KR20200135936A - 전립선 암 특이적 골수 침윤성 림프구 및 이의 용도 - Google Patents

전립선 암 특이적 골수 침윤성 림프구 및 이의 용도 Download PDF

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킴벌리 에이. 누난
이반 보렐로
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윈드밀 테라퓨틱스, 인크.
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Abstract

본 개시는 전립선 암 특이적 골수 침윤성 림프구를 포함하는 조성물 및 이를 만들기 위한 및 사용하기 위한 방법을 제공한다.

Description

전립선 암 특이적 골수 침윤성 림프구 및 이의 용도
본 출원은 미국 특허법 119(e)조(35 U.S.C. §119(e))에 따라 2018년 3월 22일자로 출원된 미국 가특허출원 제62/646,649호를 우선권으로 주장하고, 이는 그 전체가 본원에 참조로 원용된다.
본 개시는 전립선 암을 치료하는 데 특이적인 골수 침윤성 림프구(MIL) 및 이의 용도의 방법을 일반적으로 지칭한다.
전립선 암은 가장 흔하게 진단되는 암 중 하나이고 암-관련 사망의 주된 원인이고, 새로운 치료법은 여전히 임상적 최우선 과제로 남아있다. 전이성 전립선 암은 자가유래 세포 면역요법에 취약할 수 있다. mPCa 환자를 위한 자가유래 세포 치료법인 시풀루셀-티(Sipuleucel-T)는 3 상 시험에서 전체 생존율을 증가시켰다. PSMA 및 PSCA를 대상으로 하는 키메라 항원 수용체(CAR) T 세포 치료법은 전립선 암에서 현재 개발되고 있다. 비록 유망하지만, 이들 치료법의 전체 효능 및 실현가능성은 미지로 남아있다.
골수 침윤성 림프구(MIL)는 골수 T 세포를 활성화시키고 증식시키는 생산물이다. 골수는 면역계에서 특화된 니치(niche)이고, 이는 항원 노출, 중심 기억 T 세포가 풍부하다. MIL은 다발성 골수종 환자에게 면역학적으로 측정가능한 임상적 이익을 주는 것으로 보여진다(미국 특허 제9,687,510호를 참조). 골수 미세환경은 고형 종양, 예컨대 유방, 췌장 및 난소 암 환자에서 종양-항원 특이적 T 세포를 보유하는 것으로 또한 보여진다. 그러므로, 필요한 것은 암 치료법에서의 용도를 위한 전립선 암 특이적 MIL이다.
요약
본원은 (a) 전립선 암을 갖는 대상체로부터 얻어진 골수 샘플을 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체와 함께 저산소 환경에서 배양하여 저산소-활성화된 골수 침윤성 림프구를 생산하는 단계; (b) 저산소-활성화된 골수 침윤성 림프구를 정상 산소 환경에서 배양하여 치료적 활성화된 골수 침윤성 림프구를 생산하는 단계; 및 (c) 치료적 활성화된 골수 침윤성 림프구를 전립선 암을 갖는 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 전립선 암을 갖는 대상체를 골수 침윤성 림프구로 치료하는 방법을 개시한다.
또한 본원에서 개시된 것은 상기에서 기술된 방법의 실시태양이고, 여기서 저산소 환경은 약 0 % 내지 약 5 %의 산소의 산소 함량을 갖는다.
또한 본원에서 개시된 것은 상기에서 기술된 방법의 실시태양이고, 여기서 림프구는 IL-2의 존재 하에서 배양된다.
또한 본원에서 개시된 것은 상기에서 기술된 방법의 실시태양이고, 여기서 골수 샘플은 저산소 환경에서 약 24 시간 동안 배양된다.
또한 본원에서 개시된 것은 상기에서 기술된 방법의 실시태양이고, 여기서 골수 샘플은 저산소 환경에서 약 2 일 동안 배양된다.
또한 본원에서 개시된 것은 상기에서 기술된 방법의 실시태양이고, 여기서 골수 샘플은 저산소 환경에서 약 3 일 동안 배양된다.
또한 본원에서 개시된 것은 상기에서 기술된 방법의 실시태양이고, 여기서 골수 샘플은 저산소 환경에서 약 2 내지 약 5 일 동안 배양된다.
또한 본원에서 개시된 것은 상기에서 기술된 방법의 실시태양이고, 여기서 저산소 환경은 약 1 % 내지 약 2 %의 산소이다.
또한 본원에서 개시된 것은 상기에서 기술된 방법의 실시태양이고, 여기서 저산소-활성화된 골수 침윤성 림프구는 정상 산소 환경에서 약 2 내지 약 12 일 동안 배양된다.
또한 본원에서 개시된 것은 상기에서 기술된 방법의 실시태양이고, 여기서 저산소-활성화된 골수 침윤성 림프구는 정상 산소 환경에서 약 6 일 동안 배양된다.
또한 본원에서 개시된 것은 상기에서 기술된 방법의 실시태양이고, 여기서 저산소-활성화된 골수 침윤성 림프구는 정상 산소 환경에서 약 9 일 동안 배양된다.
또한 본원에서 개시된 것은 상기에서 기술된 방법의 실시태양이고, (a) 단계에 앞서 암을 갖는 대상체로부터 골수 샘플을 제거하는 단계를 더 포함한다.
또한 본원에서 개시된 것은 상기에서 기술된 방법의 실시태양이고, 여기서 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체는 비드에 부착된다.
또한 본원에서 개시된 것은 상기에서 기술된 방법의 실시태양이고, 여기서 전립선 암은 선방 선암, 관 선암, 거세-저항성, 이행 세포 암, 편평 세포 암, 또는 소 세포 전립선 암의 하나 이상이다.
또한 본원은 (a) 전립선 암을 갖는 대상체로부터 얻어진 골수 샘플을 항-CD3/항-CD28 비드와 함께 약 1 % 내지 약 2 %의 산소의 저산소 환경에서 약 2 내지 약 5 일 동안 배양하여 저산소-활성화된 골수 침윤성 림프구를 생산하는 단계; (b) 저산소-활성화된 골수 침윤성 림프구를 약 21 %의 산소의 정상 산소 환경에서 약 2 내지 약 12 일 동안 IL-2의 존재 하에서 배양하여 치료적 활성화된 골수 침윤성 림프구를 생산하는 단계; 및 (c) 치료적 활성화된 골수 침윤성 림프구를 전립선 암을 갖는 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 전립선 암을 갖는 대상체를 치료적 활성화된 골수 침윤성 림프구로 치료하는 방법을 개시한다.
또한 본원은 전립선 암 특이적 골수 침윤성 림프구를 포함하는 제약 조성물을 대상체에 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 전립선 암을 치료하는 방법을 개시한다.
또한 본원에서 개시된 것은 상기에서 기술된 방법의 실시태양이고, 여기서 전립선 암 특이적 골수 침윤성 림프구는 전립선 암을 갖는 대상체로부터 얻어진다.
또한 본원에서 개시된 것은 상기에서 기술된 방법의 실시태양이고, 여기서 전립선 암 특이적 골수 침윤성 림프구는 치료되고 있는 대상체에 자가유래다.
또한 본원에서 개시된 것은 상기에서 기술된 방법의 실시태양이고, 여기서 전립선 암 특이적 골수 침윤성 림프구는 치료되고 있는 대상체에 동종이계다.
또한 본원에서 개시된 것은 상기에서 기술된 방법의 실시태양이고, 여기서 골수 침윤성 림프구는 저산소 활성화된다.
또한 본원에서 개시된 것은 상기에서 기술된 방법의 실시태양이고, 여기서 골수 침윤성 림프구는 저산소 활성화되고 정상 산소 활성화된다.
또한 본원에서 개시된 것은 상기에서 기술된 방법의 실시태양이고, 여기서 제약 조성물이 비경구 투여, 복강내 또는 근육내 투여에 의해 투여된다.
또한 본원에서 개시된 것은 상기에서 기술된 방법의 실시태양이고, 여기서 제약 조성물이 대상체의 전립선 내로 직접 투여된다.
