CN112512507A - 使用外排体对肿瘤抑制因子的治疗性调节 - Google Patents
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Abstract
本文中提供了基于脂质的纳米粒(例如外排体)的组合物,其包含激活肿瘤抑制因子的治疗剂。还提供了使用这样的组合物来治疗患有至少部分地由肿瘤抑制活性的丧失引起的癌症的患者的方法。特别地,提供了包含靶向突变体p53的siRNA的外排体及其用于治疗癌症的方法。
Description
相关申请的引用
本申请要求于2018年4月19日提交的美国临时申请号62/659,859的优先权权益,其全部内容通过引用并入本文。
序列表的引用
本申请包含序列表,其已通过EFS-Web以ASCII格式提交,并且通过引用在此整体并入。所述ASCII副本于2019年4月9日创建,命名为UTFCP1369WO_ST25.txt且大小为0.7千字节。
背景
1.技术领域
本公开内容一般地涉及医学和肿瘤学领域。更特别地,其涉及通过施用携带载物(cargo)的外排体以激活野生型肿瘤抑制因子和/或抑制肿瘤抑制因子的致癌性功能获得性(gain-of-function)突变体来治疗癌症的组合物和方法。
2.背景技术
p53是肿瘤抑制因子并且在数种不同类型的癌症中是突变或缺失的。数项不同的研究已示出p53基因中的突变有助于癌症进展和转移。已示出突变体p53在许多不同类型癌症(包括胰腺癌和乳腺癌)中的中心功能作用。尽管p53在癌症生物学中有这样的中心作用,但目前尚不存在抑制突变体p53的药物。我们使用外排体开发了新的方法来特异性抑制突变体p53。
包括外排体的胞外囊泡(extracellular vesicle,EV)是纳米尺寸的胞间通讯载体,其参与数种生理过程并含有DNA、RNA和蛋白质。外排体显示出进入其他细胞的能力并且可潜在地将治疗剂递送到癌细胞中。
发明概述
因此,本文中提供了使用外排体特异性地激活肿瘤抑制因子(例如p53)的组合物和方法。
在一个实施方案中,提供了组合物,其包含基于脂质的纳米粒,所述基于脂质的纳米粒包含使显性负肿瘤抑制因子突变体(dominant negative tumor suppressor mutant)或致癌性功能获得性肿瘤抑制因子突变体(oncogenic gain-of-function suppressormutant)失活的治疗剂载物。在一些方面中,基于脂质的纳米粒在其表面上包含CD47。在一些方面中,基于脂质的纳米粒在其表面上包含生长因子。在一些方面中,基于脂质的纳米粒是脂质体或外排体。
在一些方面中,治疗剂载物是治疗性蛋白质、抗体、抑制性RNA、基因编辑***或小分子药物。在某些方面中,治疗性蛋白质对应于致癌性功能获得性肿瘤抑制因子突变体的显性负形式。在某些方面中,抗体结合胞内抗原。在某些方面中,抗体是全长抗体、scFv、Fab片段、(Fab)2、双链抗体(diabody)、三链抗体(triabody)或微抗体(minibody)。在某些方面中,抑制性RNA是siRNA、shRNA、miRNA或前miRNA(pre-miRNA)。在某些方面中,siRNA敲低显性负肿瘤抑制因子突变体或致癌性功能获得性肿瘤抑制因子突变体的表达。在某些方面中,基因编辑***是CRISPR***。在某些方面中,CRISPR***包含内切核酸酶和指导RNA(gRNA)。在某些方面中,内切核酸酶和gRNA在外排体内的单个核酸分子上编码。在某些方面中,CRISPR***靶向致癌突变。在某些方面中,显性负肿瘤抑制因子突变体或致癌性功能获得性肿瘤抑制因子突变体是一个或更多个点突变。
在一些方面中,肿瘤抑制因子是ACVR1B、APC、ARID1B、ARID2、ASXL1、ATM、ATRX、AXIN1、B2M、BAP1、BCOR、BLU(β*)、BRCA1、BRCA2、CACNA2D2(基因26)、CASP8、C-CAM、CDKN1A(p21)、CDKN1B(p27)、CDKN1C(p57)、CDKN2A(p16)、CDKN2D(p19)、CEBPA、CFTR、CIC、CHK2、CREBBP、CTS-1、CYB561D2、CYLD、DAXX、DCC、DPC4、EP300、FAM123B、FCC、FUBP1、FUS1、GATA1、GATA3、HIN-1、HNF1A、HYAL1(Luca-10、HYAL2(Luca-2)、KDM5C、KDM6A、KRAS、KRAS2b、MADR2/JV18、MAP3K1、MCC、MEN1、MEN2、MLH1、MLL2、MLL3、MMAC1、MSH2、MSH6、MTS1、NCOR1、NF1、NF2、NOTCHl、NOTCH2、NPM1、NPRL2(基因21)、PAX5、PBRM1、PHF6、PIK3R1、PL6、PLAGL1、PRUM1、PTCH1、PTEN、RASSFl(123F2)、RB1、RNF43、RUNX1、SCGB1A1、SEMA3A、SETD2、Skp2、SMAD2、SMAD4、SMARCA4、SMARCB1、SOCS1、SOX9、STAG2、STK11、TET2、TNPAIP3、TP53、TP73、TRAF7、TSC1、VHL、WRN、WT1或WWOX。
在一些方面中,肿瘤抑制因子是TP53。在某些方面中,致癌性功能获得性肿瘤抑制因子突变体是TP53R273H。在某些方面中,治疗剂是siRNA,其中所述siRNA具有SEQ ID NO:1的序列。
在一些方面中,肿瘤抑制因子是KRAS。在某些方面中,致癌性功能获得性肿瘤抑制因子突变体是KRASG12D。在某些方面中,治疗剂是siRNA,其中所述siRNA具有SEQ ID NO:2的序列。
在一些方面中,组合物包含第一基于脂质的纳米粒和第二基于脂质的纳米粒,所述第一基于脂质的纳米粒包含具有SEQ ID NO:1序列的siRNA,所述第二基于脂质的纳米粒包含具有SEQ ID NO:2序列的siRNA。
在一个实施方案中,提供了包含本发明实施方案中任一个的基于脂质的纳米粒的药物组合物。在一些方面中,组合物配制成用于肠胃外施用。在一些方面中,组合物配制成用于静脉内、肌内、皮下或腹膜内注射。在一些方面中,组合物还包含抗微生物剂。在某些方面中,抗微生物剂是苯扎氯铵、苄索氯铵、苄醇、布罗波尔(bronopol)、西曲溴铵(centrimide)、西吡氯铵(cetylpyridinium chloride)、氯己定、氯丁醇、氯甲酚、氯二甲酚、甲酚、乙醇、甘油、海克替啶(exetidine)、咪唑烷脲(imidurea)、苯酚、苯氧乙醇、苯乙醇、硝酸苯汞、丙二醇或硫柳汞。
在一个实施方案中,提供了在有此需要的患者中治疗癌症的方法,其包括向患者施用本发明实施方案中任一个的组合物,从而在患者中治疗癌症。在一些实施方案中,施用导致治疗剂载物向患者中的癌细胞的递送。在一些方面中,癌症是乳腺癌、肺癌、头颈癌、***癌、食管癌、气管癌、脑癌、肝癌、膀胱癌、胃癌、胰腺癌、卵巢癌、子宫癌、***、睾丸癌、结肠癌、直肠癌或皮肤癌。在某些方面中,胰腺癌是胰腺导管腺癌。
在一些方面中,癌症是转移性的。在一些方面中,癌症对于致癌性功能获得性肿瘤抑制因子突变体是纯合的。在一些方面中,癌细胞对于致癌性功能获得性肿瘤抑制因子突变体是杂合的。在一些方面中,癌细胞对于显性负肿瘤抑制因子突变体是纯合的。在一些方面中,施用是全身性施用。在某些方面中,全身性施用是静脉内施用。
在一些方面中,所述方法还包括向患者至少施用第二治疗。在某些方面中,第二治疗包括手术治疗、化学治疗、放射治疗、冷冻治疗、激素治疗或免疫治疗。在一些方面中,患者是人。在某些方面中,基于脂质的纳米粒是外排体,其中外排体对于患者是自体的。在某些方面中,外排体获自从患者获得的体液样品。在某些方面中,体液样品是血液、淋巴、唾液、尿、脑脊液、骨髓抽吸物、眼渗出物/泪、或血清。在一些方面中,所述方法还包括在癌症的部位处提供生长因子梯度以将外排体吸引至该部位并将治疗剂递送至该部位。
本文中使用的就指定组分而言的“基本上不含”在本文中用于意指没有指定组分被有目的地配制成组合物和/或仅作为污染物或以痕量存在。因此,由组合物的任何非预期的污染导致的指定组分的总量远低于0.05%,优选低于0.01%。最优选的是其中用标准分析方法不能检测到指定组分的量的组合物。
如本文在说明书中所使用的,没有数量词修饰的名词可意指一个/种或更多个/种。如本文在权利要求书中所使用的,当与词语“包含/包括”结合使用时,没有数量词修饰的名词可意指一个/种或多于一个/种。
除非明确指出仅指代替代方案或替代方案是互相排斥的,否则在权利要求书中术语“或/或者”的使用用于意指“和/或”,尽管本公开内容支持仅指代替代方案和“和/或”的限定。本文中使用的“另外的”可意指至少第二或更多。
在本申请通篇,术语“约”用于表示这样的值,其包括用于确定该值之采用的装置、方法的误差的固有变化,或者存在于研究对象之间的变化。
从以下详细描述中,本发明的其他目标、特征和优点将变得明显。然而,应理解,虽然详细描述和具体实例指示了本发明的一些优选实施方案,但是其仅以举例说明的方式给出,因为根据该详细描述,本发明的精神和范围内的多种改变和修改对于本领域技术人员而言将变得明显。
附图简述
以下附图构成本说明书的一部分,并且被包括在内以进一步说明本发明的某些方面。通过结合本文中给出的具体实施方案的详细描述来参考这些附图中的一个或更多个可更好地理解本发明。
图1A至1C.图1A-用靶向TP53R273H的siRNA处理之后Panc-1细胞中TP53的表达。Panc-1细胞系对于TP53R273H是纯合突变体。*p<0.05。图1B至1C-对裸鼠原位注射Panc-1GFP/Luc细胞。通过IVIS成像监测肿瘤生长,并将其以总通量(p/s)表示。将小鼠用对照外排体(CE)、包含抑制TP53R273H的siRNA的iExosome(P53 iexo)、或靶向KrasG12D的iExosome和靶向TP53R273H的iExosome二者的组合(P53 iexo和kras iexo)进行i.p.处理。处理之前,所有小鼠均患有肿瘤(图1B)。处理之后和疾病进展期间(图1C),针对TP53R273H的iexo和组合处理降低了肿瘤负荷。
图2.对成年恒河猴(rhesus macaque)静脉内施用未经标记的外排体(对照)或用PKH膜染料标记的外排体(PKH外排体)。将猴的肝和胰腺冷冻并切片并封固在载片上。为定义细胞核而用DAPI复染的切片的显微镜评价显示了外排体在肝和胰腺中稳健且特异性的积聚。
图3A至3B.图3A-对成年恒河猴静脉内施用未经标记的外排体(对照)或用PKH膜染料标记的外排体(PKH外排体)。将猴的肝和胰腺冷冻并切片并封固在载片上。为定义细胞核而用DAPI复染的切片的显微镜评价显示了使用共聚焦显微镜,外排体与胰腺细胞核的共定位以及外排体在肝和胰腺中稳健且特异性的积聚。图3B-在肝和胰腺中注释的外排体病灶尺寸的定量分析,并且与肝相比胰腺中每个细胞的外排体具有大尺寸的病灶以及更高的积聚。
图4.在成年恒河猴中所列的器官中施用之后并通过q-PCR分析确定的siRNA载荷(在外排体内)的定量。两只猴静脉内(iv)接受iExosome,并且第三只猴腹膜内(ip)接受iExosome。“0”表示未检测到siRNA。
发明详述
负载有对致癌性p53突变体具有特异性的siRNA的外排体在患有胰腺肿瘤的小鼠中减弱肿瘤生长。这种减弱通过负载有对致癌性p53突变体具有特异性的siRNA的外排体与负载有对致癌性Kras突变体具有特异性的siRNA的外排体的组合而得到甚至进一步增强。因此,本文中提供了靶向癌细胞中的肿瘤抑制因子中的致癌性突变(例如p53和/或Kras)以及肿瘤抑制因子中的显性负突变的方法。
I.基于脂质的纳米粒
在一些实施方案中,基于脂质的纳米粒是脂质体、外排体、脂质制品或另外的基于脂质的纳米粒,例如基于脂质的囊泡(例如,DOTAP:胆固醇囊泡)。基于脂质的纳米粒可以是带正电荷、带负电荷或中性的。基于脂质的纳米粒可包含必要的组分以允许转录和翻译、信号转导、趋化性或其他细胞功能。
在一些实施方案中,基于脂质的纳米粒在其表面上包含CD47。CD47(整合素相关蛋白)是在大多数组织和细胞上表达的跨膜蛋白。CD47是信号调节蛋白α(Signal RegulatoryProtein Alpha,SIRP-α)的配体,其在吞噬细胞(例如巨噬细胞和树突细胞)上表达。活化的CD47-SIRP-α启动抑制吞噬作用的信号转导级联反应。因此,不受理论的束缚,外排体表面上的CD47的表达可阻止通过巨噬细胞的吞噬作用(参见WO 2016/201323,其通过引用整体并入本文)。
A.脂质体
