KR20210021522A - Cd79a 키메라 항원 수용체 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 CD79A를 발현시키는 암에 대한 양자 세포 요법을 위한 개선된 조성물을 제공한다.
Description
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 미국 특허법(35 U.S.C. § 119(e)) 하에서 2018년 6월 14일자로 출원된 미국 가출원 특허 제62/685,078호의 유익을 주장하며, 이 기초출원은 본 명세서에 이의 전문이 참조에 의해 원용된다.
서열목록에 관한 언급
본 출원과 관련된 서열목록은 종이 사본 대신에 텍스트 형식으로 제공되며, 여기서 본 명세서 내에 참고로 편입된다. 서열목록을 함유하는 텍스트 파일명은 BLBD_100_01WO_ST25.txt이다. 텍스트 파일은 64KB이며, 2019년 6월 14일자로 생성되었고, 본 명세서의 출원과 동시에 EFS-Web을 통해 전자적으로 제출 중에 있다.
기술분야
본 발명은 암 치료를 위한 개선된 조성물 및 방법에 관한 것이다. 더 구체적으로는, 본 발명은 개선된 항-CD79A 키메라 항원 수용체(chimeric antigen receptor: CAR), 유전자 변형된 면역 효과기 세포, 및 CD79A 발현 암을 효과적으로 치료하기 위한 이들 조성물의 용도에 관한 것이다.
암은 전세계적으로 상당한 건강 문제이다. 2008년 내지 2010년의 비율을 기준으로, 오늘날 태어난 남성 및 여성의 40.76%는 이들의 생애 동안 일정 시기에 일부 형태의 암으로 진단될 것이다. 남성의 20.37%는 그들의 50대 내지 70대의 생일에 암이 발생될 것이며, 여성에 대한 15.30%와 비교된다. 미국에서 2010년 1월에 암 병력을 갖는 생존해 있는 대략 13,027,914명의 남성 및 여성 -- 6,078,974명의 남성 및 6,948,940명의 여성이 있었다. 미국에서 1,660,290명의 남성 및 여성(854,790명의 남성 및 805,500명의 여성)이 암으로 진단되었고, 580,350명의 남성 및 여성은 2013년에 전역에서 암으로 사망할 것으로 추정되었다. 문헌[Howlader et al. 2013].
B 세포의 악성 형질전환은 림프종, 예를 들어, 다발성 골수종 및 비호지킨 림프종을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 암을 야기한다. 비호지킨 림프종(NHL) 및 다발성 골수종(MM)을 포함하는 B 세포 악성종양을 갖는 매우 다수의 환자는 암 사망률에 대한 유의미한 기여자이다. 다양한 형태의 치료에 대한 B 악성 종양의 반응은 복합적이다. 화학요법 및 방사선요법을 포함하는 B 세포 악성종양을 치료하는 전통적인 방법은 독성 부작용으로 인해 효용이 제한되어 있다. 항-CD19, 항-CD20, 항-CD22, 항-CD23, 항-CD52, 항-CD80 및 항-HLA-DR 치료 항체에 의한 면역요법은 불량한 약물동태학 프로파일, 혈청 프로테아제에 의한 항체의 빠른 제거 및 사구체에서의 여과, 및 종양 부위 내로의 제한된 침투 및 암 세포 상의 표적 항원의 발현 수준에 부분적으로 기인하여, 제한된 성공을 제공하였다. 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현시키는 유전자 변형된 세포를 사용하기 위한 시도는 또한 제한된 성공으로 충족되었다. 추가로, 특정 CAR에서 사용되는 주어진 항원 결합 도메인의 치료 효능은 예측 불가능할 수 있으며: 항원 결합 도메인이 너무 강하게 결합한다면, CAR T 세포는 "사이토카인 폭풍"으로 여겨지는 잠재적으로 치명적인 면역 반응을 초래하는 엄청난 사이토카인 방출을 유도할 수 있으며, 항원 결합 도메인이 너무 약하게 결합한다면, CAR T 세포는 암 세포를 제거함에 있어서 충분한 치료적 효능을 나타내지 않을 수도 있다.
본 발명은 일반적으로 입양 세포(adoptive cell) 요법을 생성하기 위한 개선된 벡터 및 이를 이용하는 방법을 제공하였다. 더 구체적으로는, 본 발명은 CD79A를 발현시키는 암을 치료하거나, 예방하거나, 개선시킴에 있어서 항-CD79A CAR 분자 및 이들의 용도를 제공한다.
다양한 실시형태에서, a) 인간 CD79A 폴리펩타이드의 하나 이상의 에피토프에 결합하는 항-CD79A 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로서, 서열번호 1 내지 3, 9 내지 11, 또는 17 내지 19에 제시된 CDRL1-CDRL3 서열을 포함하는 가변 경쇄 서열, 및/또는 서열번호 4 내지 6, 12 내지 14, 또는 20 내지 22에 제시된 CDRH1-CDRH3 서열을 포함하는 가변 중쇄 서열을 포함하는, 상기 항-CD79A 항체 또는 이의 항원 결합 단편; b) 막관통 도메인; c) 하나 이상의 세포내 공자극 신호전달 도메인; 및/또는 d) 1차 신호전달 도메인을 포함하는, 세포외 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR)가 제공된다.
특정 실시형태에서, 인간 CD79A 폴리펩타이드에 결합하는 항-CD79A 항체 또는 항원 결합 단편은 Fab' 단편, F(ab')2 단편, 이중특이성 Fab 이량체(Fab2), 삼중특이성 Fab 삼량체(Fab3), Fv, 단일쇄 Fv 단백질("scFv"), 비스-scFv, (scFv)2, 미니바디, 다이어바디(diabody), 트라이어바디(triabody), 테트라바디(tetrabody), 이황화물 안정화된 Fv 단백질("dsFv") 및 단일-도메인 항체(sdAb, 나노바디(Nanobody))로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 실시형태에서, 인간 CD79A 폴리펩타이드에 결합하는 항-CD79A 항체 또는 항원 결합 단편은 scFv이다.
특정 실시형태에서, 항-CD79A 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 1 내지 3 중 어느 하나에 제시된 바와 같은 하나 이상의 경쇄 CDR 및/또는 서열번호 4 내지 6 중 어느 하나에 제시된 바와 같은 하나 이상의 중쇄 CDR을 포함한다.
일부 실시형태에서, 항-CD79A 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 9 내지 11 중 어느 하나에 제시된 바와 같은 하나 이상의 경쇄 CDR 및/또는 서열번호 12 내지 14 중 어느 하나에 제시된 바와 같은 하나 이상의 중쇄 CDR을 포함한다.
일부 실시형태에서, 항-CD79A 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 17 내지 19 중 어느 하나에 제시된 바와 같은 하나 이상의 경쇄 CDR 및/또는 서열번호 20 내지 22 중 어느 하나에 제시된 바와 같은 하나 이상의 중쇄 CDR을 포함한다.
일부 실시형태에서, 항-CD79A 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 7, 15 또는 23 중 어느 하나에 제시된 바와 같은 가변 경쇄 서열 및/또는 서열번호 8, 16 또는 24 중 어느 하나에 제시된 바와 같은 가변 중쇄 서열을 포함한다.
특정 실시형태에서, 항-CD79A 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 7, 15 또는 23 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 아미노산 동일성을 갖는 가변 경쇄 서열 및/또는 서열번호 8, 16 또는 24 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 아미노산 동일성을 갖는 가변 중쇄 서열을 포함한다.
추가 실시형태에서, 항-CD79A 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 7에 제시된 바와 같은 가변 경쇄 서열 및/또는 서열번호 8에 제시된 바와 같은 가변 중쇄 서열을 포함한다.
추가 실시형태에서, 항-CD79A 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 15에 제시된 바와 같은 가변 경쇄 서열 및/또는 서열번호 16에 제시된 바와 같은 가변 중쇄 서열을 포함한다.
추가 실시형태에서, 항-CD79A 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 23에 제시된 바와 같은 가변 경쇄 서열 및/또는 서열번호 24에 제시된 바와 같은 가변 중쇄 서열을 포함한다.
추가 실시형태에서, 막관통 도메인은 T-세포 수용체의 알파 또는 베타쇄, CDδ, CD3ε, CDγ, CD3ζ, CD4, CD5, CD8α, CD9, CD 16, CD22, CD27, CD28, CD33, CD37, CD45, CD64, CD80, CD86, CD 134, CD137, CD152, CD154 및 PD1로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리펩타이드이다.
추가 실시형태에서, 막관통 도메인은 CD8α, CD28, CD4, CD45, PD1 및 CD152로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리펩타이드이다.
일부 실시형태에서, 막관통 도메인은 CD8α로부터 유래된다.
추가 실시형태에서, 하나 이상의 공자극 신호전달 도메인은 TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9, TLR10, CARD11, CD2, CD7, CD27, CD28, CD30, CD40, CD54(ICAM), CD83, CD134(OX40), CD137(4-1BB), CD278(ICOS), DAP10, LAT, NKD2C, SLP76, TRIM 및 ZAP70로 이루어진 군으로부터 선택되는 공자극 분자로부터 유래된다.
특정 실시형태에서, 하나 이상의 공자극 신호전달 도메인은 CD28, CD134 및 CD137로 이루어진 군으로부터 선택되는 공자극 분자로부터 유래된다.
일부 실시형태에서, 하나 이상의 공자극 신호전달 도메인은 CD137로부터 유래된다.
특정 실시형태에서, 1차 신호전달 도메인은 FcRγ, FcRβ, CD3γ, CD3δ, CD3ε, CD3ζ, CD22, CD79a, CD79b 및 CD66d로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리펩타이드로부터 단리된다.
특정 실시형태에서, 1차 신호전달 도메인은 CD3ζ로부터 단리된다.
추가 실시형태에서, CAR은 힌지 영역 폴리펩타이드를 더 포함한다.
특정 실시형태에서, 힌지 영역 폴리펩타이드는 CD8α의 힌지 영역을 포함한다.
추가 실시형태에서, CAR은 스페이서 영역을 더 포함한다.
추가 실시형태에서, CAR은 신호 펩타이드를 더 포함한다.
특정 실시형태에서, 신호 펩타이드는 IgG1 중쇄 신호 폴리펩타이드, CD8α 신호 폴리펩타이드, 또는 인간 GM-CSF 수용체 알파 신호 폴리펩타이드를 포함한다.
특정 실시형태에서, CAR은 서열번호 25 내지 30 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
특정 실시형태에서, CAR은 서열번호 25에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
특정 실시형태에서, CAR은 서열번호 26에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
특정 실시형태에서, CAR은 서열번호 27에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
특정 실시형태에서, CAR은 서열번호 28에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
특정 실시형태에서, CAR은 서열번호 29에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
특정 실시형태에서, CAR은 서열번호 30에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
다양한 실시형태에서, 본 명세서에 상정된 CAR의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드가 제공된다.
다양한 실시형태에서, 본 명세서에 상정된 CAR을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드가 제공된다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에 상정된 CAR을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 31 내지 36 중 어느 하나에 제시된 서열을 포함한다.
다양한 실시형태에서, 본 명세서에 상정된 CAR을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터가 제공된다.
특정 실시형태에서, 벡터는 발현 벡터이다.
특정 실시형태에서, 벡터는 에피솜 벡터이다.
추가 실시형태에서, 벡터는 바이러스 벡터이다.
추가 실시형태에서, 벡터는 레트로바이러스 벡터이다.
특정 실시형태에서, 벡터는 렌티바이러스 벡터이다.
추가 실시형태에서, 렌티바이러스 벡터는 인간 면역결핍 바이러스 1(HIV-1); 인간 면역결핍 바이러스 2(HIV-2), 비스나-메디 바이러스(visna-maedi virus: VMV) 바이러스; 염소 관절염-뇌염바이러스(caprine arthritis-encephalitis virus: CAEV); 말 전염성 빈혈 바이러스(equine infectious anemia virus: EIAV); 고양이 면역결핍 바이러스(feline immunodeficiency virus: FIV); 소 면역결핍 바이러스(bovine immune deficiency virus: BIV); 및 시미안 면역결핍 바이러스(simian immunodeficiency virus: SIV)로 본질적으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 실시형태에서, 벡터는 좌(5') 레트로바이러스 LTR, 프사이(Ψ) 패키징 신호, 중심 폴리퓨린관/DNA 플랩(cPPT(central polypurine tract)/FLAP), 레트로바이러스 유출 요소; 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결된 프로모터; 및 우(3') 레트로바이러스 LTR을 포함한다.
추가 실시형태에서, 벡터는 이종성 폴리아데닐화 서열을 더 포함한다.
특정 실시형태에서, 벡터는 B형 간염 바이러스 전사 후 조절 요소(HPRE) 또는 마멋 전사 후 조절 요소(WPRE)를 더 포함한다.
추가 실시형태에서, 5' LTR의 프로모터는 이종성 프로모터로 대체된다.
추가 실시형태에서, 이종성 프로모터는 거대세포바이러스(CMV) 프로모터, 라우스 육종 바이러스(RSV) 프로모터 또는 시미안 바이러스 40(SV40) 프로모터이다.
일부 실시형태에서, 5' LTR 또는 3' LTR은 렌티바이러스 LTR이다.
특정 실시형태에서, 3' LTR은 하나 이상의 변형을 포함한다.
특정 실시형태에서, 3' LTR은 하나 이상의 결실을 포함한다.
특정 실시형태에서, 3' LTR은 자기-비활성화(SIN) LTR이다.
특정 실시형태에서, 폴리아데닐화 서열은 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 또는 신호 토끼 β-글로빈 폴리아데닐화 서열이다.
추가 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드는 최적화된 코작(Kozak) 서열을 포함한다.
추가 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결된 프로모터는 거대세포바이러스 급초기 유전자 프로모터(CMV), 신장 인자 1 알파 프로모터(EF1-α), 포스포글리세레이트 키나제-1 프로모터(PGK), 유비퀴틴-C 프로모터(UBQ-C), 거대세포바이러스 인핸서/닭 베타-액틴 프로모터(CAG), 폴리오마 인핸서/단순 포진 티미딘 키나제 프로모터(MC1), 베타 액틴 프로모터(β-ACT), 시미안 바이러스 40 프로모터(SV40) 및 골수증식성 육종 바이러스 인핸서, 결실된 음성 제어 영역, dl587rev 프라이머-결합 부위 치환된(MND) 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택된다.
다양한 실시형태에서, 본 명세서에 상정된 CAR을 암호화하는 벡터를 포함하는 면역 효과기 세포가 제공된다.
특정 실시형태에서, 면역 효과기 세포는 T 림프구, 자연 살해(NK) 세포 및 NKT 세포로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 면역 효과기 세포는 본 명세서에 상정된 벡터로 형질도입되고, PI3K 경로 저해제의 존재 하에 활성화되고 자극되어, PI3K 경로 저해제의 부재 하에 활성화되고 자극된 형질도입된 면역 효과기 세포의 증식에 비해 형질도입된 면역 효과기 세포의 증식을 유지한다.
특정 실시형태에서, PI3K 경로 저해제의 존재 하에 활성화되고 자극된 면역 효과기 세포는 PI3K 경로의 저해제의 존재 하에 활성화되고 자극된 면역 효과기 세포에 비해, i) CD62L, CD127, CD197 및 CD38로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 마커 또는 ii) 마커 CD62L, CD127, CD197 및 CD38 모두의 발현이 증가된다.
특정 실시형태에서, PI3K 경로 저해제의 존재 하에 활성화되고 자극된 면역 효과기 세포는 PI3K 경로 저해제의 부재 하에 활성화되고 자극된 면역 효과기 세포에 비해, i) CD62L, CD127, CD27 및 CD8로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 마커 또는 ii) 마커 CD62L, CD127, CD27 및 CD8 모두의 발현이 증가된다.
일 실시형태에서, PI3K 저해제는 ZSTK474이다.
다양한 실시형태에서, 본 명세서에 상정된 면역 효과기 세포 및 생리적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 조성물이 제공된다.
다양한 실시형태에서, 면역 효과기 세포 집단에 본 명세서에 상정된 CAR을 암호화하는 벡터를 도입하는 단계를 포함하는, 본 명세서에 상정된 CAR을 포함하는 면역 효과기 세포 집단을 생성하는 방법이 제공된다.
특정 실시형태에서, 상기 방법은 면역 효과기 세포를 자극하는 단계 및 세포를 CD3에 결합하는 항체 및 CD28에 결합하는 항체와 접촉시킴으로써 세포가 증폭되도록 유도하는 단계를 더 포함하고; 이에 의해 면역 효과기 세포의 확장된 집단을 생성한다.
특정 실시형태에서, 면역 효과기 세포는 자극되고, 벡터를 도입하기 전에 증식하도록 유도된다.
추가 실시형태에서, 면역 효과기 세포 집단은 T 세포를 포함한다.
일부 실시형태에서, 면역 효과기 세포 집단은 NK 세포를 포함한다.
특정 실시형태에서, 세포는 PI3K 경로의 저해제의 존재 하에 활성화되고 자극되고, PI3K 경로의 저해제의 부재 하에 활성화되고 자극된 면역 효과기 세포의 증식에 비해 형질도입된 면역 효과기 세포의 증식을 유지한다.
일부 실시형태에서, PI3K 경로의 저해제의 존재 하에 활성화되고 자극된 저해제의 존재 하에 활성화되고 자극된 면역 효과기 세포는 PI3K 경로 저해제의 부재 하에 활성화되고 자극된 면역 효과기 세포에 비해 i) CD62L, CD127, CD197 및 CD38로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 마커, 또는 ii) 마커 CD62L, CD127, CD197 및 CD38 모두의 발현이 증가된다.
특정 실시형태에서, PI3K 경로 저해제의 존재 하에 활성화되고 자극된 면역 효과기 세포는 PI3K 경로 저해제의 부재에서 활성화되고 자극된 면역 효과기 세포에 비해 i) CD62L, CD127, CD27 및 CD8로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 마커, 또는 ii) 마커 CD62L, CD127, CD27 및 CD8 모두의 발현이 증가된다.
일 실시형태에서, PI3K 저해제는 ZSTK474이다.
다양한 실시형태에서, 투여 전에 CD79A를 발현시키는 암 세포의 세포독성에 비해 CD79A를 발현시키는 암 세포의 세포독성을 증가시키기에 충분한 양의 본 명세서에 상정된 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 CD79A를 발현시키는 암세포에서의 세포독성을 증가시키는 방법이 제공된다.
다양한 실시형태에서, 투여 전에 CD79A를 발현시키는 암 세포 수에 비해 CD79A를 발현시키는 암 세포 수를 감소시키는 데 충분한 양의 본 명세서에 상정된 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 CD79A를 발현시키는 암세포 수를 감소시키는 방법이 제공된다.
다양한 실시형태에서, 치료적 유효량의 본 명세서에 상정된 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 암 치료가 필요한 대상체에서 암을 치료하는 방법이 제공된다.
특정 실시형태에서, 암은 액상암(liquid cancer)이다.
일부 실시형태에서, 암은 혈액 악성 종양이다.
추가 실시형태에서, 암은 폐암, 유방암, 췌장암, 난소암, 전립선암, 부신암, 흑색종, 자궁암, 고환암 또는 방광암, 비호지킨 림프종, 급성 림프구성 백혈병(ALL), 만성 림프구성 백혈병(CLL), 모발세포 백혈병(HCL), 다발성 골수종(MM), 급성 골수성 백혈병(AML) 또는 만성 골수성 백혈병(CML)이다.
특정 실시형태에서, 비호지킨 림프종은 소형 림프구성 림프종(SLL), 미만성 거대 B 세포 림프종(DLBCL), 여포성 림프종(FL), 맨틀세포 림프종(MCL) 또는 변연대 림프종(MZL)이다.
특정 실시형태에서, 암은 급성 림프구성 백혈병(ALL), 만성 림프구성 백혈병(CLL), 모발세포 백혈병(HCL), 다발성 골수종(MM), 급성 골수성 백혈병(AML) 또는 만성 골수성 백혈병(CML)이다.
특정 실시형태에서, 암은 미만성 거대 B 세포 림프종(DLBCL)이다.
특정 실시형태에서, 암은 현성 다발성 골수종, 무증상 다발성 골수종, 형질세포 백혈병, 비분비성 골수종, IgD 골수종, 골경화성 골수종, 고립성 골형질세포종 및 골수외 형질세포종으로 이루어진 군으로부터 선택된 MM이다.
다양한 실시형태에서, CD79A를 발현시키는 암과 연관된 적어도 하나의 증상을 개선하는 데 충분한 양의 본 명세서에 상정된 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 CD79A를 발현시키는 암과 연관된 하나 이상의 증상을 개선하는 방법이 제공된다.
특정 실시형태에서, 개선되는 하나 이상의 증상은 쇠약, 피로, 숨가쁨, 잦은 멍 및 출혈, 빈번한 감염, 림프절 비대, 복부 팽창 또는 복부 통증, 뼈 또는 관절 통증, 골절, 계획하지 않은 체중 감소, 식욕 부진, 도한(night sweats), 지속적 미열 및 감소된 배뇨작용으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
도 1은 CD79A 발현 표적 세포의 존재 하에 표적 세포 상의 CD79A 발현, CAR 발현, 및 항-CD79A CAR T 세포 항원 의존적 활성을 도시한 도면. a) 이 패널은 Pfeiffer 및 Daudi 세포 상에서의 CD79A 발현을 나타내지만, K562 세포 상의 발현은 나타내지 않는다. b) 이 패널은 유세포분석을 이용하여 측정한 T 세포 상의 대표적인 항-CD79A CAR 발현을 나타낸다. c) 이 패널은 표적 세포의 부재 하에 또는 with K562 세포(CD79A-), Daudi 세포(CD79A+, 고 발현), 또는 Pfeiffer 세포(CD79A+, 저 발현)와 함께 공동 배양시킨 항-CD79A CAR T 세포의 IFNγ 분비를 나타낸다.
도 2는 CD79A 발현 표적 세포의 존재 하에 CAR 발현, 표적 세포 상의 CD79A 발현, 및 항-CD79A CAR T 세포 항원 의존적 활성을 나타낸다. a) 이 패널은 Daudi, NU-DUL-1, SU-DHL-2 및 Pfeiffer 세포 상의 CD79A 수용체 밀도를 나타낸다. b) 이 패널은 유세포분석을 이용하여 측정된 T 세포 상의 대표적인 항-CD79A CAR 발현을 나타낸다. c) 이 패널은 표적 세포의 부재 하에 또는 Huh7 세포(CD79A-), Huh7.CD79a 세포(CD79A+), Daudi 세포(CD79A+), NU-DUL-1(CD79A+), SU-DHL-2(CD79A+) 또는 Pfeiffer 세포(CD79A+)와 함께 공동 배양시킨 항-CD79A CAR T 세포의 IFNγ 분비를 나타낸다.
서열분석 식별자의 간단한 설명
서열번호 1 내지 24는 본 명세서에 상정된 항-CD79A CAR에 대한 예시적인 경쇄 CDR 서열, 중쇄 CDR 서열, 가변 도메인 경쇄 및 가변 도메인 중쇄의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 25 내지 30은 예시적인 항-CD79A CAR의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 31 내지 36은 예시적인 항-CD79A CAR의 핵산 서열을 제시한다.
서열번호 37 내지 38은 예시적인 인간 CD79A 폴리펩타이드의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 39 내지 49는 다양한 링커의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 50 내지 74는 프로테아제 절단 부위 및 자기-절단성 폴리펩타이드 절단 부위의 아미노산 서열을 제시한다.
도 2는 CD79A 발현 표적 세포의 존재 하에 CAR 발현, 표적 세포 상의 CD79A 발현, 및 항-CD79A CAR T 세포 항원 의존적 활성을 나타낸다. a) 이 패널은 Daudi, NU-DUL-1, SU-DHL-2 및 Pfeiffer 세포 상의 CD79A 수용체 밀도를 나타낸다. b) 이 패널은 유세포분석을 이용하여 측정된 T 세포 상의 대표적인 항-CD79A CAR 발현을 나타낸다. c) 이 패널은 표적 세포의 부재 하에 또는 Huh7 세포(CD79A-), Huh7.CD79a 세포(CD79A+), Daudi 세포(CD79A+), NU-DUL-1(CD79A+), SU-DHL-2(CD79A+) 또는 Pfeiffer 세포(CD79A+)와 함께 공동 배양시킨 항-CD79A CAR T 세포의 IFNγ 분비를 나타낸다.
서열분석 식별자의 간단한 설명
서열번호 1 내지 24는 본 명세서에 상정된 항-CD79A CAR에 대한 예시적인 경쇄 CDR 서열, 중쇄 CDR 서열, 가변 도메인 경쇄 및 가변 도메인 중쇄의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 25 내지 30은 예시적인 항-CD79A CAR의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 31 내지 36은 예시적인 항-CD79A CAR의 핵산 서열을 제시한다.
서열번호 37 내지 38은 예시적인 인간 CD79A 폴리펩타이드의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 39 내지 49는 다양한 링커의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 50 내지 74는 프로테아제 절단 부위 및 자기-절단성 폴리펩타이드 절단 부위의 아미노산 서열을 제시한다.
A.
개요
본 발명은 일반적으로 CD79A를 발현시키는 암을 예방하거나 치료하거나, CD79A 발현 암과 연관된 적어도 하나의 증상을 예방하거나, 치료하거나, 개선시키기 위한 개선된 조성물 및 방법에 관한 것이다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 유전자 변형된 면역 효과기 세포를 이용하여 CD79A를 발현시키는 암의 개선된 입양 세포 요법에 관한 것이다. 유전적 접근은 면역 인식 및 암 세포의 제거를 향상시키기 위한 잠재적 수단을 제공한다. 한 가지 유망한 전략은, 세포독성을 암 세포 쪽으로 전향시키는(redirect) 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현시키도록 면역 효과기 세포를 유전자 조작하는 것이다.
본 명세서에 상정된 입양 세포 요법의 개선된 조성물 및 방법은 용이하게 확장되고, 생체내 장기간 지속성을 나타내며, 유전자 변형된 면역 효과기 세포를 제공하고, B 세포 항원 수용체 복합체-결합 단백질 알파쇄, 막-결합 면역글로불린-결합 단백질(MB1, MB-1), 표면 IgM-결합 단백질, 및 Ig-알파(IGA)로도 불리는, CD79A를 발현시키는 세포에 대한 항원 의존적 세포독성을 입증한다. CD79a를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열의 예시적인 예는 NM_001783.3, NM_021601.3, ENST00000221972(uc002orv.3), ENST00000597454(uc060zdj.1), ENST00000444740 (uc002oru.4), Hs.631567 및 AK223371을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. CD79a를 암호화하는 폴리펩타이드 서열의 예시적 예는 P11912-1, P11912-2, ENSP00000400605 ENSP00000468922, ENSP00000221972, NP_001774.1 및 NP_067612.1을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
CD79는 2종의 단백질, 즉, CD79A 및 CD79B로 이루어진다. CD79A는 염색체 19q13.2에 위치되고, 대략 47kDa의 226개의 아미노산 당단백질을 암호화한다. 정확한 분자량은 글리코실화 정도에 따른다. CD79B는 염색체 17q23에 위치되고, 대략 37kDa의 229개의 아미노산 당단백질을 암호화한다. CD79A 및 CD79B는 엑손-인트론 구조를 공유하며, 둘 다 단일 IgSF Ig 도메인(CD79A에 대해 111-잔기 C-형 및 CD79B에 대해 129-잔기 V형)을 함유한다. 각각은 또한 고도로 보존된 막관통 도메인 및 두드러진 아미노산 진화 보존을 또한 나타내는 61(CD79A) 또는 48(CD79B) 아미노산 세포질 꼬리를 함유한다. CD79A 및 CD79B는 가장 초기의 구속(committed) B-세포 조상세포에 의해 발현된다. CD79A/B 이형이량체는 또한 μ 중쇄의 부재 하에 조기 B-세포 조상세포 표면 상에서 관찰되었지만, 조상세포가 B 세포 계통에 관여하는 데(commit) 단백질 중 어느 것도 필요하지 않다. 이후에 발생에서, CD79A 및 CD79B는 성숙 BCR 복합체로서 B 세포 표면 상에서 모든 아이소타입의 Ig와 함께 공동발현된다. CD79 단백질은 B 계통에 특이적이며, B 림프구 생성 내내 발현된다. CD79A 및 CD79B는 B 세포주, B 세포 림프종에서, 그리고 일부 골수종에서 대다수의 급성 백혈병의 전구체 B 세포 유형인 DLBCL을 포함하는 B-세포 신생물의 동정을 위해 사용되는 마커일 수 있다.
다양한 실시형태에서, 항-CD79A 항체 서열을 포함하는 CAR은 고도로 효능있으며; 강한 생체내 확장을 겪고; CD79A를 발현시키는 암 세포를 인식하며, CD79A 발현 암 세포에 대해 세포독성 활성을 나타낸다.
일 실시형태에서, 항-CD79A 항체 또는 항원 결합 단편, 막관통 도메인, 및 하나 이상의 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 CAR이 제공된다.
일 실시형태에서, 면역 효과기 세포는 CAR을 발현시키도록 유전자 변형된다. CAR을 발현시키는 T 세포는 본 명세서에서 CAR T 세포 또는 CAR 변형된 T 세포로서 지칭된다.
다양한 실시형태에서, 유전자 변형된 면역 효과기 세포는 액체 종양 및 혈액학적 악성종양을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 CD79A를 발현시키는 암 세포와 함께 대상체에게 투여된다. 일 실시형태에서, 항-CD79A CAR T 세포는 DLBCL을 갖는 대상체에게 투여된다.
재조합(즉, 조작된) DNA, 펩타이드 및 올리고뉴클레오타이드 합성, 면역분석, 조직 배양, 형질전환(예를 들어, 전기천공법, 리포펙션), 효소 반응, 정제 및 관련된 기법 및 절차를 위한 기법은 본 명세서 전체적으로 인용되고 논의되는 바와 같은 미생물학, 분자 생물학, 생화학, 분자 유전학, 세포 생물학, 바이러스학 및 면역학의 다양한 일반적이고 더 구체적인 참고문헌에 기재된 바와 같이 일반적으로 수행된다. 예를 들어, 문헌[Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.; Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley and Sons, updated July 2008); Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience; Glover, DNA Cloning: A Practical Approach, vol. I & II (IRL Press, Oxford Univ. Press USA, 1985); Current Protocols in Immunology (Edited by: John E. Coligan, Ada M. Kruisbeek, David H. Margulies, Ethan M. Shevach, Warren Strober 2001 John Wiley & Sons, NY, NY); Real-Time PCR: Current Technology and Applications, Edited by Julie Logan, Kirstin Edwards and Nick Saunders, 2009, Caister Academic Press, Norfolk, UK; Anand, Techniques for the Analysis of Complex Genomes, (Academic Press, New York, 1992); Guthrie and Fink, Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology (Academic Press, New York, 1991); Oligonucleotide Synthesis (N. Gait, Ed., 1984); Nucleic Acid The Hybridization (B. Hames & S. Higgins, Eds., 1985); Transcription and Translation (B. Hames & S. Higgins, Eds., 1984); Animal Cell Culture (R. Freshney, Ed., 1986); Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning (1984); Next-Generation Genome Sequencing (Janitz, 2008 Wiley-VCH); PCR Protocols (Methods in Molecular Biology) (Park, Ed., 3rd Edition, 2010 Humana Press); Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press, 1986); the treatise, Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.); Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (J. H. Miller and M. P. Calos eds., 1987, Cold Spring Harbor Laboratory); Harlow and Lane, Antibodies, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1998); Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Mayer and Walker, eds., Academic Press, London, 1987); Handbook Of Experimental Immunology, Volumes I-IV (D. M. Weir andCC Blackwell, eds., 1986); Roitt, Essential Immunology, 6th Edition, (Blackwell Scientific Publications, Oxford, 1988); Current Protocols in Immunology (Q. E. Coligan, A. M. Kruisbeek, D. H. Margulies, E. M. Shevach and W. Strober, eds., 1991); Annual Review of Immunology];뿐만 아니라 [Advances in Immunology]와 같은 학술지의 논문을 참조한다.
B.
정의
본 개시내용에서 더 상세하게 제시하기 전에, 본 명세서에서 사용될 특정 용어의 정의를 제공하는 것이 이의 이해에 도움을 줄 수 있다.
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 본 명세서에 기재된 것과 유사한 또는 동등한 임의의 방법 및 물질이 특정 실시형태의 실행 또는 시험에서 사용될 수 있지만, 조성물, 방법 및 물질의 바람직한 실시형태가 본 명세서에 기재된다. 본 개시내용의 목적을 위해, 다음의 용어를 이하에 정의한다. 추가적인 정의는 본 명세서 전체적으로 제시된다.
단수의 항목은 본 명세서에서 항목의 문법적 대상의 하나 이상(즉, 적어도 하나, 또는 하나 이상)을 지칭하기 위해 사용된다. 예로서, "요소"는 하나의 요소 또는 하나 이상의 요소를 의미한다.
대안의(예를 들어, "또는")의 사용은 대안 중 하나, 둘 다, 또는 이들의 임의의 조합을 의미하는 것으로 이해되어야 한다.
용어 "및/또는"은 대안 중 하나, 또는 둘 다를 의미하는 것으로 이해되어야 한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "약" 또는 "대략"은 기준 양, 수준, 값, 숫자, 빈도, 백분율, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이에 대해 15%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% 또는 1%만큼 변하는 기준 양, 수준, 값, 숫자, 빈도, 백분율, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이를 지칭한다. 일 실시형태에서, 용어 "약" 또는 "대략"은 기준 양, 수준, 값, 숫자, 빈도, 백분율, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이에 대해 ± 15%, ± 10%, ± 9%, ± 8%, ± 7%, ± 6%, ± 5%, ± 4%, ± 3%, ± 2% 또는 ± 1%의 기준 양, 수준, 값, 숫자, 빈도, 백분율, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이의 범위를 지칭한다.
일 실시형태에서, 범위, 예를 들어, 1 내지 5, 약 1 내지 5, 또는 약 1 내지 약 5는 범위에 포괄되는 각각의 수치 값을 지칭한다. 예를 들어, 하나의 비제한적이고 단지 예시적인 실시형태에서, 범위 "1 내지 5"는 1, 2, 3, 4, 5; 또는 1.0, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 또는 5.0; 또는 1.0, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2.0, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3.0, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9, 4.0, 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 또는 5.0이라는 표현과 동등하다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "실질적으로"는 기준 양, 수준, 값, 숫자, 빈도, 백분율, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이에 비해 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상인 양, 수준, 값, 숫자, 빈도, 백분율, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이를 지칭한다. 일 실시형태에서, "실질적으로 동일한"은 기준 양, 수준, 값, 숫자, 빈도, 백분율, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이와 거의 동일한 효과, 예를 들어, 생리적 효과를 생성하는 양, 수준, 값, 숫자, 빈도, 백분율, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이를 지칭한다.
본 명세서 전체적으로, 문맥에서 달리 요구되지 않는 한, 단어 "포함하다(comprise)", "포함하다(comprises)" 및 "포함하는(comprising)"은 단계들 또는 요소들의 언급된 단계 또는 요소 또는 그룹의 포함하지만, 임의의 다른 단계 또는 요소 또는 단계들의 제외는 아니라는 것을 나타내는 것으로 이해될 것이다. "이루어진"은 어구 "이루어진"에 따르는 것을 포함하지만, 이것으로 제한되지 않음을 의미한다. 따라서, 어구 "이루어진"은 열거된 요소가 필요하거나 또는 필수라는 것, 다른 요소가 존재하지 않을 수도 있다는 것을 나타낸다. "본질적으로 이루어진"은 어구 다음에 열거된 임의의 요소를 포함하며, 열거된 요소에 대해 본 개시내용에서 구체화된 활성 또는 작용을 방해하지 않거나 또는 기여하지 않는 다른 요소로 제한되지 않음을 의미한다. 따라서, 어구 "본질적으로 이루어진"은 열거된 요소가 필요하거나 또는 필수이지만, 열거된 요소의 활성 또는 작용에 실질적으로 영향을 미치는 다른 요소가 존재하지 않는다는 것을 나타낸다.
본 명세서 전체적으로 "일 실시형태", "실시형태", "특정 실시형태", "관련된 실시형태", "특정 실시형태", "추가적인 실시형태" 또는 "추가 실시형태" 또는 이들의 조합에 대한 언급은 실시형태와 관련하여 기재된 특정 특성, 구조 또는 특징이 적어도 일 실시형태에 포함된다는 것을 의미한다. 따라서, 본 명세서 전체적으로 다양한 곳에서 앞서 언급한 어구의 출현은 반드시 모두 동일한 실시형태에 관한 것은 아니다. 더 나아가, 특정 특성, 구조 또는 특징은 하나 이상의 실시형태에서 임의의 적합한 방식으로 조합될 수 있다. 또한 일 실시형태에서 특징의 긍정적 인용은 특정 실시형태에서의 특성을 제외하기 위한 기초로서 작용한다는 것이 이해된다.
C.
키메라 항원 수용체
다양한 실시형태에서, CD79A를 발현시키는 암 세포 쪽으로 면역 효과기 세포의 세포독성을 전향시키는 유전자 조작된 수용체가 제공된다. 이들 유전자 조작된 수용체는 본 명세서에서 키메라 항원 수용체(CAR)로서 지칭된다. CAR은 목적하는 항원(예를 들어, CD79A)에 대한 항체-기반 특이성을 T 세포 수용체-활성화 세포내 도메인과 조합하여 특이적 항-CD79A 세포 면역 활성을 나타내는 키메라 단백질을 생성하는 분자이다. 본 명세서에서 사용되는 용어, "키메라"는 상이한 단백질의 부분 또는 상이한 유래로부터의 DNA로 구성되는 것을 기재한다.
특정 실시형태에서, CAR은 CD79A에 결합하는 세포외 도메인(또한 결합 도메인 또는 항원-특이적 결합 도메인으로서 지칭됨), 막관통 도메인, 및 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 표적 세포 표면 상의 CD79A와 CAR의 항-CD79A 항원 결합 도메인의 맞물림은 CAR의 클러스터링을 초래하며, CAR-함유 세포에 활성화 자극을 전달한다. CAR의 주요 특징은 면역 효과기 세포 특이성을 전향함으로써, 증식, 사이토카인 생산, 식세포작용, 또는 주조직적합성(major histocompatibility: MHC) 독립적 방식으로 표적 항원 발현 세포의 세포사를 매개할 수 있는 분자의 생산을 촉발하고, 단클론성 항체, 가용성 리간드 또는 세포 특이적 공-수용체의 세포 특이적 표적화 능력을 이용하는 이들의 능력이다.
다양한 실시형태에서, CAR은 CD79A-특이적 결합 도메인을 포함하는 세포외 결합 도메인; 막관통 도메인; 및 하나 이상의 세포내 공자극 신호전달 도메인 및/또는 1차 신호전달 도메인을 포함한다.
특정 실시형태에서, CAR은 항-CD79A 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 세포외 결합 도메인; 하나 이상의 힌지 도메인 또는 스페이서 도메인; 막관통 도메인; 및 하나 이상의 세포내 공자극 신호전달 도메인 및/또는 1차 신호전달 도메인을 포함한다.
1.
결합 도메인
특정 실시형태에서, CAR은 표적 세포, 예를 들어, 암 세포 상에서 발현되는 인간 CD79A 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 항-CD79A 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 세포외 결합 도메인을 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 용어, "결합 도메인", "세포외 도메인", "세포외 결합 도메인," "항원-특이적 결합 도메인" 및 "세포외 항원 특이적 결합 도메인"은 상호 호환적으로 사용되고, 관심 대상의 표적 항원, 예를 들어, CD79A에 특이적으로 결합하는 능력을 갖는 CAR을 제공한다. 결합 도메인은 천연, 합성, 반합성 또는 재조합 공급원으로부터 유래될 수 있다.
용어 "특이적 결합 친화도" 또는 "특이적으로 결합하다" 또는 "특이적으로 결합된" 또는 "특이적 결합" 또는 "특이적으로 표적화하다"는 배경 결합보다 더 큰 결합 친화도로 CD79A에 대한 항-CD79A 항체 또는 이의 항원 결합 단편(또는 이를 포함하는 CAR)의 결합을 기재한다. 결합 도메인(또는 결합 도메인 또는 결합 도메인을 함유하는 융합 단백질을 포함하는 CAR)이, 예를 들어, 약 105 M-1 이상의 친화도 또는 Ka(즉, 1/M의 단위로 특정 결합 상호작용의 평형 결합 상수)로 CD79A에 결합하거나 또는 회합된다면, 이는 CD79A 폴리펩타이드에 "특이적으로 결합한다". 특정 실시형태에서, 결합 도메인(또는 이의 융합 단백질)은 약 106 M-1, 107 M-1, 108 M-1, 109 M-1, 1010 M-1, 1011 M-1, 1012 M-1 또는 1013 M-1 이상의 Ka로 표적 부위에 결합한다. "고친화도" 결합 도메인(또는 이의 단일쇄 융합 단백질)은 적어도 107 M-1, 적어도 108 M-1, 적어도 109 M-1, 적어도 1010 M-1, 적어도 1011 M-1, 적어도 1012 M-1, 적어도 1013 M-1 이상의 Ka를 갖는 해당 결합 도메인을 지칭한다.
대안적으로, 친화도는 M 단위(예를 들어, 10-5 M 내지 10-13 M 이하)를 갖는 특정 결합 상호작용의 평형 해리 상수(Kd)로서 정의될 수 있다. 본 개시내용에 따른 결합 도메인 폴리펩타이드 및 CAR의 친화도는 통상적인 기법을 이용하여, 예를 들어, 경쟁적 ELISA(효소-결합 면역흡착 분석)에 의해 또는 결합 회합, 또는 표지 리간드를 이용하는 변위 분석에 의해, 또는 표면-플라즈몬 공명 장치, 예컨대 뉴저지주 피츠카타웨이에 소재한 비아코어 인코포레이티드(Biacore, Inc.)로부터 입수 가능한 비아코어 T100(Biacore T100), 또는 광학 바이오센서 기법, 예컨대 코닝사(Corning) 및 퍼킨 엘머(Perkin Elmer)로부터 각각 입수 가능한 EPIC 시스템 또는 엔스파이어(EnSpire)를 이용하여 용이하게 결정될 수 있다(또한, 예를 들어, 문헌[Scatchard et al. (1949) Ann. N.Y. Acad. Sci. 51:660]; 및 미국 특허 제5,283,173호; 제5,468,614호 또는 동등물 참조).