또한 본원에서 개시된 것은 상기에서 기술된 방법의 실시태양이고, 여기서 대상체로 투여된 골수 침윤성 림프구의 약 75 % 내지 약 100 %는 CD3을 발현한다.
또한 본원에서 개시된 것은 상기에서 기술된 방법의 실시태양이고, 여기서 대상체로 투여된 골수 침윤성 림프구의 약 80 % 내지 약 100 %는 CD3을 발현한다.
또한 본원에서 개시된 것은 상기에서 기술된 방법의 실시태양이고, 여기서 대상체로 투여된 골수 침윤성 림프구의 약 85 % 내지 약 100 %는 CD3을 발현한다.
또한 본원에서 개시된 것은 상기에서 기술된 방법의 실시태양이고, 여기서 대상체로 투여된 골수 침윤성 림프구의 약 90 % 내지 약 100 %는 CD3을 발현한다.
또한 본원에서 개시된 것은 상기에서 기술된 방법의 실시태양이고, 여기서 조성물 또는 대상체로 투여된 MIL 내 존재하는 CD4+:CD8+ T 세포의 비율은 약 2:1이다.
또한 전립선 암 환자로부터 분리된 저산소-활성화된 골수 침윤성 림프구의 집단을 포함하고, 여기서 저산소 활성화된 골수 침윤성 림프구의 집단의 약 75 % 내지 약 100 %가 CD3를 발현하는 것인, 조성물을 개시한다.
또한 본원에서 개시된 것은 상기에서 기술된 방법의 실시태양이고, 여기서 저산소 활성화된 골수 침윤성 림프구의 집단의 약 80 % 내지 약 100 %는 CD3을 발현한다.
또한 본원에서 개시된 것은 상기에서 기술된 방법의 실시태양이고, 여기서 저산소 활성화된 골수 침윤성 림프구의 집단의 약 85 % 내지 약 100 %가 CD3을 발현한다.
또한 본원에서 개시된 것은 상기에서 기술된 방법의 실시태양이고, 여기서 저산소 활성화된 골수 침윤성 림프구의 집단의 약 90 % 내지 약 100 %는 CD3을 발현한다.
또한 본원에서 개시된 것은 상기에서 기술된 방법의 실시태양이고, 여기서 조성물 내 존재하는 CD4+:CD8+ T 세포의 비율이 약 2:1이다.
또한 본원에서 개시된 것은 상기에서 기술된 방법의 실시태양이고, 여기서 세포 집단은 (a) 골수 샘플을 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체와 함께 약 1 % 내지 약 3 %의 산소의 저산소 환경에서 배양하여 활성화된 골수 침윤성 림프구를 생산하는 단계; 및 (b) 활성화된 골수 침윤성 림프구를 정상 산소 환경에서 IL-2의 존재에서 배양하여 조성물을 생산하는 단계에 의해 전립선 암을 갖는 대상체로부터 얻어진 골수 샘플로부터 얻어질 수 있다.
또한 본원에서 개시된 것은 상기에서 기술된 방법의 실시태양이고, 여기서 MIL는 전립선 암 특이적이다.
도 1은 전이성 전립선 암 환자 골수로부터의 MIL의 성공적인 증식을 보여주는 그래프이다. 각 환자의 골수 시료에 대해 채취된 세포 #/시작한 세포 수로 표현된 증식 배수가 보여진다.
도 2는 증식 이전 및 이후의 10 명의 전이성 전립선 암 환자 골수 시료의 각각에서 각 T 세포 마커에 대해 양성으로 염색되는 세포의 백분율의 그래프를 보여준다.
도 3은 종양-특이적 T 세포의 정량을 보여준다. 자가유래 항원-제시 세포(APC)는 전립선 암 세포주로부터의 용해물로 펄스처리되고, CFSE-표지 MIL 또는 PBL과 공동-배양되었다.
도 4는 단일 환자에 대한 증식된 MIL 및 PBL 내 종양-특이적 T 세포의 정량의 대표적인 결과를 보여준다.
도 5는 증식된 MIL의 각각에 대한 종양 세포 용해물 조합의 각각에 대해 측정된 IFNγ-생산 CFSE-lo CD3+ T 세포의 백분율을 보여준다.
도 6은 증식된 PBL의 각각에 대한 종양 세포 용해물 조합의 각각에 대해 측정된 IFNγ-생산 CFSE-lo CD3+ T 세포의 백분율을 보여준다.
본원에서 사용되고 달리 지시되지 않는 한, 용어 “약”은 이것이 수식하는 값의 평균 ±5 %로 의도된다. 따라서, 약 100은 95 내지 105를 의미한다. 부가적으로, 용어 “약”은 일련의 용어 내 용어, 예컨대 “약 1, 2, 3, 4, 또는 5”를 수식하고, 용어 “약”은 목록의 각각의 구성을 수식하는 것으로 이해되어야 하고, 그래서 “약 1, 2, 3, 4, 또는 5”는 “약 1, 약 2, 약 3, 약 4, 또는 약 5”를 의미하는 것으로 이해될 수 있다. 용어 “적어도” 또는 다른 수량 수식어, 예컨대 “미만”, “초과” 등에 의해 수식된 목록에 대해서도 마찬가지이지만, 이에 제한되지 않는다.
본원 및 첨부된 청구항에서 사용된 단수형은, 문맥에서 달리 분명하게 명시하지 않는 한, 복수 대상을 수반한다.
본원에서 사용된 용어 “포함하는”(및 포함하는의 임의의 형태, 예컨대 “포함하다(복수형)”, “포함하다(단수형)”, 및 “포함된”), “갖는”(및 갖는의 임의의 형태, 예컨대 “갖다(복수형)” 및 “갖다(단수형)”), “수반하는”(및 수반하는의 임의의 형태, 예컨대 “수반하다(복수형)” 및 “수반하다(단수형)”), 또는 “함유하는”(및 함유하는의 임의의 형태, 예컨대 “함유하다(복수형)” 및 “함유하다(단수형)”)은 포괄적이거나 개방형이며, 추가적인, 인용되지 않은 요소 또는 방법 단계를 배제하지 않는다. 용어 “포함하는”을 인용하는 임의의 조성물 또는 방법은 인용된 성분 또는 요소로 구성되거나, 이루어지거나, 또는 필수적으로 구성된 조성물로서도 또한 기술되는 것으로 또한 이해되어야 한다.
본원에서 사용된 용어 “치료”, “치료된”, 또는 “치료하는”은 두 치료적 치료 모두를 의미하고, 여기서 목적은 원하지 않는 생리학적 상태, 장애, 또는 질환을 늦추기(줄이기) 위한 것, 또는 이익이 되는 또는 원하는 임상적 결과를 얻기 위한 것이다. 본원에서 기술된 실시태양의 목적을 위해, 이익이 되는 또는 원하는 임상적 결과는 증상의 경감; 상태, 장애, 또는 질환의 양의 감소; 상태, 장애 또는 질환의 안정된(즉, 악화되지 않는) 상황; 상태, 장애, 또는 질환 진행의 발생 지연 또는 늦춤; 검출가능하든지 또는 검출불가능하든지, 상태, 장애 또는 질환 상황의 개선 또는 차도(부분적이든지 또는 전체적이든지); 환자에 의해 인식될 필요는 없는, 적어도 하나의 측정가능한 신체적 지표의 개선; 또는 상태, 장애 또는 질환의 증진 또는 호전을 수반하지만, 이에 제한되지 않는다. 따라서, “암의 치료” 또는 “암을 치료하는”은 암 또는 본원에서 기술된 임의의 다른 상태와 연관된 임의의 일차적 현상 또는 이차적 증상을 경감시키거나 개선시키는 활동을 의미한다. 일부 실시태양에서, 치료되고 있는 암은 본원에서 인용된 암 중 하나이다.
본원에서 사용된 용어 “대상체”는 용어 “환자”와 상호교환적으로 사용될 수 있다. 대상체는 포유류, 예컨대 개, 고양이, 원숭이, 말, 소 등일 수 있다. 일부 실시태양에서 대상체는 인간이다. 일부 실시태양에서, 대상체는 전립선 암으로 진단된다. 일부 실시태양에서, 대상체는 전립선 암을 갖는 것으로 여겨진다. 일부 실시태양에서, 대상체는 전립선 암을 갖는 것으로 의심된다.