“脂质体”是通用术语,包括通过产生封闭的脂双层或脂质聚集体形成的多种单层和多层脂质载体。脂质体可表征为具有囊泡结构,所述囊泡结构具有通常包含磷脂的双层膜,和通常包含水性组合物的内部介质。本文中提供的脂质体包括单层脂质体、多层脂质体和多囊脂质体。本文中提供的脂质体可带正电荷、带负电荷或带中性电荷。在某些实施方案中,脂质体是电荷中性的。
多层脂质体具有由水性介质分隔的多个脂质层。这样的脂质体在包含磷脂的脂质悬浮在过量的水溶液中时自发形成。脂质组分在形成封闭结构之前经历自身重排并包载脂双层之间的水和溶解的溶质。亲脂性分子或具有亲脂性区域的分子也可溶解在脂双层中或与脂双层缔合。
在一些具体方面中,多肽、核酸或小分子药物可例如包封在脂质体的水性内部、散布在脂质体的脂双层内、通过与脂质体和多肽/核酸二者缔合的连接分子与脂质体连接、包埋在脂质体中、与脂质体复合等。
如本领域普通技术人员已知的,根据本发明实施方案使用的脂质体可通过不同方法制备。例如,将磷脂,例如如中性磷脂二油酰基磷脂酰胆碱(dioleoylphosphatidylcholine,DOPC)溶解在叔丁醇中。然后将脂质与多肽、核酸和/或其他组分混合。将吐温20添加至脂质混合物,以使得吐温20为组合物重量的约5%。向该混合物添加过量的叔丁醇,以使得叔丁醇的体积为至少95%。涡旋混合物,在干冰/丙酮浴中冷冻并冻干过夜。冻干制剂被储存在-20℃下,并可使用长至三个月。当需要时,将冻干脂质体在0.9%盐水中重构。
或者,脂质体可通过将脂质在容器(例如玻璃、梨形烧瓶)中的溶剂中混合来制备。容器的体积应比预期的脂质体混悬液的体积大十倍。使用旋转蒸发器,在负压下在约40℃下去除溶剂。溶剂通常在约5分钟至2小时内去除,这取决于所期望的脂质体体积。组合物可在真空下的干燥器中进一步干燥。干燥的脂质通常由于随着时间的推移趋于恶化而在约1周之后丢弃。
干燥的脂质可在无菌、无热原的水中在约25mM至50mM磷脂下通过摇动直至全部脂质膜重新悬浮而水合。然后可将水性脂质体分成等分试样,将每个放置于小瓶中,冻干并在真空下密封。
如上所述制备的干燥脂质或冻干脂质体可脱水并在蛋白质或肽的溶液中重构,并用合适的溶剂(例如DPBS)稀释至合适的浓度。然后将混合物在涡旋混合器中剧烈摇动。通过在29,000×g下离心去除未包封的另外的材料(例如包括但不限于激素、药物、核酸构建体等的试剂),并洗涤脂质体颗粒。将经洗涤的脂质体以合适的总磷脂浓度重新悬浮,例如约50mM至200mM。包封的另外的材料或活性剂的量可根据标准方法确定。在确定包封在脂质体制剂中的另外的材料或活性剂的量之后,可将脂质体稀释至合适的浓度并储存在4℃下直至使用。包含脂质体的药物组合物将通常包含无菌的可药用载体或稀释剂,例如水或盐水溶液。
可与本发明实施方案一起使用的其他脂质体包括阳离子脂质体,例如,如WO02/100435A1、美国专利5,962,016、美国申请2004/0208921、WO03/015757A1、WO04/029213A2、美国专利5,030,453和美国专利6,680,068中所述,其全部均在没有声明放弃(disclaimer)的情况下通过引用在此整体并入。
在制备这样的脂质体中,可使用本文中所述的,或者如本领域普通技术人员已知的任何方案。制备脂质体的另外的非限制性实例描述于美国专利4,728,578、4,728,575、4,737,323、4,533,254、4,162,282、4,310,505和4,921,706;国际申请PCT/US85/01161和PCT/US89/05040中,其各自通过引用并入本文。
在某些实施方案中,基于脂质的纳米粒是中性脂质体(例如,DOPC脂质体)。本文中使用的“中性脂质体”或“不带电荷的脂质体”被限定为具有一种或更多种脂质组分的脂质体,所述脂质组分产生基本上中性的净电荷(基本上不带电荷)。“基本上中性”或“基本上不带电荷”意指给定群体(例如,脂质体群体)中的少数(如果有的话)脂质组分包含未被另一组分的相反电荷消除的电荷(即,少于10%的组分包含未消除的电荷,更优选少于5%,且最优选少于1%)。在某些实施方案中,中性脂质体可主要包含在生理条件下(即,在约pH 7下)本身是中性的脂质和/或磷脂。
本发明实施方案的脂质体和/或基于脂质的纳米粒可包含磷脂。在某些实施方案中,单种磷脂可用于产生脂质体(例如,中性磷脂(例如DOPC),可用于产生中性脂质体)。在另一些实施方案中,可使用多于一种的磷脂来产生脂质体。磷脂可来自天然或合成来源。磷脂包括,例如,磷脂酰胆碱、磷脂酰甘油和磷脂酰乙醇胺;因为磷脂酰乙醇胺和磷脂酰胆碱在生理条件下(即,在约pH 7下)是不带电荷的,所以这些化合物可特别用于产生中性脂质体。在某些实施方案中,磷脂DOPC用于产生不带电荷的脂质体。在某些实施方案中,可使用非磷脂(例如,胆固醇)的脂质。
磷脂包括甘油磷脂和某些鞘脂。磷脂包括但不限于二油酰基磷脂酰胆碱(“DOPC”)、卵磷脂酰胆碱(“EPC”)、二月桂酰基磷脂酰胆碱(“DLPC”)、二豆蔻酰基磷脂酰胆碱(“DMPC”)、二棕榈酰基磷脂酰胆碱(“DPPC”)、二硬脂酰基磷脂酰胆碱(“DSPC”)、1-豆蔻酰基-2-棕榈酰基磷脂酰胆碱(“MPPC”)、1-棕榈酰基-2-豆蔻酰基磷脂酰胆碱(“PMPC”)、1-棕榈酰基-2-硬脂酰基磷脂酰胆碱(“PSPC”)、1-硬脂酰基-2-棕榈酰基磷脂酰胆碱(“SPPC”)、二月桂酰基磷脂酰甘油(“DLPG”)、二豆蔻酰基磷脂酰甘油(“DMPG”)、二棕榈酰基磷脂酰甘油(“DPPG”)、二硬脂酰基磷脂酰甘油(“DSPG”)、二硬脂酰基鞘磷脂(“DSSP”)、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(“DSPE”)、二油酰基磷脂酰甘油(“DOPG”)、二豆蔻酰基磷脂酸(“DMPA”)、二棕榈酰基磷脂酸(“DPPA”)、二豆蔻酰基磷脂酰乙醇胺(“DMPE”)、二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺(“DPPE”)、二豆蔻酰基磷脂酰丝氨酸(“DMPS”)、二棕榈酰基磷脂酰丝氨酸(“DPPS”)、脑磷脂酰丝氨酸(“BPS”)、脑鞘磷脂(“BSP”)、二棕榈酰基鞘磷脂(“DPSP”)、二豆蔻酰基磷脂酰胆碱(“DMPC”)、1,2-二硬脂酰-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(“DAPC”)、1,2-二花生酰-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(“DBPC”)、1,2-二十二碳烯酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(“DEPC”)、二油酰基磷脂酰乙醇胺(“DOPE”)、棕榈酰氧基磷脂酰胆碱(“POPC”)、棕榈酰氧基磷脂酰乙醇胺(“POPE”)、溶血磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰乙醇胺和二亚油酰基磷脂酰胆碱。
B.外排体
本文中使用的术语“微囊泡”和“外排体”是指直径(或当颗粒不是球形时的最大尺寸)为约10nm至约5000nm,更通常30nm至1000nm,并且最通常约50nm至750nm的膜性颗粒,其中外排体膜的至少一部分直接从细胞获得。最常见的是,外排体的尺寸(平均直径)达到供体细胞尺寸的5%。因此,特别考虑的外排体包括从细胞脱落的外排体。
外排体可在任何合适的样品类型例如如体液中被检测到或从其中分离。本文中使用的术语“分离的”是指从其天然环境中分离出来,并且意指包括至少部分纯化,并且可包括大量纯化。本文中使用的术语“样品”是指适合于本发明提供的方法的任何样品。所述样品可以是包含适合于检测或分离的外排体的任何样品。样品的来源包括血液、骨髓、胸膜液、腹膜液、脑脊液、尿、唾液、羊水、恶性腹水、支气管肺泡灌洗液、滑液、乳汁、汗、泪、关节液和支气管清洗液(bronchial wash)。在一个方面中,样品是血液样品,包括例如全血或其任何级分或组分。适用于本发明的血液样品可从已知的任何来源(包括血细胞或其组分,例如静脉的、动脉的、外周的、组织、带,等)提取。例如,可使用公知和常规的临床方法(例如,用于抽取和处理全血的方法)获得和处理样品。在一个方面中,示例性样品可以是从患有癌症的对象抽取的外周血。
外排体还可从组织样品,例如手术样品、活检样品、组织、粪便和培养的细胞中分离。当从组织来源分离外排体时,可需要使组织均质化以获得单细胞悬液,然后裂解细胞以释放外排体。当从组织样品中分离外排体时,选择不导致外排体破坏的均质化和裂解方法是重要的。本文中考虑的外排体优选从在生理上可接受的溶液例如缓冲盐水、生长培养基、多种水性培养基等中的体液中分离。
可从新鲜收集的样品或从已冷冻或冷藏储存的样品中分离外排体。在一些实施方案中,外排体可从细胞培养基中分离。尽管不是必需的,但如果在用体积排除聚合物进行沉淀之前澄清流体样品以除去来自样品的任何碎屑,则可获得更高纯度的外排体。澄清方法包括离心、超速离心、过滤或超滤。最典型地,外排体可通过本领域公知的多种方法分离。一种优选的方法是从体液或细胞培养上清液中进行差速离心。分离外排体的示例性方法描述于(Losche et al.,2004;Mesri and Altieri,1998;Morel et al.,2004)中。或者,外排体也可如(Combes et al.,1997)中所述通过流式细胞术分离。
用于分离外排体的一种被接受的方案包括超速离心,其通常与蔗糖密度梯度或蔗糖垫层(cushion)结合以使相对低密度的外排体漂浮。由于与其他微囊泡或大分子复合物尺寸分布重叠的可能性,通过连续差速离心分离外排体是复杂的。此外,离心可无法提供足够的方式来根据囊泡的尺寸分离囊泡。然而,连续离心当与蔗糖梯度超速离心结合时,可提供高的外排体富集。
使用超速离心途径的替代物,基于尺寸分离外排体是另一种选择。已报道了使用超滤方法成功纯化外排体,所述超滤方法比超速离心耗时少,并且不需要使用特殊设备。类似地,可获得商业试剂盒(EXOMIRTM,Bioo Scientific),其允许在一个微滤器上去除细胞、血小板和细胞碎片,并使用正压驱动流体在第二微滤器上捕获大于30nm的囊泡。但是,对于该过程,外排体未被回收,其RNA含量直接从在第二微滤器上捕获的物质中提取,随后可用于PCR分析。基于HPLC的方案可潜在地使得人们能够获得高纯度的外排体,尽管这些方法需要专用设备且难以扩大规模。一个重要的问题是血液和细胞培养基二者均包含大量与外排体尺寸范围相同的纳米粒(一些非囊泡)。例如,一些miRNA可包含在胞外蛋白质复合物中,而不是外排体中;然而,可进行蛋白酶(例如蛋白酶K)处理以消除“外排体”蛋白质的任何可能的污染。
在另一个实施方案中,可通过通常用于富集外排体样品的技术,例如涉及免疫特异性相互作用的技术(例如免疫磁捕获)来捕获癌细胞来源的外排体。免疫磁捕获,也称为免疫磁细胞分离,通常涉及将针对特定细胞类型上发现的蛋白质的抗体附着于小的顺磁性珠上。当抗体包被的珠与样品(例如血液)混合时,它们附着于并包围特定的细胞。然后将样品置于强磁场中,使得珠沉淀至一侧。在去除血液之后,捕获的细胞与珠一起保留。该通用方法的许多变型形式在本领域中是公知的,并且适用于分离外排体。在一个实例中,外排体可附着于磁珠(例如,醛/硫酸盐珠),并随后将抗体添加至混合物以识别附着于珠的外排体表面上的表位。已知在癌细胞来源的外排体上发现的示例性蛋白质包括ATP结合盒亚家族A成员6(ABCA6)、四次穿膜蛋白-4(TSPAN4)、SLIT和NTRK样蛋白4(SLITRK4)、推定的原钙黏着蛋白β-18(PCDHB18)、髓样细胞表面抗原CD33(CD33)和磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1(GPC1)。癌细胞来源的外排体可使用例如针对这些蛋白质的一种或更多种的抗体或适配体来分离。