일 실시형태에서, 특이적 결합의 친화도는 배경 결합보다 약 2배 초과, 배경 결합보다 약 5배 초과, 배경 결합보다 약 10배 초과, 배경 결합보다 약 20배 초과, 배경 결합보다 약 50배 초과, 배경 결합보다 약 100배 초과 또는 배경 결합보다 약 1000배 초과 또는 그 이상이다.
특정 실시형태에서, CAR의 세포외 결합 도메인은 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함한다. "항체"는 항원 결정소, 예컨대 면역 세포에 의해 인식되는 것을 함유하는 펩타이드, 지질, 다당류 또는 핵산과 같은 항원 에피토프를 특이적으로 인식하고 결합하는 적어도 경쇄 또는 중쇄 면역글로불린 가변 영역을 포함하는 폴리펩타이드인 결합제를 지칭한다. "단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편"은 이의 천연 환경 성분으로부터 동정되고 분리되고/되거나 회수된 것이다.
"항원(Ag)"은 동물에게 주사 또는 흡수되는 조성물(예컨대 암-특이적 단백질을 포함하는 것)을 비롯한, 동물에서의 항체 생성 또는 T 세포 반응을 자극할 수 있는 화합물, 조성물 또는 물질을 지칭한다. 항원은 이종성 항원, 예컨대 개시된 항원에 의해 유도되는 것을 포함하는, 특정 체액성 또는 세포성 면역의 산물과 반응한다. 특정 실시형태에서, 표적 항원은 CD79A 폴리펩타이드의 에피토프이다.
"에피토프" 또는 "항원 결정소"는 결합제가 결합하는 항원의 영역을 지칭한다. 에피토프는 인접한 아미노산 또는 단백질의 3차 폴딩에 의해 병치된 비인접 아미노산으로부터 형성될 수 있다. 인접한 아미노산으로부터 형성된 에피토프는 전형적으로 변성 용매에 대한 노출에서 유지되는 반면, 3차 폴딩에 의해 형성된 에피토프는 변성 용매에 의한 처리 시 전형적으로 상실된다. 에피토프는 독특한 공간적 입체구조에서 전형적으로 적어도 3, 및 더 보통으로는, 적어도 5, 약 9, 또는 약 8 내지 10개의 아미노산을 포함한다.
항체는 이의 항원 결합 단편, 예컨대 Camel Ig, Ig NAR, Fab 단편, Fab' 단편, F(ab')2 단편, 이중특이성 Fab 이량체(Fab2), 삼중특이성 Fab 삼량체(Fab3), Fv, 단일쇄 Fv 단백질("scFv"), 비스-scFv, (scFv)2, 미니바디, 다이어바디, 트라이어바디, 테트라바디, 이황화물 안정화된 Fv 단백질("dsFv"), 및 단일-도메인 항체(sdAb, 나노바디) 및 항원 결합을 초래하는 전장 항체의 부분을 포함한다. 상기 용어는 또한 유전자 조작된 형태, 예컨대 키메라 항체(예를 들어, 인간화된 뮤린 항체), 이형접합체 항체(예컨대, 이중특이성 항체) 및 이의 항원 결합 단편을 포함한다. 또한, 문헌[Pierce Catalog and Handbook, 1994-1995 (Pierce Chemical Co., Rockford, IL); Kuby, J., Immunology, 3rd Ed., W. H. Freeman & Co., New York, 1997] 참조.
당업자에 의해 이해되고 본 명세서의 다른 곳에 기재된 바와 같이, 완전한 항체는 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 포함한다. 각각의 중쇄는 가변 영역 및 제1, 제2 및 제3 불변 영역으로 이루어진 한편, 각각의 경쇄는 가변 영역 및 불변 영역으로 이루어진다. 포유류 중쇄는 α, δ, ε, γ 및 μ로서 분류된다. 포유류 경쇄는 μ 또는 λ로서 분류된다. α, δ, ε, γ, 및 μ 중쇄를 포함하는 면역글로불린은 면역글로불린(Ig)A, IgD, IgE, IgG 및 IgM으로서 분류된다. 완전한 항체는 "Y" 형상을 형성한다. Y의 줄기는 함께 결합된 2개의 중쇄의 제2 및 제3 불변 영역(IgE 및 IgM에 대해, 제4 불변 영역)으로 이루어지고, 이황화결합(쇄간)은 힌지에서 형성된다. 중쇄 γ, α 및 δ는 가요성을 더하기 위해 3개의 탠덤(한 줄) Ig 도메인 및 힌지 영역으로 구성된 불변 영역을 가지고; 중쇄 μ 및 ε은 4개의 면역글로불린 도메인으로 구성된 불변 영역을 가진다. 제2 및 제3 불변 영역은 각각 "CH2 도메인" 및 "CH3 도메인"으로서 지칭된다. Y의 각각의 아암은 단일 경쇄의 가변 및 불변 영역에 결합된 단일 중쇄의 가변 영역 및 제1 불변 영역을 포함한다. 경쇄 및 중쇄의 항원 결합을 초래한다.
경쇄 및 중쇄 가변 영역은 "상보성-결정 영역" 또는 "CDR"로도 불리는 3개의 초가변 영역으로 가로막히는 "프레임워크" 영역을 함유한다. CDR은 통상적인 방법, 예컨대 문헌[Kabat et al. (Wu, TT and Kabat, E. A., J Exp Med. 132(2):211-50, (1970); Borden, P. and Kabat E. A., PNAS, 84: 2440-2443(1987); (본 명세서에 참고로 편입된 문헌[Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Department of Health and Human Services, 1991] 참조)에 따른 서열에 의해, 또는 문헌[Chothia et al (Chothia, C. and Lesk, A.M., J Mol. Biol., 196(4): 901-917 (1987), Chothia, C. et al, Nature, 342: 877 - 883(1989))]에 따른 구조에 의해 정해지거나 또는 동정될 수 있다.
경쇄 CDR을 예측하기 위한 규칙의 예시적 예는 약 잔기 24에서 시작하고 Cys이 앞에 오며, 약 10 내지 17개의 잔기이고, Trp이 이어지는 CDR-L1(전형적으로 Trp-Tyr-Gln뿐만 아니라 Trp-Leu-Gln, Trp-Phe-Gln, Trp-Tyr-Leu); CDR-L1의 단부 다음의 약 16개의 잔기에서 시작하고, 일반적으로 Ile-Tyr뿐만 아니라 Val-Tyr, Ile-Lys, Ile-Phe이 앞에 오고, 7개의 잔기인 CDR-L2; 및 CDR-L2의 단부 다음의 약 33개의 잔기에서 시작하고, Cys이 앞에 오고, 7 내지 11개의 잔기이며, Phe-Gly-XXX-Gly(서열번호 76)(XXX는 임의의 아미노산임)이 이어지는 CDR-L3을 포함한다.
중쇄 CDR을 예측하기 위한 규칙의 예시적 예는 약 잔기 26에서 시작하고 Cys-XXX-XXX-XXX(서열번호 77)가 앞에 오며, 약 10 내지 12개의 잔기이고, Trp(전형적으로 Trp-Val뿐만 아니라 Trp-Ile, Trp-Ala)이 이어지는 CDR-H1; CDR-H1 단부 다음의 약 15개의 잔기에서 시작하고 Leu-Glu-Trp-Ile-Gly(서열번호 78)가 앞에 오며, 약 16 내지 19개의 잔기이고, Lys/Arg-Leu/Ile/Val/Phe/Thr/Ala-Thr/Ser/Ile/Ala이 이어지는 CDR-H2; 및 CDR-H2 단부 다음의 약 33개의 잔기에서 시작하고 Cys-XXX-XXX(전형적으로 Cys-Ala-Arg)가 앞에 오며, 약 3 내지 25개의 잔기이고, Trp-Gly-XXX-Gly(서열번호 79)이 이어지는 CDR-H3을 포함한다.
일 실시형태에서, 경쇄 CDR 및 중쇄 CDR은 카바트 방법에 따라 결정된다.
일 실시형태에서, 경쇄 CDR 및 중쇄 CDR2 및 CDR3은 카바트 방법에 따라 결정되고, 중쇄 CDR1은 카바트 및 코티아 방법 사이에 포함되는 AbM 방법에 따라 결정된다, 예를 들어, 문헌[Whitelegg N & Rees AR, Protein Eng. 2000 Dec;13(12):819-24 및 Methods Mol Biol. 2004;248:51-91] 참조. CDR을 예측하기 위한 프로그램은, 예를 들어, AbYsis (www.bioinf.org.uk/abysis/)로부터 공공연하게 입수 가능하다.
상이한 경쇄 또는 중쇄의 프레임워크 영역 서열은 인간과 같은 종 내에서 상대적으로 보존된다. 구성성분 경쇄 및 중쇄의 조합된 프레임워크 영역인 항체의 프레임워크 영역은 3차원 공간에서 CDR의 자리를 잡고 정렬하는 역할을 한다. CDR은 주로 항원의 에피토프에 대한 결합을 초래한다. 각각의 쇄의 CDR은 전형적으로 N-말단으로부터 시작해서 순차적으로 넘버링된 CDR1, CDR2 및 CDR3으로서 지칭되고, 또한 전형적으로 특정 CDR이 위치된 쇄에 의해 동정된다. 따라서, 항체 중쇄의 가변 도메인에 위치된 CDR은 CDRH1, CDRH2 및 CDRH3으로서 지칭되는 반면, 항체의 경쇄의 가변 도메인에 위치된 CDR은 CDRL1, CDRL2 및 CDRL3으로서 지칭된다. 상이한 특이성을 갖는 항체(즉, 상이한 항원에 대한 상이한 조합 부위)는 상이한 CDR을 가진다. 이는 항체에 따라 다른 CDR이지만, CDR 내에서 제한된 수의 아미노산 위치만이 항원 결합에 직접적으로 연루된다. CDR 내의 이들 위치는 특이성 결정 잔기(specificity determining residue: SDR)로 불린다. 특정 실시형태에 상정된 항-CD79A CAR을 작제하는 데 적합한 경쇄 CDR의 예시적 예는 서열번호 1 내지 3, 9 내지 11, 및 17 내지 19에 제시된 CDR 서열을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 특정 실시형태에 상정된 항-CD79A CAR을 작제하기 위한 적합한 중쇄 CDR의 예시적인 예는 서열번호 4 내지 6, 12 내지 14, 및 20 내지 22에 제시된 CDR 서열을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
"VL" 또는 "VL"에 대한 언급은 본 명세서에 상정된 바와 같은 항체, Fv, scFv, dsFv, Fab, 또는 다른 항체 단편의 가변 영역을 포함하는, 면역글로불린 경쇄의 가변 영역을 지칭한다. 특정 실시형태에 상정된 항-CD79A CAR을 작제하는 데 적합한 경쇄 가변 영역의 예시적인 예는 서열번호 7, 15 및 23에 제시된 경쇄 가변 영역 서열을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
"VH" 또는 "VH"에 대한 언급은 본 명세서에 상정된 바와 같은 항체, Fv, scFv, dsFv, Fab, 또는 다른 항체 단편의 가변 영역을 포함하는, 면역글로불린 중쇄의 가변 영역을 지칭한다. 특정 실시형태에 상정된 항-CD79A CAR을 작제하는 데 적합한 중쇄 가변 영역의 예시적 예는 서열번호 8, 16 및 24에 제시된 중쇄 가변 영역 서열을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
"단클론성 항체"는 B 림프구의 단일 클론에 의해 또는 단일 항체의 경쇄 및 중쇄 유전자가 형질감염된 세포에 의해 생성된 항체이다. 단클론성 항체는 당업자에게 공지된 방법에 의해, 예를 들어, 면역 비장 세포와 골수종 세포의 융합으로부터의 혼성 항체-형성 세포를 생성함으로써 생성된다. 단클론성 항체는 인간화된 단클론성 항체를 포함한다.
"키메라 항체"는 인간과 같은 하나의 종으로부터의 프레임워크 잔기 및 마우스와 같은 다른 종으로부터의 CDR(일반적으로 항원 결합을 부여함)을 가진다. 특히 바람직한 실시형태에서, CAR은 키메라 항체 또는 이의 항원 결합 단편인 항원-특이적 결합 도메인을 포함한다.
바람직한 실시형태에서, 항체는 인간 CD79A 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 인간 항체(예컨대 인간 단클론성 항체) 또는 이의 단편이다. 인간 항체는 인간-유래된 파지 디스플레이 라이브러리로부터 선택된 Fv 클론 가변 도메인 서열(들)을 상기 기재한 바와 같은 공지된 인간 불변 도메인 서열(들)과 조합함으로써 작제될 수 있다. 대안적으로, 인간 단클론성 항체는 혼성세포 방법에 의해 만들어질 수 있다. 인간 단클론성 항체의 생성을 위한 인간 골수종 및 마우스-인간 이형골수종 세포주는, 예를 들어, 문헌[Kozbor J. Immunol., 133: 3001(1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63(Marcel Dekker, Inc., New York, 1987); 및 Boerner et al., J. Immunol., 147: 86 (1991)]에 의해 기재되었다. 추가로, 유전자이식 동물(예를 들어, 마우스)는 내인성 면역글로불린 생성의 부재 하에 인간 항체의 완전한 레퍼토리를 생성하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Jakobovits et al., PNAS USA, 90: 2551(1993); Jakobovits et al., Nature, 362: 255 (1993); Bruggermann et al., Year in Immunol., 7: 33(1993)] 참조. 유전자 셔플링은 또한 비인간으로부터의 인간 항체, 예를 들어, 설치류 항체를 유도하는 데 사용될 수 있으며, 인간 항체는 시작 비-인간 항체와 유사한 친화도 및 특이성을 가진다. 1993년 4월 1일자에 공개된 국제 특허 출원 WO 93/06213 참조. CDR 접합에 의한 비-인간 항체의 전통적 인간화와 달리, 이 기법은 비인간 유래의 FR 또는 CDR 잔기가 없는 완전한 인간 항체를 제공한다.
일 실시형태에서, CAR은 "인간화된" 항체를 포함한다. 인간화된 항체는 인간 프레임워크 영역 및 비-인간(예를 들어, 마우스, 래트 또는 합성) 면역글로불린으로부터의 하나 이상의 CDR을 포함하는 면역글로불린이다. CDR을 제공하는 비-인간 면역글로불린은 "공여자"로 칭해지며, 프레임워크를 제공하는 인간 면역글로불린은 "억셉터"로 칭해진다. 일 실시형태에서, 모든 CDR은 인간화된 면역글로불린에서의 공여자 면역글로불린으로부터 유래된다. 불변 영역이 존재할 필요는 없지만, 그들이 있다면, 그들은 인간 면역글로불린 불변 영역과 실질적으로 동일, 즉, 적어도 약 85 내지 90%, 예컨대 약 95% 이상 동일하여야 한다. 따라서, 인간화된 면역글로불린의 모든 부분(가능하다면 CDR을 제외)은 천연 인간 면역글로불린 서열의 대응하는 부분에 실질적으로 동일하다. 인간화된 또는 다른 단클론성 항체는 항원 결합 또는 다른 면역글로불린 기능에 실질적으로 효과를 갖지 않는 추가적인 보존적 아미노산 치환을 가질 수 있다. 인간화된 항체는 유전자 조작에 의해 작제될 수 있다(예를 들어, 미국 특허 제5,585,089호 참조).
특정 실시형태에서, 항-CD79A 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 낙타 Ig(낙타과 항체(VHH)), Ig NAR, Fab 단편, Fab' 단편, F(ab')2 단편, 이중특이성 Fab 이량체(Fab2), 삼중특이성 Fab 삼량체(Fab3), Fv, 단일쇄 Fv 항체("scFv"), 비스-scFv, (scFv)2, 미니바디, 다이어바디, 트라이어바디, 테트라바디, 이황화물 안정화된 Fv 단백질("dsFv") 및 단일-도메인 항체(sdAb, 나노바디)를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 "낙타 Ig" 또는 "낙타과 VHH"는 중쇄 항체의 가장 작은 공지된 항원-결합 단위를 지칭한다(Koch-Nolte, et al, FASEB J., 21: 3490-3498(2007)). "중쇄 항체" 또는 "낙타과 항체"는 2개의 VH 도메인을 함유하고 경쇄가 없는 항체를 지칭한다(Riechmann L. et al, J. Immunol. Methods 231:25-38(1999); WO94/04678; WO94/25591; 미국 특허 제6,005,079호).
"면역글로불린 신(new) 항원 수용체"의 "IgNAR"은 하나의 가변적 신 항원 수용체(VNAR) 도메인 및 5개의 불변 신 항원 수용체(CNAR) 도메인의 동종이량체로 이루어진 상어 면역 레퍼토리로부터의 항체 부류를 지칭한다. IgNAR는 일부 가장 작은 것으로 알려진 면역글로불린-기반 단백질 스캐폴드를 나타내고, 고도로 안정하고, 효율적인 결합 특징을 가진다. 고유안정성은 (i) 뮤린 항체에서 발견된 통상적인 항체 VH 및 VL 도메인에 비해 상당한 수의 하전된 그리고 친수성 표면 노출 잔기를 제공하는 근본적인 Ig 스캐폴드; 및 (ii) 루프간 이황화 브리지, 및 루프내 수소 결합의 패턴을 포함하는 상보성 결정 영역(CDR) 루프에서 안정화시키는 구조적 특징 둘 다에 기여할 수 있다.
항체의 파파인 분해는 "Fab" 단편으로 불리는 2개의 동일한 항원-결합 단편을 생성하며, 각각 단일 항원-결합 부위 및 잔여 "Fc" 단편을 가지며, 이의 명칭은 용이하게 결정화하는 그의 능력을 반영한다. 펩신 처리는 2개의 항원-조합 부위를 가지며 항원과 교차-연결할 수 있는 F(ab')2 단편을 얻는다.
"Fv"는 완전한 항원-결합 부위를 함유하는 최소 항체 단편이다. 일 실시형태에서, 2-쇄 Fv 종은 단단하게, 비공유 회합된 1개의 중쇄 및 1개의 경쇄 가변 도메인의 이량체로 이루어진다. 단일쇄 Fv(scFv) 종에서, 경쇄 및 중쇄가 2개의 쇄 Fv 종에서와 유사한 "이량체" 구조로 회합될 수 있도록, 1개의 중쇄 및 1개의 경쇄 가변 도메인은 가요성 펩타이드에 의해 공유 결합될 수 있다. 이는 이런 입체배치에서 각각의 가변 도메인의 3개의 초가변 영역(HVR)은 VH-VL 이량체의 표면 상의 항원-결합 부위를 정하도록 상호작용하는 것이다. 종합적으로, 6개의 HVR은 항체에 대한 항원-결합 특이성을 부여한다. 그러나, 전체 결합 부위보다 더 낮은 친화도에서라도, 단일 가변 도메인(또는 항원에 특이적인 단지 3개의 HVR을 포함하는 Fv의 절반)조차 항원을 인식하고 결합하는 능력을 가진다.
Fab 단편은 중쇄 및 경쇄 가변 도메인을 함유하고, 또한 경쇄의 불변 도메인 및 중쇄의 제1 불변 도메인(CH1)을 함유한다. Fab' 단편은 항체 힌지 영역으로부터의 하나 이상의 시스테인을 포함하는 중쇄 CH1 도메인의 카복시 말단에서 소수의 잔기의 첨가에 의해 Fab 단편과 상이하다. Fab'-SH는 불변 도메인의 시스테인 잔기(들)가 유리 티올기를 보유하는 Fab'에 대한 본 명세서의 표기이다. F(ab')2 항체 단편은 본래 Fab' 단편의 쌍으로서 그들 사이의 시스테인을 생성하였다. 항체 단편의 다른 화학적 결합이 또한 공지되어 있다. 이중특이성 Fab 이량체(Fab2)는 2개의 Fab' 단편을 가지며, 각각은 상이한 항원에 결합한다. 삼중특이성 Fab 삼량체(Fab3)는 3개의 Fab' 단편을 가지며, 각각은 상이한 항원에 결합한다.
용어 "다이어바디"는 2개의 항원-결합 부위를 갖는 항체 단편을 지칭하며, 이 단편들은 동일한 폴리펩타이드쇄에서 경쇄 가변 도메인(VL)에 연결된 중쇄 가변 도메인(VH)을 포함한다(VH-VL). 동일한 쇄 상에서 2개의 도메인 사이의 짝짓기를 허용하기에는 너무 짧은 링커를 이용함으로써, 도메인은 다른 쇄의 상보성 도메인과 짝짓도록 그리고 2개의 항원-결합 부위를 생성하도록 강요된다. 다이어바디는 2가 또는 이중특이성일 수 있다. 다이어바디는, 예를 들어, 유럽 특허 제404,097호; WO 1993/01161; 문헌[Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003); 및 Hollinger et al., PNAS USA 90: 6444-6448(1993)]에서 더 완전하게 기재된다. 트라이어바디 및 테트라바디는 또한 문헌[Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003)]에 기재되어 있다.
"단일 도메인 항체" 또는 "sdAb" 또는 "나노바디"는 항체 중쇄의 가변 영역(VH 도메인) 또는 항체 경쇄의 가변 영역(VL 도메인)으로 이루어진 항체 단편을 지칭한다(Holt, L., et al, Trends in Biotechnology, 21(11): 484-490).
"단일쇄 Fv" 또는 "scFv" 항체 단편은 항체의 VH 및 VL 도메인을 포함하되, 이들 도메인은 단일 폴리펩타이드 쇄로 그리고 배향 중 하나로(예를 들어, VL-VH 또는 VH-VL) 존재한다. 일반적으로, scFv 폴리펩타이드는 scFv가 항원 결합을 위해 요망되는 구조를 형성하는 것을 가능하게 하는 VH와 VL 도메인 사이의 폴리펩타이드 링커를 추가로 포함한다. scFv의 검토를 위해, 예를 들어, 문헌[ , The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., (Springer-Verlag, New York, 1994), pp. 269-315] 참조.
바람직한 실시형태에서, 항-CD79A 항원 결합 단편은 scFv이다. 특정 실시형태에서, scFv는 뮤린, 인간 또는 인간화된 scFv이다. 단일쇄 항체는 목적으로 하는 표적에 특이적인 혼성세포의 V 영역 유전자로부터 클로닝될 수 있다. 이러한 혼성세포의 생성은 일상적이 되었다. 가변 영역 중쇄(VH) 및 가변 영역 경쇄(VL)를 클로닝하기 위해 사용될 수 있는 기법은, 예를 들어, 문헌[Orlandi et al., PNAS, 1989; 86: 3833-3837]에 기재되었다.
다양한 실시형태에서, 항-CD79A 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 1 내지 3, 9 내지 11, 또는 17 내지 19에 제시된 CDRL1-CDRL3 서열을 포함하는 가변 경쇄 서열 및/또는 서열번호 4 내지 6, 12 내지 14에 제시된 CDRH1-CDRH3 서열을 포함하는 가변 중쇄 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항-CD79A 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 7, 15 또는 23 중 어느 하나에 제시된 바와 같은 가변 경쇄 서열 및/또는 서열번호 8, 16 또는 24 중 어느 하나에 제시된 바와 같은 가변 중쇄 서열을 포함한다.
특정 실시형태에서, 항원-특이적 결합 도메인은 인간 CD79A 폴리펩타이드에 결합하는 scFv이다.
예시적인 CD79A-특이적 결합 도메인은 적어도 하나의 인간 프레임워크 영역을 포함하는 CD79A에 특이적인 면역글로불린 가변 영역이다. "인간 프레임워크 영역"은 인간 면역글로불린 가변 영역의 야생형(즉, 천연 유래) 프레임워크 영역을 지칭하며, 영역 내 아미노산의 약 50% 미만(예를 들어, 바람직하게는 약 45%, 40%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5% 또는 1% 미만)으로 인간 면역글로불린 가변 영역의 변경된 프레임워크 영역은 결실되거나 (예를 들어, 대응하는 위치에서 비인간 면역글로불린 프레임워크 영역의 하나 이상의 아미노산 잔기로) 치환되고, 또는 영역 내 아미노산의 약 50% 미만(예를 들어, 45%, 40%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10% 또는 5% 미만)으로 비인간 면역글로불린 가변 영역의 변경된 프레임워크 영역은 결실되거나 (예를 들어, 노출된 잔기 위치에서 그리고/또는 대응하는 위치에서 인간 면역글로불린 프레임워크 영역의 하나 이상의 아미노산 잔기로) 치환되고, 따라서 일 양상에서, 면역원성이 감소된다.
특정 실시형태에서, 인간 프레임워크 영역은 인간 면역글로불린 가변 영역의 야생형 프레임워크 영역이다. 특정 다른 실시형태에서, 인간 프레임워크 영역은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 위치에서 아미노산 결실 또는 치환을 갖는 인간 면역글로불린 가변 영역의 변성된 프레임워크 영역이다. 다른 실시형태에서, 인간 프레임워크 영역은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 위치에서 아미노산 결실 또는 치환을 갖는 비-인간 면역글로불린 가변 영역의 변성된 프레임워크 영역이다.
특정 실시형태에서, CD79A-특이적 결합 도메인은 인간 경쇄 FR1, 인간 중쇄 FR1, 인간 경쇄 FR2, 인간 중쇄 FR2, 인간 경쇄 FR3, 인간 중쇄 FR3, 인간 경쇄 FR4, 및 인간 중쇄 FR4로부터 선택된 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8개의 인간 프레임워크 영역(FR)을 포함한다.
CD79A-특이적 결합 도메인에 존재할 수 있는 인간 FR은 또한 예시적인 FR의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 아미노산이 치환되거나 결실된 본 명세서에 제공된 예시적인 FR의 변이체를 포함한다.
특정 실시형태에서, CD79A-특이적 결합 도메인은 (a) 인간 경쇄 FR1, 인간 경쇄 FR2, 인간 경쇄 FR3, 및 인간 경쇄 FR4를 포함하는 인간화된 경쇄 가변 영역, 및 (b) 인간 중쇄 FR1, 인간 중쇄 FR2, 인간 중쇄 FR3 및 인간 중쇄 FR4를 포함하는 인간화된 중쇄 가변 영역을 포함한다.
본 명세서에서 제공된 CD79A-특이적 결합 도메인은 또한 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 CDR을 포함한다. 이러한 CDR은 경쇄의 CDRL1, CDRL2 및 CDRL3 및 중쇄의 CDRH1, CDRH2 및 CDRH3으로부터 선택된 비인간 CDR 또는 변경된 비인간 CDR일 수 있다. 특정 실시형태에서, CD79A-특이적 결합 도메인은 (a) 경쇄 CDRL1, 경쇄 CDRL2, 및 경쇄 CDRL3을 포함하는 경쇄 가변 영역, 및 (b) 중쇄 CDRH1, 중쇄 CDRH2 및 중쇄 CDRH3을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.
일부 실시형태에서, 항-CD79A 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 1 내지 3, 9 내지 11, 또는 17 내지 19에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 아미노산 동일성을 갖는 CDRL1-CDRL3 서열을 포함하는 가변 경쇄 서열 및/또는 서열번호 4 내지 6, 12 내지 14 또는 20 내지 22에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 아미노산 동일성을 갖는 CDRH1-CDRH3 서열을 포함하는 가변 중쇄 서열을 포함한다.
일 실시형태에서, CD79A-특이적 결합 도메인은 서열번호 1 내지 3, 9 내지 11, 또는 17 내지 19에 제시된 경쇄 CDR 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, CD79A-특이적 결합 도메인은 서열번호 1 내지 3, 9 내지 11, 또는 17 내지 19에 제시된 경쇄 CDR 서열에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 아미노산 동일성을 갖는 경쇄 CDR을 포함한다.
일 실시형태에서, CD79A-특이적 결합 도메인은 서열번호 4 내지 6, 12 내지 14 또는 20 내지 22에 제시된 중쇄 CDR 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, CD79A-특이적 결합 도메인은 서열번호 4 내지 6, 12 내지 14 또는 20 내지 22에 제시된 중쇄 CDR 서열에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 아미노산 동일성을 갖는 중쇄 CDR 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 항-이디오타입(anti-idiotype) 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 7, 15 또는 23 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 아미노산 동일성을 갖는 가변 경쇄 서열 및/또는 서열번호 8, 16 또는 24 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 아미노산 동일성을 갖는 가변 중쇄 서열을 포함한다.
2.
링커
특정 실시형태에서, 항-CD79A CAR은, 예를 들어, 분자의 적절한 간격 및 입체구조를 위해 부가된, 다양한 도메인 사이의 링커 잔기를 포함한다. 특정 실시형태에서, 링커는 가변 영역 연결 서열이다. "가변 영역 연결 서열"은 VH와 VL 도메인을 연결하고, 2개의 하위-결합 도메인의 상호작용에 적합한 스페이서 기능을 제공하여, 따라서 얻어진 폴리펩타이드가 동일한 경쇄 및 중쇄 가변 영역을 포함하는 항체와 동일한 표적 분자에 대해 특이적 결합 친화도를 보유하는, 아미노산 서열이다. 특정 실시형태에서, CAR은 1, 2, 3, 4 또는 5개 이상의 링커를 포함한다. 특정 실시형태에서, 링커의 길이는 약 1 내지 약 25개의 아미노산, 약 5 내지 약 20개의 아미노산, 또는 약 10 내지 약 20개의 아미노산 또는 아미노산의 임의의 개재 길이이다. 일부 실시형태에서, 링커는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25개 이상의 아미노산 길이이다.
링커의 예시적 예는 글리신 중합체(G)n; 글리신-세린 중합체(G1-5S1-5)n, 여기서 n은 적어도 1, 2, 3, 4, 또는 5임; 글리신-알라닌 중합체; 알라닌-세린 중합체; 및 당업계에 공지된 다른 가요성 링커를 포함한다. 글리신 및 글리신-세린 중합체는 상대적으로 비구조화되어 있으며, 따라서, 본 명세서에 기재된 CAR과 같은 융합 단백질의 도메인 사이의 중성 테더(neutral tether)로서 작용할 수 있다. 글리신은 심지어 알라닌보다도 유의하게 더 파이-프사이(phi-psi) 공간에 접근하고, 보다 긴 측쇄를 갖는 잔기보다 훨씬 덜 제한되어 있다(문헌[Scheraga, Rev. Computational Chem. 11173-142 (1992)] 참조). 당업자는 특정 실시형태에서 CAR의 설계가 링커가 가요성 링커뿐만 아니라 목적하는 CAR 구조를 제공하는 덜 가요성인 구조를 부여하는 하나 이상의 부분을 포함할 수 있도록, 모든 또는 부분적으로 가요성인 링커를 포함할 수 있다는 것을 인식할 것이다.
다른 예시적인 링커는 다음의 아미노산 서열을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다: DGGGS (서열번호 39); TGEKP(서열번호 40)(예를 들어, 문헌[Liu et al., PNAS 5525-5530 (1997)] 참조); GGRR(서열번호 41)(Pomerantz et al. 1995, 상기 참조); (GGGGS)n, 여기서 = 1, 2, 3, 4 또는 5임(서열번호 42)(Kim et al., PNAS 93, 1156-1160 (1996.); EGKSSGSGSESKVD(서열번호 43)(Chaudhary et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87:1066-1070); KESGSVSSEQLAQFRSLD(서열번호 44) (Bird et al., 1988, Science 242:423-426), GGRRGGGS(서열번호 45); LRQRDGERP (서열번호 46); LRQKDGGGSERP(서열번호 47); LRQKD(GGGS)2 ERP(서열번호 48). 대안적으로, 가요성 링커는 DNA-결합 부위와 펩타이드 그 자체를 둘 다 모델링할 수 있는 컴퓨터 프로그램을 이용하여(Desjarlais & Berg, PNAS 90:2256-2260 (1993), PNAS 91:11099-11103(1994) 또는 파지 디스플레이 방법에 의해 합리적으로 설계될 수 있다. 일 실시형태에서, 링커는 다음의 아미노산 서열을 포함한다: GSTSGSGKPGSGEGSTKG(서열번호 49)(Cooper et al., Blood, 101(4): 1637-1644 (2003)).
3.
스페이서 도메인
특정 실시형태에서, 항-CD79A CAR의 결합 도메인 다음에 하나 이상의 "스페이서 도메인"이 이어지며, 이는 적절한 세포/세포 접촉, 항원 결합 및 활성화를 가능하게 하기 위해 효과기 세포 표면으로부터 항원 결합 도메인이 떨어지게 이동시키는 영역을 지칭한다(Patel et al., Gene Therapy, 1999; 6: 412-419). 힌지 도메인은 천연, 합성, 반합성 또는 재조합 공급원으로부터 유래될 수 있다. 소정의 실시형태에서, 스페이서 도메인은 하나 이상의 중쇄 불변 영역, 예를 들어, CH2 및 CH3을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는, 면역글로불린의 일부이다. 스페이서 도메인은 천연 유래 면역글로불린 힌지 영역 또는 변경된 면역글로불린 힌지 영역의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
일 실시형태에서, 스페이서 도메인은 IgG1, IgG4 또는 IgD의 CH2 및 CH3을 포함한다.
4.
힌지 도메인
항-CD79A CAR의 결합 도메인은 일반적으로 다음에 하나 이상의 "힌지 도메인"이 이어지는데, 이는 적절한 세포/세포 접촉, 항원 결합 및 활성화를 가능하게 하기 위해 효과기 세포 표면으로부터 항원 결합 도메인이 떨어져서 자리잡는 데 어떤 역할을 한다. 항-CD79A CAR은 일반적으로 결합 도메인과 막관통 도메인(TM) 사이에 하나 이상의 힌지 도메인을 포함한다. 힌지 도메인은 천연, 합성, 반합성 또는 재조합 공급원으로부터 유래될 수 있다. 힌지 도메인은 천연 유래 면역글로불린 힌지 영역 또는 변경된 면역글로불린 힌지 영역의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
"변경된 힌지 영역"은 (a) 30% 까지의 아미노산 변화(예를 들어, 25%, 20%, 15%, 10% 또는 5%까지의 아미노산 치환 또는 결실)를 갖는 천연 유래 힌지 영역, (b) 30%까지의 아미노산 변화(예를 들어, 25%, 20%, 15%, 10% 또는 5%까지의 아미노산 치환 또는 결실)를 갖는 길이가 적어도 10개의 아미노산(예를 들어, 적어도 12, 13, 14 또는 15개의 아미노산)인 천연 유래 힌지 영역의 일부, 또는 (c) (길이가 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15, 또는 적어도 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15개의 아미노산일 수 있는) 코어 힌지 영역을 포함하는 천연 유래 힌지 영역의 일부를 지칭한다. 소정의 실시형태에서, 천연 유래 면역글로불린 힌지 영역에서 하나 이상의 시스테인 잔기는 하나 이상의 다른 아미노산 잔기(예를 들어, 하나 이상의 세린 잔기)로 치환될 수 있다. 변경된 면역글로불린 힌지 영역은 대안적으로 또는 추가적으로 다른 아미노산 잔기(예를 들어, 세린 잔기)에 의해 치환된 야생형 면역글로불린 힌지 영역의 프롤린 잔기를 가질 수 있다.
본 명세서에 기재된 CAR에서 사용하기에 적합한 예시적인 힌지 도메인은 이들 분자로부터의 야생형 힌지 영역일 수 있거나 또는 변경될 수 있는 1형 막 단백질, 예컨대 CD8α, 및 CD4의 세포외 영역으로부터 유래된 힌지 영역을 포함한다. 일 실시형태에서, 힌지는 PD-1 힌지 또는 CD152 힌지이다. 다른 실시형태에서, 힌지 도메인은 CD8α 힌지 영역을 포함한다.
5.
막관통(TM) 도메인
"막관통 도메인"은 세포외 결합 부분에 융합하는 항-CD79A CAR의 부분 및 면역 효과기 세포의 혈장막에 CAR을 고정시키는 세포내 신호전달 도메인이다. TM 도메인은 천연, 합성, 반합성 또는 재조합 공급원으로부터 유래될 수 있다. TM 도메인은 T-세포 수용체의 알파 또는 베타쇄, CDδ, CD3ε, CDγ, CD3ζ, CD4, CD5, CD8α, CD9, CD 16, CD22, CD27, CD28, CD33, CD37, CD45, CD64, CD80, CD86, CD 134, CD137, CD152, CD154 및 PD1로부터 유래될 수 있다(즉, 적어도 막관통 영역(들)을 포함한다). 특정 실시형태에서, TM 도메인은 합성이고, 소수성 잔기, 예컨대 류신 및 발린을 우세하게 포함한다.
일 실시형태에서, CAR은 PD1, CD152, CD28 또는 CD8α로부터 유래된 TM 도메인을 포함한다. 다른 실시형태에서, CAR은 PD1, CD152, CD28 또는 CD8α로부터 유래된 TM 도메인 및 CAR의 TM 도메인과 세포내 신호전달 도메인을 연결하는, 바람직하게는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 아미노산 길이의 짧은 올리고- 또는 폴리펩타이드 링커를 포함한다. 글리신-세린계 링커는 특히 적합한 링커를 제공한다.
6.
세포내 신호전달 도메인
특정 실시형태에서, 항-CD79A CAR은 하나 이상의 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. "세포내 신호전달 도메인"은 CAR-결합 표적 세포에 대한 세포독성 인자의 방출, 또는 세포외 CAR 도메인에 대한 항원 결합에 의해 유발된 다른 세포 반응을 포함하는 효과기 세포 기능, 예를 들어, 활성화, 사이토카인 생산, 증식 및 세포독성 활성을 유발하기 위해 면역 효과기 세포의 내부로 인간 CD79A 폴리펩타이드에 대한 효과적인 항-CD79A CAR 결합의 전령을 형질도입하는 데 참여하는 CAR의 부분을 지칭한다.
용어 "효과기 기능"은 면역 효과기 세포의 전문화된 기능을 지칭한다. T 세포의 효과기 기능은, 예를 들어, 세포용해 활성일 수 있거나 또는 사이토카인의 분비를 포함하는 활성을 돕는다. 따라서, 용어 "세포내 신호전달 도메인"은 효과기 작용 신호를 전달하고 전문화된 기능을 수행하기 위해 세포를 보내는 단백질의 일부를 지칭한다. 보통 전체 세포내 신호전달 도메인이 사용될 수 있지만, 다수의 경우에, 전체 도메인을 사용하는 것을 필수적이지 않다. 세포내 신호전달 도메인의 절단된 일부가 사용되는 정도로, 이러한 절단된 부분은 효과기 기능 신호를 전달하는 한, 전체 도메인 대신에 사용될 수 있다. 용어 세포내 신호전달 도메인은 효과기 기능 신호를 전달하는 데 충분한 세포내 신호전달 도메인의 임의의 절단된 부분을 포함하는 것을 의미한다.
TCR 단독을 통해 생성된 신호는 T 세포의 완전한 활성화에 불충분하며, 2차 또는 공자극 신호가 또한 필요하다는 것이 알려져 있다. 따라서, T 세포 활성화는 세포내 신호전달 도메인의 2개의 별개의 부류(TCR(예를 들어, TCR/CD3 복합체)를 통해 항원-의존적 1차 활성화를 개시하는 1차 신호전달 도메인 및 2차 또는 공자극 신호를 제공하는 항원-독립적 방식으로 작용하는 공자극 신호전달 도메인)에 의해 매개되는 것으로 언급될 수 있다. 바람직한 실시형태에서, CAR은 하나 이상의 "공자극 신호전달 도메인" 및 "1차 신호전달 도메인"을 포함하는 세포내 신호전달 도메인을 포함한다.
1차 신호전달 도메인은 자극 방법으로 또는 저해 방법으로 TCR 복합체의 1차 활성화를 조절한다. 자극 방식으로 작용하는 1차 신호전달 도메인은 면역수용체 타이로신계 활성화 모티프 또는 ITAM으로서 알려진 신호전달 모티프를 함유할 수 있다.
특정 실시형태에서 유용한 1차 신호전달 도메인을 함유하는 ITAM의 예시적 예는 FcRγ, FcRβ, CD3γ, CD3δ, CD3ε, CD3ζ, CD22, CD79a, CD79b 및 CD66d로부터 유래되는 것을 포함한다. 특정 바람직한 실시형태에서, 항-CD79A CAR은 CD3ζ 1차 신호전달 도메인 및 하나 이상의 공자극 신호전달 도메인을 포함한다. 세포내 1차 신호전달 및 공자극 신호전달 도메인은 막관통 도메인의 카복실 말단과 동시에 임의의 순서로 연결될 수 있다.
특정 실시형태에서, CAR은 T 세포 발현 CAR 수용체의 효능 및 확장을 향상시키기 위해 하나 이상의 공자극 신호전달 도메인을 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 용어, "공자극 신호전달 도메인" 또는 "공자극 도메인"은 공자극 분자의 세포내 신호전달 도메인을 지칭한다. 공자극 분자는 항원에 대한 결합 시 T 림프구의 효율적인 활성화 및 기능에 필요한 2차 신호를 제공하는 항원 수용체 또는 Fc 수용체 이외의 세포 표면 분자이다. 이러한 공자극 분자의 예시적인 예는 TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9, TLR10, CARD11, CD2, CD7, CD27, CD28, CD30, CD40, CD54(ICAM), CD83, CD134 (OX40), CD137(4-1BB), CD278(ICOS), DAP10, LAT, NKD2C, SLP76, TRIM 및 ZAP70을 포함한다. 일 실시형태에서, CAR은 CD28, CD137, 및 CD134, 및 CD3ζ 1차 신호전달 도메인으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 공자극 신호전달 도메인을 포함한다.