본원에서 사용된 용어 “발현하다”는, 세포 표면 수용체, 예컨대 CD3, CD4, 및 CD8을 지칭하는 것이지만, 이에 제한되지 않고, 그 마커에 양성인 세포로 또한 지칭될 수도 있다. 예를 들어, CD3을 발현하는 세포는 CD3 양성(CD3+)으로 또한 지칭될 수 있다.
본원에서 사용된 용어 “암”은 비정상적인 세포의 급진적이고 조절되지 않는 성장으로 특징지어지는 질환으로서 정의된다. 암 세포는 국소적으로 또는 혈류 및 림프계를 통해 신체의 다른 부분으로 확산될 수 있다. 본원에서 사용된 용어 “전립선 암”은 전립선으로부터 비롯된 암, 또는 전립선 표면 또는 전립선 내부의 암으로서 정의된다. 일부 실시태양에서, 전립선 암은 선방 선암, 관 선암, 거세-저항성, 이행 세포 암, 편평 세포 암, 또는 소 세포 전립선 암의 하나 이상이다.
“유효량” 또는 “치료적 유효량”은 본원에서 상호교환적으로 사용되고, 본원에서 기술된 특정한 생물학적 결과를 달성하기 위해 효과적인 화합물, 제제, 물질, 또는 조성물의 양을 지칭한다. 이러한 결과는 기술분야에 적합한 임의의 수단에 의해 결정된 바이러스 감염의 억제를 수반할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본원에서 기술된 “골수 침윤성 림프구” 또는 “MIL”은 면역 세포의 아집단이고, 예를 들어, 미국 특허 제9,687,510호에 기술되어 있고, 이는 그 전체가 본원에 참조로 원용된다. MIL은 말초의 림프구(PBL)로부터 현저히 상이하다. 예를 들어, MIL은 더 용이하게 증식되어, PBL에 비해 더 큰 양으로 활성화 마커를 상향조절하고, 더 많은 편향된 Vβ 레퍼토리를 유지하고, 골수로 이동하고, 가장 중요하게, 현저하게 높은 종양 특이성을 소유한다. 일부 실시태양에서 MIL은, 예를 들어, 본원에서 기술된 항-CD3/항-CD-28 비드와 함께 및 저산소 조건 하에서 그들을 인큐베이션함으로써 활성화될 수 있다. 일부 실시태양에서, 저산소 조건 하에서 MIL을 성장시키는 것은 미국 특허 제9,687,510호 및 국제 출원 제WO2016/037054호에 또한 기술되고, 이들 모두는 그 전체가 본원에 참조로 원용된다.
비-고형 종양 유형 암, 예컨대 다발성 골수종에서 MIL을 사용하는 이전의 방법과 대비하여, 고형 종양 암을 치료하기 위한 MIL의 용도는 상이하고 분명한 패러다임을 요구한다. 많은 종양은 T 세포-매개 종양-특이적 면역을 도피하기 위해 종양 세포 및 다른 세포의 PD-L1의 상향조절을 통해 PD-1/PD-L1 경로를 활용하는 것으로 알려졌다. PD-1 및 PD-L1 사이의 상호작용을 억제하는 것은 이 면역억제 신호를 감소시키고, 종양-특이적 세포독성 T 세포가 종양 세포에 접근하고 죽이는 것을 허용한다.
MILTM 은 입양 세포 치료법의 다른 두 형태와 구별된다. 표 1은 MILTM의 주요 특성을 키메라 항원 수용체(CAR)-T 및 유전적으로 조작된 T 세포 수용체(eTCR) 세포 치료법과 대비한다. 가장 중요한 것은 CAR-T 및 eTCR 세포 치료법의 효능이 종양 세포의 동족 항원의 관여에 의존한다는 것이다; 종양에 의한 그 항원의 선택적 편집 또는 제거는 CAR-T 또는 eTCR 치료법을 비-효과적으로 만들 것이다. 대조적으로, MILTM의 다클론성 인식은 질환 재발의 메커니즘으로서 항원 도피 소실 종양 변이체를 생성시키는 위험을 최소화해야 한다.
표 1: CAR-T 및 eTCR 세포에 대한 MILTM의 대비
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일부 실시태양에서, MIL을 준비하는 방법은 대상체로부터의 골수, 림프구, 및/또는 골수 침윤성 림프구로부터 세포를 제거하는 것; 저산소 환경에서 세포를 인큐베이션하는 것, 그렇게 함으로써 활성화된 MIL을 생산하는 것을 포함할 수 있다. 일부 실시태양에서, 대상체는 전립선 암을 갖는다. 세포는 본원에서 기술된 항-CD3/항-CD28 항체 및 싸이토카인의 존재에서 또한 활성화될 수 있다.
수집된 골수는, 예를 들어, 종양 특이적 MIL을 생성하기 위해 냉동될 수 있거나 즉시 이용될 수 있다. 골수가 냉동된 경우, 인큐베이션 전에 해동되는 것이 바람직하다. 골수는 MIL을 정제하기 위해 통상의 기술자에게 공지된 방법을 통해 처리될 수 있다. MIL은, 예를 들어, 비드, 예로써, 항-CD4/CD28 비드로 활성화될 수 있다. 용액 내 비드 대 세포의 비율은 변동할 수 있다; 특정 실시태양에서, 상기 비율은 3 대 1이다. 유사하게, MIL은 하나 이상의 항체, 항원, 및/또는 싸이토카인의 존재에서, 예로써, 항-CD3/CD28 비드의 부재에서 증식될 수 있다. 수집된 골수의 세포 수는, 예를 들어, MIL에 추가될 비드, 항체, 항원, 및/또는 싸이토카인의 양을 조절하기 위해 결정될 수 있다. 일부 실시태양에서, MIL은 세포를 수집하기 위해 특별히 설계된 비드를 사용하여 포획된다.
수집된 MIL은 첫 기간 동안 저산소 환경에서 성장될 수 있다. 저산소 환경은 약 7 % 미만의 산소, 예컨대 약 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 또는 1 % 미만의 산소를 수반할 수 있다. 예를 들어, 저산소 환경은 약 0 %의 산소 내지 약 7 %의 산소, 약 0 %의 산소 내지 약 6 %의 산소, 예컨대 약 0 %의 산소 내지 약 5 %의 산소, 약 0 %의 산소 내지 약 4 %의 산소, 약 0 %의 산소 내지 약 3 %의 산소, 약 0 %의 산소 내지 약 2 %의 산소, 약 0 %의 산소 내지 약 1 %의 산소를 수반한다. 일부 실시태양에서, 저산소 환경은 약 1 % 내지 약 5 %의 산소를 수반할 수 있다. 일부 실시태양에서, 저산소 환경은 약 1 % 내지 약 2 %의 산소이다. 일부 실시태양에서, 저산소 환경은 약 0.5 % 내지 약 1.5 %의 산소이다. 일부 실시태양에서, 저산소 환경은 약 0.5 % 내지 약 2 %의 산소이다. 저산소 환경은 약 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 % 또는 약 0 %의 산소, 및 이들 양 사이의 임의의 분율을 수반할 수 있다.
저산소 환경에서 MIL을 인큐베이션하는 것은, 예로써, 조직 배양 배지에서, 적어도 약 1 시간, 예컨대 적어도 약 12 시간, 18 시간, 24 시간, 30 시간, 36 시간, 42 시간, 48 시간, 60 시간, 3 일, 4 일, 5 일, 6 일, 7 일, 8 일, 9 일, 10 일, 11 일, 12 일, 13 일, 또는 심지어 적어도 약 14 일 동안 MIL을 인큐베이션하는 것을 포함할 수 있다. 인큐베이션하는 것은 MIL을 약 1 시간 내지 약 30 일, 예컨대 약 1 일 내지 약 20 일, 약 1 일 내지 약 14 일, 또는 약 1 일 내지 약 12 일 동안 인큐베이션하는 것을 포함할 수 있다. 일부 실시태양에서, MIL을 저산소 환경에서 인큐베이션하는 것은, MIL을 저산소 환경에서 약 2 일 내지 약 5 일 동안 인큐베이션하는 것을 포함한다. 상기 방법은 MIL을 저산소 환경에서 약 1 일, 2 일, 3 일, 4 일, 5 일, 6 일, 7 일, 8 일, 9 일, 10 일, 11 일, 12 일, 13 일, 또는 14 일 동안 인큐베이션하는 것을 포함할 수 있다. 일부 실시태양에서, 상기 방법은 MIL을 저산소 환경에서 약 3 일 동안 인큐베이션하는 것을 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 방법은 MIL을 저산소 환경에서 약 2 일 내지 약 4 일 동안 인큐베이션하는 것을 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 방법은 MIL을 저산소 환경에서 약 3일 내지 약 4 일 동안 인큐베이션하는 것을 포함한다.