本文中使用的分析包括允许直接或间接观察外排体的任何方法,并且可以是体内的或离体的。例如,分析可包括但不限于:与固体基底结合的外排体的离体显微镜或细胞计数检测和可视化、流式细胞术、荧光成像等。在一个示例性方面中,癌细胞来源的外排体使用针对以下的一种或更多种的抗体来检测并随后与固体基底结合和/或使用显微镜或细胞计数检测来可视化:ATP结合盒亚家族A成员6(ABCA6)、四次穿膜蛋白-4(TSPAN4)、SLIT和NTRK-样蛋白4(SLITRK4)、推定的原钙黏着蛋白β-18(PCDHB18)、髓样细胞表面抗原CD33(CD33)、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1(GPC1)、组蛋白H2A 2-A型(HIST1H2AA)、组蛋白H2A 1-A型(HIST1H1AA)、组蛋白H3.3(H3F3A)、组蛋白H3.1(HIST1H3A)、锌指蛋白37同源物(ZFP37)、层黏连蛋白亚基β-1(LAMB1)、肾小管间质性肾炎抗原样(TINAGL1)、过氧化物氧化还原酶4(PRDX4)、胶原蛋白α-2(IV)链(COL4A2)、推定的蛋白C3P1(C3P1)、Hemicentin-1(HMCN1)、推定的Rho结合蛋白-2样蛋白(RHPN2P1)、含锚蛋白重复结构域的蛋白62(ANKRD62)、含三联基序的蛋白42(TRIM42)、连接斑珠蛋白(JUP)、微管蛋白β-2B链(TUBB2B)、内切核糖核酸酶切酶(DICER1)、E3泛素蛋白连接酶TRIM71(TRIM71)、含剑蛋白p60 ATPase的亚基A样2(KATNAL2)、蛋白S100-A6(S100A6)、含5’核苷酸酶结构域的蛋白3(NT5DC3)、缬氨酸-tRNA连接酶(VARS)、Kazrin(KAZN)、ELAV样蛋白4(ELAVL4)、环指蛋白166(RNF166)、含FERM和PDZ结构域的蛋白1(FRMPD1)、78kDa的葡萄糖调节蛋白(HSPA5)、运输蛋白颗粒复合物亚基6A(TRAPPC6A)、鲨烯单加氧酶(SQLE)、肿瘤易感基因101蛋白(TSG101)、膜泡分拣蛋白28同源物(VPS28)、***素F2受体负调节子(PTGFRN)、异丁酰基辅酶A脱氢酶、线粒体的(ACAD8)、26S蛋白酶调节亚基6B(PSMC4)、延伸因子1-γ(EEF1G)、肌巨蛋白(TTN)、酪氨酸蛋白磷酸酶13型(PTPN13)、丙糖磷酸异构酶(TPI1)或羧肽酶E(CPE)。
应注意,并非在细胞中表达的所有蛋白质均在由该细胞分泌的外排体中被发现。例如,钙连蛋白、GM130和LAMP-2都是在MCF-7细胞中表达但未在由MCF-7细胞分泌的外排体中被发现的蛋白质(Baietti et al.,2012)。作为另一个实例,一项研究发现,190/190胰腺导管腺癌患者具有比健康对照更高的GPC1+外排体水平(Melo et al.,2015,其通过引用整体并入本文)。值得注意的是,平均仅2.3%的健康对照具有GPC1+外排体。
1.用于从细胞培养物中收集外排体的示例性方案
在第1天,在T225烧瓶中在含有10%FBS的培养基中接种足够的细胞(例如,约500万个细胞)以使得在第二天细胞为约70%汇合(confluent)。在第2天,吸出细胞上的培养基,用PBS将细胞洗涤两次,并随后向细胞添加25至30mL基本培养基(即,无PenStrep或FBS)。将细胞孵育24至48小时。优选48小时孵育,但是一些细胞系对无血清培养基更敏感,并因此孵育时间应减少到24小时。请注意,FBS包含将严重影响(skew)NanoSight结果的外排体。
在第3/4天,收集培养基并在室温下以800×g离心5分钟以使死细胞和大碎片沉淀。将上清液转移至新的锥形管,并将培养基以2000×g再次离心10分钟以去除其他大碎片和大囊泡。使培养基通过0.2μm过滤器,并随后将其等分至超速离心管(例如25×89mmBeckman Ultra-Clear),每管使用35mL。如果每个管的培养基体积小于35mL,则用PBS填充管的其余部分以达到35mL。使用SW 32 Ti转子(k因子266.7,RCF最大133,907)在4℃下以28,000rpm将培养基超速离心2至4小时。小心吸出上清液,直至剩余约1英寸的液体。将管倾斜,并且允许剩余的培养基缓慢进入抽吸液管。如果期望的话,可将外排体沉淀重悬于PBS中,并于28,000rpm下超速离心,重复1至2小时,以进一步纯化外排体群体。
最后,将外排体沉淀重悬于210μL PBS中。如果每个样品存在多个超速离心管,则使用相同的210μL PBS连续重悬每个外排体沉淀。对于每个样品,取10μL,并且将其添加至990μL H2O,以用于纳米粒追踪分析。将剩余的200μL含外排体的混悬液用于下游过程,或立即储存在-80℃下。
2.用于从血清样品中提取外排体的示例性方案
首先,使血清样品在冰上解冻。然后,将250μL的无细胞血清样品在11mL PBS中进行稀释;通过0.2μm孔过滤器进行过滤。将经稀释的样品在4℃下以150,000×g超速离心过夜。第二天,小心弃去上清液,并在11mL PBS中洗涤外排体沉淀。在4℃下以150,000×g进行第二轮的超速离心,持续2小时。最后,小心弃去上清液,并将外排体沉淀重悬于100μL PBS中以进行分析。
C.用于外排体和脂质体的电穿孔的示例性方案
将1×108个外排体(通过NanoSight分析测量)或100nm脂质体(例如,从EncapsulaNano Sciences购买)和1μg的siRNA(Qiagen)或shRNA在400μL电穿孔缓冲液(1.15mM磷酸钾,pH 7.2,25mM氯化钾,21%Optiprep)中混合。使用4mm比色皿对外排体或脂质体进行电穿孔(参见,例如Alvarez-Erviti et al.,2011;El-Andaloussi et al.,2012)。在电穿孔之后,将外排体或脂质体用不含蛋白酶的RNAse进行处理,随后添加10×浓缩的RNase抑制剂。最后,根据超速离心方法将外排体或脂质体用PBS洗涤,如上所述。
II.疾病的治疗
本发明的某些方面提供了用表达或包含以下的治疗剂来治疗患者,所述治疗剂使癌细胞中突变体肿瘤抑制因子的致癌性功能获得性活性失活或使癌细胞中突变体肿瘤抑制因子的显性负活性失活,从而允许肿瘤抑制因子的野生型等位基因发挥作用。本文中使用的“治疗剂”是可用于治疗癌症或其他病症的原子、分子或化合物。治疗剂的一些实例包括但不限于:药物、化学治疗剂、治疗性抗体和抗体片段、毒素、放射性同位素、酶、核酸酶、激素、免疫调节剂、反义寡核苷酸、基因编辑***、螯合剂、硼化合物、光敏剂以及染料。
因为已知外排体包含DICER和活性RNA加工RISC复合物(参见PCT公布WO 2014/152622,其通过引用整体并入本文),转染到外排体中的shRNA可成熟为在外排体本身内结合RISC-复合物的siRNA。或者,成熟的siRNA本身可转染到外排体或脂质体中。因此,作为实例,抑制性RNA可用于本发明方法以调节或减弱肿瘤抑制因子(例如,ACVR1B、APC、ARID1B、ARID2、ASXL1、ATM、ATRX、AXIN1、B2M、BAP1、BCOR、BLU(β*)、BRCA1、BRCA2、CACNA2D2(基因26)、CASP8、C-CAM、CDKN1A(p21)、CDKN1B(p27)、CDKN1C(p57)、CDKN2A(p16)、CDKN2D(p19)、CEBPA、CFTR、CIC、CHK2、CREBBP、CTS-1、CYB561D2、CYLD、DAXX、DCC、DPC4、EP300、FAM123B、FCC、FUBP1、FUS1、GATA1、GATA3、HIN-1、HNF1A、HYAL1(Luca-10、HYAL2(Luca-2)、KDM5C、KDM6A、KRAS、KRAS2b、MADR2/JV18、MAP3K1、MCC、MEN1、MEN2、MLH1、MLL2、MLL3、MMAC1、MSH2、MSH6、MTS1、NCOR1、NF1、NF2、NOTCH1、NOTCH2、NPM1、NPRL2(基因21)、PAX5、PBRM1、PHF6、PIK3R1、PL6、PLAGL1、PRDM1、PTCH1、PTEN、RASSF1(123F2、)、RB1、RNF43、RUNX1、SCGB1A1、SEMA3A、SETD2、Skp2、SMAD2、SMAD4、SMARCA4、SMARCB1、SOCS1、SOX9、STAG2、STK11、TET2、TNPAIP3、TP53、TP73、TRAF7、TSC1、VHL、WRN、WT1或WWOX)的显性负突变体或致癌性功能获得性突变体(例如TP53R273H;TP53R175H;KRASG12D)。在一些情况下,sh/siRNA可设计成特异性地靶向在癌细胞中表达的基因的突变形式,同时不影响对应野生型形式的表达。实际上,如果已通过任何来源发现了任何抑制性核酸是经验证的目的蛋白质的下调剂(downregulator),则这样的抑制性核酸均可应用于本发明的组合物和方法中。
在设计RNAi时需要考虑数种因素,例如siRNA的性质、沉默作用的持久性以及递送***的选择。为了产生RNAi作用,引入到生物体中的siRNA通常会包含外显子序列。此外,RNAi过程是同源性依赖性的,因此必须仔细选择序列以使基因特异性最大化,同时使同源序列而不是基因特异性序列之间的交叉干扰可能性最小化。优选地,siRNA在siRNA的序列与待抑制基因序列之间显示出大于80%、85%、90%、95%、98%或甚至100%的同一性。与靶基因具有小于约80%同一性的序列实质上没那么有效。因此,siRNA与待抑制基因之间的同源性越大,不相关基因的表达就越不太可能会受到影响。
因为已知外排体包含完成mRNA转录和蛋白质翻译所必需的机制(参见PCT/US2014/068630,其通过引用整体并入本文),可将编码治疗性蛋白质(例如治疗性抗体)的mRNA或DNA核酸转染到外排体中。或者,可将治疗性蛋白质本身电穿孔到外排体中或直接并入脂质体中。示例性治疗蛋白质包括但不限于:肿瘤抑制蛋白、肽、突变体蛋白质的野生型蛋白质对应物、DNA修复蛋白、蛋白水解酶、蛋白质毒素(proteinaceous toxin)、可抑制胞内蛋白质活性的蛋白质、可激活胞内蛋白质活性的蛋白质、或需要重建其丧失的功能的任何蛋白质。
可期望引入到病变细胞的胞内空间的一种特定类型蛋白质是可特异性或选择性地与胞内抗原结合的抗体(例如,单克隆抗体)。这样的抗体可破坏胞内蛋白质的功能和/或破坏胞内蛋白质-蛋白质相互作用。这样的单克隆抗体的示例性靶标包括但不限于肿瘤抑制因子的致癌性功能获得性突变体。除单克隆抗体之外,还考虑了其任何抗原结合片段,例如scFv、Fab片段,Fab’、F(ab’)2、Fv、肽抗体(peptibody)、双链抗体、三链抗体或微抗体。任何这样的抗体或抗体片段均可以是糖基化的或无糖基化的(aglycosylated)。
外排体也可改造成包含基因编辑***,例如CRISPR/Cas***,其在癌细胞中校正肿瘤抑制因子的致癌性功能获得性突变体或显性负突变体。一般而言,“CRISPR***”总体上是指涉及CRISPR相关(“Cas”)基因的表达或对其活性进行指导的转录物和其他元件,包括编码Cas基因的序列、tracr(反式激活CRISPR)序列(例如,tracrRNA或活性部分tracrRNA)、tracr伴侣(tracr-mate)序列(包括“同向重复序列(direct repeat)”,以及在内源性CRISPR***背景下经tracrRNA加工的部分同向重复序列)、指导序列(在内源性CRISPR***的背景下也称为“间隔区”)和/或来自CRISPR基因座的其他序列和转录物。在一些方面中,将Cas核酸酶和gRNA(包括对靶序列具有特异性的crRNA与固定的tracrRNA的融合体)引入到细胞中。一般而言,使用互补碱基配对,gRNA的5’端处的靶位点将Cas核酸酶靶向至靶位点,例如基因。靶位点可基于其紧邻前间区序列邻近基序(protospacer adjacentmotif,PAM)序列(例如通常为NGG或NAG)的5’的位置来选择。在该方面中,通过对指导RNA的前20、19、18、17、16、15、14、14、12、11或10个核苷酸进行修饰以对应于靶DNA序列来将gRNA靶向到所期望序列。一般而言,CRISPR***的特征在于促进靶序列位点处CRISPR复合物形成的元件。通常来说,“靶序列”通常是指指导序列被设计为具有互补性的序列,其中靶序列与指导序列之间的杂交促进CRISPR复合物的形成。如果存在足够的互补性以引起杂交并促进CRISPR复合物的形成,则并非必须需要完全互补性。被改造成包含这样的***的外排体中的CRISPR***可发挥在靶细胞内编辑基因组DNA的功能,或者该***可在外排体本身内编辑DNA。涉及外排体作为基因编辑***的递送手段的用途的另一些方面,参见美国申请No.62/599,340,其通过引用整体并入本文。
除了基于蛋白质和基于核酸的治疗剂之外,外排体可用于递送单独的或与任何基于蛋白质或基于核酸的治疗剂组合的小分子药物。考虑用于本发明实施方案的示例性小分子药物包括但不限于:毒素、化学治疗剂和抑制肿瘤抑制因子的致癌性功能获得性突变体的活性的药剂。
在一些方面中,可触发外排体来经受朝向血清因子的趋化性。因此,通过提供将外排体吸引至肿瘤的生长因子梯度,可触发外排体优先在肿瘤中积聚。在涉及从外排体内的核酸表达蛋白质治疗剂的方面中,可通过刺激外排体表面上的生长因子受体(例如EGFR)来增强转录和/或翻译。涉及外排体作为微细胞以靶向递送至肿瘤组织和递送治疗剂用途的另一些方面,参见美国申请No.62/649,057,其通过引用整体并入本文。
