KR20210020221A - 곰취 추출물을 포함하는 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 곰취 추출물을 유효 성분으로 포함하는 조성물 및 이의 제조 방법에 관한 것이다.

Description

곰취 추출물을 포함하는 조성물{COMPOSITION OF AN EXTRACT OF LIGULARIA FISCHERI}
본 발명은 곰취 추출물을 유효 성분으로 포함하는 조성물 및 이의 제조 방법에 관한 것이다.
염증(inflammation)은 외부 감염원(박테리아, 곰팡이, 바이러스, 다양한 종류의 알레르기 유발물질) 등 다양한 자극에 대한 생체의 방어반응으로서 일반적으로 농양의 병리적 상태를 나타낸다. 염증반응은 생체의 세포나 조직에 어떠한 기질적 변화를 가져오는 침습이 가해질 때 외부감염원의 제거와 괴사된 세포, 조직 등을 수복 재생하려고 하는 모든 과정을 포함한다. 따라서 이러한 일련의 반응에는 국소의 혈관, 체액의 각종 조직세포, 면역 세포 등이 관여한다. 최근 분자생물학의 발달과 더불어 염증성 질환에 관여하는 다양한 사이토카인(cytokine)의 유전자발현, 이를 조절하는 전사인자 등 염증반응에 대한 폭넓은 이해가 가능해졌다.
이 중 NF-kB는 많은 염증 유전자의 발현을 위해 요구되는 중요한 전사인자이다. NF-kB는 알러지 염증 반응에서 염증자극에 대한 반응을 매개하는 TNF-α, IL-6와 같은 사이토카인의 발현에 중요한 역할을 한다. 이러한 NF-κB는 활성화되면 iNOS(inducible nitrous oxide systems)의 유전자 발현을 증가시켜 과량의 NO를 생성하게 된다. 이와 같은 NO는 염증반응과 밀접하게 관련되어 있어, 그 생성과 생성에 관여하는 효소의 발현을 조절할 수 있는 물질이 염증질환의 예방 및 치료제로서 주목을 받고 있다. 포유류에서, 다음과 같은 NF-kB 계열은 5 구성원이 있다: RelA/p65, RelB, c-Rel, NF-kB1/p50, 및 NF-kB2/p52. p50-RelA/p65헤테로다이머는 전사인자 중 Rel 계열의 전형적인 구성원이다. 또한, 그것은 NF-kB 의존적 염증 유전자들의 프로모터에 결합하여 이들 유전자의 발현을 유도한다. p65는 NF-kB의 필수적인 요소이다. NF-kB 활성은 RelA/p65 아세틸화 및 탈아세틸화에 의해 조절되고, 이들은 히스톤 아세틸전달효소(histone acetyltransferases, HATs) 및 히스톤 탈아세틸화효소(histone deacetylases, HDACs)에 의해 매개된다.
히스톤은 유전자 전사 활성을 규정하는데 중요한 역할을 한다. HDACs 및 HATs에 의해 두 방향으로 작용하게 조절되는, 히스톤 아세틸화/탈아세틸화는 염증에서 중요한 역할을 하는 주요한 후성적 이벤트이다. 히스톤 아세틸화는 전사인자 NF-kB의 증가된 결합과 관련된다. HDAC 및 HAT는 전염증 반응을 조절하는데 주요한 역할을 한다. 변형된 HAT 및 HDAC 활성은 암, 당뇨병, 심장비대 및 천식을 포함하는 여러 질환을 야기할 수 있다. 고글루코즈는 내인성 HAT 활성을 가지는 전사 공활성체 분자 p300의 집적에 의해 NF-kB 활성을 유도하여, DNA 풀림에 의해 히스톤 아세틸화 및 전염증 사이토카인 분비를 야기한다. 히스톤 아세틸화는 NF-kB의 증가된 활성과 관련되고 이것은 NF-kB의 RelA/p65 서브유닉의 증가된 아세틸화를 야기한다.
HDAC는 다양한 염증성 사이토카인의 생성과 면역 조절기능에서 중요 역할을 수행하여 항염증제 개발의 중요 타겟이기도 하다. HDAC은 NF-κB의 subunit중 하나인 p65 (RelA)와 결합함으로써 염증반응에 참여함이 보고되었다.
