BR112020025439A2 - Receptores de antígenos quiméricos cd79a - Google Patents

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Abstract

''receptores de antígenos quiméricos cd79a”. a invenção fornece composições melhoradas para terapias celulares adotivas para cânceres que expressam cd79a.

Description

“RECEPTORES DE ANTÍGENOS QUIMÉRICOS CD79A”
REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS
[001] Este pedido reivindica o benefício sob 35 U.S.C. § 119(e) do Pedido Provisório dos EUA de nº 62/685.078, depositado em 14 de junho de 2018, que é incorporado por referência neste documento em sua totalidade.
DECLARAÇÃO RELATIVA À LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS
[002] A Listagem de Sequências associada a este pedido é fornecida em formato de texto em vez de uma cópia em papel e é incorporada por referência ao relatório descritivo. O nome do arquivo de texto que contém a listagem de sequência é BLBD_100_01WO_ST25.txt. O arquivo texto tem 64 KB, foi criado em 14 de junho de 2019 e está sendo enviado eletronicamente via EFS-Web, concomitantemente ao preenchimento do relatório descritivo.
ANTECEDENTES CAMPO TÉCNICO
[003] A presente invenção refere-se a composições e métodos melhorados para o tratamento do câncer. Mais particularmente, a invenção refere-se a receptores de antígenos quiméricos (CARs) anti-CD79A melhorados, células efetoras imunológicas geneticamente modificadas e uso dessas composições para tratar eficazmente cânceres que expressam CD79A.
DESCRIÇÃO DA TÉCNICA RELACIONADA
[004] O câncer é um problema de saúde significativo em todo o mundo. Com base nas taxas de 2008-2010, 40,76% dos homens e mulheres nascidos hoje serão diagnosticados com algum tipo de câncer em algum momento de suas vidas. 20,37% dos homens desenvolverão câncer entre os 50 e 70 anos, em comparação com 15,30% das mulheres. Em 1º de janeiro de 2010, nos Estados Unidos, havia aproximadamente
13.027.914 homens e mulheres vivos com histórico de câncer - 6.078.974 homens e
6.948.940 mulheres. Estima-se que 1.660.290 homens e mulheres (854.790 homens e
805.500 mulheres) nos Estados Unidos serão diagnosticados e 580.350 homens e mulheres morrerão de câncer de todos os sítios em 2013. Howlader et al. 2013.
[005] A transformação maligna de células B leva a cânceres, incluindo, mas não se limitando a linfomas, por exemplo, mieloma múltiplo e linfoma não-Hodgkin. A grande maioria dos pacientes com malignidades de células B, incluindo linfoma-não Hodgkin (LNH) e mieloma múltiplo (MM), são contribuintes significativos para a mortalidade por câncer. A resposta das malignidades das células B a várias formas de tratamento é mista. Os métodos tradicionais de tratamento de malignidades de células B, incluindo quimioterapia e radioterapia, têm utilidade limitada devido aos efeitos colaterais tóxicos. A imunoterapia com anticorpos terapêuticos anti-CD19, anti-CD20, anti-CD22, anti-CD23, anti-CD52, anti-CD80 e anti-HLA-DR proporcionou sucesso limitado, devido em parte aos perfis farmacocinéticos fracos, rápida eliminação de anticorpos por proteases séricas e filtração no glomérulo e penetração limitada no sítio do tumor e níveis de expressão do antígeno alvo em células cancerosas. As tentativas de usar células geneticamente modificadas que expressam receptores de antígenos quiméricos (CARs) também tiveram sucesso limitado. Além disso, a eficácia terapêutica de um determinado domínio de ligação ao antígeno usado em um CAR particular pode ser imprevisível: se o domínio de ligação ao antígeno se liga muito fortemente, as células T do CAR podem induzir a liberação maciça de citocinas, resultando em uma reação imunológica potencialmente fatal considerada uma “tempestade de citocina”, e se o domínio de ligação ao antígeno se ligar muito fracamente, as células T CAR podem não exibir eficácia terapêutica suficiente na eliminação das células cancerosas.
BREVE DESCRIÇÃO RESUMIDA
[006] A invenção geralmente fornece vetores melhorados para gerar terapias celulares adotivas e métodos de uso dos mesmos. Mais particularmente, a invenção fornece moléculas CAR anti-CD79A e seu uso no tratamento, prevenção ou melhoria de cânceres que expressam CD79A.
[007] Em várias modalidades, um receptor de antígeno quimérico (CAR) é fornecido compreendendo: um domínio extracelular que compreende: a) um anticorpo anti-CD79A ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga a um ou mais epítopos de um polipeptídeo CD79A humano, em que o anticorpo anti-CD79A ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende uma sequência de cadeia leve variável compreendendo sequências CDRL1-CDRL3 estabelecidas nas SEQ ID NOs: 1- 3, 9-11 ou 17-19, e/ou e uma sequência de cadeia pesada variável compreendendo CDRH1-CDRH3 sequências estabelecidas nas SEQ ID NOs: 4-6, 12-14 ou 20-22; b) um domínio transmembranar; c) um ou mais domínios de sinalização coestimuladores intracelulares; e/ou d) um domínio de sinalização primário.
[008] Em modalidades particulares, o anticorpo anti-CD79A ou fragmento de ligação ao antígeno que se liga ao polipeptídeo CD79A humano é selecionado a partir do grupo que consiste em: um fragmento Fab', um fragmento F(ab')2, um dímero Fab biespecífico (Fab2), um trímero Fab triespecífico (Fab3), um Fv, uma proteína Fv de cadeia única ("scFv"), um bis-scFv, (scFv) 2, um minicorpo, um diacorpo, um triacorpo, um tetracorpo, uma proteína Fv estabilizada por dissulfeto ("dsFv”), e um anticorpo de domínio único (sdAb, Nanocorpo).
[009] Em certas modalidades, o anticorpo anti-CD79A ou fragmento de ligação ao antígeno que se liga ao polipeptídeo CD79A humano é um scFv.
[010] Em modalidades particulares, o anticorpo anti-CD79A ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende um ou mais CDRs de cadeia leve conforme estabelecido em qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-3 e/ou um ou mais CDRs de cadeia pesada conforme estabelecido em qualquer uma das SEQ ID NOs: 4-6.
[011] Em algumas modalidades, o anticorpo anti-CD79A ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende um ou mais CDRs de cadeia leve conforme estabelecido em qualquer uma das SEQ ID NOs: 9-11 e/ou um ou mais CDRs de cadeia pesada conforme estabelecido em qualquer uma das SEQ ID NOs: 12-14.
[012] Em algumas modalidades, o anticorpo anti-CD79A ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende uma ou mais CDRs de cadeia leve conforme estabelecido em qualquer uma das SEQ ID NOs: 17-19 e/ou uma ou mais CDRs de cadeia pesada conforme estabelecido em qualquer uma das SEQ ID NOs: 20-22.
[013] Em algumas modalidades, o anticorpo anti-CD79A ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende uma sequência de cadeia leve variável conforme estabelecido em qualquer uma das SEQ ID NOs: 7, 15 ou 23 e/ou uma sequência de cadeia pesada variável conforme estabelecido em qualquer uma das SEQ ID NOs: 8, 16 ou 24.
[014] Em certas modalidades, o anticorpo anti-CD79A ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende uma sequência de cadeia leve variável com pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de aminoácidos à sequência de aminoácidos estabelecida em qualquer uma das SEQ ID NOs: 7, 15 ou 23 e/ou uma sequência de cadeia pesada variável com pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de aminoácidos identidade à sequência de aminoácidos estabelecida em qualquer uma das SEQ ID NOs: 8, 16 ou 24.
[015] Em outras modalidades, o anticorpo anti-CD79A ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende uma sequência de cadeia leve variável conforme estabelecido na SEQ ID NO: 7 e/ou uma sequência de cadeia pesada variável conforme estabelecido na SEQ ID NO: 8.
[016] Em outras modalidades, o anticorpo anti-CD79A ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende uma sequência de cadeia leve variável conforme estabelecido na SEQ ID NO: 15 e/ou uma sequência de cadeia pesada variável conforme estabelecido na SEQ ID NO: 16.
[017] Em outras modalidades, o anticorpo anti-CD79A ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende uma sequência de cadeia leve variável conforme estabelecido na SEQ ID NO: 23 e/ou uma sequência de cadeia pesada variável conforme estabelecido na SEQ ID NO: 24.
[018] Em outras modalidades, o domínio transmembranar é de um polipeptídeo selecionado a partir do grupo que consiste em: cadeia alfa ou beta do receptor de células T, CDδ, CD3ε, CDγ, CD3ζ, CD4, CD5, CD8α, CD9, CD 16, CD22, CD27, CD28, CD33, CD37, CD45, CD64, CD80, CD86, CD 134, CD137, CD152, CD154, e PD1.
[019] Em modalidades adicionais, o domínio transmembranar é de um polipeptídeo selecionado a partir do grupo que consiste em: CD8α, CD28, CD4, CD45, PD1 e CD152.
[020] Em algumas modalidades, o domínio transmembranar é de CD8α.
[021] Em outras modalidades, um ou mais domínios de sinalização coestimuladores são de uma molécula coestimuladora selecionada a partir do grupo que consiste em: TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9, TLR10, CARD11, CD2, CD7, CD27, CD28, CD30, CD40, CD54 (ICAM), CD83, CD134 (OX40), CD137 (4-1BB), CD278 (ICOS), DAP10, LAT, NKD2C, SLP76, TRIM, e ZAP70.
[022] Em certas modalidades, um ou mais domínios de sinalização coestimuladores são de uma molécula coestimuladora selecionada a partir do grupo que consiste em: CD28, CD134 e CD137.
[023] Em algumas modalidades, o um ou mais domínios de sinalização coestimuladores são de CD137.
[024] Em modalidades particulares, o domínio de sinalização primário é isolado de um polipeptídeo selecionado a partir do grupo que consiste em: FcRγ, FcRβ, CD3γ, CD3δ, CD3ε, CD3ζ, CD22, CD79a, CD79b e CD66d.
[025] Em modalidades particulares, o domínio de sinalização primário é isolado de CD3ζ.
[026] Em modalidades adicionais, o CAR compreende ainda um polipeptídeo de região de dobradiça.
[027] Em certas modalidades, o polipeptídeo de região de dobradiça compreende uma região de dobradiça de CD8α.
[028] Em modalidades adicionais, o CAR compreende ainda uma região espaçadora.
[029] Em outras modalidades, o CAR compreende ainda um peptídeo sinal.
[030] Em modalidades particulares, o peptídeo sinal compreende um polipeptídeo sinal de cadeia pesada de IgG1, um polipeptídeo sinal CD8α ou um polipeptídeo sinal alfa receptor GM-CSF humano.
[031] Em modalidades particulares, um CAR compreende uma sequência de aminoácidos estabelecida em qualquer uma das SEQ ID NOs: 25 a 30.
[032] Em modalidades particulares, um CAR compreende uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 25.
[033] Em modalidades particulares, um CAR compreende uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 26.
[034] Em modalidades particulares, um CAR compreende uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 27.
[035] Em modalidades particulares, um CAR compreende uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 28.
[036] Em modalidades particulares, um CAR compreende uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 29.
[037] Em modalidades particulares, um CAR compreende uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 30.
[038] Em várias modalidades, é fornecido um polipeptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos do CAR contemplado neste documento.
[039] Em várias modalidades, é fornecido um polinucleotídeo que codifica um CAR contemplado neste documento.
[040] Em modalidades particulares, um polinucleotídeo que codifica um CAR contemplado neste documento compreende a sequência estabelecida em qualquer uma das SEQ ID NOs: 31-36.
[041] Em várias modalidades, é fornecido um vetor que compreende um polinucleotídeo que codifica um CAR contemplado neste documento.
[042] Em certas modalidades, o vetor é um vetor de expressão.
[043] Em modalidades particulares, o vetor é um vetor epissomal.
[044] Em outras modalidades, o vetor é um vetor viral.
[045] Em outras modalidades, o vetor é um vetor retroviral.
[046] Em modalidades particulares, o vetor é um vetor lentiviral.
[047] Em outras modalidades, o vetor lentiviral é selecionado a partir do grupo que consiste essencialmente em: vírus da imunodeficiência humana 1 (HIV-1); vírus da imunodeficiência humana 2 (HIV-2), vírus visna-maedi (VMV); vírus da artrite-encefalite caprina (CAEV); vírus da anemia infecciosa equina (EIAV); vírus da imunodeficiência felina (FIV); vírus da imunodeficiência bovina (BIV); e vírus da imunodeficiência símia (SIV).
[048] Em modalidades particulares, o vetor compreende um LTR retroviral esquerdo (5'), um sinal de empacotamento Psi (Ψ), um trato central de polipurina/aba de DNA (cPPT/FLAP), um elemento de exportação retroviral; um promotor operacionalmente ligado ao polinucleotídeo; e um LTR retroviral direito (3').
[049] Em outras modalidades, o vetor compreende ainda uma sequência de poliadenilação heteróloga.
[050] Em modalidades particulares, o vetor compreende ainda um elemento regulador pós-transcricional do vírus da hepatite B (HPRE) ou elemento regulador pós- transcricional da marmota (WPRE).
[051] Em modalidades adicionais, o promotor do LTR 5' é substituído por um promotor heterólogo.
[052] Em outras modalidades, o promotor heterólogo é um promotor do citomegalovírus (CMV), um promotor do Vírus do Sarcoma de Rous (RSV) ou um promotor do Vírus Símio 40 (SV40).
[053] Em algumas modalidades, o LTR 5' ou LTR 3' é um LTR de lentivírus.
[054] Em certas modalidades, o LTR 3' compreende uma ou mais modificações.
[055] Em certas modalidades, o LTR 3' compreende uma ou mais deleções.
[056] Em modalidades particulares, o LTR 3' é um LTR de autoinativação (SIN).
[057] Em modalidades particulares, a sequência de poliadenilação é uma poliadenilação do hormônio de crescimento bovino ou sequência de poliadenilação da β- globina de coelho de sinal.
[058] Em modalidades adicionais, o polinucleotídeo compreende uma sequência de Kozak otimizada.
[059] Em modalidades adicionais, o promotor operacionalmente ligado ao polinucleotídeo é selecionado a partir do grupo que consiste em: um promotor de gene precoce imediato de citomegalovírus (CMV), um promotor alfa do fator de alongamento 1 (EF1-α), um promotor de fosfoglicerato quinase-1 (PGK), um promotor de ubiquitina-C (UBQ-C), um acentuassomo de citomegalovírus/promotor de beta-actina de galinha (CAG), acentuassomo de polioma/promotor de timidina quinase herpes simplex (MC1), um promotor de beta actina (β-ACT), um promotor de vírus símio 40 (SV40) e um acentuassomo de vírus de sarcoma mieloproliferativo, região de controle negativa deletada, promotor U3 substituído pelo sítio de ligação do iniciador dl587rev (MND).
[060] Em várias modalidades, é fornecida uma célula efetora imunológica compreendendo um vetor que codifica um CAR contemplado neste documento.
[061] Em modalidades particulares, a célula efetora imunológica é selecionada a partir do grupo que consiste em: um linfócito T, uma célula exterminadora natural (NK) e uma célula NKT.
[062] Em algumas modalidades, a célula efetora imunológica é transduzida com um vetor contemplado neste documento e é ativada e estimulada na presença de um inibidor da via PI3K, mantendo assim a proliferação das células efetoras imunológicas transduzidas em comparação com a proliferação das células efetoras imunológicas transduzidas que foram ativadas e estimuladas na ausência do inibidor da via PI3K.
[063] Em modalidades particulares, a célula efetora imunológica ativada e estimulada na presença do inibidor da via PI3K aumentou a expressão de i) um ou mais marcadores selecionados a partir do grupo que consiste em: CD62L, CD127, CD197 e CD38 ou ii) todos dos marcadores CD62L, CD127, CD197 e CD38 comparados a uma célula efetora imunológica ativada e estimulada na ausência do inibidor da via PI3K.
[064] Em modalidades particulares, a célula efetora imunológica ativada e estimulada na presença do inibidor da via PI3K aumentou a expressão de i) um ou mais marcadores selecionados a partir do grupo que consiste em: CD62L, CD127, CD27 e CD8 ou ii) todos de os marcadores CD62L, CD127, CD27 e CD8 comparados a uma célula efetora imunológica ativada e estimulada na ausência do inibidor da via PI3K.
[065] Em uma modalidade, o inibidor de PI3K é ZSTK474.
[066] Em várias modalidades, é fornecida uma composição compreendendo a célula efetora imunológica contemplada neste documento e um excipiente fisiologicamente aceitável.
[067] Em várias modalidades, um método para gerar uma população de células efetoras imunológicas compreendendo um CAR contemplado neste documento é fornecido, compreendendo introduzir em uma população de células efetoras imunológicas um vetor que codifica um CAR contemplado neste documento.
[068] Em modalidades particulares, o método compreende ainda estimular as células efetoras imunológicas e induzir as células a proliferarem por meio do contato das células com anticorpos que se ligam a CD3 e anticorpos que se ligam a CD28; gerando assim uma população expandida de células efetoras imunológicas.
[069] Em certas modalidades, as células efetoras imunológicas são estimuladas e induzidas a proliferar antes da introdução do vetor.
[070] Em modalidades adicionais, a população de células efetoras imunológicas compreende células T.
[071] Em algumas modalidades, a população de células efetoras imunológicas compreende células NK.
[072] Em modalidades particulares, as células são ativadas e estimuladas na presença de um inibidor da via PI3K, mantendo assim a proliferação das células efetoras imunológicas transduzidas em comparação com a proliferação de células efetoras imunológicas que são ativadas e estimuladas na ausência do inibidor da via PI3K.
[073] Em algumas modalidades, as células efetoras imunológicas ativadas e estimuladas na presença do inibidor da via PI3K aumentaram a expressão de i) um ou mais marcadores selecionados a partir do grupo que consiste em: CD62L, CD127, CD197 e CD38 ou ii) todos os marcadores CD62L, CD127, CD197 e CD38 em comparação com as células efetoras imunológicas ativadas e estimuladas na ausência do inibidor da via PI3K.
[074] Em modalidades particulares, a célula efetora imunológica ativada e estimulada na presença do inibidor da via PI3K aumentou a expressão de i) um ou mais marcadores selecionados a partir do grupo que consiste em: CD62L, CD127, CD27 e CD8 ou ii) todos de os marcadores CD62L, CD127, CD27 e CD8 comparados a uma célula efetora imunológica ativada e estimulada na ausência do inibidor da via PI3K.
[075] Em uma modalidade, o inibidor de PI3K é ZSTK474.
[076] Em várias modalidades, o método para aumentar a citotoxicidade em células cancerosas que expressam CD79A em um paciente é fornecido, compreendendo administrar ao paciente uma quantidade de uma composição contemplada neste documento suficiente para aumentar a citotoxicidade em células cancerosas que expressam CD79A em comparação com a citotoxicidade das células cancerosas que expressam CD79A antes da administração.
[077] Em várias modalidades, é fornecido um método para diminuir o número de células cancerosas que expressam CD79A em um paciente, compreendendo administrar ao paciente uma quantidade de uma composição contemplada neste documento suficiente para diminuir o número de células cancerosas que expressam CD79A em comparação com o número das células cancerosas que expressam CD79A antes da administração.
[078] Em várias modalidades, um método de tratamento de um câncer em um paciente em necessidade do mesmo é fornecido, compreendendo administrar ao paciente uma quantidade de efeito terapêutico de uma composição contemplada neste documento.
[079] Em certas modalidades, o câncer é um câncer líquido.
[080] Em algumas modalidades, o câncer é uma malignidade hematológica.
[081] Em outras modalidades, o câncer é câncer de pulmão, câncer de mama, câncer de pâncreas, câncer de ovário, câncer de próstata, câncer adrenal, melanoma, câncer uterino, câncer testicular ou câncer de bexiga, linfoma não-Hodgkin, leucemia linfocítica aguda (LLA), leucemia linfocítica crônica (LLC), leucemia de células pilosas (LCP), mieloma múltiplo (MM), leucemia mieloide aguda (LMA) ou leucemia mieloide crônica (LMC).
[082] Em modalidades particulares, o linfoma não-Hodgkin é linfoma linfocítico pequeno (LLP), linfoma difuso de grandes células B (LDGCB), linfoma folicular (LF), linfoma de células do manto (LMC) ou linfoma da zona marginal (LZM).
[083] Em certas modalidades, o câncer é leucemia linfocítica aguda (LLA), leucemia linfocítica crônica (LLC), leucemia de células cabeludas (HCL), mieloma múltiplo (MM), leucemia mieloide aguda (LMA) ou leucemia mieloide crônica (LMC).
[084] Em modalidades particulares, o câncer é linfoma difuso de grandes células B (LDGCB).
[085] Em modalidades particulares, o câncer é um MM selecionado a partir do grupo que consiste em: mieloma múltiplo evidente, mieloma múltiplo latente, leucemia de células plasmáticas, mieloma não secretor, mieloma de IgD, mieloma osteosclerótico,
plasmocitoma ósseo solitário e plasmocitoma extramedular
[086] Em várias modalidades, é fornecido um método para melhorar um ou mais sintomas associados a um câncer que expressa CD79A em um paciente, compreendendo administrar ao paciente uma quantidade de uma composição contemplada neste documento suficiente para melhorar pelo menos um sintoma associado a células cancerosas que expressam CD79A.
[087] Em modalidades particulares, um ou mais sintomas atenuados são selecionados a partir do grupo que consiste em: fraqueza, fadiga, falta de ar, fácil hematoma e sangramento, infecções frequentes, linfonodos aumentados, abdômen distendido ou dolorido, dor nos ossos ou nas articulações, fraturas, perda de peso não planejada, falta de apetite, suores noturnos, febre moderada persistente e diminuição da micção.
BREVE DESCRIÇÃO DE VÁRIAS VISTAS DAS FIGURAS
[088] A Figura 1 mostra a expressão de CD79A em células alvo, expressão de CAR e atividade dependente do antígeno de células T CAR anti-CD79A na presença de células alvo que expressam CD79A. A) Este painel mostra a expressão de CD79A em células Pfeiffer e Daudi, mas não em células K562. B) Este painel mostra a expressão de CAR anti-CD79A representativa em células T medidas usando citometria de fluxo. C) Este painel mostra a secreção de IFNγ de células T CAR anti-CD79A cocultivadas na ausência de células alvo ou com células K562 (CD79A-), células Daudi (CD79A+, alta expressão) ou células Pfeiffer (CD79A+, baixa expressão).
[089] A Figura 2 mostra a expressão de CAR, a expressão de CD79A em células alvo e a atividade dependente do antígeno de células T CAR anti-CD79A na presença de células alvo que expressam CD79A. A) Este painel mostra a densidade do receptor CD79A em células Daudi, NU-DUL-1, SU-DHL-2 e Pfeiffer. B) Este painel mostra a expressão de CAR anti-CD79A representativa em células T medidas usando citometria de fluxo. C) Este painel mostra a secreção de IFNγ de células T CAR anti-CD79A cocultivadas na ausência de células alvo ou com células Huh7 (CD79A-), células Huh7.CD79a (CD79A+), células Daudi (CD79A+), células NU-DUL-1 (CD79A+), SU- DHL-2 (CD79A+) ou Pfeiffer (CD79A+).
BREVE DESCRIÇÃO DOS IDENTIFICADORES DE SEQUÊNCIA
[090] As SEQ ID NOs: 1-24 estabelecem as sequências de aminoácidos das sequências de CDR de cadeia leve exemplares, sequências de CDR de cadeia pesada, cadeias leves de domínio variável e cadeias pesadas de domínio variável para CARs anti- CD79A contemplados neste documento.
[091] SEQ ID NOs: 25-30 estabelecem as sequências de aminoácidos de CARs anti-CD79A exemplares.
[092] As SEQ ID NOs: 31-36 estabelecem as sequências de ácido nucleico de CARs anti-CD79A exemplares.
[093] Ad SEQ ID NOs: 37-38 estabelecem as sequências de aminoácidos de polipeptídeos CD79A humanos exemplares.
[094] As SEQ ID NOs: 39-49 estabelecem as sequências de aminoácidos de vários ligantes.
[095] As SEQ ID NOs: 50-74 estabelecem as sequências de aminoácidos de sítios de clivagem de protease e sítios de clivagem de polipeptídeo de autoclivagem.
DESCRIÇÃO DETALHADA A. VISÃO GERAL
[096] A invenção geralmente refere-se a composições e métodos melhorados para prevenir ou tratar cânceres que expressam CD79A ou prevenir, tratar ou melhorar pelo menos um sintoma associado a um câncer que expressa CD79A. Em modalidades particulares, a invenção refere-se a terapia celular adotiva melhorada de cânceres que expressam CD79A usando células efetoras imunológicas geneticamente modificadas. As abordagens genéticas oferecem um meio potencial para acentuar o reconhecimento imunológico e a eliminação das células cancerosas. Uma estratégia promissora é a engenharia genética de células efetoras imunológicas para expressar receptores de antígenos quiméricos (CAR) que redirecionam a citotoxicidade para as células cancerosas.
[097] As composições e métodos melhorados da terapia celular adotiva contemplados neste documento fornecem células efetoras imunológicas geneticamente modificadas que podem ser facilmente expandidas, exibem persistência a longo prazo in vivo e demonstram citotoxicidade dependente de antígeno para células que expressam CD79A, também conhecida como cadeia alfa da proteína associada ao complexo receptor de antígeno de célula B, proteína associada à imunoglobulina ligada à membrana (MB1, MB-1), proteína associada a IgM de superfície e Ig-alfa (IGA). Exemplos ilustrativos de sequências polinucleotídicas que codificam CD79a incluem, mas não estão limitados a: NM_001783.3, NM_021601.3, ENST00000221972 (uc002orv.3), ENST00000597454 (uc060zdj.1), ENST00000444740 (uc002oru.4), Hs.631567, e AK223371. Exemplos ilustrativos de sequências polipeptídicas que codificam CD79a incluem, mas não estão limitados a: P11912-1, P11912-2, ENSP00000400605 ENSP00000468922, ENSP00000221972, NP_001774.1, e NP_067612.1.
[098] CD79 consiste em duas proteínas, nomeadamente CD79A e CD79B. CD79A está localizado no cromossomo 19q13.2 e codifica uma glicoproteína de 226 aminoácidos de aproximadamente 47 kDa. O peso molecular exato depende da extensão da glicosilação. CD79B está localizado no cromossomo 17q23 e codifica uma glicoproteína de 229 aminoácidos de aproximadamente 37 kDa. CD79A e CD79B compartilham uma estrutura exon-íntron, ambos contêm um único domínio IgSF Ig (tipo C de 111 resíduos para CD79A e tipo V de 129 resíduos para CD79B). Cada um também contém um domínio transmembranar altamente conservado e uma cauda citoplasmática de 61 (CD79A) ou 48 (CD79B) aminoácidos que também exibe notável conservação evolutiva de aminoácidos. CD79A e CD79B são expressos pelos progenitores precoces de células B comprometidos. O heterodímero CD79A/B também foi observado na superfície de progenitores precoces de células B na ausência da cadeia pesada μ, embora nenhuma proteína seja necessária para que os progenitores se comprometam com a linha de células B. Mais tarde no desenvolvimento, CD79A e CD79B são coexpressos juntamente com Ig de todos os isotipos na superfície das células B como um complexo BCR maduro. As proteínas CD79 são específicas da linhagem B e são expressas ao longo da linfopoiese B. CD79A e CD79B podem ser marcadores usados para a identificação de neoplasias de células B, incluindo LDGCB, a maioria das leucemias agudas do tipo de célula B precursora, em linhas de células B, linfomas de células B e em alguns mielomas.
[099] Em várias modalidades, os CARs que compreendem sequências de anticorpos anti-CD79A são altamente eficazes; sofrem expansão in vivo robusta; e reconhecem células cancerosas que expressam CD79A e mostram atividade citotóxica contra as células cancerosas que expressam CD79A.
[0100] Em uma modalidade, um CAR compreendendo um anticorpo anti-CD79A ou fragmento de ligação ao antígeno, um domínio transmembranar e um ou mais domínios de sinalização intracelular é fornecido.
[0101] Em uma modalidade, uma célula efetora imunológica é geneticamente modificada para expressar um CAR. As células T que expressam um CAR são referidas neste documento como células T CAR ou células T modificadas por CAR.
[0102] Em várias modalidades, as células efetoras imunológicas geneticamente modificadas são administradas a um paciente com células cancerosas que expressam CD79A incluindo, mas não se limitando a tumores líquidos e malignidades hematológicas. Em uma modalidade, as células T CAR anti-CD79A são administradas a um paciente que tem LDGCB.
[0103] Técnicas para DNA recombinante (ou seja, modificado), síntese de peptídeos e oligonucleotídeos, imunoensaios, cultura de tecidos, transformação (por exemplo, eletroporação, lipofecção), reações enzimáticas, purificação e técnicas e procedimentos relacionados podem ser geralmente realizados conforme descrito em várias referências gerais e mais específicas em microbiologia, biologia molecular, bioquímica, genética molecular, biologia celular, virologia e imunologia, conforme citado e discutido ao longo do presente relatório descritivo.
Vide, por exemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3ª ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.; Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley e Sons, atualizado em julho de 2008); Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub.
Associates e Wiley- Interscience; Glover, DNA Cloning: A Practical Approach, vol.
I e II (IRL Press, Oxford Univ.
Press USA, 1985); Current Protocols in Immunology (editado por: John E.
Coligan, Ada M.
Kruisbeek, David H.
Margulies, Ethan M.
Shevach, Warren Strober 2001 John Wiley & Sons, NY, NY); Real-Time PCR: Current Technology and Applications, editado por Julie Logan, Kirstin Edwards e Nick Saunders, 2009, Caister Academic Press, Norfolk, UK; Anand, Techniques for the Analysis of Complex Genomes, (Academic Press, New York, 1992); Guthrie e Fink, Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology (Academic Press, New York, 1991); Oligonucleotide Synthesis (N.
Gait, Ed., 1984); Nucleic Acid The Hybridization (B.
Hames & S.
Higgins, Eds., 1985); Transcription and Translation (B.
Hames & S.
Higgins, Eds., 1984); Animal Cell Culture (R.
Freshney, Ed., 1986); Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning (1984); Next-Generation Genome Sequencing (Janitz, 2008 Wiley-VCH); PCR Protocols (Methods in Molecular Biology) (Park, Ed., 3ª edição, 2010 Humana Press); Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press, 1986); o tratado, Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.); Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (J.
H.
Miller e M.
P.
Calos eds., 1987, Cold Spring Harbor Laboratory); Harlow e Lane, Antibodies, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1998); Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Mayer e Walker, eds., Academic Press, London, 1987); Handbook Of Experimental Immunology, volumes I-IV (D.
M.
Weir e CC Blackwell, eds., 1986); Roitt, Essential Immunology, 6ª edição,
(Blackwell Scientific Publications, Oxford, 1988); Current Protocols in Immunology (Q. E. Coligan, A. M. Kruisbeek, D. H. Margulies, E. M. Shevach e W. Strober, eds., 1991); Annual Review of Immunology; bem como monografias em publicações tais como Advances in Immunology. B. DEFINIÇÕES
[0104] Antes de estabelecer esta divulgação em mais detalhes, pode ser útil para sua compreensão fornecer definições de certos termos a serem usados neste documento.
[0105] A menos que definido de outra forma, todos os termos técnicos e científicos usados neste documento têm o mesmo significado como comumente entendido por aqueles técnicos no assunto à qual a invenção pertence. Embora quaisquer métodos e materiais semelhantes ou equivalentes aos descritos neste documento possam ser usados na prática ou teste de modalidades particulares, modalidades preferidas de composições, métodos e materiais são descritos neste documento. Para os fins da presente divulgação, os seguintes termos são definidos abaixo. Definições adicionais são estabelecidas ao longo desta divulgação.
[0106] Os artigos "um(a)" e "o(a)" são usados neste documento para referirem-se a um ou mais de um (ou seja, a pelo menos um, ou a um ou mais) do objeto gramatical do artigo. A título de exemplo, “um elemento” significa um elemento ou um ou mais elementos.
[0107] O uso da alternativa (por exemplo, “ou”) deve ser entendido como significando uma, ambas ou qualquer combinação das alternativas.
[0108] O termo “e/ou” deve ser entendido como significando uma ou ambas as alternativas.
[0109] Como usado neste documento, o termo "cerca de" ou "aproximadamente" refere-se a uma quantidade, nível, valor, número, frequência, porcentagem, dimensão, tamanho, quantidade, peso ou comprimento que varia em até 15%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% ou 1% a uma quantidade de referência, nível, valor, número, frequência, porcentagem, dimensão, tamanho, quantidade, peso ou comprimento. Em uma modalidade, o termo "cerca de" ou "aproximadamente" refere-se a uma faixa de quantidade, nível, valor, número, frequência, porcentagem, dimensão, tamanho, quantidade, peso ou comprimento ± 15%, ± 10%, ± 9%, ± 8%, ± 7%, ± 6%, ± 5%, ± 4%, ± 3%, ± 2% ou ± 1% sobre uma quantidade de referência, nível, valor, número, frequência, porcentagem, dimensão, tamanho, quantidade, peso ou comprimento.
[0110] Em uma modalidade, uma faixa, por exemplo, 1 a 5, cerca de 1 a 5 ou cerca de 1 a cerca de 5, refere-se a cada valor numérico englobado pela faixa. Por exemplo, em uma modalidade não limitante e meramente ilustrativa, a faixa “1 a 5” é equivalente à expressão 1, 2, 3, 4, 5; ou 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5 ou 5,0; ou 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3,0, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4,0, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9 ou 5,0.
[0111] Conforme usado neste documento, o termo "substancialmente" refere- se a uma quantidade, nível, valor, número, frequência, porcentagem, dimensão, tamanho, quantidade, peso ou comprimento que é 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou superior em comparação a uma quantidade de referência, nível, valor, número, frequência, porcentagem, dimensão, tamanho, quantidade, peso ou comprimento. Em uma modalidade, "substancialmente o mesmo" refere-se a uma quantidade, nível, valor, número, frequência, porcentagem, dimensão, tamanho, quantidade, peso ou comprimento que produz um efeito, por exemplo, um efeito fisiológico, que é aproximadamente o mesmo que uma quantidade de referência, nível, valor, número, frequência, porcentagem, dimensão, tamanho, quantidade, peso ou comprimento.
[0112] Ao longo deste relatório descritivo, a menos que o contexto exija de outra forma, as palavras "compreender", "que compreende" e "compreendendo" serão entendidas como implicando a inclusão de uma etapa ou elemento ou grupo de etapas ou elementos, mas não a exclusão de qualquer outra etapa ou elemento ou grupo de etapas ou elementos. Por "consistindo em" entende-se incluindo, e limitado a, tudo o que segue a frase "consistindo em". Assim, a frase “consistindo em” indica que os elementos listados são necessários ou obrigatórios e que nenhum outro elemento pode estar presente. Por "consistindo essencialmente em" significa incluir quaisquer elementos listados após a frase e limitados a outros elementos que não interferem ou contribuem para a atividade ou ação especificada na divulgação para os elementos listados. Assim, a frase "consistindo essencialmente em" indica que os elementos listados são necessários ou obrigatórios, mas que nenhum outro elemento está presente que afete materialmente a atividade ou ação dos elementos listados.
[0113] Referência ao longo deste relatório descritivo a "uma modalidade", "uma modalidade específica", "uma modalidade relacionada", "uma determinada modalidade", "uma modalidade adicional" ou ou combinações das mesmas significa que um determinado recurso, estrutura ou característica descritos em conexão com a modalidade são incluídos em pelo menos uma modalidade. Assim, o aparecimento das frases anteriores em vários lugares ao longo deste relatório descritivo não referem-se todas necessariamente à mesma modalidade. Além disso, os recursos, estruturas ou características particulares podem ser combinados de qualquer maneira adequada em uma ou mais modalidades. Também é entendido que a recitação positiva de um recurso em uma modalidade serve como uma base para excluir o recurso em uma modalidade particular. C. RECEPTORES DE ANTÍGENOS QUIMÉRICOS
[0114] Em várias modalidades, são fornecidos receptores geneticamente modificados que redirecionam a citotoxicidade de células efetoras imunológicas para células cancerosas que expressam CD79A. Esses receptores geneticamente modificados são referidos neste documento como receptores de antígenos quiméricos (CARs). CARs são moléculas que combinam a especificidade baseada em anticorpos para um antígeno desejado (por exemplo, CD79A) com um domínio intracelular de ativação do receptor de células T para gerar uma proteína quimérica que exibe uma atividade imunológica celular anti-CD79A específica. Conforme usado neste documento, o termo "quimérico" descreve ser composto por partes de diferentes proteínas ou DNAs de diferentes origens.
[0115] Em modalidades particulares, os CARs compreendem um domínio extracelular (também referido como um domínio de ligação ou domínio de ligação específico do antígeno) que se liga a CD79A, um domínio transmembranar e um domínio de sinalização intracelular. O engajamento do domínio de ligação ao antígeno anti- CD79A do CAR com CD79A na superfície de uma célula alvo resulta no agrupamento do CAR e libera um estímulo de ativação à célula que contém o CAR. A principal característica dos CARs é sua capacidade de redirecionar a especificidade das células efetoras imunológicas, desencadeando assim a proliferação, produção de citocinas, fagocitose ou produção de moléculas que podem mediar a morte celular da célula que expressa o antígeno alvo de maneira independente da histocompatibilidade principal (MHC), explorando as habilidades de direcionamento específico de células de anticorpos monoclonais, ligantes solúveis ou correceptores específicos de células.