本文中使用的术语“对象”是指对其进行主题方法的任何个体或患者。通常来说,对象是人,尽管本领域技术人员将理解,对象可以是动物。因此,另一些动物,包括哺乳动物,例如啮齿动物(包括小鼠、大鼠、仓鼠和豚鼠),猫,狗,兔,农场动物(包括牛、马、山羊、绵羊、猪等)以及灵长类(包括猴、黑猩猩、猩猩和大猩猩)均包括在对象的定义之内。
“治疗”及其变化形式是指出于获得疾病或健康相关病症的治疗益处的目的而向对象施用或应用治疗剂或者对对象进行程序或模式(modality)。例如,治疗可包括施用携带载物的外排体、化学治疗、免疫治疗或放射治疗,进行手术,或其任何组合。
本申请通篇使用的术语“治疗益处”或“治疗有效”是指对于该病症的医学治疗而言促进或增强对象的福祉的任何事物。这包括但不限于降低疾病体征或症状的频率或严重程度。例如,癌症的治疗可涉及例如降低肿瘤的侵袭力、降低癌症的生长速率或预防转移。癌症的治疗还可指延长患有癌症的对象的存活。
本文中使用的术语“癌症”可用于描述实体瘤、转移性癌症或非转移性癌症。在某些实施方案中,癌症可起源于膀胱、血液、骨、骨髓、脑、乳腺、结肠、食管、十二指肠、小肠、大肠、结肠、直肠、***、牙龈(gum)、头、肾、肝、肺、鼻咽、颈、卵巢、胰腺、***、皮肤、胃、睾丸、舌或子宫。
癌症可具体地是以下组织学类型,尽管其不限于这些:恶性肿瘤;癌;未分化的癌;巨细胞和梭形细胞癌;小细胞癌;***状癌;鳞状细胞癌;淋巴上皮癌;基底细胞癌;毛母质癌;移行细胞癌;***状移行细胞癌;腺癌;恶性胃泌素瘤;胆管癌;肝细胞癌;组合肝细胞癌和胆管癌;小梁腺癌;腺样囊性癌;腺瘤性息肉中的腺癌;腺癌,家族性结肠息肉病;实体癌;恶性类癌肿瘤;支气管肺泡腺癌;***状腺癌;嫌色细胞癌;嗜酸性癌;嗜酸性腺癌;嗜碱性粒细胞癌;透明细胞腺癌;颗粒细胞癌;滤泡状腺癌;***状和滤泡状腺癌;无包膜硬化性癌;肾上腺皮质癌;子宫内膜样癌(endometroid carcinoma);皮肤附属器癌;大汗腺腺癌;皮脂腺癌;耵聍腺癌;黏液表皮样癌;囊腺癌;***状囊腺癌;***状浆液性囊腺癌;黏液性囊腺癌;黏液腺癌;印戒细胞癌;浸润性导管癌;髓样癌;小叶癌;炎性癌;***佩吉特病(paget’s disease);腺泡细胞癌;腺鳞癌;具有鳞状化生的腺癌;恶性胸腺瘤;恶性卵巢间质肿瘤;恶性泡膜细胞瘤;恶性粒层细胞瘤;恶性男性母细胞瘤;sertoli细胞癌;恶性莱迪希细胞瘤(leydig cell tumor);恶性脂质细胞瘤;恶性神经节细胞瘤;恶性***外副神经节瘤;嗜铬细胞瘤;皮肤丝球肉瘤(glomangiosarcoma);恶性黑素瘤;无黑素性黑素瘤;浅表扩散性黑素瘤;巨大色素痣内恶性黑素瘤;上皮样细胞黑素瘤;恶性蓝痣;肉瘤;纤维肉瘤;恶性纤维组织细胞瘤;黏液肉瘤;脂肪肉瘤;平滑肌肉瘤;横纹肌肉瘤;胚胎性横纹肌肉瘤;肺泡横纹肌肉瘤;间质肉瘤;恶性混合瘤;苗勒管混合瘤(mullerian mixed tumor);肾胚细胞瘤;肝母细胞瘤;癌肉瘤;恶性间叶瘤;恶性布伦纳瘤(brenner tumor);恶性叶状肿瘤;滑膜肉瘤;恶性间皮瘤;无性细胞瘤;胚胎性癌;恶性畸胎瘤;恶性卵巢甲状腺肿;绒毛膜癌;恶性中肾瘤;血管肉瘤;恶性血管内皮瘤;卡波西肉瘤(kaposi’s sarcoma);恶性血管外皮细胞瘤;***肉瘤;骨肉瘤;皮质旁骨肉瘤;软骨肉瘤;恶性成软骨细胞瘤;间质软骨肉瘤;骨巨细胞瘤;尤因肉瘤(ewing’s sarcoma);恶性牙源性肿瘤;成釉细胞牙肉瘤;恶性成釉细胞瘤;成釉细胞纤维肉瘤;恶性松果体瘤;脊索瘤;恶性神经胶质瘤;室管膜瘤;星形细胞瘤;原浆性星形细胞瘤;纤维性星形细胞瘤;星形母细胞瘤;成胶质细胞瘤;少突神经胶质瘤;成少突神经胶质细胞瘤;原发性神经外胚层;小脑肉瘤;成神经节细胞瘤;成神经细胞瘤;视网膜母细胞瘤;嗅神经源性肿瘤;恶性脑膜瘤;神经纤维肉瘤;恶性神经鞘瘤;恶性颗粒细胞瘤;恶性淋巴瘤;霍奇金病(hodgkin’s disease);霍奇金副肉芽肿;恶性淋巴瘤,小淋巴细胞性;恶性淋巴瘤,大细胞,弥散性;恶性淋巴瘤,滤泡性;蕈样霉菌病;其他特定的非霍奇金淋巴瘤;恶性组织细胞增生症;多发性骨髓瘤;肥大细胞肉瘤;免疫增生性小肠疾病;白血病;淋巴性白血病;浆细胞白血病;红白血病;淋巴肉瘤细胞白血病;髓性白血病;嗜碱细胞性白血病;嗜酸细胞性白血病;单核细胞白血病;肥大细胞白血病;巨核母细胞白血病;髓样肉瘤;和毛细胞白血病。
本文中使用术语“接触的”和“暴露的”当应用于细胞时用于描述将治疗剂递送至靶细胞或将其置于与靶细胞直接并置的过程。为了实现细胞杀伤,例如,将一种或更多种试剂以有效杀伤细胞或防止其***的量递送至细胞。
针对治疗患者的有效响应或患者的“响应性”是指给予处于患病或障碍之风险中或者患有疾病或障碍的患者的临床或治疗性益处。这样的益处可包括细胞或生物学响应、完全响应、部分响应、稳定的疾病(无进展或复发)或者伴有之后复发的响应。例如,有效响应可在被诊断患有癌症的患者中降低肿瘤尺寸或无进展存活。可预测和监测治疗结果,和/或可通过本文中所述的方法鉴定或选择受益于这样的治疗的患者。
关于肿瘤性病症治疗,根据肿瘤性病症的阶段,肿瘤性病症治疗涉及以下治疗中的一种或组合:去除肿瘤组织的手术、放射治疗以及化学治疗。其他治疗方案可与抗癌剂,例如治疗组合物和化学治疗剂的施用组合。例如,待用这样的抗癌剂治疗的患者也可接受放射治疗和/或可经受手术。
对于疾病的治疗,治疗组合物的合适剂量将取决于如上所定义的待治疗的疾病类型、疾病的严重程度和病程、患者的临床史和对药剂的响应,以及主治医师的酌处权。该药剂适合以一次或在系列治疗中施用于患者。
可以以有效地实现所期望效果的组合量提供治疗性和预防性方法和组合物。可使组织、肿瘤或细胞与包含一种或更多种药剂的一种或更多种组合物或药理制剂接触,或者通过使组织、肿瘤和/或细胞与两种或更多种独特的组合物或制剂接触。同样,考虑了可将这样的组合治疗与化学治疗、放射治疗、手术治疗或免疫治疗结合使用。
组合施用可包括以同一剂型同时施用两种或更多种药剂,以分开的剂型同时施用,以及分开施用。即,可将主题治疗组合物和另一治疗剂一起配制在同一剂型中并同时施用。或者,可同时施用主题治疗组合物和另一治疗剂,其中两种药剂存在于分开的制剂中。在另一替代方案中,可在施用所述治疗剂之后紧接着施用另一治疗剂,或者反之亦然。在分开施用方案中,主题治疗组合物和另一治疗剂可相距数分钟、或相距数小时或相距数天施用。
相对于第二抗癌治疗,第一抗癌治疗(例如,包含治疗剂的外排体)可在其之前、期间、之后或以多种组合施用。施用可以以同时至数分钟至数天至数周的间隔进行。在其中将第一治疗与第二治疗分开提供给患者的实施方案中,通常将确保在每次递送的时间之间无终止的显著的时间段,使得两种化合物仍将能够对患者发挥有利的组合效果。在这样的情况下,预期可在彼此约12至24或72小时内,并且更特别地在彼此约6至12小时内为患者提供第一治疗和第二治疗。在一些情况下,可能期望将治疗时期显著延长,其中分开施用之间间隔数天(2、3、4、5、6或7)至数周(1、2、3、4、5、6、7或8)。
在某些实施方案中,疗程将持续1至90天或更长(该这样的范围包括中间天数)。预期可在第1天至第90天(该这样的范围包括中间天数)的任意天或其任何组合给予一个药剂,以及在第1天至第90天(该这样的范围包括中间天数)的任意天或其任何组合给予另一药剂。在单日(24小时时期)内,可给予患者一次或多次施用药剂。此外,在疗程之后,预期存在未施用抗癌治疗的时间段。该时间段可持续1至7天,和/或1至5周,和/或1至12个月或更长(该这样的范围包括中间天数),取决于患者的状况,例如其预后、体力(strength)、健康等。期望可根据需要重复治疗周期。
可采用多种组合。对于以下实例,第一抗癌治疗是“A”,以及第二抗癌治疗是“B”:
A/B/A B/A/B B/B/A A/A/B A/B/B B/A/A A/B/B/B B/A/B/B B/B/B/A B/B/A/BA/A/B/B A/B/A/B A/B/B/A B/B/A/A B/A/B/A B/A/A/B A/A/A/B B/A/A/A A/B/A/A A/A/B/A
考虑到药剂的毒性(如果有的话),向患者施用本发明的任何化合物或治疗将遵循用于施用这样的化合物的一般方案。因此,在一些实施方案中,存在监测归因于组合治疗的毒性的步骤。
1.化学治疗
根据本发明,可使用多种化学治疗剂。术语“化学治疗”是指使用药物来治疗癌症。“化学治疗剂”用于表示在癌症的治疗中施用的化合物或组合物。这些药剂或药物按其在细胞内的活性方式进行分类,例如它们是否影响细胞周期以及在什么阶段影响细胞周期。或者,药剂可基于其直接交联DNA、嵌入DNA中或通过影响核酸合成来诱导染色体和有丝***畸变的能力来表征。
化学治疗剂的一些实例包括烷化剂类,例如噻替派和环磷酰胺;烷基磺酸酯类,例如白消安、英丙舒凡和哌泊舒凡;氮杂环丙烷类,例如苯佐替哌(benzodopa)、卡波醌、美妥替哌(meturedopa)和乌瑞替派(uredopa);乙撑亚胺类(ethylenimines)和甲基蜜胺类,包括六甲蜜胺、三乙撑蜜胺(triethylenemelamine)、三乙撑磷酰胺(trietylenephosphoramide)、三乙撑硫代磷酰胺(triethiylenethiophosphoramide)和三甲蜜胺;番荔枝内酯类(acetogenins)(尤其是布拉他辛和布拉他辛酮);喜树碱类(包括合成的类似物拓扑替康);苔藓虫素;卡利他汀(callystatin);CC-1065(包括其阿多来新、卡折来新和比折来新合成类似物);念珠藻素(特别是念珠藻素1和念珠藻素8);尾海兔素;倍癌霉素(包括合成类似物KW-2189和CB1-TM1);五加素;水鬼蕉碱;匍枝珊瑚醇类;海绵抑制素;氮芥类,例如苯丁酸氮芥、萘氮芥、氯磷酰胺、雌莫司汀、异环磷酰胺、氮芥、盐酸甲氧氮芥、美法仑、新恩比兴、苯芥胆甾醇、泼尼莫司汀、曲磷胺和尿嘧啶氮芥;亚硝基脲类,例如卡莫司汀、氯脲霉素、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀和雷莫司汀;抗生素,例如烯二炔类抗生素(例如,加利车霉素,尤其是加利车霉素γ1I和加利车霉素ωI1);达因霉素,包括达因霉素A;二膦酸盐类,例如氯膦酸盐;埃斯培拉霉素类;以及新制癌菌素发色团和相关色蛋白烯二炔抗生素发色团、阿克拉霉素、放线菌素、安曲霉素、重氮丝氨酸、博来霉素、放线菌素C(cactinomycin)、卡柔比星、洋红霉素、嗜癌菌素、色霉素、更生霉素、柔红霉素、地托比星、6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸、多柔比星(包括吗啉代-多柔比星、氰基吗啉代-多柔比星、2-吡咯啉基-多柔比星和脱氧多柔比星)、表柔比星、依索比星、伊达比星、麻西罗霉素、丝裂霉素类(例如丝裂霉素C)、霉酚酸、诺加霉素、橄榄霉素类、培洛霉素、泼非霉素、嘌呤霉素、三铁阿霉素、罗多比星、链黑菌素、链脲霉素、杀结核菌素、乌苯美司、净司他丁和佐柔比星;抗代谢物类,例如甲氨蝶呤和5-氟脲嘧啶(5-FU);叶酸类似物,例如二甲叶酸、蝶罗呤和三甲曲沙;嘌呤类似物,例如氟达拉滨、6-巯基嘌呤、硫咪嘌呤和硫鸟嘌呤;嘧啶类似物,例如安西他滨、阿扎胞苷、6-氮尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、二脱氧尿苷、去氧氟尿苷、依诺他滨和氟尿苷;雄激素,例如卡鲁睾酮、丙酸屈他雄酮、环硫雄醇、美雄烷和睾内酯;抗肾上腺类,例如米托坦和曲洛司坦;叶酸补充剂,例如亚叶酸;醋葡醛内酯;醛磷酰胺糖苷;氨基乙酰丙酸;恩尿嘧啶;安吖啶;贝斯布西;比生群;依达曲沙;地磷酰胺(defofamine);秋水仙胺;地吖醌;依洛尼塞;依利醋铵;埃博霉素类;依托格鲁;硝酸镓;羟基脲;香菇多糖;氯尼达明;美登木素生物碱类,例如美登素和安丝菌素;米托胍腙;米托蒽醌;莫哌达醇;尼曲吖啶;喷司他丁;蛋氨氮芥(phenamet);吡柔比星;洛索蒽醌;鬼臼酸;2-乙酰肼;丙卡巴肼;PSK多糖复合物;雷佐生;根霉素;西佐喃;锗螺胺(spirogermanium);细交链孢菌酮酸(tenuazonic acid);三亚胺醌;2,2’,2”-三氯三乙胺;单端孢霉烯类(尤其是T-2毒素、疣孢菌素A、漆斑菌素A和蛇形菌素);乌拉坦;长春地辛;达卡巴嗪;甘露莫司汀;二溴甘露醇;二溴卫矛醇;哌泊溴烷;加西托星;***糖苷(“Ara-C”);环磷酰胺;紫杉烷类,例如紫杉醇和多西他赛吉西他滨;6-硫鸟嘌呤;巯基嘌呤;铂配位络合物,例如顺铂、奥沙利铂和卡铂;长春碱;铂;依托泊苷(VP-16);异环磷酰胺;米托蒽醌;长春新碱;长春瑞滨;诺消灵(novantrone);替尼泊苷;依达曲沙;道诺霉素;氨基喋呤;希罗达;伊班膦酸盐;伊立替康(例如,CPT-11);拓扑异构酶抑制剂RFS 2000;二氟甲基鸟氨酸(DFMO);类视黄醇,例如视黄酸;卡培他滨、卡铂、丙卡巴肼、普卡霉素、吉西他滨、诺维本、法尼基-蛋白质转移酶抑制剂、反铂,以及上述任意一种的可药用的盐、酸或衍生物。