Genes Dev, 2000, 14, 55; Expert Rev. Anticancer Ther. 2010, 10, 935; Am. J. Trans. Res, 2011, 3, 166
본 발명의 목적은 히스톤 아세틸전달효소의 활성 억제능 및 염증성 사이토카인 생성을 억제능을 갖는 곰취 주정 추출물을 유효 성분으로 포함하는 염증 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 히스톤 아세틸전달효소의 활성 억제능 및 염증성 사이토카인 생성을 억제능을 갖는 곰취 주정 추출물을 유효 성분으로 포함하는 염증 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공하는 것이다.
마지막으로, 본 발명의 목적은 히스톤 아세틸전달효소의 활성 억제능 및 염증성 사이토카인 생성을 억제능을 갖는 곰취 주정 추출물의 제조 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 일 실시상태는, 곰취의 주정 추출물을 유효성분으로 포함하는 염증 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 실시상태는, 곰취의 주정 추출물을 유효성분으로 포함하는 염증 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.
마지막으로, 본 발명의 일 실시상태는, 곰취를 건조 및 분쇄하여 분말화하는 제1 단계; 상기 곰취 분말을 주정에 넣고 교반 및 추출하는 제2 단계 상기 추출된 액을 원심 분리하고, 원심 분리하여 수득한 상등액을 여과 및 추출하는 제3 단계; 및 상기 추출된 액을 농축 및 건조하는 제4 단계를 포함하는 곰취의 주정 추출물의 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 일 실시상태에 따른 곰취의 주정 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물은 염증 질환의 예방 또는 치료에 효과적이다.
도 1은 곰취의 주정 추출물에 의한 아세틸전달효소의 활성 억제능을 확인한 도이다.
도 2는 아세틸전달효소의 측정 원리를 나타낸 모식도이다.
도 3은 곰취의 주정 추출물에 의한 아세틸전달효소의 활성 억제능의 특이성을 평가한 도이다.
도 4는 곰취의 주정 추출물의 아세틸전달효소의 활성 억제에 의한 염증 반응시 유도된 히스톤/비히스톤 단백질의 아세틸화 억제능을 평가한 도이다.
도 5는 곰취의 주정 추출물에 의한 아세틸전달효소들의 유전자/단백질 발현의 억제능을 평가한 도이다.
도 6은 곰취의 주정 추출물에 의한 p65의 아세틸화 억제능을 확인한 도이다.
도 7은 곰취의 주정 추출물에 의한 NF-kB 표적 유전자인 대표적 염증성 사이토카인 발현 억제능 평가한 도이다.
이하, 본 명세서에 대하여 더욱 상세하게 설명한다.
본 발명의 일 실시상태는, 곰취의 주정 추출물을 유효성분으로 포함하는 염증 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 명세서에서 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함" 한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
본 명세서에서 "유효성분"이란 단독으로 목적하는 활성을 나타내거나 또는 그 자체는 활성이 없는 담체와 함께 활성을 나타낼 수 있는 성분을 의미한다.
본 명세서에서 상기 "예방"이란 상기 약학적 조성물의 투여로 질환을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미한다. 또한, 상기 "치료"란 상기 약학적 조성물의 투여로 질환의 증세가 호전되거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 의미한다.
곰취(Ligularia fischeri)는 쌍떡잎식물로서 초롱꽃목 국화과의 여러해살이풀로서, 고원이나 깊은 산의 습지에서 자라며, 한국, 일본, 중국, 사할린 섬 및 동시베리아 등지에 분포한다. 한방에서는 가을에 뿌리를 캐서 말린 것을 호로칠이라 하여 해수·백일해·천식·요통·관절통·타박상 등에 처방한다.
본 명세서의 일 실시상태에 있어서, 상기 주정의 농도는 30 % 내지 80%(v/v)이다.
또 하나의 실시상태에 있어서, 상기 조성물은 상기 곰취의 주정 추출물을 5 mg/ml 내지 100mg/ml의 농도로 포함한다.
