CN112584846A - 用于皮肤病的药物组合物及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种组合物，所述组合物包含条件细胞培养基，所述条件细胞培养基通过包括以下的过程获得或可通过包括以下的过程获得：在制备用于细胞培养的富营养液体中，培养间充质基质细胞(MSC)的群，其中按细胞数计，所述群中至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％是获得自属于犬属的哺乳动物的MSC，所述富营养液体优选为基础培养基；和收集所述条件细胞定培养基，其中优选地，富营养液体是设计用于使MSC生长的无动物/人血清培养基或化学限定无动物/人血清和无异种培养基，所述组合物用于治疗。

Description

用于皮肤病的药物组合物及其用途

技术领域

本发明涉及开发、细胞生物学、分子生物学和遗传学的领域。更具体地，本发明涉及由自属于犬属的哺乳动物获得的间充质干细胞得到条件培养基的方法，以及这样的培养基用于治疗皮肤炎性病症例如牛皮癣或特应性皮炎中的用途。

背景技术

皮肤曾经被认为与身体免疫隔离，而现在被认为是多***炎症轴的组成部分。

特应性皮炎(AD)和牛皮癣，尤其是其最严重的形式，已经与多种全身性炎性病症和合并症联系到一起。这些合并症突显了儿童期炎性皮肤疾病是严重的慢性多***疾病，而不仅仅是外表的病况(cosmetic condition)。

特应性皮炎合并症随年龄和病程而异。Hanifin和Rajka的金标准AD诊断标准(Acta Derm Venereol Suppl(Stockh)1980；92:44-47)中包括一些最常见的合并症。这些标准包括瘙痒、慢性或复发性皮炎、根据年龄的特定分布(例如儿童佝偻病(flexuraldisease))和特应性(即食物过敏、哮喘和过敏性鼻结膜炎)的个人和/或家族史。次要特征包括十几种以上的合并症，包括：寻常性鱼鳞病；细菌性和病毒性感染；免疫球蛋白E和皮肤点刺试验阳性的过敏倾向；眼部检查结果，例如白内障；对接触食物、压力和环境诱因的过度皮肤反应。近40年来，这些主要和次要标准实际上对我们来说都是很明显的，合并症的概念已成为特应性皮炎和特应性体质(atopic diathesis)的定义的组成部分。

最近，小儿牛皮癣和特应性皮炎都已经与皮肤感染和社会心理障碍(例如所涉儿童及其父母的焦虑、抑郁和多动)联系到一起。在两组疾病中都可注意到与皮肤自身免疫的联系，包括白癜风和斑秃。

这两种疾病共有的最重要且充分描述的一系列合并症是与肥胖和代谢综合征(以心脏病、中风和糖尿病风险增加为特征的一类病况)的关联。幼儿肥胖已经与特应性皮炎的发展和严重程度联系到一起。在牛皮癣中，在疾病发生前几年可能出现腹围增加和肥胖，提示它们作为疾病的诱因的作用。牛皮癣疾病的一个有趣特征是来自成年人的有希望的数据，这些成年人进行了减肥手术并经历了牛皮癣疾病的改善。

尽管有许多常见的合并症，但小儿特应性皮炎和小儿牛皮癣具有许多独特的特征。

在特应性皮炎中，皮肤屏障是脆弱的并且被炎症削弱，从而允许一系列异常的过敏特征，即特应性进程(atopic march)和感染并发症。可替代地，在牛皮癣中，引发皮肤增厚，并且关节可能发炎。

在临床表现中看到进一步的分歧。在牛皮癣中，关节炎是主要的合并症，有时是由链球菌病引发的。与代谢综合征特征(例如高血压、高脂血症和胰岛素耐受性)的关联也明确得多。不管牛皮癣的共同性质和疾病的频率如何，但特应性皮炎已经发展出更广泛的合并症清单，包括婴儿脂溢性皮炎、马拉色菌病致敏、粉尘过敏、哮喘、食物过敏、环境过敏原、接触性皮炎(例如羊毛脂、香氛)、痒疹、睡眠障碍、上呼吸道感染、疣、柯萨奇泛化(coxsackie generalization)(例如，柯萨奇湿疹)和白内障。

无论如何，开发针对任何年龄的炎性皮肤疾病(例如牛皮癣或特应性皮炎)患者的筛查工具和有效药理干预措施是正在进行的工作，并且如今已成为至关重要的需求。从这个意义上讲，本发明提供了其中培养了源自属于犬属的哺乳动物的MSC(间充质干细胞)的条件培养基的用途，以便获得这样的适合于治疗皮肤炎性病症(例如牛皮癣或特应性皮炎)的条件培养基。特别重要的是要强调，本发明中公开的组合物在对人特应性皮炎的异种治疗中是特别有效的，纵使人与狗之间存在高度的***发育差异(见图7至图9)。

在这方面，WO2008155659公开了用于预防或治疗皮肤缺陷的组合物，该组合物包含来自间充质干细胞(MSC)的条件细胞培养基。另外，该文件表明MSC可以获得自人、猪、狗、猫、小鼠、马和其他哺乳动物。但是，该文件没有具体提及“特应性皮炎”或“牛皮癣”，更不用说这些疾病可以用包含来自获得自狗的间充质干细胞(MSC)的条件细胞培养基的组合物来治疗。从这个意义上说，本发明的实施例2表明，来自不同起源的MSC提供了在定性和定量的角度上不同的条件培养基。实际上，如图所示(图2，相比于图1、3和4)，来自狗脂肪MSC的条件培养基与获得自人、猫或马脂肪组织的条件培养基有很大不同。而且，WO2008155659没有表明，条件培养基，特别是获得自狗脂肪MSC的条件培养基对于人类皮炎(例如特应性皮炎和牛皮癣)的有效治疗特别有用。

另外，本发明优选专注于人特应性皮炎的异种治疗(xenogeneic treatment)，而根据诸如WO2017041133的文献，这一事实当然是违反直觉的，在WO2017041133中可以发现以下陈述：“脂肪组织可以是人脂肪组织或哺乳动物脂肪组织，例如犬、马或猫。通常，脂肪组织的来源将与MSC的预期受体属于同一物种……”

此外，尽管Mohd Matin Ansari“Therapeutic potential of canine bonemarrow derived mesenchymal stemcells and its conditioned media in diabeticrat wound healing”，Journal of stem cell research&therapy,vol.3,no.3,1January2013(2014-01-01),XP055406815中公开了犬细胞或其条件培养基在治疗不同物种(例如糖尿病大鼠)伤口中的潜在功效，这样的伤口是对大叔皮肤进行全厚切除而造成的。相反，引起特应性皮炎皮疹的皮肤炎症被认为是一种过敏反应。因此，Mohd Matin Ansari等人创造的伤口治疗与特应性皮炎的治疗是完全无关的。

最后，WO2017144552明确地涉及强制性地包含二甲基亚砜(DMSO)的组合物，实际上，DMSO是WO2017144552中的本质特征，因为DMSO增强了对其中详述的疾病的治疗。但是，WO2017144552不涉及，通过使用如下的条件细胞培养基，特别是在不含DMSO的组合物的情况下，对人特应性皮炎或牛皮癣的异种治疗，所述条件细胞培养基通过包括培养间充质基质细胞(MSC)的群的过程获得或可通过包括培养间充质基质细胞(MSC)的群的过程获得，其中按细胞数计，所述群的至少50％是获得自属于犬属的哺乳动物的MSC。