2.放射治疗
导致DNA损伤并已广泛使用的其他因素包括通常被称为γ射线、X射线和/或向肿瘤细胞定向递送放射性同位素的那些。还考虑了其他形式的DNA损伤因素,例如微波、质子束辐照(美国专利5,760,395和4,870,287)以及UV辐照。很可能所有这些因素均对DNA、DNA前体、DNA的复制和修复以及染色体的组装和维持产生广泛的损害。X射线的剂量范围以50至200伦琴日剂量持续一段长时间(3至4周)至2000至6000伦琴的单剂量。放射性同位素的剂量范围变化很大,并且取决于同位素的半衰期、发出的辐射的强度和类型以及赘生性细胞的摄取。
3.免疫治疗
技术人员将理解,可将另外的免疫治疗与本发明的方法组合或结合使用。在癌症治疗的背景下,免疫治疗通常依赖于使用免疫效应细胞和分子来靶向和破坏癌细胞。利妥昔单抗是这样的一个实例。免疫效应物可以是例如对肿瘤细胞表面上的一些标志物具有特异性的抗体。单独的抗体可用作治疗的效应物或者其可募集其他细胞以实际上影响细胞杀伤。抗体还可与药物或毒素(化学治疗剂、放射性核素、蓖麻毒素A链、霍乱毒素、百日咳毒素等)缀合并且仅用作靶向剂。或者,效应物可以是直接或间接地与肿瘤细胞靶标相互作用的携带表面分子的淋巴细胞。多种效应物细胞包括细胞毒性T细胞和NK细胞。
在免疫治疗的一个方面中,肿瘤细胞必须具有适用于靶向(即,不存在于大多数其他细胞上)的一些标志物。存在许多肿瘤标志物,并且这些肿瘤标志物中的任何一种可能适于本发明的上下文中的靶向。常见的肿瘤标志物包括CD20、癌胚抗原、酪氨酸酶(p97)、gp68、TAG-72、HMFG、唾液酸路易斯抗原、MucA、MucB、PLAP、层黏连蛋白受体、erb B和p155。免疫治疗的另一个方面是将抗癌作用与免疫刺激作用组合。还存在免疫刺激分子,包括:细胞因子,例如IL-2、IL-4、IL-12、GM-CSF、γ-IFN,趋化因子,例如MIP-1、MCP-1、IL-8,以及生长因子,例如FLT3配体。
目前正在研究或应用的免疫治疗的一些实例是免疫佐剂,例如牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)、恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)、二硝基氯苯和芳香族化合物(美国专利5,801,005和5,739,169;Hui and Hashimoto,1998;Christodoulides etal.,1998);细胞因子治疗,例如干扰素α、β和γ,IL-1,GM-CSF和TNF(Bukowski et al.,1998;Davidson et al.,1998;Hellstrand et al.,1998);基因治疗,例如TNF、IL-1、IL-2和p53(Qin et al.,1998;Austin-Ward and Villaseca,1998;美国专利5,830,880和5,846,945);以及单克隆抗体,例如抗CD20、抗神经节苷脂GM2和抗p185(Hollander,2012;Hanibuchi et al.,1998;美国专利5,824,311)。预期可将一种或更多种抗癌治疗与本文中所述的抗体治疗一起使用。
在一些实施方案中,免疫治疗可以是免疫检查点抑制剂。免疫检查点或调高信号(例如,共刺激分子)或调低信号。可被免疫检查点阻断而靶向的抑制性免疫检查点包括腺苷A2A受体(adenosine A2A receptor,A2AR)、B7-H3(也称为CD276)、B和T淋巴细胞弱化子(B and T lymphocyte attenuator,BTLA)、细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(cytotoxic T-lymphocyte-associated protein,CTLA-4,也称为CD152)、吲哚胺2,3-双加氧酶(indoleamine 2,3-dioxygenase,IDO)、杀伤细胞免疫球蛋白(killer-cellimmunoglobulin,KIR)、淋巴细胞激活基因3(lymphocyte activation gene-3,LAG3)、程序性死亡1(programmed death 1,PD-1)、T细胞免疫球蛋白结构域和黏蛋白结构域3(T-cellimmunoglobulin domain and mucin domain 3,TIM-3)以及T细胞活化V结构域Ig抑制剂(V-domain Ig suppressor of T cell activation,VISTA)。特别地,免疫检查点抑制剂靶向PD-1轴和/或CTLA-4。
免疫检查点抑制剂可以是药物,例如小分子、重组形式的配体或受体、或者特别是抗体,例如人抗体(例如,国际专利公布WO2015016718;Pardoll,Nat Rev Cancer,12(4):252-64,2012;二者均通过引用并入本文)。可使用免疫检查点蛋白或其类似物的已知抑制剂,特别地,可使用嵌合的、人源化的或人形式的抗体。如技术人员将知道的,替代和/或等同的名称可用于本公开内容中提及的某些抗体。在本公开内容的上下文中,这样的替代和/或等同的名称是可互换的。例如,已知拉立珠单抗(lambrolizumab)也以替代和等同的名称MK-3475和派姆单抗(pembrolizumab)而为人所知。
在一些实施方案中,PD-1结合拮抗剂是抑制PD-1与其配体结合伴侣结合的分子。在一个具体方面中,PD-1配体结合伴侣是PDL1和/或PDL2。在另一个实施方案中,PDL1结合拮抗剂是抑制PDL1与其结合伴侣结合的分子。在一个具体方面中,PDL1结合伴侣是PD-1和/或B7-1。在另一个实施方案中,PDL2结合拮抗剂是抑制PDL2与其结合伴侣结合的分子。在一个具体方面中,PDL2结合伴侣是PD-1。拮抗剂可以是抗体、其抗原结合片段、免疫黏附素、融合蛋白或寡肽。示例性抗体描述于美国专利No.8,735,553、8,354,509和8,008,449,其全部通过引用并入本文。用于本文中提供的方法的另一些PD-1轴拮抗剂在本领域中是已知的,所述拮抗剂例如描述于美国专利公布No.20140294898、2014022021和20110008369中,其全部通过引用并入本文。
在一些实施方案中,PD-1结合拮抗剂是抗PD-1抗体(例如,人抗体、人源化抗体或嵌合抗体)。在一些实施方案中,抗PD-1抗体选自纳武单抗(nivolumab)、派姆单抗和CT-011。在一些实施方案中,PD-1结合拮抗剂是免疫黏附素(例如,包含与恒定区(例如,免疫球蛋白序列的Fc区)融合的PDL1或PDL2的胞外部分或PD-1结合部分的免疫黏附素)。在一些实施方案中,PD-1结合拮抗剂是AMP-224。纳武单抗,也称为MDX-1106-04、MDX-1106、ONO-4538、BMS-936558和是描述于WO2006/121168中的抗PD-1抗体。派姆单抗,也称为MK-3475、Merck 3475、拉立珠单抗、和SCH-900475,是描述于WO2009/114335的抗PD-1抗体。CT-011,也称为hBAT或hBAT-1,是描述于WO2009/101611中的抗PD-1抗体。AMP-224,也称为B7-DCIg,是描述于WO2010/027827和WO2011/066342中的PDL2-Fc融合可溶性受体。
可在本文中提供的方法中靶向的另一免疫检查点是细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4),也称为CD152。人CTLA-4的完整cDNA序列的Genbank登录号为L15006。CTLA-4存在于T细胞表面上,并且当与抗原呈递细胞表面上的CD80或CD86结合时,用作“关闭”开关。CTLA4是免疫球蛋白超家族的成员,该超家族在辅助性T细胞的表面上表达并向T细胞传递抑制信号。CTLA4与T细胞共刺激蛋白CD28相似,并且两个分子均与抗原呈递细胞上的CD80和CD86结合,分别还称为B7-1和B7-2。CTLA4向T细胞传递抑制信号,而CD28则传递刺激信号。胞内CTLA4也存在于调节性T细胞中,并且可能对于调节性T细胞功能是重要的。通过T细胞受体和CD28的T细胞活化导致CTLA-4的表达提高,CTLA-4是B7分子的抑制性受体。
在一些实施方案中,免疫检查点抑制剂是抗CTLA-4抗体(例如,人抗体、人源化抗体或嵌合抗体),其抗原结合片段,免疫黏附素,融合蛋白或寡肽。
适用于本发明方法的抗人CTLA-4抗体(或来源于其的VH和/或VL结构域)可使用本领域中公知的方法产生。或者,可使用本领域公认的抗CTLA-4抗体。例如,公开于以下中的抗CTLA-4抗体可用于本文中公开的方法中:美国专利No.8,119,129、WO 01/14424、WO 98/42752;WO 00/37504(CP675,206,也称为替西木单抗(tremelimumab);原名西木单抗(ticilimumab)),美国专利No.6,207,156;Hurwitz et al.(1998)Proc Natl Acad SciUSA 95(17):10067-10071;Camacho et al.(2004)J Clin Oncology 22(145):摘要No.2505(抗体CP-675206);以及Mokyr et al.(1998)Cancer Res 58:5301-5304。每个前述出版物的教导均通过引用并入于此。也可使用与这些本领域公认的抗体中任一者竞争用于与CTLA-4结合的抗体。例如,人源化CTLA-4抗体描述于国际专利申请No.WO2001014424、WO2000037504和美国专利No.8,017,114;其全部通过引用并入本文。
示例性抗CTLA-4抗体是伊匹单抗(ipilimumab)(也称为10D1、MDX-010、MDX-101和)或其抗原结合片段以及变体(参见,例如,WO 01/14424)。在另一些实施方案中,所述抗体包含伊匹单抗的重链和轻链CDR或VR。因此,在一个实施方案中,所述抗体包含伊匹单抗的VH区的CDR1、CDR2和CDR3结构域,以及伊匹单抗的VL区的CDR1、CDR2和CDR3结构域。在另一个实施方案中,所述抗体与如上所述的抗体竞争结合CTLA-4上的同一表位和/或与之结合。在另一个实施方案中,所述抗体与上述抗体具有至少约90%的可变区氨基酸序列同一性(例如,与伊匹单抗具有至少约90%、95%或99%的可变区同一性)。
用于调节CTLA-4的另一些分子包括CTLA-4配体和受体,所述CTLA-4配体和受体例如描述于美国专利No.5844905、5885796和国际专利申请No.WO1995001994和WO1998042752中,其全部通过引用并入本文;以及免疫黏附素,所述免疫黏附素例如描述于美国专利No.8329867中,其通过引用并入本文。
在一些实施方案中,免疫治疗可以是过继免疫治疗,其涉及转移离体产生的自体抗原特异性T细胞。用于过继免疫治疗的T细胞可通过抗原特异性T细胞的扩增或通过遗传工程进行的T细胞的重定向来产生(Park,Rosenberg et al.2011)。已表明肿瘤特异性T细胞的分离和转移成功治疗黑素瘤。通过转基因T细胞受体或嵌合抗原受体(chimericantigen receptor,CAR)的遗传转移,已成功地在T细胞中产生了新的特异性(Jena,Dottiet al.2010)。CAR是由与单一融合分子中的一个或更多个信号传导结构域缔合的靶向部分组成的合成受体。一般而言,CAR的结合部分由单链抗体(scFv)的抗原结合结构域组成,该结构域包含通过柔性接头连接的单克隆抗体的轻片段和可变片段。基于受体或配体结构域的结合部分也已成功使用。第一代CAR的信号传导结构域来源于CD3ζ的胞质区或Fc受体γ链。CAR已成功地使T细胞针对来自多种恶性肿瘤(包括淋巴瘤和实体瘤)的肿瘤细胞表面表达的抗原重定向(Jena,Dotti et al.2010)。
在一个实施方案中,本申请提供了用于治疗癌症的组合治疗,其中所述组合治疗包含过继T细胞治疗和检查点抑制剂。在一个方面中,过继T细胞治疗包含自体和/或同种异体T细胞。在另一个方面中,自体和/或同种异体T细胞靶向肿瘤抗原。
4.手术
约60%的患有癌症的人将经受某种类型的手术,包括预防性、诊断性或阶段性、治疗性和姑息性手术。治疗性手术包括其中将全部或部分癌组织物理地去除、切除和/或破坏,并且可与另一些治疗,例如本发明的治疗、化学治疗、放射治疗、激素治疗、基因治疗、免疫治疗和/或替代治疗结合使用的切除术。肿瘤切除是指物理去除至少一部分的肿瘤。除肿瘤切除术之外,通过手术的治疗还包括激光手术、冷冻手术、电外科手术和显微控制的手术(莫氏手术(Mohs’surgery))。