[0116] Em várias modalidades, um CAR compreende um domínio de ligação extracelular que compreende um domínio de ligação específico de CD79A; um domínio transmembranar; e um ou mais domínios de sinalização coestimuladores intracelulares e/ou um domínio de sinalização primário.
[0117] Em modalidades particulares, um CAR compreende um domínio de ligação extracelular que compreende um anticorpo anti-CD79A ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo; um ou mais domínios de dobradiça ou domínios espaçadores; um domínio transmembranar incluindo; e um ou mais domínios de sinalização coestimuladores intracelulares e/ou um domínio de sinalização primário.
1. DOMÍNIO DE LIGAÇÃO
[0118] Em modalidades particulares, os CARs compreendem um domínio de ligação extracelular que compreende um anticorpo anti-CD79A ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que especificamente se liga a um polipeptídeo CD79A humano expresso em uma célula alvo, por exemplo, uma célula cancerosa. Tal como usado neste documento, os termos "domínio de ligação", "domínio extracelular", "domínio de ligação extracelular", "domínio de ligação específico do antígeno" e "domínio de ligação específico do antígeno extracelular" são usados de forma intercambiável e fornecem um CAR com a capacidade de especificamente se ligar ao antígeno alvo de interesse, por exemplo, CD79A. O domínio de ligação pode ser derivado de uma fonte natural, sintética, semissintética ou recombinante.
[0119] Os termos "afinidade de ligação específica" ou "especificamente se liga" ou "especificamente ligado" ou "ligação específica" ou "alvos específicos", conforme usados neste documento, descrevem a ligação de um anticorpo anti-CD79A ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo (ou um CAR compreendendo o mesmo) para CD79A com maior afinidade de ligação do que a ligação de fundo. Um domínio de ligação (ou um CAR compreendendo um domínio de ligação ou uma proteína de fusão contendo um domínio de ligação) "especificamente se liga" a um polipeptídeo CD79A se ele se liga ou se associa a CD79A com uma afinidade ou Ka (ou seja, uma constante de associação de equilíbrio de uma interação de ligação particular com unidades de 1/M), por exemplo, maior ou igual a cerca de 105M-1. Em certas modalidades, um domínio de ligação (ou uma proteína de fusão do mesmo) se liga a um alvo com uma Ka maior ou igual a cerca de 106 M-1, 107 M-1, 108 M-1, 109 M- 1, 1010 M-1, 1011 M-1, 1012 M-1, ou 1013 M-1. Domínios de ligação de "alta afinidade" (ou proteínas de fusão de cadeia única dos mesmos) referem-se aos domínios de ligação com uma Ka de pelo menos 107 M-1, pelo menos 108 M-1, pelo menos 109 M-1, pelo menos 1010 M-1, pelo menos 1011 M-1, pelo menos 1012 M-1, pelo menos 1013 M-1, ou mais.
[0120] Alternativamente, a afinidade pode ser definida como uma constante de equilíbrio de dissociação (Kd) de uma interação de ligação particular com unidades de M (por exemplo, 10-5 M de 10-13 M, ou menos). Afinidades de polipeptídeos de domínio de ligação e proteínas CAR de acordo com a presente divulgação podem ser facilmente determinadas usando técnicas convencionais, por exemplo, por ELISA competitivo (ensaio de imunoabsorção enzimática), ou por associação de ligação, ou ensaios de deslocamento usando ligantes marcados ou usando um dispositivo de ressonância de plasmônica de superfície, tal como o Biacore T100, que está disponível na Biacore, Inc., Piscataway, NJ, ou tecnologia de biossensor óptico, tal como o sistema EPIC ou EnSpire, que estão disponíveis na Corning e Perkin Elmer, respectivamente (vide também, por exemplo, Scatchard et al. (1949) Ann. N.Y. Acad. Sci. 51: 660; e Patentes dos EUA de nºs 5.283.173; 5.468.614 ou equivalente).
[0121] Em uma modalidade, a afinidade de ligação específica é cerca de 2 vezes maior que a ligação de fundo, cerca de 5 vezes maior que a ligação de fundo, cerca de 10 vezes maior que a ligação de fundo, cerca de 20 vezes maior que a ligação de fundo, cerca de 50 vezes maior que a ligação de fundo, cerca de 100 vezes maior do que a ligação de fundo, ou cerca de 1000 vezes maior do que a ligação de fundo ou mais.
[0122] Em modalidades particulares, o domínio de ligação extracelular de um CAR compreende um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo. Um "anticorpo" refere-se a um agente de ligação que é um polipeptídeo compreendendo pelo menos uma região variável de imunoglobulina de cadeia leve ou de cadeia pesada que especificamente reconhece e se liga a um epítopo de um antígeno, tal como um peptídeo, lipídeo, polissacarídeo ou ácido nucleico contendo um determinante antigênico, tal como aqueles reconhecidos por uma célula imunológica.
Um "anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo" é aquele que foi identificado e separado e/ou recuperado de um componente de seu ambiente natural.
[0123] Um "antígeno (Ag)" refere-se a um composto, composição ou substância que pode estimular a produção de anticorpos ou uma resposta de células T em um animal, incluindo composições (tais como uma que inclui uma proteína específica do câncer) que são injetadas ou absorvidas por um animal. Um antígeno reage com os produtos da imunidade humoral ou celular específica, incluindo aqueles induzidos por antígenos heterólogos, tais como os antígenos divulgados. Em modalidades particulares, o antígeno alvo é um epítopo de um polipeptídeo CD79A.
[0124] Um “epítopo” ou “determinante antigênico” refere-se à região de um antígeno ao qual um agente de ligação se liga. Os epítopos podem ser formados tanto a partir de aminoácidos contíguos como de aminoácidos não contíguos justapostos por dobramento terciário de uma proteína. Os epítopos formados a partir de aminoácidos contíguos são normalmente retidos na exposição a solventes desnaturantes, enquanto os epítopos formados por dobramento terciário são normalmente perdidos no tratamento com solventes desnaturantes. Um epítopo inclui normalmente pelo menos 3, e mais geralmente, pelo menos 5, cerca de 9 ou cerca de 8-10 aminoácidos em uma conformação espacial única.
[0125] Os anticorpos incluem fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos, tais como Camel Ig, Ig NAR, fragmentos Fab, fragmentos Fab', fragmentos F(ab')2, dímeros Fab biespecíficos (Fab2), trímeros Fab triespecíficos (Fab3), Fv, proteínas Fv de cadeia única (“ScFv”), bis-scFv, (scFv) 2, minicorpos, diacorpos, triacorpos, tetracorpos, proteínas Fv estabilizadas com dissulfeto (“dsFv”) e anticorpo de domínio único (sdAb, Nanocorpo) e porções de anticorpos de comprimento total responsáveis para ligação ao antígeno. O termo também inclui formas geneticamente modificadas, tais como anticorpos quiméricos (por exemplo, anticorpos murinos humanizados),
anticorpos heteroconjugados (tais como anticorpos biespecíficos) e fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos. Vide também Pierce Catalog and Handbook, 1994- 1995 (Pierce Chemical Co., Rockford, IL); Kuby, J., Immunology, 3ª Ed., WH Freeman & Co., New York, 1997.
[0126] Como seria entendido pelo técnico e conforme descrito em outro lugar neste documento, um anticorpo completo compreende duas cadeias pesadas e duas cadeias leves. Cada cadeia pesada consiste em uma região variável e uma primeira, segunda e terceira região constante, enquanto cada cadeia leve consiste em uma região variável e uma região constante. As cadeias pesadas de mamíferos são classificadas como , e . Cadeias leves de mamíferos são classificadas como  ou. Imunoglobulinas compreendendo as cadeias pesadas  e  são classificadas como imunoglobulina (Ig)A, IgD, IgE, IgG e IgM. O anticorpo completo tem a forma de “Y”. A haste do Y consiste na segunda e na terceira regiões constantes (e para IgE e IgM, a quarta região constante) de duas cadeias pesadas ligadas entre si e ligações dissulfeto (intercadeias) são formadas na dobradiça. As cadeias pesadas, e  têm uma região constante composta por três domínios Ig em tandem (em uma linha) e uma região de dobradiça para maior flexibilidade; cadeias pesadas e  têm uma região constante composta por quatro domínios de imunoglobulina. As segunda e terceira regiões constantes são referidas como “domínio CH2” e “domínio CH3”, respectivamente. Cada braço do Y inclui a região variável e a primeira região constante de uma cadeia única pesada ligada às regiões variáveis e constantes de uma cadeia única leve. As regiões variáveis das cadeias leve e pesada são responsáveis pela ligação ao antígeno.
[0127] As regiões variáveis da cadeia leve e pesada contêm uma região de "estrutura" interrompida por três regiões hipervariáveis, também chamadas de "regiões determinantes de complementaridade" ou "CDRs". Os CDRs podem ser definidos ou identificados por métodos convencionais, tais como por sequência de acordo com Kabat et al. (Wu, TT e Kabat, E. A., J Exp Med. 132(2):211-50, (1970); Borden, P. e Kabat E. A., PNAS, 84: 2440-2443 (1987); (vide, Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Department of Health and Human Services, 1991, que é incorporado neste documento por referência), ou por estrutura de acordo com Chothiaet al. (Chothia, C. e Lesk, A.M., J Mol. Biol., 196(4): 901-917 (1987), Chothia, C. et al, Nature, 342: 877 - 883 (1989)).
[0128] Exemplos ilustrativos de regras para prever CDRs de cadeia leve incluem: CDR-L1 que começa a cerca de resíduo 24 é precedido por um Cys, tem cerca de 10-17 resíduos e é seguido por um Trp (normalmente Trp-Tyr-Gln, mas também, Trp-Leu-Gln, Trp-Phe-Gln, Trp-Tyr-Leu); CDR-L2 que começa a cerca do resíduo 16 após o final de CDR-L1 é geralmente precedido por Ile-Tyr, mas também, Val-Tyr, Ile-Lys, Ile-Phe e tem 7 resíduos; e CDR-L3 que começa a cerca do resíduo 33 após o final de CDR-L2 é precedido por um Cys, tem 7-11 resíduos, e é seguido por Phe-Gly-XXX-Gly (SEQ ID NO: 76) (XXX é qualquer aminoácido).
[0129] Exemplos ilustrativos de regras para prever CDRs de cadeia pesada incluem: CDR-H1 que começa a cerca do resíduo 26 é precedido por Cys-XXX-XXX- XXX (SEQ ID NO: 77), tem 10-12 resíduos e é seguido por um Trp (normalmente Trp- Val, mas também, Trp-Ile, Trp-Ala); CDR-H2 que começa a cerca do resíduo 15 após o final de CDR-H1 é geralmente precedido por Leu-Glu-Trp-Ile-Gly (SEQ ID NO: 78), ou uma série de variações, que tem 16-19 resíduos, e é seguida por Lys/Arg- Leu/Ile/Val/Phe/Thr/Ala-Thr/Ser/Ile/Ala; e CDR-H3 que começa a cerca do resíduo 33 após o final de CDR-H2 é precedido por Cys-XXX-XXX (normalmente Cys-Ala-Arg), tem 3 a 25 resíduos e é seguido por Trp-Gly-XXX-Gly (SEQ ID NO: 79).
[0130] Em uma modalidade, os CDRs da cadeia leve e os CDRs da cadeia pesada são determinados de acordo com o método de Kabat.
[0131] Em uma modalidade, os CDRs da cadeia leve e os CDR2 e CDR3 da cadeia pesada são determinados de acordo com o método de Kabat, e o CDR1 da cadeia pesada é determinado de acordo com o método AbM, que é compreendido entre os métodos Kabat e Clothia, vide, por exemplo, Whitelegg N & Rees AR, Protein Eng., dezembro de 2000; 13(12):819-24 e Methods Mol Biol. 2004; 248: 51-91. Programas para prever CDRs estão disponíveis publicamente, por exemplo, AbYsis (www.bioinf.org.uk/abysis/).
[0132] As sequências das regiões de estrutura de diferentes cadeias leves ou pesadas são relativamente conservadas dentro de uma espécie, tais como os humanos. A região de estrutura de um anticorpo, ou seja, as regiões de estrutura combinadas das cadeias leves e pesadas constituintes, servem para posicionar e alinhar os CDRs no espaço tridimensional. Os CDRs são os principais responsáveis pela ligação a um epítopo de um antígeno. Os CDRs de cada cadeia são normalmente referidos como CDR1, CDR2 e CDR3, numerados sequencialmente a partir do N- terminal, e também são normalmente identificados pela cadeia em que o CDR particular está localizado. Assim, os CDRs localizados no domínio variável da cadeia pesada do anticorpo são referidos como CDRH1, CDRH2 e CDRH3, enquanto os CDRs localizados no domínio variável da cadeia leve do anticorpo são referidos como CDRL1, CDRL2, e CDRL3. Os anticorpos com diferentes especificidades (ou seja, diferentes sítios de combinação para diferentes antígenos) têm diferentes CDRs. Embora sejam os CDRs que variam de anticorpo para anticorpo, apenas um número limitado de posições de aminoácidos dentro dos CDRs está diretamente envolvido na ligação ao antígeno. Essas posições dentro dos CDRs são chamadas de resíduos determinantes de especificidade (SDRs). Exemplos ilustrativos de CDRs de cadeia leve que são adequados para a construção de CARs anti-CD79A contemplados em modalidades particulares incluem, mas não estão limitados a, sequências de CDR estabelecidas nas SEQ ID NOs: 1-3, 9-11 e 17-19. Os exemplos ilustrativos de CDRs de cadeia pesada que são adequados para construir CARs anti-CD79A contemplados em modalidades particulares incluem, mas não estão limitados a, sequências de CDR estabelecidas nas SEQ ID NOs: 4-6, 12-14 e 20-22.
[0133] As referências a "VL " ou "VL" referem-se à região variável de uma cadeia leve de imunoglobulina, incluindo a de um anticorpo, Fv, scFv, dsFv, Fab ou outro fragmento de anticorpo conforme contemplado neste documento. Exemplos ilustrativos de regiões variáveis de cadeia leve que são adequadas para a construção de CARs anti-CD79A contemplados em modalidades particulares incluem, mas não estão limitados a, sequências de região variável de cadeia leve estabelecidas nas SEQ ID NOs: 7, 15 e 23.
[0134] As referências a "VH" ou "VH" referem-se à região variável de uma cadeia pesada de imunoglobulina, incluindo a de um anticorpo, Fv, scFv, dsFv, Fab ou outro fragmento de anticorpo conforme contemplado neste documento. Exemplos ilustrativos de regiões variáveis de cadeia pesada que são adequadas para a construção de CARs anti-CD79A contemplados em modalidades particulares incluem, mas não estão limitados a, sequências de região variável de cadeia pesada estabelecidas nas SEQ ID NOs: 8, 16 e 24.
[0135] Um "anticorpo monoclonal" é um anticorpo produzido por um único clone de linfócitos B ou por uma célula na qual os genes de cadeia leve e pesada de um único anticorpo foram transfectados. Os anticorpos monoclonais são produzidos por métodos conhecidos pelos técnicos no assunto, por exemplo, fazendo células híbridas formadoras de anticorpos a partir de uma fusão de células de mieloma com células do baço imunológicas. Os anticorpos monoclonais incluem anticorpos monoclonais humanizados.
[0136] Um "anticorpo quimérico" tem resíduos de estrutura de uma espécie, tal como humana, e CDRs (que geralmente conferem ligação ao antígeno) de outra espécie, tal como um camundongo. Em modalidades preferidas particulares, um CAR compreende um domínio de ligação específico do antígeno que é um anticorpo quimérico ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo.
[0137] Em modalidades preferidas, o anticorpo é um anticorpo humano (tal como um anticorpo monoclonal humano) ou fragmento do mesmo que especificamente se liga a um polipeptídeo CD79A humano. Os anticorpos humanos podem ser construídos combinando sequência(s) de domínio variável do clone Fv selecionada(s) a partir de bibliotecas de exibição de fago derivadas de humanos com sequências de domínio constante humanas conhecidas conforme descrito acima. Alternativamente, os anticorpos monoclonais humanos podem ser produzidos pelo método de hibridoma. As linhas de células de mieloma humano e de heteromieloma camundongo-humano para a produção de anticorpos monoclonais humanos foram descritas, por exemplo, por Kozbor J. Immunol. 133:3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987); e Boerner et al., J. Immunol., 147:86 (1991). Além disso, animais transgênicos (por exemplo, camundongos) podem ser usados para produzir um repertório completo de anticorpos humanos na ausência de produção de imunoglobulina endógena. Vide, por exemplo, Jakobovits et al., PNAS USA, 90:2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362:255 (1993); Bruggermann et al., Year in Immunol., 7:33 (1993). O embaralhamento de genes também pode ser usado para derivar anticorpos humanos de não humanos, por exemplo, anticorpos de roedores, onde o anticorpo humano tem afinidades e especificidades semelhantes ao anticorpo não humano inicial. (Vide PCT WO 93/06213 publicado em 1 de abril de 1993). Ao contrário da humanização tradicional de anticorpos não humanos por enxerto de CDR, esta técnica fornece anticorpos completamente humanos, que não possuem resíduos de FR ou CDR de origem não humana.
[0138] Em uma modalidade, um CAR compreende um anticorpo "humanizado". Um anticorpo humanizado é uma imunoglobulina incluindo uma região de estrutura humana e um ou mais CDRs de uma imunoglobulina não humana (por exemplo, de um camundongo, rato ou sintética). A imunoglobulina não humana que fornece os CDRs é chamada de "doadora" e a imunoglobulina humana que fornece a estrutura é chamada de "aceitadora". Em uma modalidade, todos os CDRs são da imunoglobulina doadora em uma imunoglobulina humanizada. As regiões constantes não precisam estar presentes, mas se estiverem, devem ser substancialmente idênticas às regiões constantes da imunoglobulina humana, isto é, pelo menos cerca de 85-90%, tal como cerca de 95% ou mais idênticas. Portanto, todas as partes de uma imunoglobulina humanizada, exceto possivelmente os CDRs, são substancialmente idênticas às partes correspondentes das sequências naturais da imunoglobulina humana. Anticorpos humanizados ou outros anticorpos monoclonais podem ter substituições de aminoácidos conservativas adicionais, que substancialmente não têm efeito na ligação ao antígeno ou outras funções da imunoglobulina. Os anticorpos humanizados podem ser construídos por meio de engenharia genética (vide, por exemplo, Patente dos EUA de nº 5.585.089).
[0139] Em modalidades particulares, um anticorpo anti-CD79A ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo inclui, mas não está limitado a, um Camel Ig (um anticorpo de camelídeo (VHH)), Ig NAR, fragmentos Fab, fragmentos Fab', fragmentos F(ab')2, dímeros Fab biespecíficos (Fab2), trímeros Fab triespecíficos (Fab3), Fv, anticorpo Fv de cadeia única ("scFv"), bis-scFv, (scFv) 2, minicorpo, diacorpo, triacorpo, tetracorpo, proteína Fv estabilizada por dissulfeto ("dsFv”) e anticorpo de domínio único (sdAb, Nanocorpo).
[0140] "Camel Ig" ou "VHH de camelídeo", conforme usado neste documento, refere-se à menor unidade de ligação ao antígeno conhecida de um anticorpo de cadeia pesada (Koch-Nolte, et al., FASEB J., 21:3490-3498 (2007)). Um "anticorpo de cadeia pesada" ou um "anticorpo de camelídeo" refere-se a um anticorpo que contém dois domínios VH e nenhuma cadeia leve (Riechmann L. et al., J. Immunol. Methods 231: 25–38 (1999); WO94/04678; WO94/25591; Patente dos EUA de nº 6.005.079).
[0141] "IgNAR" de "novo receptor de antígeno de imunoglobulina" refere-se à classe de anticorpos do repertório imunológico de tubarão que consiste em homodímeros de um domínio de novo receptor de antígeno variável (VNAR) e cinco domínios de novo receptor de antígeno constante (CNAR). Os IgNARs representam alguns dos menores esqueletos de proteína baseados em imunoglobulina conhecidos e são altamente estáveis e possuem características de ligação eficientes. A estabilidade inerente pode ser atribuída a ambos (i) a estrutura de Ig subjacente, que apresenta um número considerável de resíduos carregados e hidrofílicos expostos à superfície em comparação com os domínios VH e VL de anticorpos convencionais encontrados em anticorpos murinos; e (ii) estabilizar características estruturais nas alças da região determinante complementar (CDR), incluindo pontes dissulfureto entre alças e padrões de ligações de hidrogênio intra-alças.
[0142] A digestão de anticorpos com papaína produz dois fragmentos de ligação ao antígeno idênticos, chamados fragmentos "Fab", cada um com um único sítio de ligação ao antígeno e um fragmento "Fc" residual, cujo nome reflete sua capacidade de cristalizar prontamente. O tratamento com pepsina produz um fragmento F(ab′) 2 que tem dois sítios de combinação de antígeno e ainda é capaz de reticular o antígeno.
[0143] “Fv” é o fragmento mínimo de anticorpo que contém um sítio de ligação ao antígeno completo. Em uma modalidade, uma espécie Fv de duas cadeias consiste em um dímero de um domínio variável de cadeia pesada e um domínio variável de cadeia leve em associação não covalente forte. Em uma espécie Fv de cadeia única (scFv), um domínio variável de cadeia pesada e um de cadeia leve podem ser covalentemente ligados por um ligante peptídico flexível de tal modo que as cadeias leve e pesada possam se associar em uma estrutura "dimérica" análoga àquela de um espécies Fv de duas cadeias. É nesta configuração que as três regiões hipervariáveis (HVRs) de cada domínio variável interagem para definir um sítio de ligação ao antígeno na superfície do dímero VH-VL. Coletivamente, as seis HVRs conferem especificidade de ligação ao antígeno para o anticorpo. No entanto, mesmo um único domínio variável (ou metade de um Fv compreendendo apenas três HVRs específicas para um antígeno) tem a capacidade de reconhecer e ligar o antígeno, embora com uma afinidade mais baixa do que todo o sítio de ligação.
[0144] O fragmento Fab contém os domínios variáveis da cadeia pesada e leve e também contém o domínio constante da cadeia leve e o primeiro domínio constante (CH1) de cadeia pesada. Os fragmentos Fab′ diferem dos fragmentos Fab pela adição de alguns resíduos no terminal carbóxi do domínio CH1 de cadeia pesada, incluindo uma ou mais cisteínas da região de dobradiça do anticorpo. Fab′-SH é a designação deste documento para Fab′ em que o(s) resíduo(s) de cisteína dos domínios constantes carregam um grupo tiol livre. Os fragmentos de anticorpo F(ab')2 foram originalmente produzidos como pares de fragmentos Fab' que têm cisteínas de dobradiça entre eles. Outros acoplamentos químicos de fragmentos de anticorpos também são conhecidos. Dímeros Fab biespecíficos (Fab2) têm dois fragmentos Fab′, cada um ligando um antígeno diferente. Trímeros Fab triespecíficos (Fab3) têm três fragmentos Fab′, cada um ligando um antígeno diferente.
[0145] O termo "diacorpos" refere-se a fragmentos de anticorpos com dois sítios de ligação ao antígeno, cujos fragmentos compreendem um domínio variável de cadeia pesada (VH) conectado a um domínio variável de cadeia leve (VL) na mesma cadeia polipeptídica (VH-VL). Ao usar um ligante que é muito curto para permitir o emparelhamento entre os dois domínios na mesma cadeia, os domínios são forçados a emparelhar com os domínios complementares de outra cadeia e criar dois sítios de ligação ao antígeno. Diacorpos podem ser bivalentes ou biespecíficos. Diacorpos são descritos mais completamente em, por exemplo, EP 404.097; WO 1993/01161; Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003); e Hollinger et al., PNAS USA 90: 6444- 6448 (1993). Triacorpos e tetracorpos também são descritos em Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003).
[0146] "Anticorpo de domínio único" ou "sdAb" ou "nanocorpo" refere-se a um fragmento de anticorpo que consiste na região variável de uma cadeia pesada de anticorpo (domínio VH) ou na região variável de uma cadeia leve de anticorpo (domínio VL) (Holt, L., et al, Trends in Biotechnology, 21(11): 484-490).
[0147] Fragmentos de anticorpo "Fv de cadeia única" ou "scFv" compreendem os domínios VH e VL do anticorpo, em que esses domínios estão presentes em uma cadeia polipeptídica única e em qualquer orientação (por exemplo, VL-VH ou VH-VL). Geralmente, o polipeptídeo scFv compreende ainda um ligante polipeptídico entre os domínios VH e VL que permite que o scFv forme a estrutura desejada para ligação ao antígeno. Para uma revisão de scFv, vide, por exemplo, Pluckthün, em The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg e Moore eds., (Springer- Verlag, Nova York, 1994), pp. 269-315.
[0148] Em modalidades preferidas, o fragmento de ligação ao antígeno anti- CD79A é um scFv. Em modalidades particulares, o scFv é um scFv murino, humano ou humanizado. Os anticorpos de cadeia única podem ser clonados a partir dos genes da região V de um hibridoma específico para um alvo desejado. A produção de tais hibridomas tornou-se rotina. Uma técnica que pode ser usada para clonar a cadeia pesada da região variável (VH) e a cadeia leve da região variável (VL) foi descrita, por exemplo, em Orlandi et al., PNAS, 1989; 86: 3833-3837.
[0149] Em várias modalidades, um anticorpo anti-CD79A ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende uma sequência de cadeia leve variável compreendendo sequências CDRL1-CDRL3 estabelecidas nas SEQ ID NOs: 1-3, 9-11 ou 17-19 e/ou uma pesada sequência de cadeia pesada variável que compreende as sequências CDRH1-CDRH3 estabelecidas nas SEQ ID NOs: 4-6, 12-14. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-CD79A ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende uma sequência de cadeia leve variável conforme estabelecido em qualquer uma das SEQ ID NOs: 7, 15 ou 23 e/ou uma sequência de cadeia pesada variável conforme estabelecido em qualquer uma das SEQ ID NOs: 8, 16 ou 24.
[0150] Em modalidades particulares, o domínio de ligação específico do antígeno é um scFv que se liga a um polipeptídeo CD79A humano.
[0151] Um exemplo de domínio de ligação específico de CD79A é uma região variável de imunoglobulina específica para CD79A que compreende pelo menos uma região de estrutura humana. Uma "região de estrutura humana" refere-se a uma região de estrutura do tipo selvagem (ou seja, de ocorrência natural) de uma região variável de imunoglobulina humana, uma região de estrutura alterada de uma região variável de imunoglobulina humana com menos de cerca de 50% (por exemplo, de preferência menos de cerca de 45%, 40%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5% ou 1%) dos aminoácidos na região deletada ou substituída (por exemplo, com um ou mais resíduos de aminoácidos de um região de estrutura de imunoglobulina não humana em posições correspondentes), ou uma região de estrutura alterada de uma região variável de imunoglobulina não humana com menos de cerca de 50% (por exemplo, menos de 45%, 40%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10 % ou 5%) dos aminoácidos na região deletada ou substituída (por exemplo, em posições de resíduos expostos e/ou com um ou mais resíduos de aminoácidos de uma região de estrutura de imunoglobulina humana em posições correspondentes) de modo que, em um aspecto, a imunogenicidade seja reduzida.
[0152] Em certas modalidades, uma região de estrutura humana é uma região de estrutura do tipo selvagem de uma região variável de imunoglobulina humana. Em certas outras modalidades, uma região de estrutura humana é uma região de estrutura alterada de uma região variável da imunoglobulina humana com deleções ou substituições de aminoácidos em uma, duas, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez ou mais posições. Em outras modalidades, uma região de estrutura humana é uma região de estrutura alterada de uma região variável de imunoglobulina não humana com deleções ou substituições de aminoácidos em uma, duas, três, quatro,
cinco, seis, sete, oito, nove, dez ou mais posições.
[0153] Em modalidades particulares, um domínio de ligação específico de CD79A compreende pelo menos um, dois, três, quatro, cinco, seis, sete ou oito regiões de estrutura humanas (FR) selecionadas a partir de FR1 de cadeia leve humana, FR1 de cadeia pesada humana, FR2 de cadeia leve humana, FR2 de cadeia pesada humana, FR3 de cadeia leve humana, FR3 de cadeia pesada humana, FR4 de cadeia leve humana e FR4 de cadeia pesada humana.
[0154] FRs humanas que podem estar presentes em domínios de ligação específicos de CD79A também incluem variantes das FRs exemplares fornecidas neste documento em que um, dois, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez ou mais aminoácidos das FRs exemplares foram substituídos ou deletados.
[0155] Em certas modalidades, um domínio de ligação específico de CD79A compreende (a) uma região variável de cadeia leve humanizada que compreende uma FR1 de cadeia leve humana, uma FR2 de cadeia leve humana, uma FR3 de cadeia leve humana e uma FR4 de cadeia leve humana, e (b) uma região variável de cadeia pesada humanizada que compreende uma FR1 de cadeia pesada humana, uma FR2 de cadeia pesada humana, uma FR3 de cadeia pesada humana e uma FR4 de cadeia pesada humana.
[0156] Domínios de ligação específicos de CD79A fornecidos neste documento também compreendem um, dois, três, quatro, cinco ou seis CDRs. Tais CDRs podem ser CDRs não humanos ou CDRs não humanos alterados selecionados a partir de CDRL1, CDRL2 e CDRL3 da cadeia leve e CDRH1, CDRH2 e CDRH3 de cadeia pesada. Em certas modalidades, um domínio de ligação específico de CD79A compreende (a) uma região variável de cadeia leve que compreende um CDRL1 de cadeia leve, um CDRL2 de cadeia leve e um CDRL3 de cadeia leve e (b) uma região variável de cadeia pesada que compreende um CDRH1 de cadeia pesada, um CDRH2 de cadeia pesada e um CDRH3 de cadeia pesada.
[0157] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-CD79A ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende uma sequência de cadeia leve variável compreendendo sequências CDRL1-CDRL3 com pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92 %, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de aminoácidos às sequências de aminoácidos estabelecidas nas SEQ ID NOs: 1-3, 9-11 ou 17-19 e/ou uma sequência de cadeia pesada variável compreendendo sequências CDRH1-CDRH3 com pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96 %, 97%, 98% ou 99% de identidade de aminoácidos à sequência de aminoácidos estabelecida nas SEQ ID NOs: 4-6, 12-14 ou 20-22.
[0158] Em uma modalidade, um domínio de ligação específico de CD79A compreende sequências CDR de cadeia leve estabelecidas nas SEQ ID NOs: 1-3, 9- 11 ou 17-19. Em uma modalidade particular, um domínio de ligação específico de CD79A compreende sequências CDR de cadeia leve com pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95 %, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de aminoácidos às sequências CDR da cadeia leve estabelecidas nas SEQ ID NOs: 1-3, 9-11 ou 17-19.
[0159] Em uma modalidade, um domínio de ligação específico de CD79A compreende sequências CDR de cadeia pesada estabelecidas nas SEQ ID NOs: 4-6, 12-14 ou 20-22. Em uma modalidade particular, um domínio de ligação específico de CD79A compreende sequências CDR de cadeia pesada com pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95 %, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de aminoácidos às sequências CDR da cadeia pesada estabelecidas nas SEQ ID NOs: 4-6, 12-14 ou 20-22.
[0160] Em algumas modalidades, o anticorpo anti-idiotipo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende uma sequência de cadeia leve variável com pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de aminoácidos à sequência de aminoácidos estabelecida em qualquer uma das SEQ ID NOs: 7, 15 ou 23 e/ou uma sequência de cadeia pesada variável com pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de aminoácidos à sequência de aminoácidos estabelecida em qualquer uma das SEQ ID NOs: 8, 16 ou 24.
2. Ligantes
[0161] Em certas modalidades, os CARs anti-CD79A compreendem resíduos de ligante entre os vários domínios, por exemplo, adicionados para espaçamento e conformação apropriados da molécula. Em modalidades particulares, o ligante é uma sequência de ligação de região variável. Uma "sequência de ligação de região variável" é uma sequência de aminoácidos que conecta os domínios VH e VL e fornece uma função espaçadora compatível com a interação dos dois domínios de subligação de modo que o polipeptídeo resultante retém uma afinidade de ligação específica para a mesma molécula alvo como um anticorpo que compreende as mesmas regiões variáveis de cadeia leve e pesada. Em modalidades particulares, os CARs compreendem um, dois, três, quatro ou cinco ou mais ligantes. Em modalidades particulares, o comprimento de um ligante é de cerca de 1 a cerca de 25 aminoácidos, cerca de 5 a cerca de 20 aminoácidos, ou cerca de 10 a cerca de 20 aminoácidos, ou qualquer comprimento intermediário de aminoácidos. Em algumas modalidades, o ligante é 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 ou mais aminoácidos de comprimento.
[0162] Os exemplos ilustrativos de ligantes incluem polímeros de glicina (G)n; polímeros de glicina-serina (G1-5S1-5)n, onde n é um número inteiro de pelo menos um, dois, três, quatro ou cinco; polímeros de glicina-alanina; polímeros de alanina-serina; e outros ligantes flexíveis conhecidos na técnica. Os polímeros de glicina e glicina-serina são relativamente não estruturados e, portanto, podem ser capazes de servir como uma corrente neutra entre domínios de proteínas de fusão, tais como os CARs descritos neste documento. A glicina acessa significativamente mais espaço phi-psi do que até mesmo a alanina, e é muito menos restrita do que resíduos com cadeias laterais mais longas (vide Scheraga, Rev. Computational Chem. 11173-142 (1992)). O técnica no assunto reconhecerá que o projeto de um CAR em modalidades particulares pode incluir ligantes que são totalmente ou parcialmente flexíveis, de tal modo que o ligante possa incluir um ligante flexível, bem como uma ou mais porções que conferem uma estrutura menos flexível para fornecer uma estrutura do CAR desejada.
[0163] Outros ligantes exemplares incluem, mas não estão limitados, as seguintes sequências de aminoácidos: DGGGS (SEQ ID NO: 39); TGEKP (SEQ ID NO: 40) (vide, por exemplo, Liu et al., PNAS 5525-5530 (1997)); GGRR (SEQ ID NO: 41) (Pomerantz et al. 1995, supra); (GGGGS)n em que= 1, 2, 3, 4 ou 5 (SEQ ID NO: 42) (Kim et al., PNAS 93, 1156-1160 (1996.); EGKSSGSGSESKVD (SEQ ID NO: 43) (Chaudhary et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87:1066-1070); KESGSVSSEQLAQFRSLD (SEQ ID NO: 44) (Bird et al., 1988, Science 242:423-426), GGRRGGGS (SEQ ID NO: 45); LRQRDGERP (SEQ ID NO: 46); LRQKDGGGSERP (SEQ ID NO: 47); LRQKD(GGGS)2 ERP (SEQ ID NO: 48). Alternativamente, os ligantes flexíveis podem ser racionalmente projetados usando um programa de computador capaz de modelar os sítios de ligação ao DNA e os próprios peptídeos (Desjarlais & Berg, PNAS 90:2256-2260 (1993), PNAS 91:11099-11103 (1994) ou por métodos de exibição de fago. Em uma modalidade, o ligante compreende a seguinte sequência de aminoácidos: GSTSGSGKPGSGEGSTKG (SEQ ID NO: 49) (Cooper et al., Blood, 101 (4):1637-1644 (2003)).
3. DOMÍNIO ESPAÇADOR
[0164] Em modalidades particulares, o domínio de ligação de um CAR anti- CD79A é seguido por um ou mais "domínios espaçadores", que referem-se à região que move o domínio de ligação ao antígeno para longe da superfície da célula efetora para permitir o contato adequado célula/célula, ligação ao antígeno e ativação (Patel et al., Gene Therapy, 1999; 6:412-419). O domínio de dobradiça pode ser derivado de uma fonte natural, sintética, semissintética ou recombinante. Em certas modalidades, um domínio espaçador é uma porção de uma imunoglobulina, incluindo, mas não se limitando a, uma ou mais regiões constantes de cadeia pesada, por exemplo, CH2 e CH3. O domínio espaçador pode incluir a sequência de aminoácidos de uma região dobradiça de imunoglobulina de ocorrência natural ou uma região dobradiça de imunoglobulina alterada.
[0165] Em uma modalidade, o domínio espaçador compreende o CH2 e CH3 de IgG1, IgG4 ou IgD.
4. DOMÍNIO DE DOBRADIÇA
[0166] O domínio de ligação de um CAR anti-CD79A é geralmente seguido por um ou mais "domínios de dobradiça", que desempenham um papel no posicionamento do domínio de ligação ao antígeno longe da superfície da célula efetora para permitir o contato adequado célula/célula, ligação ao antígeno e ativação. Um CAR anti-CD79A geralmente compreende um ou mais domínios de dobradiça entre o domínio de ligação e o domínio transmembranar (TM). O domínio de dobradiça pode ser derivado de uma fonte natural, sintética, semissintética ou recombinante. O domínio de dobradiça pode incluir a sequência de aminoácidos de uma região de dobradiça de imunoglobulina de ocorrência natural ou uma região de dobradiça de imunoglobulina alterada.