본 명세서의 일 실시상태에 있어서, 상기 곰취의 주정 추출물은 곰취 잎의 주정 추출물이다.
본 명세서의 일 실시상태에 있어서, 상기 조성물은 히스톤 아세틸전달효소의 활성 억제능을 갖는다. 도 1은 곰취의 주정 추출물에 의한 아세틸전달효소의 활성 억제능을 확인한 도이다. 도 3은 곰취의 주정 추출물에 의한 아세틸전달효소의 활성 억제능의 특이성을 평가한 도이다. 도 4는 곰취의 주정 추출물의 아세틸전달효소의 활성 억제에 의한 염증 반응시 유도된 히스톤/비히스톤 단백질의 아세틸화 억제능을 평가한 도이다. 도 5는 곰취의 주정 추출물에 의한 아세틸전달효소들의 유전자/단백질 발현의 억제능을 평가한 도이다. 도 6은 곰취의 주정 추출물에 의한 p65의 아세틸화 억제능을 확인한 도이다. 도 1 및 도 3 내지 도 6을 통하여, 본 발명의 일 실시상태에 따른 곰취의 주정 추출물이 히스톤 아세틸전달효소의 활성 억제능을 갖는 것을 확인할 수 있다.
본 명세서의 일 실시상태에 있어서, 상기 조성물은 히스톤 아세틸전달효소에 대하여 10 mg/ml 미만의 IC50 값을 갖는다.
도 1은 곰취의 주정 추출물에 의한 아세틸전달효소의 활성 억제능을 확인한 도이다. 도 3은 곰취의 주정 추출물에 의한 아세틸전달효소의 활성 억제능의 특이성을 평가한 도이다. 도 1 및 도 3을 통하여 본 발명의 일 실시상태에 따른 곰취의 주정 추출물의 히스톤 아세틸전달효소의 활성 억제능을 확인하였으며, 상기 곰취의 주정 추출물의 히스톤 아세틸전달효소에 대하여 10 mg/ml 미만의 IC50 값을 갖는 것을 확인할 수 있다.
또한, 본 발명의 일 실시상태에 따른 조성물은 염증성 사이토카인 생성을 억제능을 갖는다. 도 7은 곰취의 주정 추출물에 의한 NF-kB 표적 유전자인 대표적 염증성 사이토카인 발현 억제능 평가한 도이다. 도 7을 통하여, 본 발명의 일 실시상태에 따른 곰취의 주정 추출물의 염증성 사이토카인의 생성을 억제하는 것을 확인할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 약효를 증가시키지는 않으나 약학적 조성물에 통상 사용되어 냄새, 맛, 시각 등을 향상시킬 수 있는 성분을 추가로 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 허용 가능한 첨가제를 추가적으로 포함할 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 첨가제는 예컨대, 전분, 젤라틴화 전분, 미결정셀룰로오스, 유당, 포비돈, 콜로이달실리콘디옥사이드, 인산수소칼슘, 락토스, 만니톨, 엿, 아라비아고무, 전호화전분, 옥수수전분, 분말셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스, 오파드라이, 전분글리콜산나트륨, 카르나우바 납, 합성규산알루미늄, 스테아린산, 스테아린산마그네슘, 스테아린산알루미늄, 스테아린산칼슘, 백당, 덱스트로스, 소르비톨 및 탈크 등이 있으나, 이를 한정하지 않는다. 추가로, 상기 약학적 조성물은 단독 사용하거나 기존에 사용된 염증 질환에 대한 예방 또는 치료 활성을 가지는 물질을 포함할 수 있다.
본 발명의 상기 약학적 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하고 경구 또는 비경구용의 인체 또는 수의용으로 제형화될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물을 제제화하는 경우 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제 및 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용할 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제 및 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 본 발명의 화합물을 포함하는 약학적 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(Calcium carbonate), 수크로스(Sucrose) 또는 락토오스(Lactose) 및 젤라틴 등을 섞어 조제할 수 있다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘, 스티레이트, 탈크 같은 윤활제를 사용할 수 있다. 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제 및 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물 및 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제 및 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제 및 좌제가 포함된다. 비수성용제 및 현탁용제로는 프로필렌글리콜(Propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜 및 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구 투여할 수 있다. 상기 제형은 주사용 형태(용액, 현탁액 또는 유탁액)로 조제할 수 있고, 정제, 캅셀제, 연질캅셀제, 수액제, 과립제, 환제 등 경구용으로 조제하는 것이 가장 바람직하다.