因此，就我们所知，本发明首次提供包含如下的条件细胞培养基的组合物以用于人特应性皮炎的异种治疗：所述条件细胞培养基通过包括培养间充质基质细胞(MSC)的群的过程获得或可通过包括培养间充质基质细胞(MSC)的群的过程获得，其中按细胞数计所述群的至少50％是获得自属于犬属的哺乳动物的MSC。

发明内容

根据本发明，不使用干细胞，而通过施加来自MSC的分泌物而不施加MSC本身或也施加MSC本身进行内源性组织修复增强，可以使受损或丧失的组织再生或修复。具体而言，我们提供了条件培养基的用途，在该条件培养基中培养了源自属于犬属的哺乳动物的MSC，以便获得适合于治疗皮肤炎性病症(例如牛皮癣或特应性皮炎)的这样的条件培养基。

特别地，在表II(见描述)中，我们示出了来自属于犬属的哺乳动物的MSC所分泌的多肽与其他哺乳动物(例如来自猫或人的MSC)所分泌的多肽的定性和定量比较。另外，本说明书中公开的实施例清楚地示出了，与使用由培养源自属于犬属的哺乳动物的MSC而获得的条件培养基相关的治疗效果，尤其是与治疗特应性皮炎或牛皮癣相关的治疗效果。

通过这种方法，将消除目前与基于细胞的疗法相关的混杂的问题，即如果使用自体细胞制剂时的免疫相容性、致瘤性、异生物质感染、成本和等待时间问题。这样的方法可能潜在地提供了，以可负担的成本以及更好的质量控制和一致性来开发基于“MSC”的“现成(off-the-shelf)”疗法。

除非另有说明，否则本发明的实施将采用化学、分子生物学、微生物学、重组DNA和免疫学的常规技术，它们均在本领域普通技术人员的能力范围内。这样的技术在文献中进行了解释。参见，例如J.Sambrook,E.F.Fritsch,和T.Maniatis,1989,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Second Edition,Books1-3,Cold Spring Harbor LaboratoryPress；Ausubel,F.M.等人(1995and periodic supplements；Current Protocols inMolecular Biology,ch.9,13,and 16,John Wiley&Sons,New York,N.Y.)；B.Roe,J.Crabtree和A.Kahn,1996,DNA Isolation and Sequencing:Essential Techniques,John Wiley&Sons；J.M.Polak and James O'D.McGee,1990,Oligonucleotide Synthesis:A Practical Approach,IrI Press；D.M.J.Lilley和J.E.Dahlberg,1992,MethodsofEnzymology:DNA Structure Part A:Synthesis and Physical Analysis of DNAMethods in Enzymology,Academic Press；Edward Harlow,David Lane,Ed Harlow的Using Antibodies:A Laboratory Manual:Portable Protocol NO.I(1999,Cold SpringHarbor Laboratory Press,ISBN 0-87969-544-7)；Ed Harlow(编者),David Lane(编者)的Antibodies:A Laboratory Manual(1988,Cold Spring Harbor Laboratory Press,ISBN 0-87969-314-2),1855；和Lab Ref:A Handbook of Recipes,Reagents,and OtherReference Tools for Use at the Bench,Edited Jane Roskams and Linda Rodgers,2002,Cold Spring Harbor Laboratoiy,ISBN 0-87969-630-3。这些通用文本中的每个均通过引用并入本文。

因此，本发明的第一方面涉及一种组合物，所述组合物包含条件细胞培养基，所述条件细胞培养基通过包括以下的过程获得或可通过包括以下的过程获得：在制备用于细胞培养的富营养液体中，培养间充质基质细胞(MSC)的群，其中按细胞数计，所述群的至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％是获得自属于犬属的哺乳动物的MSC或获得自所述MSC的永生化间充质基质细胞，所述富营养液体优选为基础培养基，例如含有或不含补充剂的DMEM、MEM、RPMI或HAM`S，例如含血清培养基、无血清培养基、无蛋白质培养基和化学限定培养基；和收集所述条件细胞培养基，

其中优选地，富营养液体是设计用于使MSC生长的无动物和人血清培养基，和

其中优选地，所述组合物不包含二甲基亚砜(DMSO)，

所述组合物用于治疗。

优选注意的是，本发明的第一方面的组合物优选整体上不包含人和动物血清组分。

在本发明第一方面或其任何优选实施方式的优选实施方式中，MSC获得自属于狗物种的哺乳动物。

在本发明第一方面或其任何优选实施方式的另一种优选实施方式中，间充质基质细胞是从任何前述来源获得的脐带来源的基质细胞、脂肪组织来源的基质细胞、扩增的间充质基质细胞、扩增的脂肪组织来源的基质细胞、骨髓来源的基质细胞、扩增的骨髓来源的基质细胞或永生化间充质基质细胞。

在本发明第一方面或其任何优选实施方式的另一种优选实施方式中，制备用于细胞培养的富营养液体是补充有丙酮酸钠和谷氨酰胺的包含氨基酸和维生素的缓冲盐水溶液。优选地，制备用于细胞培养的富营养液体是含有或不含补充剂的基础培养基DMEM、MEM、RPMI或HAM`S，例如含血清培养基、无血清培养基、无蛋白质培养基和化学限定培养基。

在本发明的第二方面，本发明的第一方面的药物组合物用于治疗或预防人或动物对象皮炎。优选地，所述皮炎选自特应性皮炎、湿疹和牛皮癣。更优选地，本发明的第一方面的药物组合物用于人对象的特应性皮炎、湿疹和/或牛皮癣的异种治疗中。

本发明的第三方面涉及本发明的第一方面的药物组合物或根据本发明的第二方面使用的组合物，其中这样的组合物可被配置为以适当的间隔递送所需量的条件培养基，以便实现最佳治疗。

在本发明第三方面的优选实施方式中，这样的组合物包含赋形剂。优选的赋形剂是适合包含在局部组合物中的那些赋形剂(即皮肤病学可接受的赋形剂)。下文提到的以下助剂可以彼此独立地存在于这样的组合物中：胶凝剂、油、蜡、增稠剂、亲水或疏水聚合物、乳化试剂、润肤剂、脂肪酸、有机溶剂、抗氧化剂、稳定剂、掩蔽剂、酸化或碱化剂、乳化剂、润滑剂、表面活性剂、成膜剂、增强性能和/或吸引消费者的生物添加剂(例如氨基酸、蛋白质、香草、芦荟提取物或生物类黄酮)、缓冲剂、螯合剂(例如乙二胺四乙酸(EDTA)或草酸)、着色剂、染料、推进剂、消泡剂、湿润剂、维生素、乳液稳定剂、pH调节剂、增稠剂、香料、防腐剂、遮光剂、水和/或醇。用于组合物的前述辅助剂以本领域技术人员已知的常用量使用。用于组合物的合适的油选自动物油或植物油或合成油。特别优选的油选自包含液体凡士林、液体石蜡、挥发性和非挥发性硅油、异链烷烃、聚α-烯烃、氟化油和全氟化油的组。用于本发明的组合物的合适的稳定剂可以具有非离子、阴离子、阳离子和两亲性质。优选的稳定剂选自包含聚乙二醇(PEG)及其衍生物、吐温、曲拉通(triton)、司盘(span)、聚甘油、聚烷基甘油酯、烷基磺酸盐、芳基磺酸盐、烷基磷酸酯、烷基甜菜碱的衍生物和磷脂酰甘油。

在本发明的第三方面的另一种优选实施方式中，所述组合物适合通过任何以下给药途径来向对象，优选向人对象给药：静脉内、口服和局部。在本发明第三方面的优选实施方式中，本发明的组合物是可以配制成液体或半固体形式的局部配方，优选配制成液体、流体、泡沫、乳霜、凝胶、糊剂、香脂、喷雾剂、软膏、洗液、调节剂、补品、牛奶、慕斯、乳液、血清、油、条状物、洗发剂、果冻、悬浮液、分散体、喷发定型剂、涂料、酏剂、滴剂或气雾剂。在特定的实施方式中，本发明的活性化合物以脂质体制剂局部给药。

