 및 95.9 % (v / v) 멸균 수에 2 시간 동안 담가서 이루어진다. 과산화아세트산 잔류 물은 PBS (pH = 7.4)로 15 분 동안 2 회, 멸균 수로 15 분 동안 2 회 세척하여 제거한다. 그런 다음 ECM 재료는 프로필렌옥사이드(propylene oxide) 또는 에틸렌옥사이드(ethylene oxide) 처리, 감마선 조사 처리(0.05 ~ 4mRad), 가스 플라즈마 살균, 초임계 CO₂ 또는 전자빔 처리를 통해 살균할 수 있다. ECM은 또한 글루타르알데히드(glutaraldehyde)로 처리하여 단백질 물질의 가교 결합(cross linking)을 유발할 수 있지만, 이 처리는 물질이 천천히 재흡수되거나 전혀 재흡수되지 않도록 물질을 실질적으로 변경하고 구조적인 리모델링보다는 더 밀접하게 유사한 흉터조직 형성(scar tissue formation)이나 캡슐화(encapsulation)와 같은 다른 형태의 숙주(host) 리모델링을 유도한다. 단백질 물질의 가교 결합은 또한 카르보디이미드(carbodiimide) 또는 디하이드로터말(dehydrothermal) 또는 광산화(photooxidation) 방법으로 유도될 수 있다. 미국 특허 번호 8,361,503에 개시된 바와 같이, ECM은 0.1 % (v / v)과산화아세트산 (a), 4 % (v / v) 에탄올 및 96 % (v / v) 멸균수에 2 시간 동안 담가서 소독한다. ECM 물질은 PBS (pH = 7.4)로 15 분 동안 2 회, 탈이온수로 15 분 동안 2 회 세척한다.

관심 조직의 분리 후, 탈세포화는 다양한 방법, 예를 들지만 이에 국한되지 않는 고삼투압 식염수, 과산화아세트산, TRITON-X® 또는 기타 세정제(detergent)에 대한 노출에 의해 수행된다. 소독과 탈세포화는 동시에 가능하다. 예를 들지만 이에 국한되지 않는, 위에서 설명한 과산화아세트산으로 소독하는 것도 ECM을 탈세포화하는 역할을 할 수 있다. 탈세포화된 ECM은 동결 건조(freeze-dried) 또는 공기 건조로 건조할 수 있다. 건조된 ECM은 찢기(tearing), 갈기(milling), 절단(cutting), 빻기(grinding) 및 전단(shearing)을 포함하지만 이에 국한되지 않는 방법으로 분쇄할 수 있다. 분쇄된 ECM은 또한 예를 들지만 이에 국한되지 않고, 동결 또는 동결 건조 상태에서 빻기 또는 갈기와 같은 방법에 의해 분말 형태로 추가 처리될 수 있다.

ECM 하이드로겔 제조에 사용하기 위해 용해된(solubilized) ECM 조직을 준비하기 위해, 분쇄된(comminuted) ECM을 산성 용액에서 산성 프로테아제로 소화하여 소화 용액(digest solution)을 형성한다. ECM의 소화 용액은 일반적으로 실온에서 일정 시간동안 일정한 교반 상태로 유지된다. ECM 소화액은 즉시 사용하거나-20 °C에서 보관하거나 예를 들지만 이에 국한되지 않는 -20 °C 또는 -80 °C에서 냉동 할 수 있다.

일단 ECM이 용해되면 (일반적으로, 실질적으로, 완전히) 용액의 pH는 7.2와 7.8 사이로, 하나의 실시예에 따르면 pH 7.4로 올라간다. NaOH를 포함한 수산화 이온(hydroxyl ion)을 함유하는 염기와 같은, 염기는 용액의 pH를 높이는 데 사용할 수 있다. 마찬가지로 인산염 완충 식염수(Phosphate Buffered Saline, PBS)를 포함 하나 이에 국한되지 않는 등장 버퍼와 같은 버퍼를 사용하여 용액을 목표 pH로 만들거나 겔의 pH 및 이온 강도를 생리적 pH 및 이온 조건과 같은 목표 수준으로 유지하는 데 도움을 줄 수 있다. 이것은 "프리겔(pre-gel)"용액을 형성한다. 프리겔은 실온에서 점성 용액으로 액체 형태이다. 중화된 소화 용액(프리겔)은 37 °C에 가까운 온도에서 겔화 될 수 있으며, 여기서 온도는 생리적 온도에 근접한다. 이 방법은 일반적으로 겔화 이전에 투석(dialysis) 단계를 포함하지 않으며, 일반적으로 특정 속도로 37 °C에서 겔화되는, 보다 완전한 ECM 유사 기질을 생성한다(하기 참조).

따라서 ECM은 방광에서 유래된다. 방광 ECM은 한 명의 대상, 또는 2 명, 3 명 또는 4 명의 대상과 같은 한 명 이상의 대상으로부터, 또는 방광 세포주로부터 생성될 수 있다. 상기 ECM은 시판되는 방광 ECM일 수 있다. 비제한적인 하나의 실시예에서, ECM은 동결 건조되고 분쇄된다. ECM은 산성 용액에서 산성 프로테아제로 용해되어 소화된 ECM을 생성한다. 산성 프로테아제는 제한없이 펩신 또는 트립신, 또는 이들의 조합일 수 있다. ECM은 프로테아제에 적합하거나 최적인 산성 pH, 예를 들어 약 pH 2보다 크거나 또는 pH 2와 4 사이, 예를 들어 0.01M HCl 용액에서 용해될 수 있다. 용액은 일반적으로 혼합(섞기(stirring), 휘젖기(agitation), 혼합(admixing), 혼합(blending), 회전(rotating), 기울기(tilting) 등)과 함께 조직 유형(예를 들어, 아래 예 참조)에 따라 약 12 내지 약 48 시간 동안 용해된다. ECM 하이드로겔은 (i) 세포외 기질을 분쇄하고, (ii) 산성 용액에서 산성 프로테아제로 소화하여 온전한, 비투석(non-dialyzed) 또는 비가교된(non-cross-linked) 세포외 기질을 용해시켜 소화 용액을 생성하고, (iii) 소화 용액의 pH를 7.2와 7.8 사이의 pH로 상승시켜 중화된 소화 용액 (프리겔 용액)을 생성하고, (iv) 관심 대상의 식도 내에서 대략 37 °C의 온도에서 용액을 겔화한다. 산성 프로테아제를 사용하여 ECM을 소화하는 경우, 프리겔 용액과 생성된 하이드로겔은 비활성화된 프로테아제를 포함할 수 있다. 이들 방광 ECM 하이드로겔 중 임의의 것이 본 출원에 개시된 방법에 사용된다.

