KR20210017731A - 바이오 접착제가 전처리된 3차원 세포 조직체의 배양 및 테스트 장치 - Google Patents

바이오 접착제가 전처리된 3차원 세포 조직체의 배양 및 테스트 장치 Download PDF

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Abstract

본 발명의 바이오 접착제가 전처리된 3차원 세포 조직체의 배양 및 테스트 장치는, 바이오 접착제를 이용하여 트랜스웰 인서트와 같은 지지체 내에서 배양되는 3차원 세포 배양 조직체의 수축을 방지함으로써 3차원 세포 배양 조직체의 형태 및 구조 변화를 방지할 수 있으므로, 이를 이용하여 약물이나 화장품 등의 효능, 독성 평가시, 시험체간의 오차를 최소화하고 시험 결과의 신뢰성을 향상시킬 수 있다.

Description

바이오 접착제가 전처리된 3차원 세포 조직체의 배양 및 테스트 장치{Incubation and test device of 3-dimentional cell organoid treated with bioadhesive}
본 발명은 바이오 접착제가 전처리된 3차원 세포 조직체의 배양 및 테스트 장치에 관한 것으로, 트랜스웰 인서트와 같은 배양 구조체 내에서 3차원 세포 배양 조직체를 배양시킬 때 발생하는 3차원 세포 배양 조직체의 수축을 방지하여, 수축에 의해 발생하는 간극으로의 세포 이동(cell migration)을 예방함으로써 배양 완료된 3차원 세포 배양 조직체를 이식, 약물의 효능 및 독성 평가 분야에 이용할 때의 신뢰도를 향상시킨 배양 및 테스트 장치에 관한 것이다.
세포배양은 생체로부터 세포를 채취하고, 이를 생체 밖에서 배양시키는 기술로, 배양된 세포를 이용하여 약물이나 화장료 등의 효능 평가, 독성 평가에 적용하는 기술이 널리 확대되고 있고, 배양된 세포를 피부, 장기, 신경 등 신체의 다양한 조직으로 분화시켜 인체에 이식하거나 분화시키기 전 상태에서 인체에 이식시켜 생착 및 분화를 동시에 이루어지게 함으로써 다양한 질병 치료에 활용될 수 있음이 밝혀짐에 따라 세포 배양에 관한 관심 및 연구가 증가하고 있다.
기존에는 평평한 페트리 디쉬의 바닥에 세포를 부착시키고 배양시켜 얻어진 배양체를 이용하여 신호 전달, 세포 분화 등의 연구를 수행하였으나, 실제 세포는 페트리 디쉬의 바닥에 부착되어 있는 것과 같이 하나의 면에 부착되어 자라는 것이 아니라 주변의 세포와 액체 등에 둘러싸인 3차원 공간에 떠 있는 상태로 존재하기 때문에 2차원 배양 방식으로 얻어진 배양체의 거동은 실제 인체내의 세포 거동과의 오차가 존재한다.
이에, 콜라겐과 같은 천연고분자와 세포가 혼합된 젤 형태의 3차원적 환경에서 세포를 배양하는 방식이 대두되었고, 이와 같은 3차원 배양 방식으로 배양된 배양체는 실제 인체의 조직과 보다 유사한 거동을 나타내는 것이 확인되어, 최근에는 3차원 배양 방식이 널리 사용되고 있다.
3차원 세포 배양은 일반적으로 트랜스웰을 이용하여 수행된다. 트랜스웰은 하단부가 미세 다공성 멤브레인으로 이루어진 트랜스웰 인서트와, 트랜스웰 인서트를 수용하는 하부 챔버로 구성되어, 액체배지로 채워진 하부 챔버에 천연고분자와 세포가 혼합된 3차원 세포 배양 조직체가 수용된 트랜스웰 인서트를 삽입하면, 미세 다공성 멤브레인에 의해 액체배지가 공유됨으로써 3차원 세포 배양 조직체에서의 세포 배양이 이루어지는 장치이다.
이와 같은 장치를 이용하여 세포 배양을 수행하는 경우, 하부 챔버와 트랜스웰 인서트를 분리하여 손쉽게 액체배지를 교환할 수 있고, 세포 배양 효율이 높은 장점이 있다.