[0167] Uma "região de dobradiça alterada" refere-se a (a) uma região de dobradiça de ocorrência natural com até 30% de alterações de aminoácidos (por exemplo, até 25%, 20%, 15%, 10% ou 5% de substituições ou deleções de aminoácidos), (b) uma porção de uma região de dobradiça de ocorrência natural que tem pelo menos 10 aminoácidos (por exemplo, pelo menos 12, 13, 14 ou 15 aminoácidos) de comprimento com até 30% de alterações de aminoácidos (por exemplo, até 25%, 20%, 15%, 10% ou 5% substituições ou deleções de aminoácidos), ou (c) uma porção de uma região de dobradiça de ocorrência natural que compreende a região de dobradiça central (que pode ter 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou 15, ou pelo menos 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13,
14 ou 15 aminoácidos de comprimento). Em certas modalidades, um ou mais resíduos de cisteína em uma região de dobradiça de imunoglobulina de ocorrência natural podem ser substituídos por um ou mais outros resíduos de aminoácidos (por exemplo, um ou mais resíduos de serina). Uma região de dobradiça de imunoglobulina alterada pode alternativamente ou adicionalmente ter um resíduo de prolina de uma região de dobradiça de imunoglobulina do tipo selvagem substituído por outro resíduo de aminoácido (por exemplo, um resíduo de serina).
[0168] Domínios de dobradiça ilustrativos adequados para uso nos CARs descritos neste documento incluem a região de dobradiça derivada das regiões extracelulares de proteínas de membrana tipo 1, tais como CD8α e CD4, que podem ser regiões de dobradiça do tipo selvagem dessas moléculas ou podem ser alteradas. Em uma modalidade, a dobradiça é uma dobradiça PD-1 ou dobradiça CD152. Em outra modalidade, o domínio de dobradiça compreende uma região de dobradiça CD8α.
5. DOMÍNIO TRANSMEMBRANAR (TM)
[0169] O "domínio transmembranar" é a porção de um CAR anti-CD79A que funde a porção de ligação extracelular e o domínio de sinalização intracelular e ancora o CAR à membrana plasmática da célula efetora imunológica. O domínio TM pode ser derivado de uma fonte natural, sintética, semissintética ou recombinante. O domínio TM pode ser derivado de (ou seja, compreende pelo menos a(s) região(ões) transmembranar(es) da cadeia alfa ou beta do receptor de células T, CD3ε, CDγ, CD3ζ, CD4, CD5, CD8α, CD9, CD 16, CD22, CD27, CD28, CD33, CD37, CD45, CD64, CD80, CD86, CD 134, CD137, CD152, CD154, e PD1. Em uma modalidade particular, o domínio TM é sintético e compreende predominantemente resíduos hidrofóbicos, tais como leucina e valina.
[0170] Em uma modalidade, os CARs compreendem um domínio TM derivado de PD1, CD152, CD28 ou CD8α. Em outra modalidade, um CAR compreende um domínio TM derivado de PD1, CD152, CD28 ou CD8α e um ligante oligo ou polipeptídico curto, de preferência entre 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10 aminoácidos de comprimento que ligam o domínio TM e o domínio de sinalização intracelular do CAR. Um ligante baseado em glicina-serina fornece um ligante particularmente adequado.
6. DOMÍNIO DE SINALIZAÇÃO INTRACELULAR
[0171] Em modalidades particulares, os CARs anti-CD79A compreendem um ou mais domínios de sinalização intracelulares. Um "domínio de sinalização intracelular" refere-se à parte de um CAR que participa na transdução da mensagem de ligação ao CAR anti-CD79A eficaz a um polipeptídeo CD79A humano para o interior da célula efetora imunológica para eliciar a função da célula efetora, por exemplo, ativação, produção, proliferação e atividade citotóxica de citocinas, incluindo a liberação de fatores citotóxicos para a célula alvo ligada ao CAR, ou outras respostas celulares desencadeadas com ligação do antígeno ao domínio CAR extracelular.
[0172] O termo "função efetora" refere-se a uma função especializada de uma célula efetora imunológica. A função efetora da célula T, por exemplo, pode ser atividade ou ajuda citolítica ou atividade incluindo a secreção de uma citocina. Assim, o termo "domínio de sinalização intracelular" refere-se à porção de uma proteína que transduz o sinal da função efetora e que direciona a célula para realizar uma função especializada. Embora normalmente todo o domínio de sinalização intracelular possa ser empregado, em muitos casos não é necessário usar todo o domínio. Na medida em que uma porção truncada de um domínio de sinalização intracelular é usada, essa porção truncada pode ser usada no lugar de todo o domínio, desde que transduza o sinal da função efetora. O termo domínio de sinalização intracelular pretende incluir qualquer porção truncada do domínio de sinalização intracelular suficiente para transduzir o sinal da função efetora.
[0173] Sabe-se que os sinais gerados apenas pelo TCR são insuficientes para a ativação completa da célula T e que um sinal secundário ou coestimulador também é necessário. Assim, pode-se dizer que a ativação de células T é mediada por duas classes distintas de domínios de sinalização intracelulares: domínios de sinalização primários que iniciam a ativação primária dependente do antígeno através do TCR (por exemplo, um complexo TCR/CD3) e domínios de sinalização coestimuladores que atuam de uma maneira independente do antígeno para fornecer um sinal secundário ou coestimulador. Em modalidades preferidas, um CAR compreende um domínio de sinalização intracelular que compreende um ou mais "domínios de sinalização coestimuladores" e um "domínio de sinalização primário".
[0174] Os domínios de sinalização primários regulam a ativação primária do complexo TCR de uma forma estimuladora ou inibitória. Os domínios de sinalização primários que atuam de maneira estimulante podem conter motivos de sinalização que são conhecidos como motivos de ativação de imunorreceptores baseados em tirosina ou ITAMs.
[0175] Exemplos ilustrativos de ITAM contendo domínios de sinalização primários que são úteis em modalidades particulares incluem aqueles derivados de FcRγ, FcRβ, CD3γ, CD3δ, CD3ε, CD3ζ, CD22, CD79a, CD79b e CD66d. Em modalidades preferidas particulares, um CAR anti-CD79A compreende um domínio de sinalização primário de CD3ζ e um ou mais domínios de sinalização coestimuladores. Os domínios de sinalização primária intracelular e de sinalização coestimulador podem ser ligados em qualquer ordem em tandem ao terminal carboxila do domínio transmembranar.
[0176] Em modalidades particulares, os CARs compreendem um ou mais domínios de sinalização coestimuladores para aumentar a eficácia e a expansão das células T que expressam os receptores do CAR. Conforme usado neste documento, o termo "domínio de sinalização coestimulador" ou "domínio coestimulador" refere-se a um domínio de sinalização intracelular de uma molécula coestimuladora. As moléculas coestimuladoras são moléculas de superfície celular diferentes dos receptores de antígeno ou receptores Fc que fornecem um segundo sinal necessário para a ativação e função eficientes dos linfócitos T após a ligação ao antígeno. Exemplos ilustrativos de tais moléculas coestimuladoras incluem TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8,
TLR9, TLR10, CARD11, CD2, CD7, CD27, CD28, CD30, CD40, CD54 (ICAM), CD83, CD134 (OX40), CD137 (4-1BB), CD278 (ICOS), DAP10, LAT, NKD2C, SLP76, TRIM e ZAP70. Em uma modalidade, um CAR compreende um ou mais domínios de sinalização coestimuladores selecionados a partir do grupo que consiste em CD28, CD137 e CD134 e um domínio de sinalização primário de CD3ζ.
[0177] Em outra modalidade, um CAR compreende domínios de sinalização coestimuladores de CD28 e CD137 e um domínio de sinalização primário de CD3ζ.
[0178] Em ainda outra modalidade, um CAR compreende domínios de sinalização coestimuladores de CD28 e CD134 e um domínio de sinalização primário de CD3ζ.
[0179] Em uma modalidade, um CAR compreende domínios de sinalização coestimuladores CD137 e CD134 e um domínio de sinalização primário de CD3ζ.
[0180] Em uma modalidade, um CAR compreende um domínio de sinalização coestimulador de CD137 e um domínio de sinalização primário de CD3ζ.
[0181] Em uma modalidade, um CAR compreende um domínio de sinalização coestimulador de CD134 e um domínio de sinalização primário de CD3ζ.
[0182] Em uma modalidade, um CAR compreende um domínio de sinalização coestimulador de CD28 e um domínio de sinalização primário de CD3ζ.
[0183] Em modalidades particulares, os CARs compreendem um anticorpo anti-CD79A ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que especificamente se liga a um polipeptídeo CD79A expresso em uma célula cancerosa.
[0184] Em uma modalidade, um CAR compreende um scFv anti-CD79A que se liga a um polipeptídeo CD79A; um domínio transmembranar derivado de um polipeptídeo selecionado a partir do grupo que consiste em: cadeia alfa ou beta do receptor de células T, CDδ, CD3ε, CDγ, CD3ζ, CD4, CD5, CD8α, CD9, CD 16, CD22, CD27, CD28, CD33, CD37, CD45, CD64, CD80, CD86, CD 134, CD137, CD152, CD154, AMN1 e PD1; e um ou mais domínios de sinalização coestimuladores intracelulares de uma molécula coestimuladora selecionada a partir do grupo que consiste em: TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9, TLR10, CARD11, CD2, CD7, CD27, CD28, CD30, CD40, CD54 (ICAM), CD83, CD134 (OX40), CD137 (4-1BB), CD278 (ICOS), DAP10, LAT, NKD2C, SLP76, TRIM e ZAP70; e um domínio de sinalização primário de FcRγ, FcRβ, CD3γ, CD3δ, CD3ε, CD3ζ, CD22, CD79a, CD79b e CD66d.
[0185] Em uma modalidade, um CAR compreende um scFv anti-CD79A que se liga a um polipeptídeo CD79A; um domínio de dobradiça selecionado a partir do grupo que consiste em: dobradiça IgG1/CH2/CH3, dobradiça de IgG4/CH2/CH3, uma dobradiça de PD1, uma dobradiça de CD152 e uma dobradiça de CD8α; um domínio transmembranar derivado de um polipeptídeo selecionado a partir do grupo que consiste em: cadeia alfa ou beta do receptor de células T, CDδ, CD3ε, CDγ, CD3ζ, CD4, CD5, CD8α, CD9, CD 16, CD22, CD27, CD28, CD33, CD37, CD45, CD64, CD80, CD86, CD 134, CD137, CD152, CD154, AMN1 e PD1; e um ou mais domínios de sinalização coestimuladores intracelulares de uma molécula coestimuladora selecionada a partir do grupo que consiste em: TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9, TLR10, CARD11, CD2, CD7, CD27, CD28, CD30, CD40, CD54 (ICAM), CD83, CD134 (OX40), CD137 (4-1BB), CD278 (ICOS), DAP10, LAT, NKD2C, SLP76, TRIM e ZAP70; e um domínio de sinalização primário de FcRγ, FcRβ, CD3γ, CD3δ, CD3ε, CD3ζ, CD22, CD79a, CD79b e CD66d.
[0186] Em uma modalidade, um CAR compreende um scFv anti-CD79A que se liga a um polipeptídeo CD79A; um domínio de dobradiça selecionado a partir do grupo que consiste em: dobradiça de IgG1/CH2/CH3, dobradiça de IgG4/CH2/CH3, uma dobradiça de PD1, uma dobradiça de CD152 e uma dobradiça de CD8α; um domínio transmembranar derivado de um polipeptídeo selecionado a partir do grupo que consiste em: cadeia alfa ou beta do receptor de células T, CDδ, CD3ε, CDγ, CD3ζ, CD4, CD5, CD8α, CD9, CD 16, CD22, CD27, CD28, CD33, CD37, CD45, CD64, CD80,
CD86, CD 134, CD137, CD152, CD154, AMN1 e PD1; um ligante oligo ou polipeptídico curto, de preferência entre 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 aminoácidos de comprimento que liga o domínio TM ao domínio de sinalização intracelular do CAR; e um ou mais domínios de sinalização coestimuladores intracelulares de uma molécula coestimuladora selecionada a partir do grupo que consiste em: TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9, TLR10, CARD11, CD2, CD7, CD27, CD28, CD30, CD40, CD54 (ICAM), CD83, CD134 (OX40), CD137 (4-1BB), CD278 (ICOS), DAP10, LAT, NKD2C, SLP76, TRIM e ZAP70; e um domínio de sinalização primário de FcRγ, FcRβ, CD3γ, CD3δ, CD3ε, CD3ζ, CD22, CD79a, CD79b e CD66d.
[0187] Em uma modalidade particular, um CAR compreende um scFv anti- CD79A que se liga a um polipeptídeo CD79A; um domínio de dobradiça compreendendo um polipeptídeo de dobradiça de IgG1/CH2/CH3 e um polipeptídeo CD8α; um domínio transmembranar de CD8α compreendendo um ligante polipeptídico de cerca de 3 a cerca de 10 aminoácidos; um domínio de sinalização coestimulador intracelular de CD137; e um domínio de sinalização primário de CD3ζ.
[0188] Em uma modalidade particular, um CAR compreende um scFv anti- CD79A que se liga a um polipeptídeo CD79A; um domínio de dobradiça compreendendo um polipeptídeo CD8α; um domínio transmembranar de CD8α compreendendo um ligante polipeptídico de cerca de 3 a cerca de 10 aminoácidos; um domínio de sinalização coestimulador intracelular de CD134; e um domínio de sinalização primário de CD3ζ.
[0189] Em uma modalidade particular, um CAR compreende um scFv anti- CD79A que se liga a um polipeptídeo CD79A; um domínio de dobradiça compreendendo um polipeptídeo CD8α; um domínio transmembranar de CD8α compreendendo um ligante polipeptídico de cerca de 3 a cerca de 10 aminoácidos; um domínio de sinalização coestimulador intracelular de CD28; e um domínio de sinalização primário de CD3ζ.
[0190] O projeto dos CARs contemplados em modalidades particulares permitem expansão melhorada, persistência a longo prazo e propriedades citotóxicas em células T que expressam os CARs em comparação com células T não modificadas ou células T modificadas para expressar outros CARs. D. POLIPEPTÍDEOS
[0191] Vários polipeptídeos, polipeptídeos de fusão e variantes de polipeptídeos são contemplados neste documento, incluindo, mas não se limitando a, polipeptídeos CAR e fragmentos dos mesmos. Em modalidades preferidas, um polipeptídeo compreendendo um ou mais CARs é fornecido. Em modalidades particulares, o CAR é um CAR anti-CD79A compreendendo uma sequência de aminoácidos conforme estabelecido em qualquer uma das SEQ ID NOs: 25-30.
[0192] "Polipeptídeo", "peptídeo" e "proteína" são usados de forma intercambiável, a menos que especificado em contrário, e de acordo com o significado convencional, ou seja, como uma sequência de aminoácidos. Os polipeptídeos não estão limitados a um comprimento específico, por exemplo, eles podem compreender um polipeptídeo de comprimento total ou um fragmento de polipeptídeo e podem incluir uma ou mais modificações pós-tradução do polipeptídeo, por exemplo, glicosilações, acetilações, fosforilações e similares, bem como outras modificações conhecidas na técnica, tanto de ocorrência natural como não natural. Em várias modalidades, os polipeptídeos do CAR compreendem uma sequência de sinal (ou líder) na extremidade N-terminal da proteína, que direciona a transferência da proteína de forma cotraducional ou pós-traducional. Exemplos ilustrativos de sequências de sinal adequadas úteis em CARs contemplados em modalidades particulares incluem, mas não estão limitados a, polipeptídeo de sinal de cadeia pesada de IgG1, um polipeptídeo de sinal de CD8α ou um polipeptídeo de sinal alfa do receptor de GM-CSF humano. Os polipeptídeos podem ser preparados usando qualquer uma de uma variedade de técnicas recombinantes e/ou sintéticas bem conhecidas. Os polipeptídeos contemplados neste documento abrangem os CARs da presente divulgação, ou sequências que têm deleções, adições e/ou substituições de um ou mais aminoácidos de um CAR contemplado neste documento.
[0193] Um "polipeptídeo isolado" e similares, tal como usado neste documento, referem-se a síntese in vitro, isolamento e/ou purificação de um peptídeo ou molécula de polipeptídeo de um ambiente celular e da associação com outros componentes da célula, ou seja, não é significativamente associado a substâncias in vivo. Em modalidades particulares, um polipeptídeo isolado é um polipeptídeo sintético, um polipeptídeo semissintético ou um polipeptídeo obtido ou derivado de uma fonte recombinante.
[0194] Os polipeptídeos incluem "variantes de polipeptídeos". Variantes de polipeptídeo podem diferir de um polipeptídeo de ocorrência natural em uma ou mais substituições, deleções, adições e/ou inserções. Tais variantes podem ocorrer naturalmente ou podem ser geradas sinteticamente, por exemplo, modificando uma ou mais das sequências polipeptídicas acima. Por exemplo, em modalidades particulares, pode ser desejável melhorar a afinidade de ligação e/ou outras propriedades biológicas dos CARs, introduzindo uma ou mais substituições, deleções, adições e/ou inserções em um domínio de ligação, dobradiça, domínio TM, domínio de sinalização coestimulador ou domínio de sinalização primário de um polipeptídeo CAR. Em modalidades particulares, os polipeptídeos incluem polipeptídeos com pelo menos cerca de 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 86%, 97%, 98% ou 99% de identidade de aminoácidos com qualquer uma das sequências de referência contempladas neste documento, normalmente onde a variante mantém pelo menos uma atividade biológica da sequência de referência. Em modalidades particulares, a atividade biológica é afinidade de ligação. Em modalidades particulares, a atividade biológica é a atividade citolítica.
[0195] Os polipeptídeos incluem "fragmentos de polipeptídeos". Os fragmentos de polipeptídeo referem-se a um polipeptídeo, que pode ser monomérico ou multimérico que tem uma deleção no terminal amino, uma deleção no terminal carboxila e/ou uma deleção interna ou substituição de um polipeptídeo de ocorrência natural ou produzido de forma recombinante. Os exemplos ilustrativos de fragmentos polipeptídicos biologicamente ativos incluem fragmentos de anticorpo. Tal como usado neste documento, o termo "fragmento biologicamente ativo" ou "fragmento biologicamente ativo mínimo" refere-se a um fragmento de polipeptídeo que retém pelo menos 100%, pelo menos 90%, pelo menos 80%, pelo menos 70%, pelo menos 60%, pelo menos 50%, pelo menos 40%, pelo menos 30%, pelo menos 20%, pelo menos 10% ou pelo menos 5% da atividade do polipeptídeo de ocorrência natural. Em modalidades preferidas, a atividade biológica é a afinidade de ligação a um idiotipo. Em certas modalidades, um fragmento de polipeptídeo pode compreender uma cadeia de aminoácidos com pelo menos 5 a cerca de 500 aminoácidos de comprimento. Será apreciado que em certas modalidades, os fragmentos são pelo menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 150, 200, 250, 300, 350, 400 ou 450 aminoácidos de comprimento. Fragmentos polipeptídicos particularmente úteis incluem domínios funcionais, incluindo domínios de ligação ao antígeno ou fragmentos de anticorpos. No caso de um anticorpo anti-CD79A, fragmentos úteis incluem, mas não estão limitados a: uma região CDR, uma região CDR3 de cadeia pesada ou leve; uma região variável de uma cadeia pesada ou leve; uma porção de uma cadeia de anticorpo ou região variável incluindo dois CDRs; e similares.
[0196] O polipeptídeo também pode ser fundido "in-frame" ou conjugado a um ligante ou outra sequência para facilidade de síntese, purificação ou identificação do polipeptídeo (por exemplo, poli-His), ou para acentuar a ligação do polipeptídeo a um suporte sólido.
[0197] Como observado acima, em modalidades particulares, os polipeptídeos podem ser alterados de várias maneiras, incluindo substituições, deleções, truncagens e inserções de aminoácidos. Os métodos para tais manipulações são geralmente conhecidos na técnica. Por exemplo, variantes da sequência de aminoácidos de um polipeptídeo de referência podem ser preparadas por mutações no DNA. Os métodos para mutagênese e alterações na sequência de nucleotídeos são bem conhecidos na técnica. Vide, por exemplo, Kunkel (1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82: 488-492), Kunkel et al., (1987, Methods in Enzymol, 154: 367-382), Patente dos EUA de nº No.
4.873.192, Watson, J. D. et al., (Molecular Biology of the Gene, Fourth Edition, Benjamin/Cummings, Menlo Park, Calif., 1987) e as referências citadas neste documento. A orientação quanto às substituições de aminoácidos adequadas que não afetam a atividade biológica da proteína de interesse pode ser encontrada no modelo de Dayhoff et al., (1978) Atlas of Protein Sequence and Structure (Natl. Biomed. Res. Found., Washington, DC).
[0198] Em certas modalidades, uma variante de polipeptídeo compreende uma ou mais substituições conservativas. Uma "substituição conservativa" é aquela em que um aminoácido é substituído por outro aminoácido que tem propriedades semelhantes, de tal modo que um técnico no assunto da química de peptídeos esperaria que a estrutura secundária e a natureza hidropática do polipeptídeo fossem substancialmente inalteradas. As modificações podem ser feitas na estrutura dos polinucleotídeos e polipeptídeos contemplados em modalidades particulares e ainda obter uma molécula funcional que codifica uma variante ou polipeptídeo derivado com características desejáveis. Quando se deseja alterar a sequência de aminoácidos de um polipeptídeo para criar um equivalente, ou mesmo um polipeptídeo variante melhorado, um técnico no assunto, por exemplo, pode alterar um ou mais dos códons da sequência de DNA codificadora, por exemplo, de acordo com a Tabela 1. TABELA 1- CÓDONS DE AMINOÁCIDOS Código Código Aminoácidos de uma de três Códons letra letras Alanina A Ala GCA GCC GCG GCU
Cisteína C Cys UGC UGU Ácido D Asp GAC GAU aspártico Ácido E Glu GAA GAG glutâmico Fenilalanina F Phe UUC UUU Glicina G Gly GGA GGC GGG GGU Histidina H His CAC CAU Isoleucina I Iso AUA AUC AUU Lisina K Lys AAA AAG Leucina L Leu UUA UUG CUA CUC CUG CUU Metionina M Met AUG Asparagina N Asn AAC AAU Prolina P Pro CCA CCC CCG CCU Glutamina Q Gln CAA CAG Arginina R Arg AGA AGG CGA CGC CGG CGU Serina S Ser AGC AGU UCA UCC UCG UCU Treonina T Thr ACA ACC ACG ACU Valina V Val GUA GUC GUG GUU Triptofano W Trp UGG Tirosina Y Tyr UAC UAU
[0199] A orientação na determinação de quais resíduos de aminoácidos podem ser substituídos, inseridos ou deletados sem abolir a atividade biológica pode ser encontrada usando programas de computador bem conhecidos na técnica, tais como software DNASTAR, DNA Strider, Geneious, Mac Vector ou Vector NTI. De preferência, as alterações de aminoácidos nas variantes de proteínas divulgadas neste documento são alterações conservativas de aminoácidos, isto é, substituições de aminoácidos com carga semelhante ou sem carga. Uma mudança conservativa de aminoácidos envolve a substituição de um de uma família de aminoácidos que estão relacionados em suas cadeias laterais. Os aminoácidos de ocorrência natural são geralmente divididos em quatro famílias: ácidos (aspartato, glutamato), básicos (lisina, arginina, histidina), não polares (alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofano) e sem carga aminoácidos polares (glicina, asparagina, glutamina, cisteína, serina, treonina, tirosina). Fenilalanina, triptofano e tirosina são às vezes classificados em conjunto como aminoácidos aromáticos. Em um peptídeo ou proteína, as substituições conservativas adequadas de aminoácidos são conhecidas pelos técnicos no assunto e geralmente podem ser feitas sem alterar a atividade biológica de uma molécula resultante. Os técnicos no assunto reconhecem que, em geral, substituições de aminoácidos individuais em regiões não essenciais de um polipeptídeo não alteram substancialmente a atividade biológica (vide, por exemplo, Watson et al. Molecular Biology of the Gene, 4ª edição, 1987, The Benjamin/Cummings Pub. Co., p.224).
[0200] Conforme descrito acima, as substituições de aminoácidos podem ser baseadas na similaridade relativa dos substituintes da cadeia lateral de aminoácidos, por exemplo, sua hidrofobicidade, hidrofilicidade, carga, tamanho e similares.
[0201] As variantes de polipeptídeos incluem ainda formas glicosiladas, conjugados agregativos com outras moléculas e conjugados covalentes com frações químicas não relacionadas (por exemplo, moléculas peguiladas). As variantes covalentes podem ser preparadas ligando funcionalidades a grupos que se encontram na cadeia de aminoácidos ou no resíduo N- ou C-terminal, conforme é conhecido na técnica. As variantes também incluem variantes alélicas, variantes de espécies e muteínas. Truncagens ou deleções de regiões que não afetam a atividade funcional das proteínas também são variantes.
[0202] Em uma modalidade, onde a expressão de dois ou mais polipeptídeos é desejada, as sequências polinucleotídicas que os codificam podem ser separadas por uma sequência IRES como discutido em outro lugar neste documento. Em outra modalidade, dois ou mais polipeptídeos podem ser expressos como uma proteína de fusão que compreende uma ou mais sequências polipeptídicas autocliváveis.
[0203] Os polipeptídeos contemplados em modalidades particulares incluem polipeptídeos de fusão. Em modalidades preferidas, polipeptídeos de fusão e polinucleotídeos que codificam polipeptídeos de fusão são fornecidos, por exemplo, CARs. Polipeptídeos de fusão e proteínas de fusão referem-se a um polipeptídeo tendo pelo menos dois, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove ou dez ou mais segmentos polipeptídicos. Os polipeptídeos de fusão são normalmente ligados do C-terminal ao N- terminal, embora eles também possam ser ligados do C-terminal ao C-terminal, do N- terminal ao N-terminal ou N-terminal ao C-terminal. Os polipeptídeos da proteína de fusão podem estar em qualquer ordem ou em uma ordem especificada. Os polipeptídeos de fusão ou proteínas de fusão também podem incluir variantes modificadas de forma conservativa, variantes polimórficas, alelos, mutantes, subsequências e homólogos interespécies, desde que a atividade transcricional desejada do polipeptídeo de fusão seja preservada. Os polipeptídeos de fusão podem ser produzidos por métodos de síntese química ou por ligação química entre as duas frações ou podem geralmente ser preparados usando outras técnicas padrão. As sequências de DNA ligadas que compreendem o polipeptídeo de fusão estão operacionalmente ligadas a elementos de controle de transcrição ou tradução adequados, conforme discutido em outro lugar neste documento.
[0204] Em uma modalidade, um parceiro de fusão compreende uma sequência que auxilia na expressão da proteína (um acentuassomo de expressão) com rendimentos mais elevados do que a proteína recombinante nativa. Outros parceiros de fusão podem ser selecionados de modo a aumentar a solubilidade da proteína ou para permitir que a proteína seja direcionada para compartimentos intracelulares desejados ou para facilitar o transporte da proteína de fusão através da membrana celular.
[0205] Os polipeptídeos de fusão podem compreender ainda um sinal de clivagem de polipeptídeo entre cada um dos domínios polipeptídicos descritos neste documento. Além disso, um sítio de clivagem de polipeptídeo pode ser colocado em qualquer sequência peptídica ligante. Sinais de clivagem de polipeptídeo exemplares incluem sítios de reconhecimento de clivagem de polipeptídeo, tais como sítios de clivagem de protease, sítios de clivagem de nuclease (por exemplo, sítios de reconhecimento de enzimas de restrição raros, sítios de reconhecimento de ribozima de autoclivagem) e oligopeptídeos virais de autoclivagem (vide deFelipe e Ryan, 2004. Traffic, 5(8); 616-26).
[0206] Os sítios de clivagem de protease e peptídeos de autoclivação adequados são conhecidos pelo técnico (vide, por exemplo, em Ryan et al., 1997. J. Gener. Virol. 78, 699-722; Scymczak et al. (2004) Nature Biotech. 5, 589-594). sítios de clivagem de protease exemplares incluem, mas não estão limitados a, sítios de clivagem de proteases de potyvirus NIa (por exemplo, protease de vírus de ataque de tabaco), proteases de HC de potyvirus, proteases de potyvirus P1 (P35), proteases de byovirus NIa, proteases codificadas por RNA-2 de byovirus, proteases de aftovirus L, proteases de enterovírus 2A, proteases de rinovírus 2A, proteases de picorna 3C, proteases de comovírus 24K, proteases de nepovírus 24K, protease semelhante a 3C de RTSV (vírus tungro esférico do arroz), protease semelhante a 3C de PYVF (virus da febre amarela), heparina, trombina, fator Xa e enteroquinase. Devido ao seu alto rigor de clivagem, os sítios de clivagem da protease de TEV (vírus da gravação do tabaco) são preferidos em uma modalidade, por exemplo), EXXYXQ(G/S) (SEQ ID NO: 50), for example, ENLYFQG (SEQ ID NO: 51) e ENLYFQS (SEQ ID NO: 52), em que X representa qualquer aminoácido (a clivagem por TEV ocorre entre Q e G ou Q e S).
[0207] Em modalidades particulares, o sinal de clivagem do polipeptídeo é um peptídeo de autoclivagem viral ou sequência de salto ribossomal.
[0208] Os exemplos ilustrativos de sequências de salto ribossomal incluem, mas não estão limitados a: um sítio, sequência ou domínio semelhante a 2A ou 2A (Donnelly et al., 2001. J. Gen. Virol. 82:1027-1041). Em uma modalidade particular, o peptídeo 2A viral é um peptídeo de aftovírus 2A, um peptídeo de potyvírus 2A ou um peptídeo de cardiovírus 2A.
[0209] Em uma modalidade, o peptídeo 2A viral é selecionado a partir do grupo que consiste em: um peptídeo 2A do vírus da febre aftosa (FMDV), um peptídeo 2A do vírus da rinite A equina (ERAV), um peptídeo 2A do vírus Thosea asigna (TaV), um peptídeo 2A porcino do Teschovírus-1 (PTV-1), um peptídeo 2A do Theilovírus e um peptídeo 2A do vírus da encefalomiocardite.
[0210] Exemplos ilustrativos de sítios 2A são fornecidos na Tabela 2. TABELA 2 SEQ ID NO: 53 GSGATNFSLLKQAGDVEENPGP SEQ ID NO: 54 ATNFSLLKQAGDVEENPGP SEQ ID NO: 55 LLKQAGDVEENPGP SEQ ID NO: 56 GSGEGRGSLLTCGDVEENPGP SEQ ID NO: 57 EGRGSLLTCGDVEENPGP SEQ ID NO: 58 LLTCGDVEENPGP SEQ ID NO: 59 GSGQCTNYALLKLAGDVESNPGP SEQ ID NO: 60 QCTNYALLKLAGDVESNPGP SEQ ID NO: 61 LLKLAGDVESNPGP SEQ ID NO: 62 GSGVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP SEQ ID NO: 63 VKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP SEQ ID NO: 64 LLKLAGDVESNPGP SEQ ID NO: 65 LLNFDLLKLAGDVESNPGP SEQ ID NO: 66 TLNFDLLKLAGDVESNPGP SEQ ID NO: 67 LLKLAGDVESNPGP SEQ ID NO: 68 NFDLLKLAGDVESNPGP SEQ ID NO: 69 QLLNFDLLKLAGDVESNPGP SEQ ID NO: 70 APVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP SEQ ID NO: 71 VTELLYRMKRAETYCPRPLLAIHPTEARHKQKIVAPVKQT SEQ ID NO: 72 LNFDLLKLAGDVESNPGP SEQ ID NO: 73 LLAIHPTEARHKQKIVAPVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP SEQ ID NO: 74 EARHKQKIVAPVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP
[0211] Em modalidades preferidas, um polipeptídeo compreende um polipeptídeo anti-CD79A CAR. E. POLINUCLEOTÍDEOS
[0212] Em modalidades preferidas, um polinucleotídeo que codifica um ou mais polipeptídeos CAR é fornecido. Conforme usado neste documento, os termos "polinucleotídeo" ou "ácido nucleico" referem-se a ácido desoxirribonucleico (DNA), ácido ribonucleico (RNA) e híbridos de DNA/RNA. Os polinucleotídeos podem ser de fita simples ou dupla e podem ser recombinantes, sintéticos ou isolados. Os polinucleotídeos incluem, mas não estão limitados a: RNA pré-mensageiro (pré-mRNA), RNA mensageiro (mRNA), RNA, DNA genômico (gDNA), DNA amplificado por PCR, DNA complementar
(cDNA), DNA sintético ou DNA recombinante. Polinucleotídeos referem-se a uma forma polimérica de nucleotídeos de pelo menos 5, pelo menos 10, pelo menos 15, pelo menos 20, pelo menos 25, pelo menos 30, pelo menos 40, pelo menos 50, pelo menos 100, pelo menos 200, pelo menos 300, pelo menos 400, pelo menos 500, pelo menos 1000, pelo menos 5000, pelo menos 10000, ou pelo menos 15000 ou mais nucleotídeos de comprimento, ribonucleotídeos ou desoxirribonucleotídeos ou uma forma modificada de qualquer tipo de nucleotídeo, bem como todos os comprimentos intermediários. Será prontamente entendido que "comprimentos intermediários", neste contexto, significa qualquer comprimento entre os valores citados, tais como 6, 7, 8, 9, etc., 101, 102, 103, etc.; 151, 152, 153, etc.; 201, 202, 203, etc. Em modalidades particulares, polinucleotídeos ou variantes têm pelo menos ou cerca de 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95 %, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência a uma sequência de referência.
[0213] Exemplos ilustrativos de polinucleotídeos incluem, mas não estão limitados a SEQ ID NOs: 31-36 e polinucleotídeos que codificam as SEQ ID NOs: 1-30.
[0214] Conforme usado neste documento, "polinucleotídeo isolado" refere-se a um polinucleotídeo que foi purificado das sequências que o flanqueiam em um estado de ocorrência natural, por exemplo, um fragmento de DNA que foi removido das sequências que são normalmente adjacentes ao fragmento. Em modalidades particulares, um "polinucleotídeo isolado" também refere-se a um DNA complementar (cDNA), um DNA recombinante ou outro polinucleotídeo que não existe na natureza e que foi feito pela mão do homem. Em modalidades particulares, um polinucleotídeo isolado é um polinucleotídeo sintético, um polinucleotídeo semissintético ou um polinucleotídeo obtido ou derivado de uma fonte recombinante.
[0215] Em várias modalidades, um polinucleotídeo compreende um mRNA que codifica um polipeptídeo contemplado neste documento. Em certas modalidades, o mRNA compreende um cap, um ou mais nucleotídeos e uma cauda poli(A).
[0216] Em modalidades particulares, os polinucleotídeos podem ser otimizados por códons. Conforme usado neste documento, o termo "otimizado por códon" refere-se à substituição de códons em um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo a fim de aumentar a expressão, estabilidade e/ou atividade do polipeptídeo. Os fatores que influenciam a otimização de códons incluem, mas não estão limitados a um ou mais dos seguintes: (i) variação de vieses de códons entre dois ou mais organismos ou genes ou tabelas de vieses construídas sinteticamente, (ii) variação no grau de vieses de códons dentro de um organismo, gene ou conjunto de genes, (iii) variação sistemática de códons, incluindo contexto, (iv) variação de códons de acordo com seus tRNAs de decodificação, (v) variação de códons de acordo com GC%, seja global ou em uma posição do tripleto, (vi) variação no grau de semelhança com uma sequência de referência, por exemplo, uma sequência de ocorrência natural, (vii) variação no corte de frequência de códon, (viii) propriedades estruturais de mRNAs transcritos a partir da sequência de DNA, (ix) conhecimento prévio sobre a função das sequências de DNA nas quais o projeto do conjunto de substituição de códons deve ser baseado, (x) variação sistemática de conjuntos de códons para cada aminoácido e/ou (xi) remoção isolada de sítios de iniciação de tradução espúrios.
[0217] Conforme usado neste documento, os termos "variante de polinucleotídeo" e "variante" e similares referem-se a polinucleotídeos que exibem identidade de sequência substancial a uma sequência de polinucleotídeo de referência ou polinucleotídeos que hibridizam a uma sequência de referência sob condições rigorosas que são definidas a seguir. Estes termos incluem polinucleotídeos nos quais um ou mais nucleotídeos foram adicionados ou deletados, ou substituídos por diferentes nucleotídeos em comparação a um polinucleotídeo de referência. A este respeito, é bem compreendido na técnica que certas alterações, inclusive de mutações, adições, deleções e substituições podem ser feitas a um polinucleotídeo de referência em que o polinucleotídeo alterado retém a função biológica ou atividade do polinucleotídeo de referência.
[0218] Variantes de polinucleotídeos incluem fragmentos de polinucleotídeos que codificam fragmentos ou variantes de polipeptídeos biologicamente ativos. Conforme usado neste documento, o termo "fragmento de polinucleotídeo" refere-se a um fragmento de polinucleotídeo pelo menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700 ou mais nucleotídeos de comprimento que codificam uma variante de polipeptídeo que retém pelo menos 100%, pelo menos 90 %, pelo menos 80%, pelo menos 70%, pelo menos 60%, pelo menos 50%, pelo menos 40%, pelo menos 30%, pelo menos 20%, pelo menos 10% ou pelo menos 5% da atividade polipeptídica de ocorrência natural. Fragmentos de polinucleotídeo referem-se a um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo que tem uma deleção no terminal amino, uma deleção no terminal carboxila e/ou uma deleção interna ou substituição de um ou mais aminoácidos de um polipeptídeo de ocorrência natural ou produzido de forma recombinante.
