KR20210002556A - 엑소좀을 사용한 종양 억제자의 치료적 조절 - Google Patents

엑소좀을 사용한 종양 억제자의 치료적 조절 Download PDF

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KR20210002556A
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라구 칼룰리
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보드 오브 리전츠, 더 유니버시티 오브 텍사스 시스템
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Abstract

종양 억제자를 활성화하는 치료제를 포함하는 지질계 나노 입자, 예컨대 엑소좀의 조성물이 본원에 제공된다. 또한, 적어도 부분적으로는 종양 억제 활성의 손실에 의해 유발된 암에 걸린 환자를 치료하기 위해 이러한 조성물을 사용하는 방법도 제공된다. 특히, 돌연변이 p53을 표적으로 삼는 siRNA를 포함하는 엑소좀이 암 치료에 있어서 이들의 사용 방법과 함께 제공된다.

Description

엑소좀을 사용한 종양 억제자의 치료적 조절
관련 출원의 인용
[0001] 본 출원은 2018년 4월 19일자로 출원된 미국 가특허출원 62/659,859호의 우선권의 이익을 주장하며, 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
서열 목록에 관한 언급
[0002] 본 출원은 EFS-웹을 통해 ASCII 형식으로 제출된 서열 목록을 포함하는데, 해당 목록 전체가 본원에 참조로 포함된다. 2019년 4월 9일에 생성한 상기 ASCII 복사본은 파일명이 UTFCP1369WO_ST25.txt로서, 크기는 0.7 킬로바이트이다.
기술분야
[0003] 본 발명은 일반적으로 의학 및 종양학 분야에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 야생형 종양 억제자를 활성화하고/하거나 종양 억제자에 대한 종양에 의한 기능 획득성 돌연변이(oncogenic gain-of-function mutant)를 억제하기 위해 탑재물을 운반하는 엑소좀의 투여에 의한 암 치료용 조성물 및 방법에 관한 것이다.
[0004] p53은 종양 억제자로서, 여러가지 서로 다른 유형의 암에서 돌연변이되거나 결실된다. 여러가지 서로 다른 연구들은 암의 진행과 전이가 p53 유전자의 돌연변이에 의해 촉진된다는 사실을 입증한 바 있다. 돌연변이 p53의 중추적인 기능적 역할은 췌장암 및 유방암을 비롯한 여러가지 서로 다른 유형의 암들에 대해 입증된 바 있다. 암 생물학에서 p53의 중추적 역할에도 불구하고, 돌연변이 p53을 억제하는 약물은 현재 존재하지 않는다. 본 발명자들은 엑소좀을 사용하여 돌연변이 p53을 특이적으로 억제하는 새로운 방법을 개발하였다.
[0005] 엑소좀을 포함하는 세포외 소포 (EV)는 여러가지 생리학적 과정에 참여하는 나노 크기의 세포간 교신 비히클로서 DNA, RNA 및 단백질을 함유하고 있다. 엑소좀은 다른 세포들에 유입하는 능력이 있어서 잠재적으로 암세포에 치료제를 전달할 수 있다.
[0006] 이와 같이, 본원에서는 엑소좀을 사용하여 p53과 같은 종양 억제자를 특이적으로 활성화하기 위한 조성물 및 방법이 제공된다.
[0007] 한 실시양태에서, 우성적 음성 종양 억제자 돌연변이 또는 종양에 의한 기능 획득성 종양 억제자 돌연변이를 불활성화시키는 치료제 탑재물을 포함하는 지질계 나노입자를 포함하는 조성물이 제공된다. 일부 양태에서, 상기 지질계 나노입자는 그 표면에 CD47을 포함한다. 일부 양태에서, 상기 지질계 나노입자는 그 표면에 성장 인자를 포함한다. 일부 양태에서, 상기 지질계 나노입자는 그 표면에 리포좀 또는 엑소좀을 포함한다.
[0008] 일부 양태에서, 상기 치료제 탑재물은 치료용 단백질, 항체, 억제성 RNA, 유전자 편집 시스템 또는 저분자 의약품이다. 특정 양태에서, 상기 치료용 단백질은 종양에 의한 기능 획득성 종양 억제자 돌연변이의 우성적 음성 형태에 해당한다. 특정 양태에서, 상기 항체는 세포내 항원에 결합한다. 특정 양태에서, 상기 항체는 전장 항체, scFv, Fab 단편, (Fab)2, 이원항체, 삼원항체 또는 미니항체이다. 특정 양태에서, 상기 억제성 RNA는 siRNA, shRNA, miRNA 또는 pre-miRNA이다. 특정 양태에서, 상기 siRNA는 우성적 음성 종양 억제자 돌연변이 또는 종양에 의한 기능 획득성 억제제 돌연변이의 발현을 녹다운시킨다. 특정 양태에서, 상기 유전자 편집 시스템은 CRISPR 시스템이다. 특정 양태에서, 상기 CRISPR 시스템은 엔도뉴클레아제 및 가이드 RNA (gRNA)를 포함한다. 특정 양태에서, 상기 엔도뉴클레아제 및 gRNA는 엑소좀 내의 단일 핵산 분자 상에 암호화된다. 특정 양태에서, 상기 CRISPR 시스템은 종양성 돌연변이를 표적으로 삼는다. 특정 양태에서, 상기 우성적 음성 종양 억제자 돌연변이 또는 종양에 의한 기능 획득성 종양 억제자 돌연변이는 하나 이상의 점 돌연변이이다.
[0009] 일부 양태에서, 상기 종양 억제자는 ACVR1B, APC, ARID1B, ARID2, ASXL1, ATM, ATRX, AXIN1, B2M, BAP1, BCOR, BLU (Beta*), BRCA1, BRCA2, CACNA2D2 (Gene 26), CASP8, C-CAM, CDKN1A (p21), CDKN1B (p27), CDKN1C (p57), CDKN2A (p16), CDKN2D (p19), CEBPA, CFTR, CIC, CHK2, CREBBP, CTS-1, CYB561D2, CYLD, DAXX, DCC, DPC4, EP300, FAM123B, FCC, FUBP1, FUS1, GATA1, GATA3, HIN-1, HNF1A, HYAL1 (Luca-10, HYAL2 (Luca-2), KDM5C, KDM6A, KRAS, KRAS2b, MADR2/JV18, MAP3K1, MCC, MEN1, MEN2, MLH1, MLL2, MLL3, MMAC1, MSH2, MSH6, MTS1, NCOR1, NF1, NF2, NOTCH1, NOTCH2, NPM1, NPRL2 (Gene 21), PAX5, PBRM1, PHF6, PIK3R1, PL6, PLAGL1, PRDM1, PTCH1, PTEN, RASSF1 (123F2), RB1, RNF43, RUNX1, SCGB1A1, SEMA3A, SETD2, Skp2, SMAD2, SMAD4, SMARCA4, SMARCB1, SOCS1, SOX9, STAG2, STK11, TET2, TNPAIP3, TP53, TP73, TRAF7, TSC1, VHL, WRN, WT1 또는 WWOX이다.
[0010] 일부 양태에서, 상기 종양 억제자는 TP53이다. 특정 양태에서, 상기 종양에 의한 기능 획득성 종양 억제자 돌연변이는 TP53R273H이다. 특정 양태에서, 상기 치료제는 siRNA이고, 이 경우 siRNA는 서열번호 1의 서열을 가진다.
[0011] 일부 양태에서, 상기 종양 억제자는 KRAS이다. 특정 양태에서, 상기 종양에 의한 기능 획득성 종양 억제자 돌연변이는 KRASG12D이다. 특정 양태에서, 상기 치료제는 siRNA이고, 이 경우 siRNA는 서열번호 2의 서열을 가진다.
[0012] 일부 양태에서, 상기 조성물은 서열번호 1의 서열을 갖는 siRNA를 포함하는 제1 지질계 나노입자 및 서열번호 2의 서열을 갖는 siRNA를 포함하는 제2 지질계 나노입자를 포함한다.
[0013] 한 실시양태에서, 본 실시양태 들중 어느 하나의 지질계 나노입자를 포함하는 약제학적 조성물이 제공된다. 일부 양태에서, 상기 조성물은 비경구 투여용으로 제형화된다. 일부 양태에서, 상기 조성물은 정맥내, 근육내, 피하 또는 복강내 주사용으로 제형화된다. 일부 양태에서, 상기 조성물은 항균제를 추가로 포함한다. 특정 양태에서, 상기 항균제로는, 염화벤잘코늄, 염화벤제토늄, 벤질알코올, 브로노폴, 세트리미드, 염화세틸피리디늄, 클로르헥시딘, 클로로부탄올, 클로로크레졸, 클로록실레놀, 크레졸, 에틸알코올, 글리세린, 헥세티딘, 이미드우레아, 페놀, 페녹시에탄올, 페닐에틸알코올, 페닐질산수은, 프로필렌 글리콜, 또는 티메로살을 들 수 있다.
[0014] 본 실시양태들 중 어느 한 실시양태의 조성물을 암 치료를 필요로 하는 환자에게 투여함으로써 상기 환자의 암을 치료하는 단계를 포함하는 환자의 암을 치료하는 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 투여에 의해 치료제 탑재물을 환자의 암 세포에 전달한다. 일부 양태에서, 암은 유방암, 폐암, 두경부암, 전립선암, 식도암, 기관지암, 뇌암, 간암, 방광암, 위암, 췌장암, 난소암, 자궁암, 자궁경부암, 고환암, 결장암, 직장암 또는 피부암이다. 일부 양태에서, 상기 췌장암은 췌장관 암종이다.
[0015] 일부 양태에서, 상기 암은 전이성이다. 일부 양태에서, 상기 암은 종양에 의한 기능 획득성 종양 억제자 돌연변이에 대해 동형 접합성이다. 일부 양태에서, 상기 암세포는 종양에 의한 기능 획득성 종양 억제자 돌연변이에 대해 이형 접합성이다. 일부 양태에서, 상기 암세포는 우성적 음성 종양 억제자 돌연변이에 대해 동형 접합성이다. 일부 양태에서, 상기 투여는 전신 투여이다. 특정 양태에서, 상기 전신 투여는 정맥내 투여이다.
[0016] 일부 양태에서, 상기 방법은 적어도 제2 요법을 환자에게 실시하는 단계를 추가로 포함한다. 특정 양태에서, 상기 제2 요법은 수술 요법, 화학요법, 방사선 요법, 저온요법, 호르몬 요법 또는 면역요법을 포함한다. 일부 양태에서, 상기 환자는 인간이다. 특정 양태에서, 상기 지질계 나노입자는 엑소좀이고, 이 경우 엑소좀은 환자에게 자가유래성이다. 특정 양태에서, 상기 엑소좀은 환자로부터 수득한 체액 샘플로부터 얻는다. 특정 양태에서, 상기 체액 샘플은 혈액, 림프액, 타액, 소변, 뇌척수액, 골수 흡인액, 눈 삼출물/눈물 또는 혈청이다. 일부 양태에서, 본 방법은 암 부위에 성장 인자 구배를 제공하여 엑소좀을 해당 부위로 유인해 그 부위에 치료제를 전달하는 단계를 추가로 포함한다.
[0017] 특정 성분과 관련하여, 본원에 사용된 "본질적으로 없는"이라는 말은, 해당 특정 성분을 의도적으로 조성물에 제제화시키지 않았고/않았거나 오염물로서 또는 미량으로만 존재함을 의미하고자 본원에 사용된다. 따라서, 조성물의 의도치 않은 임의의 오염으로 초래되는 특정 성분의 총량은 0.05%를 훨씬 밑도는 수준, 바람직하게는 0.01% 미만이다. 특정 성분의 양을 표준 분석 방법으로 전혀 검출할 수 없는 조성물이 가장 바람직하다.
[0018] 본 출원의 명세서에서 사용되는 단수형 명사 ("a" 또는 "an")는 하나 이상을 의미할 수도 있다. 본 출원의 청구항에서 사용되는 단수형 명사 ("a" 또는 "an") 단어는, "포함하는" 이라는 단어와 함께 사용되는 경우, 하나 또는 하나 이상을 의미할 수 있다.
[0019] 청구항에서 "또는" 이라는 용어의 사용은, 그것이 명시적으로 대안만을 언급하지 않는 한, 또는 명세서가 대안 및 "및/또는"만을 언급하는 정의를 뒷받침하고 있더라도 그 대안이 상호 배타적이지 않는 한, "및/또는"을 의미하는 것으로 사용된다. 본원에서, "또 다른"이라는 말은 두번째 또는 그 이상의 경우를 의미할 수 있다.
[0020] 본 출원 전반에 걸쳐, "약"이라는 용어는 어떠한 수치가, 해당 수치를 측정하는데 사용되는 장치, 방법에 대한 고유의 오차 변동, 또는 해당 연구 대상체들 간에 존재하는 편차를 포함하고 있음을 나타내는데 사용된다.
[0021] 본 발명의 다른 목적, 특징 및 이점들은 하기의 상세한 설명을 보면 명백해 질 것이다. 그러나, 상세한 설명 및 본 발명의 바람직한 실시양태를 제시하는 구체적인 실시예는, 상기 상세한 설명으로부터 본 발명의 개념과 범위 내에서 다양한 변화 및 변형을 줄 수 있음이 당업계의 숙련자에게는 명백하기 때문에, 단지 예시로서만 제공되는 것임을 알아야 한다.
[0022] 하기의 도면은 본 명세서의 일부를 형성하며 본 발명의 특정 양태들을 추가로 설명하기 위해 포함된다. 본 발명은 여기에 제공되는 특정 실시양태들에 대한 상세한 설명과 함께 하나 이상의 이들 도면을 참조하면 보다 잘 이해될 수 있다.
[0023] 도 1a-c. 도 1a - TP53R273H를 표적으로 삼는 siRNA로 처리한 후 Panc-1 세포에서 TP53 발현. 상기 Panc-1 세포주는 TP53R273H에 대해 동형 접합성인 돌연변이가다. *p < 0.05. 도 1b-c - 누드 마우스에 Panc-1 GFP/Luc 세포를 주입하여 동소이식하였다. 종양 성장을 IVIS 영상으로 모니터링하여 총 플럭스 (p/s)로 나타내었다. 마우스를 대조군 엑소좀 (CE), TP53R273H (P53 iexo)를 억제하는 siRNA를 포함하는 iExosome, 또는 KrasG12D와 TP53R273H를 모두 표적으로 삼는 iExosome들의 조합 (P53 iexo와 kras iexo)를 사용하여 i.p. 처리하였다. 처리전, 종양이 있는 모든 마우스 (도 1b). 처리후 및 질병이 진행되는 동안 (도 1c), TP53R273H에 대한 iexo 및 조합 처리가 종양 크기를 감소시켰다.
[0024] 도 2. 성체 히말라야 원숭이에게 비표지된 엑소좀 (대조군) 또는 PKH 막 염료로 표지된 엑소좀 (PKH 엑소좀)을 정맥내로 투여하였다. 원숭이의 간과 췌장을 냉동하고 절개하여 슬라이드 상에 장착하였다. 핵을 명확하기 보기 위해 DAPI로 대비 염색시킨 상기 절개물을 현미경으로 관찰한 결과, 간과 췌장에서 엑소좀들이 견실하고 특이적으로 축적되어 있음을 발견하였다.
[0025] 도 3a-b. 3a - 성체 히말라야 원숭이에게 비표지된 엑소좀 (대조군) 또는 PKH 막 염료로 표지된 엑소좀 (PKH 엑소좀)을 정맥내로 투여하였다. 원숭이의 간과 췌장을 냉동하고 절개하여 슬라이드 상에 장착하였다. 핵을 명확하기 보기 위해 DAPI로 대비 염색시킨 상기 절개물을 현미경으로 관찰한 결과, 공초점 현미경을 사용하였을 때, 간과 췌장에서 엑소좀들이 견실하고 특이적으로 축적되어 있었을 뿐 아니라, 해당 엑소좀들이 췌장 세포 핵과 공동으로 국소편재되어 있음도 발견하였다. 도 3b - 간과 췌장에 표시한 엑소좀 초점 크기, 간과 비교한 췌장에서의 세포당 큰 크기의 초점 및 높은 엑소좀 축적에 대한 정량적 분석.
[0026] 도 4. 열거한 장기들에 있어서, (엑소좀 내부의) siRNA 탑재물을 성체 히말라야 원숭이에게 투여한 후 그의 정량화 및 q-PCR 분석에 의한 확인. 두 원숭이들은 iExosome을 정맥내로 (iv), 세번째 원숭이는 iExosome를 복강내로 (ip) 투여받았다. '0'은 siRNA가 검출되지 않았음을 나타낸다.
[0027] 종양성 p53 돌연변이에 특이적인 siRNA가 로딩 된 엑소좀은 췌장 종양이 있는 마우스에서 종양 성장을 약화시켰다. 상기 약독화는 종양성 p53 돌연변이에 특이적인 siRNA가 로딩된 엑소좀과 종양성 Kras 돌연변이에 특이적인 siRNA가 로딩된 엑소좀의 조합에 의해 보다 더욱 강화되었다. 이와 같이, 본원에서는 p53 및/또는 Kras와 같은 종양 억제자의 종양성 돌연변이뿐만 아니라 암 세포에 대한 종양 억제자의 우성적 음성 돌연변이를 표적으로 삼는 방법이 제공된다.
I. 지질계 나노입자
[0028] 일부 실시양태에서, 지질계 나노입자는 리포좀, 엑소좀, 지질 제제 또는 다른 지질계 나노입자, 예컨대 지질계 소포 (예를 들어, DOTAP: 콜레스테롤 소포)이다. 지질계 나노입자는 양으로 하전되거나, 음으로 하전되거나 또는 중성으로 하전될 수 있다. 지질계 나노입자는 전사와 해독, 신호 전달, 주화성 또는 기타 세포 기능들을 가능케하는데 필요한 성분들을 포함할 수 있다.
[0029] 일부 실시양태에서, 지질계 나노입자는 그 표면에 CD47을 포함한다. CD47 (인테그린 관련 단백질)은 대부분의 조직과 세포들에서 발현되는 막관통 단백질이다. CD47은 신호 조절 단백질 알파 (SIRP-α)에 대한 리간드로서, 대식세포와 수지상 세포들과 같은 식균작용 세포들에서 발현된다. 활성화된 CD47-SIRP-α는 식균작용을 억제하는 신호 전달 캐스케이드를 개시한다. 따라서, 어떠한 특정 이론으로 국한시키고자하는 것은 아니지만, 엑소좀 표면에서의 CD47의 발현은 대식세포에 의한 식균작용을 방지할 수 있다 (전문이 본원에 참고로 포함되는 WO 2016/201323호 참조).
