KR20200143455A - 인간 키누레니나제 효소 및 이의 사용법 - Google Patents

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KR20200143455A
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조지 조르지우
에버렛 스톤
존 블라젝
크리스토스 카라미트로스
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Abstract

키누레니나제 활성을 갖는 단백질의 사용과 관련된 방법 및 조성물이 기술된다. 예를 들어, 특정 양태에서 키누레닌을 분해할 수 있는, 변형된 키누레니나제가 개시될 수 있다. 또한, 본 발명의 특정 양태는, 개시된 단백질 또는 핵산을 사용해서 키누레닌을 고갈시켜 암을 치료하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다.

Description

인간 키누레니나제 효소 및 이의 사용법
본 출원은 2018년 4월 16일 출원된 미국 가특허 출원 제62/658,261호의 이익을 주장하며, 이의 전체 내용이 본원에 참조로 포함된다.
본 발명은 미 국립보건원이 수여한 인가 번호 제R01 CA154754호 하의 정부지원으로 이루어졌다. 정부가 본 발명에 특정한 권리를 갖는다.
본 발명은 일반적으로 분자 생물학 및 종양학 분야에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 조작된 키누레니나제 효소와 이를 사용하기 위한 방법에 관한 것이다.
키누레닌은 인돌아민 2,3 디옥시게나제(IDO) 또는 트립토판 2,3 디옥시게나제(TDO) 중 어느 하나의 작용을 통해 생성된 아미노산 트립토판의 대사산물이다. 키누레닌은 세포 생리학에 복합적인 영향을 주며, 그 중 가장 중요한 것 중 하나는 T 세포 반응의 조절이다. 많은 종양 세포는 키누레닌의 국부 농도를 상승시키기 위해 IDO 및/또는 TDO 효소의 합성을 조절하며, 이는 트립토판의 고갈을 동반한다. 이어서, 높은 수준의 키누레닌은 원래는 종양을 공격했었을 종양 침투 T 세포의 기능을 저해하는 강력한 수단으로 기능한다.
암에서 키누레닌 생성의 중요성은 잘 알려져 있으며 키누레닌 생성 효소 IDO 및 TDO의 억제제를 개발해 왔고, 이들 화합물 중 적어도 하나는 현재 임상 2상 평가를 받고 있다. 그러나, IDO 또는 TDO 억제는 암 치료에 문제점이 있는데, 그 이유는, (1) IDO에는 두 가지 동형단백질이 있으며 TDO와 함께 현재 키누레닌 생성을 위해 가능한 모든 경로를 억제하려면 다중 소분자 억제제의 생성이 필요하고, (2) 억제에 대한 내성이 생길 수 있기 때문이다.
인간 키누레니나제는 3'0H 키누레닌의 분해에 대해 강한 선호도를 가지며, 이는 키누레닌 분해에 대해 나타난 것보다 약 1,000 높은 촉매 효율 (Kcat/Km)로 분해된다. 대조적으로, 일부 박테리아 효소, 예컨대 P. fluorescens 효소는 3'OH 키누레닌보다 키누레닌에 강한 선호도를 갖는다. 치료 목적상, 인간의 생체 내 적용을 위한 필수 약리학적 특성을 갖는 제제(즉, 치료 효소)를 갖는 것이 필수적이다. 이들은, (i) 키누레닌에 대한 높은 촉매 활성도, (ii) 단일 투여시 혈청 및 조직에서 키누레닌의 장기간 고갈을 달성하기 위해 혈청에서의 비활성화에 대한 안정성 향상을 포함한다.
본 발명의 양태는 당해 분야의 주요 결함을 극복하기 위해, L-키누레닌을 분해할 수 있는 조작된 폴리펩티드 서열을 포함하는 효소를 제공하고, 이는 불리한 면역 반응의 유도를 피하기 위해 인간 효소와 높은 정도의 서열 동일성을 갖고 암 치료를 위해 원하는 대로 혈청에서 유리한 약동학을 나타낸다. PCT/US2014/053437에서, 본 발명자는 야생형 인간 효소에 비해 KYN 분해에 대해 최대 24배 더 높은 촉매 효율을 갖는 돌연변이 인간 키누레니나제(본원에서 h-KYNase 또는 HsKYN로도 지칭됨) 효소를 개시하였다. PCT/US2014/053437에 개시된 것에 비해, 인간 혈청에서 더 높은 촉매 활성 및 안정성을 갖는 돌연변이 h-KYNase 효소의 발견이 필요하다. 본 출원의 양태는 이러한 필요성을 해결하고, 더 높은 촉매 효율을 갖는 돌연변이 효소, 및 야생형 h-KYNase보다 더 높은 촉매 활성을 갖는 돌연변이 효소뿐만 아니라 향상된 혈청 안정성을 갖는 효소를 개시한다.
제1 구현예에서, 본 발명은 단리된, 변형된 인간 키누레니나제 효소를 제공하고, 상기 변형된 효소는 SEQ ID NO:1, 2, 3의 인간 키누레니나제 효소 또는 표1에 제공된 폴리펩티드 중 하나에 대해 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 아미노산 서열 동일성을 갖고, (SEQ ID NO:1에 대해) 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 치환을 포함한다: L8P, K38E, Y47L, I48F, K50Q, I51M, S60N, K64N, D65G, E66K, N67D, N67P, D67S, A68F, A68T, A68V, F71L, F71M, L72N, K84E, E88N, E89K, E89S, E90Q, D92E, K93N, K93T, A95H, A95Q, K96N, I97H, I97L, I97V, A98G, A99G, A99I, A99R, A99S, A99T, A99V, Y100N, Y100S, Y100T, G101A, H102W, E103F, E103H, E103N, E103Q, E103R, E103V, E103W, V104D, V104E, V104F, V104H, V104K, V104L, V104R, G105A, G105H, G105S, G105T, E106D,K106D, K106E, K106H, K106N, R107P, R107S, P108R, I110A, I110F, I110L, I110M, I110T, T111D, T111H, T111N, T111R, G112A, G112C, G112D, G112K, G112L, G112M, G112Q, G112R, G112S, G112T, G112Y, N127K, I131V, A132V, L133V, A136T, L137T, T138S, N140D, H142Q, Q14R, Y156H, K163T, D168E, H169R, Q175L, I183F, I183L, I183P, I183S, E184A, E184D, E184R, E184T, E184V, E185T, M187L, M189I, K191A, K191G, K191H, K191M, K191N, K191R, K191S, K191T, K191W, E197A, E197D, E197F, E197K, E197M, E197Q, E197S, E197T, E197V, I201C, I201E, I201F, I201H, I201L, I201S, I201T, I201V, H203K, L219M, L219W, F220L, V223I, F225Y, H230F, H230L, H230Y, N232S, Y246F, F249W, D250E, S274A, S274C, S274G, S274N, S274T, L278M, A280G, A280S, A280T, G281S, A282M, A282P, G284N, I285L, V303L, V303S, F306W, F306Y, S311N, K315E, D317E, D317K, I331C, I331L, I331N, I331S, I331T, I331V, N333T, P334N, P335T, L337T, L338A, L338Q, S341I, K373E, K373N, N375A, N375H, Y376C, Y376F, Y376L, K378G, K378P, K378Q, K378R, K380G, K380S, A382G, A382R, A382T, T383S, K384G, K384N, P386K, P386S, V387L, N389E, I405L, F407Y, S408D, S408N, N411R, D413S, D413V, Q416T, E419A, E419L, K420E, R421N, V424I, K427M, N429E, G432A 및 A436T. 일부 양태에서, 상기 아미노산 서열은 SEQ ID NO:1, 2, 또는 3의 아미노산 서열에 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일하거나, 표 1의 효소 하나에 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일하다. 특정 양태에서, 상기 효소는 A282(예, A282M 또는 A282P), F306(예, F306W 또는 F306Y) 또는 F249, 예컨대 F249W에서 치환을 포함할 수 있다. 추가 양태에서, 상기 효소는 L72N 치환을 포함할 수 있다. 또한 추가 양태에서, 상기 효소는 F306W 치환을 포함할 수 있다. 특정 양태에서, 상기 효소는 H102W 및 N333T 치환을 포함할 수 있다. 다른 양태에서, 상기 효소는 A99에서 치환을 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 상기 효소는 G112에서 치환을 포함할 수 있다. 특정 양태에서, 상기 효소는 E103에서 치환을 포함할 수 있다. 다른 양태에서, 상기 효소는 V104에서 치환을 포함할 수 있다. 추가 양태에서, 상기 효소는 S408에서 치환을 포함할 수 있다. 추가 양태에서, 상기 효소는 I183P 치환을 포함할 수 있다. 일부 특정 양태에서, 상기 효소는 R107P 치환을 포함할 수 있다. 다른 특정 양태에서, 상기 효소는 A436T 치환을 포함할 수 있다.
또한 추가 양태에서, 상기 효소는 L72N, H102W, A282P, F306W, I331S 및 N333T로부터 선택된 적어도 하나의 치환을 포함할 수 있다. 특정 양태에서, 상기 효소는 L72N, H102W, A282P, F306W, I331S 및 N333T로부터 선택된 적어도 2, 3, 4, 또는 5개의 치환을 포함한다. 일부 양태에서, 상기 효소는 L72N, H102W, A282P, F306W, I331S 및 N333T 치환을 포함할 수 있다. 추가적인 양태에서, 상기 효소는 KYN에 대한 촉매 활성도(kcat/kM)가 적어도 8000M-1s-1이다. 다른 양태에서, 상기 효소는 KYN에 대한 촉매 활성도(kcat/kM)가 8000M-1s-1 내지 40000M-1s-1, 10000M-1s-1 내지 40000M-1s-1, 20000M-1s-1 내지 40000M-1s-1, 또는 25000M-1s-1 내지 35000M-1s-1이다.
일부 추가 양태에서, 상기 폴리펩티드는 표 1의 폴리펩티드 중 하나의 아미노산 사열에 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일하다. 특정 양태에서, 상기 폴리펩티드는 표 1의 폴리펩티드 중 하나에 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 추가 양태에서, 상기 폴리펩티드는 SEQ ID NO:2의 아미노산 서열에 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 특정 양태에서 상기 폴리펩티드는 SEQ ID NO:2에 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 특정 양태에서, 상기 아미노산 서열은 SEQ ID NO:3의 아미노산 서열에 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일하다. 특정 양태에서 상기 폴리펩티드는 SEQ ID NO:3에 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
추가적인 양태에서, 본 구현예의 키누레니나제 효소는, 본원에 참조로 전체가 포함된 WO/2015/031771, WO/2016/033488 또는 WO/2017/151860 각각에 개시된 아미노산 치환 중 하나를 추가로 포함한다.
추가 양태에서, KYN을 분해할 수 있는 자연적인 또는 변형된 인간 또는 영장류 키누레니나제를 포함한 폴리펩티드가 제공된다. 일부 구현예에서, 상기 폴리펩티드는 생리학적 조건 하에 KYN을 분해할 수 있다. 예를 들어, 상기 폴리펩티드는 KYN에 대한 촉매 효율(k cat /K M )을 적어도 또는 약 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 104, 105, 106 M-1s-1 또는 이들 중 파생 가능한 임의 범위를 갖는다.
위에서 설명한 바와 같이 변형된 폴리펩티드는, 변형되지 않은 폴리펩티드(예, 자연적인 폴리펩티드, 예컨대 SEQ ID NO:1의 인간 키누레니나제) 또는 본 명세서에 개시된 임의의 폴리펩티드 서열과 비교시, 특정 비율의 동일성을 갖는 것을 특징으로 할 수 있다. 예를 들어, 상기 변형되지 않은 폴리펩티드는 적어도, 또는 최대, 약 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 또는 465 잔기(또는 이들 중 파생 가능한 임의 범위)의 자연적인 키누레니나제를 포함할 수 있다. 상기 동일성 비율은, 상기 변형된 및 상기 변형되지 않은 폴리펩티드 또는 임의의 두 서열을 비교할 때, 대략, 최대 또는 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%(또는 이들 중 파생 가능한 임의 범위)일 수 있다. 또한 위에서 설명된 동일성 비율은, 폴리펩티드의 변형되지 않은 영역과 비교할 때, 폴리펩티드의 특정 변형된 영역과 관련될 수 있다고 여겨진다. 예를 들어, 폴리펩티드는 키누레니나제의 변형되거나 돌연변이를 일으킨 기질 인식 부위를 포함할 수 있고, 이 부위는 동일한 종 또는 다른 종으로부터의 변형되지 않았거나 돌연변이를 일으킨 키누레니나제의 아미노산 서열 대비 키누레니나제의 변형되거나 돌연변이를 일으킨 기질 인식 부위의 아미노산 서열의 동일성을 기초로 특징화될 수 있다. 예를 들어, 변형되지 않은 키누레니나제에 대해 적어도 90% 동일성을 갖는 것을 특징으로 하는, 변형되거나 돌연변이를 일으킨 인간 폴리펩티드는, 상기 변형되거나 돌연변이를 일으킨 인간 폴리펩티드 내 아미노산의 적어도 90%가 상기 변형되지 않은 폴리펩티드 내 아미노산과 동일함을 의미한다.
이렇게 변형되지 않은 폴리펩티드는 자연적인 키누레니나제, 특히 인간 동형 단백질 또는 다른 영장류 동형 단백질일 수 있다. 예를 들어, 자연적인 인간 키누레니나제는 SEQ ID NO:1 서열을 가질 수 있다. 다른 자연적인 영장류 키누레니나제의 비제한적인 예시는, Pongo abelii 키누레니나제(Genbank ID:XP_009235962.1, GI:686708656), Macaca fascicularis 키누레니나제(Genbank ID:EHH54849.1, GI:355750522), 및 Pan troglodytes 키누레니나제(Genbank ID:XP_003309314.1, GI:332814521)를 포함한다. 자연적인 폴리펩티드 예시는 SEQ ID NO:1의 약, 최대 또는 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성(또는 이들 중 파생 가능한 임의 범위)을 갖는 서열을 포함한다. 예를 들어, 상기 자연적인 폴리펩티드는 SEQ ID NO:1의 서열의 적어도 또는 최대 약 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 465 잔기(또는 이들 중 파생 가능한 임의 범위)를 포함할 수 있다.
일부 양태에서, 본 구현예의 폴리펩티드는 이종 아미노산 서열에 연결된 키누레니나제를 포함한다. 예를 들어, 상기 키누레니나제는 상기 이종 아미노산 서열에 융합 단백질로서 연결될 수 있다. 특정 구현예에서, 키누레니나제는 생체 내 반감기를 증가시키기 위해 아미노산 서열, 예컨대 IgG Fc, 알부민, 알부민 결합 단백질, 또는 XTEN 폴리펩티드에 연결된다.
혈청 지속성을 높이기 위해, 키누레니나제는 하나 이상의 폴리에테르 분자에 연결될 수 있다. 특정 구현예에서, 폴리에테르는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)일 수 있다. 폴리펩티드는 특정한 아미노산 잔기, 예컨대 리신 또는 시스테인을 통해 PEG에 (예를 들어, 공유적으로) 연결될 수 있다. 치료적 투여를 위해, 키누레니나제를 포함하는 이러한 폴리펩티드는 약제학적으로 허용되는 담체 내에 분산될 수 있다.
일부 양태에서, 이러한 키누레니나제를 인코딩하는 핵산이 고려된다. 일부 구현예에서, 핵산은 박테리아에서 발현이 최적화된 코돈이었다. 특정 구현예에서, 박테리아는 대장균(E. coli)다. 다른 양태에서, 핵산은 균류(예, 효모), 곤충, 또는 포유류에서 발현이 최적화된 코돈이었다. 추가 양태에서, 벡터, 예컨대 이러한 핵산을 함유한 발현 백터가 제공된다. 특정 구현예에서, 키누레니나제를 인코딩하는 핵산은, 이종 프로모터를 포함하지만 이에 제한되지 않는 프로모터에 작동 가능하도록 연결된다. 일 구현예에서, 키누레니나제는 벡터(예, 유전자 치료 벡터)에 의해 표적 세포로 송달될 수 있다. 이러한 바이러스는 표적 세포에서 키누레니나제-인코딩 핵산의 발현이 가능하도록 재조합 DNA 기술에 의해 변형될 수 있었다. 이들 벡터는 비-바이러스성(예, 플라스미드) 또는 바이러스성(예, 아데노바이러스, 아데노-연관 바이러스, 레트로바이러스, 렌티바이러스, 헤르페스 바이러스 또는 백시니아 바이러스) 유래의 벡터로부터 도출될 수 있다. 비-바이러스성 벡터는 바람직하게는 세포막을 통한 DNA의 유입을 용이하게 하는 물질과 복합체를 이룬다. 이러한 비-바이러스성 벡터 복합체의 예시는, DNA 축합 반응 및 지질-기반 송달 시스템을 촉진하는 다중양이온성 물질을 갖는 제형을 포함한다. 지질-기반 송달 시스템의 예시는 핵산의 리포좀 기반 송달을 포함할 수 있다.
또한 추가적인 양태에서, 본 발명은 추가로 이러한 벡터를 포함한 숙주 세포를 고려한다. 숙주 세포는 박테리아(예, E. coli), 균류 세포(예, 효모), 곤충 세포, 또는 포유류 세포일 수 있다.
일부 구현예에서, 벡터는 키누레니나제를 발현하기 위해 숙주 세포에 도입된다. 단백질은 임의의 적절한 방식으로 발현될 수 있다. 일 구현예에서, 단백질은 숙주 세포에서 단백질이 글리코실화되어 발현된다. 다른 구현예에서, 단백질은 숙주 세포에서 단백질이 탈글리코실화되어 발현된다.
일부 구현예에서, 암은 키누레닌 고갈에 민감한 임의의 암이다. 일 구현예에서, 본 발명은 종양 세포 또는 암 환자를 치료하는 방법을 고려하며, 이러한 폴리펩티드를 포함한 제형을 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 투여는 암 세포의 적어도 일부가 사멸되게 하는 조건 하에 이루어진다. 다른 구현예에서, 상기 제형은, 생리학적 조건 하에 키누레닌-분해 활성을 가지며 부착된 폴리에틸렌 글리콜 사슬을 추가로 포함하는 그러한 키누레니나제를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 제형은, 전술한 키누레니나제 중 어느 하나 및 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약제학적 제형이다. 이렇게 약제학적으로 허용되는 부형제는 당업자에게 널리 공지되어 있다. 상기 모든 키누레니나제가 인간 치료에 유용할 것으로 고려될 수 있다.