일부 실시태양에서, 저산소-활성화된 MIL은 정상 산소 환경에서 배양되어 치료적으로 활성화된 골수 침윤성 림프구를 생산한다. 일부 실시태양에서, 정상 산소 환경은 적어도 약 7 %의 산소를 수반할 수 있다. 일부 실시태양에서, 정상 산소 환경은 약, 예컨대 약 8 %의 산소 내지 약 30 %의 산소, 10 %의 산소 내지 약 30 %의 산소, 약 15 %의 산소 내지 약 25 %의 산소, 약 18 %의 산소 내지 약 24 %의 산소, 약 19 %의 산소 내지 약 23 %의 산소, 또는 약 20 %의 산소 내지 약 22 %의 산소를 수반할 수 있다. 일부 실시태양에서, 정상 산소 환경은 약 21 %의 산소를 수반한다.
일부 실시태양에서, MIL은 IL-2 또는 다른 싸이토카인의 존재에서 배양된다. 일부 실시태양에서, MIL은 정상 산소 조건에서 IL-2의 존재에서 배양된다. 일부 실시태양에서, 다른 싸이토카인은 IL-7, IL-15, IL-9, IL-21, 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다. 일부 실시태양에서, MIL은 하나 이상의 싸이토카인, 예로써, 예컨대 IL-2, IL-7, 및/또는 IL-15, 또는 이들의 임의의 적합한 조합을 포함하는 세포 배양 배지에서 배양될 수 있다. 각각의 싸이토카인의 적합한 농도 또는 싸이토카인의 전체 농도의 도식적인 실시예는 약 25 IU/mL, 약 50 IU/mL, 약 75 IU/mL, 약 100 IU/mL, 약 125 IU/mL, 약 150 IU/mL, 약 175 IU/mL, 약 200 IU/mL, 약 250 IU/mL, 약 300 IU/mL, 약 350 IU/mL, 약 400 IU/mL, 약 450 IU/mL, 또는 약 500 IU/mL 또는 이들의 싸이토카인의 사이에 있는 임의의 양을 수반하지만, 이에 제한되지 않는다. 일부 실시태양에서, 세포는 IL-2, IL-1, 및/또는 IL-15 각각의, 또는 전체로, 약 100 IU/mL, 또는 이들의 임의의 조합에서 배양된다. 일부 실시태양에서, 세포 배양 배지는 IL-2, IL-1, 및/또는 IL-15 각각의, 또는 전체로, 약 250 IU/mL, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다.
MIL을 정상 산소 환경에서 인큐베이션하는 것은 MIL을 적어도 약 1 시간, 예컨대 적어도 약 12 시간, 18 시간, 24 시간, 30 시간, 36 시간, 42 시간, 48 시간, 60 시간, 3 일, 4 일, 5 일, 6 일, 7 일, 8 일, 9 일, 10 일, 11 일, 12 일, 13 일, 또는 심지어 적어도 약 14 일 동안 인큐베이션하는 것을 포함할 수 있다. 인큐베이션하는 것은 MIL을 약 1 시간 내지 약 30 일, 예컨대 약 1 일 내지 약 20 일, 약 1 일 내지 약 14 일, 약 1 일 내지 약 12 일, 또는 약 2 일 내지 약 12 일 동안 인큐베이션하는 것을 포함할 수 있다.
일부 실시태양에서, MIL은 본원에서 기술된 대상체로부터 골수 샘플을 추출하는 것 및 세포를 배양하는 것/인큐베이션하는 것에 의해 얻어진다. 일부 실시태양에서, 골수 샘플은 원심분리되어 적혈구를 제거한다. 일부 실시태양에서, 골수 샘플은 성분채집의 대상이 아니다. 일부 실시태양에서, 골수 샘플은 말초 혈액 림프구(“PBL”)를 포함하지 않거나 골수 샘플은 실질적으로 PBL이 없다. 이들 방법은 TIL로서 알려지게 된 것과 동일하지 않은 세포를 선택한다. 따라서, MIL은 TIL이 아니다. TIL은 통상의 기술자에 공지된 방법에 의해 선택될 수 있고, 본원에서 기술된 핵산 분자로 형질전환시킬 수 있거나 감염시킬 수 있고, 이로써 TIL은 본원에서 기술된 키메라성 막관통 단백질을 발현할 수 있다. 일부 실시태양에서, 골수 샘플은 전체 MIL에 대해 10 %, 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 % 미만의 PBL을 함유한다. 일부 실시태양에서, 상기 샘플은 PBL이 없다.
일부 실시태양에서, 세포는 CD3 및 CD28에 대한 항체와 함께 배양하는 것에 의해 또한 활성화될 수 있다. 이것은, 예를 들어, 세포를 상업적으로 이용가능하거나 통상의 기술자에 의해 만들어질 수 있는 항-CD3/항-CD28 비드와 함께 인큐베이션하는 것에 의해 수행될 수 있다. 세포는 플레이트, 플라스크, 또는 백에 도말될 수 있다. 저산소 조건은 저산소 챔버 또는 세포 배양 백 중 하나에 3 분 동안 95 %의 질소 및 5 %의 CO2 가스 혼합물을 주입하는 것에 의해 달성될 수 있다. 이는, 예를 들어, 리셉터클 내 1 내지 2 % 또는 미만의 O2 기체를 초래할 수 있다. 이러한 비드의 실시예 및 자극의 방법은, 예를 들어, 미국 특허 제6,352,694호, 제6,534,055호, 제6,692,964호, 제6,797,514호, 제6,867,041호, 제6,905,874호에서 발견될 수 있고, 이들 각각은 그 전체가 참조로 원용된다. 비드의 대안은 조작된 세포, 예컨대 K562 세포이고, 이는 MIL을 자극하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 방법은, 예를 들어, 미국 특허 제8,637,307호 및 제7,638,325호에서 발견될 수 있고, 이들 각각은 그 전체가 참조로 원용된다. 세포는 다른 방법, 예컨대 미국 특허 제8,383,099호에 기술된 것들을 사용하여 또한 자극될 수 있고, 이는 그 전체가 참조로 원용된다.
일부 실시태양에서, 활성화된 MIL 및/또는 치료적 활성화된 MIL은 전립선 암을 갖는, 또는 갖는 것으로 의심되는 대상체에게 투여된다. 일부 실시태양에서, 저산소-활성화된 MIL 및/또는 치료적 활성화된 MIL은 전립선 암을 갖는, 또는 갖는 것으로 의심되는 대상체로부터의 골수 샘플로부터 생산되고, 이후 동일한 대상체에 전립선 암을 치료하기 위해 투여된다. 일부 실시태양에서, MIL은 대상체에 동종이계다.
일부 실시태양에서, MIL은 제약 제제 또는 제약 조성물로 투여될 수 있다. 전립선 암 특이적 MIL을 포함하는 제약 조성물은 완충액 예컨대 중성의 완충 식염수, 인산염 완충 식염수 등; 탄수화물 예컨대 글루코오스, 만노오스, 수크로오스 또는 덱스트란, 만니톨; 단백질; 폴리펩티드 또는 아미노산 예컨대 글리신; 항산화제; 킬레이트제 예컨대 EDTA 또는 글루타치온; 보조제 (예로써, 수산화 알루미늄); 및 보존제를 더 포함할 수 있다. 조성물은 비경구 투여, 예로써, 혈관내(정맥내 또는 동맥내), 복강내 또는 근육내 투여를 위해 조제될 수 있다. 일부 실시태양에서, MIL 및/또는 조성물은 비경구 투여, 예로써, 혈관내(정맥내 또는 동맥내), 복강내 또는 근육내 투여로 투여된다. 조성물은 또한 전립선 내로 직접 투여될 수 있다. 일부 실시태양에서, 조성물은 정맥내 투여된다.