그러나, 배양 과정에서 세포가 증식 및 분화함에 따라 천연고분자의 수축이 발생하게 되는데, 이와 같은 수축에 의해 3차원 세포 배양 조직체의 구조 및 형태가 불균일해지는 문제가 있다. 뿐만 아니라, 피부와 같이 계층적 구조를 갖는 조직체를 배양하는 경우에는 수축에 의해 발생한 트랜스웰 인서트와의 간극으로 세포 이동(cell migration)이 이루어져 계층 구조가 무너지게 되므로, 이후 배양이 완료된 3차원 세포 배양 조직체를 이용한 효능이나 독성 시험을 수행할 때, 각 시험체간의 오차를 크게 발생시켜 시험의 신뢰도를 저해하는 문제가 있다.
이에, 3차원 세포 배양 조직체를 상부 챔버와 같은 지지체를 이용하여 배양할 때 발생하는 3차원 세포 배양 조직체의 수축을 방지할 수 있는 기술 개발이 요구된다.
등록특허 제10-1900466호(2018.09.13 등록)
본 발명에서는 3차원 세포 배양 조직체를 트랜스웰 인서트와 같은 지지체 내에서 배양할 때 발생하는 3차원 세포 배양 조직체의 수축을 방지하는 기술을 제공하고자 한다.
상술한 바와 같은 목적을 달성하기 위한 본 발명의 일 실시 형태는, 3차원 세포 배양 조직체를 포함하는 테스트 장치에 관한 것으로, 보다 상세하게는, 배양 구조체; 상기 배양 구조체 내측에 배치되는 3차원 세포 배양 조직체; 및 상기 배양 구조체와 3차원 세포 배양 조직체 사이의 적어도 일부 계면에 배치되는 바이오 접착제;를 포함하고, 상기 배양 구조체는, 몸체, 상기 몸체를 관통하는 홀 및 상기 홀의 일단을 덮도록 형성되는 다공성 멤브레인을 포함하는, 바이오 접착제가 전처리된 3차원 세포 조직체의 배양 및 테스트 장치에 관한 것이다.
상기 바이오 접착제는, 홍합 접착 단백질, 피브린 글루, 젤라틴 글루, 시아노아크릴레이트계 바이오 접착제 및 폴리우레탄계 바이오 접착제 중 적어도 어느 하나 이상을 포함할 수 있다.
상기 바이오 접착제는, 홍합 접착 단백질일 수 있다.
상기 바이오 접착제는, 3차원 세포 배양 조직체와 상기 배양 구조체의 다공성 멤브레인 사이에 배치될 수 있다.
상기 바이오 접착제는, 3차원 세포 배양 조직체와 다공성 멤브레인 사이에 배치되되, 상기 몸체를 관통하는 홀의 내측면을 따라 3차원 세포 배양 조직체의 측면으로 연장 배치될 수 있다.
상기 3차원 세포 배양 조직체는, 천연고분자 내에 세포가 분산된 젤 형태일 수 있다.
본 발명의 다른 실시 형태는, 3차원 세포 배양 조직체를 포함하는 테스트 장치의 제조방법에 관한 것으로, 몸체, 상기 몸체를 관통하는 홀 및 상기 홀의 일단을 덮도록 형성되는 다공성 멤브레인을 포함하는 배양 구조체의 내측에 바이오 접착제를 도포하는 바이오 접착제 도포 단계; 상기 바이오 접착제를 건조하는 건조 단계; 및 적어도 일부가 상기 바이오 접착제와 맞닿도록 3차원 세포 배양 조직체를 배양 구조체 내측에 배치하는 3차원 세포 배양 조직체 배치 단계;를 포함한다.
본 발명의 바이오 접착제가 전처리된 3차원 세포 조직체의 배양 및 테스트 장치는 트랜스웰 인서트와 같은 지지체 내에서 배양되는 3차원 세포 배양 조직체의 수축을 방지함으로써 3차원 세포 배양 조직체의 형태 및 구조 변화를 방지할 수 있으므로, 이를 이용하여 약물이나 화장품 등의 효능, 독성 평가시, 시험체간의 오차를 최소화하고 시험 결과의 신뢰성을 향상시킬 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 바이오 접착제가 전처리된 3차원 세포 조직체의 배양 및 테스트 장치를 개략적으로 도시한 단면도이다.
도 2는 본 발명의 바이오 접착제가 전처리된 3차원 세포 조직체의 배양 및 테스트 장치에 바이오 접착제를 도포하는 방법을 도시한 것이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 바이오 접착제가 전처리된 3차원 세포 조직체의 배양 및 테스트 장치를 개략적으로 도시한 단면도이다.
도 4, 도 5 및 도 6은 각각 실험예 1, 실험예 2 및 실험예 3의 결과를 도시한 사진이다.
이하 본 발명의 바람직한 실시예를 통해 상세히 설명하기에 앞서, 본 명세서 및 청구범위에 사용된 용어나 단어는 통상적이거나 사전적인 의미로 한정하여 해석되어서는 아니 되며, 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야 함을 밝혀둔다.