상기 조성물은 곰취의 주정 추출물을 캅셀에 부형제 없이 충전하거나 미립된 고체 담체 또는 액체 담체 또는 그 양자와 균일하게 충분히 접촉시켜 제조할 수 있다. 그 다음, 필요한 경우 생성물을 바람직한 제제로 성형할 수 있다.
이러한 담체 부형제의 예로서 전분, 물, 식염수, 링거액 및 덱스트로스 용액이 있다. 당해 기술 분야에 알려진 적합한 제제는 문헌[Remington's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton PA]에 개시되어 있는 것을 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명의 상기 약학적 조성물은 개체에 투여하여 염증 질환을 예방 또는 치료할 수 있다. 본 발명에서 사용된 용어, "개체"는 염증 질환을 가지고 있으며, 본 발명의 상기 약학적 조성물을 투여하여 증상이 호전될 수 있는 질환을 가진 인간을 포함한 말, 양, 돼지, 염소, 개 등의 포유동물을 의미하나, 바람직하게는 인간을 의미한다.
본 발명에서 사용된 용어, "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 개체에 본 발명의 약학적 조성물을 도입하는 것을 의미한다. 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 경구 또는 비경구 투여될 수 있다. 또한, 본 발명의 약학적 조성물이 표적 세포로 이동할 수 있도록 하는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에서 사용된 용어, 약학적으로 유효한 양은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 환자의 체중, 성별, 연령, 건강상태, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명의 다른 실시상태는, 곰취의 주정 추출물을 유효성분으로 포함하는 염증 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.
본 명세서에서 상기 곰취의 주정 추출물은 전술한 약학적 조성물에서 언급된 사항과 서로 모순되지 않는 한 동일하게 적용될 수 있다.
본 명세서는 또한, 상기 식품 조성물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다.
본 명세서에서 상기 "식품 조성물"이란 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 의미한다.
상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 곰취의 주정 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물에 첨가할 수 있는 식품의 예로는 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함할 수 있다. 상기 외에 본 발명의 곰취의 주정 추출물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 식품 조성물은 천연 과일주스, 과일주스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 혼합하여 사용할 수 있다.
본 발명의 또 하나의 일 실시상태는, 곰취를 건조 및 분쇄하여 분말화하는 제1 단계; 상기 곰취 분말을 주정에 넣고 교반 및 추출하는 제2 단계 상기 추출된 액을 원심 분리하고, 원심 분리하여 수득한 상등액을 여과 및 추출하는 제3 단계; 및 상기 추출된 액을 농축 및 건조하는 제4 단계를 포함하는 곰취의 주정 추출물의 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 실시상태에 있어서, 상기 곰취를 건조 및 분쇄하는 제1 단계는 냉동 건조할 수 있다.
또 하나의 실시상태에 있어서, 상기 곰취 분말을 주정에 넣고 교반 및 추출하는 제2 단계는 곰취 분말을 기준으로 2배 내지 6배 부피의 주정에 혼입할 수 있다. 더 구체적으로 상기 곰취 분말을 주정에 넣고 교반 및 추출하는 제2 단계는 곰취 분말을 기준으로 5배 부피의 주정에 혼입할 수 있다.
하나의 실시상태에 있어서, 상기 곰취 분말을 주정에 넣고 교반 및 추출하는 제2 단계는 상온에서 교반할 수 있다.
본 발명의 실시상태에 있어서, 상기 추출된 액을 농축 및 건조하는 제4 단계에서 건조는 냉동 건조할 수 있다.
본 명세서에서 냉동 건조는 건조 대상을 어는점 이하의 온도로 동결시켜 그 상태대로 승화에 의해서 수분을 제거 건조시키는 방법으로 일반적으로 사용되는 방법으로 제조될 수 있다.
