KR20210021358A

KR20210021358A - 약제학적 피부과 조성물 및 그 용도

Info

Publication number: KR20210021358A
Application number: KR1020217000805A
Authority: KR
Inventors: 파르도 루이스 마리나스; 프리에토 마누엘 에르미다
Original assignee: 파르도 루이스 마리나스; 프리에토 마누엘 에르미다
Priority date: 2018-06-15
Filing date: 2019-06-14
Publication date: 2021-02-25
Also published as: US20210244767A1; JP2021528489A; EP3875097B1; EP3875097A1; AU2019287353A1; CN112584846A; CA3103043A1; EP3806872A1; US11413314B2; WO2019238952A1; MA52883A; US20210236560A1

Abstract

본 발명은, 세포수 측면에서 집단의 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99%가 카니스 속에 속하는 포유류로부터 수득된 MSC인 중간엽 기질 세포 (MSC) 집단을, 세포 배양을 위해 준비된 영양분 풍부 액체, 바람직하게는 MSC를 배양하기 위해 고안된 동물/인간 무혈청성 배지 또는 화학적으로 규정되는 동물/인간 무혈청성 및 이종-비함유성 배지, 바람직하게는 기본 배지에서 배양한 다음, 컨디셔닝화된 세포 배양 배지를 수집하는 것을 포함하는 방법에 의해 수득되거나 또는 수득가능한 컨디셔닝화된 세포 배양 배지를 포함하는, 치료에 사용하기 위한 조성물에 관한 것이다.

Description

약제학적 피부과 조성물 및 그 용도

본 발명은 발생학, 세포 생물학, 분자 생물학 및 유전학 기술 분야에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 카니스 (canis) 속에 속하는 포유류로부터 수득한 중간엽 줄기 세포로부터 컨디셔닝화된 배지를 수득하는 방법, 및 건선 또는 아토피성 피부염과 같은 피부 염증 장애를 치료하기 위한 이러한 배지의 용도에 관한 것이다.

피부는 면역학적으로 신체와 분리된 것으로 생각되었지만, 지금은 다기관성 염증 축에 필수적인 한 부분으로서 간주된다.

아토피성 피부염 (AD)과 건선은 특히 가장 심각한 형태일 경우, 다양한 전신성 염증 장애 및 동반 질환과 관련되어 있다. 이러한 동반 질환은, 유년기 염증성 피부 질환이 심각한 만성 다기관 질환이며, 단순한 미용학적 병태가 아니라는 것을, 부각시켜 준다.

아토피성 피부염의 동반 질환은 연령 및 질환에 걸린 기간에 따라 다양하다. 가장 일반적인 동반 질환들 중 일부는 Hanifin 및 Rajka (Acta Derm Venereol Suppl (Stockh) 1980;92:44-47)의 최적-표준 AD 진단 기준에 포함된다. 이러한 기준으로는 소양증, 만성 또는 재발성 피부염, 연령에 따른 특정한 분포 (예, 유년기 굴측 질환) 및 아토피의 개인력 및/또는 가족력, 즉 식품 알레르기, 천식 및 알레르기성 비결막염 등이 있다. 사소한 특징으로 심상어린선 (ichthyosis vulgaris); 박테리아 감염 및 바이러스 감염; 양성 면역글로불린 E 및 피부 단자 검사에 따른 알레르기성 소인; 백내장과 같은 안과 소견; 및 음식물 접촉, 압력 및 환경적인 촉발인자에 대한 과도한 피부 반응성 등의 십여가지 이상의 동반 병태를 포함한다. 이러한 주 기준과 부 기준이 실제 거의 40년간 명백해졌으며, 동반 질환 개념은 아토피성 피부염과 아토피성 체질을 정의하는 핵심이다.

최근, 소아 건선 및 아토피성 피부염은 피부 감염과 사회심리적 장애, 예를 들어 이와 관련된 어린이 및 부모의 불안, 우울증 및 과잉 행동과 연관되어 있다. 이들 양쪽 질환에서 백반증 및 원형 탈모 등의 피부성 자가면역이 두드러질 수도 있다.

이들 2가지 질환에서 공유되는 가장 중요하고 잘 확립된 일련의 동반 질환은 비만 및 대사 증후군 - 심장병, 뇌졸중 및 당뇨병 위험성 증가를 특징으로 하는 일군의 병태들과 관련되어 있다. 유아기 비만은 아토피성 피부염의 발병 및 심각성과 연관성이 있다. 건선의 경우, 질환이 발병하기 수년 전에 복부 둘레 증가 및 비만이 선행하여 발생할 수 있는데, 이는 질환의 촉발 인자로서의 역할을 시사해준다. 건선 질환에서 흥미로운 한가지 특징은 체중 감량 시술을 받았으며 건성 질환의 개선을 경험한 성인에서 나온 기대되는 데이터이다.

소아 아토피성 피부염 및 소아 건선은, 많은 공통적인 동반 질환들에도 불구하고, 다수의 독특한 특징들을 가지고 있다.

아토피성 피부염의 경우, 피부 장벽이 약하고 염증에 의해 약화되어, 일련의 독특한 알레르기성 특징들, 즉 아토피 행진 및 감염성 합병증이 발생할 수 있다. 또는, 건선의 경우, 피부의 비후화가 촉발되고, 관절에 염증이 생길 수 있다.

추가적인 차이는 임상 증상에서는 나타난다. 건선의 경우, 관절염은 연쇄구균 질환에 의해 때때로 촉발되는 주요 동반 질환이다. 또한, 고혈압, 고지혈증 및 인슐린 내성과 같은 대사 증후군 특징과 훨씬 더 명확한 연관성을 보인다. 건선의 공통적인 특성 및 질환의 빈도에도 불구하고, 아토피성 피부염은 유아 지루성 피부염, 말라세지아 감작 (Malassezia sensitization), 먼지 알레르기, 천식, 식품 알레르기, 환경 알레르겐, 접촉성 피부염 (예, 라놀린, 향료), 가려움발진 (prurigo), 수면 장애, 상부 호흡기 감염, 사마귀, 콕사키 일반화 (coxsackie generalization) (예, 콕사키 습진) 및 백내장 등의, 동반 질환 목록이 더 광범위하다.

여하튼, 건선 또는 아토피성 피부염과 같은 피부 염증 질환을 가진 모든 연령대의 환자를 스크리닝하는 도구와 효과적인 약리학적 개입을 개발하고자 하는 작업이 진행 중에 있으며, 오늘날 그 필요성은 더 절실해졌다. 이런 의미에서, 본 발명은, 건선 또는 아토피성 피부염과 같은 피부 염증 장애를 치료하는데 적합한 컨디셔닝화된 배지를 수득하기 위해 카니스 속에 속하는 포유류로부터 유래된 MSC (중간엽 줄기 세포)를 배양한, 컨디셔닝화된 배지의 사용을 제공한다. 특히, 본 발명에 개시된 조성물은 인간과 개 간의 높은 계통 발생학적 차이에도 불구하고 , 인간 아토피성 피부염을 이종적으로 치료 ( xenogeneic treatment)하는데 매우 효과적임이 부각된다는 점에서 중요하다 (도 7-9).

이와 관련하여, WO2008155659에서는 중간엽 줄기 세포 (MSC)로부터 유래된 컨디셔닝화된 세포 배지를 포함하는 피부 결함을 치료 또는 예방하기 위한 조성물을 개시하였다. 또한, 이 문헌에 따르면, MSC는 인간, 돼지, 개, 고양이, 마우스, 말 및 기타 포유류로부터 수득할 수 있다. 그러나, 이 문헌에는 "아토피성 피부염" 또는 "건선"이 구체적으로 언급된 것은 아니며, 이들 질환이 개로부터 수득된 중간엽 줄기 세포 (MSC) 유래의 컨디셔닝화된 세포 배지를 포함하는 조성물로 치료할 수 있는 것은 더더욱 아니다. 이런 의미에서, 본 발명의 실시예 2는, 여러가지 기원의 MSC가 정성 및 정량적인 관점에서 서로 다른 컨디셔닝화된 배지들을 제공한다는 것을, 보여준다. 실제, 도면 (도 1, 3 및 4와 비교해, 도 2)에 예시된 바와 같이, 개 지방세포 MSC로부터 유래된 컨디셔닝화된 배양 배지는 인간, 고양이 또는 말의 지방조직으로부터 수득된 컨디셔닝화된 배양 배지와 상당한 차이를 나타낸다. 다시 말해, WO2008155659에는 개 지방세포 MSC로부터 특이적으로 수득한 컨디셔닝화된 배양 배지가 인간에서 아토피성 피부염 및 건선과 같은 피부염을 효과적으로 치료하는데 특히 유용하다는 내용은 전혀 언급되어 있지 않다.

아울러, 본 발명이 바람직하게는 인간 아토피성 피부염의 이종적인 치료에 중점을 둔다는 점은, 다음과 같은 내용을 찾아볼 수 있는 WO2017041133과 같은 문헌에 비추어 명백하게도 반직관적이다: "지방조직은 개, 말 또는 고양이와 같은 인간 지방조직 또는 포유류 동물 지방조직일 수 있다. 전형적으로, 지방조직의 기원은 계획된 MSC 수용자와 동일한 종일 것이다..."

또한, Mohd Matin Ansari "당뇨병 랫의 상처 치유에 대한 개 유래 중간엽 줄기 세포 및 이의 컨디셔닝화된 배지의 치료학적 잠재성", Journal of stem cell research & therapy, vol. 3, no. 3, 1 January 2013 (2014-01-01), XP055406815는, 당뇨병 랫과 같은 여러가지 종들에서 랫 피부의 전층 절개로 생긴 상처를 치료함에 있어 개의 세포 또는 이의 컨디셔닝화된 배지의 잠재적인 효능을 기술하고 있다. 하지만, 아토피성 피부염 발진을 유발하는 피부 염증은 알레르기 반응의 한 유형으로 간주된다. 즉, Mohd Matin Ansari 문헌에서 언급된 상처 치료와 아토피성 피부염의 치료는 전혀 무관한 내용이다.

마지막으로, WO2017144552는 명백하게도 다이메틸 설폭사이드 (DMSO)를 반드시 포함하는 조성물에 관한 것으로, 실제 DMSO는 문헌에 상세히 언급된 질환들의 치료를 개선하므로, WO2017144552에서 필수적인 특징이다. 그러나, WO2017144552는, 특히 DMSO 비함유 조성물과 관련하여, 세포수 측면에서 집단의 50% 이상이 카니스 속에 속하는 포유류로부터 수득되는 중간엽 기질 세포인 MSC 집단을 배양하는 것을 포함하는 방법에 의해 수득하거나 또는 수득가능한 컨디셔닝화된 세포 배양 배지를 이용하는, 인간 아토피성 피부염 또는 건선에 대한 이종적인 치료에 대한 것이 아니다.

따라서, 본 발명은, 인지하는 한, 세포수 측면에서 집단의 50% 이상이 카니스 속에 속하는 포유류로부터 수득되는 중간엽 기질 세포인 MSC 집단을 배양하는 것을 포함하는 방법에 의해 수득하거나 또는 수득가능한 컨디셔닝화된 세포 배양 배지를 포함하는, 인간 아토피성 피부염의 이종적인 치료에 사용하기 위한, 조성물을 최초로 제공한다.