A. 리포좀
[0030] "리포좀"은 밀폐된 지질 이중층 또는 응집체가 생성되어 형성되는 여러가지 단일 및 다중 라멜라 지질 소포를 망라하는 일반적인 용어이다. 리포좀은 일반적으로 인지질을 포함하는 이중층 막, 및 일반적으로 수성 조성물을 포함하는 내부 매질을 갖는 소포 구조체를 보유하는 것을 특징으로 할 수 있다. 본원에 제공되는 리포좀은 단일 라멜라 리포좀, 다중 라멜라 리포좀 및 다중 소포 리포좀을 포함한다. 본원에 제공되는 리포좀은 양으로 하전되거나, 음으로 하전되거나, 또는 중성으로 하전될 수 있다. 특정 실시양태에서, 상기 리포좀은 중성으로 하전되어 있다.
[0031] 다중 라멜라 리포좀은 수성 매질에 의해 분리된 다수의 지질층을 가진다. 이러한 리포좀은 인지질을 포함하는 지질이 과량의 수용액 중에 현탁되는 경우에 자발적으로 형성된다. 상기 지질 성분들은 폐쇄된 구조를 형성하기 전 자가 재배열을 거쳐 해당 지질 이중층 사이에 물과 용해된 용질들을 포집하게 된다. 친유성 분자 또는 친유성 영역들을 갖는 분자도 지질 이중층 중에 용해되거나 이와 결합될 수도 있다.
[0032] 특정 양태에서, 폴리펩타이드, 핵산 또는 소분자 약물은, 예를 들어 리포좀 중 수성인 내부에 캡슐화되거나, 리포좀의 지질 이중층 내에 산재되거나, 상기 리포좀과 폴리펩타이드/핵산 모두에 결합되어 있는 연결 분자를 통해 리포좀에 부착되거나, 리포좀에 포집되거나, 리포좀과 복합체를 형성할 수도 있다.
[0033] 본 실시양태에 따라 사용된 리포좀은 당업자에게 알려져 있는 바와 같이 서로 다른 방법들로 제조될 수 있다. 예를 들어, 인지질, 예컨대 중성 인지질 디올레오일포스파티딜콜린 (DOPC)을 tert-부탄올 중에 용해시킨다. 다음으로, 상기 지질(들)을 폴리펩타이드, 핵산 및/또는 기타 성분(들)과 혼합한다. 상기 지질 혼합물에 Tween 20을 첨가하여 Tween 20이 조성물 중량의 약 5%가 되도록 한다. 과량의 tert-부탄올을 상기 혼합물에 첨가하여 tert-부탄올의 부피가 적어도 95%가 되도록 한다. 상기 혼합물을 볼텍싱하고, 드라이 아이스/아세톤 조에서 냉동시킨 후, 밤새 동결건조시켰다. 상기 동결건조된 제제를 -20℃로 보관하여 최대 3개월간 사용할 수 있다. 필요한 경우마다, 상기 동결건조시킨 리포좀을 0.9%의 식염수 중에서 환원시킨다.
[0034] 다르게는, 리포좀은 용기, 예컨대 유리 재질의 배형(pear-shaped) 플라스크 내의 용매에 지질을 혼합함으로써 제조될 수 있다. 상기 용기는 리포좀 현탁액의 예상 부피의 10배 큰 부피를 가져야 한다. 회전식 증발기를 사용하여, 음압 하에 약 40℃에서 상기 용매를 제거한다. 상기 용매는 일반적으로 해당 리포좀의 목적한 부피에 따라 약 5분 내지 2시간 이내에 제거한다. 상기 조성물은 진공 하에 건조기 중에서 더 건조시킬 수도 있다. 상기 건조된 지질은 일반적으로 시간이 경과함에 따라 품질이 저하되는 경향이 있으므로 약 1주 후에는 폐기한다.
[0035] 건조된 지질들은 모든 지질막이 재현탁될 때까지 진탕함으로써 멸균 무발열원 증류수 중 약 25-50 mM의 인지질로 수화될 수 있다. 이후, 상기 수성 리포좀들을 분취액으로 나누어, 각각 바이알에 넣어 동결건조시킨 후, 진공 하에 밀봉할 수 있다.
[0036] 상술한 바와 같이 제조된 상기 건조된 지질 또는 동결건조된 리포좀은 단백질 또는 펩타이드의 용액 중에서 탈수 및 환원시키고, 적절한 용매, 예컨대 DPBS를 사용하여 적절한 농도로 희석할 수 있다. 다음으로, 상기 혼합물을 볼텍스 혼합기 중에서 강하게 진탕시킨다. 캡슐화되지 않은 추가의 물질들, 예컨대 호르몬, 약물, 핵산 구조물 등을 포함하나 이에 제한되지 않는 제제들은 29,000xg로 원심분리하여 제거하고 리포좀 펠릿은 세척한다. 상기 세척한 리포좀은 적절한 총 인지질 농도, 예를 들어 약 50-200 mM로 재현탁된다. 캡슐화된 추가의 물질 또는 활성제의 양은 표준 방법에 따라 측정될 수 있다. 리포좀 제제 중에 캡슐화된 추가의 물질 또는 활성제의 양을 측정한 후, 상기 리포좀을 적절한 농도로 희석하여 사용할 때까지 4℃로 보관할 수 있다. 상기 리포좀을 포함하는 약제학적 조성물은 일반적으로 멸균된 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제, 예컨대 물 또는 식염수 용액을 포함할 것이다.
[0037] 본 실시양태에 유용할 수 있는 추가의 리포좀들로는, 예를 들어 WO02/100435A1호, 미국 특허 5,962,016호, 미국 출원 2004/0208921호, WO03/015757A1호, WO04/029213A2호, 미국 특허 5,030,453호 및 미국 특허 6,680,068호 (이들의 전문은 해당 특허에 대한 권리에 대한 포기 없이 참고로 포함됨)에 기재된 양이온성 리포좀을 포함한다.
[0038] 이러한 리포좀을 제조함에 있어서는, 본원에 기술되거나 당업자에게 공지된 바와 같은 임의의 프로토콜이 사용될 수 있다. 리포좀을 제조하는 추가의 비제한적인 예들은 미국 특허 4,728,578호, 4,728,575호, 4,737,323호, 4,533,254호, 4,162,282호, 4,310,505호 및 4,921,706호; 국제출원 PCT/US85/01161호 및 PCT/US89/05040호 (각각 본원에 참조로 포함됨)에 기재되어 있다.
[0039] 특정 실시양태에서, 상기 지질계 나노입자는 중성 리포좀 (예컨대, DOPC 리포좀)이다. 본원에 사용된 "중성 리포좀"또는 "하전되지 않은 리포좀"은 본질적으로 중성인 (실질적으로 하전되지 않은) 순전하를 나타내는 하나 이상의 지질 성분들을 함유하는 리포좀으로 정의된다. "본질적으로 중성인" 또는 "본질적으로 하전되지 않는"이라는 말은, 주어진 대상군 (예컨대, 리포좀 대상군) 내의 지질 성분들이 또 다른 성분의 반대 전하에 의해 상쇄되지 않는 전하를 (있다손 치더라도) 거의 포함하지 않는다는 의미로 말하려고 한 것이다 (즉, 성분들 중 10% 미만, 보다 바람직하게는 5% 미만, 가장 바람직하게는 1% 미만이 상쇄되지 않은 전하를 포함함). 특정 실시양태에서, 중성 리포좀은 대부분, 생체 조건 하에 (즉, 약 pH 7에서) 자체적으로 중성인 지질 및/또는 인지질을 포함할 수 있다.
[0040] 본 실시양태의 리포좀 및/또는 지질계 나노입자들은 인지질을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 1종의 인지질이 리포좀의 생성에 사용될 수 있다 (예컨대, DOPC와 같은 중성 인지질이 중성 리포좀을 생성하는데 사용될 수 있음). 다른 실시양태에서, 리포좀을 생성하기 위해 1종 이상의 인지질이 사용될 수 있다. 인지질은 천연 또는 합성 공급원으로부터 유래할 수 있다. 인지질은, 예를 들어 포스파티딜콜린, 포스파티딜글리세롤 및 포스파티딜에탄올아민을 포함하는데; 포스파티딜에탄올아민 및 포스파티딜콜린은 생리학적 조건 하에 (즉, 약 pH 7에서) 하전되지 않기 때문에, 이러한 화합물들은 중성 리포좀을 생성하는데 특히 유용할 수 있다. 특정 실시양태에서, 상기 인지질 DOPC는 하전되지 않는 리포좀을 제조하는데 사용된다. 특정 실시양태에서, 인지질이 아닌 지질 (예컨대, 콜레스테롤)이 사용될 수 있다.
[0041] 인지질은 글리세로 인지질 및 특정 스핑고 지질을 포함한다. 인지질로는, 이에 제한되지는 않지만, 디올레오일포스파티딜콜린 ("DOPC"), 에그 포스파티딜콜린 ("EPC"), 디라우릴로일포스파티딜콜린 ("DLPC"), 디미리스토일포스파티딜콜린 ("DMPC"), 디팔미토일포스파티딜콜린 ("DPPC"), 디스테아로일포스파티딜콜린 ("DSPC"), 1-미리스토일-2-팔미토일 포스파티딜콜린 ("MPPC"), 1-팔미토일-2-미리스토일 포스파티딜콜린 ("PMPC"), 1-팔미토일-2-스테아로일 포스파티딜콜린 ("PSPC"), 1-스테아로일-2-팔미토일 포스파티딜콜린 ("SPPC"), 디라우릴로일포스파티딜글리세롤 ("DLPG"), 디미리스토일포스파티딜글리세롤 ("DMPG"), 디팔미토일포스파티딜글리세롤 ("DPPG"), 디스테아로일포스파티딜글리세롤 ("DSPG"), 디스테아로일 스핑고미엘린 ("DSSP"), 디스테아로일포스파티딜에탄올아민 ("DSPE"), 디올레오일포스파티딜글리세롤 ("DOPG"), 디미리스토일포스파티드산 ("DMPA"), 디팔미토일 포스파티드산 ("DPPA"), 디미리스토일 포스파티딜 에탄올아민 ("DMPE"), 디팔미토일 포스파티딜에탄올아민 ("DPPE"), 디미리스토일 포스파티딜세린 ("DMPS"), 디팔미토일 포스파티딜세린 ("DPPS"), 뇌 포스파티딜세린 ("BPS"), 뇌 스핑고미엘린 ("BSP"), 디팔미토일 스핑고미엘린 ("DPSP"), 디미리스틸 포스파티딜콜린 ("DMPC"), 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린 ("DAPC"), 1,2-디아라키도일-sn-글리세로-3-포스포콜린 ("DBPC"), 1,2-디에이코세노일-sn-글리세로-3-포스포콜린 ("DEPC"), 디올레오일포스파티딜에탄올아민 ("DOPE"), 팔미토일로에오일 포스파티딜콜린 ("POPC"), 팔미토일로에오일 포스파티딜에탄올아민 ("POPE"), 리소포스파티딜콜린, 리소포스파티딜에탄올아민 및 디리놀레오일포스파티딜콜린을 포함한다.
B. 엑소좀
[0042] 본원에 사용된 "미세소포" 및 "엑소좀"이라는 용어는 약 10 nm 내지 약 5000 nm, 보다 일반적으로는 30 nm 내지 1000 nm, 가장 일반적으로는 약 50 nm 내지 750 nm의 직경 (또는 입자가 구형이 아닌 가장 큰 치수)을 갖는 막성 입자를 가리키며, 이 경우 해당 엑소좀 막의 적어도 일부는 세포로부터 직접 수득된다. 가장 일반적으로, 엑소좀은 공여체 세포 크기의 최대 5%의 크기 (평균 직경)를 가질 것이다. 따라서, 특히 고려되는 엑소좀은 세포로부터 배출되는 것을 포함한다.
[0043] 엑소좀은 예를 들어 체액과 같은 임의 적절한 샘플 종류에서 검출되거나 그로부터 분리될 수 있다. 본원에 사용된 "분리된"이라는 용어는 해당 자연 환경으로부터의 분리를 가리키는 것으로, 적어도 부분적인 정제를 포함하며 실질적인 정제를 포함할 수 있음을 말하고자 한 것이다. 본원에 사용된 "샘플"이라는 용어는 본 발명에 의해 제공된 방법에 적절한 임의의 샘플을 지칭한다. 상기 샘플은 검출 또는 분리에 적합한 엑소좀을 포함하는 임의의 샘플일 수 있다. 샘플의 공급원으로는 혈액, 골수, 흉수, 복막액, 뇌척수액, 소변, 침, 양수, 악성 복수, 기관지 폐포 세척액, 활액, 모유, 땀, 눈물, 관절액 및 기관지 세척물을 포함한다. 한 양태에서, 상기 샘플은 예를 들어 전혈 또는 이의 임의의 분획 또는 성분을 포함하는 혈액 샘플이다. 본 발명에 사용하기에 적합한 혈액 샘플은 혈액 세포 또는 그의 성분들, 예컨대 정맥, 동맥, 말초, 조직, 탯줄 등을 포함하는 공지된 임의의 공급원으로부터 추출될 수 있다. 예를 들어, 샘플은 널리 공지되어 있어 통상적인 임상 방법들 (예컨대, 전혈 채혈 및 가공을 위한 절차)을 사용하여 수득해 가공처리할 수 있다. 한 양태에서, 대표적인 샘플은 암에 걸린 대상체로부터 채취한 말초 혈액일 수 있다.
[0044] 엑소좀은 수술 샘플, 생검 샘플, 조직, 대변 및 배양된 세포와 같은 조직 샘플들로부터 분리될 수 있다. 조직 공급원으로부터 엑소좀을 분리할 때, 단일 세포 현탁액을 수득한 후 세포들을 용해시켜 엑소좀을 방출시키기 위해 해당 조직을 균질화하는 것이 필요할 수 있다. 조직 샘플들로부터 엑소좀을 분리할 때, 엑소좀의 붕괴를 초래하지 않는 균질화 및 용해 절차를 선택하는 것이 중요하다. 본원에서 고려되는 엑소좀은 바람직하게는 생리학적으로 허용가능한 용액, 예를 들어 완충 식염수, 증식 배지, 다양한 수성 배지 등 중의 체액으로부터 분리된다.
[0045] 엑소좀은 새로 수집된 샘플이나 냉동 또는 냉장 보관된 샘플로부터 분리될 수 있다. 일부 실시양태에서, 엑소좀은 세포 배양 배지로부터 분리될 수 있다. 필수적인 것은 아니지만, 부피 배제 중합체(volume-excluding polymer)로 침전시키기 전에 유체 샘플을 정제하여 해당 샘플로부터 잔해물을 제거하면 고순도의 엑소좀이 수득될 수 있다. 정제 방법으로는 원심분리, 초원심분리, 여과 또는 한외여과를 포함한다. 가장 통상적으로, 엑소좀은 당업계에 널리 공지된 수많은 방법들로 분리할 수 있다. 한 바람직한 방법으로는 체액 또는 세포 배양 상청액으로부터의 분별 원심분리를 들 수 있다. 엑소좀의 분리를 위한 예시적인 방법들은 문헌 [Losche et al., 2004]; [Mesri and Altieri, 1998]; [Morel et al., 2004]에 기술되어 있다. 다르게는, 엑소좀은 문헌 [Combes et al., 1997]에 기술된 바와 같이 유세포분석법을 통해 분리될 수도 있다.
[0046] 엑소좀의 분리를 위해 용인된 한 프로토콜로는 흔히 비교적 저밀도의 엑소좀을 부유시키기 위해 수크로스 밀도 구배 또는 수크로스 쿠션(sucrose cushion)과 조합된 초원심분리를 포함한다. 순차적인 분별 원심분리에 의한 엑소좀의 분리는 다른 미세소포 또는 거대분자 복합체들과 크기 분포가 중첩될 가능성이 있기 때문에 복잡하다. 또한, 원심분리는 크기에 따라 소포들을 분리하기에는 불충분한 방법일 수 있다. 그러나, 순차적 원심분리는, 수크로스 구배 초원심분리와 조합하는 경우라면 엑소좀을 고농축시킬 수 있다.
[0047] 초원심분리 루트에 대한 대안으로서 크기에 기반한 엑소좀의 분리는 또 다른 선택사항이다. 초원심분리에 비해 시간이 덜 걸리고 특수 장비를 사용할 필요가 없는 한외여과 절차를 이용한 엑소좀의 성공적인 정제에 대해서도 보고된 바 있다. 이와 유사하게, 상용 키트도 이용할 수 있는데 [EXOMIR™, 바이우사이언티픽(Bioo Scientific)사 제조], 이를 사용하면 한 마이크로필터에서는 세포, 혈소판 및 세포 잔해물들을 제거하고, 제2 마이크로필터에서는 유체를 구동시키기 위해 양압을 사용하여 30 nm보다 큰 소포들을 포획할 수 있다. 그러나, 이 과정에서, 엑소좀은 회수되지 않고, 이들의 RNA 내용물을 제2 마이크로필터 상에서 걸린 물질로부터 직접 추출한 후, PCR 분석에 사용할 수 있다. HPLC 기반 프로토콜을 통해서 잠재적으로 고순도의 엑소좀을 얻을 수는 있지만, 이러한 공정은 전용 장비가 필요하고 확장성을 갖기가 어렵다. 중요한 문제는 혈액 및 세포 배양 배지 모두 엑소좀과 동일한 크기 범위 내의 다수의 나노입자들 (일부는 비소포성)을 함유한다는 점이다. 예를 들어, 일부 miRNA들은 엑소좀보다는 세포외 단백질 복합체 내에 함유될 수 있으나; 프로테아제 (예컨대, 프로테이나아제 K)로 처리하여 "엑소좀외" 단백질로 인해서 가능한 임의의 오염을 제거할 수 있다.
[0048] 또 다른 실시양태에서, 암세포 유래의 엑소좀은, 엑소좀을 위한 샘플을 농축하는데 통상적으로 사용되는 기법들, 예컨대 면역특이적 상호작용 (예컨대, 면역자성 포획)을 수반하는 기법들에 의해 포획할 수 있다. 면역자성 세포 분리로도 알려진 면역자성 포획은, 통상적으로 특정 세포 유형에서 발견되는 단백질에 대해 유도된 항체를 작은 상자성 비드에 부착시키는 단계를 수반한다. 항체 코팅된 비드들을 혈액과 같은 샘플과 혼합하는 경우, 이들은 특정 세포에 부착하여 이를 둘러싸게 된다. 다음으로, 상기 샘플을 강한 자기장에 위치시켜 상기 비드들이 한쪽으로 펠릿화되도록 한다. 상기 혈액을 제거한 후, 포획된 세포들을 비드로 유지시킨다. 이러한 일반적인 방법에 대한 많은 변형법들은 당업계에 널리 알려져 있으며 엑소좀을 분리하는데 사용하기에 적합하다. 한 예에서, 상기 엑소좀은 자성 비드 (예컨대, 알데하이드/설페이트 비드)에 부착시킨 후, 항체를 상기 혼합물에 첨가하여, 상기 비드들에 부착되어 있는 엑소좀들의 표면 상의 에피토프를 인식시킬 수 있다. 암세포 유래의 엑소좀에서 발견되는 것으로 알려진 대표적인 단백질로는 ATP 결합 카세트 서브 패밀리 A 구성원 6 (ABCA6), 테트라스파닌-4 (TSPAN4), SLIT 및 NTRK 유사 단백질 4 (SLITRK4), 추정상의 프로토카데린 베타-18 (PCDHB18), 골수종 세포 표면 항원 CD33 (CD33) 및 글리피칸-1 (GPC1)을 포함한다. 암세포 유래의 엑소좀은, 예를 들어 이러한 하나 이상의 단백질들에 대한 항체 또는 앱타머를 사용하여 분리될 수 있다.