다른 실시형태에서, CAR은 CD28 및 CD137 공자극 신호전달 도메인 및 CD3ζ 1차 신호전달 도메인을 포함한다.
또 다른 실시형태에서, CAR은 CD28 및 CD134 공자극 신호전달 도메인 및 CD3ζ 1차 신호전달 도메인을 포함한다.
일 실시형태에서, CAR은 CD137 및 CD134 공자극 신호전달 도메인 및 CD3ζ 1차 신호전달 도메인을 포함한다.
일 실시형태에서, CAR은 CD137 공자극 신호전달 도메인 및 CD3ζ 1차 신호전달 도메인을 포함한다.
일 실시형태에서, CAR은 CD134 공자극 신호전달 도메인 및 CD3ζ 1차 신호전달 도메인을 포함한다.
일 실시형태에서, CAR은 CD28 공자극 신호전달 도메인 및 CD3ζ 1차 신호전달 도메인을 포함한다.
특정 실시형태에서, CAR은 암 세포 상에서 발현된 CD79A 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 항-CD79A 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함한다.
일 실시형태에서, CAR은 CD79A 폴리펩타이드에 결합하는 항-CD79A scFv; T-세포 수용체의 알파 또는 베타쇄, CDδ, CD3ε, CDγ, CD3ζ, CD4, CD5, CD8α, CD9, CD 16, CD22, CD27, CD28, CD33, CD37, CD45, CD64, CD80, CD86, CD 134, CD137, CD152, CD154, AMN1, 및 PD1로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리펩타이드로부터 유래된 막관통 도메인; 및 TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9, TLR10, CARD11, CD2, CD7, CD27, CD28, CD30, CD40, CD54(ICAM), CD83, CD134(OX40), CD137(4-1BB), CD278(ICOS), DAP10, LAT, NKD2C, SLP76, TRIM, 및 ZAP70으로 이루어진 군으로부터 선택되는 공자극 분자로부터의 하나 이상의 세포내 공자극 신호전달 도메인; 및 FcRγ, FcRβ, CD3γ, CD3δ, CD3ε, CD3ζ, CD22, CD79a, CD79b, 및 CD66d로부터의 1차 신호전달 도메인을 포함한다.
일 실시형태에서, CAR은 CD79A 폴리펩타이드에 결합하는 항-CD79A scFv; IgG1 힌지/CH2/CH3, IgG4 힌지/CH2/CH3, PD1 힌지, CD152 힌지 및 CD8α 힌지로 이루어진 군으로부터 선택되는 힌지 도메인; T-세포 수용체의 알파 또는 베타쇄, CDδ, CD3ε, CDγ, CD3ζ, CD4, CD5, CD8α, CD9, CD 16, CD22, CD27, CD28, CD33, CD37, CD45, CD64, CD80, CD86, CD 134, CD137, CD152, CD154, AMN1 및 PD1로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리펩타이드로부터 유래된 막관통 도메인; 및 TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9, TLR10, CARD11, CD2, CD7, CD27, CD28, CD30, CD40, CD54(ICAM), CD83, CD134(OX40), CD137(4-1BB), CD278(ICOS), DAP10, LAT, NKD2C, SLP76, TRIM 및 ZAP70로 이루어진 군으로부터 선택되는 공자극 분자로부터 선택되는 하나 이상의 세포내 공자극 신호전달 도메인; 및 FcRγ, FcRβ, CD3γ, CD3δ, CD3ε, CD3ζ, CD22, CD79a, CD79b 및 CD66d로부터의 1차 신호전달 도메인을 포함한다.
일 실시형태에서, CAR은 CD79A 폴리펩타이드에 결합하는 항-CD79A scFv; IgG1 힌지/CH2/CH3, IgG4 힌지/CH2/CH3, PD1 힌지, CD152 힌지, 및 CD8α 힌지로 이루어진 군으로부터 선택되는 힌지 도메인; T-세포 수용체의 알파 또는 베타쇄, CDδ, CD3ε, CDγ, CD3ζ, CD4, CD5, CD8α, CD9, CD 16, CD22, CD27, CD28, CD33, CD37, CD45, CD64, CD80, CD86, CD 134, CD137, CD152, CD154, AMN1 및 PD1로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리펩타이드로부터 유래된 막관통 도메인; CAR의 세포내 신호전달 도메인에 TM 도메인을 연결하는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 아미노산 길이의 짧은 올리고- 또는 폴리펩타이드 링커; 및 TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9, TLR10, CARD11, CD2, CD7, CD27, CD28, CD30, CD40, CD54(ICAM), CD83, CD134 (OX40), CD137(4-1BB), CD278(ICOS), DAP10, LAT, NKD2C, SLP76, TRIM 및 ZAP70으로 이루어진 군으로부터 선택되는 공자극 분자로부터의 하나 이상의 세포내 공자극 신호전달 도메인; 및 FcRγ, FcRβ, CD3γ, CD3δ, CD3ε, CD3ζ, CD22, CD79a, CD79b 및 CD66d로부터의 1차 신호전달 도메인을 포함한다.
특정 실시형태에서, CAR은 CD79A 폴리펩타이드에 결합하는 항-CD79A scFv; IgG1 힌지/CH2/CH3 폴리펩타이드 및 CD8α 폴리펩타이드를 포함하는 힌지 도메인; 약 3 내지 약 10개 아미노산의 폴리펩타이드 링커를 포함하는 CD8α 막관통 도메인; CD137 세포내 공자극 신호전달 도메인; 및 CD3ζ 1차 신호전달 도메인을 포함한다.
특정 실시형태에서, CAR은 CD79A 폴리펩타이드에 결합하는 항-CD79A scFv; CD8α 폴리펩타이드를 포함하는 힌지 도메인; 약 3 내지 약 10개의 아미노산의 폴리펩타이드 링커를 포함하는 CD8α 막관통 도메인; CD134 세포내 공자극 신호전달 도메인; 및 CD3ζ 1차 신호전달 도메인을 포함한다.
특정 실시형태에서, CAR은 CD79A 폴리펩타이드에 결합하는 항-CD79A scFv; CD8α 폴리펩타이드를 포함하는 힌지 도메인; 약 3 내지 약 10개의 아미노산의 폴리펩타이드 링커를 포함하는 CD8α 막관통 도메인; CD28 세포내 공자극 신호전달 도메인; 및 CD3ζ 1차 신호전달 도메인을 포함한다.
특정 실시형태에 상정된 CAR의 설계는 비-변형 T 세포 또는 다른 CAR을 발현시키도록 변형된 T 세포에 비해 CAR을 발현시키는 T 세포에서 개선된 확장, 장기간 지속성 및 세포독성 특성을 가능하게 한다.
D.
폴리펩타이드
CAR 폴리펩타이드 및 이의 단편을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 다양한 폴리펩타이드, 융합 폴리펩타이드 및 폴리펩타이드 변이체가 상정된다. 바람직한 실시형태에서, 하나 이상의 CAR을 포함하는 폴리펩타이드가 제공된다. 특정 실시형태에서, CAR은 서열번호 25 내지 30 중 어느 하나에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 항-CD79A CAR이다.
"폴리펩타이드", "펩타이드" 및 "단백질"은 반대로 구체화되지 않는 한, 통상적인 의미에 따라, 즉, 아미노산의 서열로서 상호 호환적으로 사용된다. 폴리펩타이드는 구체적 길이로 제한되지 않으며, 예를 들어, 이들은 전장 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드 단편을 포함할 수 있고, 폴리펩타이드의 한 가지 이상의 번역 후 변형, 예를 들어, 글리코실화, 아세틸화, 포스포릴화 등뿐만 아니라 당업계에 공지된 다른 변형, 즉, 천연 유래와 비천연 유래 둘 다를 포함할 수 있다. 다양한 실시형태에서, CAR 폴리펩타이드는 단백질의 N-말다 단부에서 신호(또는 리더) 서열을 포함하는 데, 이는 번역과 함께 또는 번역 후에 단백질 전달을 지시한다. 특정 실시형태에서 상정된 CAR에서 유용한 적합한 신호 서열의 예시적 예는 IgG1 중쇄 신호 폴리펩타이드, CD8α 신호 폴리펩타이드, 또는 인간 GM-CSF 수용체 알파 신호 폴리펩타이드를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 폴리펩타이드는 임의의 다양한 잘 공지된 재조합 및/또는 합성 기법을 이용하여 제조될 수 있다. 본 명세서에 상정된 폴리펩타이드는 본 개시내용의 CAR, 또는 본 명세서에 상정된 CAR의 하나 이상의 아미노산에 대한 첨가 및/또는 치환으로부터 결실을 갖는 서열을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "단리된 폴리펩타이드" 등은 세포 환경으로부터 그리고 세포의 다른 성분과의 결합으로부터의 펩타이드 또는 폴리펩타이드 분자의 시험관내 합성, 단리 및/또는 정제를 지칭하며, 즉, 이는 생체내 물질과 상당하게 관련되지 않는다. 특정 실시형태에서, 단리된 폴리펩타이드는 합성 폴리펩타이드, 반-합성 폴리펩타이드, 또는 재조합 공급원으로부터 얻거나 유래된 폴리펩타이드이다.
폴리펩타이드는 "폴리펩타이드 변이체"를 포함한다. 폴리펩타이드 변이체는 하나 이상의 치환, 결실, 첨가 및/또는 삽입에서 천연 유래 폴리펩타이드와 상이할 수 있다. 이러한 변이체는 천연 유래일 수 있거나 또는, 예를 들어, 상기 폴리펩타이드 서열 중 하나 이상을 변형시킴으로써 합성에 의해 생성될 수 있다. 예를 들어, 특정 실시형태에서, CAR 폴리펩타이드의 결합 도메인, 힌지, TM 도메인, 공자극 신호전달 도메인 또는 1차 신호전달 도메인 내로 하나 이상의 치환, 결실, 첨가 및/또는 삽입을 도입함으로써 CAR의 결합 친화도 및/또는 다른 생물학적 특성을 개선시키는 것이 바람직할 수 있다. 특정 실시형태에서, 폴리펩타이드는 본 명세서에 상정된 임의의 기준 서열에 대해 적어도 약 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 86%, 97%, 98% 또는 99%의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 포함하며, 전형적으로 여기서 변이체는 기준 서열의 적어도 하나의 생물학적 활성을 유지한다. 특정 실시형태에서, 생물학적 활성은 결합 친화도이다. 특정 실시형태에서, 생물학적 활성은 세포용해 활성이다.
폴리펩타이드는 "폴리펩타이드 단편"을 포함한다. 폴리펩타이드 단편은 천연 유래 또는 재조합적으로 생성된 폴리펩타이드의 아미노-말단 결실, 카복실-말단 결실 및/또는 내부 결실 또는 치환을 갖는 단량체 또는 다량체일 수 있는 폴리펩타이드를 지칭한다. 생물학적으로 활성인 폴리펩타이드 단편의 예시적인 예는 항체 단편을 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "생물학적으로 활성인 단편" 또는 "최소 생물학적으로 활성인 단편"은 천연 유래 폴리펩타이드 활성의 적어도 100%, 적어도 90%, 적어도 80%, 적어도 70%, 적어도 60%, 적어도 50%, 적어도 40%, 적어도 30%, 적어도 20%, 적어도 10% 또는 적어도 5%를 보유하는 폴리펩타이드 단편을 지칭한다. 바람직한 실시형태에서, 생물학적 활성은 이디오타입에 대한 결합 친화도이다. 특정 실시형태에서, 폴리펩타이드 단편은 적어도 5 내지 약 500개의 아미노산 길이의 아미노산 쇄를 포함한다. 특정 실시형태에서, 단편은 적어도 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 150, 200, 250, 300, 350, 400 또는 450개의 아미노산 길이인 것으로 인식될 것이다. 특히 유용한 폴리펩타이드 단편은 항체의 항원-결합 도메인 또는 단편을 포함하는, 기능성 도메인을 포함한다. 항-CD79A 항체의 경우에, 유용한 단편은 CDR 영역, 중쇄 또는 경쇄의 CDR3 영역; 중쇄 또는 경쇄의 가변 영역; 2개의 CDR을 포함하는 항체 쇄 또는 가변 영역 일부; 등을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
폴리펩타이드는 또한 폴리펩타이드(예를 들어, 폴리-His)의 합성, 정제 또는 동정의 용이함을 위해, 또는 고체 지지체에 대한 폴리펩타이드의 결합을 향상시키기 위해, 프레임내에서 융합되거나 또는 링커 또는 다른 서열에 접합될 수 있다.
상기 언급한 바와 같이, 특정 실시형태에서, 폴리펩타이드는 아미노산 치환, 결실, 절단 및 삽입을 포함하는 다양한 방법으로 변경될 수 있다. 이러한 조작을 위한 방법은 일반적으로 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 기준 폴리펩타이드의 아미노산 서열 변이체는 DNA에서의 돌연변이에 의해 제조될 수 있다. 돌연변이유발 및 뉴클레오타이드 서열 변경을 위한 방법은 당업계에 잘 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌[Kunkel (1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82: 488-492), Kunkel et al., (1987, Methods in Enzymol, 154: 367-382)], 미국 특허 제4,873,192호, 문헌[Watson, J. D. et al., (Molecular Biology of the Gene, Fourth Edition, Benjamin/Cummings, Menlo Park, Calif., 1987)] 및 그에 인용된 참고문헌을 참조. 관심 대상의 단백질의 생물학적 활성에 영향을 미치지 않는 적절한 아미노산 치환에 대한 가이드는 문헌[Dayhoff et al., (1978) Atlas of Protein Sequence and Structure (Natl. Biomed. Res. Found., Washington, D.C.)]의 모델에서 찾을 수 있다.
특정 실시형태에서, 폴리펩타이드 변이체는 하나 이상의 보존적 치환을 포함한다. "보존적 치환"은 펩타이드 화학 분야의 당업자가 폴리펩타이드의 2차 구조 및 소수성 특성이 실질적으로 변하지 않는 것으로 예상하도록 아미노산이 유사한 특성을 갖는 다른 아미노산으로 치환되는 것이다. 변형은 특정 실시형태에서 상정된 폴리뉴클레오타이드 및 폴리펩타이드의 구조에서 만들어질 수 있으며, 바람직한 특징을 갖는 변이체 또는 유도체 폴리펩타이드를 암호화하는 작용성 분자를 여전히 얻는다. 동등한, 또는 심지어 개선된 변이체 폴리펩타이드를 생성하기 위해 폴리펩타이드의 아미노산 서열을 변경시키도록 요망될 때, 당업자는, 예를 들어, 표 1에 따라, 예를 들어 암호화 DNA 서열의 코돈 중 하나 이상을 변화시킬 수 있다.
생물학적 활성을 없애는 일 없이 아미노산 잔기가 치환, 삽입 또는 결실되는 것을 결정하는 가이드는 당업계에 잘 공지된 컴퓨터 프로그램, 예컨대 DNASTAR, DNA Strider, Geneious, Mac Vector, 또는 Vector NTI 소프트웨어를 이용하여 찾을 수 있다. 바람직하게는, 본 명세서에 개시된 단백질 변이체에서 아미노산 변화는 보존적 아미노산 변화, 즉, 유사하게 하전된 또는 비하전된 아미노산의 치환이다. 보존적 아미노산 변화는 그들의 측쇄와 관련된 아미노산 패밀리 중 하나의 치환을 수반한다. 천연 유래 아미노산은 일반적으로 4가지 패밀리로 분류된다: 산성(아스파르테이트, 글루타메이트), 염기성(라이신, 알기닌, 히스티딘), 비극성(알라닌, 발린, 류신, 아이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판) 및 비하전 극성(글리신, 아스파라긴, 글루타민, 시스테인, 세린, 트레오닌, 타이로신) 아미노산. 페닐알라닌, 트립토판 및 타이로신은 때때로 공통적으로 방향족 아미노산으로서 분류된다. 펩타이드 또는 단백질에서, 아미노산의 적합한 보존적 치환은 당업자에게 공지되어 있으며, 일반적으로 얻어진 분자의 생물학적 활성을 변경시키는 일 없이 이루어질 수 있다. 당업자라면 일반적으로, 폴리펩타이드의 비필수 영역 내 단일 아미노산 치환이 생물학적 활성을 실질적으로 변경시키지 않는다는 것을 인식한다(예를 들어, 문헌[Watson et al. Molecular Biology of the Gene, 4th Edition, 1987, The Benjamin/Cummings Pub. Co., p.224] 참조).
상기 약술한 바와 같이, 아미노산 치환은 아미노산 측쇄 치환체, 예를 들어, 이들의 소수성, 친수성, 전하, 크기 등의 상대적 유사성에 기반할 수 있다.
폴리펩타이드 변이체는 글리코실화된 형태, 다른 분자와의 응집 접합체, 및 관련없는 화학적 모이어티(예를 들어, 페길화된 분자)와의 공유 접합체를 더 포함한다. 공유 변이체는 당업계에 공지된 바와 같이, 아미노산 쇄에서 또는 N- 또는 C-말단 잔기에서 발견되는 기에 작용기를 연결함으로써 제조될 수 있다. 변이체는 또한 대립유전자 변이체, 종 변이체 및 돌연변이 단백질을 포함한다. 단백질의 기능적 활성에 영향을 미치지 않는 영역의 절단 또는 결실은 또한 변이체이다.
일 실시형태에서, 둘 이상의 폴리펩타이드의 발현이 요망되는 경우, 이를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열은 본 명세서의 다른 곳에 논의된 바와 같은 IRES 서열에 의해 분리될 수 있다. 다른 실시형태에서, 둘 이상의 폴리펩타이드는 하나 이상의 자기-절단성 폴리펩타이드 서열을 포함하는 융합 단백질로서 발현될 수 있다.
특정 실시형태에서 상정된 폴리펩타이드는 융합 폴리펩타이드를 포함한다. 바람직한 실시형태에서, 융합 폴리펩타이드 및 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 예를 들어, CAR이 제공된다. 융합 폴리펩타이드 및 융합 단백질은 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 이상의 폴리펩타이드 세그먼트를 갖는 폴리펩타이드를 지칭한다. 융합 폴리펩타이드는, 또한 C-말단에서 C-말단으로, N-말단에서 N-말단으로, 또는 N-말단에서 C-말단으로 연결될 수 있지만, 전형적으로 C-말단에서 N-말단으로 연결된다. 융합 단백질의 폴리펩타이드는 임의의 순서 또는 구체화된 순서일 수 있다. 융합 폴리펩타이드 또는 융합 단백질은 또한, 융합 폴리펩타이드의 목적하는 전사 활성이 보존되는 한, 보존적으로 변형된 변이체, 다형성 변이체, 대립유전자, 돌연변이체, 하위서열 및 종간 상동체를 포함할 수 있다. 융합 폴리펩타이드는 화학적 합성 방법에 의해 또는 두 모이어티 사이의 화학적 결합에 의해 생산될 수 있거나 또는 일반적으로 다른 표준 기법을 이용하여 제조될 수 있다. 융합 폴리펩타이드를 포함하는 결찰된 DNA 서열은 본 명세서의 다른 곳에 논의된 바와 같은 적합한 전사 또는 번역 제어 요소에 작동 가능하게 연결된다.
일 실시형태에서, 융합 상대는 천연 재조합 단백질보다 더 높은 수율로 단백질(발현 인핸서)을 발현시키는 것을 보조하는 서열을 포함한다. 다른 융합 상대는 단백질 용해도를 증가시키기 위해 또는 단백질이 목적하는 세포내 구획에 대해 표적화되는 것을 가능하게 하기 위해 또는 세포막을 통해 융합 단백질의 수송을 용이하게 하기 위해 선택될 수 있다.
융합 폴리펩타이드는 본 명세서에 기재된 각각의 폴리펩타이드 도메인 사이에 폴리펩타이드 절단 신호를 더 포함할 수 있다. 추가로, 폴리펩타이드 절단 부위는 임의의 링커 펩타이드 서열 내로 들어갈 수 있다. 예시적인 폴리펩타이드 절단 신호는 폴리펩타이드 절단 인식 부위, 예컨대 프로테아제 절단 부위, 뉴클레아제 절단 부위(예를 들어, 희귀 제한 효소 인식 부위, 자기-절단성 리보자임 인식 부위) 및 자기-절단성 바이러스 올리고펩타이드를 포함한다(문헌[deFelipe and Ryan, 2004. Traffic, 5(8); 616-26] 참조).
적합한 프로테아제 절단 부위 및 자기-절단성 펩타이드는 당업자에게 공지되어 있다(예를 들어, 문헌[Ryan et al., 1997. J. Gener. Virol. 78, 699-722; Scymczak et al. (2004) Nature Biotech. 5, 589-594] 참조). 예시적인 프로테아제 절단 부위는 포티바이러스 NIa 프로테아제(예를 들어, 담배 식각 바이러스), 포티바이러스 HC 프로테아제, 포티바이러스 P1(P35) 프로테아제, 비오바이러스 NIa 프로테아제, 비오바이러스 RNA-2-암호화된 프로테아제, 아프타바이러스 L 프로테아제, 엔테로바이러스 2A 프로테아제, 리노바이러스 2A 프로테아제, 피코르나 3C 프로테아제, 코모바이러스 24K 프로테아제, 네포바이러스 24K 프로테아제, RTSV (벼 퉁그로 구형 바이러스) 3C-유사 프로테아제, PYVF(파스닙 황색 얼룩 바이러스(parsnip yellow fleck virus)) 3C-유사 프로테아제, 헤파린, 트롬빈, 인자 Xa 및 엔테로키나제의 절단 부위를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 그의 고절단 엄격성에 기인하여, TEV(담배 식각 바이러스) 프로테아제 절단 부위는 일 실시형태, 예를 들어, EXXYXQ(G/S)(서열번호 50), 예를 들어, ENLYFQG(서열번호 51) 및 ENLYFQS(서열번호 52)에서 바람직하되, X는 임의의 아미노산을 나타낸다(TEV에 의한 절단은 Q와 G 또는 Q와 S 사이에서 생김).
특정 실시형태에서, 폴리펩타이드 절단 신호는 바이러스의 자기-절단 펩타이드 또는 리보솜 스키핑 서열이다.
리보솜 스키핑 서열의 예시적인 예는 2A 또는 2A-유사 부위, 서열 또는 도메인을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다(Donnelly et al., 2001. J. Gen. Virol. 82:1027-1041). 특정 실시형태에서, 바이러스 2A 펩타이드는 아프타바이러스 2A 펩타이드, 포티바이러스 2A 펩타이드, 또는 카디오바이러스 2A 펩타이드이다.
일 실시형태에서, 바이러스 2A 펩타이드는 구제역바이러스(FMDV) 2A 펩타이드, 마 비염 A 바이러스(ERAV) 2A 펩타이드, 토세아 아시그나 바이러스(TaV) 2A 펩타이드, 돼지 테스코바이러스-1(PTV-1) 2A 펩타이드, 테일로바이러스 2A 펩타이드 및 뇌심근염 바이러스 2A 펩타이드로 이루어진 군으로부터 선택된다.
2A 부위의 예시적인 예를 표 2에 제공한다.
바람직한 실시형태에서, 폴리펩타이드는 항-CD79A CAR 폴리펩타이드를 포함한다.
E.
폴리뉴클레오타이드
바람직한 실시형태에서, 하나 이상의 CAR 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드가 제공된다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "폴리뉴클레오타이드" 또는 "핵산"은 데옥시리보핵산(DNA), 리보핵산(RNA) 및 DNA/RNA 혼성체를 지칭한다. 폴리뉴클레오타이드는 단일 가닥 또는 이중 가닥이고 재조합, 합성이거나, 또는 단리될 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는 전-전령 RNA(전-mRNA), 전령 RNA(mRNA), RNA, 게놈 DNA(gDNA), PCR 증폭된 DNA, 상보성 DNA(cDNA), 합성 DNA 또는 재조합 DNA를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 폴리뉴클레오타이드는 리보뉴클레오타이드 또는 데옥시뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유형의 변형된 형태의 길이가 적어도 5, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 40, 적어도 50, 적어도 100, 적어도 200, 적어도 300, 적어도 400, 적어도 500, 적어도 1000, 적어도 5000, 적어도 10000, 또는 적어도 15000개 이상뿐만 아니라 모든 중간 길이인 뉴클레오타이드의 중합체 형태를 지칭한다. 이와 관련하여 "중간 길이"는 인용된 값 사이의 임의의 길이, 예컨대 6, 7, 8, 9 등, 101, 102, 103 등; 151, 152, 153 등; 201, 202, 203 등을 의미한다. 특정 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드 또는 변이체는 기준 서열에 대해 적어도 또는 약 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 가진다.
폴리뉴클레오타이드의 예시적 예는 서열번호 31 내지 36, 및 서열번호 1 내지 30을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
본 명세서에서 사용되는 "단리된 폴리뉴클레오타이드"는 천연-유래 상태, 예를 들어, 단편에 정상적으로 인접한 서열로부터 제거된 DNA 단편에서 그것에 측접하는 서열로부터 정제된 폴리뉴클레오타이드를 지칭한다. 특정 실시형태에서, "단리된 폴리뉴클레오타이드"는 또한 상보성 DNA(cDNA), 재조합 DNA 또는 천연에 존재하지 않고 사람의 손으로 만든 다른 폴리뉴클레오타이드를 지칭한다. 특정 실시형태에서, 단리된 폴리뉴클레오타이드는 합성 폴리뉴클레오타이드, 반-합성 폴리뉴클레오타이드, 또는 재조합 공급원으로부터 얻거나 또는 유래된 폴리뉴클레오타이드이다.
다양한 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드는 본 명세서에 상정된 폴리펩타이드를 암호화하는 mRNA를 포함한다. 소정의 실시형태에서, mRNA는 캡, 하나 이상의 뉴클레오타이드 및 폴리(A) 꼬리를 포함한다.
특정 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드는 코돈-최적화될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "코돈-최적화된"은 폴리펩타이드의 발현, 안정성 및/또는 활성을 증가시키기 위해 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 내 코돈을 치환하는 것을 지칭한다. 코돈 최적화에 영향을 미치는 인자는 (i) 둘 이상의 유기체 사이의 코돈 편향의 변형 또는 유전자 또는 합성으로 작제된 편향 표, (ii) 유기체, 유전자 또는 유전자 세트 내에서 코돈 편향 정도의 변형, (iii) 맥락을 포함하는 코돈의 체계적 변형, (iv) 그들의 탈암호 tRNA에 따른 코돈의 변형, (v) 전반적으로 또는 삼중 중 하나의 위치에서 GC%에 따른 코돈의 변형, (vi) 기준 서열, 예를 들어 천연 유래 서열과의 유사성 정도의 변형, (vii) 코돈 빈도 컷오프에서의 변형, (viii) DNA 서열로부터 전사된 mRNA의 구조적 특성, (ix) 코돈 치환 세트의 설계에 기반한 DNA 서열의 기능에 관한 사전 지식, (x) 각각의 아미노산에 대한 코돈 세트의 체계적 변형, 및/또는 (xi) 비논리적 번역 개시 부위의 단리된 제거를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "폴리뉴클레오타이드 변이체" 및 "변이체" 등은 기준 폴리뉴클레오타이드 서열과 실질적인 서열 동일성을 나타내는 폴리뉴클레오타이드 또는 본 명세서에서 이후에 나타내는 엄격한 조건 하에 기준 서열과 혼성화되는 폴리뉴클레오타이드를 지칭한다. 이들 용어는 기준 폴리뉴클레오타이드에 비해 하나 이상의 뉴클레오타이드가 첨가되거나 또는 결실되거나, 또는 상이한 뉴클레오타이드로 대체된 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 이와 관련하여, 돌연변이, 첨가, 결실 및 치환을 포함하는 특정 변경은 기준 폴리뉴클레오타이드에 대해 이루어질 수 있고, 이에 의해 변경된 폴리뉴클레오타이드는 기준 폴리뉴클레오타이드의 생물학적 기능 또는 활성을 보유한다는 것이 잘 이해된다.
폴리뉴클레오타이드 변이체는 생물학적으로 활성인 폴리펩타이드 단편 또는 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 단편을 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "폴리뉴클레오타이드 단편"은 천연 유래 폴리펩타이드 활성의 적어도 100%, 적어도 90%, 적어도 80%, 적어도 70%, 적어도 60%, 적어도 50%, 적어도 40%, 적어도 30%, 적어도 20%, 적어도 10% 또는 적어도 5%를 보유하는 폴리펩타이드 변이체를 암호화하는 적어도 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700개 이상의 뉴클레오타이드 길이의 폴리뉴클레오타이드 단편을 지칭한다. 폴리뉴클레오타이드 단편은 천연 유래 또는 재조합적으로 생성된 폴리펩타이드의 하나 이상의 아미노산의 아미노-말단 결실, 카복실-말단 결실, 및/또는 내부 결실 또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 지칭한다.
설명 "서열 동일성" 또는, 예를 들어, 본 명세서에서 사용되는 바와 같이 "에 대해 50% 동일한 서열"을 포함하는 것은 서열이 비교창에 걸쳐 뉴클레오타이드 대 뉴클레오타이드 염기 기준 또는 아미노산 대 아미노산 기준과 동일한 정도를 지칭한다. 따라서, "서열 동일성의 백분율"은 비교창에 걸쳐 2개의 최적으로 정렬된 서열을 비교하는 단계, 매칭된 위치의 수를 수득하기 위해 동일한 핵산 염기(예를 들어, A, T, C, G, I) 또는 동일한 아미노산 잔기(예를 들어, Ala, Pro, Ser, Thr, Gly, Val, Leu, Ile, Phe, Tyr, Trp, Lys, Arg, His, Asp, Glu, Asn, Gln, Cys 및 Met)가 서열 둘 다에서 생기는 위치 수를 결정하는 단계, 매칭된 위치의 수를 비교창에서의 위치의 총수(즉, 창 크기)로 나누는 단계, 및 결과에 100을 곱하여서 서열 동일성의 백분율을 수득하는 단계에 의해 계산될 수 있다. 본 명세서에 기재된 임의의 기준 서열에 대해 적어도 약 50%, 55%, 60%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 86%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 및 폴리펩타이드가 포함되며, 전형적으로 폴리펩타이드 변이체는 기준 폴리펩타이드의 적어도 하나의 생물학적 활성을 유지한다.
2 이상의 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드 사이의 서열 관계를 기재하기 위해 사용되는 용어는 "기준 서열", "비교창", "서열 동일성", "서열 동일성의 백분율" 및 "실질적인 동일성"을 포함한다. "기준 서열"은 길이가 적어도 12개이지만, 빈번하게는 15 내지 18개 및 종종 적어도 25개의 단량체 단위(뉴클레오타이드 및 아미노산 잔기를 포함)이다. 두 폴리뉴클레오타이드는 (1) 두 폴리뉴클레오타이드 사이의 유사한 서열(즉, 완전한 폴리뉴클레오타이드 서열의 일부만), 및 (2) 두 폴리뉴클레오타이드 간에 다른 서열을 각각 포함할 수 있기 때문에, 2(이상의) 폴리뉴클레오타이드 사이의 서열 비교는 전형적으로 서열 유사성의 국소 영역을 확인하고 비교하기 위해 "비교창"에 걸쳐 두 폴리뉴클레오타이드의 서열을 비교함으로써 수행된다. "비교창"은 적어도 6개의 인접한 위치, 보통 약 50 내지 약 100, 더 보통으로는 약 100 내지 약 150개의 개념적 세그먼트를 지칭하며, 이때 서열은 두 서열이 최적으로 정렬된 후에 동일한 수의 인접한 위치의 기준 서열과 비교된다. 비교창은 두 서열의 최적의 정렬을 위해 기준 서열(첨가 또는 결실을 포함하지 않음)에 비해 약 20% 이하의 첨가 또는 결실(즉, 갭)을 포함할 수 있다. 비교창을 정렬하기 위한 서열의 최적의 정렬은 알고리즘의 컴퓨터화된 실행(위스콘신 제네틱스 소프트웨어 패키지 릴리즈 7.0에서 GAP, BESTFIT, FASTA 및 TFASTA, 미국 위스콘신주 메디슨 사이언스 드라이브 575에 소재한 제네틱스 컴퓨터 그룹(Genetics Computer Group))에 의해 또는 검사 및 선택된 임의의 다양한 방법에 의해 생성된 최적의 정렬(즉, 비교창에 걸쳐 가장 큰 백분율의 상동성을 초래)에 의해 수행될 수 있다. 또한, 예를 들어 문헌[Altschul et al., 1997, Nucl. Acids Res. 25:3389]에 의해 개시되는 바와 같이 프로그램의 BLAST 패밀리가 언급될 수 있다. 서열 분석의 상세한 논의는 문헌[Unit 19.3 of Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Inc., 1994-1998, Chapter 15]에서 찾을 수 있다.
폴리뉴클레오타이드의 배향을 기재하는 용어는 하기를 포함한다: 5'(정상적으로는 유리 인산염기를 갖는 폴리뉴클레오타이드의 말단) 및 3'(정상적으로는 유리 하이드록실(OH) 기를 갖는 폴리뉴클레오타이드의 말단). 폴리뉴클레오타이드 서열은 5'에서 3' 배향 또는 3'에서 5' 배향으로 주석이 달릴 수 있다. DNA 및 mRNA에 대해, 5'에서 3' 가닥은 "센스", "플러스" 또는 "암호" 가닥으로 표기되는데, 그의 서열이 전전령(전mRNA)의 서열과 동일하기 때문이다[DNA에서 티민(T)을 대신하는 RNA에서의 유라실(U)을 제외함]. DNA 및 mRNA에 대해, RNA 중합효소에 의해 전사되는 가닥인 상보성 3'에서 5' 가닥은 "주형", "안티센스", "마이너스" 또는 "비암호화" 가닥으로 표기된다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "역 배향"은 3'에서 5' 배향으로 기재된 5'에서 3' 서열 또는 5'에서 3' 배향으로 기재된 3'에서 5' 서열을 지칭한다.
용어 "상보적" 및 "상보성"은 염기쌍 규칙과 관련된 폴리뉴클레오타이드(즉, 뉴클레오타이드의 서열)를 지칭한다. 예를 들어, DNA 서열 5' A G T C A T G 3'의 상보성 가닥은 3' T C A G T A C 5'이다. 후자의 서열은 종종 좌측 상에서 5' 말단 및 우측 상에서 3' 말단과 역 상보체로서 기재된다, 5' C A T G A C T 3'. 역 상보체와 동일한 서열은 회문구조 서열인 것으로 언급된다. 상보성은 "부분적"일 수 있는데, 이때 핵산의 염기 중 일부만이 염기쌍 규칙에 따라 매칭된다. 또는, 핵산 사이의 "완전한" 또는 "총" 상보성이 있을 수 있다.
게다가, 유전자 암호 축퇴의 결과로서, 본 명세서에서 기재된 폴리펩타이드, 또는 이의 변이체의 단편을 암호화할 수 있는 다수의 뉴클레오타이드 서열이 있다는 것은 당업자에 의해 인식될 것이다. 이들 폴리뉴클레오타이드 중 일부는 임의의 천연 유전자의 뉴클레오타이드 서열에 대해 최소 상동성을 보유한다. 그럼에도 불구하고, 코돈출현빈도의 차이에 기인하여 변하는 폴리뉴클레오타이드, 예를 들어 인간 및/또는 영장류 코돈 선택을 위해 최적화된 폴리뉴클레오타이드가 특이적으로 상정된다. 추가로, 본 명세서에 제공된 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 유전자의 대립유전자가 또한 사용될 수 있다. 대립유전자는 하나 이상의 돌연변이, 예컨대 뉴클레오타이드의 결실, 첨가 및/또는 치환의 결과로서 변경된 내인성 폴리뉴클레오타이드 서열이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "핵산 카세트" 또는 "발현 카세트"는 RNA, 및 후속적으로 폴리펩타이드를 발현시킬 수 있는 벡터 내의 유전자 서열을 지칭한다. 일 실시형태에서, 핵산 카세트는 관심 대상의 유전자(들), 예를 들어, 관심 대상의 폴리뉴클레오타이드(들)를 함유한다. 다른 실시형태에서, 핵산 카세트는 하나 이상의 발현 제어 서열, 예를 들어, 프로모터, 인핸서, 폴리(A) 서열 및 관심대상의 유전자(들), 예를 들어, 관심대상의 폴리뉴클레오타이드(들)를 함유한다. 벡터는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 이상의 핵산 카세트를 포함할 수 있다. 카세트 내 핵산이 RNA로 전사될 수 있고, 필요할 때, 단백질 또는 폴리펩타이드로 번역되며, 형질전환 세포에서 활성에 필요한 적절한 번역후 변형을 겪으며, 적절한 세포내 구획에 대한 표적화 또는 세포외 구획으로의 분비에 의해 생물학적 활성을 위한 적절한 구획으로 전좌되도록, 핵산 카세트는 벡터 내에서 위치적으로 그리고 순차적으로 배향된다. 바람직하게는, 카세트는 벡터 내로 용이한 삽입에 적합한 그의 3' 및 5' 말단을 가지며, 예를 들어, 그는 각각의 말단에서 제한 엔도뉴클레아제 부위를 가진다. 바람직한 실시형태에서, 핵산 카세트는 CD79A를 발현시키는 암 세포의 세포독성을 증가시키기 위해 사용되는 키메라 항원 수용체 서열을 함유한다. 카세트는 제거되고, 단일 단위로서 플라스미드 또는 바이러스 벡터에 삽입될 수 있다.
폴리뉴클레오타이드는 관심 대상의 폴리뉴클레오타이드(들)를 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "관심 대상의 폴리뉴클레오타이드"는 폴리펩타이드, 폴리펩타이드 변이체 또는 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 지칭한다. 벡터는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 관심 대상의 폴리뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 특정 실시형태에서, 관심 대상의 폴리뉴클레오타이드는 질환 또는 장애의 치료 또는 예방에서 치료적 효과를 제공하는 폴리펩타이드를 암호화한다. 관심 대상의 폴리뉴클레오타이드, 및 이로부터 암호화된 폴리펩타이드는 야생형 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드뿐만 아니라 이의 기능성 변이체 및 단편을 포함한다. 특정 실시형태에서, 기능성 변이체는 대응하는 야생형 기준 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드 서열에 대해 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99% 동일성을 가진다. 특정 실시형태에서, 기능성 변이체 또는 단편은 대응하는 야생형 폴리펩타이드의 생물학적 활성의 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80% 또는 적어도 90%를 가진다.
암호 서열 그 자체의 길이와 상관없이, 본 명세서에 상정된 폴리뉴클레오타이드는 그들의 전체 길이가 상당히 다를 수 있도록, 본 명세서의 다른 곳에 개시되거나 또는 당업계에 공지된 바와 같이 다른 DNA 서열, 예컨대 프로모터 및/또는 인핸서, 비번역 영역(UTR), 신호 서열, 코작 서열, 폴리아데닐화 신호, 추가적인 제한 효소 부위, 다중 클로닝 부위, 내부 리보솜 유입 부위(IRES), 재조합효소 인식 부위(예를 들어, LoxP, FRT 및 Att 부위), 종결 코돈, 전사 종결 신호, 및 자기-절단성 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 에피토프 태그와 조합될 수 있다. 따라서 거의 임의의 길이의 폴리뉴클레오타이드 단편이 특정 실시형태에서 사용될 수 있으며, 총 길이가 제조의 용이함 및 의도된 재조합 DNA 프로토콜에서의 사용에 의해 바람직하게 제한된다는 것이 상정된다.
폴리뉴클레오타이드는 당업계에 공지되고 이용 가능한 임의의 다양한 잘 확립된 기법을 이용하여 제조되고/되거나 조작되고/되거나 발현될 수 있다. 목적으로 하는 폴리펩타이드를 발현시키기 위해, 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 적절한 벡터 내로 삽입될 수 있다.
벡터의 예시적 예는 플라스미드, 자율적 복제 서열 및 전위요소, 예를 들어, piggyBac, 잠자는 미녀(Sleeping Beauty), Mos1, Tc1/마리너(mariner), Tol2, 미니-Tol2, Tc3, MuA, Himar I, 프로그 프린스(Frog Prince) 및 이들의 유도체를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
벡터의 추가적인 예시적 예는 플라스미드, 파지미드, 코스미드, 인공 염색체, 예컨대 효모 인공 염색체(YAC), 박테리아 인공 염색체(BAC) 또는 P1-유래 인공 염색체(PAC), 박테리오파지, 예컨대 람다 파지 또는 M13 파지 및 동물 바이러스를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
벡터로서 유용한 바이러스의 예시적 예는 레트로바이러스(렌티바이러스를 포함), 아데노바이러스, 아데노-연관 바이러스, 헤르페스바이러스(예를 들어, 단순 포진 바이러스), 폭스바이러스, 바큘로바이러스, 유두종바이러스 및 파보바이러스(예를 들어, SV40)을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
발현 벡터의 예시적 예는 포유류 세포에서 발현을 위한 pClneo 벡터(프로메가(Promega)); 포유류 세포에서 렌티바이러스-매개 유전자 전달 및 발현을 위한 pLenti4/V5-DEST(상표명), pLenti6/V5-DEST(상표명) 및 pLenti6.2/V5-GW/lacZ(인비트로젠(Invitrogen))를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 특정 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 폴리펩타이드의 암호 서열은 포유류 세포에서 폴리펩타이드의 발현을 위해 이러한 발현 벡터 내로 결찰될 수 있다.
특정 실시형태에서, 벡터는 에피솜 벡터 또는 염색체외로 유지되는 벡터이다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "에피솜"은 숙주의 염색체 DNA 내로의 통합 없이 그리고 분할 숙주 세포로부터의 점진적 상실 없이 복제할 수 있는 벡터를 지칭하는데, 또한 이는 상기 벡터가 염색체외로 또는 에피솜으로 복제한다는 것을 의미한다.