본 발명에 따르면, 줄기 세포를 이용하는 대신, MSC 대신 또는 MSC와 더불어, MSC로부터 나온 분비물을 적용함으로써, 내인성 조직 회복을 강화하여 손상된 또는 유실된 조직을 재생 또는 회복시킬 수 있다. 구체적으로, 본 발명자들은, 건선 또는 아토피성 피부염과 같은 피부 염증 장애를 치료하는데 적합한 컨디셔닝화된 배지를 수득하기 위해 카니스 속에 속하는 포유류로부터 유래된 MSC가 배양된, 컨디셔닝화된 배지의 용도를 제공한다.

구체적으로, 표 II에 (설명 참조), 카니스 속에 속하는 포유류 유래의 MSC에 의해 분비된 폴리펩타이드를, 고양이 또는 인간 유래 MSC 등의 다른 포유류로부터 분비되는 폴리펩타이드와 정성적으로, 정량적으로 비교하여 표시한다. 아울러, 본 명세서에 기술된 실시예에서는 카니스 속에 속하는 포유류로부터 유래된 MSC의 배양을 통해 수득한 컨디셔닝화된 배지의 사용과 관련된 치료학적 효과, 특히 아토피성 피부염 또는 건선 치료와 관련된 치료학적 효과를 보여준다.

이러한 접근 방식을 통해, 세포에 기반한 요법과 관련한 현재의 혼란스러운 논란들, 즉 면역 적합성, 종양 생성, 이종동물성 감염 (xenozootic infection), 비용 및 자가 세포 제제가 사용되는 경우에 대기 시간 문제가 해결될 것이다. 이러한 접근 방식은 저렴한 비용으로, 그리고 보다 나은 품질 관리와 일관성을 달성하면서, "기성품" MSC-기반의 치료제의 개발을 잠재적으로 제공할 수 있다.

본 발명의 실시는, 달리 언급되지 않은 한, 당해 기술 분야의 당업자의 능력 내에서 화학, 분자생물학, 미생물학, 재조합 DNA 및 면역학 등의 통상적인 기법을 채택할 것이다. 이러한 기법들은 문헌에 기술되어 있다. 예를 들어, J. Sambrook, E. F. Fritsch, and T. Maniatis, 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Books 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Ausubel, F. M. et al. (1995 and periodic supplements; Current Protocols in Molecular Biology, ch. 9, 13, and 16, John Wiley & Sons, New York, N. Y.); B. Roe, J. Crabtree, and A. Kahn, 1996, DNA Isolation and Sequencing: Essential Techniques, John Wiley & Sons; J. M. Polak and James O'D. McGee, 1990, Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, IrI Press; D. M. J. Lilley and J. E. Dahlberg, 1992, Methods of Enzymology: DNA Structure Part A: Synthesis and Physical Analysis of DNA Methods in Enzymology, Academic Press; Using Antibodies : A Laboratory Manual : Portable Protocol NO. I by Edward Harlow, David Lane, Ed Harlow (1999, Cold Spring Harbor Laboratory Press, ISBN 0-87969-544-7); Antibodies : A Laboratory Manual by Ed Harlow (Editor), David Lane (Editor) (1988, Cold Spring Harbor Laboratory Press, ISBN 0-87969-314-2), 1855; 및 Lab Ref: A Handbook of Recipes, Reagents, and Other Reference Tools for Use at the Bench, Edited Jane Roskams and Linda Rodgers, 2002, Cold Spring Harbor Laboratoiy, ISBN 0-87969-630-3을 참조한다. 이들 일반 문헌들 각각은 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.

이에, 본 발명의 일 측면은, 세포수 측면에서 집단의 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99%가 카니스 속에 속하는 포유류로부터 수득된 중간엽 기질 세포 (MSC) 또는 이로부터 수득된 불멸화 중간엽 기질 세포인, MSC 집단을, 세포 배양을 위해 준비된 영양분 풍부 액체, 바람직하게는 첨가제가 첨가 또는 비-첨가된 DMEM, MEM, RPMI 또는 HAM'S 등의 기본 배지, 예를 들어 혈청 함유 배지, 무혈청성 배지, 단백질 비함유 배지 및 화학적으로 규정되는 배지에서 배양한 다음, 컨디셔닝화된 세포 배양 배지를 수집하는 것을 포함하는, 방법에 의해 수득되거나 또는 수득가능한 컨디셔닝화된 세포 배양 배지를 포함하는, 요법에 사용하기 위한 조성물에 관한 것으로,

바람직하게는, 영양분 풍부 액체는 MSC를 배양하기 위해 고안된 동물 및 인간 무혈청성 배지이고,

바람직하게는, 상기한 조성물은 다이메틸 설폭사이드 (DMSO)를 포함하지 않는다.

특히 바람직하게는, 본 발명의 제1 측면에 따른 조성물은 전체적으로 인간 및 동물의 혈청 성분을 포함하지 않는다.

본 발명의 제1 측면에 대한 바람직한 구현예에서 또는 이의 바람직한 임의의 구현예에서, MSC는 개 종에 속하는 포유류로부터 수득된다.

본 발명의 제1 측면에 대한 다른 바람직한 구현예 또는 이의 임의의 바람직한 구현예에서, 중간엽 기질 세포는 전술한 임의 공급원으로부터 수득되는 탯줄 유래 기질 세포, 지방조직-유래 기질 세포, 증식된 중간엽 기질 세포, 증식된 지방조직-유래 기질 세포, 골수 유래 기질 세포, 증식된 골수 유래 기질 세포 또는 불멸화 중간엽 기질 세포이다.

본 발명의 제1 측면에 대한 다른 바람직한 구현예 또는 이의 임의의 바람직한 구현예에서, 세포 배양을 위해 준비된 영양분 풍부 액체는 소듐 피루베이트 및 글루타민이 첨가되고 아미노산 및 비타민을 포함하는, 완충 식염수이다. 바람직하게는, 세포 배양을 위해 준비된 영양분 풍부 액체는 첨가제가 첨가 또는 비-첨가된 기본 배지 DMEM, MEM, RPMI 또는 HAM'S, 예를 들어 혈청 함유 배지, 무혈청성 배지, 단백질 비함유 배지 및 화학적으로 규정된 배지이다.

본 발명의 제2 측면에서, 본 발명의 제1 측면에 따른 의학적 조성물은 인간 또는 동물 개체에서 피부염을 치료 또는 예방하는데 유용하다. 바람직하게는, 이러한 피부염은 아토피성 피부염, 습진 및 건선으로 이루어진 목록으로부터 선택된다. 더 바람직하게는, 본 발명의 제1 측면에 따른 의학적 조성물은 인간 개체에서 아토피성 피부염, 습진 및/또는 건선을 이종적으로 치료하기 위해 사용된다.

본 발명의 제3 측면은, 최적의 치료를 달성하기 위해 적절한 간격으로 컨디셔닝화된 배지를 필요한 양으로 전달하도록 구성될 수 있는, 본 발명의 제1 측면에 따른 의학적 조성물 또는 본 발명의 제2 측면에 따라 사용하기 위한 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 제3 측면에 대한 바람직한 구현예에서, 조성물은 부형제를 포함한다. 바람직한 부형제는 국소 조성물에 포함시키기에 적합한 부형제 (즉, 피부학적으로 허용가능한 부형제)이다. 아래 기술된 보조제들이 서로 독립적으로 조성물에 존재할 수 있다: 겔화제, 오일, 왁스, 점증제, 친수성 또는 소수성 폴리머, 유화성 물질, 연화제, 지방산, 유기 용매, 항산화제, 안정화제, 격리제, 산성화제, 염기성화제, 유화제, 연화제, 계면활성제, 막 형성제, 아미노산, 단백질, 바닐라, 알로에 추출물 또는 바이오플라비노이드와 같은 성능 및/또는 소비자 흥미를 높이기 위한 생물학적 첨가제, 완충제, 킬레이트제, 예를 들어 에틸렌다이아민테트라-아세트산 (EDTA) 또는 옥살산, 착색제, 염료, 추진제, 소포제, 습윤제, 비타민, 에멀젼 안정화제, pH 조절제, 증점제, 향료, 보존제, 불투명화제, 물 및/또는 알코올. 조성물에 대한 전술한 보조제들은 당해 기술 분야의 당업자가 인지하는 통상적인 양으로 사용된다. 본 조성물에 적합한 오일은 동물 오일 또는 식물 오일 또는 합성 오일로부터 선택된다. 특히 바람직한 오일은 액체 바셀린, 액체 파라핀, 휘발성 및 비-휘발성 실리콘 오일, 이소파라핀, 폴리알파올레핀, 플루오르화 (fluorated) 및 퍼플루오르화 (perfluorated) 오일을 포함하는 군으로부터 선택된다. 본 발명의 조성물에 적합한 안정화제는 비-이온성, 음이온성, 양이온성 및 양친매성 특성을 가진 것일 수 있다. 바람직한 안정화제는 폴리에틸렌글리콜 (PEG) 및 이의 유도체, 트윈, 트리톤, 스판, 폴리글리세린, 폴리알킬 글리세라이드, 알킬 설포네이트, 아릴 설포네이트, 알킬 포스페이트, 알킬-베타인의 유도체 및 포스파티딜글리세롤을 포함하는 군으로부터 선택된다.

본 발명의 제3 측면에 대한 다른 바람직한 구현예에서, 조성물은 개체, 바람직하게는 인간 개체에게, 다음과 같은 투여 경로들 중 임의의 경로를 통해 투여하기에 적합하다: 정맥내, 경구 및 국소. 본 발명의 제3 측면에 대한 바람직한 구현예에서, 본 발명의 조성물은 액체 또는 반고체 형태, 바람직하게는 액체, 유체, 폼, 크림, 젤, 페이스트, 발삼, 스프레이, 연고, 로션, 컨디셔너, 토닉, 밀크, 무스, 에멀젼, 세럼, 오일, 스틱, 샴푸, 젤리, 현탁액, 분산제, 락커, 페인트, 엘릭실제 (elixir), 점적제 또는 에어로졸로서 제형화될 수 있는 국소 제형이다. 특정 구현예에서, 본 발명의 활성 화합물은 리포좀 제제로 국소 투여된다.

도 1. 인간 지방세포 유래 중갑엽 줄기 세포로부터 컨디셔닝화된 배양 배지와 혼성화한, 인간 XL 사이토카인 어레이 좌표의 대표 이미지.
도 2. 개 지방세포 유래 중갑엽 줄기 세포로부터 컨디셔닝화된 배양 배지와 혼성화한, 인간 XL 사이토카인 어레이 좌표의 대표 이미지.
도 3. 고양이 지방세포 유래 중갑엽 줄기 세포로부터 컨디셔닝화된 배양 배지와 혼성화한, 인간 XL 사이토카인 어레이 좌표의 대표 이미지.
도 4. 말 지방세포 유래 중갑엽 줄기 세포로부터 컨디셔닝화된 배양 배지와 혼성화한, 인간 XL 사이토카인 어레이 좌표의 대표 이미지.
도 5. 개 컨디셔닝화된 배지로 치료받은 페키니즈 품종의 개. 사진은 4가지 시점에 상처 진행을 보여준다. 피부 러쉬 및 벗겨짐이 치료 중에 완화되어, 6주차에 완전 관해된다.
도 6. 개 컨디셔닝화된 배지로 치료받은 샤미즈 고양이. 사진은 치료 시작 시점과 5주차 치료 종료 시점에 상처의 경과를 보여준다. 상처의 크기가 비교 중첩에서 확인되는 바와 같이 감소하였다.
도 7. 개 컨디셔닝화된 배지로 치료받은 79세 남성 환자. 사진은 치료 지속 기간 35일 동안 다리와 손에서 건선으로 인한 상처의 경과를 보여준다. 피부 벗겨짐 및 딱지가 피부에서 현저하게 감소하였다.
도 8. 개 컨디셔닝화된 배지로 치료받은 37세 여성 환자. 사진은 치료 지속 기간 21일 동안 팔 및 발에서 건선으로 상처의 경과를 보여준다. 피부에서 벗겨짐 및 딱지 형성이 현저하게 감소하였다.
도 9. 개 컨디셔닝화된 배지로 치료받은 58세 남성 환자. 사진은 치료 지속 기간 36일 동안 다리 및 손에서 건선으로 상처의 경과를 보여준다. 피부에서 벗겨짐 및 딱지 형성이 없어졌다.