일부 실시태양에서, 조성물은, 그들이 용액이든, 현탁액이든 또는 다른 비슷한 형태의 것이든, 다음 중 하나 이상을 수반할 수 있다: DMSO, 멸균된 희석액 예컨대 주사를 위한 물, 식염수 용액, 바람직하게는 생리 식염수, 링거액, 등장성 염화 나트륨, 고정유 예컨대 용매 또는 현탁 매질의 역할을 할 수 있는 합성 모노 또는 디글리세리드, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 다른 용매; 항세균제 예컨대 벤질 알콜 또는 메틸 파라벤; 항산화제 예컨대 아스코르브산 또는 아황산수소나트륨; 킬레이트제 예컨대 에틸렌디아민테트라아세트산; 완충액 예컨대 아세트산염, 시트르산염 또는 인산염 및 긴장성의 조절을 위한 작용제 예컨대 염화 나트륨 또는 덱스트로오스.
일부 실시태양에서, 대상체는 플루다라빈과 함께 또는 없이, 사이클로포스파미드로 사전-컨디셔닝 될 수 있다. 하나의 이러한 예는 미국 제9,855,298호에서 제공되고, 이는 본원에 참조로 원용된다. 또 다른 비-제한적인 실시예는 플루다라빈(4 일 간 매일 정맥내 30mg/m2) 및 사이클로포스파미드(플루다라빈의 1차 투여와 함께 시작하여 2 일 간 매일 정맥내 500 mg/m2)를 투여하는 것이다. 투여 후, MIL은 플루다라빈의 완료 2 내지 14 일 후에 투여된다. 일부 실시태양에서, 사이클로포스파미드가 투여되거나 약 500 내지 약 600 mg/m2의 용량에서 2 내지 3 일.
일부 실시태양에서, 투여된 제약 조성물은 본원에 제공된 전립선-암 특이적 MIL을 포함한다. 이러한 MIL의 조성물은 본원에 또한 제공된다. 일부 실시태양에서, 전립선 암 특이적 MIL은 저산소 활성화된다. 일부 실시태양에서, 전립선 암 특이적 MIL은 저산소 활성화/정상 산소 활성화 MIL이다. 전립선 암 특이적 MIL은 대상체에서 전립선 암을 특이적으로 겨냥할 수 있는 MIL이다.
일부 실시태양에서, 조성물은 CD3 양성인 전립선 암 특이적 MIL의 집단을 포함한다. 일부 실시태양에서, MIL의 적어도 약, 또는 적어도, 40 %는 CD3 양성이다. 일부 실시태양에서, MIL의 약, 또는 적어도, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 또는 89 %는 CD3 양성이다. 일부 실시태양에서, MIL의 적어도, 또는 약, 80 %는 CD3 양성이다. 일부 실시태양에서, MIL의 약 40 % 내지 약 100 %은 CD3 양성이다. 일부 실시태양에서, MIL의 약 45 % 내지 약 100 %, 약 50 % 내지 약 100 %, 약 55 % 내지 약 100 %, 약 60 % 내지 약 100 %, 약 65 % 내지 약 100 %, 약 70 % 내지 약 100 %, 약 75 % 내지 약 100 %, 약 80 % 내지 약 100 %, 약 85 % 내지 약 100 %, 약 86 % 내지 약 100 %, 약 87 % 내지 약 100 %, 약 88 % 내지 약 100 %, 또는 약 90 % 내지 약 100 %는 CD3 양성이다(CD3을 발현한다).
일부 실시태양에서, 조성물은 CD3을 발현하지 않는 MIL의 집단, 또는 예를 들어, CD3을 발현하는 MIL의 집단으로부터의 MIL의 발현 수준에 대하여 낮은 수준의 CD3을 발현하는 MIL의 집단 중 하나를 포함한다.
일부 실시태양에서, 조성물은 인터페론 감마(”IFNγ”)를 발현하는 MIL의 집단을 포함하고, 즉, 여기서 IFNγ를 발현하는 MIL의 집단 내 각각의 세포는, 예컨대 유세포 분석법에 의해 검출된 IFNγ을 발현하는 골수 침윤성 림프구이다. 예를 들어, 조성물 내 세포의 적어도 약 2 %는 IFNγ을 발현하는 MIL일 수 있거나, 또는 MIL의 적어도 약 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, 11 %, 12 %, 13 %, 14 %, 15 %, 16 %, 17 %, 또는 심지어 적어도 약 18 %는 IFNγ을 발현하다. 일부 실시태양에서, MIL의 약 2 % 내지 약 100 %는 IFNγ을 발현하고, 예컨대 약 2 % 내지 약 100 %, 약 3 % 내지 약 100 %, 약 4 % 내지 약 100 %, 약 5 % 내지 약 100 %, 약 6 % 내지 약 100 %, 약 7 % 내지 약 100 %, 약 8 % 내지 약 100 %, 약 9 % 내지 약 100 %, 약 10 % 내지 약 100 %, 약 11 % 내지 약 100 %, 약 12 % 내지 약 100 %, 약 13 % 내지 약 100 %, 약 14 % 내지 약 100 %, 약 15 % 내지 약 100 %, 약 16 % 내지 약 100 %, 약 17 % 내지 약 100 %, 또는 심지어 약 18 % 내지 약 100 %이다. 일부 실시태양에서, 조성물은, 예컨대 유세포 분석법에 의해 검출된 IFNγ를 발현하지 않는 MIL의 집단, 또는 즉, IFNγ을 발현하는 MIL의 집단으로부터의 MIL의 발현 수준에 대해 IFNγ의 낮은 수준을 발현하는 MIL의 집단 중 하나를 포함한다.
일부 실시태양에서, 조성물은 CXCR4를 발현하는 MIL의 집단을 포함한다. 예를 들어, MIL의 적어도 약 98%는 CXCR4를 발현하고, 예컨대 MIL의 적어도 약 98.1 %, 98.2 %, 98.3 %, 98.4 %, 98.5 %, 98.6 %, 98.7 %, 98.8 %, 98.9 %, 99.0 %, 99.1 %, 99.2 %, 99.3 %, 99.4 %, 99.5 %, 99.6 %, 또는 심지어 적어도 약 99.7%이다. 일부 실시태양에서, 약 98 % 내지 약 100 %는 CXCR4를 발현하는 MIL일 수 있고, 예컨대 적어도 약 98.1 % 내지 약 100 %, 약 98.2 % 내지 약 100 %, 약 98.3 % 내지 약 100 %, 약 98.4 % 내지 약 100 %, 약 98.5 % 내지 약 100 %, 약 98.6 % 내지 약 100 %, 약 98.7 % 내지 약 100 %, 약 98.8 % 내지 약 100 %, 약 98.9 % 내지 약 100 %, 약 99.0 % 내지 약 100 %, 약 99.1 % 내지 약 100 %, 약 99.2 % 내지 약 100 %, 약 99.3 % 내지 약 100 %, 약 99.4 % 내지 약 100 %, 약 99.5 % 내지 약 100 %, 약 99.6 % 내지 약 100 %, 또는 심지어 약 99.7 % 내지 약 100 %의 조성물 내 MIL이다. 일부 실시태양에서, 조성물은, 예컨대 유세포 분석법에 의해 검출된 CXCR4를 발현하지 않는 MIL의 집단, 또는 즉, CXCR4를 발현하는 MIL 집단으로부터의 MIL의 발현 수준에 대해 낮은 수준의 CXCR4를 발현하는 MIL의 집단 중 하나를 포함한다.