발현 벡터에 존재하는 "제어 요소" 또는 "조절 서열"은 전사 및 번역을 수행하기 위해 숙주 세포 단백질화 상호작용하는 벡터의 해당 비번역 영역(복제기점, 선택 카세트, 프로모터, 인핸서, 번역 개시 신호(샤인 달가노 서열 또는 코작 서열) 인트론, 폴리아데닐화 서열, 5' 및 3' 비번역 영역)이다. 이러한 요소는 그들의 강도 및 특이성이 다를 수 있다. 이용되는 벡터 시스템 및 숙주에 다라서, 편재성 프로모터 및 유도성 프로모터를 포함하는 다수의 적합한 전사 및 번역 요소가 사용될 수 있다.
특정 실시형태에서, 벡터는 발현 벡터 및 바이러스 벡터를 포함하지만, 이들로 제한되지 않으며, 외인성, 내인성, 또는 이종성 제어 서열, 예컨대 프로모터 및/또는 인핸서를 포함할 수 있다. "내인성" 제어 서열은 게놈 내 주어진 유전자와 자연적으로 연결된 것이다. "외인성" 제어 서열은 해당 유전자의 전사가 연결된 인핸서/프로모터에 의해 지시되도록 유전자 조작 수단(즉, 분자 생물학 기법)에 의해 유전자에 대한 병렬 배치로 위치되는 것이다. "이종성" 제어 서열은 유전자 조작 중인 세포와 상이한 종으로부터 유래된 외인성 서열이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "프로모터"는 RNA 중합효소에 결합하는 폴리뉴클레오타이드(DNA 또는 RNA)의 인식 부위를 지칭한다. RNA 중합효소는 프로모터에 작동 가능하게 연결된 폴리뉴클레오타이드를 개시하고 전사시킨다. 특정 실시형태에서, 포유류 세포에서 작동성인 프로모터는 전사가 개시되는 부위로부터 상류의 대략 25 내지 30개 염기에 위치된 AT-풍부 영역 및/또는 전사 시작으로부터 상류의 70 내지 80개 염기로 발현되는 다른 서열, N이 임의의 뉴클레오타이드일 수 있는 CNCAAT 영역을 포함한다.
용어 "인핸서"는 향상된 전사를 제공할 수 있는 서열을 함유하는 DNA의 세그먼트를 지칭하며, 일부 예에서 다른 제어 서열에 비해 그들의 배향과 독립적으로 작용할 수 있다. 인핸서는 프로모터 및/또는 다른 인핸서 요소와 협응하여 또는 상가적으로 작용할 수 있다. 용어 "프로모터/인핸서"는 프로모터와 인핸서 기능을 둘 다 제공할 수 있는 서열을 함유하는 DNA의 세그먼트를 지칭한다.
용어 "작동 가능하게 연결된"은 병렬배치를 지칭하되, 기재된 성분인 그들의 의도된 방식으로 작용하도록 하는 관계이다. 일 실시형태에서, 상기 용어는 핵산 발현 제어 서열(예컨대 프로모터, 및/또는 인핸서)과 제2 폴리뉴클레오타이드 서열, 예를 들어, 관심 대상의 폴리뉴클레오타이드 사이의 작용성 결합을 지칭하되, 발현 제어 서열은 제2 서열에 대응하는 핵산의 전사를 지시한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "구성적 발현 제어 서열"은 작동 가능하게 연결된 서열의 전사를 계속해서 또는 지속적으로 허용하는 프로모터, 인핸서, 또는 프로모터/인핸서를 지칭한다. 구성적 발현 제어 서열은 매우 다양한 세포 및 조직 유형에서의 발현을 허용하는 "편재성" 프로모터, 인핸서, 또는 프로모터/인핸서 또는 제한된 각각 다양한 세포 및 조직 유형에서의 발현을 허용하는 "세포 특이적", "세포 유형 특이적", "세포 계통 특이적" 또는 "조직 특이적" 프로모터, 인핸서 또는 프로모터/인핸서일 수 있다.
특정 실시형태에서 사용하는 데 적합한 예시적 편재성 발현 제어 서열은 거대세포바이러스(CMV) 급초기 프로모터, 바이러스 유인원 바이러스 40(SV40)(예를 들어, 초기 또는 후기), 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스(MoMLV) LTR 프로모터, 라우스 육종 바이러스(RSV) LTR, 단순 포진 바이러스(HSV)(티미딘 키나제) 프로모터, 백시니아 바이러스로부터의 H5, P7.5 및 P11 프로모터, 신장 인자 1-알파(EF1a) 프로모터, 초기 성장 반응 1(EGR1), 페리틴 H(FerH), 페리틴 L(FerL), 글리세르알데하이드 3-인산염 탈수소효소(GAPDH), 진핵 번역 개시 인자 4A1(EIF4A1), 열 충격 70kDa 단백질 5(HSPA5), 열 충격 단백질 90kDa 베타, 구성원 1(HSP90B1), 열 충격 단백질 70kDa(HSP70), β-키네신(β-KIN), 인간 ROSA 26 좌위(Irions et al., Nature Biotechnology 25, 1477 - 1482 (2007)), 유비퀴틴 C 프로모터(UBC), 포스포글리세레이트 키나제-1(PGK) 프로모터, 거대세포바이러스 인핸서/닭 β-액틴(CAG) 프로모터, β-액틴 프로모터 및 골수증식성 육종 바이러스 인핸서, 결실된 음성 대조 영역, dl587rev 프라이머-결합 부위 치환된(MND) U3 프로모터를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다(Haas et al. Journal of Virology. 2003;77(17): 9439-9450).
일 실시형태에서, 벡터는 MNDU3 프로모터를 포함한다.
일 실시형태에서, 벡터는 인간 EF1a 유전자의 제1 인트론을 포함하는 EF1a 프로모터를 포함한다.
일 실시형태에서, 벡터는 인간 EF1a 유전자의 제1 인트론을 결여하는 EF1a 프로모터를 포함한다.
특정 실시형태에서, T 세포 특이적 프로모터로부터 CAR을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 발현시키는 것이 바람직할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는, "조건적 발현"은 유도성 발현; 억제성 발현; 특정 생리적, 생물학적 또는 질환 상태 등을 갖는 세포 또는 조직에서의 발현을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 임의의 유형의 조건적 발현을 지칭할 수 있다. 이 정의는 세포 유형 또는 조직 특이적 발현을 제외하는 것으로 의도되지 않는다. 특정 실시형태는 관심 대상의 폴리뉴클레오타이드의 조건적 발현을 제공하며, 예를 들어, 발현은 세포, 조직, 유기체 등에 폴리뉴클레오타이드가 발현되도록 야기하거나 또는 관심 대상의 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 폴리뉴클레오타이드의 증가 또는 감소를 야기하는 처리 또는 조건을 실시함으로써 제어된다.
유도성 프로모터/시스템의 예시적 예는 스테로이드-유도성 프로모터, 예컨대 글루코코르티코이드 또는 에스트로겐 수용체를 암호화하는 유전자에 대한 프로모터(대응하는 호르몬에 의한 처리에 의한 유도성), 메탈로티오닌 프로모터(다양한 중금속에 의한 처리에 의한 유도성), MX-1 프로모터(인터페론에 의한 유도성), "진스위치(GeneSwitch)" 미페프리스톤-조절 가능 시스템(Sirin et al., 2003, Gene, 323:67), 큐메이트 유도성 유전자 스위치(WO 2002/088346), 테트라사이클린-의존적 조절 시스템 등을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
조건적 발현은 또한 부위 특이적 DNA 재조합효소를 이용함으로써 달성될 수 있다. 특정 실시형태에 따르면, 벡터는 부위 특이적 재조합효소에 의해 매개된 재조합을 위한 적어도 하나의(전형적으로 2개의) 부위(들)를 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "재조합효소" 또는 "부위 특이적 재조합효소"는 하나 이상의 재조합 부위(예를 들어, 2, 3, 4, 5, 7, 10, 12, 15, 20, 30, 50개 등)를 수반하는 재조합 반응에 연루된 절단 또는 통합적 단백질, 효소, 보조 요소 또는 관련 단백질을 포함하는데, 이는 야생형 단백질(문헌[Landy, Current Opinion in Biotechnology 3:699-707(1993)] 참조) 또는 돌연변이체, 유도체(예를 들어, 재조합 단백질 서열 또는 이의 단편을 함유하는 융합 단백질), 이의 단편 및 변이체일 수 있다. 특정 실시형태에서 사용하기에 적합한 재조합효소의 예시적 예는 Cre, Int, IHF, Xis, Flp, Fis, Hin, Gin, ΦC31, Cin, Tn3 위치특이성 재조합촉진효소, TndX, XerC, XerD, TnpX, Hjc, Gin, SpCCE1 및 ParA를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
벡터는 임의의 매우 다양한 부위 특이적 재조합효소에 대한 하나 이상의 재조합 부위를 포함할 수 있다. 부위 특이적 재조합효소에 대한 표적 부위는 벡터, 예를 들어, 레트로바이러스 벡터 또는 렌티바이러스 벡터의 통합에 필요한 임의의 부위(들)에 추가된다는 것이 이해되어야 한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "재조합 서열", "재조합 부위" 또는 "부위-특이적 재조합 부위"는 재조합효소가 인식하고 결합하는 특정 핵산 서열을 지칭한다.
예를 들어, Cre 재조합효소에 대한 하나의 재조합 부위는 8개의 염기쌍 코어 서열에 측접하는 2개의 13개 염기쌍 역위 반복부(재조합효소 결합 부위로서 작용)를 포함하는 34개의 염기쌍 서열인 loxP이다(문헌[Sauer, B., Current Opinion in Biotechnology 5:521-527(1994)]의 도 1 참조). 다른 예시적인 loxP 부위는 lox511(Hoess et al., 1996; Bethke and Sauer, 1997), lox5171(Lee and Saito, 1998), lox2272(Lee and Saito, 1998), m2(Langer et al., 2002), lox71(Albert et al., 1995) 및 lox66(Albert et al., 1995)을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
FLP 재조합효소에 대한 적합한 인식 부위는 적합한 인식 부위는 FRT (McLeod, et al., 1996), F1, F2, F3(Schlake and Bode, 1994), F4, F5(Schlake and Bode, 1994), FRT(LE)(Senecoff et al., 1988), FRT(RE)(Senecoff et al., 1988)를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
인식 서열의 다른 예는 재조합효소 λ 인테그라제, 예를 들어, phi-c31에 의해 인식되는 attB, attP, attL, 및 attR 서열이다. φC31 SSR은 이종성 부위 attB(길이가 34 bp)와 attP(길이가 39 bp)사이에서만 재조합을 매개한다(Groth et al., 2000). 각각 박테리아 및 파지 게놈 상의 파지 인테그라제에 대한 부착 부위에 대해 명명되는 attB 및 attP는 둘 다 φC31 동종이량체에 의해 결합될 가능성이 있는 불완전한 역위 반복부를 함유한다(Groth et al., 2000). 산물 부위인 attL 및 attR은 추가적인 φC31-매개 재조합으로 효과적으로 비활성이 되어(Belteki et al., 2003), 반응을 비가역적으로 만든다. 삽입을 촉매하기 위해, attB-보유 DNA는 attP가 게놈 attB 부위 내로 삽입되는 것보다 더 용이하게 게놈 attP 부위 내로 삽입한다는 것을 발견하였다(Thyagarajan et al., 2001; Belteki et al., 2003). 따라서, 전형적인 전략은 정해진 좌위 내로 attP-보유 "도킹 부위"의 상동성 재조합에 의해 위치가 정해지며, 이는 이어서, 삽입을 위한 attB-보유 유입 서열과 짝지어진다.
본 명세서에서 사용되는, "내부 리보솜 유입 부위" 또는 "IRES"는 시스트론(단백질 암호화 영역)의 개시 코돈, 예컨대 ATG에 대한 직접 내부 리보솜 유입을 촉진시킴으로써 유전자의 캡-독립적 번역을 야기하는 요소를 지칭한다. 예를 들어, 문헌[Jackson et al., 1990. Trends Biochem Sci 15(12):477-83) 및 Jackson and Kaminski. 1995. RNA 1(10):985-1000] 참조. 특정 실시형태에서, 벡터는 하나 이상의 폴리펩타이드를 암호화하는 관심 대상의 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 특정 실시형태에서, 복수의 폴리펩타이드 각각의 효율적인 번역을 달성하기 위해, 폴리뉴클레오타이드 서열은 자기-절단성 폴리펩타이드를 암호화하는 하나 이상의 IRES 서열 또는 폴리뉴클레오타이드 서열에 의해 분리될 수 있다. 일 실시형태에서, 본 명세서에 상정된 폴리뉴클레오타이드에서 사용되는 IRES는 EMCV IRES이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "코작 서열"은 리보솜에 대한 mRNA의 초기 결합을 크게 용이하게 하고 번역을 증가시키는 짧은 뉴클레오타이드 서열을 지칭한다. 공통 코작 서열은 (GCC)RCCATGG(서열번호 75)이며, 여기서 R은 퓨린(A 또는 G)이다(Kozak, 1986. Cell. 44(2):283-92, 및 Kozak, 1987. Nucleic Acids Res. 15(20):8125-48). 특정 실시형태에서, 벡터는 공통 코작 서열을 갖고 목적하는 폴리펩타이드, 예를 들어, CAR을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다.
이종성 핵산 전사체의 효율적인 종결 및 폴리아데닐화를 지시하는 요소는 이종성 유전자 발현을 증가시킨다. 전사 종결 신호는 일반적으로 폴리아데닐화 신호의 하류에서 발견된다. 특정 실시형태에서, 벡터는 발현될 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드의 폴리아데닐화 서열 3′을 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "폴리A 부위 또는 "폴리A 서열"은 RNA 중합효소 II에 의한 초기 RNA 전사체의 종결과 폴리아데닐화를 둘 다 지시하는 DNA 서열을 의미한다. 폴리아데닐화 서열은 암호 서열의 3' 말단에 대한 폴리A 꼬리의 첨가에 의해 mRNA 안정성을 촉진시킬 수 있고, 따라서, 증가된 번역 효율에 기여한다. 절단 및 폴리아데닐화는 RNA에서 폴리(A) 서열에 의해 지시된다. 포유류 프레-mRNA에 대한 코어 폴리(A) 서열은 절단-폴리아데닐화 부위에 측접하는 2개의 인식 요소를 가진다. 전형적으로, 대부분의 비변이체 AAUAAA 헥사머는 U 또는 GU 잔기가 풍부한 더 가변적인 상류의 20 내지 50개 뉴클레오타이드에 놓인다. 초기 전사체의 절단은 이들 두 요소 사이에서 생기고, 5' 절단 생성물에 대한 250개까지의 아데노신의 첨가에 결합된다. 특정 실시형태에서, 코어 폴리(A) 서열은 이상적인 폴리A 서열(예를 들어, AATAAA, ATTAAA, AGTAAA)이다. 특정 실시형태에서, 폴리(A) 서열은 SV40 폴리A 서열, 소 성장 호르몬 폴리A 서열(BGHpA), 토끼 β-글로빈 폴리A 서열(rβgpA), 이의 변이체, 또는 당업계에 공지된 다른 적합한 이종성 또는 내인성 폴리A 서열이다.
일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드를 보유하는 세포는 직접적인 독성 및/또는 비제어 증식의 위험을 감소시키기 위해 유도성 자살 유전자를 포함하는 자살 유전자를 이용한다. 구체적 양상에서, 자살 유전자는 폴리뉴클레오타이드 또는 세포를 보유하는 숙주에 대해 면역원성이 아니다. 사용될 수 있는 자살 유전자의 특정 예는 카스파제-9 또는 카스파제-8 또는 사이토신 데아미나제이다. 카스파제-9는 이량체화(CID)의 특정 화학적 유도자를 이용하여 활성화될 수 있다.
특정 실시형태에서, 항-CD79A CAR을 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드는 비-바이러스 또는 바이러스 벡터에 의해 세포(예를 들어, 면역 효과기 세포) 내로 도입된다.
용어 "벡터"는 다른 핵산 분자를 전달하거나 또는 수송할 수 있는 핵산 분자를 지칭하기 위해 본 명세서에서 사용된다. 전달된 핵산은 일반적으로 벡터 핵산 분자에 연결되고, 예를 들어, 이에 삽입된다. 벡터는 세포 내 자율 복제를 지시하는 서열을 포함할 수 있거나, 또는 숙주 세포 DNA 내로의 통합을 허용하기에 충분한 서열을 포함할 수 있다. 특정 실시형태에서, 비바이러스 벡터는 본 명세서에 상정된 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 T 세포에 전달하는 데 사용된다. 일 실시형태에서, 벡터는 시험관내에서 합성되거나 또는 합성에 의해 제조된, 항-CD79A CAR을 암호화하는 mRNA이다.
비바이러스 벡터의 예시적 예는 mRNA, 플라스미드(예를 들어, DNA 플라스미드 또는 RNA 플라스미드), 트랜스포존, 코스미드 및 박테리아 인공 염색체를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
특정 실시형태에서 상정된 폴리뉴클레오타이드의 비바이러스 전달의 예시적 방법은 전기천공법, 초음파천공법, 리포펙션, 미량주사법, 유전자총법, 바이로좀, 리포좀, 면역리포좀, 나노입자, 다양이온 또는 지질:핵산 접합체, 네이키드 DNA, 인공 비리온, DEAE-덱스트란-매개 전달, 유전자 총 및 열-충격을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
특정 실시형태에 상정된 특정 실시형태에서 사용하기에 적합한 폴리뉴클레오타이드 전달 시스템의 예시적 예는 아막사 바이오시스템즈(Amaxa Biosystems), 맥스사이트 인코포레이티드(Maxcyte, Inc.), BTX 몰레큘러 딜리버리 시스템즈(BTX Molecular Delivery Systems) 및 코페르니쿠스 쎄라퓨틱스 인코포레이티드(Copernicus Therapeutics Inc.)에 의해 제공된 것을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 리포펙션 시약은 상업적으로 시판된다(예를 들어, 트랜스펙탐(Transfectam)(상표명) 및 리포펙틴(Lipofectin)(상표명)). 폴리뉴클레오타이드의 효율적인 수용체-인식 리포펙션에 적합한 양이온성 및 중성 지질은 문헌에 기재되어 있다. 예를 들어, 문헌[Liu et al. (2003) Gene Therapy. 10:180-187; 및 Balazs et al. (2011) Journal of Drug Delivery. 2011:1-12] 참조. 항체-표적화된, 박테리아 유래된, 살아있지 않은 나노세포-기반 전달이 또한 특정 실시형태에서 상정된다.
다양한 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드는 목적하는 폴리펩타이드를 일시적으로 발현시키기 위해 세포 내로 도입된 mRNA이다. 본 명세서에 사용된 바와 같은, "일시적"은 몇 시간, 며칠 또는 몇 주의 기간 동안의 비통합 이식유전자의 발현을 지칭하되, 게놈 내로 통합되거나 세포 내 안정한 플라스미드 레플리콘 내에 함유된다면, 발현 시간 기간은 폴리뉴클레오타이드의 발현 동안의 시간 기간 미만이다.
특정 실시형태에서, 폴리펩타이드를 암호화하는 mRNA는 시험관내 전사된 mRNA이다. 본 명세서에 사용되는 바와 같은 "시험관내 전사된 RNA"는 시험관내에서 합성된 RNA, 바람직하게는 mRNA를 지칭한다. 일반적으로, 시험관내 전사된 RNA는 시험관내 전사 벡터로부터 생성된다. 시험관내 전사 벡터는 시험관내 전사 RNA를 생성하기 위해 사용되는 주형을 포함한다.
특정 실시형태에서, mRNA는 5' 캡 또는 변형된 5' 캡 및/또는 폴리(A) 서열을 더 포함할 수 있다. 본 명세서에 사용되는 바와 같은, 5' 캡(RNA 캡, RNA 7-메틸구아노신 캡 또는 RNA m7G 캡으로도 지칭됨)은 저사 시작 직후에 진핵 전령 RNA의 "앞" 또는 5' 단부에 첨가된 변형된 구아닌 뉴클레오타이드이다. 5' 캡은 처음 전사된 뉴클레오타이드에 연결되고 리보솜에 의해 인식되며 RNases로부터 보호된 말단기를 포함한다. 캡핑 모이어티는 mRNA의 작용성, 예컨대 이의 안정성 또는 번역 효율을 조절하도록 변형될 수 있다. 특정 실시형태에서, mRNA는 약 50 내지 약 5000개의 아데닌의 폴리(A) 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, mRNA는 약 100 내지 약 1000개의 염기, 약 200 내지 약 500개의 염기, 또는 약 300 내지 약 400개의 염기의 폴리(A) 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, mRNA는 약 65개의 염기, 약 100개의 염기, 약 200개의 염기, 약 300개의 염기, 약 400개의 염기, 약 500개의 염기, 약 600개의 염기, 약 700개의 염기, 약 800개의 염기, 약 900개의 염기, 또는 약 1000개 이상의 염기의 폴리(A) 서열을 포함한다. 폴리(A) 서열은 mRNA 작용성, 예컨대 국소화, 안정성 또는 번역 효율을 조절하기 위해 화학적으로 또는 효소적으로 변형될 수 있다.
특정 실시형태에서 상정된 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 바이러스 벡터는 개개 환자에 대한 투여에 의해, 전형적으로 이하에 기재하는 바와 같이 전신 투여(예를 들어, 정맥내, 복강내, 근육내, 피하 또는 두개내 주입) 또는 국소 적용에 의해 생체내로 전달될 수 있다. 대안적으로, 벡터는 생체외 세포, 예컨대 개개 환자로부터 외식된 세포(예를 들어, 동원된(mobilized) 말초 혈액, 림프구, 골수 흡입물, 조직 생검 등) 또는 보편적 공여자 조혈 세포 세포에 전달될 수 있고, 다음에 환자 내로 세포의 재이식이 이어진다.
일 실시형태에서, 항-CD79A CAR을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 바이러스 벡터는 생체내 세포의 형질도입을 위해 유기체 내로 직접적으로 투여된다. 대안적으로, 네이키드 DNA가 투여될 수 있다. 투여는 주사, 주입, 국소 적용 및 전기천공법을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 혈액 또는 조직 세포와의 궁극적 접촉으로 분자를 도입하기 위해 정상적으로 사용되는 임의의 경로에 의한다. 특정 조성물을 투여하기 위해 하나 초과의 경로가 사용될 수 있지만, 이러한 핵산을 투여하는 적합한 방법은 당업계에서 이용되고 잘 공지되어 있으며, 특정 경로는 종종 다른 경로보다 더 즉각적이고 더 효과적인 반응을 제공할 수 있다.
본 명세서에 상정된 특정 실시형태에서 사용하기에 적합한 바이러스 벡터 시스템의 예시적 예는 아데노-연관 바이러스(AAV), 레트로바이러스, 단순 포진 바이러스, 아데노바이러스 및 백시니아 바이러스 벡터를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
다양한 실시형태에서, 항-CD79A CAR을 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 아데노-연관 바이러스(rAAV)를 이용하여 세포를 형질도입함으로써 면역 효과기 세포, 예를 들어, T 세포 내로 도입된다.
AAV는 작은(대략 26㎚) 복제-결함의, 주로 에피솜, 비외피 바이러스이다. AAV는 분할세포와 비분할 세포를 둘 다 감염시킬 수 있고, 숙주 세포 내로 그의 게놈을 혼입시킬 수 있다. 재조합 AAV(rAAV)는 전형적으로 최소, 이식유전자 및 그의 조절 서열, 및 5' 및 3' AAV 역위 말단 반복부(ITR)로 구성된다. ITR 서열은 길이가 약 145bp이다. 특정 실시형태에서, rAAV는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9 또는 AAV10로부터 단리된 IRT 및 캡시드 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 키메라 rAAV가 사용되며, ITR 서열은 하나의 AAV 혈청형으로부터 단리되고, 캡시드 서열은 상이한 AAV 혈청형으로부터 단리된다. 예를 들어, AAV2로부터 유래된 ITR 서열 및 AAV6로부터 유래된 캡시드 서열을 갖는 rAAV은 AAV2/AAV6로서 지칭된다. 특정 실시형태에서, rAAV 벡터는 AAV2로부터의 ITR, 및 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9 또는 AAV10 중 어느 하나로부터의 캡시드 단백질을 포함할 수 있다. 바람직한 실시형태에서, rAAV는 AAV2로부터 유래된 ITR 서열 및 AAV6로부터 유래된 캡시드 서열을 포함한다. 바람직한 실시형태에서, rAAV는 AAV2로부터 유래된 ITR 서열 및 AAV2로부터 유래된 캡시드 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 조작 및 선택 방법은 관심 대상의 세포를 형질도입할 가능성을 더 만들기 위해 AAV 캡시드에 적용될 수 있다.
rAAV 벡터의 구성, 이의 생산 및 정제는, 예를 들어, 미국 특허 제9,169,494호; 제9,169,492호; 제9,012,224호; 제8,889,641호; 제8,809,058호; 및 제8,784,799호에 개시되어 있으며, 이들 각각은 본 명세서에 그의 전문이 참고로 포함된다.
다양한 실시형태에서, 항-CD79A CAR을 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드는 레트로바이러스, 예를 들어, 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 렌티바이러스를 이용하여 세포를 형질도입함으로써 면역 효과기 세포 내로 도입된다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "레트로바이러스"는 그의 게놈 RNA를 선형 이중 가닥 DNA 복제물로 역전사시키고, 후속적으로 그의 게놈 DNA를 숙주 게놈 내로 공유적으로 통합시키는 RNA 바이러스를 지칭한다. 특정 실시형태에서 사용하기에 적합한 예시적인 레트로바이러스는 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스(M-MuLV), 몰로니 뮤린 육종 바이러스(MoMSV), 하비 뮤린 육종 바이러스(HaMuSV), 뮤린 유방 종양 바이러스(MuMTV), 깁본 유인원 백혈병 바이러스(GaLV), 고양이 백혈병 바이러스(FLV), 스푸마바이러스, 프렌드 뮤린 백혈병 바이러스, 뮤린 줄기 세포 바이러스(MSCV) 및 라우스 육종 바이러스(RSV) 및 렌티바이러스를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "렌티바이러스"는 복잡한 레트로바이러스의 군(또는 속)을 지칭한다. 예시적인 렌티바이러스는 HIV(인간 면역결핍 바이러스; HIV 1형, 및 HIV 2형을 포함); 비스나-메디 바이러스(VMV) 바이러스; 염소 관절염-뇌염바이러스(CAEV); 마 전염성 빈혈 바이러스(EIAV); 고양이 면역결핍 바이러스(FIV); 소 면역 결핍 바이러스(BIV); 및 시미안 면역결핍 바이러스(SIV)를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 일 실시형태에서, HIV 기반 벡터 골격(즉, HIV 시스-작용성 서열 요소)이 바람직하다.
다양한 실시형태에서, 본 명세서에 상정된 렌티바이러스 벡터는 하나 이상의 LTR, 및 다음의 부속 요소: cPPT/FLAP, 프사이(Ψ) 패키징 신호, 유출 요소, 폴리(A) 서열 중 하나 이상 또는 모두를 포함하고, 선택적으로 본 명세서의 다른 곳에 논의된 바와 같이 WPRE 또는 HPRE, 절연체 요소, 선택 가능한 마커, 및 세포 자살 유전자를 포함할 수 있다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에 상정된 렌티바이러스 벡터는 통합적 또는 비통합적 또는 통합 결함 렌티바이러스일 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "통합 결함 렌티바이러스" 또는 "IDLV"는 숙주 세포의 게놈 내로 바이러스 게놈을 통합하는 능력을 결여하는 인테그라제를 갖는 렌티바이러스를 지칭한다. 통합-부적격 바이러스 벡터는 본 명세서에 전문이 참고로 포함된 특허 출원 WO 2006/010834에 기재되어 있다.
인테그라제 활성을 감소시키는 데 적합한 HIV-1 pol 유전자에서의 예시적인 돌연변이는 H12N, H12C, H16C, H16V, S81 R, D41A, K42A, H51A, Q53C, D55V, D64E, D64V, E69A, K71A, E85A, E87A, D116N, D1161, D116A, N120G, N1201, N120E, E152G, E152A, D35E, K156E, K156A, E157A, K159E, K159A, K160A, R166A, D167A, E170A, H171A, K173A, K186Q, K186T, K188T, E198A, R199c, R199T, R199A, D202A, K211A, Q214L, Q216L, Q221 L, W235F, W235E, K236S, K236A, K246A, G247W, D253A, R262A, R263A 및 K264H를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
일 실시형태에서, HIV-1 인테그라제 결여 pol 유전자는 D64V, D116I, D116A, E152G 또는 E152A 돌연변이; D64V, D116I 및 E152G 돌연변이; 또는 D64V, D116A 및 E152A 돌연변이를 포함한다.
일 실시형태에서, HIV-1 인테그라제 결여 pol 유전자는 D64V 돌연변이를 포함한다.
용어 "긴 말단 반복부(LTR)"는 그들의 천연 서열과 관련하여, 반복을 지시하고 U3, R 및 U5 영역을 함유하는 레트로바이러스 DNA의 말단에 위치된 염기쌍의 도메인을 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "FLAP 요소" 또는 "cPPT/FLAP"는 서열이 레트로바이러스, 예를 들어, HIV-1 또는 HIV-2의 중심 폴리퓨린관 및 중심 종결 서열(cPPT 및 CTS)을 포함하는 핵산을 지칭한다. 적합한 FLAP 요소는 미국 특허 제6,682,907호에 그리고 문헌[Zennou, et al., 2000, Cell, 101:173]에 기재되어 있다. 다른 실시형태에서, 렌티바이러스 벡터는 cPPT 및/또는 CTS 요소에서 하나 이상의 돌연변이를 갖는 FLAP 요소를 함유한다. 또 다른 실시형태에서, 렌티바이러스 벡터는 cPPT 또는 CTS 요소 중 하나를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 렌티바이러스 벡터는 cPPT 또는 CTS 요소를 포함하지 않는다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "패키징 신호" 또는 "패키징 서열"은 바이러스 캡시드 또는 입자 내로의 바이러스 RNA의 삽입에 필요한 레트로바이러스 게놈 내에 위치된 싸이[Ψ] 서열을 지칭한다, 예를 들어, 문헌[Clever et al., 1995. J. of Virology, Vol. 69, No. 4; pp. 2101-2109] 참조.
용어 "유출 요소"는 세포의 핵으로부터 세포질까지 RNA 전사체의 수송을 조절하는 시스-작용성 전사후 조절 요소를 지칭한다. RNA 유출 요소의 예는 인간 면역결핍 바이러스(HIV) rev 반응 요소(RRE)(예를 들어, 문헌[Cullen et al., 1991. J. Virol. 65: 1053; 및 Cullen et al., 1991. Cell 58: 423] 참조), 및 B형 간염 바이러스 전사후 조절 요소(HPRE)를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
특정 실시형태에서, 바이러스 벡터 내 이종성 서열의 발현은 전사후 조절 요소, 효율적인 폴리아데닐화 부위, 및 선택적으로, 전사 종결 신호를 벡터 내로 혼입함으로써 증가된다. 다양한 전사후 조절 요소, 예를 들어, 마멋 간염 바이러스 전사후 조절 요소(WPRE; Zufferey et al., 1999, J. Virol., 73:2886); B형 간염 바이러스에 존재하는 전사후 조절 요소(HPRE)(Huang et al., Mol. Cell. Biol., 5:3864); 등(Liu et al., 1995, Genes Dev., 9:1766)은 단백질에서 이종성 핵산의 발현을 증가시킬 수 있다.
렌티바이러스 벡터는 바람직하게는 LTR을 변형시키는 결과로서 몇몇 안전한 향상을 함유한다. "자기-비활성화"(SIN) 벡터는 복제-결함 벡터, 예를 들어, 이때 U3 영역으로서 알려진 우측(3') LTR 인핸서-프로모터 영역은 바이러스 복제의 제1 라운드 이후의 바이러스 전사를 방지하기 위해 (예를 들어, 결실 또는 치환에 의해) 변형되었다. 추가적인 안전성 향상은 바이러스 입자의 생산 동안 바이러스 게놈의 전사를 유도하기 위해 5' LTR의 U3 영역을 이종성 프로모터로 대체함으로써 제공된다. 사용될 수 있는 이종성 프로모터의 예는, 예를 들어, 바이러스 유인원 바이러스 40(SV40)(예를 들어, 초기 또는 후기), 거대세포바이러스(CMV)(예를 들어, 급초기), 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스(MoMLV), 라우스 육종 바이러스(RSV) 및 단순 포진 바이러스(HSV)(티미딘 키나제) 프로모터를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "위형" 또는 "위형화(pseudotyping)"는 바람직한 특징을 갖는 다른 바이러스의 외피 단백질로 치환된 바이러스 외피 단백질을 갖는 바이러스를 지칭한다. 예를 들어, HIV 외피 단백질(env 유전자에 의해 암호화)이 정상적으로는 바이러스를 CD4+ 제시 세포로 표적화하기 때문에, HIV가 매우 다양한 세포를 감염시키도록 허용하는 수포성 구내염 바이러스 G-단백질(VSV-G) 외피 단백질에 의해 HIV는 위형화될 수 있다.
특정 실시형태에서, 렌티바이러스 벡터는 공지된 방법에 따라 생산된다. 예를 들어, 문헌[Kutner et al., BMC Biotechnol. 2009;9:10. doi: 10.1186/1472-6750-9-10; Kutner et al. Nat. Protoc. 2009;4(4):495-505. doi: 10.1038/nprot.2009.22] 참조.
본 명세서에 상정된 특정 구체적 실시형태에 따르면, 대부분의 또는 모든 바이러스 벡터 골격 서열은 렌티바이러스, 예를 들어, HIV-1로부터 유래된다. 그러나, 레트로바이러스 및/또는 렌티바이러스 서열의 다수의 상이한 공급원이 사용되거나 또는 조합될 수 있고, 특정 렌티바이러스 서열의 수많은 치환 및 변경은 본 명세서에 기재된 기능을 수행하는 전달 벡터의 능력을 손상시키는 일 없이 수용될 수 있다는 것이 이해되어야 한다. 게다가, 다양한 렌티바이러스 벡터는 당업계에 공지되어 있으며(문헌[Naldini et al., (1996a, 1996b 및 1998); Zufferey et al., (1997); Dull et al., 1998, 미국 특허 제6,013,516호; 및 제5,994,136호 참조), 이들 중 다수는 본 명세서에 상정된 바이러스 벡터 또는 전달 플라스미드를 생산하기에 적합할 수 있다.
다양한 실시형태에서, 항-CD79A CAR을 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 아데노바이러스를 이용하여 세포를 형질도입함으로써 면역 효과기 세포 내로 도입된다.
아데노바이러스 기반 벡터는 다수의 세포 유형에서 매우 높은 형질도입 효율 능력이 있으며, 세포 분할을 필요로 하지 않는다. 이러한 벡터에 의해, 고역가 및 고수준의 발현이 얻어졌다. 이 벡터는 상대적으로 단순한 시스템에서 다량으로 생산될 수 있다. 이식유전자가 Ad E1a, E1b 및/또는 E3 유전자를 대체하고; 후속적으로 복제 결함 벡터가 도중에 결실된 유전자 기능을 공급하는 인간 293 세포에서 증식되도록 대부분의 아데노바이러스 벡터는 조작된다. Ad 벡터는 비분할, 분화 세포, 예컨대 간, 신장 및 근육에서 발견되는 것을 포함하는 생체내 다중 유형의 조직을 형질도입할 수 있다. 통상적인 Ad 벡터는 큰 운반 능력을 가진다.
복제 결여인 현재의 아데노바이러스 벡터의 생성 및 증식은 293으로 표기되는 독특한 헬퍼 세포주를 이용할 수 있는데, 이는 Ad5 DNA 단편에 의해 인간 배아 신장 세포로부터 형질전환되고, E1 댄백질을 구성적으로 발현시킨다(Graham et al., 1977). E3 영역은 아데노바이러스 게놈으로부터 필요 없기 때문에(Jones & Shenk, 1978), 293 세포의 도움으로 본 아데노바이러스 벡터는 E1, D3 중 하나 또는 영역 둘 다에서 외래 DNA를 운반한다(Graham & Prevec, 1991). 아데노바이러스 벡터는 진핵 유전자 발현(Levrero et al., 1991; Gomez-Foix et al., 1992) 및 백신 개발에서 사용되었다(Grunhaus & Horwitz, 1992; Graham & Prevec, 1992). 상이한 조직에 재조합 아데노바이러스를 투여하는 연구는 기관 점적(Rosenfeld et al., 1991; Rosenfeld et al., 1992), 근육 주사(Ragot et al., 1993), 말초 정맥내 주사(Herz & Gerard, 1993) 및 뇌 내로의 정위 접종(Le Gal La Salle et al., 1993)을 포함한다. 임상 시험에서 Ad 벡터사용의 예는 근육내 주사에 의한 항종양 면역화를 위한 폴리뉴클레오타이드 요법을 수반하였다(Sterman et al., Hum. Gene Ther. 7:1083-9 (1998)).
다양한 실시형태에서, 항-CD79A CAR을 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 단순 포진 바이러스, 예를 들어, HSV-1, HSV-2를 이용하여 세포를 형질도입함으로써 면역 효과기 세포 내로 도입된다.
성숙 HSV 비리온은 152kb인 선형 이중 가닥 DNA 분자로 이루어진 바이러스 게놈과 함께 외피 이십면체 캡시드로 이루어진다. 일 실시형태에서, HSV 기반 바이러스 벡터는 하나 이상의 필수 또는 비필수 HSV 유전자에서 결여된다. 일 실시형태에서, HSV 기반 바이러스 벡터는 복제 결여이다. 대부분의 복제 결여 HSV 벡터는 복제를 방지하기 위해 하나 이상의 급초기, 초기 또는 후기 HSV 유전자를 제거하는 결실을 함유한다. 예를 들어, HSV 벡터는 ICP4, ICP22, ICP27, ICP47 및 이들의 조합물로 이루어진 군으로부터 선택된 급초기 유전자가 결여될 수 있다. HSV 벡터의 이점은 장기간 DNA 발현을 초래할 수 있는 잠복기로 유입되는 그의 능력 및 25kB까지의 외인성 DNA 삽입물을 수용할 수 있는 그의 거대 바이러스 DNA 게놈이다. HSV-기반 벡터는, 예를 들어, 미국 특허 제5,837,532호, 제5,846,782호 및 제5,804,413호 및 국제 특허 출원 WO 91/02788, WO 96/04394, WO 98/15637 및 WO 99/06583에 기재되어 있고, 이들 각각은 그의 전문이 본 명세서에 참고로 포함된다.
F.
유전자 변형된 세포
다양한 실시형태에서, 암 치료에서 사용하기 위한 본 명세서에 상정된 CAR을 발현하기 위해 유전자 변형된 세포가 제공된다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "유전자 조작된" 또는 "유전자 변형된"은 세포 내 총 유전자 물질 내로의 DNA 또는 RNA 형태의 유전자 외 물질의 첨가를 지칭한다. 용어 "유전자 변형된 세포", "변형된 세포" 및 "전향된 세포"는 상호 호환적으로 사용된다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "유전자 요법"은 치료적 폴리펩타이드, 예를 들어, CAR을 발현시키는 목적을 위한, 또는 유전자 발현을 회복하거나, 수정하거나 변형시키는 세포에서 총 유전자 물질 내로의 DNA 또는 RNA 형태로 유전자 외 물질의 도입을 지칭한다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에 상정된 항-CD79A CAR은 관심 대상의 표적 항원, 예를 들어, CD79A 폴리펩타이드에 대한 이들의 특이성을 전향시키기 위해 면역 효과기 세포에서 도입되고, 발현된다. "면역 효과기 세포"는 하나 이상의 효과기 기능(예를 들어, 세포독성 세포 사멸 활성, 사이토카인의 분비, ADCC 및/또는 CDC의 유도)을 갖는 면역계의 임의의 세포이다. 본 명세서에 상정된 예시적인 면역 효과기 세포는 세포독성 T 세포(CTL; CD8+ T 세포), TIL 및 헬퍼 T 세포(HTL; CD4+ T 세포)를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는, T 림프구이다. 특정 실시형태에서, 세포는 αβ T 세포를 포함한다. 특정 실시형태에서, 세포는 γδ T 세포를 포함한다. 일 실시형태에서, 면역 효과기 세포는 자연 살해(NK) 세포를 포함한다. 일 실시형태에서, 면역 효과기 세는 자연 살해 T(NKT) 세포를 포함한다.
면역 효과기 세포는 자가/자율("자기") 또는 비-자가("비-자기", 예를 들어, 동종이계, 동계 또는 이종성)일 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 "자가"는 동일한 대상체로부터의 세포를 지칭한다. 본 명세서에 사용되는 "동종이계"는 비교하는 세포와 유전적으로 상이한 동일한 종의 세포를 지칭한다. 본 명세서에서 사용되는 "동계"는 비교하는 세포와 유전적으로 동일한 상이한 대상체의 세포를 지칭한다. 본 명세서에서 사용되는 "이종성"은 비교하는 세포와 상이한 종의 세포를 지칭한다. 바람직한 실시형태에서, 세포는 동종이계이다.
특정 실시형태에 상정된 항-CD79A CAR과 함께 사용되는 예시적인 면역 효과기 세포는 T 림프구를 포함한다. 용어 "T 세포" 또는 "T 림프구"는 당업계에 인식되고, 흉선세포, 미숙 T 림프구, 성숙 T 림프구, 휴지 T 림프구 또는 활성화된 T 림프구를 포함하는 것으로 의도된다. T 세포는 T 헬퍼(Th) 세포, 예를 들어 T 헬퍼 1(Th1) 또는 T 헬퍼 2(Th2) 세포일 수 있다. T 세포는 헬퍼 T 세포(HTL; CD4+ T 세포) CD4+ T 세포, 세포독성 T 세포(CTL; CD8+ T 세포), CD4+CD8+ T 세포, CD4-CD8- T 세포, 또는 T 세포의 임의의 다른 서브세트일 수 있다. 특정 실시형태에서 사용하기에 적합한 T 세포의 다른 예시적 집단은 미경험() T 세포(TN), T 기억 줄기 세포(TSCM), 중심 기억 T 세포(TCM), 효과기 기억 T 세포(TEM), 및 효과기 T 세포(TEFF)를 포함한다.