[0049] 본원에 사용된 분석이란 엑소좀의 직접 또는 간접적인 가시화를 가능케하는 생체내 또는 생체외로 행할 수 있는 임의의 방법을 포함한다. 예를 들어, 분석은, 이에 제한되지는 않지만, 고체 기질에 결합된 엑소좀의 생체외 현미경 또는 세포분석 검출 및 가시화, 유세포분석, 형광 영상촬영 등을 포함할 수 있다. 예시적인 양태에서, 암세포 유래의 엑소좀은 ATP 결합 카세트 서브 패밀리 A 구성원 6 (ABCA6), 테트라스파닌-4 (TSPAN4), SLIT 및 NTRK 유사 단백질 4 (SLITRK4), 추정상의 프로토카데린 베타-18 (PCDHB18), 골수종 세포 표면 항원 CD33 (CD33), 글리피칸-1 (GPC1), 히스톤 H2A 2-A형 (HIST1H2AA), 히스톤 H2A 1-A형 (HIST1H1AA), 히스톤 H3.3 (H3F3A), 히스톤 H3.1 (HIST1H3A), 징크 핑거 단백질 37 상동체 (ZFP37), 라미닌 서브유닛 베타-1 (LAMB1), 세뇨관간질성 신염 항원 유사형 1 (TINAGL1), 퍼옥시레독신 -4 (PRDX4), 콜라겐 알파-2(IV) 사슬 (COL4A2), 추정상의 단백질 C3P1 (C3P1), 헤미센틴-1 (HMCN1), 추정상의 로필린-2 유사 단백질 (RHPN2P1), 안키린 반복 도메인 함유 단백질 62 (ANKRD62), 3분자 모티프 함유 단백질 42 (TRIM42), 결합 플라코글로빈 (JUP), 튜불린 베타-2B 사슬 (TUBB2B), 엔도리보뉴클레아제 다이서 (DICER1), E3 유비퀴틴-단백질 리가제 TRIM71 (TRIM71), 카타닌 p60 ATPase 함유 서브유닛 A 유사형 2 (KATNAL2), 단백질 S100-A6 (S100A6), 5'-뉴클레오티다제 도메인 함유 단백질 3 (NT5DC3), 발린-tRNA 리가제 (VARS), 카즈린 (KAZN), ELAV 유사 단백질 4 (ELAVL4 ), RING 핑거 단백질 166 (RNF166), FERM 및 PDZ 도메인 함유 단백질 1 (FRMPD1), 78 kDa 글루코스 조절된 단백질 (HSPA5), 수송(Trafficking) 단백질 입자 복합체 서브유닛 6A (TRAPPC6A), 스쿠알렌 모노옥시게나제 (SQLE), 종양 감수성 유전자 101 단백질 (TSG101), 액포 단백질 선별 28 상동체 (VPS28), 프로스타글란딘 F2 수용체 음성 조절제 (PTGFRN), 이소부티릴-CoA 탈수소효소, 미토콘드리아 (ACAD8), 26S 프로테아제 조절 서브유닛 6B (PSMC4), 신장 인자 1-감마 (EEF1G), 티틴 (TTN), 티로신-단백질 포스파타제 13형 (PTPN13), 트리오스포스페이트 아이소머라제 (TPI1) 또는 카르복시펩티다제 E (CPE) 중 하나 이상에 대해 유도된 항체들을 사용하여 검출한 후 고체 기질에 결합시키고/시키거나 현미경 또는 세포분석 검출을 사용하여 가시화한다.
[0050] 세포에서 발현되는 단백질들이 모두 해당 세포에 의해 분비되는 엑소좀에서 발견되는 것은 아니라는 점에 유의할 필요가 있다. 예를 들어, 칼넥신, GM130 및 LAMP-2는 모두 MCF-7 세포에서 발현되지만 MCF-7 세포에 의해 분비되는 엑소좀에서는 발견되지 않는 단백질이다 (Baietti et al., 2012). 또 다른 예로서, 한 연구는 190/190 췌장관 선암종 환자들이 건강한 대조군에 비해 높은 수준의 GPC1+ 엑소좀을 보유하고 있음을 발견하였다 (Melo et al., 2015, 본 문헌은 전문이 본원에 참조로 포함됨). 그 중에서도, 평균적으로, 건강한 대조군의 2.3%만이 GPC1+ 엑소좀을 보유하였다.
1. 세포 배양물로부터 엑소좀을 수집하기 위한 예시적인 프로토콜
[0051] 1일째에, 10% FBS를 함유하는 배지 중 T225 플라스크에 충분한 세포 (예컨대, 약 5백만 개의 세포)를 분주하여 다음날 상기 세포들이 약 70% 전면생장될 수 있도록 한다. 2일째에, 상기 세포들에서 배지를 흡인하고, PBS로 상기 세포들을 2회 세척한 후, 25-30 mL의 기본 배지 (즉, PenStrep이나 FBS가 없음)를 상기 세포들에 첨가한다. 상기 세포들을 24-48시간 동안 항온배양한다. 48시간의 항온배양이 바람직하지만, 일부 세포주는 무혈청 배지에 더 민감하기 때문에 상기 항온배양 시간을 24시간으로 감소시켜야 한다. FBS에는 NanoSight 결과를 심히 왜곡시키는 엑소좀들이 함유되어 있음에 유의한다.
[0052] 3/4일째에, 상기 배지를 수집하여 실온에서 800xg로 5분간 원심분리하여 사멸한 세포와 큰 잔해물을 펠릿화시킨다. 상청액을 새 원추형 튜브로 옮겨 상기 배지를 2000xg로 10분간 재차 원심분리하여 다른 큰 잔해물과 큰 소포들을 제거한다. 상기 배지를 0.2 μm 필터에 통과시킨 후, 초원심분리 튜브들 (예컨대, 25 x 89 mm의 Beckman Ultra-Clear)에 튜브당 35 mL로 분취한다. 튜브당 배지의 부피가 35 mL 미만인 경우에는, 35 mL가 되도록 해당 튜브의 잔여부에 PBS를 채운다. SW 32 Ti 로터 (k-계수 266.7, RCF 최대 133,907)를 사용하여 4℃에서 28,000 rpm으로 2-4시간 동안 상기 배지를 초원심분리한다. 약 1인치의 액체가 남을 때까지 상기 상청액을 조심스럽게 흡인한다. 상기 튜브를 기울여 남아있는 배지가 천천히 흡인기 피펫에 유입되도록 한다. 필요하다면, 상기 엑소좀 펠릿을 PBS에 재현탁시키고, 상기 28,000 rpm에서의 초원심분리를 1-2시간 동안 반복하여 상기 엑소좀 대상군을 추가로 정제할 수도 있다.
[0053] 마지막으로, 상기 엑소좀 펠릿을 210 μL의 PBS에 재현탁시킨다. 각 시료에 대해서 다수의 원심분리 튜브가 있는 경우, 동일한 210 μL의 PBS를 사용하여 각 엑소좀 펠릿을 연속적으로 재현탁시킨다. 각 시료에 대해, 10 μL를 취하여 990 μL의 H2O를 첨가해 나노입자 추적 분석에 사용한다. 남아있는 200 μL의 엑소좀 함유 현탁액은 이후의 다운스트림 공정에서 사용하거나 또는 이를 -80℃로 즉시 보관한다.
2. 혈청 샘플에서 엑소좀을 추출하기 위한 예시적인 프로토콜
[0054] 먼저, 혈청 샘플을 얼음에서 해동시킨다. 다음으로, 11 mL의 PBS 중에 250 μL의 무세포 혈청 샘플을 희석하고; 0.2 μm 공극 필터를 통해 여과한다. 상기 희석된 샘플을 4℃에서 150,000xg로 밤새 초원심분리한다. 그 다음날, 상청액을 조심스럽게 버린 후 상기 엑소좀 펠릿들을 11 mL의 PBS 중에서 세척한다. 4℃에서 150,000xg로 2시간 동안 제2차 초원심분리를 수행한다. 마지막으로, 상청액을 조심스럽게 버린 후 분석을 위해 상기 엑소좀 펠릿들을 100 μL의 PBS 중에 재현탁시킨다.
C. 엑소좀 및 리포좀의 전기천공을 위한 예시적인 프로토콜
[0055] 400 μL의 전기천공 버퍼 (1.15 mM의 인산칼륨, pH 7.2, 25 mM의 염화칼륨, 21%의 Optiprep) 중에서 1×108개의 엑소좀 (NanoSight 분석으로 측정함) 또는 100 nm의 리포좀 [예컨대, 인캡슐라 나노 사이언시즈(Encapsula Nano Sciences)에서 구입]과 1 ㎍의 siRNA (퀴아젠) 또는 shRNA를 혼합한다. 4 mm의 큐벳을 사용하여 상기 엑소좀 또는 리포좀을 전기천공한다 (예컨대, 문헌 [Alvarez-Erviti et al., 2011]; [El-Andaloussi et al., 2012] 참조). 전기천공후, 상기 엑소좀 또는 리포좀을 프로테아제 무함유 RNAse로 처리한 후 10배로 농축된 RNase 억제제를 첨가한다. 마지막으로, 상기 기술된 바와 같이, 초원심분리 방법 하에 상기 엑소좀 또는 리포좀을 PBS로 세척한다.
II. 질병의 치료
[0056] 본 발명의 특정 양태는, 암세포에서 돌연변이 종양 억제자의 종양에 의한 기능 획득 활성을 불활성화시키거나 또는 암세포에서 돌연변이 종양 억제자의 우성적 음성 활성을 불활성화시키는 치료제를 발현하거나 포함하는 엑소좀으로 환자를 치료함으로써, 종양 억제자의 야생형 대립유전자가 기능할 수 있도록 만들어주는 것에 관한 것이다. 본원에 사용된 "치료제"란 암 또는 다른 질환들의 치료에 유용한 원자, 분자 또는 화합물이다. 치료제의 예로는, 이에 제한되지는 않지만, 약물, 화학요법제, 치료용 항체 및 항체 단편, 독소, 방사성 동위원소, 효소, 뉴클레아제, 호르몬, 면역조절제, 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 유전자 편집 시스템, 킬레이트제, 붕소 화합물, 광활성제, 및 염료를 포함한다.
[0057] 엑소좀은 DICER 및 활성 RNA 처리용 RISC 복합체 (PCT 공보 WO 2014/152622호 참조, 전문이 본원에 참고로 포함됨)를 포함하는 것으로 알려져 있는 바, 엑소좀 내로 형질감염된 shRNA는 엑소좀 자체 내에서 RISC-복합체 결합된 siRNA로 성숙할 수 있다. 다르게는, 성숙한 siRNA 자체가 엑소좀 또는 리포좀으로 형질감염될 수도 있다. 따라서, 예로서, 억제성 RNA를 본 발명의 방법에 사용하여 종양 억제자 [예컨대, ACVR1B, APC, ARID1B, ARID2, ASXL1, ATM, ATRX, AXIN1, B2M, BAP1, BCOR, BLU (Beta*), BRCA1, BRCA2, CACNA2D2 (Gene 26), CASP8, C-CAM, CDKN1A (p21), CDKN1B (p27), CDKN1C (p57), CDKN2A (p16), CDKN2D (p19), CEBPA, CFTR, CIC, CHK2, CREBBP, CTS-1, CYB561D2, CYLD, DAXX, DCC, DPC4, EP300, FAM123B, FCC, FUBP1, FUS1, GATA1, GATA3, HIN-1, HNF1A, HYAL1 (Luca-10), HYAL2 (Luca-2), KDM5C, KDM6A, KRAS, KRAS2b, MADR2/JV18, MAP3K1, MCC, MEN1, MEN2, MLH1, MLL2, MLL3, MMAC1, MSH2, MSH6, MTS1, NCOR1, NF1, NF2, NOTCH1, NOTCH2, NPM1, NPRL2 (Gene 21), PAX5, PBRM1, PHF6, PIK3R1, PL6, PLAGL1, PRDM1, PTCH1, PTEN, RASSF1 (123F2), RB1, RNF43, RUNX1, SCGB1A1, SEMA3A, SETD2, Skp2, SMAD2, SMAD4, SMARCA4, SMARCB1, SOCS1, SOX9, STAG2, STK11, TET2, TNPAIP3, TP53, TP73, TRAF7, TSC1, VHL, WRN, WT1 또는 WWOX]의 우성적 음성 돌연변이 또는 종양에 의한 기능 획득성 돌연변이 (예컨대, TP53R273H; TP53R175H; KRASG12D)의 발현을 조절하거나 약화시킬 수 있다. 경우에 따라서, sh/siRNA는 그에 상응하는 야생형 형태의 발현에는 영향을 미치지 않으면서 암세포에서 발현된 유전자의 돌연변이 형태를 특이적으로 표적화하도록 설계될 수도 있다. 실제로, 어떤 임의의 억제성 핵산이 어떤 출처로부터 관심 단백질에 대한 유효성이 검증된 하향 조절자인 것으로 밝혀진 바 있다고 한다면, 이러한 억제성 핵산은 본 발명의 조성물 및 방법에 적용될 수 있다.
[0058] RNAi를 설계함에 있어서는, siRNA의 성질, 사일런싱 효과의 내구성 및 전달 시스템의 선택과 같이 몇 가지 고려해야 될 요인들이 있다. RNAi 효과를 만들어 내기 위해서, 해당 유기체에 도입되는 siRNA는 통상적으로 엑손 서열을 포함하게 될 것이다. 또한, RNAi 과정은 상동성에 의존하므로, 유전자 특이적 서열들 간이 아닌 상동성 서열들 간의 교차 간섭의 가능성을 최소화하면서도 유전자 특이성을 극대화하기 위해서는 서열들을 신중하게 선택해야 한다. 바람직하게는, 상기 siRNA는 siRNA의 서열과 억제될 유전자 간에 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 심지어 100% 이상의 동일성을 나타낸다. 표적 유전자와의 동일성이 약 80% 미만인 서열들은 실질적으로 효과가 덜하다. 따라서, siRNA와 억제할 유전자 간의 상동성이 클수록, 무관한 유전자들의 발현이 영향을 덜 받게될 것이다.
[0059] 엑소좀은 mRNA 전사 및 단백질 해독을 완료하는데 필요한 기구를 포함하는 것으로 알려진 바 있으므로 (PCT/US2014/068630호, 전문이 본원에 참조로 포함됨), 치료용 항체와 같은 치료용 단백질을 암호화하는 mRNA 또는 DNA 핵산은 엑소좀 내로 형질감염될 수 있다. 다르게는, 치료용 단백질 자체는 엑소좀 내로 전기천공되거나 리포좀 내로 직접 혼입될 수도 있다. 대표적인 치료용 단백질로는, 이에 제한되지는 않지만, 종양 억제자 단백질, 펩타이드, 돌연변이 단백질의 야생형 단백질 대응물, DNA 복구 단백질, 단백질가수분해 효소, 단백질성 독소, 세포내 단백질의 활성을 억제할 수 있는 단백질, 세포내 단백질의 활성을 활성화시킬 수 있는 단백질, 또는 기능 상실이 재구성되야할 필요가 있는 모든 단백질들을 포함한다.
[0060] 질환이 생긴 세포의 세포내 공간에 도입하는 것이 바람직할 수 있는 구체적 유형의 한 단백질은 세포내 항원에 특이적 또는 선택적으로 결합할 수 있는 항체 (예컨대, 단일클론 항체)이다. 이러한 항체는 세포내 단백질의 기능을 방해하고/하거나 세포내 단백질-단백질 상호작용을 방해할 수 있다. 이러한 단일클론 항체의 예시적인 표적으로는, 이에 제한되지는 않지만, 종양 억제자의 종양에 의한 기능 획득성 돌연변이를 포함한다. 단일클론 항체에 이외에도, 이의 항원 결합 단편, 예컨대 scFv, Fab 단편, Fab', F(ab')2, Fv, 펩티바디, 이원항체, 삼원항체 또는 미니항체도 고려된다. 이러한 임의의 항체 또는 항체 단편은 글리코실화 또는 비글리코실화될 수 있다.
[0061] 엑소좀은 암세포에서 종양 억제자의 종양에 의한 기능 획득성 돌연변이 또는 우성적 음성 돌연변이를 교정하는 유전자 편집 시스템, 예컨대 CRISPR/Cas 시스템을 포함하도록 조작될 수도 있다. 일반적으로, "CRISPR 시스템"이란 Cas 유전자를 암호화하는 서열, tracr (전사활성화 CRISPR) 서열 (예컨대, tracrRNA 또는 부분 활성 tracrRNA), tracr-메이트(mate) 서열 (내인성 CRISPR 시스템과 관련하여 "직접 반복" 및 tracrRNA로 처리된 부분 직접 반복을 망라함), 가이드 서열 (내인성 CRISPR 시스템과 관련하여 "스페이서"로도 지칭함) 및/또는 CRISPR 유전자좌의 다른 서열 및 전사체를 포함하는, CRISPR 관련 ("Cas") 유전자의 발현 또는 이의 활성을 유도하는데 관여하는 전사체 및 다른 구성요소들을 총괄적으로 가리킨다. 일부 양태에서, Cas 뉴클레아제 및 gRNA (표적 서열에 특이적인 crRNA 및 고정된 tracrRNA의 융합물을 포함)를 세포 내로 도입한다. 일반적으로, gRNA의 5' 말단의 표적 부위들은 상보적 염기쌍을 사용하여 상기 Cas 뉴클레아제를 상기 표적 부위, 예컨대 상기 유전자로 표적화한다. 상기 표적 부위는 일반적으로 NGG 또는 NAG와 같은 프로토스페이서 인접 모티프 (PAM) 서열의 5'에 가까운 위치에 기초하여 선택될 수 있다. 이와 관련하여, 상기 gRNA는 해당 가이드 RNA의 처음 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 14, 12, 11개 또는 10개의 뉴클레오타이드를 상기 표적 DNA 서열에 상응하도록 변형시킴으로써 원하는 서열에 표적화시킨다. 일반적으로, CRISPR 시스템은 표적 서열 부위에서 CRISPR 복합체의 형성을 촉진하는 구성요소들을 특징으로 한다. 일반적으로, "표적 서열"은 일반적으로 가이드 서열이 상보성을 보유하도록 설계된 서열을 가리키는데, 여기서 상기 표적 서열과 가이드 서열 간의 하이브리드화가 CRISPR 복합체의 형성을 촉진한다. 하이브리드화를 유도하여 CRISPR 복합체의 형성을 촉진하기에 충분한 상보성이 존재하는 한, 완전한 상보성이 반드시 요구되는 것은 아니다. 이러한 시스템을 포함하도록 조작된 엑소좀에서의 CRISPR 시스템은 표적 세포 내부의 유전체 DNA를 편집하는 기능을 할 수 있거나, 또는 해당 시스템은 엑소좀 자체 내부의 DNA를 편집할 수 있다. 유전자 편집 시스템의 전달 수단으로서 엑소좀의 사용과 관련된 추가의 양태들에 관해서는 미국 출원 62/599,340호 (전문이 본원에 참고로 포함됨)를 참조한다.