추가 구현예에서, 종양 세포를 처리하는 방법이 또한 제공될 수 있으며, 상기 방법은 키누레닌-분해 활성을 가진 비-세균성(포유류, 예컨대, 영장류 또는 마우스) 키누레니나제 또는 이를 인코딩하는 핵산을 포함하는 제형을 투여하는 단계를 포함한다.
본 발명의 특정 양태에 따라, 키누레니나제를 함유하는 이러한 제형은, 정맥내, 피내, 동맥내, 복강내, 병변내, 두개내, 관절내, 전립선내, 흉막내, 활막내, 기관내, 비강내, 유리체내, 질내, 직장내, 종양내, 근육내, 피하, 결막하, 소포내, 점막으로, 심막내, 탯줄내, 안내, 경구로, 국소적으로, 흡입, 주입, 연속 주입, 국부 관류에 의해, 카테터를 통해, 세척을 통해, 지질 조성물 내(예, 리포좀), 또는 당업자에게 공지된 다른 방법 또는 앞서 나열한 것들의 임의 조합에 의해 투여될 수 있다.
추가 구현예에서, 상기 방법은 적어도 2차 항암 요법을 개체에 투여하는 단계를 또한 포함할 수 있다. 2차 항암 요법은 수술 요법, 화학 요법, 방사선 요법, 한랭 요법, 호르몬 요법, 면역 요법 또는 사이토킨 요법일 수 있다. 특정 양태에서, 2차 항암 요법은 면역 관문 억제제 요법, 예컨대 항-PD-1, 항-CTLA-4, 항-PD-L1 항체, 항-LAG3, 항-TIM-3, 항-ICOS, 항-CD137, 항-CD40, 항-KIR, 항-CD40L, 항-GITR, 또는 항-OX40 요법일 수 있다. 추가 양태에서, 2차 항암 요법은 항체 요법일 수 있고, 예컨대 항체-약물 접합체를 이용할 수 있다. 또한 추가 양태에서, 2차 항암 요법은 면역 이펙터 세포 또는 면역원성 조성물을 투입하는 것과 같은 면역요법이다. 예를 들어, 면역원성 조성물은 암 세포 항원, 및 선택적으로 보조제를 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 면역 이펙터 세포는 NK-세포, T-세포(예, CAR T-세포) 또는 NK/T-세포를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 키메라 항원 수용체(CAR) 및 본 구현예의 키누레니나제 효소를 포함한 T 세포가, 암을 가진 개체의 치료에 사용하기 위해 고려된다. 일부 양태에서, 상기 세포는 CAR 및 키누레니나제, 및 일부 경우에, 트랜스포사제를 인코딩하는 DNA로 형질주입될 수 있다.
CAR은, 예를 들어 HER2, CD19, CD20, 및 GD2를 포함한 임의의 관심의 암-세포 항원을 표적화할 수 있다. 항원 결합 부위 또는 도메인은, 본원에 전체가 참조로 포함된 미국 특허 제7,109,304호에 설명된 바와 같이, 특정 인간 단클론 항체로부터 유도된 단일-사슬 가변 단편(scFv)의 VH 및 VL 사슬 단편을 포함할 수 있다. 단편은 또한 인간 항원 특이적 항체의 임의의 수의 상이한 항원 결합 도메인일 수 있다. 더 많은 특정 구현예에서, 단편은 인간 세포에서 발현을 위한 인간 코돈 사용에 최적화된 서열에 의해 암호화된 항원 특이적 scFv이다. CAR의 추가적인 예시는, 예를 들어 WO 2012/031744, WO 2012/079000, WO 2013/059593, 및 미국 특허 제8,465,743호를 참조바라고, 상기 문헌은 전체가 본 명세서에 참조로 포함된다.
키누레니나제는 본원에 개시된 어느 한 키누레니나제일 수 있다. 세포를 형질감염시키는 방법은 당해 분야에 널리 공지되어 있지만, 특정 양태에서, 고도로 효율적인 형질감염 방법, 예컨대 전기천공이 사용된다. 예를 들어, 핵산은 뉴클레오펙션(nucleofection) 장치를 이용하여 세포에 주입될 수 있다. 바람직하게는, 형질감염 단계는 세포를 바이러스로 감염시키거나 형질도입하는 단계를 포함하지 않는데, 이는 처리된 개체에서 유전독성을 일으키고/일으키거나 바이러스 서열을 포함한 세포에 대한 면역 반응을 야기할 수 있기 때문이다.
다양한 CAR 구조체 및 이를 위한 발현 벡터는 당해 분야에 공지되어 있으며 추가로 본 명세서에서 자세히 언급된다. 예를 들어, 일부 양태에서, CAR 발현 벡터는 DNA 발현 벡터, 예컨대 플라스미드, 선형 발현 벡터 또는 에피솜(episome)이다. 일부 양태에서, 벡터는 추가적인 서열, 예컨대 CAR의 발현을 촉진하는 서열, 예컨대 프로모터, 촉진제, 다중-A 신호, 및/또는 하나 이상의 인트론의 발현을 촉진하는 서열을 포함한다. 바람직한 양태에서, CAR 암호화 서열은 전이인자 서열의 측면에 존재하므로, 트랜스포사제의 존재는 암호화 서열을 형질주입된 세포의 게놈에 통합시킬 수 있도록 한다.
특정 양태에서, 세포는 CAR 암호화 서열이 형질주입된 세포의 게놈 내로 통합되도록 촉진하는 트랜스포사제로 인해 추가로 형질주입된다. 일부 양태에서, 트랜스포사제는 DNA 발현 벡터로서 제공된다. 그러나, 바람직한 양태에서, 트랜스포사제는 발현가능한 RNA 또는 단백질로서 제공되므로 트랜스포사제의 장기 발현은 형질전환 세포에서 일어나지 않는다. 본 구현예에 따라 어떠한 트랜스포사제 시스템도 사용될 수 있다. 다른 양태에서, 세포는, CAR 암호화 서열 및 키누레니나제 암호화 서열이 세포의 게놈으로 통합되도록 촉진하는 렌티바이러스로 감염될 수 있다.
일 구현예에서, 키누레니나제 또는 키누레니나제를 인코딩하는 핵산을 포함하는 조성물은, 개체에서 종양을 치료하는데 사용될 수 있다. 다른 구현예에서, 종양의 치료를 위한 의약품의 제조에서 키누레니나제 또는 키누레니나제를 인코딩하는 핵산을 사용하는 방법이 제공된다. 상기 키누레니나제는 본 구현예 중 어느 한 키누레니나제일 수 있다.
본 발명의 방법 및/또는 조성물의 맥락에서 논의된 구현예는 본원에 기술된 임의의 다른 방법 또는 조성물에 대하여 사용될 수 있다. 따라서, 하나의 방법 또는 조성물에 관련된 구현예는 본 발명의 다른 방법 및 조성물에도 또한 적용될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 특정 성분에 대하여 “본질적으로 없는”이라는 말은 특정 성분이 조성물에 의도적으로 제형화되지 않았고/않았거나 단지 오염물질로서 존재하거나 극소량 존재한다는 것을 의미하는 것으로 본원에서 사용된다. 조성물의 임의의 의도치않은 오염물질로부터 기인한 특정 성분의 총량은 바람직하게는 0.01% 미만이다. 상기 특정 성분의 함량이 표준 분석 방법으로 검출될 수 없는 조성물이 가장 바람직하다.
본 명세서와 청구범위에서 사용된 바와 같이, 단수 표현(“하나” 또는 “일”)은 하나 이상을 의미할 수 있다. 본 명세서와 청구범위(들)에서 사용된 바와 같이, 단어 “포함하는”과 함께 사용되는 경우, 단수 표현(“하나” 또는 “일”)은 하나 또는 하나 초과를 의미할 수 있다. 본 명세서와 청구범위에서 사용된 바와 같이, 단수 표현(“다른 하나” 또는 “추가적인 하나”)은 하나 이상을 의미할 수 있다.
본 명세서와 청구범위에서 사용된 바와 같이, 용어 “약”은 값이, 장치, 값을 측정하는 데 사용된 방법, 또는 연구 대상 중에 존재하는 편차에 있어서 오차의 내재 편차를 포함하는 것을 나타내는 데 사용된다.
본 발명의 기타 목적, 특징 및 이점은 하기 상세한 설명으로부터 명백해질 것이다. 하지만, 본 발명의 사상 및 범주 내에서 다양한 변형 및 수정이 이 상세한 설명으로부터 당업자에게 명백해질 것이므로, 상세한 설명 및 구체적인 실시예는 본 발명의 특정 구현예를 나타내지만 단지 예시의 방식으로 주어짐을 이해해야 한다.
하기 도면은 본 명세서의 부분을 이루며 본 발명의 특정 양태를 추가로 설명하기 위해 포함된다. 본 발명은 본원에 제시된 특정 구현예의 상세한 설명과 함께 이 도면들 중 하나 이상을 참조하여 보다 잘 이해될 수 있다.
도 1의 A-C: HsKYN 단백질 조작의 성공적 결과 A) 인간 변이체는 Kyn에 대한 촉매 활성도(Kcat/Km)를 500배 초과하여 증가시켰고, 박테리아 툴 KYNase에 견줄 만하다. B) 인간 변이체는 생체 내 인간 혈청에서 촉매 안정성을 상당히 개선했다. C) 표 1에 설명된 바와 같이, 본원에서 인간 변이체 (68) 및 (153)은 단일 iv 투여 이후 마우스에서 장시간 Kyn 분해를 나타냈다.
도 2의 A-B: HsKYN 변이체의 생체 내 효능 A) 항PD-1과 조합한 단백질(68)은 CT26 모델에서 Epacadostat보다 월등한 종양 성장 억제/생존 이익을 상당히 입증했다. B) 종양 완전 소실 개체(CRs)가 CT26으로 재시험되었고, 어느 하나도 종양을 발생시키지 않았고 CT26에 대한 항-종양 기억을 확인시켰다. 대조적으로, CT26을 접종받은 무처리 마우스는 종양을 발생시켰다.
도 3의 A-B: CT26 종양을 갖는 마우스에서 단백질(68)의 면역 프로파일링 A) Nanostring을 사용한 멀티플렉스 유전자 발현 분석은, HsKYN +/- 항PD1 처리시 IFNγ 유전자 표지의 상향 조절을 나타냈다. B) FAC 분석은, HsKYN 처리가 CD8/Treg(T조절세포) 및 M1/M2 대식 세포 비율을 증가시켰음을 입증했다.
도 4의 A-C: 독성 종에서 단백질(153)의 PD/PK 프로파일 A) 단백질(153)은, 10 mg/kg의 단일 투여 및 반복된 매주 iv 투여들 후에 쥐에서 강력하고 내구성 있는 혈장 Kyn 고갈을 입증했다. B) 단백질(153)은 원숭이에게 단일 iv 투여 후 최대 7일 동안 혈장 Kyn을 50% 이상 분해했다. C) 단백질(153) 원숭이 PK 프로파일은 6일 초과의 유리한 T1/2를 가졌다.
I. 현재 구현예
특정 구현예에서, 본 개시 내용은 Kyn 고갈 효소인 키누레니나제(Kynase)를 제공한다. 특히, 본 출원은, 야생형 인간 키누레니나제 효소에 비해 키누레닌 분해에 대해 적어도 100 배 더 높은 촉매 활성을 나타내는, 인간 키누레니나제 변이체 세트를 제공한다. 일부 양태에서, 본원에서 제공된 키누레니나제 변이체는 추가로 혈청에서 비활성화에 대한 내성을 증가시킨다. 따라서, 이들 효소는 상당히 개선된 특성을 갖고, 이는 암 치료와 같은 치료적 질병 개입에 이들을 이상적으로 만든다. 일부 양태에서, 상기 효소(또는 효소를 코딩하는 서열)는 암 환자, 예컨대 IDO1 및/또는 TDO2 발현 종양을 갖는 환자를 치료하는 데 사용될 수 있다.
현재 연구에서, 인간 키나아제(h-KYNase)는, WT 효소에 비해 Kyn에 대해 크게 개선된 촉매 활성 및 안정성을 나타내도록 성공적으로 조작되었으며, 마우스에서 내구성 있는 혈장 Kyn 고갈을 달성했다. 단일 물질 및 PD1 조합 효능은, CT26 및 B16-IDO 모델에서 선도 IDO1 억제제 Epacadostat보다 우수함이 또한 입증되었고, 종양 완전 소실 최종 개체(CR)는 종양 재시험에 내성이 있었다. 종양 면역 프로파일링은, HsKYN +/- PD1 처리시 IFNg 표지 유전자 발현 및 M1/M2 대식 세포 비율의 상향 조절을 나타냈다. 선도 HsKYN 변이체는 쥐 및 비-인간 영장류에서 유리한 Kyn 분해 및 PK 프로파일을 나타내었으며, 암, 예컨대 IDO1 및/또는 TDO2 경로가 면역 억제 역할을 하는 암의 치료에 사용될 수 있다.
II. 정의
본 명세서에서 사용된 용어 "단백질" 및 "폴리펩티드"는 펩티드 결합을 통해 연결된 아미노산을 포함하는 화합물을 가리키며 상호교환적으로 사용된다.
본 명세서에서 사용된 용어 "융합 단백질"은 비-자연적인 방식으로 작동가능하도록 연결된 단백질 또는 단백질 단편을 함유하는 키메라 단백질을 가리킨다.
본 명세서에서 사용된 용어 "반감기(½-감소기간)"은 시험관 내 또는 생체 내, 예를 들어 포유류에게 주입한 이후에 폴리펩티드의 농도가 반으로 떨어지는데 필요한 시간을 가리킨다.
용어 "작동가능한 조합", "작동가능한 순서" 및 "작동가능하도록 연결된"은 그렇게 기술된 성분이 의도된 방식으로, 예를 들어 핵산 서열의 연결이 소정의 유전자의 전사 및/또는 요망되는 단백질 분자의 합성을 지시할 수 있는 방식으로, 또는 아미노산 서열의 연결이 융합 단백질을 생산하게 하는 방식으로 기능하도록 허용하는 관계에 있는 연결을 가리킨다.
용어 "링커"는 두 가지 상이한 분자를 작동가능하도록 연결하는, 여기서 링커의 한 부분을 첫 번째 분자에 작동가능하도록 연결하고, 링커의 또다른 부분을 두 번째 분자에 작동가능하도록 연결하는 분자 가교로서 작용하는 화합물 또는 모이어티를 가리키도록 의도된다.
용어 "페길화(PEGylated)"는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)과의 접합을 가리키며, 상기 접합은 이의 높은 생체적합성 수준 및 변형의 용이성때문에 약물 담체로서 널리 사용되고 있다. PEG는 PEG 사슬의 말단의 하이드록시 기를 통해 화학적 방법으로 활성 물질에 연결(예, 공유적으로 연결)될 수 있지만; PEG 그 자체는 분자당 최대 두 개의 활성 물질로 제한된다. 상이한 접근법에서, PEG 및 아미노산의 공중합체는 PEG의 생체적합성을 유지할 수 있지만, 분자당 수많은 부착점을 갖는 (따라서 더 높은 약물 적재를 제공하는) 부가적인 장점을 지니며, 다양한 적용에 적합하도록 합성을 설계할 수 있는 신규 생체물질로서 연구되어 왔다.
용어 "유전자"는 폴리펩티드 또는 이의 전구체의 생산을 위해 필요한 조절 및 암호화 서열을 포함한 DNA 서열을 가리킨다. 폴리펩티드는, 요망되는 효소 활성이 보유되도록 전장 암호화 서열 또는 암호화 서열의 임의 부분에 의해 인코딩될 수 있다.
용어 "자연적인"은 유전자, 유전자 산물, 또는 자연발생적 공급원에서 단리되었을 때 유전자 또는 유전자 산물의 특징의 전형적인 형태를 가리킨다. 자연적인 형태는, 자연적인 집단에서 가장 흔히 발견되며 따라서 임의로 정상 또는 야생형으로 지칭되는 형태이다. 반대로, 용어 "변형된", "변이체" 또는 "돌연변이"는 자연적인 유전자 또는 유전자 산물과 비교했을 때 서열 및 기능적 특성에서 변형(즉, 변형된 특징)을 나타내는 유전자 또는 유전자 산물을 가리킨다.
용어 "벡터"는 복제할 수 있는 세포 내로 도입하려는 핵산 서열을 삽입할 수 있는 담체 핵산 분자를 가리키기 위해 사용된다. 핵산 서열은 "외생성"일 수 있으며, 이는 그러한 서열이 벡터가 도입되는 세포에게 낯선 것이거나 서열이 세포 내 서열과 상동이나 본래 그러한 서열이 발견되지 않는 숙주 세포 핵산 내 위치에 있는 것을 의미한다. 벡터는 플라스미드, 코스미드, 바이러스(박테리오파지, 동물 바이러스, 및 식물 바이러스), 및 인공적인 염색체(예, YAC)를 포함한다. 당업자는 표준 재조합 기법을 통해 벡터를 구성하도록 잘 준비된다.
용어 "발현 벡터"는, 전사될 수 있는 RNA를 암호화하는 핵산을 포함한 임의 유형의 유전자 구조체를 가리킨다. 일부 경우에, RNA 분자는 이후 단백질, 폴리펩티드, 또는 펩티드로 번역된다. 다른 경우에, 예를 들어 안티센스 분자 또는 리보자임의 생산에서, 이들 서열은 번역되지 않는다. 발현 벡터는 다양한 "조절 서열"을 보유할 수 있고, 이는 특정 숙주 세포에서 작동가능하도록 연결된 암호화 서열의 전사 및 가능하게는 번역을 위해 필요한 핵산 서열을 가리킨다. 전사 및 번역을 관장하는 조절 서열 외에, 벡터 및 발현 벡터는 다른 기능도 수행하는 핵산 서열을 보유할 수 있고 이것들은 이하에 설명된다.
