KR20210018336A - 항인터류킨-17a 항체, 그의 약학 조성물 및 용도 - Google Patents

항인터류킨-17a 항체, 그의 약학 조성물 및 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 자가면역 질환 치료 및 분자 면역학 분야에 포함되며, 항IL-17A 항체, 그의 약학 조성물, 및 그의 용도에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 단일클론 항체의 중쇄 가변 영역이 각각 서열 번호 31-33에 기재된 아미노산 서열을 갖는 HCDR1-HCDR3, 또는 각각 서열 번호 37-39에 기재된 아미노산 서열을 갖는 HCDR1-HCDR3을 포함하고, 단일클론 항체의 경쇄 가변 영역이 각각 서열 번호 34-36에 기재된 아미노산 서열을 갖는 LCDR1-LCDR3, 또는 각각 서열 번호 40-42에 기재된 아미노산 서열을 갖는 LCDR1-LCDR3을 포함하는 것인, 단일클론 항체 또는 그의 항원 결합 단편에 관한 것이다. 본 발명의 단일클론 항체는 IL-17A에 특이적으로 결합할 수 있고, IL-17A의 그의 리간드에의 결합을 특이적으로 길항시킬 수 있고, IL-17A에 의한 섬유아세포의 활성화를 억제시킬 수 있다.

Description

항인터류킨-17A 항체, 그의 약학 조성물 및 용도
본 발명은 분자 면역학 분야에 속하고, 항인터류킨-17A 항체, 그의 약학 조성물 및 그의 용도에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 항인터류킨-17A 단일클론 항체에 관한 것이다.
인터류킨-17A(IL-17A 또는 IL 17A로 약칭)는 6개의 구성원, 즉, IL-17A(IL-17A가 최초로 발견된 것이고, 이는 또한 IL-17로도 불린다), IL-17B, IL-17C, IL-17D, IL-17E(이는 또한 IL-25로도 명명) 및 IL-17F를 갖는 IL-17 시토카인 패밀리의 구성원이다(문헌 [Shi Peiqing et al., Chinese Journal of Cell Biology 33: 345-357 (2011)]). IL-17F는 IL-17A와 약 50%의 상동성을 공유하고, 그의 코딩 유전자는 염색체 6p12의 동일한 세그먼트에 위치한다(문헌 [Gaffen et al., Nat Rev Immunol 9:556-67 (2009)]). IL-17A 및 IL-17F는 예컨대, IL-17A/IL-17A 및 IL-17F/IL-17F와 같은 동종이량체 뿐만 아니라, 이종이량체 IL-17A/IL-17F 형태로 존재할 수 있다. IL-17A 및 IL-17F는 수용체에의 결합에 의해 생물학적 효과를 나타낸다다(문헌 [Wright et al., J Immunol 181: 2799-805 (2008)]).
IL-17 수용체(IL-17R: IL-17 receptor) 패밀리는 5개의 구성원, 즉, IL-17RA, IL-17RB, IL-17RC, IL-17RD, 및 IL-17RE로 구성된다. IL-17 수용체 패밀리의 구성원은 상이한 수용체 복합체를 형성할 수 있으며, 상기 패밀리 중에서 현재까지 발견된 것 중 가장 큰 분자인 IL-17RA는 적어도 4개의 리간드에 대한 신호를 전달하는 공통 서브유닛이고, 주요 생물학적 효과를 나타낸다(문헌 [Gaffen et al., Nat Rev Immunol 9: 556-67 (2009)]). IL-17RA 및 IL-17RC 복합체는 IL-17A 및 IL-17F에의 세포 반응을 매개한다(문헌 [Toy et al., J Immunol 177: 36-9 (2006)]).
자가면역 염증 반응에서 IL-17A가 IL-17F보다 더 중요한데, 그에 대한 중요한 이유는 IL17RA가 IL-17F에 대해서보다 IL-17A에 대해 100배 더 큰 친화도를 갖고(문헌 [Ely et al., Nat Immunol 10 1245-51 (2009)]), IL-17A에 대한 세포의 반응이 IL-17F에 대한 것보다 10배 더 강력하기 때문이다(문헌 [Dubin et al., Immunity 30: 9-11 (2009)]). 항IL-17A 항체 또는 항IL-17-수용체 항체는 IL-17A의 그의 수용체에의 결합을 차단하여 IL-17A의 생물학적 활성을 차단하는 데 사용될 수 있다.
IL-17A는 여러 자가면역 질환(예컨대 건선, 건선성 관절염, 류머티스성 관절염, 강직성 척추염, 전신 홍반성 루프스 등)에서 중요한 역할을 한다. 항IL-17A 단일클론 항체인 세쿠키누맙(Secukinumab)은 중등도 내지 중증의 판상 건선, 건선성 관절염, 및 강직성 척추염 치료용으로서 미국 식품 의약국(FDA: Food and Drug Administration) 및 유럽 의약청(EMA: European Medicines Agency) 승인을 받은 것이다.
소라(psora)로도 또한 공지된 건선은 만성 자가면역 피부 질환이다. 그의 피부 조직학적 특징은 표피 각질형성세포 과다증식, 혈관신생 뿐만 아니라, 수지상 세포, 대식세포, 호중구, 및 T 세포 침윤이다(문헌 [Nestle et al., N Engl J Med, 361: 496-509 (2009)]). 건선에는 다양한 증상이 있고, 그 중에서 판상 건선이 가장 일반적인 유형으로서, 이는 전체 건선 환자의 90% 초과를 차지한다. 건선성 관절염(PsA: psoriatic arthritis)은 특수한 유형의 건선으로서, 건선 발진 뿐만 아니라, 관절과 주변 연조직에서 통증, 부기, 압통, 뻣뻣함 및 운동 장애를 유발한다. 일부 환자는, 장기간 진행되고, 재발되기 쉬우며, 말기 관절 강직증이 발생하며, 장애로 이어지는 천장관절염 및(또는) 척추염을 앓을 수 있다. 건선의 존재가 건선성 관절염과 다른 염증성 관절 질환 사이의 중요한 차이이고, 피부 병변의 중증도는 관절 염증의 정도와 직접적인 관련은 없다(문헌 [Tan Zhen et al., Chinese Journal of Rheumatology 20:354-357 (2016)]).
건선에 걸린 피부 조직에서, IL-17A의 발현이 현저하게 증가하고, 이 증가는 건선 질환 활성과 밀접한 관련이 있다(문헌 [Johansen et al., Brit J Dermatol, 160:319-24 (2009)]; [Lowes et al. J Invest Dermatol 128:1207-11 (2008)]). 건선 환자에서, 항IL-17A 단일클론 항체인 세쿠키누맙은 탁월한 효능을 보였고, 이는 건선 환자의 질환 활성을 현저히 완화시키고, 건선 플라크 영역을 감소시킬 수 있고(문헌 [Langley et al., N Engl J Med, 371:326-38 (2014)]); 세쿠키누맙 또한 건선성 관절염 환자의 관절염 증상을 현저히 감소시키고, 관절 기능을 현저히 개선시킬 수 있다(문헌 [Gottlieb et al., J Drugs Dermatol, 14821-33 (2015)]). 세쿠키누맙은 중등도 내지 중증의 판상 건선 및 건선성 관절염 치료용으로서 FDA 승인을 받은 것이다.
류머티스성 관절염(RA: rheumatoid arthritis)은 염증성 관절 활액 섬유아세포 증식, 관절 및 연골 손상, CD4+ 헬퍼 T 세포 및 자가항체를 생산하는 형질 세포의 침윤을 주요 특징으로 한다. IL-17A는 류머티스성 관절염에서 염증과 골 손상, 둘 모두를 유발할 수 있다. IL-17A는 건강한 사람 또는 골관절염 환자와 비교할 때, 류머티스성 관절염 환자의 류마티스 활액 단핵구에서 높게 발현되며(문헌 [Sarkar et al., Clin Exp Immunol. 177: 652-61 (2014)]), 세포학적 연구는 IL-17A가 골 흡수와 콜라겐 파괴를 자극할 수 있다고 제안한다(문헌 [Kitami et al., Biochimie. 92: 398-404 (2010)]). IL-17A는 연골, 활액 세포, 대식세포 및 골아세포가 염증유발성 시토카인, 예컨대, TNFa, IL-1b 및 IL-6을 분비하고, 생물학적 효과를 발휘하도록 유도할 수 있다. 상기 염증유발성 시토카인은 류머티스성 관절염의 갑작스러운 발병을 유발하고, IL-17A로 유도된 IL-6을 통해 TH17 세포의 수를 유지하여 양성 피드백을 형성하고, 시너지 작용으로 그의 염증 효과를 증폭시켜, 만성 염증성 상태를 확립한다(문헌 [Ogura et al., Immunity 29: 628-36 (2008)]). 길항성 IL-17A가 류머티스성 관절염의 증상을 효과적으로 완화시킬 수 있다. 콜라겐 유도 관절염 마우스 모델에서 중화 IL-17A 또는 그의 수용체는 류머티스성 관절염의 증상을 해소시킬 수 있고(문헌 [Chao et al., Autoimmunity. 2011 May; 44 (3):243-52)]; IL-17 결핍은 콜라겐 유도 관절염으로부터 숙주 마우스를 보호할 수 있는 반면(문헌 [Nakae et al., J Immunol, 171: 6173-7 (2003)]), IL-17A 과다발현은 상기 병태를 악화시킬 수 있다(문헌 [Lubberts et al., Inflamm Res 51: 102-4 (2002)]).
강직성 척추염(AS: ankylosing spondylitis)은 만성 자가면역 질환이다. AS의 초기 병적 특징은 천장 관절, 힘줄 및 인대의 골 부착점의 급성 또는 만성 염증이며, 이는 후기 단계에서 추간판염 및 추간 관절염으로 발전할 수 있고; 모든 AS 환자는 감소된 골밀도를 보인다. 연구에 따르면, AS 환자의 말초 혈액에서 IL-17A를 분비하는 Th17 세포의 수와 IL-17A 농도는 건강한 사람보다 유의적으로 상승되어 있는 것으로 나타났다(문헌 [Gracey et al., Arthritis Rheumatol. 68: 679-89. (2016)]). IL-17A는 다수의 염증 파괴 인자를 생산할 수 있는 다양한 세포, 예컨대, 대식세포, 수지상 세포, 내피 세포, 섬유아세포, 연골세포, 및 골아세포를 활성화시킬 수 있다(문헌 [Ogura et al., Immunity 29: 628-36 (2008)]). 골 조직에서, IL-17A는 골아세포가 핵 인자-κB 리간드 수용체 활성화제(RANKL: receptor activator of nuclear factor-κB ligand)를 발현하도록 유도하고, 파골세포를 활성화시켜 골 흡수를 유도하고, 점증적으로 골 손실을 악화시키고, 직접 또는 간접적으로 골 파괴를 유도한다(문헌 [Gaffen, Curr Rheumatol Rep 11:365-370 (2009)]). AS 환자에서, 항IL-17A 단일클론 항체인 세쿠키누맙은 탁월한 효능을 보였고, 강직성 척추염의 증상 및 징후를 현저히 감소시킬 수 있다(문헌 [Baeten et al., N Engl J Med, 373:2534-48 (2015)]). 이러한 결과에 기초하여, 세쿠키누맙은 강직성 척추염 치료용으로서 FDA 승인을 받은 것이다.
전신 홍반성 루프스(SLE: systemic lupus erythematosus)는 다중 시스템에 영향을 미치는 자가면역 질환이다. 구체적으로, 자가항원에 대한 항체는 환자의 신체에 나타나며, 이는 다양한 조직 또는 기관을 직접 또는 간접적으로 공격하고, 가장 일반적으로 영향을 받는 부위로는 피부, 관절 및 신장을 포함한다. 연구에 따르면, IL-17A는 SLE에서 중요한 역할을 하는 것으로 나타났다. SLE 환자의 말초 혈액에서 IL-17A를 생산하는 세포의 비율은 증가되어 있고, 환자의 혈청내 IL-17A 수준은 비정상적으로 높다(문헌 [Chen et al., J Clin Immunol, 30:221-5 (2010)]). 신장 손상을 동반하는 SLE 환자의 말초 혈액 단핵 세포는 IL-17과 함께 배양되었을 때, 더 많은 IgG, 항dsDNA IgG 및 IL-6을 생산할 수 있으, 이는 IL-17이 B 세포 활성화에 참여할 수 있다는 것을 시사하는 것이다(문헌 [Dong Et al., Chin Med J (Engl), 116:543-8 (2003)]). 최근에는 또한 IL-17A가 BAFF(B-세포 활성화 인자: B-cell activating factor)와 협력하여 B 세포를 아폽토시스로부터 보호함으로써 자가항체를 생산하는 세포의 수를 증가시킬 수 있다는 것이 밝혀졌다(문헌 [Onishi et al., Immunology 129: 311-21 (2010)]).
집중적인 연구 및 독창적인 노력 후에, 본 발명자들은 포유동물 세포 발현 시스템을 사용하여 재조합 IL-17A (24-155)를 항원으로서 발현하여 마우스를 면역화시키고, 마우스 비장 세포와 골수종 세포의 융합에 의해 다수의 하이브리도마 세포 샘플을 수득하였다. 본 발명자들은 다수의 샘플을 스크리닝하여 분리된 하기의 두 하이브리도마 세포주를 수득하였다:
2017년 9월 12일, 중국 기준 배양물 보존 센터(CCTCC)에 수탁 번호 CCTCC NO: C2017102로 기탁된 하이브리도마 세포주 LT006(IL-17A-13E9); 및
2017년 9월 12일, 중국 기준 배양물 보존 센터(CCTCC)에 수탁 번호 CCTCC NO: C2017165로 기탁된 하이브리도마 세포주 LT007(IL-17A-2G2).
본 발명자들은 놀랍게도,
하이브리도마 세포주 LT006이 IL-17A에 특이적으로 결합하는 특이적인 단일클론 항체(13E9로 명명)를 분비 및 생산할 수 있고, 상기 단일클론 항체는 IL-17A의 IL-17RA로의 결합을 매우 효과적으로 차단할 수 있고;
하이브리도마 세포주 LT007은 IL-17A에 특이적으로 결합하는 특이적인 단일클론 항체(2G2로 명명)를 분비 및 생산할 수 있고, 상기 단일클론 항체는 IL-17A의 IL-17RA로의 결합을 매우 효과적으로 차단할 수 있다는 것을 발견하게 되었고;
추가로, 본 발명자들은 독창적으로, 모두가 인간 IL-17A에 효과적으로 결합할 수 있고, IL-17A의 IL-17RA로의 결합을 차단할 수 있고, IL-17A 수용체의 하류 신호전달 경로의 활성화를 억제시킬 수 있는 것인, 항IL-17A 인간화 항체(각각 13E9 H1L1, 13E9 H2L2, 13E9 H3L2; 및 2G2 H1L1, 2G2 H2L2, 2G2 H3L3)를 제조하였고;
본 발명의 항체는 자가면역 질환, 예컨대, 건선, 류머티스성 관절염, 건선성 관절염, 강직성 척추염, 및 전신 홍반성 루프스 예방 및/또는 치료용 약물을 제조할 수 있는 잠재성을 갖는다.
따라서, 하기 발명을 제공한다:
본 발명의 한 측면은
단일클론 항체의 중쇄 가변 영역(VH: heavy chain variable region)이 각각 서열 번호 31-33에 기재된 아미노산 서열을 갖는 HCDR1-HCDR3, 또는 각각 서열 번호 37-39에 기재된 아미노산 서열을 갖는 HCDR1-HCDR3을 포함하고;
단일클론 항체의 경쇄 가변 영역(VL: light chain variable region)이 각각 서열 번호 34-36에 기재된 아미노산 서열을 갖는 LCDR1-LCDR3, 또는 각각 서열 번호 40-42에 기재된 아미노산 서열을 갖는 LCDR1-LCDR3을 포함하는 것인, 단일클론 항체 또는 그의 항원 결합 단편에 관한 것이다.
경쇄 및 중쇄의 가변 영역이 항원의 결합을 결정하고; 각 쇄의 가변 영역은 3개의 초가변 영역, 즉, 상보성 결정 영역(CDR: complementarity determining region)을 함유한다(중쇄(H: heavy chain)의 CDR은 HCDR1, HCDR2, HCDR3을 포함하고, 경쇄(L: light chain)의 CDR은 LCDR1, LCDR2, LCDR3을 포함한다; (Kabat et al.)에 의해 정의, 문헌 [Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition (1991), Volumes 1-3, NIH Publication 91-3242, Bethesda Md] 참조).