[0219] As recitações "identidade de sequência" ou, por exemplo, compreendendo uma "sequência 50% idêntica a", conforme usado neste documento, referem-se à extensão em que as sequências são idênticas em uma base de nucleotídeo a nucleotídeo ou um aminoácido a aminoácido base sobre uma janela de comparação. Assim, uma "porcentagem de identidade de sequência" pode ser calculada comparando duas sequências alinhadas de forma otimizada ao longo da janela de comparação, determinando o número de posições nas quais o ácido nucleico idêntico base (por exemplo, A, T, C, G, I) ou o resíduo de aminoácido idêntico (por exemplo, Ala, Pro, Ser, Thr, Gly, Val, Leu, Ile, Phe, Tyr, Trp, Lys, Arg, His, Asp, Glu, Asn, Gln, Cys e Met) ocorre em ambas as sequências para produzir o número de posições combinadas, dividindo o número de posições combinadas pelo número total de posições na janela de comparação (ou seja, o tamanho da janela) e multiplicando o resultado por 100 para produzir a porcentagem de identidade de sequência. Estão incluídos os nucleotídeos e polipeptídeos com pelo menos cerca de 50%, 55%, 60%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92 %, 93%, 94%, 95%, 86%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência a qualquer uma das sequências de referência descritas neste documento, normalmente onde a variante do polipeptídeo mantém pelo menos uma atividade biológica do polipeptídeo de referência.
[0220] Os termos usados para descrever as relações de sequência entre dois ou mais polinucleotídeos ou polipeptídeos incluem "sequência de referência", "janela de comparação", "identidade de sequência", "porcentagem de identidade de sequência" e "identidade substancial". Uma "sequência de referência" tem pelo menos 12, mas frequentemente 15 a 18 e muitas vezes pelo menos 25 unidades monoméricas, incluindo nucleotídeos e resíduos de aminoácidos, de comprimento. Como dois polinucleotídeos podem compreender cada um (1) uma sequência (ou seja, apenas uma porção da sequência polinucleotídica completa) que é semelhante entre os dois polinucleotídeos e (2) uma sequência que é divergente entre os dois polinucleotídeos, comparações de sequência entre dois (ou mais) polinucleotídeos são normalmente realizadas comparando sequências dos dois polinucleotídeos ao longo de uma "janela de comparação" para identificar e comparar regiões de locais de similaridade de sequência. Uma "janela de comparação" refere-se a um segmento conceitual de pelo menos 6 posições contíguas, geralmente cerca de 50 a cerca de 100, mais geralmente cerca de 100 a cerca de 150 em que uma sequência é comparada a uma sequência de referência com o mesmo número de posições contíguas após as duas sequências estiverem alinhadas de maneira ideal. A janela de comparação pode compreender adições ou deleções (isto é, lacunas) de cerca de 20% ou menos em comparação com a sequência de referência (que não compreende adições ou deleções) para o alinhamento ótimo das duas sequências. O alinhamento ideal de sequências para alinhar uma janela de comparação pode ser conduzido por implementações computadorizadas de algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA e TFASTA no Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0, Genetics Computer Group, 575 Science Drive Madison, WI, EUA) ou por inspeção e o melhor alinhamento (ou seja, resultando na maior homologia percentual sobre a janela de comparação) gerado por qualquer um dos vários métodos selecionados. Também pode ser feita referência à família de programas BLAST como, por exemplo, divulgado por Altschul et al., 1997, Nucl. Acids Res. 25:3389. Uma discussão detalhada da análise de sequência pode ser encontrada na Unidade 19.3 de Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Inc, 1994-1998, Capítulo 15.
[0221] Os termos que descrevem a orientação de polinucleotídeos incluem: 5' (normalmente a extremidade do polinucleotídeo tendo um grupo fosfato livre) e 3' (normalmente a extremidade do polinucleotídeo tendo um grupo hidroxila livre (OH)). As sequências polinucleotídicas podem ser anotadas na orientação 5' para 3' ou na orientação 3' para 5'. Para DNA e mRNA, a fita 5' a 3' é designada fita "senso", "mais" ou "codificante" porque sua sequência é idêntica à sequência do pré-mensageiro (premRNA) [exceto para uracila (U) no RNA, em vez de timina (T) no DNA]. Para DNA e mRNA, a fita complementar 3' a 5' que é a fita transcrita pela RNA polimerase é designada como fita "molde", "antissenso", "menos" ou "não codificante". Conforme usado neste documento, o termo "orientação reversa" refere-se a uma sequência de 5' para 3' escrita na orientação 3' para 5' ou uma sequência de 3' para 5' escrita na orientação 5' para 3'.
[0222] Os termos "complementar" e "complementaridade" referem-se a polinucleotídeos (ou seja, uma sequência de nucleotídeos) relacionados pelas regras de emparelhamento de bases. Por exemplo, a cadeia complementar da sequência de DNA 5' A G T C A T G 3' é 3' T C A G T A C 5'. A última sequência é frequentemente escrita como o complemento reverso com a extremidade 5' à esquerda e a extremidade 3' à direita, 5' C A T G A C T 3'. Uma sequência que é igual ao seu complemento reverso é chamada de sequência palindrômica. A complementaridade pode ser “parcial”, na qual apenas algumas das bases dos ácidos nucléicos são combinadas de acordo com as regras de emparelhamento de bases. Ou, pode haver complementaridade "completa" ou "total" entre os ácidos nucleicos.
[0223] Além disso, será apreciado por aqueles técnicos no assunto que, como resultado da degenerescência do código genético, existem muitas sequências de nucleotídeos que codificam um polipeptídeo, ou fragmento de variante do mesmo, conforme descrito neste documento. Alguns desses polinucleotídeos possuem homologia mínima com a sequência de nucleotídeos de qualquer gene nativo. No entanto, polinucleotídeos que variam devido a diferenças no uso de códons são especificamente contemplados em modalidades particulares, por exemplo, polinucleotídeos que são otimizados para seleção de códons humanos e/ou primatas. Além disso, alelos dos genes que compreendem as sequências polinucleotídicas fornecidas neste documento também podem ser usados. Alelos são genes endógenos que são alterados como resultado de uma ou mais mutações, tais como deleções, adições e/ou substituições de nucleotídeos.
[0224] O termo "cassete de ácido nucleico" ou "cassete de expressão", conforme usado neste documento, refere-se a sequências genéticas dentro do vetor que podem expressar um RNA e, subsequentemente, um polipeptídeo. Em uma modalidade, o cassete de ácido nucleico contém um gene(s) de interesse, por exemplo, um polinucleotídeo de interesse. Em outra modalidade, o cassete de ácido nucleico contém uma ou mais sequências de controle de expressão, por exemplo, um promotor, acentuassomo, sequência poli(A) e um gene(s) de interesse, por exemplo, um polinucleotídeo(s) de interesse. Os vetores podem compreender 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 ou mais cassetes de ácido nucleico. O cassete de ácido nucleico é posicionalmente e sequencialmente orientado dentro do vetor de tal modo que o ácido nucleico no cassete possa ser transcrito em RNA e, quando necessário, traduzido em uma proteína ou polipeptídeo, sofrendo modificações pós-traducionais adequadas necessárias para a atividade na célula transformada, e ser translocado para o compartimento apropriado para atividade biológica por direcionamento para compartimentos intracelulares apropriados ou secreção em compartimentos extracelulares. De preferência, o cassete tem as suas extremidades 3' e 5' adaptadas para uma inserção rápida em um vector, por exemplo, tem sítios de endonuclease de restrição em cada extremidade. Em uma modalidade preferida, o cassete de ácido nucleico contém a sequência de um receptor de antígeno quimérico usado para aumentar a citotoxicidade de células cancerosas que expressam CD79A. O cassete pode ser removido e inserido em um plasmídeo ou vetor viral como uma unidade única.
[0225] Os polinucleotídeos incluem polinucleotídeo(s) de interesse. Conforme usado neste documento, o termo "polinucleotídeo de interesse" refere-se a um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo, variante de polipeptídeo ou polipeptídeo de fusão. Um vetor pode compreender 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 polinucleotídeos de interesse. Em certas modalidades, o polinucleotídeo de interesse codifica um polipeptídeo que fornece um efeito terapêutico no tratamento ou prevenção de uma doença ou distúrbio. Os polinucleotídeos de interesse e os polipeptídeos codificados a partir deles incluem ambos os polinucleotídeos que codificam polipeptídeos do tipo selvagem, bem como variantes funcionais e fragmentos dos mesmos. Em modalidades particulares, uma variante funcional tem pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 99% de identidade a um polinucleotídeo de referência do tipo selvagem correspondente ou sequência polipeptídica. Em certas modalidades, uma variante ou fragmento funcional tem pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%,
pelo menos 80% ou pelo menos 90% de uma atividade biológica de um polipeptídeo do tipo selvagem correspondente.
[0226] Os polinucleotídeos contemplado neste documento, independentemente do comprimento da própria sequência de codificação, podem ser combinados com outras sequências de DNA, tais como promotores e/ou acentuassomos, regiões não traduzidas (UTRs), sequências de sinal, sequências de Kozak, sinais de poliadenilação, sítios de enzimas de restrição adicionais, sítios de clonagem múltipla, sítios de entrada ribossômica interna (IRES), sítios de reconhecimento de recombinase (por exemplo, sítios LoxP, FRT e Att), códons de terminação, sinais de terminação transcricional e polinucleotídeos que codificam polipeptídeos autocliváveis, marcadores de epítopo, conforme divulgado neste documento ou conforme conhecido na técnica, de tal modo que seu comprimento total pode variar consideravelmente. É, portanto, contemplado que um fragmento de polinucleotídeo de quase qualquer comprimento pode ser empregado em modalidades particulares, com o comprimento total sendo preferencialmente limitado pela facilidade de preparação e uso no protocolo de DNA recombinante pretendido.
[0227] Os polinucleotídeos podem ser preparados, manipulados e/ou expressos usando qualquer uma de uma variedade de técnicas bem estabelecidas conhecidas e disponíveis na técnica. Para expressar um polipeptídeo desejado, uma sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo pode ser inserida no vetor apropriado.
[0228] Exemplos ilustrativos de vetores incluem, mas não estão limitados a, plasmídeo, sequências de replicação autônoma e elementos transponíveis, por exemplo, piggyBac, Sleeping Beauty, Mos1, Tc1/mariner, Tol2, mini-Tol2, Tc3, MuA, Himar I, Frog Prince, e derivados dos mesmos.
[0229] Exemplos ilustrativos adicionais de vetores incluem, sem limitação, plasmídeos, fagemídeos, cosmídeos, cromossomos artificiais, tais como cromossomo artificial de levedura (YAC), cromossomo artificial bacteriano (BAC) ou cromossomo artificial derivado de P1 (PAC), bacteriófagos, tais como fago lambda ou Fago M13 e vírus de animais.
[0230] Exemplos ilustrativos de vírus úteis como vetores incluem, sem limitação, retrovírus (incluindo lentivírus), adenovírus, vírus adeno-associado, herpesvírus (por exemplo, vírus herpes simplex), poxvírus, baculovírus, papilomavírus e papovavírus (por exemplo, SV40).
[0231] Exemplos ilustrativos de vetores de expressão incluem, mas não estão limitados a, vetores pClneo (Promega) para expressão em células de mamífero; pLenti4/V5-DEST™, pLenti6/V5-DEST™ e pLenti6.2/V5-GW/lacZ (Invitrogen) para transferência de genes mediada por lentivírus e expressão em células de mamíferos. Em modalidades particulares, as sequências de codificação de polipeptídeos divulgados neste documento podem ser ligadas a tais vetores de expressão para a expressão dos polipeptídeos em células de mamífero.
[0232] Em modalidades particulares, o vetor é um vetor epissomal ou um vetor que é mantido de forma extracromossal. Tal como usado neste documento, o termo "epissomal" refere-se a um vetor que é capaz de se replicar sem integração no DNA cromossômico do hospedeiro e sem perda gradual de uma célula hospedeira em divisão, significando também que o referido vetor se replica de forma extracromossal ou epissomal.
[0233] Os "elementos de controle" ou "sequências regulatórias" presentes em um vetor de expressão são aquelas regiões não traduzidas do vetor - origem de replicação, cassetes de seleção, promotores, acentuassomos, sinais de iniciação de tradução (sequência de Shine Dalgarno ou sequência de Kozak) íntrons, um sequência de poliadenilação, regiões 5' e 3' não traduzidas - que interagem com as proteínas celulares do hospedeiro para realizar a transcrição e tradução. Esses elementos podem variar em sua força e especificidade. Dependendo do sistema de vetor e hospedeiro usado, qualquer número de elementos de transcrição e tradução adequados, incluindo promotores ubíquos e promotores induzíveis, pode ser usado.
[0234] Em modalidades particulares, os vetores incluem, mas não estão limitados a, vetores de expressão e vetores virais, que incluirão sequências de controle exógenas, endógenas ou heterólogas, tais como promotores e/ou acentuassomos. Uma sequência de controle "endógena" é aquela que está naturalmente ligada a um determinado gene no genoma. Uma sequência de controle "exógena" é aquela que é colocada em justaposição a um gene por meio de manipulação genética (ou seja, técnicas de biologia molecular) de tal modo que a transcrição desse gene seja dirigida pelo acentuassomo/promotor ligado. Uma sequência de controle "heteróloga" é uma sequência exógena que é de uma espécie diferente da célula sendo manipulada geneticamente.
[0235] O termo "promotor", conforme usado neste documento, refere-se a um sítio de reconhecimento de um polinucleotídeo (DNA ou RNA) ao qual uma RNA polimerase se liga. Uma RNA polimerase inicia e transcreve polinucleotídeos operacionalmente ligados ao promotor. Em modalidades particulares, os promotores operativos em células de mamíferos compreendem uma região rica em AT sítioizada aproximadamente 25 a 30 bases a montante do sítio onde a transcrição é iniciada e/ou outra sequência encontrada 70 a 80 bases a montante do início da transcrição, uma região CNCAAT onde N pode ser qualquer nucleotídeo.
[0236] O termo "acentuassomo" refere-se a um segmento de DNA que contém sequências capazes de fornecer transcrição acentuada e, em alguns casos, pode funcionar independentemente de sua orientação em relação a outra sequência de controle. Um acentuassomo pode funcionar cooperativamente ou aditivamente com promotores e/ou outros elementos de acentuassomo. O termo "promotor/acentuassomo" refere-se a um segmento de DNA que contém sequências capazes de fornecer funções de promotor e acentuassomo.
[0237] O termo "operacionalmente ligado" refere-se a uma justaposição em que os componentes descritos estão em uma relação que lhes permite funcionar da maneira pretendida. Em uma modalidade, o termo refere-se a uma ligação funcional entre uma sequência de controle de expressão de ácido nucleico (tal como um promotor e/ou acentuassomo) e uma segunda sequência de polinucleotídeo, por exemplo, um polinucleotídeo de interesse, em que a sequência de controle de expressão direciona transcrição do ácido nucleico correspondente à segunda sequência.
[0238] Conforme usado neste documento, o termo "sequência de controle de expressão constitutiva" refere-se a um promotor, acentuassomo ou promotor/acentuassomo que permite contínua ou continuamente a transcrição de uma sequência operacionalmente ligada. Uma sequência de controle de expressão constitutiva pode ser um promotor, acentuassomo ou promotor/acentuassomo "ubíquo" que permite a expressão em uma ampla variedade de tipos de células e tecidos ou um promotor, acentuassomo ou promotor/acentuassomo "específico da célula", "específico do tipo de célula", "específico da linha de células" ou "específico do tecido" que permite a expressão em uma variedade restrita de tipos de células e tecidos, respectivamente.
[0239] As sequências de controle de expressão ubíquas ilustrativas adequadas para uso em modalidades particulares incluem, mas não estão limitadas a, um promotor inicial imediato de citomegalovírus (CMV), um vírus símio viral 40 (SV40) (por exemplo, precoce ou tardio), um vírus da leucemia murina Moloney (MoMLV) promotor LTR, um vírus do sarcoma de Rous (RSV) LTR, um promotor do vírus herpes simplex (HSV) (timidina quinase), promotores H5, P7.5 e P11 do vírus vaccinia, um promotor do fator de alongamento 1-alfa (EF1a), resposta de crescimento inicial 1 (EGR1), ferritina H (FerH), ferritina L (FerL), gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase (GAPDH), fator de iniciação da tradução eucariótica 4A1 (EIF4A1),
proteína 5 de choque térmico de 70 kDa (HSPA5), proteína de choque térmico de 90 kDa beta, membro 1 (HSP90B1), proteína de choque térmico de 70kDa (HSP70), β- cinesina (β-KIN), o locus ROSA 26 humano (Irions et al., Nature Biotechnology 25, 1477 - 1482 (2007)), um promotor da Ubiquitina C (UBC), um promotor de fosfoglicerato quinase-1 (PGK), um acentuassomo do citomegalovírus/promotor da β- actina de galinha (CAG), um promotor da β-actina e um acentuassomo do vírus de sarcoma mieloproliferativo, região de controle negativo deletada, promotor U3 substituído pelo sítio de ligação do iniciador dl587rev (MND) (Haas et al. Journal of Virology. 2003; 77 (17): 9439-9450).
[0240] Em uma modalidade, um vetor compreende um promotor MNDU3.
[0241] Em uma modalidade, um vetor compreende um promotor EF1a que compreende o primeiro íntron do gene EF1a humano.
[0242] Em uma modalidade, um vetor compreende um promotor EF1a que não possui o primeiro íntron do gene EF1a humano.
[0243] Em uma modalidade particular, pode ser desejável expressar um polinucleotídeo compreendendo um CAR de um promotor específico de células T.
[0244] Conforme usado neste documento, "expressão condicional" pode referir-se a qualquer tipo de expressão condicional, incluindo, mas não se limitando a, expressão induzível; expressão reprimível; expressão em células ou tecidos tendo um estado fisiológico, biológico ou de doença particular, etc. Essa definição não se destina a excluir o tipo de célula ou a expressão específica de tecido. Certas modalidades fornecem expressão condicional de um polinucleotídeo de interesse, por exemplo, a expressão é controlada submetendo uma célula, tecido, organismo, etc., a um tratamento ou condição que faz com que o polinucleotídeo seja expresso ou que causa um aumento ou diminuição na expressão do polinucleotídeo codificado pelo polinucleotídeo de interesse.
[0245] Exemplos ilustrativos de promotores/sistemas indutíveis incluem, mas não estão limitados a, promotores indutíveis por esteroides, tais como promotores para genes que codificam glucocorticóides ou receptores de estrogênio (indutíveis por tratamento com o hormônio correspondente), promotor de metalotionina (indutível por tratamento com vários metais pesados), Promotor MX-1 (indutível por interferon), o sistema regulável de mifepristona "GeneSwitch" (Sirin et al., 2003, Gene, 323:67), a troca de gene induzível por cumate (WO 2002/088346), sistemas regulatórios dependentes de tetraciclina, etc.
[0246] A expressão condicional também pode ser alcançada usando uma recombinase de DNA específica do sítio. De acordo com certas modalidades, o vetor compreende pelo menos um (normalmente dois) sítio para recombinação mediada por uma recombinase específica do sítio. Conforme usado neste documento, os termos "recombinase" ou "recombinase específica do sítio" incluem proteínas excisivas ou integrativas, enzimas, cofatores ou proteínas associadas que estão envolvidas em reações de recombinação envolvendo um ou mais sítios de recombinação (por exemplo, dois, três, quatro cinco, sete, dez, doze, quinze, vinte, trinta, cinquenta, etc.), que podem ser proteínas do tipo selvagem (vide Landy, Current Opinion in Biotechnology 3:699-707 (1993)), ou mutantes, derivados (por exemplo, proteínas de fusão contendo as sequências de proteína de recombinação ou fragmentos das mesmas), fragmentos e variantes dos mesmos. Exemplos ilustrativos de recombinases adequadas para uso em modalidades particulares incluem, mas não estão limitados a: Cre, Int, IHF, Xis, Flp, Fis, Hin, Gin, ΦC31, Cin, Tn3 resolvase, TndX, XerC, XerD, TnpX, Hjc, Gin, SpCCE1 e ParA.
[0247] Os vetores podem compreender um ou mais sítios de recombinação para qualquer uma de uma ampla variedade de recombinases específicas do sítio. Deve ser entendido que o sítio alvo para uma recombinase específica do sítio é além de qualquer sítio(s) necessário para a integração de um vetor, por exemplo, um vetor retroviral ou vetor lentiviral. Conforme usado neste documento, os termos “sequência de recombinação”, “sítio de recombinação” ou “sítio de recombinação específica do sítio” referem-se a uma sequência de ácido nucleico particular à qual uma recombinase reconhece e se liga.
[0248] Por exemplo, um sítio de recombinação para a recombinase Cre é loxP, que é uma sequência de 34 pares de bases compreendendo duas repetições invertidas de 13 pares de bases (servindo como os sítios de ligação da recombinase) flanqueando uma sequência central de 8 pares de bases (vide Figura 1 de Sauer, B., Current Opinion in Biotechnology 5: 521-527 (1994)). Outros sítios loxP exemplares incluem, mas não estão limitados a: lox511 (Hoess et al., 1996; Bethke e Sauer, 1997), lox5171 (Lee e Saito, 1998), lox2272 (Lee e Saito, 1998), m2 (Langer et al., 2002), lox71 (Albert et al., 1995), e lox66 (Albert et al., 1995).
[0249] Os sítios de reconhecimento adequados para a FLP recombinase incluem, mas não estão limitados a: FRT (McLeod, et al., 1996), F1, F2, F3 (Schlake and Bode, 1994), F4, F5 (Schlake and Bode, 1994), FRT(LE) (Senecoff et al., 1988), FRT(RE) (Senecoff et al., 1988).
[0250] Outros exemplos de sequências de reconhecimento são as sequências attB, attP, attL e attR, que são reconhecidas pela enzima recombinase λ Integrase, por exemplo, phi-c31. O SSR φ C31 medeia a recombinação apenas entre os sítios heterotípicos attB (34 bp de comprimento) e attP (39 bp de comprimento) (Groth et al., 2000). attB e attP, nomeados para os sítios de ligação para o fago integrase nos genomas bacteriano e fago, respectivamente, ambos contêm repetições invertidas imperfeitas que são provavelmente ligadas por homodímeros φC31 (Groth et al., 2000). Os sítios do produto, attL e attR, são efetivamente inertes para promover a recombinação mediada por φC31 (Belteki et al., 2003), tornando a reação irreversível. Para catalisar inserções, verificou-se que o DNA portador de attB se insere em um sítio attP genômico mais facilmente do que um sítio attP em um sítio attB genômico (Thyagarajan et al., 2001; Belteki et al., 2003). Assim, as estratégias típicas posicionam por recombinação homóloga um "sítio de encaixe" contendo attP em um locus definido, que é então associado a uma sequência de entrada contendo attB para inserção.
[0251] Conforme usado neste documento, um "sítio de entrada de ribossomo interno" ou "IRES" refere-se a um elemento que promove a entrada direta de ribossomo interno para o códon de iniciação, tal como ATG, de um cistron (uma região de codificação de proteína), conduzindo assim à tradução independente de cap do gene. Vide, por exemplo, Jackson et al., 1990. Trends Biochem Sci 15(12):477-83) e Jackson e Kaminski. 1995. RNA 1(10):985-1000. Em modalidades particulares, os vetores incluem um ou mais polinucleotídeos de interesse que codificam um ou mais polipeptídeos. \Em modalidades particulares, para alcançar a tradução eficiente de cada um da pluralidade de polipeptídeos, as sequências polinucleotídicas podem ser separadas por uma ou mais sequências IRES ou sequências polinucleotídicas que codificam polipeptídeos autocliváveis. Em uma modalidade, o IRES usado nos polinucleotídeos contemplados neste documento é um IRES EMCV.
[0252] Conforme usado neste documento, o termo "sequência de Kozak" refere-se a uma sequência de nucleotídeos curta que facilita muito a ligação inicial do mRNA à pequena subunidade do ribossomo e aumenta a tradução. A sequência de consenso de Kozak é (GCC)RCCATGG (SEQ ID NO: 75), onde R é uma purina (A ou G) (Kozak, 1986. Cell. 44(2):283-92, e Kozak, 1987. Nucleic Acids Res. 15(20):8125- 48). Em modalidades particulares, os vetores compreendem polinucleotídeos que têm uma sequência de consenso de Kozak e que codificam um polipeptídeo desejado, por exemplo, um CAR.
[0253] Os elementos que direcionam a terminação e poliadenilação eficientes dos transcritos de ácido nucleico heterólogos aumentam a expressão do gene heterólogo. Os sinais de terminação da transcrição são geralmente encontrados a jusante do sinal de poliadenilação. Em modalidades particulares, os vetores compreendem uma sequência de poliadenilação 3' de um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo a ser expresso. O termo "locL poliA" ou "sequência poliA", conforme usado neste documento, denota uma sequência de DNA que direciona tanto a terminação quanto a poliadenilação do transcrito de RNA nascente pela RNA polimerase II. As sequências de poliadenilação podem promover a estabilidade do mRNA pela adição de uma cauda poliA à extremidade 3' da sequência de codificação e, assim, contribuir para o aumento da eficiência da tradução. A clivagem e a poliadenilação são dirigidas por uma sequência poli(A) no RNA. A sequência de núcleo poli(A) para pré-mRNAs de mamíferos tem dois elementos de reconhecimento que flanqueiam um sítio de clivagem-poliadenilação. Normalmente, um hexâmero AAUAAA quase invariável fica 20-50 nucleotídeos a montante de um elemento mais variável rico em resíduos U ou GU. A clivagem do transcrito nascente ocorre entre esses dois elementos e é acoplada à adição de até 250 adenosinas ao produto de clivagem 5'. Em modalidades particulares, a sequência de núcleo poli(A) é uma sequência poliA ideal (por exemplo, AATAAA, ATTAAA, AGTAAA). Em modalidades particulares, a sequência poli(A) é uma sequência SV40 poliA, uma sequência poliA do hormônio de crescimento bovino (BGHpA), uma sequência poliA de β-globina de coelho (rβgpA), variantes dos mesmos ou outra sequência poliA heteróloga ou endógena adequada conhecida na técnica.
[0254] Em algumas modalidades, um polinucleotídeo ou célula que abriga o polinucleotídeo usa um gene suicida, incluindo um gene suicida induzível para reduzir o risco de toxicidade direta e/ou proliferação descontrolada. Em aspectos específicos, o gene suicida não é imunogênico para o hospedeiro que hospeda o polinucleotídeo ou célula. Um certo exemplo de um gene suicida que pode ser usado é a caspase-9 ou caspase-8 ou citosina desaminase. A caspase-9 pode ser ativada usando um indutor químico específico de dimerização (CID).
[0255] Em modalidades particulares, um ou mais polinucleotídeos que codificam um CAR anti-CD79A são introduzidos em uma célula (por exemplo, uma célula efetora imunológica) por vetores não virais ou virais.
[0256] O termo "vetor" é usado neste documento para se referir a uma molécula de ácido nucleico capaz de transferir ou transportar outra molécula de ácido nucleico. O ácido nucleico transferido está geralmente ligado, por exemplo, inserido na molécula de ácido nucleico do vetor. Um vetor pode incluir sequências que direcionam a replicação autônoma em uma célula ou pode incluir sequências suficientes para permitir a integração no DNA da célula hospedeira. Em modalidades particulares, vetores não virais são usados para liberar um ou mais polinucleotídeos contemplados neste documento a uma célula T. Em uma modalidade, o vetor é um mRNA sintetizado in vitro ou preparado sinteticamente que codifica um CAR anti-CD79A.
[0257] Exemplos ilustrativos de vetores não virais incluem, mas não estão limitados a, mRNA, plasmídeos (por exemplo, plasmídeos de DNA ou plasmídeos de RNA), transposons, cosmídeos e cromossomos artificiais bacterianos.
[0258] Métodos ilustrativos de distribuição não viral de polinucleotídeos contemplados em modalidades particulares incluem, mas não estão limitados a: eletroporação, sonoporação, lipofecção, microinjeção, biolística, virossomas, lipossomas, imunolipossomas, nanopartículas, policatião ou lipídeo: conjugados de ácido nucleico, DNA nu, virions artificiais, transferência mediada por DEAE-dextrano, arma de gene e choque térmico.
[0259] Exemplos ilustrativos de sistemas de liberação de polinucleotídeos adequados para uso em modalidades particulares contempladas em modalidades particulares incluem, mas não estão limitados a, aqueles fornecidos por Amaxa Biosystems, Maxcyte, Inc., BTX Molecular Delivery Systems e Copernicus Therapeutics Inc. Os reagentes de lipofecção são vendidos comercialmente (por exemplo, Transfectam™ e Lipofectin™). Lípidos catiônicos e neutros que são adequados para lipofecção de polinucleotídeos de reconhecimento de receptor eficiente foram descritos na literatura. Vide, por exemplo, Liu et al. (2003) Gene Therapy. 10:180–187; e Balazs et al. (2011) Journal of Drug Delivery. 2011:1-12. A liberação à base de nanocélulas não vivas, derivadas de bactérias e direcionadas a anticorpos também é contemplada em modalidades particulares.
[0260] Em várias modalidades, o polinucleotídeo é um mRNA que é introduzido em uma célula a fim de expressar transitoriamente um polipeptídeo desejado. Conforme usado neste documento, "transitório" refere-se à expressão de um transgene não integrado por um período de horas, dias ou semanas, em que o período de expressão é menor do que o período de tempo para a expressão do polinucleotídeo se integrado no genoma ou contido dentro de um replicon plasmídeo estável na célula.
[0261] Em modalidades particulares, o mRNA que codifica um polipeptídeo é um mRNA transcrito in vitro. Conforme usado neste documento, "RNA transcrito in vitro" refere-se a RNA, de preferência, mRNA, que foi sintetizado in vitro. Geralmente, o RNA transcrito in vitro é gerado a partir de um vetor de transcrição in vitro. O vetor de transcrição in vitro compreende um molde que é usado para gerar o RNA transcrito in vitro.
[0262] Em modalidades particulares, os mRNAs podem compreender ainda um cap 5' ou cap 5' modificado e/ou uma sequência poli(A). Conforme usado neste documento, um cap 5' (também denominado um cap de RNA, um cap de 7- metilguanosina de RNA ou um cap de m7G de RNA) é um nucleotídeo de guanina modificado que foi adicionado à "frente" ou extremidade 5' de um RNA mensageiro eucariótico logo após o início da transcrição. O cap 5' compreende um grupo terminal que está ligado ao primeiro nucleotídeo transcrito e reconhecido pelo ribossomo e protegido de RNases. A porção de capeamento pode ser modificada para modular a funcionalidade do mRNA, como sua estabilidade ou eficiência de tradução. Em uma modalidade particular, o mRNA compreende uma sequência poli(A) entre cerca de 50 e cerca de 5000 adeninas. Em uma modalidade, o mRNA compreende uma sequência poli(A) entre cerca de 100 e cerca de 1000 bases, entre cerca de 200 e cerca de 500 bases, ou entre cerca de 300 e cerca de 400 bases. Em uma modalidade, o mRNA compreende uma sequência poli(A) de cerca de 65 bases, cerca de 100 bases, cerca de 200 bases, cerca de 300 bases, cerca de 400 bases, cerca de 500 bases, cerca de 600 bases, cerca de 700 bases, cerca de 800 bases, cerca de 900 bases, ou cerca de 1000 ou mais bases. As sequências poli(A) podem ser modificadas quimicamente ou enzimaticamente para modular a funcionalidade do mRNA, tal como localização, estabilidade ou eficiência da tradução.
[0263] Os vetores virais que compreendem polinucleotídeos contemplados em modalidades particulares podem ser liberados in vivo por administração a um paciente individual, normalmente por administração sistêmica (por exemplo, intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, subdérmica ou infusão intracraniana) ou aplicação tópica, conforme descrito abaixo. Alternativamente, os vetores podem ser liberados às células ex vivo, tais como células explantadas de um paciente individual (por exemplo, sangue periférico mobilizado, linfócitos, aspirados da medula óssea, biópsia de tecido, etc.) ou células-tronco hematopoiéticas de doadores universais, seguido por reimplante das células em um paciente.
[0264] Em uma modalidade, um vetor viral compreendendo um polinucleotídeo que codifica um CAR anti-CD79A é administrado diretamente a um organismo para transdução de células in vivo. Alternativamente, DNA nu pode ser administrado. A administração é por qualquer uma das vias normalmente usadas para introduzir uma molécula em contato final com células de sangue ou tecido, incluindo, mas não se limitando a, injeção, infusão, aplicação tópica e eletroporação. Métodos adequados de administração de tais ácidos nucleicos estão disponíveis e são bem conhecidos pelos técnicos no assunto e, embora mais de uma via possa ser usada para administrar uma composição particular, uma via particular pode muitas vezes fornecer uma reação mais imediata e eficaz do que outra rota.
[0265] Exemplos ilustrativos de sistemas de vetores virais adequados para uso em modalidades particulares contempladas neste documento incluem, mas não estão limitados a vírus adeno-associados (AAV), retrovírus, vírus herpes simplex, adenovírus e vetores do vírus vaccinia.
[0266] Em várias modalidades, um ou mais polinucleotídeos que codificam um CAR anti-CD79A são introduzidos em uma célula efetora imunológica, por exemplo, uma célula T, por meio da transdução da célula com um vírus adeno-associado recombinante (rAAV), compreendendo um ou mais polinucleotídeos.
[0267] AAV é um vírus pequeno (~ 26 nm) com defeito de replicação, principalmente epissomal, sem envelope. O AAV pode infectar células em divisão e não em divisão e pode incorporar seu genoma ao da célula hospedeira. Os AAV recombinantes (rAAV) são normalmente compostos de, no mínimo, um transgene e suas sequências regulatórias e repetições terminais invertidas (RTIs) de AAV 5' e 3'. As sequências de RTI têm cerca de 145 bp de comprimento. Em modalidades particulares, o rAAV compreende sequências de RTIs e de capsídeo isoladas de AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9 ou AAV10.
[0268] Em algumas modalidades, um rAAV quimérico é usado, as sequências de RTI são isoladas de um serótipo de AAV e as sequências de capsídeo são isoladas de um serótipo de AAV diferente. Por exemplo, um rAAV com sequências de RTI derivadas de AAV2 e sequências de capsídeo derivadas de AAV6 é referido como AAV2/AAV6. Em modalidades particulares, o vetor rAAV pode compreender RTIs de AAV2 e proteínas de capsídeo de qualquer um de AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9 ou AAV10. Em uma modalidade preferida, o rAAV compreende sequências de RTI derivadas de AAV2 e sequências de capsídeo derivadas de AAV6. Em uma modalidade preferida, o rAAV compreende sequências de RTI derivadas de AAV2 e sequências de capsídeo derivadas de AAV2.
[0269] Em algumas modalidades, métodos de engenharia e seleção podem ser aplicados aos capsídeos de AAV para torná-los mais propensos a transduzir células de interesse.
[0270] A construção de vetores de rAAV, produção e purificação dos mesmos foram divulgadas, por exemplo, nas Patentes dos EUA de n 9.169.494; 9.169.492;
9.012.224; 8.889.641; 8.809.058; e 8.784.799, cada uma dos quais é incorporada por referência neste documento, em sua totalidade.
[0271] Em várias modalidades, um ou mais polinucleotídeos que codificam um CAR anti-CD79A são introduzidos em uma célula efetora imunológica, transduzindo a célula com um retrovírus, por exemplo, lentivírus, compreendendo um ou mais polinucleotídeos.
[0272] Tal como usado neste documento, o termo "retrovírus" refere-se a um vírus de RNA que transcreve reversamente seu RNA genômico em uma cópia de DNA de fita dupla linear e, subsequentemente, integra covalentemente seu DNA genômico em um genoma hospedeiro. Retrovírus ilustrativos adequados para uso em modalidades particulares incluem, mas não estão limitados a: vírus da leucemia murina Moloney (M-MuLV), vírus do sarcoma murino Moloney (MoMSV), vírus do sarcoma murino Harvey (HaMuSV), vírus do tumor mamário murino (MuMTV), vírus da leucemia do macaco gibão (GaLV), vírus da leucemia felina (FLV), spumavírus, vírus da leucemia murina Friend, vírus da célula-tronco murina (MSCV) e vírus do sarcoma de Rous (RSV)) e lentivírus.
[0273] Conforme usado neste documento, o termo "lentivírus" refere-se a um grupo (ou gênero) de retrovírus complexos. Lentivírus ilustrativos incluem, mas não estão limitados a: HIV (vírus da imunodeficiência humana; incluindo HIV tipo 1 e HIV 2); vírus visna-maedi (VMV); o vírus da artrite-encefalite caprina (CAEV); vírus da anemia infecciosa equina (EIAV); vírus da imunodeficiência felina (FIV); vírus da imunodeficiência bovina (BIV); e vírus da imunodeficiência símia (SIV). Em uma modalidade, estruturas de vetor baseadas em HIV (isto é, elementos de sequência de ação cis de HIV) são preferidas.
[0274] Em várias modalidades, um vetor lentiviral contemplado neste documento compreende uma ou mais LTRs, e um ou mais, ou todos, dos seguintes elementos acessórios: um cPPT/FLAP, um sinal de empacotamento Psi (Ψ), um elemento de exportação, sequências poli(A) e podem compreender opcionalmente um WPRE ou HPRE, um elemento isolante, um marcador selecionável e um gene de suicídio celular, conforme discutido em outro lugar neste documento.
[0275] Em modalidades particulares, os vetores lentivirais contemplados neste documento podem ser lentivírus integrativos ou não integrados ou defeituosos de integração. Conforme usado neste documento, o termo "lentivírus de integração defeituosa" ou "IDLV" refere-se a um lentivírus com uma integrase que não tem a capacidade de integrar o genoma viral no genoma das células hospedeiras. Os vetores virais incompetentes para integração foram descritos no pedido de patente WO 2006/010834, que é incorporado neste documento por referência em sua totalidade.