본 명세서에서 사용된 용어 "치료적으로 효과적인 양"은 치료 효과를 얻기 위한 방법에서 사용되는 세포 및/또는 치료적 조성물 (예, 치료적 폴리뉴클레오티드 및/또는 치료적 폴리펩티드)의 양을 가리킨다. 본 출원 전체에서 사용된 용어 “치료적 이익” 또는 “치료적으로 효과적인”은 이 병태의 의학적 치료에 대하여 개체의 삶의 질을 촉진하거나 증진시키는 임의의 것을 말한다. 이는 질환의 징후나 증상의 빈도나 중증도의 감소를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 암의 치료는, 가령 종양의 크기 감소, 종양의 침윤성 감소, 암의 성장 속도의 감소, 또는 전이 방지를 포함할 수 있다. 암의 치료는 또한 암을 가진 개체의 생존 연장을 가리킬 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "K M "는 효소에 대한 미하엘리스-멘텐(Michaelis-Menten) 상수를 가리키며 소정의 효소가 효소 촉매된 반응에서 이의 최대 속도의 절반에 이르는 특정한 기질의 농도로서 정의된다. 본 명세서에서 사용된 용어 "k cat "는 각각의 효소 부위가 단위 시간당 산물로 전환시키는 재생 수 또는 기질 분자의 수를 가리키며, 여기서 효소는 최대 효율로 작동한다. 본 명세서에서 사용된 용어 "k cat /K M "는 효소가 얼마나 효율적으로 기질을 산물로 전환시키는지의 척도인 특이성 상수다.
본 명세서에서 사용된 용어 “키메라 항원 수용체(CAR)”는 인공적인 T-세포 수용체, 키메라 T-세포 수용체, 또는 키메라 면역수용체를 가리킬 수 있고, 예를 들어 특정 면역 이펙터 세포에 인공적 특이성을 이식하는 조작된 수용체를 포함한다. CAR는 T 세포 상에 단클론 항체의 특이성을 부여하기 위해 사용될 수 있고, 이를 통해 가령 입양면역 세포 치료를 위해 사용하는 수많은 특이적 T 세포를 생성할 수 있다. 특정 구현예에서, CAR은, 가령 종양 관련 항원에 대한 세포의 특이성을 유도한다. 일부 구현예에서, CAR은 세포내 활성화 도메인, 막관통 도메인, 및 종양 관련 항원 결합 부위를 포함한 세포외 도메인을 포함한다. 특정한 양태에서, CAR은, 단클론 항체(예컨대, 미국 특허 제7,109,304호에 기술된 것, 상기 문헌은 본 명세서에 전체가 참조로 포함됨)에서 유래한 단일-사슬 가변 단편(scFv)이 CD3-제타 막관통 및 막내도메인(endodomain)에 융합된 융합을 포함한다. 다른 CAR 설계의 특이성은 수용체 리간드(예, 펩티드)에서. 또는 패턴-인식 수용체, 예컨대 덱틴(Dectin)에서 유래될 수 있다. 특정 구현예에서, B-계열 분자에 대해 특이적인 CAR인, CD19를 이용하여 T 세포의 특이성을 재유도함으로써 악성 B 세포를 표적화할 수 있다. 특정한 경우에, 항원-인식 도메인을 멀어지게 함으로써 활성화-유도 세포 사멸이 감소하도록 조절할 수 있다. 특정한 경우에, CAR은 부가적인 보조-조절성 신호전달을 위한 도메인, 예컨대 CD3-제타, FcR, CD27, CD28, CD137, DAP10, 및/또는 OX40을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 보조-조절성 분자, 영상화를 위한(예, 양전자방출 단층촬영용) 리포터 유전자, 전구-약물의 부가시 T 세포를 조건적으로 제거하는 유전자 산물, 귀소 수용체, 케모카인, 케모카인 수용체, 사이토킨, 및 사이토킨 수용체를 포함한 분자가 CAR과 동시-발현될 수 있다.
"치료" 및 "치료하는"은 질환 또는 건강-관련 병태의 치료적 이익을 얻기 위한 목적으로 치료 물질을 개체에 투여 또는 적용하는 것 또는 절차 또는 요법을 개체에 시행하는 것을 가리킨다. 예를 들어, 치료는 약제학적 유효량의 키누레니나제의 투여를 포함할 수 있다.
"개체" 및 "환자"는 인간 또는 비-인간, 예컨대 영장류, 포유류, 및 척추동물 중 어느 하나를 가리킨다. 특정한 구현예에서, 상기 개체는 인간이다.
III. 키누레니나제 폴리펩티드
일부 구현예는 변형된 단백질 및 폴리펩티드에 관한 것이다. 특정한 구현예는 변형되지 않은 버전에 필적하는 적어도 하나의 기능적 활성, 바람직하게는, 키누레닌 분해 활성을 나타내는 변형된 단백질 또는 폴리펩티드에 관한 것이다. 추가의 양태에서, 단백질 또는 폴리펩티드는 혈청 안정성을 증가시키기 위해 추가로 변형될 수 있다. 따라서, 본 출원이 "변형된 단백질" 또는 "변형된 폴리펩티드"를 언급하는 경우, 당업자는, 예를 들어 변형되지 않은 단백질 또는 폴리펩티드에 대해 추가적인 장점, 가령 키누레닌 분해 활성 또는 열역학적 안정성을 보유하는 단백질 또는 폴리펩티드가 포함됨을 이해할 것이다.
활성의 측정은 당업자에게 익숙한 어세이, 특히 단백질의 활성에 관한 어세이를 이용하여 이루어질 수 있고, 비교의 목적으로, 변형된 또는 변형되지 않은 단백질 또는 폴리펩티드의 자연적인 및/또는 재조합 버전의 사용을 포함할 수 있다.
특정 구현예에서, 변형된 폴리펩티드, 예컨대 변형된 키누레니나제는 키누레닌의 증가를 기초로 하여 확인될 수 있다. 예를 들어, 변형되지 않은 폴리펩티드의 기질 인식 부위가 확인될 수 있다. 이러한 확인은 구조적 분석 또는 상동체 분석을 기반으로 할 수 있다. 그러한 기질 인식 부위의 변형을 포함하는 돌연변이 집단이 생성될 수 있다. 추가의 구현예에서, 증가된 키누레닌 분해 활성을 갖는 돌연변이가 돌연변이 집단으로부터 선택될 수 있다. 요망되는 돌연변이의 선택은, 키누레닌 분해의 부산물 또는 산물의 검출과 같은 방법을 포함할 수 있다.
변형된 단백질은 아미노산의 결실 및/또는 치환을 보유할 수 있고; 따라서, 결실을 갖는 단백질, 치환을 갖는 단백질, 및 결실과 치환을 갖는 단백질은 변형된 단백질이다. 일부 구현예에서, 이들 변형된 단백질은, 예를 들어 융합 단백질 또는 링커를 갖는 단백질과 같이, 추가로 삽입 또는 부가된 아미노산을 포함할 수 있다. "변형된 결실 단백질"은 자연적인 단백질 중 하나 이상의 잔기가 결여되지만, 자연적인 단백질의 특징 및/또는 활성을 보유할 수 있다. "변형된 결실 단백질"은 또한 감소된 면역원성 또는 항원성을 가질 수 있다. 변형된 결실 단백질의 예시는, 특정 유기체(예, 변형된 단백질을 투여할 수 있는 유형의 유기체)에서 항원으로 결정되는 단백질의 부위인 적어도 하나의 항원 부위에서 결실된 아미노산 잔기를 갖는 단백질이다.
치환 또는 대체 변이체는 전형적으로 단백질 내 하나 이상의 위치에서 하나의 아미노산이 다른 하나의 아미노산으로 바뀐 것을 포함하고, 폴리펩티드의 하나 이상의 특성, 특히 이의 이펙터 기능 및/또는 생체이용률을 조절하도록 설계될 수 있다. 치환은 보존적일 수 있거나 아닐 수 있고, 즉 하나의 아미노산이 유사한 형태와 전하를 가진 아미노산으로 교체된다. 보존적 치환은 당해 분야에 널리 공지되어 있으며, 예를 들어: 알라닌에서 세린으로; 아르기닌에서 리신으로; 아스파라긴에서 글루타민 또는 히스티딘으로; 아스파르테이트에서 글루타메이트로; 시스테인에서 세린으로; 글루타민에서 아스파라긴으로; 글루타메이트에서 아스파르테이트로; 글리신에서 프롤린으로; 히스티딘에서 아스파라긴 또는 글루타민으로; 이소류신에서 류신 또는 발린으로; 류신에서 발린 또는 이소류신으로; 리신에서 아르기닌으로; 메티오닌에서 류신 또는 이소류신으로; 페닐알라닌에서 티로신, 류신, 또는 메티오닌으로; 세린에서 트레오닌으로; 트레오닌에서 세린으로; 트립토판에서 티로신으로; 티로신에서 트립토판 또는 페닐알라닌으로; 및 발린에서 이소류신 또는 류신으로의 변화를 포함한다.
결실 또는 치환 외에도, 변형된 단백질은 잔기의 삽입을 포함할 수 있고, 이는 전형적으로 폴리펩티드 내 적어도 하나의 잔기의 부가를 포함한다. 이는 표적화 펩티드 또는 폴리펩티드 또는 단순히 단일 잔기의 삽입을 포함할 수 있다. 융합 단백질이라고 지칭하는 말단 부가는 하기에서 논의된다.
용어 "생물학적 기능적 균등물"은 당해 분야에 널리 알려져 있으며 본 명세서에서 더욱 상세하게 정의된다. 따라서, 대조 폴리펩티드의 아미노산에 비해 약 70% 내지 약 80%, 또는 약 81% 내지 약 90%, 또는 심지어 약 91% 내지 약 99%의 아미노산이 동일하거나 기능적으로 균등한 서열은, 단백질의 생물학적 활성이 유지된다는 단서 하에 포함된다. 변형된 단백질은 특정 양태에서 대응되는 자연적인 단백질에 대해 생물학적으로 기능적으로 균등물일 수 있다.
또한 아미노산 및 핵산 서열이 추가적인 잔기, 예컨대 추가적인 N- 또는 C-말단 아미노산 또는 5' 또는 3' 서열을 포함할 수 있으며, 그럼에도 해당 서열이 단백질 발현이 관련된 생물학적 단백질 활성의 유지를 비롯하여 상기 제시된 기준에 부합하는 한 여전히 본질적으로는 본 명세서에 개시된 서열 중 하나에 제시된 바와 같음이 이해될 것이다. 말단 서열의 부가는 특히 핵산 서열에 해당하는데, 예를 들어 암호화 부위의 5' 또는 3' 부분 중 어느 하나의 옆에 부착된 다양한 비-암호화 서열을 포함할 수 있거나 다양한 내부 서열, 즉, 유전자 내에 발생하는 것으로 공지된 인트론을 포함할 수 있다.
특정 구현예에서, 상기 구현예에 따른 키누레니나제는, SEQ ID NO:1, 2, 또는 3의 키누레니나제에 적어도 약 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 또한 추가 양태에서, 키누레니나제는, SEQ ID NO:1, 2, 또는 3의 키누레니나제에 적어도 약 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하고, L8P, K38E, Y47L, I48F, K50Q, I51M, S60N, K64N, D65G, E66K, N67D, N67P, D67S, A68F, A68T, A68V, F71L, F71M, L72N, K84E, E88N, E89K, E89S, E90Q, D92E, K93N, K93T, A95H, A95Q, K96N, I97H, I97L, I97V, A98G, A99G, A99I, A99R, A99S, A99T, A99V, Y100N, Y100S, Y100T, G101A, H102W, E103F, E103H, E103N, E103Q, E103R, E103V, E103W, V104D, V104E, V104F, V104H, V104K, V104L, V104R, G105A, G105H, G105S, G105T, E106D,K106D, K106E, K106H, K106N, R107P, R107S, P108R, I110A, I110F, I110L, I110M, I110T, T111D, T111H, T111N, T111R, G112A, G112C, G112D, G112K, G112L, G112M, G112Q, G112R, G112S, G112T, G112Y, N127K, I131V, A132V, L133V, A136T, L137T, T138S, N140D, H142Q, Q14R, Y156H, K163T, D168E, H169R, Q175L, I183F, I183L, I183P, I183S, E184A, E184D, E184R, E184T, E184V, E185T, M187L, M189I, K191A, K191G, K191H, K191M, K191N, K191R, K191S, K191T, K191W, E197A, E197D, E197F, E197K, E197M, E197Q, E197S, E197T, E197V, I201C, I201E, I201F, I201H, I201L, I201S, I201T, I201V, H203K, L219M, L219W, F220L, V223I, F225Y, H230F, H230L, H230Y, N232S, Y246F, F249W, D250E, S274A, S274C, S274G, S274N, S274T, L278M, A280G, A280S, A280T, G281S, A282M, A282P, G284N, I285L, V303L, V303S, F306W, F306Y, S311N, K315E, D317E, D317K, I331C, I331L, I331N, I331S, I331T, I331V, N333T, P334N, P335T, L337T, L338A, L338Q, S341I, K373E, K373N, N375A, N375H, Y376C, Y376F, Y376L, K378G, K378P, K378Q, K378R, K380G, K380S, A382G, A382R, A382T, T383S, K384G, K384N, P386K, P386S, V387L, N389E, I405L, F407Y, S408D, S408N, N411R, D413S, D413V, Q416T, E419A, E419L, K420E, R421N, V424I, K427M, N429E, G432A 및 A436T로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 치환의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25를 포함한다. 추가 양태에서, 키누레니나제는, 표 1에 제공된 키누레니나제 중 하나에 적어도 약 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하다. 특정한 양태에서, 키누레니나제는 표 1에 제공된 것 중 하나로부터 선택된다. 일부 양태에서, 예를 들어 표 1에 따른 키누레니나제는 페길화될 수도, 되지 않을 수도 있다.
하기 표 1은, 본 개시의 조성물과 방법과 연관되어 사용될 수 있는 다양한 키누레니나제 효소를 설명한다. 표 1에 명시적으로 나열되지 않지만, 본원에서 "단백질(1)"은 야생형 인간 키누레니나제, SEQ ID NO:1으로 설명되는 아미노산 서열을 가리킨다.
표 1. 구현예의 키누레니나제 효소 예시
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005
Figure pct00006
Figure pct00007
Figure pct00008
Figure pct00009
Figure pct00010
Figure pct00011
Figure pct00012
IV. 치료를 위한 효소적 키누레닌 분해
특정 양태에서, 폴리펩티드는 키누레닌을 고갈시키는 효소와 함께, 키누레닌 고갈에 민감한 암을 비롯한 질환의 치료를 위해 사용되어, 종양-매개 관용원성 효과를 방지하고 그 대신 종양-제거 염증-촉진 반응을 매개할 수 있다. 특정 양태에서, 키누레니나제는 IDO1, IDO2, 및/또는 TDO를 발현하는 종양을 치료하는데 사용하기 위해 고려된다.
본 발명의 특정 양태는 질환, 예컨대 종양을 치료하기 위한 변형된 키누레니나제를 제공한다. 특히, 변형된 폴리펩티드는 인간 폴리펩티드 서열을 가질 수 있고 따라서 인간 환자에서 알러지 반응을 방지하고, 반복된 투여가 가능하며, 치료적 효능을 증가시킬 수 있다.