본 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 “포함” 한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
이하에서는, 본 발명의 실시예를 살펴본다. 그러나 본 발명의 범주가 이하의 바람직한 실시예에 한정되는 것은 아니며, 당업자라면 본 발명의 권리범위 내에서 본 명세서에 기재된 내용의 여러 가지 변형된 형태를 실시할 수 있다.
먼저, 본 발명은 트랜스웰 인서트와 같은 배양 구조체 내에서 3차원 세포 배양 조직체를 배양할 때 발생하는 3차원 세포 배양 조직체의 수축을 방지하는 기술에 관한 것이다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 바이오 접착제가 전처리된 3차원 세포 조직체의 배양 및 테스트 장치(10)를 도시한 것으로, 도 1을 참조하면, 상기 배양 및 테스트 장치(10)는, 배양 구조체(100); 상기 배양 구조체(100) 내측에 배치되는 3차원 세포 배양 조직체(300); 및 상기 배양 구조체(100)와 3차원 세포 배양 조직체(300)의 적어도 일부 계면에 배치되는 바이오 접착제(200);를 포함한다.
상기 배양 구조체(100)로 본 발명이 속하는 기술분야에서 사용되는 트랜스웰에 사용되는 트랜스웰 인서트 또는 상부 챔버가 사용될 수 있으며, 배양 구조체(100)는 몸체(110)를 관통하는 홀(120) 및 상기 홀의 일단을 덮도록 형성되는 다공성 멤브레인(130)을 포함하는 것이 바람직하다.
상기 트랜스웰은 상업적으로 시판되는 제품이 사용될 수 있으며, 예를 들어, Corning incorporated 사의 제품이 사용될 수 있다. 또는, 등록특허 제1981053호(2019.05.16 등록)에 제시된 높이조절이 가능한 분리형 구조의 배양구조체가 사용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 트랜스웰은 배양 구조체(100); 및 상기 배양 구조체(100)와 배지를 수용하는 하부 챔버;로 구성되며, 배양 구조체(100)가 하부 챔버 내에 수용되어, 배양 구조체(100)의 다공성 멤브레인(130)에 의해 하부 챔버에 수용된 배지가 공유됨으로써 배양 구조체(100) 내의 3차원 세포 배양 조직체(300)의 세포 분화 및 증식이 이루어질 수 있다.
상기 다공성 멤브레인(130)은 액채배지가 투과될 수 있는 미세다공성 막일 수 있으며, 공극의 크기는 특별히 제한되지 않으나, 바람직하게는 마이크로 단위의 공극이 형성된 미세다공성 막일 수 있다. 다공성 멤브레인(130)은 접착제, 접착 테이프 등을 통해 몸체(110)에 부착될 수 있으며, 또는 커버 등의 수단에 의해 다공성 멤브레인(130)의 둘레부가 커버와 몸체(100) 사이에 고정되는 방식으로 부착될 수도 있다.
이와 같은 배양 구조체(100)는 다공성 멤브레인(130)이 하부에 위치하도록 배치되어 사용되므로, 3차원 세포 배양 조직체(300)는 일반적으로 다공성 멤브레인(130)의 상면과 홀(120)의 하부 내측면에 부착되어 배양된다.
그러나, 배양 과정에서 세포의 분화 및 증식이 일어나면서 3차원 세포 배양 조직체(300)가 수축되는 현상이 발생하여 3차원 세포 배양 조직체(300)의 형태를 변형시킬 뿐만 아니라, 3차원 세포 배양 조직체(300)가 진피와 표피를 갖는 피부 조직과 같이 계층적 구조를 가질 경우, 수축에 의해 발생한 배양 구조체(100)와의 간극으로의 세포 이동(cell migration)이 일어나며 조직체의 계층적 구조를 무너뜨린다.
따라서, 배양이 완료된 3차원 세포 배양 조직체(300)를 이용하여 이식을 수행하거나, 약물이나 화장품의 효능, 자극, 독성 등의 평가를 할 때 시험체간의 오차를 크게 발생시키는 문제가 있다.
본 발명에서는 이러한 문제를 방지하기 위해 배양 구조체(100)와 3차원 세포 배양 조직체(300) 사이의 적어도 일부 계면에 바이오 접착제(200)를 배치시킴으로써 배양 구조체(100)와 3차원 세포 배양 조직체(300) 사이의 부착력을 향상시킴으로써 3차원 세포 배양 조직체(300)의 수축을 방지하고자 한다.