附图说明

图1与来自人脂肪来源间充质干细胞的条件培养基杂交的人XL细胞因子阵列坐标的代表性图像。

图2与来自狗脂肪来源间充质干细胞的条件培养基杂交的人XL细胞因子阵列坐标的代表性图像。

图3与来自猫脂肪来源间充质干细胞的条件培养基杂交的人XL细胞因子阵列坐标的代表性图像。

图4与来自马脂肪来源间充质干细胞的条件培养基杂交的人XL细胞因子阵列坐标的代表性图像。

图5用狗条件培养基治疗的北京犬。图像显示了伤口在四个不同时间点的演变。在治疗期间，皮疹和脱皮都有所减少，直至第6周完全缓解。

图6用狗条件培养基治疗的暹罗猫。图片显示治疗开始和第5周治疗结束时伤口的演变。如比较叠加图所示，伤口的大小减小。

图7用狗条件培养基治疗79岁的男性。图像显示在持续对腿部和手部治疗的35天期间牛皮癣伤口的演变。脱皮和皮肤鳞屑明显减少。

图8用狗条件培养基治疗37岁的女性。图像显示在持续对手臂和足部治疗的21天期间牛皮癣伤口的演变。脱皮和皮肤鳞屑明显减少。

图9用狗条件培养基治疗58岁的男性。图像显示在持续对腿部和手部治疗的36天期间牛皮癣伤口的演变。脱皮和皮肤鳞屑消失。

具体实施方式

定义

如本文所使用，以下术语和短语应当具有以下阐述的含义。除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。

冠词“一/一个(a/an)”指一个或多于一个(即至少一个)该冠词的语法对象。举例来说，“元件(an element)”是指一个元件或多于一个元件。

术语“约”当与值有关使用时涉及值±10％。

“脂肪组织”是指任何脂肪组织。脂肪组织可以是棕色脂肪组织或白色脂肪组织，其源自例如皮下、网膜/内脏、乳腺、性腺或其他脂肪组织部位。优选地，脂肪组织是皮下白色脂肪组织。脂肪组织可包含原代细胞培养物或永生化细胞系。脂肪组织可以来自具有脂肪组织的任何生物体。在一些实施方式中，脂肪组织是哺乳动物的，并且在进一步的实施方案中，脂肪组织是人的。脂肪组织的方便来源是抽脂手术。然而，将理解，脂肪组织的来源或脂肪组织的分离方法对于本发明都不是关键的。如果本文所述的细胞对于自体移植到对象中是需要的，则将从该对象中分离出脂肪组织。

“脂肪组织来源的基质细胞(ASC)”是指源自脂肪组织的MSC，通常指源自人脂肪组织的MSC(hASC)。这些细胞已用于本发明中以重现本发明。

本文使用的术语“细胞/kg”应理解为是指每千克患者体重给药的细胞(例如MSC)数。

术语“培养(culture)”是指细胞、生物体、多细胞实体或组织在培养基中的生长。术语“培养(culturing)”是指实现这种生长的任何方法，并且可以包括多个步骤。术语“进一步培养”是指将细胞、生物体、多细胞实体或组织培养至某个生长阶段，然后使用另一种培养方法使所述细胞、生物体、多细胞实体或组织进入另一生长阶段。“细胞培养”是指细胞在体外的生长。在这样的培养中，细胞增殖，但是它们本身并不***化成组织。“组织培养”是指组织(例如原初(primordial)器官的外植体或成人器官的外植体)的体外维持或生长，以保持其结构和功能。“单层培养”是指细胞在合适的培养基中繁殖同时主要彼此附着和辅附着在基底上的培养。此外，“悬浮培养”是指其中细胞在繁殖的同时悬浮于合适培养基中的培养。同样，“连续流培养”是指在新鲜培养基的连续流中培养细胞或外植体，以维持细胞生长，例如活力。术语“条件培养基”是指例如不含培养细胞/组织的上清液，得自经过一段时间与培养细胞接触后，培养基已被改变为包含某些由细胞产生并分泌到培养物中的旁分泌和/或自分泌因子。“汇合培养(confluent culture)”是所有细胞都处于接触状态因此覆盖了培养皿整个表面的细胞培养，这意味着细胞也已达到其最大密度，尽管汇合并不一定意味着***会停止或群的大小不会增加。

术语“培养基(culture medium/medium)”是本领域中公认的，并且通常是指用于培养活细胞的任何物质或制剂。关于细胞培养中所使用的术语“培养基”包括细胞周围环境的组分。培养基可以是固体、液体、气体或相和材料的混合物。培养基包括液体生长培养基以及不维持细胞生长的液体培养基。培养基还包括凝胶状培养基，例如琼脂、琼脂糖、明胶和胶原蛋白基质。示例性的气体培养基包括在培养皿或其他固体或半固体支持物上生长的细胞所暴露的气相。术语“培养基”还指旨在用于细胞培养的材料，即使该材料尚未与细胞接触。换句话说，制备用于细菌培养的富营养液体是培养基。类似地，当与水或其他液体混合时变得适于细胞培养的粉末混合物可以被称为“粉状培养基”。“限定培养基”是指由化学限定(通常是纯化的)组分制成的培养基。“限定培养基”不含不易表征的生物提取物，例如酵母提取物和牛肉汤。“加富培养基”包括设计用于支持特定物种的大多数或所有可存活形式的生长的培养基。加富培养基通常包含复杂的生物提取物。术语“基础培养基”是指促进不需要任何特殊的营养补充剂的许多类型微生物的生长的培养基。大多数基础培养基通常包含四个基本化学基团：氨基酸、碳水化合物、无机盐和维生素。基础培养基通常充当更复杂的培养基的基础，所述更复杂的培养基中添加了补充剂(例如血清、缓冲液、生长因子、脂质等)。基础培养基的示例包括但不限于伊戈尔基础培养基、最低必需培养基、杜氏改良伊格尔培养基、199培养基、营养混合物Ham's F-10和Ham's F-12、McCoy's 5A、杜氏MEM/FI2、RPMI 1640和伊思考夫改良杜氏培养基。要注意，自从最初的配方出现在文献中以来，已经开发了伊格尔培养基的许多改良形式。这些改良形式中使用最广泛的是杜氏改良伊格尔培养基(DMEM)。DMEM是伊格尔基础培养基(BME)的改良形式，包含四倍浓度的氨基酸和维生素以及其他补充组分。原始DMEM配方含有1000mg/L的葡萄糖，并首次被报道用于培养小鼠胚胎细胞(低葡萄糖DMEM)。已经证明，用4500mg/L葡萄糖进行的进一步改变对于某些细胞类型的培养是最佳的(高葡萄糖DMEM)。在本发明的上下文中，DMEM是优选的基础培养基。要注意，本发明中提到的基础培养基是设计用于使MSC生长的无动物/人血清培养基或化学限定无血清无异种培养基，例如伊格尔基础培养基或杜氏改良伊格尔培养基(DMEM)。

在本发明的上下文中，无动物和人血清培养基应当理解为不包含动物或人来源的血液或血清成分的培养基。特别地，它是指不包含人或动物血液中存在的人或动物蛋白(例如白蛋白或胎牛血清或小牛血清(fetal calf serum))的培养基(也就是说，该培养基不包含动物或人来源的血液或血清组分)。无动物和人血清培养基的示例是DMEM。