본 치료 방법이 유용한 종양은 임의의 악성 세포 유형, 예컨대 충실성 종양 또는 혈액 종양에서 발견되는 것들을 포함한다. 예시적인 충실성 종양은 이에 제한되지 않지만, 췌장, 결장, 맹장, 위, 뇌, 머리, 목, 난소, 콩팥, 후두, 육종, 폐, 방광, 흑색종, 전립선, 및 유방으로 이루어진 군에서 선택된 장기의 종양을 포함할 수 있다. 예시적인 혈액 종양은 골수의 종양, T 또는 B 세포 악성 종양, 백혈병, 림프종, 아세포종, 골수종 등을 포함한다. 추가로 본 명세서에 제공된 방법을 이용하여 치료될 수 있는 암의 예시는, 암종, 림프종, 아세포종, 육종, 백혈병, 편평세포 암, 폐암 (소-세포 폐암, 비-소세포 폐암, 폐의 선암종, 및 폐의 편평 암종을 포함), 복막의 암, 간세포 암, 위 또는 위 암 (위장 암 및 위장 기질의 암을 포함), 췌장 암, 교모세포종, 자궁경부 암, 난소 암, 간 암, 방광 암, 유방암, 결장 암, 대장 암, 자궁내막 또는 자궁 암종, 침샘 암종, 신 또는 신장 암, 전립선암, 음문 암, 갑상선 암, 다양한 유형의 두경부 암, 흑색종, 표재 확장성 흑색종, 악성 흑색점 흑색종, 말단 흑색점 흑색종, 결절성 흑색종, 뿐만 아니라 B-세포 림프종 (저등급/소포성 비-호지킨(Hodgkin)성 림프종 (NHL); 소형 림프구성 (SL) NHL; 중간 등급/소포성 NHL; 중간 등급 미만성 NHL; 고등급 면역아세포 NHL; 고등급 림프모구 NHL; 고등급 소형 비-분할 세포 NHL; 거대 종양 NHL; 외투 세포 림프종; AIDS-연관성 림프종; 및 발렌스트롬(Waldenstrom) 매크로글로불린혈증을 포함), 만성 림프구성 백혈병 (CLL), 급성 림프모구 백혈병 (ALL), 유모세포 백혈병, 다중 골수종, 급성 골수의 백혈병 (AML) 및 만성 골수아구성 백혈병을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
암은 특히 다음의 조직학적 유형을 갖지만, 이들에 제한되지 않는다: 신생물, 악성; 암종; 암종, 미분화; 거대 및 방추상세포 암종; 소세포 암종; 갑상선유두 암종; 편평세포 암종; 림프상피성 암종; 기저의 세포 암종; 모기질 암종; 이행세포 암종; 갑상선유두 이행세포 암종; 선암종; 가스트린, 악성; 담관암종; 간세포 암종; 혼합 간세포 암종 및 담관암종; 육주상 선암종; 선모낭포 암종; 선종성 폴립 내 선암종; 선암종, 가족성 대장용종증; 고체 암종; 유암종 종양, 악성; 세기관지-폐포성 선암종; 갑상선유두 선암종; 난염성세포 암종; 호산성구 암종; 호산소구 선암종; 호염기구 암종; 투명세포 선암종; 과립 세포 암종; 소포성 선암종; 갑상선유두 및 소포성 선암종; 비피막성 경화성 암종; 부신 피질 암종; 자궁내막 암종; 피부 부속 암종; 아포크린 선암종; 피지 선암종; 귀지 선암종; 점액상피 암종; 췌장낭선암종; 갑상선유두 췌장낭선암종; 갑상선유두 장액성 췌장낭선암종; 점액성 췌장낭선암종; 점액성 선암종; 반지세포 위선 암종; 침투 도관 암종; 수질 암종; 소엽 암종; 염증 암종; 파젯(paget) 질환, 유방; 소엽 세포 암종; 선편평세포 암종; 선암종 w/편평 화생; 흉선종, 악성; 난소 기질의 종양, 악성; 협막세포종, 악성; 과립막세포 종양, 악성; 남성아세포종, 악성; 세르톨리 세포 암종; 레이디히 세포 종양, 악성; 지질 세포 종양, 악성; 부신경절종, 악성; 외-유선 부신경절종, 악성; 갈색세포종; 사구맥관육종; 악성 흑색종; 무흑색소성 흑색종; 표재 확장성 흑색종; 거대 색소침착 모반 내 악성 흑색종; 유상피 세포 흑색종; 청색 모반, 악성; 육종; 섬유육종; 섬유성 조직구종, 악성; 점액육종; 지방육종; 평활근육종; 횡문근육종; 배아 횡문근육종; 폐포성 횡문근육종; 기질의 육종; 혼합 종양, 악성; 뮐러 혼합 종양; 신아세포종; 간모세포종; 암육종증; 간엽세포종, 악성; 브레너 종양, 악성; 엽상 종양, 악성; 활막 육종; 중피종, 악성; 미분화배세포종; 배아 암종; 기형종, 악성; 난소갑상샘종, 악성; 융모암; 중신종, 악성; 혈관육종; 혈관내피종, 악성; 카포시(kaposi) 육종; 혈관주위세포종, 악성; 림프관육종; 골육종; 방피질성 골육종; 연골육종; 연골모세포종, 악성; 간엽 연골육종; 뼈의 거세포 종양; 유잉(ewing) 육종; 치성 종양, 악성; 사기질모세포성 치아육종; 에나멜상피종, 악성; 사기질모세포성 섬유육종; 송과체종, 악성; 척색종; 신경교, 악성; 상의세포종; 성상세포종; 원형질성 성상세포종; 섬유성 성상세포종; 성상모세포종; 교모세포종; 핍지교종; 핍지모세포종; 원시성 신경외배엽성; 소뇌 육종; 신경절아세포종; 신경모세포종; 망막모세포종; 후각 신경인성 종양; 뇌수막종, 악성; 신경섬유육종; 신경초종, 악성; 과립 세포 종양, 악성; 악성 림프종; 호지킨 질환; 호지킨; 파라육아종; 악성 림프종, 소세포성 림프구성; 악성 림프종, 대세포, 미만성; 악성 림프종, 소포성; 균상식육종; 다른 명시된 비-호지킨 림프종; 악성 조직구증; 다중 골수종; 비만세포 육종; 면역증식성 소장 질환; 백혈병; 림프양 백혈병; 혈장 세포 백혈병; 적백혈병; 림프육종 세포 백혈병; 골수의 백혈병; 호염기성 백혈병; 호산구 백혈병; 단세포성 백혈병; 비만세포 백혈병; 거대모구성 백혈병; 골수의 육종; 및 유모세포 백혈병.
본 명세서에서 키누레니나제는, 종양 조직 또는 암을 가진 포유류의 순환계로부터 키누레닌 및/또는 키누레닌-유도 대사산물을 고갈시키기 위해, 또는 키누레닌의 고갈이 요망된다고 고려되는 경우에 키누레닌을 고갈시키기 위해, 다양한 요법에서 항종양 물질로서 사용될 수 있다.
고갈은, 포유류의 순환계에서는 생체 내에서, 조직 배양 또는 다른 생물학적 배지 내 키누레닌 및/또는 키누레닌-유도 대사산물 고갈이 요망되는 경우에는 시험관 내에서, 및 생물학적 유체, 세포, 또는 조직이 신체 외부에서 조작되고 나중에 환자 포유류의 신체로 되돌려지는 경우에는 생체외 절차에서 수행될 수 있다. 순환계, 배양 배지, 생물학적 유체, 또는 세포로부터 키누레닌의 고갈은 처리되는 물질에 접근가능한 키누레닌의 양을 감소시키기 위해 수행되며, 따라서 접촉되는 물질에서 주변 키누레닌을 분해하도록 키누레닌-고갈 조건 하에서 키누레닌을 고갈시킬 양의 키누레니나제와 고갈되어야 하는 물질을 접촉시키는 단계를 포함한다.
고갈은 세포의 영양 공급원에 이루어지며, 세포 자체에 부가되어야 할 필요는 없다. 그러므로, 생체 내 적용에서, 종양 세포의 처리 단계는 종양 세포 집단용 영양 배지를 키누레니나제와 접촉시키는 단계를 포함한다. 본 구현예에서, 배지는 혈액, 림프성 유체, 척수액 등 키누레닌 고갈이 요망되는 유사 체액일 수 있다.
키누레닌- 및 키누레닌-유도 대사산물 고갈 효율은 적용에 따라 매우 달라질 수 있고, 전형적으로 물질 내에 존재하는 키누레닌의 양, 요망되는 고갈 속도, 및 키누레니나제에 노출되는 동안 물질의 내성에 따라 달라질 수 있다. 물질 내 키누레닌과 키누레닌 대사산물 수준, 및 따라서 물질로부터 키누레닌과 키누레닌 대사산물이 고갈되는 속도는, 당해 분야에 널리 공지된 다양한 화학 및 생화학적 방법에 의해 쉽게 관찰할 수 있다. 예시적인 키누레닌-고갈 양이 추가로 본 명세서에 기술되며, 처리될 물질의 밀리리터(mL)당 0.001 내지 100 단위(U) 키누레니나제, 바람직하게는 약 0.01 내지 10 U, 및 더 바람직하게는 약 0.1 내지 5 U 키누레니나제 범위일 수 있다. 전형적인 투여량이 체중을 기초로 투여될 수 있고, 약 5 내지 1000 U/킬로그램(kg)/일, 바람직하게는 약 5 내지 100 U/kg/일, 더 바람직하게는 약 10 내지 50 U/kg/일, 및 더 바람직하게는 약 20-40 U/kg/일의 범위이다.
키누레닌-고갈 조건은 키누레니나제의 생물학적 활성에 적합한 완충액 및 온도 조건이며, 효소에 적합한 온화한 온도, 염, 및 pH 조건, 예를 들어 생리학적 조건을 포함한다. 예시적인 조건은, 약 4 내지 40℃, 약 0.05 내지 0.2 M NaCl와 동등한 이온 강도, 및 약 5 내지 9의 pH이며, 생리학적 조건도 포함된다.
특정 구현예에서, 본 발명은 항종양 물질로서 키누레니나제를 사용하는 방법을 고려하고, 따라서 종양 세포 집단을 치료적으로 효과적인 양의 키누레니나제와 종양 세포 성장을 저해하기에 충분한 기간 동안 접촉시키는 단계를 포함한다.
키누레니나제의 치료적으로 효과적인 양은 요망되는 효과를 얻게하도록, 즉, 종양 조직 또는 환자의 순환계에서 키누레닌을 고갈시키고, 이를 통해 종양-제거 염증-촉진 반응을 매개하도록 산출되어 설정된 양이다. 따라서, 본 발명의 키누레니나제의 투여를 위한 투여량 범위는, 종양 세포 분열 및 세포 순환의 증상이 감소되는 요망 효과를 생성하기에 충분히 큰 범위이다. 투여량은 과다점성 증후군, 폐 수종, 울혈성 심부전, 신경학적 효과 등과 같은 유해한 부작용을 일으킬 정도로 커서는 안 된다. 일반적으로, 투여량은 환자의 연령, 병태, 성별, 및 질환 정도에 따라 달라지며 당업자에 의해 결정될 수 있다. 투여량은, 임의의 합병증이 발생하는 경우에 개인 전문의에 의해 조절될 수 있다.
키누레니나제는 주사 또는 시간에 따른 점진적인 주입에 의해 비경구적으로 투여될 수 있다. 키누레니나제는 정맥내, 복강내, 경구, 근육내, 피하, 체강내, 경피, 진피로 투여될 수 있고, 연동적 수단에 의해 전달될 수 있으며, 종양 세포를 포함하는 조직으로 직접 주입될 수 있고, 또는 키누레닌에 대해 잠재적 생체센서를 포함할 수 있는 카테터에 연결된 펌프로 투여될 수 있다.
키누레니나제를 포함하는 치료적 조성물은 통상적으로 정맥내에, 예를 들어 단위 용량을 주입함으로써 투여된다. 치료적 조성물에 기준으로 사용되는 경우에, 용어 "단위 용량"은 개체에게 한 번에 투여하기에 적절하도록 물리적으로 분리된 단위를 지칭하며, 각각의 단위는, 필요한 희석제, 즉 담체, 또는 비히클과 함께 요망되는 치료 효과를 만들도록 산출된 소정량의 활성 물질을 함유한다.
조성물은, 투여 제형에 적합한 방식으로 그리고 치료적으로 효과적인 양으로 투여된다. 투여되는 양은, 치료받는 개체, 활성 성분을 이용할 개체 시스템의 용량, 및 요망되는 치료 효과의 정도에 의존한다. 투여되도록 요구되는 활성 성분의 정확한 양은, 전문의의 판단에 의존하며 각 개체에 따라 달라진다. 그러나, 전신 투여를 위해 적절한 투여 범위가 본 명세서에 개시되며 투여 경로에 의존한다. 최초 투여 및 보강 투여를 위한 적절한 계획이 또한 고려되며, 전형적으로 초기 투여 이후에, 후속 주입 또는 다른 투여에 의해 한 시간 이상의 간격으로 반복 투여가 이루어진다. 예시적인 다중 투여가 본 명세서에 기술되며, 지속적으로 높은 키누레니나제의 혈청 및 조직 수준, 그리고 역으로 낮은 키누레닌의 혈청 및 조직 수준을 유지하는 것이 특히 바람직하다. 대안적으로, 생체 내 요법을 위해 규정된 범위로 혈액내 농도를 유지하기에 충분한, 연속적인 정맥내 주입이 고려된다.
V. 접합체
본 발명의 조성물 및 방법은, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜과 같은 이종 펩티드 단편 또는 중합체를 갖는 접합체를 형성함으로써, 변형된 키누레니나제를 포함한다. 추가의 양태에서, 키누레니나제는 PEG에 연결되어 효소의 수화 반경을 증가시키고 따라서 혈청 지속성을 증가시킬 수 있다. 특정 양태에서, 개시된 폴리펩티드는 임의의 표적화 물질, 예컨대 외부 수용체 또는 종양 세포의 결합 부위에 특정하고 안정하게 결합하는 능력을 가진 리간드에 공액결합될 수 있다 (미국 특허 공보 제2009/0304666호).
A. 융합 단백질
본 발명의 특정 구현예는 융합 단백질에 관한 것이다. 이들 분자는 N- 또는 C-말단에서 이종 도메인에 연결된 자연적인 또는 변형된 키누레니나제를 가질 수 있다. 예를 들어, 융합은 또한 다른 종으로부터의 선도 서열을 사용하여 이종 숙주에서 단백질의 재조합 발현을 가능하게 할 수 있다. 또 다른 유용한 융합은 단백질 친화성 태그, 가령 혈청 알부민 친화성 태그 또는 여섯 개의 히스티딘 잔기, 또는 면역학적 활성 도메인, 가령 항체 에피토프, 바람직하게는 절단가능한 에피토프의 부가를 포함하여 융합 단백질의 정제를 용이하게 한다. 비-제한적인 친화성 태그는 폴리히스티딘, 키틴 결합 단백질(CBP), 말토오스 결합 단백질(MBP), 및 글루타티온-S-전이효소(GST)를 포함한다.
특정 구현예에서, 키누레니나제는 생체 내 반감기를 증가시키는 펩티드, 예컨대 XTEN 폴리펩티드(Schellenberger et al., 2009), IgG Fc 도메인, 알부민, 또는 알부민 결합 펩티드에 연결될 수 있다.
융합 단백질을 생성하는 방법은 당업자에게 널리 공지되어 있다. 그러한 단백질은, 예를 들어 완전한 융합 단백질의 신생 합성에 의해, 또는 이종 도메인을 인코딩하는 DNA 서열의 부착 이후에 온전한 융합 단백질의 발현에 의해 생산될 수 있다.
모 단백질의 기능적 활성을 회복하는 융합 단백질의 생산은, 나란히 연결된 폴리펩티드 사이에 끼어든 펩티드 링커를 인코딩하는 가교 DNA 단편과 유전자를 연결함으로써, 촉진될 수 있다. 링커는, 생성된 융합 단백질의 적절한 접힘을 허용하기에 충분한 길이일 수 있다.
B. 페길화(PEGylation)
본 발명의 특정 양태에서, 키누레니나제의 페길화에 관련된 방법 및 조성물이 개시된다. 예를 들어, 키누레니나제는 본 명세서에 개시된 방법에 따라 페길화될 수 있다.
페길화는 폴리(에틸렌 글리콜) 중합체 사슬을 다른 분자, 일반적으로는 약물 또는 치료적 단백질에 공유적으로 부착시키는 과정이다. 페길화는 표적 거대분자와 PEG의 반응성 유도체를 항온처리함으로써 일상적으로 얻어진다. 약물 또는 치료적 단백질에 PEG를 공유 부착하면, 숙주의 면역 시스템으로부터 물질을 "차폐"(면역원성 및 항원성을 감소)시키거나 또는 물질의 유체역학 크기(용액 내 크기)를 증가시킬 수 있고, 이는 신장 배출을 감소시킴으로써 물질의 순환 기간을 연장시킨다. 페길화는 또한 소수성 약물 및 단백질에 수용해성을 제공할 수 있다.
페길화의 첫 번째 단계는 하나 또는 양 말단에서 PEG 중합체를 적절히 관능화하는 것이다. 동일한 반응성 모이어티로 각 말단에서 활성화된 PEG는 "동종이관능성"으로 공지되는 반면에, 만약 존재하는 관능기가 상이하다면 PEG 유도체는 "이종이관능성" 또는 "이종관능성"이라고 지칭된다. 요망되는 분자에 PEG를 부착하기 위해, PEG 중합체의 화학적으로 활성이거나 활성화된 유도체가 제조된다.
PEG 유도체를 위해 적절한 관능기의 선택은, PEG에 결합될 분자에 있는 이용가능한 반응기의 유형을 기반으로 한다. 단백질에 있어서, 전형적인 반응성 아미노산은 리신, 시스테인, 히스티딘, 아르기닌, 아스파르트산, 글루탐산, 세린, 트레오닌, 및 티로신을 포함한다. N-말단 아미노 기와 C-말단 카르복실산이 또한 사용될 수 있다.
제1 세대 PEG 유도체를 형성하기 위해 사용되는 기술은, 일반적으로 PEG 중합체를 하이드록실 기, 전형적으로 무수물, 산 클로라이드, 클로로포르메이트, 및 카르보네이트와 반응성인 기와 반응시키는 것이다. 제2 세대 페길화 화학에서는, 더 효율적인 관능기, 예컨대 알데히드, 에스테르, 아미드 등이 공액 결합을 위해 이용가능하다.
페길화 적용이 더욱 더 발전하고 복잡해짐에 따라, 공액 결합을 위한 이종이관능성 PEG에 대한 수요가 증가해왔다. 이들 이종이관능성 PEG은 친수성, 유연성, 및 생체적합성 스페이서를 필요로 하는 두 가지 독립체를 연결하는데 매우 유용하다. 이종이관능성 PEG를 위한 바람직한 말단 기는 말레이미드, 비닐 설폰, 피리딜 디설파이드, 아민, 카르복실산, 및 NHS 에스테르이다.
가장 공통적인 변형 물질, 또는 링커는 메톡시 PEG(mPEG) 분자를 기반으로 한다. 이들의 활성은 알코올 말단에 단백질-변형 기를 부가하는데 의존적이다. 일부 경우에 폴리에틸렌 글리콜(PEG 디올)은 전구체 분자로서 사용된다. 디올은 나중에 이종- 또는 동종-이량체 PEG-연결된 분자를 만들기 위해 양쪽 말단이 변형된다.
단백질은 일반적으로 친핵성 부위, 예컨대 비양성화된 티올 (시스테이닐 잔기) 또는 아미노 기에 페길화된다. 시스테이닐-특이적 변형 시약의 예시는 PEG 말레이미드, PEG 아이오도아세테이트, PEG 티올, 및 PEG 비닐설폰을 포함한다. 상기 네 가지는 온화한 조건 및 중성 내지 알칼리 pH에서 강하게 시스테이닐-특이적이지만 각각 단점을 일부 지닌다. 말레이미드로 형성된 티오에테르는 알칼리 조건 하에 다소 불안정할 수 있으며 따라서 이 링커에는 제형화 선택지에 있어서 일부 제약이 존재할 수 있다. 아이오도 PEG로 형성된 카르바모티오에이트 연결은 더 안정하지만, 유리 요오드가 일부 조건 하에 티로신 잔기를 변형시킬 수 있다. PEG 티올은 단백질 티올과 함께 이황화 결합을 형성하지만, 이 연결 또한 알칼리 조건 하에 불안정할 수 있다. PEG-비닐설폰 반응성은 말레이미드 및 아이오도 PEG에 비해 비교적 느리지만; 그러나, 형성된 티오에테르 연결은 상당히 안정하다. 이의 더 느린 반응 속도는 또한 PEG-비닐설폰 반응을 더 쉽게 제어하도록 만들 수 있다.
자연적인 시스테이닐 잔기에서의 부위-특이적 페길화는 거의 수행되지 않는데, 이들 잔기가 일반적으로 이황화 결합의 형태이거나 생물학적 활성을 위해 필요하기 때문이다. 반면에, 부위-겨냥성 돌연변이유발 방법은 티올-특이적 링커를 위한 시스테이닐 페길화 부위를 도입하기 위해 사용될 수 있다. 시스테인 돌연변이는, 이것이 페길화 시약과 접촉할 수 있으면서도 페길화 후에도 여전히 생물학적으로 활성이도록 설계되어야 한다.