정의

본원에서, 하기 용어 및 표현들은 후술한 의미를 가질 것이다. 본원에 사용되는 모든 기술 용어 및 과학 용어들은, 달리 정의되지 않은 한, 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자들에게 통상적으로 이해되는 의미를 가진다.

관사 ("a" 및 "an")는 하나 또는 둘 이상 (즉, 하나 이상)의 문법적 대상을 나타낸다. 예를 들어, "요소 (an element)"는 요소 하나 또는 둘 이상의 요소를 의미한다.

용어 "약"은 수치 값에 대해 사용되는 경우 수치 값 ±10%를 의미한다.

"지방조직 (adipose tissue)"은 모든 지방 (fat) 조직을 의미한다. 지방조직은, 예를 들어, 피하, 장골/내장, 유선, 생식선 또는 기타 지방조직 부위에서 유래되는, 갈색 또는 백색 지방조직일 수 있다. 바람직하게는, 지방조직은 피하 백색 지방조직이다. 지방조직은 일차 세포 배양물 또는 불멸화 세포주를 포함할 수도 있다. 지방조직은 지방 조직을 가진 임의 유기체로부터 유래할 수 있다. 일부 구현예에서, 지방조직은 포유류 유래이고, 추가적인 구현예에서, 지방조직은 인간 유래이다. 지방조직의 편리한 공급원은 지방흡입 수술이다. 그러나, 지방조직의 공급원 또는 지방조직의 분리 방법이 본 발명에서 중요한 것은 아닌 것으로 이해될 것이다. 만일 본원에 기술된 세포를 개체 자신에게 이식하고자 한다면, 지방조직은 개체로부터 분리된다.

"지방조직-유래 기질 세포 (ASC)"는 MSC가 지방조직으로부터, 일반적으로 인간 지방조직 (hASC)으로부터 기원하는 것을 의미한다. 이러한 세포를 본 발명에서 본 발명을 재현하기 위해 사용하였다.

본원에서, 용어 "세포/kg"은 환자의 체중 kg 당 투여되는 세포 (예, MSC)의 수를 의미하는 것으로 이해하여야 한다.

용어 "배양"은 세포, 유기체, 다세포 개체 또는 조직을 배지에서 증식시키는 것을 의미한다. 용어 "배양하는"은 이러한 증식을 달성하는 모든 방법을 의미하며, 다단계를 포함할 수 있다. 용어 "추가적으로 배양하는"은 세포, 유기체, 다세포 개체 또는 조직을 특정 증식 단계까지 배양한 다음 다른 배양 방법을 이용해 세포, 유기체, 다세포 개체 또는 조직을 다른 증식 단계에 도달하게 하는 것을 의미한다. "세포 배양"은 세포의 시험관내 증식을 의미한다. 이러한 배양에서, 세포는 증식하지만, 자체적으로 조직을 형성하진 않는다. "조직 배양"은 구조 및 기능이 보존되도록 조직, 예를 들어 시험관내 원시 장기 또는 성체 장기의 외식편을 유지 또는 배양하는 것을 의미한다. "단층 배양"은 세포가 대부분 기판에 그리고 세포 간에 서로 붙은 상태로 적정 배지에서 증폭하는 배양을 의미한다. 또한, "현탁 배양"은 세포가 적정 배지에 현탁된 상태로 증폭하는 배양을 의미한다. 마찬가지로, "연속적인 유동 배양"은 세포 증식, 예를 들어 생존성을 유지하기 위해 연속적인 신선 배지 흐름 하에 세포 또는 외식편을 배양하는 것을 의미한다. 용어 "컨디셔닝화된 배지"는, 배지가 세포에 의해 생산되어 배양물로 분비된 특정 파라크린 및/또는 오토크린 인자를 포함하게 변형되도록, 배양된 세포와 일정 기간 동안 접촉시킨 후 수득한, 상층액, 예를 들어 배양된 세포/조직이 제거된 상층액을 지칭한다. "컨플루언트 배앙"은 모든 세포가 접촉된 상태로, 배양 용기의 전체 표면을 덮는, 세포 배양으로, 컨플루언스가 반드시 분열이 중지되거나 또는 집단이 크기 증가하지 않는다는 것을 의미하는 것은 아니지만, 세포가 최대 밀도에 도달하였음을 내포한다.

용어 "배양 배지" 또는 "배지"는 당해 기술 분야에서 인정되며, 일반적으로 살아있는 세포를 배양하는데 사용되는 임의 물질 또는 조제물을 지칭한다. 용어 "배지"는 세포 배양과 관련하여 사용되는 경우 세포를 둘러싼 환경적인 요소를 포함한다. 배지는 고체, 액체, 기체 또는 상과 물질의 혼합일 수 있다. 배지는 액체 배양 배지뿐 아니라 세포 증식을 지속시키지 않는 액체 배지를 포함한다. 배지는 또한 젤라틴성 배지, 예를 들어 아가, 아가로스, 젤라틴 및 콜라겐 매트릭스를 포함한다. 기체 배지의 예로는 페트리 디쉬 또는 기타 고체 또는 반고체 지지체 상에서 배양 중인 세포가 노출되는 기상을 포함한다. 용어 "배지"는 또한 심지어 세포와 접촉되지 않더라도 세포 배양에 사용하도록 의도된 물질을 지칭한다. 다시 말해, 박테리아 배양을 위해 준비된 영양분 풍부 액체는 배지이다. 마찬가지로, 물 또는 기타 액체와 혼합되었을 때 세포 배양에 적합해지는 분말 혼합물도 "분말 배지"로 지칭될 수 있다. "규정된 배지"는 화학적으로 규정된 (통상적으로 정제된) 성분들로 제조된 배지를 지칭한다. "규정된 배지"는 효모 추출물 및 비프 브로스와 같은 특정화가 충분하지 못한 생물학적 추출물은 포함하지 않는다. "풍부 배지"는 특정 종의 대부분 또는 모든 살아있는 형태의 증식을 뒷받침하도록 고안된 배지를 포함한다. 풍부 배지는 대개 복합 생물 추출물을 포함한다. 용어 "기본 배지"는 임의의 특수 영양분 첨가제가 필요없는 다수의 미생물 타입의 증식을 촉진하는 배지를 지칭한다. 대부분의 기본 배지는 일반적으로 4가지의 기본적인 화합물 군을 포함한다: 아미노산, 탄수화물, 무기염 및 비타민. 기본 배지는 일반적으로 혈청, 완충제, 성장인자, 지질 등과 같은 첨가제가 첨가된 더 복잡한 배지에 대한 토대로서 제공된다. 기본 배지의 예로는, 비-제한적으로, 이글스 기본 배지, 최소 필수 배지, 둘베코의 변형된 이글스 배지, Medium 199, 영양분 혼합물 햄의 F-10 및 햄의 F-12, 맥코이의 5 A, 둘베코의 MEM/F-I 2, RPMI 1640, 및 이스코브의 변형된 둘베코의 배지 등이 있다. 오리지널 제형이 문헌에 등장한 이후로 이글스 배지에 대한 다수의 변형 버전들이 개발되었다. 이러한 변형 배지들 중 가장 널리 사용되는 것은 둘베코의 변형된 이글스 배지 (DMEM)이다. DMEM은, 아미노산과 비타민을 4배 더 높은 농도로 포함하고 부가적인 보충 성분이 포함된, 기본 배지 이글 (BME)의 변형 버전이다. 오리지널 DMEM 제형은 글루코스 1000 mg/L을 포함하며, 처음에는 마우스 배아 세포를 배양하기 위한 용도로 발표되었다 (글루코스 저 농도 DMEM). 다른 변형 버전인 글루코스 4500 mg/L를 함유한 배지는 특정 세포 타입을 배양하는데 최적인 것으로 입증되었다 (글루코스 고 농도 DMEM). DMEM은 본 발명의 맥락에서 바람직한 기본 배지이다. 본 발명에서 언급되는 기본 배지는 이글스 기본 배지 또는 둘베코의 변형된 이글스 배지 (DMEM) 등의, MSC를 배양하기 위해 고안된 동물/인간 무혈청성 배지 또는 화학적으로 규정된 무혈청성 및 이종 비함유성 배지이다.

본 발명의 맥락에서, 동물 및 인간 무혈청성 배지는 동물 또는 인간으로부터 유래된 혈액 또는 혈청 성분을 포함하지 않은 배지로서 이해된다. 구체적으로, 알부민, 소 태아 혈청 또는 송아지 태아 혈청 등의 동물 또는 인간의 혈액에 존재하는 인간 또는 동물 단백질을 포함하지 않는 배지를 지칭한다 (즉, 배지는 동물 또는 인간-유래 혈액 또는 혈청 성분을 함유하지 않음). 동물 및 인간 무혈청성 배지의 일 예는 DMEM이다.

용어 "포함한다" 및 "포함하는"은 부가적인 요소가 포함될 수 있는 포괄적인, 열린 의미로 사용된다.

본원에서, 용어 "증식된 (expanded)"은 세포에 대해 사용되는 경우, 당해 기술 분야에서의 통상적인 의미로 간주되어야 하며, 즉 세포가 시험관내에서 증식되었음을 의미한다. MSC는, 표준 배양 조건에서, MSC의 한가지 이상의 생물학적 기능, 전형적으로 플라스틱 표면에의 부착성을 가진 세포 집단을 제공하기 위해 증식시킬 수 있다. 세포의 증식된 집단은 하나 이상의 세포 유형으로 분화할 수 있는 능력을 보유할 수 있다.

본원에서, 용어 "포함하여"는 "로는 비-제한적으로 등이 있다"를 의미한다. "포함하여" 및 "로는 비-제한적으로 등이 있다"은 상호 호환적으로 사용된다.

"중간엽 기질 세포 (본원에서 "MSC"로도 언급됨)는 다능성 기질 세포이며, 즉 여러가지 다른 유형의 세포가 될 수 있는 세포이다. 이러한 유형의 세포는 플라스틱 부착 증식 및 특정 배양 조건에서의 후속적인 증식에 의해, 그리고 시험관내 및 생체내 분화 잠재력에 의해 정의된다 (Caplan AI: Mesenchymal Stem Cells. J Orthop Res 1991, 9:641-650; Zuk PA, Zhu M, Mizuno H, Huang J, Futrell JW, Katz AJ, Benhaim AJ, Lorenz HP, Hedrick MH: Multi-lineage cells from human adipose tissue: implication for cell-based therapies. Tissue Eng 2001, 7:211-228; Huang JI, Beanes SR, Zhu M, Lorenz HP, Hedrick MH, Benhaim P: Rat extramedullary adipose tissue as a source of osteochondrogenic progenitor cells. Plast Reconstr Surg 2002, 109:1033-1041; Dennis JE, Caplan AI: Differentiation potential of conditionally immortalized mesenchymal progenitor cells from adult marrow of a H-2Kb-tsA58 transgenic mouse. J Cell Physiol 1996, 167(3):523-538; Johnstone B, Hering TM, Caplan AI, Goldberg VM, Yoo JU: In vitro chondrogenesis of bone marrow-derived mesenchymal progenitor cells. Exp Cell Res 1998, 238(1):265-272; Dennis JE, Merriam A, Awadallah A, Yoo JU, Johnstone B, Caplan AI: A quadricpotential mesenchymal progenitor cell isolated from the marrow of an adult mouse. J Bone Miner Res 1999, 14(5):700-709; Kopen GC, Prockop DJ, Phinney DG: Marrow stromal cells migrate throughout forebrain and cerebellum, and they differentiate into astrocytes after injection into neonatal mouse brains. Proc Natl Acad Sci USA 1999, 96:10711-10716; Toma C, Pittenger MF, Cahill KS, Byrne BJ, Kessler PD: Human mesenchymal stem cells differentiate to a cardiomyocyte phenotype in the adult murine heart. Circulation 2002, 105:93-98). MSC는 전술한 문헌들에 잘 알려져 있으며, 따라서 당해 기술 분야의 당업자에게 귀속되는 일반적인 상식의 일부를 형성한다.