CD4를 발현하는 MIL의 집단은 4-1BB를 발현하는 복수의 MIL를 포함할 수 있다. 예를 들어, 조성물 내 세포의 적어도 약 21 %는 4-1BB를 발현하는 복수의 MIL로부터의 MIL일 수 있고, 예컨대 조성물 내 세포의 적어도 약 22 %, 23 %, 24 %, 25 %, 26 %, 27 %, 28 %, 29 %, 30 %, 31 %, 32 %, 33 %, 34 %, 35 %, 36 %, 37 %, 38 %, 39 %, 40 %, 41 %, 42 %, 또는 심지어 적어도 약 43 %이다. 일부 실시태양에서, 조성물 내 세포의 약 21 % 내지 약 100 %는 4-1BB를 발현하는 복수의 MIL로부터의 MIL일 수 있고, 예컨대 조성물 내 세포의 약 22 % 내지 약 100 %, 약 23 % 내지 약 100 %, 약 24 % 내지 약 100 %, 약 25 % 내지 약 100 %, 약 26 % 내지 약 100 %, 약 27 % 내지 약 100 %, 약 28 % 내지 약 100 %, 약 29 % 내지 약 100 %, 약 30 % 내지 약 100 %, 약 31 % 내지 약 100 %, 약 32 % 내지 약 100 %, 약 33 % 내지 약 100 %, 약 34 % 내지 약 100 %, 약 35 % 내지 약 100 %, 약 36 % 내지 약 100 %, 약 37 % 내지 약 100 %, 약 38 % 내지 약 100 %, 약 39 % 내지 약 100 %, 약 40 % 내지 약 100 %, 약 41 % 내지 약 100 %, 약 42 % 내지 약 100 %, 또는 심지어 약 43 % 내지 약 100 %이다.
조성물은 CD8을 발현하는 MIL의 집단을 포함할 수 있다. CD8을 발현하는 MIL의 집단은 CXCR4를 발현하는 복수의 MIL을 포함할 수 있다.
CD8을 발현하는 MIL의 집단은 4-1BB를 발현하는 복수의 MIL을 포함할 수 있다. 예를 들어, 조성물 내 세포의 적어도 약 21 %는 4-1BB를 발현하는 복수의 MIL로부터의 MIL일 수 있고, 예컨대 조성물 내 세포의 적어도 약 8 %, 9 %, 10 %, 11 %, 12 %, 13 %, 14 %, 15 %, 16 %, 17 %, 18 %, 19 %, 20 %, 또는 심지어 적어도 약 21 %이다. 일부 실시태양에서, 조성물 내 세포의 약 2 % 내지 100 %는 4-1BB를 발현하는 복수의 MIL로부터의 MIL일 수 있고, 예컨대 조성물 내 세포의 약 8 % 내지 약 100 %, 약 9 % 내지 약 100 %, 약 10 % 내지 약 100 %, 약 11 % 내지 약 100 %, 약 12 % 내지 약 100 %, 약 13 % 내지 약 100 %, 약 14 % 내지 약 100 %, 약 15 % 내지 약 100 %, 약 16 % 내지 약 100 %, 약 17 % 내지 약 100 %, 약 18 % 내지 약 100 %, 약 19 % 내지 약 100 %, 약 20 % 내지 약 100 %, 또는 심지어 약 21 % 내지 약 100 %이다.
일부 실시태양에서, 조성물은 4-1BB를 발현하는 MIL의 집단을 포함한다. 예를 들어, 조성물 내 세포의 적어도 약 21 %는 4-1BB를 발현하는 MIL의 집단으로부터의 MIL일 수 있고, 예컨대, 조성물 내 세포의 적어도 약 22 %, 23 %, 24 %, 25 %, 26 %, 27 %, 28 %, 29 %, 30 %, 31 %, 32 %, 33 %, 34 %, 35 %, 36 %, 37 %, 38 %, 39 %, 40 %, 41 %, 42 %, 또는 적어도 약 43 %이다. 일부 실시태양에서, 조성물 내 세포의 약 21 % 내지 100 %는 4-1BB를 발현하는 MIL의 집단으로부터의 MIL일 수 있고, 예컨대 조성물 내 세포의 약 22 % 내지 약 100 %, 약 23 % 내지 약 100 %, 약 24 % 내지 약 100 %, 약 25 % 내지 약 100 %, 약 26 % 내지 약 100 %, 약 27 % 내지 약 100 %, 약 28 % 내지 약 100 %, 약 29 % 내지 약 100 %, 약 30 % 내지 약 100 %, 약 31 % 내지 약 100 %, 약 32 % 내지 약 100 %, 약 33 % 내지 약 100 %, 약 34 % 내지 약 100 %, 약 35 % 내지 약 100 %, 약 36 % 내지 약 100 %, 약 37 % 내지 약 100 %, 약 38 % 내지 약 100 %, 약 39 % 내지 약 100 %, 약 40 % 내지 약 100 %, 약 41 % 내지 약 100 %, 약 42 % 내지 약 100 %, 또는 심지어 약 43 % 내지 약 100 %이다. 일부 실시태양에서, 조성물은 예로써 유세포 분석법으로 검출된 4-1BB를 발현하지 않는 MIL의 집단 또는, 즉, 4-1BB를 발현하는 MIL의 집단으로부터의 MIL의 발현 수준에 대해 4-1BB의 낮은 수준을 발현하는 MIL의 집단 중 하나를 포함한다.
일부 실시태양에서, 조성물은 CD4를 발현하는 MIL을 포함한다.
일부 실시태양에서, 조성물은 CD8를 발현하는 MIL을 포함한다.
일부 실시태양에서, 조성물은 CD4를 발현하는 MIL을 포함한다. 일부 실시태양에서, 조성물은 CD8를 발현하는 MIL을 포함한다. 일부 실시태양에서, 조성물 내 존재하는 CD4+:CD8+ MIL의 비율은 약 2:1이다.
조성물은 CD8을 발현하는 MIL의 집단을 포함할 수 있다. CD8을 발현하는 MIL의 집단은 CXCR4를 발현하는 복수의 MIL을 포함할 수 있다.
일부 실시태양에서, 조성물은 CD4를 발현하는 MIL의 집단을 포함한다. CD4를 발현하는 MIL의 집단은 CXCR4를 발현하는 복수의 MIL을 포함할 수 있다.
MIL은 본원에서 기술된 상이한 요인 또는 표면 수용체를 단독으로 또는 서로의 조합으로 발현할 수 있다. 따라서, 예를 들어, MIL은 CD3+, CD4+, 및 CD8+일 수 있다. 이러한 세포는 IFNγ를 또한 발현할 수 있다. 세포는 본원에서 제공된 다양한 요인 또는 수용체에 대해 또한 양성 또는 음성일 수 있다.
일부 실시태양에서, 대상체에서 전립선 암을 예방하는 것 또는 치료하는 것에 대한 방법이 제공된다. 일부 실시태양에서, 상기 방법은 본원에서 기술된 조성물 중 하나, 예컨대, 본원에서 제공된 전립선-특이적 MIL를 대상체로 투여하는 것을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 일부 실시태양에서, 조성물은 본원에 제공된 것과 같이 투여된다. 일부 실시태양에서, 상기 방법은 본원에서 기술된 조성물 중 임의의 하나의 치료적 유효량을 대상체로 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시태양에서, 전립선 암 특이적 MIL의 치료적-유효량을 대상체로 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시태양에서, MIL은 활성화된다. 일부 실시태양에서, MIL은 본원에서 기술되고 본원에서 참조된 것과 같이 저산소 활성화된다. 일부 실시태양에서, MIL은 본원에서 기술되고 참조된 것과 같이 저산소 조건하에서 배양되고 이어서 정상 산소 조건 하에서 배양된다. 일부 실시태양에서, MIL은 전립선 암을 갖는 대상체로부터 얻어진 골수 샘플로부터 얻어지거나 추출된다. 일부 실시태양에서, MIL은 치료되고 있는 대상체에 동종이계다. 일부 실시태양에서, 상기 방법은 대상체로부터의 골수 샘플을 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체와 함께 약 1 % 내지 약 3 %의 산소의 저산소 환경에서 배양하여 활성화된 골수 침윤성 림프구를 생산하는 것; 및 (b) 활성화된 골수 침윤성 림프구를 정상 산소 환경에서 IL-2의 존재에서 배양하여 조성물을 생산하는 것을 포함한다. 상기 조성물은 이후 전립선 암 대상체에게 투여될 수 있다.