[0062] 단백질 및 핵산계 치료제 이외에도, 엑소좀은 단독으로 또는 임의의 단백질 또는 핵산계 치료제와 병용하여 저분자 의약물을 전달하는데 사용될 수 있다. 본 실시양태들에서 사용하기 위해 고려되는 대표적인 저분자 의약물로는, 이에 제한되지는 않지만, 독소, 화학요법제, 및 종양 억제자의 종양에 의한 기능 획득성 돌연변이의 활성을 억제하는 제제를 포함한다.
[0063] 일부 양태에서, 엑소좀은 혈청 인자에 대하여 주화성을 겪도록 할 수도 있다. 그 결과, 엑소좀을 종양으로 유인하는 성장 인자 구배를 제공함으로써 엑소좀이 종양에 우선적으로 축적되도록 할 수 있다. 엑소좀 내부의 핵산으로부터 단백질 치료제의 발현을 수반하는 양태들에서, 전사 및/또는 해독은 엑소좀의 표면 상의 성장 인자 수용체, 예컨대 EGFR의 자극에 의해 향상될 수 있다. 종양 조직에 대한 전달을 표적으로 삼아 치료제를 전달하는 미니세포로서 엑소좀의 사용과 관련된 추가의 양태들에 관해서는 미국 출원 62/649,057호 (전문이 본원에 참고로 포함됨)를 참조한다.
[0064] 본원에 사용된 "대상체"라는 용어는 대상 방법들이 수행되는 임의의 개체 또는 환자를 가리킨다. 일반적으로 상기 대상체는 인간이지만, 당업자라면 누구나 이해할 수 있듯이, 상기 대상체는 동물일 수 있다. 따라서, 설치류 (마우스, 랫트, 햄스터 및 기니피그 포함), 고양이, 개, 토끼, 농장 동물 (소, 말, 염소, 양, 돼지 등을 포함) 및 영장류 (원숭이, 침팬지, 오랑우탄 및 고릴라 포함)와 같은 포유동물을 포함하는 기타 동물들도 본 대상체의 정의 내에 포함된다.
[0065] "치료" 및 "치료하는"이라는 말은, 질병 또는 건강 관련 상태에 대한 치료적 유용성을 얻을 목적으로, 치료제를 대상체에게 투여 또는 적용하거나, 또는 대상체에게 어떤 절차 또는 작용 기작을 수행하는 것을 지칭한다. 예를 들어, 치료는 탑재물을 수반하는 엑소좀의 투여, 화학요법, 면역요법 또는 방사선요법, 수술의 시행 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
[0066] 본 출원 전반에 걸쳐 사용된 "치료적 유용성" 또는 "치료적으로 효과적인"이라는 용어는, 상기 병태의 의학적 치료와 관련하여 대상체의 건강을 증진시키거나 향상시키는 것을 의미한다. 여기에는 질병의 징후 또는 증상의 빈도 또는 중증도의 감소가 포함되지만 이에 국한되지는 않는다. 예를 들어, 암의 치료는 예를 들어 종양의 침습성 감소, 암의 증식 속도 감소, 또는 전이의 방지를 포함할 수 있다. 암의 치료는 암에 걸린 대상체의 생존을 연장하는 것을 지칭할 수도 있다.
[0067] 본원에 사용된 "암"이라는 용어는 고형 종양, 전이성 암 또는 비전이성 암을 기술하는데 사용될 수 있다. 특정 실시양태에서, 상기 암은 방광, 혈액, 뼈, 골수, 뇌, 유방, 결장, 식도, 십이지장, 소장, 대장, 결장, 직장, 항문, 잇몸, 머리, 신장, 간, 폐, 비인두, 목, 난소, 췌장, 전립선, 피부, 위, 고환, 혀 또는 자궁에서 발생할 수 있다.
[0068] 상기 암은, 구체적으로 하기의 조직학적 유형의 암일 수 있지만, 이들에 한정되는 것은 아니다: 악성 종양; 암종; 미분화 암종; 거대 세포 및 방추 세포 암종; 소세포 암종; 유두 암종; 편평상피 세포 암종; 림프상피 암종; 기저 세포 암종; 모기질 암종; 전이 세포 암종; 유두 전이 세포 암종; 선암종; 악성 가스트린종; 담관암; 간세포 암종; 간세포 암종과 담관암의 병합 암종; 소주 선암종; 선양 낭포 암종; 선종성 용종의 선암종; 선암종, 가족성 대장 용종증; 고형 암종; 악성 카르시노이드 종양; 세기관지-폐포 선암종; 유두 선암종; 혐색소성 암종; 호산성(acidophil) 암종; 호산성(oxyphilic) 선암종; 호염기성 암종; 투명 세포 선암종; 과립 세포 암종; 여포성 선암종; 유두 및 여포성 선암종; 비피막형 경화성 암종; 부신 피질 암종; 자궁내막 암종; 피부 부속기 암종; 아포크린 선암종; 피지 선암종; 이도 선암종; 점막 표피양 암종; 낭포선암종; 유두 낭포선암종; 장액성 유두 낭포선암종; 점액성 낭포선암종; 점액성 선암종; 인환 세포 암종; 침윤성 도관 암종; 수질 암종; 소엽성 암종; 염증성 암종; 유방의 페제트병; 선포 세포 암종; 선편평상피 암종; 편평상피 화생이 있는 선암종; 악성 흉선종; 악성 난소 간질성 종양; 악성 난포막종; 악성 과립막 세포 종양; 악성 남성모세포종; 세르톨리 세포 암종; 악성 라이디히(leydig) 세포 종양; 악성 지질 세포 종양; 악성 곁신경절종; 악성 유방외 곁신경절종; 갈색세포종; 사구혈관육종; 악성 흑색종; 무색소성 흑색종; 표재 확산성 흑색종; 거대 색소 모반의 악성 흑색종; 상피모양 세포 흑색종; 악성 청색 모반; 육종; 섬유육종; 악성 섬유성 조직구종; 점액육종; 지방육종; 평활근육종; 횡문근육종; 배아 횡문근육종; 폐포 횡문근육종; 간질성 육종; 악성 혼합종; 뮬러리안 혼합종; 신장모세포종; 간모세포종; 암육종; 악성 중간엽세포종; 악성 브렌너 종양; 악성 엽상 종양; 활막 육종; 악성 중피종; 미분화배세포종; 배아 암종; 악성 기형종; 악성 난소갑상선종; 융모막암종; 악성 중신종; 혈관육종; 악성 혈관내피종; 카포시 육종; 악성 혈관 주위 세포종; 림프관 육종; 골육종; 방피질성 골육종; 연골육종; 악성 연골 모세포종; 중간엽 연골육종; 뼈의 거대 세포 종양; 유윙 육종; 악성 치원성 종양; 법랑질모세포성 치아육종; 악성 법랑질모세포종; 법랑질모세포성 섬유육종; 악성 송과체종; 척색종; 악성 신경교종; 뇌실 상의 세포종; 성상세포종; 원형질 성상세포종; 원섬유성 성상모세포종; 교모세포종; 성긴돌기 아교세포종(oligodendroglioma); 성긴돌기 아교모세포종(oligodendroblastoma); 원시 신경 외배엽 종양; 소뇌 육종; 신경절 모세포종; 신경모세포종; 망막모세포종; 후각 신경성 종양; 악성 수막종; 신경섬유육종; 악성 신경초종; 악성 과립상 세포 종양; 악성 림프종; 호지킨병; 부육아종(paragranuloma); 소형 림프구성 악성 림프종; 확산성 거대 세포 악성 림프종; 여포성 악성 림프종; 균상식육종; 기타 명시된 비호지킨 림프종; 악성 조직구증; 다발성 골수종; 비만 세포 육종; 면역증식성 소장 질환; 백혈병; 림프성 백혈병; 혈장 세포 백혈병; 적백혈병; 림프육종 세포 백혈병; 골수성 백혈병; 호염기구성 백혈병; 호산구성 백혈병; 단핵구성 백혈병; 비만 세포 백혈병; 거핵모구성 백혈병; 골수성 육종; 및 모발 세포 백혈병.
[0069] 세포에 대하여 사용되는 "접촉된" 및 "노출된"이라는 용어들은 치료제가 표적 세포로 전달되거나 표적 세포와 직접적으로 병치되는 과정을 설명하기 위해 본원에 사용된다. 세포를 사멸시키기 위해, 예를 들어, 해당 세포를 사멸시키거나 해당 세포가 분열하는 것을 방지하는데 효과적인 양으로 하나 이상의 제제를 세포에 전달한다.
[0070] 치료에 대한 환자의 유효 반응 또는 환자의 "반응성"이란 질병 또는 장애에 걸릴 위험이 있거나 해당 질병 또는 장애를 앓고 있는 환자에게 부여되는 임상적 또는 치료적 이점을 가리킨다. 이러한 이점으로는 세포 또는 생체 반응, 완전 반응, 부분 반응, (진행 또는 재발없이) 안정된 질병, 또는 차후 재발하는 반응을 포함할 수 있다. 예를 들어, 유효 반응이란 암으로 진단받은 환자에서 종양 크기 감소 또는 무진행 생존일 수 있다. 치료 결과는 예측하여 모니터링할 수 있고/있거나 이러한 치료로부터 혜택을 받는 환자들은 본원에 기술된 방법을 통해 확인 또는 선택될 수 있다.
[0071] 종양 질환의 치료와 관련하여, 종양 질환의 단계에 따라, 종양 질환의 치료는 종양 조직을 제거하기 위한 수술, 방사선 요법 및 화학요법 중 하나 또는 이들의 조합을 수반한다. 다른 치료 요법들은 항암제, 예컨대 치료 조성물 및 화학요법제의 투여와 조합할 수 있다. 예를 들어, 이러한 항암제로 치료를 받을 환자는 방사선 요법을 받을 수 있고/있거나 수술을 받을 수도 있다.
[0072] 질환의 치료를 위해, 치료 조성물의 적절한 용량은, 상기 규정한 바와 같이 치료될 질환의 종류, 해당 질환의 중증도 및 경과, 해당 환자의 임상 병력 및 제제에 대한 반응, 및 주치의의 판단에 따라 좌우될 것이다. 제제는 한번에 투여되거나, 또는 일련의 치료 과정 동안에 걸쳐서 환자에게 적절하게 투여된다.
[0073] 치료 및 예방 방법 및 조성물은 목적하는 효과를 달성하기에 효과적인 총량으로 제공될 수 있다. 조직, 종양 또는 세포는 하나 이상의 제제를 포함하는 하나 이상의 조성물 또는 약리학적 제형(들)과 접촉되거나, 또는 조직, 종양 및/또는 세포를 2종 이상의 서로 다른 조성물 또는 제형들과 접촉될 수 있다. 또한, 이러한 병용 요법은 화학요법, 방사선 요법, 수술적 치료 또는 면역요법과 함께 사용될 수 있다.
[0074] 병용 투여는 동일한 제형의 2종 이상의 제제의 동시적 투여, 별도의 제형의 동시적 투여 및 개별적 투여를 포함할 수 있다. 즉, 본 발명의 치료 조성물 및 다른 치료제는 동일한 제형으로 함께 제제화하여 동시에 투여할 수 있다. 다르게는, 본 발명의 치료 조성물 및 다른 치료제는 동시에 투여될 수 있으며, 이 경우 두 제제는 모두 별도의 제형으로 존재한다. 또 다른 대안으로, 상기 치료제는 다른 치료제를 투여한 직후에 투여하거나, 또는 그 반대로 투여할 수도 있다. 별도의 투여 프로토콜에서, 본 발명의 치료 조성물과 다른 치료제는 몇 분의 간격을 두어, 몇 시간 간격을 두어, 또는 며칠 간격을 두어 투여될 수 있다.
[0075] 제1 항암 치료 (예컨대, 치료제를 포함하는 엑소좀)는 제2 항암 치료 전에, 그 동안, 그 후에 투여될 수 있거나, 또는 제2 항암 치료와의 다양한 조합으로 투여될 수도 있다. 상기 투여는 동시적 내지 수분 내지 수일 내지 수주까지의 범위 간격으로 이루어질 수 있다. 상기 제1 치료가 제2 치료와는 별도로 환자에 제공되는 실시양태에서, 투여자는 일반적으로 각 전달 시간 사이에 상당한 시간이 경과되지 않도록 함으로써, 상기 두 화합물이 환자에게 유리한 병용 효과를 계속 발휘할 수 있도록 할 것이다. 이러한 경우에, 서로 약 12시간 내지 24시간 또는 72시간 이내에, 보다 구체적으로는 서로 약 6시간 내지 12시간 이내에 환자에게 제1 치료 및 제2 치료를 제공할 수 있을 것이다. 일부 상황에서는, 각 투여 사이에 수일 (2, 3, 4, 5, 6 또는 7일) 내지 수주 (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8주)의 경과로 치료 기간을 상당 기간 연장하는 것이 바람직할 수도 있다.
[0076] 특정 실시양태에서, 치료 과정은 1-90일 또는 그 이상 (이러한 범위는 중간 조정일을 포함) 지속될 것이다. 한 제제를 1일 내지 90일 중 어느 날 (이러한 범위는 중간 조정일을 포함) 또는 이들을 임의로 조합한 날에 투여할 수 있고, 또 다른 제제를 1일 내지 90일 중 어느 날 (이러한 범위는 중간 조정일을 포함) 또는 이들을 임의로 조합한 날에 투여할 수 있다. 하루 (24시간) 안에, 환자에게 해당 제제(들)을 1회 또는 다회 투여할 수 있다. 또한, 치료 과정 후에, 항암 치료가 실시되지 않는 기간을 두는 것도 고려된다. 이 기간은 환자의 예후, 기운, 건강 등과 같은 환자의 상태에 따라 1-7일 및/또는 1-5주 및/또는 1-12개월 또는 그 이상 (이러한 범위에는 중간 조정일을 포함)이 지속될 수 있다. 치료 주기는 필요에 따라 반복될 것으로 예상된다.
[0077] 다양한 조합들을 사용할 수 있다. 아래 예의 경우, 제1 항암 요법은 "A"이고, 제2 항암 요법은 "B"이다:
A/B/A B/A/B B/B/A A/A/B A/B/B B/A/A A/B/B/B B/A/B/B
B/B/B/A B/B/A/B A/A/B/B A/B/A/B A/B/B/A B/B/A/A
B/A/B/A B/A/A/B A/A/A/B B/A/A/A A/B/A/A A/A/B/A
[0078] 환자에 대한 본 발명의 임의의 화합물 또는 요법의 투여 또는 실시는, 제제들의 독성이 존재하는 경우라면 그의 독성을 고려하여, 상기 화합물의 투여에 대한 일반적인 프로토콜을 따르게 될 것이다. 따라서, 일부 실시양태에서는 병용 요법에 기인하는 독성을 모니터링하는 단계를 둔다.
1. 화학요법
[0079] 본 발명에 따르면, 다양한 화학요법제들을 사용할 수 있다. "화학요법"이라는 용어는 암을 치료하기 위해 약물을 사용하는 것을 가리킨다. "화학요법제"는 암 치료시 투여되는 화합물 또는 조성물을 의미하는 것으로 사용된다. 이러한 제제 또는 약물은 세포 내에서의 이들의 활동 방식, 예를 들어 이들이 세포 주기에 영향을 미치는지의 여부 및 어느 단계에서 영향을 미치는지에 따라 분류된다. 다르게는, 제제는 DNA를 직접 가교결합하거나, DNA에 삽입되거나, 또는 핵산 합성에 영향을 주어 염색체 및 유사분열 변이를 유도하는 그의 능력을 기반으로 특성화시킬 수 있다.