상기 (1) 내지 (2)에서 단일클론 항체의 CDR 영역의 아미노산 서열은 당업자에게 널리 공지된 기술 수단, 예를 들어, VBASE2 데이터베이스에 의해 분석되고:
본 발명의 항체 13E9, 13E9 H1L1, 13E9 H2L2, 및 13E9 H3L2는 동일한 CDR을 갖고;
중쇄 가변 영역의 3개의 CDR 영역의 아미노산 서열은 하기와 같고:
HCDR1: SYSFTSDYA(서열 번호 31),
HCDR2: ITYSGVT(서열 번호 32),
HCDR3: ARADYDSYYTMDY(서열 번호 33);
경쇄 가변 영역의 3개의 CDR 영역의 아미노산 서열은 하기와 같다:
LCDR1: QSLVHSNGNTY(서열 번호 34),
LCDR2: KVS(서열 번호 35),
LCDR3: SQSTHFWT(서열 번호 36).
본 발명의 항체 2G2, 2G2 H1L1, 2G2 H2L2, 및 2G2 H3L3은 동일한 CDR을 갖고;
중쇄 가변 영역의 3개의 CDR 영역의 아미노산 서열은 하기와 같고:
HCDR1: SEVFPIAD(서열 번호 37),
HCDR2: ILPSFGRT(서열 번호 38),
HCDR3: ARGNYGFAY(서열 번호 39);
경쇄 가변 영역의 3개의 CDR 영역의 아미노산 서열은 하기와 같다:
LCDR1: QSLLNSDGKTY(서열 번호 40),
LCDR2: LVS(서열 번호 41),
LCDR3: WQGSHFPQT(서열 번호 42).
본 발명의 하나 이상의 실시양태에서, 단일클론 항체 또는 그의 항원 결합 단편에서,
단일클론 항체의 중쇄 가변 영역(VH)은 각각 서열 번호 31-33에 기재된 아미노산 서열을 갖는 HCDR1-HCDR3을 포함하고,
단일클론 항체의 경쇄 가변 영역(VL)은 각각 서열 번호 34-36에 기재된 아미노산 서열을 갖는 HCDR1-HCDR3을 포함한다.
본 발명의 하나 이상의 실시양태에서, 단일클론 항체 또는 그의 항원 결합 단편에서,
단일클론 항체의 중쇄 가변 영역(VH)은 각각 서열 번호 37-39에 기재된 아미노산 서열을 갖는 HCDR1-HCDR3을 포함하고,
단일클론 항체의 경쇄 가변 영역(VL)은 각각 서열 번호 40-42에 기재된 아미노산 서열을 갖는 HCDR1-HCDR3을 포함한다.
본 발명의 하나 이상의 실시양태에서, 단일클론 항체 또는 그의 항원 결합 단편에서,
중쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 서열 번호 2, 서열 번호 6, 서열 번호 10, 서열 번호 14, 서열 번호 16, 서열 번호 20, 서열 번호 24, 및 서열 번호 28로부터 선택되고;
경쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 서열 번호 4, 서열 번호 8, 서열 번호 12, 서열 번호 18, 서열 번호 22, 서열 번호 26, 및 서열 번호 30으로부터 선택된다.
본 발명의 하나 이상의 실시양태에서, 단일클론 항체 또는 그의 항원 결합 단편에서,
중쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 서열 번호 2, 서열 번호 6, 서열 번호 10, 및 서열 번호 14로부터 선택되고, 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 서열 번호 4, 서열 번호 8, 및 서열 번호 12로부터 선택되거나; 또는
중쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 서열 번호 16, 서열 번호 20, 서열 번호 24, 및 서열 번호 28로부터 선택되고, 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 서열 번호 18, 서열 번호 22, 서열 번호 26, 및 서열 번호 30으로부터 선택된다.
본 발명의 하나 이상의 실시양태에서, 단일클론 항체 또는 그의 항원 결합 단편에서, 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역은 하기 (1) 내지 (8) 중 어느 하나로부터 선택된다:
(1) 서열 번호 2에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및
서열 번호 4에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(2) 서열 번호 6에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및
서열 번호 8에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(3) 서열 번호 10에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및
서열 번호 12에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(4) 서열 번호 14에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및
서열 번호 12에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(5) 서열 번호 16에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및
서열 번호 18 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(6) 서열 번호 20에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및
서열 번호 22에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(7) 서열 번호 24에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및
서열 번호 26에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; 및
(8) 서열 번호 28에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및
서열 번호 30에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역.
본 발명의 하나 이상의 실시양태에서, 단일클론 항체 또는 그의 항원 결합 단편에서, 단일클론 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 Fab, Fab', F(ab')2, Fd, Fv, dAb, 상보성 결정 영역 단편, 단일 쇄 항체, 인간화 항체, 키메라 항체 및 디아바디로부터 선택된다.
본 발명의 하나 이상의 실시양태에서, 단일클론 항체 또는 그의 항원 결합 단편에서, 단일클론 항체는 약 100 nM 미만, 예컨대, 약 10 nM, 5 nM, 4 nM, 3 nM, 2.5 nM, 2 nM, 또는 그보다 낮은 값 미만의 EC50로 IL-17A 단백질에 결합하고; 바람직하게는, EC50은 경쟁적 ELISA 방법에 의해 측정된다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 단일클론 항체 또는 그의 항원 결합 단편에서, 단일클론 항체는 약 10-5 M 미만, 예컨대, 약 10-6 M, 10-7 M, 10-8 M, 10-9 M, 10-10 M, 또는 그보다 낮은 값 미만의 KD로 IL-17A 단백질에 결합하고; 바람직하게는, KD는 포르테바이오(Fortebio) 분자 상호작용 장치에 의해 측정된다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 단일클론 항체 또는 그의 항원 결합 단편에서, 단일클론 항체는 약 100 nM 미만, 예컨대, 약 10 nM, 1 nM, 0.9 nM, 0.8 nM, 0.7 nM, 0.6 nM, 0.5 nM, 0.4 nM, 0.3 nM, 0.2 nM, 0.1 nM, 또는 그보다 낮은 값 미만의 EC50로 IL-17A 단백질에 결합하고; 특히, EC50은 간접 ELISA 방법에 의해 측정된다.
본 발명의 하나 이상의 실시양태에서, 단일클론 항체는 비CDR 영역을 포함하고, 비CDR 영역은 뮤린 이외의 종, 예컨대 인간 항체로부터의 것이다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 면역글로불린의 불변 영역은 인간화 불변 영역이고, 예를 들어, 중쇄 불변 영역은 Ig 감마-1 쇄 C 영역, 수탁:P01857을 사용하고; 경쇄 불변 영역은 카파 쇄 C 영역, 수탁:P01834이다.
본 발명의 하나 이상의 실시양태에서, 단일클론 항체 또는 그의 항원 결합 단편에서, 단일클론 항체는 중국 기준 배양물 보존 센터(CCTCC)에 수탁 번호 CCTCC NO: C2017102로 기탁된 하이브리도마 세포주 LT006에 의해 생산되거나; 또는
단일클론 항체는 중국 기준 배양물 보존 센터(CCTCC)에 수탁 번호 CCTCC NO: C2017165로 기탁된 하이브리도마 세포주 LT007에 의해 생산된다.
본 발명의 하나 이상의 실시양태에서, 단일클론 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 종양 또는 자가면역 질환을 예방 및/또는 치료하는 데, 또는 자가면역 질환을 진단하는 데 사용되고; 바람직하게는, 자가면역 질환은 건선, 류머티스성 관절염, 건선성 관절염, 강직성 척추염, 및 전신 홍반성 루프스로부터 선택되고; 바람직하게는, 건선은 중등도 내지 중증의 판상 건선이다.
본 발명의 하나 이상의 실시양태에서, 단일클론 항체 또는 그의 항원 결합 단편은
IL-17A의 IL-17RA로의 결합을 차단하는 데,
IL-17A 활성 또는 수준을 조절하는 데(예컨대, 하향조절하는 데), 또는
세포에서 IL-6 발현을 억제시키는 데 사용된다.
본 발명의 또 다른 측면은 본 발명에 기술된 단일클론 항체 중 어느 하나의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자에 관한 것이다.
본 발명의 하나 이상의 실시양태에서, 단리된 핵산 분자는 하기 (1) 내지 (8) 중 임의의 것으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함한다:
(1) 서열 번호 1，서열 번호 3;
(2) 서열 번호 5，서열 번호 7;
(3) 서열 번호 9， 서열 번호 11;
(4) 서열 번호 13，서열 번호 11;
(5) 서열 번호 15，서열 번호 17;
(6) 서열 번호 19，서열 번호 21;
(7) 서열 번호 23，서열 번호 25; 및
(8) 서열 번호 27，서열 번호 29.
본 발명의 또 다른 측면은 본 발명의 단리된 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터에 관한 것이다. 바람직하게는, 재조합 벡터는 재조합 발현 벡터, 예컨대, 재조합 원핵성 발현 벡터 또는 재조합 진핵성 발현 벡터이다.
본 발명의 또 다른 측면은 본 발명의 재조합 벡터를 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 측면은 본 발명의 숙주 세포를 적절한 조건하에서 배양하는 단계 및 세포 배양물로부터 단일클론 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 단리시키는 단계를 포함하는, 본 발명에 기술된 단일클론 항체 또는 그의 항원 결합 단편 중 어느 하나를 제조하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 측면은
중국 기준 배양물 보존 센터(CCTCC)에 수탁 번호 CCTCC NO: C2017102로 기탁된 하이브리도마 세포주 LT006; 및
중국 기준 배양물 보존 센터(CCTCC)에 수탁 번호 CCTCC NO: C2017165로 기탁된 하이브리도마 세포주 LT007로부터 선택되는 하이브리도마 세포주에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 측면은 단일클론 항체 또는 그의 항원 결합 단편 및 접합부를 포함하고, 여기서, 단일클론 항체는 본 발명에 기술된 단일클론 항체 또는 그의 항원 결합 단편 중 어느 하나이고, 접합부는 검출가능한 표지이고; 바람직하게는, 검출가능한 표지는 방사성 동위원소, 발광 물질, 예컨대, 형광 물질, 착색 물질, 또는 효소인 것인 접합체에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 측면은 본 발명에 기술된 단일클론 항체 또는 그의 항원 결합 단편 중 어느 하나를 포함하거나, 또는 본 발명의 접합체를 포함하는 키트에 관한 것이고;
바람직하게는, 키트는 단일클론 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 특이적으로 인식하는 제2 항체를 추가로 포함하고; 임의로, 제2 항체는 검출가능한 표지를 추가로 포함하고; 바람직하게는, 검출가능한 표지는 방사성 동위원소, 발광 물질 예컨대, 형광 물질, 착색 물질, 또는 효소이다.
본 발명의 또 다른 측면은 IL-17A에 대한 정성적 또는 정량적 검출용 키트 제조에서 본 발명에 기술된 단일클론 항체 또는 그의 항원 결합 단편 중 어느 하나, 또는 본 발명의 접합체의 용도에 관한 것이다. 정성적 검출은 시험되는 샘플 중 IL-17A의 존재를 검출하는 것을 지칭하고, 정량적 검출은 시험되는 샘플 중 IL-17A의 농도 또는 함량을 검출하는 것을 지칭한다.
본 발명의 또 다른 측면은 본 발명에 기술된 단일클론 항체 또는 그의 항원 결합 단편 중 어느 하나, 또는 본 발명의 접합체를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이고; 임의로, 약학 조성물은 약학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 추가로 포함한다.
본 발명의 또 다른 측면은 종양 또는 자가면역 질환 예방 및/또는 치료용 약물의 제조에서의 본 발명에 기술된 단일클론 항체 또는 그의 항원 결합 단편 중 어느 하나, 또는 본 발명의 접합체의 용도, 또는 자가면역 질환 진단용 약물의 제조에서의 용도에 관한 것이고; 바람직하게는, 자가면역 질환은 건선, 류머티스성 관절염, 건선성 관절염, 강직성 척추염, 및 전신 홍반성 루프스로부터 선택되고; 바람직하게는, 건선은 중등도 내지 중증의 판상 건선이다.
특히, 본 발명자들은 13E9H3L2가 건선을 앓는 C57BL/6 마우스 모델의 표피 두께 증가를 효과적으로 억제시킬 수 있다는 것을 동물 실험(실시예 11)으로부터 확인하였고, 이는 항체 약물 13E9H3L2가, 동일한 표적에 대한 시판 단일클론 항체 약물 세쿠키누맙과 등가인 효능을 보이면서, IL-17A 및 피하 주사에 의해 유발된 마우스의 표피 두께 증가를 유의적으로 억제시킬 수 있다는 것을 제시한다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 자가면역 질환(예컨대, 건선 예컨대, 중등도 내지 중증의 판상 건선, 류머티스성 관절염, 건선성 관절염, 강직성 척추염 또는 전신 홍반성 루프스)은 IL-17A 발현 수준 상승에 의해 유발된다. 본원에 기술된 발현 수준 상승이란, 건강한 사람의 발현 수준보다 더 높고, 발병 수준에 도달했다는 것을 지칭한다.
본 발명의 또 다른 측면은 하기 약물:
IL-17A의 IL-17RA로의 결합 차단용 약물,
IL-17A 활성 또는 수준 조절용(예컨대, 하향조절용) 약물, 또는
세포에서의 IL-6 발현 억제용 약물 제조에서의 본 발명에 기술된 단일클론 항체 또는 그의 항원 결합 단편 중 어느 하나, 또는 본 발명의 접합체의 용도에 관한 것이다
본 발명의 또 다른 측면은
IL-17A의 IL-17RA로의 결합 차단,
IL-17A 활성 또는 수준 조절(예컨대, 하향조절), 또는
섬유아세포에서의 IL-6 발현 억제를 필요로 하는 세포 또는 대상체에게 유효량의, 본 발명에 기술된 단일클론 항체 또는 그의 항원 결합 단편 중 어느 하나, 또는 본 발명의 접합체를 투여하는 단계를 포함하는, 하기:
IL-17A의 IL-17RA로의 결합을 차단시키는 방법,
IL-17A 활성 또는 수준을 조절하는(예컨대, 하향조절하는) 방법, 또는
섬유아세포에서 IL-6 발현을 억제시키는 방법으로부터 선택되는 생체내 또는 시험관내 방법에 관한 것이다.
본 발명의 구체적인 실시양태에서, 시험관내 방법은 비치료 및/또는 비진단 방법이다.
인터류킨 6(IL-6 또는 IL 6으로 약칭)은 섬유아세포, 단핵구/대식세포, T 림프구, B 림프구, 상피 세포, 각질형성세포, 및 다양한 종양 세포에 의해 생산될 수 있다. 인터류킨 6은 면역 반응을 조절하는 데 중요한 인자이고, IL-6 및 IL-1은 시너지적으로 T 세포 증식을 촉진시킬 수 있고, B 세포 분화를 자극시킬 수 있고, 신체 염증 반응에 참여할 수 있다(문헌 [Schoenborn et al. Advances in Immunology 96: 41-101 (2007)]). 본 발명의 시험관내 실험(실시예 10)은 항IL-17A 항체가 유의적으로 IL-6 분비를 감소시키고, IL-6 매개 면역 반응을 억제시킬 수 있다는 것을 보여준다.
본 발명의 또 다른 측면은 종양 또는 자가면역 질환을 치료 및/또는 예방하는 방법에 관한 것이고, 상기 방법은 그를 필요로 하는 대상체에게 유효량의, 본 발명에 기술된 단일클론 항체 또는 그의 항원 결합 단편 중 어느 하나, 또는 본 발명의 접합체를 투여하는 단계를 포함하고; 바람직하게는, 자가면역 질환은 건선, 류머티스성 관절염, 건선성 관절염, 강직성 척추염, 및 전신 홍반성 루프스로부터 선택되고; 바람직하게는, 건선은 중등도 내지 중증의 판상 건선이다.
본 발명의 또 다른 측면은 자가면역 질환을 진단하는 방법에 관한 것이고, 상기 방법은 시험하고자 하는 샘플(예컨대, 조직 샘플, 세포 샘플, 또는 혈액 샘플)을 적용하거나, 또는 그를 필요로 하는 대상체에게 유효량의, 본 발명에 기술된 단일클론 항체 또는 그의 항원 결합 단편 중 어느 하나, 또는 본 발명의 접합체를 투여하는 단계를 포함하고; 바람직하게는, 자가면역 질환은 건선, 류머티스성 관절염, 건선성 관절염, 강직성 척추염, 및 전신 홍반성 루프스로부터 선택되고; 바람직하게는, 건선은 중등도 내지 중증의 판상 건선이다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 자가면역 질환(예컨대, 건선, 예컨대, 중등도 내지 중증의 판상 건선, 류머티스성 관절염, 건선성 관절염, 강직성 척추염 또는 전신 홍반성 루프스)이 IL-17A 발현 수준 상승에 의해 유발된다는 점을 고려하면, 이에 진단은 본 발명에 기술된 단일클론 항체 또는 그의 항원 결합 단편 중 어느 하나, 또는 본 발명의 접합체를 사용하여 IL-17A 발현 수준을 검출함으로써 수행될 수 있다. IL-17A 발현 수준이 건강한 사람의 발현 수준보다 더 높고, 발병 수준에 도달했다면, 진단은 양성 결과이고; 그렇지 않다면, 진단은 음성 결과이다.