본 발명의 상기 제조 방법으로 제조된 곰취의 주정 추출물을 유효 성분으로 포함하는 약학적 조성물을 제공할 수 있다. 상기 약학적 조성물은 앞서 설명한 약학적 조성물의 설명과 동일할 수 있다.
또한, 본 발명의 상기 제조 방법으로 제조된 곰취의 주정 추출물을 유효 성분으로 포함하는 식품 조성물을 제공할 수 있다. 상기 식품 조성물은 앞서 설명한 식품 조성물의 설명과 동일할 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
실시예 1. 곰취의 주정 추출물의 제조
세척한 곰취를 냉동 건조하여 건조한 뒤 분쇄기를 이용하여 분말화하였다. 상기 분말을 분말의 5배 부피의 70% 주정에 혼입한 뒤 상온에서 교반하면서 추출하였다. 상기 추출액을 원심 분리하여 얻은 상등액을 여과하여 고형분을 제거한 추출액을 감압 농축한 뒤, 냉동 건조하여 본 발명의 곰취의 주정 추출물을 제조하였다.
실시예 2. 아세틸전달효소의 활성 억제능 확인
곰취의 주정 추출물에 의한 아세틸전달효소의 활성 억제능을 확인하기 위하여, 실시예 1에서 제조한 10mg/ml, 25mg/ml, 50mg/ml, 그리고 100mg/ml 농도의 곰취의 주정 추출물을 아세틸전달효소를 포함하는 핵 추출물(Nuclear extract)과 함께 인 비트로(in vitro)에서 30분간 반응 후 활성변화 관찰을 위하여 440nm에서 OD (optical density)를 측정하였다.
도 2는 아세틸전달효소의 측정 원리를 나타낸 모식도이다. 구체적으로, 아세틸전달효소의 활성 측정을 위하여 Biovision사의 HAT activity colorimetric assay kit (Cat. No. K332)를 사용하였다. 위의 시약들을 혼합하여 제공된 protocol에 따라 반응 뒤 440nm에서 OD를 측정하는 방식으로 아세틸전달효소의 활성을 평가하였다.
도 1은 곰취의 주정 추출물에 의한 아세틸전달효소의 활성 억제능을 확인한 도이다. 아세틸전달효소의 활성은 대조군(NE만 포함된 군) 대비 (100%) %로 표기하였다. 그 결과 곰취의 주정 추출물 10mg/ml의 경우, 약 35.4%, 25mg/ml의 경우 13.3%, 50mg/ml의 경우 9.4%, 그리고 100mg/ml의 경우 8.2%의 아세틸전달효소의 활성을 보이는 것을 확인하였다. 아세틸전달효소의 활성을 약 50% 낮출수 있는 곰취의 주정 추출물의 IC50 (half maximal inhibitory concentration)값은 약 5.33mg/ml로 예상할 수 있다.
실시예 3. 아세틸전달효소의 활성 억제 특이성 평가
곰취의 주정 추출물에 의한 아세틸전달 효소의 활성 억제 특이성을 평가하기 위하여, 10mg/ml, 25mg/ml, 50mg/ml 및 100mg/ml 농도의 실시예 1에서 제조한 곰취 추출물을 p300, CBP, 및 pCAF와 함께 인 비트로에서 30분간 반응한 후, 활성변화 관찰을 위하여 440nm에서 OD (optical density)를 측정하였다. 아세틸전달효소의 측정 원리는 앞서 실시예 2에서 언급한 바와 동일한 원리이다.