당업자에 의해 이해될 바와 같이, 다른 세포는 또한 본 명세서에 상정된 바와 같은 항-CD79A CAR과 함께 면역 효과기 세포로서 사용될 수 있다. 특히, 면역 효과기 세포는 또한 NK 세포, NKT 세포, 호중구 및 대식세포를 포함한다. 면역 효과기 세포는 또한 효과기 세포의 전구체를 포함하되, 이러한 전구체 세포는 생체내 또는 시험관내 면역 효과기 세포로 분화되도록 유도될 수 있다. 따라서, 특정 실시형태에서, 면역 효과기 세포는 대상체에서 투여 시 성숙 면역 효과기 세포로 분화되거나, 또는 시험관내에서 성숙 면역 효과기 세포로 분화되도록 유도될 수 있는 제대혈, 골수 또는 이동된 말초 혈액으로부터 유래된 세포의 CD34+ 집단 내에 함유된 조혈 줄기 세포(HSC)와 같은 면역 효과기 세포의 전구체를 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은, CD79A-특이적 CAR을 함유하도록 유전자 조작된 면역 효과기 세포는 "CD79A-특이적 전향된 면역 효과기 세포"로서 지칭될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "CD34+ 세포"는 그의 세포 표면 상에서 CD34 단백질을 발현시키는 세포를 지칭한다. 본 명세서에서 사용되는 "CD34"는 종종 세포-세포 접착 인자로서 작용하고 림프절 내로의 T 세포 유입에 연루된 세포 표면 당단백질(예를 들어, 시알로뮤신 단백질)을 지칭한다. CD34+ 세포 집단은 환자에게 투여 시 T 세포, NK 세포, NKT 세포, 호중구 및 단핵/대식세포 계통의 세포를 포함하는 모든 조혈 계통으로 분화되고 이에 기여하는 조혈 줄기 세포(HSC)를 함유한다.
특정 실시형태에서 항-CD79A 본 명세서에 상정된 CAR을 발현시키는 면역 효과기 세포의 제조 방법이 제공된다. 일 실시형태에서, 상기 방법은 면역 효과기 세포가 본 명세서에 상정된 하나 이상의 항-CD79A CAR을 발현시키도록 개체로부터 단리된 면역 효과기 세포를 형질감염시키거나 형질도입하는 단계를 포함한다. 특정 실시형태에서, 면역 효과기 세포는 개체로부터 단리되고 시험관내 추가 조작 없이 유전자 변형된다. 이어서, 이러한 세포는 개체에게 직접 재투여될 수 있다. 추가적 실시형태에서, 면역 효과기 세포는 처음 활성화되고, 항-CD79A CAR을 발현시키기 위해 유전자 변형되기 전에 시험관내에서 증식되도록 자극된다. 이와 관련하여, 면역 효과기 세포는 유전자 변형되기(즉, 항-CD79A 본 명세서에 상정된 CAR을 발현시키기 위해 형질도입되거나 형질감염되기) 전에 그리고/또는 후에 배양될 수 있다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 면역 효과기 세포의 시험관내 조작 또는 유전자 변형 전에, 세포의 공급원은 대상체로부터 얻어진다. 특정 실시형태에서, CAR-변형된 면역 효과기 세포는 T 세포를 포함한다.
특정 실시형태에서, PBMC는 본 명세서에 상정된 방법을 이용하여 항-CD79A CAR을 발현시키기 위해 직접적으로 유전자 변형될 수 있다. 특정 실시형태에서, PBMC의 단리 후에, T 림프구는 추가로 단리되고, 특정 실시형태에서, 세포독성 림프구와 헬퍼 T 림프구는 둘 다 유전자 변형 및/또는 확장 전에 또는 후에 미경험, 기억 및 효과기 T 세포 하위집단으로 분류될 수 있다.
면역 효과기 세포, 예컨대 T 세포는 공지된 방법을 이용하여 단리 후에 유전자 변형될 수 있거나, 면역 효과기 세포는 유전자 변형되기 전에 시험관내에서 활성화되거나 확장될 수 있다(또는 조상세포의 경우에 분화될 수 있다). 특정 실시형태에서, 면역 효과기 세포, 예컨대 T 세포는 본 명세서에 상정된 키메라 항원 수용체에 의해 유전자 변형되고(예를 들어, 항-CD79A CAR을 암호화하는 핵산을 포함하는 바이러스 벡터에 의해 형질도입되고), 이어서, 시험관내에서 활성화되고 확장된다. 다양한 실시형태에서, T 세포는, 예를 들어, 미국 특허 제6,352,694호; 제6,534,055호; 제6,905,680호; 제6,692,964호; 제5,858,358호; 제6,887,466호; 제6,905,681호; 제7,144,575호; 제7,067,318호; 제7,172,869호; 제7,232,566호; 제7,175,843호; 제5,883,223호; 제6,905,874호; 제6,797,514호; 제6,867,041호; 및 미국 특허 출원 공개 제20060121005호에 기재된 방법을 이용하여 CAR을 발현시키기 위한 유전자 변형 전에 또는 후에 활성화되고 확장될 수 있다.
일 실시형태에서, CD34+ 세포는 본 명세서에 상정된 핵산 작제물에 의해 형질도입된다. 특정 실시형태에서, 형질도입된 CD34+ 세포는 대상체, 즉, 일반적으로 세포가 본래 단리된 대상체 내로의 투여 후 생체내에서 성숙 면역 효과기 세포로 분화한다. 다른 실시형태에서, CD34+ 세포는 다음의 사이토카인 중 하나 이상에 의해, 본 명세서에 기재된 바와 같은 CAR에 대한 노출 전에 또는 이에 의해 유전자 변형된 후에 시험관 내에서 자극될 수 있다: Flt-3 리간드(FLT3), 줄기 세포 인자(SCF), 거핵세포 성장 및 분화 인자(TPO), 앞서 기재한 방법에 따른 IL-3 및 IL-6(Asheuer et al., 2004; Imren, et al., 2004).
특정 실시형태에서, 암 치료를 위한 변형된 면역 효과기 세포의 집단은 본 명세서에 상정된 바와 같은 CAR을 포함한다. 예를 들어, 변형된 면역 효과기 세포 집단은 본 명세서에 기재된 B 세포 악성종양으로 진단된 환자(자가 공여자)로부터 얻은 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)로부터 제조된다. PBMC는 CD4+, CD8+, 또는 CD4+ 및 CD8+일 수 있는 T 림프구의 이종 집단을 형성한다.
PBMC는 또한 다른 세포독성 림프구, 예컨대 NK 세포 또는 NKT 세포를 포함할 수 있다. 특정 실시형태에서 상정된 CAR의 암호 서열을 운반하는 발현 벡터는 인간 공여자 T 세포, NK 세포 또는 NKT 세포 집단 내로 도입된다. 특정 실시형태에서, 발현 벡터를 운반하는 성공적으로 형질도입된 T 세포는 CD3 양성 T 세포를 단리시키기 위해 유세포 분석을 이용하여 분류될 수 있고, 항-CD3 항체 및 또는 항-CD28 항체 및 IL-2 또는 본 명세서의 다른 곳에 기재된 바와 같은 당업계에 공지된 임의의 다른 방법을 이용하여 세포 활성화에 추가로 T 세포를 발현시키는 이들 CAR 단백질의 수를 증가시키도록 추가로 증식될 수 있다. 인간 대상체에서의 사용을 위한 저장 및/또는 제조를 위해 CAR 단백질 T 세포를 발현시키는 T 세포의 동결보존을 위해 표준 절차가 사용된다. 일 실시형태에서, T 세포의 시험관내 형질도입, 배양 및/또는 확장은 비인간 동물 유래 산물, 예컨대 송아지 태아 혈청 및 소 태아 혈청의 부재 하에 수행된다. PBMC의 이종 집단은 유전자 변형되기 때문에, 얻어진 형질도입 세포는 본 명세서에 상정된 바와 같은 항-CD79A CAR을 포함하는 변형된 세포의 이종 집단이다.
추가 실시형태에서, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5개 이상의 상이한 발현 벡터의 혼합물은 면역 효과기 세포의 공여자 집단을 유전자 변형시키는 데 사용될 수 있되, 각각의 벡터는 본 명세서에 상정된 바와 상이한 키메라 항원 수용체 단백질을 암호화한다. 얻어진 변형된 면역 효과기 세포는 변형된 세포의 혼합 집단을 형성하고, 변형된 세포의 집단은 1종 초과의 상이한 CAR 단백질을 발현시킨다.
G.
T 세포 제조 방법
다양한 실시형태에서, 유전자 변형된 T 세포는 CD3 TCR 복합체 연관 신호를 자극하는 제제 및 T 세포 표면 상의 공자극 분자를 자극하는 리간드와의 접촉에 의해 확장된다.
특정 실시형태에서, PBMC 또는 단리된 T 세포는 적절한 사이토카인, 예컨대 IL-2, IL-7 및/또는 IL-15를 갖는 배양 배지에서 자극제 및 공자극제, 예컨대 가용성 항-CD3 및 항-CD28 항체, 또는 비드 또는 다른 표면에 부착된 항체와 접촉된다.
특정 실시형태에서, PBMC 또는 단리된 T 세포는 적절한 사이토카인, 예컨대 IL-2, IL-7 및/또는 IL-15 및/또는 PI3K/Akt/mTOR 세포 신호전달 경로를 조절하는 1종 이상의 제제를 갖는 배양 배지에서 자극제 및 공자극제, 예컨대 가용성 항-CD3 및 항-CD28 항체, 또는 비드 또는 다른 표면에 부착된 항체와 접촉된다.
바람직한 실시형태에서, 본 명세서에 상정된 방법에 의해 제조된 T 세포는 개선된 입양 면역요법 조성물을 제공한다. 임의의 특정 이론으로 구속되는 일 없이, 본 명세서에 상정된 특정 실시형태의 방법에 의해 제조된 T 세포 조성물은 생체내 분화 및 지속성의 상대적 부재 하에 증가된 생존, 확장을 포함하는 우수한 특성을 갖는 것으로 여겨진다. 일 실시형태에서, T 세포의 제조 방법은 세포를 PI3K 세포 신호전달 경로를 조절하는 1종 이상의 제제와 접촉시키는 단계를 포함한다. 일 실시형태에서, T 세포의 제조 방법은 세포를 PI3K/Akt/mTOR 세포 신호전달 경로를 조절하는 1종 이상의 제제와 접촉시키는 단계를 포함한다. 다양한 실시형태에서, T 세포는 임의의 공급원으로부터 얻을 수 있고, 제조 공정의 활성화 및/또는 확장기 동안에 세포와 접촉될 수 있다. 얻어진 T 세포 조성물은 다음의 생체마커 중 하나 이상을 증식 및 발현시키는 능력을 갖는 발생적으로 강한 T 세포에 풍부하다: CD62L, CCR7, CD28, CD27, CD122, CD127, CD197, CD38 및 CD8. 일 실시형태에서, 1종 이상의 PI3K 저해제로 처리된, T 세포를 포함하는 세포 집단은 다음의 생체마커 중 하나 이상 또는 모두를 공동발현시키는 CD8+ T 세포 집단이 풍부하다: CD62L, CD127, CD197 및 CD38.
일 실시형태에서, 1종 이상의 PI3K 저해제로 처리된, T 세포를 포함하는 세포 집단은 다음의 생체마커 중 하나 이상 또는 모두를 공동 발현시키는 CD8+ T 세포 집단이 풍부하다: CD62L, CD127, CD27 및 CD8.
일 실시형태에서, 유지되는 수준의 증식 및 감소된 분화를 포함하는 변화된 T 세포가 제조된다. 특정 실시형태에서, T 세포는 하나 이상의 자극 신호 및 PI3K 세포 신호전달 경로의 저해제인 제제의 존재 하에 T 세포가 활성화되고 증식되도록 자극함으로써 제조된다.
이어서, T 세포는 항-CD79A CAR을 발현시키도록 변형될 수 있다. 일 실시형태에서, T 세포는 항-CD79A 본 명세서에 상정된 CAR을 포함하는 바이러스 벡터와 함께 T 세포를 형질도입함으로써 변형된다. 특정 실시형태에서, T 세포는 PI3K 세포 신호전달 경로 저해제의 존재 하에 자극 및 활성화 전에 변형된다. 다른 실시형태에서, T 세포는 PI3K 세포 신호전달 경로 저해제의 존재 하에 자극 및 활성화 후에 변형된다. 특정 실시형태에서, T 세포는 PI3K 세포 신호전달 경로 저해제의 존재 하에 자극의 12시간, 24시간, 36시간 또는 48시간 이내에 변형된다.
T 세포가 활성화된 후에, 세포는 증식을 위해 배양된다. T 세포는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10회 이상의 확장 라운드로 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7일, 적어도 2주, 적어도 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개월 이상 동안 배양될 수 있다.
다양한 실시형태에서, T 세포 조성물은 PI3K/Akt/mTOR 세포 신호전달 경로의 1종 이상의 저해제의 존재 하에 제조된다. 저해제는 경로 또는 단일 활성에서 하나 이상의 활성을 표적화할 수 있다. 임의의 특정 이론으로 구속되는 일 없이, 제조 공정의 자극, 활성화, 및/또는 확장기 동안 PI3K 경로의 1종 이상의 저해제에 의한 처리 또는 이와 T 세포를 접촉시키는 것은 어린(young) T 세포를 우선적으로 증가시킴으로써, 우수한 치료적 T 세포 조성물을 생성하는 것으로 상정된다.
특정 실시형태에서, 조작된 T 세포 수용체를 발현시키는 T 세포의 증식을 증가시키는 방법이 제공된다. 이러한 방법은, 예를 들어, 대상체로부터 T 세포 공급원을 채취하는 단계, PI3K 경로의 1종 이상의 저해제의 존재 하에 T 세포를 자극 및 활성화시키는 단계, T 세포를 변형시켜 항-CD79A CAR을 발현시키는 단계, 및 배양물에서 T 세포를 확장시키는 단계를 포함할 수 있다.
특정 실시형태에서, 다음의 생체마커 중 하나 이상의 발현을 위해 T 세포가 풍부한 집단을 생성하는 방법이 상정된다: CD62L, CCR7, CD28, CD27, CD122, CD127, CD197, CD38 및 CD8. 일 실시형태에서, 어린 T 세포는 다음의 생물학적 마커 중 하나 이상 또는 모두를 포함한다: CD62L, CD127, CD197 및 CD38.
일 실시형태에서, 어린 T 세포는 다음의 생물학적 마커 중 하나 이상 또는 모두를 포함한다: CD62L, CD127, CD27 및 CD8.
일 실시형태에서, CD57, CD244, CD160, PD-1, CTLA4, TIM3 및 LAG3의 발현을 결여하는 어린 T 세포가 제공된다. 본 명세서의 다른 곳에 논의되는 바와 같이, 어린 T 세포 생체마커의 발현 수준은 더 분화된 T 세포 또는 면역 효과기 세포 집단에서 이러한 마커의 발현 수준에 대한 것이다.
일 실시형태에서, 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)는 본 명세서에 상정된 T 세포 제조 방법에서 T 세포의 공급원으로서 사용된다. PBMC는 CD4+, CD8+ 또는 CD4+ 및 CD8+일 수 있는 T 림프구의 이종 집단을 형성하며, 다른 단핵 세포, 예컨대 단핵구, B 세포, NK 세포 및 NKT 세포를 포함할 수 있다. 특정 실시형태에서 상정된 조작된 TCR 또는 CAR을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터는 인간 공여자 T 세포, NK 세포 또는 NKT 세포의 집단 내로 도입된다. 특정 실시형태에서, 발현 벡터를 운반하는 성공적으로 형질도입된 T 세포는 CD3 양성 T 세포를 단리시키기 위해 유세포분석을 이용하여 분류될 수 있고, 이어서, 항-CD3 항체 및 또는 항-CD28 항체 및 IL-2, IL-7, 및/또는 IL-15를 이용하여 세포 활성화에 추가로 변형된 T 세포 수를 증가시키도록 추가로 증식된다.
본 명세서에 상정된 제조 방법은 저장을 위한 변형된 T 세포의 저온보존 및/또는 인간 대상체에서의 사용을 위한 제조를 추가로 포함할 수 있다. 일 실시형태에서, CD79A 발현 세포를 표적화하는 면역 효과기 세포를 발현시키는 유전자 변형된 뮤린, 인간 또는 인간화된 CAR 단백질을 저장하는 방법은, 해동 시 세포가 생존한 채로 남아있도록 면역 효과기 세포를 동결보존하는 단계를 포함한다. CAR 단백질을 발현시키는 면역 효과기 세포의 분획은 CD79A 발현 암 세포로 고통받는 환자의 장래의 치료를 위해 이러한 세포의 영구한 공급원을 제공하기 위해 당업계에 공지된 방법에 의해 저온보존될 수 있다. 해동 시 세포가 생존한 채로 남아있도록, T 세포는 저온보존된다. 필요한 경우, 저온보존된 형질전환 면역 효과기 세포는 해동될 수 있으며, 더 많은 이러한 세포를 위해 성장 및 확장될 수 있다. 본 명세서에 사용되는 바와 같은, "저온보존"은 세포의 보존을 0도 미만, 예컨대 (전형적으로) 77 K 또는 -196℃(액체 질소의 끓는점)로 냉각시키는 것에 의한 세포 보존을 지칭한다. 저온보존제는 종종 저온에서의 냉동 또는 실온으로의 가온으로 인해 보존 중인 세포가 손상되는 것을 방지하기 위해 0도 미만의 온도에서 사용된다. 저온보존제 및 최적의 냉각 속도는 세포 손상에 대해 보호할 수 있다. 사용될 수 있는 저온보존제는 다이메틸 설폭사이드(DMSO)(Lovelock and Bishop, Nature, 1959; 183: 1394-1395; Ashwood-Smith, Nature, 1961; 190: 1204-1205), 글리세롤, 폴리비닐피롤리딘(Rinfret, Ann. N.Y. Acad. Sci., 1960; 85: 576), 및 폴리에틸렌 글리콜(Sloviter and Ravdin, Nature, 1962; 196: 48)을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 바람직한 냉각 속도는 1° 내지 3℃/분이다. 적어도 2시간 후에, T 세포는 -80℃의 온도에 도달되고, 영구적인 저장 동안, 예컨대 장기간 저온 저장 용기에 액체 질소(-196℃) 내에 직접 넣어질 수 있다.
1.
T 세포
특정 실시형태에서 개선된 CAR T 세포 조성물의 제조가 제공된다. CAR T 세포 생성을 위해 사용되는 T 세포는 자가/자율("자기") 또는 비-자가("비-자기", 예를 들어, 동종이계, 동계 또는 이종성)일 수 있다. 바람직한 실시형태에서, T 세포는 포유류 대상체로부터 얻는다. 더 바람직한 실시형태에서, T 세포는 영장류 대상체로부터 얻는다. 가장 바람직한 실시형태에서, T 세포는 인간 대상체로부터 얻는다.
T 세포는 말초 혈액 단핵 세포, 골수, 림프절 조직, 제대혈, 흉선 문제, 감염 부위로부터의 조직, 복수, 흉막 삼출, 비장 조직 및 종양을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 다수의 공급원으로부터 얻을 수 있다. 특정 실시형태에서, T 세포는 당업계에 공지된 다수의 기법, 예컨대 침강, 예를 들어, FICOLLTM 분리를 이용하여 대상체로부터 수집한 혈액 단위로부터 얻을 수 있다. 일 실시형태에서, 개체의 순환 혈액으로부터의 세포는 분리반출법에 의해 얻는다. 분리반출법 생성물은 전형적으로 T 세포, 단핵구, 과립구, B 세포, 다른 유핵 백혈구 세포, 적혈구 세포 및 혈소판을 포함하는 림프구를 함유한다. 일 실시형태에서, 분리반출법에 의해 수집되는 세포는 세척되어 혈장 분획을 제거하고 후속 가공 동안 적절한 완충제 또는 배지에 세포를 넣어질 수 있다. 세포는 PBS로 또는 칼슘, 마그네슘, 및 모두는 아니지만 대부분의 다른 2가 양이온을 결여하는 다른 적합한 용액으로 세척될 수 있다. 당업자에 의해 인식될 바와 같이, 세척 단계는 당업계에 공지된 방법에 의해, 예컨대 반자동화된 통과액(flowthrough) 원심분리기, 예를 들어, 코베(Cobe) 2991 세포 처리기, 박스터 사이토메이트(Baxter CytoMate) 등을 이용함으로써 달성될 수 있다. 세척 후에, 세포는 다양한 생체적합 완충제 또는 완충제와 함께 또는 완충제 없이 다른 식염수 용액에서 재현탁될 수 있다. 특정 실시형태에서, 분리반출법 샘플의 바람직하지 않은 성분은 배양 배지에서 직접적으로 재현탁된 세포에서 제거될 수 있다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에 상정된 제조 방법에서 T 세포, 예를 들어, PBMC를 포함하는 세포 집단이 사용된다. 다른 실시형태에서, T 세포의 단리되거나 정제된 집단은 본 명세서에 상정된 제조 방법에서 사용된다. 세포는 적혈구를 용해하고 단핵구를 고갈시킴으로써, 예를 들어, PERCOLL™ 구배를 통한 원심분리에 의해 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)로부터 단리될 수 있다. 일부 실시형태에서, PBMC의 단리 후에, 세포독성과 헬퍼 T 림프구는 둘 다 활성화, 확장 및/또는 유전자 변형 전에 또는 후에 미경험, 기억 및 효과기 T 세포 하위집단으로 분류될 수 있다.
특정 실시형태에서, T 세포, 예를 들어, PBMC를 포함하는 세포 집단은 본 명세서에 상정된 제조 방법에서 사용된다. 다른 실시형태에서, T 세포의 단리되거나 정제된 집단은 본 명세서에 상정된 제조 방법에서 사용된다. 세포는 적혈구를 용해시키고 단핵구를 고갈시킴으로써, 예를 들어, PERCOLL™ 구배를 통한 원심분리에 의해 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)로부터 단리될 수 있다. 일부 실시형태에서, PBMC의 단리 후에, 세포독성과 헬퍼 T 림프구는 둘 다 활성화, 확장 및/또는 유전자 변형 전에 또는 후에 미경험, 기억 및 효과기 T 세포 하위집단으로 분류될 수 있다.
특정 실시형태에서, 면역 효과기 세포 집단은 본 명세서에 상정된 방법을 이용하여 발현하도록 유전자 변형되지만, 양성 또는 음성 선택이 실시되지 않는 PBMC로부터 제조된다. 특정 실시형태에서, PBMC의 단리 후에, T 림프구는 추가로 단리되고, 특정 실시형태에서, 세포독성과 헬퍼 T 림프구는 둘 다 유전자 변형 및/또는 확장 전에 또는 후에 미경험, 기억 및 효과기 T 세포 하위집단으로 분류될 수 있다.
특정 실시형태에서, 다음의 마커 중 하나 이상의 발현시키는 T 세포의 특이적 하위 집단은 양성 또는 음성 선택 기법에 의해 추가로 단리될 수 있다: CD3, CD4, CD8, CD28, CD45RA, CD45RO, CD62, CD127 및 HLA-DR. 일 실시형태에서, i) CD62L, CCR7, CD28, CD27, CD122, CD127, CD197; ii) CD62L, CD127, CD197 및 CD38 또는 iii) CD62L, CD127, CD27 및 CD8로 이루어진 군으로부터 선택되는 마커 중 하나 이상을 발현시키는, T 세포의 특이적 하위집단은 양성 또는 음성 선택 기법에 의해 추가로 단리된다. 다양한 실시형태에서, 제조된 T 세포 조성물은 다음의 마커 중 하나 이상을 발현시키지 않거나, 실질적으로 발현시키지 않는다: CD57, CD244, CD160, PD-1, CTLA4, TIM3 및 LAG3.
일 실시형태에서, i) CD62L, CD127, CD197 및 CD38 또는 ii) CD62L, CD127, CD27 및 CD8로 이루어진 군으로부터 선택되는 마커 중 하나 이상의 발현은 PI3K 저해제 없이 활성화되고 확장된 T 세포 집단에 비해 적어도 1.5배, 적어도 2배, 적어도 3배, 적어도 4배, 적어도 5배, 적어도 6배, 적어도 7배, 적어도 8배, 적어도 9배, 적어도 10배, 적어도 25배 이상 증가된다. 일 실시형태에서, T 세포는 CD8+ T 세포를 포함한다.
일 실시형태에서, CD57, CD244, CD160, PD-1, CTLA4, TIM3 및 LAG3으로 이루어진 군으로부터 선택되는 마커 중 하나 이상의 발현은 PI3K 저해제에 의해 활성화되고 확장된 T 세포 집단에 비해 적어도 1.5배, 적어도 2배, 적어도 3배, 적어도 4배, 적어도 5배, 적어도 6배, 적어도 7배, 적어도 8배, 적어도 9배, 적어도 10배, 적어도 25배 이상 감소된다. 일 실시형태에서, T 세포는 CD8+ T 세포를 포함한다.
일 실시형태에서, 본 명세서에 상정된 제조 방법은 미경험 또는 발생적으로 강력한 T 세포의 하나 이상의 마커를 포함하는 CAR T 세포 수를 증가시킨다. 임의의 특정 이론으로 구속되는 일 없이, 본 발명자들은 1종 이상의 PI3K 저해제로 T 세포를 포함하는 세포 집단을 처리하는 것이 발생적으로 강한 T 세포의 확장 증가를 초래하며, 기존의 CAR T 세포 요법에 비해 더 강하고 효능있는 입양 CAR T 세포 면역요법을 제공하는 것으로 여긴다.
특정 실시형태에 상정된 방법을 이용하여 제조된 T 세포에서 증가된 미경험 또는 발생적으로 강력한 T 세포 마커의 예시적인 예는 i) CD62L, CD127, CD197 및 CD38 또는 ii) CD62L, CD127, CD27 및 CD8을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 특정 실시형태에서, 미경험 T 세포는 다음의 마커 중 하나 이상을 발현시키지 않거나 실질적으로 발현시키지 않는다: CD57, CD244, CD160, PD-1, BTLA, CD45RA, CTLA4, TIM3 및 LAG3.
T 세포에 대해, 본 명세서에 상정된 다양한 확장 방법으로부터 초래되는 T 세포 집단은 사용되는 조건에 따라서 다양한 특이적 표현형 특성을 가질 수 있다. 다양한 실시형태에서, 확장된 T 세포 집단은 다음의 표현형 마커 중 하나 이상을 포함한다: CD62L, CD27, CD127, CD197, CD38, CD8 및 HLA-DR.
일 실시형태에서, 이러한 표현형 마커는 CD62L, CD127, CD197 및 CD38 중 하나 이상 또는 모두의 향상된 발현을 포함한다. 특정 실시형태에서, CD62L, CD127, CD197 및 CD38을 포함하는 천연 T 세포의 표현형 마커 발현을 특징으로 하는 CD8+ T 림프구가 확장된다.
일 실시형태에서, 이러한 표현형 마커는 CD62L, CD127, CD27 및 CD8 중 하나 이상 또는 모두의 향상된 발현을 포함한다. 특정 실시형태에서, CD62L, CD127, CD27 및 CD8을 포함하는 천연 T 세포의 표현형 마커의 발현을 특징으로 하는 CD8+ T 림프구가 확장된다.
특정 실시형태에서, CD45RO, CD62L, CD127, CD197 및 CD38을 포함하고 그랜자임 B에 음성인 중심 기억 T 세포의 표현형 마커의 발현을 특징으로 하는 T 세포가 확장된다. 일부 실시형태에서, 중심 기억 T 세포는 CD45RO+, CD62L+, CD8+ T 세포이다.
특정 실시형태에서, CD62L을 포함하고, CD45RA 및/또는 CD45RO의 발현에 음성인 미경험 CD4+ 세포의 표현형 마커의 발현을 특징으로 하는 CD4+ T 림프구가 확장된다. 일부 실시형태에서, CD4+ 세포는 CD62L 및 CD45RO 양성을 포함하는 중심 기억 CD4+ 세포의 표현형 마커 발현을 특징으로 한다. 일부 실시형태에서, 효과기 CD4+ 세포는 CD62L 양성 및 CD45RO 음성이다.
특정 실시형태에서, T 세포는 개체로부터 단리되고, 항-CD79A CAR를 발현시키도록 유전자 변형되기 전에 시험관내에서 증식하도록 활성화되고 자극된다. 이와 관련하여, T 세포는 유전자 변형되기 전에 그리고/또는 후에 배양될 수 있다(즉, 본 명세서에 상정된 항-CD79A CAR을 발현시키도록 형질도입 또는 형질감염됨).
2.
활성화 및 확장
충분한 치료적 용량의 T 세포 조성물을 달성하기 위해, T 세포는 종종 자극, 활성화 및/또는 확장의 하나 이상의 라운드가 실시된다. T 세포는 일반적으로, 예를 들어, 각각 본 명세서에 전문이 참고로 편입된 미국 특허 제6,352,694호; 제6,534,055호; 제6,905,680호; 제6,692,964호; 제5,858,358; 제6,887,466호; 제6,905,681호; 제7,144,575호; 제7,067,318호; 제7,172,869호; 제7,232,566호; 제7,175,843호; 제5,883,223호; 제6,905,874호; 제6,797,514호; 및 제6,867,041호에 기재된 방법을 이용하여 활성화되고 확장될 수 있다. 항-CD79A CAR을 발현시키기 위해 변형된 T 세포는 T 세포가 변형되기 전에 그리고/또는 후에 활성화되고 확장될 수 있다. 추가로, T 세포는 활성화 및/또는 확장 전에, 동안에 그리고/또는 후에 PI3K/Akt/mTOR 세포 신호전달 경로를 조절하는 1종 이상의 제제와 접촉될 수 있다. 일 실시형태에서, 본 명세서에 상정된 방법에 의해 제조된 T 세포는 활성화 및 확장의 1, 2, 3, 4 또는 5회 이상 라운드를 겪으며, 이들 각각은 PI3K/Akt/mTOR 세포 신호전달 경로를 조절하는 1종 이상의 제제를 포함할 수 있다.
인공 항원 제시 세포(aAPC)는 천연 APC의 사용과 대조적으로 외인성 사이토카인의 첨가를 필요로 하는 일 없이, 기능성 인간 CD8+ T 세포의 생체외 성장 및 장기간 확장을 뒷받침한다. 특정 실시형태에서, PBMC 또는 단리된 T 세포는 자극제 및 공자극제, 예컨대 항-CD3 및 항-CD28 항체와 접촉되고, 일반적으로 적절한 사이토카인, 예컨대 IL-2, IL-7 및/또는 IL-15가 있는 배양 배지에서, 비드 또는 다른 표면에 부착된다.
다른 실시형태에서, 인공 APC(aAPC)는 다양한 공자극 분자 및 사이토카인의 안정한 발현 및 분비를 지시하기 위해 K562, U937, 721.221, T2, 및 C1R 세포를 조작함으로써 만들어진다. 특정 실시형태에서 K32 또는 U32 aAPC는 AAPC 세포 표면 상에서 하나 이상의 항체-기반 자극 분자의 디스플레이를 지시하기 위해 사용된다. T 세포의 집단은 CD137L(4-1BBL), CD134L(OX40L), 및/또는 CD80 또는 CD86을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 다양한 공자극 분자를 발현시키는 aAPC에 의해 확장될 수 있다. aAPC는 유전자 변형된 T 세포를 확장시키기 위해 그리고 CD8 T 세포 상에서 CD28 발현을 유지하기 위해 효율적인 플랫폼을 제공한다. WO 03/057171 및 미국 특허 제2003/0147869호에서 제공된 aAPC는 본 명세서에서 그들의 전문이 참고로 편입된다.
일 실시형태에서, 공자극 리간드는 T 세포 상의 동족 공자극 분자에 특이적으로 결합함으로써, 예를 들어, TCR/CD3 복합체의 결합에 의해 제공되는 1차 신호에 추가로 목적하는 T 세포 반응을 매개하는 신호를 제공하는 항원 제시 세포(예를 들어, aAPC, 수지상 세포, B 세포 등) 상에서 제시된다. 적합한 공자극 리간드는 CD7, B7-1 (CD80), B7-2 (CD86), 4-1BBL, OX40L, 유도성 공자극 리간드(ICOS-L), 세포내 접착 분자(ICAM), CD30L, CD40, CD70, CD83, HLA-G, MICA, MICB, HVEM, 림포톡신 베타 수용체, ILT3, ILT4, Toll 리간드 수용체에 결합하는 작용제 또는 항체, 및 B7-H3에 특이적으로 결합하는 리간드를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
특정 실시형태에서, 공자극 리간드는 CD27, CD28, 4-1BB, OX40, CD30, CD40, ICOS, 림프구 기능-연관 항원-1 (LFA-1), CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, 및 CD83에 특이적으로 결합하는 리간드를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는, T 세포 상에 존재하는 공자극 분자에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함한다.
적합한 공자극 리간드는 표적 항원을 더 포함하는데, 이는 가용성 형태로 제공되거나 변형된 T 세포 상에서 발현된 조작된 TCR 또는 CAR에 결합하는 APC 또는 aAPC 상에서 발현될 수 있다.
다양한 실시형태에서, 본 명세서에 상정된 T 세포를 제조하기 위한 방법은 T 세포를 포함하는 세포 집단을 활성화시키는 단계 및 T 세포 집단을 확장시키는 단계를 포함한다. T 세포 활성화는 T 세포 TCR/CD3 복합체를 통해 또는 CD2 표면 단백질의 자극을 통해 1차 자극 신호를 제공함으로써 그리고 부속 분자, 예를 들어, CD28을 통해 2차 공자극 신호를 제공함으로써 달성될 수 있다.
TCR/CD3 복합체는 T 세포를 적합한 CD3 결합제, 예를 들어, CD3 리간드 또는 항-CD3 단클론성 항체와 접촉시킴으로써 자극될 수 있다. CD3 항체의 예시적인 예는 OKT3, G19-4, BC3 및 64.1을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
다른 실시형태에서, CD2 결합제는 T 세포에 대한 1차 자극 신호를 제공하는 데 사용될 수 있다. CD2 결합제의 예시적인 예는 CD2 리간드 및 항-CD2 항체, 예를 들어, T11.1 또는 T11.2 항체와 조합한 T11.3 항체(Meuer, S. C. et al. (1984) Cell 36:897-906) 및 9-1 항체와 조합한 9.6 항체(TI 1.1과 동일한 에피토프를 인식함)(Yang, S. Y. et al. (1986) J. Immunol. 137:1097-1100)를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 임의의 상기 기재한 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 다른 항체가 또한 사용될 수 있다. 추가적인 항체, 또는 항체의 조합물은 본 명세서의 다른 곳에 개시된 바와 같은 표준 기법에 의해 제조되고 동정될 수 있다.
TCR/CD3 복합체를 통해, 또는 CD2를 통해 제공된 1차 자극 신호에 추가로, T 세포 반응의 유도는 제2, 공자극 신호를 필요로 한다. 특정 실시형태에서, CD28 결합제는 공자극 신호를 제공하기 위해 사용될 수 있다. CD28 결합제의 예시적인 예는 천연 CD28 리간드, 예를 들어, CD28에 대한 천연 리간드(예를 들어, 단백질의 B7 패밀리의 구성원, 예컨대 B7-1(CD80) 및 B7-2(CD86); 및 항-CD28 단클론성 항체 또는 CD28 분자와 가교할 수 있는 이의 단편, 예를 들어, 단클론성 항체 9.3, B-T3, XR-CD28, KOLT-2, 15E8, 248.23.2 및 EX5.3D10을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
일 실시형태에서, 1차 자극 신호를 제공하는 분자, 예를 들어, TCR/CD3 복합체 또는 CD2를 통해 자극을 제공하는 분자, 및 공자극 분자는 동일한 표면에 결합된다.
특정 실시형태에서, 자극 및 공자극 신호를 제공하는 결합제는 세포 표면 상에 위치된다. 이는 세포 표면 상에서 그의 발현에 적합한 형태로 결합제를 암호화하는 핵산으로 세포를 형질감염 또는 형질도입함으로써 또는 대안적으로 세포 표면에 결합제를 결합시킴으로써 달성될 수 있다.
다른 실시형태에서, 1차 자극 신호를 제공하는 분자, 예를 들어, TCR/CD3 복합체 또는 CD2를 통해 자극을 제공하는 분자, 및 공자극 분자는 항원 제시 세포 상에 나타난다.
일 실시형태에서, 1차 자극 신호를 제공하는 분자, 예를 들어 TCR/CD3 복합체 또는 CD2를 통해 자극을 제공하는 분자, 및 공자극 분자는 별개의 표면 상에 제공된다.
특정 실시형태에서, 자극 및 공자극 신호를 제공하는 결합제 중 하나는 가용성이며(용액으로 제공됨), 나머지 제제(들)는 하나 이상의 표면 상에 제공된다.
특정 실시형태에서, 자극 및 공자극 신호를 제공하는 결합제는 둘 다 가용성 형태로 제공된다(용액으로 제공됨).
다양한 실시형태에서, 본 명세서에 상정된 T 세포의 제조 방법은 항-CD3 및 항-CD28 항체를 이용하여 T 세포를 활성화시키는 단계를 포함한다.
특정 실시형태에 상정된 방법에 의해 제조된 T 세포 조성물은 PI3K 세포 신호전달 경로를 저해하는 1종 이상의 제제의 존재 하에 활성화되고/되거나 확장된 T 세포를 포함한다. 항-CD79A CAR을 발현시키도록 변형된 T 세포는 T 세포가 변형되기 전에 그리고/또는 후에 활성화 및 확장될 수 있다. 특정 실시형태에서, T 세포 집단은 항-CD79A CAR을 발현시키도록 활성화, 변형되고, 이어서, 확장을 위해 배양된다.
일 실시형태에서, 본 명세서에 상정된 방법에 의해 제조된 T 세포는 높은 증식 가능성 및 자기 재생 능력을 나타내는 증가된 수의 T 세포를 포함하지만, T 세포 분화의 마커를 발현시키지 않거나 실질적으로 검출 가능하지 않은 마커를 발현시킨다. 이들 T 세포는 강한 방식으로 반복적으로 활성화되고 확장될 수 있으며, 이에 의해 개선된 T 세포 조성물을 제공한다.
일 실시형태에서, PI3K 세포 신호전달 경로를 저해하는 1종 이상의 제제의 존재 하에 활성화되고 확장된 T 세포 집단은 PI3K 저해제 없이 활성화 및 확장된 T 세포 집단에 비해 적어도 1.5배, 적어도 2배, 적어도 3배, 적어도 4배, 적어도 5배, 적어도 6배, 적어도 7배, 적어도 8배, 적어도 9배, 적어도 10배, 적어도 25배, 적어도 50배, 적어도 100배, 적어도 250배, 적어도 500배, 적어도 1000배 이상으로 확장된다.
일 실시형태에서, PI3K 세포 신호전달 경로를 저해하는 1종 이상의 제제의 존재 하에 활성화되고 확장된 어린 T 세포 마커의 발현을 특징으로 하는 T 세포 집단은 PI3K 저해제 없이 활성화되고 확장된 T 세포 집단에 비해 적어도 1.5배, 적어도 2배, 적어도 3배, 적어도 4배, 적어도 5배, 적어도 6배, 적어도 7배, 적어도 8배, 적어도 9배, 적어도 10배, 적어도 25배, 적어도 50배, 적어도 100배, 적어도 250배, 적어도 500배, 적어도 1000배 이상 확장된다.
일 실시형태에서, 본 명세서에 상정된 방법에 의해 활성화된 T 세포를 확장시키는 것은 몇 시간(약 3시간) 내지 약 7일 내지 약 28일 또는 그 사이의 임의의 시간 정수 값 동안 T 세포를 포함하는 세포 집단을 배양시키는 단계를 추가로 포함한다. 다른 실시형태에서, T 세포 조성물은 14일 동안 배양될 수 있다. 특정 실시형태에서, T 세포는 약 21일 동안 배양된다. 다른 실시형태에서, T 세포 조성물은 약 2 내지 3일 동안 배양된다. T 세포의 배양 시간이 60일 이상일 수 있도록 몇 주기의 자극/활성화/확장이 또한 요망될 수 있다.
특정 실시형태에서, T 세포 배양에 적절한 조건은 적절한 배지(예를 들어, 최소 필수 배지 또는 RPMI 배지 1640 또는 X-vivo 15(론자(Lonza))) 및 혈청(예를 들어, 소 태아 또는 인간 혈청), 인터류킨-2(IL-2), 인슐린, IFN-γ, IL-4, IL-7, IL-21, GM-CSF, IL-10, IL-12, IL-15, TGFβ 및 TNF-α 또는 당업자에게 알려진 세포 성장에 적합한 임의의 다른 첨가제를 포함한다.
세포 배양 배지의 추가적인 예시적 예는 아미노산, 피루브산나트륨 및 비타민이 첨가되고, 무 혈청이거나 또는 적절한 양의 혈청(또는 혈장) 또는 정해진 세트의 호르몬, 및/또는 T 세포의 성장 및 확장에 충분한 양의 사이토카인(들)이 보충된, RPMI 1640, Clicks, AIM-V, DMEM, MEM, a-MEM, F-12, X-Vivo 1 5 및 X-Vivo 20, 옵티마이저(Optimizer)를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
T 세포 확장을 위한 다른 첨가제의 예시적인 예는 계면활성제, 피아스만네이트(piasmanate), pH 완충제, 예컨대 HEPES, 및 환원제, 예컨대 N-아세틸-시스테인 및 2-머캅토에탄올을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
항생제, 예를 들어, 페니실린 및 스트렙토마이신은 실험 배양물에서만 포함되고, 대상체에게 주입되는 세포 배양물에는 포함되지 않는다. 표적 세포는 성장을 뒷받침하는 데 필요한 조건, 예를 들어, 적절한 온도(예를 들어, 37℃) 및 분위기(예를 들어, 공기 + 5% C02) 하에 유지된다.