[0080] 화학요법제의 예로는 알킬화제, 예컨대 티오테파 및 사이클로포스파미드; 알킬 술포네이트, 예컨대 부술판, 임프로술판 및 피포술판; 아지리딘, 예컨대 벤조도파, 카보쿠온, 메투레도파 및 우레도파; 알트레타민, 트리에틸렌멜라민, 트리에틸렌포스포아미드, 트리에틸렌티오포스포아미드 및 트리메틸올로멜라민을 포함하는 에틸렌이민 및 메틸아멜라민; 아세토게닌 (특히 불라타신 및 불라타시논); 캄프토테신 (합성 유사체 토포테칸 포함); 브리오스타틴; 칼리스타틴; CC-1065 (이의 아도젤레신, 카젤레신 및 비젤레신 합성 유사체 포함); 크립토파이신 (특히, 크립토파이신 1 및 크립토파이신 8); 돌라스타틴; 두오카마이신 (합성 유사체 KW-2189 및 CB1-TM1 포함); 엘레우테로빈; 판크라티스타틴; 사르코딕틴; 스폰지스타틴; 질소 머스타드, 예컨대 클로람부실, 클로나파진, 클로포스파미드, 에스트라무스틴, 이포스파미드, 메클로레타민, 메클로레타민 옥사이드 하이드로클로라이드, 멜팔란, 노벰비친, 페네스테린, 프레드니무스틴, 트로포스파미드 및 우라실 머스타드; 니트로스우레아, 예컨대 카무스틴, 클로로조토신, 포테무스틴, 로무스틴, 니무스틴 및 라님누스틴; 항생제, 예컨대 에네딘 항생제 (예컨대, 칼리케아미신, 특히 칼리케아미신 감마lI 및 칼리케아미신 오메가II); 다이네미신 A를 포함하는 다이네미신; 비스포스포네이트, 예컨대 클로드로네이트; 에스페라미신; 뿐만 아니라, 네오카지노스타틴 발색단 및 관련 색소단백질인 에네딘 항생제 발색단, 아클라시노마이신, 악티노마이신, 아우트라니신, 아자세린, 블레오마이신, 칵티노마이신, 카라비신, 카미노마이신, 카지노필린, 크로모마이시니스, 닥티노마이신, 다우노루비신, 데토루비신, 6-디아조-5-옥소-L-노르류신, 독소루비신 (모르폴리노-독소루비신, 시아노모르폴리노-독소루비신, 2-피롤리노-독소루비신 및 데옥시독소루비신 포함), 에피루비신, 에소루비신, 이다루비신, 마셀로마이신, 미토마이신, 예컨대 미토마이신 C, 마이코페놀산, 노갈라나이신, 올리보마이신, 페플로마이신, 포트피로마이신, 푸로마이신, 쿠엘라마이신, 로도루비신, 스트렙토니그린, 스트렙토조신, 투베시딘, 우베니멕스, 지노스타틴 및 조루비신; 항대사물질, 예컨대 메토트렉세이트 및 5-플루오로우라실 (5-FU); 엽산 유사체, 예컨대 데노프테린, 프테로프테린 및 트리메트렉세이트; 퓨린 유사체, 예컨대 플루다라빈, 6-머캅토퓨린, 티아미프린 및 티오구아닌; 피리미딘 유사체, 예컨대 안시타빈, 아자시티딘, 6-아자우리딘, 카모푸르, 시타라빈, 디데옥시우리딘, 독시플루리딘, 에노시타빈 및 플록스우리딘; 안드로겐, 예컨대 칼루스테론, 드로나놀론 프로피오네이트, 에피티오스타놀, 메피티오스탄 및 테스토락톤; 항부신제, 예컨대 미토탄 및 트릴로스탄; 엽산 보충제, 예컨대 프롤린산; 아세글라톤; 알도포스파미드 글리코시드; 아미노레불린산; 에닐우라실; 암사크린; 베스트라부실; 비산트렌; 에다트락세이트; 데포파민; 데메콜신; 디아지쿠온; 엘포미틴; 엘립티늄 아세테이트; 에포틸론; 에토글루시드; 질산갈륨; 하이드록시우레아; 렌티난; 로니다이닌; 메이탄시노이드, 예컨대 메이탄신 및 안사미토신; 미토구아존; 미톡산트론; 모피단몰; 니트라에린; 펜토스타틴; 페나메트; 피라루비신; 로속산트론; 포도필린산; 2-에틸히드라지드; 프로카바진; PSK다당류 복합체; 라족산; 리족신; 시조피란; 스피로게마늄; 테누아존산; 트리아지쿠온; 2,2',2"-트리클로로트리에틸아민; 트리코테센 (특히, T-2 톡신, 베라쿠린 A, 로리딘 A 및 안구이딘); 우레탄; 빈데신; 다카바진; 만노무스틴; 미토브로니톨; 미톨락톨; 피포브로만; 가시토신; 아라비노시드 ("Ara-C"); 사이클로포스파미드; 탁소이드, 예를 들어, 파클리탁셀 및 도세탁셀 겜시타빈; 6-티오구아닌; 머캅토퓨린; 백금 배위 착물, 예컨대 시스플라틴, 옥살리플라틴 및 카보플라틴; 빈블라스틴; 백금; 에토포시드 (VP-16); 이포스파미드; 미톡산트론; 빈크리스틴; 비노렐빈; 노반트론; 테니포시드; 에다트렉세이트; 다우노마이신; 아미노프테린; 엑셀로다; 이반드로네이트; 이리노테칸 (예컨대, CPT-11); 토포아이소머라아제 억제제 RFS 2000; 디플루오로메틸오르니틴 (DFMO); 레티노이드, 예컨대 레티노산; 카페시타빈; 카보플라틴, 프로카바진, 플리코마이신, 겜시타비엔, 나벨빈, 파네실-단백질 트랜스퍼라아제 억제제, 트랜스백금, 및 전술한 것들 중 임의의 것의 약제학적으로 허용가능한 염, 산 또는 유도체를 포함한다.
2. 방사선요법
[0081] DNA 손상을 유발하는 광범위하게 사용되는 다른 요인으로는 일반적으로 γ-선, X-선 및/또는 종양 세포에 대한 방사성 동위원소의 유도형 전달로 통상적으로 공지된 것들을 포함한다. 마이크로파, 양성자 빔 조사 (미국 특허 5,760,395호 및 4,870,287호) 및 자외선 조사와 같은 다른 형태의 DNA 손상 요인들도 고려된다. 이러한 인자들은 모두 DNA, DNA 전구체, DNA 복제 및 수선, 염색체 조립 및 유지에 광범위하게 손상을 미칠 가능성이 크다. X-선의 조사량 범위는, 장기간 (3주 내지 4주) 동안에는 하루 조사량으로 50 내지 200 ?盧?겐에서부터 단회 조사량으로 2000 내지 6000 렌트겐까지의 범위이다. 방사성 동위원소의 조사 범위는 광범위하게 다를 수 있어서, 해당 동위원소의 반감기, 방출되는 방사선의 강도와 종류, 및 신생물 세포의 흡수율에 좌우된다.
3. 면역요법
[0082] 당업자라면 누구나 추가의 면역요법을 본 발명의 방법들과 조합하거나 그와 함께 사용할 수 있음을 이해할 것이다. 암치료와 관련하여, 면역요법은 일반적으로 암세포를 표적으로 삼아 파괴하는 면역 효과기 세포 및 분자의 사용에 의존한다. 리툭시맙 (RITUXAN®)이 이러한 예이다. 면역 효과기는, 예를 들어, 종양 세포의 표면상의 일부 마커에 특이적인 항체일 수 있다. 항체는 단독으로 요법의 효과기로서 기능을 할 수 있거나, 또는 세포 사멸에 실질적으로 영향을 미치는 다른 세포들을 동원할 수도 있다. 또한, 항체는 약물 또는 독소 (화학요법, 방사성 핵종, 리신 A 사슬, 콜레라 독소, 백일해 독소 등)에 접합되어 단지 표적화제로만 기능할 수도 있다. 다르게는, 효과기는 종양 세포 표적과 직간접적으로 상호작용하는 표면 분자를 운반하는 림프구일 수도 있다. 다양한 효과기 세포로는 세포독성 T 세포 및 NK 세포를 포함한다.
[0083] 면역요법의 한 양태에서, 종양 세포는 표적화가 용이한, 즉 대다수의 다른 세포 상에는 존재하지 않는 일부 마커를 보유하여야 한다. 다수의 종양 마커들이 존재하며, 이들 중 임의의 마커가 본 발명과 관련한 표적화에 적합할 수 있다. 일반적인 종양 마커로는 CD20, 암배아 항원, 티로시나제 (p97), gp68, TAG-72, HMFG, 시알릴 루이스 항원, MucA, MucB, PLAP, 라미닌 수용체, erb B 및 p155를 포함한다. 면역요법의 대안적인 양태는 항암 효과와 면역 자극 효과를 조합시키는 것이다. 사이토카인, 예컨대 IL-2, IL-4, IL-12, GM-CSF, γ-IFN, 케모카인, 예컨대 MIP-1, MCP-1, IL-8, 및 성장 인자, 예컨대 FLT3 리간드를 포함하는, 면역 자극 분자들도 존재한다.
[0084] 현재 연구 중이거나 사용 중인 면역요법의 예로는 면역 아주반트, 예를 들어, 마이코박테리움 보비스, 플라스모디움 팔시파룸, 디니트로클로로벤젠 및 방향족 화합물 (미국 특허 5,801,005호 및 5,739,169호; 문헌 [Hui and Hashimoto, 1998]; [Christodoulides et al., 1998]); 사이토카인 요법, 예를 들어, 인터페론 α, β 및 γ, IL-1, GM-CSF 및 TNF (문헌 [Bukowski et al., 1998]; [Davidson et al., 1998]; [Hellstrand et al., 1998]); 유전자 요법, 예를 들어, TNF, IL-1, IL-2 및 p53 (문헌 [Qin et al., 1998]; [Austin-Ward and Villaseca, 1998]; 미국 특허 5,830,880호 및 5,846,945호); 및 단일클론성 항체, 예를 들어, 항-CD20, 항-강글리오시드 GM2 및 항-p185 (문헌 [Hollander, 2012]; [Hanibuchi et al., 1998]; 미국 특허 5,824,311호)를 들 수 있다. 하나 이상의 항암 요법들을 본원에 기재된 항체 요법과 함께 사용할 수 있을 것으로 생각된다.
[0085] 일부 실시양태에서, 면역요법은 면역 체크포인트 억제제일 수 있다. 면역 체크포인트는 신호 (예컨대, 보조 자극 분자)를 증폭시키거나, 신호를 거절한다. 면역 체크포인트 차단에 의해 표적화될 수 있는 억제성 면역 체크포인트로는 아데노신 A2A 수용체 (A2AR), B7-H3 (CD276으로도 공지됨), B 및 T 림프구 감쇠기 (BTLA), 세포독성 T 림프구 연관 단백질 4 (CTLA-4, CD152로도 공지됨), 인돌레아민 2,3-디옥시게나아제 (IDO), 살해 세포 면역글로불린 (KIR), 림프구 활성화 유전자-3 (LAG3), 프로그래밍된 사멸 1 (PD-1), T 세포 면역글로불린 도메인 및 뮤신 도메인 3 (TIM-3) 및 T 세포 활성화에 대한 V-도메인 Ig 억제자 (VISTA)를 포함한다. 특히, 면역 체크포인트 억제제는 PD-1 축 및/또는 CTLA-4를 표적으로 한다.
[0086] 면역 체크포인트 억제제는 리간드 또는 수용체의 재조합체 형태인 소분자와 같은 약물일 수 있거나, 특히 항체, 예컨대 인간 항체이다 (예컨대, 국제 특허 공보 WO2015016718호; 문헌 [Pardoll, Nat Rev Cancer, 12(4): 252-64, 2012]; 상기 문헌 모두 본원에 참조로 포함됨). 면역 체크포인트 단백질 또는 이의 유사체의 공지된 억제제들이 사용될 수 있으며, 특히 키메라 형태, 인간화 형태, 인간 형태의 항체들이 사용될 수 있다. 당업자가 주지하는 바와 같이, 본 발명에 언급된 특정 항체에 대해서 대안적인 명칭 및/또는 그와 균등한 명칭들이 사용될 수도 있다. 이러한 대안적인 명칭 및/또는 그와 균등한 명칭들은 본 발명의 내용에서 서로 혼용가능하다. 예를 들어, 람브롤리주맙은 대안적인 명칭 및/또는 그와 균등한 명칭인 MK-3475와 펨브롤리주맙으로도 알려져 있다.
[0087] 일부 실시양태에서, PD-1 결합 길항제는 PD-1의 리간드 결합 파트너에 대한 결합을 억제하는 분자이다. 특정 양태에서, PD-1 리간드 결합 파트너는 PDL1 및/또는 PDL2이다. 또 다른 실시양태에서, PDL1 결합 길항제는 PD-1의 결합 파트너에 대한 결합을 억제하는 분자이다. 특정 양태에서, PDL1 결합 파트너는 PD-1 및/또는 B7-1이다. 또 다른 실시양태에서, PDL2 결합 길항제는 PDL2의 결합 파트너에 대한 결합을 억제하는 분자이다. 특정 양태에서, PDL2 결합 파트너는 PD-1이다. 길항제는 항체, 이의 항원 결합 단편, 면역접합소, 융합 단백질 또는 올리고펩타이드일 수 있다. 대표적인 항체들은 미국 특허 8,735,553호, 8,354,509호 및 8,008,449호에 기재되어 있으며, 상기 문헌들은 모두 본원에 참조로 포함된다. 본원에 제공되는 방법에 사용하기 위한 다른 PD-1 축 길항제들은, 예컨대 미국 특허 공보 20140294898호, 2014022021호 및 20110008369호에 기술된 바와 같이 당업계에 공지되어 있으며, 상기 문헌들은 모두 본 명세서에 참조로 포함된다.
[0088] 일부 실시양태에서, PD-1 결합 길항제는 항-PD-1 항체 (예컨대, 인간 항체, 인간화 형태의 항체 또는 키메라 형태의 항체)이다. 일부 실시양태에서, 항-PD-1 항체는 니볼루맙, 펨브롤리주맙 및 CT-011로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, PD-1 결합 길항제는 면역접합소 [예를 들어, 불변 영역 (예컨대, 면역글로불린 서열의 Fc 영역)에 융합된 PDL1 또는 PDL2의 세포외 또는 PD-1 결합 부분을 포함하는 면역접합소]이다. 일부 실시양태에서, PD-1 결합 길항제는 AMP-224이다. MDX-1106-04, MDX-1106, ONO-4538, BMS-936558 및 OPDIVO®로도 알려진 니볼루맙은 WO2006/121168호에 기재된 항-PD-1 항체이다. MK-3475, Merck 3475, 람브롤리주맙, KEYTRUDA® 및 SCH-900475로도 알려진 펨브롤리주맙은 WO2009/114335호에 기재된 항-PD-1 항체이다. hBAT 또는 hBAT-1로도 알려진 CT-011은 WO2009/101611호에 기재된 항-PD-1 항체이다. B7-DCIg로도 알려진 AMP-224는 WO2010/027827호 및 WO2011/066342호에 기재된 PDL2-Fc 융합 가용성 수용체이다.
[0089] 본원에 제공된 방법에서 표적으로 삼을 수 있는 또 다른 면역 체크포인트는 CD152로도 알려진 세포독성 T 림프구 연관 단백질 4 (CTLA-4)이다. 인간 CTLA-4의 완전한 cDNA 서열은 Genbank 수탁번호 L15006으로 등록되어 있다. CTLA-4는 T 세포의 표면에 존재하며, 항원 제시 세포의 표면 상의 CD80 또는 CD86과 결합하는 경우, "오프 (off)" 스위치로 작용한다. CTLA4는 헬퍼 T 세포의 표면 상에 발현되어 T 세포에 억제 신호를 전송하는 면역글로불린 상과 계열의 일원이다. CTLA4는 T 세포 보조 자극 단백질인 CD28과 유사하며, 양 분자 모두 각각 항원 제시 세포 상의 B7-1 및 B7-2로도 불리는 CD80 및 CD86에 결합한다. CTLA4는 T 세포에 억제 신호를 전송하는 한편, CD28은 자극 신호를 전송한다. 세포내 CTLA4는 조절 T 세포에서도 발견되며, 이들의 기능에 중요할 수 있다. T 세포 수용체 및 CD28을 통한 T 세포 활성화는 B7 분자의 억제 수용체인 CTLA-4의 발현을 증가시킨다.
[0090] 일부 실시양태에서, 면역 체크포인트 억제제는 항-CTLA-4 항체 (예컨대, 인간 항체, 인간 형태의 항체 또는 키메라 형태의 항체), 이의 항원 결합 단편, 면역접합소, 융합 단백질 또는 올리고펩타이드이다.
[0091] 본 방법에 사용하기에 적합한 항-인간-CTLA-4 항체 (또는 그로부터 유래한 VH 및/또는 VL 도메인)는 당업계에 익히 공지되어 있는 방법들을 사용하여 제조할 수 있다. 다르게는, 당업계에 알려져 있는 항-CTLA-4 항체가 사용될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 8,119,129호, WO 01/14424호, WO 98/42752호; WO 00/37504호 (CP675,206, 트레멜리무맙으로도 알려짐; 구명칭은 티실리무맙), 미국 특허 6,207,156호; 문헌 [Hurwitz et al. (1998) Proc Natl Acad Sci USA 95(17): 10067-10071]; [Camacho et al. (2004) J Clin Oncology 22(145): Abstract No. 2505 (항체 CP-675206)]; 및 [Mokyr et al. (1998) Cancer Res 58:5301-5304]에 개시된 항-CTLA-4 항체들을 본원에 개시된 방법에 사용할 수 있다. 전술한 공보들의 각 교시내용은 본원에 참조로 포함된다. CTLA-4와 결합하는 것으로 당업계에 알려져 있는 항체들 중 임의의 항체와 경쟁하는 항체들도 사용될 수 있다. 예를 들어, 인간 형태의 CTLA-4 항체가 국제 특허 출원 WO2001014424호, WO2000037504호 및 미국 특허 8,017,114호에 기재되어 있으며; 상기 문헌들은 모두 본 명세서에 참조로 포함된다.
[0092] 항-CTLA-4 항체의 예로는 이필리무맙 (10D1, MDX-010, MDX-101 및 Yervoy®로도 알려짐) 또는 이의 항원 결합 단편 및 변이체 (예컨대, WO 01/14424호 참조)를 들 수 있다. 다른 실시양태에서, 상기 항체는 이필리무맙의 중쇄 및 경쇄 CDR 또는 VR을 포함한다. 따라서, 한 실시양태에서, 상기 항체는 이필리무맙의 VH 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3 도메인 및 이필리무맙의 VL 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3 도메인을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 상기 항체는 상기 언급한 항체와 동일한 CTLA-4 상의 에피토프와 결합하기 위해 경쟁하고/경쟁하거나, 상기에서 언급한 항체와 동일한 CTLA-4 상의 동일한 에피토프에 결합한다. 또 다른 실시양태에서, 상기 항체는 상기 언급된 항체와 적어도 약 90%의 가변 영역 아미노산 서열 동일성 (예컨대, 이필리무맙과 적어도 약 90%, 95% 또는 99%의 가변 영역 동일성)을 가진다.
[0093] CTLA-4를 조절하기 위한 다른 분자들로는, 모두 본원에 참고로 포함되는 미국 특허 5844905호, 5885796호 및 국제 특허 출원 WO1995001994호 및 WO1998042752호에 기재된 것과 같은 CTLA-4 리간드 및 수용체와, 본원에 참고로 포함되는 미국 특허 8329867호에 기재된 것과 같은 면역접합소를 포함한다.
[0094] 일부 실시양태에서, 면역요법은 생체외에서 생성된 자가유래성 항원 특이적 T 세포의 전달을 수반하는 입양 면역요법일 수 있다. 입양 면역요법에 사용되는 T 세포는 항원 특이적 T 세포의 증식 또는 유전공학을 통한 T 세포의 전향에 의해 제조될 수 있다 (Park, Rosenberg et al. 2011). 종양 특이적 T 세포의 분리 및 전달은 흑색종 치료에 성공적인 것으로 나타났다. 유전자이식 T 세포 수용체 또는 키메라 항원 수용체 (CAR)의 유전자 전달을 통해 T 세포의 신규한 특이성이 성공적으로 창출된 바 있다 (Jena, Dotti et al. 2010). CAR은 하나의 융합 분자에서 하나 이상의 신호전달 도메인들과 연관된 표적화 모이어티로 이루어진 합성 수용체이다. 일반적으로, CAR의 결합 모이어티는 가요성 링커에 의해 연결된 단일클론 항체의 경쇄 및 가변성 단편을 포함하는 단일쇄 항체 (scFv)의 항원 결합 도메인으로 이루어진다. 수용체 또는 리간드 도메인에 기초한 결합 모이어티들도 성공적으로 사용된 바 있다. 1세대 CAR용 신호전달 도메인은 CD3제타의 세포질 영역 또는 Fc 수용체 감마 사슬로부터 유래된다. CAR은 림프종 및 고형 종양을 포함하는 다양한 악성종양들의 종양 세포의 표면에서 발현되는 항원들에 대하여 T 세포들을 성공적으로 전향시킨 바 있다 (Jena, Dotti et al. 2010).
[0095] 한 실시양태에서, 본 출원은 암 치료를 위한 병용 요법을 제공하는데, 이 경우 상기 병용 요법은 입양 T 세포 요법 및 체크포인트 억제제를 포함한다. 한 양태에서, 상기 입양 T 세포 요법은 자가유래성 및/또는 동종이계성 T 세포를 포함한다. 다른 양태에서, 상기 자가유래성 및/또는 동종이계성 T 세포는 종양 항원에 대해 표적화된다.