도 3은 곰취의 주정 추출물에 의한 아세틸전달효소의 활성 억제능의 특이성을 평가한 도이다. 아세틸전달효소의 활성은 대조군(아세틸전달효소만 포함된 군) 대비 (100%) %로 표기하였다. 구체적으로 도 3을 살피면, 아세틸전달효소 p300에 대하여, 곰취의 주정 추출물 10mg/ml의 농도에서는 36.5%, 25mg/ml의 농도에서는 20.4%, 50mg/ml의 농도에서 14.5%, 100mg/ml의 농도에서는 15.3%의 아세틸전달효소의 활성을 확인하였다. 따라서, p300에 대한 곰취의 주정 추출물의 IC50 값은 약 6.54mg/ml로 예상할 수 있다. 또한, CBP에 대하여, 곰취의 주정 추출물 10mg/ml의 농도에서는 37.1%, 25mg/ml의 농도에서는 24.8%, 50mg/ml의 농도에서 17.3%, 100mg/ml의 농도에서는 16.0%의 아세틸전달효소의 활성을 확인하였으며, CBP에 대한 곰취의 주정 추출물의 IC50 값은 약 7.54mg/ml로 예상할 수 있다. 마지막으로 pCAF에 대하여, 곰취의 주정 추출물 10mg/ml의 농도에서는 42.3%, 25mg/ml의 농도에서는 25.0%, 50mg/ml의 농도에서 21.7%, 그리고 100mg/ml의 농도에서는 23.5%의 아세틸전달효소의 활성을 확인하였고, pCAF에 대한 곰취의 주정 추출물의 IC50 값은 약 9.36mg/ml로 예상할 수 있다. 상기 도 3의 결과로 실시예 1에서 제조한 곰취의 주정 추출물은 아세틸전달효소의 억제능을 지니고 있는 것을 확인할 수 있었으며, 특히, p300에 대한 민감도가 다소 높은 것을 확인하였다.
실시예 4. 히스톤 및 비히스톤 단백질의 아세틸화 억제능 평가
곰취의 주정 추출물의 아세틸전달효소 활성 억제능이 항염 작용에 미치는 영향을 관찰하기 위하여 Raw264.7 세포주에 10nM의 LPS(lipopolysaccharides)와 각 25mg/ml, 50mg/ml의 곰취추출물을 2시간 동안 병합처리 후 세포로부터 비히스톤 단백질 및 히스톤단백질을 추출하여 웨스턴 블라팅을 실시하였다.
도 4는 곰취의 주정 추출물의 아세틸전달효소의 활성 억제에 의한 염증 반응시 유도된 히스톤/비히스톤 단백질의 아세틸화 억제능을 평가한 도이다. 도 4를 구체적으로 살피면, LPS 처리로 염증 반응이 유도되었을 때 비히스톤 단백질과 histone H3K9, H4K8, H4K12, H4K15 및 H4K16의 아세틸화가 증가되는 것을 확인할 수 있다. 또한, LPS 및 곰취의 주정 추출물이 혼합 처리된 경우 LPS에 의하여 증가되었던 비히스톤 및 히스톤 단백질의 아세틸화가 감소되는 것을 확인할 수 있었다. 이와 같은 결과로 곰취의 주정 추출물이 아세틸전달효소의 억제능을 가지며, 염증 반응으로 유도된 비히스톤 및 히스톤 단백질의 아세틸화의 억제능 역시 가지는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 5. 아세틸전달효소의 유전자 및 단백질 발현 억제능 평가
비히스톤/히스톤 단백질의 아세틸화에 직접적인 영향을 주는 아세틸화전달효소들의 유전자 발현이 곰취의 주정 추출물에 의하여 억제되는지 여부를 관찰하기 위하여 qRT-PCR (quantitative real time polymerase chain reaction)을 실시하였다. Raw264.7 세포주에 각각 10 mg/mL, 25 mg/mL, 50 mg/mL 및 100mg/mL 농도의 곰취의 주정 추출물을 18시간 전처리 후 마지막 6시간 동안 1ng LPS를 추가하여 처리함으로써 염증반응을 유도하였다. 최종 18시간되는 시점에서 세포를 수거하고 RNA를 추출 후 역전사효소를 이용한 역전사반응으로 cDNA를 합성하여 qRT-PCR에 이용하였다. P300, CBP, 및 pCAF를 선별적으로 증폭할 수 있는 프라이머를 합성하여 해당 qRT-PCR을 통해 유전자를 증폭한 후 발현변화를 대조군과 상대 비교하였다.