방광 ECM 하이드로겔은 약 37 °C의 온도에 노출되면 겔을 형성한다. "프리겔"형태의 방광ECM 하이드로겔은 예를 들지만 이에 국한되지 않고 -20 °C 또는 -80 °C에서 냉동 및 보관할 수 있다. "프리겔"형태의 방광 ECM 하이드로겔은 약 25 °C와 같은 실온에서 보관할 수 있다. 따라서 방광 ECM 하이드로겔은 37 °C 미만, 예를 들어 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4 °C 에서 프리겔 형태이다. 방광 ECM 하이드로겔은 냉동 보관이 가능하므로 0 °C 이하에서 보관할 수 있다. 본 출원에서 사용되는 용어 "프리겔 형태"또는 "프리겔"은 pH가 증가하지만 겔화되지 않은 방광 ECM 하이드로겔을 의미한다. 예를 들어지만 이에 국한되지 않고, 프리겔 형태의 방광ECM 하이드로겔은 pH가 7.2와 7.8 사이이다. 방광 ECM 하이드로겔은 경구, 카테터 또는 내시경을 통해 식도 염증이 있는 대상에게 프리겔 형태로 전달될 수 있다.

프리겔 형태의 방광 ECM 하이드로겔은 환자의 식도로 도입될 수 있다. 약 37 °C의 식도에 점막하로 도입되면 방광 ECM 하이드로겔이 겔화되고 고유근과 식도의 점막하 사이에 ECM 하이드로겔 쿠션을 생성하여 외과적 절제를 위해 점막하를 들어 올린다.

일부 실시예에서, 방광 ECM 하이드로겔은 다음과 같은 특징을 갖는다: a) 약 37 °C의 온도에서 20 분 미만의 50 % 겔화 시간; b) 식도로의 주입에 적합한 유동 점도; 및 c) i) 약 10 내지 약 400 Pascal (Pa), ii) 약 10 내지 약 450 Pa; iii) 약 10 내지 약 600 Pa, iv) 약 5 내지 약 1,000 Pa, v) 약 10 내지 1,000 Pa, 또는 vi) 약 10 내지 약 70 Pa의 경도.

실시예에서, 방광 ECM 하이드로겔은 다음과 같은 특징을 갖는다: a) 약 37 °C의 온도에서 30 분 미만의 50 % 겔화 시간; b) 식도로의 주입에 적합한 유동 점도; 및 c) 약 10 내지 약 400 파스칼 (Pa)의 경도. 다른 실시예에서, ECM 하이드로겔은 다음과 같은 특징을 갖는다: a) 약 37 °C의 온도에서 20 분 미만의 50 % 겔화까지의 시간; b) 식도로의 주입에 적합한 유동 점도; 및 c) 약 10 내지 약 450 Pascal (Pa)의 경도. 다른 실시예에서, 방광 ECM 하이드로겔은 다음과 같은 특징을 갖는다: a) 약 37 °C의 온도에서 20 분 미만의 50 % 겔화 시간; b) 식도로의 주입에 적합한 유동 점도; 및 c) 약 10 내지 약 600 Pascal (Pa)의 경도.

다른 실시예에서, 방광 ECM 하이드로겔은 다음과 같은 특징을 갖는다: a) 약 37 °C의 온도에서 20 분 미만의 50 % 겔화 시간; b) 식도로의 주입에 적합한 유동 점도; 및 c) 약 5 내지 약 1,000 Pascal (Pa)의 경도. 다른 실시예에서, 방광 ECM 하이드로겔은 다음과 같은 특징을 갖는다: a) 약 37 °C의 온도에서 20 분 미만의 50 % 겔화 시간; b) 식도로의 주입에 적합한 유동 점도; 및 c) 약 10 내지 약 1,000 Pascal (Pa)의 경도. 더 많은 실시예에서, 방광 ECM 하이드로겔은 다음과 같은 특징을 갖는다: a) 약 37 °C의 온도에서 20 분 미만의 50 % 겔화 시간; b) 식도로의 주입에 적합한 유동 점도; 및 c) 10-70 파스칼 (Pa)의 경도.

추가적인 특정 비제한적 예에서, 방광 ECM 하이드로겔은 (a) 산성 용액에서 산성 프로테아제로 방광을 소화함으로써 무세포(acellular) 세포외 기질을 용해시켜 소화된 ECM을 생성하고; (b) 소화된 ECM의 pH를 7.2와 7.8 사이의 pH로 올려 중화된 소화 용액을 생성하는 단계; (c) 소화된 ECM을 약 2mg / ml 내지 약 16mg / ml의 농도, 예를 들어 약 8mg / ml 내지 약 12mg / ml의 방광 ECM 하이드로겔로 희석하는 단계. 이 방광 ECM 하이드로겔은 대상의 식도로 도입되어 겔화된다.

본 출원에 개시된 방법에서 사용되는 방광 ECM 하이드로겔은 약 37 °C, 예컨대 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 분 미만의 온도에서 20 분 미만의 50 % 겔화 시간을 갖는다. 일부 실시예에서, 방광 ECM 하이드로겔은 약 37 °C의 온도에서 10 분 미만의 50 % 겔화에 이르는 시간을 갖는다. 다른 실시예에서, 50 % 겔화까지의 시간은 약 37 °C의 온도에서 약 2 내지 약 20 분이다. 추가 실시예에서, 50 % 겔화까지의 시간은 약 37 °C의 온도에서 약 2 내지 약 10 분이다. 또 다른 실시예에서, 50 % 겔화까지의 시간은 약 37 °C의 온도에서 약 3 내지 약 8 분이다.

개시된 방광 ECM 하이드로겔은 식도 점막하 공간으로의 주입 / 주사에 적합한 유동 점도를 가질 수 있다. 일부 실시예에서, 방광 ECM 하이드로겔은 0.1 / s의 전단 속도에서 약 0.1 내지 약 100 Pa*s, 예컨대 약 0.2, 1, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 또는 90 Pa*s의 유동 점도를 갖는다. 추가 실시예에서, 방광 ECM 하이드로겔은 0.1 / s의 전단 속도에서 약 1 내지 약 40 Pa * s, 예컨대 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35 또는 40 Pa * s 의 유동 점도를 갖는다.