본 발명에서, 달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 과학 및 기술 용어는 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미를 갖는다. 추가로, 본원에서 사용된 세포 배양, 분자 유전학, 핵산 화학, 면역학의 실험실 조작 절차는 해당 분야에서 널리 사용되는 통상의 조작 절차이다. 한편, 본 발명을 더 잘 이해하기 위해, 관련된 용어의 정의 및 설명이 하기에서 제공된다.
본원에서 사용되는 바, IL-17A(인터류킨-17A) 단백질의 아미노산 서열이 언급될 때, 이는 전장의 IL-17A 단백질; 예컨대, 마우스 또는 인간 IgG Fc 단백질 단편(mFc 또는 hFc)에 융합된, IL-17A의 융합 단백질 또한 포함한다. 그러나, 당업자라면, IL-17A 단백질의 아미노산 서열에서 돌연변이 또는 변이(제한하는 것은 아니지만, 치환, 결실 및/또는 부가 포함)가 자연적으로 생성될 수 있거나, 또는 그의 생물학적 기능에 영향을 미치지 않으면서, 인공적으로 도입될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 그러므로, 본 발명에서, "IL-17A 단백질"이라는 용어는 그의 천연 또는 인공 변이체를 비롯한, 상기의 모든 서열을 포함하여야 한다. 추가로, IL-17A 단백질의 서열 단편이 기술될 때, IL-17A 단백질은 또한 그의 천연 또는 인공 변이체의 상응하는 서열 단편도 포함한다.
IL-17A의 전장의 서열(155aa)은 하기와 같고, 여기서, 신호 펩티드 서열(23aa)은 밑줄체로 표시되어 있다:
Figure pct00001
.
본원에서 사용되는 바, 달리 정의되지 않는 한, IL-17R은 IL-17RA이고; 그의 구체적인 단백질 서열은 선행 기술에 공지된 서열이고, 기존 문헌 또는 진뱅크(GenBank)에 개시된 서열을 참조할 수 있다. 예를 들어, IL-17RA(CD217, NCBI Gene ID: NP_055154.3)가 있다.
본원에서 사용되는 바, EC50이라는 용어는 최대 효과의 50%에 대한 농도, 즉, 최대 효과의 50%를 야기할 수 있는 농도를 지칭한다.
본원에서 사용되는 바, "항체"라는 용어는 일반적으로 (각 쌍은 하나의 "경쇄"(L: "light") 및 하나의 "중쇄"(H: "heavy")를 갖는) 2쌍의 폴리펩티드 쇄로 구성된 면역글로불린 분자를 지칭한다. 일반적인 의미에서, 중쇄는 항체에서 분자량이 더 큰 폴리펩티드 쇄로 해석될 수 있고, 경쇄는 항체에서 분자량이 더 작은 폴리펩티드 쇄를 지칭한다. 경쇄는 κ 및 λ 경쇄로 분류된다. 중쇄는 일반적으로 μ, δ, γ, α 또는 ε으로 분류되고, 항체의 이소타입은 각각 IgM, IgD, IgG, IgA 및 IgE로 정의된다. 경쇄 및 중쇄 내에서, 가변 영역 및 불변 영역은 약 12개 이상의 아미노산으로 이루어진 "J" 영역을 통해 연결되고, 중쇄는 또한 약 3개 이상의 아미노산으로 이루어진 "D" 영역을 포함한다. 각 중쇄는 중쇄 가변 영역(VH) 및 중쇄 불변 영역(CH)으로 이루어진다. 중쇄 불변 영역은 3개의 도메인(CH1, CH2 및 CH3)으로 이루어진다. 각 경쇄는 경쇄 가변 영역(VL) 및 경쇄 불변 영역(CL)으로 이루어진다. 경쇄 불변 영역은 한 도메인 CL로 이루어진다. 항체의 불변 영역은 면역계의 다양한 세포(예컨대, 이펙터 세포)의 고전적 보체계의 제1 성분(C1q)에의 결합을 비롯한, 숙주 조직 또는 인자에의 면역글로불린의 결합을 매개할 수 있다. VH 및 VL 영역은 (상보성 결정 영역(CDR)으로 불리는) 초가변 영역으로 추가로 세분될 수 있으며, 그 사이에 프레임워크 영역(FR: framework region)으로 불리는 보존 영역이 분포되어 있다. 각 VH 및 VL은 아미노 말단에서 카복시 말단으로 하기 순서: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4로 배열된 3개의 CDR 및 4개의 FR로 이루어진다. 각 중쇄/경쇄 쌍의 가변 영역(VH 및 VL)은 각각 항체 결합 부위를 형성한다. 각 영역 또는 도메인에 대한 아미노산의 할당은 문헌 [Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 and 1991))], 또는 [Chothia & Lesk (1987) J. Mol. Biol. 196:901-917; Chothia et al. (1989) Nature 342:878-883]의 정의를 따른다. 특히, 중쇄는 또한 3개 초과의 CDR, 예컨대, 6, 9, 또는 12개를 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 이중특이적 항체에서, 중쇄는, IgG 항체의 중쇄의 C-말단 또 다른 항체에 연결된 ScFv일 수 있고, 이러한 경우, 중쇄는 9개의 CDR을 포함한다. "항체"라는 용어는 항체를 생산하는 임의의 특정 방법에 의해 제한되지 않는다. 예를 들어, 항체는 특히 재조합 항체, 단일클론 항체 또는 다중클론 항체를 포함한다. 항체는 상이한 이소타입의 항체, 예컨대, 항체 IgG(예컨대, 서브타입 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4), IgA1, IgA2, IgD, IgE 또는 IgM일 수 있다.
본원에서 사용되는 바, "항원 결합 단편"이라는 용어는 전장의 항체가 결합하는 항원과 동일한 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 능력을 유지하고/거나, 상기 항원에의 특이적인 결합에 대해 전장의 항체와 경쟁하는, 전장의 항체의 단편을 포함하는 폴리펩티드를 지칭하며, 이는 "항원 결합부"로도 알려져 있다. 일반적으로 문헌 [Fundamental Immunology, Ch. 7 (Paul, W., ed., 2nd edition, Raven Press, N.Y. (1989)](상기 문헌은 그 전문이 본원에서 모든 목적을 위해 참조로 포함된다)를 참조한다. 항체의 항원 결합 단편은 재조합 DNA 기술에 의해 또는 무손상 항체의 효소에 의한 절단 또는 화학적 절단에 의해 생산될 수 있다. 일부 경우에서, 항원 결합 단편은 Fab, Fab', F (ab')2, Fd, Fv, dAb, 상보성 결정 영역(CDR) 단편, 단일 쇄 항체 단편(예컨대, scFv), 키메라 항체, 디아바디 및 특이적으로 항원에 결합하는 능력을 폴리펩티드에 부여하는 데 충분한 항체의 적어도 일부분을 포함하는 폴리펩티드를 포함한다.
본원에서 사용되는 바, "Fd 단편"이라는 용어는 VH 및 CH1 도메인으로 이루어진 항체 단편을 지칭하고; "Fv 단편"이라는 용어는 항체의 단일 아암의 VL 및 VH 도메인으로 이루어진 항체 단편을 지칭하고; "dAb 단편"이라는 용어는 VH 도메인으로 이루어진 항체 단편을 지칭하고(문헌 [Ward et al., Nature 341:544-546 (1989)]); "Fab 단편"이라는 용어는 VL, VH, CL, 및 CH1 도메인으로 이루어진 항체 단편을 지칭하고; "F (ab')2 단편"이라는 용어는 힌지 영역에서 디술피드 브릿지로 연결된 두 Fab 단편을 포함하는 항체 단편을 지칭한다.
일부 경우에서, 항체의 항원 결합 단편은 단일 폴리펩티드 쇄의 생산을 가능하게 하는 링커를 통해 VL 및 VH 도메인이 서로 쌍을 형성하여 1가 분자를 형성한 단일 쇄 항체(예컨대, scFv)이다(예컨대, 문헌 [Bird et al., Science 242:423-426 (1988)] 및 [Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883 (1988)] 참조). 상기 scFv 분자는 일반 구조식: NH2-VL-링커-VH-COOH 또는 NH2-VH-링커-VL-COOH를 가질 수 있다. 선행 기술의 적절한 링커는 반복 GGGGS 아미노산 서열 또는 그의 변이체로 이루어진다. 예를 들어, 아미노산 서열(GGGGS)4를 갖는 링커가 사용될 수 있지만, 그의 변이체 또한 사용될 수 있다(문헌 [Holliger et al. (1993), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448]). 본 발명에서 사용될 수 있는 다른 링커는 문헌 [Alfthan et al. (1995), Protein Eng. 8:725-731], [Choi et al. (2001), Eur. J. Immunol. 31: 94-106], [Hu et al. (1996), Cancer Res. 56:3055-3061], [Kipriyanov et al. (1999), J. Mol. Biol. 293:41-56] 및 [Roovers et al. (2001), Cancer Immunol]에 기술되어 있다.
일부 경우에서, 항체의 항원 결합 단편은 VH 및 VL 도메인이 단일 폴리펩티드 쇄 상에서 발현된 것인 디아바디, 즉, 2가 항체이다. 그러나, 이용된 링커는 너무 짧기 때문에 동일한 쇄 상의 두 도메인이 서로 쌍을 형성할 수 없고, 이에, 강제로 나머지 다른 한 쇄 상의 상보적인 도메인과 쌍을 이루게 되고, 2개의 항원 결합 부위가 생성된다(예컨대, 문헌 [Holliger P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993)], 및 [Poljak RJ et al., Structure 2:1121-1123 (1994)] 참조).
항체의 항원 결합 단편(예컨대, 상기 언급된 항체 단편)은 관련 기술 분야의 기술자에게 공지된 통상적인 기술(예컨대, 재조합 DNA 기술 또는 효소에 의한 절단 또는 화학적 절단)을 사용하여 주어진 항체로부터 수득될 수 있고, 항체의 항원 결합 단편은 무손상 항체와 동일한 방식으로 특이성에 대해 스크리닝될 수 있다.
본원에서 사용되는 바, 문맥상 명확하게 정의되지 않는 한, "항체"라는 용어를 언급할 때, 이는 무손상 항체 뿐만 아니라, 항체의 항원 결합 단편 또한 포함한다.
본원에서 사용되는 바, "mAb" 및 "단일클론 항체(monoclonal antibody)"라는 용어는 고도로 균질한 항체 분자들의 군, 즉, 자발적으로 발생할 수 있는 자연 발생 돌연변이를 제외하면, 동일한 항체 분자들로 이루어진 군으로부터의 항체 또는 항체 단편을 지칭한다. 단일클론 항체는 항원 상의 단일 에피토프에 대해 고도로 특이적이다. 단일클론 항체와 대조적으로, 다중클론 항체는 일반적으로 항원 상의 상이한 에피토프들을 인식하는 적어도 2개 이상의 상이한 항체를 일반적으로 포함한다. 단일클론 항체는 일반적으로 문헌 [Kohler et al. (Nature, 256:495, 1975)]에 최초로 보고된 하이브리도마 기술을 사용하여 수득될 수 있고, 재조합 DNA 기술 (예를 들어, U.S.P 4,816,567 참조)에 의해서도 또한 수득될 수 있다.
본원에서 사용되는 바, "키메라 항체"라는 용어는 경쇄 및/또는 중쇄의 일부분은 하나의 항체(특정 종으로부터 유래될 수 있거나 또는 특정 항체 부류 또는 하위부류에 속할 수 있는 것)로부터 유래되고, 경쇄 및/또는 중쇄의 또 다른 일부분은 또 다른 항체(동일하거나, 또는 상이한 종으로부터 유래될 수 있거나, 또는 동일하거나, 또는 상이한 항체 부류 또는 하위부류에 속할 수 있는 것)로부터 유래되는 항체를 지칭한다. 그러나, 어느 경우에서든, 키메라 항체는 표적 항원에의 결합 활성은 유지한다(USP 4,816,567(Cabilly et al.); 문헌 [Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851 6855 (1984)]).
본원에서 사용되는 바, "인간화 항체"라는 용어는 인간 면역글로불린(수용자 항체)의 CDR 영역 모두 또는 그의 일부가 비인간 항체(공여자 항체)의 CDR에 의해 교체되었을 때 수득되며, 여기서 공여자 항체는 기대되는 특이성, 친화성 또는 반응성을 갖는 비인간(예컨대, 마우스, 래트 또는 토끼) 항체일 수 있는, 항체 또는 항체 단편을 지칭한다. 추가로, 항체의 성능을 추가로 개선시키거나, 또는 최적화시키기 위해 수용자 항체의 프레임워크 영역(FR)의 일부 아미노산 잔기 또한 비인간 항체의 상응하는 아미노산 잔기, 또는 다른 항체의 아미노산 잔기로 교체될 수 있다. 인간화 항체에 관한 더 많은 상세한 설명을 위해, 예를 들어, 문헌 [Jones et al., Nature, 321:522 525 (1986)]; [Reichmann et al., Nature, 332:323 329 (1988)]; [Presta, Curr. Op Struct. Biol., 2:593 596 (1992)]; 및 [Clark, Immunol. Today 21: 397 402 (2000)]을 참조한다.
본원에서 사용되는 바, "에피토프"라는 용어는 면역글로불린 또는 항체가 특이적으로 결합하는 항원 상의 부위를 지칭한다. "에피토프"는 또한 당업계에서 "항원 결정기"로도 불린다. 에피토프 또는 항원 결정기는 일반적으로 분자의 화학적으로 활성인 표면 기, 예컨대, 아미노산 또는 탄수화물 화합물 또는 당 측쇄로 이루어지고, 일반적으로 특이적인 3차원 구조 특징 및 특이적인 전하 특징을 갖는다. 예를 들어, 일반적으로 에피토프는 "선형" 또는 "입체형상"일 수 있는 고유한 공간 형상의 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 또는 15개의 연속적인 또는 비연속적인 아미노산을 포함한다. 예를 들어, 문헌 [Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, G. E. Morris, Ed. (1996)]을 참조한다. 선형 에피토프에서, 단백질과 상호작용 분자(예컨대, 항체) 사이의 모든 상호작용 지점은 단백질의 1차 아미노산 서열을 따라 일렬로 존재한다. 입체형상 에피토프에서, 서로 분리되어 있는 단백질의 아미노산 잔기들에 걸쳐 상호작용 지점이 존재한다.
본원에서 사용되는 바, "단리된"이라는 용어는 인공적인 수단에 의해 천연 상태로부터 수득되는 것을 의미한다. 특정의 "단리된" 물질 또는 성분이 천연에서 발생하면, 그의 천연 환경이 변화되었기 때문일 수 있거나, 또는 물질이 천연 환경으로부터 단리된 것이거나, 또는 그 둘 모두일 수 있다. 예를 들어, 특정의 비단리된 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 특정의 살아있는 동물에 천연적으로 존재하고, 상기 천연 상태로부터 단리된 고순도의 동일한 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드가 단리된 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드로 불린다. "단리된"이라는 용어는 인공 또는 합성 물질, 또는 상기 물질의 활성에 영향을 미치지 않는 다른 불순물의 존재를 배제하지 않는다.
본원에서 사용되는 바, "E. 콜라이(E. coli) 발현 시스템"이라는 용어는 E. 콜라이(균주) 및 벡터로 이루어진 발현 시스템을 지칭하고, 여기서, E. 콜라이(균주)는 상업적으로 이용가능한 균주, 예컨대, 제한 없이, GI698, ER2566, BL21(DE3), B834(DE3), 및 BLR(DE3)로부터 유래된 것이다.