4. 수술
[0096] 암에 걸린 사람의 약 60%가 예방, 진단 또는 병기결정, 치료 및 완화 수술을 포함하는, 일정 유형의 수술을 받게 될 것이다. 치료 수술은 암 조직의 전부 또는 일부를 물리적으로 제거, 절개 및/또는 파괴하는 절제술을 포함하며, 본 발명의 치료, 화학요법, 방사선요법, 호르몬 요법, 유전자 요법, 면역요법 및/또는 대체 요법과 같은 다른 요법들과 함께 사용될 수 있다. 종양 절제술은 종양의 적어도 일부를 물리적으로 제거하는 것을 가리킨다. 종양 절제술 이외에, 수술에 의한 치료는 레이저 수술, 저온수술, 전기수술 및 현미경 제어 수술 [모즈 수술 (Mohs' surgery)]을 포함한다.
[0097] 암세포, 조직 또는 종양의 일부 또는 전부의 절개시, 체내에 공동이 형성될 수 있다. 치료는 관류, 직접 주사, 또는 추가의 항암 요법을 사용한 해당 영역에 대한 국소 적용에 의해 이루어질 수 있다. 이러한 치료는, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7일 마다 또는 1, 2, 3, 4 및 5주 마다 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12개월 마다 반복할 수 있다. 이러한 치료 역시 다양한 투여량으로 이루어질 수 있다.
5. 기타 제제
[0098] 기타 다른 제제들을 본 발명의 특정 양태들과 조합해 사용하여 해당 치료의 치료 효능을 개선시키는 것도 고려할 수 있다. 이러한 추가의 제제들은 세포 표면 수용체 및 GAP 접합부의 상향 조절에 영향을 미치는 제제, 세포 증식 억제제 및 분화제, 세포 부착 억제제, 아폽토시스 유도제에 대한 과증식성 세포의 감응성을 증가시키는 제제, 또는 기타 생물학적 제제를 포함한다. GAP 접합부 수의 증가에 의한 세포간 신호전달의 증가는 인접한 과증식성 세포군에 대한 항-과증식성 효과를 증대시킬 것이다. 다른 실시양태에서, 세포 증식 억제 또는 분화제는 치료의 항-과증식성 효능을 개선시키기 위해, 본 발명의 특정 양태들과 조합하여 사용될 수 있다. 세포 부착 억제제는 본 발명의 효능을 개선시킬 수 있을 것으로 생각된다. 세포 부착 억제제의 예로는 국소 부착 키나제 (FAK) 억제제 및 로바스타틴을 들 수 있다. 추가로, 항체 c225와 같이 치료 효능을 개선시키기 위해, 아폽토시스에 대한 과증식성 세포의 감응성을 증가시키는 다른 제제들을 본 발명의 특정 양태들과 조합하여 사용할 수 있을 것으로 사료된다.
III. 약제학적 조성물
[0099] 치료제를 발현하거나 포함하는 엑소좀을 전신 또는 국소 투여하여 종양 세포 성장을 억제하고, 가장 바람직하게는 국소 진행성 또는 전이성 암이 있는 암 환자에서 암세포를 사멸시킬 수 있다. 이들은 정맥내, 척수강내 및/또는 복강내 투여될 수 있다. 이들은 단독으로 또는 항증식성 약물과 함께 투여될 수 있다. 한 실시양태에서, 이들은 수술 또는 다른 절차를 수행하기 전에 환자의 암 부하도를 감소시키기 위해 투여된다. 다르게는, 이들을 수술 후에 투여하여 남아있을 수 있는 암 (예컨대, 수술로 제거하지 못한 암)이 생존하지 못하도록 할 수도 있다.
[00100] 본 발명을 해당 치료 제제의 구체적인 특성에 의해 제한하고자 하는 의도는 없다. 예를 들어, 이러한 조성물은 생리학적으로 허용가능한 액체, 겔, 고체 담체, 희석제 또는 부형제와 함께 제형으로 제공될 수 있다. 이러한 치료 제제들은 다른 치료제들과 유사한 방식으로 가축에서와 같은 수의용의 포유동물 및 인간의 임상용 포유동물에게 투여될 수 있다. 일반적으로, 치료 효능에 필요한 용량은 활용 유형과 투여 방식 뿐만 아니라 개별 대상체의 특수한 요건들에 따라서도 달라질 것이다.
[00101] 임상적으로 활용해야 하는 경우에는, 해당 활용 의도에 적절한 형태로 엑소좀을 포함하는 약제학적 조성물을 제조하는 것이 필요할 수도 있다. 일반적으로, 약제학적 조성물은 유효량의 하나 이상의 엑소좀 및/또는 약제학적으로 허용가능한 담체에 용해 또는 분산된 추가의 제제들을 포함할 수 있다. "약제학적 또는 약리학적으로 허용가능한"이라는 말은, 예를 들어, 인간과 같은 동물에게 적절하게 투여시 이상 반응, 알러지 반응 또는 기타 뜻하지 않은 반응을 나타내지 않는 성분 의약품 (molecular entities) 및 조성물을 지칭한다. 본원에 개시된 엑소좀, 또는 추가의 활성 성분을 포함하는 약제학적 조성물의 제조에 대해서는 본원에 참고로 포함되는 문헌 [Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., 1990]에 예시되어 있는 것과 같이, 당업자의 숙련자들에게 알려져 있다. 또한, 동물 (예컨대, 인간)에게 투여하는 경우, 상기 제제가 FDA 생물의약품국(Office of Biologics) 기준에서 요구하는 무균성, 발열성, 전반적인 안전성 및 순도 기준을 충족해야 함을 이해할 수 있을 것이다.
[00102] 또한, 본 발명의 특정 양태에 따르면, 투여에 적합한 조성물은 비활성 희석제를 함유 또는 함유하지 않는 약제학적으로 허용가능한 담체로 제공될 수 있다. 본원에 사용된 "약제학적으로 허용가능한 담체"는 당업자에게 공지된 것과 같은 임의의 모든 수성 용매 (예컨대, 물, 알콜/수용액, 에탄올, 식염수, 비경구 비히클, 예컨대 염화나트륨, 링거 덱스트로스 등), 비수성 용매 [예컨대, 지방, 오일, 폴리올 (예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 식물성 오일 및 주사용 유기 에스테르, 예컨대 에틸올레에이트], 지질, 리포좀, 분산매, 코팅 (예컨대, 레시틴), 계면활성제, 산화방지제, 보존제 [예컨대, 항균제 또는 항진균제, 항산화제, 킬레이트제, 불활성 기체, 파라벤 (예컨대, 메틸파라벤, 프로필파라벤), 클로로부탄올, 페놀, 소르브산, 티메로살 또는 이들의 조합], 등장화제 (예컨대, 당 및 염화나트륨), 흡수 지연제 (예컨대, 스테아린산알루미늄 및 젤라틴), 염, 약물, 약물 안정제, 겔, 수지, 충전제, 결합제, 부형제, 붕해제, 윤활제, 감미제, 향미제, 염료, 유체 및 영양 보충제, 이와 유사한 물질들 및 이들의 조합을 포함한다. 상기 담체는 동화될 수 있어야 하며, 액체, 반고체, 즉 페이스트 또는 고체 담체를 포함한다. 또한, 필요하다면, 조성물은 소량의 보조제, 예컨대 습윤제 또는 유화제, 안정화제 또는 pH 완충제를 함유할 수도 있다. 약제학적 조성물에서 다양한 성분들의 pH 및 정확한 농도는 널리 공지된 파라미터들에 따라 조정한다. 적절한 유동성은, 예를 들어 레시틴과 같은 코팅의 사용에 의해, 분산의 경우에는 요구되는 입자 크기의 유지에 의해, 및 계면 활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다.
[00103] 약제학적으로 허용가능한 담체는, 특히 인간에게 투여하도록 제조되기는 하지만, 특정 실시양태에서는 (예컨대, 정부의 규제로 인해) 인간에게 투여하는 것이 허용되지 않고 인간이 아닌 동물에 투여하도록 제형화되는 약제학적으로 허용가능한 담체를 사용하는 것이 바람직할 수있다. 임의의 통상적인 담체가 활성 성분과 함께 사용할 수 없는 경우 (예컨대, 수용 대상체나 해당 담체 내에 함유되어 있는 조성물의 치료적 효능에 유해한 경우)를 제외하고는, 해당 담체의 치료적 조성물 또는 약제학적 조성물에서의 사용은 고려된다. 본 발명의 특정 양태에 따르면, 본 조성물은 임의의 적절하고 실용적인 방식으로, 즉 용해, 현탁, 유화, 혼합, 캡슐화, 흡수 등에 의해 담체와 조합된다. 이러한 절차들은 당업자에게는 일반적인 것들이다.
[00104] 본 발명의 특정 실시양태들은 해당 조성물이 고체, 액체 또는 에어로졸 형태로 투여될 것인지의 여부에 따라, 그리고 주사로서의 투여 경로를 위해 멸균될 필요가 있는지의 여부에 따라 서로 다른 유형의 담체들을 포함할 수 있다. 본 조성물은 흡입 (예컨대, 에어로졸 흡입)에 의해, 주사에 의해, 주입에 의해, 연속 주입에 의해, 표적 세포에 대하여 직접적으로 관류욕을 수행함에 의해, 카테터를 통해, 세척술을 통해, 지질 조성물 (예컨대, 리포좀)로, 또는 기타 방법들 또는 상기한 것들의 조합에 의해, 정맥내, 피부내, 경피, 척수강내, 동맥내, 복강내, 비강내, 질내, 직장내, 근육내, 피하, 점막, 경구, 국부, 국소 투여될 수 있으며, 이러한 내용에 대해서는 당업계의 숙련자들에게 공지되어 있다 (예를 들어, 본원에 참고로 포함되는 문헌 [Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., 1990] 참조).
[00105] 상기 엑소좀은 비경구 투여용, 예를 들어 정맥내, 근육내, 피하 또는 심지어 복강내 경로를 통한 주사용으로 제형화될 수 있다. 일반적으로, 이러한 조성물은 액체 용액 또는 현탁액으로 제조될 수 있으며; 주사하기 전 액체를 첨가하여 용액 또는 현탁액을 제조하는데 사용하기에 적합한 고체 형태 역시 제조될 수 있으며; 해당 제제들은 유화될 수도 있다.
[00106] 주사용으로 적절한 약학적 제형으로는, 멸균 수용액 또는 분산액; 참기름, 땅콩유 또는 수성 프로필렌 글리콜을 포함하는 제형; 및 멸균 주사액 또는 분산액의 즉석 조제용 제제를 위한 멸균 분말을 포함한다. 어떠한 경우에서든, 상기 제형은 멸균되어야 하고, 쉽게 주사될 수 있을 정도로 유동성이 있어야 한다. 또한, 상기 제형은 제조 및 보관 조건 하에서 안정해야 하며, 박테리아와 진균과 같은 미생물의 오염 활동으로부터 보존되어야 한다.
[00107] 제제화시, 용액은 해당 제형과 양립가능한 방식으로 그리고 치료적으로 유효한 양으로 투여될 것이다. 상기 제형은 주사용 용액, 또는 폐 전달용 에어로졸과 같이 비경구 투여용으로 제형화되거나, 또는 약물 방출 캡슐 등과 같이 소화관 투여를 위해 제형화되는 것과 같은 여러가지 제형으로 쉽게 투여한다.
[00108] "단위 용량" 또는 "투여량"이라는 용어는 대상체에 사용하기에 적절한 물리적으로 구분된 별개의 단위를 지칭하며, 각 단위는 그의 투여, 즉 적절한 경로 및 치료 처방계획과 관련하여 상기 논의된 목적한 반응을 나타내도록 계산된 사전에 결정된 소정량의 치료 조성물을 함유하고 있다. 치료 횟수와 단위 용량 모두에 따라 투여되는 양은 목적하는 효과에 따라 달라진다. 환자 또는 대상체에게 투여되는 본 발명의 조성물의 실제 투여량은 대상체의 체중, 연령, 건강 및 성별, 치료되는 질환의 종류, 질환의 침투 정도, 기존 또는 현재의 치료적 개입, 해당 환자의 특발성 질환, 투여 경로, 및 구체적인 치료제의 효능, 안정성 및 독성과 같은 물리적 및 생리학적 요인들에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어, 용량은 투여당 약 1 μg/kg/체중 내지 약 1000 mg/kg/체중 (이러한 범위는 중간 조정 투여량을 포함함) 이상, 및 상기 수치에서 추론가능한 임의의 범위를 포함할 수도 있다. 본원에 열거된 수치들로부터 유도가능한 범위의 비제한적 예로서, 약 5 μg/kg/체중 내지 약 100 mg/kg/체중, 약 5 μg/kg/체중 내지 약 500 mg/kg/체중 등의 범위를 투여할 수 있다. 투여를 담당하는 의사는 여하튼 조성물 내 활성 성분(들)의 농도와 각 대상체에 대한 적절한 용량(들)을 결정할 것이다.
[00109] 동물인 환자에 투여되는 조성물의 실제 투여량은 체중, 질환의 중증도, 치료될 질병의 종류, 기존 또는 현재의 치료적 개입, 해당 환자의 특발성 질환과 같은 물리적 및 생리학적 요인들과 투여 경로에 의해 결정될 수 있다. 투여량과 투여 경로에 따라, 바람직한 투여량 및/또는 유효량의 투여 횟수는 대상체의 반응에 따라 달라질 수도 있다. 투여를 담당하는 의사는 여하튼 조성물 내 활성 성분(들)의 농도와 각 대상체에 대한 적절한 용량(들)을 결정할 것이다.
[00110] 특정 실시양태에서, 약제학적 조성물은, 예를 들어 적어도 약 0.1%의 활성 화합물을 포함할 수 있다. 다른 실시양태에서, 활성 화합물은, 예를 들어 해당 단위의 중량의 약 2% 내지 약 75%, 또는 해당 단위의 중량의 약 25% 내지 약 60% 및 상기 수치에서 추론가능한 임의의 범위를 포함할 수 있다. 당연히, 각각의 치료적으로 유용한 조성물 중의 활성 화합물(들)의 양은, 적절한 용량이 임의의 주어진 해당 화합물의 단위 용량 중에 수득되도록 하는 방식으로 제조될 수 있다. 용해도, 생체이용률, 생체 반감기, 투여 경로, 제품 보존 기간 및 기타 약리학적 고려사항들과 같은 요인들이, 이러한 약제학적 제형을 제조하는 당업자들에 의해 고려될 것이며, 그런 까닭에 다양한 투여량과 치료 처방계획이 요구될 수 있다.
[00111] 다른 비제한적인 예로서, 용량은 투여당 약 1 마이크로그램/kg/체중, 약 5 마이크로그램/kg/체중, 약 10 마이크로그램/kg/체중, 약 50 마이크로그램/kg/체중, 약 100 마이크로그램/kg/체중, 약 200 마이크로그램/kg/체중, 약 350 마이크로그램/kg/체중, 약 500 마이크로그램/kg/체중, 약 1 밀리그램/kg/체중, 약 5 밀리그램/kg/체중, 약 10 밀리그램/kg/체중, 약 50 밀리그램/kg/체중, 약 100 밀리그램/kg/체중, 약 200 밀리그램/kg/체중, 약 350 밀리그램/kg/체중, 약 500 밀리그램/kg/체중 내지 약 1000 밀리그램/kg/체중 또는 그 이상까지, 그리고 상기 수치에서 추론가능한 임의의 범위도 포함할 수 있다. 본원에 열거된 수치들로부터 유도가능한 범위의 비제한적 예로서, 상술한 수치에 기초하여, 약 5 밀리그램/kg/체중 내지 약 100 밀리그램/kg/체중, 약 5 마이크로그램/kg/체중 내지 약 500 밀리그램/kg/체중 등의 범위를 투여할 수 있다.
IV. 엑소좀 탑재물
A. 핵산 및 벡터
[00112] 본 발명의 특정 양태에서, 치료 단백질 또는 항체를 암호화하는 핵산 서열이 개시될 수 있다. 어떠한 발현 시스템을 사용하느냐에 따라, 핵산 서열은 통상적인 방법에 기초하여 선택될 수 있다. 예를 들어, 각 유전자들 또는 이의 변이체들은 특정 시스템에서의 발현을 위해서 코돈 최적화될 수 있다. 또한, 다양한 벡터들을 사용하여 관심대상 단백질을 발현시킬 수도 있다. 대표적인 벡터로는 플라스미드 벡터, 바이러스 벡터, 트랜스포존 또는 리포좀계 벡터를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.
B. 재조합 단백질
[00113] 일부 실시양태들은, 재조합 단백질 및 폴리펩타이드, 예를 들어 치료용 항체에 관한 것이다. 일부 양태에서, 치료용 항체는 세포내 단백질에 특이적 또는 선택적으로 결합하는 항체일 수 있다. 추가의 양태에서, 상기 단백질 또는 폴리펩타이드는 혈청 안정성을 증대시키기 위해 변형될 수도 있다. 따라서, 본 출원에서 "변형된 단백질" 또는 "변형된 폴리펩타이드"의 기능이나 활성을 언급하는 경우, 당업자라면 누구나, 여기에 예를 들어 변형되지 않은 단백질이나 폴리펩타이드에 비해 부가적인 이점을 갖는 단백질 또는 폴리펩타이드가 포함된다는 점을 이해하고 있을 것이다. "변형된 단백질"에 관한 실시양태들은 "변형된 폴리펩타이드"에 대해서도 시행될 수 있고, 그 반대도 역시 가능하다.
[00114] 본원에 사용된 단백질 또는 펩타이드란 일반적으로, 이에 제한되지는 않지만, 유전자로부터 해독된 전장 서열 이하의 약 200개 초과의 아미노산의 단백질; 약 100개 초과의 아미노산의 폴리펩타이드; 및/또는 약 3개 내지 약 100개의 아미노산의 펩타이드를 지칭한다. 편의상, "단백질", "폴리펩타이드" 및 "펩타이드"라는 용어들은 본원에서 서로 교환하여 사용될 수 있다.
[00115] 본원에 사용된 "아미노산 잔기"는 당업계에 공지된 임의의 천연 아미노산, 임의의 아미노산 유도체 또는 임의의 아미노산 모방체를 가리킨다. 특정 실시양태에서, 단백질 또는 펩타이드의 잔기들은 아미노산 잔기들의 서열을 중단시키는 임의의 비아미노산이 없이 순차적으로 되어 있다. 다른 실시양태에서, 서열은 하나 이상의 비아미노산 모이어티를 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 단백질 또는 펩타이드의 잔기들의 서열은 하나 이상의 비아미노산 모이어티에 의해 중단될 수 있다.
[00116] 따라서, "단백질 또는 펩타이드"라는 용어는 천연 단백질에서 발견되는 20개의 통상적인 아미노산들 중 적어도 하나의 아미노산, 또는 적어도 하나의 변형되거나 통상적이지 않은 아미노산을 포함하는 아미노산 서열을 망라한다.