3.
제제
다양한 실시형태에서, T 세포를 세포 내 PI3K 경로를 조절하는 제제와 접촉시키는 단계를 포함하는 미분화된 또는 발생적으로 강력한 T 세포를 확장시키는 T 세포의 제조 방법이 제공된다. 다양한 실시형태에서, T 세포를 세포 내 PI3K/AKT/mTOR 경로를 조절하는 제제와 접촉시키는 단계를 포함하는 미분화된 또는 발생적으로 강력한 T 세포를 확장시키는 T 세포의 제조 방법이 제공된다. 세포는 활성화 및 확장 전에, 동안에 그리고/EH는 후에 접촉될 수 있다. T 세포 조성물은 이들이 분화의 실질적인 증가 없이 다중 확장 라운드를 겪을 수 있도록 충분한 T 세포 효능을 보유한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "조절한다", "조절제" 또는 "조절 제제" 또는 비슷한 용어는 세포 신호전달 경로의 변화를 일으키는 제제의 능력을 지칭한다. 조절제는 경로 성분의 양, 활성을 증가 또는 감소시킬 수 있거나, 세포 신호전달 경로의 목적하는 효과 또는 결과를 증가 또는 감소시킬 수 있다. 일 실시형태에서, 조절제는 저해제이다. 다른 실시형태에서, 조절제는 활성제이다.
"제제"는 화합물, 소분자, 예를 들어, 소 유기 분자, 핵산, 폴리펩타이드 또는 PI3K/AKT/mTOR 경로의 조절에서 사용되는 이들의 단편, 아이소폼, 변이체, 유사체 또는 유도체를 지칭한다.
"소분자"는 분자량이 약 5kD 미만, 약 4kD 미만, 약 3kD 미만, 약 2kD 미만, 약 1kD 미만, 또는 약 .5kD 미만인 조성물을 지칭한다. 소분자는 핵산, 펩타이드, 폴리펩타이드, 펩타이드모방체(peptidomimetic), 펩토이드(peptoid), 탄수화물, 지질, 이들의 성분 또는 다른 유기 또는 무기 분자를 포함할 수 있다. 화학적 및/또는 생물학적 혼합물의 라이브러리, 예컨대 진균, 박테리아 또는 조류 추출물은 당업계에 공지되어 있으며, 임의의 분석을 이용하여 선별될 수 있다. 분자 라이브러리의 합성을 위한 방법의 예는 문헌[(Carell et al., 1994a; Carell et al., 1994b; Cho et al., 1993; DeWitt et al., 1993; Gallop et al., 1994; Zuckermann et al., 1994)]에서 찾을 수 있다.
"유사체"는 목적하는 활성을 갖는 화합물, 뉴클레오타이드, 단백질 또는 폴리펩타이드 또는 화합물과 유사하거나 동일한 활성 또는 기능(들)을 갖지만, 바람직한 실시형태의 서열 또는 구조와 유사하거나 동일한 서열 또는 구조를 반드시 포함할 필요는 없는 소 유기 화합물, 뉴클레오타이드, 단백질 또는 폴리펩타이드를 지칭한다.
"유도체"는 아미노산 잔기 치환, 결실 또는 첨가의 도입에 의해 변경된 모 단백질 또는 폴리펩타이드의 아미노산 서열을 포함하는 화합물, 단백질 또는 폴리펩타이드, 또는 뉴클레오타이드 치환 또는 결실, 첨가 또는 돌연변이의 도입에 의해 변형된 핵산 또는 뉴클레오타이드를 지칭한다. 유도체 핵산, 뉴클레오타이드, 단백질 또는 폴리펩타이드는 모 폴리펩타이드와 유사하거나 동일한 기능을 가진다.
다양한 실시형태에서, PI3K 경로를 조절하는 제제는 경로 성분을 활성화시킨다. "활성제" 또는 "작용제"는 PI3K의 하나 이상의 활성을 활성화시키는 분자를 포함하지만, 이것으로 제한되지 않는 PI3K/AKT/mTOR 경로 내 분자의 하나 이상의 활성을 촉진시키거나, 증가시키거나, 유도하는 제제를 지칭한다.
다양한 실시형태에서, PI3K 경로를 조절하는 제제는 경로 성분을 저해한다. "저해제" 또는 "길항제"는 PI3K의 하나 이상의 활성을 저해하는 분자를 포함하지만, 이것으로 제한되지 않는, PI3K/AKT/mTOR 경로 내 분자의 하나 이상의 활성을 저해하거나, 줄이거나, 감소시키는 제제를 지칭한다. 일 실시형태에서, 저해제는 이중 분자 저해제이다. 특정 실시형태에서, 저해제는 동일 또는 실질적으로 유사한 활성을 갖는 분자의 부류를 저해할 수 있거나(pan-저해제) 또는 분자의 활성을 특이적으로 저해할 수 있다(선택적 또는 특이적 저해제). 저해는 또한 비가역적 또는 가역적일 수 있다.
일 실시형태에서, 저해제는 IC50이 적어도 1nM, 적어도 2nM, 적어도 5nM, 적어도 10nM, 적어도 50nM, 적어도 100nM, 적어도 200nM, 적어도 500nM, 적어도 1μM, 적어도 10μM, 적어도 50μM 또는 적어도 100μM이다. IC50 결정은 당업계에 공지된 임의의 통상적인 기법을 이용하여 달성될 수 있다. 예를 들어, IC50은 연구 하의 다양한 농도의 저해제의 존재 하에 주어진 효소의 활성을 측정함으로써 결정될 수 있다. 이어서, 효소 활성의 실험에 의해 얻어진 값은 사용된 저해제 농도에 대해 플롯팅된다. (임의의 저해제의 부재 하의 활성에 비해) 50%의 효소 활성을 나타내는 저해제의 농도는 "IC50" 값으로서 취해진다. 유사하게, 다른 저해 농도는 활성의 적절한 결정을 통해 정해질 수 있다.
다양한 실시형태에서, T 세포는 적어도 1nM, 적어도 2nM, 적어도 5nM, 적어도 10nM, 적어도 50nM, 적어도 100nM, 적어도 200nM, 적어도 500nM, 적어도 1μM, 적어도 10μM, 적어도 50μM, 적어도 100μM, 또는 적어도 1M 농도에서 PI3K/AKT/mTOR 경로의 1종 이상의 조절제와 접촉되거나, 처리되거나 또는 배양된다.
특정 실시형태에서, T 세포는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10회 이상의 확장 라운드로 적어도 12시간, 18시간, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7일, 적어도 2주, 적어도 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개월 이상 동안 PI3K/AKT/mTOR 경로의 1종 이상의 조절제와 접촉되거나, 처리되거나, 배양될 수 있다.
라파마이신 경로의 포스파티딜-이노시톨-3 키나제/Akt/포유류 표적은 성장 인자 신호전달을 세포의 증식, 분화, 대사 및 생존과 통합시키기 위한 전달자로서 작용한다. PI3K는 고도로 보존된 세포내 지질 키나제의 패밀리이다. 클래스 IA PI3K은 직접적으로 또는 어댑터 분자(adaptor molecule)의 인슐린 수용체 기질과의 상호작용을 통해 성장 인자 수용체 타이로신 키나제(receptor tyrosine 키나제: RTK)에 의해 활성화된다. 이런 활성은 세린/트레오닌 키나제 Akt의 조절제인 포스파티딜-이노시톨-3,4,5-트라이포스페이트(PIP3)의 생산을 초래한다. mTOR은 2개의 별개의 복합체를 통해 표준(canonical) PI3K 경로를 통해 작용하며, 각각은 별개의 활성을 부여하는 상이한 결합 상대를 특징으로 한다. mTORC1(PRAS40, 랩터(raptor) 및 mLST8/GbL와 복합체화된 mTOR)은 성장 인자 신호를 단백질 번역, 세포 성장, 증식 및 생존과 연결하는, PI3K/Akt 신호전달의 하류 효과기로서 작용한다. mTORC2(릭터(rictor), mSIN1, 프로터(protor) 및 mLST8과 복합체화된 mTOR)는 Akt의 상류 활성제로서 작용한다.
PI3K의 성장 인자 수용체-매개 활성화 시, Akt는 이의 플레크스트린(pleckstrin) 상동성 도메인과 PIP3의 상호작용을 통해 막에 보충되며, 따라서 이의 활성화 루프에 노출시키고, 구성적으로 활성인 포스포이노시타이드-의존적 단백질 키나제 1(PDK1)에 의해 트레오닌 308(Thr308)에서 인산화를 가능하게 한다. 최대 활성화를 위해, Akt는 또한 이의 C-말단의 소수성 모티프의 세린 473(Ser473)에서 mTORC2에 의해 인산화된다. DNA-PK 및 HSP는 또한 Akt 활성의 조절에서 중요한 것으로 나타났다. Akt는 TSC2의 저해 인산화를 통해 mTORC1을 활성화시키는데, 이는 TSC1과 함께, mTORC1의 양성 조절자인 Rheb GTPase를 저해함으로써 mTORC1을 음성으로 조절한다. mTORC1은 2가지의 잘 정의된 기질, 즉, p70S6K(본 명세서에서 S6K1로서 지칭됨)과 4E-BP1을 가지며, 이들 둘 다 단백질 합성을 결정적으로 조절한다. 따라서, mTORC1은 성장 인자 신호전달을 단백질 번역과 세포 증식과 연결하는 PI3K의 중요한 하류 효과기이다.
a.
PI3K 저해제
본 명세서에서 사용되는 용어 "PI3K 저해제"는 PI3K의 적어도 하나의 활성에 결합하고 이를 저해하는 핵산, 펩타이드, 화합물 또는 소 유기 분자를 지칭한다. PI3K 단백질은 3가지 부류, 클래스 1 PI3K, 클래스 2 PI3K 및 클래스 3 PI3K으로 나눌 수 있다. 클래스 1 PI3K은 4가지 p110 촉매 서브유닛(p110α, p110β, p110δ 및 p110γ) 중 하나 및 조절 서브유닛의 2가지 패밀리 중 하나로 이루어진 이형이량체로서 존재한다. PI3K 저해제는 바람직하게는 클래스 1 PI3K 저해제를 표적화한다. 일 실시형태에서, PI3K 저해제는 클래스 1 PI3K 저해제의 하나 이상의 아이소폼에 대한 선택성(즉, p110α, p110β, p110δ, 및 p110γ, 또는 p110α, p110β, p110δ 및 p110γ 중 하나 이상에 대한 선택성)을 나타낼 것이다. 다른 양상에서, PI3K 저해제는 아이소폼 선택성을 나타내지 않을 것이며, "pan-PI3K 저해제"로 간주된다. 일 실시형태에서, PI3K 저해제는 PI3K 촉매적 도메인에 대한 결합에 대해 ATP와 경쟁할 것이다.
특정 실시형태에서, PI3K 저해제는, 예를 들어, PI3K뿐만 아니라 PI3K-AKT-mTOR 경로 내 추가적인 단백질을 표적화할 수 있다. 특정 실시형태에서, mTOR과 PI3K를 둘 다 표적화하는 PI3K 저해제는 mTOR 저해제 또는 PI3K 저해제 중 하나로서 지칭될 수 있다. PI3K만을 표적화하는 PI3K 저해제는 선택적 PI3K 저해제로서 지칭될 수 있다. 일 실시형태에서, 선택적 PI3K 저해제는 경로에서 mTOR 및/또는 다른 단백질에 대한 저해제의 IC50보다 적어도 10배, 적어도 20배, 적어도 30배, 적어도 50배, 적어도 100배, 적어도 1000배 이상 더 낮은 PI3K에 대한 50% 저해 농도를 나타내는 제제를 지칭하는 것으로 이해될 수 있다.
특정 실시형태에서, 예시적인 PI3K 저해제는 약 200nM 이하, 바람직하게는 약 100 nm 이하, 훨씬 더 바람직하게는 약 60nM 이하, 약 25nM, 약 10nM, 약 5nM, 약 1nM, 100μM, 50μM, 25μM, 10μM, 1μM 이하의 IC50(활성의 50%를 저해하는 농도)로 PI3K를 저해한다. 일 실시형태에서, PI3K 저해제는 약 2nM 내지 약 100 nm, 더 바람직하게는 약 2nM 내지 약 50nM, 훨씬 더 바람직하게는 약 2nM 내지 약 15nM인 IC50으로 PI3K를 저해한다.
특정 실시형태에서 상정된 T 세포 제조 방법에서 사용하기에 적합한 PI3K 저해제의 예시적 예는 BKM120(클래스 1 PI3K 저해제, 노바티스(Novartis)), XL147(클래스 1 PI3K 저해제, 엑셀리시스(Exelixis)), (pan-PI3K 저해제, 글락소스미스클라인(GlaxoSmithKline)), 및 PX-866(클래스 1 PI3K 저해제; p110α, p110β 및 p110γ 아이소폼, 온코타이레온(Oncothyreon))을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
선택적 PI3K 저해제의 다른 예시적 예는 BYL719, GSK2636771, TGX-221, AS25242, CAL-101, ZSTK474 및 IPI-145를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
pan-PI3K 저해제의 추가적인 예시적 예는 BEZ235, LY294002, GSK1059615, TG100713 및 GDC-0941를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
바람직한 실시형태에서, PI3K 저해제는 ZSTK474이다.
b.
AKT 저해제
본 명세서에서 사용되는 용어 "AKT 저해제"는 AKT의 활성 중 적어도 하나를 저해하는 핵산, 펩타이드, 화합물, 또는 소 유기 분자를 지칭한다. AKT 저해제는 지질계 저해제(예를 들어, AKT가 혈장막으로 국소화되는 것을 방지하는 AKT의 플레크스트린 상동 도메인을 표적화하는 저해제), ATP-경쟁적 저해제 및 다른자리입체성 저해제를 포함하는 몇몇 부류로 그룹화될 수 있다. 일 실시형태에서, AKT 저해제는 AKT 촉매 부위에 대한 결합에 의해 작용한다. 특정 실시형태에서, Akt 저해제는 하류의 AKT 표적, 예컨대 mTOR의 인산화를 저해함으로써 작용한다. 다른 실시형태에서, AKT 활성은, 예를 들어, AKT의 DNA-PK 활성화, AKT의 PDK-1 활성화 및/또는 Akt의 mTORC2 활성화를 저해함으로써, Akt를 활성화시키기 위한 입력 신호를 저해함으로써 저해된다.
AKT 저해제는 모두 3종의 AKT 아이소폼, 즉, AKT1, AKT2, AKT3을 표적화할 수 있거나, 또는 아이소폼 선택적일 수 있고, AKT 아이소폼 중 하나 또는 둘만을 표적화할 수 있다. 일 실시형태에서, AKT 저해제는 PI3K-AKT-mTOR 경로에서 AKT뿐만 아니라 추가적인 단백질을 표적화할 수 있다. AKT만을 표적화하는 AKT 저해제는 선택적 AKT 저해제로서 지칭될 수 있다. 일 실시형태에서, 선택적 AKT 저해제는 경로 내 다른 단백질에 대한 저해제의 IC50보다 적어도 10배, 적어도 20배, 적어도 30배, 적어도 50배, 적어도 100배, 적어도 1000배 이상 더 낮은 AKT에 대한 50% 저해 농도를 나타내는 제제를 지칭하는 것으로 이해될 수 있다.
특정 실시형태에서, 예시적인 AKT 저해제는 약 200nM 이하, 바람직하게는 약 100 nm 이하, 훨씬 더 바람직하게는 약 60nM 이하, 약 25nM, 약 10nM, 약 5nM, 약 1nM, 100μM, 50μM, 25μM, 10μM, 1μM 이하의 IC50(활성의 50%를 저해하는 농도)으로 AKT를 저해한다. 일 실시형태에서, AKT는 약 2nM 내지 약 100 nm, 더 바람직하게는 약 2nM 내지 약 50nM, 훨씬 더 바람직하게는 약 2nM 내지 약 15 nM의 IC50으로 AKT를 저해한다.
아우리스타틴계 항체-약물 접합체와 조합하여 사용하기 위한 AKT 저해제의 예시적 예는, 예를 들어, 페리포신(케릭스(Keryx)), MK2206(머크(Merck)), VQD-002(바이오퀘스트(VioQuest)), XL418(엑셀리시스(Exelixis)), GSK690693, GDC-0068 및 PX316(프로엘엑스 파마슈티컬스(PROLX Pharmaceuticals))를 포함한다.
선택적 Akt1 저해제의 예시적인, 비제한적 예는 A-674563이다.
선택적 Akt2 저해제의 예시적인, 비제한적 예는 CCT128930이다.
특정 실시형태에서, Akt 저해제는 Akt의 DNA-PK, Akt의 PDK-1 활성화, Akt의 mTORC2 활성화, 또는 Akt의 HSP 활성화.
DNA-PK 저해제의 예시적 예는 NU7441, PI-103, NU7026, PIK-75 및 PP-121을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
c.
mTOR 저해제
용어 "mTOR 저해제" 또는 "mTOR을 저해하는 제제"는 mTOR 단백질의 적어도 하나의 활성, 예를 들어, 기질(예를 들어, p70S6 키나제 1, 4E-BP1, AKT/PKB 및 eEF2) 중 적어도 하나에 대한 세린/트레오닌 단백질 키나제 활성을 저해하는 핵산, 펩타이드, 화합물 또는 소 유기 분자를 지칭한다. mTOR 저해제는 mTORC1, mTORC2 또는 mTORC1과 mTORC2 둘 다에 직접 결합하고, 이를 저해할 수 있다.
mTORC1 및/또는 mTORC2 활성의 저해는 PI3K/Akt/mTOR 경로의 신호 전달 감소에 의해 결정될 수 있다. 이러한 신호전달 경로 결과의 감소를 확립하기 위해 매우 다양한 판독이 이용될 수 있다. 일부 비제한적인 예시적 판독은 (1) 5473 및 T308을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 잔기에서 Akt의 인산화 감소; (2) 예를 들어, Fox01/O3a T24/32, GSK3a/β; S21/9 및 TSC2 T1462를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 Akt 기질의 인산화 감소에 의해, 입증된 바와 같은 Akt의 활성화 감소; (3) 리보솜 S6 S240/244, 70S6K T389, 및 4EBP1 T37/46을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 mTOR 하류의 신호전달 분자 인산화의 감소; 및 (4) 암 세포 증식의 저해를 포함한다.
일 실시형태에서, mTOR 저해제는 활성 부위 저해제이다. 이들은 mTOR의 ATP 결합 부위(ATP 결합 포켓으로도 지칭됨)에 결합하고, mTORC1과 mTORC2 둘 다의 촉매적 활성을 저해하는 mTOR 저해제이다. 특정 실시형태에서 상정된 T 세포 제조 방법에서 사용하기에 적합한 활성 부위 저해제의 일 부류는 PI3K와 mTOR 둘 다를 표적화하고 직접적으로 저해하는 이중 특이성 저해제이다. 이중 특이성 저해제는 mTOR과 PI3K의 ATP 결합 부위 둘 다에 결합한다. 이러한 저해제의 예시적 예는 이미다조퀴나졸린, 보르트만닌(wortmannin), LY294002, PI-103(카이만 케미컬(Cayman Chemical)), SF1126 (세마포어(Semafore)), BGT226(노바티스), XL765(엑셀리시스) 및 NVP-BEZ235(노바티스)를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
특정 실시형태에서 상정된 방법에서 사용하기에 적합한 다른 부류의 mTOR 활성 부위 저해제는 하나 이상의 I형 포스파티딜이노시톨 3-키나제, 예를 들어, PI3 키나제 α, β, γ 또는 δ에 비해 mTORC1 및 mTORC2 활성을 선택적으로 저해한다. 이들 활성 부위 저해제는 mTOR의 활성부위에 결합하지만, PI3K에는 결하하지 않는다. 이러한 저해제의 예시적 예는 피라졸로피리미딘, Torin1(게르틴(Guertin) 및 사바티니(Sabatini)), PP242(2-(4-아미노-1-아이소프로필-1H-피라졸로[3,4-d]피리미딘-3-일)-1H-인돌-5-올), PP30, Ku-0063794, WAY-600(와이어스(Wyeth)), WAY-687(와이어스), WAY-354(와이어스) 및 AZD8055(Liu et al., Nature Review, 8, 627-644, 2009)를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. I
일 실시형태에서, 선택적 mTOR 저해제는 1, 2, 3종 이상의 I형 PI3-키나제에 대한 또는 모든 I형 PI3-키나제에 대한 저해제의 IC50보다 적어도 10배, 적어도 20배, 적어도 50배, 적어도 100배, 적어도 1000배 이상 더 낮은 mTORC1 및/또는 mTORC2에 대한 50% 저해 농도(IC50)를 나타내는 제제를 지칭한다.
mTOR 저해제의 다른 부류는 본 명세서에서 "라팔로그(rapalog)"로서 지칭된다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "라팔로그"는 mTOR FRB 도메인(FKBP 라파마이신 결합 도메인)에 특이적으로 결합하며, 라파마이신과 구조적으로 관련되고, mTOR 저해 특성을 보유하는 화합물을 지칭한다. 용어 라팔로그는 라파마이신을 제외한다. 라팔로그는 라파마이신의 에스터, 에터, 옥심, 하이드라존 및 하이드록실아민뿐만 아니라 라파마이신 코어 구조 상의 작용기가, 예를 들어, 환원 또는 산화에 의해 변형된 화합물을 포함한다. 이러한 화합물의 약제학적으로 허용 가능한 염은 또한 라파마이신 유도체인 것으로 간주된다. 특정 실시형태에서 상정된 방법에서 사용하는 데 적합한 라팔로그의 예시적 예는 템시롤리무스(CC1779), 에베롤리무스(RAD001), 데포롤리무스(AP23573), AZD8055(아스트라제네카(AstraZeneca)) 및 OSI-027(OSI)을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
일 실시형태에서, 제제는 mTOR 저해제 라파마이신 (sirolimus)이다.
특정 실시형태에서, 예시적인 mTOR 저해제는 약 200nM 이하, 바람직하게는 약 100 nm 이하, 훨씬 더 바람직하게는 약 60nM 이하, 약 25nM, 약 10nM, 약 5nM, 약 1nM, 100μM, 50μM, 25μM, 10μM, 1μM 이하의 IC50(활성의 50%를 저해하는 농도)으로 mTORC1, mTORC2 중 하나 또는 mTORC1와 mTORC2 둘 다를 저해한다. 일 양상에서, mTOR 저해제는 약 2nM 내지 약 100 nm, 더 바람직하게는 약 2nM 내지 약 50nM, 훨씬 더 바람직하게는 약 2nM 내지 약 15nM의 IC50으로 mTORC1, mTORC2 중 하나 또는 mTORC1과 mTORC2 둘 다를 저해한다.
일 실시형태에서, 예시적인 mTOR 저해제는 약 200nM 이하, 바람직하게는 약 100 nm 이하, 훨씬 더 바람직하게는 약 60nM 이하, 약 25nM, 약 10nM, 약 5nM, 약 1nM, 100μM, 50μM, 25μM, 10μM, 1μM 이하의 IC50(활성의 50%를 저해하는 농도)으로 PI3K 및 mTORC1 또는 mTORC2 또는 mTORC1 및 mTORC2와 PI3K 둘 다를 저해한다. 일 양상에서, mTOR 저해제는 약 2nM 내지 약 100 nm, 더 바람직하게는 약 2nM 내지 약 50nM, 훨씬 더 바람직하게는 약 2nM 내지 약 15 nM의 IC50으로 PI3K 및 mTORC1 또는 mTORC2 또는 mTORC1과 mTORC2 및 PI3K 둘 다를 저해한다.
특정 실시형태에서 사용하는 데 적합한 mTOR 저해제의 추가적인 예시적인 예는 AZD8055, INK128, 라파마이신, PF-04691502, 및 에베롤리무스를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
mTOR은 웨스턴 블롯팅에서 포스포르-특이적 항체에 의해 측정되는 바와 같이 생리적 기질 단백질, p70 S6 리보솜 단백질 키나제 I(p70S6K1) 및 eIF4E 결합 단백질 1(4EBP1)에 대해 강하고 특이적인 촉매 활성을 입증하는 것으로 나타났다.
일 실시형태에서, PI3K/AKT/mTOR 경로의 저해제는 BI-D1870, H89, PF-4708671, FMK 및 AT7867로 이루어진 군으로부터 선택되는 s6 키나제 저해제이다.
H.
조성물 및 제형
본 명세서에 상정된 조성물은 본 명세서에 상정된 바와 같은 하나 이상의 CAR 폴리펩타이드, 폴리뉴클레오타이드, 이를 포함하는 벡터, 유전자 변형된 면역 효과기 세포 등을 포함할 수 있다. 조성물은 약제학적 조성물을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. "약제학적 조성물"은 단독으로 또는 한 가지 이상의 치료 양상과 조합하여 세포 또는 동물에게 투여를 위한 약제학적으로 허용 가능한 또는 생리적으로 허용 가능한 용액 중에서 제형화된 조성물을 지칭한다. 또한 원한다면, 조성물은 마찬가지로 다른 제제, 예컨대 사이토카인, 성장 인자, 호르몬, 소분자, 화학치료제, 프로드러그, 약물, 항체 또는 다른 다양한 약제학적 활성제와 조합하여 투여될 수 있다는 것이 이해될 것이다. 또한 조성물 중에 포함될 수 있는 다른 성분에 대한 제한은 사실상 없으며, 단, 추가적인 제제는 의도된 요법을 전달하기 위한 조성물의 능력에 유해하게 영향을 미치지 않는다.
어구 "약제학적으로 허용 가능한"은 타당한 의학적 판단의 범주 내에서, 합리적인 유해/유익비에 비례하여 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응 또는 다른 문제 또는 합병증 없이 인간 및 동물의 조직과 접촉하여 사용하기에 적합한 본 명세서에서 해당 화합물, 물질, 조성물 및/또는 투약 형태를 지칭하기 위해 사용된다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "약제학적으로 허용 가능한 담체, 희석제 또는 부형제"는 인간 또는 가축 동물에서의 용도에 허용 가능한 것으로 미식품 의약국(United States Food and Drug Administration)에 의해 승인된 임의의 보조제, 담체, 부형제, 활택제, 감미제, 희석제, 보존제, 염료/착색제, 향미제, 인핸서, 계면활성제, 습윤제, 붕해제, 현탁제, 안정제, 등장제, 용매, 계면활성제, 또는 유화제를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 예시적인 약제학적으로 허용 가능한 담체는 당, 예컨대 락토스, 글루코스 및 수크로스; 전분, 예컨대 옥수수 전분 및 감자 전분; 셀룰로스, 및 이의 유도체, 예컨대 카복시메틸 셀룰로스 나트륨, 에틸 셀룰로스 및 셀룰로스 아세테이트; 트래거캔스; 맥아; 젤라틴; 활석; 코코아 버터, 왁스, 동물 및 식물성 지방, 파라핀, 실리콘, 벤토나이트, 규산, 산화아연; 오일, 예컨대 땅콩유, 면실유, 홍화유, 참깨유, 올리브유, 옥수수유 및 대두유; 글리콜, 예컨대 프로필렌e 글리콜; 폴리올, 예컨대 글리세린, 솔비톨, 만니톨 및 폴리에틸렌 글리콜; 에스터, 예컨대 에틸 올레이트 및 에틸 라우레이트; 한천; 완충제, 예컨대 수산화마그네슘 및 수산화알루미늄; 알긴산; 무발열원수; 등장 식염수; 링거액; 에틸 알코올; 인산염 완충 용액; 및 약제학적 제형에서 사용되는 임의의 다른 적합한 물질을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
특정 실시형태에서, 조성물은 본 명세서에 상정된 CAR-발현 면역 효과기 세포의 양을 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "양"은 임상 결과를 비롯한 유리한 또는 목적하는 예방적 또는 치료적 결과를 달성하기 위한 유전자 변형된 치료적 세포, 예를 들어, T 세포의 "효과적인 양" 또는 "유효량"을 지칭한다.
"예방적 유효량"은 목적하는 예방적 결과를 달성하는 데 효과적인 유전자 변형된 치료적 세포의 양을 지칭한다. 전형적으로 반드시는 아니지만, 예방적 용량이 대상체에서 질환 전에 또는 질환의 초기 병기에서 사용되기 때문에, 예방적 유효량은 치료적 유효량보다 적다.
유전자 변형된 치료 세포의 "치료적 유효량"은 개체의 질환 상태, 연령, 성별 및 체중과 같은 인자, 및 개체의 목적하는 반응을 일으키는 줄기 및 조상세포의 능력에 따라 다를 수 있다. 치료적 유효량은 또한 바이러스 또는 형질도입된 치료적 세포의 임의의 독성 또는 유해한 효과가 치료적으로 유리한 효과보다 더 큰 것이다. 용어 "치료적 유효량"은 대상체(예를 들어, 환자)를 "치료하는데" 효과적인 본 명세서에 상정된 CTBR 신호 컨버터를 포함하는 세포의 양을 지칭한다. 치료적 양이 표시될 때, 투여될 조성물의 정확한 양은 환자(대상체)의 연령, 체중, 종양 크기, 감염 또는 전이 정도, 및 병태의 개체 차이를 고려하여 의사에 의해 결정될 수 있다. 본 명세서에 기재된 면역 효과기 세포를 포함하는 약제학적 조성물은 102 내지 1010개의 세포/㎏ 체중, 바람직하게는 105 내지 106개의 세포/㎏ 체중(해당 범위 내의 모든 정수값을 포함)의 투약량으로 투여될 수 있다는 것이 일반적으로 언급될 수 있다. 세포수는 그에 포함된 세포 유형에서 조성물에 의도된 궁극의 용도에 의도될 것이다. 본 명세서에 제공된 용도에 대해, 세포는 일반적으로 1리터 이하의 용적이고, 500㎖ 이하, 심지어 250㎖ 또는 100㎖ 이하일 수 있다. 따라서, 목적으로 하는 세포의 밀도는 전형적으로 106개 초과의 세포/㎖이고, 일반적으로 107개 초과의 세포/㎖, 일반적으로 108개 이상의 세포/㎖이다. 임상적으로 적절한 수의 면역 세포가 105, 106, 107, 108, 109, 1010, 1011 또는 1012개의 세포와 누적적으로 동일하거나 또는 초과하는 다중 주입으로 배분될 수 있다. 일부 양상에서, 특히 모든 주입 세포가 특정 표적 항원으로 전향되기 때문에, 106개/킬로그램의 범위(106 내지 1011개/환자)에서 더 적은 수의 세포가 투여될 수 있다. CAR 발현 세포 조성물은 이들 범위 내의 투약량에서 다회 투여될 수 있다. 세포는 요법을 받는 환자에 대해 동종이계, 동계, 이종성 또는 자가일 수 있다. 원한다면, 치료는 또한 면역 반응의 유도를 향상시키기 위해 본 명세서에 기재된 바와 같은 미토겐(예를 들어, PHA) 또는 림포카인, 사이토카인 및/또는 케모카인(예를 들어, IFN-γ, IL-2, IL-12, TNF-알파, IL-18 및 TNF-베타, GM-CSF, IL-4, IL-13, Flt3-L, RANTES, MIP1α 등)의 투여를 포함할 수 있다.
일반적으로, 본 명세서에 기재된 바와 같이 활성화되고 확장된 세포를 포함하는 조성물은 면역 손상된 개체에서 생기는 질환의 치료 및 예방에서 이용될 수 있다. 특정 실시형태에서, 본 명세서에 상정된 CAR-변형 T 세포를 포함하는 조성물은 암 치료에서 사용된다. CAR-변형 T 세포는 단독으로 또는 담체, 희석제, 부형제와 그리고/또는 다른 성분, 예컨대 IL-2 또는 다른 사이토카인 또는 세포 집단과 조합하여 약제학적 조성물로서 투여될 수 있다. 특정 실시형태에서, 약제학적 조성물은 하나 이상의 약제학적으로 또는 생리적으로 허용 가능한 담체, 희석제 또는 부형제와 조합된 유전자 변형 T 세포의 양을 포함한다.
CAR-발현 면역 효과기 세포 집단, 예컨대 T 세포를 포함하는 약제학적 조성물은 완충제, 예컨대 중성 완충 식염수, 인산염 완충 식염수 등; 탄수화물, 예컨대 글루코스, 만노스, 수크로스 또는 덱스트란, 만니톨; 단백질; 폴리펩타이드 또는 아미노산, 예컨대 글리신; 항산화제; 킬레이트제, 예컨대 EDTA 또는 글루타티온; 보조제(예를 들어, 수산화알루미늄); 및 보존제를 포함할 수 있다. 조성물은 바람직하게는 비경구 투여, 예를 들어, 혈관내(정맥내 또는 동맥내), 복막내 또는 근육내 투여를 위해 제형화된다.
액체 약제학적 조성물은, 이들이 용액이든, 현탁액이든 또는 기타 유사한 형태이든, 다음 중 하나 이상을 포함할 수 있다: 멸균 희석제, 예컨대 주사용수, 식염수 용액, 바람직하게는 생리 식염수, 링거액, 등장성 염화나트륨, 고정유, 예컨대 용매 또는 현탁 매질로서 작용할 수 있는 합성 모노 또는 다이글리세라이드, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 다른 용매; 항박테리아제, 예컨대 벤질 알코올 또는 메틸 파라벤; 항산화제, 예컨대 아스코브산 또는 아황산수소나트륨; 킬레이트제, 예컨대 에틸렌다이아민테트라아세트산; 완충제, 예컨대 아세테이트, 시트레이트 또는 포스페이트 및 염화나트륨 또는 덱스트로스와 같은 등장 조절을 위한 제제. 비경구 제제는 앰플, 1회용 주사기 또는 유리 또는 플라스틱으로 이루어진 다회 용량 바이알에 밀봉될 수 있다. 주사 가능한 약제학적 조성물은 바람직하게는 멸균이다.
일 실시형태에서, 본 명세서에 상정된 T 세포 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 세포 배양 배지에서 제형화된다. 이러한 조성물은 인간 대상체에 대한 투여에 적합하다. 특정 실시형태에서, 약제학적으로 허용 가능한 세포 배양 배지는 무혈청 배지이다.
무혈청 배지는 단순화된 그리고 보다 잘 한정된 조성물, 감소된 정도의 오염물질, 감염제의 잠재적 공급원의 제거, 및 보다 저비용을 비롯하여, 혈청 함유 배지 이상의 몇 가지 이점을 가진다. 다양한 실시형태에서, 무 혈청 배지는 무-동물(animal-free)이며, 선택적으로 무-단백질일 수 있다. 선택적으로, 배지는 생체약제학적으로 허용 가능한 재조합 단백질을 함유할 수 있다. "무-동물" 배지는 성분이 비동물 공급원으로부터 유래된 배지를 지칭한다. 재조합 단백질은 무동물 배지에서 천연 동물 단백질을 대체하고, 영양소는 합성, 식물 또는 미생물 공급원으로부터 얻는다. "무 단백질" 배지는 대조적으로 단백질이 실질적으로 없는 것으로 정의된다.
특정 조성물에서 사용되는 무혈청 배지의 예시적 예는 QBSF-60(퀄러티 바이올로지컬 인코포레이티드(Quality Biological, Inc.)), 스템프로-34(StemPro-34)(라이프 테크놀로지즈(Life Technologies)) 및 X-VIVO 10을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
일 바람직한 실시형태에서, 본 명세서에 상정된 면역 효과기 세포를 포함하는 조성물은 플라즈마라이트 A(PlasmaLyte A)를 포함하는 용액에서 제형화된다.
다른 바람직한 실시형태에서, 본 명세서에 상정된 면역 효과기 세포를 포함하는 조성물은 저온보존 배지를 포함하는 용액에서 제형화된다. 예를 들어, 저온보존제가 있는 저온보존 배지는 해동 후 높은 세포 생존도 결과를 유지하는 데 사용될 수 있다. 특정 조성물에서 사용되는 저온보존 배지의 예시적 예는 CryoStor CS10, CryoStor CS5 및 CryoStor CS2를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
더 바람직한 실시형태에서, 본 명세서에 상정된 면역 효과기 세포를 포함하는 조성물은 50:50의 PlasmaLyte A 대 CryoStor CS10을 포함하는 용액에서 제형화된다.
특정 실시형태에서, 조성물은 유효량의 CAR-발현 면역 효과기 세포를 단독으로 또는 1종 이상의 치료제와 조합하여 포함한다. 따라서, CAR-발현 면역 효과기 세포 조성물은 단독으로 또는 방사선 요법, 화학요법, 이식, 면역요법, 호르몬 요법, 광역학 요법 등과 같은 다른 공지된 암 치료와 조합하여 투여될 수 있다. 조성물은 또한 항생제와 병용하여 투여될 수 있다. 이러한 치료제는 본 명세서에 기재된 특정 질환 상태, 예컨대 특정 암을 위한 표준 치료로서 당업계에서 허용될 수 있다. 특정 실시형태에서 상정된 예시적 치료제는 사이토카인, 성장 인자, 스테로이드, NSAID, DMARD, 항-염증제, 화학치료제, 방사선치료제, 치료적 항체 또는 다른 활성 및 보조제를 포함한다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 CAR-발현 면역 효과기 세포를 포함하는 면역 효과기 세포를 포함하는 조성물은 다수의 화학치료제와 함께 투여될 수 있다. 화학치료제의 예시적 예는 알킬화제, 예컨대 티오테파 및 사이클로포스파마이드(사이톡산(CYTOXAN)(상표명)); 알킬 설포네이트, 예컨대 부설판, 임프로설판 및 피포설판; 아지리딘, 예컨대 벤조도파, 카보쿠온, 메투레도파, 및 유레도파; 에틸렌이민 및 알트레타민을 포함하는 메틸아멜라민, 트라이에틸렌멜라민, 트라이에틸렌포스포르아마이드, 트라이에틸렌티오포스포르아마이드 및 트라이메틸롤로멜라민 레주메; 질소 머스터드, 예컨대 클로람부실, 클로르나파진, 클로로포스파마이드, 에스트라무스틴, 이포스파마이드, 메클로르에타민, 메클로르에타민 옥사이드 하이드로클로라이드, 멜팔란, 노벰비신, 페네스테린, 프레드니무스틴, 트로포스파마이드, 유라실 머스터드; 나이트로스유레아, 예컨대 카무스틴, 클로로조토신, 포테무스틴, 로무스틴, 니무스틴, 라니무스틴; 항생제, 예컨대 아클라시노마이신, 악티노마이신, 오트라마이신, 아자세린, 블레오마이신, 칵티노마이신, 칼리케아마이신, 카라비신, 카르미노마이신, 카지노필린, 크로모마이신, 닥티노마이신, 다우노루비신, 데토루비신, 6-다이아조-5-옥소-L-노르류신, 독소루비신, 에피루비신, 에소루비신, 이다루비신, 마르셀로마이신, 미토마이신, 마이코페놀산, 노갈라마이신, 올리보마이신, 페플로마이신, 포트피로마이신, 퓨로마이신, 무엘라마이신, 로도루비신, 스트렙토니그린, 스트렙토조신, 투베르시딘, 유베니멕스, 지노스타틴, 조루비신; 항-대사제, 예컨대 메토트렉세이트 및 5-플루오로유라실(5-FU); 엽산 유사체, 예컨대 데노프테린, 메토트렉세이트, 프테로프테린, 트라이메트렉세이트; 퓨린 유사체, 예컨대 플루다라빈, 6-머캅토퓨린, 티아미프린, 티오구아닌; 피리미딘 유사체, 예컨대 안시타빈, 아자시티딘, 6-아자유리딘, 카모푸르, 사이타라빈, 다이데옥시유리딘, 독시플루리딘, 에노시타빈, 플록수리딘, 5-FU; 안드로겐, 예컨대 칼루스테론, 드로모스타놀론 프로피오네이트, 에피티오스탄올, 메피티오스탄, 테스톨락톤; 항-부신제, 예컨대 아미노글루테티마이드, 미토탄, 트라이로스탄; 엽산 보충제, 예컨대 프롤린산; 아세글라톤; 알도포스파마이드 글리코사이드; 아미노레불린산; 암사크린; 베스트라뷰실; 비산트렌; 에다트라세이트; 데포파민; 데메콜신; 다이아지쿠온; 엘포미틴; 엘립티늄 아세테이트; 에토글루시드; 질산갈륨; 하이드록시유레아; 렌티난; 로니다민; 미토구아존; 미톡산트론; 모피다몰; 나이트라크린; 펜토스타틴; 페나메트; 피라루비신; 포도필린산; 2-에틸하이드라자이드; 프로카바진; PSK(등록상표); 라족산; 시조피란; 스피로게르마늄; 테누아진산; 트라이아지쿠온; 2,2',2"-트라이클로로트라이에틸아민; 유레탄; 빈데신; 다카바진; 만노무스틴; 미토브로니톨; 미톨락톨; 피포브로만; 가사이토신; 아라비노사이드("Ara-C"); 사이클로포스파마이드; 티오테파; 탁소이드, 예를 들어, 파클리탁셀(탁솔(TAXOL)(등록상표), 뉴저지주 프린스턴에 소재한 브리스톨-마이어스 스큅 옹콜로지(Bristol-Myers Squibb Oncology)) 및 도세탁셀(탁소텔(TAXOTERE)(등록상표), 프랑스 앙토니에 소재한 론-플랑크 로어(Rhne-Poulenc Rorer)); 클로람부실; 겜시타빈; 6-티오구아닌; 머캅토퓨린; 메토트렉세이트; 백금 유사체, 예컨대 시스플라틴 및 카보플라틴; 빈블라스틴; 백금; 에토포사이드(VP-16); 이포스파마이드; 미토마이신 C; 미톡산트론; 빈크리스틴; 비노렐빈; 나벨빈; 노반트론; 테니포사이드; 다우노마이신; 아미노프테린; 젤로다; 이반드로네이트; CPT-11; 토포아이소머라제 저해제 RFS 2000; 다이플루오로메틸로미틴(DMFO); 레티노산 유도체, 예컨대 타르그레틴(Targretin)(상표명)(벡사로텐), 판레틴(Panretin)(상표명)(알리트레티노인); ONTAK(상표명)(데니류킨 디프티톡스); 에스페라미신; 카페시타빈; 및 상기 중 어떤 것의 약제학적으로 허용 가능한 염, 산 또는 유도체를 포함한다. 또한, 예를 들어 타목시펜, 랄록시펜, 방향화효소 저해 4(5)-이미다졸, 4-하이드록시타목시펜, 트라이옥시펜, 케옥시펜, LY117018, 오나프리스톤 및 토레미펜(파레스톤(Fareston)); 및 항-안드로겐, 예컨대 플루타마이드, 닐루타마이드, 바이칼루타마이드, 류프롤라이드 및 고세렐린; 및 상기 중 어떤 것의 약제학적으로 허용 가능한 염, 산 또는 유도체를 포함하는, 암에 대해 호르몬 작용을 조절하거나 또는 저해하는 작용을 하는 항-호르몬제, 예컨대 항-에스트로겐이 본 정의에 포함된다.