MSC는 본 발명을 실시하기 위해 여러가지 포유류로부터 분리된다. 예를 들어, MSC는 골수 (Arnhold SJ, Goletz I, Klein H, Stumpf G, Beluche LA, Rohde C, Addicks K, Litzke LF. Isolation and characterization of bone marrow-derived equine mesenchymal stem cells. Am J Vet Res 2007, 68, 1095-1105; Kisiday JD, Kopesky PW, Evans CH, Grodzinsky AJ, McIlwraith CW, Frisbie DD. Evaluation of adult equine bone marrow- and adipose-derived progenitor cell chondrogenesis in hydrogel cultures. J Orthop Res 2008, 26, 322-33; Smith RKW, Korda M, Blunn GW, Goodship AE. Isolation and implantation of autologous equine mesenchymal stem cells from bone marrow into the superficial digital flexor tendon as a potential novel treatment. Equine Vet J 2003, 35, 99-102), 지방조직 (Vidal MA, Kilroy GE, Johnson JR, Lopez MJ, Moore RM, Gimble JM. Cell growth characteristics and differentiation frequency of adherent equine bone marrow-derived mesenchymal stromal cells: adipogenic and osteogenic capacity. Vet Surg 2006, 35, 601-610), 말초혈, 제대혈, 탯줄 매트릭스 및 양수를 포함하여, 다양한 말 조직으로부터 유래된다. 그러나, 본 발명은 개 MSC, 특히 골수 및 지방조직으로부터 분리된 개 MSC에 관한 것임에 유념한다. 이러한 개 MSC는 Hiroshi Takemitsu et al. Comparison of bone marrow and adipose tissue-derived canine mesenchymal stem cells. BMC Veterinary Research 2012, 8:150에 잘 기술되어 있다. 마지막으로, MSC는 인간에서 골수 및 지방조직으로부터 성공적으로 분리된 바 있다 (Caplan AI: Mesenchymal Stem Cells. J Orthop Res 1991, 9:641-650. Zuk PA, Zhu M, Mizuno H, Huang J, Futrell JW, Katz AJ, Benhaim AJ, Lorenz HP, Hedrick MH: Multi-lineage cells from human adipose tissue: implication for cell- based therapies. Tissue Eng 2001, 7:211-228. Huang JI, Beanes SR, Zhu M, Lorenz HP, Hedrick MH, Benhaim P: Rat extramedullary adipose tissue as a source of osteochondrogenic progenitor cells. Plast Reconstr Surg 2002, 109:1033-1041).

대상 방법에 의해 치료할 "환자", "개체" 또는 "숙주"는 인간 또는 인간이 아닌 동물을 의미할 수 있다.

용어 "약학적 조성물"은 인간 또는 동물 요법을 위한 것인 지와는 무관하게, 요법에 사용하도록 의도된 조성물을 지칭하며, 그래서 본 발명의 약학적 조성물 용어에는 수의학적 조성물이 포함된다. 본 발명의 조성물은 환자 또는 숙주를 치료하는데 사용하기 위해 의도된, 약학적 조성물이다.

"약제학적으로 허용가능한"이라는 표현은, 그러한 화합물, 물질, 조성물 및/또는 투약 형태가, 적절한 의학적 판단 범위 안에서, 합리적인 유익성/위해성 비율에 상응하게, 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응 또는 기타 문제나 합병증 없이, 인간 또는 동물의 조직과 접촉 사용하기에 적합하다는 것을 나타내기 위해 사용된다.

본원에서 "약제학적으로 허용가능한 담체"라는 표현은, 대상 화합물을 하나의 장기 또는 신체 부위에서 다른 장기 또는 신체 부위로 운반 또는 수송하는데 관여하는, 약제학적으로 허용가능한 물질, 조성물, 또는 비히클, 예를 들어 액체 또는 고체 충전제, 희석제, 부형제 또는 물질을 둘러싸는 용매를 의미한다. 각각의 담체는 제형의 다른 성분과 혼용가능하고 환자에게 무해하다는 점에서 "허용가능하"여야 한다.

본원에서, 용어 "용액"은 본 발명에서 사용되는 MSC가 생존한 상태로 잔류하는 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제를 포함한다.

MSC 집단과 관련하여 용어 "실질적으로 순수한"은 세포수 측면에서 적어도 약 50%, 60%, 70%, 75%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90% 또는 적어도 약 95%가 MSC인 세포 집단을 의미한다. 다시 말해, MSC 집단과 관련하여 용어 "실질적으로 순수한"은 계통 확정된 세포 (lineage committed cell)의 수가 약 50% 미만, 약 30% 미만, 약 20% 미만, 약 10% 미만 또는 약 5% 미만인 세포 집단을 의미한다. 본원에서 "지지체"는 지방조직-유래 기질 세포를 증식하는데 있어 토대 또는 매트릭스로서 제공할 수 있는 모든 기구 또는 물질을 지칭한다.

설명

본 발명의 제1 측면은, 세포수 측면에서 집단의 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99%가 카니스 속에 속하는 포유류로부터 수득된 중간엽 기질 세포 (MSC)인, MSC 집단을 세포 배양을 위해 준비된 영양분 풍부 액체, 바람직하게는 기본 배지에서 배양한 다음 컨디셔닝화된 세포 배양 배지를 수집하는 것을 포함하는 방법에 의해 수득되거나 또는 수득가능한 컨디셔닝화된 세포 배양 배지를 포함하는 요법에 사용하기 위한 조성물에 관한 것으로,

바람직하게는, 영양분 풍부 액체는 MSC를 배양하기 위해 고안된 동물 및 인간 무혈청성 배지이고, 바람직하게는, 상기한 조성물은 다이메틸 설폭사이드 (DMSO)를 포함하지 않는다.

본 발명의 MSC는 다른 세포로 분화할 수 있는 능력을 가진 미분화된 기질 세포이며, 전형적으로 결합 조직으로부터 유래되며, 따라서 비-조혈 세포이다. 용어 "결합 조직"은 중간엽으로부터 유래된 조직을 지칭하며, 세포외 매트릭스 내에 세포가 함유된 특징을 가진 수종의 조직을 포함한다. 여러가지 타입의 결합 조직들 중에서, 지방조직 및 연골 조직이 포함된다. 일 구현예에서, MSC는 지방조직의 기질 분획으로부터 유래된다. 다른 구현예에서, MSC는 연골 세포, 예를 들어 유리질 연골로부터 수득된다. 다른 구현예에서, MSC는 피부로부터 수득된다. 또한, 다른 구현예에서, MSC는 골수로부터 수득된다. MSC의 다른 공급원으로는 비-제한적으로 골막, 치수, 비장, 췌장, 인대, 힘줄, 골격근, 탯줄 및 태반 등이 있다. 기타 공급원으로는 유도된 만능성 줄기 세포 또는 배아 줄기 세포가 있다.

본 발명의 제1 측면에 따른 조성물을 수득하기 위해 사용되는 MSC는 카니스 속에 속하는 포유류로부터 수득된 것이고, 특히 이들 세포가 개 MSC이라는 점이 중요하다. 전형적으로, 개 MSC는 지방조직의 기질 분획으로부터 수득되며, 즉, 이것은 개 지방조직-유래 기질 세포 (ASC) 또는 이로부터 수득되는 불멸화 MSC이다. 개 MSC는 표준 배양 조건에서 플라스틱에 부착된다. 개 MSC는 중배엽 세포와 같은 체세포 (예, 지방세포, 연골 세포, 조골세포)로 또는 그 계통 방향으로, 선택적으로 내배엽 및/또는 외배엽 세포 타입 또는 계통으로 또는 그 계통 방향으로 분화할 수 있는 능력을 가진, 미분화된 다능성 세포이다. 전형적으로, 이 세포는 지방세포, 연골모세포 및 골모세포 계통으로 이루어진 군으로부터 선택되는 세포 타입들 중 적어도 2가지 또는 이들 모두로 또는 그 계통 방향으로 분화하는 능력을 가진다.

본 발명의 제1 측면에 대한 일 구현예에서, 개 MSC는 시험관내 배양 증식된 개 MSC 또는 이의 시험관내 배양 증식된 후대 (이하 둘다 증식된 MSC 또는 "eMSC"로 지칭함)이다. eMSC 준비 방법은 당해 기술 분야에, 예를 들어 WO2007039150에 공지되어 있다. eMSC는 MSC의 몇가지 표현형 특징을 가지며, 예를 들어 eMSC는 표준 배양 조건에서 플라스틱에 부착되며, 미분화된 표현형을 가진다.

eMSC는, 중배엽 세포와 같은 체세포로 분화하는 능력을 가진, 미분화된 다능성 세포이다. 반면, MSC는 비-제한적인 예로, 지방세포, 연골모세포 및 골모세포 계열 등의 한가지 이상의 특수 세포 계통으로 분화할 수 있는 능력을 가지고 있으며; 전형적으로, eMSC의 경우 이러한 분화력은 감소되거나, 또는 심지어 없을 수 있는데, 예를 들어 MSC는 적어도 골형성 계통 및 지방세포 계통으로 분화할 수 있는 반면, 이로부터 유래된 eMSC는 오직 지방세포 계통으로만 분화할 수 있다. 이런 점은, eMSC의 예측불가능하고 잠재적으로 유해한 분화가 발생할 가능성이 낮을 것으로 합리적으로 예상할 수 있는 바, 세포가 환자에게 투여될 수 있는 경우, 세포의 치료학적 용도에 유익할 수 있다.

일 구현예에서, 개 eMSC는 줄기 세포의 후대일 수 있다. 전형적으로, 개 eMSC는 (i) APC로부터 특이적인 마커를 발현하지 않으며; (ii) IDO를 구성적으로 발현하지 않으며, (iii) MHC II를 구성적으로 유의한 수준으로 발현하지 않는다. 전형적으로, IDO 또는 MHC II의 발현은 IFN-γ를 이용한 자극에 의해 유도할 수 있다.

아울러, 본 발명의 제1 측면에서 언급되는 세포 집단은 또한 "본 발명의 세포 집단"으로 언급됨에 또한 유념한다. 전형적으로, 개 MSC는 증식된 ASC, 전형적으로 동종이계 또는 자가 증식된 ASC이다. 전형적으로, 본 발명의 세포 집단은 동종의 또는 실질적으로 동종의 개 MSC 및/또는 eMSC 집단이다. 본 발명의 세포 집단은 기본적으로 개 MSC 및/또는 개 eMSC를 포함하지만, 본 발명의 세포 집단은 다른 세포 타입도 포함할 수 있다. 이에, 일 구현예에서, 본 발명은, 세포들 중 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99%가 개 MSC 및/또는 개 eMSC인, 본 발명의 세포 집단을 제공한다.