术语“包含(comprise/comprising)”以包括的、开放的含义使用，意味着可以包含额外的组成部分。

当提及细胞时，本文所用的术语“扩增”应当被认为具有其本领域通常的含义，即已经在体外增殖的细胞。可以扩增MSC以提供在标准培养条件下保留MSC的至少一种生物学功能(通常是贴附至塑料表面的能力)的细胞群。扩增的细胞群可以保留分化为一种或多种细胞类型的能力。

术语“包括”在本文中用来表示“包括但不限于”。“包括”和“包括但不限于”可互换使用。

“间充质基质细胞(本文中也称为“MSC”)”是多能基质细胞，即它们是能够产生多种不同类型细胞的细胞。这些类型的细胞由它们在特定培养条件下贴附塑料生长并且随后扩增以及由它们在体外和体内的分化潜能来定义(Caplan AI:Mesenchymal Stem Cells.JOrthop Res 1991,9:641–650；Zuk PA,Zhu M,Mizuno H,Huang J,Futrell JW,Katz AJ,Benhaim AJ,Lorenz HP,Hedrick MH:Multi-lineage cells from human adiposetissue:implication for cell-based therapies.Tissue Eng 2001,7:211–228；HuangJI,Beanes SR,Zhu M,Lorenz HP,Hedrick MH,Benhaim P:Rat extramedullary adiposetissue as a source of osteochondrogenic progenitor cells.Plast Reconstr Surg2002,109:1033–1041；Dennis JE,Caplan AI:Differentiation potential ofconditionally immortalized mesenchymal progenitor cells from adult marrow ofa H-2Kb-tsA58 transgenic mouse.J Cell Physiol 1996,167(3):523–538；JohnstoneB,Hering TM,Caplan AI,Goldberg VM,Yoo JU:In vitro chondrogenesis of bonemarrow-derived mesenchymal progenitor cells.Exp Cell Res 1998,238(1):265–272；Dennis JE,Merriam A,Awadallah A,Yoo JU,Johnstone B,Caplan AI:A quadr-icpotential mesenchymal progenitor cell isolated from the marrow of an adultmouse.J Bone Miner Res 1999,14(5):700–709；Kopen GC,Prockop DJ,Phinney DG:Marrow stromal cells migrate throughout forebrain and cerebellum,and theydifferentiate into astrocytes after injection into neonatal mouse brains.ProcNatl Acad Sci USA 1999,96:10711–10716；Toma C,Pittenger MF,Cahill KS,Byrne BJ,Kessler PD:Human mesenchymal stem cells differentiate to a cardiomyocytephenotype in the adult murine heart.Circulation 2002,105:93–98)。如上所述，MSC在文献中是众所周知的，因此形成了本领域技术人员的公知常识的一部分。

为了实施本发明，已经从众多哺乳动物中分离出MSC。例如，MSC已经源自各种马组织，包括骨髓(Arnhold SJ,Goletz I,Klein H,Stumpf G,Beluche LA,Rohde C,AddicksK,Litzke LF.Isolation and characterization of bone marrow-derived equinemesenchymal stem cells.Am J Vet Res 2007,68,1095-1105；Kisiday JD,Kopesky PW,Evans CH,Grodzinsky AJ,McIlwraith CW,Frisbie DD.Evaluation of adult equinebone marrow-and adipose-derived progenitor cell chondrogenesis in hydrogelcultures.J Orthop Res 2008,26,322-33；Smith RKW,Korda M,Blunn GW,GoodshipAE.Isolation and implantation of autologous equine mesenchymal stem cellsfrom bone marrow into the superficial digital flexor tendon as a potentialnovel treatment.Equine Vet J 2003,35,99-102)、脂肪组织(Vidal MA,Kilroy GE,Johnson JR,Lopez MJ,Moore RM,Gimble JM.Cell growth characteristics anddifferentiation frequency of adherent equine bone marrow-derived mesenchymalstromal cells:adipogenic and osteogenic capacity.Vet Surg 2006,35,601-610.)、外周血、脐带血、脐带基质和羊水。然而，要注意，本发明涉及犬MSC，特别是从骨髓和脂肪组织分离的犬MSC的用途。这样的犬MSC在Hiroshi Takemitsu等人Comparison of bonemarrow and adipose tissue-derived canine mesenchymal stem cells.BMCVeterinary Research 2012,8:150中有充分的记载。最后，已经成功地从人的骨髓和脂肪组织中分离了MSC(Caplan AI:Mesenchymal Stem Cells.J Orthop Res 1991,9:641–650.Zuk PA,Zhu M,Mizuno H,Huang J,Futrell JW,Katz AJ,Benhaim AJ,Lorenz HP,Hedrick MH:Multi-lineage cells from human adipose tissue:implication forcell-based therapies.Tissue Eng 2001,7:211–228.Huang JI,Beanes SR,Zhu M,Lorenz HP,Hedrick MH,Benhaim P:Rat extramedullary adipose tissue as a sourceof osteochondrogenic progenitor cells.Plast Reconstr Surg 2002,109:1033–1041.)。

要通过本主题方法治疗的“患者”、“对象”或“宿主”可以是人或非人动物。

术语“药物组合物”是指旨在用于治疗的组合物，无论该组合物用于人类还是动物治疗，因此在本发明的术语药物组合物中涵盖了兽用组合物。本发明的组合物是药物组合物，旨在用于治疗患者或宿主。

本文中使用短语“药学上可接受的”指代在合理的医学判断范围内，适合与人类和动物的组织接触而没有过度的毒性、刺激、过敏反应或其他问题或并发症，且具有合理的获益/风险比的那些化合物、材料、组合物和/或剂型。

如本文所用，短语“药学上可接受的载体”是指涉及将主题化合物从一个器官、或身体的一部分运载或运输到身体的另一个器官或另一部分的药学上可接受的材料、组合物或溶媒，例如液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂或溶剂包封材料。从与配方的其他成分相容且对患者无害的意义上，每种载体必须是“可接受的”。

如本文所用，术语“溶液”包括用于本发明的MSC在其中保持存活的药学上可接受的载体或稀释剂。

就MSC群而言，术语“基本上纯的”是指按细胞数计其中至少约50％、60％、70％、75％、至少约85％、至少约90％或至少约95％为MSC的细胞群。换句话说，术语“基本上纯的”是指相对于MSC群，含有少于约50％、少于约30％、少于约20％、少于约10％或少于约5％谱系定型细胞数的细胞群。如本文所用，“支持物”是指可用作脂肪组织来源的基质细胞生长的基础或基质的任何装置或材料。

描述

本发明的第一方面涉及一种组合物，所述组合物包含条件细胞培养基，所述条件细胞培养基通过包括以下的过程获得或可通过包括以下的过程获得：在制备用于细胞培养的富营养液体中，培养间充质基质细胞(MSC)的群，其中按细胞数计所述群中至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％是获得自属于犬属的哺乳动物的MSC，所述富营养液体优选为基础培养基；和收集所述条件细胞培养基，

其中优选地，富营养液体是设计用于使MSC生长的无动物和人血清培养基，和其中优选地，所述组合物不包含二甲基亚砜(DMSO)，

所述组合物用于治疗。

本发明的第一方面的MSC是具有分化为其他细胞的能力的未分化基质细胞，并且通常源自***，因此是非造血细胞。术语“***”是指源自间充质的组织，并且包括几种组织，这些组织以组织的细胞被包括在胞外基质内为特征。在不同类型的***中，包括脂肪和软骨组织。在一种实施方式中，MSC来自脂肪组织的基质部分。在另一种实施方式中，从软骨细胞，例如从透明软骨获得MSC。在另一种实施方式中，从皮肤获得MSC。同样，在另一种实施方式中，从骨髓获得MSC。MSC的替代来源包括但不限于骨膜、牙髓、脾脏、胰腺、韧带、肌腱、骨骼肌、脐带和胎盘。其他来源是诱导性多能干细胞或胚胎干细胞。