이때 사용되는 바이오 접착제(200)로 생체조직 접착에 사용될 수 있는 홍합 접착 단백질, 피브린 글루, 젤라틴 글루, 시아노아크릴레이트계 바이오 접착제 및 폴리우레탄계 바이오 접착제 중 적어도 어느 하나 이상을 포함할 수 있다.
바람직하게는 홍합 접착 단백질이 사용될 수 있는데, 피브린 글루는 접착력이 약한 문제가 있고, 젤라틴 글루는 접착성은 우수하나 가교제로 사용되는 포르말린에 의해 독성을 나타낼 수 있으며, 시아노아크릴레이트계나 폴리우레탄계 바이오 접착제와 같은 합성 고분자계 접착제의 경우에는 생체 독성 및 부작용 등의 문제를 나타낼 수 있기 때문이다.
다만, 이와 같은 피브린 글루, 젤라틴 글루 및 합성 고분자계 접착제의 문제점들은 다른 기술적 수단을 통해 해결될 수 있으므로, 본 발명에서 사용될 수 있는 바이오 접착제(200)로 이들을 배제하는 것은 아니다.
상기 홍합 접착 단백질은, 도파(L-dihydroxylalanine, DOPA)가 풍부한 단백질로, 물이 있는 환경에서도 친수성 표면, 소수성 표면, 금속 표면 등 다양한 표면에 강력한 접착력을 나타내고, 인간세포를 공격하지 않으며, 면역반응을 일으키지 않아 인체에 무해하므로, 본 발명에 사용되는 바이오 접착제(200)로 가장 바람직한 물질이다.
상기 바이오 접착제(200)는 3차원 세포 배양 조직체(300)와 다공성 멤브레인(130) 사이에 배치될 수 있다. 이 경우, 3차원 세포 배양 조직체(300)의 하면은 바이오 접착제(200)에 의해 다공성 멤브레인(130)에 부착되고, 측면은 홀(120)의 내측면에 부착된다.
또는, 상기 바이오 접착제(200)가 3차원 세포 배양 조직체(300)와 다공성 멤브레인(130) 사이에 배치되고, 여기서부터 몸체(110)를 관통하는 홀(120)의 내측면을 따라 3차원 세포 배양 조직체(300)의 측면으로 연장 배치될 수 있다. 이 경우, 3차원 세포 배양 조직체(300)의 하면은 바이오 접착제(200)에 의해 다공성 멤브레인(130)에 부착되고, 적어도 일부 측면, 혹은 측면 전체가 바이오 접착제(200)에 의해 홀(120)의 내측면에 부착될 수 있다.
상기 바이오 접착제(200)는 인젝션 방식을 통해 배양 구조체(100)에 도포될 수 있고, 도포 후 소정 시간 동안 건조되어 준비될 수 있다.
상기 인젝션 방식은 작업자에 의해 수작업으로 진행될 수도 있고, 플로팅 혹은 프린팅 방식으로도 진행될 수도 있다. 바람직하게는, 3D 잉크젯 프린팅 방식이 이용될 수 있으며, 이와 같은 방식을 이용하면 바이오 접착제(200)를 균일하게 분포시킬 수 있고, 바이오 접착제(200)가 배출되는 노즐이 다공성 멤브레인(130)에 닿지 않아 다공성 멤브레인(130)의 손상을 최소화 할 수 있는 장점이 있다.
상기 3차원 세포 배양 조직체(300)는 천연고분자 내에 세포가 분산된 젤 형태일 수 있으며, 상기 천연고분자는 콜라겐, 피브린겔, 마트리겔, 알지네이트, 젤라틴, 아가로스 또는 이 중 적어도 둘 이상을 포함한 천연고분자 혼합물일 수 있다.
상기 세포로 적용될 수 있는 세포의 종류는 특별히 한정되지 않으며, 동물세포, 식물세포 또는 이들의 조직일 수 있다. 예를 들어, 상기 세포는 줄기세포(stem cell), 조골세포(osteoblast), 근아세포(myoblast), 건세포(tenocyte), 신경아세포(neuroblast), 섬유아세포(fibroblast), 신경교아세포(glioblast), 배세포(germcell), 간세포(hepatocyte), 신장세포(renal cell), 지대세포(Sertoli cell), 연골세포(chondrocyte), 상피세포(epithelial cell), 심혈관세포, 각질세포(keratinocyte), 평활근세포(smooth muscle cell), 심장근세포(cardiomyocyte), 신경교세포(glial cell), 내피세포(endothelial cell), 호르몬 분비세포, 면역세포, 췌장섬세포(pancreatic islet cell) 및 신경세포(neuron)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상일 수 있다.