C. 억제성 RNA
[00117] siRNA (예컨대, siNA)는 당업계에 널리 알려져 있다. 예를 들어, siRNA 및 이중 가닥 RNA는 미국 특허 출원 2003/0051263호, 2003/0055020호, 2004/0265839호, 2002/0168707호, 2003/0159161호 및 2004/0064842호 뿐만 아니라, 미국 특허 6,506,559호와 6,573,099호에 기술된 바 있으며, 상기 문헌들은 모두는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
[00118] siRNA 내에서, 핵산의 성분들이 전반적으로 동일한 유형이거나 동종일 필요는 없다 (예를 들어, siRNA는 뉴클레오타이드 및 핵산 또는 뉴클레오타이드 유사체를 포함할 수 있음). 일반적으로, siRNA는 이중 가닥 구조를 형성하며; 상기 이중 가닥 구조는 부분적으로 또는 완전히 상보적인 별개의 두 핵산으로부터 유래할 수 있다. 본 발명의 특정 실시양태에서, siRNA는 단일 핵산 (폴리뉴클레오타이드) 또는 핵산 유사체만을 포함하여 그 자체를 가지고 보완 (예컨대, 헤어핀 루프를 형성)함으로써 이중 가닥 구조를 형성할 수 있다. siRNA의 이중 가닥 구조는 16, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500개 이상 (이 안에 모든 범위들을 포함함)의 연속한 핵염기들을 포함할 수 있다. siRNA는 (동일한 핵산의 또 다른 부분이거나 별개의 상보적 핵산일 수 있는) 상보적 핵산과 하이브리드화하는 17 내지 35개의 연속한 핵염기, 보다 바람직하게는 18 내지 30개의 연속한 핵염기, 보다 바람직하게는 19 내지 25개의 핵염기, 보다 바람직하게는 20 내지 23개의 연속한 핵염기, 또는 20 내지 22개의 연속한 핵염기, 또는 21개의 연속한 핵염기를 포함하여 이중 가닥 구조를 형성할 수 있다.
[00119] 본 발명의 방법을 수행하는데 유용한 본 발명의 제제로는, 이에 제한되지는 않지만, siRNA를 포함한다. 일반적으로, 짧은 간섭 RNA (siRNA)로도 달리 지칭될 수 있는 이중 가닥 RNA (dsRNA)의 도입은, RNA 간섭 또는 RNAi라고 불리는 현상인 강력하고 특이적인 유전자 사일런싱을 유도한다. RNA 간섭은 "공동억제", "전사후 유전자 사일런싱", "센스 억제" 및 "진정(quelling)"으로 지칭되어 왔다. RNAi는 특정 유전자들의 활성을 녹아웃하는 수단을 제공하기 때문에 매력이 있는 생명공학적 도구이다.
[00120] RNAi를 설계함에 있어서는, siRNA의 성질, 사일런싱 효과의 내구성 및 전달 시스템의 선택과 같이 몇 가지 고려해야 될 요인들이 있다. RNAi 효과를 만들어 내기 위해서, 해당 유기체에 도입되는 siRNA는 통상적으로 엑손 서열을 포함하게 될 것이다. 또한, RNAi 과정은 상동성에 의존하므로, 유전자 특이적 서열들 간이 아닌 상동성 서열들 간의 교차 간섭의 가능성을 최소화하면서도 유전자 특이성을 극대화하기 위해서는 서열들을 신중하게 선택해야 한다. 바람직하게는, 상기 siRNA는 siRNA의 서열과 억제될 유전자 간에 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 심지어 100% 이상의 동일성을 나타낸다. 표적 유전자와의 동일성이 약 80% 미만인 서열들은 실질적으로 효과가 덜하다. 따라서, siRNA와 억제할 유전자 간의 상동성이 클수록, 무관한 유전자들의 발현이 영향을 덜 받게될 것이다.
[00121] 또한, siRNA의 크기도 중요한 고려사항이다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 적어도 약 19-25개의 뉴클레오타이드를 포함하여 유전자 발현을 조절할 수 있는 siRNA 분자에 관한 것이다. 본 발명의 내용에서, 상기 siRNA의 길이는 바람직하게는 500, 200, 100, 50 또는 25개 미만의 뉴클레오타이드이다. 보다 바람직하게는, 상기 siRNA는 길이는 약 19개 뉴클레오타이드 내지 약 25개의 뉴클레오타이드이다.
[00122] 일반적으로, 표적 유전자는 폴리펩타이드를 암호화하는 영역을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 의미하거나; 해당 폴리펩타이드의 발현에 중요한 복제, 전사 또는 해독 또는 기타 과정들을 조절하는 폴리뉴클레오타이드 영역을 의미하거나; 또는 폴리펩타이드를 암호화하는 영역 및 그에 작동가능하게 연결된 발현을 조절하는 영역을 모두 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 의미한다. 세포 중에서 발현되는 임의의 유전자를 표적으로 삼을 수 있다. 바람직하게는, 표적 유전자는 연구 대상으로서 질병에 중요하거나 특정 관심 대상인 세포 활동의 진행에 관여되어 있거나 이와 관련된 유전자이다.
[00123] siRNA는 시판되는 공급원, 천연 공급원으로부터 얻을 수 있거나, 또는 당업자에게 익히 공지된 수많은 기법들 중의 하나의 기법을 사용하여 합성할 수도 있다. 예를 들어, siRNA 시판 기성품의 한 예로는 Ambion® (미국 텍사주 오스틴 소재)을 들 수 있다. 다른 한 예로는 Qiagen® (미국 캘리포니아주 발렌시아 소재)을 들 수 있다. 본 발명의 조성물 및 방법에 적용될 수 있는 억제성 핵산은, 어떤 임의의 출처를 통해 관심 단백질에 대한 유효성이 검증된 하향 조절자인 것으로 밝혀진 바 있는 임의의 핵산 서열이다. 과도한 실험없이도 본 발명의 개시내용을 이용하면, 추가의 siRNA들을 설계하여 본 발명의 방법을 시행하는데 사용할 수 있다.
[00124] siRNA는 하나 이상의 뉴클레오타이드의 변형을 포함할 수도 있다. 이러한 변형은, 예컨대 19 내지 25개의 뉴클레오타이드 RNA의 말단(들)에 또는 내부 (해당 RNA의 하나 이상의 뉴클레오타이드)에 비-뉴클레오타이드 물질의 첨가를 포함할 수 있다. 특정 양태에서, RNA 분자는 3'-하이드록실기를 함유한다. 본 발명의 RNA 분자 내의 뉴클레오타이드는 비자연발생적 뉴클레오타이드 또는 데옥시리보뉴클레오타이드를 비롯한 비표준 뉴클레오타이드를 포함할 수도 있다. 이중 가닥의 올리고뉴클레오타이드는 변형된 백본, 예를 들어 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 또는 당업계에 공지된 다른 변형된 백본을 함유할 수 있거나, 또는 비천연 뉴클레오사이드간 결합을 함유할 수 있다. siRNA에 대한 추가의 변형 (예컨대, 2'-O-메틸 리보뉴클레오타이드, 2'-데옥시-2'-플루오로 리보뉴클레오타이드, "범용 염기" 뉴클레오타이드, 5-C-메틸 뉴클레오타이드, 하나 이상의 포스포로티오에이트 인터 뉴클레오타이드간 결합 및 역상 데옥시염기 결여성 잔기의 도입)에 대한 내용은 미국 특허 공보 2004/0019001호 및 미국 특허 6,673,611호 (각각 그 전문이 참조로 포함됨)에서 찾아볼 수 있다. 총괄하여, 상술된 이러한 변형된 모든 산 또는 RNA를 변형된 siRNA로 지칭한다.
D. 유전체 편집 시스템
[00125] 일반적으로, "CRISPR 시스템"이란 Cas 유전자를 암호화하는 서열, tracr (전사활성화 CRISPR) 서열 (예컨대, tracrRNA 또는 부분 활성 tracrRNA), tracr-메이트(mate) 서열 (내인성 CRISPR 시스템과 관련하여 "직접 반복" 및 tracrRNA로 처리된 부분 직접 반복을 망라함), 가이드 서열 (내인성 CRISPR 시스템과 관련하여 "스페이서"로도 지칭함) 및/또는 CRISPR 유전자좌의 다른 서열 및 전사체를 포함하는, CRISPR 관련 ("Cas") 유전자의 발현 또는 이의 활성을 유도하는데 관여하는 전사체 및 다른 구성요소들을 총괄적으로 가리킨다.
[00126] 상기 CRISPR/Cas 뉴클레아제 또는 CRISPR/Cas 뉴클레아제 시스템은, DNA에 특이적으로 결합하는 비암호화 RNA 분자 (가이드) RNA 및 뉴클레아제 작용성 (예컨대, 2개의 뉴클레아제 도메인)을 갖는 Cas 단백질 (예컨대, Cas9)을 포함할 수 있다. CRISPR 시스템의 하나 이상의 구성요소는, 예를 들어 내인성 CRISPR 시스템을 포함하는 특정 유기체, 예컨대 스트렙토코커스 피오게네스 (Streptococcus pyogenes)로부터 유래된 I형, II형 또는 III형 CRISPR 시스템으로부터 유래할 수 있다.
[00127] 일부 양태에서, Cas 뉴클레아제 및 gRNA (표적 서열에 특이적인 crRNA 및 고정된 tracrRNA의 융합물을 포함)를 세포 내로 도입한다. 일반적으로, gRNA의 5' 말단의 표적 부위들은 상보적 염기쌍을 사용하여 상기 Cas 뉴클레아제를 상기 표적 부위, 예컨대 상기 유전자로 표적화한다. 상기 표적 부위는 일반적으로 NGG 또는 NAG와 같은 프로토스페이서 인접 모티프 (PAM) 서열의 5'에 가까운 위치에 기초하여 선택될 수 있다. 이와 관련하여, 상기 gRNA는 해당 가이드 RNA의 처음 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 14, 12, 11개 또는 10개의 뉴클레오타이드를 상기 표적 DNA 서열에 상응하도록 변형시킴으로써 원하는 서열에 표적화시킨다. 일반적으로, CRISPR 시스템은 표적 서열 부위에서 CRISPR 복합체의 형성을 촉진하는 구성요소들을 특징으로 한다. 일반적으로, "표적 서열"은 일반적으로 가이드 서열이 상보성을 보유하도록 설계된 서열을 가리키는데, 여기서 상기 표적 서열과 가이드 서열 간의 하이브리드화가 CRISPR 복합체의 형성을 촉진한다. 하이브리드화를 유도하여 CRISPR 복합체의 형성을 촉진하기에 충분한 상보성이 존재하는 한, 완전한 상보성이 반드시 요구되는 것은 아니다.
[00128] 상기 CRISPR 시스템은 표적 부위에서 이중 가닥 절단 (DSB)을 유도한 후, 본원에 논의된 바와 같이 붕괴시킬 수도 있다. 다른 실시양태에서, "니카제(nickase)"로 간주되는 Cas9 변이체는 표적 부위에서 단일 가닥에 새김눈(nick)을 내는데 사용된다. 각각 한 쌍의 서로 다른 gRNA 표적화 서열들에 의해 유도되는 쌍을 이루고 있는 니카제들은, 예를 들어 특이성을 개선하는데 사용될 수 있는데, 이 경우 새김눈을 동시에 도입할 때 5' 돌출부가 도입되도록 할 수 있다. 다른 실시양태에서, 촉매적으로 비활성인 Cas9를 이종성 효과기 도메인, 예컨대 전사 억제제 또는 활성제에 융합시켜, 유전자 발현에 영향을 준다.
[00129] 상기 표적 서열은 DNA 또는 RNA 폴리뉴클레오타이드와 같은 임의의 폴리뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 상기 표적 서열은 세포의 소기관 내와 같은 세포의 핵이나 세포질 내에 위치할 수 있다. 일반적으로, 표적 서열을 포함하는 표적화된 유전자좌로의 재조합에 사용될 수 있는 서열 또는 주형을 "편집용 주형" 또는 "편집용 폴리뉴클레오타이드" 또는 "편집용 서열"로 지칭한다. 일부 양태에서는, 외인성 주형 폴리뉴클레오타이드도 편집 주형으로 지칭할 수 있다. 일부 양태에서, 상기 재조합은 상동성 재조합이다.
[00130] 일반적으로, 내인성 CRISPR 시스템과 관련하여, CRISPR 복합체 (표적 서열에 하이브리드화되고 하나 이상의 Cas 단백질과 복합체화된 가이드 서열을 포함함)의 형성으로 해당 표적 서열 내 또는 그 근방 (예컨대, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 50개 또는 그 이상의 염기쌍 내)의 한 가닥 또는 양 가닥의 절단이 유발된다. 야생형 tracr 서열의 전부 또는 일부 (예컨대, 야생형 tracr 서열 중 약 20, 26, 32, 45, 48, 54, 63, 67, 85개 또는 그 이상의 뉴클레오타이드)를 포함하거나 이들로 이루어질 수 있는 tracr 서열은, 예를 들어 적어도 tracr 서열의 일부를 따라, 가이드 서열에 작동가능하게 연결된 tracr 메이트 서열의 전부 또는 일부에 하이브리드화시킴으로써, CRISPR 복합체의 일부를 형성할 수도 있다. 상기 tracr 서열은 하이브리드화하여 CRISPR 복합체의 형성에 참여하도록 tracr 메이트 서열에 대한 충분한 상보성, 예컨대 최적으로 정렬되는 경우 tracr 메이트 서열의 길이를 따라 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99%의 서열 상보성을 가진다.
[00131] CRISPR 시스템의 하나 이상의 구성요소의 발현을 유도하는 하나 이상의 벡터들을 세포 내로 도입하여, 해당 CRISPR 시스템의 구성요소들의 발현이 하나 이상의 표적 부위에서 CRISPR 복합체의 형성을 지시하도록 할 수 있다. 구성요소들은 단백질 및/또는 RNA로서 세포에 전달될 수도 있다. 예를 들어, Cas 효소, tracr 메이트 서열에 결합된 가이드 서열 및 tracr 서열은 각각 별개의 벡터 상의 별도의 조절 요소들에 작동가능하게 연결될 수 있다. 다르게는, 동일하거나 상이한 조절 요소들로부터 발현된 2 이상의 구성요소들은, 단일 벡터 중에서 조합될 수 있고, 하나 이상의 추가의 벡터들로 첫 벡터에 포함되어 있지 않은 CRISPR 시스템의 임의의 구성요소들을 제공할 수 있다. 벡터는 제한 엔도뉴클레아제 인식 서열 ("클로닝 부위"라고도 함)과 같은 하나 이상의 삽입 부위를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 삽입 부위는 하나 이상의 벡터의 하나 이상의 서열 구성요소의 상류 및/또는 하류에 위치된다. 다수의 서로 다른 가이드 서열을 사용하는 경우, 단일 발현 작제물을 사용하여 CRISPR 활성을 한 세포 내에서 상응하는 다수의 서로 다른 표적 서열들을 표적화할 수 있다.
[00132] 벡터는 CRISPR 효소, 예컨대 Cas 단백질을 암호화하는 효소 암호화 서열에 작동가능하게 연결된 조절 요소를 포함할 수 있다. Cas 단백질의 비제한적 예로는 Cas1, Cas1B, Cas2, Cas3, Cas4, Cas5, Cas6, Cas7, Cas8, Cas9 (Csn1 및 Csx12로도 알려짐), Cas10, Csy1, Csy2, Csy3, Cse1, Cse2, Csc1, Csc2, Csa5, Csn2, Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Csm6, Cmr1, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, Csb1, Csb2, Csb3, Csx17, Csx14, Csx10, Csx16, CsaX, Csx3, Csx1, Csx15, Csfl, Csf2, Csf3, Csf4, 이의 상동체 또는 이의 변형된 버전을 포함한다. 이러한 효소들이 공지되어 있으며; 예를 들어, S. 피오게네스 Cas9 단백질의 아미노산 서열은 SwissProt 데이터베이스에서 등록번호 Q99ZW2로 찾아볼 수 있다.
[00133] 상기 CRISPR 효소는 (예컨대, S. 피오게네스 또는 S. 뉴모니아 유래의) Cas9일 수 있다. 상기 CRISPR 효소는 표적 서열의 위치에서, 예컨대 표적 서열의 내에서 및/또는 표적 서열의 상보체 내에서 한 가닥 또는 양 가닥의 절단을 지시할 수 있다. 상기 벡터는 상응하는 야생형 효소에 대하여 돌연변이된 CRISPR 효소를 암호화하여, 상기 돌연변이된 CRISPR 효소가 표적 서열을 함유하는 표적 폴리뉴클레오타이드의 한 가닥 또는 양 가닥을 절단하는 능력이 결여되도록 할 수 있다. 예를 들어, S. 피오게네스로부터 유래된 Cas9의 RuvC I 촉매 도메인에 있어서 아스파르테이트에서 알라닌으로의 치환 (D10A)은, Cas9를 양 가닥을 절단하는 뉴클레아제로부터 (단일 가닥을 절단하는) 니카제로 전환시킨다. 일부 실시양태에서, Cas9 니카제는 DNA 표적의 센스 및 안티센스 가닥을 각각 표적으로 하는 가이드 서열(들), 예컨대 2개의 가이드 서열과 함께 조합하여 사용할 수 있다. 상기 조합은 양 가닥에 모두 새김눈을 내어 NHEJ 또는 HDR을 유도하는데 사용할 수 있게 해준다.
[00134] 일부 실시양태에서, CRISPR 효소를 암호화하는 효소 암호화 서열은 진핵 세포와 같은 특정 세포에서의 발현에 대해 최적화된 코돈이다. 상기 진핵 세포는 인간, 마우스, 랫트, 토끼, 개 또는 인간이 아닌 영장류를 포함하지만 이에 제한되지 않는 포유동물과 같은 특정 유기체의 세포이거나 이로부터 유래될 수도 있다. 일반적으로, 코돈 최적화는, 본래의 아미노산 서열을 유지하면서, 본래 서열의 적어도 하나의 코돈을 관심대상 숙주의 유전자에서 보다 빈번하게 혹은 가장 빈번하게 사용되는 코돈으로 대체함으로써 상기 숙주 세포에서의 발현을 향상시키기 위해 핵산 서열을 변형시키는 과정을 지칭한다. 다양한 종들은 특정 아미노산의 특정 코돈에 대해 특유의 편향성을 나타낸다. 코돈 편향성 (유기체간 코돈 사용빈도의 차이)은 메신저 RNA (mRNA)의 해독 효율성과 관련이 있는 경우가 많은데, 결과적으로 특히 해독되는 코돈의 특성 및 특정한 트랜스퍼 RNA (tRNA) 분자의 유용성에 좌우되는 것으로 생각된다. 세포에서 선택된 tRNA의 우위성은 일반적으로 펩타이드 합성에 가장 빈번하게 사용되는 코돈의 속성을 반영한 것이다. 따라서, 유전자는 코돈 최적화에 기반하여 주어진 유기체에서 최적의 유전자 발현에 맞추어질 수 있다.