본원에서 사용되는 바, "벡터"라는 용어는 폴리뉴클레오티드가 삽입될 수 있는 핵산 비히클을 지칭한다. 벡터가 삽입된 폴리뉴클레오티드가 코딩하는 단백질의 발현을 가능하게 하면, 상기 벡터는 발현 벡터로 불린다. 벡터가 운반하는 유전 물질 요소가 숙주 세포 내에서 발현되도록, 형질전환, 형질도입 또는 형질감염에 의해 벡터가 숙주 세포 내로 도입될 수 있다. 플라스미드; 파지미드; 코스미드; 인공 염색체, 예컨대, 효모 인공 염색체(YAC: yeast artificial chromosome), 박테리아 인공 염색체(BAC: bacterial artificial chromosome) 또는 P1-유래 인공 염색체(PAC: P1-derived artificial chromosome); 파지, 예컨대, 람다 파지 또는 M13 파지 및 바이러스 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는 벡터들이 당업자에게 널리 공지되어 있다. 벡터로서 사용될 수 있는 동물 바이러스는 레트로바이러스(렌티바이러스 포함), 아데노바이러스, 아데노 연관 바이러스, 헤르페스 바이러스(예컨대, 단순 헤르페스 바이러스), 폭스바이러스, 배큘로바이러스, 유두종 바이러스, 파포바 바이러스(예컨대, SV40)를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 벡터는 프로모터 서열, 전사 개시 서열, 인핸서 서열, 선별 성분 및 리포터 유전자를 포함하나, 이에 제한되지 않는, 발현을 제어하는 다양한 요소를 함유할 할 수 있다. 추가로, 벡터는 복제 개시 부위를 함유할 수도 있다.
본원에서 사용되는 바, "숙주 세포"라는 용어는 원핵성 세포, 예컨대 E. 콜라이 또는 바실러스 서브틸리스(bacillus subtilis), 진균 세포, 예컨대 효모 세포 또는 아스페르길루스(Aspergillus), 곤충 세포, 예컨대 S2 드로소필라(Drosophila) 세포 또는 Sf9, 또는 동물 세포, 예컨대, 섬유아세포, CHO 세포, COS 세포, NSO 세포, HeLa 세포, BHK 세포, HEK 293 세포 또는 인간 세포를 포함하나, 이에 제한되지 않는, 벡터 도입에 사용될 수 있는 세포를 지칭한다.
본원에서 사용되는 바, "KD"라는 용어는 특정 항체-항원 상호작용의 해리 평형 상수를 지칭하고, 이는 항체와 항원 사이의 결합 친화도를 기술하는 데 사용된다. 평형 해리 상수가 작을수록, 항체-항원 결합은 더 단단하고, 항체와 항원 사이의 친화도가 더 높다. 일반적으로, 항체는 약 10-5 M 미만, 예컨대, 약 10-6 M, 10-7 M, 10-8 M, 10-9 M, 10-10 M, 또는 이보다 낮은 값 미만의 해리 평형 상수(KD)로 항원에 결합하고, 해리 평형 상수는 예를 들어, 포르테바이오 분자 상호작용 장치를 이용하여 측정될 수 있다.
본원에서 사용되는 바, "단일클론 항체" 및 "mAb"라는 용어는 동일한 의미를 갖고, 상호교환적으로 사용될 수 있고; "다중클론 항체(polyclonal antibody)" 및 "PcAb"라는 용어는 동일한 의미를 갖고, 상호교환적으로 사용될 수 있고; "폴리펩티드" 및 "단백질"이라는 용어는 동일한 의미를 갖고, 상호교환적으로 사용될 수 있다. 또한, 본 발명에서, 아미노산은 일반적으로 당업계에 공지된 1-문자 또는 3-문자 약어로 표현된다. 예를 들어, 알라닌은 A 또는 Ala로 표현될 수 있다.
본원에서 사용되는 바, "하이브리도마" 및 "하이브리도마 세포주"라는 용어는 동일한 의미를 갖고, 상호교환적으로 사용될 수 있고, "하이브리도마" 및 "하이브리도마 세포주"라는 용어가 언급될 때, 이는 하이브리도마의 서브클론 및 자손 세포도 또한 포함한다. 예를 들어, 하이브리도마 세포주 LT006 또는 LT007이 언급될 때, 이는 하이브리도마 세포주 LT006 또는 LT007의 서브클론 및 자손 세포도 또한 지칭한다.
본원에서 사용되는 바, "약학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제"라는 용어는 약리학적으로 및/또는 생리학적으로 대상체 및 활성 성분과 화합성인 담체 및/또는 부형제를 지칭하고, 이는 당업계에 널리 공지되어 있고(예컨대, 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences. Edited by Gennaro AR, 19th ed. Pennsylvania: Mack Publishing Company, 1995] 참조), pH 조절제, 계면활성제, 애주번트, 이온 강도 강화제를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, pH 조절제는 포스페이트 완충제를 포함하나, 이에 제한되지 않고; 계면활성제는 양이온성, 음이온성 또는 비이온성 계면활성제, 예컨대, 트윈(Tween)-80을 포함하나, 이에 제한되지 않고; 이온 강도 강화제는 염화나트륨을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
본원에서 사용되는 바, "애주번트"라는 용어는 항원과 함께 신체 내로 전달되었을 때, 또는 미리 신체 내로 전달되었을 때, 항원에 대한 신체의 면역 반응을 강화할 수 있거나, 또는 면역 반응의 유형을 변화시킬 수 있는 비특이적인 면역 강화제를 지칭한다. 알루미늄 애주번트(예컨대, 수산화알루미늄), 프로인트 애주번트(예컨대, 완전 프로인트 애주번트 및 불완전 프로인트 애주번트), 코리네박테리움 파르붐(corynebacterium parvum), 지질다당류, 시토카인 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는 다수의 애주번트가 있다. 프로인트 애주번트가 동물 실험에서 가장 보편적으로 사용되는 애주번트이다. 수산화알루미늄 애주번트는 임상 시험에서 더 많이 사용된다.
본원에서 사용되는 바, "유효량"이라는 용어는 원하는 효과를 달성하거나 또는 적어도 부분적으로 달성하는 데 충분한 양을 지칭한다. 예를 들어, 질환(예컨대, IL-17A 수용체에의 IL-17A 결합, 또는 과도한 IL-17A 활성과 관련된 질환, 예컨대, 자가면역 질환)을 예방하기 위한 유효량은 질환(예컨대, IL-17A 수용체에의 IL-17A 결합, 또는 과도한 IL-17A 활성과 관련된 질환, 예컨대, 자가면역 질환)의 발병을 방지하거나, 정지시키거나 또는 지연시키는 데 충분한 양이고; 치료 유효량은 이미 질환을 앓고 있는 환자에서 질환 또는 그의 합병증을 치유하거나, 또는 적어도 부분적으로 정지시키는 데 충분한 양이다. 상기 유효량을 결정하는 것은 충분히 당업자의 기술 내에 속한다. 예를 들어, 치료적 유효량은 치료하고자 하는 질환의 중증도, 환자 본인의 면역계의 일반적인 상태, 환자의 일반적인 상태, 예컨대, 연령, 체중 및 성별, 약물 투여 방식, 동시에 투여되는 다른 치료법 등에 의존할 것이다.
본 발명의 유익한 효과
본 발명은 하기 기술적 효과 중 적어도 하나를 달성한다:
(1) 본 발명의 단일클론 항체, 예컨대, 13E9 H1L1, 13E9 H2L2, 13E9 H3L2, 및 2G2 H1L1, 2G2 H2L2, 2G2 H3L3 모두 특이적으로 IL-17A에 매우 잘 결합할 수 있고, IL-17A의 IL-17A 리간드에의 결합을 효과적으로 차단할 수 있고, IL-17A 매개 섬유아세포에서 특이적으로 IL-6의 분비를 감소시킬 수 있다;
(2) 본 발명의 단일클론 항체, 특히, 13E9 H2L2는 IL-6의 분비를 감소시키는 데 있어서 동일한 표적에 대하여 시판 약물 세쿠키누맙과 동일한 효과를 갖는다;
(3) 본 발명의 단일클론 항체는 항자가면역 질환, 예컨대, 건선, 류머티스성 관절염, 건선성 관절염, 강직성 척추염 또는 전신 홍반성 루프스의 치료 및/또는 예방에서 적용될 수 있는 잠재능을 갖고 있다.
도 1: 단일클론 뮤린 항체 13E9의 SDS-PAGE 검출 결과. 왼쪽에서 오른쪽으로 4개 레인의 샘플 및 그의 각 로딩량은 하기와 같다: 비환원성 단백질 전기영동 로딩 완충제 중 항체, 1 ㎍; 환원성 단백질 전기영동 로딩 완충제 중 항체, 1 ㎍; 마커, 5 ㎕; BSA, 1 ㎍.
도 2: 단일클론 뮤린 항체 2G2의 SDS-PAGE 검출 결과. 왼쪽에서 오른쪽으로 4개 레인의 샘플 및 그의 각 로딩량은 하기와 같다: 비환원성 단백질 전기영동 로딩 완충제 중 항체, 1 ㎍; 환원성 단백질 전기영동 로딩 완충제 중 항체, 1 ㎍; 마커, 5 ㎕; BSA, 1 ㎍.
도 3: 단일클론 인간화 항체 13E9 H3L2의 SDS-PAGE 검출 결과. 왼쪽에서 오른쪽으로 3개 레인의 샘플 및 그의 각 로딩량은 하기와 같다: BSA, 1 ㎍; 마커, 5 μl; 환원성 단백질 전기영동 로딩 완충제 중 항체, 1 ㎍; 비환원성 단백질 전기영동 로딩 완충제 중 항체, 1 ㎍.
도 4: 항체 13E9 H1L1의 동력학적 특징 파라미터의 검출 결과. 도면에서, 세로 좌표는 신호로서, 여기서, 단위는 nm이고; 가로 좌표는 시간으로서, 여기서, 단위는 sec이다.
도 5: 항체 13E9 H2L2의 동력학적 특징 파라미터의 검출 결과. 도면에서, 세로 좌표는 신호로서, 여기서, 단위는 nm이고; 가로 좌표는 시간으로서, 여기서, 단위는 sec이다.
도 6: 항체 13E9 H3L2의 동력학적 특징 파라미터의 검출 결과. 도면에서, 세로 좌표는 신호로서, 여기서, 단위는 nm이고; 가로 좌표는 시간으로서, 여기서, 단위는 sec이다.
도 7: 항체 세쿠키누맙의 동력학적 특징 파라미터의 검출 결과. 도면에서, 세로 좌표는 신호로서, 여기서, 단위는 nm이고; 가로 좌표는 시간으로서, 여기서, 단위는 sec이다.
도 8: 항체 2G2 H1L1의 동력학적 특징 파라미터의 검출 결과. 도면에서, 세로 좌표는 신호로서, 여기서, 단위는 nm이고; 가로 좌표는 시간으로서, 여기서, 단위는 sec이다.
도 9: 항체 2G2 H2L2의 동력학적 특징 파라미터의 검출 결과. 도면에서, 세로 좌표는 신호로서, 여기서, 단위는 nm이고; 가로 좌표는 시간으로서, 여기서, 단위는 sec이다.
도 10: 항체 2G2 H3L3의 동력학적 특징 파라미터의 검출 결과. 도면에서, 세로 좌표는 신호로서, 여기서, 단위는 nm이고; 가로 좌표는 시간으로서, 여기서, 단위는 sec이다.
도 11: 항체 세쿠키누맙의 동력학적 특징 파라미터의 검출 결과. 도면에서, 세로 좌표는 신호로서, 여기서, 단위는 nm이고; 가로 좌표는 시간으로서, 여기서, 단위는 sec이다.
도 12: 간접 ELISA 방법을 이용한, 항체 13E9 H1L1 및 13E9 H2L2의 항원 IL17A-His에의 결합 활성 검출. 시판 약물 세쿠키누맙이 양성 대조군으로서 사용된다.
도 13: 간접 ELISA 방법을 이용한, 항체 13E9 H3L2의 항원 IL17A-His에의 결합 활성 검출. 시판 약물 세쿠키누맙이 양성 대조군으로서 사용된다.
도 14: 경쟁적 ELISA 방법에 의한, 결합에 대하여 수용체 IL17RA-His(비오틴)와 경쟁하는 항체 13E9 H1L1 및 13E9 H2L2의 활성 검출. 시판 약물 세쿠키누맙이 양성 대조군으로서 사용된다.
도 15: 경쟁적 ELISA 방법에 의한, 결합에 대하여 수용체 IL17RA-His(비오틴)와 경쟁하는 항체 13E9 H3L2의 활성 검출. 시판 약물 세쿠키누맙이 양성 대조군으로서 사용된다.
도 16: 간접 ELISA 방법에 의한, 항체 2G2 H1L1, 2G2 H2L2 및 2G2 H3L3의 항원 IL17A-His에의 결합 활성 검출. 시판 약물 세쿠키누맙이 양성 대조군으로서 사용된다.
도 17: 경쟁적 ELISA 방법에 의한, 항원 IL17A-His에의 결합에 대하여 수용체 IL17RA-His(비오틴)와 경쟁하는 항체 2G2 H1L1, 2G2 H2L2 및 2G2 H3L3의 활성 검출. 시판 약물 세쿠키누맙이 양성 대조군으로서 사용된다.
도 18: 항체 13E9 H1L1, 13E9 H2L2 및 13E9 H3L2 뿐만 아니라, 2G2 H1L1, 2G2 H2L2 및 2G2 H3L3이 혼합된 림프구에 의한 시토카인 분비에 미치는 효과.
도 19: 항체 약물 13E9 H3L2가 건선을 앓는 C57BL/6 마우스 모델의 표피 두께에 미치는 효과.
생물학적 물질 보존에 관한 설명:
2017년 9월 12일, 중국 430072 우한 우한 대학교 소재의 중국 기준 배양물 보존 센터(CCTCC)에 수탁 번호 CCTCC NO: C2017102로 기탁된 하이브리도마 세포주 LT006(IL-17A-13E9).
2017년 9월 12일, 중국 430072 우한 우한 대학교 소재의 중국 기준 배양물 보존 센터(CCTCC)에 수탁 번호 CCTCC NO: C2017165로 기탁된 하이브리도마 세포주 LT007(IL-17A-2G2).
본 발명의 실시양태는 하기에서 실시예를 참조로 상세하게 기술될 것이다. 당업자는 하기 실시예가 단지 본 발명을 설명하기 위해서 사용되고, 본 발명의 범주를 제한하는 것으로 간주되지 않아야 함을 이해할 것이다. 구체적인 기술 또는 조건이 본원에서 언급되지 않았다면, 실시예는 당업계의 문헌에 기재된 기술 또는 조건 (예컨대, 문헌 [Guide to Molecular Cloning Experiments, ((J. Sambrook et al.) 저자), 및 ((Huang Peitang et al.) 번역), third edition, Science Press] 참조)에 따라, 제품 매뉴얼에 따라 수행된다. 제조사가 명시되지 않았다면, 사용된 시약 또는 장치는 모두 상업적으로 이용가능한 통상의 제품이다.
하기 실시예에서, 사용된 BALB/C 마우스는 광둥 의료 실험실 동물 센터(Guangdong Medical Laboratory Animal Center)로부터 구입하였고; 사용된 C57BL/6 마우스는 난징 갤럭시 바이오팜 컴퍼니 리미티드(Nanjing Galaxy Biopharma Co., Ltd.)로부터 입수하였고; 사용된 MRC5 세포는 상해 푸단 IBS 세포 센터(Shanghai Fudan IBS Cell Center)로부터 입수하였고; 사용된 단일클론 항체 세쿠키누맙(Cosentyx®)은 노파르티스 코포레이션(Novartis Corporation)으로부터 구입하였다.
실시예 1: 항IL -17A 항체 13E9 및 2G2 제조
1. 하이브리도마 세포주 LT006 및 LT007 제조
항IL-17A 항체를 생성하는 데 사용된 항원 IL17A (24-155)-his는 인간 IL-17A (진뱅크 ID: Q16552) 성숙한 펩티드 및 His 태그의 융합 단백질이다. (광둥 의료 실험실 동물 센터로부터 구입한) 면역화된 BALB/C 마우스로부터의 비장 세포 및 마우스 골수종 세포를 하이브리도마 세포로 융합하였고, 구체적인 조작 절차를 위해 확립된 방법(예컨대, 문헌 ["Monoclonal Antibody Production", in Basic Methods in Antibody Production and Characterization, Eds. G.C. Howard and D.R. Bethell, Boca Raton: CRC Press, 2000])을 참조하였다.
융합 단백질 IL17A-His을 TEV 프로테아제로 효소 분해하고, 칼럼에 의해 정제하여 IL-17A (24-155) 단백질을 수득하였다. 항원으로서 IL-17A (24-155) 단백질 을 사용하여 코팅된 마이크로플레이트에서 간접 ELISA 스크리닝을 수행함으로써 IL-17A (24-155)에 특이적으로 결합한 새 항체를 분비한 하이브리도마 세포를 수득하였다.
간접 ELISA 스크리닝에 의해 수득한 하이브리도마 세포를 경쟁적 ELISA에 의해 스크리닝함으로써, IL-17A로의 결합에 대하여 수용체 IL-17RA(CD217, NCBI 진 ID: NP_055154.3)와 경쟁한 단일클론 항체를 분비할 수 있는 하이브리도마 세포주를 수득하고, 안정한 두 하이브리도마 세포주를 제한 희석에 의해 수득하였다.