[0276] Mutações ilustrativas no gene pol HIV-1 adequadas para reduzir a atividade da integrase incluem, mas não estão limitadas a: H12N, H12C, H16C, H16V, S81 R, D41A, K42A, H51A, Q53C, D55V, D64E, D64V, E69A, K71A, E85A, E87A, D116N, D1161, D116A, N120G, N1201, N120E, E152G, E152A, D35E, K156E, K156A, E157A, K159E, K159A, K160A, R166A, D167A, E170A, H171A, K173A, K186Q, K186T, K188T, E198A, R199c, R199T, R199A, D202A, K211A, Q214L, Q216L, Q221 L, W235F, W235E, K236S, K236A, K246A, G247W, D253A, R262A, R263A e K264H.
[0277] Em uma modalidade, o gene pol deficiente de integrase de HIV-1 compreende uma mutação D64V, D116I, D116A, E152G ou E152A; mutações D64V, D116I e E152G; ou mutações D64V, D116A e E152A.
[0278] Em uma modalidade, o gene pol deficiente de integrase de HIV-1 compreende uma mutação D64V.
[0279] O termo "repetição terminal longa (LTR)" refere-se a domínios de pares de bases localizados nas extremidades de DNAs retrovirais que, em seu contexto de sequência natural, são repetições diretas e contêm regiões U3, R e U5.
[0280] Tal como usado neste documento, o termo "elemento FLAP" ou "cPPT/FLAP" refere-se a um ácido nucleico cuja sequência inclui o trato central de polipurina e sequências de terminação central (cPPT e CTS) de um retrovírus, por exemplo, HIV-1 ou HIV-2. Elementos FLAP adequados são descritos na Patente dos EUA de nº 6.682.907 e em Zennou, et al., 2000, Cell, 101:173. Em outra modalidade, um vetor lentiviral contém um elemento FLAP com uma ou mais mutações nos elementos cPPT e/ou CTS. Em ainda outra modalidade, um vetor lentiviral compreende um elemento cPPT ou CTS. Em ainda outra modalidade, um vetor lentiviral não compreende um elemento cPPT ou CTS.
[0281] Tal como usado neste documento, o termo "sinal de empacotamento" ou "sequência de empacotamento" refere-se a sequências psi [Ψ] localizadas dentro do genoma retroviral que são necessárias para a inserção do RNA viral no capsídeo ou partícula viral, vide, por exemplo, Clever et al., 1995. J. of Virology, Vol. 69, No. 4; pp. 2101–2109.
[0282] O termo "elemento de exportação" refere-se a um elemento regulador pós-transcricional de ação cis que regula o transporte de um transcrito de RNA do núcleo para o citoplasma de uma célula. Exemplos de elementos de exportação de RNA incluem, mas não estão limitados a, o elemento de resposta rev do vírus da imunodeficiência humana (HIV) (RRE) (vide, por exemplo, Cullen et al., 1991. J. Virol. 65: 1053; e Cullen et al., 1991. Cell 58: 423), e o elemento regulador pós-transcricional do vírus da hepatite B (HPRE).
[0283] Em modalidades particulares, a expressão de sequências heterólogas em vetores virais é aumentada pela incorporação de elementos reguladores pós- transcricionais, sítios de poliadenilação eficientes e, opcionalmente, sinais de terminação da transcrição nos vetores. Uma variedade de elementos reguladores pós-transcricionais pode aumentar a expressão de um ácido nucleico heterólogo na proteína, por exemplo, elemento regulador pós-transcricional do vírus da hepatite da marmota (WPRE; Zufferey et al., 1999, J. Virol., 73: 2886); o elemento regulador pós-transcricional presente no vírus da hepatite B (HPRE) (Huang et al., Mol. Célula. Biol., 5: 3864); e similares (Liu et al., 1995, Genes Dev., 9:1766).
[0284] Os vetores lentivirais contêm, de preferência, vários aprimoramentos de segurança como resultado da modificação das LTRs. Os vetores de "autoinativação" (SIN) referem-se a vetores com defeito de replicação, por exemplo, em que a região de promotor-acentuassomo da LTR direita (3'), conhecida como a região U3, foi modificada (por exemplo, por deleção ou substituição) para prevenir a transcrição viral além da primeira rodada de replicação viral. Um aumento de segurança adicional é fornecido pela substituição da região U3 da LTR 5' por um promotor heterólogo para conduzir a transcrição do genoma viral durante a produção de partículas virais. Exemplos de promotores heterólogos que podem ser usados incluem, por exemplo, vírus símio viral 40 (SV40) (por exemplo, precoce ou tardio), citomegalovírus (CMV) (por exemplo, início imediato), vírus da leucemia murina Moloney (MoMLV), vírus do sarcoma de Rous (RSV) e promotores do vírus herpes simplex (HSV) (timidina quinase).
[0285] Os termos "pseudótipo" ou "pseudotipagem", conforme usados neste documento, referem-se a um vírus que tem proteínas do envelope viral que foram substituídas por aquelas de outro vírus que possui características preferíveis. Por exemplo, o HIV pode ser pseudotipado com proteínas do envelope da proteína G do vírus da estomatite vesicular (VSV-G), o que permite que o HIV infecte uma faixa mais ampla de células porque as proteínas do envelope do HIV (codificadas pelo gene env) normalmente direcionam o vírus para células CD4+ de apresentação.
[0286] Em certas modalidades, os vetores lentivirais são produzidos de acordo com métodos conhecidos. Vide por exemplo, Kutner et al., BMC Biotechnol. 2009;9:10.
doi: 10.1186/1472-6750-9-10; Kutner et al. Nat. Protoc. 2009;4(4):495–505. doi:
10.1038/nprot.2009.22.
[0287] De acordo com certas modalidades específicas contempladas neste documento, a maioria ou todas as sequências do esqueleto do vetor viral são derivadas de um lentivírus, por exemplo, HIV-1. No entanto, deve ser entendido que muitas fontes diferentes de sequências retrovirais e/ou lentivirais podem ser usadas, ou combinadas e numerosas substituições e alterações em algumas das sequências lentivirais podem ser acomodadas sem prejudicar a capacidade de um vetor de transferência para realizar as funções descritas neste documento. Além disso, uma variedade de vetores lentivirais são conhecidos na técnica, vide Naldini et al., (1996a, 1996b e 1998); Zufferey et al., (1997); Dull et al., 1998, Patente dos EUA de nºs 6.013.516; e 5.994.136, muitos dos quais podem ser adaptados para produzir um vetor viral ou plasmídeo de transferência contemplado neste documento.
[0288] Em várias modalidades, um ou mais polinucleotídeos que codificam um CAR anti-CD79A são introduzidos em uma célula efetora imunológica através da transdução da célula com um adenovírus compreendendo um ou mais polinucleotídeos.
[0289] Os vetores de base adenoviral são capazes de uma eficiência de transdução muito alta em muitos tipos de células e não requerem divisão celular. Com tais vetores, títulos elevados e níveis elevados de expressão foram obtidos. Esse vetor pode ser produzido em grandes quantidades em um sistema relativamente simples. A maioria dos vetores de adenovírus são projetados de tal modo que um transgene substitua os genes Ad E1a, E1b e/ou E3; subsequentemente, o vetor de replicação defeituosa é propagado em células 293 humanas que fornecem função de gene deletada em trans. Os vetores de anúncios podem transduzir vários tipos de tecidos in vivo, incluindo células diferenciadas que não se dividem, tais como as encontradas no fígado, rim e músculo. Os vetores convencionais de anúncios têm uma grande capacidade de carga.
[0290] A geração e propagação dos vetores de adenovírus atuais, que são deficientes em replicação, podem usar uma linha de células auxiliares única, designada 293, que foi transformada a partir de células renais embrionárias humanas por fragmentos de DNA Ad5 e expressa constitutivamente proteínas E1 (Graham et al., 1977). Uma vez que a região E3 é dispensável do genoma do adenovírus (Jones & Shenk, 1978), os vetores atuais do adenovírus, com a ajuda de células 293, carregam DNA estranho em qualquer das regiões E1, D3 ou ambas (Graham & Prevec, 1991). Os vetores de adenovírus foram usados na expressão de genes eucarióticos (Levrero et al., 1991; Gomez-Foix et al., 1992) e no desenvolvimento de vacinas (Grunhaus & Horwitz, 1992; Graham & Prevec, 1992). Estudos na administração de adenovírus recombinante a diferentes tecidos incluem instilação de traqueia (Rosenfeld et al., 1991; Rosenfeld et al., 1992), injeção muscular (Ragot et al., 1993), injeções intravenosas periféricas (Herz & Gerard, 1993) e inoculação estereotáxica no cérebro (Le Gal La Salle et al., 1993). Um exemplo do uso de um vetor Ad em um ensaio clínico envolveu terapia polinucleotídica para imunização antitumoral com injeção intramuscular (Sterman et al., Hum. Gene Ther. 7:1083-9 (1998)).
[0291] Em várias modalidades, um ou mais polinucleotídeos que codificam um CAR anti-CD79A são introduzidos em uma célula efetora imunológica através da transdução da célula com um vírus herpes simplex, por exemplo, HSV-1, HSV-2, compreendendo um ou mais polinucleotídeos.
[0292] O vírion HSV maduro consiste em um capsídeo icosaédrico envelopado com um genoma viral que consiste em uma molécula de DNA de fita dupla linear que tem 152 kb. Em uma modalidade, o vetor viral baseado em HSV é deficiente em um ou mais genes HSV essenciais ou não essenciais. Em uma modalidade, o vetor viral baseado em HSV é deficiente em replicação. A maioria dos vetores de HSV com deficiência em replicação contém uma deleção para remover um ou mais genes de HSV intermediários iniciais, precoces ou tardios para prevenir a replicação. Por exemplo, o vetor de HSV pode ser deficiente em um gene precoce imediato selecionado a partir do grupo que consiste em: ICP4, ICP22, ICP27, ICP47 e uma combinação dos mesmos. As vantagens do vetor de HSV são sua capacidade de entrar em um estágio latente que pode resultar na expressão de DNA a longo prazo e seu grande genoma de DNA viral que pode acomodar inserções de DNA exógeno de até 25 kb. Os vetores baseados em HSV são descritos, por exemplo, na patente dos EUA de nºs 5.837.532, 5.846.782 e 5.804.413, e nos Pedidos de Patente Internacional WO 91/02788, WO 96/04394, WO 98/15637 e WO 99/06583, cada um dos quais são incorporados neste documento por referência em sua totalidade. F. CÉLULAS GENETICAMENTE MODIFICADAS
[0293] Em várias modalidades, são fornecidas células geneticamente modificadas para expressar os CARs contemplados neste documento, para uso no tratamento do câncer. Conforme usado neste documento, o termo "geneticamente projetado(a)" ou "geneticamente modificado" refere-se à adição de material genético extra na forma de DNA ou RNA no material genético total em uma célula. Os termos “células geneticamente modificadas”, “células modificadas” e “células redirecionadas” são usados de forma intercambiável. Tal como usado neste documento, o termo "terapia genética" refere-se à introdução de material genético extra na forma de DNA ou RNA no material genético total em uma célula que restaura, corrige ou modifica a expressão de um gene, ou para o propósito de expressar um polipeptídeo terapêutico, por exemplo, um CAR.
[0294] Em modalidades particulares, os CARs anti-CD79A contemplados neste documento são introduzidos e expressos em células efetoras imunológicas de modo a redirecionar sua especificidade para um antígeno alvo de interesse, por exemplo, um polipeptídeo CD79A. Uma "célula efetora imunológica" é qualquer célula do sistema imunológico que tem uma ou mais funções efetoras (por exemplo, atividade de morte celular citotóxica, secreção de citocinas, indução de ADCC e/ou CDC). As células efetoras imunológicas ilustrativas contempladas neste documento são linfócitos T, incluindo, mas não se limitando a células T citotóxicas (CTLs; células T CD8+), TILs e células T auxiliares (HTLs; células T CD4+). Em uma modalidade particular, as células compreendem células T αβ. Em uma modalidade particular, as células compreendem células T γδ. Em uma modalidade, as células efetoras imunológicas incluem células natural killer (NK). Em uma modalidade, as células efetoras imunológicas incluem células T natural killer (NKT).
[0295] As células efetoras imunológicas podem ser autólogas/autogênicas ("próprias") ou não autólogas ("não próprias", por exemplo, alogênicas, singênicas ou xenogênicas). "Autólogo", conforme usado neste documento, refere-se a células do mesmo paciente. "Alogênico", conforme usado neste documento, refere-se a células da mesma espécie que diferem geneticamente da célula em comparação. “Singeneico”, conforme usado neste documento, refere-se a células de um paciente diferente que são geneticamente idênticas à célula em comparação. "Xenogênico", conforme usado neste documento, refere-se a células de uma espécie diferente para a célula em comparação. Em modalidades preferidas, as células são alogênicas.
[0296] Células efetoras imunológicas ilustrativas usadas com os CARs anti- CD79A contemplados em modalidades particulares incluem linfócitos T. Os termos "célula T" ou "linfócito T" são reconhecidos na técnica e se destinam a incluir timócitos, linfócitos T imaturos, linfócitos T maduros, linfócitos T em repouso ou linfócitos T ativados. A célula AT pode ser uma célula T auxiliar (Th), por exemplo, uma célula T auxiliar 1 (Th1) ou uma célula T auxiliar 2 (Th2). A célula T pode ser uma célula T auxiliar (HTL; célula T CD4+), célula T CD4+, uma célula T citotóxica (CTL; célula T CD8+), célula T CD4+CD8+, célula T CD4-CD8- ou qualquer outro subconjunto de células T. Outras populações ilustrativas de células T adequadas para uso em modalidades particulares incluem células T virgens (TN), células-tronco T de memória (TSCM), células T de memória central (TCM), células T de memória efetoras (TEM) e células T efetoras (TEFF).
[0297] Como seria entendido pelo técnico no assunto, outras células também podem ser usadas como células efetoras imunológicas com os CARs anti-CD79A conforme contemplados neste documento. Em particular, as células efetoras imunológicas também incluem células NK, células NKT, neutrófilos e macrófagos. As células efetoras imunológicas também incluem progenitores de células efetoras, em que tais células progenitoras podem ser induzidas a se diferenciar em células efetoras imunológicas in vivo ou in vitro. Assim, em modalidades particulares, a célula efetora imunológica inclui progenitores de células efetoras imunológicas, tais como células-tronco hematopoiéticas (HSCs) contidas na população CD34+ de células derivadas do sangue do cordão umbilical, medula óssea ou sangue periférico mobilizado que, após administração em um paciente, se diferenciam em células efetoras imunológicas maduras, ou que podem ser induzidas in vitro para se diferenciar em células efetoras imunológicas maduras.
[0298] Conforme usado neste documento, as células efetoras imunológicas geneticamente modificadas para conter um CAR específico para CD79A podem ser referidas como "células efetoras imunológicas redirecionadas específicas para CD79A".
[0299] O termo "célula CD34+ ", conforme usado neste documento, refere-se a uma célula que expressa a proteína CD34 em sua superfície celular. "CD34", conforme usado neste documento, refere-se a uma glicoproteína de superfície celular (por exemplo, proteína sialomucina) que frequentemente atua como um fator de adesão célula-célula e está envolvida na entrada de células T nos nódulos linfáticos. A população de células CD34+ contém células-tronco hematopoiéticas (HSC), que após administração a um paciente se diferenciam e contribuem para todas as linhagens hematopoiéticas, incluindo células T, células NK, células NKT, neutrófilos e células da linhagem de monócitos/macrófagos.
[0300] Métodos para fazer as células efetoras imunológicas que expressam um CAR anti-CD79A contemplado neste documento são fornecidos em modalidades particulares. Em uma modalidade, o método compreende a transfecção ou transdução de células efetoras imunológicas isoladas de um indivíduo de tal modo que as células efetoras imunológicas expressem um ou mais CARs anti-CD79A contemplados neste documento. Em certas modalidades, as células efetoras imunológicas são isoladas de um indivíduo e geneticamente modificadas sem manipulação adicional in vitro. Essas células podem então ser administradas de novo diretamente no indivíduo. Em outras modalidades, as células efetoras imunológicas são primeiro ativadas e estimuladas a proliferar in vitro antes de serem geneticamente modificadas para expressar um CAR anti-CD79A. A este respeito, as células efetoras imunológicas podem ser cultivadas antes e/ou depois de serem geneticamente modificadas (isto é, transduzidas ou transfectadas para expressar um CAR anti-CD79A contemplado neste documento).
[0301] Em modalidades particulares, antes da manipulação in vitro ou modificação genética das células efetoras imunológicas descritas neste documento, a fonte de células é obtida de um paciente. Em modalidades particulares, células efetoras imunológicas modificadas por CAR compreendem células T.
[0302] Em modalidades particulares, PBMCs podem ser diretamente modificadas geneticamente para expressar CARs anti-CD79A usando métodos contemplados neste documento. Em certas modalidades, após o isolamento da PBMCs, os linfócitos T são ainda isolados e, em certas modalidades, tanto os linfócitos T citotóxicos quanto os auxiliares podem ser classificados em subpopulações de células T virgens, de memória e efetoras antes ou após a modificação e/ou expansão genética.
[0303] As células efetoras imunológicas, tais como células T, podem ser geneticamente modificadas após o isolamento usando métodos conhecidos, ou as células efetoras imunológicas podem ser ativadas e expandidas (ou diferenciadas no caso de progenitores) in vitro antes de serem geneticamente modificadas. Em uma modalidade particular, as células efetoras imunológicas, tais como células T, são geneticamente modificadas com os receptores de antígenos quiméricos contemplados neste documento (por exemplo, transduzidas com um vetor viral compreendendo um ácido nucleico que codifica um CAR anti-CD79A) e, em seguida, são ativadas e expandidas in vitro. Em várias modalidades, as células T podem ser ativadas e expandidas antes ou depois da modificação genética para expressar um CAR, usando métodos conforme descritos, por exemplo, nas Patentes dos EUA de nºs 6.352.694;
6.534.055; 6.905.680; 6.692.964; 5.858.358; 6.887.466; 6.905.681; 7.144.575;
7.067.318; 7, 172.869; 7.232.566; 7, 175.843; 5.883.223; 6.905.874; 6.797.514;
6.867.041; e Publicação do Pedido de Patente dos EUA de nº 20060121005.
[0304] Em uma modalidade, as células CD34+ são transduzidas com um construto de ácido nucleico contemplado neste documento. Em certas modalidades, as células CD34+ transduzidas diferenciam-se em células efetoras imunológicas maduras in vivo após a administração em um paciente, geralmente o paciente de quem as células foram originalmente isoladas. Em outra modalidade, as células CD34+ podem ser estimuladas in vitro antes da exposição ou após serem geneticamente modificadas com um CAR conforme descrito neste documento, com uma ou mais das seguintes citocinas: ligante Flt-3 (FLT3), fator de células-tronco (SCF), fator de crescimento e diferenciação de megacariócitos (TPO), IL-3 e IL-6 de acordo com os métodos descritos anteriormente (Asheuer et al., 2004; Imren, et al., 2004).
[0305] Em modalidades particulares, uma população de células efetoras imunológicas modificadas para o tratamento de câncer compreende um CAR conforme contemplado neste documento. Por exemplo, uma população de células efetoras imunológicas modificadas é preparada a partir de células mononucleares do sangue periférico (CMSP) obtidas de um paciente com diagnóstico de malignidade de células B descrito neste documento (doadores autólogos). As PBMCs formam uma população heterogênea de linfócitos T que podem ser CD4+, CD8+, ou CD4+ e CD8+.
[0306] As PBMCs também podem incluir outros linfócitos citotóxicos, tais como células NK ou células NKT. Um vetor de expressão que carrega a sequência de codificação de um CAR contemplado em modalidades particulares é introduzido em uma população de células T de doadores humanos, células NK ou células NKT. Em modalidades particulares, as células T transduzidas com sucesso que transportam o vetor de expressão podem ser classificadas usando citometria de fluxo para isolar células T CD3 positivas e, em seguida, propagadas para aumentar o número dessas células T expressando a proteína CAR, além da ativação celular usando anticorpos anti-CD3 e ou anticorpos anti-CD28 e IL-2 ou quaisquer outros métodos conhecidos na técnica como descrito em outro lugar neste documento. Os procedimentos padrão são usados para a criopreservação de células T que expressam as células T da proteína CAR para armazenamento e/ou preparação para uso em um paciente humano. Em uma modalidade, a transdução, cultura e/ou expansão in vitro de células T são realizadas na ausência de produtos derivados de animais não humanos, tais como soro fetal de vitela e soro fetal bovino. Uma vez que uma população heterogênea de PBMCs é geneticamente modificada, as células transduzidas resultantes são uma população heterogênea de células modificadas compreendendo um CAR anti-CD79A como contemplado neste documento.
[0307] Em uma outra modalidade, uma mistura de, por exemplo, um, dois, três, quatro, cinco ou mais, vetores de expressão diferentes pode ser usada na modificação genética de uma população de doadores de células efetoras imunológicas, em que cada vetor codifica uma proteína receptora de antígeno quimérico diferente conforme contemplado neste documento. As células efetoras imunológicas modificadas resultantes formam uma população mista de células modificadas, com uma proporção das células modificadas expressando mais de uma proteína CAR diferente. G. MÉTODOS DE FABRICAÇÃO DE CÉLULAS T
[0308] Em várias modalidades, as células T geneticamente modificadas são expandidas pelo contato com um agente que estimula um sinal associado ao complexo TCR CD3 e um ligante que estimula uma molécula coestimuladora na superfície das células T.
[0309] Em modalidades particulares, PBMCs ou células T isoladas são postas em contato com um agente estimulador e agente coestimulador, tal como anticorpos anti- CD3 e anti-CD28 solúveis, ou anticorpos ligados a uma esfera ou outra superfície, em um meio de cultura com citocinas apropriadas, tais como como IL-2, IL-7 e/ou IL-15.
[0310] Em modalidades particulares, PBMCs ou células T isoladas são postas em contato com um agente estimulador e agente coestimulador, tal como anticorpos anti- CD3 e anti-CD28 solúveis, ou anticorpos ligados a uma esfera ou outra superfície, em um meio de cultura com citocinas apropriadas, tais como como IL-2, IL-7 e/ou IL-15 e/ou um ou mais agentes que modulam uma via de sinalização de células PI3K/Akt/mTOR.
[0311] Em modalidades preferidas, as células T fabricadas pelos métodos contemplados neste documento fornecem composições de imunoterapia adotiva melhoradas. Sem desejar estar vinculado a qualquer teoria particular, acredita-se que as composições de células T fabricadas pelos métodos em modalidades particulares contempladas neste documento estão imbuídas com propriedades superiores, incluindo sobrevivência aumentada, expansão na ausência relativa de diferenciação e persistência in vivo. Em uma modalidade, um método para fabricar células T compreende o contato das células com um ou mais agentes que modulam uma via de sinalização de células PI3K. Em uma modalidade, um método para fabricar células T compreende o contato das células com um ou mais agentes que modulam uma via de sinalização de células PI3K/Akt/mTOR. Em várias modalidades, as células T podem ser obtidas de qualquer fonte e contatadas com o agente durante as fases de ativação e/ou expansão do processo de fabricação. As composições de células T resultantes são enriquecidas em células T potentes para o desenvolvimento que têm a capacidade de proliferar e expressar um ou mais dos seguintes biomarcadores: CD62L, CCR7, CD28, CD27, CD122, CD127, CD197, CD38 e CD8. Em uma modalidade, as populações de células que compreendem células T, que foram tratadas com um ou mais inibidores de PI3K, são enriquecidas para uma população de células T CD8+ que coexpressam um ou mais ou, ou todos, os seguintes biomarcadores: CD62L, CD127, CD197 e CD38.
[0312] Em uma modalidade, as populações de células que compreendem células T, que foram tratadas com um ou mais inibidores de PI3K, são enriquecidas para uma população de células T CD8+ que coexpressam um ou mais ou, ou todos, os seguintes biomarcadores: CD62L, CD127, CD27 e CD8.
[0313] Em uma modalidade, células T modificadas compreendendo níveis mantidos de proliferação e diferenciação diminuída são fabricadas. Em uma modalidade particular, as células T são fabricadas estimulando as células T a se tornarem ativadas e proliferarem na presença de um ou mais sinais estimuladores e de um agente que é um inibidor de uma via de sinalização de células PI3K.
[0314] As células T podem então ser modificadas para expressar um CAR anti- CD79A. Em uma modalidade, as células T são modificadas pela transdução das células T com um vetor viral compreendendo um CAR anti-CD79A contemplado neste documento. Em uma determinada modalidade, as células T são modificadas antes da estimulação e ativação na presença de um inibidor de uma via de sinalização de células PI3K. Em outra modalidade, as células T são modificadas após estimulação e ativação na presença de um inibidor de uma via de sinalização de células PI3K. Em uma modalidade particular, as células T são modificadas dentro de 12 horas, 24 horas, 36 horas ou 48 horas de estimulação e ativação na presença de um inibidor de uma via de sinalização de células PI3K.
[0315] Após as células T serem ativadas, as células são cultivadas para proliferar. As células T podem ser cultivadas por pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7 dias, pelo menos 2 semanas, pelo menos 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 meses ou mais com 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 ou mais rodadas de expansão.
[0316] Em várias modalidades, as composições de células T são fabricadas na presença de um ou mais inibidores de uma via de sinalização de células PI3K/Akt/mTOR. Os inibidores podem direcionar uma ou mais atividades na via ou uma única atividade. Sem desejar estar vinculado a qualquer teoria particular, é contemplado que o tratamento ou contato de células T com um ou mais inibidores da via PI3K durante as fases de estimulação, ativação e/ou expansão do processo de fabricação aumenta preferencialmente as células T jovens, produzindo assim composições de células T terapêuticas superiores.
[0317] Em uma modalidade particular, é fornecido um método para aumentar a proliferação de células T que expressam um receptor de células T projetado. Tais métodos podem compreender, por exemplo, a colheita de uma fonte de células T de um paciente, estimulação e ativação das células T na presença de um ou mais inibidores da via PI3K, modificação das células T para expressar um CAR anti-CD79A, e expandir as células T em cultura.
[0318] Em uma determinada modalidade, um método para produzir populações de células T enriquecidas para expressão de um ou mais dos seguintes biomarcadores: CD62L, CCR7, CD28, CD27, CD122, CD127, CD197, CD38 e CD8 é contemplado. Em uma modalidade, as células T jovens compreendem um ou mais de, ou todos os seguintes marcadores biológicos: CD62L, CD127, CD197 e CD38.
[0319] Em uma modalidade, as células T jovens compreendem um ou mais de, ou todos os seguintes marcadores biológicos: CD62L, CD127, CD27 e CD8.
[0320] Em uma modalidade, as células T jovens não apresentam expressão de CD57, CD244, CD160, PD-1, CTLA4, TIM3 e LAG3. Como discutido em outro lugar neste documento, os níveis de expressão de biomarcadores de células T jovens são relativos aos níveis de expressão de tais marcadores em células T mais diferenciadas ou populações de células efetoras imunológicas.
[0321] Em uma modalidade, células mononucleares do sangue periférico (PBMC) são usadas como a fonte de células T nos métodos de fabricação de células T contemplados neste documento. PBMCs formam uma população heterogênea de linfócitos T que podem ser CD4+, CD8+ ou CD4+ e CD8+ e podem incluir outras células mononucleares, tais como monócitos, células B, células NK e células NKT. Um vetor de expressão compreendendo um polinucleotídeo que codifica um TCR ou CAR projetado em modalidades particulares é introduzido em uma população de células T de doadores humanos, células NK ou células NKT. Em uma modalidade particular, as células T transduzidas com sucesso que carregam o vetor de expressão podem ser classificadas usando citometria de fluxo para isolar células T CD3 positivas e, em seguida, propagadas para aumentar o número de células T modificadas, além da ativação de células usando anticorpos anti-CD3 e ou anticorpos anti-CD28 e IL-2, IL-7 e/ou IL-15.
[0322] Os métodos de fabricação contemplados neste documento podem compreender ainda a criopreservação de células T modificadas para armazenamento e/ou preparação para uso em um paciente humano. Em uma modalidade, um método de armazenamento de células efetoras imunológicas que expressam a proteína CAR murina, humana ou humanizada geneticamente modificada que direciona uma célula que expressa CD79A compreende a criopreservação das células efetoras imunológicas de tal modo que as células permaneçam viáveis após o descongelamento. Uma fração das células efetoras imunológicas que expressam as proteínas CAR pode ser criopreservada por métodos conhecidos na técnica para fornecer uma fonte permanente de tais células para o futuro tratamento de pacientes afetados com uma célula cancerosa que expressa CD79A. As células T são criopreservadas de tal modo que as células permaneçam viáveis após o descongelamento. Quando necessário, as células efetoras imunológicas transformadas criopreservadas podem ser descongeladas, cultivadas e expandidas para mais de tais células. Conforme usado neste documento, "criopreservação" refere-se à preservação de células por resfriamento a temperaturas abaixo de zero, tal como (normalmente) 77 K ou -196 °C (o ponto de ebulição do nitrogênio líquido). Os agentes crioprotetores são frequentemente usados em temperaturas abaixo de zero para evitar que as células sejam preservadas de danos devido ao congelamento à temperaturas baixas ou aquecimento à temperatura ambiente. Agentes criopreservativos e taxas de resfriamento ideais podem proteger contra lesão celular. Os agentes crioprotetores que podem ser usados incluem, mas não estão limitados a, dimetilsulfóxido (DMSO) (Lovelock e Bishop, Nature, 1959; 183: 1394-1395; Ashwood-Smith, Nature, 1961; 190: 1204-1205), glicerol, polivinilpirrolidina (Rinfret, Ann. N.Y. Acad. Sci., 1960; 85: 576), e polietilenoglicol (Sloviter e Ravdin, Nature, 1962; 196:48). A taxa de resfriamento preferida é de 1 ° a 3 °C/minuto. Após pelo menos duas horas, as células T atingiram uma temperatura de −80 °C e podem ser colocadas diretamente em nitrogênio líquido (−196 °C) para armazenamento permanente, como em um recipiente de armazenamento criogênico a longo prazo.
1. CÉLULAS T
[0323] A fabricação de composições de células T CAR melhoradas é fornecida em modalidades particulares. As células T usadas para a produção de células T CAR podem ser autólogas/autogênicas ("próprias") ou não autólogas ("não próprias", por exemplo, alogênicas, singênicas ou xenogênicas). Em modalidades preferidas, as células T são obtidas de um paciente mamífero. Em uma modalidade mais preferida, as células T são obtidas de um paciente primata. Na modalidade mais preferida, as células T são obtidas de um paciente humano.
[0324] As células T podem ser obtidas a partir de uma série de fontes, incluindo, mas não se limitando a, células mononucleares do sangue periférico, medula óssea, tecido de nódulos linfáticos, sangue do cordão umbilical, emissão do timo, tecido de um sítio de infecção, ascite, derrame pleural, tecido do baço, e tumores. Em certas modalidades, as células T podem ser obtidas a partir de uma unidade de sangue coletada de um paciente usando qualquer número de técnicas conhecidas pelo técnico, tais como sedimentação, por exemplo, separação de FICOLLTM. Em uma modalidade, as células do sangue circulante de um indivíduo são obtidas por aférese. O produto de aférese normalmente contém linfócitos, incluindo células T, monócitos, granulócitos, células B, outros glóbulos brancos nucleados, glóbulos vermelhos e plaquetas. Em uma modalidade, as células coletadas por aférese podem ser lavadas para remover a fração de plasma e para colocar as células em um tampão ou meio apropriado para processamento subsequente. As células podem ser lavadas com PBS ou com outra solução adequada que não tenha cálcio, magnésio e a maioria, senão todos os outros cátions divalentes. Como seria apreciado por aqueles técnicos no assunto, uma etapa de lavagem pode ser realizada por métodos conhecidos daqueles na técnica, tais como o uso de uma centrífuga de fluxo direto semiautomática. Por exemplo, o processador de células Cobe 2991, o Baxter CytoMate ou similares. Após a lavagem, as células podem ser ressuspensas em uma variedade de tampões biocompatíveis ou outra solução salina com ou sem tampão. Em certas modalidades, os componentes indesejáveis da amostra de aférese podem ser removidos no meio de cultura celular ressuspenso diretamente.
[0325] Em modalidades particulares, uma população de células compreendendo células T, por exemplo, PBMCs, é usada nos métodos de fabricação contemplados neste documento. Em outras modalidades, uma população isolada ou purificada de células T é usada nos métodos de fabricação contemplados neste documento. As células podem ser isoladas de células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) por lise dos glóbulos vermelhos e esgotamento dos monócitos, por exemplo, por centrifugação através de um gradiente de PERCOLLTM. Em algumas modalidades, após o isolamento das PBMCs, ambos os linfócitos T citotóxicos e auxiliares podem ser classificados em subpopulações de células T virgens, de memória e efetoras antes ou depois da ativação, expansão e/ou modificação genética.
[0326] Em modalidades particulares, uma população de células compreendendo células T, por exemplo, PBMCs, é usada nos métodos de fabricação contemplados neste documento. Em outras modalidades, uma população isolada ou purificada de células T é usada nos métodos de fabricação contemplados neste documento. As células podem ser isoladas de células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) por lise dos glóbulos vermelhos e esgotamento dos monócitos, por exemplo, por centrifugação através de um gradiente PERCOLL™. Em algumas modalidades, após o isolamento das PBMCs,
ambos os linfócitos T citotóxicos e auxiliares podem ser classificados em subpopulações de células T virgens, de memória e efetoras antes ou depois da ativação, expansão e/ou modificação genética.
[0327] Em modalidades particulares, a população de células efetoras imunológicas é fabricada a partir das PBMCs que são geneticamente modificadas para expressar CARs usando métodos contemplados neste documento, mas que não são submetidas à seleção positiva ou negativa. Em certas modalidades, após o isolamento da PBMCs, os linfócitos T são ainda isolados e, em certas modalidades, tanto os linfócitos T citotóxicos quanto os auxiliares podem ser classificados em subpopulações de células T virgens, de memória e efetoras antes ou após a modificação e/ou expansão genética.
[0328] Em certas modalidades, a subpopulação específica de células T, expressando um ou mais dos seguintes marcadores: CD3, CD4, CD8, CD28, CD45RA, CD45RO, CD62, CD127 e HLA-DR pode ser ainda isolada por técnicas de seleção positiva ou negativa. Em uma modalidade, uma subpopulação específica de células T, expressando um ou mais dos marcadores selecionados a partir do grupo que consiste em i) CD62L, CCR7, CD28, CD27, CD122, CD127, CD197; ii) CD62L, CD127, CD197 e CD38 ou iii) CD62L, CD127, CD27 e CD8 é ainda isolada por técnicas de seleção positiva ou negativa. Em várias modalidades, as composições de células T fabricadas não expressam ou não expressam substancialmente um ou mais dos seguintes marcadores: CD57, CD244, CD160, PD-1, CTLA4, TIM3 e LAG3.
[0329] Em uma modalidade, a expressão de um ou mais dos marcadores selecionados a partir do grupo que consiste em i) CD62L, CD127, CD197 e CD38 ou ii) CD62L, CD127, CD27 e CD8 é aumentada pelo menos 1,5 vezes, pelo menos 2 vezes, pelo menos 3 vezes, pelo menos 4 vezes, pelo menos 5 vezes, pelo menos 6 vezes, pelo menos 7 vezes, pelo menos 8 vezes, pelo menos 9 vezes, pelo menos 10 vezes, pelo menos 25 vezes ou mais em comparação a uma população de células T ativadas e expandidas sem um inibidor de PI3K. Em uma modalidade, as células T compreendem células T CD8+.
[0330] Em uma modalidade, a expressão de um ou mais dos marcadores selecionados a partir do grupo que consiste em CD57, CD244, CD160, PD-1, CTLA4, TIM3 e LAG3 é diminuída pelo menos 1,5 vezes, pelo menos 2 vezes, pelo menos 3 vezes, pelo menos 4 vezes, pelo menos 5 vezes, pelo menos 6 vezes, pelo menos 7 vezes, pelo menos 8 vezes, pelo menos 9 vezes, pelo menos 10 vezes, pelo menos 25 vezes ou mais em comparação com uma população de células T ativada e expandida com um inibidor PI3K. Em uma modalidade, as células T compreendem células T CD8+.
[0331] Em uma modalidade, os métodos de fabricação contemplados neste documento aumentam o número de células T CAR compreendendo um ou mais marcadores de células T virgens ou potentes para o desenvolvimento. Sem desejar estar vinculado a qualquer teoria particular, os presentes inventores acreditam que o tratamento de uma população de células compreendendo células T com um ou mais inibidores de PI3K resulta em um aumento e uma expansão de células T potentes para o desenvolvimento e fornece uma imunoterapia de células T CAR adotiva mais robusta e eficaz em comparação com as terapias de células T CAR existentes.
[0332] Exemplos ilustrativos de marcadores de células T virgens ou potentes para o desenvolvimento aumentados em células T fabricadas usando os métodos contemplados em modalidades particulares incluem, mas não estão limitados a, i) CD62L, CD127, CD197 e CD38 ou ii) CD62L, CD127, CD27, e CD8. Em modalidades particulares, as células T virgens não expressam não expressam ou não expressam substancialmente um ou mais dos seguintes marcadores: CD57, CD244, CD160, PD-1, BTLA, CD45RA, CTLA4, TIM3 e LAG3.
[0333] Em relação às células T, as populações de células T resultantes das várias metodologias de expansão contempladas neste documento podem ter uma variedade de propriedades fenotípicas específicas, dependendo das condições empregadas. Em várias modalidades, as populações de células T expandidas compreendem um ou mais dos seguintes marcadores fenotípicos: CD62L, CD27, CD127, CD197, CD38, CD8 e HLA-DR.