아민-특이적 변형 물질은 PEG NHS 에스테르, PEG 트레실레이트, PEG 알데히드, PEG 이소티오시아네이트, 및 기타 여러가지를 포함한다. 모든 반응은 온화한 조건 하에 일어나며 아미노 기에 매우 특이적이다. PEG NHS 에스테르는 아마도 더 반응성인 물질 중 하나이지만; 그러나, 이의 높은 반응성은 대규모 공정에서 페길화 반응을 제어하기 어렵게 만들 수 있다. PEG 알데히드는 아미노 기와 함께 이민을 형성하며, 이민은 이후 나트륨 시아노보로하이드라이드를 통해 이차 아민으로 환원된다. 나트륨 보로하이드라이드와 달리, 나트륨 시아노보로하이드라이드는 이황화 결합을 환원시키지 않을 것이다. 그러나, 이 화학 물질은 상당히 독성이며 특히 이것이 휘발성이 되는 더 낮은 pH에서 취급을 주의해야 한다.
대부분의 단백질에 있는 복수의 리신 잔기로 인해, 부위-특이적 페길화가 어려울 수 있다. 다행히, 이들 시약이 비양자화된 아미노 기와 반응하기 때문에, 더 낮은 pH에서 반응을 수행함으로써 더 낮은-pK 아미노 기에 페길화를 진행할 수 있다. 일반적으로 알파-아미노 기의 pK는, 리신 잔기의 엡실론-아미노 기보다 더 낮은 1-2 pH 단위이다. pH 7 이하에서 분자를 페길화함으로써, N-말단에 대한 높은 선택성을 흔히 얻을 수 있다. 그러나, 이는 단백질의 N-말단 부분이 생물학적 활성을 위해 요구되지 않는 경우에만 가능하다. 하지만, 페길화로부터의 약동학적 이익은 시험관 내 생체활성의 상당한 손실을 능가하며, 페길화 화학과 관계없이 훨씬 더 큰 생체 내 생체활성을 갖는 산물을 생성한다.
페길화 절차를 개발하는 경우 고려해야 할 몇 가지 변수가 존재한다. 다행히, 일반적으로 최대 넷 또는 다섯 가지 핵심 변수만이 존재한다. 페길화 조건의 최적화를 위한 "실험 설계" 접근법은 아주 유용할 수 있다. 티올-특이적 페길화 반응에 있어서, 고려할 변수는: 단백질 농도, PEG-대-단백질 비율 (몰 기준), 온도, pH, 반응 시간, 및 일부 경우에는, 산소의 배제를 포함한다. (산소는 단백질에 의한 분자간 디설파이드 형성을 야기할 수 있고, 이는 페길화 산물의 수율을 감소시킬 것이다.) 아민-특이적 변형을 위해 (산소의 배제를 포함하여) 동일한 요인을 고려해야 하지만 예외적으로 pH는, 특히 N-말단 아미노 기를 표적하는 경우 훨씬 더 중요할 수 있다.
아민- 및 티올-특이적 변형 모두를 위해, 반응 조건은 단백질의 안정성에 영향을 미칠 수 있다. 이는 온도, 단백질 농도, 및 pH를 제한할 수 있다. 또한, 페길화 반응을 시작하기 전에 PEG 링커의 반응성을 알아야 한다. 예를 들어, 페길화 물질이 단지 70 퍼센트 활성이라면, 사용되는 PEG의 양은 단백질-대-PEG 반응 화학양론에서 반드시 활성 PEG 분자만 계산에 포함되도록 해야 한다.
VI. 단백질 및 펩티드
특정 구현예에서, 본 발명은 적어도 하나의 단백질 또는 펩티드, 예컨대 키누레니나제를 포함하는 신규한 조성물에 관한 것이다. 이들 펩티드는 융합 단백질에 포함되거나 상기 기술된 바와 같은 물질에 공액결합될 수 있다.
본 명세서에서 사용된, 단백질 또는 펩티드는 일반적으로 약 200 아미노산을 초과하여, 유전자로부터 번역된 전장 서열까지의 단백질; 약 100 아미노산을 초과하는 폴리펩티드; 및/또는 약 3 내지 약 100 아미노산의 펩티드를 가리키지만, 이에 제한되지 않는다. 편의를 위해, 용어 "단백질", "폴리펩티드", 및 "펩티드"는 본 명세서에서 상호교환적으로 사용된다.
본 명세서에서 사용된, "아미노산 잔기"는 당해 분야에 공지된 임의의 자연발생적 아미노산, 임의의 아미노산 유도체, 또는 임의의 아미노산 모방체를 가리킨다. 특정 구현예에서, 단백질 또는 펩티드의 잔기는 연속적이며, 아미노산 잔기의 서열을 중단시키는 어떠한 비-아미노산도 없다. 다른 구현예에서, 서열은 하나 이상의 비-아미노산 모이어티를 포함할 수 있다. 특정한 구현예에서, 단백질 또는 펩티드 잔기의 서열은 하나 이상의 비-아미노산 모이어티에 의해 중단될 수 있다.
따라서, 용어 "단백질 또는 펩티드"는 자연발생적 단백질에서 발견되는 20가지 공통 아미노산 중 적어도 하나, 또는 적어도 하나의 변형된 또는 이례적 아미노산을 포함하는 아미노산 서열을 포괄한다.
단백질 또는 펩티드는 당업자에게 공지된 임의의 기술, 가령 표준 분자생물학적 기술을 통한 단백질, 폴리펩티드, 또는 펩티드의 발현, 천연 공급원에서 단백질 또는 펩티드의 단리, 또는 단백질 또는 펩티드의 화학적 합성에 의해 제조될 수 있다. 다양한 유전자에 상응하는 뉴클레오티드 및 단백질, 폴리펩티드, 및 펩티드 서열은 이미 개시된 바 있으며, 당업자에게 공지된 컴퓨터 데이터베이스에서 찾을 수 있다. 그러한 데이터베이스 중 하나는 국립 생명과학기술 정보센터(National Center for Biotechnology Information)의 유전자은행(Genbank) 및 유전자단백질(GenPept) 데이터베이스(웹주소 ncbi.nlm.nih.gov/로 접근가능)이다. 공지된 유전자를 위한 암호화 부위는 본 명세서에 개시된 기술을 이용하거나 당업자에게 공지된 기술을 이용하여 증폭 및/또는 발현될 수 있다. 대안적으로, 단백질, 폴리펩티드, 및 펩티드의 다양한 상업적인 제조방법이 당업자에게 공지되어 있다.
VII. 핵산 및 벡터
본 발명의 특정 양태에서, 키누레니나제 또는 키누레니나제를 내포한 융합 단백질을 인코딩하는 핵산 서열이 개시될 수 있다. 사용되는 발현 시스템에 따라, 핵산 서열은 통상적인 방법을 기반으로 선택될 수 있다. 예를 들어, 키누레니나제가 인간 키누레니나제에서 유도되고 E. coli에서 거의 사용되지 않는 복수의 코돈을 내포하는 경우, 이것이 발현을 방해할 수 있다. 그러므로, 각각의 유전자 또는 이들의 변이체는 E. coli 발현을 위해 최적화된 코돈일 수 있다. 다양한 벡터가 또한 관심 단백질을 발현시키기 위해 사용될 수 있다. 예시적인 벡터는 플라스미드 벡터, 바이러스 벡터, 전이인자, 또는 리포좀 계열 벡터를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
VIII. 숙주 세포
숙주 세포는 키누레니나제 및 이들의 접합체의 발현과 분비를 허용하도록 변환될 수 있는 것이면 어느 것이나 될 수 있다. 숙주 세포는 박테리아, 포유류 세포, 효모, 또는 사상균일 수 있다. 다양한 박테리아는 대장균(Escherichia) 및 간균(Bacillus)을 포함한다. 사카로미세스(Saccharomyces), 또는 피키아(Pichia)속에 속하는 효모가 적합한 숙주 세포로 사용될 수 있다.
IX. 약제학적 조성물
신규 키누레니나제가 국부적으로 진행된 또는 전이성 암을 가진 암 환자에서 종양 세포 성장을 저해하기 위해, 그리고 가장 바람직하게는 암 세포를 죽이기 위해, 전신 또는 국부적으로 투여될 수 있음이 고려된다. 이들은 정맥내, 척추강내, 및/또는 복강내로 투여될 수 있다. 이들은 단독으로 또는 항-증식 약물과 조합되어 투여될 수 있다. 일 구현예에서, 이들은 수술 또는 다른 절차 전에 환자에서 암의 부하를 줄이기 위해 투여된다. 대안적으로, 이들은 수술 후에 잔여하는 임의의 잔류 암(예, 수술에서 제거되지 못한 암)이 생존하지 못하도록 보장하기 위해 투여될 수 있다.
본 발명이 치료 제제의 특정한 성질에 제한되는 것으로 의도되지 않는다. 예를 들어, 이러한 조성물은 생리학적으로 허용되는 액체, 겔, 또는 고체 담체, 희석제, 및 부형제를 갖는 제형으로 제공될 수 있다. 이들 치료 제제는 포유류에게, 수의학적 용도를 위해, 예컨대 가축에게, 및 임상 용도를 위해 인간에게 다른 치료제와 유사한 방식으로 투여될 수 있다. 일반적으로, 치료적 효능을 위해 요구되는 투여량은 투여의 목적 및 사용 유형뿐만 아니라 개별적인 개체의 특화된 요구조건에 따라 달라질 것이다.
이러한 조성물은 전형적으로 주사가능한 액체 용액 또는 현탁액으로 제조된다. 적절한 희석제 및 부형제는, 예를 들어 물, 식염수, 덱스트로스, 글리세롤, 또는 기타, 및 이들의 조합이다. 또한, 조성물은, 원하면 미량의 보조제, 예컨대 습윤제 또는 유화제, 안정화제, 또는 pH 완충제를 함유할 수 있다.
임상적인 적용이 고려되는 경우, 의도되는 적용을 위해 적절한 형태로 단백질, 항체, 및 약물을 포함하는 약제학적 조성물을 제조하는 것이 필요할 수 있다. 일반적으로, 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체에 용해되거나 분산된 유효량으로 하나 이상의 키누레니나제 또는 부가적인 물질을 포함할 수 있다. 표현 "약제학 또는 약리학적으로 허용되는"은, 예를 들어 인간과 같은 동물에게 적절히 투여되는 경우에, 부작용, 알러지, 또는 다른 원치않는 반응을 일으키지 않는 분자 독립체 및 조성물을 가리킨다. 본원에 개시된 방법으로 단리된 적어도 하나의 키누레니나제, 또는 부가적인 활성 성분을 함유한 약제학적 조성물의 제조는, 본 명세서에 비추어 당업자에게 공지될 것이고, 참조로 본원에 포함된 Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., 1990에 예시되는 바와 같다. 게다가, 동물(예, 인간) 투여에 있어서, 제조는 FDA 생물 표준국(FDA Office of Biological Standarsds)에서 요구하는 무균성, 발열원성, 일반적 안전성, 및 순도 표준에 부합해야 함을 이해할 것이다.
본 명세서에서 사용된, "약제학적으로 허용되는 담체"는 당업자에게 공지된 바와 같이, 임의의 및 모든 용매, 분산 매체, 코팅제, 계면활성제, 항산화제, 보존제(예, 항생제, 항진균제), 등장화제, 흡수지연제, 염, 보존제, 약물, 약물 안정화제, 겔, 결합제, 부형제, 붕해제, 활택제, 감미제, 착향제, 염료, 이들의 유사 물질 및 이들의 조합을 포함한다(예, 본원에 참조로 포함된 Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., 1990를 참조하기 바람). 임의의 통상적인 담체가 활성 성분에 부적합한 경우를 제외하고, 약제학적 조성물에서 이의 사용이 고려된다.
본 발명의 특정 구현예는, 고체, 액체, 또는 에어로졸 형태의 투여 여부, 그리고 주사와 같은 투여 경로에 대해 무균일 필요성 여부에 따라, 상이한 유형의 담체를 포함한다. 조성물은 정맥내, 피내, 경피, 척추강내, 동맥내, 복강내, 비강내, 질내, 직장내, 근육내, 피하, 점막으로, 경구, 국소, 국부적으로, 흡입(예, 에어로졸 흡입)에 의해, 주사에 의해, 주입에 의해, 연속 주입에 의해, 표적 세포를 직접적으로 국소 관류욕하여, 카테터를 통해, 세척을 통해, 지질 조성물(예, 리포좀) 내, 또는 당업자에게 공지된 바와 같이 다른 방법에 의해 또는 상기 서술한 것들의 조합에 의해 투여될 수 있다(예, 본원에 참조로 포함된 Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., 1990를 참조하기 바람).
변형된 폴리펩티드는 유리 염기, 중성, 또는 염 형태의 조성물로 제형화될 수 있다. 약제학적으로 허용되는 염은, 산 부가 염을 포함하고, 예를 들어 이는 단백질성 조성물의 유리 아미노 기를 통해 형성되거나, 예를 들어 염산 또는 인산과 같은 무기산 또는 아세트산, 옥살산, 타르타르산, 또는 만델산과 같은 유기산으로 형성된다. 유리 카르복실 기를 통해 형성된 염은, 예를 들어 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘, 또는 제2철 하이드록사이드와 같은 무기 염기; 또는 이소프로필아민, 트리메틸아민, 히스티딘, 또는 프로카인과 같은 유기 염기로부터 또한 유도될 수 있다. 제형에 따라, 용액은 투여 제형에 적합한 방식에서 치료 효과적인 양으로 투여될 것이다. 제형은 다양한 투여 형태로, 예를 들어 주사 용액 또는 폐로 송달하기 위한 에어로졸와 같이 비경구 투여를 위해 제형화된 형태, 또는 예를 들어 약물 방출 캅셀 등과 같이 경구 투여를 위해 제형화된 형태로 용이하게 투여된다.
추가로 본 발명의 특정한 양태에 따라, 투여를 위해 적절한 조성물은 불활성 희석제와 함께 또는 없이 약제학적으로 허용되는 담체 내에 제공될 수 있다. 담체는 소화가 가능해야 하고 액체, 반-고체(즉, 페이스트), 또는 고체 담체를 포함한다. 임의의 통상적인 매체, 물질, 희석제, 또는 담체는 수용자 또는 이것이 함유된 조성물의 치료 효과에 유해한 경우를 제외하고는, 본 방법의 실시에서 사용하기 위해 투여가능한 조성물에 사용하는 것이 적절하다. 담체 또는 희석제의 예시는 지방, 오일, 물, 식염수 용액, 지질, 리포좀, 수지, 결합제, 충전제, 기타, 또는 이들의 조합을 포함한다. 조성물은 또한 하나 이상의 성분의 산화를 지연시키기 위해 다양한 항산화제를 포함할 수 있다. 추가적으로, 파라벤(예, 메틸파라벤, 프로필파라벤), 클로로부탄올, 페놀, 소르브산, 티메로살 또는 이들의 조합을 포함하지만 이에 제한되지 않는 보존제, 예컨대 다양한 항생 및 항진균 물질에 의해 미생물 작용의 방지가 이루어질 수 있다.
본 발명의 특정 양태에 따라, 조성물은 임의의 편리하고 실용적인 방식으로 즉, 용해, 현탁, 유화, 배합, 캡슐화, 흡수 등에 의해 담체와 조합된다. 이러한 절차는 당업자에게 일상적인 것이다.
본 발명의 특정한 구현예에서, 조성물은 반-고체 또는 고체 담체와 완전히 조합 또는 혼합된다. 혼합은 분쇄와 같은 임의의 편리한 방식으로 수행될 수 있다. 안정화제가 또한 혼합 과정에서 치료 활성의 손실, 즉 위장 내 변성으로부터 조성물을 보호하기 위해 부가될 수 있다. 조성물에서 사용하기 위한 안정화제의 예시는 완충제, 아미노산(가령, 글리신 및 리신), 탄수화물(가령, 덱스트로스, 만노스, 갈락토스, 프럭토스, 락토스, 수크로스, 말토오스, 소르비톨, 만니톨) 등을 포함한다.
추가의 구현예에서, 본 발명은 약제학적 지질 비히클 조성물에 관한 것일 수 있고, 이는 키누레니나제, 하나 이상의 지질, 및 수성 용매를 포함한다. 본 명세서에서 사용된, 용어 "지질"은 특징적으로 물에서 불용성이고 유기 용매로 용출될 수 있는 광범위한 물질 중 어느 하나를 포함하는 것으로 정의될 것이다. 이러한 폭넓은 부류의 화합물은 당업자에게 널리 공지되어 있으며, 본 명세서에서 용어 "지질"이 사용되는 경우, 이는 임의의 구체적인 구조에 제한되지 않는다. 예시는, 긴 사슬 지방족 탄화수소 및 이들의 유도체를 함유하는 화합물을 포함한다. 지질은 자연발생적 또는 합성된 것(즉, 인공적으로 설계되거나 제조된 것)일 수 있다. 그러나, 지질은 보통 생물학적 물질이다. 생물학적 지질은 당해 분야에 널리 공지되어 있으며, 예를 들어, 중성 지방, 인지질, 포스포글리세라이드, 스테로이드, 테르펜, 리소리피드, 글리코스핑고리피드, 글리코리피드, 설파타이드, 에테르- 및 에스테르-연결된 지방산을 갖는 지질, 중합가능한 지질, 및 이들의 조합을 포함한다. 물론, 본 명세서에 구체적으로 기술된 것 외에 당업자에게 지질로서 이해되는 화합물이, 본 조성물 및 방법에 또한 포함된다.
당업자는 지질 비히클 내에 조성물을 분산하기 위해 사용될 수 있는 기술 범위에 익숙할 것이다. 예를 들어, 키누레니나제 또는 이의 융합 단백질은 지질을 함유한 용액 내에 분산되거나, 지질에 용해되거나, 지질과 함께 유화되거나, 지질과 혼합되거나, 지질과 조합되거나, 지질에 공유 결합되거나, 현탁액으로서 지질 내에 내포되거나, 미셀(micelle) 또는 리포좀 내에 내포되거나 복합체를 이루거나, 또는 달리 당업자에게 공지된 임의의 수단에 의해 지질 또는 지질 구조와 연관될 수 있다. 분산은 리포좀을 형성하거나 형성하지 못할 수 있다.