다양한 다른 치료제가 본 명세서에 기재된 조성물과 함께 사용될 수 있다. 일 실시형태에서, CAR-발현 면역 효과기 세포를 포함하는 조성물은 항-염증제와 함께 투여된다. 항-염증제 또는 약물은 스테로이드 및 글루코코르티코이드(베타메타손, 부데소나이드, 덱사메타손, 하이드로코티손 아세테이트, 하이드로코티손, 하이드로코티손, 메틸프레드니솔론, 프레드니솔론, 프레드니손, 트라이아미시놀론을 포함), 아스피린, 이부프로펜, 나프록센을 포함하는 비스테로이드 항-염증 약물(NSAIDS), 메토트렉세이트, 설파살라진, 레플루로마이드, 항-TNF 의약, 사이클로포스파마이드 및 마이코페놀레이트를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
다른 예시적 NSAID는 이부프로펜, 나프록센, 나프록센 나트륨, Cox-2 저해제, 예컨대 VIOXX(등록상표)(레페콕십) 및 셀레브렉스(CELEBREX)(등록상표)(셀레콕십) 및 시알릴레이트로 이루어진 군으로부터 선택된다. 예시적인 진통제는 아세트아마노펜, 옥시코돈, 프로폭시펜 하이드로클로라이드의 트라마돌로 이루어진 군으로부터 선택된다. 예시적인 글루코코르티코이드는 코티손, 덱사메타손, 하이드로코티손, 메틸프레드니솔론, 프레드니솔론 또는 프레드니손으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 예시적인 생물학적 반응 변형제는 세포 표면 마커(예를 들어, CD4, CD5 등), 사이토카인 저해제, 예컨대 TNF 길항제(예를 들어, 에타너셉트(엔브렐(ENBREL)(등록상표)), 아달리무맙(휴미라(HUMIRA)(등록상표)) 및 이플릭시맙(레미케이드(REMICADE)(등록상표)), 케모카인 저해제 및 접착 분자 저해제에 관련된 분자를 포함한다. 생물학적 반응 변형제는 단클론성 항체뿐만 아니라 분자의 재조합 형태를 포함한다. 예시적인 DMARD는 아자티오프린, 사이클로포스파마이드, 사이클로스포린, 메토트렉세이트, 페니실라민, 레플루노마이드, 설파살라진, 하이드록시클로로퀸, 골드(Gold)(경구(아우라노핀) 및 근육내) 및 미노사이클린을 포함한다.
특정 실시형태에 상정된 CAR 변형된 T 세포와 조합하기에 적합한 치료 항체의 예시적 예는 아테졸리주맙, 아벨루맙, 바비툭시맙, 베바시주맙(아바스틴), 비바투주맙, 블리나투모맙, 코나투무맙, 크리조티닙, 다라투무맙, 둘리고투맙, 다세투주맙, 달로투주맙, 두르발루맙, 엘로투주맙(HuLuc63), 겜투주맙, 이브리투모맙, 인다툭시맙, 이노투주맙, 이필리무맙, 로르보투주맙, 루카투무맙, 밀라투주맙, 목세투모맙, 니볼루맙, 오카라투주맙, 오파투무맙, 펨브롤리주맙, 리툭시맙, 실툭시맙, 테프로투무맙 및 유블리툭시맙을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
소정의 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 조성물은 사이토카인과 함께 투여된다. 본 명세서에 사용된 바와 같은 "사이토카인"은 세포내 매개체로서 다른 세포상에서 작용하는 하나의 세포 집단에 의해 방출된 단백질에 대한 일반 용어를 의미한다. 이러한 사이토카인의 예는 림포카인, 모노카인 및 전통적 폴리펩타이드 호르몬이다. 사이토카인 중에서 성장 호르몬, 예컨대 인간 성장 호르몬, N-메티오닐 인간 성장 호르몬, 및 소 성장 호르몬; 부갑상선 호르몬; 티록신; 인슐린; 프로인슐린; 릴랙신; 프로릴랙신; 당단백질 호르몬, 예컨대 여포 자극 호르몬(FSH), 갑상선 자극 호르몬(TSH) 및 황체형성 호르몬(LH); 간 성장 인자; 섬유아세포 성장 인자; 프로락틴; 태반 락토겐; 종양 괴사 인자-알파 및 -베타; 뮐러-저해 물질; 마우스 성선자극호르몬-연관 펩타이드; 인히빈; 액티빈; 혈관내피성장인자; 인테그린; 트롬보포이에틴(TPO); 신경 성장 인자, 예컨대 NGF-베타; 혈소판-성장 인자; 형질전환 성장 인자(TGF), 예컨대 TGF-알파 및 TGF-베타; 인슐린-유사 성장 인자-I 및 -II; 에리트로포이에틴(EPO); 골유도 인자; 인터페론, 예컨대 인터페론-알파, 베타 및 -감마; 콜로니 자극 인자(CSF), 예컨대 대식세포-CSF(M-CSF); 과립구-대식세포-CSF(GM-CSF); 및 과립구-CSF(G-CSF); 인터류킨(IL), 예컨대 IL-1, IL-1알파, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12; IL-15, 종양 괴사 인자, 예컨대 TNF-알파 또는 TNF-베타; 및 LIF 및 키트 리간드(KL)를 포함하는 다른 폴리펩타이드 인자가 포함된다. 본 명세서에서 사용되는 용어 사이토카인은 천연 공급원으로부터의 또는 재조합 세포 배양물 및 천연 서열 사이토카인의 생물학적으로 활성인 동등물로부터의 단백질을 포함한다.
특정 실시형태에서, 조성물은 PI3K 저해제의 존재 하에 배양되고 다음의 마커: CD3, CD4, CD8, CD27, CD28, CD45RA, CD45RO, CD62L, CD127 중 하나 이상을 발현시키는 본 명세서에 상정된 CAR T 세포를 포함하며, HLA-DR은 양성 또는 음성 선택 기법에 의해 추가로 단리될 수 있다. 일 실시형태에서, 조성물은 i) CD62L, CCR7, CD28, CD27, CD122, CD127, CD197; ii) CD62L, CD127, CD197, CD38; 및 iii) CD62L, CD27, CD127, 및 CD8로 이루어진 군으로부터 선택되는 마커 중 하나 이상을 발현시키는, T 세포의 특이적 하위집단을 포함하며, 양성 또는 음성 선택 기법에 의해 더 단리된다. 다양한 실시형태에서, 조성물은 다음의 마커 중 하나 이상을 발현시키지 않거나 실질적으로 발현시키지 않는다: CD57, CD244, CD160, PD-1, CTLA4, TIM3 및 LAG3.
일 실시형태에서, CD62L, CD127, CD197 및 CD38로 이루어진 군으로부터 선택되는 마커 중 하나 이상의 발현은 PI3K 저해제 없이 활성화되고 확장된 T 세포 집단에 비해 적어도 1.5배, 적어도 2배, 적어도 3배, 적어도 4배, 적어도 5배, 적어도 6배, 적어도 7배, 적어도 8배, 적어도 9배, 적어도 10배, 적어도 25배 이상 증가된다.
일 실시형태에서, CD62L, CD127, CD27 및 CD8로 이루어진 군으로부터 선택되는 마커 중 하나 이상의 발현은 PI3K 저해제 없이 활성화되고 확장된 T 세포 집단에 비해 적어도 1.5배, 적어도 2배, 적어도 3배, 적어도 4배, 적어도 5배, 적어도 6배, 적어도 7배, 적어도 8배, 적어도 9배, 적어도 10배, 적어도 25배 이상 증가된다.
일 실시형태에서, CD57, CD244, CD160, PD-1, CTLA4, TIM3 및 LAG3으로 이루어진 군으로부터 선택되는 마커 중 하나 이상의 발현은 PI3K 저해제 없이 활성화되고 확장된 T 세포 집단에 비해 적어도 1.5배, 적어도 2배, 적어도 3배, 적어도 4배, 적어도 5배, 적어도 6배, 적어도 7배, 적어도 8배, 적어도 9배, 적어도 10배, 적어도 25배 이상 감소된다.
I.
표적 세포 및 항원
표적 세포, 예를 들어, 암세포로 전향되고, 표적 세포 상의 CD79A에 결합하는 결합 도메인을 갖는 CAR을 포함하는 유전자 변형된 면역 효과기 세포가 특정 실시형태에서 제공된다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "암"은 일반적으로 비정상 세포가 제어 없이 분할되고 가까운 조직을 침윤할 수 있는 질환 또는 병태 부류에 관한 것이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "악성종양"은 종양 세포의 그룹이 제어되지 않는 성장(즉, 정상 한계 이상의 분할), 침윤(즉, 인접한 조직 상의 침범 및 파괴) 및 전이(즉, 림프 또는 혈액을 통한 신체 내 다른 위치로의 확산) 중 하나 이상을 나타내는 암을 지칭한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "전이하다"는 신체의 한 부분으로부터 다른 부분까지의 암의 확산을 지칭한다. 확산을 갖는 세포에 의해 형성된 종양은 "전이성 종양" 또는 "전이"로 불린다. 전이성 종양은 본래의(원발성) 종양에서와 유사한 세포를 함유한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "양성" 또는 "비악성"은 더 크게 성장할 수 있지만, 신체의 다른 부분으로 확산되지 않는 종양을 지칭한다. 양성 종양은 자기 제한적이며, 전형적으로 침윤하거나 또는 전이하지 않는다.
"암세포"는 암성 성장의 개개 세포 또는 조직을 지칭한다. 암세포는 고형암과 액상암을 둘 다 포함한다. "종양" 또는 "종양 세포"는 일반적으로 양성, 전악성 또는 악성일 수 있는 세포의 비정상적 성장에 의해 형성되는 팽윤 또는 병변을 지칭한다. 대부분의 암은 종양을 형성하지만, 액상암, 예를 들어, 백혈병은 반드시 종양을 형성하지는 않는다. 종양을 형성하는 해당 암에 대해, 용어 암(세포)과 종양(세포)은 상호 호환적으로 사용된다. 개체에서 종양의 양은 종양의 수, 용적 또는 중량으로서 측정될 수 있는 "종양 부담"이다.
용어 "재발"은 개선 또는 관해 기간 후에 암의 복귀, 또는 복귀의 징후 및 증상의 진단을 지칭한다.
"관해"는 또한 "임상 관해"로서 지칭되고, 부분적 관해와 완전한 관해를 둘 다 포함한다. 특정 관해에서, 모두는 아니지만 일부 암 징후 및 증상은 사라졌다. 완전한 관해에서, 암이 여전히 신체에 있을 수도 있지만, 암의 모든 징후 및 증상은 사라졌다.
"난치성"은 특정 치료제에 의하나 요법에 대해 내성이 있거나 또는 비반응성인 암을 지칭한다. 암은 치료의 개시로부터 난치성(즉, 치료제에 대한 초기 노출에 대해 비반응성) 또는 제1 치료 기간 과정에 걸쳐 또는 후속적 치료 기간 동안에 치료제에 대해 발생되는 내성의 결과로서 난치성일 수 있다.
일 실시형태에서, 표적 세포는 다른 정상(목적하는) 세포의 표면 상에서 실질적으로 발견되지 않는 항원, 예를 들어, 표적 항원을 발현시킨다.
일 실시형태에서, 표적 세포는 조혈 세포, 림프모양 세포 또는 골수성 세포이다.
특정 실시형태에서, 표적 세포는 혈액, 림프모양 조직, 또는 골수모양 조직의 일부이다.
특정 실시형태에서, 표적 세포는 CD79A를 발현시키는 암세포 또는 암 줄기 세포이다.
특정 실시형태에서, 표적 세포는 CD79A를 발현시키는 액상암 세포 또는 혈액암 세포이다.
특정 실시형태에서 상정된 조성물에 의해 예방되거나, 치료되거나, 개선될 수 있는 액상암 또는 혈액암의 예시적 예는 백혈병, 림프종 및 다발성 골수종을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
특정 실시형태에서 상정된 항-CD79A CAR에 의해 표적화될 수 있는 세포의 예시적 예는 다음의 백혈병의 세포를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다: 급성 림프구성 백혈병(ALL), 급성 골수성 백혈병(AML), 골수모구성, 전골수구성, 골수단핵구, 단핵구, 적백혈병, 모발세포 백혈병(HCL), 만성 림프구성 백혈병(CLL) 및 만성 골수성 백혈병(CML), 만성 골수단핵구 백혈병(CMML) 및 진성다혈구증.
특정 실시형태에 상정된 조성물 및 방법에 의해 표적화될 수 있는 세포의 예시적 예는 다음의 림프종의 세포를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다: 호지킨 림프종, 결절성 림프구-우세 호지킨 림프종, 및 B-세포 비호지킨 림프종: 버킷 림프종, 소형 림프구성 림프종(SLL), 미만성 거대 B 세포 림프종(DLBCL), 여포성 림프종, 면역아세포 거대 세포 림프종, 전구체 B-림프아구성 림프종, 및 맨틀세포 림프종을 포함하지만, 이것으로 제한되지 않는 비호지킨 림프종; 및 T-세포 비호지킨 림프종: 균상식육종, 역형성 대세포 림프종, 세자리 증후군, 및 전구체 T-림프아구성 림프종을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
특정 실시형태에서 상정된 조성물 및 방법에 의해 표적화될 수 있는 세포의 예시적인 예는 다음의 다발성 골수종 세포를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다: 현성 다발성 골수종, 무증상 다발성 골수종(MGUS), 형질세포 백혈병, 비분비성 골수종, IgD 골수종, 골경화성 골수종, 고립성 골형질세포종, 및 골수외 형질세포종.
바람직한 실시형태에서, 표적 세포를 발현시키는 CD79A는 DLBCL 암 세포이다.
J.
치료 방법
본 명세서에 상정된 유전자 변형된 면역 효과기 세포는 CD79A를 발현시키는 암의 예방, 치료 및 개선에서 사용하기 위한 또는 CD79A 발현 암과 관련된 적어도 하나의 증상을 예방하거나, 치료하거나 또는 개선시키기 위한 양자 면역요법의 개선된 방법을 제공한다.
다양한 실시형태에서, 본 명세서에 상정된 유전자 변형된 면역 효과기 세포는 대상체에서 CD79A를 발현시키는 암 세포에서 세포독성을 증가시키는 데 또는 대상체에서 CD79A를 발현시키는 암 세포 수를 감소시키는 데 사용하기 위한 입양 면역요법의 개선된 방법을 제공한다.
특정 실시형태에서, 1차 면역 효과기 세포의 특이성은 본 명세서에 상정된 CAR을 이용하여 1차 면역 효과기 세포를 유전자 변형시킴으로써, CD79A를 발현시키는 세포, 예를 들어, 암 세포로 전향된다. 다양한 실시형태에서, 바이러스 벡터는 CD79A 폴리펩타이드에 결합하는 항-CD79A 항원 결합 도메인; 힌지 도메인; 막관통(TM) 도메인, 즉, CAR의 세포내 신호전달 도메인에 TM 도메인을 연결하는 짧은 올리고- 또는 폴리펩타이드 링커; 및 하나 이상의 세포내 공자극 신호전달 도메인; 및 1차 신호전달 도메인을 포함하는, CAR을 암호화하는 특정 폴리뉴클레오타이드를 이용하여 면역 효과기 세포를 유전자 변형시키는 데 사용된다.
일 실시형태에서, CD79A 발현 암 세포를 표적화하는 항-CD79A CAR을 발현시키도록 유전자 변형되고, CAR T 세포가 세포 요법을 필요로 하는 수용자에게 주입되는, 세포 요법의 유형이 제공된다. 주입된 세포는 수용자에서 질환 유발 세포를 사멸시킬 수 있다. 항체 요법과 달리, CAR T 세포는 생체내에서 복제되어 지속된 암 요법을 야기할 수 있는 장기간 지속성을 초래할 수 있다.
일 실시형태에서, 항-CD79A CAR T 세포는 강한 생체내 T 세포 확장을 겪을 수 있고, 연장된 시간의 양 동안 지속될 수 있다. 다른 실시형태에서, 항-CD79A CAR T 세포는 임의의 추가적인 종양 형성 또는 성장을 저해하기 위해 재활성화될 수 있는 특이적 기억 T 세포 또는 줄기 세포 기억 T 세포를 진화시킨다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에 상정된 CAR을 포함하는 면역 효과기 세포를 포함하는 조성물은 CD79A 발현 암 세포 또는 암 줄기 세포와 연관된 병태 치료에서 사용된다.
CAR을 포함하는 면역 효과기 세포를 이용하여 치료되거나, 예방되거나 개선될 수 있는 병태의 예시적 예가 특정 실시형태에서 상정된다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에 상정된 CAR-변형 T 세포를 포함하는 조성물은 액상암 또는 혈액암의 치료에서 사용된다.
특정 실시형태에서, 액상암 또는 혈액암은 백혈병, 림프종 및 다발성 골수종으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 실시형태에서, 액상암 또는 혈액암은 급성 림프구성 백혈병(ALL), 급성 골수성 백혈병(AML), 골수모구성, 전골수구성, 골수단핵구, 단핵구, 적백혈병, 모발세포 백혈병(HCL), 만성 림프구성 백혈병(CLL), 및 만성 골수성 백혈병(CML), 만성 골수단핵구 백혈병(CMML) 및 진성다혈구증, 호지킨 림프종, 결절성 림프구-우세 호지킨 림프종, 버킷 림프종, 소형 림프구성 림프종(SLL), 미만성 거대 B 세포 림프종, 여포성 림프종, 면역아세포 거대 세포 림프종, 전구체 B-림프아구성 림프종, 맨틀세포 림프종, 변연대 림프종, 균상식육종, 역형성 대세포 림프종, 세자리 증후군, 전구체 T-림프아구성 림프종, 다발성 골수종, 현성 다발성 골수종, 무증상 다발성 골수종, 형질세포 백혈병, 비분비성 골수종, IgD 골수종, 골경화성 골수종, 고립성 골형질세포종, 및 골수외 형질세포종으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 실시형태에서, 액상암 또는 혈액암은 급성 림프구성 백혈병(ALL), 만성 림프구성 백혈병(CLL), 모발세포 백혈병(HCL), 다발성 골수종(MM), 급성 골수성 백혈병(AML) 또는 만성 골수성 백혈병(CML)으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
바람직한 실시형태에서, 액상암 또는 혈액암은 DLBCL이다.
바람직한 실시형태에서, 액상암 또는 혈액암은 재발/난치성 DLBCL이다.
특정 실시형태에서, 치료적 유효량의 본 명세서에 상정된 항-CD79A CAR-발현 면역 효과기 세포 또는 이를 포함하는 조성물을 치료가 필요한 환자에게 단독으로 또는 1종 이상의 치료제와 병용하여 투여하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다. 특정 실시형태에서, 세포는 CD79A를 발현시키는 암 세포와 연관된 병태가 발생할 위험에 있는 환자의 치료에서 사용된다. 따라서, 특정 실시형태에서, 치료적 유효량의 본 명세서에 상정된 CAR-변형 세포를 암 치료 또는 예방 또는 개선이 필요한 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 암의 적어도 하나의 증상의 치료 또는 예방을 위한 방법이 제공된다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "개체" 및 "대상체"는 종종 상호 호환적으로 사용되며, 유전자 요법 벡터, 세포 기반 치료제, 및 본 명세서의 다른 곳에 상정된 방법으로 치료될 수 있는 질환, 장애 또는 병태의 증상을 나타내는 임의의 동물을 지칭한다. 바람직한 실시형태에서, 대상체는 유전자 요법 벡터, 세포 기반 치료제, 및 본 명세서의 다른 곳에 상정된 방법으로 치료될 수 있는 암과 관련된 질환, 장애 또는 병태 증상을 나타내는 임의의 동물을 포함한다. 적합한 대상체(예를 들어, 환자)는 실험실 동물(예컨대, 마우스, 래트, 토끼 또는 기니피그), 농장 동물 및 가축 동물 또는 반려동물(예컨대, 고양이 또는 개)을 포함한다. 비인간 영장류 및 바람직하게는 인간 환자가 포함된다. 전형적인 대상체는 CD79A 발현 암을 갖거나, CD79A 발현 암으로 진단되었거나, CD79A 발현 암, 예를 들어, DLBCL의 위험에 있거나 이를 갖는 인간 환자를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "환자"는 유전자 요법 벡터, 세포-기반 치료제, 및 본 명세서의 다른 곳에 개시된 방법으로 치료될 수 있는 특정 질환, 장애 또는 병태로 진단된 대상체를 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 "치료" 또는 "치료하는"은 질환 또는 병리적 병태의 증상 또는 병리에 대한 임의의 유리한 또는 바람직한 효과를 포함하고, 치료 중인 질환 또는 병태 중 하나 이상의 측정 가능한 마커의 심지어 최소 감소를 포함할 수 있다. 치료는 선택적으로 질환 또는 병태의 감소 또는 질환 또는 병태 진행의 지연을 수반할 수 있다. "치료"는 질환 또는 병태, 또는 이의 관련된 증상의 완전한 근절 또는 치유를 반드시 나타내지는 않는다.
본 명세서에서 사용하는 바와 같은, "예방하다" 및 유사한 단어, 예컨대 "예방되는", "예방하는" 등은 질환 또는 병태의 발생 또는 재발 가능성을 예방하거나, 저해하거나 또는 감소시키기 위한 접근을 나타낸다. 또한 질환 또는 병태의 개시 또는 재발을 지연시키거나 또는 질환 또는 병태의 발생 또는 재발을 지연시키는 것을 지칭한다. 본 명세서에서 사용하는 바와 같은 "예방" 및 유사한 단어는 또한 질환 또는 병태의 개시 또는 재발 전에 질환 또는 병태의 강도, 효과, 증상 및/또는 부담을 감소시키는 것을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 어구 "의 적어도 하나의 증상을 개선시키는"은 대상체에 대해 치료 중인 질환 또는 병태의 하나 이상의 증상을 감소시키는 것을 지칭한다. 특정 실시형태에서, 치료 중인 질환 또는 병태는 암이되, 개선될 하나 이상의 증상은 쇠약, 피로, 숨가쁨, 잦은 멍 및 출혈, 빈번한 감염, 림프절 비대, 복부 팽창 또는 복부 통증(팽창된 복부 기관에 기인), 뼈 또는 관절 통증, 골절, 계획하지 않은 체중 감소, 식욕 부진, 도한, 지속적 미열 및 감소된 배뇨작용(손상된 신장 기능에 기인)을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
"향상시키다" 또는 "촉진시키다" 또는 "증가시키다" 또는 "확장하다" 또는 "강화하다"는 일반적으로 비히클 또는 대조군 중 하나에 의해 야기되는 반응에 비해 더 큰 반응 생리적 반응(즉, 하류 효과)을 생산하거나, 유발하거나 또는 야기하기 위한 본 명세서에 상정된 조성물, 예를 들어, 유전자 변형된 T 세포 또는 CAR을 암호화하는 벡터의 능력을 지칭한다. 측정 가능한 생리적 반응은, 특히 당업계 및 본 명세서의 설명에서의 이해로부터 분명한 T 세포 확장, 활성화, 지속성, 사이토카인 분비의 증가 및/또는 암 세포 사멸 능력의 증가를 포함할 수 있다. "증가된" 또는 "향상된" 양은 전형적으로 "통계적으로 유의한" 양이고, 비히클 또는 대조군에 의해 생산되는 반응의 1.1, 1.2, 1.5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30배 이상(예를 들어, 500, 1000배)(그 사이의 그리고 1 초과의 모든 정수 및 소수점을 포함, 예를 들어, 1.5, 1.6, 1.7. 1.8 등)인 증가를 포함할 수 있다.
"감소시키다" 또는 "낮추다" 또는 "줄이다" 또는 "줄어들게 하다" 또는 "없애다"는 일반적으로 비히클 또는 대조군 중 하나에 의해 야기되는 반응에 비해 더 적은 생리적 반응(즉, 하류 효과)을 생산하거나, 유발하거나 또는 야기하기 위한 본 명세서에 상정된 조성물의 능력을 지칭한다. "감소된" 또는 "줄어든" 양은 전형적으로 "통계적으로 유의한" 양이며, 비히클 또는 대조군 조성물에 의해 생산된 반응(기준 반응) 또는 특정 세포 계통에서의 반응의 1.1, 1.2, 1.5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30배 이상(예를 들어, 500, 1000배)(그 사이의 그리고 1 초과의 모든 정수 및 소수점을 포함, 예를 들어, 1.5, 1.6, 1.7. 1.8 등)인 감소를 포함할 수 있다.
"유지하다" 또는 "보존하다" 또는 "유지" 또는 "변화 없음" 또는 "통계학적 변화 없음" 또는 "실질적 감소 없음"은 일반적으로 비히클, 대조군 분자/조성물에 의해 야기되는 반응, 또는 특정 세포 계통에서의 반응에 비해, 세포에서 실질적으로 유사한 생리적 반응(즉, 하류 효과)를 생산하거나, 유발하거나 또는 야기하는 본 명세서에 상정된 조성물의 능력을 지칭한다. 비슷한 반응은 기준 반응과 유의하게 다르지 않거나 또는 측정 가능하게 다르지 않은 것이다.
일 실시형태에서, 암 치료가 필요한 대상체에서 암을 치료하는 방법은 유효량, 예를 들어, 치료적 유효량의 본 명세서에 상정된 유전자 변형된 면역 효과기 세포를 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함한다. 적절한 투약량이 임상 시험에 의해 결정될 수 있다면, 투여량 및 빈도는 환자의 병태, 및 환자 질환의 유형 및 중증도와 같은 인자에 의해 결정될 것이다.
일 실시형태에서, 대상체에게 투여되는 조성물 중의 면역 효과기 세포, 예를 들어, T 세포의 양은 적어도 0.1×105개의 세포, 적어도 0.5×105개의 세포, 적어도 1×105개의 세포, 적어도 5×105개의 세포, 적어도 1×106개의 세포, 적어도 0.5×107개의 세포, 적어도 1×107개의 세포, 적어도 0.5×108개의 세포, 적어도 1×108개의 세포, 적어도 0.5×109개의 세포, 적어도 1×109개의 세포, 적어도 2×109개의 세포, 적어도 3×109개의 세포, 적어도 4×109개의 세포, 적어도 5×109 세포, 또는 적어도 1×1010개의 세포이다.
특정 실시형태에서, 약 1×107개의 T 세포 내지 약 1×109개의 T 세포, 약 2×107개의 T 세포 내지 약 0.9×109개의 T 세포, 약 3×107개의 T 세포 내지 약 0.8×109개의 T 세포, 약 4×107개의 T 세포 내지 약 0.7×109개의 T 세포, 약 5×107개의 T 세포 내지 약 0.6×109개의 T 세포, 또는 약 5×107개의 T 세포 내지 약 0.5×109개의 T 세포가 대상체에게 투여된다.
일 실시형태에서, 대상체에게 투여되는 조성물 중의 면역 효과기 세포, 예를 들어, T 세포의 양은 적어도 0.1×104개의 세포/㎏ 체중, 적어도 0.5×104개의 세포/㎏ 체중, 적어도 1×104개의 세포/㎏ 체중, 적어도 5×104개의 세포/㎏ 체중, 적어도 1×105개의 세포/㎏ 체중, 적어도 0.5×106개의 세포/㎏ 체중, 적어도 1×106개의 세포/㎏ 체중, 적어도 0.5×107개의 세포/㎏ 체중, 적어도 1×107개의 세포/㎏ 체중, 적어도 0.5×108개의 세포/㎏ 체중, 적어도 1×108개의 세포/㎏ 체중, 적어도 2×108개의 세포/㎏ 체중, 적어도 3×108개의 세포/㎏ 체중, 적어도 4×108개의 세포/㎏ 체중, 적어도 5×108개의 세포/㎏ 체중, 또는 적어도 1×109개의 세포/㎏ 체중이다.
특정 실시형태에서, 약 1×106개의 T 세포/㎏ 체중 내지 약 1×108개의 T 세포/㎏ 체중, 약 2×106개의 T 세포/㎏ 체중 내지 약 0.9×108개의 T 세포/㎏ 체중, 약 3×106개의 T 세포/㎏ 체중 내지 약 0.8×108개의 T 세포/㎏ 체중, 약 4×106개의 T 세포/㎏ 체중 내지 약 0.7×108개의 T 세포/㎏ 체중, 약 5×106개의 T 세포/㎏ 체중 내지 약 0.6×108개의 T 세포/㎏ 체중, 또는 약 5×106개의 T 세포/㎏ 체중 내지 약 0.5×108개의 T 세포/㎏ 체중이 대상체에게 투여된다.
당업자는 본 명세서에 상정된 조성물의 다중 투여가 목적으로 하는 요법을 달성하는 데 필요할 수 있다는 것을 인식할 것이다. 예를 들어, 조성물은 1주, 2주, 3주, 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 1년, 2년, 5년, 10년 이상의 기간에 걸쳐 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10회 이상 투여될 수 있다.
특정 실시형태에서, 대상체에게 활성화된 면역 효과기 세포를 투여하는 것이 바람직할 수 있으며, 이어서, 후속적으로 혈액을 재채혈하고(또는 성분채집술이 수행됨), 이로부터 면역 효과기 세포를 활성화시키며, 이들 활성화되고 확장된 면역 효과기 세포를 환자에 재주입한다. 이 과정은 몇 주마다 다회 수행될 수 있다. 특정 실시형태에서, 면역 효과기 세포는 10㏄ 내지 400㏄의 채혈로부터 활성화될 수 있다. 특정 실시형태에서, 면역 효과기 세포는 20㏄, 30㏄, 40㏄, 50㏄, 60㏄, 70㏄, 80㏄, 90㏄, 100㏄, 150㏄, 200㏄, 250㏄, 300㏄, 350㏄ 또는 400㏄ 이상의 채혈로부터 활성화된다. 이론에 의해 구속되지 않고, 이런 다회 채혈/다중 재주입 프로토콜을 이용하는 것은 면역 효과기 세포의 특정 집단을 선택하는 작용을 할 수 있다.
본 명세서에 상정된 조성물의 투여는 에어로졸 흡입, 주사, 섭취, 수혈, 이식 또는 이식술에 의하는 것을 포함하는, 임의의 편리한 방식으로 수행될 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 조성물은 비경구로 투여된다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같은 어구 "비경구 투여" 및 "비경구로 투여되는"은 보통 주사에 의하는 장용 및 국소 투여 이외의 투여 방식을 지칭하며, 혈관내, 정맥내, 근육내, 동맥내, 척추강내, 낭내, 안와내, 종양내, 심장내, 피부내, 복강내, 경기관, 피하, 피부밑, 관절내, 피막하, 지주막하, 척수내 및 흉골내 주사 및 주입을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 일 실시형태에서, 본 명세서에 상정된 조성물은 종양, 림프절 EH는 감염 부위 내로의 직접 주사에 의해 대상체에게 투여된다.
일 실시형태에서, 세포 면역 반응의 증가가 필요한 대상체는 대상체에서 B 세포 관련 병태에 대해 세포 면역 반응을 증가시키기 위해 유효량의 조성물이 투여된다. 면역 반응은 감염된 세포, 조절 T 세포, 및 헬퍼 T 세포 반응을 사멸시킬 수 있는 세포독성 T 세포에 의해 매개되는 세포 면역 반응을 포함할 수 있다. 이렇게 항체 생성을 야기하는 B 세포를 활성화시킬 수 있는 헬퍼 T 세포에 의해 주로 매개되는 체액성 면역 반응이 또한 유도될 수 있다. 당업계에 잘 기재되어 있는 조성물에 의해 유도되는 면역 반응의 유형을 분석하기 위한 다양한 기법이 사용될 수 있다; 예를 들어, 문헌[Current Protocols in Immunology, Edited by: John E. Coligan, Ada M. Kruisbeek, David H. Margulies, Ethan M. Shevach, Warren Strober (2001) John Wiley & Sons, NY, N.Y].
T 세포-매개 사멸의 경우에, CAR-리간드 결합은 T 세포에 대한 CAR 신호전달을 개시하여, 다양한 메커니즘에 의한 표적 세포의 세포자멸사를 유도할 수 있는 단백질을 생성하거나 방출하는 T 세포를 유도하는 다양한 T 세포 신호전달 경로의 활성화를 초래한다. 이들 T 세포-매개 메커니즘은 T 세포로부터 표적 세포 내로 세포내 세포독성 과립의 전달, 직접적으로(또는 다른 사멸 효과기 세포의 보충을 통해 간접적으로) 표적 세포 사멸을 유도할 수 있는 전염증 사이토카인의 T 세포 분비, 및 표적 세포 상에서 이들의 동족 사멸 수용체(예를 들어, Fas)에 대한 결합 후 표적 세포의 세포자멸사를 유도하는 T 세포 표면 상의 사멸 수용체 리간드(예를 들어, FasL)의 상향 조절을 포함한다(그러나, 이들로 제한되지 않는다).
일 실시형태에서, CD79A 발현 암으로 진단된 대상체로부터 면역 효과기 세포를 제거하는 단계, 상기 면역 효과기 세포를 본 명세서에 상정된 CAR을 암호화하는 핵산을 포함하는 벡터로 유전자 변형시킴으로써, 변형된 면역 효과기 세포 집단을 생성하는 단계, 및 동일한 대상체에게 변형된 면역 효과기 세포 집단을 투여하는 단계를 포함하는, CD79A 발현 암으로 진단된 대상체의 치료 방법이 제공된다. 바람직한 실시형태에서, 면역 효과기 세포는 T 세포를 포함한다.
특정 실시형태에서, CAR 분자를 암호화하는 핵산 작제물을 발현시키는 면역 효과기 세포 집단을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 표적 세포 집단에 대한 면역 효과기 세포 매개 면역 조절자 반응을 자극하기 위한 방법이 제공된다.
특정 실시형태에서 상정된 세포 조성물을 투여하는 방법은 대상체에서 CAR을 직접적으로 발현시키는 생체외 유전자 변형된 면역 효과기 세포의 재도입 또는 대상체에 도입 시 CAR을 발현시키는 성숙 면역 효과기 세포로 분화되는 면역 효과기 세포의 유전자 변형된 조상세포의 재도입을 초래하는 데 유효한 임의의 방법을 포함한다. 한 가지 방법은 본 명세서에 상정된 핵산 작제물로 생체외에서 말초 혈액 T 세포를 형질도입하는 단계 및 형질도입된 세포를 대상체에게 복귀시키는 단계를 포함한다.
본 명세서의 모든 간행물, 특허 출원 및 공개된 특허는 각각의 개개 간행물, 특허 출원 또는 공개된 특허가 구체적이고 개별적으로 참고로 편입되도록 나타나는 것과 같이 본 명세서에 참고로 편입된다.
앞서 언급한 실시형태는 이해의 분명함의 목적을 위해 예시 및 실시예로 일부 상세하게 기재하였지만, 특정 변화 및 변형이 첨부된 청구범위의 정신 또는 범주로부터 벗어나는 일 없이 이루어질 수 있다는 것은 본 명세서에 상정된 교시에 비추어 당업자에게 용이하게 분명할 것이다. 다음의 실시예는 단지 예로서 제한의 방법에 의하지 않고 제공한다. 당업자는 본질적으로 유사한 결과를 수득하기 위해 변화 또는 변형될 수 있는 다양한 중요하지 않은 매개변수를 용이하게 인식할 것이다.
실시예
실시예 1
항-CD79A CAR의 작제
인간화된 항-CD79A scFv 항체를 함유하는 CAR은 항-CD79A scFv에 작동 가능하게 연결된 MND 프로모터, CD8α로부터의 힌지 및 막관통 도메인 및 CD137 공자극 도메인, 다음에 CD3ζ 쇄의 세포내 신호전달 도메인을 함유하도록 설계하였다. 항-CD79A CAR은 면역 효과기 세포 상의 표면 발현을 위한 CD8α 신호 펩타이드(SP) 서열을 포함한다. 표 3은 예시적인 항-CD79A CAR 렌티바이러스 벡터의 다양한 뉴클레오타이드 세그먼트에 대한 ID, 젠뱅크 참조번호, 공급원 명칭 및 인용문헌을 나타낸다. 예시적인 CD79A CAR 폴리펩타이드 서열을 서열번호 25 내지 30에 제시하고, 예시적인 CD79A CAR 폴리뉴클레오타이드 서열을 서열번호 31 내지 36에 제시한다.
실시예 2
인간 항-CD79A CAR T 세포의 평가
CD79A(예를 들어, 서열번호 25, 27, 29 및 30)에 특이적인 키메라 항원 수용체(CAR)를 CD79A 발현 세포에 대한 CAR 발현 및 생물학적 활성에 대해 평가하였다.
표적 항원 발현
일 실험에서, 항-CD79A 항체를 이용하여 K562 세포, Pfeiffer 세포, 및 Daudi 표적 세포는 CD79A 발현에 대해 정보를 얻었다. 세포를 CD79A 항체와 함께 인큐베이션시켰고, 발현을 유세포분석에 의해 평가하였다. CD79A 발현은 K562 세포 상에서 검출 가능하지 않았고, 세포 상에서 적정하게 발현되며, Daudi 세포 상에서 고도로 발현되었다. 도 1a.
다른 실험에서, CD79A 발현은 항-CD79A 항체를 이용하여 Daudi, NU-DUL-1, SU-DHL-2, 및 Pfeiffer 표적 세포 상에서 측정된다. 세포를 CD79A 항체와 함께 인큐베이션시키고, 유세포분석기에 의해 발현을 평가하였다. 또한 CD79A 발현은 Daudi 세포 상에서 가장 높았고, 이어서, NU-DUL-1, SU-DHL-2, 및 Pfeiffer 세포 상에서 점진적으로 줄어들었다. 도 2a.
항-CD79A CAR 발현
대규모 임상 제조 공정에 직접 확장 가능한 시스템을 이용하여 CAR T 세포를 생성하였다. 간단하게, IL-2(셀지닉스(CellGenix)) 및 CD3 및 CD28(밀테니 바이오텍(Miltenyi Biotec))에 특이적인 항체를 함유하는 배지에서 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 배양시켰다. 배양 개시 후 1일에 항-CD79A CAR을 암호화하는 렌티바이러스를 첨가하였다. 총 10일의 배양 동안 IL-2를 함유하는 신선한 배지를 첨가함으로써 항-CD79A CAR T 세포를 대수증식기에서 유지하였다. 배양의 종료 시, 유세포분석을 이용하여 발현에 대한 항-CD79A CAR T 세포의 정보를 얻었다. 일 실험에서, 항-CD79A CAR을 발현시키는 렌티바이러스로 조작한 1차 인간 T 세포를 바이오틴에 접합된 염소-항-마우스(GaM)로 염색하고, PE-접합된 스트렙타비딘으로 검출하였다. 도 1b. 다른 실험에서, T 세포 상의 항-CD79A CAR 발현을 염소-항-마우스(GaM) 염색으로 평가하고, 피코에리트린(PE)으로 표지한 CD79a 세포외 도메인 -Fc 융합 단백질로 염색함으로써 항-CD79A CAR-T 세포에 대한 가용성 CD79A 항원의 결합을 평가하였다. 도 2b. 이들 시약은 항-CD79A CAR을 발현시키는 T 세포를 특이적으로 동정하였다.
항원 의존적 항-CD79A CAR T 세포 활성
일 실험에서, 인터페론-감마(IFNγ) 방출 분석을 이용하여 CD79A-양성(Pfeiffer 및 Daudi) 및 CD79A-음성(K562) 세포주에 대한 항-CD79A CAR T 세포의 생물학적 활성을 평가하였다. 항-CD79A CAR T 세포를 표적 세포의 부재 하에 또는 K562(CD79A-), Pfeiffer 세포(CD79A-low) 및 Daudi 세포(CD79A-고)와 함께 24시간 동안 공동배양시켰다. 항-CD79A CAR T 세포는 CD79A 양성 세포주의 존재 하에서만 IFNγ를 방출하였다. 도 1c.
다른 실험에서, 인터페론-감마(IFNγ) 방출 분석을 이용하여 CD79A-양성 (Huh7.CD79A, Daudi, NU-DUL-1, SU-DHL-2, 및 Pfeiffer) 및 CD79A-음성(Huh7) 세포주에 대한 항-CD79A CAR T 세포의 생물학적 활성을 평가하였다. 항-CD79A CAR T 세포를 표적 세포(T 세포 단독)의 부재 하에 또는 Huh7 세포(CD79A-), Huh7.CD79a 세포(CD79A+), Daudi 세포(CD79A+), NU-DUL-1(CD79A+), SU-DHL-2(CD79A+) 또는 Pfeiffer 세포(CD79A+)와 함께 공동배양시켰다. 도 2c.
일반적으로, 다음의 청구범위에서, 사용하는 용어는 본 명세서 및 청구범위에 개시된 구체적 실시형태로 청구범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안 되며, 이러한 청구범위가 자격을 부여하는 균등론의 완전한 범주와 함께 모든 가능한 실시형태를 포함하는 것으로 해석되어야 한다. 따라서, 청구범위는 본 개시내용에 의해 제한되지 않는다.