[0334] Em uma modalidade, tais marcadores fenotípicos incluem expressão aumentada de um ou mais de, ou todos de CD62L, CD127, CD197 e CD38. Em modalidades particulares, os linfócitos T CD8+ caracterizados pela expressão de marcadores fenotípicos de células T virgens incluindo CD62L, CD127, CD197 e CD38 são expandidos.
[0335] Em uma modalidade, tais marcadores fenotípicos incluem expressão aumentada de um ou mais de, ou todos de CD62L, CD127, CD27 e CD8. Em modalidades particulares, os linfócitos T CD8+ caracterizados pela expressão de marcadores fenotípicos de células T virgens incluindo CD62L, CD127, CD27 e CD8 são expandidos.
[0336] Em modalidades particulares, as células T caracterizadas pela expressão de marcadores fenotípicos de células T de memória central, incluindo CD45RO, CD62L, CD127, CD197 e CD38 e negativas para granzima B são expandidas. Em algumas modalidades, as células T de memória central são células T CD45RO+, CD62L+, CD8+.
[0337] Em certas modalidades, os linfócitos T CD4+ caracterizados pela expressão de marcadores fenotípicos de células CD4+ virgens, incluindo CD62L e negativos para a expressão de CD45RA e/ou CD45RO, são expandidos. Em algumas modalidades, as células CD4+ são caracterizadas pela expressão de marcadores fenotípicos de células CD4+ de memória central, incluindo CD62L e CD45RO positivo. Em algumas modalidades, as células efetoras CD4+ são CD62L positivas e CD45RO negativas.
[0338] Em certas modalidades, as células T são isoladas de um indivíduo e ativadas e estimuladas para proliferar in vitro antes de serem geneticamente modificadas para expressar um CAR anti-CD79A. A este respeito, as células T podem ser cultivadas antes e/ou depois de serem geneticamente modificadas (ou seja, transduzidas ou transfectadas para expressar um CAR anti-CD79A contemplado neste documento).
2. ATIVAÇÃO E EXPANSÃO
[0339] A fim de alcançar doses terapêuticas suficientes de composições de células T, as células T são frequentemente sujeitas a uma ou mais rodadas de estimulação, ativação e/ou expansão. As células T podem ser ativadas e expandidas geralmente usando métodos conforme descritos, por exemplo, nas Patentes dos EUA de nºs 6.352.694; 6.534.055; 6.905.680; 6.692.964; 5.858.358; 6.887.466; 6.905.681;
7.144.575; 7.067.318; 7.172.869; 7.232.566; 7.175.843; 5.883.223; 6.905.874;
6.797.514; e 6.867.041, cada uma das quais é incorporada neste documento por referência em sua totalidade. As células T modificadas para expressar um CAR anti- CD79A podem ser ativadas e expandidas antes e/ou após as células T serem modificadas. Além disso, as células T podem ser contatadas com um ou mais agentes que modulam uma via de sinalização de células PI3K/Akt/mTOR antes, durante e/ou após a ativação e/ou expansão. Em uma modalidade, as células T fabricadas pelos métodos contemplados neste documento passam por uma, duas, três, quatro ou cinco ou mais rodadas de ativação e expansão, cada uma das quais pode incluir um ou mais agentes que modulam uma via de sinalização de células PI3K/Akt/mTOR.
[0340] As células de apresentação de antígenos artificiais (aAPCs) suportam o crescimento ex vivo e a expansão a longo prazo de células T CD8+ humanas funcionais sem exigir a adição de citocinas exógenas, em contraste com o uso de APCs naturais. Em modalidades particulares, PBMCs ou células T isoladas são postas em contato com um agente estimulador e agente coestimulador, tais como anticorpos anti-CD3 e anti- CD28, geralmente anexados a uma esfera ou outra superfície, em um meio de cultura com citocinas apropriadas, tais como IL -2, IL-7 e/ou IL-15.
[0341] Em outras modalidades, APC artificial (aAPC) é feita pela engenharia de células K562, U937, 721.221, T2 e C1R para direcionar a expressão e secreção estáveis de uma variedade de moléculas coestimuladoras e citocinas. Em uma modalidade particular, aAPCs K32 ou U32 são usadas para direcionar a exibição de uma ou mais moléculas estimuladoras baseadas em anticorpos na superfície da célula AAPC. Populações de células T podem ser expandidas por aAPCs que expressam uma variedade de moléculas coestimuladoras incluindo, mas não se limitando a, CD137L (4- 1BBL), CD134L (OX40L) e/ou CD80 ou CD86. As aAPCs fornecem uma plataforma eficiente para expandir células T geneticamente modificadas e para manter a expressão de CD28 em células T CD8+. As aAPCs fornecidas em WO 03/057171 e US2003/0147869 são incorporadas neste documento por referência em sua totalidade.
[0342] Em uma modalidade, um ligante coestimulador é apresentado em uma célula de apresentação de antígeno (por exemplo, uma aAPC, célula dendrítica, célula B e similares) que especificamente se liga a uma molécula coestimuladora cognata em uma célula T, fornecendo assim um sinal que, além do sinal primário fornecido por, por exemplo, ligação de um complexo TCR/CD3, medeia uma resposta de célula T desejada. Ligantes coestimuladores adequados incluem, mas não estão limitados a, CD7, B7-1 (CD80), B7-2 (CD86), 4-1BBL, OX40L, ligante coestimulador induzível (ICOS-L), molécula de adesão intercelular (ICAM), CD30L, CD40, CD70, CD83, HLA-G, MICA, MICB, HVEM, receptor de linfotoxina beta, ILT3, ILT4, um agonista ou anticorpo que se liga ao receptor de ligante Toll e um ligante que especificamente se liga a B7-H3.
[0343] Em uma modalidade particular, um ligante coestimulador compreende um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que especificamente se liga a uma molécula coestimuladora presente em uma célula T, incluindo, mas não se limitando a, CD27, CD28, 4-1BB, OX40, CD30, CD40, ICOS, antígeno-1 associado à função linfocitária (LFA-1), CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3 e um ligante que especificamente se liga a CD83.
[0344] Ligantes coestimuladores adequados incluem ainda antígenos alvo, que podem ser fornecidos na forma solúvel ou expressos em APCs ou aAPCs que se ligam a TCRs ou CARs modificados expressos em células T modificadas.
[0345] Em várias modalidades, um método de fabricação de células T contemplado neste documento compreende a ativação de uma população de células compreendendo células T e a expansão da população de células T. A ativação das células T pode ser realizada fornecendo um sinal de estimulação primário através do complexo TCR/CD3 da célula T ou através da estimulação da proteína de superfície CD2 e fornecendo um sinal de coestimulação secundário através de uma molécula acessória, por exemplo, CD28.
[0346] O complexo TCR/CD3 pode ser estimulado pelo contato da célula T com um agente de ligação a CD3 adequado, por exemplo, um ligante de CD3 ou um anticorpo monoclonal anti-CD3. Exemplos ilustrativos de anticorpos CD3 incluem, mas não estão limitados a, OKT3, G19-4, BC3 e 64.1.
[0347] Em outra modalidade, um agente de ligação a CD2 pode ser usado para fornecer um sinal de estimulação primário para as células T. Exemplos ilustrativos de agentes de ligação a CD2 incluem, mas não estão limitados a, ligantes CD2 e anticorpos anti-CD2, por exemplo, o anticorpo T11.3 em combinação com o anticorpo T11.1 ou T11.2 (Meuer, SC et al. (1984) Cell 36: 897-906) e o anticorpo 9.6 (que reconhece o mesmo epítopo como TI 1.1) em combinação com o anticorpo 9-1 (Yang, SY et al. (1986) J. Immunol. 137:1097-1100). Outros anticorpos que se ligam aos mesmos epítopos como qualquer um dos anticorpos descritos acima também podem ser usados. Anticorpos adicionais, ou combinações de anticorpos, podem ser preparados e identificados por técnicas padrão conforme divulgado em outro lugar neste documento.
[0348] Além do sinal de estimulação primário fornecido através do complexo TCR/CD3, ou através de CD2, a indução de respostas de células T requer um segundo sinal coestimulador. Em modalidades particulares, um agente de ligação a CD28 pode ser usado para fornecer um sinal coestimulador. Exemplos ilustrativos de agentes de ligação de CD28 incluem, mas não estão limitados a: ligantes naturais de CD 28, por exemplo, um ligante natural para CD28 (por exemplo, um membro da família B7 de proteínas, tal como B7-1 (CD80) e B7-2 (CD86); e anticorpo monoclonal anti-CD28 ou fragmento do mesmo capaz de reticular a molécula de CD28, por exemplo, anticorpos monoclonais 9.3, B-T3, XR-CD28, KOLT-2, 15E8, 248.23.2 e EX5.3D10.
[0349] Em uma modalidade, a molécula que fornece o sinal de estimulação primário, por exemplo, uma molécula que fornece estimulação através do complexo TCR/CD3 ou CD2, e a molécula coestimuladora são acopladas à mesma superfície.
[0350] Em certas modalidades, os agentes de ligação que fornecem sinais estimuladores e coestimuladores estão localizados na superfície de uma célula. Isso pode ser realizado por transfecção ou transdução de uma célula com um ácido nucleico que codifica o agente de ligação em uma forma adequada para sua expressão na superfície da célula ou alternativamente por acoplamento de um agente de ligação à superfície da célula.
[0351] Em outra modalidade, a molécula que fornece o sinal de estimulação primário, por exemplo, uma molécula que fornece estimulação através do complexo TCR/CD3 ou CD2, e a molécula coestimuladora são exibidas em células apresentadoras de antígeno.
[0352] Em uma modalidade, a molécula que fornece o sinal de estimulação primário, por exemplo, uma molécula que fornece estimulação através do complexo TCR/CD3 ou CD2, e a molécula coestimuladora são fornecidas em superfícies separadas.
[0353] Em uma determinada modalidade, um dos agentes de ligação que fornecem sinais estimuladores e coestimuladores é solúvel (fornecido em solução) e os outros agentes são fornecidos em uma ou mais superfícies.
[0354] Em uma modalidade particular, os agentes de ligação que fornecem sinais estimuladores e coestimuladores são fornecidos em uma forma solúvel (fornecida em solução).
[0355] Em várias modalidades, os métodos de fabricação de células T contemplados neste documento compreendem a ativação de células T com anticorpos anti-CD3 e anti-CD28.
[0356] As composições de células T fabricadas pelos métodos contemplados em modalidades particulares compreendem células T ativadas e/ou expandidas na presença de um ou mais agentes que inibem uma via de sinalização de células PI3K. As células T modificadas para expressar um CAR anti-CD79A podem ser ativadas e expandidas antes e/ou após as células T serem modificadas. Em modalidades particulares, uma população de células T é ativada, modificada para expressar um CAR anti-CD79A e, em seguida, cultivada para expansão.
[0357] Em uma modalidade, as células T fabricadas pelos métodos contemplados neste documento compreendem um número aumentado de células T que expressam marcadores indicativos de alto potencial proliferativo e a capacidade de autorrenovação, mas que não expressam ou expressam marcadores substancialmente indetectáveis de diferenciação de células T. Essas células T podem ser repetidamente ativadas e expandidas de forma robusta e, assim, fornecer uma composição de células T terapêutica melhorada.
[0358] Em uma modalidade, uma população de células T ativadas e expandidas na presença de um ou mais agentes que inibem uma via de sinalização de células PI3K é expandida pelo menos 1,5 vezes, pelo menos 2 vezes, pelo menos 3 vezes, pelo menos 4 vezes, em pelo menos 5 vezes, pelo menos 6 vezes, pelo menos 7 vezes, pelo menos 8 vezes, pelo menos 9 vezes, pelo menos 10 vezes, pelo menos 25 vezes, pelo menos 50 vezes, pelo menos 100 vezes, pelo menos 250 vezes, em pelo menos 500 vezes, pelo menos 1000 vezes ou mais em comparação com uma população de células T ativadas e expandidas sem um inibidor de PI3K.
[0359] Em uma modalidade, uma população de células T CARACTERIZADA pela expressão de marcadores de células T jovens que são ativadas e expandidas na presença de um ou mais agentes que inibem uma via de sinalização de células PI3K é expandida pelo menos 1,5 vezes, pelo menos 2 vezes, em pelo menos 3 vezes, pelo menos 4 vezes, pelo menos 5 vezes, pelo menos 6 vezes, pelo menos 7 vezes, pelo menos 8 vezes, pelo menos 9 vezes, pelo menos 10 vezes, pelo menos 25 vezes, pelo menos 50 vezes, em pelo menos 100 vezes, pelo menos 250 vezes, pelo menos 500 vezes, pelo menos 1000 vezes ou mais em comparação com a população de células T ativadas e expandidas sem um inibidor de PI3K.
[0360] Em uma modalidade, a expansão de células T ativadas pelos métodos contemplados neste documento compreende ainda a cultura de uma população de células compreendendo células T por várias horas (cerca de 3 horas) a cerca de 7 dias a cerca de 28 dias ou qualquer valor inteiro por hora no meio. Em outra modalidade, a composição de células T pode ser cultivada por 14 dias. Em uma modalidade particular, as células T são cultivadas por cerca de 21 dias. Em outra modalidade, as composições de células T são cultivadas por cerca de 2-3 dias. Vários ciclos de estimulação/ativação/expansão também podem ser desejados de tal modo que o tempo de cultura de células T possa ser de 60 dias ou mais.
[0361] Em modalidades particulares, as condições apropriadas para a cultura de células T incluem um meio apropriado (por exemplo, meio essencial mínimo ou meio RPMI 1640 ou, X-vivo 15, (Lonza)) e um ou mais fatores necessários para a proliferação e viabilidade incluindo, mas não se limitando a, soro (por exemplo, bovino fetal ou soro humano), interleucina-2 (IL-2), insulina, IFN-γ, IL-4, IL-7, IL-21, GM-CSF, IL-10, IL-12, IL- 15, TGFβ e TNF-α ou quaisquer outros aditivos adequados para o crescimento de células conhecidas pelo técnico no assunto.
[0362] Outros exemplos ilustrativos de meios de cultura de células incluem, mas não estão limitados a, RPMI 1640, Clicks, AIM-V, DMEM, MEM, a-MEM, F-12, X-Vivo 1 5 e X-Vivo 20, Optimizer, com aminoácidos adicionados, piruvato de sódio e vitaminas, sem soro ou suplementado com uma quantidade apropriada de soro (ou plasma) ou um conjunto definido de hormônios e/ou uma quantidade de citocina(s) suficiente para o crescimento e expansão de células T.
[0363] Exemplos ilustrativos de outros aditivos para expansão de células T incluem, mas não estão limitados a, surfactante, piasmanato, tampões de pH, tais como HEPES, e agentes redutores, tais como N-acetil-cisteína e 2-mercaptoetanol.
[0364] Antibióticos, por exemplo, penicilina e estreptomicina, são incluídos apenas em culturas experimentais, não em culturas de células que serão infundidas em um paciente. As células alvo são mantidas sob condições necessárias para suportar o crescimento, por exemplo, uma temperatura apropriada (por exemplo, 37 °C) e atmosfera (por exemplo, ar mais 5% de C02).
3. AGENTES
[0365] Em várias modalidades, é fornecido um método de fabricação de células T que expande células T indiferenciadas ou potentes para o desenvolvimento, compreendendo o contato de células T com um agente que modula uma via PI3K nas células. Em várias modalidades, é fornecido um método de fabricação de células T que expande células T indiferenciadas ou potentes para o desenvolvimento, compreendendo o contato de células T com um agente que modula uma via PI3K/AKT/mTOR nas células. As células podem ser contatadas antes, durante e/ou após a ativação e expansão. As composições de células T retêm potência de células T suficiente de tal modo que possam sofrer múltiplos ciclos de expansão sem um aumento substancial na diferenciação.
[0366] Conforme usado neste documento, os termos "modular", "modulador" ou "agente modulador" ou termo comparável referem-se à capacidade de um agente de provocar uma mudança em uma via de sinalização celular. Um modulador pode aumentar ou diminuir uma quantidade, atividade de um componente da via ou aumentar ou diminuir um efeito desejado ou saída de uma via de sinalização celular. Em uma modalidade, o modulador é um inibidor. Em outra modalidade, o modulador é um ativador.
[0367] Um "agente" refere-se a um composto, molécula pequena, por exemplo, molécula orgânica pequena, ácido nucleico, polipeptídeo ou um fragmento, isoforma,
variante, análogo ou derivado do mesmo usado na modulação de uma via PI3K/AKT/mTOR.
[0368] Uma "molécula pequena" refere-se a uma composição que tem um peso molecular inferior a cerca de 5 kD, inferior a cerca de 4 kD, inferior a cerca de 3 kD, inferior a cerca de 2 kD, inferior a cerca de 1 kD ou inferior a cerca de 5kD. As moléculas pequenas podem compreender ácidos nucleicos, peptídeos, polipeptídeos, peptidomiméticos, peptóides, carboidratos, lipídeos, componentes dos mesmos ou outras moléculas orgânicas ou inorgânicas. Bibliotecas de misturas químicas e/ou biológicas, tais como extratos de fungos, bactérias ou algas, são conhecidas na técnica e podem ser rastreadas com qualquer um dos ensaios. Exemplos de métodos para a síntese de bibliotecas moleculares podem ser encontrados em: (Carell et al., 1994a; Carell et al., 1994b; Cho et al., 1993; DeWitt et al., 1993; Gallop et al., 1994; Zuckermann et al., 1994).
[0369] Um "análogo" refere-se a um pequeno composto orgânico, um nucleotídeo, uma proteína ou um polipeptídeo que possui atividade ou função(ões) semelhante(s) ou idêntica(s) como o composto, nucleotídeo, proteína, polipeptídeo ou composto tendo a atividade desejada, mas não precisa necessariamente compreender uma sequência ou estrutura que é semelhante ou idêntica à sequência ou estrutura da modalidade preferida.
[0370] Um "derivado" refere-se a um composto, uma proteína ou polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos de uma proteína parental ou polipeptídeo que foram alterados pela introdução de substituições, deleções ou adições de resíduos de aminoácidos, ou um ácido nucleico ou nucleotídeo que foram modificados pela introdução de substituições de nucleotídeos ou deleções, adições ou mutações. O ácido nucleico, nucleotídeo, proteína ou polipeptídeo derivado possui uma função semelhante ou idêntica à do polipeptídeo parental.
[0371] Em várias modalidades, o agente que modula uma via PI3K ativa um componente da via. Um "ativador" ou "agonista" refere-se a um agente que promove,
aumenta ou induz uma ou mais atividades de uma molécula em uma via PI3K/AKT/mTOR incluindo, sem limitação, uma molécula que ativa uma ou mais atividades de um PI3K.
[0372] Em várias modalidades, o agente que modula uma via PI3K inibe um componente da via. Um "inibidor" ou "antagonista" refere-se a um agente que inibe, diminui ou reduz uma ou mais atividades de uma molécula em uma via PI3K/AKT/mTOR incluindo, sem limitação, uma molécula que inibe uma ou mais atividades de uma PI3K. Em uma modalidade, o inibidor é um inibidor de molécula dupla. Em uma modalidade particular, o inibidor pode inibir uma classe de moléculas com atividades iguais ou substancialmente semelhantes (um inibidor pan) ou pode especificamente inibir a atividade de uma molécula (um inibidor seletivo ou específico). A inibição também pode ser irreversível ou reversível.
[0373] Em uma modalidade, o inibidor tem uma IC50 de pelo menos 1nM, pelo menos 2nM, pelo menos 5nM, pelo menos 10nM, pelo menos 50nM, pelo menos 100nM, pelo menos 200nM, pelo menos 500nM, pelo menos 1μM, pelo menos 10μM, pelo menos 50μM, ou pelo menos 100μM. As determinações de IC50 podem ser realizadas usando quaisquer técnicas convencionais conhecidas na técnica. Por exemplo, uma IC50 pode ser determinada medindo a atividade de uma determinada enzima na presença de uma faixa de concentrações do inibidor em estudo. Os valores de atividade enzimática obtidos experimentalmente são então representados graficamente contra as concentrações de inibidor usadas. A concentração do inibidor que mostra 50% da atividade enzimática (em comparação com a atividade na ausência de qualquer inibidor) é considerada como o valor de “IC50”. Analogamente, outras concentrações inibitórias podem ser definidas por meio de determinações apropriadas da atividade.
[0374] Em várias modalidades, as células T são colocadas em contato ou tratadas ou cultivadas com um ou mais moduladores de uma via PI3K/AKT/mTOR a uma concentração de pelo menos 1 nM, pelo menos 2 nM, pelo menos 5 nM, pelo menos 10 nM, pelo menos 50 nM, pelo menos 100nM, pelo menos 200nM, pelo menos 500nM, pelo menos 1μM, pelo menos 10μM, pelo menos 50μM, pelo menos 100μM ou pelo menos 1 M.
[0375] Em modalidades particulares, as células T podem ser contatadas ou tratadas ou cultivadas com um ou mais moduladores de uma via PI3K/AKT/mTOR por pelo menos 12 horas, 18 horas, pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7 dias, pelo menos 2 semanas, pelo menos 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 meses ou mais com 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 ou mais rodadas de expansão.
[0376] O alvo fosfatidil-inositol-3 quinase/Akt/mamífero da via da rapamicina serve como um canal para integrar a sinalização do fator de crescimento com a proliferação, diferenciação, metabolismo e sobrevivência celular. PI3Ks são uma família de quinases lipídicas intracelulares altamente conservadas. As PI3Ks de classe IA são ativadas pelas tirosina quinases receptoras do fator de crescimento (RTKs), seja diretamente ou por meio da interação com a família de substratos do receptor de insulina de moléculas adaptadoras. Esta atividade resulta na produção de fosfatidil-inositol-3,4,5- trisfospato (PIP3) um regulador da serina/treonina quinase Akt. O mTOR atua através da via PI3K canônica por meio de 2 complexos distintos, cada um caracterizado por diferentes parceiros de ligação que conferem atividades distintas. mTORC1 (mTOR em complexo com PRAS40, raptor e mLST8/GbL) atua como um efetor a jusante da sinalização PI3K/Akt, ligando os sinais do fator de crescimento à tradução de proteínas, crescimento celular, proliferação e sobrevivência. mTORC2 (mTOR em complexo com rictor, mSIN1, protor e mLST8) atua como um ativador a montante de Akt.
[0377] Após a ativação de PI3K mediada pelo receptor do fator de crescimento, Akt é recrutada para a membrana por meio da interação de seu domínio de homologia de plecstrina com PIP3, expondo assim sua alça de ativação e permitindo a fosforilação na treonina 308 (Thr308) pela proteína quinase dependente de fosfoinositídeo constitutivamente ativa 1 (PDK1). Para ativação máxima, Akt também é fosforilada por mTORC2, na serina 473 (Ser473) de seu motivo hidrofóbico C-terminal. DNA-PK e HSP também mostraram ser importantes na regulação da atividade de Akt. Akt ativa mTORC1 através da fosforilação inibitória de TSC2, que junto com TSC1, regula negativamente mTORC1 ao inibir a Rheb GTPase, um regulador positivo de mTORC1. mTORC1 tem 2 substratos bem definidos, p70S6K (referido daqui em diante como S6K1) e 4E-BP1, os quais regulam criticamente a síntese de proteínas. Assim, mTORC1 é um importante efetor a jusante de PI3K, ligando a sinalização do fator de crescimento com a tradução de proteínas e proliferação celular. a. INIBIDORES DE PI3K
[0378] Conforme usado neste documento, o termo "inibidor de PI3K" refere-se a um ácido nucleico, peptídeo, composto ou pequena molécula orgânica que se liga a e inibe pelo menos uma atividade de PI3K. As proteínas PI3K podem ser divididas em três classes, classe 1 PI3Ks, classe 2 PI3Ks e classe 3 PI3Ks. As PI3Ks de classe 1 existem como heterodímeros que consistem em uma das quatro subunidades catalíticas p110 (p110α, p110β, p110δ e p110γ) e uma das duas famílias de subunidades regulatórias. Um inibidor de PI3K preferencialmente direciona os inibidores de PI3K de classe 1. Em uma modalidade, um inibidor de PI3K exibirá seletividade para uma ou mais isoformas dos inibidores de PI3K de classe 1 (isto é, seletividade para p110α, p110β, p110δ e p110γ ou um ou mais de p110α, p110β, p110δ e p110γ). Em outro aspecto, um inibidor de PI3K não exibirá seletividade de isoforma e será considerado um "inibidor de pan-PI3K". Em uma modalidade, um inibidor de PI3K competirá pela ligação com ATP ao domínio catalítico de PI3K.
[0379] Em certas modalidades, um inibidor de PI3K pode, por exemplo, alvejar PI3K, bem como proteínas adicionais na via PI3K-AKT-mTOR. Em modalidades particulares, um inibidor de PI3K que direciona tanto mTOR quanto PI3K pode ser referido como um inibidor de mTOR ou um inibidor de PI3K. Um inibidor de PI3K que direciona somente PI3K pode ser referido como um inibidor de PI3K seletivo. Em uma modalidade, um inibidor seletivo de PI3K pode ser entendido como se referindo a um agente que exibe uma concentração inibitória de 50% em relação a PI3K que é pelo menos 10 vezes, pelo menos 20 vezes, pelo menos 30 vezes, pelo menos 50 vezes, pelo menos 100 vezes, pelo menos 1000 vezes ou mais, menor do que a IC50 do inibidor em relação ao mTOR e/ou outras proteínas na via.
[0380] Em uma modalidade particular, inibidores de PI3K exemplares inibem PI3K com uma IC50 (concentração que inibe 50% da atividade) de cerca de 200 nM ou menos, de preferência cerca de 100 nm ou menos, ainda mais preferencialmente cerca de 60 nM ou menos, cerca de 25 nM, cerca de 10 nM, cerca de 5 nM, cerca de 1 nM, 100 μM, 50 μM, 25 μM, 10 μM, 1 μM ou menos. Em uma modalidade, um inibidor de PI3K inibe PI3K com uma IC50 de cerca de 2 nM a cerca de 100 nm, mais preferencialmente de cerca de 2 nM a cerca de 50 nM, ainda mais preferencialmente de cerca de 2 nM a cerca de 15 nM.
[0381] Exemplos ilustrativos de inibidores de PI3K adequados para uso nos métodos de fabricação de células T contemplados em modalidades particulares incluem, mas não estão limitados a, BKM120 (inibidor de PI3K de classe 1, Novartis), XL147 (inibidor de PI3K de classe 1, Exelixis), (inibidor de pan-PI3K, GlaxoSmithKline) e PX-866 (inibidor de PI3K de classe 1; isoformas de p110α, p110β e p110γ, Oncothyreon).
[0382] Outros exemplos ilustrativos de inibidores seletivos de PI3K incluem, mas não estão limitados a BYL719, GSK2636771, TGX-221, AS25242, CAL-101, ZSTK474 e IPI-145.
[0383] Outros exemplos ilustrativos de inibidores de pan-PI3K incluem, mas não estão limitados a BEZ235, LY294002, GSK1059615, TG100713 e GDC-0941.
[0384] Em uma modalidade preferida, o inibidor de PI3K é ZSTK474. b. INIBIDORES DE AKT
[0385] Conforme usado neste documento, o termo "inibidor de AKT" refere-se a um ácido nucleico, peptídeo, composto ou pequena molécula orgânica que inibe pelo menos uma atividade de AKT. Os inibidores de AKT podem ser agrupados em várias classes, incluindo inibidores baseados em lipídios (por exemplo, inibidores que direcionam o domínio de homologia da pleckstrina de AKT que impede que AKT se localize nas membranas plasmáticas), inibidores competitivos de ATP e inibidores alostéricos. Em uma modalidade, os inibidores de AKT atuam ligando-se ao sítio catalítico de AKT. Em uma modalidade particular, os inibidores de Akt atuam inibindo a fosforilação de alvos AKT a jusante, tais como mTOR. Em outra modalidade, a atividade de AKT é inibida pela inibição dos sinais de entrada para ativar Akt por meio da inibição, por exemplo, da ativação de AKT por DNA-PK, ativação de PDK-1 de AKT e/ou ativação de mTORC2 de Akt.
[0386] Os inibidores de AKT podem direcionar todas as três isoformas de AKT, AKT1, AKT2, AKT3 ou podem ser seletivos para isoformas e direcionar apenas uma ou duas das isoformas de AKT. Em uma modalidade, um inibidor de AKT pode direcionar AKT, bem como proteínas adicionais na via PI3K-AKT-mTOR. Um inibidor de AKT que direciona somente AKT pode ser referido como um inibidor de AKT seletivo. Em uma modalidade, um inibidor de AKT seletivo pode ser entendido como se referindo a um agente que exibe uma concentração inibitória de 50% em relação a AKT que é pelo menos 10 vezes, pelo menos 20 vezes, pelo menos 30 vezes, pelo menos 50 vezes, pelo menos 100 vezes, pelo menos 1000 vezes ou mais, menor do que a IC50 do inibidor em relação a outras proteínas na via.
[0387] Em uma modalidade particular, inibidores de AKT exemplares inibem AKT com uma IC50 (concentração que inibe 50% da atividade) de cerca de 200 nM ou menos, preferencialmente cerca de 100 nm ou menos, ainda mais preferencialmente cerca de 60 nM ou menos, cerca de 25 nM, cerca de 10 nM, cerca de 5 nM, cerca de 1 nM, 100 μM, 50 μM, 25 μM, 10 μM, 1 μM ou menos. Em uma modalidade, um AKT inibe AKT com uma IC50 de cerca de 2 nM a cerca de 100 nm, mais preferencialmente de cerca de 2 nM a cerca de 50 nM, ainda mais preferencialmente de cerca de 2 nM a cerca de 15 nM.
[0388] Exemplos ilustrativos de inibidores de AKT para uso em combinação com conjugados de anticorpo-fármaco à base de auristatina incluem, por exemplo, perifosina (Keryx), MK2206 (Merck), VQD-002 (VioQuest), XL418 (Exelixis), GSK690693, GDC- 0068, e PX316 (PROLX Pharmaceuticals).
[0389] Um exemplo ilustrativo e não limitante de um inibidor de Akt1 seletivo é A-
674563.
[0390] Um exemplo ilustrativo e não limitante de um inibidor de Akt2 seletivo é CCT128930.
[0391] Em modalidades particulares, a ativação do inibidor Akt DNA-PK de Akt, ativação de PDK-1 de Akt, ativação de mTORC2 de Akt ou ativação de HSP de Akt.
[0392] Exemplos ilustrativos de inibidores de DNA-PK incluem, mas não estão limitados a, NU7441, PI-103, NU7026, PIK-75 e PP-121. c. INIBIDORES DE MTOR
[0393] Os termos "inibidor de mTOR" ou "agente que inibe mTOR" referem-se a um ácido nucleico, peptídeo, composto ou pequena molécula orgânica que inibe pelo menos uma atividade de uma proteína mTOR, tal como, por exemplo, a proteína quinase serina/treonina atividade em pelo menos um de seus substratos (por exemplo, p70S6 quinase 1, 4E-BP1, AKT/PKB e eEF2). Os inibidores de mTOR são capazes de se ligar diretamente e inibir mTORC1, mTORC2 ou ambos mTORC1 e mTORC2.
[0394] A inibição da atividade de mTORC1 e/ou mTORC2 pode ser determinada por uma redução na transdução de sinal da via PI3K/Akt/mTOR. Uma ampla variedade de leituras pode ser usada para estabelecer uma redução da saída de tal via de sinalização. Algumas leituras exemplificativas não limitantes incluem (1) uma diminuição na fosforilação de Akt em resíduos, incluindo, mas não se limitando a, 5473 e T308; (2) uma diminuição na ativação de Akt como evidenciado, por exemplo, por uma redução da fosforilação de substratos de Akt incluindo, mas não se limitando a, Fox01/O3a T24/32, GSK3a/β; S21/9 e TSC2 T1462; (3) uma diminuição na fosforilação de moléculas de sinalização a jusante de mTOR, incluindo, mas não se limitando a ribossomal S6
S240/244, 70S6K T389 e 4EBP1 T37/46; e (4) inibição da proliferação de células cancerosas.
[0395] Em uma modalidade, os inibidores de mTOR são inibidores de sítio ativo. Esses são inibidores de mTOR que se ligam ao sítio de ligação a ATP (também conhecido como bolso de ligação a ATP) de mTOR e inibem a atividade catalítica de mTORC1 e mTORC2. Uma classe de inibidores de sítio ativo adequados para uso nos métodos de fabricação de células T contemplados em modalidades particulares são inibidores de especificidade dupla que direcionam e inibem diretamente PI3K e mTOR. Os inibidores de especificidade dupla se ligam ao sítio de ligação de ATP de mTOR e PI3K. Exemplos ilustrativos de tais inibidores incluem, mas não estão limitados a: imidazoquinazolinas, wortmannin, LY294002, PI-103 (Cayman Chemical), SF1126 (Semafore), BGT226 (Novartis), XL765 (Exelixis) e NVP-BEZ235 (Novartis).
[0396] Outra classe de inibidores de sítio ativo de mTOR adequados para uso nos métodos contemplados em modalidades particulares inibem seletivamente a atividade de mTORC1 e mTORC2 em relação a uma ou mais fosfatidilinositol 3-quinases do tipo I, por exemplo, PI3 quinase α, β, γ ou δ. Esses inibidores de sítio ativo se ligam ao sítio ativo de mTOR, mas não a PI3K. Exemplos ilustrativos de tais inibidores incluem, mas não estão limitados a: pirazolopirimidinas, Torin1 (Guertin e Sabatini), PP242 (2-(4- Amino-1-isopropil-1H-pirazol [3,4-d] pirimidin-3-il) -1H-indol-5-ol), PP30, Ku-0063794, WAY-600 (Wyeth), WAY-687 (Wyeth), WAY-354 (Wyeth) e AZD8055 (Liu et al., Nature Review, 8, 627-644, 2009). I
[0397] Em uma modalidade, um inibidor seletivo de mTOR refere-se a um agente que exibe uma concentração inibitória de 50% (IC50) em relação a mTORC1 e/ou mTORC2, que é pelo menos 10 vezes, pelo menos 20 vezes, pelo menos 50 vezes, pelo menos 100 vezes, pelo menos 1000 vezes ou mais, menor do que a IC50 do inibidor em relação a uma, duas, três ou mais PI3-quinases do tipo I ou a todas as PI3-quinases do tipo I.
[0398] Outra classe de inibidores de mTOR é referida neste documento como "rapalogs". Conforme usado neste documento, o termo "rapalog" refere-se a compostos que especificamente se ligam ao domínio FRB de mTOR (domínio de ligação a rapamicina FKBP), estão estruturalmente relacionados à rapamicina e retêm as propriedades de inibição de mTOR. O termo rapalogs exclui a rapamicina. Os rapalogs incluem ésteres, éteres, oximas, hidrazonas e hidroxilaminas de rapamicina, bem como compostos nos quais grupos funcionais na estrutura do núcleo da rapamicina foram modificados, por exemplo, por redução ou oxidação. Os sais farmaceuticamente aceitáveis de tais compostos são também considerados derivados da rapamicina. Exemplos ilustrativos de rapalogs adequados para uso nos métodos contemplados em modalidades particulares incluem, sem limitação, temsirolimus (CC1779), everolimus (RAD001), deforolimus (AP23573), AZD8055 (AstraZeneca) e OSI-027 (OSI).
[0399] Em uma modalidade, o agente é o inibidor de mTOR rapamicina (sirolimus).
[0400] Em uma modalidade particular, inibidores de mTOR exemplares inibem mTORC1, mTORC2 ou ambos mTORC1 e mTORC2 com uma IC50 (concentração que inibe 50% da atividade) de cerca de 200 nM ou menos, de preferência cerca de 100 nm ou menos, ainda mais preferencialmente cerca de 60 nM ou menos, cerca de 25 nM, cerca de 10 nM, cerca de 5 nM, cerca de 1 nM, 100 μM, 50 μM, 25 μM, 10 μM, 1 μM ou menos. Em um aspecto, um inibidor de mTOR inibe mTORC1, mTORC2 ou ambos mTORC1 e mTORC2 com uma IC50 de cerca de 2 nM a cerca de 100 nm, mais preferencialmente de cerca de 2 nM a cerca de 50 nM, ainda mais preferencialmente de cerca de 2 nM a cerca de 15 nM.
[0401] Em uma modalidade, inibidores de mTOR exemplares inibem PI3K e mTORC1 ou mTORC2 ou ambos mTORC1 e mTORC2 e PI3K com uma IC50 (concentração que inibe 50% da atividade) de cerca de 200 nM ou menos, de preferência cerca de 100 nm ou menos, ainda mais de preferência cerca de 60 nM ou menos, cerca de 25 nM, cerca de 10 nM, cerca de 5 nM, cerca de 1 nM, 100 μM, 50 μM, 25 μM, 10 μM, 1 μM ou menos. Em um aspecto, um inibidor de mTOR inibe PI3K e mTORC1 ou mTORC2 ou ambos mTORC1 e mTORC2 e PI3K com uma IC50 de cerca de 2 nM a cerca de 100 nm, mais preferencialmente de cerca de 2 nM a cerca de 50 nM, ainda mais preferencialmente de cerca de 2 nM a cerca de 15 nM.
[0402] Outros exemplos ilustrativos de inibidores de mTOR adequados para uso em modalidades particulares incluem, mas não estão limitados a, AZD8055, INK128, rapamicina, PF-04691502 e everolimus.
[0403] Foi demonstrado que mTOR demonstra uma atividade catalítica robusta e específica em relação às proteínas do substrato fisiológico, proteína quinase ribossomal p70 S6 I p70S6K1) e proteína de ligação a eIF4E 1 (4EBP1), conforme medido por anticorpos específicos de fósforo em Western blotting.