상기 3차원 세포 배양 조직체(300)는 한 종류의 세포만을 포함할 수도 있고, 두 종류 이상의 세포를 포함할 수도 있는데, 후자의 경우, 두 종류 이상의 세포가 균일하게 분산되어 포함될 수도 있고, 두 종류 이상의 세포가 서로 분리되어 계층적 구조를 형성할 수도 있다. 계층적 구조란, 피부나 호흡기와 같이 적어도 두 개 이상의 층으로 구성되는 조직 구조를 의미하며, 예를 들어, 피부의 경우에는 진피층과 표피층 두 개의 층을 갖는 계층적 구조를 갖는다.
본 발명의 일 실시예에 따른 바이오 접착제가 전처리된 3차원 세포 조직체의 배양 및 테스트 장치(10)는, 이를 이용하여 피부 구조체를 형성할 때 특히 더 우수한 효과를 나타낸다. 구체적으로, 상부 표면을 이루는 표피층과 나머지 진피층으로 구성된 3차원 세포 배양 조직체(300)의 상부 표면을 제외한 나머지 면은 바이오 접착제(200)에 의해 배양 구조체(100)에 강하게 부착되어 있으므로, 다공성 멤브레인(130)을 통해 유입되는 배양액이 진피층으로만 공급되고 표피층으로 침범하는 것이 미연에 방지되어, 상부 표면의 표피층이 안정적으로 공기층에서 배양될 수 있다.
또한, 강한 접착력에 의해 3차원 세포 배양 조직체(300)의 측면과 배양 구조체(100) 사이의 간극이 형성되지 않으므로, 표피층을 구성하는 세포의 간극으로의 세포 이주가 방지되어 표피 세포가 일정한 위치에서만 증식될 수 있다.
한편, 본 발명의 다른 실시예는 바이오 접착제가 전처리된 3차원 세포 조직체의 배양 및 테스트 장치(10)의 제조방법에 관한 것으로, 상기 배양 및 테스트 장치(10)는 앞서 설명한 것과 동일하므로, 중복되는 설명은 생략한다.
상기 바이오 접착제가 전처리된 3차원 세포 조직체의 배양 및 테스트 장치(10)의 제조방법은, 몸체(110), 상기 몸체(110)를 관통하는 홀(120) 및 상기 홀(120)의 일단을 덮도록 형성되는 다공성 멤브레인(130)을 포함하는 배양 구조체(100)의 내측에 바이오 접착제(200)를 도포하는 바이오 접착제 도포 단계; 상기 바이오 접착제(200)를 건조하는 건조 단계; 및 적어도 일부가 상기 바이오 접착제(200)와 맞닿도록 3차원 세포 배양 조직체(300)를 배양 구조체(100) 내측에 배치하는 3차원 세포 배양 조직체 배치 단계;를 포함한다.
먼저, 상기 바이오 접착제 도포 단계는, 바이오 접착제(200)를 배양 구조체(100)의 내측에 도포하는 단계로, 인젝션 방식을 통해 다공성 멤브레인(130)상에 도포될 수 있다.
바이오 접착제(200)의 도포는, 도 2(a)에 도시된 바와 같이 작업자에 의해 수작업으로 진행될 수도 있고, 도 2(b) 및 도 2(c)와 같은 3D 프린팅 방식으로 진행될 수도 있다. 바람직하게는, 다공성 멤브레인(130)의 손상을 최소화하면서 바이오 접착제(200)를 균일하게 도포시킬 수 있는 3D 잉크젯 프린팅 방식이 이용될 수 있다.
상기 건조 단계는, 배양 구조체(100)에 도포된 바이오 접착제(200)를 건조시키기 위해 진행되는 단계로, 건조 단계를 통해 바이오 접착제(200)가 얇은 박막 형태로 변한다. 이때, 도포된 바이오 접착제(200)의 양에 따라 바이오 접착제(200)가 다공성 멤브레인(130) 상에 박막 형태로 존재할 수 있고(도 1), 또는 다공성 멤브레인(130) 상부와, 여기서부터 연장되어 홀(120) 내측면까지 덮는 형태로 존재할 수도 있다(도 3). 또는 적량을 다공성 멤브레인(130)과 배양 구조체(100)의 홀(120) 내측면에 도포하고 건조하여 바이오 접착제(200)를 도 3과 같은 형태로 형성하는 것도 가능하다.