重要的是注意，用于获得本发明的第一方面的组合物的MSC获得自属于犬属的哺乳动物，特别地，这些细胞是犬MSC。通常，犬MSC从脂肪组织的基质部分获得，即它们是犬脂肪组织来源的基质细胞(ASC)或获得自ASC的永生化MSC。犬MSC在标准培养条件下贴附至塑料。犬MSC是未分化的多能细胞，具有这样的能力：分化成体细胞如中胚层细胞(例如脂肪、软骨细胞、成骨细胞)或向体细胞如中胚层细胞(例如脂肪、软骨细胞、成骨细胞)分化，以及任选地分化成内胚层细胞类型或谱系和/或外胚层细胞类型或谱系或向内胚层细胞类型或谱系和/或外胚层细胞类型或谱系分化。通常，细胞具有分化成选自由脂肪细胞谱系、成软骨细胞谱系和成骨细胞谱系组成的组中的至少两种或所有细胞类型或向选自由脂肪细胞谱系、成软骨细胞谱系和成骨细胞谱系组成的组中的至少两种或所有细胞分化的能力。

在本发明的第一方面的一种实施方式中，犬MSC是体外培养扩增的犬MSC或其体外培养扩增的后代(下文均称为扩增的MSC或“eMSC”)。制备eMSC的方法是本领域已知的，例如如WO2007039150中所述。eMSC保留了MSC的几种表型特征，例如eMSC在标准培养条件下贴附至塑料，并保留未分化的表型。

eMSC是未分化的多能细胞，具有分化为体细胞(如中胚层细胞)的能力。MSC具有向至少一种或多种特殊细胞谱系(例如但不限于脂肪细胞谱系、成软骨细胞谱系和成骨细胞谱系)分化的能力；然而，通常在eMSC中，这种分化能力降低了，甚至可能不存在，例如，MSC可以至少向成骨细胞谱系和脂肪细胞谱系分化，然而源自MSC的eMSC仅可以向脂肪细胞谱系分化。这对于该细胞的治疗应用可能是有利的，其中可以将该细胞给药至患者，因为可以合理地预期将不太可能发生eMSC的意外和潜在有害的分化。

在一种实施方式中，犬eMSC可以是干细胞的后代。通常，犬eMSC(i)不表达来自APC的特定标志物；(ii)不组成性表达IDO(iii)不显著地组成性表达MHC II。通常，IDO或MHCII的表达可以通过用IFN-γ刺激来诱导。

另外，还要注意，在本发明的第一方面中提及的细胞群也被称为“本发明的细胞群”。典型地，犬MSC是扩增的ASC，通常是同种或自体扩增的ASC。通常，本发明的细胞群是同质或基本上同质的犬MSC和/或犬eMSC的群。本发明的细胞群本质上包含犬MSC和/或犬eMSC，然而，本发明的细胞群也可以包含其他细胞类型。因此，在一种实施方式中，本发明提供了其中至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％的细胞是犬MSC和/或犬eMSC的本发明的细胞群。

在一种实施方式中，eMSC是eASC，例如人eASC。在一种特定的实施方式中，细胞相对于要治疗的对象是同种异体的。在另一种特定的实施方式中，细胞相对于要治疗的对象是自体同源的。

通常，本发明的细胞群可以具有向至少一种或多种特化细胞谱系分化的能力，所述特化细胞谱系例如但不限于脂肪细胞谱系、成软骨细胞谱系和成骨细胞谱系。在一种实施方式中，本发明的细胞群可以具有分化成选自由脂肪细胞谱系、成软骨细胞谱系和成骨细胞谱系组成的组中的至少两种或所有细胞类型或向选自由脂肪细胞谱系、成软骨细胞谱系和成骨细胞谱系组成的组中的至少两种或所有细胞分化的能力。但是，在替代的实施方式中，这种分化能力降低了，甚至可能不存在，例如，MSC可以至少向成骨细胞谱系和脂肪细胞谱系分化，然而源自MSC的eMSC群仅可以向脂肪细胞谱系分化。这对于该细胞的治疗应用可能是有利的，其中可以将该细胞给药至患者，因为可以合理地预期将不太可能发生eMSC的意外和潜在有害的分化。

如在本发明的第一方面中所提及的，以及在实施例中所举例说明的，我们提供了一种培养基，该培养基通过培养获得自属于犬属的哺乳动物的间充质干细胞(MSC)来条件化。这样的条件培养基包含由这样的MSC分泌的分子，包括独特的基因产物。这样的条件培养基，以及其中包含的任何分子的组合，特别是包括蛋白质或多肽，可以用于疾病的治疗。为了例如治疗或预防疾病，它们可用于补充MSC的活性或代替MSC的活性。

本发明的第一方面的条件培养基可以通过在培养基中培养犬MSC来制成，所述培养基是例如制备用于细胞培养的富营养液体，优选是基础培养基；其中，富营养液体优选是设计用于使MSC在预定的时间长度内生长的无动物和人血清培养基。因此，条件培养基将包含犬MSC分泌的多肽，如实施例中所述。

在优选的实施方式中，无血清培养基包括Knockout DMEM培养基(纽约州格兰德艾兰Invitrogen-Gibco)。

尽管如此，本发明的第一方面的条件培养基可以由适合繁殖犬MSC的任何培养基制成，因此可以具有几种不同的配方中的任一种，只要获得的细胞具有所需的特性并可以进一步繁殖即可。合适的来源如下：杜氏改良伊格尔培养基(DMEM)，Gibco#l 1965-092；和Knockout杜氏改良伊格尔培养基(KO DMEM)，Gibco#10829-018；200mM L-谷氨酰胺，Gibco#15039-027；非必需氨基酸溶液，Gibco 11140-050；β-巯基乙醇，Sigma#M7522；人重组碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)，Gibco#13256-029。示例性的含血清胚胎干细胞(ES)培养基由80％DMEM(通常为KO DMEM)、未热灭活的20％特级胎牛血清(FBS)、0.1mM非必需氨基酸、1mML-谷氨酰胺和0.1niM的β-巯基乙醇。将培养基过滤并在4℃下保存不超过2周。无血清胚胎干细胞(ES)培养基用80％KO DMEM、20％血清替代品、0.1mM非必需氨基酸、1mM L-谷氨酰胺和0.1mMβ-巯基乙醇制成。有效的血清替代品是Gibco#10828-028。将培养基过滤并在4℃下保存不超过2周。在即将使用前，添加人bFGF至终浓度为4ng/mL(Bodnar等人，Geron Corp，国际专利公开文本WO 99/20741)。

在优选的实施方式中，培养基包括补充有10％血清替代培养基(纽约州格兰德艾兰Invitrogen-Gibco)、5ng/ml FGF2(纽约州格兰德艾兰Invitrogen-Gibco)和5ng/mlPDGF AB(新泽西州洛基希尔Peprotech)的Knockout DMEM培养基(纽约州格兰德艾兰Invitrogen-Gibco)。