이어지는 실시예는 본원에서 기술된 조성물 및 방법의 예시이지만, 이로 제한하지 않는다. 통상의 기술자에게 알려진 다른 적합한 변경 및 개조는 이어지는 실시예의 범위 내에 있다.
실시예
실시예 1: 전립선 암 대상체로부터의 MIL 생산
골수 샘플을 다양한 양의 골수 침범(involvement)을 동반한 호르몬-반응성 및 거세-저항성 전립선 암 환자(n=10)로부터 수집하였다. 환자의 부분집합(n=4)에서, 일치된 말초 혈액을 골수 흡입 시에 또한 수집하였다.
MIL 및 말초 혈액 림프구(PBL) 모두를, 이전에 기술된 방법을 사용하여, 환자의 골수 및 혈액 샘플 각각으로부터 활성화시키고 증식시켰다(미국 특허 제9,687,510호 및 제10,172,887호를 참조, 이들 모두는 참조로 원용된다). MIL을 10명의 mPCa 환자로부터 분리된 골수로부터 315.1(범위: 29.1 내지 1625)의 평균적인 증식 배수로 성공적으로 증식시켰다. 각각의 환자의 골수 시료의 증식 배수(채취된 세포 #/시작한 세포 수)가 보여진다. 도 1을 참조.
실시예 2: T 세포 표현형 마커의 특성화
T 세포 표현형 마커인 CD3, CD4, 및 CD8을 유세포 분석법(FACS)으로 증식-이전 및 -이후에 특성화하였다. 각각의 T 세포 마커에 양성으로 염색된 세포의 백분율은 증식에 앞서(이전) 및 이어서(이후)의 10명의 전이성 전립선 암 환자 골수 시료의 각각에 대해 보여진다. 증식-이전, 골수 T 세포 조성물은 21.5 %(7.8 내지 38.0)의 CD3+, 14.1 %(7.5 내지 26.2)의 CD4+, 및 6.1% (2.3 내지 11.8)의 CD8+이었다. 활성화 및 증식 이후, MIL은 CD4+:CD8+ T 세포의 비율 ~2.5:1[각각, 66.4 %(37.2 내지 88.0) vs. 25.7 %(11.9 내지 56.3)]과 함께 평균 91.5 %(88.6 내지 95.1)의 CD3+이었다. 도 2를 참조.
실시예 3: 증식된 MIL 및 PBL 내 종양-특이적 T 세포의 정량
종양-특이적 T 세포를 이전에 기술된 기능 검사법을 사용하여 확장된 MIL 및 PBL에서 정량하였다(문헌[Noonan KA, Huff CA, Davis J, et al. Sci Transl Med. 2015;7(288):288ra78]). 간략하게, 실시예 1에서 기술된 것처럼 얻어진 MIL 및 PBL을 카복시플루오레신 디아세테이트 숙신이미딜 에스테르(CFSE; 인비트로젠(Invitrogen))로 표지하였고, 37 ℃에서 10 분 동안 인큐베이션하였고, 제조업체의 권장사항에 따라 세척하였다. 자가유래 항원-제시 세포(APC)를 전립선 암 세포주로부터의 용해물로 펄스처리하였고 CSFE-표지 MIL 또는 PBL과 함께 공동-배양하였다. 골수종 세포주 용해물로 펄스처리한 APC 또는 배지 단독을 음성 대조군으로 사용하였다. 5 일 후, 항-CD3 및 IFN-γ(이바이오사이언스(eBioscience))로 세포를 염색함으로써 및 유세포 분석법으로 그들을 분석함으로써 종양 특이성을 결정하였다. 데이터를 갈리오스(Gallios) 유세포 분석기(베크만 쿨터(Beckman Coulter))로 수집하였고, 칼루자(Kaluza) 소프트웨어(베크만 쿨터)로 분석하였다. 종양-특이적 T 세포는 IFNγ-생산 CFSE-저, CD3+ 집단으로 정의되었다. 도 3을 참조.
도 4는 단일 환자에 대한 대표적인 결과를 나타낸다. 세포 용해물 없이(배지 단독) 펄스처리된 자가유래 골수 APC로, 음성 대조군으로서 다발성 골수종 용해물로, 또는 시험된 전립선 암 세포주 용해물의 네 가지 상이한 조합 중 두 가지로의 자극 이후 IFNγ-생산 CFSE-lo CD3+, CD8+ 및 CD4+ T 세포의 백분율이 환자 8로부터 증식된 일치된 MIL 및 PBL에 대해 보여진다.
도 5는 증식된 MIL의 각각에 대한 종양 세포 용해물 조합의 각각에 대해 측정된 IFNγ-생산 CFSE-lo CD3+ T 세포의 백분율을 나타낸다. 전립선 종양-특이적 T 세포를 증식된 MIL의 모두에서 검출하였다(n=9). 평균적으로, 증식된 MIL 내 총 T 세포 레퍼토리의 11.1 %(1.25 내지 44)는 종양 특이적이었다.
도 6은 증식된 PBL의 각각에 대한 종양 세포 용해물 조합의 각각에 대해 측정된 IFNγ-생산 CFSE-lo CD3+ T 세포의 백분율을 나타낸다. 반면, 네 환자로부터 증식되고 활성화된 일치된 PBL은 측정가능한 종양-특이적 T 세포가 없는 것으로 입증되었다.
실시예 4: 전립선 암 환자로 MIL의 투여
MIL의 투여에 앞서, 환자는 사이클로포스파미드(300 mg/m2/일) 및 플루다라빈(30 mg/m2/일)으로 -5 일로부터 -3 일까지 비-골수제거 림프구고갈을 받게 된다. 림프구고갈은 입양 T 세포 치료법의 전체 효능을 증가시키는 것으로 보여진다. 2-머캅토에탄 설폰산 나트륨(MESNA)은 요구된 것처럼 방광 내 임의의 출혈을 최소화하는 것에 사용될 수 있다.
환자는 펨브롤리주맙(200mg)을 1 일 차(MILTM 투여 대략 24 시간 후) 및 매 3 주마다 또한 투여 받을 수 있다.
환자는 MILTM을 단독 투여받을 수 있다. 이들 대상체는 안전한 관찰을 위해 MILTM 투여 이후 7 일 동안 면밀히 이어질 것이다.
MILTM은 중심 카테터를 통해 투여될 수 있고, 이는 말초 삽입 중심 카테터(PICC) 라인 또는 중심 라인 중 하나가 될 수 있다. 활성화된 MILTM을 투여하기에 앞서, 대상체는 5%의 덱스트로오스 수액 및 50 %의 생리 식염수(D5W½NS)로 적어도 1 시간 동안 시간 당 대략 200 mL의 속도로 수분공급될 것이다. MILTM은 0 일 차(+1 일)에 투여되는 것에 앞서, 37 ℃(±2 ℃) 수조 내에서 백 당 대략 90초(±30 초) 동안 침대 옆에서 해동될 것이다. 각각의 백은, 한 번에 하나씩, 증기 상태 액체 질소 운반기로부터 제거될 것이고, 일부 작은 얼음 덩어리가 존재할 때까지 수조 내에 놓여지고 주물러 질 것이다. 각각의 MILTM의 백은 분 당 대략 10 mL의 속도로 주입될 것이고, 그 다음의 MILTM의 백을 투여하는 것에 앞서 식염수로 헹궈질 것이다.
MILTM 주입에 이어서, 환자는 D5W½NS로 시간 당 대략 200 mL의 속도로 2시간 동안 수분공급될 것이다. 해동의 날짜 및 시간, 투여의 시간, 및 주입 시간을 비롯한 투여 정보는 각각의 백에 기록될 것이나, 이에 제한되지 않는다. 전체 MILTM 생산물이 적어도 하루, 0 일차(+1 일)에 투여될 것이기 때문에, 용량 변경은 적용가능하지 않다.
환자에서 종양 부담은 알려진 검사법을 사용하여 전립선 특이적 항원(“PSA”)을 측정함에 의해 평가될 것이다.