동물 환자에게 투여되는 조성물의 실제 투여량은 물리적 및 생리적 요인, 예컨대 체중, 병태의 중증도, 치료 중인 질환의 유형, 이전 또는 현재의 치료 개입, 환자의 특발증, 및 투여의 경로에 의해 결정될 수 있다. 투여량 및 투여의 경로에 따라서, 바람직한 투여량 및/또는 유효량의 투여 횟수는 개체의 반응에 따라 달라질 수 있다. 투여를 담당하는 전문의는 어떠한 경우에도, 개별적인 개체에 대한 조성물 내 활성 성분(들)의 농도 및 적절한 투여량(들)을 결정할 것이다.
특정 구현예에서, 약제학적 조성물은, 예를 들어 적어도 약 0.1%의 활성 화합물을 포함할 수 있다. 다른 구현예에서, 활성 화합물은, 예를 들어 단위 중량의 약 2% 내지 약 75%, 또는 약 25% 내지 약 60%, 및 이들 중 도출가능한 임의 범위를 포함할 수 있다. 치료적으로 유용한 각각의 조성물 내 활성 화합물(들)의 양은, 어떠한 소정의 단위 용량의 화합물에서도 적절한 투여가 이루어지게 될 방식으로, 자연적으로 제조될 수 있다. 용해성, 생체이용률, 생물학적 반감기, 투여 경로, 제품 보관 기한과 같은 요인뿐만 아니라 다른 약리학적 고려 사항이, 이러한 약제학적 제형을 제조하는 당업자에게 고려될 것이며, 따라서 다양한 투여 및 치료 계획이 바람직할 수 있다.
다른 비 제한적인 예시에서, 투여량은 또한 투여당 약 1 마이크로그램/kg/체중, 약 5 마이크로그램/kg/체중, 약 10 마이크로그램/kg/체중, 약 50 마이크로그램/kg/체중, 약 100 마이크로그램/kg/체중, 약 200 마이크로그램/kg/체중, 약 350 마이크로그램/kg/체중, 약 500 마이크로그램/kg/체중, 약 1 밀리그램/kg/체중, 약 5 밀리그램/kg/체중, 약 10 밀리그램/kg/체중, 약 50 밀리그램/kg/체중, 약 100 밀리그램/kg/체중, 약 200 밀리그램/kg/체중, 약 350 밀리그램/kg/체중, 약 500 밀리그램/kg/체중, 내지 약 1000 밀리그램/kg/체중 또는 그 이상, 및 이들 중 도출가능한 임의 범위를 포함할 수 있다. 본원에 나열된 수치로부터 도출 가능한 범위의 비 제한적인 예시에서, 약 5 밀리그램/kg/체중 내지 약 100 밀리그램/kg/체중, 약 5 마이크로그램/kg/체중 내지 약 500 밀리그램/kg/체중 범위, 등이 상기 설명된 수치를 기초로 하여 투여될 수 있다.
X. 병행 치료
특정 구현예에서, 본 구현예의 조성물 및 방법은 키누레니나제의 투여를 2차 또는 추가의 요법과 병행하는 것을 포함한다. 이러한 요법은 키누레닌 의존성과 연관된 임의의 질환의 치료에 적용될 수 있다. 예를 들어, 상기 질환은 암일 수 있다.
병행 치료를 포함하는 방법 및 조성물은 치료 또는 보호 효과를 증진하고/증진하거나 다른 하나의 항암 또는 항-과다증식 요법의 치료 효과를 증가시킨다. 치료 및 예방 방법과 조성물은 효과적인 조합된 양으로 제공될 수 있어서 암 세포 사멸 및/또는 세포 과다증식의 저해와 같이 요망되는 효과를 얻는다. 이 과정은 키누레니나제 및 2차 요법을 투여하는 것을 포함할 수 있다. 2차 요법은 직접적인 세포독성 효과을 갖거나 갖지 않을 수 있다. 예를 들어, 2차 요법은 직접적인 세포독성 효과 없이 면역 시스템을 상향조절하는 물질일 수 있다. 조직, 종양, 또는 세포는, 하나 이상의 물질(예, 키누레니나제 또는 항암제)을 포함한 하나 이상의 조성물 또는 약리학적 제형(들)에 노출될 수 있거나, 조직, 종양, 및/또는 세포는 둘 이상의 개별 조성물 또는 제형에 노출될 수 있고, 여기서 하나의 조성물은 1) 키누레니나제, 2) 항암제, 또는 3) 키누레니나제 및 항암제 둘 모두를 제공한다. 또한, 이러한 병행 요법이 화학 요법, 방사선 요법, 수술 요법, 또는 면역 요법과 함께 사용될 수 있음이 고려된다.
세포에 적용되는 경우에, 용어 "접촉된" 및 "노출된"은 치료적 구조체 및 화학요법제 또는 방사선치료제가 표적 세포에 송달되거나 표적 세포와 가까이 위치하도록 배치되는 과정을 설명하기 위해 본원에서 사용된다. 세포 사멸을 얻기 위해, 예를 들어 물질 모두는 효과적인 양으로 조합되어 세포로 송달되어 세포를 사멸시키거나 세포 분열을 막는다.
키누레니나제는 항암 치료 이전, 도중, 이후, 또는 항암 치료에 대해 다양한 조합으로 투여될 수 있다. 동시 내지 수 분 내지 수 일 내지 수 주의 범위의 간격으로 투여될 수 있다. 키누레니나제가 항암제와 별도로 환자에게 제공되는 경우의 구현예에서, 각각의 송달 시간 사이에 상당한 기간이 경과하지 않게 하여, 두 가지 화합물이 여전히 환자에게 유리하게 조합된 효과를 전달할 수 있도록 보장해야 한다. 이러한 경우에, 환자에게 키누레니나제 및 항암 요법을 약 12 내지 24 또는 72 시간 이내에 각각 및, 더 상세하게는, 약 6-12 시간 이내에 각각 제공할 수 있음이 고려된다. 일부 상황에서, 치료를 위한 기간을 상당히 연장하는 것이 바람직할 수 있고, 여기서 각각의 투여 사이에 수 일(2, 3, 4, 5, 6, 또는 7일) 내지 수 주(1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8주)가 소요된다.
특정 구현예에서, 치료 과정은 1-90 일 또는 그 이상 지속될 것이다(이러한 범위는 개입하는 일을 포함함). 하나의 물질이 제1일 내지 제90일 중 아무 일(이러한 범위는 개입하는 일을 포함함) 또는 이중 임의의 일 조합에 제공되고, 다른 하나의 물질이 제1일 내지 제90일 중 아무 일(이러한 범위는 개입하는 일을 포함함) 또는 이중 임의의 일 조합에 제공될 수 있음이 고려된다. 하루(24-시간 동안) 이내에, 환자는 물질(들)의 일회 또는 다회 투여를 받을 수 있다. 게다가, 치료 기간 후에, 항암 치료제가 투여되지 않는 일정 기간이 존재함이 고려된다. 이 기간은 환자의 조건, 예컨대 이들의 예후, 체력, 건강 등에 따라 1-7 일, 및/또는 1-5 주, 및/또는 1-12 달 또는 그 이상이 걸릴 수 있다(이러한 범위는 개입하는 일을 포함함).
다양한 조합이 사용될 수 있다. 하기 실시예에서 키누레니나제는 "A"이고 항암 요법은 "B"이다:
A/B/A B/A/B B/B/A A/A/B A/B/B B/A/A A/B/B/B B/A/B/B
B/B/B/A B/B/A/B A/A/B/B A/B/A/B A/B/B/A B/B/A/A
B/A/B/A B/A/A/B A/A/A/B B/A/A/A A/B/A/A A/A/B/A
환자에게 본 구현예의 임의의 화합물을 투여하거나 요법을 실시하는 것은 만약 있다면, 약제의 독성을 고려하여, 이러한 화합물의 투여에 대한 일반적인 프로토콜을 따를 것이다. 그러므로, 일부 구현예에서, 병행 요법에 기인하는 독성을 모니터링하는 단계가 있다.
XI. 실시예
하기의 실시예가 본 발명의 바람직한 구현예를 설명하기 위해 포함된다. 하기의 실시예에 개시된 기술이 본 발명의 실시에서 본 발명자에 의해 잘 기능하는 것으로 확인된 기술을 나타내며, 따라서 본 발명의 실시의 바람직한 방식을 구성하는 것으로 간주될 수 있음을 당업자는 이해할 것이다. 그러나, 당업자는 본 개시에 비추어, 개시된 특정 구현예에 많은 변화가 이루어질 수 있으며 본 발명의 사상 및 범주를 벗어나지 않으면서 동일하거나 유사한 결과를 얻을 수 있음을 이해해야 한다.
실시예 1-인간 키나제(h-KYNase)의 개발과 특징
본 연구는, h-KYNase 변이체의 조작과 광범위한 종양에 대한 치료제로서 상기 변이체의 개발을 포함했다. 수많은 인간 변이체가 조작되었고, 박테리아 툴 Kynase와 비교할 수는 있는, Kyn에 대한 촉매 활성(Kcat/Km)을 측정하였다(도 1의 A 및 표 2, 하기). 변이체는, 증가된 촉매 활성 및 시험관 내 90% 인간 혈청(특정 시간 동안 혈청에서 배양한 후 잔류 활성으로 표현됨)에서 비활성화에 대한 내성을 위해 최적화되었다. 조작된 인간 변이체는 시험관 내 인간 혈청에서 촉매 안정성을 크게 향상시켰다(도 1의 B 및 표2).
단백질(68) 및 단백질(153)과 같은 인간 변이체는, 단일 정맥 투여 후 마우스에서 연장된 Kyn 분해를 나타냈다(도 1의 C). 이들 연구를 위해, 체중이 약 18-20 g이고 6-8 주 BALB/c 암컷 마우스에 비히클(PBS pH 7.4) 또는 10 mg/kg(68)/(153)을 iv 투여했다. 투여 이후 6, 24, 48, 72 및 120 시간에, 마우스를 말기 채혈(n=4 마리 마우스/시점)하고, 혈장 샘플을, 즉시 내부 표준(IS) 용액을 함유한 산으로 급냉시키고 키누레닌의 LC/MS 분석을 위해 처리했다.
표 2. 선택된 효소 변이체에 대한 촉매 활성 및 혈청 안정성
Figure pct00013
Figure pct00014
Figure pct00015
Figure pct00016
Figure pct00017
Figure pct00018
Figure pct00019
Figure pct00020
실시예 2-HsKYN 효능 및 항-종양 기억
다음으로, HsKYN 변이체의 생체 내 효능을 CT26 마우스 모델과 B16-IDO 모델에서 테스트했다. 6-8 주령 암컷 BALB/c 마우스를 오른쪽 아래 옆구리 안으로 100 μl PBS 중 500,000 CT26 세포를 피하 이식했다. 투여는 세포 접종 후 4 일차에 시작되었다. 단백질(68)은 3 회 투여 동안 10 mg/kg Q6D로 피하 투여되었다; Epacadostat는 300 mg/kg QD로 경구 투여되었다(5 일 on, 2일 off). 항PD-1은 5 회 투여 동안 10 mg/kg Q3D로 복막 내 투여되었다. 종양은 디지털 캘리퍼스로 일주일에 세 번 측정되었고 종양 부피는 부피 공식=(LxWxT)xPi/6을 사용하여 계산되었다. 종양이 2,000mm3 초과하면 동물을 희생시켰다(도 2의 A). (A)에서 마지막 종양 완전 소실 개체(CR)가 나타난 지 100 일 후, 무처리 BALB/c 마우스와 CR을 왼쪽 아래 옆구리 안으로 피하 이식된 CT26으로 재시험했다. 종양 부피는 전술한 바와 같이 측정되었고, 결과를 도 2의 B에 나타냈다.
실시예 3- HsKYN 종양 면역 프로파일링
CT26 종양을 갖는 마우스에서, 단백질(68)의 면역 프로파일링을 수행했다. 6-8 주령 암컷 BALB/c 마우스를 오른쪽 아래 옆구리 안으로 100 μl PBS 중 500,000 CT26 세포를 피하 이식했다. 투여는 세포 접종 후 4 일차에 시작되었다. 종양은 디지털 캘리퍼로 일주일에 세 번 측정되었고 종양 부피는 공식 부피=(LxWxT)xPi/6을 사용하여 계산되었다. 마지막 투여 이후 24 시간이 지나 동물을 희생시키고 추가 분석을 위해 종양을 수집했다. 단백질(68)은 2 회 투여 동안 10 mg/kg Q6D로 피하 투여되었다; 항PD-1은 3 회 투여 동안 10 mg/kg Q3D로 복막내 투여되었다. Qiagen RNAeasy 키트를 사용하여 RNA를 추출하고, PanCancer Immune Profiling Panel을 사용하여 Nanostring 분석에 100 ng의 RNA를 사용했다(도 3의 A). 도 3의 B의 연구를 위해 단백질(68)은 2 회 투여 동안 10 mg/kg Q6D로 피하 투여되었다. 종양은 Miltenyi의 종양 분해 키트로 분해되었다. 단일 세포 현탁액을 표지된 항체로 염색하고, Fortessa:CD8(CD45+ CD3+ CD8+ CD4-); T조절세포(CD45+ CD3+ CD4+ CD8- FoxP3+ CD25+); M1 대식세포(CD45+ CD11b+ F4/80+ MHCII+ CD206-); M2 대식 세포(CD45+ CD11b+ F4/80+ MHCII+ CD206+)를 이용해 분석하였다.
실시예 4-쥐 및 NHP에서의 선도 HsKYN 변이체 PD 및 PK 프로파일
수컷 Sprague Dawley 쥐(200-300g)를 꼬리 정맥을 통해 느린 주사로, 단일 용량 또는 3 주당 10 mg/kg(153)을 iv 투여했다. 투여 24 시간 전(-24 시간), 1차, 2차 또는 3차 투여 후 6, 24, 48, 72 또는 120 시간(n=4 마리 마우스/시점)에 혈액을 채혈하였다. 도 1의 C에 설명된 바와 같이 혈장 샘플이 처리되었고, 키누레닌 수준이 LC/MS로 분석되었다(도 4의 A). 다음으로, 한 마리의 수컷과 한 마리의 암컷 시노 원숭이(2 살 이상)에게 두부 정맥을 통해 느린 주사로 10 mg/kg(153)의 단일 용량을 iv 투입했다. 투여 전(0 시간), 0.25, 6, 24, 48, 72, 120, 168, 240 및 336 시간 후 혈액을 채혈하였다. 혈장 샘플을 두 부분으로 나누었다: 한 부분은 키누레닌 LC/MS 분석을 위해 도1의 C에 설명된 대로 처리되었고(도 4의 B); 다른 한 부분은 페길화된 단백질의 ELISA 분석(항-PEG 항체(Abcam # ab51257) 포획 및 비오틴화된 항-PEG 항체(Abcam # ab53449) 검출)을 거쳤다. 혈장 농도 대 시간 데이터는, WinNonlin 소프트웨어 프로그램을 사용하는 비 구획 접근법으로 분석되었으며, C0, Cmax, T1/2, AUC0-last, AUC0-inf를 사용한 약동학적 매개 변수를 계산하였다.
따라서, 본 연구는 키나제에 의한 키누레닌 분해가 IDO 및 TDO 발현 종양 모두에 광범위하게 적용될 수 있음을 보여 주었다. HsKYN 단백질 조작은 촉매 활성을 500 배 이상 증가시켰고 촉매 안정성을 크게 향상시켜 생체 내에서 견고하고 내구성있는 Kyn 고갈을 유도했다. HsKYN 변이체는, Epacadostat에 비해 우수한 단일 물질 및 PD1 조합 효능뿐만 아니라 지속적인 항-종양 기억을 입증했다. 증가된 IFNg와 관련된 T-세포 염증성 표지 유전자 발현 및 M1/M2 대식 세포 비율은, HsKYN +/- PD1 매개 종양 효능의 기본 메커니즘일 수 있다. 결론적으로, 전임상 독성 종에서 바람직한 PK/PD 프로파일은 선도 HsKYN 변이체의 추가 임상 개발을 지지한다.
* * *
본원에 개시되고 청구되는 모든 방법은, 본 개시에 비추어 과도한 실험 없이 이루어지고 실시될 수 있다. 본 발명의 조성물 및 방법이 바람직한 구현예에 관해 설명되었지만, 당업자는, 본 발명의 개념, 사상, 및 범위를 벗어나지 않고 본원에 개시된 방법 및 본원에 개시된 방법의 단계 또는 일련의 단계에 변형이 적용될 수 있음을 이해할 것이다. 보다 구체적으로는, 화학적으로 그리고 생리학적으로 관련된 특정 약제가, 본원에 개시된 약제를 대체할 수 있는 동시에 동일하거나 유사한 결과가 달성되는 것이 자명할 것이다. 당업자에게 자명한 이러한 모든 유사한 치환물 및 변형은, 첨부된 청구 범위에 의해 한정되는 본 발명의 사상, 범위, 및 개념 내에 있는 것으로 간주된다.
참조 문헌
하기의 참조 문헌은 본원에 개시된 것들에 예시적인 절차 또는 기타 상세한 보충을 제공하는 정도로 본원에 참조로서 구체적으로 포함된다.