SEQUENCE LISTING
<110> bluebird bio, Inc.
<120> CD79A CHIMERIC ANTIGEN RECEPTORS
<130> IPA201648-US
<140> PCT/US2019/037270
<141> 2019-06-14
<150> US 62/685,078
<151> 2018-06-14
<160> 79
<170> PatentIn version 3.5
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Gly
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50 55 60
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Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Val Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
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Glu Arg Phe Tyr Tyr Gly Asn Thr Phe Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
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Gly
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Lys
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50 55 60
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65 70 75 80
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Gly
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Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser Asn Gly Asn
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Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val
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Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser Thr His Val
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<223> Made in Lab - anti-CD79A-10_LH CAR construct
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Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu
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Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr
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Ala Phe Ser Phe Ser Trp Met Asn Trp Val Lys Trp Gly Pro Gly Gln
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Gly Leu Glu Trp Ile Gly Arg Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Asn
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Ala Val Tyr Phe Cys Ala Arg Trp Val Tyr Ser Gly Asn Asn Tyr Ala
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Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala
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Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr
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Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln
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Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Made in Lab - anti-CD79A-02_HL CAR construct
<400> 29
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Thr Lys Leu Thr Val Leu Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr
260 265 270
Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala
275 280 285
Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe
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Trp Val Ser Gly Ile Ser Gly Ser Gly Gly Gly Thr Tyr Tyr Ala Asp
195 200 205
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr
210 215 220
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
225 230 235 240
Tyr Cys Ala Lys Leu Gly Gly Trp Ser Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
245 250 255
Leu Val Thr Val Ser Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr
260 265 270
Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala
275 280 285
Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe
290 295 300
Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val
305 310 315 320
Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys
325 330 335
Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr
340 345 350
Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu
355 360 365
Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro
370 375 380
Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly
385 390 395 400
Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro
405 410 415
Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr
420 425 430
Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly
435 440 445
Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln
450 455 460
Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln
465 470 475 480
Ala Leu Pro Pro Arg
485
<210> 31
<211> 1479
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Made in Lab - anti-CD79A-01_HL CAR polynucleotide construct
<400> 31
atggcacttc cagtgactgc attgttgttg cccctggccc tgctgcttca cgccgcaagg 60
ccccaggtcc agcttcagca gtccggacca gagttggtga aacctggggc atcagtcaag 120
attagctgca aggcatcagg gtacaccttc agcactagtt ggatgaattg ggtgaagcag 180
cggcctggcc aggggttgga gtggatcgga cgcatctacc caggggatgg cgatacaaac 240
tacaacggaa agtttaaagg taaggctact ttgaccgctg acaaatcatc aaacacggca 300
tatatgcaac tgtctagcct cacatctgtc gactctgccg tctacttttg cgagcgattc 360
tactatggca acacttttgc catggactac tgggggcagg ggacatcagt aacagttagt 420
tctggagggg gcggttccgg gggcggggga tccggagggg gaggcagtga tgtgctgatg 480
acccagatac cgttgtcact cccggtctca ctgggtgacc aggcaagcat cagctgcagg 540
agcagccagt ccatcgtgca ctctaacgga aatacctacc tggagtggta tctgcagaaa 600
cctggccagt cccctaagtt gttgatttac aaagtttcaa accgatttag tggagttccc 660
gataggtttt ccggttccgg gagcggtaca gacttcaccc tgaagataag tcgggttgag 720
gctgaagacc tgggagtata ttattgcttt cagggcagcc acgtaccatt cacatttggg 780
agtggaacca aactggagat caaaagaacc acaacacctg ctccaaggcc ccccacaccc 840
gctccaacta tagccagcca accattgagc ctcagacctg aagcttgcag gcccgcagca 900
ggaggcgccg tccatacgcg aggcctggac ttcgcgtgtg atatttatat ttgggcccct 960
ttggccggaa catgtggggt gttgcttctc tcccttgtga tcactctgta ttgtaagcgc 1020
gggagaaaga agctcctgta catcttcaag cagcctttta tgcgacctgt gcaaaccact 1080
caggaagaag atgggtgttc atgccgcttc cccgaggagg aagaaggagg gtgtgaactg 1140
agggtgaaat tttctagaag cgccgatgct cccgcatatc agcagggtca gaatcagctc 1200
tacaatgaat tgaatctcgg caggcgagaa gagtacgatg ttctggacaa gagacggggc 1260
agggatcccg agatgggggg aaagccccgg agaaaaaatc ctcaggaggg gttgtacaat 1320
gagctgcaga aggacaagat ggctgaagcc tatagcgaga tcggaatgaa aggcgaaaga 1380
cgcagaggca aggggcatga cggtctgtac cagggtctct ctacagccac caaggacact 1440
tatgatgcgt tgcatatgca agccttgcca ccccgctaa 1479
<210> 32
<211> 1479
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Made in Lab - anti-CD79A-01_LH CAR polynucleotide construct
<400> 32
atggctctgc ctgtgacggc cctgcttttg cccctcgccc tgcttctgca tgccgcgaga 60
cccgacgtgt tgatgaccca aataccgctt agtctgcctg tatctcttgg ggaccaggct 120
agcatctcat gccgcagcag tcaatccatt gtgcactcaa atgggaacac ctatttggag 180
tggtatctgc aaaaaccggg acagtctccg aaactgctga tatacaaagt aagcaacagg 240
ttcagcggag ttcctgacag attcagcgga agcggttctg gaactgactt tacacttaag 300
atctctcgcg ttgaggcgga ggacctgggc gtgtattact gttttcaagg atcccacgtc 360
ccgtttacat tcggatcagg caccaagctg gagatcaagc gcggtggcgg gggttctggc 420
gggggcggat ccggaggcgg cggatcccag gtgcagctgc agcagtctgg accagaactg 480
gttaagcccg gagcttcagt taagatttcc tgtaaggctt caggctatac attttccact 540
tcttggatga actgggtgaa acagcgccct ggccaggggc tggaatggat cggacggatc 600
tatcccggcg atggagacac taattataac ggtaagttca aagggaaggc caccctcacg 660
gccgacaagt cctccaatac agcgtacatg caactcagtt ccctgaccag cgttgatagc 720
gcagtttact tctgtgagcg cttctattac ggaaacacct tcgctatgga ttactggggt 780
caggggacct ccgtgaccgt gtcctctacc acaacacctg ctccaaggcc ccccacaccc 840
gctccaacta tagccagcca accattgagc ctcagacctg aagcttgcag gcccgcagca 900
ggaggcgccg tccatacgcg aggcctggac ttcgcgtgtg atatttatat ttgggcccct 960
ttggccggaa catgtggggt gttgcttctc tcccttgtga tcactctgta ttgtaagcgc 1020
gggagaaaga agctcctgta catcttcaag cagcctttta tgcgacctgt gcaaaccact 1080
caggaagaag atgggtgttc atgccgcttc cccgaggagg aagaaggagg gtgtgaactg 1140
agggtgaaat tttctagaag cgccgatgct cccgcatatc agcagggtca gaatcagctc 1200
tacaatgaat tgaatctcgg caggcgagaa gagtacgatg ttctggacaa gagacggggc 1260
agggatcccg agatgggggg aaagccccgg agaaaaaatc ctcaggaggg gttgtacaat 1320
gagctgcaga aggacaagat ggctgaagcc tatagcgaga tcggaatgaa aggcgaaaga 1380
cgcagaggca aggggcatga cggtctgtac cagggtctct ctacagccac caaggacact 1440
tatgatgcgt tgcatatgca agccttgcca ccccgctaa 1479
<210> 33
<211> 1482
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Made in Lab - anti-CD79A-10_HL CAR polynucleotide construct
<400> 33
atggctctgc cagtgactgc gctgctgctg cccctcgctc ttctgctgca cgccgctcgg 60
ccacaggtcc aactgcaaca gagcggcccc gagctggtaa aacccggggc ctccgtaaaa 120
atatcctgca agaccagcgg ctatgccttt tcattctcct ggatgaactg ggtgaagtgg 180
ggacccggtc agggacttga gtggatcggg cgaatctatc ccggaaacgg ggacacgaat 240
tacaacggca aatttaaagg caaggctact ctgactgctg acaaaagtag caacaccgcc 300
tacatgcagt tgtcctcttt gacatcagta gactctgcag tgtatttttg cgcccggtgg 360
gtttactccg gaaataacta cgcggttgac tattggggac agggcacctc cgtgacagtg 420
tcttctggcg gcgggggatc aggtggcggc gggtctgggg gtggagggag cgacgtggtt 480
atgacccaga cccctttgag cctgcccgtg agccttggcg accaagcctc catctcttgc 540
cggtcctctc aatcactggt gcacagtaac gggaatactt atctccactg gtatttgcaa 600
aagcccggtc agtctcctaa gcttctgatc tataaggtgt ccaaccgctt ttctggagtg 660
cccgatagat tttccggatc tggatccgga acagacttca cattgaagat tagtagagtc 720
gaagcggagg acttgggtgt ttatttttgt tcccagagta cccacgtgcc tccatacacg 780
tttggaggtg gaaccaaact tgaaattaag accacaacac ctgctccaag gccccccaca 840
cccgctccaa ctatagccag ccaaccattg agcctcagac ctgaagcttg caggcccgca 900
gcaggaggcg ccgtccatac gcgaggcctg gacttcgcgt gtgatattta tatttgggcc 960
cctttggccg gaacatgtgg ggtgttgctt ctctcccttg tgatcactct gtattgtaag 1020
cgcgggagaa agaagctcct gtacatcttc aagcagcctt ttatgcgacc tgtgcaaacc 1080
actcaggaag aagatgggtg ttcatgccgc ttccccgagg aggaagaagg agggtgtgaa 1140
ctgagggtga aattttctag aagcgccgat gctcccgcat atcagcaggg tcagaatcag 1200
ctctacaatg aattgaatct cggcaggcga gaagagtacg atgttctgga caagagacgg 1260
ggcagggatc ccgagatggg gggaaagccc cggagaaaaa atcctcagga ggggttgtac 1320
aatgagctgc agaaggacaa gatggctgaa gcctatagcg agatcggaat gaaaggcgaa 1380
agacgcagag gcaaggggca tgacggtctg taccagggtc tctctacagc caccaaggac 1440
acttatgatg cgttgcatat gcaagccttg ccaccccgct aa 1482
<210> 34
<211> 1482
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Made in Lab - anti-CD79A-10_LH CAR polynucleotide construct
<400> 34
atggccctgc cagtaacagc actgctcctt cctctcgcac tcctcctgca cgcagcaaga 60
ccagatgtcg tgatgactca gacacctctt agcttgcccg tctccttggg tgatcaggct 120
agcatttcat gtagatcaag ccagagcttg gtacattcaa atggcaatac ctacctgcac 180
tggtatctcc agaaacctgg ccagagccca aaattgctta tctataaagt tagtaacaga 240
ttctccgggg tcccagatcg attttccggc tcaggctcag gcacggattt taccctgaag 300
atctcacgag tcgaggcaga agatcttggc gtgtactttt gttcccagag tacccacgta 360
cccccttaca cattcggagg agggaccaag ttggagatca aaggaggggg gggcagtggg 420
gggggcggtt ccggaggggg aggaagccaa gtacaactgc aacaaagcgg acccgagctc 480
gtcaaacctg gtgctagcgt caaaatttcc tgtaagacca gcggctacgc ttttagcttt 540
tcttggatga actgggtgaa atgggggccg gggcagggcc tggagtggat aggacgaatt 600
tatcccggga atggggatac aaattacaat ggtaaattca aggggaaagc cacactgact 660
gcagataaaa gctccaacac ggcatacatg cagctcagct ccctcacttc tgtggattct 720
gctgtttact tttgtgccag gtgggtttac tctggtaata actatgccgt ggattactgg 780
gggcaaggca cctctgttac agtgagttcc accacaacac ctgctccaag gccccccaca 840
cccgctccaa ctatagccag ccaaccattg agcctcagac ctgaagcttg caggcccgca 900
gcaggaggcg ccgtccatac gcgaggcctg gacttcgcgt gtgatattta tatttgggcc 960
cctttggccg gaacatgtgg ggtgttgctt ctctcccttg tgatcactct gtattgtaag 1020
cgcgggagaa agaagctcct gtacatcttc aagcagcctt ttatgcgacc tgtgcaaacc 1080
actcaggaag aagatgggtg ttcatgccgc ttccccgagg aggaagaagg agggtgtgaa 1140
ctgagggtga aattttctag aagcgccgat gctcccgcat atcagcaggg tcagaatcag 1200
ctctacaatg aattgaatct cggcaggcga gaagagtacg atgttctgga caagagacgg 1260
ggcagggatc ccgagatggg gggaaagccc cggagaaaaa atcctcagga ggggttgtac 1320
aatgagctgc agaaggacaa gatggctgaa gcctatagcg agatcggaat gaaaggcgaa 1380
agacgcagag gcaaggggca tgacggtctg taccagggtc tctctacagc caccaaggac 1440
acttatgatg cgttgcatat gcaagccttg ccaccccgct aa 1482
<210> 35
<211> 1458
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Made in Lab - anti-CD79A-02_HL CAR polynucleotide construct
<400> 35
atggcgcttc ctgtcactgc cctgcttctg cccctcgctc ttctgctgca cgccgctcgc 60
cccgaagttc agctgttgga aagcggaggc ggcctggttc aacccggtgg cagtctgagg 120
ctgtcctgcg ccgcctccgg tcttacattc acatcttacg ctatgaattg ggtgcgccaa 180
gcccccggca agggcctgga gtgggttagt ggtatcagcg ggtccggagg agggacttac 240
tacgccgact ctgtaaaggg acggttcact atctcccggg acaactccaa aaacacactt 300
tacctgcaga tgaactcctt gcgagccgaa gacacagccg tgtactactg tgctaagctt 360
ggaggctgga gtgattattg gggtcagggg accttggtga cagtgtcttc cgggggtggg 420
ggatccggtg gcggtggatc aggagggggt ggctcccaga gcgctctcac acagccggcc 480
agtgtgtcag gatcacctgg acagtccatt acgatctctt gcactggaac aagctctgac 540
tttggctcct ataatctcgt gtcctggtat cagcagcacc ccgggaaggc tcccaagctt 600
atgatttacg agggctcaaa acgcccttca ggtgtatcca accgattcag cggaagcaaa 660
tccggcaata ccgcaagtct caccataagt ggcctgcagg cagaagacga agccgactac 720
tattgttgtt cttatgccgg cggctcaaca tgggtgttcg gcgggggcac caagctgact 780
gtattgacca caacacctgc tccaaggccc cccacacccg ctccaactat agccagccaa 840
ccattgagcc tcagacctga agcttgcagg cccgcagcag gaggcgccgt ccatacgcga 900
ggcctggact tcgcgtgtga tatttatatt tgggcccctt tggccggaac atgtggggtg 960
ttgcttctct cccttgtgat cactctgtat tgtaagcgcg ggagaaagaa gctcctgtac 1020
atcttcaagc agccttttat gcgacctgtg caaaccactc aggaagaaga tgggtgttca 1080
tgccgcttcc ccgaggagga agaaggaggg tgtgaactga gggtgaaatt ttctagaagc 1140
gccgatgctc ccgcatatca gcagggtcag aatcagctct acaatgaatt gaatctcggc 1200
aggcgagaag agtacgatgt tctggacaag agacggggca gggatcccga gatgggggga 1260
aagccccgga gaaaaaatcc tcaggagggg ttgtacaatg agctgcagaa ggacaagatg 1320
gctgaagcct atagcgagat cggaatgaaa ggcgaaagac gcagaggcaa ggggcatgac 1380
ggtctgtacc agggtctctc tacagccacc aaggacactt atgatgcgtt gcatatgcaa 1440
gccttgccac cccgctaa 1458
<210> 36
<211> 1458
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Made in Lab - anti-CD79A-02_LH CAR polynucleotide construct
<400> 36
atggctctgc ctgtaactgc tctgctgctt ccccttgctc tgctcctgca tgccgcccgg 60
ccgcaaagcg ccctgactca gccagcttcc gtgtctggct ctccggggca gtccatcacc 120
atctcatgca caggaacctc cagcgacttc ggatcatata acctggtttc atggtatcag 180
cagcatcctg ggaaggctcc gaagttgatg atctacgagg gaagcaagag gcccagtggg 240
gtcagtaacc gcttctctgg aagtaagtca ggcaataccg ctagtctgac catctccgga 300
ttgcaagctg aggacgaagc tgattactac tgctgttcat atgcaggggg ttctacttgg 360
gtgttcggcg gtggaaccaa gcttaccgtt ctgggaggcg gaggctccgg gggaggcgga 420
tcaggcggag gtggatccga agtgcagctg cttgagtcag gagggggatt ggtccagccg 480
gggggatcat tgaggctgtc ttgtgccgca agtggactca cttttaccag ttatgcaatg 540
aactgggtgc ggcaggcacc cgggaaggga ctggaatggg tgagtggcat atctggcagc 600
gggggcggaa cttactacgc tgattctgtc aagggaaggt ttactatctc acgagacaac 660
agcaaaaaca ccctctacct gcagatgaac tcactcagag cagaggatac tgcagtctac 720
tattgtgcta agctgggtgg ttggagcgac tactggggac aagggacgtt ggtgaccgtg 780
tcttcaacca caacacctgc tccaaggccc cccacacccg ctccaactat agccagccaa 840
ccattgagcc tcagacctga agcttgcagg cccgcagcag gaggcgccgt ccatacgcga 900
ggcctggact tcgcgtgtga tatttatatt tgggcccctt tggccggaac atgtggggtg 960
ttgcttctct cccttgtgat cactctgtat tgtaagcgcg ggagaaagaa gctcctgtac 1020
atcttcaagc agccttttat gcgacctgtg caaaccactc aggaagaaga tgggtgttca 1080
tgccgcttcc ccgaggagga agaaggaggg tgtgaactga gggtgaaatt ttctagaagc 1140
gccgatgctc ccgcatatca gcagggtcag aatcagctct acaatgaatt gaatctcggc 1200
aggcgagaag agtacgatgt tctggacaag agacggggca gggatcccga gatgggggga 1260
aagccccgga gaaaaaatcc tcaggagggg ttgtacaatg agctgcagaa ggacaagatg 1320
gctgaagcct atagcgagat cggaatgaaa ggcgaaagac gcagaggcaa ggggcatgac 1380
ggtctgtacc agggtctctc tacagccacc aaggacactt atgatgcgtt gcatatgcaa 1440
gccttgccac cccgctaa 1458
<210> 37
<211> 226
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 37
Met Pro Gly Gly Pro Gly Val Leu Gln Ala Leu Pro Ala Thr Ile Phe
1 5 10 15
Leu Leu Phe Leu Leu Ser Ala Val Tyr Leu Gly Pro Gly Cys Gln Ala
20 25 30
Leu Trp Met His Lys Val Pro Ala Ser Leu Met Val Ser Leu Gly Glu
35 40 45
Asp Ala His Phe Gln Cys Pro His Asn Ser Ser Asn Asn Ala Asn Val
50 55 60
Thr Trp Trp Arg Val Leu His Gly Asn Tyr Thr Trp Pro Pro Glu Phe
65 70 75 80
Leu Gly Pro Gly Glu Asp Pro Asn Gly Thr Leu Ile Ile Gln Asn Val
85 90 95
Asn Lys Ser His Gly Gly Ile Tyr Val Cys Arg Val Gln Glu Gly Asn
100 105 110
Glu Ser Tyr Gln Gln Ser Cys Gly Thr Tyr Leu Arg Val Arg Gln Pro
115 120 125
Pro Pro Arg Pro Phe Leu Asp Met Gly Glu Gly Thr Lys Asn Arg Ile
130 135 140
Ile Thr Ala Glu Gly Ile Ile Leu Leu Phe Cys Ala Val Val Pro Gly
145 150 155 160
Thr Leu Leu Leu Phe Arg Lys Arg Trp Gln Asn Glu Lys Leu Gly Leu
165 170 175
Asp Ala Gly Asp Glu Tyr Glu Asp Glu Asn Leu Tyr Glu Gly Leu Asn
180 185 190
Leu Asp Asp Cys Ser Met Tyr Glu Asp Ile Ser Arg Gly Leu Gln Gly
195 200 205
Thr Tyr Gln Asp Val Gly Ser Leu Asn Ile Gly Asp Val Gln Leu Glu
210 215 220
Lys Pro
225
<210> 38
<211> 188
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 38
Met Pro Gly Gly Pro Gly Val Leu Gln Ala Leu Pro Ala Thr Ile Phe
1 5 10 15
Leu Leu Phe Leu Leu Ser Ala Val Tyr Leu Gly Pro Gly Cys Gln Ala
20 25 30
Leu Trp Met His Lys Val Pro Ala Ser Leu Met Val Ser Leu Gly Glu
35 40 45
Asp Ala His Phe Gln Cys Pro His Asn Ser Ser Asn Asn Ala Asn Val
50 55 60
Thr Trp Trp Arg Val Leu His Gly Asn Tyr Thr Trp Pro Pro Glu Phe
65 70 75 80
Leu Gly Pro Gly Glu Asp Pro Asn Glu Pro Pro Pro Arg Pro Phe Leu
85 90 95
Asp Met Gly Glu Gly Thr Lys Asn Arg Ile Ile Thr Ala Glu Gly Ile
100 105 110
Ile Leu Leu Phe Cys Ala Val Val Pro Gly Thr Leu Leu Leu Phe Arg
115 120 125
Lys Arg Trp Gln Asn Glu Lys Leu Gly Leu Asp Ala Gly Asp Glu Tyr
130 135 140
Glu Asp Glu Asn Leu Tyr Glu Gly Leu Asn Leu Asp Asp Cys Ser Met
145 150 155 160
Tyr Glu Asp Ile Ser Arg Gly Leu Gln Gly Thr Tyr Gln Asp Val Gly
165 170 175
Ser Leu Asn Ile Gly Asp Val Gln Leu Glu Lys Pro
180 185
<210> 39
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Exemplary linker sequence
<400> 39
Asp Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 40
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Exemplary linker sequence
<400> 40
Thr Gly Glu Lys Pro
1 5
<210> 41
<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Exemplary linker sequence
<400> 41
Gly Gly Arg Arg
1
<210> 42
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Exemplary linker sequence
<400> 42
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 43
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Exemplary linker sequence
<400> 43
Glu Gly Lys Ser Ser Gly Ser Gly Ser Glu Ser Lys Val Asp
1 5 10
<210> 44
<211> 18
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Exemplary linker sequence
<400> 44
Lys Glu Ser Gly Ser Val Ser Ser Glu Gln Leu Ala Gln Phe Arg Ser
1 5 10 15
Leu Asp
<210> 45
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Exemplary linker sequence
<400> 45
Gly Gly Arg Arg Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 46
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Exemplary linker sequence
<400> 46
Leu Arg Gln Arg Asp Gly Glu Arg Pro
1 5
<210> 47
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Exemplary linker sequence
<400> 47
Leu Arg Gln Lys Asp Gly Gly Gly Ser Glu Arg Pro
1 5 10
<210> 48
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Exemplary linker sequence
<400> 48
Leu Arg Gln Lys Asp Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu Arg Pro
1 5 10 15
<210> 49
<211> 18
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Exemplary linker sequence
<400> 49
Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr
1 5 10 15
Lys Gly
<210> 50
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Cleavage sequence by TEV protease
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(3)
<223> Xaa is any amino acid
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(5)
<223> Xaa is any amino acid
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (7)..(7)
<223> Xaa = Gly or Ser
<400> 50
Glu Xaa Xaa Tyr Xaa Gln Xaa
1 5
<210> 51
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Cleavage sequence by TEV protease
<400> 51
Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly
1 5
<210> 52
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Cleavage sequence by TEV protease
<400> 52
Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Ser
1 5
<210> 53
<211> 22
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Self-cleaving polypeptide comprising 2A site
<400> 53
Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val
1 5 10 15
Glu Glu Asn Pro Gly Pro
20
<210> 54
<211> 19
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Self-cleaving polypeptide comprising 2A site
<400> 54
Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn
1 5 10 15
Pro Gly Pro
<210> 55
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Self-cleaving polypeptide comprising 2A site
<400> 55
Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro
1 5 10
<210> 56
<211> 21
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Self-cleaving polypeptide comprising 2A site
<400> 56
Gly Ser Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu
1 5 10 15
Glu Asn Pro Gly Pro
20
<210> 57
<211> 18
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Self-cleaving polypeptide comprising 2A site
<400> 57
Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro
1 5 10 15
Gly Pro
<210> 58
<211> 13
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Self-cleaving polypeptide comprising 2A site
<400> 58
Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro
1 5 10
<210> 59
<211> 23
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Self-cleaving polypeptide comprising 2A site
<400> 59
Gly Ser Gly Gln Cys Thr Asn Tyr Ala Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp
1 5 10 15
Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro
20
<210> 60
<211> 20
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Self-cleaving polypeptide comprising 2A site
<400> 60
Gln Cys Thr Asn Tyr Ala Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser
1 5 10 15
Asn Pro Gly Pro
20
<210> 61
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Self-cleaving polypeptide comprising 2A site
<400> 61
Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro
1 5 10
<210> 62
<211> 25
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Self-cleaving polypeptide comprising 2A site
<400> 62
Gly Ser Gly Val Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala
1 5 10 15
Gly Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro
20 25
<210> 63
<211> 22
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Self-cleaving polypeptide comprising 2A site
<400> 63
Val Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val
1 5 10 15
Glu Ser Asn Pro Gly Pro
20
<210> 64
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Self-cleaving polypeptide comprising 2A site
<400> 64
Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro
1 5 10
<210> 65
<211> 19
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Self-cleaving polypeptide comprising 2A site
<400> 65
Leu Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser Asn
1 5 10 15
Pro Gly Pro
<210> 66
<211> 19
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Self-cleaving polypeptide comprising 2A site
<400> 66
Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser Asn
1 5 10 15
Pro Gly Pro
<210> 67
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Self-cleaving polypeptide comprising 2A site
<400> 67
Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro
1 5 10
<210> 68
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Self-cleaving polypeptide comprising 2A site
<400> 68
Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly
1 5 10 15
Pro
<210> 69
<211> 20
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Self-cleaving polypeptide comprising 2A site
<400> 69
Gln Leu Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser
1 5 10 15
Asn Pro Gly Pro
20
<210> 70
<211> 24
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Self-cleaving polypeptide comprising 2A site
<400> 70
Ala Pro Val Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly
1 5 10 15
Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro
20
<210> 71
<211> 40
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Self-cleaving polypeptide comprising 2A site
<400> 71
Val Thr Glu Leu Leu Tyr Arg Met Lys Arg Ala Glu Thr Tyr Cys Pro
1 5 10 15
Arg Pro Leu Leu Ala Ile His Pro Thr Glu Ala Arg His Lys Gln Lys
20 25 30
Ile Val Ala Pro Val Lys Gln Thr
35 40
<210> 72
<211> 18
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Self-cleaving polypeptide comprising 2A site
<400> 72
Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser Asn Pro
1 5 10 15
Gly Pro
<210> 73
<211> 40
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Self-cleaving polypeptide comprising 2A site
<400> 73
Leu Leu Ala Ile His Pro Thr Glu Ala Arg His Lys Gln Lys Ile Val
1 5 10 15
Ala Pro Val Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly
20 25 30
Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro
35 40
<210> 74
<211> 33
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Self-cleaving polypeptide comprising 2A site
<400> 74
Glu Ala Arg His Lys Gln Lys Ile Val Ala Pro Val Lys Gln Thr Leu
1 5 10 15
Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly
20 25 30
Pro
<210> 75
<211> 10
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Consensus Kozak sequence
<400> 75
gccrccatgg 10
<210> 76
<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Exemplary rule for determining light chain CDR-L3 motif
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> Xaa is any amino acid
<400> 76
Phe Gly Xaa Gly
1
<210> 77
<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Exemplary rule for determining heavy chain CDR-H1motif
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(4)
<223> Xaa is any amino acid
<400> 77
Cys Xaa Xaa Xaa
1
<210> 78
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Exemplary rule for determining heavy chain CDR-H2motif
<400> 78
Leu Glu Trp Ile Gly
1 5
<210> 79
<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Exemplary rule for determining heavy chain CDR-H3 motif
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> Xaa is any amino acid
<400> 79
Trp Gly Xaa Gly
1
Claims (69)
- 키메라 항원 수용체(chimeric antigen receptor: CAR)로서, 하기 a) 내지 d)를 포함하는 세포외 도메인을 포함하는, 키메라 항원 수용체:
a) 인간 CD79A 폴리펩타이드의 하나 이상의 에피토프에 결합하는 항-CD79A 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로서, 서열번호 1 내지 3, 9 내지 11, 또는 17 내지 19에 제시된 CDRL1 내지 CDRL3 서열을 포함하는 가변 경쇄 서열 및 서열번호 4 내지 6, 12 내지 14, 또는 20 내지 22에 제시된 CDRH1 내지 CDRH3 서열을 포함하는 가변 중쇄 서열을 포함하는, 상기 항-CD79A 항체 또는 이의 항원 결합 단편;
b) 막관통 도메인;
c) 하나 이상의 세포내 공자극 신호전달 도메인; 및
d) 1차 신호전달 도메인. - 제1항에 있어서, 상기 인간 CD79A 폴리펩타이드에 결합하는 상기 항-CD79A 항체 또는 항원 결합 단편은 Fab' 단편, F(ab')2 단편, 이중특이성 Fab 이량체(Fab2), 삼중특이성 Fab 삼량체(Fab3), Fv, 단일쇄 Fv 단백질("scFv"), 비스-scFv, (scFv)2, 미니바디, 다이어바디(diabody), 트라이어바디(triabody), 테트라바디(tetrabody), 이황화물 안정화된 Fv 단백질("dsFv"), 및 단일-도메인 항체(sdAb, 나노바디(Nanobody))로 이루어진 군으로부터 선택된, CAR.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 인간 CD79A 폴리펩타이드에 결합하는 상기 항-CD79A 항체 또는 항원 결합 단편은 scFv인, CAR.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항-CD79A 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 1 내지 3 중 어느 하나에 제시된 바와 같은 하나 이상의 경쇄 CDR 및/또는 서열번호 4 내지 6 중 어느 하나에 제시된 바와 같은 하나 이상의 중쇄 CDR을 포함하는, CAR.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항-CD79A 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 9 내지 11 중 어느 하나에 제시된 바와 같은 하나 이상의 경쇄 CDR 및/또는 서열번호 12 내지 14 중 어느 하나에 제시된 바와 같은 하나 이상의 중쇄 CDR을 포함하는, CAR.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항-CD79A 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 17 내지 19 중 어느 하나에 제시된 바와 같은 하나 이상의 경쇄 CDR 및/또는 서열번호 20 내지 22 중 어느 하나에 제시된 바와 같은 하나 이상의 중쇄 CDR을 포함하는, CAR.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항-CD79A 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 7, 15 또는 23 중 어느 하나에 제시된 바와 같은 가변 경쇄 서열 및/또는 서열번호 8, 16 또는 24 중 어느 하나에 제시된 바와 같은 가변 중쇄 서열을 포함하는, CAR.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항-CD79A 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 7에 제시된 바와 같은 가변 경쇄 서열 및/또는 서열번호 8에 제시된 바와 같은 가변 중쇄 서열을 포함하는, CAR.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항-CD79A 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 15에 제시된 바와 같은 가변 경쇄 서열 및/또는 서열번호 16에 제시된 바와 같은 가변 중쇄 서열을 포함하는, CAR.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항-CD79A 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 23에 제시된 바와 같은 가변 경쇄 서열 및/또는 서열번호 24에 제시된 바와 같은 가변 중쇄 서열을 포함하는, CAR.
- 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 막관통 도메인은 상기 T-세포 수용체의 알파 또는 베타쇄, CDδ, CD3ε, CDγ, CD3ζ, CD4, CD5, CD8α, CD9, CD 16, CD22, CD27, CD28, CD33, CD37, CD45, CD64, CD80, CD86, CD 134, CD137, CD152, CD154 및 PD1로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리펩타이드로부터 단리된, CAR.
- 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 막관통 도메인은 CD8α, CD28, CD4, CD45, PD1 및 CD152로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리펩타이드로부터 단리된, CAR.
- 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 막관통 도메인은 CD8α로부터 단리된, CAR.
- 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 공자극 신호전달 도메인은 TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9, TLR10, CARD11, CD2, CD7, CD27, CD28, CD30, CD40, CD54(ICAM), CD83, CD134(OX40), CD137(4-1BB), CD278(ICOS), DAP10, LAT, NKD2C, SLP76, TRIM 및 ZAP70으로 이루어진 군으로부터 선택된 공자극 분자로부터 단리된, CAR.
- 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 공자극 신호전달 도메인은 CD28, CD134 및 CD137로 이루어진 군으로부터 선택된 공자극 분자로부터 단리된, CAR.
- 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 공자극 신호전달 도메인은 CD137로부터 단리된, CAR.
- 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 1차 신호전달 도메인은 FcRγ, FcRβ, CD3γ, CD3δ, CD3ε, CD3ζ, CD22, CD79a, CD79b 및 CD66d로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리펩타이드로부터 단리된, CAR.
- 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 1차 신호전달 도메인은 CD3ζ로부터 단리된, CAR.
- 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 힌지 영역 폴리펩타이드를 더 포함하는, CAR.
- 제19항에 있어서, 상기 힌지 영역 폴리펩타이드는 CD8α의 힌지 영역을 포함하는, CAR.
- 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 스페이서 영역을 더 포함하는, CAR.
- 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 신호 펩타이드를 더 포함하는, CAR.
- 제22항에 있어서, 상기 신호 펩타이드는 IgG1 중쇄 신호 폴리펩타이드, CD8α 신호 폴리펩타이드, 또는 인간 GM-CSF 수용체 알파 신호 폴리펩타이드를 포함하는, CAR.
- 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 25 내지 30 중 어느 하나에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는, CAR.
- 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 25에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는, CAR.
- 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 26에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는, CAR.
- 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 27에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는, CAR.
- 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 28에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는, CAR.
- 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 29에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는, CAR.
- 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 30에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는, CAR.
- 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항의 CAR의 아미노산 서열을 포함하는, 폴리펩타이드.
- 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항의 CAR을 암호화하는, 폴리뉴클레오타이드.
- 서열번호 31 내지 36 중 어느 하나에 제시된 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오타이드.
- 제32항 또는 제33항의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 벡터.
- 제34항에 있어서, 상기 벡터는 발현 벡터인, 벡터.
- 제34항 또는 제35항에 있어서, 상기 벡터는 에피솜 벡터인, 벡터.
- 제34항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 벡터는 바이러스 벡터인, 벡터.
- 제34항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 벡터는 레트로바이러스 벡터인, 벡터.
- 제34항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 벡터는 렌티바이러스 벡터인, 벡터.
- 제34항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 벡터는 인간 면역결핍 바이러스 1(HIV-1); 인간 면역결핍 바이러스 2(HIV-2), 비스나-메디 바이러스(visna-maedi virus: VMV) 바이러스; 염소 관절염-뇌염바이러스(caprine arthritis-encephalitis virus: CAEV); 말 전염성 빈혈 바이러스(equine infectious anemia virus: EIAV); 고양이 면역결핍 바이러스(feline immunodeficiency virus: FIV); 소 면역결핍 바이러스(bovine immune deficiency virus: BIV); 및 시미안 면역결핍 바이러스(simian immunodeficiency virus: SIV)로 본질적으로 이루어진 군으로부터 선택된 렌티바이러스 벡터인, 벡터.
- 제34항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 좌(5') 레트로바이러스 LTR, 프사이(Ψ) 패키징 신호, 중심 폴리퓨린관/DNA 플랩(cPPT(central polypurine tract)/FLAP), 레트로바이러스 유출(export) 요소; 제32항 또는 제33항의 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결된 프로모터; 및 우(3') 레트로바이러스 LTR을 포함하는, 벡터.
- 제34항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 이종성 폴리아데닐화 서열을 더 포함하는, 벡터.
- 제34항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, B형 간염 바이러스 전사 후 조절 요소(hepatitis B virus posttranscriptional regulatory element: HPRE) 또는 마멋 전사 후 조절 요소(woodchuck post-transcriptional regulatory element: WPRE)를 더 포함하는, 벡터.
- 제41항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 5' LTR의 상기 프로모터는 이종성 프로모터로 대체되는, 벡터.
- 제44항에 있어서, 상기 이종성 프로모터는 거대세포바이러스(CMV) 프로모터, 라우스 육종 바이러스(RSV) 프로모터 또는 시미안 바이러스 40(SV40) 프로모터인, 벡터.
- 제41항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 5' LTR 또는 3' LTR은 렌티바이러스 LTR인, 벡터.
- 제41항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 3' LTR은 하나 이상의 변형을 포함하는, 벡터.
- 제41항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 3' LTR은 하나 이상의 결실을 포함하는, 벡터.
- 제41항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 3' LTR은 자기-비활성화(self-inactivating: SIN) LTR인, 벡터.
- 제41항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 제32항 또는 제33항의 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결된 상기 프로모터는 거대세포바이러스 급초기 유전자 프로모터(CMV), 신장 인자 1 알파 프로모터(EF1-α), 포스포글리세레이트 키나제-1 프로모터(PGK), 유비퀴틴-C 프로모터(UBQ-C), 거대세포바이러스 인핸서/닭 베타-액틴 프로모터(CAG), 폴리오마 인핸서/단순 포진 티미딘 키나제 프로모터(MC1), 베타 액틴 프로모터(β-ACT), 시미안 바이러스 40 프로모터(SV40), 및 골수증식성 육종 바이러스 인핸서, 결실된 음성 제어 영역, dl587rev 프라이머-결합 부위 치환된(MND) U3 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택된, 벡터.
- 제34항 내지 제50항 중 어느 한 항의 벡터를 포함하는, 면역 효과기 세포.
- 제51항에 있어서, 상기 면역 효과기 세포는 T 림프구, 자연 살해(NK) 세포 및 NKT 세포로 이루어진 군으로부터 선택된, 면역 효과기 세포.
- 제51항 또는 제52항의 면역 효과기 세포 및 생리적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는, 조성물.
- 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 따른 CAR을 포함하는 면역 효과기 세포 집단의 생성 방법으로서, 면역 효과기 세포 집단에 제32항 또는 제33항의 폴리뉴클레오타이드 또는 제34항 내지 제50항 중 어느 한 항의 벡터를 도입하는 단계를 포함하는, 방법.
- 제54항에 있어서, 상기 면역 효과기 세포를 자극하는 단계 및 상기 세포를, CD3에 결합하는 항체 및 CD28에 결합하는 항체와 접촉시킴으로써 상기 세포가 증식하도록 유도하는 단계를 더 포함하고; 이에 의해 면역 효과기 세포의 확장 집단을 생성하는, 방법.
- 제54항에 있어서, 상기 면역 효과기 세포는 T 세포, NK 세포 및/또는 NKT 세포를 포함하는, 방법.
- 제56항에 있어서, 상기 면역 효과기 세포는 T 세포를 포함하는, 방법.
- 대상체에서 CD79A를 발현시키는 암 세포에서의 세포독성을 증가시키는 방법으로서, 투여 전 CD79A를 발현시키는 암 세포의 세포독성에 비해 CD79A를 발현시키는 암 세포에서의 세포독성을 증가시키는 데 충분한 양의 제53항의 조성물을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
- 대상체에서 CD79A를 발현시키는 암 세포의 수를 감소시키는 방법으로서, 투여 전 CD79A를 발현시키는 암 세포의 수에 비해 CD79A를 발현시키는 암 세포 수를 감소시키는 데 충분한 양의 제53항의 조성물을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
- 암 치료가 필요한 대상체에서 암을 치료하는 방법으로서, 치료적 유효량의 제53항의 조성물을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
- 제60항에 있어서, 상기 암은 액상암(liquid cancer)인, 방법.
- 제60항 또는 제61항에 있어서, 상기 암은 혈액 악성 종양인, 방법.
- 제60항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암은 비호지킨 림프종, 급성 림프구성 백혈병(ALL), 만성 림프구성 백혈병(CLL), 모발세포 백혈병(HCL), 다발성 골수종(MM), 급성 골수성 백혈병(AML) 또는 만성 골수성 백혈병(CML)인, 방법.
- 제63항에 있어서, 상기 비호지킨 림프종은 버킷 림프종, 소형 림프구성 림프종(SLL), 미만성 거대 B 세포 림프종(DLBCL), 여포성 림프종(FL), 맨틀세포 림프종(MCL) 또는 변연대 림프종(MZL)인, 방법.
- 제63항에 있어서, 상기 비호지킨 림프종은 미만성 거대 B 세포 림프종(DLBCL)인, 방법.
- 제60항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암은 급성 림프구성 백혈병(ALL), 만성 림프구성 백혈병(CLL), 모발세포 백혈병(HCL), 다발성 골수종(MM), 급성 골수성 백혈병(AML) 또는 만성 골수성 백혈병(CML)인, 방법.
- 제60항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암은 현성 다발성 골수종, 무증상 다발성 골수종, 형질세포 백혈병, 비분비성 골수종, IgD 골수종, 골경화성 골수종, 고립성 골형질세포종, 및 골수외 형질세포종으로 이루어진 군으로부터 선택된 MM인, 방법.
- 대상체에서 CD79A를 발현시키는 암과 연관된 하나 이상의 증상을 개선시키는 방법으로서, CD79A를 발현시키는 암 세포와 연관된 적어도 하나의 증상을 개선시키는 데 충분한 양의 제53항의 조성물을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
- 제68항에 있어서, 개선되는 상기 하나 이상의 증상은 쇠약, 피로, 숨가쁨, 잦은 멍 및 출혈, 빈번한 감염, 림프절 비대, 복부 팽창 또는 복부 통증, 뼈 또는 관절 통증, 골절, 계획하지 않은 체중 감소, 식욕 부진, 도한(night sweats), 지속적 미열 및 감소된 배뇨작용으로 이루어진 군으로부터 선택된, 방법.
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