다른 실시예에서, 방광 ECM 하이드로겔은 1000 / s의 전단 속도에서 약 0.01 내지 약 0.20 Pa * s, 예를 들어 약 0.01, 0.02, 0.03, 0.04, 0.05, 0.06, 0.07, 0.08, 0.09, 0.10, 0.11, 0.12, 0.13, 0.14, 0.15, 0.16, 0.17, 0.19 또는 0.2, 또는 1000 / s의 전단 속도에서 약 0.01 내지 약 0.10 Pa*s의 유동 점도를 갖는다.

더 많은 실시예에서, 방광 ECM 하이드로겔은 100 / s의 전단 속도에서 약 0.02 내지 약 0.8 Pa * s, 또는 100 / s의 전단 속도에서 약 0.1 내지 약 0.8 Pa*s, 예컨대 약 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7 또는 0.8 Pa*s를 갖는다.

추가 실시예에서, 방광 ECM 하이드로겔은 0.2 / s의 전단 속도에서 약 10 내지 약 100 Pa*s의 유동 점도 및 1000 /s의 전단 속도에서 약 0.01 내지 약 0.10 Pa*s의 유동 점도를 갖는다. 더 많은 실시예에서, ECM 하이드로겔은 0.1 / s의 전단 속도에서 1 내지 40 Pa*s 및 1000 / s의 전단 속도에서 0.01 내지 0.2 Pa*s의 유동 점도를 갖는다.

다른 실시예에서, 방광 ECM 하이드로겔은 전단 속도 1 / s에서 약 0.1 내지 약 25 Pa*s, 예컨대 1 내지 약 25 Pa*s, 또는 1 내지 약 20 Pa*s, 또는 1 내지 약 10 Pa*s, 예를 들면 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25 Pa*s의 유동 점도를 갖는다. 유동 점도는 1 / s의 전단 속도에서 예를 들어 5, 10, 15 또는 20 Pa*s일 수 있다. 다른 실시예에서, 방광 ECM 하이드로겔은100 / s의 전단 속도에서 약 0.025 내지 약 0.06, 예를 들어 약 0.025, 0.030, 0.035, 0.040, 0.045, 0.050, 0.055 또는 0.060의 유동 점도를 갖는다. 유동 점도는 1 / s의 전단 속도에서 약 0.1 내지 약 25 Pa*s이고, 100 / s의 전단 속도에서 약 0.02 내지 약 0.8 Pa*s이다. 추가 실시예에서, 유동 점도는 1 / s의 전단 속도에서 약 1 내지 약 10 Pa*s이고, 100 / s의 전단 속도에서 약 0.1 내지 약 0.3이다.

추가 실시예에서, 방광 ECM 하이드로겔은 0.2 / s의 전단 속도에서 약 10 내지 약 100 Pa*s의 유동 점도를 갖는다. 다른 실시예에서, 방광 ECM 하이드로겔은 1000 / s의 전단 속도에서 약 0.01 내지 약 0.10 Pa*s의 유동 점도를 갖는다. 다른 실시예에서, 방광 ECM 하이드로 겔은 0.1 / s의 전단 속도에서 약 1 내지 약 40 Pa*s의 유동 점도를 갖고 1000 / s의 전단 속도에서 0.01 내지 0.2 Pa*s의 유동 점도를 갖는다.

개시된 방광 ECM 하이드로겔은 i) 약 10 내지 약 400 Pascal (Pa), ii) 약 10 내지 약 600 Pa, iii) 약 5 내지 약 1,000 Pa, iv) 약 10 내지 1,000 Pa, 또는 v) 약 10 내지 약 70 Pa의 경도를 갖는다. 방광 ECM 하이드로겔은 약 10 내지 약 400 Pascal (Pa), 예를 들어 약 10 내지 약 70 Pa, 약 10 내지 약 100 Pascal (Pa), 또는 약 10 내지 약 150 Pascal (Pa), 약 10 내지 약 200 Pa, 또는 약 10 내지 약 250 Pa의 경도를 가질 수 있다. 일부 실시예에서, 개시된 방광 ECM 하이드로겔은 약 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 또는 70 Pa의 경도를 갖는다. 다른 실시예에서, 개시된 방광 ECM 하이드로겔은 약 10 내지 약 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390 또는 400 Pa의 경도를 갖는다. 추가로 실시예에서, 개시된 방광 ECM 하이드로겔은 약 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400Pa의 경도를 가질 수 있다.

일부 실시예에서, 하이드로겔 중 방광 ECM 농도는 약 2 mg / ml 내지 약 20 mg / ml, 예를 들어 약 8 mg / ml 내지 약 12 mg / ml 또는 약 2 mg / ml 내지 약 16 mg / ml 이다. 다른 실시예에서, 하이드로겔 중 방광 ECM 농도는 약 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 또는 16 mg / ml이다. 예시적인 사용 농도는 약 9mg / ml 내지 약 11mg / ml, 및 약 10mg / ml 내지 약 12mg / ml를 포함하되 이에 국한되지 않는다. 추가의 예시적인 농도는 약 8mg / ml 내지 약 10mg / ml, 약 8mg / ml 내지 약 11mg / ml, 약 8mg / ml 내지 약 13mg / ml, 약 8mg / ml 내지 약 14mg / ml, 약 8 mg / ml 내지 약 15 mg / ml, 및 약 8 mg / ml 내지 약 16 mg / ml 를 포함한다. 추가의 예시적인 사용 농도는 또한 약 6 mg / ml 내지 약 12 mg / ml, 약 13 mg / ml, 약 14 mg / ml, 약 15 mg / ml 또는 약 16 mg / ml를 포함한다.

치료 방법(Methods of Treatment)

대상의 식도에서 고유근으로부터 점막 및 점막하를 분리하는 방법이 본 출원에 개시되어 있으며, 이러한 방법은 기관 부위에서 점막하와 하부 고유근 사이에 쿠션을 형성하기 위해 UBS 또는 UBM ECM 하이드로겔과 같은 방광 세포외 기질(ECM) 하이드로겔을 포함하는 약학적 조성물을 식도에 점막하 주사하는 것을 포함한다. 상기 방법은 EMR 또는 EMD일 수 있다.