상기 3차원 세포 배양 조직체 배치 단계는, 천연고분자와 세포가 혼합된 겔 형태의 혼합물을 배양 구조체(100) 내에 수작업 혹은 3D 프린팅 방식을 통해 주입하고 상온냉각하여 젤 형태의 3차원 세포 배양 조직체(300)를 배양 구조체(100) 내에 배치하는 단계이다.
이와 같은 방법을 통해 제조된 바이오 접착제가 전처리된 3차원 세포 조직체의 배양 및 테스트 장치를 이용하여 배양을 진행하는 경우, 3차원 세포 배양 조직체(300)의 수축으로 인한 3차원 세포 배양 조직체(300)와 배양 구조체(100) 사이의 간극이 발생하지 않아, 배양 완료된 3차원 세포 배양 조직체(300)를 이용한 이식, 화장품 및 약품의 효능, 독성 평가를 진행할 때 3차원 세포 배양 조직체(300)의 형태 및 구조에 의한 오차의 발생을 최소화 할 수 있어, 이식의 완성도 및 평가 결과의 신뢰도를 향상시킬 수 있다.
이하, 본 발명의 일 실시예에 따른 바이오 접착제가 전처리된 3차원 세포 조직체의 배양 및 테스트 장치를 제조하고, 이를 통해 본 발명의 구체적인 작용과 효과를 설명하고자 한다. 다만, 이는 본 발명의 바람직한 예시로서 제시된 것으로, 실시예에 따라 본 발명의 권리범위가 한정되는 것은 아니다.
[ 제조예 ]
트랜스웰 인서트에 3D 잉크젯 프린팅 방식을 이용하여 홍합 접착 단백질을 주입하고 건조하여, 도 3과 같은 형태로 건조된 홍합 접착 단백질이 포함된 트랜스웰 인서트를 제조하였다.
이후, 트랜스웰 인서트에 콜라겐과 섬유아세포(Fibroblast)가 혼합된 겔을 주입하고, 상부 표면에 각질형성세포(Keratinocyte)를 접종하여 테스트 장치를 제조한 뒤, 하부는 액체배지와 접촉시키고, 상부는 공기중에 노출시킨 공기-액체 계면(Air-liquid interface, ALI) 방식으로 세포 배양을 진행하였다.
액체배지로는 KBMTM Gold Basal Medium(LONZA)에 KGMTM Gold SingleQuots supplements(LONZA) 7종(Hydrocortisone 0.50 mL, Transferrin 0.50 mL, Epinephrine 0.25 mL, GA-1000 0.50 mL, BPE 2.00 mL, hEGF, 0.50 mL, Insulin 0.50 mL)을 추가하고, 각질형성세포의 분화를 유도한다고 알려진 Calcium chloride(Sigma-Aldrich)를 1.8mM의 농도가 되도록 첨가한 것을 사용하였다.
세포 배양은 CO2 5%, 37℃, 상대습도 95%의 조건에서 수행되었고, 15mL의 액체배지가 수용된 100mm 페트리디쉬에 두 개의 트랜스웰 인서트를 조립하여 수행되되, 액체배지는 3일 단위로 교환되었다.
[ 실험예 1]
홍합 접착 단백질 주입 단계를 제외하고 제조예와 동일한 방식을 이용하여 테스트 장치를 제조한 뒤 세포 배양을 진행하였다. 이때, 주입되는 섬유아세포의 농도를 달리하여 실험을 진행하였고, 각질형성세포는 모든 샘플에서 동일하게 5 ×105 cells/well의 농도로 사용되었으며, 배양 시작 후 3일, 4일 및 7일 경과 시점에서 3차원 세포 배양 조직체의 외관을 촬영하여 도 4에 도시하였다.
도 4를 참조하면, 주입되는 세포의 농도가 높을수록 3차원 세포 배양 조직체의 수축이 더 빠르게 일어나는 것을 확인할 수 있었으며, 주입되는 세포의 농도가 낮더라도 배양이 어느정도 진행 된 시점에서 3차원 세포 배양 조직체의 수축이 발생하는 것을 확인할 수 있었다.
따라서, 종래의 방식을 이용하여 트랜스웰 인서트에 3차원 세포 배양을 진행하는 경우, 수축에 의해 3차원 세포 배양 조직체의 형태가 변화하고, 각 개체별 형태가 불균일하게 형성되므로, 이후 이를 이용하여 약물이나 화장품의 효능, 자극, 독성 등의 실험을 진행하는 경우 실험 결과의 신뢰성을 저하시킬 수 있고, 수축 정도가 심한 경우에는 이와 같은 실험에 사용할 수 없는 문제가 발생함을 확인할 수 있었다.