2015년 9월 12일 토요일, 중국 430072 우한 우한 대학교 소재의 중국 기준 배양물 보존 센터(CCTCC)에 하이브리도마 세포주 LT006(IL17A-13E9)을 기탁하였다. 하이브리도마 세포주 LT006에 의해 분비된 단일클론 항체를 13E9로 명명하였다.
2017년 9월 12일, 중국 430072 우한 우한 대학교 소재의 중국 기준 배양물 보존 센터(CCTCC)에 하이브리도마 세포주 LT007(IL17A-2G2)을 기탁하였다. 하이브리도마 세포주 LT007에 의해 분비된 단일클론 항체를 2G2로 명명하였다.
2. 항IL-17A 항체 13E9 제조
상기 제조된 LT006 세포주(1 Х 105개의 세포/웰)를 하이브리도마 무혈청 배지(1% 페니실린-스트렙토마이신 및 4% 글루타맥스 함유, 5% CO2 하에 37℃ 세포 인큐베이터에서 배양)를 이용하여 배양하고, 7일 동안 배양한 후, 생존율이 대략 20%일 때, 세포 배양 상청액을 수집하였고, 이어서, 고속 원심분리하고, 미소공성 막을 통해 진공 여과하고, 하이트랩(HiTrap) 단백질 A HP 칼럼을 통해 정제하여 항체 13E9를 수득하였다. 정제된 13E9 샘플을 SDS-PAGE 전기영동에 의해 검출하였고, 결과는 도 1에 제시되어 있다.
3. 항IL-17A 항체 2G2 제조
상기 제조된 LT007 세포주(1 Х 105개의 세포/웰)를 하이브리도마 무혈청 배지(1% 페니실린-스트렙토마이신 및 4% 글루타맥스 함유, 5% CO2 하에 37℃ 세포 인큐베이터에서 배양)를 이용하여 배양하고, 7일 동안 배양한 후, 생존율이 대략 20%일 때, 세포 배양 상청액을 수집하였고, 이어서, 고속 원심분리하고, 미소공성 막을 통해 진공 여과하고, 하이트랩 단백질 A HP 칼럼을 통해 정제하여 항체 2G2를 수득하였다. 정제된 2G2 샘플을 SDS-PAGE 전기영동에 의해 검출하였고, 결과는 도 2에 제시되어 있다.
실시예 2: 항체 13E9의 서열 분석
LT006 세포를 실시예 1의 단계 2 방법에 따라 배양하였다.
세포/박테리아 전체 RNA 추출용 키트(Tiangen, 물품 번호 DP430)를 이용하여 키트 매뉴얼의 방법에 따라, mRNA를 배양된 LT006 세포로부터 추출하였다.
인비트로겐(Invitrogen)의 RT-PCR용 슈퍼스크립트® III 퍼스트-스트랜드 신테시스 시스템(SuperScript® III First-Strand Synthesis System)의 키트 매뉴얼에 따라 cDNA를 합성하고, PCR에 의해 증폭시켰다.
PCR-증폭된 생성물을 직접 TA 클로닝하고, 구체적인 조작 절차를 위해 pEASY-T1 클로닝 키트(Transgen CT101)의 키트 매뉴얼을 참조하였다.
TA-클로닝된 생성물을 직접 서열분석하였고, 서열분석 결과는 하기와 같다:
중쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 서열: (360 bp)
Figure pct00002
그의 코딩된 아미노산 서열: (120 aa)
Figure pct00003
경쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 서열: (333 bp)
Figure pct00004
그의 코딩된 아미노산 서열: (111 aa)
Figure pct00005
밑줄 표시된 영역은 CDR 영역이다.
실시예 3: 항IL -17A 인간화 항체 13E9 H1L1 , 13E9 H2L2 및 13E9 H3L2의 디자인, 제조, 및 검출
1. 항IL-17A 인간화 항체 13E9 H1L1, 13E9 H2L2 및 13E9 H3L2의 경쇄 및 중쇄 서열의 디자인
IL-17A 단백질의 3차원 결정 구조(문헌 [EMBO J. (2001) 20 p: 5332-41]) 및 실시예 2에서 수득된 항체 13E9의 서열에 기초하여, 컴퓨터에 의해 항체 모델을 모의하고, 모델에 따라 돌연변이를 디자인하여 가변 영역 서열 항체 13E9 H1L1, 13E9 H2L2 및 13E9 H3L2를 수득하였다(항체 불변 영역 서열은 NCBI 데이터베이스로부터의 것이며, 여기서, 중쇄 불변 영역은 Ig 감마-1 쇄 C 영역, 수탁:P01857이고, 경쇄 불변 영역은 Ig 카파 쇄 C 영역, 수탁:P01834이다).
디자인된 가변 영역 서열은 하기와 같다:
(1) 인간화 단일클론 항체 13E9 H1L1의 중쇄 및 경쇄 서열
중쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 서열: (360 bp)
Figure pct00006
그의 코딩된 아미노산 서열: (120 aa)
Figure pct00007
밑줄 표시된 영역은 CDR 영역이다.
경쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 서열: (333 bp)
Figure pct00008
그의 코딩된 아미노산 서열: (111 aa)
Figure pct00009
밑줄 표시된 영역은 CDR 영역이다.
(2) 인간화 단일클론 항체 13E9 H2L2의 중쇄 및 경쇄 서열
중쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 서열: (360 bp)
Figure pct00010
그의 코딩된 아미노산 서열: (120 aa)
Figure pct00011
밑줄 표시된 영역은 CDR 영역이다.
경쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 서열: (333 bp)
Figure pct00012
그의 코딩된 아미노산 서열: (111 aa)
Figure pct00013
밑줄 표시된 영역은 CDR 영역이다.
(3) 인간화 단일클론 항체 13E9 H3L2의 중쇄 및 경쇄 서열
중쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 서열: (360 bp)
Figure pct00014
그의 코딩된 아미노산 서열: (120 aa)
Figure pct00015
밑줄 표시된 영역은 CDR 영역이다.
경쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 11에 기재된, 13E9 H2L2의 경쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 서열과 동일하다.
그의 코딩된 아미노산 서열 또한 서열 번호 12에 기재된, 13E9 H2L2의 경쇄 가변 영역과 동일하다.
2. 인간화 항체 13E9 H1L1, 13E9 H2L2 및 13E9 H3L2의 제조
중쇄 불변 영역 모두 Ig 감마-1 쇄 C 영역, 수탁:P01857을 이용하고; 경쇄 불변 영역은 Ig 카파 쇄 C 영역, 수탁:P01834를 이용한다.
13E9 H1L1의 중쇄 cDNA 및 경쇄 cDNA, 13E9 H2L2의 중쇄 cDNA 및 경쇄 cDNA, 및 13E9 H3L2의 중쇄 cDNA 및 경쇄 cDNA를 각각 pUC57simple(Genscript 제공) 벡터로 클로닝하여 pUC57simple-13E9H1, pUC57simple-13E9L1, pUC57simple-13E9H2, pUC57simple-13E9L2 및 pUC57simple-13E9H3을 수득하였고, 상응하는 중쇄를 함유하는 단편 및 상응하는 경쇄를 함유하는 단편을 각각 pcDNA3.1 벡터로 클로닝하여 재조합 플라스미드 pcDNA3.1-13E9H1, pcDNA3.1-13E9L1, pcDNA3.1-13E9H2, pcDNA3.1-13E9L2, pcDNA3.1-13E9H3 및 pcDNA3.1-13E9L2를 수득하였다. 이어서, 상응하는 경쇄 재조합 플라스미드 및 중쇄 재조합 플라스미드(pcDNA3.1-13E9H1 및 pcDNA3.1-13E9L1; pcDNA3.1-13E9H2 및 pcDNA3.1-13E9L2; pcDNA3.1-13E9H3 및 pcDNA3.1-13E9L2)를 293F 세포에 공동 형질감염시키고, 세포 배양물을 수집하고, 정제하여 각각 인간화 항체 13E9 H1L1, 13E9 H2L2, 및 13E9 H3L2를 수득하였다. 정제된 13E9 H3L2 샘플을 SDS-PAGE 전기영동에 의해 검출하고, 결과는 도 3에 제시되어 있다.
실시예 4: 항체 2G2의 서열 분석
LT007 세포를 실시예 1의 단계 3 방법에 따라 배양하였다.
세포/박테리아 전체 RNA 추출용 키트(Tiangen, 물품 번호 DP430)를 이용하여 키트 매뉴얼의 방법에 따라, mRNA를 배양된 LT007 세포로부터 추출하였다.
인비트로겐의 RT-PCR용 슈퍼스크립트® III 퍼스트-스트랜드 신테시스 시스템의 키트 매뉴얼에 따라 cDNA를 합성하고, PCR에 의해 증폭시켰다.
PCR-증폭된 생성물을 직접 TA 클로닝하고, 구체적인 조작 절차를 위해 pEASY-T1 클로닝 키트(Transgen CT101)의 키트 매뉴얼을 참조하였다.
TA-클로닝된 생성물을 직접 서열분석하였고, 서열분석 결과는 하기와 같다:
중쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 서열: (351 bp)
Figure pct00016
그의 코딩된 아미노산 서열: (117 aa)
Figure pct00017
밑줄 표시된 영역은 CDR 영역이다.
경쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 서열: (336 bp)
Figure pct00018
그의 코딩된 아미노산 서열: (112 aa)
Figure pct00019
밑줄 표시된 영역은 CDR 영역이다.
실시예 5: 항IL -17A 인간화 항체 2G2 H1L1 , 2G2 H2L2 및 2G2 H3L3의 디자인, 제조, 및 검출
(1) 인간화 단일클론 항체 2G2 H1L1의 중쇄 및 경쇄 서열
중쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 서열: (348 bp)
Figure pct00020
그의 코딩된 아미노산 서열: (116 aa)
Figure pct00021
밑줄 표시된 영역은 CDR 영역이다.
경쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 서열: (336 bp)
Figure pct00022
그의 코딩된 아미노산 서열: (112 aa)
Figure pct00023
밑줄 표시된 영역은 CDR 영역이다.
(2) 인간화 단일클론 항체 2G2 H2L2의 중쇄 및 경쇄 서열
중쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 서열: (348 bp)
Figure pct00024
그의 코딩된 아미노산 서열: (116 aa)
Figure pct00025
밑줄 표시된 영역은 CDR 영역이다.
경쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 서열: (336 bp)
Figure pct00026
그의 코딩된 아미노산 서열: (112 aa)
Figure pct00027
밑줄 표시된 영역은 CDR 영역이다.
(3) 인간화 단일클론 항체 2G2 H3L3의 중쇄 및 경쇄 서열
중쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 서열: (348 bp)
Figure pct00028
그의 코딩된 아미노산 서열: (116 aa)
Figure pct00029
밑줄 표시된 영역은 CDR 영역이다.
경쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 서열: (336 bp)
Figure pct00030
그의 코딩된 아미노산 서열: (112 aa)
Figure pct00031
밑줄 표시된 영역은 CDR 영역이다.
2. 인간화 항체 2G2 H1L1, 2G2 H2L2 및 2G2 H3L3의 제조 및 SDS-PAGE 전기영동 검출
중쇄 불변 영역은 Ig 감마-1 쇄 C 영역, 수탁:P01857을 사용하였고; 경쇄 불변 영역은 Ig 카파 쇄 C 영역, 수탁:P01834를 사용하였다.
2G2 H1L1의 중쇄 cDNA 및 경쇄 cDNA, 2G2 H2L2의 중쇄 cDNA 및 경쇄 cDNA, 및 2G2 H3L3의 중쇄 cDNA 및 경쇄 cDNA를 각각 pUC57simple(Genscript 제공) 벡터로 클로닝하여 pUC57simple-2G2H1, pUC57simple-2G2L1; pUC57simple-2G2H2, pUC57simple-2G2L2; 및 pUC57simple-2G2H3, pUC57simple-2G2L3을 수득하였다. 이어서, 상응하는 중쇄를 함유하는 뉴클레오티드 단편 및 상응하는 경쇄를 함유하는 뉴클레오티드 단편을 각각 pcDNA3.1 벡터로 클로닝하여 재조합 플라스미드 pcDNA3.1-2G2H1, pcDNA3.1-2G2L1, pcDNA3.1-2G2H2, pcDNA3.1-2G2L2, pcDNA3.1-2G2H3 및 pcDNA3.1-2G2L3을 수득하였다. 이어서, 상응하는 경쇄 재조합 플라스미드 및 중쇄 재조합 플라스미드(pcDNA3.1-2G2H1 및 pcDNA3.1-2G2L1; pcDNA3.1-2G2H2 및 pcDNA3.1-2G2L2; pcDNA3.1-2G2H3 및 pcDNA3.1-2G2L3)를 293F 세포에 공동 형질감염시키고, 세포 배양물을 수집하고, 정제하여 각각 인간화 항체 2G2 H1L1, 2G2 H2L2 및 2G2 H3L3을 수득하였다. 정제된 13E9 H3L2 샘플을 SDS-PAGE 전기영동에 의해 검출하였다.
실시예 6: 13E9 H1L1 , 13E9 H2L2 및 13E9 H3L2의 항원 IL-17A (24-155) 단백질에의 결합에 대한 동력학적 파라미터의 측정
포르테바이오 분자 상호작용 장치를 이용하여 인간화 항체 13E9 H1L1, 13E9 H2L2 및 13E9 H3L2의 항원 IL-17A (24-155)에의 결합에 대한 동력학적 파라미터를 측정하였다.
AR2G 센서를 EDC/NHS에 의해 활성화시키고, 항체를 아민 커플링에 의해 활성화된 AR2G 센서에 고정시키고, 센서를 1 M 에탄올아민(pH 8.5)으로 차단시켰다. 센서를 PBST 중에서 300 s 동안 평형화시킨 후, 센서 상에 고정된 항체는 항원 IL-17A (24-155) 단백질(실시예 1에서 사용된 항원과 동일)에 결합하였고, 여기서, 항원 농도는 6.25-400 nM(2배 구배 희석)였고, 결합 시간은 420 s였고, 항원 및 항체는 PBST 중에서 600 s 동안 해리되었다.
항체 13E9 H1L1, 13E9 H2L2, 13E9 H3L2 및 세쿠키누맙의 동력학적 파라미터가 하기 표 1에 제시되어 있고, 동력학적 특징 파라미터 검출 결과는 각각 도 4, 도 5, 도 6 및 도 7에 제시되어 있다.
Figure pct00032
본 결과는 13E9 H1L1, 13E9 H2L2, 및 13E9 H3L2 모두 항원 IL-17A (24-155)에 대해 우수한 친화도를 갖고, 상기 친화도는 대조군 항체 세쿠키누맙의 것과 등가라는 것을 보여준다.
실시예 7: 2G2 H1L1 , 2G2 H2L2 , 및 2G2 H3L3의 항원 IL-17A (24- 155)에의 결합에 대한 동력학적 파라미터의 측정
포르테바이오 분자 상호작용 장치를 이용하여 인간화 항체 2G2 H1L1, 2G2 H2L2 및 2G2 H3L3의 항원 IL-17A (24-155)에의 결합에 대한 동력학적 파라미터를 측정하였다.
AR2G 센서를 EDC/NHS에 의해 활성화시키고, 항체를 아민 커플링에 의해 활성화된 AR2G 센서에 고정시키고, 센서를 1 M 에탄올아민(pH 8.5)으로 차단시켰다. 센서를 PBST 중에서 300 s 동안 평형화시킨 후, 센서 상에 고정된 항체는 항원 IL-17A (24-155)에 결합하였고, 여기서, 항원 농도는 6.25-400 nM(2배 구배 희석)였고, 결합 시간은 420 s였고, 항원 및 항체는 PBST 중에서 600 s 동안 해리되었다.
항체 2G2 H1L1, 2G2 H2L2, 2G2 H3L3, 및 세쿠키누맙의 동력학적 파라미터가 하기 표 2에 제시되어 있고, 동력학적 특징 파라미터 검출 결과는 각각 도 8, 도 9, 도 10, 및 도 11에 제시되어 있다.
Figure pct00033
본 결과는 대조군 항체 세쿠키누맙과 비교하였을 때, 2G2 H2L2가 항원 IL-17A (24-155)에 대하여 더 높은 친화도를 갖고; 2G2 H1L1 및 2G2 H3L3의 친화도는 대조군 항체 세쿠키누맙의 것과 등가라는 것을 보여준다.
실시예 8: ELISA 방법을 이용한, 항체 13E9 H1L1 , 13E9 H2L2 및 13E9 H3L2의 항원에의 결합 활성 검출
1. 항체 13E9 H1L1, 13E9 H2L2 및 13E9 H3L2의 항원 IL17A-His에의 결합 활성을 간접 ELISA로 검출하고, 동일한 표적에 대하여 시판 약물 세쿠키누맙과 비교하였다.