EMR는 위장관의 표재층(점막 및 점막하)에 국한된 고착성 또는 편평한 신생물을 제거하기 위해 개발된 내시경 기술이다. EMR는 일반적으로 2cm 미만의 병변을 제거하거나 더 큰 병변을 단편적으로 제거하는 데 사용된다. EMR는 또한 정확한 병리학적 병기를 위해 절제된 표본을 평가하는 데 중요한 역할을 한다. 용종 절제술(polypectomy)과는 대조적으로, EMR는 점막하 층에 일반적으로 생리 식염수(normal saline, NS) 용액을 주입하여 근육층에서 병변을 들어 올리는 것을 포함한다. EMR는 림프절 전이의 위험을 결정하기 위해 정확한 조직병리학적 병기 (histopathological staging)를 위한 표본을 얻는데도 유용하다. EMR는 장벽 점막하의 중간 또는 더 깊은 부분을 절제하여 감염된 점막의 완전한 제거를 용이하게 한다. 다양한 EMR 기술이 설명되었으며 스네어 절제(snare resection)를 포함하는 네 가지 방법이 일반적으로 사용된다. (1) 주사 및 절단 방법(the inject and cut method); (2) 주사, 들어 올리기 및 절단 방법(inject, lift, and cut method); (3) 캡-보조 내시경 점막 절제(cap-assisted EMR, EMRC); 및 (4) 결찰(ligation)이 있는 EMR (EMRL). 주사 및 절단 기술에서 병든 점막은 점막하 액체 쿠션을 생성하여 근육층에서 들어 올려서 잡고 수술용 전기 스네어(electrosurgical snare)를 사용하여 꽉 조인 다음 절제한다. 그러나 얇은 점막하 층에 주사하는 것은 섬세한 과정이며, 주사된 용액은 빠르게 소멸되는 경향이 있으며, 튀어 나온 병변에 비해 스네어로 편평하고 눌린 병변을 포착하기 어렵고 크거나 처리하기 곤란한 곳에 위치한 병변은 제거하기 어려울 수 있다(Uraoka et al., Drug Design, Development and Therapy 2008 : 2 131-138). 주사 보조 내시경 점막 절제술(Injection-assisted EMR)은 크고 편평한 결장 폴립에 자주 사용된다.

ESD는 더 큰 병변을 제거하기 위해 특별히 개발되었다. 병변은 수술용 전기칼을 사용하여 점막하 층을 따라 직접 분리하여 큰 병변도 일괄 절제(en-bloc resection)한다. ESD는 특정 암 단계 치료에서 기존 수술을 대체할 것으로 예측되었지만 기존 EMR보다 천공(perforation) 및 출혈 합병증(bleeding complication) 비율이 더 높기 때문에 EMR보다 더 많은 내시경 기술과 경험이 필요하다. ESD는 절연팁 투열성 나이프(insulation-tipped diathermic knife), 바늘 나이프(needle knife), 후크 나이프(hook knife), 플렉스 나이프(flex knife), 삼각형 팁 나이프(triangle tipped knife), 플러시 나이프(flush knife), 스플래시 바늘(splash needle) 및 작은 구경 팁 투명 후드(small-caliber tip transparent hood)와 같은 수많은 수술용 전기칼을 사용할 수 있다. 이 칼은 고주파 전기 수술 전류 (high frequency electrosurgical current, HFEC) 발생기와 함께 사용할 수 있다. ESD의 특징은 다음 세 단계이다: (1) 점막하 쿠션을 형성하기 위해 유체를 주사하여 근육층에서 병변을 높이고; (2) 병변 주변 점막의 원주형 절단 (circumferential cutting); 및 (3) 병변 아래 점막하의 결합 조직의 분리 (Kakushima et al., Wold J. Gstroenterol. 14 (9) : 2962-2967, 2008 참조, 본 출원에 참고로 포함됨). 다양한 점막하 주사 용액은 이전에 개발되어 EMR 동안 사용하기에 만족스러운 것으로 나타났지만 더 긴 ESD 수술을 도입하려면 점막하 층을 분리하는 동안에 절단 선을 식별하는데 도움이되는 더 오래 지속되는 용액이 요구되었다(Uraoka et al., Drug Design, Development and Therapy 2008 : 2 131-138). 현재 개시된 방법은 이러한 요구를 충족시킨다.

EMR에서 사용하는 점막하 주사는 점막하 쿠션에 유체를 주입하면 스네어로 표적 병변을 포착하기 직전에 제거할 조직의 분리를 용이하게 하여 열 손상과 천공 및 출혈의 위험을 줄이고 또한 절제를 용이하게 한다. 점막하 주사는 EMR 수술에서 중요한 역할을 하는데 이는 용액이 충분한 기간 동안 제자리에 유지되어야 하고 스네어로 잡는 것을 용이하게 하기 위해 반구 모양을 형성해야 하기 때문이다. 또한 충분히 높은 점막하 상승을 제공하면 ESD 수술 중에 안전한 점막하 절단이 가능하다(Uraoka et al., Drug Design, Development and Therapy 2008 : 2 131-138). 게다가 수술로 인해 염증이 생기기 때문에 수술 부위에 남아있는 쿠션은 항염(anti-inflammatory) 작용을 해야 한다. 방광 ECM 하이드로겔은 협착(stricture)을 완화하고 재상피화(re-epithelialization)를 촉진한다. 현재 개시된 방법은 또한 이러한 요구를 충족시킨다.

일부 실시예에서, 개시된 방법은 항염증 특성을 갖고, 저렴하고, 무독성이며, 주사하기 쉽고, 높고 오래 지속되는 점막하 쿠션을 제공하는 ECM 하이드로겔을 사용한다. ECM 하이드로겔은 프리겔 형태로 투여된 후 주사 부위에서 겔화되어 쿠션을 형성한다. 쿠션은 수술 중에 분리되어 일부 하이드로겔이 하부 고유근에 남아 치유를 돕는다. 개시된 ECM 하이드로겔은 절제된 점막 / 점막하의 제거에 의해 생성된 상처의 폐쇄를 용이하게 한다. 일부 실시예에서, 이 수술은 ESD이다. 다른 실시예에서, 이 수술은 EMR이다.

정상 식염수 (NS) 및 희석 용액(thinner solution)(예: ELEVIEW^TM, 미국 특허 번호 9,226,996 참조)이 내시경 절제를 위한 점막하 쿠션으로 사용되었지만, 이러한 용액의 고유한 특성인 용액의 빠른 분산으로 인해 적절한 점막하 유체 쿠션을 생성하고, 원하는 높이에서 유지되며 원하는 위치에 쿠션을 유지하는 것이 어려웠다. 더욱이 ESD에서 일단 점막 / 점막하 막이 제거되면 이러한 제제는 하부 고유근에 유지되지 않는다. 또한, 이러한 제제는 염증 감소와 같은 치유 과정을 돕지 않는다. 방광 ECM 하이드로겔의 사용은 이러한 요구를 충족한다.