[ 실험예 2]
제조예와 동일한 방법을 이용하여 실시예의 테스트 장치를 제조하고, 제조예와 동일한 방법을 이용하되 홍합 접착 단백질 주입 단계를 제외하여 비교예의 테스트 장치를 제조한 뒤 세포 배양을 진행하였으며, 배양 초기, 3일 경과 후, 10일 경과 후에 3차원 세포 배양 조직체의 외관을 촬영하여 도 5에 도시하였다.
이때, 각 시험체별로 섬유아세포는 1×106 cells/ml, 각질형성세포는 5×105 cells/well의 농도로 주입되었다.
도 5를 참조하면, 실시예의 경우에는 배양 10일 경과 후에도 홍합 접착 단백질에 의해 3차원 세포 배양 조직체와 트랜스웰 인서트간의 강력한 접착력이 형성되어, 3차원 세포 배양 조직체의 수축이 관찰되지 않았으나, 비교예의 경우에는 3일 경과 후부터 계면에서의 3차원 세포 배양 조직체의 수축이 나타나는 것으로 확인되었다.
따라서, 본 실험 결과로부터, 배양 구조체인 트랜스웰 인서트와 3차원 세포 배양 조직체 사이에 홍합 접착 단백질을 적용하는 경우, 트랜스웰 인서트와 3차원 세포 배양 조직체간의 접착력이 강력하게 유지되어, 배양 과정에서 3차원 세포 배양 조직체가 수축되지 않고 안정적으로 장기간 동안 배양될 수 있음을 확인할 수 있었다.
[ 실험예 3]
상기 실험예 2의 시험체 중 10일간 배양된 실시예와 비교예의 시험체를 동결절단(cryosection) 방식을 이용하여 조직 절편으로 제작하고 염색한 뒤 투과전자현미경을 이용하여 관찰하였다.
보다 구체적으로, 4℃에서 각 시험체를 4% paraformaldehyde에 24시간 고정시키고, PBS로 1시간 동안 세척한 후 인서트에서 조직을 분리하여 30% sucrose에 조직을 담궈 조직이 침전될 때까지 정치시킴으로써 조직을 고정한 뒤, OCT 화합물을 이용하여 OCT 블록을 제조하고, 액체 질소를 이용하여 급랭시킨 후, 동결절단(cryosection)하여 조직 절편을 준비하였다.
다음으로, Hematoxylin and Eosin stain kit HAE-1(ScyTek)를 이용하여 상기 조직 절편의 염색을 수행하고 투과전자현미경을 이용하여 촬영한 뒤 도 6에 도시하였다.
도 6을 참조하면, 홍합 접착 단백질로 처리되지 않은 비교예의 3차원 세포 배양 조직체는, 배양 구조체와의 간극으로 표피를 구성하는 각질형성세포의 세포이동이 이루어져 진피와 표피의 계층 구조가 무너진 것으로 나타난 반면, 홍합 접착 단백질로 처리된 실시예의 3차원 세포 배양 조직체는 진피와 표피의 계층 구조가 안정적으로 유지되는 것으로 확인되었다.
즉, 홍합 접착 단백질에 의해 배양 구조체와 3차원 세포 배양 조직체간의 접착력이 강력하게 형성되어, 3차원 세포 배양 조직체의 수축이 방지되므로 수축된 영역으로의 세포 이동에 의한 계층 구조 손상, 상층부의 세포 손실 등의 문제가 방지되므로, 배양 완료된 3차원 세포 배양 조직체의 제품 신뢰도를 향상시킬 수 있음을 확인할 수 있었다.
[ 실험예 4]
상기 실험예 2의 시험체 중 10일간 배양된 실시예와 비교예의 바닥면 영역에 존재하는 세포를 배양하여 흡광도를 측정한 뒤 그 결과를 표 1에 기재하였다.
구체적으로, KBMTM Gold Basal Medium(LONZA) 300㎕와 WST-1 시약 30㎕가 혼합된 혼합시약을 준비하고, 10일간 배양이 완료된 각 조직을 트랜스웰 인서트에서 분리하여 24웰 플레이트로 옮겨 바닥면에만 상기 혼합시약을 분주하고, 37°C, 5% CO2, 상대습도 95%의 인큐베이터에서 4시간 동안 배양한 뒤, 웰 내의 혼합시약의 흡광도를 측정하였다.
흡광도는 440nm의 파장범위에서 측정되었으며, 표 1에는 기준 파장값인 650nm의 파장값과 조직이 없는 혼합시약의 파장값을 제외한 순수 조직의 파장값을 기재하였다.
Tissue No. 비교예(A.u.) 실시예(A.u.)