일 구현예에서, eMSC는 eASC, 예를 들어 인간 eASC이다. 특정 구현예에서, 세포는 치료할 개체에 대해 동종이계이다. 다른 특정 구현예에서, 세포는 치료할 개체에 대해 자가이다.

전형적으로, 본 발명의 세포 집단은 비-제한적인 예로, 지방세포, 연골모세포 및 골모세포 계통 등의 적어도 하나 이상의 특수 세포 계통으로 분화할 수 있는 능력을 가질 수 있다. 일 구현예에서, 본 발명의 세포 집단은 지방세포, 연골모세포 및 골모세포 계통으로 이루어진 군으로부터 선택되는 2가지 이상 또는 이들 모든 세포 타입으로 분화할 수 있는 능력을 가질 수 있다. 그러나, 대안적인 구현예에서, 이러한 분화 능력은 감소되거나 또는 심지어 없어질 수 있는데, 예를 들어 MSC는 적어도 골형성 계통 및 지방세포 계통으로 분화할 수 있는 반면, 이로부터 유래된 eMSC는 오직 지방세포 계통으로만 분화할 수 있다. 이런 점은, eMSC의 예측불가능하고 잠재적으로 유해한 분화가 발생할 가능성이 낮을 것으로 합리적으로 예상할 수 있는 바, 세포가 환자에게 투여될 수 있는 경우, 세포의 치료학적 용도에 유익할 수 있다.

본 발명의 제1 측면에서 참조되고 실시예에 예시된 바와 같이, 본 발명자들은 카니스 속에 속하는 포유류로부터 수득한 중간엽 줄기 세포 (MSC)의 배양을 통해 컨디셔닝화된 배지를 제공한다. 이러한 컨디셔닝화된 배지는 독특한 유전자 산물을 포함하여, 상기한 MSC에 의해 분비된 분자들을 포함한다. 이러한 컨디셔닝화된 배지, 및 특히 단백질 또는 폴리펩타이드 등의 이에 포함된 임의 분자들의 조합은, 질환을 치료하는데 이용할 수 있다. 이를 이용해, 예를 들어 질환의 치료 또는 예방 목적으로, MSC의 활성을 보충하거나 또는 그 대신 사용할 수 있다.

본 발명의 제1 측면에 따른 컨디셔닝화된 배지는 개 MSC를 세포 배양을 위해 준비된 영양분 풍부 액체, 바람직하게는 기본 배지와 같은 배지에서 미리 정해진 시간 동안 배양함으로써 만들 수 있으며; 여기서 영양분 풍부 액체는 바람직하게는 MSC를 배양하기 위해 고안된 동물 및 인간 무혈청성 배지이다. 컨디셔닝화된 배지는 따라서 실시예에 기술된 바와 같이 개 MSC에 의해 분비된 폴리펩타이드를 포함할 것이다.

바람직한 구현예에서, 무혈청성 배지는 넉아웃 DMEM 배지 (Invitrogen-Gibco, Grand Island, New York)를 포함한다.

전술한 설명에도 불구하고, 본 발명의 제1 측면에 따른 컨디셔닝화된 배지는 개 MSC를 증폭시키는데 적합한 임의 배지에 의해 제조할 수 있으며, 즉 수득되는 세포가 바람직한 특징을 가지고 추가적으로 증폭될 수 있는 한, 수종의 여러가지 임의 조성 (formula)을 가질 수 있다. 적합한 공급원은 다음과 같다: 둘베코의 변형된 이글스 배지 (DMEM), Gibco#l 1965-092; 넉아웃 둘베코의 변형된 이글스 배지 (KO DMEM), Gibco# 10829-018; 200 mM L-글루타민, Gibco# 15039-027; 비-필수 아미노산 용액, Gibco 11140-050; β-머캅토에탄올, Sigma#M7522; 인간 재조합 베이직 섬유모세포 성장인자 (bFGF), Gibco#13256-029. 예시적인 혈청-함유 배아 줄기 (ES) 배지는 80% DMEM (전형적으로 KO DMEM), 20% 규정된 소 태아 혈청 (FBS) (열 불활화되지 않음), 0.1 mM 비-필수 아미노산, 1 mM L-글루타민 및 0.1 mM β-머캅토에탄올로 제조된다. 배지는 여과하고, 4℃에서 2주 이하에서 보관한다. 무혈청성 배아 줄기 (ES) 배지는 80% KO DMEM, 20% 혈청 대체제, 0.1 mM 비-필수 아미노산, 1 mM L-글루타민 및 0.1 mM β-머캅토에탄올로 제조된다. 효과적인 혈청 대체제는 Gibco#10828-028이다. 배지는 여과하고, 4℃에서 2주 이하에서 보관한다. 사용 직전에 인간 bFGF를 최종 농도 4 ng/mL로 첨가한다 (Bodnar et al., Geron Corp, 국제 특허 공개공보 WO 99/20741).

바람직한 구현예에서, 배지는 10% 혈청 대체 배지 (Invitrogen- Gibco, Grand Island, New York), 5 ng/ml FGF2 (Invitrogen-Gibco, Grand Island, New York) 및 5 ng/ml PDGF AB (Peprotech, Rocky Hill, New Jersey)가 첨가된, 넉아웃 DMEM 배지 (Invitrogen-Gibco, Grand Island, New York)이다.

본 발명의 컨디셔닝화된 배지를 수득하기 위한 개 MSC의 배양 조건은 실시예 1에 명확하게 예시되어 있지만, 이 조건을 적절하게 최적화할 수 있다.

본 발명의 컨디셔닝화된 배지는 그대로 요법에 사용하거나, 또는 하나 이상의 처리 단계 후 요법에 사용할 수 있다. 예를 들어, 컨디셔닝화된 배지는 UV 처리하거나, 필터 살균 처리하거나 기타 처리할 수 있다. 하나 이상의 정제 단계를 이용할 수 있다.

특히, 컨디셔닝화된 배지는, 예를 들어 투석 또는 한외여과에 의해 농축할 수 있다. 예를 들어, 배지는 명목 분자량 한계 (NMWL), 예를 들어 3K의 멤브레인 한외여과를 사용해 농축할 수 있다.

또한, 본 발명은, 상기한 컨디셔닝화된 배지 대신 또는 이를 보충하기 위해, 실시예 1에 기술된 폴리펩타이드를 하나 이상, 바람직하게는 이들 모두를 포함하는 조성물을 제공한다.

본 발명에 따라 제조되는 바와 같은 중간엽 줄기 세포로부터의 컨디셔닝화된 배지 및 본원에 기술된 조성물은 다양한 상업적으로 중요한 연구, 진단 및 치료학적 목적으로 이용할 수 있다.

중간엽 줄기 세포로부터 유래된 컨디셔닝화된 배지는, 특히, 질환을 치료하기 위한 약학적 조성물을 제조하는데 이용할 수 있다. 이러한 질환은 피부 질환, 화상, 건선 또는 아토피성 피부염 등의 재생 요법에 의해 치료가능한 질환을 포함할 수 있다. 이런 의미에서, 본 발명에서는, 실시예에 나타낸 바와 같이, 개 MSC에 의해 배양 배지로 분리된 단백질을 분석한 바 (표 II 참조), 발현된 단백질이 혈관형성, 조혈 및 골격 발생 등의 조직 분화를 포함하여, 다수의 생물학적 과정에 관여하는 것으로, 확인하였다. 이에, 본 발명은, 일반적으로, 이러한 임의의 생물학적 과정을 조절하기 위한, 카니스 속에 속하는 포유류로부터 수득한 중간엽 줄기 세포 (MSC) 또는 카니스 속에 속하는 포유류로부터 수득한 중간엽 줄기 세포 (MSC)에 의해 컨디셔닝화된 배지의 용도를 제공한다.

아울러, 카니스 속에 속하는 포유류로부터 수득한 중간엽 줄기 세포 (MSC)는, 이들 생물학적 과정이 질환에서 역할을 하거나 또는 이의 회복 또는 치료에 이들 생물학적 과정들 중 임의의 하나 이상이 관여하는, 질환을 치료하기 위해 사용할 수 있다. 마찬가지로, 카니스 속에 속하는 포유류로부터 수득한 중간엽 줄기 세포 (MSC)에 의해 발현되는 단백질은, 단독으로 또는 조합하여, 바람직하게는 컨디셔닝화된 배지 형태로, 예를 들어 상기한 질환을 치료 또는 예방할 목적으로, 카니스 속에 속하는 포유류로부터 수득한 중간엽 줄기 세포 (MSC)의 활성을 보충하기 위해 사용하거나 또는 이를 대체하기 위해 사용할 수 있다.

즉, 상기한 컨디셔닝화된 배지를 사용해, 피부 상처, 피부 장애, 피부 병변, 피부염, 건선, 곤지름, 사마귀, 혈관종, 켈로이드, 피부암, 아토피성 피부염, 베체트병, 만성 육아종성 질환, T 세포성 피부 림프종 및 궤양을 치료할 수 있다. 구체적으로, 이러한 컨디셔닝화된 배지를 이용해 건선 또는 아토피성 피부염을 치료할 수 있다. 또한, 컨디셔닝화된 배지를 이용해 개체에서 상처 치유를 돕거나 또는 흉터 저하를 보조할 수 있다.

특히, 컨디셔닝화된 배지를 이용해, 혈관화, 조혈 (특히 면역 과정) 또는 근골격 발달 등에 관여하는 과정들을 조절할 수 있다.

바람직하게는, 이러한 컨디셔닝화된 배지 또는 이를 포함하거나 함유하는 조성물은 다이메틸 설폭사이드 ( DMSO )를 포함하지 않으며, 인간 개체에서 아토피성 피부염, 습진 및/또는 건선에 대한 이종적인 치료에 이용된다.

아울러, 컨디셔닝화된 배지 형태를 포함하여, 본원에 기술된 MSC로부터 분비되는 하나 이상의 임의의 단백질은, 본원에 기술된 MSC와 동일한 목적으로 사용할 수 있다. 이에, 본 발명은 컨디셔닝화된 배지에 존재하는 폴리펩타이드를 하나 이상, 바람직하게는 실질적으로 모두 포함하는 조성물을 제공한다. 특히, 본 발명은, 구체적으로 개의 지방조직으로부터 유래된 MSC 경우에, 표 II에 기술된 폴리펩타이드를 하나 이상, 바람직하게는 실질적으로 모두 포함하는 조성물을 제공한다.

이러한 조성물은 컨디셔닝화된 배지를 이용할 수 있는 모든 목적으로 활용할 수 있다. 문맥상 그렇지 않은 것으로 명시되지 않은 한, 용어 "컨디셔닝화된 배지"는 MSC에 노출된 세포 배양 배지뿐 아니라 컨디셔닝화된 배지에 존재하는 하나 이상의, 바람직하게는 실질적으로 모든 폴리펩타이드 (표 II 참조)를 포함하는 조성물을 포괄하는 것으로 간주하여야 한다.

본원에 기술된 방법 및 조성물은 중간엽 줄기 세포로부터 컨디셔닝화된 배지를 제조할 수 있음은 명백할 것이다. 따라서, 중간엽 줄기 세포의 임의 사용은 중간엽 줄기 세포로부터 컨디셔닝화된 배지를 동일하게 수반할 것이다.