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본 개시는 다음의 숫자로 나열된 구현예에 추가 설명된다:
구현예 1. 단리된, 변형된 인간 키누레니나제 효소, 상기 변형된 효소는 SEQ ID NO:1의 인간 키누레니나제 효소와 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 갖고, 다음 군으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 치환을 포함한다: L8P, K38E, Y47L, I48F, K50Q, I51M, S60N, K64N, D65G, E66K, N67D, N67P, D67S, A68F, A68T, A68V, F71L, F71M, L72N, K84E, E88N, E89K, E89S, E90Q, D92E, K93N, K93T, A95H, A95Q, K96N, I97H, I97L, I97V, A98G, A99G, A99I, A99R, A99S, A99T, A99V, Y100N, Y100S, Y100T, G101A, H102W, E103F, E103H, E103N, E103Q, E103R, E103V, E103W, V104D, V104E, V104F, V104H, V104K, V104L, V104R, G105A, G105H, G105S, G105T, E106D,K106D, K106E, K106H, K106N, R107P, R107S, P108R, I110A, I110F, I110L, I110M, I110T, T111D, T111H, T111N, T111R, G112A, G112C, G112D, G112K, G112L, G112M, G112Q, G112R, G112S, G112T, G112Y, N127K, I131V, A132V, L133V, A136T, L137T, T138S, N140D, H142Q, Q14R, Y156H, K163T, D168E, H169R, Q175L, I183F, I183L, I183P, I183S, E184A, E184D, E184R, E184T, E184V, E185T, M187L, M189I, K191A, K191G, K191H, K191M, K191N, K191R, K191S, K191T, K191W, E197A, E197D, E197F, E197K, E197M, E197Q, E197S, E197T, E197V, I201C, I201E, I201F, I201H, I201L, I201S, I201T, I201V, H203K, L219M, L219W, F220L, V223I, F225Y, H230F, H230L, H230Y, N232S, Y246F, F249W, D250E, S274A, S274C, S274G, S274N, S274T, L278M, A280G, A280S, A280T, G281S, A282M, A282P, G284N, I285L, V303L, V303S, F306W, F306Y, S311N, K315E, D317E, D317K, I331C, I331L, I331N, I331S, I331T, I331V, N333T, P334N, P335T, L337T, L338A, L338Q, S341I, K373E, K373N, N375A, N375H, Y376C, Y376F, Y376L, K378G, K378P, K378Q, K378R, K380G, K380S, A382G, A382R, A382T, T383S, K384G, K384N, P386K, P386S, V387L, N389E, I405L, F407Y, S408D, S408N, N411R, D413S, D413V, Q416T, E419A, E419L, K420E, R421N, V424I, K427M, N429E, G432A, 및 A436T.
구현예 2. 제1 구현예의 효소에 있어서, 상기 아미노산 서열은 표 1의 폴리펩티드 중 임의의 하나의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일하다.
구현예 3. 제1 또는 제2 구현예의 효소는, A282, F306 및/또는 F249에서의 치환을 포함한다.
구현예 4. 제1 내지 제3 구현예 중 어느 하나의 효소는 F306W 치환을 포함한다.
구현예 5. 제1 내지 제4 구현예 중 어느 하나의 효소는 L72N 치환을 포함한다.
구현예 6. 제1 내지 제5 구현예 중 어느 하나의 효소는 H102W 및/또는 N333T 치환을 포함한다.
구현예 7. 제1 내지 제6 구현예 중 어느 하나의 효소는 A99에서의 치환을 포함한다.
구현예 8. 제1 내지 제7 구현예 중 어느 하나의 효소는 G112에서의 치환을 포함한다.
구현예 9. 제1 내지 제8 구현예 중 어느 하나의 효소는 E103에서의 치환을 포함한다.
구현예 10. 제1 내지 제9 구현예 중 어느 하나의 효소는 V104에서의 치환을 포함한다.
구현예 11. 제1 내지 제10 구현예 중 어느 하나의 효소는 S408에서의 치환을 포함한다.
구현예 12. 제1 내지 제11 구현예 중 어느 하나의 효소는 I183P 치환을 포함한다.
구현예 13. 제1 내지 제12 구현예 중 어느 하나의 효소는 R107P 치환을 포함한다.
구현예 14. 제1 내지 제13 구현예 중 어느 하나의 효소는 A436T 치환을 포함한다.
구현예 15. 제1 내지 제14 구현예 중 어느 하나의 효소는 L72N, H102W, A282P, F306W, I331S 및 N333T로부터 선택된 적어도 하나의 치환을 포함한다.
구현예 16. 제1 내지 제15 구현예 중 어느 하나의 효소는 L72N, H102W, A282P, F306W, I331S 및 N333T로부터 선택된 적어도 2, 3, 4, 또는 5 개의 치환을 포함한다.
구현예 17. 제1 내지 제16 구현예 중 어느 하나의 효소는 L72N, H102W, A282P, F306W, I331S 및 N333T 치환을 포함한다.
구현예 18. 제1 내지 제17 구현예 중 어느 하나에 있어서, 상기 효소는 KYN에 대한 촉매 활성도(kcat/kM)가 적어도 8000 M-1s-1이다.
구현예 19. 제1 내지 제18 구현예 중 어느 하나의 효소에 있어서, 상기 효소는 KYN에 대한 촉매 활성도(kcat/kM)가 8000 M-1s-1 내지 40000 M-1s-1, 10000 M-1s-1 내지 40000 M-1s-1, 20000 M-1s-1 내지 40000 M-1s-1, 또는 25000 M-1s-1 내지 35000 M-1s-1이다.
구현예 20. 제1 내지 제19 구현예 중 어느 하나의 효소에 있어서, 상기 아미노산 서열은 SEQ ID NO:2의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일하다.
구현예 21. 제20 구현예의 효소에 있어서, 상기 아미노산 서열은 SEQ ID NO:2의 아미노산 서열과 적어도 95% 동일하다.
구현예 22. 제1 내지 제19 구현예 중 어느 하나의 효소에 있어서, 상기 아미노산 서열은 SEQ ID NO:3의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일하다.
구현예 23. 제22 구현예의 효소에 있어서, 상기 아미노산 서열은 SEQ ID NO:3의 아미노산 서열과 적어도 95% 동일하다.
구현예 24. 제1 내지 제23 구현예 중 어느 하나의 효소는, 이종 펩티드 단편을 추가로 포함한다.
구현예 25. 제1 내지 제24 구현예 중 어느 하나의 효소에 있어서, 상기 효소는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)에 결합된다.
구현예 26. 제25 구현예의 효소에 있어서, 상기 효소는 하나 이상의 Lys 또는 Cys 잔기를 통해 PEG에 결합된다.
구현예 27. 핵산은, 제1 내지 제26 구현예 중 어느 하나의 효소를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
구현예 28. 제27 구현예의 핵산에 있어서, 상기 핵산은 박테리아, 균류, 곤충, 또는 포유류에서 발현되도록 최적화된 코돈이다.
구현예 29. 발현 벡터는 제27 구현예 또는 제28 구현예의 핵산을 포함한다.
구현예 30. 숙주 세포는 제27 구현예 또는 제28 구현예의 핵산 또는 제29 구현예의 발현 벡터를 포함한다.
구현예 31. 제30 구현예의 숙주 세포에 있어서, 상기 숙주 세포는 박테리아 세포, 균류 세포, 곤충 세포, 또는 포유류 세포이다.
구현예 32. 제31 구현예의 숙주 세포에 있어서, 상기 숙주 세포는 박테리아 세포이다.
구현예 33. 제31 구현예의 숙주 세포에 있어서, 상기 숙주 세포는 포유류 세포이고, 선택적으로 상기 포유류 세포는 면역 이펙터 세포이다.
구현예 34. 제33 구현예의 숙주 세포에 있어서, 상기 면역 이펙터 세포는 NK-세포 또는 T-세포이다.
구현예 35. 약제학적 제형은, 제1 내지 제26 구현예 중 어느 하나에 따른 효소를 약제학적으로 허용되는 담체에 포함한다.
구현예 36. 종양을 갖는 개체를 치료하는 방법은, 제1 내지 제26 구현예 중 어느 하나의 효소 또는 제35 구현예의 제형을 유효한 양으로 상기 개체에게 투여하는 단계를 포함한다.
구현예 37. 조성물은, 종양을 갖는 개체의 치료에 사용하기 위해 제1 내지 제26 구현예 중 어느 하나의 효소 또는 제35 구현예의 제형의 유효한 양을 포함한다.
구현예 38. 제36 구현예의 방법 또는 제37 구현예의 조성물에 있어서, 상기 개체는 IDO1, IDO2, 또는 TDO 발현 종양을 갖는 것으로 확인되었다.
구현예 39. 제36 또는 제38 구현예의 방법, 또는 제37 또는 제38 구현예의 조성물에 있어서, 상기 종양은 충실성 종양이다.
구현예 40. 제36 또는 제38 구현예의 방법, 또는 제37 또는 제38 구현예의 조성물에 있어서, 상기 종양은 혈액 종양이다.
구현예 41. 제36 또는 제38 내지 제40 구현예 중 어느 하나의 방법, 또는 제37 내지 제40 구현예 중 어느 하나의 조성물에 있어서, 상기 개체는 인간 환자이다.
구현예 42. 제36 또는 제38 내지 제41 구현예 중 어느 하나의 방법, 또는 제37 내지 제41 구현예 중 어느 하나의 조성물에 있어서, 상기 효소 또는 제형은 종양내, 정맥내, 피내, 동맥내, 복강내, 병변내, 두개내, 관절내, 전립선내, 흉막내, 기관내, 안내, 비강내, 유리체내, 질내, 직장내, 근육내, 피하, 결막하, 소포내, 점막으로, 심막내, 탯줄내, 경구로, 흡입으로, 주사로, 주입으로, 연속 주입으로, 표적 세포를 직접적으로 국소 관류욕하여, 카테터를 통해, 또는 세척을 통해 투여된다.
구현예 43. 제36 및 제38 내지 제42 구현예 중 어느 하나의 방법은, 적어도 2차 항암 요법을 실행하는 단계를 추가로 포함한다.
구현예 44. 제43 구현예의 방법에 있어서, 상기 2차 항암 요법은 방사선 요법, 수술 요법, 면역 요법 또는 항암 화합물이다.
구현예 45. 제44 구현예의 방법에 있어서, 상기 2차 항암 화합물은 면역 관문 억제제이다.
구현예 46. 제44 구현예 또는 제45 구현예의 방법에 있어서, 상기 2차 항암 화합물은 항체이다.
구현예 47. 제44 내지 제46 구현예 중 어느 하나의 방법에 있어서, 상기 2차 항암 화합물은 항-PD1, 항-CTLA-4, 또는 항-PD-L1 항체를 포함한다.
구현예 48. 제44 내지 제47 구현예 중 어느 하나의 방법에 있어서, 상기 2차 항암 화합물은 항체-약물 접합체이다.
구현예 49. 제44 내지 제48 구현예 중 어느 하나의 방법에 있어서, 상기 면역 요법은 면역 이펙터 세포 또는 면역원성 조성물을 투여한다.
구현예 50. 제49 구현예의 방법에 있어서, 상기 면역원성 조성물은 암 세포 항원을 포함한다.
구현예 51. 제49 구현예 또는 제50 구현예의 방법에 있어서, 상기 면역 이펙터 세포는 NK-세포 또는 T-세포를 포함한다.
구현예 52. 제49 내지 제51 구현예 중 어느 하나의 방법에 있어서, 상기 면역 이펙터 세포는 CAR T-세포를 포함한다.
구현예 53. 형질전환 T 세포는, 제1 내지 제26 구현예 중 어느 하나에 따라 발현된 키누레니나제 효소를 포함한다.
구현예 54. 제53 구현예의 세포는, 발현된 키메라 항원 T-세포 수용체(CAR) 또는 조작된 T-세포 수용체(TCR)를 추가로 포함한다.
구현예 55. 제53 구현예 또는 제54 구현예의 세포에 있어서, 상기 세포는 인간 T 세포이다.
구현예 56. 제54 구현예 또는 제55 구현예의 세포에 있어서, CAR 및 키누레니나제를 인코딩하는 DNA는, 상기 세포의 게놈 내에 통합된다.
구현예 57. 제54 내지 제56 구현예 중 어느 하나의 세포에 있어서, 상기 CAR은 암-세포 항원을 표적화한다.
구현예 58. 제57 구현예의 세포에 있어서, 상기 암-세포 항원은 HER2, CD19, CD20, 또는 GD2이다.
구현예 59. 종양을 가진 인간 개체에서 T-세포 반응을 제공하는 방법은, 제53 내지 제58 구현예 중 어느 하나에 따른 형질전환 세포를 유효량으로 상기 개체에게 투여하는 단계를 포함한다.
구현예 60. 조성물은, 종양을 갖는 개체 치료에 사용하기 위해 제53 내지 제58 구현예 중 어느 하나에 따른 형질전환 세포를 유효량으로 포함한다.
구현예 61. 제59 구현예의 방법 또는 제60 구현예의 조성물에 있어서, 상기 형질전환 세포는 자가 세포이다.
구현예 62. 제59 구현예의 방법 또는 제60 구현예의 조성물에 있어서, 상기 형질전환 세포는 이종 세포이다.
구현예 63. 종양 치료를 위한 의약품을 제조하는 데 있어서, 제1 내지 제26 구현예 중 어느 하나에 따른 키누레니나제 효소, 또는 제27 구현예 또는 제28 구현예에 따른 핵산, 또는 제29 구현예에 따른 발현 벡터를 사용한다.
서열 부록:
SEQ ID NO:1: 야생형 인간 KYNase
MEPSSLELPADTVQRIAAELKCHPTDERVALHLDEEDKLRHFRECFYIPKIQDLPPVDLSLVNKDENAIYFLGNSLGLQPKMVKTYLEEELDKWAKIAAYGHEVGKRPWITGDESIVGLMKDIVGANEKEIALMNALTVNLHLLMLSFFKPTPKRYKILLEAKAFPSDHYAIESQLQLHGLNIEESMRMIKPREGEETLRIEDILEVIEKEGDSIAVILFSGVHFYTGQHFNIPAITKAGQAKGCYVGFDLAHAVGNVELYLHDWGVDFACWCSYKYLNAGAGGIAGAFIHEKHAHTIKPALVGWFGHELSTRFKMDNKLQLIPGVCGFRISNPPILLVCSLHASLEIFKQATMKALRKKSVLLTGYLEYLIKHNYGKDKAATKKPVVNIITPSHVEERGCQLTITFSVPNKDVFQELEKRGVVCDKRNPNGIRVAPVPLYNSFHDVYKFTNLLTSILDSAETKN
SEQ ID NO:2
단백질 168:
MEPSSLELPADTVQRIAAELKCHPTDERVALHLDEEDKLRHFRECFYIPK
IQDLPPVDLSLVNKDENAIYFNGNSLGLQPKMVKTYLEEELDKWAKIARY
GWRHGKPPWITYDESIVGLMKDIVGANEKEIALMNALTVNLHLLMLSFFK
PTPKRYKILLEAKAFPSDHYAIESQLQLHGLNPEESMRMIKPREGEETLR
IEDILEVIEKEGDSIAVILFSGVHFYTGQHFNIPAITKAGQAKGCYVGWD
LAHAVGNVELYLHDWGVDFACWCSYKYLNAGPGGIAGAFIHEKHAHTIKP
ALVGWWGHELSTRFKMDNKLQLIPGVCGFRSSTPPILLVCSLHASLEIFK
QATMKALRKKSVLLTGYLEYLIKHNYGKDKAATKKPVVNIITPSHVEERG
CQLTITFNVPNKDVFQELEKRGVVCDKRNPNGIRVTPVPLYNSFHDVYKF
TNLLTSILDSAETKN*
SEQ ID NO:3
단백질 153:
MEPSSLELPADTVQRIAAELKCHPTDERVALHLDEEDKLRHFRECFYIPKIQDLPPVDLSLVNKDENAIYFNGNSLGLQPKMVKTYLEEELDKWAKIARY
GWRHGKPPWITYDESIVGLMKDIVGANEKEIALMNALTVNLHLLMLSFFKPTPKRYKILLEAKAFPSDHYAIESQLQLHGLNPEESMRMIKPREGEETLR
IEDILEVIEKEGDSIAVILFSGVHFYTGQHFNIPAITKAGQAKGCYVGFDLAHAVGNVELYLHDWGVDFACWCSYKYLNAGPGGIAGAFIHEKHAHTIKP
ALVGWWGHELSTRFKMDNKLQLIPGVCGFRSSTPPILLVCSLHASLEIFKQATMKALRKKSVLLTGYLEYLIKHNYGKDKAATKKPVVNIITPSHVEERG
CQLTITFNVPNKDVFQELEKRGVVCDKRNPNGIRVTPVPLYNSFHDVYKFTNLLTSILDSAETKN*
<110> Board of Regents, The University of Texas System <120> 인간 키누레니나제 효소 및 그 용도 <130> UTFB.P1194WO <150> 62/658,261 <151> 2018년 4월 16일 <160> 3 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 465 <212> PRT <213> 호모 사피엔스 <400> 1 Met Glu Pro Ser Ser Leu Glu Leu Pro Ala Asp Thr Val Gln Arg Ile 1 5 10 15 Ala Ala Glu Leu Lys Cys His Pro Thr Asp Glu Arg Val Ala Leu His 20 25 30 Leu Asp Glu Glu Asp Lys Leu Arg His Phe Arg Glu Cys Phe Tyr Ile 35 40 45 Pro Lys Ile Gln Asp Leu Pro Pro Val Asp Leu Ser Leu Val Asn Lys 50 55 60 Asp Glu Asn Ala Ile Tyr Phe Leu Gly Asn Ser Leu Gly Leu Gln Pro 65 70 75 80 Lys Met Val Lys Thr Tyr Leu Glu Glu Glu Leu Asp Lys Trp Ala Lys 85 90 95 Ile Ala Ala Tyr Gly His Glu Val Gly Lys Arg Pro Trp Ile Thr Gly 100 105 110 Asp Glu Ser Ile Val Gly Leu Met Lys Asp Ile Val Gly Ala Asn Glu 115 120 125 Lys Glu Ile Ala Leu Met Asn Ala Leu Thr Val Asn Leu His Leu Leu 130 135 140 Met Leu Ser Phe Phe Lys Pro Thr Pro Lys Arg Tyr Lys Ile Leu Leu 145 150 155 160 Glu Ala Lys Ala Phe Pro Ser Asp His Tyr Ala Ile Glu Ser Gln Leu 165 170 175 Gln Leu His Gly Leu Asn Ile Glu Glu Ser Met Arg Met Ile Lys Pro 180 185 190 Arg Glu Gly Glu Glu Thr Leu Arg Ile Glu Asp Ile Leu Glu Val Ile 195 200 205 Glu Lys Glu Gly Asp Ser Ile Ala Val Ile Leu Phe Ser Gly Val His 210 215 220 Phe Tyr Thr Gly Gln His Phe Asn Ile Pro Ala Ile Thr Lys Ala Gly 225 230 235 240 Gln Ala Lys Gly Cys Tyr Val Gly Phe Asp Leu Ala His Ala Val Gly 245 250 255 Asn Val Glu Leu Tyr Leu His Asp Trp Gly Val Asp Phe Ala Cys Trp 260 265 270 Cys Ser Tyr Lys Tyr Leu Asn Ala Gly Ala Gly Gly Ile Ala Gly Ala 275 280 285 Phe Ile His Glu Lys His Ala His Thr Ile Lys Pro Ala Leu Val Gly 290 295 300 Trp Phe Gly His Glu Leu Ser Thr Arg Phe Lys Met Asp Asn Lys Leu 305 310 315 320 Gln Leu Ile Pro Gly Val Cys Gly Phe Arg Ile Ser Asn Pro Pro Ile 325 330 335 Leu Leu Val Cys Ser Leu His Ala Ser Leu Glu Ile Phe Lys Gln Ala 340 345 350 Thr Met Lys Ala Leu Arg Lys Lys Ser Val Leu Leu Thr Gly Tyr Leu 355 360 365 Glu Tyr Leu Ile Lys His Asn Tyr Gly Lys Asp Lys Ala Ala