1 0.76 0.73
2 0.79 0.76
3 0.76 0.78
4 0.79 0.85
5 1.32 0.73
6 1.30 0.76
7 0.95 0.78
8 0.97 0.85
9 0.76 0.97
10 0.79 0.98
표준편차 0.22 0.09
표 1의 실험 결과를 참조하면, 비교예의 경우에는 표피층 전체 면에서의 세포 생존율이 불균일한 것으로 확인되었다. 이는, 3차원 세포 배양 조직체가 수축되어 발생한 간극으로 표피층을 구성하는 세포의 이동이 일어나기 때문에 나타나는 문제로 확인되었다.반면, 실시예의 경우에는 표피층 전체 면에서의 세포 생존율이 균일하게 나타났는데, 이는 홍합 접착 단백질에 의해 3차원 세포 배양 조직체의 수축이 방지되어 세포 이동이 일어나지 않고, 각질형성세포를 분주한 상부층 영역에서만 세포의 분화 및 증식이 일어났기 때문에 나타난 결과로 확인되었다.
따라서, 본 실험 결과로부터 홍합 접착 단백질을 사용하여 트랜스웰 인서트에 3차원 세포 배양 조직체를 배양하면, 각 제품별 품질이 균일하게 유지되어, 이를 이용하여 약물이나 화장품의 효능, 독성 등의 평가 실험을 수행할 때, 실험 결과의 신뢰성을 높일 수 있다.
본 발명은 상술한 특정의 실시예 및 설명에 한정되지 아니하며, 청구범위에서 청구하는 본 발명의 요지를 벗어남이 없이 당해 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 누구든지 다양한 변형 실시가 가능하며, 그와 같은 변형은 본 발명의 보호 범위 내에 있게 된다.
10: 테스트 장치 100: 배양 구조체
110: 몸체 120: 홀
130: 멤브레인 200: 바이오 접착제
300: 3차원 세포 배양 조직체

Claims (7)

  1. 배양 구조체;
    상기 배양 구조체 내측에 배치되는 3차원 세포 배양 조직체; 및
    상기 배양 구조체와 3차원 세포 배양 조직체 사이의 적어도 일부 계면에 배치되는 바이오 접착제;를 포함하고,
    상기 배양 구조체는, 몸체, 상기 몸체를 관통하는 홀 및 상기 홀의 일단을 덮도록 형성되는 다공성 멤브레인을 포함하는 것을 특징으로 하는, 바이오 접착제가 전처리된 3차원 세포 조직체의 배양 및 테스트 장치.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 바이오 접착제는, 홍합 접착 단백질, 피브린 글루, 젤라틴 글루, 시아노아크릴레이트계 바이오 접착제 및 폴리우레탄계 바이오 접착제 중 적어도 어느 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는, 바이오 접착제가 전처리된 3차원 세포 조직체의 배양 및 테스트 장치.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 바이오 접착제는, 홍합 접착 단백질인 것을 특징으로 하는, 바이오 접착제가 전처리된 3차원 세포 조직체의 배양 및 테스트 장치.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 바이오 접착제는, 3차원 세포 배양 조직체와 상기 배양 구조체의 다공성 멤브레인 사이에 배치되는 것을 특징으로 하는, 바이오 접착제가 전처리된 3차원 세포 조직체의 배양 및 테스트 장치.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 바이오 접착제는, 3차원 세포 배양 조직체와 다공성 멤브레인 사이에 배치되되, 상기 몸체를 관통하는 홀의 내측면을 따라 3차원 세포 배양 조직체의 측면으로 연장 배치되는 것을 특징으로 하는, 바이오 접착제가 전처리된 3차원 세포 조직체의 배양 및 테스트 장치.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 3차원 세포 배양 조직체는, 천연고분자 내에 세포가 분산된 젤 형태인 것을 특징으로 하는, 바이오 접착제가 전처리된 3차원 세포 조직체의 배양 및 테스트 장치.
  7. 몸체, 상기 몸체를 관통하는 홀 및 상기 홀의 일단을 덮도록 형성되는 다공성 멤브레인을 포함하는 배양 구조체의 내측에 바이오 접착제를 도포하는 바이오 접착제 도포 단계;
    상기 바이오 접착제를 건조하는 건조 단계; 및
    적어도 일부가 상기 바이오 접착제와 맞닿도록 3차원 세포 배양 조직체를 배양 구조체 내측에 배치하는 3차원 세포 배양 조직체 배치 단계;를 포함하는, 바이오 접착제가 전처리된 3차원 세포 조직체의 배양 및 테스트 장치의 제조방법.
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