본원에 기술된 컨디셔닝화된 배지는 임의의 적절한 수단에 의해 인간 또는 동물 신체에 전달할 수 있다.

이에, 본 발명에서는 본원에 기술된 컨디셔닝화된 배지를 표적 세포, 조직, 장기, 동물 신체 또는 인간 신체에 전달하기 위한 약학적 또는 코스메틱 조성물 또는 전달 시스템, 및 약학적 또는 코스메틱 조성물 또는 전달 시스템을 이용한 컨디셔닝화된 배지의 표적으로의 전달 방법을 기술한다. 전달 시스템은 컨디셔닝화된 배지를 함유한 용기 등의 컨디셔닝화된 배지의 공급원을 포함할 수 있다. 전달 시스템은 컨디셔닝화된 배지를 표적으로 분배하기 위한 분배기를 포함할 수 있다.

이에, 본 발명은 컨디셔닝화된 배지를 표적으로 전달하도록 작동가능한 분배기와 함께 본원에 기술된 컨디셔닝화된 배지의 공급원을 포함하는, 컨디셔닝화된 배지를 전달하기 위한 전달 시스템을 제공한다.

또한, 본 발명은 컨디셔닝화된 배지를 표적으로 전달하는 방법에서 상기한 전달 시스템의 용도를 제공한다.

유체를 신체에 전달하기 위한 전달 시스템은 당해 기술 분야에 공지되어 있으며, 주사, 외과적 드립 (surgical drip), 미국 특허 6,139,524에 기술된 바와 같은 카테터 (관류 카테터 등), 예를 들어 미국 특허 7,122,019에 기술된 바와 같은 약물 전달 카테터 등이 있다.

특정한 전달은 최적의 치료를 달성하기 위해, 적절한 간격으로 컨디셔닝화된 배지를 필요한 양만큼 전달하도록 구성되어야 함은 자명할 것이다. 컨디셔닝화된 배지의 바람직한 전달 또는 투여는 국소 전달 또는 투여이다. 이를 위해, 조성물 또는 전달 시스템은 부형제를 포함할 수 있다. 부형제는 본원에서 정의되는 바와 같이 조성물에 포함된 컨디셔닝화된 배지에 대한 담체 또는 비히클로서 사용되는 비활성 물질이다. 본 발명의 조성물은 임의의 부형제, 바람직하게는 국소 조성물에 함유시키기에 적합한 부형제 (즉, 피부과적으로 허용가능한 부형제)를 포함할 수 있다. 상기에서 언급된 다음과 같은 보조제도 서로 독립적으로 본 발명의 조성물에 존재할 수 있다: 겔화제, 오일, 왁스, 점증제, 친수성 또는 소수성 폴리머, 유화성 물질, 연화제, 지방산, 유기 용매, 항산화제,안정화제, 격리제, 산성화제, 염기성화제, 유화제, 연화제, 계면활성제, 막 형성제, 아미노산, 단백질, 바닐라, 알로에 추출물 또는 바이오플라비노이드와 같은 성능 및/또는 소비자 흥미를 높이기 위한 생물학적 첨가제, 완충제, 킬레이트제, 예를 들어 에틸렌다이아민테트라-아세트산 (EDTA) 또는 옥살산, 착색제, 염료, 추진제, 소포제, 습윤제, 비타민, 에멀젼 안정화제, pH 조절제, 증점제, 향료, 보존제, 불투명화제, 물 및/또는 알코올. 조성물에 대한 전술한 보조제들은 당해 기술 분야의 당업자가 인지하는 통상적인 양으로 사용된다. 조성물에 적합한 오일은 동물 오일 또는 식물 오일 또는 합성 오일로부터 선택된다. 특히 바람직한 오일은 액체 바셀린, 액체 파라핀, 휘발성 및 비-휘발성 실리콘 오일, 이소파라핀, 폴리알파올레핀, 플루오르화 (fluorated) 및 퍼플루오르화 (perfluorated) 오일을 포함하는 군으로부터 선택된다. 본 발명의 조성물에 적합한 안정화제는 비-이온성, 음이온성, 양이온성 및 양친매성 특성을 가진 것일 수 있다. 바람직한 안정화제는 폴리에틸렌글리콜 (PEG) 및 이의 유도체, 트윈, 트리톤, 스판, 폴리글리세린, 폴리알킬 글리세라이드, 알킬 설포네이트, 아릴 설포네이트, 알킬 포스페이트, 알킬-베타인의 유도체 및 포스파티딜글리세롤을 포함하는 군으로부터 선택된다.

유화제는 본 발명의 조성물에 조성물의 구성성분들의 균일한 블렌딩을 제공하는데 효과적인 양으로 사용될 수 있다. 적합한 유화제로는 음이온성 (anionics), 예를 들어 지방산 솝 (fatty acid soap), 예를 들어, 포타슘 스테아레이트, 소듐 스테아레이트, 암모늄 스테아레이트 및 트리에탄올아민 스테아레이트; 지방산 솝을 함유한 폴리올 지방산 모노에스테르, 예를 들어, 포타슘 또는 소듐 염을 함유한 글리세롤 모노스테아레이트; 설푸릭 에스테르 (소듐 염), 예를 들어, 소듐 라우릴 5 설페이트 및 소듐 아세틸 설페이트; 및 설푸릭 에스테르를 함유한 폴리올 지방산 모노에스테르, 예를 들어, 소듐 라우릴 설페이트를 함유한 글리세릴 모노스테아레이트; (ii) 양이온성 (cationics) 클로라이드, 예를 들어 N(스테아로일 콜라미노 포르밀메틸)피리듐; N-soya-N-에틸 모르폴리늄 에토설페이트; 알킬 다이메틸 벤질 암모늄 클로라이드; 다이이소부틸페녹시에톡시에틸 다이메틸 벤질 암모늄 클로라이드; 및 아세틸 피리듐 클로라이드; 및 (iii) 비이온성 (nonionics), 예를 들어 폴리옥시 에틸렌 지방 알코올 에테르, 예를 들어, 모노스테아레이트; 폴리옥시 에틸렌 라우릴 알코올; 폴리옥시프로필렌 지방 알코올 에테르, 예를 들어, 프로폭시화된 올레일 알코올; 폴리옥시에틸렌 지방산 에스테르, 예를 들어, 폴리옥시에틸렌 스테아레이트; 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르, 예를 들어, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노스테아레이트; 소르비탄 지방산 에스테르, 예를 들어, 소르비탄; 폴리옥시에틸렌 글리콜 지방산 에스테르, 예를 들어, 폴리옥시에틸렌 글리콜 모노스테아레이트; 및 폴리올 지방산 에스테르, 예를 들어, 글리세릴 모노스테아레이트 및 프로필렌 글리콜 모노스테아레이트; 및 에톡시화된 라놀린 유도체, 예를 들어, 에톡시화된 라놀린, 에톡시화된 라놀린 알코올 및/또는 에톡시화된 콜레스테롤 등이 있다.

연화제는 본 발명의 조성물에 건조한 상태를 방지 또는 완화하기 위한 양으로 사용될 수 있다. 적절한 연화제로는, 비-제한적으로 탄화수소 오일 및 왁스; 실리콘 오일; 트리글리세라이드 에스테르; 아세토글리세라이드 에스테르; 에톡시화된 글리세라이드; 알킬 에스테르; 알케닐 에스테르; 지방산; 지방 알코올; 지방 알코올 에테르; 에테르에스테르; 라놀린 및 유도체; 다가 알코올 (폴리올) 및 폴리에테르 유도체; 다가 알코올 (폴리올) 에스테르; 왁스 에스테르; 밀랍 유도체; 식물성 왁스; 인지질; 스테롤; 및/또는 아미드 등이 있다.

본 발명의 조성물에 계면활성제도 추가적으로 사용될 수 있다. 적절한 계면활성제로는, 예를 들어, 클리닝제, 유화제, 거품 촉진제 (foam booster), 친수제 (hydrotrope), 가용화제, 현탁화제 및 액체내 고체의 분산을 촉진하는 비-계면활성제가 있다.

본 발명의 조성물에 바람직하게는 사용될 수 있는 막 형성제는 본 발명의 조성물을 매끄럽고 평탄하게 유지시켜야 하며, 바람직하게는 이로 제한되진 않는다. 적절한 막 형성제는 아크릴아미드/소듐 아크릴레이트 코폴리머; 암모늄 아크릴레이트 코폴리머; 발삼 페루 (Balsam Peru); 셀룰로스 검; 에틸렌/말레 무수물 코폴리머; 하이드록시에틸셀룰로스; 하이드록시프로필셀룰로스; 폴리아크릴아미드; 폴리에틸렌; 폴리비닐 알코올; pvm/MA 코폴리머 (비닐 메틸 에테르/말레익 안하이드라이드 코폴리머); PVP (폴리비닐피롤리돈); 말레 무수물 폴리머, 비닐피롤리돈/헥사데센 코폴리머; 아크릴릭 아크릴레이트 코폴리머 등을 포함하는 군으로부터 선택된다. pH 조절제 역시 본 발명의 조성물에 사용될 수 있다. 이러한 pH 조절제는 바람직하게는 암모늄 하이드록사이드, 트리에탄올아민 또는 구연산으로부터 선택된다.

본 발명의 조성물에 사용되는 증점제는 바람직하게는 칸델릴라 (candelilla), 카나우바 및 미세결정 왁스, 가교된 아크릴산 폴리머, 카보머, 메틸하이드록시에틸셀룰로스, 하이드록시프로필메틸셀룰로스 또는 하이드록시 에틸셀룰로스 및 폴리에틸렌 증점제로부터 선택된다.

본 발명의 조성물에 바람직한 유기 용매의 예로는 저급 지방족 알코올 및 폴리올 등이 있다.

본 발명의 조성물에 사용하기 적합한 항산화제는 바람직하게는 아스코르브산 (비타민 C), 소듐-L-아스코르베이트, 칼슘-L- 아스코르베이트, 아스코르빌 팔미테이트, 부틸하이드록시아니솔, 부틸하이드록시톨루엔, 칼슘-다이소듐-EDTA, 이소아스코르브산, 렉시틴, 락트산, 폴리포스페이트, 토코페롤 (비타민 E), 유사 물질 [α]-토코페롤, [γ]-토코페롤, [δ]-토코페롤, 프로필갈레이트, 옥틸갈레이트, 도데실갈레이트, 소듐-이소아스코르베이트, 구연산, 소듐 사이트레이트, 포타슘 사이트레이트 및 tin-ll-클로라이드를 포함하는 군으로부터 선택된다. 바람직하게는 본 발명의 조성물에 사용되는 겔화제는 천연 또는 합성 폴리머일 수 있다. 천연 폴리머는 바람직하게는 아가-아가, 알기네이트, 펙틴, 카보머, 카라기난, 카세인, 엑스트린, 젤라틴, 아라비아검, 케라틴, 로커스트빈 검, 잔탄검 등으로부터 선택된다. 본 발명의 조성물에 사용될 수 있는 바람직한 합성 폴리머는 아실산 폴리머, 폴리아크릴 아미드 및 알킬렌 옥사이드 폴리머로부터 선택된다.