Thr Lys 370 375 380 Lys Pro Val Val Asn Ile Ile Thr Pro Ser His Val Glu Glu Arg Gly 385 390 395 400 Cys Gln Leu Thr Ile Thr Phe Ser Val Pro Asn Lys Asp Val Phe Gln 405 410 415 Glu Leu Glu Lys Arg Gly Val Val Cys Asp Lys Arg Asn Pro Asn Gly 420 425 430 Ile Arg Val Ala Pro Val Pro Leu Tyr Asn Ser Phe His Asp Val Tyr 435 440 445 Lys Phe Thr Asn Leu Leu Thr Ser Ile Leu Asp Ser Ala Glu Thr Lys 450 455 460 Asn 465 <210> 2 <211> 465 <212> PRT <213> 인공 서열 <220> <223> 합성 폴리펩티드 <400> 2 Met Glu Pro Ser Ser Leu Glu Leu Pro Ala Asp Thr Val Gln Arg Ile 1 5 10 15 Ala Ala Glu Leu Lys Cys His Pro Thr Asp Glu Arg Val Ala Leu His 20 25 30 Leu Asp Glu Glu Asp Lys Leu Arg His Phe Arg Glu Cys Phe Tyr Ile 35 40 45 Pro Lys Ile Gln Asp Leu Pro Pro Val Asp Leu Ser Leu Val Asn Lys 50 55 60 Asp Glu Asn Ala Ile Tyr Phe Asn Gly Asn Ser Leu Gly Leu Gln Pro 65 70 75 80 Lys Met Val Lys Thr Tyr Leu Glu Glu Glu Leu Asp Lys Trp Ala Lys 85 90 95 Ile Ala Arg Tyr Gly Trp Arg His Gly Lys Pro Pro Trp Ile Thr Tyr 100 105 110 Asp Glu Ser Ile Val Gly Leu Met Lys Asp Ile Val Gly Ala Asn Glu 115 120 125 Lys Glu Ile Ala Leu Met Asn Ala Leu Thr Val Asn Leu His Leu Leu 130 135 140 Met Leu Ser Phe Phe Lys Pro Thr Pro Lys Arg Tyr Lys Ile Leu Leu 145 150 155 160 Glu Ala Lys Ala Phe Pro Ser Asp His Tyr Ala Ile Glu Ser Gln Leu 165 170 175 Gln Leu His Gly Leu Asn Pro Glu Glu Ser Met Arg Met Ile Lys Pro 180 185 190 Arg Glu Gly Glu Glu Thr Leu Arg Ile Glu Asp Ile Leu Glu Val Ile 195 200 205 Glu Lys Glu Gly Asp Ser Ile Ala Val Ile Leu Phe Ser Gly Val His 210 215 220 Phe Tyr Thr Gly Gln His Phe Asn Ile Pro Ala Ile Thr Lys Ala Gly 225 230 235 240 Gln Ala Lys Gly Cys Tyr Val Gly Trp Asp Leu Ala His Ala Val Gly 245 250 255 Asn Val Glu Leu Tyr Leu His Asp Trp Gly Val Asp Phe Ala Cys Trp 260 265 270 Cys Ser Tyr Lys Tyr Leu Asn Ala Gly Pro Gly Gly Ile Ala Gly Ala 275 280 285 Phe Ile His Glu Lys His Ala His Thr Ile Lys Pro Ala Leu Val Gly 290 295 300 Trp Trp Gly His Glu Leu Ser Thr Arg Phe Lys Met Asp Asn Lys Leu 305 310 315 320 Gln Leu Ile Pro Gly Val Cys Gly Phe Arg Ser Ser Thr Pro Pro Ile 325 330 335 Leu Leu Val Cys Ser Leu His Ala Ser Leu Glu Ile Phe Lys Gln Ala 340 345 350 Thr Met Lys Ala Leu Arg Lys Lys Ser Val Leu Leu Thr Gly Tyr Leu 355 360 365 Glu Tyr Leu Ile Lys His Asn Tyr Gly Lys Asp Lys Ala Ala Thr Lys 370 375 380 Lys Pro Val Val Asn Ile Ile Thr Pro Ser His Val Glu Glu Arg Gly 385 390 395 400 Cys Gln Leu Thr Ile Thr Phe Asn Val Pro Asn Lys Asp Val Phe Gln 405 410 415 Glu Leu Glu Lys Arg Gly Val Val Cys Asp Lys Arg Asn Pro Asn Gly 420 425 430 Ile Arg Val Thr Pro Val Pro Leu Tyr Asn Ser Phe His Asp Val Tyr 435 440 445 Lys Phe Thr Asn Leu Leu Thr Ser Ile Leu Asp Ser Ala Glu Thr Lys 450 455 460 Asn 465 <210> 3 <211> 465 <212> PRT <213> 인공 서열 <220> <223> 합성 폴리펩티드 <400> 3 Met Glu Pro Ser Ser Leu Glu Leu Pro Ala Asp Thr Val Gln Arg Ile 1 5 10 15 Ala Ala Glu Leu Lys Cys His Pro Thr Asp Glu Arg Val Ala Leu His 20 25 30 Leu Asp Glu Glu Asp Lys Leu Arg His Phe Arg Glu Cys Phe Tyr Ile 35 40 45 Pro Lys Ile Gln Asp Leu Pro Pro Val Asp Leu Ser Leu Val Asn Lys 50 55 60 Asp Glu Asn Ala Ile Tyr Phe Asn Gly Asn Ser Leu Gly Leu Gln Pro 65 70 75 80 Lys Met Val Lys Thr Tyr Leu Glu Glu Glu Leu Asp Lys Trp Ala Lys 85 90 95 Ile Ala Arg Tyr Gly Trp Arg His Gly Lys Pro Pro Trp Ile Thr Tyr 100 105 110 Asp Glu Ser Ile Val Gly Leu Met Lys Asp Ile Val Gly Ala Asn Glu 115 120 125 Lys Glu Ile Ala Leu Met Asn Ala Leu Thr Val Asn Leu His Leu Leu 130 135 140 Met Leu Ser Phe Phe Lys Pro Thr Pro Lys Arg Tyr Lys Ile Leu Leu 145 150 155 160 Glu Ala Lys Ala Phe Pro Ser Asp His Tyr Ala Ile Glu Ser Gln Leu 165 170 175 Gln Leu His Gly Leu Asn Pro Glu Glu Ser Met Arg Met Ile Lys Pro 180 185 190 Arg Glu Gly Glu Glu Thr Leu Arg Ile Glu Asp Ile Leu Glu Val Ile 195 200 205 Glu Lys Glu Gly Asp Ser Ile Ala Val Ile Leu Phe Ser Gly Val His 210 215 220 Phe Tyr Thr Gly Gln His Phe Asn Ile Pro Ala Ile Thr Lys Ala Gly 225 230 235 240 Gln Ala Lys Gly Cys Tyr Val Gly Phe Asp Leu Ala His Ala Val Gly 245 250 255 Asn Val Glu Leu Tyr Leu His Asp Trp Gly Val Asp Phe Ala Cys Trp 260 265 270 Cys Ser Tyr Lys Tyr Leu Asn Ala Gly Pro Gly Gly Ile Ala Gly Ala 275 280 285 Phe Ile His Glu Lys His Ala His Thr Ile Lys Pro Ala Leu Val Gly 290 295 300 Trp Trp Gly His Glu Leu Ser Thr Arg Phe Lys Met Asp Asn Lys Leu 305 310 315 320 Gln Leu Ile Pro Gly Val Cys Gly Phe Arg Ser Ser Thr Pro Pro Ile 325 330 335 Leu Leu Val Cys Ser Leu His Ala Ser Leu Glu Ile Phe Lys Gln Ala 340 345 350 Thr Met Lys Ala Leu Arg Lys Lys Ser Val Leu Leu Thr Gly Tyr Leu 355 360 365 Glu Tyr Leu Ile Lys His Asn Tyr Gly Lys Asp Lys Ala Ala Thr Lys 370 375 380 Lys Pro Val Val Asn Ile Ile Thr Pro Ser His Val Glu Glu Arg Gly 385 390 395 400 Cys Gln Leu Thr Ile Thr Phe Asn Val Pro Asn Lys Asp Val Phe Gln 405 410 415 Glu Leu Glu Lys Arg Gly Val Val Cys Asp Lys Arg Asn Pro Asn Gly 420 425 430 Ile Arg Val Thr Pro Val Pro Leu Tyr Asn Ser Phe His Asp Val Tyr 435 440 445 Lys Phe Thr Asn Leu Leu Thr Ser Ile Leu Asp Ser Ala Glu Thr Lys 450 455 460 Asn 465

Claims (20)

  1. 단리된, 변형된 인간 키누레니나제 효소로서, 상기 변형된 효소는 SEQ ID NO:1의 인간 키누레니나제 효소와 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 갖고, L8P, K38E, Y47L, I48F, K50Q, I51M, S60N, K64N, D65G, E66K, N67D, N67P, D67S, A68F, A68T, A68V, F71L, F71M, L72N, K84E, E88N, E89K, E89S, E90Q, D92E, K93N, K93T, A95H, A95Q, K96N, I97H, I97L, I97V, A98G, A99G, A99I, A99R, A99S, A99T, A99V, Y100N, Y100S, Y100T, G101A, H102W, E103F, E103H, E103N, E103Q, E103R, E103V, E103W, V104D, V104E, V104F, V104H, V104K, V104L, V104R, G105A, G105H, G105S, G105T, E106D,K106D, K106E, K106H, K106N, R107P, R107S, P108R, I110A, I110F, I110L, I110M, I110T, T111D, T111H, T111N, T111R, G112A, G112C, G112D, G112K, G112L, G112M, G112Q, G112R, G112S, G112T, G112Y, N127K, I131V, A132V, L133V, A136T, L137T, T138S, N140D, H142Q, Q14R, Y156H, K163T, D168E, H169R, Q175L, I183F, I183L, I183P, I183S, E184A, E184D, E184R, E184T, E184V, E185T, M187L, M189I, K191A, K191G, K191H, K191M, K191N, K191R, K191S, K191T, K191W, E197A, E197D, E197F, E197K, E197M, E197Q, E197S, E197T, E197V, I201C, I201E, I201F, I201H, I201L, I201S, I201T, I201V, H203K, L219M, L219W, F220L, V223I, F225Y, H230F, H230L, H230Y, N232S, Y246F, F249W, D250E, S274A, S274C, S274G, S274N, S274T, L278M, A280G, A280S, A280T, G281S, A282M, A282P, G284N, I285L, V303L, V303S, F306W, F306Y, S311N, K315E, D317E, D317K, I331C, I331L, I331N, I331S, I331T, I331V, N333T, P334N, P335T, L337T, L338A, L338Q, S341I, K373E, K373N, N375A, N375H, Y376C, Y376F, Y376L, K378G, K378P, K378Q, K378R, K380G, K380S, A382G, A382R, A382T, T383S, K384G, K384N, P386K, P386S, V387L, N389E, I405L, F407Y, S408D, S408N, N411R, D413S, D413V, Q416T, E419A, E419L, K420E, R421N, V424I, K427M, N429E, G432A, 및 A436T로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 치환을 포함하는, 효소.
  2. 제1항에 있어서, 상기 아미노산 서열은 표 1의 폴리펩티드 중 임의의 하나의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한, 효소.
  3. 제1항에 있어서,
    (a) A282, F306 또는 F249에서의 치환;
    (b) F306W 치환;
    (c) L72N 치환;
    (d) H102W 및 N333T 치환;
    (e) A99에서의 치환;
    (f) G112에서의 치환;
    (g) E103에서의 치환;
    (h) V104에서의 치환;
    (i) S408에서의 치환;
    (j) I183P 치환;
    (k) R107P 치환; 및/또는
    (l) A436T 치환을 포함하는 효소.
  4. 제1항에 있어서, L72N, H102W, A282P, F306W, I331S 및 N333T로부터 선택된 적어도 하나의 치환을 포함하고, 선택적으로 상기 효소는 A282P, F306W, I331S 및 N333T로부터 선택된 적어도 2, 3, 4, 또는 5 개의 치환을 포함하는, 효소.
  5. 제4항에 있어서, L72N, H102W, A282P, F306W, I331S 및 N333T 치환을 포함하는, 효소.
  6. 제5항에 있어서, 상기 효소는 키누레닌(KYN)에 대한 촉매 활성도(kcat/kM)가 적어도 8000 M-1s-1이고, 선택적으로 상기 효소는 KYN에 대한 촉매 활성도가 8000 M-1s-1 내지 40000 M-1s-1, 10000 M-1s-1 내지 40000 M-1s-1, 20000 M-1s-1 내지 40000 M-1s-1, 또는 25000 M-1s-1 내지 35000 M-1s-1인, 효소.
  7. 제1항에 있어서, 상기 아미노산 서열은 SEQ ID NO:2의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일하고, 선택적으로 상기 아미노산 서열은 SEQ ID NO:2의 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한, 효소.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 이종 펩티드 단편을 추가로 포함하는 효소.
  9. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 효소는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)에 결합되고, 선택적으로 상기 효소는 하나 이상의 Lys 또는 Cys 잔기에서 PEG에 결합되는, 효소.
  10. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 효소를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산으로서, 선택적으로 상기 핵산은 박테리아, 균류, 곤충, 또는 포유류에서 발현되도록 최적화된 코돈인, 핵산.
  11. 제10항의 핵산을 포함하는 발현 벡터.
  12. 제10항의 핵산 또는 제11항의 발현 벡터를 포함한 숙주 세포로서, 선택적으로 상기 숙주 세포는 박테리아 세포, 균류 세포, 곤충 세포, 또는 포유류 세포이고, 선택적으로 상기 포유류 세포는 포유류 면역 이펙터 세포이고, 선택적으로 상기 포유류 면역 이펙터 세포는 NK-세포 또는 T-세포인, 숙주 세포.
  13. 약제학적으로 허용되는 담체에, 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 효소를 포함하는 약제학적 제형.
  14. 종양을 가진 개체를 치료하기 위해, 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 효소 또는 제13항의 제형을 유효한 양으로 상기 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  15. 종양을 가진 개체의 치료에 사용하기 위해, 제1항 내지 제9항 중 어느 하나의 효소 또는 제13항의 제형을 유효한 양으로 포함하는 조성물.
  16. 제14항의 방법 또는 제15항의 조성물에 있어서, 상기 개체는 IDO1, IDO2, 또는 TDO 발현 종양을 갖는 것으로 확인되었고, 선택적으로:
    (a) 상기 종양은 충실성 종양 또는 혈액 종양이고;
    (b) 상기 개체는 인간 환자이고;
    (c) 상기 효소 또는 제형은 종양내, 정맥내, 피내, 동맥내, 복강내, 병변내, 두개내, 관절내, 전립선내, 흉막내, 기관내, 안내, 비강내, 유리체내, 질내, 직장내, 근육내, 피하, 결막하, 소포내, 점막으로, 심막내, 탯줄내, 경구로, 흡입으로, 주사로, 주입으로, 연속 주입으로, 표적 세포를 직접적으로 국소 관류욕하여, 카테터를 통해, 또는 세척을 통해 투여되고/투여되거나;
    (d) 상기 효소 또는 제형은 적어도 2차 항암 요법과 함께 투여되고, 선택적으로 상기 2차 항암 요법은 방사선 요법, 수술 요법, 면역 요법 또는 2차 항암 화합물이고, 선택적으로:
    (i) 상기 2차 항암 화합물은 면역 관문 억제제이고, 선택적으로 상기 면역 관문 억제제는 항체 또는 항체-약물 접합체이고, 선택적으로 상기 항체는 항-PD1, 항-CTLA-4, 또는 항-PD-L1 항체이고/항체이거나;
    (ii) 상기 면역 요법은 면역 이펙터 세포 또는 면역원성 조성물을 투여하는 단계를 포함하고, 선택적으로 상기 면역원성 조성물은 암 세포 항원을 포함하고/포함하거나 상기 면역 이펙터 세포는 NK-세포, T-세포, 또는 CAR T-세포를 포함하는, 방법 또는 조성물.
  17. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따라 발현된 키누레니나제 효소를 포함하는 형질전환 T 세포로서, 선택적으로:
    (a) 상기 형질전환 T 세포는, 발현된 키메라 항원 T-세포 수용체(CAR) 또는 조작된 T-세포 수용체(TCR)를 추가로 포함하고;
    (b) 상기 형질전환 T 세포는 인간 형질전환 T 세포이고;
    (c) 상기 CAR과 상기 키누레니나제를 인코딩하는 DNA가 상기 세포의 게놈 내에 통합되고/통합되거나;
    (d) 상기 CAR은 암-세포 항원을 표적화하고, 선택적으로 상기 암-세포 항원은 HER2, CD19, CD20, 또는 GD2인, 세포.
  18. 종양을 가진 인간 개체에서 T-세포 반응을 촉진하기 위해, 제17항에 따른 형질전환 세포를 유효량으로 상기 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  19. 종양을 가진 개체 치료에 사용하기 위해, 제17항에 따른 형질전환 세포를 유효량으로 포함하는 조성물로서, 선택적으로:
    (a) 상기 형질전환 세포는 자가세포이거나;
    (b) 상기 형질전환 세포는 이종세포인, 조성물.
  20. 종양 치료를 위한 의약품을 제조하는 데 있어서, 제1 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 키누레니나제 효소, 또는 제10항에 따른 핵산의 용도.
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