实施例1清楚地说明了为获得本发明的条件培养基而培养犬MSC的条件；但是，可以适当优化这些条件。

本发明的条件培养基可以按原样用于治疗或在一个或多个处理步骤之后用于治疗。例如，条件培养基可以经UV处理、过滤灭菌等。可以采用一个或多个纯化步骤。

特别地，可以例如通过透析或超滤来浓缩条件培养基。例如，可以使用具有例如3K的标称分子量极限(NMWL)的膜超滤来浓缩培养基。

我们还提供了一种组合物，该组合物包含实施例中所述的一种或多种多肽，优选所有多肽，以代替或补充这样的条件培养基。

来自间充质干细胞的条件培养基，例如根据在此所述的方法和组合物制成的条件培养基，可以用于各种在商业上重要的研究、诊断和治疗目的。

来自间充质干细胞的条件培养基可以特别地用于制备用于治疗疾病的药物组合物。这样的疾病可包括可通过再生疗法治疗的疾病，所述疾病包括皮肤疾病、烧伤、牛皮癣或特应性皮炎。从这个意义上讲，在此要注意，如实施例所示，对由犬MSC向培养基中分泌的蛋白的分析(见表II)显示，表达的蛋白与许多生物学过程有关，包括：组织分化，组织分化包括血管形成、造血作用和骨骼发育。因此，我们一般地提供了获得自属于犬属的哺乳动物的间充质干细胞(MSC)或由获得自属于犬属的哺乳动物的间充质干细胞(MSC)条件化的培养基在调节任何这些生物过程中的用途。

此外，获得自属于犬属的哺乳动物的间充质干细胞(MSC)可以用于治疗这样的疾病，在所述疾病中这些生物过程可能起作用，或者所述疾病的修复或治疗涉及这些生物过程中的任何一个或多个。类似地，出于例如治疗或预防这样的疾病的目的，由获得自属于犬属的哺乳动物的间充质干细胞(MSC)表达的蛋白质单独地或组合地，优选以条件培养基的形式，可以用于补充获得自属于犬属的哺乳动物的间充质干细胞(MSC)的活性或代替获得自属于犬属的哺乳动物的间充质干细胞(MSC)。

因此，这样的条件培养基可以用于治疗皮肤伤口、皮肤病病症、皮肤病变、皮炎、牛皮癣、***、疣、血管瘤、瘢痕瘤、皮肤癌、特应性皮炎、白塞病、慢性肉芽肿病、皮肤T细胞淋巴瘤和溃疡。特别地，这样的条件培养基可以用于治疗牛皮癣或特应性皮炎。另外，条件培养基可以用于帮助个体的伤口愈合或疤痕减少。

特别地，条件培养基可以用于调节涉及血管形成、血液学(特别是免疫过程)或肌肉骨骼发育等的过程。

优选地，所述条件培养基或含有或包含该条件培养基的组合物不包含二甲基亚砜(DMSO)，并且用于人对象的特应性皮炎、湿疹和/或牛皮癣的异种治疗。

此外，由本文所述的MSC(包括条件培养基形式)分泌的任何一种或多种蛋白质可以用于与本文所述的MSC相同的目的。因此，我们提供了一种组合物，该组合物包含存在于条件培养基中的一种或多种多肽，优选基本上所有多肽。具体地，我们提供了一种组合物，该组合物包含表II中列出的，特别是源自狗脂肪组织的MSC的情况下的一种或多种多肽，优选基本上所有多肽。

这样的组合物可以用于条件培养基所可以用于的任何目的。除非上下文另有说明，否则术语“条件培养基”应当视为不仅包括暴露于MSC的细胞培养基，还包括这样一种组合物，该组合物包含存在于条件培养基中的一种或多种多肽，优选基本上所有多肽(见表II)。

显然，本文所述的方法和组合物使得能够由间充质干细胞产生条件培养基。因此，间充质干细胞的任何用途都将同等地附加于来自间充质干细胞的条件培养基上。

如本文所述的条件培养基可以通过任何合适的方式递送至人体或动物体。

因此，我们描述了用于将如本文所述的条件培养基递送至靶细胞、组织、器官、动物体或人体的药物组合物或化妆品组合物或递送***，以及使用该药物组合物或化妆品组合物或递送***将条件培养基递送至靶标的方法。递送***可以包括条件培养基来源，例如含有条件培养基的容器。递送***可以包括用于将条件培养基分配到靶标的分配器。

因此，我们提供了一种用于递送条件培养基的递送***，该递送***包括如本文所述的条件培养基来源以及可操作以将条件培养基递送至靶标的分配器。

我们进一步提供了这样的递送***用于将条件培养基递送至靶标的方法中的用途。

用于将流体输送到体内的输送***在本领域中是已知的，并且包括注射器、外科滴注器、导管(包括灌注导管)，如美国专利第6,139,524号中所述的那些，例如药物递送导管，如美国专利第7,122,019号中所述的那些。

显而易见的是，特定的递送应该可配置为以适当的间隔递送所需量的条件培养基，以便实现最佳治疗。条件培养基的优选递送或给药是局部递送或给药。为此目的，组合物或递送***可具有赋形剂。本说明书中定义的赋形剂是用作组合物中包含的条件培养基的载体或溶媒的惰性物质。本发明的组合物可包含任何赋形剂，优选适合于包含在局部组合物中的任何赋形剂(即皮肤病学可接受的赋形剂)。下文提到的以下助剂可以彼此独立地存在于本发明的组合物中：胶凝剂、油、蜡、增稠剂、亲水或疏水聚合物、乳化试剂、润肤剂、脂肪酸、有机溶剂、抗氧化剂、稳定剂、掩蔽剂、酸化或碱化剂、乳化剂、润滑剂、表面活性剂、成膜剂、增强性能和/或吸引消费者的生物添加剂(例如氨基酸、蛋白质、香草、芦荟提取物或生物类黄酮)、缓冲剂、螯合剂(例如乙二胺四乙酸(EDTA)或草酸)、着色剂、染料、推进剂、消泡剂、湿润剂、维生素、乳液稳定剂、pH调节剂、增稠剂、香料、防腐剂、遮光剂、水和/或醇。用于本发明的组合物的前述辅助剂以本领域技术人员已知的常用量使用。用于本发明的组合物的合适的油选自动物油或植物油或合成油。特别优选的油选自包含液体凡士林、液体石蜡、挥发性和非挥发性硅油、异链烷烃、聚α-烯烃、氟化油和全氟化油的组。用于本发明的组合物的合适的稳定剂可以具有非离子、阴离子、阳离子和两亲性质。优选的稳定剂选自包含聚乙二醇(PEG)及其衍生物、吐温、曲拉通(triton)、司盘(span)、聚甘油、聚烷基甘油酯、烷基磺酸盐、芳基磺酸盐、烷基磷酸酯、烷基甜菜碱的衍生物和磷脂酰甘油。

乳化剂可以以有效使所述组合物成分均匀掺混的量用于本发明的组合物中。合适的乳化剂包括阴离子表面活性剂，如脂肪酸皂，例如硬脂酸钾、硬脂酸钠、硬脂酸铵和三乙醇胺硬脂酸酯；含有脂肪酸皂的多元醇脂肪酸单酯，例如含有钾盐或钠盐的单硬脂酸甘油酯；硫酸酯(钠盐)，例如月桂基5硫酸钠和乙酰基硫酸钠；含有硫酸酯的多元醇脂肪酸单酯，例如含有月桂基硫酸钠的单硬脂酸甘油酯；(ii)阳离子氯化物，如N(硬脂酰基胆胺基甲酰基甲基)吡啶鎓(N(stearoyl colamino formylmethyl)pyridium)；N-大豆油基-N-乙基吗啉氮鎓乙基硫酸盐；烷基二甲基苄基氯化铵；二异丁基苯氧基乙氧基乙基二甲基苄基氯化铵；和乙酰基氯化吡啶鎓(acetyl pyridium chloride)；(iii)非离子物质，如聚氧乙烯脂肪醇醚，例如单硬脂酸酯；聚氧乙烯月桂醇；聚氧丙烯脂肪醇醚，例如丙氧基化油醇；聚氧乙烯脂肪酸酯，例如聚氧乙烯硬脂酸酯；聚氧乙烯脱水山梨糖醇脂肪酸酯，例如聚氧乙烯脱水山梨糖醇单硬脂酸酯；脱水山梨糖醇脂肪酸酯，例如脱水山梨糖醇；聚氧乙二醇脂肪酸酯(polyoxyethylene glycol fatty acid ester)，例如聚氧乙二醇单硬脂酸酯；多元醇脂肪酸酯，例如单硬脂酸甘油酯和单硬脂酸丙二醇酯；和乙氧基化羊毛脂衍生物，例如乙氧基化羊毛脂、乙氧基化羊毛脂醇和/或乙氧基化胆固醇。