IL17A-His는 당업계에 공개된 서열 및 통상의 기술 수단을 참조하여, 또는 하기 단계를 참조함으로써 제조할 수 있다:
IL17A-His 제조: 인간 IL-17A의 전장의 단백질 서열은 NCBI 단백질 데이터베이스에서 찾았고, His*6 정제 태그와 융합하였다. 난징(Nanjing) 소재의 진스크립트(Genscript)는 위탁받아 융합 단백질을 코딩하는 핵산을 합성하였고, 문헌 [Guide to Molecular Cloning Experiments(Second Edition)]에 도입된 표준 기술을 참조하고, 표준 분자 클로닝 기술, 예컨대, PCR, 효소 분해, 겔 회수, 라이게이션 전환, 콜로니 PCR 또는 효소 분해 식별을 이용하여, 표적 유전자를 포유동물 세포 발현 벡터로 서브클로닝하고, 재조합 발현 벡터와 표적 유전자를 추가로 서열분석하고, 분석하였다. 서열이 정확한지 확인한 후, 중간 및 대량의 내독소-무함유 발현 플라스미드를 제조하고, 단백질 발현을 위해 HEK293 세포를 일시적으로 형질감염시켰다. 7일 배양 후, 세포 배양액을 수집하고, Ni 세파로스 칼럼(GE)을 이용하여 친화도 정제하고, SDS-PAGE 및 SEC-HPLC 표준 분석 기술을 이용하여 생성된 단백질 샘플의 품질이 표준이 되는지 확인하였다.
ELISA: IL17A-His를 마이크로플레이트에 첨가하고, 4℃에서 밤새도록 인큐베이션시키고; 37℃에서 2 h 동안 PBS 중 1% BSA로 차단한 후, 항체를 각각 첨가하고, 37℃에서 30 min 동안 인큐베이션시키고; 염소 항 인간 IgG(H + L)-HRP (Jackson, 109-035-088)를 첨가하고, 37℃에서 30 min 동안 인큐베이션시킨 후; 이어서, TMB(Neogen, 308177)를 이용하여 5 min 동안 착색 반응을 수행하고, 마이크로플레이트 판독기에서 450 nm에서의 흡광도를 검출하였다. 수득된 실험 데이터를 분석하고, 소프트맥스 프로(SoftMax Pro) 6.2.1 소프트웨어를 이용하여 프로세싱하고, 항체 농도를 가로 좌표로 하고, 흡광도 값을 세로 좌표로 하여 4-파라미터 피팅된 곡선을 플롯팅하여 분석하였다.
실험 결과는 도 12, 도 13, 및 하기 표 3 및 표 4에 제시되어 있다.
Figure pct00034
Figure pct00035
실험 결과는 항체 13E9 H1L1, 13E9 H2L2 및 13E9 H3L2 모두 항원 IL17A-His에 효과적으로 결합할 수 있고, 그의 결합 효율은 용량에 의존한다는 것을 보여준다. 동일한 실험 조건하에서, 13E9 H1L1의 결합 EC50은 0.044 nM이고, 13E9 H2L2의 결합 EC50은 0.048 nM이고, 동일한 표적에 대해 시판 약물 세쿠키누맙의 EC50은 0.082 nM이며(도 12, 표 3); 동일한 실험 조건하에서, 13E9 H3L2의 결합 EC50은 0.043 nM이고, 동일한 표적에 대해 시판 약물 세쿠키누맙의 EC50은 0.078 nM이다(도 13, 표 4).
상기 실험 결과는 동일한 실험 조건하에서 13E9 H1L1, 13E9 H2L2 및 13E9 H3L2의 EC50 값이 동일한 표적에 대하여 양성 대조군 약물 세쿠키누맙의 것보다 모두 작다는 것을 나타내며, 이는 13E9 H1L1, 13E9 H2L2 및 13E9 H3L2의 IL17A-His에의 결합 활성이 동일한 표적에 대하여 시판 대조군 약물 세쿠키누맙의 것보다 더 우수하다는 것을 시사하는 것이다.
2. 경쟁적 ELISA를 이용하여, IL17RA-His(비오틴)의 항원 IL17A-His에의 결합을 차단하는 활성 항체 13E9 H1L1, 13E9 H2L2 및 13E9 H3L2를 검출한다.
IL17RA-His(비오틴)은 당업계에 공개된 서열 및 통상의 기술 수단을 참조하여, 또는 하기 단계를 참조함으로써 제조할 수 있다:
IL17RA-His(비오틴) 제조: 인간 IL-17RA의 세포외 도메인 서열은 NCBI 단백질 데이터베이스에서 찾았고, His*6 정제 태그와 융합하였다. 난징 소재의 진스크립트는 위탁받아 융합 단백질을 코딩하는 핵산을 합성하였고, 문헌 [Guide to Molecular Cloning Experiments(Second Edition)]에 도입된 표준 기술을 참조하고, 표준 분자 클로닝 기술, 예컨대, PCR, 효소 분해, 겔 회수, 라이게이션 전환, 콜로니 PCR 또는 효소 분해 식별을 이용하여, 표적 유전자를 포유동물 세포 발현 벡터로 서브클로닝하고, 재조합 발현 벡터와 표적 유전자를 추가로 서열분석하고, 분석하였다. 서열이 정확한지 확인한 후, 중간 및 대량의 내독소-무함유 발현 플라스미드를 제조하고, 단백질 발현을 위해 HEK293 세포를 일시적으로 형질감염시켰다. 7일 배양 후, 세포 배양액을 수집하고, Ni 세파로스 칼럼(GE)을 이용하여 친화도 정제하고, SDS-PAGE 및 SEC-HPLC 표준 분석 기술을 이용하여 생성된 단백질 샘플의 품질이 표준이 되는지 확인하였다. 품질 확인 완료 후, 비오티닐화된 인간 IL-17RA-His 단백질 샘플을 표지하고, 써모 사이언티픽(Thermo scientific)의 시판용 키트 EZ-링크®술포-NHS-LC-비오티닐레이션(EZ-Link®Sulfo-NHS-LC-Biotinylation)을 이용하여 수득하고, 키트의 매뉴얼에 따라 구체적인 제조 방법을 수행하였다.
ELISA: IL17A-His를 마이크로플레이트에 첨가하고, 4℃에서 밤새도록 인큐베이션시키고; 37℃에서 2 h 동안 PBS 중 1% BSA로 차단한 후, 항체를 각각 첨가하고, 항원 및 항체는 실온에서 10 min 동안 반응시킨 후; 이어서, 수용체 IL17RA-His(비오틴)을 첨가하고, 1:1의 부피 비로 항체와 함께 잘 혼합하고, 37℃에서 30 min 동안 인큐베이션시키고; SA-HRP(KPL, 14-30-00)를 첨가하고, 37℃에서 30 min 동안 인큐베이션시킨 후; 이어서, TMB(Neogen, 308177)를 이용하여 5 min 동안 착색 반응을 수행하고, 마이크로플레이트 판독기에서 450 nm에서의 흡광도를 검출하였다. 수득된 실험 데이터를 분석하고, 소프트맥스 프로 6.2.1 소프트웨어를 이용하여 프로세싱하고, 항체 농도를 가로 좌표로 하고, 흡광도 값을 세로 좌표로 하여 4-파라미터 피팅된 곡선을 플롯팅하여 분석하였다. 실험 결과는 도 14, 도 15, 및 하기 표 5 및 표 6에 제시되어 있다.
Figure pct00036
Figure pct00037
실험 결과는 항체 13E9 H1L1, 13E9 H2L2 및 13E9 H3L2 모두 수용체 IL17RA-His(비오틴)의 항원 IL17A-His에의 결합을 효과적으로 차단할 수 있고, 차단 효율은 용량에 의존한다는 것을 보여준다. 동일한 실험 조건하에서, IL17A-His에의 결합에 대해 IL17AR-His(비오틴)과 경쟁하는 13E9 H1L1의 EC50은 1.437 nM이고, IL17A-His에의 결합에 대해 IL17AR-His(비오틴)과 경쟁하는 13E9 H2L2의 EC50은 1.281 nM이고, IL17A-His에의 결합에 대해 IL17AR-His(비오틴)과 경쟁하는, 동일한 표적에 대한 양성 대조군 약물 세쿠키누맙의 EC50은 1.807 nM이고(표 5, 도 14); IL17A-His에의 결합에 대해 IL17AR-His(비오틴)과 경쟁하는 13E9 H3L2의 EC50은 0.805 nM이고, IL17A-His에의 결합에 대해 IL17AR-His(비오틴)과 경쟁하는, 동일한 표적에 대한 시판 약물 세쿠키누맙의 EC50은 1.580 nM이다(표 6, 도 15).
상기 실험 결과는 동일한 실험 조건하에서 IL17A-His에의 결합에 대해 IL17AR-His(비오틴)과 경쟁하는 13E9 H1L1, 13E9 H2L2 및 13E9 H3L2의 EC50 값이 모두 동일한 표적에 대하여 시판 대조군 약물 세쿠키누맙의 것보다 모두 작다는 것을 나타내며, 이는 IL17A-His에의 결합에 대해 IL17AR-His(비오틴)과 경쟁하는 13E9 H1L1, 13E9 H2L2 및 13E9 H3L2의 활성이 동일한 표적에 대하여 시판 약물 세쿠키누맙의 것보다 더 우수하다는 것을 시사하는 것이다.
실시예 9: ELISA 방법을 이용한, 항체 2G2 H1L1 , 2G2 H2L2 및 2G2 H3L3의 항원에의 결합 활성 검출
1. 항체 2G2 H1L1, 2G2 H2L2 및 2G2 H3L3의 항원 IL17A-His에의 결합 활성을 간접 ELISA로 검출한다.
실험 단계: IL17A-His를 마이크로플레이트에 첨가하고, 4℃에서 밤새도록 인큐베이션시키고; 37℃에서 2 h 동안 PBS 중 1% BSA로 차단한 후, 항체를 각각 첨가하고, 37℃에서 30 min 동안 인큐베이션시키고; 염소 항 인간 IgG(H + L)-HRP (Jackson, 109-035-088)를 첨가하고, 37℃에서 30 min 동안 인큐베이션시킨 후; 이어서, TMB(Neogen, 308177)를 이용하여 5 min 동안 착색 반응을 수행하고, 마이크로플레이트 판독기에서 450 nm에서의 흡광도를 검출하였다. 수득된 실험 데이터를 분석하고, 소프트맥스 프로 6.2.1 소프트웨어를 이용하여 프로세싱하고, 항체 농도를 가로 좌표로 하고, 흡광도 값을 세로 좌표로 하여 4-파라미터 피팅된 곡선을 플롯팅하여 분석하였다.
실험 결과는 도 16 및 하기 표 7에 제시되어 있다. 여기서, 2G2 H1L1의 결합 EC50은 0.177 nM이고, 2G2 H2L2결합 EC50은 0.421 nM이다.
Figure pct00038
실험 결과는 항체 2G2 H1L1, 2G2 H2L2 및 2G2 H3L3 모두 항원 IL17A-His에 효과적으로 결합할 수 있고, 그의 결합 효율은 용량에 의존한다는 것을 보여준다.
2. 경쟁적 ELISA를 이용하여, 항원 IL17A-His에의 결합에 대해 수용체 IL17A-His(비오틴)과 경쟁하는 활성 항체 2G2 H1L1, 2G2 H2L2 및 2G2 H3L3을 검출하였다.
실험 단계: IL17A-His를 마이크로플레이트에 첨가하고, 4℃에서 밤새도록 인큐베이션시키고; 37℃에서 2 h 동안 PBS 중 1% BSA로 차단한 후, 항체를 각각 첨가하고, 항원 및 항체는 실온에서 10 min 동안 반응시킨 후; 이어서, 수용체 IL17RA-His(비오틴)을 첨가하고, 1:1의 부피 비로 항체와 함께 잘 혼합하고, 37℃에서 30 min 동안 인큐베이션시키고; SA-HRP(KPL, 14-30-00)를 첨가하고, 37℃에서 30 min 동안 인큐베이션시킨 후; 이어서, TMB(Neogen, 308177)를 이용하여 5 min 동안 착색 반응을 수행하고, 마이크로플레이트 판독기에서 450 nm에서의 흡광도를 검출하였다. 수득된 실험 데이터를 분석하고, 소프트맥스 프로 6.2.1 소프트웨어를 이용하여 프로세싱하고, 항체 농도를 가로 좌표로 하고, 흡광도 값을 세로 좌표로 하여 4-파라미터 피팅된 곡선을 플롯팅하여 분석하였다.
실험 결과는 도 17, 및 하기 표 8에 제시되어 있다. 여기서, 2G2 H1L1의 차단 EC50은 2.264 nM이고, 2G2 H2L2의 차단 EC50은 5.408 nM이고, 2G2 H3L3의 차단 EC50은 5.911 nM이다(도 17, 표 8).
Figure pct00039
실험 결과는 항체 2G2 H1L1, 2G2 H2L2, 및 2G2 H3L3 모두 수용체 IL17RA-His(비오틴)의 항원 IL17A-His에의 결합을 효과적으로 차단할 수 있고, 차단 효율은 용량에 의존한다는 것을 보여준다.
실시예 10: 혼합된 인간 배아 섬유아세포 반응: 시토카인 IL-6 분비
MRC 5(Cell Center of the Chinese Academy of Sciences로부터 구입) 세포를 96 웰 플레이트에 5,000개의 세포/웰로 플레이팅하고, 밤새도록 배양하였다. 37℃에서 20 min 동안 인큐베이션된 IL-17 및 항체(대조군으로서 hIgG)의 혼합물을 MRC 5 세포에 첨가하고, 48 h 동안 배양하였다. 48 h 동안 배양한 후, 세포 상청액을 수집하고, ELISA 키트(Dakewe Corporation으로부터 구입)에 의해 IL-6 분비량을 검출하였다.
MRC 5 세포를 혼합하고, 13E9 H1L1, 13E9 H2L2, 13E9 H3L2, 2G2 H1L1, 2G2 H2L2 또는 2G2 H3L3(1 nM, 10 nM, 100 nM) 및 세쿠키누맙(1 nM, 10 nM, 100 nM)과 각각 혼합하였고, 분비된 IL-6의 검출 결과는 도 18에 제시되어 있다.
13E9 H1L1, 13E9 H2L2, 13E9 H3L2, 및 2G2 H2L2 모두 IL-17에 의해 유도되는 MRC 5 세포의 IL-6 분비를 효과적으로 감소시킬 수 있고, 여기서:
13E9 H1L1 항체가 100 nM 농도에서 IL-6 분비를 억제시키는 데 미치는 효과는 동일한 용량에서 대조군 항체 세쿠키누맙의 것보다 우수하고, 10 nM 농도에서 IL-6 분비에 대한 억제 효과는 100 nM 농도에서 대조군 항체 세쿠키누맙의 것과 등가이고;
13E9 H2L2 항체가 1 nM, 10 nM 및 100 nM 농도에서 모두 IL-6 분비를 억제시키는 데 미치는 효과는 동일한 용량에서 대조군 항체 세쿠키누맙의 것과 등가이고;
10 nM 및 100 nM 농도에서 모두 IL-6 분비에 대한 13E9 H3L2 항체의 억제 효과는 동일한 용량에서 대조군 항체 세쿠키누맙의 것보다 우수하고, 1 nM 농도에서의 효과는 대조군 항체 세쿠키누맙의 것과 등가이고;
2G2 H2L2 항체가 1 nM 및 100 nM 농도에서 모두 IL-6 분비를 억제시키는 데 미치는 효과는 대조군 항체 세쿠키누맙의 것과 등가이고;
2G2 H3L3이 1 nM 농도에서 IL-6 분비를 억제시키는 데 미치는 효과는 동일한 용량에서 대조군 항체 세쿠키누맙의 것보다 우수하다는 것을 도 18로부터 알 수 있다.
상기 결과는 시험관내 혼합된 인간 배아 섬유아세포 반응에서, IL-6의 IL-17A 매개 분비를 차단시키는 데 있어서 본 발명의 항체의 생물학적 활성이 동일한 표적에 대하여 시판 약물 세쿠키누맙의 것보다 우수하거나, 또는 적어도 등가라는 것을 나타낸다.
실시예 11: 항체 약물 13E9 H3L2가 C57BL /6 마우스 건선 모델의 표피 두께에 미치는 효과
C57BL/6 마우스를 각 군단 마우스 8마리씩 5개 군으로 나누었다.