도 5는 곰취의 주정 추출물에 의한 아세틸전달효소들의 유전자/단백질 발현의 억제능을 평가한 도이다. 구체적으로 도 5를 살피면, 대조군 대비 염증반응 (LPS처리)에 의하여 p300 및 CBP 아세틸전달효소의 유전자 발현이 p300의 경우, 1.9배, CBP의 경우 1.7배로 약 2배 증가하였으며, 10 mg/mL, 25 mg/mL 및 50mg/mL 곰취의 주정 추출물이 전처리된 경우 p300 유전자의 발현은 LPS가 처리되지 않은 대조군과 동일하였으며, 100mg/mL의 곰취의 주정 추출물이 전처리된 경우 0.4배로 대조군 대비 큰 폭으로 감소하였다. 또한, LPS에 의하여 1.7배 가까이 증가하였던 CBP 발현은 곰취의 주정 추출물의 전처리에 의하여 곰취의 주정 추출물 10mg/ml의 농도에서는 0.6배, 25mg/ml의 농도에서는 0.4배, 50mg/ml의 농도에서 0.6배, 100mg/ml의 농도에서는 0.7배로 나타나는 것을 확인하였다. pCAF의 경우 LPS처리에 의한 유전자 발현증가가 관찰되지 않았으나 10mg/mL 농도 및 25mg/mL 농도의 곰취의 주정 추출물 전처리에 의하여 대조군 대비 유전자 발현의 감소되는 것을 확인하였다. 또한, 동일한 준비 과정을 거쳐 단백질 추출 후 웨스턴블라팅을 통하여 p300, CBP 및 pCAF의 단백질 발현을 관찰한 결과 곰취의 주정 추출물은 p300과 CBP의 단백질 발현을 저해하는 것을 확인할 수 있었다. 상기와 같은 결과로 곰취의 주정 추출물은 아세틸전달효소의 유전자 및 단백질의 발현을 억제하는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 6. p65의 아세틸화 억제능 평가
p65는 염증반응 매개의 주요 전사인자로 염증성 사이토카인의 발현에 중요한 역할을 한다. p65가 염증반응을 매개하기 위해서는 염증신호전달에 의한 p65K310의 아세틸화와 핵으로의 이동이 필수적이다. 곰취의 주정 추출물의 아세틸전달효소 p300의 활성억제를 통하여 p65K310의 아세틸화를 억제하고 연속적으로 핵내 유입을 저해하는지 여부를 평가하기 위하여 다음의 실험들을 진행하였다.
(A) Raw264.7 세포주에 각각 10 mg/mL, 25 mg/mL, 50 mg/mL 및 100 mg/mL 농도의 곰취의 주정 추출물을 18시간 전처리 후 마지막 2시간 동안 1ng LPS를 추가하여 처리함으로써 염증반응을 유도하였다. 최종 18시간되는 시점에서 세포를 수거하고 세포질 단백질과 핵단백질을 분리하여 웨스턴블라팅을 실시하였다. 도 6은 곰취의 주정 추출물에 의한 p65의 아세틸화 억제능을 확인한 도이다. 도 6을 살피면, 곰취의 주정 추출물을 처리한 경우, p65K310의 아세틸화가 감소하였으며, 곰취의 에턴올 추출물의 농도가 높아짐에 따라 p65의 핵내 이동이 감소하는 것을 확인할 수 있었다.