润肤剂也可以以防止或减轻干燥的量用于本发明的组合物中。合适的润肤剂包括但不限于烃油和蜡；硅油；甘油三酸酯；乙酰甘油酯；乙氧基化甘油酯；烷基酯；烯基酯；脂肪酸；脂肪醇；脂肪醇醚；醚酯；羊毛脂及其衍生物；多元醇(polyols)和聚醚衍生物；多元醇(polyol)酯；蜡酯；蜂蜡衍生物；植物蜡；磷脂；固醇；和/或酰胺。

表面活性剂也可以进一步用于本发明的组合物中。合适的表面活性剂例如为，通常如下分类的那些表面活性剂：清洁剂、乳化试剂、泡沫促进剂、助水溶剂、增溶剂、助悬剂和有助于固体在液体中分散的非表面活性剂。

可以优选用于本发明组合物中的成膜剂应保持组合物顺滑和均匀，并且优选没有限制。合适的成膜剂选自丙烯酰胺/丙烯酸钠共聚物；丙烯酸铵共聚物；秘鲁香脂(BalsamPeru)；纤维素胶；乙烯/马来酸酐共聚物；羟乙基纤维素；羟丙基纤维素；聚丙烯酰胺；聚乙烯；聚乙烯醇；pvm/MA共聚物(乙烯基甲基醚/马来酸酐共聚物)；PVP(聚乙烯吡咯烷酮)；马来酸酐聚合物，乙烯基吡咯烷酮/十六烯共聚物；丙烯酸丙烯酯共聚物等。PH调节剂也可用于本发明的组合物中。这些pH调节剂优选选自：氢氧化铵、三乙醇胺或柠檬酸。

用于本发明的组合物的增稠剂优选选自：小烛树蜡(candelilla)、巴西棕榈蜡(carnauba)和微晶蜡、交联丙烯酸聚合物、卡波姆、甲基羟乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素或羟乙基纤维素和聚乙烯增稠剂。

用于本发明组合物的优选有机溶剂的实例包括低级脂族醇和多元醇。

用于本发明的组合物的合适的抗氧化剂优选选自包括以下的组：抗坏血酸(维生素C)、L-抗坏血酸钠、L-抗坏血酸钙、抗坏血酸棕榈酸酯、丁基羟基茴香醚、丁基羟基甲苯、钙二钠-EDTA、异抗坏血酸、卵磷脂、乳酸、多磷酸盐、生育酚(维生素E)(例如α-生育酚、γ-生育酚、δ-生育酚)、没食子酸丙酯、没食子酸辛酯、没食子酸十二烷基酯、异抗坏血酸钠、柠檬酸、柠檬酸钠、柠檬酸钾和氯化亚锡。优选用于本发明的组合物中的胶凝剂可以是天然或合成聚合物。天然聚合物优选选自：琼脂-琼脂、藻酸盐、果胶、卡波姆、角叉菜胶、酪蛋白、糊精、明胶、***胶、角蛋白、刺槐豆胶、黄原胶等。可用于本发明的组合物中的优选的合成聚合物选自：丙烯酸聚合物、聚丙烯酰胺和环氧烷聚合物。

如已经表明的，可以将任何给药途径用于将本发明的组合物给药至对象，优选给药途径为静脉内、口服和局部给药。在优选实施方式中，本发明的组合物是可以配制成液体或半固体形式的局部配方，优选配制成液体、流体、泡沫、乳霜、凝胶、糊剂、香脂、喷雾剂、软膏、洗液、调节剂、补品、牛奶、慕斯、乳液、血清、油、条状物、洗发剂、果冻、悬浮液、分散体、喷发定型剂、涂料、酏剂、滴剂或气雾剂。在特定的实施方式中，本发明的活性化合物以脂质体制剂的形式局部给药。如本发明中所使用的，“脂质体”是由一个或多个同心层组成的人造囊泡，并且特别用于将物质(即条件培养基)递送至体细胞。

局部给药本发明的组合物导致条件培养基中活性化合物的生物利用度高。在药理学中，生物利用度用于描述到达全身循环的原形药物的给药剂量的分数，这是药物主要的药代动力学特性之一。因此，生物利用度是药代动力学的重要工具之一，在计算非静脉内给药途径的剂量时必须考虑生物利用度。

显而易见的是，递送方法将取决于条件培养基所要输送至的具体器官，并且技术人员将能够确定相应地采用哪种手段。

以下实施例仅用于说明目的，并且不限制本发明。

实施例

实施例1本发明的条件培养基的获取

一般而言，本发明的条件培养基可以通过如下获得：在合适的细胞培养基中，优选在补充有10％FBS和PSG的DMEM中，培养MSC(间充质干细胞)直至达到70％至80％汇合(通常在第3代达到这样的汇合水平)，所述MSC优选源自狗脂肪组织。

脂肪组织从一个或几个健康的供体获得。来自每个供体的约10g至500g脂肪组织将产生一批主细胞库(master cell bank)。供体的年龄可能影响细胞的体外寿命，因此原始的供体将在两岁以下。将评估供体的临床病史和良好的总体状况。将收集几个样本进行常规和疾病测试，并证明没有病原体。脂肪组织的提取将根据兽医外科标准在手术室或用于提取的稳定设备中进行。组织提取将由有资质的兽医在动物福利条件下进行。

用于脂肪组织提取的部位将优选地是肝镰状韧带，但是脂肪组织也可以从其他腹膜内脂肪获得的或是皮下的(即尾巴的骨肉部分位)。收集脂肪组织的程序如下：简单来说，根据标准外科技术，将该区域彻底地清洁、剃毛和消毒。然后，在局部麻醉或全身麻醉下进行切割。将提取的脂肪组织放置在无菌容器中并进行相应处理。

一旦达到这样的汇合水平，则将培养基丢弃，并且应当用盐溶液例如PBS漂洗细胞，优选漂洗三次。然后，应当在无血清和无抗生素的培养基(如DMEM)中培养细胞至少约24小时。然后应当收集条件培养基，并通过0.2毫米过滤器过滤以除去细胞碎片。

特别地，按如下获得本实施例中使用的条件培养基：

脂肪组织从狗(家犬(Canis lupus familiaris L.))、猫(家猫(Felissilvestris catus L.))和马(Equus caballus L.)以及从人中，通过外科切除对来自动物和人的腹部区域的所述组织进行无菌采集而获得。然后将从这样的脂肪组织中获得的MSC在补充有10％FBS和PSG的DMEM中培养，直至达到70％至80％汇合，在第3代达到了这样的汇合水平。然后丢弃培养基，并用PBS漂洗细胞3次。然后用无血清和无抗生素的培养基培养细胞24至72小时。然后收集条件培养基，并通过0.2毫米过滤器过滤以除去细胞碎片。注意，如下文实施例2所示表征了这四种条件培养基(获得自狗、马、人和猫)。