앞서 언급한 바와 같이, 본 발명의 조성물을 개체에 투여하기 위해 임의의 투여 경로를 이용할 수 있으며, 바람직한 투여 경로는 정맥내, 경구 및 국소이다. 바람직한 구현예에서, 본 발명의 조성물은 액체 또는 반고체 형태로, 바람직하게는 액체, 유체, 폼, 크림, 젤, 페이스트, 발삼, 스프레이, 연고, 로션, 컨디셔너, 토닉, 밀크, 무스, 에멀젼, 세럼, 오일, 스틱, 샴푸, 젤리, 현탁액, 분산제, 락커, 페인트, 엘릭실제, 점적제 또는 에어로졸로서 제형화될 수 있는 국소 제형이다. 특정 구현예에서, 본 발명의 활성 화합물은 리포좀 제제로 국소적으로 투여된다. 본 발명에서 사용되는 바와 같이, "리포좀"은 하나 이상의 동심원 층으로 구성된 인공 소낭으로, 특히 물질 (즉, 컨디셔닝화된 배지)을 신체 세포로 전달하기 위해 사용된다.

본 발명의 조성물의 국소 투여는 컨디셔닝화된 배지의 활성 화합물의 높은 생체이용성으로 이어진다. 약리학에서, 생체이용성은 약물의 기본적인 약동학적 특성들 중 하나로, 비-변형된 약물의 투여량 중 전신 순환계에 도달한 비율을 나타내기 위해 사용된다. 따라서, 생체이용성은 약동학에서 필수 도구 중 하나이며, 비-정맥내 투여 경로에서 투여량을 계산할 때 고려되어야 한다.

전달 방법은 컨디셔닝화된 배지를 전달하고자 하는 구체적인 장기에 따라 달라질 것이 자명하며, 당해 기술 분야의 당업자라면 그에 따라 어떤 수단을 사용할 것인지를 결정할 수 있을 것이다.

아래 실시예들은 주로 예시하기 위한 목적일 뿐 본 발명을 제한하는 것은 아니다.

실시예

실시예 1. 본 발명의 컨디셔닝화된 배지 수득

일반적으로, 본 발명의 컨디셔닝화된 배지는 MSC (중간엽 줄기 세포), 바람직하게는 개의 지방조직으로부터 유래된 MSC를 적절한 세포 배지, 바람직하게는 10% FBS 및 PSG가 첨가된 DMEM에서, 통상적으로 3 계대에 도달하는 수준인 컨플루언스 70% 내지 80%에 도달할 때까지 배양하여 수득할 수 있다.

지방조직은 건강한 공여자 한명 또는 여러명으로부터 입수한다. 지방조직 약 10 - 500 g이 마스터 세포 은행의 배치 1개가 될 것이다. 공여자의 나이는 세포의 시험관내 수명에 영향을 미칠 수 있으므로, 오리지널 공여자는 2살 미만이다. 공여자의 임상 병력과 양호한 일반적인 상태들을 조사한다. 샘플 수종을 수집해 일반적인 검사와 질병 검사를 수행하고, 병원체가 없다는 것을 확인한다. 지방조직의 추출은 수의사의 수술 기준에 따라 추출하기 위해 설비된 안정적인 셋업 또는 수술실에서 수행한다. 조직 추출은 동물 복지 조건에 준하여 자격을 갖춘 수의사에 의해 수행된다.

지방조직 추출 부위는 바람직하게는 간겸상간막이지만, 지방조직은 그외 복막내 지방 또는 피하 (즉, 축적된 부위)에서도 수득할 수 있다. 지방조직을 수집하는 시술은 다음과 같다: 간략하게는, 표준 수술 기법에 따라 부위를 잘 세척하고, 면도한 다음 소독한다. 그런 후, 국소 또는 전신 마취 하에 절개를 수행한다. 추출한 지방조직은 무균 수용체에 배치하고, 그에 따라 처리한다.

상기한 컨플루언스 수준에 도달하면, 배지는 버리고, 세포를 PBS와 같은 염수로 바람직하게는 3번 헹구어야 한다. 그런 후, 세포를 무혈청성 및 항체-비함유 배지, 예를 들어 DMEM에서 적어도 약 24시간 동안 배양하여야 한다. 이후, 컨디셔닝화된 배지를 수집하고, 0.2 mm 필터를 통해 여과하여 세포 파편을 제거하여야 한다.

특히, 본 실시예에 사용되는 컨디셔닝화된 배지는 다음과 같이 수득하였다:

개 (Canis lupus familiaris L.), 고양이 (Felis silvestris catus L.) 및 말 (Equus caballus L.), 또한 인간으로부터, 외과적 절개를 통해 동물 및 인간의 복부로부터 지방조직을 무균적으로 수집하여, 지방조직을 수득하였다. 이러한 지방조직으로부터 수득한 MSC는 10% FBS 및 PSG가 첨가된 DMEM에서, 3 계대에 도달하는 수준인 컨플루언스 70% 내지 80%에 도달할 때까지 배양하였다. 그런 후, 배지는 버리고, 세포를 PBS로 3번 헹구었다. 이후 세포를 무혈청성 및 항생제-비함유 배지에서 24-72시간 동안 배양하였다. 그런 다음, 컨디셔닝화된 배지를 수집하고, 0.2 mm 필터로 여과하여 세포 파편을 제거하였다. 이러한 4종의 컨디셔닝화된 배지 (개, 말, 인간 및 고양이로부터 수득)를 아래 실시예 2에 예시된 바와 같이 특징을 규명하였다.

세포를 탈착시키고, 유세포 측정에 의해 동정된 표면 마커를 사용해 MSC로서의 특징을 확인하였다.

실시예 2. 실시예 1에서 수득한 컨디셔닝화된 배지에 대한 특징 규명.

컨디셔닝화된 배지의 특징을 확인하기 위해 프로테옴 프로파일 어레이를 이용하였다.

인간 XL 사이토카인 어레이 키트 R&D Systems (Catalog Number ARY022B)를 다음과 같이 제조사의 지침에 따라 사용하였다. 이 키트는 샘플들 간의 사이토카인 차이를 동시적으로 검출하는 신속하고 민감한 도구이다. 이 키트로, 용해성 인간 단백질 최대 105개의 상대적인 발현 수준을 측정할 수 있다.

컨디셔닝화된 배지의 특징을 규명하기 위해, 포획 항체 및 대조군 항체를 니트로셀룰로스 막에 2 세트로 스팟팅하였다. 실시예 1에서 수득한 세포 배양 상층액을 프로테오 프로파일러 인간 XL 사이토카인 어레이와 밤새 직접 인큐베이션하였다. 막을 세척하여 결합되지 않은 물질은 제거한 다음, 바이오틴화된 검출 항체 칵테일과 인큐베이션하였다. 스트렙타비딘-HRP 및 화학발광 검출 시약을 첨가하고, 결합된 단백질 양에 해당하는 신호를 각 포획 스팟에서 발생시켰다.

105종의 검출 단백질 목록을 표 I에 나타낸다. 4가지 다른 종에 대한 결과는 하기 도면들에서 확인할 수 있다: 도 1 (인간), 도 2 (개), 도 3 (고양이) 및 도 4 (말).

표 I. 양성 대조군, 음성 대조군, 체크한 분석물, 분석물의 Entrez gene ID 및 존재하는 경우 다른 명칭을 표시한, 인간 XL 사이토카인 어레이 좌표.

좌표	분석물/대조군	Entrez Gene ID	다른 명칭
A1, A2	참조 스팟	N/A	RS
A3, A4	아디포넥틴	9370	Acrp30
A5, A6	아포지단백질 A-I	335	ApoA1
A7, A8	안지오게닌	283	______
A9, A10	안지오포이에틴-1	284	Ang-1, ANGPT1
A11, A12	안지오포이에틴-2	285	Ang-2, ANGPT2
A13, A14	BAFF	10673	BLyS, TNFSF13B
A15, A16	BDNF	627	뇌-유래 신경영양 인자
A17, A18	보체 성분 C5/C5a	727	C5/C5a
A19, A20	CD14	929	______
A21, A22	CD30	943	TNFRSF8
A23, A24	참조 스팟	N/A	RS
B3, B4	CD40 리간드	959	CD40L, TNFSF5, CD154, TRAP
B5, B6	키티나제 3-유사 1	1116	CHI3L1, YKL-40
B7, B8	보체 인자 D	1675	아딥신, CFD
B9, B10	C-반응성 단백질	1401	CRP
B11, B12	Cripto-1	6997	기형 암종-유래 성장 인자
B13, B14	시스타틴 C	1471	CST3, ARMD11
B15, B16	Dkk-1	22943	Dickkopf-1
B17, B18	DPPIV	1803	CD26, DPP4, 다이펩티딜-펩티다제 IV
B19, B20	EGF	1950	표피 성장 인자
B21, B22	엠프린 (Emmprin)	682	CD147, 바시긴 (Basigin)
C3, C4	ENA-78	6374	CXCL5
C5, C6	엔도글린 (Endoglin)	2022	CD105, ENG
C7, C8	Fas 리간드	356	TNFSF6, CD178, CD95L
C9, C10	FGF 염기성	2247	FGF-2
C11, C12	FGF-7	2252	KGF
C13, C14	FGF-19	9965	______
C15, C16	Flt-3 리간드	2323	FLT3LG
C17, C18	G-CSF	1440	CSF3
C19, C20	GDF-15	9518	MIC-1
C21, C22	GM-CSF	1437	CSF2
D1, D2	GROα	2919	CXCL1, MSGA-α
D3, D4	성장 호르몬	2688	GH, 소마토트로핀
D5, D6	HGF	3082	스캐터 인자, SF
D7, D8	ICAM-1	3383	CD54
D9, D10	IFN-γ	3458	IFNG
D11, D12	IGFBP-2	3485	______
D13, D14	IGFBP-3	3486	______
D15, D16	IL-1α	3552	IL-1F1
D17, D18	IL-1β	3553	IL-1F2
D19, D20	IL-1ra	3557	IL-1F3
D21, D22	IL-2	3558	______
D23, D24	IL-3	3562	______
E1, E2	IL-4	3565	______
E3, E4	IL-5	3567	______
E5, E6	IL-6	3569	______
E7, E8	IL-8	3576	CXCL8
E9, E10	IL-10	3586	______
E11, E12	IL-11	3589	______
E13, E14	IL-12 p70	3593	______
E15, E16	IL-13	3596	______
E17, E18	IL-15	3600	______
E19, E20	IL-16	3603	______
E21, E22	IL-17A	3605	IL-17, CTLA8
E23, E24	IL-18 Bpa	10068	______
F1, F2	IL-19	29949	______
F3, F4	IL-22	50616	IL-TIF
F5, F6	IL-23	51561	IL-23A, SGRF
F7, F8	IL-24	3627	C49A, FISP, MDA-7, MOB-5, ST16
F9, F10	IL-27	246778	______
F11, F12	IL-31	386653	______
F13, F14	IL-32	9235	______
F15, F16	IL-33	90865	C9orf26, DVS27, NF-HEV
F17, F18	IL-34	146433	C16orf77
F19, F20	IP-10	3627	CXCL10
F21, F22	I-TAC	6373	CXCL11, SCYB9B
F23, F24	칼리크레인 3	354	PSA, KLK3
G1, G2	렙틴	3952	OB
G3, G4	LIF	3976	______
G5, G6	리포칼린-2	3934	NGAL, LCN2, 시데로칼린
G7, G8	MCP-1	6347	CCL2, MCAF
G9, G10	MCP-3	6354	CCL7, MARC
G11, G12	M-CSF	1435	CSF1
G13, G14	MIF	4282	______
G15, G16	MIG	4283	CXCL9
G17, G18	MIP-1α/MIP-1베타	6348/6351	CCL3/CCL4
G19, G20	MIP-3α	6364	CCL20, Exodus-1, LARC
G21, G22	MIP-3β	6363	CCL19, ELC
G23, G24	MMP-9	4318	CLG4B, 겔라티나제 B
H1, H2	마이엘로퍼옥시다제	4353	MPO, 락토퍼옥시다제
H3, H4	오스테오폰틴	6696	OPN
H5, H6	PDGF-AA	5154	______
H7, H8	PDGF-AB/BB	5154/5155	______
H9, H10	펜트락신 3	5806	PTX3, TSG-14
H11, H12	PF4	5196	CXCL4
H13, H14	RAGE	177	______
H15, H16	RANTES	6352	CCL5
H17, H18	RBP-4	5950	______
H19, H20	렐락신-2 (Relaxin-2)	6019	RLN2, RLXH2
H21, H22	레시스틴	56729	ADSF, FIZZ3, RETN
H23, H24	SDF-1α	6387	CXCL12, PBSF
I1, I2	세르핀 E1	5054	PAI-I, PAI-1, 넥신
I3, I4	SHBG	6462	ABP
I5, I6	ST2	9173	IL-1 R4, IL1RL1, ST2L
I7, I8	TARC	6361	CCL17
I9, I10	TFF3	7033	ITF, TFI
I11, I12	TfR	7037	CD71, TFR1, TFRC, TRFR
I13, I14	TGF-α	7039	TGFA
I15, I16	트롬보스폰딘-1	7057	THBS1, TSP-1
I17, I18	TNF-α	7124	TNFSF1A
I19, I20	uPAR	5329	PLAUR
I21, I22	VEGF	7422	BEGFA
J1, J2	참조 스팟	N/A	RS
J5, J6	비타민 D BP	2638	VDB, DBP, VDBP
J7, J8	CD31	5175	PECAM-1
J9, J10	TIM-3	84868	HAVCR2
J11, J12	VCAM-1	7412	CD106
J23, J24	음성 대조군	N/A	대조군 (-)