在切除部分或全部的癌细胞、组织或肿瘤之后,可在体内形成腔。治疗可通过灌注、直接注射或在该区域局部施用另外的抗癌治疗来完成。可重复这样的治疗,例如每1、2、3、4、5、6或7天,或者每1、2、3、4周和5周或者每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月。这些治疗也可以是不同的剂量。
5.其他药剂
预期可将其他药剂与本发明的某些方面组合使用以提高治疗的治疗效力。这些另外的药剂包括影响细胞表面受体和GAP连接的上调的药剂、细胞抑制剂和分化剂、细胞黏附抑制剂、提高过度增殖细胞对凋亡诱导剂敏感性的药剂或其他生物药剂。通过升高GAP连接数提高胞间信号传导,将提高对邻近的过度增殖细胞群的抗过度增殖作用。在另一些实施方案中,细胞抑制剂或分化剂可与本发明的某些方面组合使用以提高治疗的抗过度增殖效力。预期细胞黏附抑制剂提高本发明的效力。细胞黏附抑制剂的一些实例是黏着斑激酶(focal adhesion kinase,FAK)抑制剂和洛伐他汀(Lovastatin)。还预期可将提高过度增殖细胞对凋亡的敏感性的另一些药剂,例如抗体c225,与本发明的某些方面组合使用以提高治疗效力。
III.药物组合物
预期表达或包含治疗剂的外排体可全身或局部地施用以抑制肿瘤细胞生长,并且最优选地,在患有局部晚期或转移性癌症的癌症患者中杀伤癌细胞。其可静脉内、鞘内和/或腹膜内施用。其可单独地或与抗增殖药物组合施用。在一个实施方案中,其在手术或其他操作之前施用以降低患者中的癌症负荷。或者,其可在手术之后施用以确保任何剩余的癌症(例如,手术未能消除的癌症)无法存活。
无意于本发明受到治疗制剂的特定性质的限制。例如,这样的组合物可与生理上可耐受的液体、凝胶、固体载体、稀释剂或赋形剂一起提供于制剂中。可将这些治疗制剂以类似于其他治疗剂的方式施用于哺乳动物,例如家养动物以用于兽医用途,以及人中以用于临床用途。一般而言,治疗效力所需的剂量将根据用途类型和施用方式以及个体对象的特定需求而变化。
在预期临床应用的情况下,可能有必要以适于旨在应用的形式制备包含外排体的药物组合物。通常来说,药物组合物可包含有效量的溶解或分散在可药用载体中的一种或更多种外排体和/或另外的药剂。短语“可药用或药理学上可接受的”是指当施用(视情况而定)于动物,例如如人时,不产生不良、变应性或其他不良反应的分子实体和组合物。根据本公开内容,包含如本文中公开的外排体或者另外的活性成分的药物组合物的制备对本领域技术人员是已知的,如由Remington’s Pharmaceutical Sciences,18th Ed.,1990所例示,其通过引用并入本文。此外,对于动物(例如,人)施用,应当理解,制剂应符合如由FDA生物标准办公室(FDA Office of Biological Standards)所要求的无菌性、致热原性、一般安全性和纯度标准。
进一步根据本发明的某些方面,适合于施用的组合物可在具有或不具有惰性稀释剂的可药用载体中提供。本文中使用的“可药用载体”包括任何和所有水溶剂(例如,水、醇/水溶液、乙醇、盐溶液、肠胃外载剂,例如氯化钠、林格右旋糖(Ringer’s dextrose)等);非水溶剂(例如,脂肪、油剂、多元醇(例如,甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等),植物油和可注射的有机酯,例如油酸乙酯);脂质;脂质体;分散介质;包衣(例如,卵磷脂);表面活性剂;抗氧化剂;防腐剂(例如,抗细菌剂或抗真菌剂、抗氧化剂、螯合剂、惰性气体、对羟基苯甲酸酯(例如,对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯)、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞,或其组合);等张剂(例如,糖和氯化钠);吸收延迟剂(例如,单硬脂酸铝和明胶);盐;药物;药物稳定剂;凝胶剂;树脂;填充剂;结合剂;赋形剂;崩解剂;润滑剂;甜味剂;矫味剂;染料;流体和营养补充剂;例如材料及其组合,如本领域普通技术人员已知的。载体应是可吸收的,并且包括液体、半固体即糊剂,或固体载体。另外,如果期望的话,该组合物可包含少量的助剂物质,例如润湿剂或乳化剂、稳定剂或pH缓冲剂。根据公知的参数调节药物组合物中多种组分的pH和确切浓度。可例如通过使用包衣,例如卵磷脂,在分散体的情况下通过维持所需的粒径,以及通过使用表面活性剂来维持合适的流动性。
可药用载体特别地配制成用于向人施用,尽管在某些实施方案中可能期望使用配制成用于向非人动物施用但对于向人施用是不可接受的(例如,由于政府法规)的可药用载体。除非任何常规载体与活性成分不相容(例如,不利于接受体或其中所含组合物的治疗效力),否则考虑将其用于治疗组合物或药物组合物中。根据本发明的某些方面,以任何方便和实用的方式,即通过溶液剂、混悬剂、乳化、混合、包封、吸收等将组合物与载体组合。这样的操作对于本领域技术人员而言是常规的。
本发明的某些实施方案可包括不同类型的载体,这取决于其是以固体、液体还是气雾剂形式施用,以及施用途径(例如注射)是否需要无菌。如本领域普通技术人员已知的,所述组合物可如下施用:静脉内、皮内、经皮、鞘内、动脉内、腹膜内、鼻内、***内、直肠内、肌内、皮下、黏膜、经口、表面、局部、通过吸入(例如,气雾剂吸入)、通过注射、通过输注、通过持续输注、通过直接局部灌注浸浴靶细胞、通过导管、通过灌洗、在脂质组合物(例如,脂质体)中、或者通过其他方法或前述方法的任意组合(参见,例如,Remington’sPharmaceutical Sciences,18th Ed.,1990,其通过引用并入本文)。
外排体可配制成用于肠胃外施用,例如配制成用于通过静脉内、动脉内、肌内、皮下或甚至腹膜内途径注射。通常来说,这样的组合物可制备成液体溶液剂或混悬剂;也可制备适合用于在注射之前添加液体之后制备溶液剂或混悬剂的固体形式;并且制剂还可被乳化。
适用于可注射使用的药物形式包括无菌水溶液或分散剂;包含芝麻油、花生油、或水性丙二醇的制剂;以及用于临时制备无菌可注射溶液或分散剂的无菌散剂。在所有情况下,所述形式必须是无菌的并且必须是达到其可容易地注射之程度的流体。其在制造和储存条件下也应该是稳定的,并且必须防止微生物(例如细菌和真菌)的污染作用。
配制之后,溶液将以与剂量制剂相容的方式并以例如治疗有效的量施用。制剂易于以多种剂型施用,例如,配制成用于肠胃外施用,例如,可注射溶液,或用于递送至肺的气雾剂、或者配制成用于消化施用,例如药物释放胶囊等。
术语“单位剂量”或“剂量”是指适用于对象的物理上离散的单元,每个单位含有预定量的治疗组合物,所述预定量经计算产生与其施用(即,合适的途径和治疗方案)相关的以上讨论的期望响应。根据治疗数量和单位剂量二者,待施用的量取决于所期望的效果。施用于患者或对象的本发明的组合物的实际剂量量可通过物理和生理因素(例如对象的体重、年龄、健康状况和性别、所治疗疾病的类型、疾病渗透程度、先前或同时的治疗干预、患者的特发病、施用途径、以及特定治疗物质的效力、稳定性和毒性)来确定。例如,剂量还可包含每次施用约1μg/kg/体重至约1000mg/kg/体重(该这样的范围包括干预剂量)或更多,以及其中可推论出的任何范围。在从本文中所列数字可推论出的范围的一些非限制性实例中,可施用约5μg/kg/体重至约100mg/kg/体重,约5μg/kg/体重至约500mg/kg/体重等的范围。在任何事件下,负责施用的医疗人员将确定组合物中活性成分的浓度和个体对象的合适剂量。
施用于动物患者的组合物的实际剂量量可通过物理和生理因素来确定,例如体重、病症严重程度、所治疗疾病的类型、先前或同时的治疗干预、患者的特发病、以及施用途径。取决于剂量和施用途径,优选剂量和/或有效量的施用次数可根据对象的响应而变化。在任何事件下,负责施用的医疗人员将确定组合物中活性成分的浓度和个体对象的合适剂量。
在某些实施方案中,药物组合物可包含例如至少约0.1%的活性化合物。在另一些实施方案中,活性化合物可包含单位重量的约2%至约75%,或例如约25%至约60%,以及其中可推论出的任何范围。自然地,每种治疗上有用的组合物中活性化合物的量可以以这样的方式制备:在任何给定的单位剂量的化合物中将获得合适的剂量。制备这样的药物制剂的本领域技术人员将考虑以下因素,例如溶解度、生物利用度、生物学半衰期、施用途径、产品保存期限以及其他药理学考虑因素,并因此,可期望多种剂量和治疗方案。
在另一些非限制性实例中,剂量还可包括每次施用约1微克/kg/体重、约5微克/kg/体重、约10微克/kg/体重、约50微克/kg/体重、约100微克/kg/体重、约200微克/kg/体重、约350微克/kg/体重、约500微克/kg/体重、约1毫克/kg/体重、约5毫克/kg/体重、约10毫克/kg/体重、约50毫克/kg/体重、约100毫克/kg/体重、约200毫克/kg/体重、约350毫克/kg/体重、约500毫克/kg/体重、至约1000毫克/kg/体重或更多,以及其中可推论出的任何范围。在从本文中所列数字可推论出的范围的一些非限制性实例中,基于上述数字,可施用约5毫克/kg/体重至约100毫克/kg/体重,约5微克/kg/体重至约500毫克/kg/体重等的范围。
IV.外排体载物
A.核酸和载体
在本发明的某些方面中,可公开编码治疗性蛋白质或抗体的核酸序列。根据所使用的表达***,可基于常规方法选择核酸序列。例如,可针对在某个***中的表达对各个基因或其变体进行密码子优化。多种载体也可用于表达目的蛋白质。示例性载体包括但不限于质粒载体、病毒载体、转座子或基于脂质体的载体。
B.重组蛋白质
一些实施方案涉及重组蛋白质和多肽。例如,如,治疗性抗体。在一些方面中,治疗性抗体可以是特异性或选择性地与胞内蛋白质结合的抗体。在另一些方面,可修饰蛋白质或多肽以提高血清稳定性。因此,当本申请提及“经修饰的蛋白质”或“经修饰的多肽”的功能或活性时,本领域普通技术人员将理解,这包括例如,相对于未经修饰的蛋白质或多肽具有另外的优势的蛋白质或多肽。特别考虑了关于“经修饰的蛋白质”的实施方案可相对于“经修饰的多肽”来实施,反之亦然。
本文中使用的蛋白质或肽通常是指但不限于大于约200个氨基酸至从基因翻译的全长序列的蛋白质;大于约100个氨基酸的多肽;和/或约3至约100个氨基酸的肽。为了方便起见,术语“蛋白质”、“多肽”和“肽”在本文中可互换使用。
本文中使用的“氨基酸残基”是指本领域已知的任何天然存在的氨基酸,任何氨基酸衍生物或任何氨基酸模拟物。在某些实施方案中,蛋白质或肽的残基是连续的,没有任何非氨基酸中断氨基酸残基的序列。在另一些实施方案中,该序列可包含一个或更多个非氨基酸部分。在一些具体实施方案中,蛋白质或肽的残基序列可被一个或更多个非氨基酸部分打断。
因此,术语“蛋白质或肽”涵盖包含天然存在的蛋白质中发现的20种常见氨基酸中的至少一种或至少一种经修饰或异常氨基酸的氨基酸序列。
C.抑制性RNA
siRNA(例如,siNA)是本领域公知的。例如,siRNA和双链RNA已在美国专利No.6,506,559和6,573,099,以及美国专利申请2003/0051263、2003/0055020、2004/0265839、2002/0168707、2003/0159161和2004/0064842中描述,其所有均通过引用整体并入本文。
在siRNA内,核酸的组分不需要全部是相同的类型或同质的(例如,siRNA可包含核苷酸和核酸或核苷酸类似物)。通常来说,siRNA形成双链结构;双链结构可由部分或完全互补的两个单独的核酸产生。在本发明的某些实施方案中,siRNA可包含仅单个核酸(多核苷酸)或核酸类似物,并且通过与其自身互补形成双链结构(例如,形成发夹环)。siRNA的双链结构可包含16、20、25、30、35、40、45、50、60、65、70、75、80、85、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500或更多个连续核碱基(nucleobase),包括其中的所有范围。siRNA可包含17至35个连续核碱基,更优选18至30个连续核碱基,更优选19至25个核碱基,更优选20至23个连续核碱基、或20至22个连续核碱基、或21个连续核碱基,其与互补核酸(其可以是相同核酸的另一部分或单独的互补核酸)杂交以形成双链结构。