[0404] Em uma modalidade, o inibidor da via PI3K/AKT/mTOR é um inibidor da s6 quinase selecionado a partir do grupo que consiste em: BI-D1870, H89, PF-4708671, FMK e AT7867. H. COMPOSIÇÕES E FORMULAÇÕES
[0405] As composições contempladas neste documento podem compreender um ou mais polipeptídeos CAR, polinucleotídeos, vetores compreendendo os mesmos, células efetoras imunológicas geneticamente modificadas, etc., conforme contemplado neste documento. As composições incluem, mas não estão limitadas a composições farmacêuticas. Uma "composição farmacêutica" refere-se a uma composição formulada em soluções farmaceuticamente aceitáveis ou fisiologicamente aceitáveis para administração a uma célula ou um animal, sozinha ou em combinação com uma ou mais outras modalidades de terapia. Também será entendido que, se desejado, as composições podem ser administradas em combinação com outros agentes, tais como, por exemplo, citocinas, fatores de crescimento, hormônios, moléculas pequenas, quimioterápicos, pró-fármacos, fármacos, anticorpos ou outros vários agentes farmaceuticamente ativos. Não há praticamente nenhum limite para outros componentes que também possam ser incluídos nas composições, desde que os agentes adicionais não afetem adversamente a capacidade da composição de administrar a terapia pretendida.
[0406] A frase "farmaceuticamente aceitável" é empregada neste documento para se referir àqueles compostos, materiais, composições e/ou formas de dosagem que são, dentro do escopo do julgamento médico adequado, adequados para uso em contato com os tecidos de seres humanos e animais sem toxicidade, irritação, resposta alérgica excessivas ou outro problema ou complicação, proporcional a uma relação risco/benefício razoável.
[0407] Conforme usado neste documento, "transportador, diluente ou excipiente farmaceuticamente aceitável" inclui, sem limitação, qualquer adjuvante, transportador, excipiente, deslizante, agente adoçante, diluente, conservante, colorante/corante, intensificador de sabor, tensoativo, agente umectante, agente dispersante, agente de suspensão, estabilizador, agente isotônico, solvente, tensoativo ou emulsificante que tenha sido aprovado pela Food and Drug Administration dos Estados Unidos como sendo aceitável para uso em humanos ou animais domésticos. Os transportadores farmaceuticamente aceitáveis exemplares incluem, mas não estão limitados a, açúcares, tais como lactose, glicose e sacarose; amidos, tais como amido de milho e amido de batata; celulose e seus derivados, tais como carboximetilcelulose de sódio, etilcelulose e acetato de celulose; tragacanto; malte; gelatina; talco; manteiga de cacau, ceras, gorduras animais e vegetais, parafinas, silicones, bentonites, ácido silícico, óxido de zinco; óleos, tais como óleo de amendoim, óleo de semente de algodão, óleo de cártamo, óleo de sésamo, azeite, óleo de milho e óleo de soja; glicóis, tais como propilenoglicol; polióis, tais como glicerina, sorbitol, manitol e polietilenoglicol; ésteres, tais como oleato de etila e laurato de etila; ágar; agentes tamponantes, tais como hidróxido de magnésio e hidróxido de alumínio; ácido algínico; água apirogênica; solução salina isotônica;
Solução de Ringer; álcool etílico; soluções tampão de fosfato; e quaisquer outras substâncias compatíveis empregadas em formulações farmacêuticas.
[0408] Em modalidades particulares, as composições compreendem uma quantidade de células efetoras imunológicas que expressam CAR contemplada neste documentos. Tal como usado neste documento, o termo "quantidade" refere-se a "uma quantidade eficaz" ou "uma eficaz quantidade" de uma célula terapêutica geneticamente modificada, por exemplo, célula T, para atingir um resultado profilático ou terapêutico benéfico ou desejado, incluindo resultados clínicos.
[0409] Uma "quantidade profilaticamente eficaz" refere-se a uma quantidade de uma célula terapêutica geneticamente modificada eficaz para atingir o resultado profilático desejado. Normalmente, mas não necessariamente, uma vez que uma dose profilática é usada em pacientes antes ou em uma fase anterior da doença, a quantidade profilaticamente eficaz é menor que a quantidade terapeuticamente eficaz.
[0410] Uma "quantidade terapeuticamente eficaz" de uma célula terapêutica geneticamente modificada pode variar de acordo com fatores como o estado da doença, idade, sexo e peso do indivíduo e a capacidade das células-tronco e progenitoras de induzir uma resposta desejada no indivíduo. Uma quantidade terapeuticamente eficaz é também aquela em que quaisquer efeitos tóxicos ou prejudiciais do vírus ou células terapêuticas transduzidas são compensados pelos efeitos terapeuticamente benéficos. O termo "quantidade terapeuticamente eficaz" inclui uma quantidade que é eficaz para "tratar" um sujeito (por exemplo, um paciente). Quando uma quantidade terapêutica é indicada, a quantidade precisa das composições a serem administradas pode ser determinada por um médico levando em consideração as diferenças individuais de idade, peso, tamanho do tumor, extensão da infecção ou metástase e condição do paciente (sujeito). Pode-se geralmente afirmar que uma composição farmacêutica compreendendo as células T descritas neste documento pode ser administrada em uma dosagem de 102 a 1010 células/kg de peso corporal, de preferência 105 a 106 células/kg de peso corporal, incluindo todos os valores inteiros dentro esses intervalos. O número de células dependerá do uso final para o qual a composição se destina, assim como o tipo de células nela incluídas. Para usos fornecidos no presente documento, as células estão geralmente em um volume de um litro ou menos, e podem ser de 500 mLs ou menos, ainda 250 mLs ou 100 mLs ou menos. Portanto, a densidade das células desejadas é normalmente maior do que 106 células/ml e geralmente é maior do que 107 células/ml, geralmente 108 células/ml ou mais. O número clinicamente relevante de células imunes pode ser distribuído em múltiplas infusões que cumulativamente igualam ou excedem 105, 106, 107, 108, 109, 1010, 1011 ou 1012 células. Em alguns aspectos, particularmente, uma vez que todas as células infundidas serão redirecionadas para um determinado antígeno alvo, podem ser administrados números menores de células, na faixa de 106/quilograma (106-1011 por paciente). As composições de células que expressam CAR podem ser administradas várias vezes em dosagens dentro dessas faixas. As células podem ser alogênicas, singênicas, xenogênicas ou autólogas para o paciente em terapia. Se desejado, o tratamento também pode incluir a administração de mitógenos (por exemplo, PHA) ou linfocinas, citocinas e/ou quimiocinas (por exemplo, IFN-γ, IL-2, IL-12, TNF-alfa, IL-18 e TNF -beta, GM-CSF, IL-4, IL-13, Flt3-L, RANTES, MIP1α, etc.) conforme descrito no presente documento para aperfeiçoar a indução da resposta imunológica.
[0411] Geralmente, as composições que compreendem as células ativadas e expandidas conforme descritas no presente documento podem ser usadas no tratamento e prevenção de doenças que surgem em indivíduos que são imunocomprometidos. Em modalidades particulares, as composições compreendendo as células T modificadas com CAR contempladas neste documentos são usadas no tratamento do câncer. As células T modificadas com CAR podem ser administradas sozinhas ou como uma composição farmacêutica em combinação com transportadores, diluentes, excipientes e/ou com outros componentes, como IL-2 ou outras citocinas ou populações de células. Em modalidades particulares, as composições farmacêuticas compreendem uma quantidade de células T geneticamente modificadas, em combinação com um ou mais transportadores, diluentes ou excipientes farmaceuticamente ou fisiologicamente aceitáveis.
[0412] As composições farmacêuticas compreendendo uma população de células efetoras imunológicas que expressam CAR, como células T, podem compreender tampões, como solução salina tamponada neutra, solução salina tamponada com fosfato e semelhantes; carboidratos, tais como glicose, manose, sacarose ou dextranos, manitol; proteínas; polipéptidos ou aminoácidos, tais como glicina; antioxidantes; agentes quelantes como EDTA ou glutationa; adjuvantes (por exemplo, hidróxido de alumínio); e conservantes. As composições são formuladas de preferência para administração parenteral, por exemplo, administração intravascular (intravenosa ou intra-arterial), intraperitoneal ou intramuscular.
[0413] As composições farmacêuticas líquidas, sejam soluções, suspensões ou outra forma similare, podem incluir um ou mais dos seguintes: diluentes estéreis, tais como água para injeção, solução salina, de preferência soro fisiológico, solução de Ringer, cloreto de sódio isotônico, óleos fixos, tais como como mono ou diglicéridos sintéticos que podem servir como solvente ou meio de suspensão, polietilenoglicóis, glicerina, propilenoglicol ou outros solventes; agentes antibacterianos, tais como álcool benzílico ou parabeno de metila; antioxidantes, tais como ácido ascórbico ou bissulfito de sódio; agentes quelantes, tais como ácido etilenodiaminotetracético; tampões como acetatos, citratos ou fosfatos e agentes para o ajuste da tonicidade como cloreto de sódio ou dextrose. A preparação parentérica pode ser acondicionada em ampolas, seringas descartáveis ou frascos de dose múltipla feitos de vidro ou plástico. Uma composição farmacêutica injetável é preferencialmente estéril.
[0414] Em uma modalidade, as composições de células T contemplada neste documento são formuladas em um meio de cultura de células farmaceuticamente aceitável. Essas composições são adequadas para administração a pacientes humanos. Em modalidades particulares, o meio de cultura de células farmaceuticamente aceitável é um meio sem soro.
[0415] O meio sem soro tem várias vantagens sobre o meio contendo soro, incluindo uma composição simplificada e melhor definida, um grau reduzido de contaminantes, eliminação de uma fonte potencial de agentes infecciosos e custo mais baixo. Em várias modalidades, o meio sem soro é sem animais e pode, opcionalmente, ser sem proteínas. Opcionalmente, o meio pode conter proteínas recombinantes biofarmaceuticamente aceitáveis. Meio "sem animais" refere-se ao meio em que os componentes são derivados de fontes não animais. As proteínas recombinantes substituem as proteínas animais nativas em meio sem animais e os nutrientes são obtidos de fontes sintéticas, vegetais ou microbianas. O meio "sem proteínas", em contraste, é definido como substancialmente sem proteínas.
[0416] Exemplos ilustrativos de meios sem soro usados em composições particulares incluem, mas não estão limitados a, QBSF-60 (Quality Biological, Inc.), StemPro-34 (Life Technologies) e X-VIVO 10.
[0417] Em uma modalidade preferida, as composições compreendendo células efetoras imunológicas contempladas neste documento são formuladas em uma solução compreendendo PlasmaLyte A.
[0418] Em outra modalidade preferida, composições compreendendo células efetoras imunológicas contempladas neste documento são formuladas em uma solução compreendendo um meio de criopreservação. Por exemplo, meios de criopreservação com agentes de criopreservação podem ser usados para manter um resultado de alta viabilidade celular após o descongelamento. Exemplos ilustrativos de meios de criopreservação usados em composições particulares incluem, mas não estão limitados a, CryoStor CS10, CryoStor CS5 e CryoStor CS2.
[0419] Em uma modalidade mais preferida, composições compreendendo células efetoras imunológicas contempladas neste documento são formuladas em uma solução compreendendo 50:50 de PlasmaLyte A para CryoStor CS10.
[0420] Em uma modalidade particular, as composições compreendem uma quantidade eficaz de células efetoras imunológicas que expressam CAR, sozinhas ou em combinação com um ou mais agentes terapêuticos. Assim, as composições de células efetoras imunológicas que expressam CAR podem ser administradas sozinhas ou em combinação com outros tratamentos de câncer conhecidos, tais como radioterapia, quimioterapia, transplante, imunoterapia, terapia hormonal, terapia fotodinâmica, etc. As composições também podem ser administradas em combinação com antibióticos. Tais agentes terapêuticos podem ser aceitos na técnica como um tratamento padrão para um estado de doença particular, conforme descrito neste documento, tal como um câncer particular. Agentes terapêuticos exemplares contemplados em modalidades particulares incluem citocinas, fatores de crescimento, esteróides, NSAIDs, DMARDs, antiinflamatórios, quimioterápicos, radioterapêuticos, anticorpos terapêuticos ou outros agentes ativos e auxiliares.
[0421] Em certas modalidades, composições compreendendo células efetoras imunológicas que expressam CAR divulgadas neste documento podem ser administradas em conjunto com qualquer número de agentes quimioterápicos. Os exemplos ilustrativos de agentes quimioterapêuticos incluem agentes alquilantes, tais como tiotepa e ciclofosfamida (CYTOXAN™); sulfonatos de alquilo, tais como busulfano, improsulfano e piposulfano; aziridinas, tais como benzodopa, carboquona, meturedopa e uredopa; etileniminas e metilamelaminas incluindo altretamina, trietilenomelamina, trietilenofosforamida, trietilenotiofosforamida e resumo de trimetilolomelamina; mostardas de nitrogênio, tais como clorambucila, clornafazina, colofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, cloridrato de óxido de mecloretamina, melfalan, novembiquina, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostarda de uracila; nitrosureias, tais como carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina,
ranimustina; antibióticos, tais como aclacinomisinas, actinomicina, auttramicina, azasserina, bleomicinas, cactinomicina, caliqueamicina, carabicina, carminomicina, carzinofilina, cromomicinas, dactinomicina, daunorubicina, detorubicina, 6-diazo-5-oxo-L- norleucina, doxorubicina, epirubicina, esorubicina, idarubicina, marcelomicina, mitomicinas, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicinas, peplomicina, potfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorrubicina; antimetabólitos, tais como metotrexato e 5- fluorouracila (5-FU); análogos de ácido fólico, tais como denopterina, metotrexato, pteropterina, trimetrexato; análogos de purina, tais como fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina; anogos de pirimidina, tais como ancitabina, azacitidina, 6- azauridina, carmofur, citarabina, didesoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina, 5- FU; andrógenos, tais como calusterona, propionato de dromostanolona, epitiostanol, mepitiostano, testolactona; antiadrenais, tais como aminoglutetimida, mitotano, trilostano; reforçador de ácido fólico, tal como ácido frolínico; aceglatona; glicosídeo aldofosfamida; ácido aminolevulínico; amsacrina; bestrabucila; bisantreno; edatraxato; defofamina; demecolcina; diaziquona; elformitina; acetato de eliptínio; etoglucida; nitrato de gálio; hidroxiureia; lentinan; lonidamina; mitoguazona; mitoxantrona; mopidamol; nitracrina; pentostatina; fenameto; pirarrubicina; ácido podofilínico; 2-etil-hidrazida; procarbazina; PSK®; razoxano; sizofiran; spirogermanium; ácido tenuazônico; triaziquona; 2,2',2”- triclorotrietilamina; uretano; vindesina; dacarbazina; mannomustina; mitobronitol; mitolactol; pipobroman; gacitosina; arabinósido (“Ara-C”); ciclofosfamida; tiotepa; taxóides, por exemplo, paclitaxel, (TAXOL®, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.) e doxetaxel (TAXOTERE®., Rhne-Poulenc Rorer, Antony, França); clorambucila; gencitabina; 6-tioguanina; mercaptopurina; metotrexato; análogos de platina, tais como cisplatina e carboplatina; vinblastina; platina; etoposídeo (VP-16); ifosfamida; mitomicina C; mitoxantrona; vincristina; vinorelbina; umbigo; novantrona; teniposídeo; daunomicina; aminopterina; xeloda; ibandronato; CPT-11; inibidor de topoisomerase RFS 2000;
difluorometilomitina (DMFO); derivados do ácido retinóico, tais como Targretin™ (bexaroteno), Panretin™ (alitretinoína); ONTAK™ (denileucina diftitox); esperamicinas; capecitabina; e sais, ácidos ou derivados farmaceuticamente aceitáveis de qualquer um dos anteriores. Também incluídos nesta definição estão os agentes anti-hormonais que atuam para regular ou inibir a ação hormonal em cânceres, tais como antiestrogênios, incluindo, por exemplo, tamoxifeno, raloxifeno, 4(5)-imidazóis que inibem aromatase, 4- hidroxitamoxifeno, trioxifeno, ceoxifeno, LY117018, onapristona e toremifeno (Fareston); e antiandrógenos, tais como flutamida, nilutamida, bicalutamida, leuprolida e goserelina; e sais, ácidos ou derivados farmaceuticamente aceitáveis de qualquer um dos anteriores.
[0422] Uma variedade de outros agentes terapêuticos pode ser usada em conjunto com as composições descritas neste documento. Em uma modalidade, a composição compreendendo células efetoras imunológicas que expressam CAR é administrada com um agente anti-inflamatório. Os agentes ou medicamentos anti- inflamatórios incluem, mas não estão limitados a, esteróides e glucocorticóides (incluindo betametasona, budesonida, dexametasona, acetato de hidrocortisona, hidrocortisona, metilprednisolona, prednisolona, prednisona, triancinolona), medicamentos anti- inflamatórios não esteróides (AINEs), aspirina, ibuprofeno, naproxeno, metotrexato, sulfassalazina, leflunomida, medicamentos anti-TNF, ciclofosfamida e micofenolato.
[0423] Outros AINEs exemplares são escolhidos a partir do grupo que consiste em ibuprofeno, naproxeno, naproxeno sódico, inibidores de Cox-2, tais como VIOXX® (rofecoxib) e CELEBREX® (celecoxib) e sialilatos. Analgésicos exemplares são escolhidos a partir do grupo que consiste em acetaminofeno, oxicodona, tramadol de cloridrato de proporxifeno. Glucocorticóides exemplificativos são escolhidos a partir do grupo que consiste em cortisona, dexametasona, hidrocortisona, metilprednisolona, prednisolona ou prednisona. Modificadores de resposta biológica exemplares incluem moléculas direcionadas contra marcadores de superfície celular (por exemplo, CD4, CD5, etc.), inibidores de citocinas, tai scomo os antagonistas de TNF (por exemplo, etanercept
(ENBREL®), adalimumabe (HUMIRA®) e infliximabe (REMICADE®), inibidores de quimiocinas e inibidores de moléculas de adesão. Os modificadores da resposta biológica incluem anticorpos monoclonais, bem como formas recombinantes de moléculas. DMARDs exemplares incluem azatioprina, ciclofosfamida, ciclosporina, metotrexato, penicilamina, leflunomida, sulfasalazina, hidroxicloroquina, ouro (oral (auranofina) e intramuscular) e minociclina.
[0424] Exemplos ilustrativos de anticorpos terapêuticos adequados para combinação com as células T modificadas com CAR contempladas em modalidades particulares, incluem, mas não estão limitados a, atezolizumabe, avelumabe, bavituximabe, bevacizumabe (avastin), bivatuzumabe, blinatumomabe, conatumumabe, crizotinibe, daratumumabe, duligotumabe, dacetuzumabe, dalotuzumabe, durvalumabe, elotuzumabe (HuLuc63), gemtuzumabe, ibritumomabe, indatuximabe, inotuzumabe, ipilimumabe, lorvotuzumabe, lucatumumabe, milatuzumabe, moxetumomabe, nivolumabe, ocaratuzumabe, ofatumumabe, pembrolizumabe, rituximabe, siltuximabe, teprotumumabe, e ublituximabe.
[0425] Em certas modalidades, as composições descritas neste documento são administradas em conjunto com uma citocina. Por "citocina", conforme usado neste documento, entende-se um termo genérico para proteínas liberadas por uma população de células que atuam em outra célula como mediadores intercelulares. Exemplos de tais citocinas são linfoquinas, monocinas e hormônios polipeptídicos tradicionais. Incluídos entre as citocinas estão os hormônios do crescimento, tais como o hormônio do crescimento humano, o hormônio do crescimento humano N-metionila e o hormônio do crescimento bovino; hormônio da paratireóide; tiroxina; insulina; pró-insulina; relaxina; prorelaxina; hormonas glicoproteicas, tais como hormona estimulante do folulo (FSH), hormona estimulante da tireoide (TSH) e hormona luteinizante (LH); fator de crescimento hepático; fator de crescimento de fibroblasto; prolactina; lactogênio placentário; fator de necrose tumoral alfa e beta; substância inibidora de muller; peptídeo associado à gonadotropina de camundongo; inibina; activina; fator de crescimento endotelial vascular; integrina; trombopoietina (TPO); fatores de crescimento do nervo, tais como NGF-beta; fator de crescimento plaquetário; fatores de crescimento de transformação (TGFs), tais como TGF-alfa e TGF-beta; fator de crescimento semelhante à insulina-I e -II; eritropoietina (EPO); fatores osteoindutivos; interferons, tais como interferon alfa, beta e gama; fatores estimuladores de colônias (CSFs), tais como macrófago-CSF (M-CSF); granulócito-macrófago-CSF (GM-CSF); e granulócito-CSF (G-CSF); interleucinas (ILs), tais como IL-1, IL-1alfa, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12; IL- 15, um fator de necrose tumoral, tal como TNF-alfa ou TNF-beta; e outros fatores polipeptídicos incluindo LIF e kit ligante (KL). Conforme usado neste documento, o termo citocina inclui proteínas de fontes naturais ou de cultura de células recombinantes e equivalentes biologicamente ativos das citocinas de sequência nativa.
[0426] Em modalidades particulares, uma composição compreende células T CAR contempladas neste documento que são cultivadas na presença de um inibidor de PI3K conforme contemplado neste documento e expressam um ou mais dos seguintes marcadores: CD3, CD4, CD8, CD27, CD28, CD45RA, CD45RO, CD62L, CD127 e HLA- DR que podem ser ainda isolados por técnicas de seleção positiva ou negativa. Em uma modalidade, uma composição compreende uma subpopulação específica de células T, expressando um ou mais dos marcadores selecionados a partir do grupo que consiste em i) CD62L, CCR7, CD28, CD27, CD122, CD127, CD197; ii) CD62L, CD127, CD197, CD38; e iii) CD62L, CD27, CD127 e CD8, que são ainda isolados por técnicas de seleção positiva ou negativa. Em várias modalidades, as composições não expressam ou não expressam substancialmente um ou mais dos seguintes marcadores: CD57, CD244, CD160, PD-1, CTLA4, TIM3 e LAG3.
[0427] Em uma modalidade, a expressão de um ou mais dos marcadores selecionados a partir do grupo que consiste em CD62L, CD127, CD197 e CD38 é aumentada pelo menos 1,5 vezes, pelo menos 2 vezes, pelo menos 3 vezes, pelo menos
4 vezes, pelo menos 5 vezes, pelo menos 6 vezes, pelo menos 7 vezes, pelo menos 8 vezes, pelo menos 9 vezes, pelo menos 10 vezes, pelo menos 25 vezes ou mais em comparação com uma população de células T ativadas e expandidas sem um inibidor de PI3K.
[0428] Em uma modalidade, a expressão de um ou mais dos marcadores selecionados a partir do grupo que consiste em CD62L, CD127, CD27 e CD8 é aumentada pelo menos 1,5 vezes, pelo menos 2 vezes, pelo menos 3 vezes, pelo menos 4 vezes, pelo menos 5 vezes, pelo menos 6 vezes, pelo menos 7 vezes, pelo menos 8 vezes, pelo menos 9 vezes, pelo menos 10 vezes, pelo menos 25 vezes ou mais em comparação com uma população de células T ativadas e expandidas sem um inibidor de PI3K.
[0429] Em uma modalidade, a expressão de um ou mais dos marcadores selecionados a partir do grupo que consiste em CD57, CD244, CD160, PD-1, CTLA4, TIM3 e LAG3 é diminuída pelo menos 1,5 vezes, pelo menos 2 vezes, pelo menos 3 vezes, pelo menos 4 vezes, pelo menos 5 vezes, pelo menos 6 vezes, pelo menos 7 vezes, pelo menos 8 vezes, pelo menos 9 vezes, pelo menos 10 vezes, pelo menos 25 vezes ou mais em comparação com uma população de células T ativada e expandida com um inibidor PI3K. I. CÉLULAS ALVO E ANTÍGENOS
[0430] Células efetoras imunológicas geneticamente modificadas redirecionadas para uma célula alvo, por exemplo, célula cancerosa, e que compreendem CARs tendo um domínio de ligação que se liga a CD79A nas células alvo, são fornecidas em modalidades particulares. Conforme usado neste documento, o termo "câncer" refere-se geralmente a uma classe de doenças ou condições nas quais células anormais se dividem sem controle e podem invadir tecidos próximos
[0431] Conforme usado neste documento, o termo "maligno" refere-se a um câncer em que um grupo de células tumorais exibe um ou mais de crescimento descontrolado (isto é, divisão além dos limites normais), invasão (isto é, intrusão e destruição de tecidos adjacentes), e metástase (ou seja, disseminada para outros locais do corpo via linfa ou sangue). Conforme usado neste documento, o termo "metástase" refere-se à disseminação do câncer de uma parte do corpo para outra. Um tumor formado por células que se espalharam é chamado de "tumor metastático" ou "metástase". O tumor metastático contém células semelhantes às do tumor original (primário).
[0432] Conforme usado neste documento, o termo "benigno" ou "não maligno" refere-se a tumores que podem crescer maiores, mas não se espalham para outras partes do corpo. Os tumores benignos são autolimitados e normalmente não invadem ou metastizam.
[0433] Uma "célula cancerosa" refere-se a uma célula individual de um tecido ou crescimento canceroso. As células cancerosas incluem cânceres sólidos e cânceres líquidos. Um "tumor" ou "célula tumoral" refere-se geralmente a um inchaço ou lesão formada por um crescimento anormal de células, que podem ser benignas, pré-malignas ou malignas. A maioria dos cânceres forma tumores, mas os cânceres líquidos, por exemplo, leucemia, não necessariamente formam tumores. Para os cânceres que formam tumores, os termos câncer (célula) e tumor (célula) são usados alternadamente. A quantidade de um tumor em um indivíduo é a “carga tumoral”, que pode ser medida como o número, volume ou peso do tumor.
[0434] O termo “recaída” refere-se ao diagnóstico de retorno, ou sinais e sintomas de retorno, de um câncer após um período de melhora ou remissão.
[0435] “Remissão” também é conhecida como “remissão clínica” e inclui remissão parcial e completa. Na remissão parcial, alguns, mas não todos, sinais e sintomas do câncer desapareceram. Na remissão completa, todos os sinais e sintomas do câncer desapareceram, embora o câncer ainda possa estar no corpo.
[0436] "Refratário" refere-se a um câncer resistente ou não responsivo à terapia com um agente terapêutico específico. Um câncer pode ser refratário desde o início do tratamento (ou seja, não responsivo à exposição inicial ao agente terapêutico), ou como resultado do desenvolvimento de resistência ao agente terapêutico, seja durante o curso de um primeiro período de tratamento ou durante um período de tratamento subsequente.
[0437] Em uma modalidade, a célula alvo expressa um antígeno, por exemplo, um antígeno alvo que não é substancialmente encontrado na superfície de outras células normais (desejadas).
[0438] Em uma modalidade, a célula alvo é uma célula hematopoiética, uma célula linfóide ou uma célula mielóide.
[0439] Em certas modalidades, a célula alvo é parte do sangue, um tecido linfóide ou um tecido mielóide.
[0440] Em uma modalidade particular, a célula alvo é uma célula cancerosa ou uma célula-tronco cancerosa que expressa CD79A.
[0441] Em uma modalidade particular, a célula alvo é uma célula cancerosa líquida ou célula cancerosa hematológica que expressa CD79A.
[0442] Exemplos ilustrativos de cânceres líquidos ou hematológicos que podem ser prevenidos, tratados ou aprimorados com as composições contempladas em modalidades particulares incluem, mas não estão limitados a: leucemias, linfomas e mieloma múltiplo.
[0443] Exemplos ilustrativos de células que podem ser direcionados por CARs anti-CD79A contemplados em modalidades particulares incluem, mas não estão limitados àqueles das seguintes leucemias: leucemia linfocítica aguda (LLA), leucemia mieloide aguda (LMA), mieloblástica, promielocítica, mielomonocítica, monocítica, eritroleucemia, leucemia de células pilosas (LCP), leucemia linfocítica crônica (LLC) e leucemia mielóide crônica (LMC), leucemia mielomonocítica crônica (CMML) e policitemia vera.
[0444] Exemplos ilustrativos de células que podem ser direcionados pelas composições e métodos contemplados em modalidades particulares incluem, mas não estão limitados àqueles dos seguintes linfomas: linfoma de Hodgkin, linfoma de Hodgkin com predominância de linfócitos nodulares e linfoma não-Hodgkin, incluindo, mas não se limitando a Linfomas não-Hodgkin de células B: linfoma de Burkitt, linfoma linfocítico pequeno (LLP), linfoma difuso de grandes células B (LDGCB), linfoma folicular, linfoma imunoblástico de grandes células, linfoma linfoblástico B precursor e linfoma de células do manto; e linfomas não-Hodgkin de células T: micose fungóide, linfoma anaplásico de células grandes, síndrome de Sézary e linfoma linfoblástico T precursor.
[0445] Exemplos ilustrativos de células que podem ser direcionados pelas composições e métodos contemplados em modalidades particulares incluem, mas não estão limitados àqueles dos seguintes mielomas múltiplos: mieloma múltiplo evidente, mieloma múltiplo latente (MML), leucemia de células plasmáticas, mieloma não secretor, mieloma IgD, mieloma osteosclerótico, plasmocitoma ósseo solitário e plasmocitoma extramedular.
[0446] Em modalidades preferidas, a célula alvo que expressa CD79A é uma célula de câncer LDGCB. J. MÉTODOS TERAPÊUTICOS
[0447] As células efetoras imunológicas geneticamente modificadas contempladas neste documento fornecem métodos aprimorados de imunoterapia adotiva para uso na prevenção, tratamento e melhoria de cânceres que expressam CD79A ou para prevenir, tratar ou melhorar pelo menos um sintoma associado a um câncer que expressa CD79A.
[0448] Em várias modalidades, as células efetoras imunológicas geneticamente modificadas contempladas neste documento fornecem métodos aprimorados de imunoterapia adotiva para uso no aumento da citotoxicidade em células cancerosas que expressam CD79A em um paciente ou para uso na diminuição do número de células cancerosas que expressam CD79A em um paciente.
[0449] Em modalidades particulares, a especificidade de uma célula efetora imunológica primária é redirecionada para células que expressam CD79A, por exemplo, células cancerosas, modificando geneticamente a célula efetora imunológica primária com um CAR contemplado neste documento. Em várias modalidades, um vetor viral é usado para modificar geneticamente uma célula efetora imunológica com um polinucleotídeo particular que codifica um CAR compreendendo um domínio de ligação ao antígeno anti-CD79A que se liga a um polipeptídeo CD79A; um domínio de dobradiça; um domínio transmembranar (TM), um ligante oligo ou polipeptídico curto, que liga o domínio TM ao domínio de sinalização intracelular do CAR; e um ou mais domínios de sinalização coestimuladores intracelulares; e um domínio de sinalização primário.
[0450] Em uma modalidade, é fornecido um tipo de terapia celular em que as células T são geneticamente modificadas para expressar um CAR anti-CD79A direcionado às células cancerosas que expressam CD79A e a célula T CAR é infundida a um receptor em necessidade. A célula infundida é capaz de matar células causadoras de doenças no receptor. Ao contrário das terapias de anticorpos, as células T CAR são capazes de se replicar in vivo, resultando em persistência de longo prazo que pode levar a uma terapia sustentada do câncer.
[0451] Em uma modalidade, as células T CAR anti-CD79A podem sofrer expansão robusta de células T in vivo e podem persistir por um longo período de tempo. Em outra modalidade, as células T CAR anti-CD79A evoluem para células T de memória específicas ou células T de memória de células-tronco que podem ser reativadas para inibir qualquer formação ou crescimento tumoral adicional.
[0452] Em modalidades particulares, composições compreendendo células efetoras imunológicas compreendendo os CARs contemplados neste documento são usadas no tratamento de condições associadas com células cancerosas que expressam CD79A ou células-tronco cancerosas.
[0453] Exemplos ilustrativos de condições que podem ser tratadas, prevenidas ou melhoradas usando as células efetoras imunológicas compreendendo os CARs contemplados em modalidades particulares
[0454] Em uma modalidade particular, composições compreendendo células T modificadas por CAR contempladas neste documento são usadas no tratamento de cânceres líquidos ou hematológicos.
[0455] Em certas modalidades, o câncer líquido ou hematológico é selecionado a partir do grupo que consiste em: leucemias, linfomas e mielomas múltiplos.
[0456] Em certas modalidades, o câncer líquido ou hematológico é selecionado a partir do grupo que consiste em: leucemia linfocítica aguda (LLA), leucemia mieloide aguda (LMA), mieloblástica, promielocítica, mielomonocítica, monocítica, eritroleucemia, leucemia de células pilosas (LCP), leucemia linfocítica crônica (LLC) e leucemia mieloide crônica (LMC), leucemia mielomonocítica crônica (CMML) e policitemia vera, linfoma de Hodgkin, linfoma de Hodgkin com predomínio de linfócitos nodulares, linfoma de Burkitt, linfoma linfocítico pequeno (SLL), linfoma difuso de grandes células B, linfoma folicular, linfoma imunoblástico de grandes células, linfoma linfoblástico B precursor, linfoma de células do manto, linfoma de zona marginal, micose fungóide, linfoma anaplásico de grandes células, síndrome de Sézary, linfoma linfoblástico T precursor, mieloma múltiplo, mieloma múltiplo manifesto, mieloma múltiplo latente, leucemia de células plasmáticas, mieloma não secretor, mieloma IgD, mieloma osteosclerótico, plasmocitoma ósseo solitário e plasma extramedular citoma.
[0457] Em certas modalidades, o câncer líquido ou hematológico é selecionado a partir do grupo que consiste em: leucemia linfocítica aguda (LLA), leucemia linfocítica crônica (LLC), leucemia de células pilosas (LCP), mieloma múltiplo (MM), leucemia mieloide aguda (LMA) ou leucemia mieloide crônica (LMC).
[0458] Em modalidades preferidas, o câncer líquido ou hematológico é LDGCB.
[0459] Em modalidades preferidas, o câncer líquido ou hematológico é LDGCB de recaída/refratário.
[0460] Em modalidades particulares, métodos compreendendo a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de células efetoras imunológicas que expressam anti-CD79A CAR contempladas neste documento ou uma composição compreendendo as mesmas, a um paciente em necessidade, sozinhos ou em combinação com um ou mais agentes terapêuticos, são fornecidos. Em certas modalidades, as células são usadas no tratamento de pacientes em risco de desenvolver uma condição associada a células cancerosas que expressam CD79A. Assim, em modalidades particulares, métodos para o tratamento ou prevenção ou melhoria de pelo menos um sintoma de câncer compreendendo a administração a um paciente em necessidade de uma quantidade terapeuticamente eficaz das células modificadas com CAR contempladas neste documento.
[0461] Tal como usado neste documento, os termos "indivíduo" e "paciente" são frequentemente usados de forma intercambiável e referem-se a qualquer animal que exibe um sintoma de uma doença, distúrbio ou condição que pode ser tratada com os vetores de terapia gênica, terapêutica baseada em células e métodos contemplados em outro lugar neste documento. Em modalidades preferidas, um paciente inclui qualquer animal que exibe sintomas de uma doença, distúrbio ou condição relacionada ao câncer que pode ser tratada com os vetores de terapia gênica, terapêutica baseada em células e métodos contemplados em outro lugar neste documento. Sujeitos adequados (por exemplo, pacientes) incluem animais de laboratório (como camundongo, rato, coelho ou porquinho da índia), animais de fazenda e animais domésticos ou animais de estimação (como um gato ou cachorro). Primatas não humanos e, de preferência, pacientes humanos, estão incluídos. Indivíduos típicos incluem pacientes humanos que têm um câncer que expressa CD79A, foram diagnosticados com um câncer que expressa CD79A ou estão em risco ou tendo um câncer que expressa CD79A, por exemplo, LDGCB.
[0462] Conforme usado neste documento, o termo "paciente" refere-se a um sujeito que foi diagnosticado com uma doença, distúrbio ou condição específica que pode ser tratada com os vetores de terapia gênica, terapêutica baseada em células e métodos divulgados em outro lugar neste documento.
[0463] Conforme usado neste documento, "tratamento" ou "tratar" inclui qualquer efeito benéfico ou desejável sobre os sintomas ou patologia de uma doença ou condição patológica e pode incluir até mesmo reduções mínimas em um ou mais marcadores mensuráveis da doença ou condição sendo tratada. O tratamento pode envolver, opcionalmente, a redução da doença ou condição ou o retardo da progressão da doença ou condição. “Tratamento” não indica necessariamente a erradicação completa ou cura da doença ou condição, ou sintomas associados.
[0464] Conforme usado neste documento, "prevenir" e palavras semelhantes, como "prevenido", "prevenindo" etc., indicam uma abordagem para prevenir, inibir ou reduzir a probabilidade de ocorrência ou recorrência de uma doença ou condição. Também refere-se a retardar o início ou recorrência de uma doença ou condição ou retardar a ocorrência ou recorrência dos sintomas de uma doença ou condição. Conforme usado neste documento, "prevenção" e palavras semelhantes também incluem a redução da intensidade, efeito, sintomas e/ou carga de uma doença ou condição antes do início ou recorrência da doença ou condição.