본 출원에 개시된 방광 ECM 하이드로겔은 임의의 ESD 또는 EMR에서 사용될 수 있다. 본 출원에 참고로 포함된 미국 특허 제 9,364,580 호에 개시된 바와 같이, 내시경 주사 바늘은 길이(최대 약 230cm)가 길고 원위(distal) 주사 바늘이 있는 내부 주사 튜브가 슬라이드 가능하게 배치된 비교적 긴 카테터를 포함하는 장치이다. 근위(proximal) 작동 핸들은 필요할 때 하나를 다른 하나에 대해 상대적으로 이동시키기 위해 카테터 및 주사 튜브에 결합한다. 주사 튜브에 대한 유체 접근은 일반적으로 핸들의 리어 커넥터(eer connector)를 통해 제공된다. 내시경 주사 바늘 장치는 일반적으로 내시경의 작업 채널을 통해 주사 부위로 전달된다. 내시경 작업 채널의 내강이 손상되지 않도록 보호하기 위해 주입 바늘 장치의 핸들을 조작하여 장치를 내시경에 삽입하기 전에 원위 주사 바늘을 카테터의 내강으로 빼낸다. 이것은 장치가 내시경의 내강을 통해 이동할 때 주사 바늘의 날카로운 부분이 노출되는 것을 방지한다. 내시경 주사 바늘 장치의 원위 말단이 주사 부위에 위치 할 때, 그 핸들을 다시 조작하여 주사 바늘을 카테터의 내강에서 말단으로 이동시킨다. 가장 먼 위치로 전진할 때 주사 바늘의 노출 된 부분의 길이는 약 4-6mm이다.

주사 부위를 뚫은 후, 주사 바늘 핸들에 연결된 루어락 피팅(luer-lock fitting)과 함께 제공된 5ml ~ 10ml 주사기에 들어있는 프리겔 형태의 ECM을 주사 튜브와 바늘을 통해 점막하와 하부 고유근 사이와 같은 주사 부위로 전달할 수 있다.

내시경술 중에 일반적으로 사용되는 주사 바늘 및 기타 부대용품, 예를들어 용종 절제술용 스네어, 클리핑(clipping) 장치, 생검 겸자 등은 일반적으로 작업 채널 또는 수술 채널이라고 하는 내시경의 하나 이상의 특정 채널을 통과한다. 사용되는 내시경의 유형에 따라 작업 채널의 내경이 다를 수 있다. 그러나 GI 내시경에 사용되는 가장 일반적인 내시경에는 내경이 약 2mm에서 약 5mm 범위인 작업 채널이 있다. 일반적으로 내시경 부대용품 제조업체는 모든 작업 채널에 맞는 외경이 있는 부대용품을 생산한다. 일부 실시예에서, 내시경 주사 바늘, 카테터의 외경은 약 1.9, 2.0, 2.1, 2.2 또는 2.3cm와 같이 1.9mm 내지 2.3mm 범위이다. 따라서 내부 주사 튜브가 외부 카테터에 포함되어 있음을 고려할 때 내경은 일반적으로 1mm 이하이다. 프리겔 형태의 개시된 방광 ECM 하이드로겔은 이러한 카테터를 쉽게 통과할 수 있다.

프리겔 형태의 방광 ECM 하이드로겔은 주사기를 사용하여 1 차 용기에서 에멀젼 볼륨을 흡입하고 표재성 점막층 바로 아래 내시경의 작업 채널에 삽입된 내시경 주사 바늘을 사용하여 상기 에멀젼의 적절한 볼륨을 주사하여, 제자리에 있을 때 쿠션이 되는 점막하층에 액체 볼륨을 배치하기 위한 내시경 절제술에 사용할 수 있다: 병변이 편평하여 식도 내강과 같은 내강으로 튀어 나오지 않더라도 내시경술을 수행하는 동안 점막 표면의 상승으로 내시경 시술의가 발견된 점막 병변을 쉽게 절제할 수 있다.

쿠션에 적어도 하나의 염료가 있으면 내시경 시술의가 점막 아래의 구조(예: 점막하층 및 외부 근육벽)를 시각화하는데 도움이 될 수 있으므로 절제술을 수행하는 내시경 시술의가 상기 구조에 손상을 일으킬 수 있는 위험을 낮출 수 있다. 염료를 사용하면 쿠션 구멍(cavity)과 점막 기저부를 시각화 할 수 있다. 점막 표면에서 병변을 제거하면 점막에 상처가 생긴다. 약학적 조성물의 주사된 볼륨에 의해 생성된 쿠션의 지속성은 재주입할 필요 없이 내시경 절제술을 수행할 수 있게 한다. 프리겔 형태의 방광 ECM 하이드로겔은 병변 또는 종양의 부위와 같은 대상 기관의 관심 부위에 점막하 주사하여 기관의 부위에서 점막하와 하부 고유근 사이에 쿠션을 형성한다. 쿠션이 분리되어 방광 ECM 하이드로겔의 일부가 하부 고유근에 유지되고 치유 과정을 돕는다.

개시된 방법은 식도에서 사용된다. 비제한적인 예에서, 기관은 식도이고, 방법은 식도로부터 식도 암종 또는 선암을 분리하는 방법을 포함한다. 또 다른 비제한적인 예에서, 방법은 바렛씨 식도를 가진 대상의 식도로부터 점막 및 점막하를 절개하는 것을 포함한다.

본 출원에 개시된 바와 같이 방광 ECM 하이드로겔은 겔화되는 온도 이하, 예컨대 실온 이하(예를 들어, 약 25°C에서 유지된다. 방광 ECM 하이드로겔은 예를 들어 투여 전에 25°C 또는 4°C에서 유지될 수 있다. 그런 다음 프리겔 형태의 방광 ECM 하이드로겔 유효량을 대상의 식도에 투입한다. 방광 ECM 하이드로겔은 동결 건조 또는 동결된 형태로 제공될 수 있으며 대상의 기관 부위에 투여하기 직전에 재구성될 수 있다.

개시된 방법은 인간 및 수의학적 대상를 포함하는 임의의 대상에서 사용된다. 대상은 모든 연령이 될 수 있다. 한 실시예에서, 방광 ECM 하이드로겔을 포함하는 프리겔 형태의 조성물은 인간의 표적 조직에 주입되어 쿠션을 형성한 다음 선택적으로 절제술과 같은 내시경술 절차를 받게된다. 방광 ECM은 치료중인 대상과 동일한 종에서 유래하거나 다른 종에서 유래 할 수 있다. 일부 실시에에서, 대상은 인간이고 방광 ECM 하이드로겔은 인간 및 / 또는 돼지 방광으로부터 유래된다. 다른 실시예에서, 방광 ECM 하이드로겔은 비인간 영장류, 개, 고양이, 말 또는 소로부터 유래된다. 방광 ECM은 상업적 원천에서도 제공될 수 있다.