可用于实施本发明方法的本发明的试剂包括但不限于siRNA。通常来说,双链RNA(dsRNA)(其在本文中可替代地称为小干扰RNA(siRNA))的引入诱导强效且特异性的基因沉默,这是一种称为RNA干扰或RNAi的现象。RNA干扰已被称为“共抑制”、“转录后基因沉默”、“有义抑制(sense suppression)”和“压制(quelling)”。RNAi是一种有吸引力的生物技术工具,因为它提供了敲除特定基因活性的手段。
在设计RNAi时需要考虑数种因素,例如siRNA的性质、沉默作用的持久性以及递送***的选择。为了产生RNAi作用,引入到生物体中的siRNA通常会包含外显子序列。此外,RNAi过程是同源性依赖性的,因此必须仔细选择序列以使基因特异性最大化,同时使同源序列而不是基因特异性序列之间的交叉干扰可能性最小化。优选地,siRNA在siRNA的序列与待抑制基因序列之间显示出大于80%、85%、90%、95%、98%或甚至100%的同一性。与靶基因具有小于约80%同一性的序列实质上没那么有效。因此,siRNA与待抑制基因之间的同源性越大,不相关基因的表达就越不太可能会受到影响。
此外,siRNA的尺寸是重要的考虑因素。在一些实施方案中,本发明涉及siRNA分子,其包含至少约19至25个核苷酸并且能够调节基因表达。在本发明的上下文中,siRNA在长度上优选小于500、200、100、50或25个核苷酸。更优选地,siRNA在长度上为约19个核苷酸至约25个核苷酸。
靶基因通常意指包含编码多肽的区域或者调节对多肽表达而言重要的复制、转录、或翻译或其他过程的多核苷酸区域的多核苷酸;或者包含编码多肽的区域和与之可操作地连接的调节表达的区域二者的多核苷酸。任何在细胞中表达的基因都可被靶向。优选地,靶基因是涉及对疾病重要或作为研究对象特别令人感兴趣的细胞活动的进展或与其相关的基因。
siRNA可从商业来源、天然来源获得,或者可使用本领域普通技术人员公知的许多技术中的任一种来合成。例如,一种预设计siRNA的商业来源是Austin,Tex。另一种是(Valencia,Calif.)。可应用于本发明的组合物和方法中的抑制性核酸可以是通过任何来源已发现为目的蛋白质的经验证的下调剂的任何核酸序列。无需过度实验并使用本发明的公开内容,另外的siRNA可被设计并用于实施本发明的方法是应理解的。
siRNA还可包含一个或更多个核苷酸的改变。这样的改变可包括非核苷酸材料的添加,例如添加至19至25个核苷酸的RNA的末端或添加至内部(在RNA的一个或更多个核苷酸处)。在某些方面中,RNA分子包含3’-羟基。本发明的RNA分子中的核苷酸还可包含非标准核苷酸,包括非天然存在的核苷酸或脱氧核糖核苷酸。双链寡核苷酸可包含经修饰骨架,例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯或本领域已知的其他经修饰骨架,或者可包含非天然的核苷间键联(internucleoside linkage)。siRNA的另外的修饰(例如,2’-O-甲基核糖核苷酸、2’-脱氧-2’-氟核糖核苷酸、“通用碱基”核苷酸、5-C-甲基核苷酸、一个或更多个硫代磷酸酯核苷间键联、以及反向脱氧无碱基(deoxyabasic)残基并入)可见于美国申请公布2004/0019001和美国专利No.6,673,611(其各自通过引用整体并入)。上述所有这样的改变的核酸或RNA被统称为经修饰siRNA。
D.基因编辑***
一般而言,“CRISPR***”总体上是指涉及CRISPR相关(“Cas”)基因的表达或对其活性进行指导的转录物和其他元件,包括编码Cas基因的序列、tracr(反式激活CRISPR)序列(例如,tracrRNA或活性部分tracrRNA)、tracr伴侣(tracr-mate)序列(包括“同向重复序列”,以及在内源性CRISPR***背景下经tracrRNA加工的部分同向重复序列)、指导序列(在内源性CRISPR***的背景下也称为“间隔区”)和/或来自CRISPR基因座的其他序列和转录物。
CRISPR/Cas核酸酶或CRISPR/Cas核酸酶***可包含非编码RNA分子(指导)RNA,其序列与DNA特异性地结合;以及Cas蛋白(例如,Cas9),其具有核酸酶功能(例如,两个核酸酶结构域)。CRISPR***的一个或更多个元件可来源于I型、II型或III型CRISPR***,例如来源于包含内源性CRISPR***的特定生物体,例如酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)。
在一些方面中,将Cas核酸酶和gRNA(包括对靶序列具有特异性的crRNA与固定的tracrRNA的融合体)引入到细胞中。一般而言,使用互补碱基配对,gRNA的5’端处的靶位点将Cas核酸酶靶向至靶位点,例如基因。靶位点可基于其紧邻前间区序列邻近基序(PAM)序列(例如通常为NGG或NAG)的5’的位置来选择。在该方面中,通过对指导RNA的前20、19、18、17、16、15、14、14、12、11或10个核苷酸进行修饰以对应于靶DNA序列来将gRNA靶向到所期望序列。一般而言,CRISPR***的特征在于促进靶序列位点处CRISPR复合物形成的元件。通常来说,“靶序列”通常是指指导序列被设计为具有互补性的序列,其中靶序列与指导序列之间的杂交促进CRISPR复合物的形成。如果存在足够的互补性以引起杂交并促进CRISPR复合物的形成,则并非必须需要完全互补性。
CRISPR***可在靶位点处诱导双链断裂(double stranded break,DSB),随后如本文中所述进行破坏。在另一些实施方案中,被认为是“切口酶”的Cas9变体用于在靶位点处使单链产生切口。可使用成对的切口酶,例如以提高特异性,每种酶均由不同的gRNA靶向序列对来指导,以使得在同时引入切口时,引入5’突出端。在另一些实施方案中,将无催化活性的Cas9与异源效应物结构域,例如转录阻遏物或激活物融合,以影响基因表达。
靶序列可包含任何多核苷酸,例如DNA或RNA多核苷酸。靶序列可位于细胞的核或胞质中,例如在细胞的细胞器内。通常来说,可用于重组为包含靶序列的靶基因座的序列或模板被称为“编辑模板”或“编辑多核苷酸”或“编辑序列”。在一些方面中,外源模板多核苷酸可被称为编辑模板。在一些方面中,重组是同源重组。
通常来说,在内源性CRISPR***的背景下,CRISPR复合物(包含与靶序列杂交并与一种或更多种Cas蛋白复合的指导序列)的形成导致靶序列中或其附近(例如,距靶序列1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、50或更多个碱基对内)的一条或两条链的切割。可包含野生型tracr序列的全部或一部分(例如,野生型tracr序列的约或多于约20、26、32、45、48、54、63、67、85或更多个核苷酸)或者由其组成的tracr序列也可形成CRISPR复合物的一部分,例如通过沿tracr序列的至少一部分与可操作地连接至指导序列的tracr伴侣序列的全部或一部分进行杂交。tracr序列与tracr伴侣序列具有足够的互补性以进行杂交并参与CRISPR复合物的形成,例如当进行最佳比对时,沿tracr伴侣序列的长度至少50%、60%、70%、80%、90%、95%或99%的序列互补性。
可将驱动CRISPR***的一个或更多个元件表达的一个或更多个载体引入细胞中,以使得CRISPR***的元件表达指导一个或更多个靶位点处CRISPR复合物的形成。组件也可作为蛋白质和/或RNA递送至细胞。例如,Cas酶、与tracr伴侣序列连接的指导序列以及tracr序列可各自可操作地连接至单独载体上的单独调节元件。或者,可将由相同或不同调节元件表达的两个或更多个元件组合在单一载体中,同时一个或更多个另外的载体提供不包含在第一载体中的CRISPR***的任何组件。载体可包含一个或更多个***位点,例如限制性内切核酸酶识别序列(也称为“克隆位点”)。在一些实施方案中,一个或更多个***位点位于一个或更多个载体的一个或更多个序列元件的上游和/或下游。当使用多个不同的指导序列时,可使用单一表达构建体以将CRISPR活性靶向到细胞内的多个不同的相应靶序列。
载体可包含可操作地连接至编码CRISPR酶(例如Cas蛋白)的酶编码序列的调节元件。Cas蛋白的一些非限制性实例包括Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9(也称为Csn1和Csx12)、Cas10、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx15、Csfl、Csf2、Csf3、Csf4,其同源物或其经修饰形式。这些酶是已知的;例如,酿脓链球菌(S.pyogenes)Cas9蛋白的氨基酸序列可见于SwissProt数据库于登录号Q99ZW2下。
CRISPR酶可以是Cas9(例如来自酿脓链球菌或肺炎链球菌(S.pneumonia))。CRISPR酶可指导在靶序列的位置处,例如在靶序列内和/或在靶序列的互补序列内的一条或两条链的切割。载体可编码相对于相应的野生型酶突变的CRISPR酶,以使得突变的CRISPR酶缺乏切割包含靶序列的靶多核苷酸的一条或两条链的能力。例如,来自酿脓链球菌的Cas9的RuvC I催化结构域中的天冬氨酸至丙氨酸的替换(D10A)将Cas9从切割两条链的核酸酶转换为切口酶(切割单链)。在一些实施方案中,Cas9切口酶可与指导序列(例如两个指导序列)组合使用,所述指导序列分别靶向DNA靶标的有义和反义链。该组合允许这两条链均产生切口并用于诱导NHEJ或HDR。
在一些实施方案中,对编码CRISPR酶的酶编码序列进行密码子优化以在特定细胞,例如真核细胞中表达。真核细胞可以是特定生物体的那些或者来源于所述特定生物体,所述生物体例如哺乳动物,包括但不限于人、小鼠、大鼠、兔、狗或非人灵长类。一般而言,密码子优化是指在维持天然氨基酸序列的同时,通过用目的宿主细胞的基因中更频繁或最频繁使用的密码子替换天然序列的至少一个密码子来修饰核酸序列以在该宿主细胞中增强表达的过程。多种物种对特定氨基酸的某些密码子表现出特定的偏倚。密码子偏倚(生物体之间密码子选用的差异)通常与信使RNA(mRNA)的翻译效率相关,而信使RNA(mRNA)的翻译效率继而被认为尤其取决于所翻译密码子的特性和特定转移RNA(tRNA)分子的可用性。所选择tRNA在细胞中的优势通常反映了肽合成中最频繁使用的密码子。因此,可基于密码子优化来定制基因以在给定生物体中进行最佳基因表达。
一般而言,指导序列是与靶多核苷酸序列具有足够互补性以与靶序列杂交并且将CRISPR复合物与靶序列直接序列特异性地结合的任何多核苷酸序列。在一些实施方案中,当使用合适的比对算法进行最佳比对时,指导序列与其对应的靶序列之间的互补性程度为约或大于约50%、60%、75%、80%、85%、90%、95%、97.5%、99%或更高。
最佳比对可通过使用用于比对序列的任何合适的算法来确定,所述算法的一些非限制性实例包括史密斯-沃特曼算法(Smith-Waterman algorithm);内德勒曼-温施算法(Needleman-Wunsch algorithm);基于伯劳斯-惠勒变换(Burrows-Wheeler Transform)的算法(例如,伯劳斯-惠勒比对器(Burrows Wheeler Aligner));Clustal W;Clustal X;BLAT;Novoalign(Novocraft Technologies,ELAND(Illumina,San Diego,Calif.));SOAP(可在soap.genomics.org.cn上获得)以及Maq(可在maq.sourceforge.net上获得)。
CRISPR酶可以是包含一个或更多个异源蛋白质结构域的融合蛋白的一部分。CRISPR酶融合蛋白可包含任何另外的蛋白质序列,以及任选地在任何两个结构域之间的接头序列。可与CRISPR酶融合的蛋白质结构域的一些实例包括但不限于表位标签、报道基因序列和具有以下活性中的一种或更多种的蛋白质结构域:甲基化酶活性、去甲基化酶活性、转录激活活性、转录阻遏活性、转录释放因子活性、组蛋白修饰活性、RNA切割活性和核酸结合活性。表位标签的一些非限制性实例包括组氨酸(His)标签、V5标签、FLAG标签、流感血凝素(influenza hemagglutinin,HA)标签、Myc标签、VSV-G标签和硫氧还蛋白(thioredoxin,Trx)标签。报道基因的一些实例包括但不限于谷胱甘肽5转移酶(glutathione-5-transferase,GST)、辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)、氯霉素乙酰转移酶(chloramphenicol acetyltransferase,CAT)β半乳糖苷酶、β葡糖醛酸糖苷酶、萤光素酶、绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)、HcRed、DsRed、青色荧光蛋白(cyanfluorescent protein,CFP)、黄色荧光蛋白(yellow fluorescent protein,YFP)以及自发荧光蛋白,包括蓝色荧光蛋白(blue fluorescent protein,BFP)。CRISPR酶可与编码结合DNA分子或结合其他细胞分子的蛋白质或蛋白质片段的基因序列融合,所述蛋白质或蛋白质片段包括但不限于麦芽糖结合蛋白(maltose binding protein,MBP)、S标签、Lex A DNA结合结构域(DNA binding domain,DBD)融合体、GAL4A DNA结合结构域融合体以及单纯疱疹病毒(herpes simplex virus,HSV)BP16蛋白质融合体。可形成包含CRISPR酶的融合蛋白的一部分的另外结构域描述于US 20110059502,其通过引用并入本文。