[0465] Conforme usado neste documento, a frase "melhorando pelo menos um sintoma de" refere-se a diminuir um ou mais sintomas da doença ou condição para a qual o paciente está sendo tratado. Em modalidades particulares, a doença ou condição sendo tratada é um câncer, em que os um ou mais sintomas melhorados incluem, mas não estão limitados a, fraqueza, fadiga, falta de ar, hematomas e sangramentos fáceis, infecções frequentes, linfonodos aumentados, abdome distendido ou doloroso (devido a órgãos abdominais aumentados), dores nos ossos ou nas articulações, fraturas, perda de peso não planejada, falta de apetite, suores noturnos, febre leve persistente e diminuição da micção (devido à função renal comprometida)
[0466] Por “aperfeiçoar” ou “promover” ou “aumentar” ou “expandir” refere-se geralmente à capacidade de uma composição contemplada neste documento, por exemplo, uma célula T geneticamente modificada ou vetor que codifica um CAR, para produzir, provocar ou causar uma resposta fisiológica maior (ou seja, efeitos a jusante) em comparação com a resposta causada pelo veículo ou por uma molécula/composição de controle. Uma resposta fisiológica mensurável pode incluir um aumento na expansão das células T, ativação, persistência e/ou um aumento na capacidade de matar células cancerígenas, entre outros aparentes a partir do entendimento na técnica e da descrição contida no presente documento. Uma quantidade "aumentada" ou "aperfeiçoada" é normalmente uma quantidade "estatisticamente significativa" e pode incluir um aumento que é 1,1, 1,2, 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30 ou mais vezes (por exemplo, 500, 1000 vezes) (incluindo todos os números inteiros e casas decimais entre e acima de 1, por exemplo, 1,5, 1,6, 1,7. 1,8, etc.) a resposta produzida pelo veículo ou uma composição de controle.
[0467] Por “diminuir” ou “abaixar” ou “atenuar” ou “reduzir” ou “abater” refere-se geralmente à capacidade da composição contemplada neste documento para produzir, provocar ou causar uma resposta fisiológica menor (ou seja, efeitos a jusante) em comparação à resposta causada pelo veículo ou por uma molécula/composição de controle. Uma quantidade "diminuída" ou "reduzida" é normalmente uma quantidade "estatisticamente significativa" e pode incluir uma diminuição que é 1,1, 1,2, 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30 ou mais vezes (por exemplo, 500, 1000 vezes) (incluindo todos os números inteiros e casas decimais entre e acima de 1, por exemplo, 1,5, 1,6, 1,7. 1,8, etc.) a resposta (resposta de referência) produzida pelo veículo, uma composição de controle ou a resposta em uma linhagem celular particular.
[0468] Por "manter" ou "preservar" ou "manutenção" ou "sem alteração" ou "sem alteração substancial" ou "sem redução substancial" refere-se geralmente à capacidade de uma composição contemplada neste documento para produzir, provocar ou causar uma resposta fisiológica semelhante (ou seja, efeitos a jusante) em uma célula, em comparação com a resposta causada por qualquer veículo, uma molécula/composição de controle ou a resposta em uma linhagem celular particular. Uma resposta comparável é aquela que não é significativamente diferente ou mensurável diferente da resposta de referência.
[0469] Em uma modalidade, um método de tratamento de câncer em um paciente em necessidade compreende a administração de uma quantidade eficaz, por exemplo, uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição compreendendo células efetoras imunológicas geneticamente modificadas contempladas neste documento. A quantidade e a frequência de administração serão determinadas por fatores como a condição do paciente e o tipo e gravidade da doença do paciente, embora as dosagens apropriadas possam ser determinadas por ensaios clínicos.
[0470] Em uma modalidade, a quantidade de células efetoras imunológicas, por exemplo, células T, na composição administrada a um paciente é de pelo menos 0,1 x 105 células, pelo menos 0,5 x 105 células, pelo menos 1 x 105 células, pelo menos 5 x 105 células, pelo menos 1 x 106 células, pelo menos 0,5 x 107 células, pelo menos 1 x 107 células, pelo menos 0,5 x 108 células, pelo menos 1 x 108 células, pelo menos 0,5 x 109 células, pelo menos 1 x 109 células, pelo menos 2 x 109 células, pelo menos 3 x 109 células, pelo menos 4 x 109 células, pelo menos 5 x 109 células, ou pelo menos 1 x 1010 células.
[0471] Em modalidades particulares, cerca de 1 x 107 células T a cerca de 1 x 109 células T, cerca de 2 x 107 células T a cerca de 0,9 x 109 células T, cerca de 3 x 107 células T a cerca de 0,8 x 109 T células, cerca de 4 x 107 células T a cerca de 0,7 x 109 células T, cerca de 5 x 107 células T a cerca de 0,6 x 109 células T ou cerca de 5 x 107 células T a cerca de 0,5 x 109 células T são administrados a um sujeito.
[0472] Em uma modalidade, a quantidade de células efetoras imunológicas, por exemplo, células T, na composição administrada a um paciente é de pelo menos 0,1 x 104 células/kg de peso corporal, pelo menos 0,5 x 104 células/kg de peso corporal, pelo menos 1 x 104 células/kg de peso corporal, pelo menos 5 x 104 células/kg de peso corporal, pelo menos 1 x 105 células/kg de peso corporal, pelo menos 0,5 x 106 células/kg de peso corporal, pelo menos 1 x 106 células/kg de peso corporal, pelo menos 0,5 x 107 células/kg de peso corporal, pelo menos 1 x 107 células/kg de peso corporal, pelo menos 0,5 x 108 células/kg de peso corporal, pelo menos 1 x 108 células/kg de peso corporal, pelo menos 2 x 108 células/kg de peso corporal, pelo menos 3 x 108 células/kg de peso corporal, pelo menos 4 x 108 células/kg de peso corporal, pelo menos 5 x 108 células/kg de peso corporal, ou, pelo menos, 1 x 109 células/kg de peso corporal.
[0473] Em modalidades particulares, cerca de 1 x 106 células T/kg de peso corporal a cerca de 1 x 108 células T/kg de peso corporal, cerca de 2 x 106 células T/kg de peso corporal a cerca de 0,9 x 108 células T/kg de peso corporal, cerca de 3 x 106 células T/kg de peso corporal a cerca de 0,8 x 108 células T/kg de peso corporal, cerca de 4 x 106 células T/kg de peso corporal a cerca de 0,7 x 108 células T/kg de peso corporal, cerca de 5 x 106 células T/kg de peso corporal a cerca de 0,6 x 108 células T/kg de peso corporal, ou cerca de 5 x 106 células T/kg de peso corporal a cerca de 0,5 x 108 células T/kg de peso corporal são administradas a um sujeito.
[0474] Um técnico no assunto reconheceria que múltiplas administrações das composições contemplada neste documentos podem ser necessárias para efetuar a terapia desejada. Por exemplo, uma composição pode ser administrada 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 ou mais vezes ao longo de um período de 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 1 mês, 2 meses, 3 meses, 4 meses, 5 meses, 6 meses, 1 ano, 2 anos, 5, anos, 10 anos ou mais.
[0475] Em certas modalidades, pode ser desejável administrar células efetoras imunológicas ativadas a um paciente e, em seguida, recoletar sangue (ou ter uma aférese realizada), ativar células efetoras imunológicas a partir delas e reinfundir o paciente com essas células efetoras imunológicas ativadas e expandidas. Este processo pode ser realizado várias vezes a cada poucas semanas. Em certas modalidades, as células efetoras imunológicas podem ser ativadas a partir de coletas de sangue de 10 cc a 400 cc. Em certas modalidades, as células efetoras imunológicas são ativadas a partir de extrações de sangue de 20cc, 30cc, 40cc, 50cc, 60cc, 70cc, 80cc, 90cc, 100cc, 150cc, 200cc, 250cc, 300cc, 350cc ou 400cc ou mais. Para não ser limitado pela teoria, o uso deste protocolo de coleta múltipla de sangue/reinfusão múltipla pode servir para selecionar certas populações de células efetoras imunológicas.
[0476] A administração das composições contemplada neste documentos pode ser realizada de qualquer maneira conveniente, incluindo por inalação de aerossol, injeção, ingestão, transfusão, implantação ou transplante. Numa modalidade, as composições são administradas por via parentérica. As frases "administração parenteral" e "administrado parenteralmente", conforme usadas neste documento, referem-se a modos de administração diferentes da administração enteral e tópica, geralmente por injeção, e incluem, sem limitação, injeção intravascular, intravenosa, intramuscular, intraarterial, intratecal, intracapsular, intraorbital, intratumoral, intracardíaca, intradérmica, intraperitoneal, transtraqueal, subcutânea, subcuticular, intraarticular, subcapsular, subaracnoide, intraespinal e intraesternal e infusão. Em uma modalidade, as composições contempladas neste documentos são administradas a um paciente por injeção direta em um tumor, nódulo linfático ou sítio de infecção.
[0477] Em uma modalidade, um paciente em necessidade é administrado com uma quantidade eficaz de uma composição para aumentar uma resposta imunológica celular a uma condição relacionada à célula B no paciente. A resposta imunológica pode incluir respostas imunológicas celulares mediadas por células T citotóxicas capazes de matar células infectadas, células T reguladoras e respostas de células T auxiliares. As respostas imunológicas humorais, mediadas principalmente por células T auxiliares capazes de ativar células B, levando assim à produção de anticorpos, também podem ser induzidas. Uma variedade de técnicas pode ser usada para analisar o tipo de respostas imunológicas induzidas pelas composições, que são bem descritas na técnica; por exemplo, Current Protocols in Immunology, Editado por: John E. Coligan, Ada M.
Kruisbeek, David H. Margulies, Ethan M. Shevach, Warren Strober (2001) John Wiley & Sons, NY, N.Y.
[0478] No caso de morte mediada por células T, a ligação ligante de CAR inicia a sinalização para a célula T CAR, resultando na ativação de uma variedade de vias de sinalização de células T que induzem a célula T a produzir ou liberar proteínas capazes de induzir a apoptose de células alvo por vários mecanismos. Esses mecanismos mediados por células T incluem (mas não estão limitados a) a transferência de grânulos citotóxicos intracelulares da célula T para a célula-alvo, secreção de células T de citocinas pró-inflamatórias que podem induzir a morte de células-alvo diretamente (ou indiretamente via recrutamento de outras células efetoras exterminadoras) e a regulação positiva de ligantes do receptor de morte (por exemplo, FasL) na superfície da célula T que induz a apoptose da célula-alvo após a ligação ao seu receptor de morte cognato (por exemplo, Fas) na célula-alvo.
[0479] Em uma modalidade, um método de tratamento de um paciente diagnosticado com um câncer que expressa CD79A é fornecido, compreendendo a remoção de células efetoras imunológicas de um paciente diagnosticado com um câncer que expressa CD79A, modificando geneticamente as referidas células efetoras imunológicas com um vetor compreendendo um ácido nucleico que codifica um CAR contemplado aqui, produzindo assim uma população de células efetoras imunológicas modificadas e administrando a população de células efetoras imunológicas modificadas ao mesmo paciente. Em uma modalidade preferida, as células efetoras imunológicas compreendem células T.
[0480] Em certas modalidades, os métodos para estimular uma resposta de modulador imunológico mediada por células efetoras imunológicas a uma população de células alvo em um paciente são fornecidos, compreendendo as etapas de administração ao paciente de uma população de células efetoras imunológicas que expressa um construto de ácido nucleico que codifica uma molécula de CAR.
[0481] Os métodos para administrar as composições celulares contempladas em modalidades particulares incluem qualquer método que seja eficaz para resultar na reintrodução de células efetoras imunológicas geneticamente modificadas ex vivo que expressam diretamente um CAR no paciente ou na reintrodução dos progenitores geneticamente modificados de células efetoras imunológicas que na introdução em um paciente se diferenciam em células efetoras imunológicas maduras que expressam o CAR. Um método compreende a transdução de células T do sangue periférico ex vivo com um construto de ácido nucleico contemplado neste documento e o retorno das células transduzidas ao sujeito.
[0482] Todas as publicações, pedidos de patente e patentes emitidas citadas neste relatório descritivo são incorporadas no presente documento por referência como se cada publicação individual, pedido de patente ou patente emitida fosse especificamente e individualmente indicadas para serem incorporadas por referência.
[0483] Embora as modalidades anteriores tenham sido descritas com algum detalhe a título de ilustração e exemplo para fins de clareza de entendimento, será facilmente aparente para um técnico no assunto à luz dos ensinamentos contemplados no presente documento que certas mudanças e modificações podem ser feitas sem se afastar do espírito ou do escopo das reivindicações anexas. Os exemplos a seguir são fornecidos apenas a título de ilustração e não como forma de limitação. Os técnicos no assunto reconhecerão prontamente uma variedade de parâmetros não críticos que podem ser alterados ou modificados para produzir resultados essencialmente semelhantes.
EXEMPLOS EXEMPLO 1 CONSTRUÇÃO DE CARS ANTI-CD79A
[0484] CARs contendo anticorpos anti-CD79A scFv humanizados foram projetados para conter um promotor MND operacionalmente ligado a anti-CD79A scFv, um domínio de dobradiça e transmembrana de CD8α e domínios co-estimuladores de CD137 seguido pelo domínio de sinalização intracelular da cadeia CD3ζ. Os CARs anti- CD79A compreendem uma sequência de peptídeo sinal (PS) de CD8α para a expressão de superfície em células efetoras imunológicas. A Tabela 3 mostra a Identidade, Referência do Genbank, Nome da Fonte e Citação para os vários segmentos de nucleotídeos de um vetor lentiviral de CAR anti-CD79A exemplar. Sequências polipeptídicas de CAR CD79A exemplares são apresentadas em SEQ ID NOs: 25-30 e sequências polinucleotídicas de CAR CD79A exemplares são apresentadas em SEQ ID NOs: 31-36. TABELA 3. Referência Nome de Nucleotídeos Identidade Citação GenBank Origem Estrutura do Nº de Acesso New 1-185 plasmídeo L09137.2 pUC19 England pUC19 nt 1 - 185 Biolabs Não 185-222 Ligante Não aplicável Sintético aplicável (1994) 223-800 CMV Não aplicável pHCMV PNAS 91: 9564-68 Maldarelli, et.al. R, U5, PBS e Nº de Acesso (1991) 801-1136 sequências de M19921.2 pNL4-3 J Virol: 65 empacotamento nt 454-789 (11): 5732-43
Referência Nome de Nucleotídeos Identidade Citação GenBank Origem Códon de iniciação gag (ATG) alterado Não 1137-1139 Não aplicável Sintético para códon de aplicável terminação (TAG) Maldarelli, et.al.
Nº de Acesso Sequência gag (1991) 1140-1240 M19921.2 pNL4-3 de HIV-1 J Virol: 65 nt 793-893 (11): 5732-43 A sequência gag do HIV-1 Não 1241-1243 mudou para um Não aplicável Sintético aplicável segundo códon de terminação Maldarelli, et.al.
Nº de Acesso Sequência gag (1991) 1244-1595 M19921.2 pNL4-3 de HIV-1 J Virol: 65 nt 897-1248 (11): 5732-43 Maldarelli, et.al.
Nº de Acesso HIV-1 pol (1991) 1596-1992 M19921.2 pNL4-3 cPPT/CTS J Virol: 65 nt 4745-5125 (11): 5732-43 Malim, M.H.
HIV-1, região Nº de Acesso Nature 1993-2517 env isolada de M14100.1 PgTAT-CMV (1988) HXB3 (RRE) nt 1875-2399 335:181- 183 Maldarelli, et.al.
Nº de Acesso Sequências env (1991) 2518-2693 M19921.2 pNL4-3 de HIV-1 S/A J Virol: 65 nt 8290-8470 (11): 5732-43 Não 2694-2708 Ligante Não aplicável Sintético aplicável
Referência Nome de Nucleotídeos Identidade Citação GenBank Origem Haas et al.
Journal of Virology. 2709-3096 MNDU3 Não aplicável rSPA.mPro.MND 2003; 77 (17): 9439- 9450 Não 3097-3125 Ligante Não aplicável Sintético aplicável Não 3126-3188 Peptídeo sinal Sintético aplicável anti-CD79A Não variável Não aplicável Sintético ScFv aplicável Não 3927-3935 Ligante Não aplicável Sintético aplicável Milone et al (2009) Dobradiça Nº de Acesso 3936-4142 Sintético Mol Ther CD8a e TM NM_001768 17(8): 1453-64 Milone et Domínio de al (2009) Nº de Acesso 4143-4268 sinalização Sintético Mol Ther NM_001561 CD137 (4-1BB) 17(8): 1453-64 Milone et Domínio de al (2009) Nº de Acesso 4269-4607 sinalização Sintético Mol Ther NM_000734 CD3-ζ 17(8): 1453-64 Maldarelli, et.al.
Nº de Acesso HIV-1 ppt e (1991) 4608-4718 M19921.2 pNL4-3 parte do U3 J Virol: 65 nt 9005-9110 (11): 5732-43 Maldarelli, et.al.
HIV-1 parte de Nº de Acesso (1991) 4719-4835 U3 (deleção de M19921.2 pNL4-3 J Virol: 65 399bp) e R nt 9511-9627 (11): 5732-43
Referência Nome de Nucleotídeos Identidade Citação GenBank Origem Levitt, N. Genes & Dev 4836-4859 PolyA sintético Não aplicável Sintético (1989) 3: 1019- 1025 Não 4860-4878 Ligante Não aplicável Sintético aplicável 1 New Nº de Acesso England Estrutura 4879-7351 L09137.2 pUC19 Biolabs pUC19 nt 2636-2686 (em anexo) EXEMPLO 2 AVALIAÇÃO DE CÉLULAS T HUMANAS CAR ANTI-CD79A
[0485] Receptores de antígenos quiméricos (CARs) específicos para CD79A (por exemplo, SEQ ID NOs: 25, 27, 29 e 30) foram avaliados quanto à expressão de CAR e atividade biológica contra células que expressam CD79A.
EXPRESSÃO DO ANTÍGENO ALVO
[0486] Em um experimento, células K562, células Pfeiffer e células alvo Daudi foram interrogadas para a expressão de CD79A usando anticorpos anti-CD79A. As células foram incubadas com anticorpo CD79A e a expressão foi avaliada por citometria de fluxo. A expressão de CD79A não foi detectável em células K562, foi moderadamente expressa em células Pfeiffer e foi altamente expressa em células Daudi. Figura 1A.
[0487] Em outra experiência, a expressão de CD79A foi medida em células alvo Daudi, NU-DUL-1, SU-DHL-2 e Pfeiffer usando anticorpos anti-CD79A. As células foram incubadas com anticorpo CD79A e a expressão foi avaliada por citômetro de fluxo. A expressão de CD79A foi novamente mais alta em células Daudi, depois progressivamente menor em células NU-DUL-1, SU-DHL-2 e Pfeiffer. Figura 2A. EXPRESSÃO CAR ANTI-CD79A
[0488] As células T CAR foram produzidas usando um sistema diretamente escalonável para grandes processos de fabricação clínica. Resumidamente, células mononucleares de sangue periférico (CMSP) foram cultivadas em meio contendo IL-2 (CellGenix) e anticorpos específicos para CD3 e CD28 (Miltenyi Biotec). Lentivírus que codificam CARs anti-CD79A foram adicionados um dia após o início da cultura. As células T CAR anti-CD79A foram mantidas em fase log, adicionando meio fresco contendo IL-2 por um total de dez dias de cultura. No final da cultura, as células T CAR anti-CD79A foram interrogadas para expressão usando citometria de fluxo. Em um experimento, células T humanas primárias projetadas com lentivírus que expressam CARs anti-CD79A foram coradas com anti-camundongo de cabra (GaM) conjugado com biotina e detectado com estreptavidina conjugada com PE. Figura 1B. Em outro experimento, a expressão do CAR anti-CD79A em células T foi avaliada por coloração anti-camundongo de cabra (GaM) e a ligação do antígeno CD79A solúvel a células T CAR anti-CD79A foi avaliada por coloração com uma fusão de domínio extracelular de CD79a -Fc proteína marcada com ficoeritrina (PE). Figura 2B. Esses reagentes identificaram especificamente células T que expressam CARs anti-CD79A. ATIVIDADE DE CÉLULAS T CAR ANTI-CD79A DEPENDENTE DE
ANTÍGENO
[0489] Em um experimento, a atividade biológica de células T CAR anti-CD79A para linhas de células CD79A-positivas (Pfeiffer e Daudi) e CD79A-negativas (K562) foi avaliada usando um ensaio de liberação de interferon-gama (IFNγ). Células T CAR anti- CD79A foram co-cultivadas na ausência de células alvo ou com células K562 (CD79A-), células Pfeiffer (CD79A-baixo) e células Daudi (CD79A-alto) por 24 horas. As células T CAR anti-CD79A liberaram IFNγ apenas na presença de linhas de células positivas para CD79A. Figura 1C.
[0490] Em outro experimento, a atividade biológica de células T CAR anti-CD79A para linhas de células CD79A-positivas (Huh7.CD79A, Daudi, NU-DUL-1, SU-DHL-2 e
Pfeiffer) e CD79A-negativas (Huh7) foi avaliado usando um ensaio de liberação de interferon-gama (IFNγ). Células T CAR anti-CD79A foram co-cultivadas na ausência de células alvo (células T sozinhas) ou com células Huh7 (CD79A-), células Huh7.CD79a (CD79A+), células Daudi (CD79A+), NU-DUL-1 (CD79A+), SU-DHL-2 (CD79A +) ou células Pfeiffer (CD79A+). Figura 2C.
[0491] Em geral, nas reivindicações a seguir, os termos usados não devem ser interpretados para limitar as reivindicações às modalidades específicas divulgadas no relatório descritivo e nas reivindicações, mas devem ser interpretados de forma a incluir todas as modalidades possíveis juntamente com o escopo completo de equivalentes aos quais tais reivindicações têm direito. Por conseguinte, as reivindicações não são limitadas pela divulgação.

Claims (69)

REIVINDICAÇÕES
1. Receptor de antígeno quimérico (CAR), CARACTERIZADO por compreender: um domínio extracelular que compreende: a) um anticorpo anti-CD79A ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga a um ou mais epítopos de um polipeptídeo CD79A humano, em que o anticorpo anti-CD79A ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende uma sequência de cadeia leve variável compreendendo sequências de CDRL1- CDRL3 estabelecidas nas SEQ ID NOs: 1-3, 9-11 ou 17-19 e uma sequência de cadeia pesada variável compreendendo as sequências CDRH1-CDRH3 estabelecidas nas SEQ ID NOs: 4-6, 12-14 ou 20-22; b) um domínio transmembranar; c) um ou mais domínios de sinalização coestimuladores intracelulares; e d) um domínio de sinalização primário.
2. CAR, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO por o anticorpo anti-CD79A ou fragmento de ligação ao antígeno que se liga ao polipeptídeo CD79A humano ser selecionado do grupo que consiste em: um fragmento Fab', um fragmento F(ab')2, um dímero Fab biespecífico (Fab2), um trímero Fab triespecífico (Fab3), um Fv, uma proteína Fv de cadeia única ("scFv"), um bis-scFv, (scFv)2, um minicorpo, um diacorpo, um triacorpo, um tetracorpo, uma proteína Fv estabilizada por dissulfeto ("dsFv") e um anticorpo de domínio único (sdAb, Nanocorpo).
3. CAR, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2, CARACTERIZADO por o anticorpo anti-CD79A ou fragmento de ligação ao antígeno que se liga ao polipeptídeo CD79A humano ser um scFv.
4. CAR, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, CARACTERIZADO por o anticorpo anti-CD79A ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreender um ou mais CDRs de cadeia leve, conforme estabelecidos em qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-3 e/ou um ou mais CDRs de cadeia pesada,
conforme estabelecidos em qualquer uma das SEQ ID NOs: 4-6.
5. CAR, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, CARACTERIZADO por o anticorpo anti-CD79A ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreender um ou mais CDRs de cadeia leve, conforme estabelecidos em qualquer uma das SEQ ID NOs: 9-11 e/ou um ou mais CDRs de cadeia pesada, conforme estabelecidos em qualquer uma das SEQ ID NOs: 12-14.
6. CAR, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, CARACTERIZADO por o anticorpo anti-CD79A ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreender um ou mais CDRs de cadeia leve, conforme estabelecidos em qualquer uma das SEQ ID NOs: 17-19 e/ou um ou mais CDRs de cadeia pesada, conforme estabelecidos em qualquer uma das SEQ ID NOs: 20-22.
7. CAR, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, CARACTERIZADO por o anticorpo anti-CD79A ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreender uma sequência de cadeia leve variável, conforme estabelecida em qualquer uma das SEQ ID NOs: 7, 15 ou 23 e/ou uma sequência de cadeia pesada variável, conforme estabelecida em qualquer uma das SEQ ID NOs: 8, 16 ou 24.
8. CAR, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, CARACTERIZADO por o anticorpo anti-CD79A ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreender uma sequência de cadeia leve variável, conforme estabelecida na SEQ ID NO: 7 e/ou uma sequência de cadeia pesada variável, conforme estabelecida na SEQ ID NO: 8.
9. CAR, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, CARACTERIZADO por o anticorpo anti-CD79A ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreender uma sequência de cadeia leve variável, conforme estabelecida na SEQ ID NO: 15 e/ou uma sequência de cadeia pesada variável, conforme estabelecida na SEQ ID NO: 16.
10. CAR, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, CARACTERIZADO por o anticorpo anti-CD79A ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreender uma sequência de cadeia leve variável, conforme estabelecida na SEQ ID NO: 23 e/ou uma sequência de cadeia pesada variável, conforme estabelecida na SEQ ID NO: 24.
11. CAR, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, CARACTERIZADO por o domínio transmembranar estar isolado de um polipeptídeo selecionado a partir do grupo que consiste em: cadeia alfa ou beta do receptor de células T, CDδ, CD3ε, CDγ, CD3ζ, CD4, CD5, CD8α, CD9, CD 16, CD22, CD27, CD28, CD33, CD37, CD45, CD64, CD80, CD86, CD 134, CD137, CD152, CD154 e PD1.
12. CAR, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, CARACTERIZADO por o domínio transmembranar estar isolado de um polipeptídeo selecionado a partir do grupo que consiste em: CD8α, CD28, CD4, CD45, PD1 e CD152.
13. CAR, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, CARACTERIZADO por o domínio transmembranar estar isolado de CD8α.
14. CAR, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, CARACTERIZADO por um ou mais domínios de sinalização coestimuladores estarem isolados de uma molécula coestimuladora selecionada a partir do grupo que consiste em: TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9, TLR10, CARD11, CD2, CD7, CD27, CD28, CD30, CD40, CD54 (ICAM), CD83, CD134 (OX40), CD137 (4-1BB), CD278 (ICOS), DAP10, LAT, NKD2C, SLP76, TRIM e ZAP70.
15. CAR, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, CARACTERIZADO por o um ou mais domínios de sinalização coestimuladores estarem isolados de uma molécula coestimuladora selecionada a partir do grupo que consiste em: CD28, CD134 e CD137.
16. CAR, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, CARACTERIZADO por o um ou mais domínios de sinalização coestimuladores estarem isolados de CD137.
17. CAR, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16, CARACTERIZADO por o domínio de sinalização primário isolado de um polipeptídeo selecionado a partir do grupo que consiste em: FcRγ, FcRβ, CD3γ, CD3δ, CD3ε, CD3ζ, CD22, CD79a, CD79b e CD66d.
18. CAR, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 17, CARACTERIZADO por o domínio de sinalização primário estar isolado de um CD3ζ.
19. CAR, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 18, CARACTERIZADO por compreender ainda um polipeptídeo de região de dobradiça.
20. CAR, de acordo com a reivindicação 19, CARACTERIZADO por o polipeptídeo de região de dobradiça compreender uma região de dobradiça de CD8α.
21. CAR, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 20, CARACTERIZADO por compreender ainda uma região espaçadora.
22. CAR, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 21, CARACTERIZADO por compreender ainda um peptídeo sinal.
23. CAR, de acordo com a reivindicação 22, CARACTERIZADO por o peptídeo sinal compreender um polipeptídeo sinal de cadeia pesada de IgG1, um polipeptídeo sinal CD8α ou um polipeptídeo sinal alfa receptor GM-CSF humano.
24. CAR, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 23, CARACTERIZADO por compreender uma sequência de aminoácidos, conforme estabelecida em qualquer uma das SEQ ID NOs: 25 a 30.
25. CAR, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 24, CARACTERIZADO por compreender uma sequência de aminoácidos, conforme estabelecida na SEQ ID NO: 25.
26. CAR, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 24,
CARACTERIZADO por compreender uma sequência de aminoácidos, conforme estabelecida na SEQ ID NO: 26.
27. CAR, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 24, CARACTERIZADO por compreender uma sequência de aminoácidos, conforme estabelecida na SEQ ID NO: 27.
28. CAR, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 24, CARACTERIZADO por compreender uma sequência de aminoácidos, conforme estabelecida na SEQ ID NO: 28.
29. CAR, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 24, CARACTERIZADO por compreender uma sequência de aminoácidos, conforme estabelecida na SEQ ID NO: 29.
30. CAR, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 24, CARACTERIZADO por compreender uma sequência de aminoácidos, conforme estabelecida na SEQ ID NO: 30.
31. Polipeptídeo, CARACTERIZADO por compreender a sequência de aminoácidos do CAR, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 30.
32. Polinucleotídeo, CARACTERIZADO por codificar um CAR, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 31.
33. Polinucleotídeo, CARACTERIZADO por compreender uma sequência estabelecida em qualquer uma das SEQ ID NOs: 31-36.
34. Vetor, CARACTERIZADO por compreender o polinucleotídeo, conforme definido em qualquer uma das reivindicação 32 a 33.
35. Vetor, de acordo com a reivindicação 34, CARACTERIZADO por ser um vetor de expressão.
36. Vetor, de acordo com qualquer uma das reivindicações 34 a 35, CARACTERIZADO por ser um vetor epissomal.
37. Vetor, de acordo com qualquer uma das reivindicações 34 a 36,
CARACTERIZADO por ser um vetor viral.
38. Vetor, de acordo com qualquer uma das reivindicações 34 a 37, CARACTERIZADO por ser um vetor retroviral.
39. Vetor, de acordo com qualquer uma das reivindicações 34 a 38, CARACTERIZADO por ser um vetor lentiviral.
40. Vetor, de acordo com qualquer uma das reivindicações 34 a 39, CARACTERIZADO por ser um vetor lentiviral selecionado a partir do grupo que consiste essencialmente em: vírus da imunodeficiência humana 1 (HIV-1); vírus da imunodeficiência humana 2 (HIV-2), vírus visna-maedi (VMV); vírus da artrite- encefalite caprina (CAEV); vírus da anemia infecciosa equina (EIAV); vírus da imunodeficiência felina (FIV); vírus da imunodeficiência bovina (BIV); e vírus da imunodeficiência símia (SIV).
41. Vetor, de acordo com qualquer uma das reivindicações 34 a 39, CARACTERIZADO por compreender um LTR retroviral esquerdo (5'), um sinal de empacotamento Psi (Ψ), um trato central de polipurina/aba de DNA (cPPT/FLAP), um elemento de exportação retroviral; um promotor operacionalmente ligado ao polinucleotídeo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 32 a 33; e um LTR retroviral direito (3').
42. Vetor, de acordo com qualquer uma das reivindicações 34 a 41, CARACTERIZADO por compreender ainda uma sequência de poliadenilação heteróloga.
43. Vetor, de acordo com qualquer uma das reivindicações 34 a 41, CARACTERIZADO por compreender ainda um elemento regulador pós-transcricional do vírus da hepatite B (HPRE) ou elemento regulador pós-transcricional da marmota (WPRE).
44. Vetor, de acordo com qualquer uma das reivindicações 41 a 43, CARACTERIZADO por o promotor do LTR 5' ser substituído por um promotor heterólogo.
45. Vetor, de acordo com a reivindicação 44, CARACTERIZADO por o promotor heterólogo ser um promotor de citomegalovírus (CMV), um promotor do vírus do sarcoma de Rous (RSV) ou um promotor do vírus símio 40 (SV40).
46. Vetor, de acordo com qualquer uma das reivindicações 41 a 45, CARACTERIZADO por o LTR 5' ou LTR 3' ser um LTR de lentivírus.
47. Vetor, de acordo com qualquer uma das reivindicações 41 a 46, CARACTERIZADO por o LTR 3' compreender uma ou mais modificações.
48. Vetor, de acordo com qualquer uma das reivindicações 41 a 47, CARACTERIZADO por o LTR 3' compreender uma ou mais deleções.
49. Vetor, de acordo com qualquer uma das reivindicações 41 a 48, CARACTERIZADO por o LTR 3' ser um LTR de autoinativação (SIN).
50. Vetor, de acordo com qualquer uma das reivindicações 41 a 49, CARACTERIZADO por o promotor operacionalmente ligado ao polinucleotídeo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 32 a 33, ser selecionado a partir do grupo que consiste em: um promotor de gene precoce imediato de citomegalovírus (CMV), um promotor alfa do fator de alongamento 1 (EF1-α), um promotor de fosfoglicerato quinase-1 (PGK), um promotor de ubiquitina-C (UBQ-C), um acentuassomo de citomegalovírus/promotor de beta-actina de galinha (CAG), acentuassomo de polioma/promotor de timidina quinase herpes simplex (MC1), um promotor de beta actina (β-ACT), um promotor de vírus símio 40 (SV40) e um acentuassomo de vírus de sarcoma mieloproliferativo, região de controle negativa deletada, promotor U3 substituído pelo sítio de ligação do iniciador dl587rev (MND).
51. Célula efetora imunológica, CARACTERIZADA por compreender o vetor, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 34 a 50.
52. Célula efetora imunológica, de acordo com a reivindicação 51, CARACTERIZADA por ser selecionada a partir do grupo que consiste em: um linfócito
T, uma célula exterminadora natural (NK) e uma célula NKT.
53. Composição, CARACTERIZADA por compreender a célula efetora imunológica, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 51 a 52, e um excipiente fisiologicamente aceitável.
54. Método para gerar uma população de células efetoras imunológicas compreendendo um CAR, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 30, CARACTERIZADO por compreender introduzir em uma população de células efetoras imunológicas o polinucleotídeo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 32 a 33, ou o vetor, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 34 a 50.
55. Método, de acordo com a reivindicação 54, CARACTERIZADO por compreender ainda estimular as células efetoras imunológicas e induzir as células a proliferarem por meio do contato das células com anticorpos que se ligam a CD3 e anticorpos que se ligam a CD28; gerando assim uma população expandida de células efetoras imunológicas.
56. Método, de acordo com a reivindicação 54, CARACTERIZADO por as células efetoras imunológicas compreenderem células T, células NK e/ou células NKT.
57. Método, de acordo com a reivindicação 56, CARACTERIZADO por as células efetoras imunológicas compreenderem células T.
58. Método para aumentar a citotoxicidade em células cancerosas que expressam CD79A em um paciente, CARACTERIZADO por compreender administrar ao paciente uma quantidade da composição, conforme definida na reivindicação 53, suficiente para aumentar a citotoxicidade em células cancerosas que expressam CD79A, em comparação com a citotoxicidade das células cancerosas que expressam CD79A antes da administração.
59. Método para diminuir o número de células cancerosas que expressam CD79A em um paciente, CARACTERIZADO por compreender administrar ao paciente uma quantidade da composição, conforme definida na reivindicação 53, suficiente para diminuir o número de células cancerosas que expressam CD79A, em comparação com o número de células cancerosas que expressam CD79A antes da administração.
60. Método de tratamento de um câncer em um paciente em necessidade do mesmo, CARACTERIZADO por compreender administrar ao paciente uma quantidade de efeito terapêutico da composição, conforme definida na reivindicação
53.
61. Método, de acordo com a reivindicação 60, CARACTERIZADO por o câncer ser um câncer líquido.
62. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 60 a 61, CARACTERIZADO por o câncer ser uma malignidade hematológica.
63. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 60 a 62, CARACTERIZADO por o câncer ser linfoma não-Hodgkin, leucemia linfocítica aguda (LLA), leucemia linfocítica crônica (LLC), leucemia de células pilosas (LCP), mieloma múltiplo (MM), leucemia mieloide aguda (LMA), ou leucemia mieloide crônica (LMC).
64. Método, de acordo com a reivindicação 63, CARACTERIZADO por o linfoma não-Hodgkin ser linfoma de Burkitt, linfoma linfocítico pequeno (LLP), linfoma difuso de grandes células B (LDGCB), linfoma folicular (LF), linfoma de células do manto (LCM) ou linfoma da zona marginal (LZM).
65. Método, de acordo com a reivindicação 63, CARACTERIZADO por o linfoma não-Hodgkin ser linfoma difuso de grandes células B (LDGCB).
66. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 60 a 62, CARACTERIZADO por o câncer ser leucemia linfocítica aguda (LLA), leucemia linfocítica crônica (LLC), leucemia de células pilosas (LCP), mieloma múltiplo (MM), leucemia mieloide aguda (LMA), ou leucemia mieloide crônica (LMC).
67. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 60 a 62,
CARACTERIZADO por o câncer ser um MM selecionado a partir do grupo que consiste em: mieloma múltiplo evidente, mieloma múltiplo latente, leucemia de células plasmáticas, mieloma não secretor, mieloma IgD, mieloma osteosclerótico, plasmocitoma solitário de osso e plasmocitoma extramedular.
68. Método para melhorar um ou mais sintomas associados a um câncer que expressa CD79A em um paciente, CARACTERIZADO por compreender administrar ao paciente uma quantidade da composição, conforme definida na reivindicação 53, suficiente para melhorar pelo menos um sintoma associado a células cancerosas que expressam CD79A.
69. Método, de acordo com a reivindicação 68, CARACTERIZADO por um ou mais sintomas melhorados serem selecionados do grupo que consiste em: fraqueza, fadiga, falta de ar, hematomas e sangramento fáceis, infecções frequentes, linfonodos aumentados, abdômen distendido ou dolorido, dor no osso ou nas articulações, fraturas, perda de peso não planejada, falta de apetite, suores noturnos, febre moderada persistente e diminuição da micção.
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