개시된 방법은 대상의 장관 기관 부위에서 고유근으로부터 점막 및 점막하를 분리하는 주사를 필요로하기 때문에 침습적이다. 본 출원에 개시된 임의의 방법은 방광 ECM 하이드로겔을 포함하는 약학적 조성물을 대상의 식도에 점막하 주사하여 기관 부위에서 점막하와 하부 고유근 사이에 쿠션을 형성하는 것을 포함할 수 있다. 방광 ECM 하이드로겔은 다음과 같은 특징을 갖는다: a) 약 37 °C의 온도에서 20 분 미만의 50 % 겔화 시간; b) 식도로 주입하기에 적합한 유동 점도; 및 c) 약 10 내지 약 400 Pascal (Pa)의 경도. 방광 ECM 하이드로겔은 겔화되고 밑에 존재하는 고유근으로부터 점막과 점막하를 분리하며 대상의 기관 부위에서 염증을 억제한다. ECM 하이드로겔은 프리겔 형태로 내시경 또는 카테터를 통해 투여할 수 있다.

일부 실시예에서, 절제술은 내시경 점막 절제술 또는 식도 내시경 점막하 박리술이고, 방법은 식도로부터 식도 암종 또는 선암을 절개하는 방법을 포함한다. 더 많은 실시예에서, 방법은 이형성증이 있는 환자의 식도로부터 점막 및 점막하를 분리하는 것을 포함한다. 더 많은 실시예에서, 방법은 바렛씨 식도를 갖는 대상의 식도로부터 점막 및 점막하를 분리하는 것을 포함한다.

방법은 또한 쿠션에 내시경 절제술을 수행하는 것을 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 방법은 하이드로겔이 기관의 하부 고유근에 유지되고 점막 및 점막하가 기관 부위로부터 제거되도록 쿠션을 분할하는 것을 포함한다. 일부 비제한적인 예에서, 하부 고유근에 유지되는 하이드로겔 쿠션의 부분은 조직에서 전염증성(pro-inflammatory) 대식세포 활성화를 하향 조절한다.

일부 실시예에서, 하이드로겔의 50 % 겔화까지의 시간은 약 37 °C의 온도에서 20 분 미만이다. 일부 특정 비제한적인 예에서, 50 % 겔화까지의 시간은 약 37 °C에서 약 2 내지 약 20 분이다. 다른 특정 비제한적 예에서, 50 % 겔화까지의 시간은 약 37 °C에서 약 2 내지 약 10 분이다. 추가의 비제한적 예에서, 50 % 겔화까지의 시간은 약 3 내지 약 8 분이다.

추가 실시예에서, 프리겔 형태의 유동 점도는 식도로 주사하기에 충분하다. 일부 실시예에서, 방광 ECM 하이드로겔의 유동 점도는 약 0.1 / s의 전단 속도에서 약 0.1 내지 약 100 Pa*s이고 1000 / s의 전단 속도 에서 약 0.01 내지 약 0.2 Pa*s이다. 일부 비제한적인 예에서, 유동 점도는 1 / s의 전단 속도에서 약 0.1 내지 약 25 Pa*s이고, 약 100 / s의 전단 속도에서 약 0.02 내지 약 0.8 Pa*s이다.

추가 실시예에서, 방광 ECM 하이드로겔은 조직에 도입될 때 약 10 내지 약 400 Pascal (Pa)의 경도를 가지며; 여기서 ECM 하이드로겔은 10-70 Pa의 경도를 갖는다. 추가 실시예에서, 하이드로겔의 ECM 농도는 2 mg / ml 내지 약 16 mg / ml이다.

방광 ECM 하이드로겔은 본 출원에 개시된 임의의 방법에 의해 생성될 수 있다. 일부 실시예에서, ECM 하이드로겔은 (a) 산성 용액에서 산성 프로테아제로 조직을 소화하여 탈세포화된 세포외 기질(ECM)을 용해시켜 소화된 ECM을 생성하고; (b) 소화된 식도 ECM의 pH를 7.2 내지 7.8 사이의 pH로 상승시켜 중화된 소화 용액을 생성하는 단계에 의해 생성된다. 추가 실시예에서, 단계 (b)에서 소화된 ECM의 pH를 높이는 것은 염기 또는 등장 버퍼를 첨가하여 소화된 ECM의 pH를 높이는 것을 포함한다. 추가 실시예에서, 펩신, 트립신 또는 이들의 조합과 같은 산성 프로테아제가 사용된다.

일부 실시예에서, 방광 ECM 하이드로겔은 대상에게 투여하기 전에 25 ℃ 이하에서 유지된다. 일부 실시예에서, ECM 하이드로겔은 약 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 또는 28 °C 과 같은 약 4 °C 내지 약 28 °C에서 유지된다. ECM 하이드로겔은 사용 직전에 약 4 °C에서 유지하고 약 4 °C에서 약 25 °C에서 사용하거나 약 25 °C로 데울 수 있다. 일부 실시예에서, 온도 조절은 ECM 하이드로겔이 프리겔 형태로 유지되도록 보장하고, 따라서 점막하와 하부 고유근 사이의 주사에 적합하다. 추가 실시예에서, 하이드로겔은 예를 들어 37 °C의 온도에 도달할 때와 같이 대상에게 투여될 때 겔화된다.

실시예(EXAMPLES)

ELEVIEW ^TM와 방광 ECM 하이드로겔은 서로 다른 생체 재료이다. ELEVIEW ^TM (Aries Pharmaceuticals, Inc, Dublin, Ireland)는 EMR 및 ESD 수술을 위한 점막하 들어 올리기를 제공하기 위해 임상 적으로 사용되는 Poloxamer 188의 상업적으로 이용가능한 저점도 에멀젼이다. ELEVIEW ™는 37 °C에서 안정적으로 형성된 하이드로겔을 형성하지 않고 37 °C에서 한 시간 동안 액체 상태를 유지한다. 대조적으로, 방광 ECM(본 출원에 개시된 방법에 따라, 즉 ECM의 프로테아제 소화에 의해 제조됨)은 37 ℃ (체온)에서 안정적으로 형성되는 하이드로겔을 형성한다. ELEVIEW ™ 및 UBM 및 UBS ECM 하이드로 겔을 포함한 방광 ECM 하이드로겔은 점막 아래에 주사할 수 있다. 이상적인 생체 재료는 두 층 모두에 부착된다. 방광 ECM 하이드로겔은 강력한 점막 접착 특성과 유익한 생물학적 특성을 가지고 있다. 방광 ECM 하이드로겔은 생체 내에서 점막하 쿠션으로 효과적으로 사용될 수 있으며, 따라서 하부 고유근으로부터 점막하를 분리하는데 사용할 수 있다.