V.试剂盒和诊断
在本发明的多个方面中,设想了包含从体液或组织培养基中纯化外排体所必需组分的试剂盒。在另一些方面中,设想了包含分离外排体并将其用治疗性核酸、治疗性蛋白质或抑制性RNA进行转染所必需组分的试剂盒。该试剂盒可包含一个或更多个密封的小瓶,其中包含任何这样的组分。在一些实施方案中,试剂盒还可包含合适的容器装置,所述容器是不会与试剂盒的组分反应的容器,例如eppendorf管、测定板、注射器、瓶或管。容器可由可灭菌材料(例如塑料或玻璃)制成。试剂盒还可包含说明单,其概述了本文中所阐述方法的程序性步骤,并且将遵循与本文中所述或本领域普通技术人员已知的基本上相同的程序。指令信息可在包含机器可读指令的计算机可读介质中,当使用计算机执行该机器可读指令时,导致显示从样品中纯化外排体并转染具有治疗性载物的外排体的真实或虚拟程序。
VI.实施例
包括以下实施例以示出本发明的一些优选实施方案。本领域技术人员应理解,以下实施例中公开的技术表示发明人发现的在本发明的实践中运行良好的技术,并因此可认为构成用于其实践的优选模式。然而,根据本公开内容,本领域技术人员应理解,在不脱离本发明的精神和范围的情况下,可在所公开的一些具体实施方案中进行许多改变,并且仍然获得相似或类似的结果。
实施例1-使用外排体将TP53R273H siRNA向Panc-1原位肿瘤的递送
使用lipofectamine转染测试了靶向TP53R273H的siRNA(CAGCUUUGAGGUGCAUGUUUG;SEQ ID NO:1)在Panc-1细胞(其对于TP53R273H是纯合突变体)中的敲低效率(图1A)。
siRNA构建体设计成特异性地靶向KrasG12D。siRNA序列反映了与野生型Kras基因序列的G到A核苷酸偏差(下划线且粗体),以便特异性地靶向在细胞系和动物模型中发现的KrasG12D突变中甘氨酸到天冬氨酸的氨基酸替换,以及TT核苷酸突出端(下划线)以提高沉默效率(Rejiba et al.,2007;Ma et al.,2004;Du et al.,2005)。
将携带Panc-1GFP/Luc原位肿瘤的小鼠用(1)对照外排体、(2)包含靶向TP53R273H的siRNA的外排体或(3)包含靶向TP53R273H的siRNA的外排体和包含靶向KrasG12D的siRNA的外排体进行处理(i.p.)。对照组显示出最高的肿瘤生长水平(图1B和1C)。并且发现两个处理组均降低了肿瘤负荷(图1B和1C)。
为了评估外排体向肝和胰腺的递送,对成年恒河猴静脉内施用未经标记的外排体(对照)或用PKH膜染料标记的外排体(PKH外排体)。将猴的肝和胰腺冷冻并切片并封固在载片上。为定义细胞核而用DAPI复染的切片的显微镜评价显示了外排体在肝和胰腺中稳健且特异性的积聚(图2)。此外,还观察到外排体与胰腺细胞核的共定位(图3A)。在肝和胰腺中注释的外排体病灶尺寸的定量分析,并且与肝相比胰腺中每个细胞的外排体具有大尺寸的病灶以及更高的积聚(图3B)。
为了评估外排体载物向不同器官的递送,两只猴静脉内(i.v.)接受iExosome,并且第三只猴腹膜内(i.p.)接受iExosome。在成年恒河猴中施用之后,通过q-PCR分析确定siRNA载荷(在外排体内)的定量(图4)。
***
根据本公开内容,本文中公开和要求保护的所有方法无需过度实验就可进行和实施。尽管已经以一些优选实施方案的方式描述了本发明的组合物和方法,但对于本领域技术人员来说将明显的是可将改变应用于本文中所述的方法以及所述方法的步骤或步骤顺序而不脱离本发明的概念、精神和范围。更具体地,将明显的是,可用化学和生理学二者相关的某些试剂替代本文中描述的试剂,同时将获得相同或类似的结果。对于本领域技术人员明显的所有此类类似的替代和改变被视为在由所附权利要求书所限定的本发明的精神、范围和概念内。
参考文献
以下参考文献通过引用特定地并入本文中,在某种程度上,其提供了补充本文中所示出的那些的示例性过程或其他细节。
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序列表
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<120> 使用外排体对肿瘤抑制因子的治疗性调节
<130> UTFC.P1369WO
<140> 尚且未知
<141> 2019-04-19
<150> US 62/659,859
<151> 2018-04-19
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 1
cagcuuugag gugcauguuu g 21
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 2
guuggagcug auggcguagt t 21
Claims (45)
1.组合物,其包含基于脂质的纳米粒,所述基于脂质的纳米粒包含使显性负肿瘤抑制因子突变体或致癌性功能获得性肿瘤抑制因子突变体失活的治疗剂载物。
2.权利要求1所述的组合物,其中所述基于脂质的纳米粒在其表面上包含CD47。
3.权利要求1所述的组合物,其中所述基于脂质的纳米粒在其表面上包含生长因子。
4.权利要求1所述的组合物,其中所述基于脂质的纳米粒是脂质体或外排体。
5.权利要求1所述的组合物,其中所述治疗剂载物是治疗性蛋白质、抗体、抑制性RNA、基因编辑***或小分子药物。
6.权利要求5所述的组合物,其中所述治疗性蛋白质对应于致癌性功能获得性肿瘤抑制因子突变体的显性负形式。
7.权利要求5所述的组合物,其中所述抗体结合胞内抗原。
8.权利要求5所述的组合物,其中所述抗体是全长抗体、scFv、Fab片段、(Fab)2、双链抗体、三链抗体或微抗体。
9.权利要求5所述的组合物,其中所述抑制性RNA是siRNA、shRNA、miRNA或前miRNA。
10.权利要求9所述的组合物,其中所述siRNA敲低所述显性负肿瘤抑制因子突变体或致癌性功能获得性肿瘤抑制因子突变体的表达。
11.权利要求9所述的组合物,其中所述基因编辑***是CRISPR***。
12.权利要求11所述的组合物,其中所述CRISPR***包含内切核酸酶和指导RNA(gRNA)。
13.权利要求12所述的组合物,其中所述内切核酸酶和所述gRNA在所述外排体内的单个核酸分子上编码。
14.权利要求11所述的组合物,其中所述CRISPR***靶向致癌突变。
15.权利要求14所述的组合物,其中所述显性负肿瘤抑制因子突变体或致癌性功能获得性肿瘤抑制因子突变体是一个或更多个点突变。
16.权利要求1所述的组合物,其中所述肿瘤抑制因子是ACVR1B、APC、ARID1B、ARID2、ASXL1、ATM、ATRX、AXIN1、B2M、BAP1、BCOR、BLU(β*)、BRCA1、BRCA2、CACNA2D2(基因26)、CASP8、C-CAM、CDKN1A(p21)、CDKN1B(p27)、CDKN1C(p57)、CDKN2A(p16)、CDKN2D(p19)、CEBPA、CFTR、CIC、CHK2、CREBBP、CTS-1、CYB561D2、CYLD、DAXX、DCC、DPC4、EP300、FAM123B、FCC、FUBP1、FUS1、GATA1、GATA3、HIN-1、HNF1A、HYAL1(Luca-10、HYAL2(Luca-2)、KDM5C、KDM6A、KRAS、KRAS2b、MADR2/JV18、MAP3K1、MCC、MEN1、MEN2、MLH1、MLL2、MLL3、MMAC1、MSH2、MSH6、MTS1、NCOR1、NF1、NF2、NOTCH1、NOTCH2、NPM1、NPRL2(基因21)、PAX5、PBRM1、PHF6、PIK3R1、PL6、PLAGL1、PRDM1、PTCH1、PTEN、RASSF1(123F2)、RB1、RNF43、RUNX1、SCGB1A1、SEMA3A、SETD2、Skp2、SMAD2、SMAD4、SMARCA4、SMARCB1、SOCS1、SOX9、STAG2、STK11、TET2、TNPAIP3、TP53、TP73、TRAF7、TSC1、VHL、WRN、WT1或WWOX。
17.权利要求1所述的组合物,其中所述肿瘤抑制因子是TP53。
18.权利要求17所述的组合物,其中所述致癌性功能获得性肿瘤抑制因子突变体是TP53R273H。
19.权利要求18所述的组合物,其中所述治疗剂是siRNA,其中所述siRNA具有SEQ IDNO:1的序列。
20.权利要求1所述的组合物,其中所述肿瘤抑制因子是KRAS。
21.权利要求20所述的组合物,其中所述致癌性功能获得性肿瘤抑制因子突变体是KRASG12D。
22.权利要求21所述的组合物,其中所述治疗剂是siRNA,其中所述siRNA具有SEQ IDNO:2的序列。
23.权利要求1所述的组合物,其包含第一基于脂质的纳米粒和第二基于脂质的纳米粒,所述第一基于脂质的纳米粒包含具有SEQ ID NO:1序列的siRNA,所述第二基于脂质的纳米粒包含具有SEQ ID NO:2序列的siRNA。
24.药物组合物,其包含权利要求1至23中任一项所述的基于脂质的纳米粒以及赋形剂。
25.权利要求24所述的组合物,其中所述组合物配制成用于肠胃外施用。
26.权利要求25所述的组合物,其中所述组合物配制成用于静脉内、肌内、皮下或腹膜内注射。
27.权利要求25所述的组合物,其还包含抗微生物剂。
28.权利要求27所述的组合物,其中所述抗微生物剂是苯扎氯铵、苄索氯铵、苄醇、布罗波尔、西曲溴铵、西吡氯铵、氯己定、氯丁醇、氯甲酚、氯二甲酚、甲酚、乙醇、甘油、海克替啶、咪唑烷脲、苯酚、苯氧乙醇、苯乙醇、硝酸苯汞、丙二醇或硫柳汞。
29.在有此需要的患者中治疗癌症的方法,其包括向所述患者施用权利要求24至28中任一项所述的组合物,从而在所述患者中治疗所述癌症。
30.权利要求29所述的方法,其中施用导致所述治疗剂载物向所述患者中的癌细胞的递送。
31.权利要求29所述的方法,其中癌症是乳腺癌、肺癌、头颈癌、***癌、食管癌、气管癌、脑癌、肝癌、膀胱癌、胃癌、胰腺癌、卵巢癌、子宫癌、***、睾丸癌、结肠癌、直肠癌或皮肤癌。
32.权利要求31所述的方法,其中所述胰腺癌是胰腺导管腺癌。
33.权利要求29所述的方法,其中所述癌症是转移性的。
34.权利要求29所述的方法,其中所述癌症对于所述致癌性功能获得性肿瘤抑制因子突变体是纯合的。
35.权利要求29所述的方法,其中癌细胞对于所述致癌性功能获得性肿瘤抑制因子突变体是杂合的。
36.权利要求29所述的方法,其中癌细胞对于所述显性负肿瘤抑制因子突变体是纯合的。
37.权利要求29所述的方法,其中所述施用是全身性施用。
38.权利要求37所述的方法,其中所述全身性施用是静脉内施用。
39.权利要求29所述的方法,其还包括向所述患者至少施用第二治疗。
40.权利要求39所述的方法,其中所述第二治疗包括手术治疗、化学治疗、放射治疗、冷冻治疗、激素治疗或免疫治疗。
41.权利要求29所述的方法,其中所述患者是人。
42.权利要求41所述的方法,其中所述基于脂质的纳米粒是外排体,其中所述外排体对于所述患者是自体的。
43.权利要求42所述的方法,其中所述外排体获自从所述患者获得的体液样品。
44.权利要求43所述的方法,其中所述体液样品是血液、淋巴、唾液、尿、脑脊液、骨髓抽吸物、眼渗出物/泪、或血清。
45.权利要求29所述的方法,其还包括在所述癌症的部位处提供生长因子梯度以将所述外排体吸引至所述部位并将所述治疗剂递送至所述部位。
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