分离细胞，并通过流式细胞术鉴定的表面标志物将所述细胞表征为MSC。

实施例2实施例1中获得的条件培养基的表征

蛋白质组分析仪阵列(Proteome Profiler Array)用于条件培养基的表征。

按照制造商的说明，使用人XL细胞因子阵列试剂盒R&D***(目录号ARY022B)。它是同时检测样品之间细胞因子差异的快速灵敏工具。该试剂盒可用于测量多达105种可溶性人蛋白质的相对表达水平。

为了进行条件培养基的表征，将捕获抗体和对照抗体一式两份地在硝酸纤维素膜上点样。将实施例1中获得的细胞培养上清液与蛋白质组分析仪人XL细胞因子阵列直接孵育过夜。洗涤该膜以除去未结合的物质，然后与生物素化检测抗体的混合物一起孵育。接着施用链霉亲和素-HRP和化学发光检测试剂，并在每个捕获点处产生一个信号，该信号对应于结合的蛋白质的量。

表I中示出了105种不同的检测蛋白的清单。在下图中可以找到四种不同物种的结果：图1(人)、图2(狗)、图3(猫)和图4(马)。

表I.人XL细胞因子阵列坐标，示出了阳性对照和阴性对照、所检查的分析物、分析物的Entrez基因ID以及其他命名(如果存在)。

表II中可以找到平均像素密度的比较结果。

表II四种分析物种的代表性印迹的平均像素密度

鉴于这些结果，显然来自不同起源的MSC提供了在定性和定量的角度上不同的条件培养基。

本发明的发明人令人惊讶地发现，获得自狗的条件培养基不仅在动物而且在人类中对于治疗皮肤疾病(例如特应性皮炎和牛皮癣)特别有效。从狗到人的异种用途的成功并非显而易见的。此外，鉴于两个物种之间存在高度的***发育差异，因此这种成功不是显而易见的。

实施例3用本发明的组合物得到的临床结果和兽用结果

病例1.狗的特应性皮炎的治疗

患有皮肤病，即引起睾丸溃疡(testicular affectation)和非常瘙痒的特应性皮炎的八岁老年北京犬作为本发明的治疗的候选动物。在该个体中，对通常的皮质类固醇处方的反应频繁复发。我们使用狗条件培养基作为皮肤洗液来在伤口上治疗这样的皮肤病，在6周内每天涂抹该皮肤洗液两次。

用条件培养基治疗一个半月后，Pancho得到完全缓解，如图5所示。

病例2.遭受严重皮肤灼伤的暹罗猫的治疗

五年前，该暹罗猫掉进盛有沸腾的油的煎锅中。全身30％受到影响，主要是腿以及身体的一侧。最初的治疗由磺胺嘧啶银药膏和液体组成。

这只猫在第一年里病变得到恢复，但是在过去的三年里，大约10×5cm的区域没有恢复，产生了稳定病变，并伴随持续渗出并发痒。

我们使用狗条件培养基作为皮肤洗液来在伤口上治疗这样的稳定病变，在6周内每天涂抹该皮肤洗液两次。

用条件培养基处理后一个半月，伤口大小减小，如图6所示。

病例3.人牛皮癣的治疗

男性，79岁，1975年被诊断为牛皮癣。患处是肘部和右腿，可以清楚地看到从膝盖到几乎脚踝的大块斑。在大约八到十年的时间里，手部有小面积患处。

该人对象经历了许多治疗，包括皮质类固醇治疗。

我们使用狗条件培养基在35天期间以每天两次治疗这样的稳定病变。

使用条件培养物后，使用蒸发器直接涂布在腿部和手部的皮肤病变上，脱皮和皮肤鳞屑消失。

手部的小面积患处几乎完全消失了。请参考图7。

病例4.人牛皮癣的治疗

女性，79岁，被诊断为牛皮癣性关节炎超过10年。

用salazopyrine治疗(4片/天)。对于急性危象，治疗由小剂量甲氨蝶呤组成。这样的治疗被认为是无效的。

我们用狗条件培养基治疗牛皮癣产生的病变。

使用条件培养基21天后，脱皮和皮肤鳞屑明显减少，如图8所示。

病例5.人牛皮癣的治疗

58岁男性，1980年春被诊断为牛皮癣，患处位于肘部。

在主要相关区域进行类固醇霜治疗没有显著改善。改为用石油/碘制剂治疗没有积极效果(1981年)。

改为用乙酰水杨酸多年，没有进一步影响鳞屑产生(1982年)。

头皮定期出现和消失，且从未处于严重或恼人的状态(1990年至…)。

放弃乙酰水杨酸，并在肘部、手部使用保湿剂(1996年至今)。

我们用狗条件培养基治疗牛皮癣产生的病变。

使用条件培养基36天后，脱皮和皮肤鳞屑明显减少，如图9所示。

Claims (10)

1.一种组合物，所述组合物包含条件细胞培养基，所述条件细胞培养基通过包括以下的过程获得或能够通过包括以下的过程获得：在适合繁殖犬间充质基质细胞(MSC)的富营养液体或基础培养基中，培养MSC的群或获得自所述MSC的永生化细胞的群，其中按细胞数计，所述群中至少约50％是获得自属于犬属的哺乳动物的MSC或获得自所述MSC的永生化细胞；和收集所述条件细胞培养基，

其中，所述组合物不包含二甲基亚砜(DMSO)，

并且其中，所述组合物用于人对象特应性皮炎的异种治疗。

2.根据权利要求1所述的用途的组合物，其特征在于，所述MSC获得自属于狗物种的哺乳动物。

3.根据权利要求1或2中任一项所述的用途的组合物，其特征在于，所述间充质基质细胞是从任何前述来源获得的脐带来源的基质细胞、脂肪组织来源的基质细胞、扩增的间充质基质细胞、扩增的脂肪组织来源的基质细胞、骨髓来源的基质细胞、扩增的骨髓来源的基质细胞或永生化间充质基质细胞。

4.根据前述权利要求中任一项所述的用途的组合物，其特征在于，制备用于细胞培养的富营养液体是缓冲盐水溶液，所述缓冲盐水溶液包含氨基酸和维生素且补充有丙酮酸钠和谷氨酰胺。

5.根据前述权利要求中任一项所述的用途的组合物，其特征在于，制备用于细胞培养的富营养液体是含有或不含补充物的基础培养基。

6.根据前述权利要求中任一项所述的用途的组合物，其特征在于，所述组合物可被配置为以适当的间隔递送所需量的条件培养基，以便实现最佳治疗。

7.根据权利要求6所述的用途的组合物，其特征在于，所述组合物可被配置以通过任何以下给药途径来向对象给药：静脉内、口服和局部。

8.根据权利要求7所述的组合物，其特征在于，所述给药途径是局部的，并且其中所述组合物是配制成液体或半固体形式的局部配方。

9.根据权利要求7所述的组合物，其特征在于，所述给药途径是局部的，并且其中所述组合物是局部配方，所述局部配方配制成以下任意一种：液体、流体、泡沫、乳霜、凝胶、糊剂、香脂、喷雾剂、软膏、洗液、调节剂、补品、牛奶、慕斯、乳液、血清、油、条状物、洗发剂、果冻、悬浮液、分散体、喷发定型剂、涂料、酏剂、滴剂或气雾剂。

10.根据权利要求7所述的组合物，其特征在于，所述给药途径是局部的，并且其中所述组合物是配制成脂质体制剂的局部配方。

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