실시예1(Example1)

재료 및 방법(Materials and Methods)

방광 ECM의 준비: 표면을 70 % 에탄올과 25 % 파이로클린(Pyroclean)으로 멸균하였다. -20 °C에 보관된 돼지 방광(Animal Biotech Industries)을 해동하고 Type I 물로 철저히 세척하였다. 방광은 정점(apex)에서 돔(dome)으로 나뉘어 내강면(luminal side)이 아래를 향하도록 평평하게 놓았다. 비스듬한 아크릴 스크레이퍼(beveled acrylic scraper) 및 겸자(forceps)를 사용하여 고유(판)막(tunica (lamina) propria) 및 기저막(UBM을 포함하는 조직층)을 남기기 위해 내강에서 먼 측면(장막(tunica serosa), 외근층(tunica muscularis externa), 점막하조직(tunica submucosa) 및 중막 근막(tunica muscularis mucosa))의 평활근 조직(smooth muscle tissue)을 기계적으로 제거하였다. UBM을 4 °C의 Type I 물에 밤새 저장하고 4 % 에탄올에서 0.1 %과산화아세트산(PAA)을 사용하여 4 시간 동안 탈세포화하고 PBS, Type 1 물, PBS 및 Type 1 물로 15 분 세척하여 UBM을 생성하였다. 모든 탈세포화 단계는 300rpm의 쉐이커 플레이트(shaker plate)에서 교반하면서 실온에서 수행되었다.

방광 ECM 하이드로겔 형성: UBM을 동결 건조하고 Wiley mill을 사용하여 분말 화하고, 분말형 ECM 10mg / mL를 실온에서 48 시간 동안 0.01M HCl에서 펩신 (1mg / mL)으로 분해하였다. ECM 다이제스트(digest) 및 펩신 대조군은 사용할 때까지 -20 °C에서 보관하였다. 실험 당일, ECM 다이제스트 및 펩신 대조군은4 °C에서 0.1M NaOH (프리겔 용액의 1/10 부피), pH 7.4의 10x PBS (프리겔 용액의 1/19 부피)에 의해 중화되었고 4 °C에서 얼음처럼 차가운 1x PBS를 사용하여 5 mg / mL ECM 농도로 희석하였다(본 출원에 참고로 포함된Freytes et al.. Biomaterials 29 (11) : p. 1630-7. 2008참조).

유동학: 방광 ECM의 점탄성(viscoelastic) 특성은 온도 조절식 40mm 평행 플레이트(parallel plate) 유량계(rheometer) (AR2000)로 측정되었다. 샘플을 4 °C로 유지하고 10 °C로 사전 냉각된 평행 플레이트 구조를 사용하여 유량계에 로드(load)했다. 샘플 플레이트 인터페이스(interface)를 밀봉하고 테스트 중 증발을 최소화하기 위해 미네랄 오일이 사용되었다. 일련의 유동학적 테스트가 각 샘플에 순서대로 수행되었다. 전단 속도 범위(0.1-1000 s^-1)에서 샘플의 점도 프로파일(profile)을 결정하기 위해 10 °C에서 정상 상태 흐름 곡선(steady state flow curve)을 수행하였다. 플레이트 온도는 10 °C에서 37 °C로 급격히 상승했으며, 최대 저장 계수(maximum storage modulus)(G '), 최대 손실 계수(maximum loss modulus)(G '') 및 겔화 역학(gelation kinetics)을 측정하기 위해 1rad / s의 주파수에서 작은, 0.5 %의 진동 변형(oscillatory strain)을 적용하여 37 °C에서 진동 타임 스윕(oscillatory time sweep)을 수행하였다. 데이터는 통계 분석(n = 3)을 위해 Prism (버전 6, GraphPad)에서 추출 및 분석되었다.

생체 내(In-vivo)에서 EMR를 위한 점막하 유체 쿠션으로 ECM의 사용: 아세프로마진(acepromazine)(0.01 mg / kg, SC) 및 케타민(ketamine)(5-11 mg / kg)으로 마취(anesthesia)를 유도하고, 기관내관(endotracheal tube)를 통해 1-5 % 아이소플루레인(isofluorane)으로 수술 평면 마취(surgical plane anesthesia)를 유지한다. 수술 및 수술 직후 기간 동안 동물에게 젖산 링거 용액(lactated Ringer's solution) I.V. 2ml / kg / h를 투여하였다. 온도는 동물 아래에 놓인 온수 순환 가열 패드를 통해 제어되었다. 수술 중에 심장, 호흡률, 체온 및 반응성과 같은 생리학적 매개 변수가 모니터링되었다. 수술을 시작하기 전에 25mg / kg의 세파졸린(Cefazolin)을 사용한 항생제 예방(antibiotic prophylaxis)을 투여하였다.

동물을 바로 누운 자세(supine position)로 놓고 Pentax EG3430K 내시경을 사용하여 식도를 평가하였다. 입에서 GE 접합부(GE junction)까지의 거리를 측정하였다. 식도의 기준점(reference point)을 확인한 후, 4˚C에서 절제 부위의 점막과 점막하를 Olympus Injectorforce 4mm 23G 바늘을 사용하여 8mg / ml의 하이드로겔 주사로 파란색 염색된 방광 기질을 분리하였다. 이 온도는 겔화 및 바늘의 잠재적인 막힘을 방지하기 위해 항상 유지되었다. 부위 당 약 2-5ml의 파란색 겔을 주사하였다. 5cm 길이의 점막 전체 둘레(100 %)는 밴드-라이게이션(band-ligation) EMR 기술을 사용하여 제거되었다. EMR의 경우 라이게이션 밴드(ligation band)가 있는 Cook Duette Kit가 사용되었다. 그런 다음 스네어를 사용하여 점막을 절제하였다.

실시예2(Example2)

EMR을 위한 점막하 유체 쿠션으로 방광 ECM 하이드로겔의 생체 내 사용

(In-vivo use of a urinary bladder ECM hydrogel as submucosal fluid cushion for EMR)

방광 ECM-하이드로겔은 저항없이 긴 내시경 바늘을 통해 전달될 수 있었다. EMR 수술을 용이하게 하기 위해 점막의 상승이 성공적으로 이루어지고 유지되었으며, 제거를 위해 분리가 생성된 장소를 나타내는 파란색 염료가 보였다(도 1A). 스네어를 사용하여 조직을 쉽게 제거하였다. 육안으로 관찰했을 때, 제거된 식도 점막 조직은 겔의 일부를 포함하였다(도 1B). 하이드로겔의 파란색 염료는 점막을 제거한 후 식도 둘레를 가로 질러 확산되는 것으로 보였으며 하이드로겔을 사용하여 완전한 원주가 달성되었다(도 1C).