(1) 모델링:
정상군, C57BL/6 마우스의 매끄러운 등에 1일째부터 6일째까지 연속 6일 동안 생리 식염수를 25 ㎕/마우스로 진피내로 주사하였고;
나머지 마우스 군에는 1일째부터 4일째까지 재조합 인간 IL-17A를 2 ㎍/25 ㎕/마우스로 진피내로 주사하고, 5일째부터 6일째까지는 재조합 인간 IL-17A를 5 ㎍/25 ㎕/마우스로 진피내로 주사하였다.
(2) 구체적인 군 분류 및 투여
정상군: 생리 식염수, 0 mg/kg 용량으로, 주 3회에 걸쳐 총 3회 투여;
모델 군: 음성 이소타입 대조군, 50 mg/kg 용량으로, 주 3회에 걸쳐 총 3회 투여;
세쿠키누맙 군: 세쿠키누맙, 50 mg/kg 용량으로, 주 3회에 걸쳐 총 3회 투여;
13E9 H3L2 고용량 군: 50 mg/kg 용량으로, 주 3회에 걸쳐 총 3회 투여;
13E9 H3L2 저용량 군: 10 mg/kg 용량으로, 주 3회에 걸쳐 총 3회 투여.
각 군에 각각 3회에 걸쳐, 즉, 모델링 1일전, 모델링 후 3일째 및 모델링 후 6일째에 피하로 투여하였다.
7일째, 마우스 등의 주사 부위의 피부를 고정시켜 병리학적 절편을 만들고, 표피 두께를 측정하였다.
실험 결과는 도 19에 제시되어 있다.
본 결과는 통계학상, 세쿠키누맙 군(50 mg/kg), 13E9 H3L2 고용량 군(50 mg/kg) 및 13E9 H3L2 저용량 군(10 mg/kg)의 표피 두께는 모델 군의 것보다 유의적으로 더 작았다는 것을 보여준다(P < 0.01).
본 결과는 항체 13E9 H3L2(50 mg/kg)가 C57BL/6 마우스 건선 모델에서 표피 두께에 대해 통계적으로 유의적인 억제 효과를 보이고, 세쿠키누맙(50 mg/kg)과 동일한 효능을 갖고; 13E9 H3L2(10 mg/kg)가 표피 두께에 미치는 억제 효과 또한 통계적으로 유의적이라는 것을 나타낸다.
비록 본 발명의 구체적인 실시양태가 상세하게 기술되었지만, 당업자라면 이해할 수 있을 것이다. 개시된 모든 교시내용에 따르면, 이러한 세부 사항에 대해 다양한 수정 및 치환이 이루어질 수 있으며, 이러한 변형 모두 본 발명의 보호 범주 내에 있다. 본 발명의 전체 범주는 첨부된 청구범위 및 그의 임의의 등가물에 의해 제공된다.
SEQUENCE LISTING <110> AKESO BIOPHARMA, INC <120> ANTI-INTERLEUKIN-17A ANTIBODY, PHARMACEUTICAL COMPOSITION AND USE THEREOF <130> IEC180082PCT <150> 201810539405.0 <151> 2018-05-30 <160> 43 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 360 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Nucleotide sequence of antibody 13E9 heavy chain variable region <400> 1 gaagtaaagc tgcaggagtc gggacctggc ctggtgaaac cttctcagtc tctgtccctc 60 acctgcactg tcactagcta ctcattcacc agtgattatg cctggagctg gatccggcag 120 tttccaggaa tcaaactgga gtggatgggc tacataacct acagtggtgt cactagctac 180 aacccctctc tcaaaagtcg aatctctatc actcgagaca catccaagaa ccagttcttc 240 ctacagttga attctgtgac tactgaggac acggccacat attactgtgc aagggcagac 300 tatgatagct actatactat ggactactgg ggtcaaggaa cctcagtcac cgtctcctca 360 <210> 2 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> The amino acid sequence of antibody 13E9 heavy chain variable region <400> 2 Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Ser Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Thr Ser Tyr Ser Phe Thr Ser Asp 20 25 30 Tyr Ala Trp Ser Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Ile Lys Leu Glu Trp 35 40 45 Met Gly Tyr Ile Thr Tyr Ser Gly Val Thr Ser Tyr Asn Pro Ser Leu 50 55 60 Lys Ser Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe 65 70 75 80 Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ala Asp Tyr Asp Ser Tyr Tyr Thr Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 3 <211> 333 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Nucleotide sequence of antibody 13E9 light chain variable region <400> 3 gacatccagc tgactcagtc tccactctcc ctgcctgtca gtcttggaga tcaagcctcc 60 atctcttgca gatctagtca gagccttgta cacagtaatg gaaacaccta tttacattgg 120 tacctgcaga agccaggcca gtctccaagg ctcctgatct acaaagtttc caaccgattt 180 tctggggtcc cagacaggtt cagtggcagt ggatcaggga cagatttcac actcaagatc 240 agcagagtgg aggctgagga tctgggagtt tatttctgct ctcaaagtac acatttttgg 300 acgttcggtg gaggcaccaa gctggaaata aaa 333 <210> 4 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> The amino acid sequence of antibody 13E9 light chain variable region <400> 4 Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser 20 25 30 Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser 85 90 95 Thr His Phe Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 5 <211> 360 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Nucleotide sequence of antibody 13E9H1L1 heavy chain variable region <400> 5 gatgtgcagc tgcaggaaag cggaccagga ctggtgaagc ctagccagac cctgagcctg 60 acttgcaccg tgtccagcta cagcttcacc agcgactacg cttggtcttg gatcagacag 120 ttcccaggaa ttggcctcga gtggatgggc tacatcacct acagcggcgt gaccagctac 180 aaccccagcc tgaagagcag gatcaccatc agccgggaca ccagcaagaa ccagttcttc 240 ctgcagctga acagcgtgac agcagccgat accgcagtgt actattgcgc cagggccgac 300 tacgacagct actacaccat ggactattgg ggccagggaa ccagcgtgac agtgtctagc 360 <210> 6 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> The amino acid sequence of antibody 13E9H1L1 heavy chain variable region <400> 6 Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Ser Tyr Ser Phe Thr Ser Asp 20 25 30 Tyr Ala Trp Ser Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Ile Gly Leu Glu Trp 35 40 45 Met Gly Tyr Ile Thr Tyr Ser Gly Val Thr Ser Tyr Asn Pro Ser Leu 50 55 60 Lys Ser Arg Ile Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe 65 70 75 80 Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ala Asp Tyr Asp Ser Tyr Tyr Thr Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 7 <211> 333 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Nucleotide sequence of antibody 13E9H1L1 light chain variable region <400> 7 gatgtcgtga tgacccagac ccctctgtct ctgccagtga cactgggaca gcaggctagc 60 atctcttgca gaagcagcca gagcctggtg cacagcaacg gcaacaccta cctgcattgg 120 tacctgcaga agccaggcca gtctcctaga ctgctgatct acaaggtgtc caaccggttc 180 agcggcgtgc cagatagatt cagcggaagc ggaagcggca ccgacttcac cctgaagatc 240 agcagagtgg aggccgagga tctgggagtg tacttctgca gccagagcac ccacttttgg 300 accttcggcg gaggcaccaa gctggagatc aag 333 <210> 8 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> The amino acid sequence of antibody 13E9H1L1 light chain variable region <400> 8 Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly 1 5 10 15 Gln Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser 20 25 30 Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser 85 90 95 Thr His Phe Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 9 <211> 360 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Nucleotide sequence of antibody 13E9H2L2 heavy chain variable region <400> 9 gatgtgcagc tgcaggaaag cggaccagga ctggtgaagc ctagccagac cctgagcctg 60 acttgcaccg tgtccagcta cagcttcacc agcgactacg cttggtcttg gatcagacag 120 ccaccaggaa agggactcga gtggatcggc tacatcacct acagcggcgt gaccagctac 180 aaccccagcc tgaagagcag gatcaccatc agccgggaca ccagcaagaa ccagttcttc 240 ctgcagctgt ctagcgtgac agcagccgat accgcagtgt actattgcgc cagggccgac 300 tacgacagct actacaccat ggactattgg ggccagggaa ccagcgtgac agtgtctagc 360 <210> 10 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> The amino acid sequence of antibody 13E9H2L2 heavy chain variable region <400> 10 Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Ser Tyr Ser Phe Thr Ser Asp 20 25 30 Tyr Ala Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 35 40 45 Ile Gly Tyr Ile Thr Tyr Ser Gly Val Thr Ser Tyr Asn Pro Ser Leu 50 55 60 Lys Ser Arg Ile Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe 65 70 75 80 Leu Gln Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ala Asp Tyr Asp Ser Tyr Tyr Thr Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 11 <211> 333 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Nucleotide sequence of antibody 13E9H2L2 light chain variable region <400> 11 gatgtcgtga tgacccagac ccctctgtct ctgccagtga cactgggaca gccagctagc 60 atctcttgca gaagcagcca gagcctggtg cacagcaacg gcaacaccta cctgcattgg 120 tacctgcaga agccaggcca gtctcctaga ctgctgatct acaaggtgtc caaccggttc 180 agcggcgtgc cagatagatt cagcggaagc ggaagcggca ccgacttcac cctgaagatc 240 agcagagtgg aggccgagga tctgggagtg tactactgca gccagagcac ccacttttgg 300 accttcggcg gaggcaccaa gctggagatc aag 333 <210> 12 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> The amino acid sequence of antibody 13E9H2L2 light chain variable region <400> 12 Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser 20 25 30 Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Ser 85 90 95 Thr His Phe Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 13 <211> 360 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Nucleotide sequence of antibody 13E9H3L2 heavy chain variable region <400> 13 gatgtgcagc tgcaggaaag cggaccagga ctggtgaagc ctagccagac cctgagcctg 60 acttgcaccg tgtccagcta cagcttcacc agcgactacg cttggtcttg gatcagacag 120 ccaccaggaa agggactcga gtggatcggc tacatcacct acagcggcgt gaccagctac 180 aaccctagcc tgaagagccg cgtgaccatt agcgtggaca ccagcaagaa ccagttctcc 240 ctgaagctga gcagcgtgac agccgccgat acagcagtgt actattgcgc ccgggccgat 300 tacgacagct actacaccat ggactattgg ggccagggaa ccagcgtgac agtgtctagc 360 <210> 14 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> The amino acid sequence of antibody 13E9H3L2 heavy chain variable region <400> 14 Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Ser Tyr Ser Phe Thr Ser Asp 20 25 30 Tyr Ala Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 35 40 45 Ile Gly Tyr Ile Thr Tyr Ser Gly Val Thr Ser Tyr Asn Pro Ser Leu 50 55 60 Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser 65 70 75 80 Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ala Asp Tyr Asp Ser Tyr Tyr Thr Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 15 <211> 351 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Nucleotide sequence of antibody 2G2 heavy chain variable region <400> 15 gaggttcagc tggagcagtc tggttctgaa ctgaggagtc ctggatcttc agtaaagctt 60 tcatgcaagg attttgattc agaagtcttc cctattgctg atatgagttg ggttaggcag 120 aagcctgggc atggatttga atggattgga gacatactcc caagttttgg tagaacaatc 180 tatggagaga agtttgagga caaagccaaa gtggatgcag acacagtgtc caacacagcc 240 tacttggaac tcaacagtct gacatctgag gactctgcta tctactactg tgcaaggggt 300 aactacgggt ttgcttactg gggccaaggg actctggtca ctgtctctgc a 351 <210> 16 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> The amino acid sequence of antibody 2G2 heavy chain variable region <400> 16 Glu Val Gln Leu Glu Gln Ser Gly Ser Glu Leu Arg Ser Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Asp Phe Asp Ser Glu Val Phe Pro Ile 20 25 30 Ala Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Lys Pro Gly His Gly Phe Glu Trp 35 40 45 Ile Gly Asp Ile Leu Pro Ser Phe Gly Arg Thr Ile Tyr Gly Glu Lys 50 55 60 Phe Glu Asp Lys Ala Lys Val Asp Ala Asp Thr Val Ser Asn Thr Ala 65 70 75 80 Tyr Leu Glu Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Ile Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Arg Gly Asn Tyr Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ala 115 <210> 17 <211> 336 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Nucleotide sequence of antibody 2G2 light chain variable region <400> 17 gatgttttga tgacccaaac tccactcact ttgtcggtta tcattggaca accagcctcc 60 atctcttgca agccaagtca gagcctctta aatagtgatg gaaagacata tttgaattgg 120 ttgttgcaga ggccaggcca gtctccaaag cgcctaatct atctggtgtc taaactggac 180 tctggagtcc ctgacaggtt cactggcagt ggatcaggga cagatttcac actgaaaatc 240 agcagagtgg aggctgagga tttgggagtt tattattgct ggcaaggttc acattttcct 300 cagacgttcg gtggaggcac aaagttggaa ataaaa 336 <210> 18 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> The amino acid sequence of antibody 2G2 light chain variable region <400> 18 Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Thr Leu Ser Val Ile Ile Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Pro Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser 20 25 30 Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly 85 90 95 Ser His Phe Pro Gln Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 19 <211> 348 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Nucleotide sequence of antibody 2G2H1L1 heavy chain variable region <400> 19 gtgcagctgg tgcagagcgg aagcgaactg agaaagccag gctccagcgt gaagctgtct 60 tgcaaggact tcgacagcga ggtgttcccc atcgccgata tgtcttgggt ccgacaggct 120 ccaggccagg gattcgagtg gatcggtgac attctgccca gcttcggaag aaccaactac 180 gcccagaagt tcgagggcaa ggccaaggtg gacgcagaca agagcaccaa caccgcctac 240 ctggagctga acagcctgag aagcgaggac accgccatct actattgcgc caggggcaac 300 tacggattcg cctattgggg ccagggaaca ctggtgacag tgtccgcc 348 <210> 20 <211> 116 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> The amino acid sequence of antibody 2G2H1L1 heavy chain variable region <400> 20 Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Arg Lys Pro Gly Ser Ser 1 5 10 15 Val Lys Leu Ser Cys Lys Asp Phe Asp Ser Glu Val Phe Pro Ile Ala 20 25 30 Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Phe Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Asp Ile Leu Pro Ser Phe Gly Arg Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Glu Gly Lys Ala Lys Val Asp Ala Asp Lys Ser Thr Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Glu Leu Asn Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Asn Tyr Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ala 115 <210> 21 <211> 336 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Nucleotide sequence of antibody 2G2H1L1 light chain variable region <400> 21 gatgtcgtga tgacccagac ccctctgtct ctgagcgtga cactgggaca gccagctagc 60 atcagctgca gaagcagcca gagcctgctg aacagcgacg gcaagaccta cctgaattgg 120 ctgctgcaga gaccaggcca gtctcctaga aggctgatct acctggtgtc caagctggac 180 agcggcgtgc cagatagatt cagcggaagc ggaagcggca ccgacttcac cctgaagatc 240 agcagagtgg aggccgagga tctgggagtg tactactgtt ggcagggcag ccacttccct 300 cagacattcg gcggcggcac aaagctggag atcaag 336 <210> 22 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> The amino acid sequence of antibody 2G2H1L1 light chain variable region <400> 22 Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Leu Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser 20 25 30 Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Arg Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly 85 90 95 Ser His Phe Pro Gln Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 23 <211> 348 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Nucleotide sequence of antibody 2G2H2L2 heavy chain variable region <400> 23 gtgcagctgg tgcagagcgg agcagaagtg aagaagccag gctccagcgt gaagctgtct 60 tgcaaggact tcgacagcga ggtgttcccc atcgccgata tgtcttgggt ccgacaggct 120 ccaggccagg gattcgagtg gatcggtgac attctgccca gcttcgggag aaccaattac 180 gcccagaagt tccagggcag agtgaccgtg accgcagaca agagcaccaa caccgcctac 240 ctggagctga acagcctgag gagcgaggat accgccgtgt actattgcgc caggggcaac 300 tacggcttcg cctattgggg acagggaaca ctggtgacag tgtccgcc 348 <210> 24 <211> 116 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> The amino acid sequence of antibody 2G2H2L2 heavy chain variable region <400> 24 Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser Ser 1 5 10 15 Val Lys Leu Ser Cys Lys Asp Phe Asp Ser Glu Val Phe Pro Ile Ala 20 25 30 Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Phe Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Asp Ile Leu Pro Ser Phe Gly Arg Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Val Thr Ala Asp Lys Ser Thr Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Glu Leu Asn Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Asn Tyr Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ala 115 <210> 25 <211> 336 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Nucleotide sequence of antibody 2G2H2L2 light chain variable region <400> 25 gatgtcgtga tgacccagac ccctctgtct ctgagcgtga cactgggaca gccagctagc 60 atcagctgca gaagcagcca gagcctgctg aacagcgacg gcaagaccta cctgaattgg 120 ctgctgcaga gaccaggcca gtctcctaga aggctgatct acctggtgtc caacctggac 180 agcggcgtgc cagatagatt cagcggaagc ggaagcggca ccgacttcac cctgaagatc 240 agcagagtgg aagccgagga cgtgggagtg tactactgtt ggcagggcag ccacttccct 300 cagacattcg gcggcggcac aaagctggag atcaag 336 <210> 26 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> The amino acid sequence of antibody 2G2H2L2 light chain variable region <400> 26 Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Leu Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser 20 25 30 Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Arg Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Asn Leu Asp Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly 85 90 95 Ser His Phe Pro Gln Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 27 <211> 348 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Nucleotide sequence of antibody 2G2H3L3 heavy chain variable region <400> 27 gtgcagctgg tgcagagcgg agcagaagtg aagaagccag gcagcagcgt gaaggtgtct 60 tgcaaggact tcagcagcga ggtgttcccc atcgccgata tgtcttgggt ccgacaggct 120 ccaggccagg gactggagtg gatcggtgac attctgccca gcttcgggag aaccaattac 180 gcccagaagt tccagggcag agtgaccgtg accgcagaca agagcaccaa caccgcctac 240 ctggagctgt ctagcctgag aagcgaggac accgccgtgt actattgcgc caggggcaac 300 tacggcttcg cctattgggg acagggaaca ctggtgacag tgtccgcc 348 <210> 28 <211> 116 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> The amino acid sequence of antibody 2G2H3L3 heavy chain variable region <400> 28 Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser Ser 1 5 10 15 Val Lys Val Ser Cys Lys Asp Phe Ser Ser Glu Val Phe Pro Ile Ala 20 25 30 Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Asp Ile Leu Pro Ser Phe Gly Arg Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Val Thr Ala Asp Lys Ser Thr Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Asn Tyr Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ala 115 <210> 29 <211> 336 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Nucleotide sequence of antibody 2G2H3L3 light chain variable region <400> 29 gatgtcgtga tgacccagac ccctctgtct ctgagcgtga cactgggaca gccagctagc 60 atcagctgca gaagcagcca gagcctgctg aacagcgacg gcaagaccta cctgaattgg 120 ttcctgcaga gaccaggcca gtctcctaga aggctgatct acctggtgtc caacctggac 180 agcggcgtgc cagatagatt cagcggaagc ggaagcggca ccgacttcac cctgaagatc 240 agcagagtgg aagccgagga cgtgggagtg tactactgtt ggcagggcag ccacttccct 300 cagacattcg gcggcggcac aaagctggag atcaag 336 <210> 30 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> The amino acid sequence of antibody 2G2H3L3 light chain variable region <400> 30 Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Leu Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser 20 25 30 Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Phe Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Arg Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Asn Leu Asp Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly 85 90 95 Ser His Phe Pro Gln Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 31 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> HCDR1 of Antibodies 13E9, 13E9H1L1, 13E9H2L2 or 13E9H3L2 <400> 31 Ser Tyr Ser Phe Thr Ser Asp Tyr Ala 1 5 <210> 32 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> HCDR2 of Antibodies 13E9, 13E9H1L1, 13E9H2L2 or 13E9H3L2 <400> 32 Ile Thr Tyr Ser Gly Val Thr 1 5 <210> 33 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> HCDR3 of Antibodies 13E9, 13E9H1L1, 13E9H2L2 or 13E9H3L2 <400> 33 Ala Arg Ala Asp Tyr Asp Ser Tyr Tyr Thr Met Asp Tyr 1 5 10 <210> 34 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> LCDR3 of Antibodies 13E9, 13E9H1L1, 13E9H2L2 or 13E9H3L2 <400> 34 Gln Ser Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr 1 5 10 <210> 35 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> LCDR2 of Antibodies 13E9, 13E9H1L1, 13E9H2L2 or 13E9H3L2 <400> 35 Lys Val Ser 1 <210> 36 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> LCDR3 of Antibodies 13E9, 13E9H1L1, 13E9H2L2 or 13E9H3L2 <400> 36 Ser Gln Ser Thr His Phe Trp Thr 1 5 <210> 37 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> HCDR1 of 2G2, 2G2H1L1, 2G2H2L2 or 2G2H3L3 <400> 37 Ser Glu Val Phe Pro Ile Ala Asp 1 5 <210> 38 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> HCDR2 of 2G2, 2G2H1L1, 2G2H2L2 or 2G2H3L3 <400> 38 Ile Leu Pro Ser Phe Gly Arg Thr 1 5 <210> 39 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> HCDR3 of 2G2, 2G2H1L1, 2G2H2L2 or 2G2H3L3 <400> 39 Ala Arg Gly Asn Tyr Gly Phe Ala Tyr 1 5 <210> 40 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> LCDR1 of 2G2, 2G2H1L1, 2G2H2L2 or 2G2H3L3 <400> 40 Gln Ser Leu Leu Asn Ser Asp Gly Lys Thr Tyr 1 5 10 <210> 41 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> LCDR2 of 2G2, 2G2H1L1, 2G2H2L2 or 2G2H3L3 <400> 41 Leu Val Ser 1 <210> 42 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> LCDR3 of 2G2, 2G2H1L1, 2G2H2L2 or 2G2H3L3 <400> 42 Trp Gln Gly Ser His Phe Pro Gln Thr 1 5 <210> 43 <211> 155 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 43 Met Thr Pro Gly Lys Thr Ser Leu Val Ser Leu Leu Leu Leu Leu Ser 1 5 10 15 Leu Glu Ala Ile Val Lys Ala Gly Ile Thr Ile Pro Arg Asn Pro Gly 20 25 30 Cys Pro Asn Ser Glu Asp Lys Asn Phe Pro Arg Thr Val Met Val Asn 35 40 45 Leu Asn Ile His Asn Arg Asn Thr Asn Thr Asn Pro Lys Arg Ser Ser 50 55 60 Asp Tyr Tyr Asn Arg Ser Thr Ser Pro Trp Asn Leu His Arg Asn Glu 65 70 75 80 Asp Pro Glu Arg Tyr Pro Ser Val Ile Trp Glu Ala Lys Cys Arg His 85 90 95 Leu Gly Cys Ile Asn Ala Asp Gly Asn Val Asp Tyr His Met Asn Ser 100 105 110 Val Pro Ile Gln Gln Glu Ile Leu Val Leu Arg Arg Glu Pro Pro His 115 120 125 Cys Pro Asn Ser Phe Arg Leu Glu Lys Ile Leu Val Ser Val Gly Cys 130 135 140 Thr Cys Val Thr Pro Ile Val His His Val Ala 145 150 155

Claims (26)

  1. 단일클론 항체 또는 그의 항원 결합 단편으로서,
    단일클론 항체의 중쇄 가변 영역이 각각 서열 번호 31-33에 기재된 아미노산 서열을 갖는 HCDR1-HCDR3, 또는 각각 서열 번호 37-39에 기재된 아미노산 서열을 갖는 HCDR1-HCDR3을 포함하고,
    단일클론 항체의 경쇄 가변 영역이 각각 서열 번호 34-36에 기재된 아미노산 서열을 갖는 LCDR1-LCDR3, 또는 각각 서열 번호 40-42에 기재된 아미노산 서열을 갖는 LCDR1-LCDR3을 포함하는 것인 단일클론 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  2. 제1항에 있어서, 단일클론 항체의 중쇄 가변 영역이 각각 서열 번호 31-33에 기재된 아미노산 서열을 갖는 HCDR1-HCDR3을 포함하고, 단일클론 항체의 경쇄 가변 영역이 각각 서열 번호 34-36에 기재된 아미노산 서열을 갖는 LCDR1-LCDR3을 포함하거나; 또는
    단일클론 항체의 중쇄 가변 영역이 각각 서열 번호 37-39에 기재된 아미노산 서열을 갖는 HCDR1-HCDR3을 포함하고, 단일클론 항체의 경쇄 가변 영역이 각각 서열 번호 40-42에 기재된 아미노산 서열을 갖는 LCDR1-LCDR3을 포함하는 것인 단일클론 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열이 서열 번호 2, 서열 번호 6, 서열 번호 10, 서열 번호 14, 서열 번호 16, 서열 번호 20, 서열 번호 24 및 서열 번호 28로부터 선택되고,
    경쇄 가변 영역의 아미노산 서열이 서열 번호 4, 서열 번호 8, 서열 번호 12, 서열 번호 18, 서열 번호 22, 서열 번호 26 및 서열 번호 30으로부터 선택되는 것인 단일클론 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열이 서열 번호 2, 서열 번호 6, 서열 번호 10, 및 서열 번호 14로부터 선택되고, 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열이 서열 번호 4, 서열 번호 8, 및 서열 번호 12로부터 선택되거나; 또는
    중쇄 가변 영역의 아미노산 서열이 서열 번호 16, 서열 번호 20, 서열 번호 24 및 서열 번호 28로부터 선택되고, 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열이 서열 번호 18, 서열 번호 22, 서열 번호 26 및 서열 번호 30으로부터 선택되는 것인 단일클론 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역은 하기 (1)-(8):
    (1) 서열 번호 2에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및
    서열 번호 4에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
    (2) 서열 번호 6에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및
    서열 번호 8에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
    (3) 서열 번호 10에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및
    서열 번호 12에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
    (4) 서열 번호 14에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및
    서열 번호 12에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
    (5) 서열 번호 16에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및
    서열 번호 18에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
    (6) 서열 번호 20에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및
    서열 번호 22에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
    (7) 서열 번호 24에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및
    서열 번호 26에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; 및
    (8) 서열 번호 28에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및
    서열 번호 30에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역
    중 어느 하나로부터 선택되는 것인 단일클론 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 단일클론 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 Fab, Fab', F(ab')2, Fd, Fv, dAb, 상보성 결정 영역 단편, 단일 쇄 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 및 디아바디로부터 선택되는 것인 단일클론 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 단일클론 항체는 약 100 nM 미만, 예컨대, 약 10 nM, 5 nM, 4 nM, 3 nM, 2.5 nM, 2 nM, 또는 그보다 낮은 값 미만의 EC50으로 IL-17A에 결합하고; 바람직하게는, EC50은 경쟁적 ELISA에 의해 측정되는 것인 단일클론 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 단일클론 항체는 뮤린 이외의 종, 예컨대 인간 항체로부터 유래된 비CDR 영역을 포함하는 것인 단일클론 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    단일클론 항체는 중국 기준 배양물 보존 센터(CCTCC: China Center for Type Culture Collection)에 수탁 번호 CCTCC NO: C2017102로 기탁된 하이브리도마 세포주 LT006에 의해 생산된 단일클론 항체이거나; 또는
    단일클론 항체가 중국 기준 배양물 보존 센터(CCTCC)에 수탁 번호 CCTCC NO: C2017165로 기탁된 하이브리도마 세포주 LT007에 의해 생산된 단일클론 항체인 단일클론 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 단일클론 항체의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 코딩하는 핵산을 포함하는 단리된 핵산 분자.
  11. 제10항에 있어서, 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 코딩하는 핵산은 하기 (1)-(8):
    (1) 서열 번호 1，서열 번호 3;
    (2) 서열 번호 5，서열 번호 7;
    (3) 서열 번호 9， 서열 번호 11;
    (4) 서열 번호 13，서열 번호 11;
    (5) 서열 번호 15，서열 번호 17;
    (6) 서열 번호 19，서열 번호 21;
    (7) 서열 번호 23，서열 번호 25; 및
    (8) 서열 번호 27，서열 번호 29
    중 어느 하나로부터 선택되는 것인 단리된 핵산 분자.
  12. 제10항 또는 제11항에 따른 단리된 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터로서, 바람직하게는, 재조합 발현 벡터, 예컨대 재조합 원핵성 발현 벡터 또는 재조합 진핵성 발현 벡터인 재조합 벡터.
  13. 제12항에 따른 재조합 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  14. 제13항에 따른 숙주 세포를 적절한 조건하에서 배양하는 단계 및 세포 배양물로부터 단일클론 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 단리시키는 단계를 포함하는, 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 단일클론 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제조하는 방법.
  15. 중국 기준 배양물 보존 센터(CCTCC)에 수탁 번호 CCTCC NO: C2017102로 기탁된 하이브리도마 세포주 LT006; 및
    중국 기준 배양물 보존 센터(CCTCC)에 수탁 번호 CCTCC NO: C2017165로 기탁된 하이브리도마 세포주 LT007
    로부터 선택된 하이브리도마 세포주.
  16. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 단일클론 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 및 접합부를 포함하는 접합체로서, 접합부는 검출가능한 표지이고; 바람직하게는, 검출가능한 표지는 방사성 동위원소, 발광 물질, 예컨대 형광 물질, 착색 물질, 또는 효소인 접합체.
  17. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 단일클론 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 또는 제16항에 따른 접합체를 포함하는 키트로서,
    바람직하게는, 키트는 단일클론 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 특이적으로 인식하는 제2 항체를 추가로 포함하고; 임의로, 제2 항체는 검출가능한 표지를 추가로 포함하고; 바람직하게는, 검출가능한 표지는 방사성 동위원소, 발광 물질, 예컨대 형광 물질, 착색 물질, 또는 효소인 키트.
  18. IL-17A의 정성적 또는 정량적 검출용 키트 제조에서의, 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 단일클론 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 또는 제16항에 따른 접합체의 용도.
  19. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 단일클론 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 또는 제16항에 따른 접합체를 포함하는 약학 조성물로서, 임의로, 약학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 추가로 포함하는 약학 조성물.
  20. 종양 또는 자가면역 질환의 예방 및/또는 치료용 약물의 제조에서의, 또는 자가면역 질환의 진단용 약물의 제조에서의, 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 단일클론 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 또는 제16항에 따른 접합체의 용도로서, 바람직하게는, 자가면역 질환은 건선, 류머티스성 관절염, 건선성 관절염, 강직성 척추염, 및 전신 홍반성 루프스로부터 선택되고; 바람직하게는, 건선은 중등도 내지 중증의 판상 건선인 용도.
  21. IL-17A의 IL17RA로의 결합 차단용 약물,
    IL-17A 활성 또는 수준 조절용(예컨대, 하향조절용) 약물, 또는
    세포에서의 IL-6 발현 억제용 약물
    의 제조에서의, 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 단일클론 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 또는 제16항에 따른 접합체의 용도.
  22. 유효량의 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 단일클론 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 또는 제16항에 따른 접합체를 이를 필요로 하는 세포 또는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 생체내 또는 시험관내 방법으로서,
    IL-17A의 IL17RA로의 결합을 차단시키는 방법,
    IL-17A 활성 또는 수준을 조절하는(예컨대, 하향조절하는) 방법, 또는
    섬유아세포에서 IL-6 발현을 억제시키는 방법
    으로부터 선택되는 생체내 또는 시험관내 방법.
  23. 종양 또는 자가면역 질환을 치료 및/또는 예방하는 방법으로서, 상기 치료 및/또는 예방을 필요로 하는 대상체에게 유효량의 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 단일클론 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 또는 제16항에 따른 접합체를 투여하는 단계를 포함하고, 바람직하게는, 자가면역 질환은 건선, 류머티스성 관절염, 건선성 관절염, 강직성 척추염, 및 전신 홍반성 루프스로부터 선택되고; 바람직하게는, 건선은 중등도 내지 중증의 판상 건선인, 종양 또는 자가면역 질환을 치료 및/또는 예방하는 방법.
  24. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 종양 또는 자가면역 질환을 예방 및/또는 치료하는 데, 또는 자가면역 질환을 진단하는 데 사용되고, 바람직하게는, 자가면역 질환은 건선, 류머티스성 관절염, 건선성 관절염, 강직성 척추염, 및 전신 홍반성 루프스로부터 선택되고; 바람직하게는, 건선은 중등도 내지 중증의 판상 건선인 단일클론 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  25. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    IL-17A의 IL-17RA로의 결합을 차단하는 데,
    IL-17A 활성 또는 수준을 조절하는 데(예컨대, 하향조절하는 데), 또는
    세포에서 IL-6 발현을 억제시키는 데 사용되는, 단일클론 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  26. 자가면역 질환을 진단하는 방법으로서, 시험하고자 하는 샘플(예컨대, 조직 샘플, 세포 샘플, 또는 혈액 샘플), 또는 자가면역 질환의 진단을 필요로 하는 대상체에게 유효량의 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 단일클론 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 또는 제16항에 따른 접합체를 투여하는 단계를 포함하고, 바람직하게는, 자가면역 질환은 건선, 류머티스성 관절염, 건선성 관절염, 강직성 척추염, 및 전신 홍반성 루프스로부터 선택되고; 바람직하게는, 건선은 중등도 내지 중증의 판상 건선이고;
    바람직하게는, 측정된 IL-17A 발현 수준이 건강한 대상체에서의 발현 수준보다 높고 발병 수준에 도달했다면, 진단 결과는 양성이고; 그렇지 않다면, 진단 결과는 음성인, 자가면역 질환을 진단하는 방법.
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