[00135] 일반적으로, 가이드 서열은 표적 서열과 하이브리드화하여 상기 표적 서열에 대한 CRISPR 복합체의 서열 특이적 결합을 유도하기에 표적 폴리뉴클레오타이드 서열과 충분한 상보성을 갖는 임의의 폴리뉴클레오타이드 서열이다. 일부 실시양태에서, 적합한 정렬 알고리즘을 사용하여 최적으로 정렬하는 경우, 가이드 서열과 이의 상응하는 표적 서열 간의 상보성의 정도는 약 50%, 60%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97.5%, 99% 또는 그 이상이다.
[00136] 최적의 정렬은 서열을 정렬하기에 적절한 임의의 알고리즘을 사용하여 결정될 수 있는데, 이러한 알고리즘의 비제한적인 예로는 스미스-워터맨(Smith-Waterman) 알고리즘, 니들만-분쉬(Needleman-Wunsch) 알고리즘, 버로우스-휠러 변환(Burrows-Wheeler Transform)에 기반한 알고리즘 [예컨대, 버로우스 휠러 얼라이너(Aligner)사 제조], Clustal W, Clustal X, BLAT, Novoalign [노보크래프트 테크놀로지스(Novocraft Technologies)사 제조], ELAND [미국 캘리포니아주 샌디에고 소재의 일루미나 (Illumina)사 제조], SOAP (soap.genomics.org.cn에서 이용가능) 및 Maq (maq.sourceforge.net에서 이용가능)를 포함한다.
[00137] CRISPR 효소는 하나 이상의 이종 단백질 도메인을 포함하는 융합 단백질의 일부일 수 있다. CRISPR 효소 융합 단백질은 임의의 추가 단백질 서열, 및 임의로 임의의 두 도메인 사이의 링커 서열을 포함할 수 있다. CRISPR 효소에 융합될 수 있는 단백질 도메인의 예로는, 이에 제한되지는 않지만, 에피토프 태그; 리포터 유전자 서열; 및 메틸라제 활성, 탈메틸라제 활성, 전사 활성화 활성, 전사 억제 활성, 전사 방출 인자 활성, 히스톤 변형 활성, RNA 절단 활성 및 핵산 결합 활성 중 하나 이상의 활성을 보유하는 단백질 도메인을 포함한다. 에피토프 태그의 비제한적 예로는 히스티딘 (His) 태그, V5 태그, FLAG 태그, 인플루엔자 헤마글루티닌 (HA) 태그, Myc 태그, VSV-G 태그 및 티오레독신 (Trx) 태그를 포함한다. 리포터 유전자의 예로는, 이에 제한되지는 않지만, 글루타티온-5-트랜스퍼라제 (GST), 호스래디쉬 퍼옥시다제 (HRP), 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제 (CAT), 베타 갈락토시다제, 베타-글루쿠로니다제, 루시퍼라제, 녹색 형광 단백질 (GFP), HcRed, DsRed, 청록색 형광 단백질 (CFP), 황색 형광 단백질 (YFP) 및 자가 형광 단백질, 예컨대 청색 형광 단백질 (BFP)을 포함한다. CRISPR 효소는, 말토오스 결합 단백질 (MBP), S-태그, Lex A DNA 결합 도메인 (DBD) 융합물, GAL4A DNA 결합 도메인 융합물, 및 단순 포진 바이러스 (HSV) BP16 단백질 융합물을 포함하는 이에 제한되지 않는, DNA 분자나 다른 세포성 분자에 결합하는 단백질 또는 단백질의 단편을 암호화하는 유전자 서열에 융합될 수 있다. CRISPR 효소를 포함하는 융합 단백질의 일부를 형성할 수 있는 추가의 도메인은 본원에 참고로 포함되는 US 20110059502호에 기재되어 있다.
V. 키트 및 진단
[00138] 본 발명의 다양한 양태에서, 체액 또는 조직 배양 배지로부터 엑소좀을 정제하는데 필요한 성분들을 함유하는 키트가 상정된다. 다른 양태에서, 엑소좀을 분리하여 이를 치료용 핵산, 치료용 단백질 또는 억제성 RNA로 형질감염시키는데 필요한 성분들을 함유하는 키트도 고려된다. 본 키트는 임의의 이러한 성분들을 함유하는 하나 이상의 밀봉된 바이알을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 키트는 적절한 용기 수단도 포함할 수 있는데, 이 용기는 상기 키트의 부품들, 예컨대 에펜도르프 튜브, 분석 플레이트, 주사기, 병 또는 튜브와 반응하지 않는 용기이다. 상기 용기는 플라스틱 또는 유리와 같은 멸균가능한 재료로 제조될 수 있다. 상기 키트는 본원에 제시된 방법들의 절차적 단계들을 개략적으로 설명하는 지침서를 추가로 포함할 수 있는데, 이것은 본원에 기술된 것과 실질적으로 동일한 절차를 따를 것이거나 당업자에게 공지되어 있다. 상기 지침서의 정보는, 컴퓨터를 사용하여 실행하는 경우에 샘플로부터 엑소좀을 정제하는 단계 및 치료용 탑재물로 상기 엑소좀을 형질감염시키는 단계에 대한 실제 또는 가상 절차를 표시하여 보여주는 기계 판독가능 지침들을 포함하는 컴퓨터 판독가능 매체 내에 존재할 수 있다.
VI. 실시예
[00139] 하기의 실시예를 들어 본 발명의 바람직한 실시양태를 설명한다. 당업계의 숙련자라면, 하기의 실시예에 기술된 기법들이 본 발명을 잘 수행하기 위해 본 발명자들에 의해 발견된 기법들을 대표하는 것이기 때문에, 발명의 수행에 대한 바람직한 양태를 구성하는 것으로 간주될 수 있음을 알 수 있을 것이다. 그러나, 당업계의 숙련자라면, 본 명세서의 내용을 고려하여, 개시된 구체적인 실시양태에 있어서 본 발명의 개념과 범위를 벗어나지 않으면서 여러가지 변화를 주어도 그와 비슷하거나 유사한 결과를 얻을 수 있다는 사실을 알 수 있을 것이다.
실시예 1 - 엑소좀을 사용한 Panc-1 동소 종양에 대한 TP53R273H siRNA의 전달
[00140] 리포펙타민 형질 감염을 이용하여, TP53R273H에 대한 동형 접합성 돌연변이인 Panc-1 세포에서 TP53R273H (CAGCUUUGAGGUGCAUGUUUG; 서열번호 1)를 표적으로 하는 siRNA의 녹다운 효율에 대해 시험하였다 (도 1a).
[00141] siRNA 작제물은 KrasG12D를 특이적으로 표적화하도록 설계되었다. siRNA 서열 (GUUGGAGCUG A UGGCGUAGTT; 서열번호 2)은, 세포주 및 동물 모델에서 발견되는 KrasG12D 돌연변이에서 글리신 → 아스파르테이트 아미노산 치환을 특이적으로 표적화하기 위해 야생형 Kras 유전자 서열 (밑줄 및 굵은 글씨)의 G → A 뉴클레오타이드 일탈, 및 사일런싱 효율을 촉진하기 위한 TT 뉴클레오타이드 오버행 (밑줄)을 반영하고 있다 (Rejiba et al., 2007; Ma et al., 2004; Du et al., 2005).
[00142] Panc-1 GFP/Luc 동소 종양을 보유하고 있는 마우스를 (1) 대조군 엑소좀, (2) TP53R273H를 표적으로 삼는 siRNA를 함유하는 엑소좀, 또는 (3) TP53R273H를 표적으로 삼는 siRNA를 함유하는 엑소좀, 및 KrasG12D를 표적으로 삼는 siRNA를 함유하는 엑소좀으로 (i.p.) 처리하였다. 상기 대조군에서는 가장 높은 수준의 종양 성장이 나타났다 (도 1b & c). 그리고 두 치료군에서는 모두 종양 크기가 감소된 것으로 나타났다 (도 1b & c).
[00143] 간 및 췌장으로의 엑소좀 전달을 평가하기 위해, 성체 히말라야 원숭이에게 비표지된 엑소좀 (대조군) 또는 PKH 막 염료로 표지된 엑소좀 (PKH 엑소좀)을 정맥내로 투여하였다. 원숭이의 간과 췌장을 냉동하고 절개하여 슬라이드 상에 장착하였다. 핵을 명확하기 보기 위해 DAPI로 대비 염색시킨 상기 절개물을 현미경으로 관찰한 결과, 간과 췌장에서 엑소좀들이 견실하고 특이적으로 축적되어 있음을 발견하였다 (도 2). 또한, 엑소좀과 췌장 세포핵의 공동 국소 편재화도 관찰되었다 (도 3a). 간과 췌장에 표시한 엑소좀 초점 크기, 간과 비교한 췌장에서의 세포당 큰 크기의 초점 및 높은 엑소좀 축적에 대한 정량적 분석 (도 3b).
[00144] 다양한 장기들에 대한 엑소좀 탑재물의 전달을 평가하기 위해, 두 원숭이들은 iExosome을 정맥내로 (iv), 세번째 원숭이는 iExosome를 복강내로 (ip) 투여받았다. (엑소좀 내부의) siRNA 탑재물을 성체 히말라야 원숭이에게 투여한 후 그의 정량화를 q-PCR 분석에 의해 확인하였다 (도 4).
* * *
[00145] 본원에 개시되어 청구된 모든 방법들은 본 명세서의 내용을 미루어 보면 과도한 실험없이 준비하여 실행할 수 있다. 본 발명의 조성물 및 방법을 바람직한 실시양태의 양태에서 기재하였으나, 본 발명의 개념, 사상 및 범위를 벗어나지 않으면서 본원에 기재된 방법 및 이러한 방법의 단계 또는 상기 단계들의 순서에 다양한 변화들을 적용할 수 있음은 당업계의 통상의 기술자들에게는 자명한 사항일 것이다. 보다 구체적으로, 화학적 및 생리학적으로 모두 관련이 있는 특정 제제들은, 동일하거나 유사한 결과가 달성될 수 있는 것이라면 본원에 기술된 제제들을 대신할 수 있음은 자명한 사항일 것이다. 당업계의 숙련자들에게 명백한 이러한 모든 유사한 대체물 및 변형은 첨부된 특허청구범위에 정의된 본 발명의 의미, 범위 및 개념에 속하는 것으로 간주된다.
참고문헌
하기의 참고문헌들은, 본 명세서에 기재된 예시적인 절차 또는 기타 세부적인 내용을 제공하는 하는 범위 내에서, 본원에 참고로 인용된다.
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005
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Claims (45)

  1. 우성적 음성 종양 억제자 돌연변이 또는 종양에 의한 기능 획득성 종양 억제자 돌연변이를 불활성화시키는 치료제 탑재물을 포함하는 지질계 나노입자를 포함하는 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 지질계 나노입자가 그 표면에 CD47을 포함하는 것인, 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 지질계 나노입자가 그 표면에 성장 인자를 포함하는 것인, 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 지질계 나노입자가 리포좀 또는 엑소좀인 것인, 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 치료제 탑재물이 치료용 단백질, 항체, 억제성 RNA, 유전자 편집 시스템 또는 저분자 의약품인 것인, 조성물.
  6. 제5항에 있어서, 상기 치료용 단백질이 종양에 의한 기능 획득성 종양 억제자 돌연변이의 우성적 음성 형태에 해당하는 것인, 조성물.
  7. 제5항에 있어서, 상기 항체가 세포내 항원에 결합하는 것인, 조성물.
  8. 제5항에 있어서, 상기 항체가 전장 항체, scFv, Fab 단편, (Fab)2, 이원항체, 삼원항체 또는 미니항체인 것인, 조성물.
  9. 제5항에 있어서, 상기 억제성 RNA가 siRNA, shRNA, miRNA 또는 pre-miRNA인 것인, 조성물.
  10. 제9항에 있어서, 상기 siRNA가 우성적 음성 종양 억제자 돌연변이 또는 종양에 의한 기능 획득성 억제제 돌연변이의 발현을 녹다운시키는 것인, 조성물.
  11. 제9항에 있어서, 상기 유전체 편집 시스템이 CRISPR 시스템인 것인, 조성물.
  12. 제11항에 있어서, 상기 CRISPR 시스템이 엔도뉴클레아제 및 가이드 RNA (gRNA)를 포함하는 것인, 조성물.
  13. 제12항에 있어서, 상기 엔도뉴클레아제 및 gRNA가 엑소좀 내의 하나의 핵산 분자 상에 암호화되는 것인, 조성물.
  14. 제11항에 있어서, 상기 CRISPR 시스템이 종양성 돌연변이를 표적으로 삼는 것인, 조성물.
  15. 제14항에 있어서, 상기 우성적 음성 종양 억제자 돌연변이 또는 종양에 의한 기능 획득성 종양 억제자 돌연변이가 하나 이상의 점 돌연변이인 것인, 조성물.
  16. 제1항에 있어서, 상기 종양 억제자가 ACVR1B, APC, ARID1B, ARID2, ASXL1, ATM, ATRX, AXIN1, B2M, BAP1, BCOR, BLU (Beta*), BRCA1, BRCA2, CACNA2D2 (Gene 26), CASP8, C-CAM, CDKN1A (p21), CDKN1B (p27), CDKN1C (p57), CDKN2A (p16), CDKN2D (p19), CEBPA, CFTR, CIC, CHK2, CREBBP, CTS-1, CYB561D2, CYLD, DAXX, DCC, DPC4, EP300, FAM123B, FCC, FUBP1, FUS1, GATA1, GATA3, HIN-1, HNF1A, HYAL1 (Luca-10), HYAL2 (Luca-2), KDM5C, KDM6A, KRAS, KRAS2b, MADR2/JV18, MAP3K1, MCC, MEN1, MEN2, MLH1, MLL2, MLL3, MMAC1, MSH2, MSH6, MTS1, NCOR1, NF1, NF2, NOTCH1, NOTCH2, NPM1, NPRL2 (Gene 21), PAX5, PBRM1, PHF6, PIK3R1, PL6, PLAGL1, PRDM1, PTCH1, PTEN, RASSF1 (123F2), RB1, RNF43, RUNX1, SCGB1A1, SEMA3A, SETD2, Skp2, SMAD2, SMAD4, SMARCA4, SMARCB1, SOCS1, SOX9, STAG2, STK11, TET2, TNPAIP3, TP53, TP73, TRAF7, TSC1, VHL, WRN, WT1 또는 WWOX인 것인, 조성물.
  17. 제1항에 있어서, 상기 종양 억제자가 TP53인 것인, 조성물.
  18. 제17항에 있어서, 상기 종양에 의한 기능 획득성 종양 억제자 돌연변이가 TP53R273H인 것인, 조성물.
  19. 제18항에 있어서, 상기 치료제가 서열번호 1을 갖는 siRNA인 것인, 조성물.
  20. 제1항에 있어서, 상기 종양 억제자가 KRAS인 것인, 조성물.
  21. 제20항에 있어서, 상기 종양에 의한 기능 획득성 종양 억제자 돌연변이가 KRASG12D인 것인, 조성물.
  22. 제21항에 있어서, 상기 치료제가 서열번호 2를 갖는 siRNA인 것인, 조성물.
  23. 제1항에 있어서, 서열번호 1의 서열을 갖는 siRNA를 포함하는 제1 지질계 나노입자 및 서열번호 2의 서열을 갖는 siRNA를 포함하는 제2 지질계 나노입자를 포함하는 것인, 조성물.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항의 지질계 나노입자 및 부형제를 포함하는 약제학적 조성물.
  25. 제24항에 있어서, 비경구 투여용으로 제형화되는, 조성물.
  26. 제25항에 있어서, 정맥내, 근육내, 피하 또는 복강내 주사용으로 제형화되는, 조성물.
  27. 제25항에 있어서, 항균제를 추가로 포함하는, 조성물.
  28. 제27항에 있어서, 상기 항균제가 염화벤잘코늄, 염화벤제토늄, 벤질알코올, 브로노폴, 세트리미드, 염화세틸피리디늄, 클로르헥시딘, 클로로부탄올, 클로로크레졸, 클로록실레놀, 크레졸, 에틸알코올, 글리세린, 헥세티딘, 이미드우레아, 페놀, 페녹시에탄올, 페닐에틸알코올, 페닐질산수은, 프로필렌 글리콜 또는 티메로살인 것인, 조성물.
  29. 제24항 내지 제28항 중 어느 한 항의 조성물을 암의 치료를 필요로 하는 환자에게 투여함으로써 상기 환자의 암을 치료하는 단계를 포함하는, 환자의 암을 치료하는 방법.
  30. 제29항에 있어서, 투여에 의해 치료제 탑재물을 환자의 암 세포에 전달하는 것인, 방법.
  31. 제29항에 있어서, 상기 암이 유방암, 폐암, 두경부암, 전립선암, 식도암, 기관지암, 뇌암, 간암, 방광암, 위암, 췌장암, 난소암, 자궁암, 자궁경부암, 고환암, 결장암, 직장암 또는 피부암인 것인, 방법.
  32. 제31항에 있어서, 상기 췌장암이 췌장관 암종인 것인, 방법.
  33. 제29항에 있어서, 상기 암이 전이성인 것인, 방법.
  34. 제29항에 있어서, 상기 암이 종양에 의한 기능 획득성 종양 억제자 돌연변이에 대해 동형 접합성인 것인, 방법.
  35. 제29항에 있어서, 상기 암세포가 종양에 의한 기능 획득성 종양 억제자 돌연변이에 대해 이형 접합성인 것인, 방법.
  36. 제29항에 있어서, 상기 암세포가 우성적 음성 종양 억제자 돌연변이에 대해 동형 접합성인 것인, 방법.
  37. 제29항에 있어서, 상기 투여가 전신 투여인 것인, 방법.
  38. 제37항에 있어서, 상기 전신 투여가 정맥내 투여인 것인, 방법.
  39. 제29항에 있어서, 환자에게 적어도 제2 요법을 실시하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 방법.
  40. 제39항에 있어서, 상기 제2 요법이 수술 요법, 화학요법, 방사선 요법, 저온요법, 호르몬 요법 또는 면역요법을 포함하는 것인, 방법.
  41. 제29항에 있어서, 상기 환자가 인간인 것인, 방법.
  42. 제41항에 있어서, 상기 지질계 나노입자가 상기 환자에 대해 자가유래성인 엑소좀인 것인, 방법.
  43. 제42항에 있어서, 상기 엑소좀을 환자로부터 수득한 체액 샘플로부터 얻는 것인, 방법.
  44. 제43항에 있어서, 상기 체액 샘플이 혈액, 림프액, 타액, 소변, 뇌척수액, 골수 흡인액, 눈 삼출물/눈물 또는 혈청인 것인, 방법.
  45. 제29항에 있어서, 암 부위에 성장 인자 구배를 제공하여 엑소좀을 해당 부위로 유인해 그 부위에 치료제를 전달하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 방법.
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