실시예3(Example3)

유동학 데이터(Rheology Data)

UBM의 점탄성 특성은 도3에 나타내었다. UBM에 대해 설명된 것과 유사하게 수행 된 항상성 상태 흐름 곡선(steady state flow curve) (도 3A)은 ECM 농도가 증가함에 따라 점도의 농도 의존적 증가와 UBM 하이드로 겔의 전단-감소(shear-thinning) 프로파일을 보인다. 즉, 점도는 각 ECM 농도에 대한 전단 속도가 증가함에 따라 감소한다.

UBM ECM(도 3B)은 ECM이 증가함에 따라 증가하는 저장 계수(경도)를 보여 주었다. UBM은 안정적으로 형성된 ECM 하이드로겔(Freytes et al., Biomaterials, 2008. 29(11): p. 1630-7)의 정의에 따라 각 ECM 농도에서 손실 계수(G '')보다 10 배 더 큰 저장 계수(G ')를 나타내었다. UBM은 농도에 비의존적인 겔화 시간을 보여 주었으며, 즉 겔화 시간은 모든 ECM 농도에 대해 일정하게 유지되었다(도 3C).

본 발명의 원리가 적용될 수 있는 많은 가능한 실시예를 고려하여, 예시된 실시예는 본 발명의 예일 뿐이며 본 발명의 범위에 대한 제한으로 간주되어서는 안된다는 것을 인식해야 한다. 오히려, 본 발명의 범위는 다음의 청구 범위에 의해 정의된다. 따라서 우리는 이러한 청구 범위와 정신에 포함되는 모든 것을 발명이라고 주장한다.

Claims

방광(urinary bladder) 세포외 기질(ECM) 하이드로겔(hydrogel)을 포함하는 약학적 조성물을 식도(esophagus)에 점막하 주사하여 식도에서 점막하(submucosa)와 점막하 아래에 존재하는 고유근(underlying muscularis propria) 사이에 쿠션을 형성하는 단계를 포함하되,
상기 세포외 기질(ECM) 하이드로겔은:
a) 약 37 °C의 온도에서 20 분 미만의 50 % 겔화(gelation) 시간;
b) 식도로의 주입에 적합한 유동 점도(flow viscosity); 및
c) 약 10 내지 약 400 Pascal (Pa)의 경도(stiffness)의 특징을 가져,
식도에서 고유근으로부터 점막(mucosa)과 점막하를 분리하고 염증을 억제하는 특징을 갖는 것을 특징으로 하는, 식도의 부위에서 고유근으로부터 점막 및 점막하를 분리하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 50 % 겔화 시간이 약 37 °C에서 약 2 내지 약 20 분인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 50 % 겔화 시간이 약 37 ℃에서 약 2 내지 약 10 분인 것을 특징으로 하는 방법.
제2항에 있어서, 상기 50 % 겔화 시간이 약 3 내지 약 8 분인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유동 점도가 약 0.1 / s의 전단 속도(shear rate)에서 약 0.1 내지 약 100 Pa*s이고 1000 / s의 전단 속도에서 약 0.01 내지 약 0.2 Pa*s인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유동 점도가 1 / s의 전단 속도에서 약 0.1 내지 약 25 Pa*s이고, 약 100 / s 전단 속도에서 약 0.02 내지 약 0.8 Pa*s 인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포외 기질(ECM) 하이드로겔은 10 내지 300 Pa의 경도를 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하이드로겔 중 ECM 농도가 2 mg / ml 내지 약 16 mg / ml 인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포외 기질(ECM) 하이드로겔은 내시경(endoscope) 또는 카테터(catheter)를 통해 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포외 기질(ECM) 하이드로겔이
(a) 산성 용액에서 산성 프로테아제(acid protease)로 조직을 소화하여 탈세포화된(decellularized) ECM을 용해시켜 소화된 ECM을 제조하는 단계; 및
(b) 소화된 ECM의 pH를 7.2와 7.8 사이의 pH로 올려 중화된 소화 용액을 생성하는 단계에 의해 제조되는 것을 특징으로 하는 방법.
제10항에 있어서, (b)의 소화된 ECM의 pH를 높이는 것은 염기 또는 등장 버퍼(isotonic buffer)를 첨가하여 소화된 ECM의 pH를 높이는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제10항 또는 제11항에 있어서, 상기 산성 프로테아제가 펩신(pepsin), 트립신(trypsin) 또는 이들의 조합인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포외 기질(ECM) 하이드로겔이 대상에게 투여되기 전에 25 ℃ 이하에서 유지되는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포외 기질(ECM) 하이드로겔이 내시경으로 또는 카테터를 통해 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 기관이 식도이고, 상기 방법은 식도로부터 식도 이형성증(esophageal dysplasia), 선암(adenocarcinoma) 또는 암종(carcinoma)을 분리하는 방법을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 16 항에 있어서, 상기 방법이 바렛씨 식도(Barrett's esophagus)를 갖는 대상의 식도로부터 점막 및 점막하를 분리하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 쿠션에서 내시경 절제술(endoscopic resection procedure)을 수행하는 것을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제18항에 있어서, 분리된 점막 및 점막하를 제거하기 위한 절제술이 내시경 점막 절제술(endoscopic mucosal resection) 또는 내시경 점막하 박리술(endoscopic submucosal dissection)인 것을 특징으로 하는 방법.
제19항에 있어서, 상기 방법은
쿠션을 분할하는 것은 하이드로겔이 식도의 하부 고유근에 유지되고 점막 및 점막하가 식도 부위에서 제거되는 것을 포함하는 방법인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상이 인간인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 분리 방법이 내시경 점막 절제술 또는 내시경 점막하 박리술을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방광 ECM 하이드로겔이 방광 기질(UBM) ECM 하이드로겔인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방광 ECM 하이드로겔이 방광 점막하(UBS) ECM 하이드로겔인 것을 특징으로 하는 방법.
a) 약 37 °C에서 20 분 미만의 50 % 겔화 시간;
b) 식도로의 주입에 적합한 유동 점도; 및
c) 약 10 내지 약 400 Pascal (Pa)의 경도; 특징을 갖는 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항의 방법에 사용하기 위한 방광 세포외 기질(ECM) 하이드로겔을 포함하는 조성물.