(B) 공초점 현미경(Confocal microscope)을 통하여 실제 세포 내 p65 단백질 (Green, FITC)을 염색하고 그 이동을 관찰하였다. 도 6은 곰취의 주정 추출물에 의한 p65의 아세틸화 억제능을 확인한 도이다. 도 6을 자세히 살피면, LPS 처리에 의하여 핵과 세포질 모두에서 관찰된 반면, 50mg/mL의 곰취의 주정 추출물 전처리군에서 p65 단백질은 세포질에서만 관찰되었다. 이를 통하여 곰취추출물이 p65의 아세틸화 억제를 통해 핵으로의 이동을 저해하는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 7. 염증성 사이토카인 발현 억제능 평가
아세틸전달효소의 활성은 유전자들의 발현 증가의 직접적인 원인으로 작용한다. 그러므로 곰취의 주정 추출물에 의한 아세틸전달효소 활성 억제가 실제로 NF-kB의 표적 유전자인 염증성 사이토카인의 발현에 미치는 영향을 qRT-PCR (quantitative real-time polymerase chain reaction)을 통하여 평가하였다. Raw264.7 세포주에 각각 10 mg/mL, 25 mg/mL, 50 mg/mL 및 100 mg/mL 농도의 곰취의 에턴올 추출물을 18시간 전처리 후 마지막 6시간 동안 1ng의 LPS를 추가하여 처리함으로써 염증반응을 유도하였다. 최종 18시간되는 시점에서 세포를 수거하고 RNA를 추출 후 역전사효소를 이용한 역전사반응으로 cDNA를 합성한 후, qRT-PCR에 이용하였다. IL-6, IL-1β 및 TNF-α를 선별적으로 증폭할 수 있는 프라이머를 합성하여 해당 qRT-PCR을 통해 유전자를 증폭한 후 발현변화를 대조군과 상대 비교하였다. 도 7은 곰취의 주정 추출물에 의한 NF-kB 표적 유전자인 대표적 염증성 사이토카인 발현 억제능 평가한 도이다. 도 7을 자세히 살피면, IL-6 및 IL-1β 모두 LPS에 의한 염증 반응 유도 시 대조군 대비 3,000배 정도의 발현 증가를 보인데 반해, 곰취의 주정 추출물 전처리 군에서는 IL-6는 농도 별로 각각 1238, 1395, 1009 및 499배 증가에 그치고, IL-1β 는 농도 별로 각각 2121, 1528, 1291, 1057배의 증가에 그치는 것을 확인할 수 있었다. 또한, TNFα의 발현의 발현은 LPS에 의하여 약 13배 정도 증가하였고, 곰취의 주정 추출물이 전처리 된 경우 농도 별로 각각 11.8, 12.4, 10.4, 10.5배의 증가되는 것으로 통계적으로 유의함을 확인하였다.
상기 실시예 2 내지 7의 실험 결과로, 본 발명의 일 실시상태에 따른 곰취의 주정 추출물은 아세틸전달효소의 활성 억제능을 가지고, 염증성 사이토카인의 생성의 억제능을 갖는 것을 확인할 수 있다. 따라서, 본 발명의 일 실시상태에 따른 곰취의 주정 추출물은 염증 질환의 예방 또는 치료에 효과적인 것을 확인할 수 있다.

Claims (11)

  1. 곰취의 주정 추출물을 유효성분으로 포함하는 염증 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 주정의 농도는 30 % 내지 80 %(v/v)인 것인 염증 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 상기 곰취의 주정 추출물을 5 mg/ml 내지 100mg/ml의 농도로 포함하는 것인 염증 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 곰취의 주정 추출물은 곰취 잎의 주정 추출물인 것인 염증 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 히스톤 아세틸전달효소의 활성 억제능을 갖는 것인 염증 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 히스톤 아세틸전달효소에 대하여 10 mg/ml 미만의 IC50 값을 갖는 것인 염증 질환 또는 치료용 약학적 조성물.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 염증성 사이토카인 생성을 억제능을 갖는 것인 염증 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  8. 곰취의 주정 추출물을 유효성분으로 포함하는 염증 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물.
  9. 곰취를 건조 및 분쇄하여 분말화하는 제1 단계;
    상기 곰취 분말을 주정에 넣고 교반 및 추출하는 제2 단계;
    상기 추출된 액을 원심 분리하고, 원심 분리하여 수득한 상등액을 여과 및 추출하는 제3 단계; 및
    상기 추출된 액을 농축 및 건조하는 제4 단계를 포함하는 곰취의 주정 추출물의 제조 방법.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 곰취를 건조 및 분쇄하는 제1 단계는 냉동 건조하는 것인 곰취의 주정 추출물의 제조 방법.
  11. 제9항에 있어서,
    상기 곰취 분말을 주정에 넣고 교반 및 추출하는 제2 단계는 곰취 분말을 기준으로 2배 내지 6배 부피의 주정에 혼입하는 것인 곰취의 주정 추출물의 제조 방법.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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Genes Dev, 2000, 14, 55; Expert Rev. Anticancer Ther. 2010, 10, 935; Am. J. Trans. Res, 2011, 3, 166

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