평균 픽셀 세기를 비교한 결과들은 표 II에서 확인할 수 있다.

표 II. 4가지 분석 종들에 대한 대표적인 블롯들의 평균 픽셀 세기.

좌표	분석물	평균 픽셀 세기
좌표	분석물	인간	개	고양이	말
A7, A8	안지오게닌	16843	0	0	86
B5, B6	키티나제 3-유사 1	22816	0	521	13
B7, B8	보체 인자 D	11286	74	0	95
B21, B22	엠프린	6109	1775	431	1055
C5, C6	엔도글린	13619	0	335	0
C11, C12	FGF-7	11032	0	20	0
C13, C14	FGF-19	5339	170	284	343
C19, C20	GDF-15	13684	142	133	78
D11, D12	IGFBP-2	17762	12412	3225	10783
D13, D14	IGFBP-3	8568	0	71	4
E7, E8	IL-8	8153	0	227	37
E21, E22	IL-17A	4800	311	709	870
G7, G8	MCP-1	20066	37	768	2006
G13, G14	MIF	15445	0	4358	159
G23, G24	MMP-9	3980	400	373	514
H5, H6	PDGF-AA	1731	150	3482	65
H9, H10	펜트락신 3	10306	8	555	85
H23, H24	SDF-1α	6486	1146	609	629
I1, I2	세르핀 E1	26138	6871	2264	837
I15, I16	트롬보스폰딘-1	18335	14541	17516	49
I21, I22	VEGF	10296	10239	1095	941

이들 결과에 비추어, 서로 다른 기원으로부터 유래된 MSC들은 정성적인 및 정량적인 관점에서 서로 다른 컨디셔닝화된 배지를 제공한다는 것이 명확해 확인된다.

본 발명의 발명자들은, 개에서 수득한 컨디셔닝화된 배지가 동물뿐 아니라 인간에서 아토피성 피부염 및 건선과 같은 피부 질환을 치료하는데 특히 효과적이라는 것을 놀랍게도 알게 되었다. 개에서 인간으로의 이종적인 사용의 성공은 확실하지 않다. 아울러, 성공은 이들 2종 간에 존재하는 높은 계통발생학적 차이를 감안하였을 때 명확하지 않다.

실시예 3. 본 발명의 조성물에 대한 임상적인 및 수의학적인 결과들.

제1 사례. 개의 아토피성 피부염 치료

피부 질환, 즉 고환 병증 및 상당한 소양증을 유발하는 아토피성 피부염을 앓고 있는 8세 페키니즈 품종의 개를 본 발명의 치료 후보로 선정하였다. 이 개체에서 통상적인 코르티코스테로이드 처방에 대한 반응이 빈번하게 재발하였다. 이러한 피부 질환에 피부 로션으로서 개 컨디셔닝화된 배지를 상처 위에 매일 2회로 6주간 도포하는 치료를 실시하였다.

컨디셔닝화된 배지로 치료한지 1.5개월 후, Pancho는 도 5에 나타낸 바와 같이 완전 관해되었다.

제2 사례. 중증 피부 화상 상처를 가진 샤미즈 고양이 치료.

5세 샤미즈 고양이는 기름이 끓고 있는 프라이팬으로 떨어졌다. 신체의 30%가 다쳤으며, 주로 다리와 한쪽 옆구리가 다쳤다. 초기 치료제는 설파다이아진은, 연고 및 액체였다.

고양이 다리는 처음 1년간 회복되었지만, 약 10 x 5 cm 정도의 부위가 치유되지 않았으며, 지난 3년 동안 안정적인 병변 상태로 유지되었는데, 삼출물과 가려움이 계속적으로 동반되었다.

이러한 안정적인 병변에 피부 로션으로서 개 컨디셔닝화된 배지를 상처 위에 매일 2회로 6주간 도포하는 치료를 실시하였다.

컨디셔닝화된 배지로 치료한지 1.5개월 후, 상처의 크기가 도 6에 나타낸 바와 같이 줄어들었다.

제3 사례. 인간에서 건선 치료

남성. 79세. 1975년에 건선으로 진단받았다. 발병 부위는 팔꿈치와 오른쪽 다리이고, 무릎에서부터 거의 발목까지 큰 스팟을 명확하게 볼 수 있었다. 약 8-10년 동안, 손 부위에 작은 영역들에서 증상이 나타났다.

인간 환자는 코르티코스테로이드 치료를 포함하여 여러가지 치료를 받았다.

이러한 안정적인 병변에 개 컨디셔닝화된 배지를 35일간 매일 2회로 처리하는 치료를 실시하였다.

컨디셔닝화된 배지를 바른 후, 다리와 손의 피부 병변에 증기발생기를 사용해 직접 적용하였으며, 피부 벗겨짐 및 딱지가 피부에서 없어졌다.

손에 발생한 작은 병변들도 거의 완전히 없어졌다. 도 7을 참조한다.

제4 사례. 인간에서 건선 치료

여성. 37세. 10년 이상 건선성 관절염으로 진단받음.

살라조피린을 이용한 치료 (정제 4개/일). 급성 위기에는 메토트렉세이트를 소량으로 사용해 치료하였다. 이러한 치료는 효과가 없는 것으로 보였다.

건선으로 인한 병변에 개 컨디셔닝화된 배지를 처리하는 치료를 실시하였다. 컨디셔닝화된 배지를 사용한지 21일 후, 피부 벗겨짐과 딱지가 도 8에 나타낸 바와 같이 크게 완화되었다.

제5 사례. 인간에서 건선 치료

58세 남성. 1980년 봄에 건선으로 진단받았으며, 팔꿈치에 병변이 발생하였다.

주요 관련 부위는 크림 스테로이드로 치료하였지만 현저하게 개선되진 않았다. 페트롤륨/요오드 제제를 이용한 치료로 바꾸었지만, 긍정적인 효과는 없었다 (1981).

몇년간 아세틸살리실산으로 바꾸었으며, 추가적인 딱지 형성은 발생되지 않았다 (1982).

두피 상에 주기적으로 증상이 나타났다가 사라졌으며, 심각하거나 또는 성가신 상태는 아니었다 (1990-...).

아세틸살리실산 사용 포기, 팔꿈치, 손 등의 부위에 보습제 사용 (1996-현재).

건선으로 인한 병변에 개 컨디셔닝화된 배지를 처리하는 치료를 실시하였다.

컨디셔닝화된 배지를 사용한지 36일 후, 피부 벗겨짐과 딱지 형성은 도 9에 나타낸 바와 같이 현저하게 완화되었다.

Claims

컨디셔닝화된 세포 배양 배지 (conditioned cell culture medium)를 포함하는 조성물로서,
상기 컨디셔닝화된 세포 배양 배지는, 중간엽 기질 세포 (MSC) 집단 또는 이로부터 수득되는 불멸화 세포를, 개의 MSC 증식에 적합한 영양분 풍부 액체 (nutrient rich liquid) 또는 기본 배지에서 배양한 다음, 컨디셔닝화된 세포 배양 배지를 수집하는 것을 포함하는 방법에 의해 수득되거나 또는 수득가능하고,
상기 집단이 세포수 측면에서 적어도 50%가 카니스 (canis) 속에 속하는 포유류로부터 수득된 MSC 또는 이로부터 수득된 불멸화 세포이고,
상기 조성물이 다이메틸 설폭사이드 (DMSO)를 포함하지 않으며,
상기 조성물이 인간 개체에서 아토피성 피부염을 이종적으로 (xenogeneic) 치료하는데 사용되는, 조성물.
제1항에 있어서,
상기 MSC가 개 종 (dog species)에 속하는 포유류로부터 수득되는, 조성물.
제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 중간엽 기질 세포가 탯줄 유래 기질 세포, 지방조직-유래 기질 세포, 증식된 중간엽 기질 세포 (expanded mesenchymal stromal cell), 증식된 지방조직-유래 기질 세포, 골수 유래 기질 세포, 증식된 골수 유래 기질 세포 또는 이들 중 임의 세포로부터 수득되는 불멸화 중간엽 기질 세포인, 조성물.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
세포 배양을 위해 준비되는 상기 영양분 풍부 액체가 소듐 피루베이트 및 글루타민이 첨가된 아미노산과 비타민을 포함하는 완충 식염수 (buffered saline solution)인, 조성물.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
세포 배양을 위해 준비되는 상기 영양분 풍부 액체가 첨가제가 첨가되거나 첨가되지 않은 기본 배지인, 조성물.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 조성물이 최적의 치료를 달성하기 위해 적절한 간격으로 컨디셔닝화된 배지를 필요한 양으로 전달하도록 구성될 수 있는, 조성물.
제6항에 있어서,
상기 조성물이 개체에게 정맥내, 경구 및 국소 투여 경로 중 임의의 경로에 의해 투여하도록 구성될 수 있는, 조성물.
제7항에 있어서,
상기 투여 경로가 국소 경로이고,
상기 조성물이 액체 또는 반-고체 형태로 제형화된 국소 제형 (topical formulation)인, 조성물.
제7항에 있어서,
상기 투여 경로가 국소 경로이고,
상기 조성물이 액체, 유체, 폼, 크림, 젤, 페이스트, 발삼 (balsam), 스프레이, 연고, 로션, 컨디셔너, 토닉, 밀크, 무스, 에멀젼, 세럼, 오일, 스틱, 샴푸, 젤리, 현탁액, 분산제, 락커, 페인트, 엘릭실제 (elixir), 점적제 또는 에어로졸 중 임의로 제형화된 국소 제형인, 조성물.
제7항에 있어서,
상기 투여 경로가 국소 경로이고,
상기 조성물이 리포좀 제제로 제형화된 국소 제형인, 조성물.