MIL은 존재했고 시험된 모든 전립선 암 골수 샘플로부터 증식되었다. 모든 환자로부터의 MIL은 기능적으로 활동적인 종양-특이적 T 세포를 함유했다. 반면에, 대응되는 PBL은 어떠한 검출가능한 종양-특이적 면역 인식을 보이는 데 실패했다. 이처럼, MIL의 입양 T 세포 치료법은 전립선 암의 환자에 대해 놀랍고 실행가능한 새로운 치료적 접근이고, 이때까지 본원에서 제공된 실시태양은 입양 T 세포 치료법을 사용하여 달성가능한 것으로 기대되지 않았다. 전립선-특이적 MIL로부터의 결과는 놀랍고 예상외였다.
본 기술은 특정 절차, 조성물, 또는 기술된 방법에 제한되지 않는데, 이들은 변할 수 있기 때문이다. 본 기술에서 사용된 용어는 단지 특정 버전 또는 실시예를 기술하기 위한 목적을 위함이고, 본원에서 기술된 실시태양의 범위를 제한시키는 것으로 의도되지 않았다. 달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 통상의 기술자에 의해 흔히 이해되는 것과 같은 동일한 의미를 갖는다. 일부 경우에서, 흔히 이해되는 의미의 용어는 명확성 및/또는 즉시 참조를 위해 본원에서 정의되고, 이러한 본원에서의 정의의 수반은 기술분야에서 일반적으로 이해되는 것을 넘는 현저한 차이를 표현하는 것으로 반드시 해석되어서는 안 된다. 그러나, 충돌이 생기는 경우에, 정의를 비롯한 특허 명세서가 우선할 것이다.
앞선 내용으로부터, 본 개시의 다양한 실시태양은 도시의 목적으로 본원에 기술되었다는 것, 및 다양한 변경이 본 개시의 범위 및 사상으로부터 벗어남 없이 만들어질 수 있다는 것이 인정될 수 있다. 따라서, 본원에 개시된 다양한 실시태양은 제한적인 것으로 의도되지 않았다. 본원에 인용된 모든 참조는 그 전체가 본원에 참조로 원용된다.

Claims (36)

  1. (a) 전립선 암을 갖는 대상체로부터 얻어진 골수 샘플을 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체와 함께 저산소 환경에서 배양하여 저산소-활성화된 골수 침윤성 림프구를 생산하는 단계;
    (b) 저산소-활성화된 골수 침윤성 림프구를 정상 산소 환경에서 배양하여 치료적 활성화된 골수 침윤성 림프구를 생산하는 단계; 및
    (c) 치료적 활성화된 골수 침윤성 림프구를 전립선 암을 갖는 대상체에 투여하는 단계;
    를 포함하는, 전립선 암을 갖는 대상체를 골수 침윤성 림프구로 치료하는 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 저산소 환경은 약 0 % 내지 약 5 %의 산소 함량을 갖는 것인, 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 림프구는 IL-2의 존재 하에서 배양된 것인, 방법.
  4. 제1항에 있어서,
    정상 산소 환경에서 상기 저산소-활성화된 골수 침윤성 림프구를 배양하는 것은 IL-2의 존재 하에서 수행되는 것인, 방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 골수 샘플은 상기 저산소 환경에서 약 24 시간 동안 배양된 것인, 방법.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 골수 샘플은 상기 저산소 환경에서 약 2 일 동안 배양된 것인, 방법.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 골수 샘플은 상기 저산소 환경에서 약 3 일 동안 배양된 것인, 방법.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 골수 샘플은 상기 저산소 환경에서 약 2 내지 약 5 일 동안 배양된 것인 방법.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 저산소 환경은 약 1 % 내지 약 2 %의 산소인 것인, 방법.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 저산소-활성화된 골수 침윤성 림프구는 상기 정상 산소 환경에서 약 2 내지 약 12 일 동안 배양된 것인, 방법.
  11. 제1항에 있어서,
    상기 저산소-활성화된 골수 침윤성 림프구는 상기 정상 산소 환경에서 약 6 일 동안 배양된 것인, 방법.
  12. 제1항에 있어서,
    상기 저산소-활성화된 골수 침윤성 림프구는 상기 정상 산소 환경에서 약 9 일 동안 배양된 것인, 방법.
  13. 제1항에 있어서,
    (a) 단계에 앞서 암을 갖는 대상체로부터 골수 샘플을 제거하는 단계를 더 포함하는, 방법.
  14. 제1항에 있어서,
    상기 항-CD3 항체 및 상기 항-CD28 항체는 비드에 부착된 것인, 방법.
  15. 제1항에 있어서,
    상기 전립선 암은 선방 선암, 관 선암, 거세-저항성, 이행 세포 암, 편평 세포 암, 또는 소 세포 전립선 암의 하나 이상인 것인, 방법.
  16. (a) 전립선 암을 갖는 대상체로부터 얻어진 골수 샘플을 항-CD3/항-CD28 비드와 함께 약 1 % 내지 약 2 %의 산소의 저산소 환경에서 약 2 내지 약 5 일 동안 배양하여 저산소-활성화된 골수 침윤성 림프구를 생산하는 단계;
    (b) 저산소-활성화된 골수 침윤성 림프구를 약 21 %의 산소의 정상 산소 환경에서 약 2 내지 약 12 일 동안 IL-2의 존재 하에서 배양하여 치료적 활성화된 골수 침윤성 림프구를 생산하는 단계; 및
    (c) 치료적 활성화된 골수 침윤성 림프구를 전립선 암을 갖는 대상체에 투여하는 단계;
    를 포함하는, 전립선 암을 갖는 대상체를 치료적 활성화된 골수 침윤성 림프구로 치료하는 방법.
  17. 전립선 암 특이적 골수 침윤성 림프구를 포함하는 제약 조성물을 대상체에 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 전립선 암을 치료하는 방법.
  18. 제17항에 있어서,
    상기 전립선 암 특이적 골수 침윤성 림프구는 전립선 암을 갖는 대상체로부터 얻어진 것인, 방법.
  19. 제17항에 있어서,
    상기 전립선 암 특이적 골수 침윤성 림프구는 치료되고 있는 대상체에 자가유래인 것인, 방법.
  20. 제17항에 있어서,
    상기 전립선 암 특이적 골수 침윤성 림프구는 치료되고 있는 대상체에 동종이계인 것인, 방법.
  21. 제17항에 있어서,
    상기 골수 침윤성 림프구는 저산소 활성화된 것인, 방법.
  22. 제17항에 있어서,
    상기 골수 침윤성 림프구는 저산소 활성화된 것 및 정상 산소 활성화된 것인, 방법.
  23. 제17항에 있어서,
    상기 제약 조성물이 비경구 투여, 복강내 또는 근육내 투여에 의해 투여되는 것인, 방법.
  24. 제17항에 있어서,
    상기 제약 조성물이 대상체의 전립선 내로 직접 투여되는 것인, 방법.
  25. 제1항에 있어서,
    대상체로 투여된 골수 침윤성 림프구의 약 75 % 내지 약 100 %가 CD3를 발현하는 것인, 방법.
  26. 제1항에 있어서,
    대상체로 투여된 골수 침윤성 림프구의 약 80 % 내지 약 100 %가 CD3를 발현하는 것인, 방법.
  27. 제1항에 있어서,
    대상체로 투여된 골수 침윤성 림프구의 약 85 % 내지 약 100 %가 CD3를 발현하는 것인, 방법.
  28. 제1항에 있어서,
    대상체로 투여된 골수 침윤성 림프구의 약 90 % 내지 약 100 %가 CD3를 발현하는 것인, 방법.
  29. 제1항에 있어서,
    조성물 또는 대상체로 투여된 MIL 내 존재하는 CD4+:CD8+ T 세포의 비율은 약 2:1인 것인, 방법.
  30. 전립선 암이 있는 환자로부터 분리된 저산소-활성화된 골수 침윤성 림프구의 집단을 포함하고, 여기서 저산소 활성화된 골수 침윤성 림프구의 집단의 약 75 % 내지 약 100 %가 CD3를 발현하는 것인, 조성물.
  31. 제30항에 있어서,
    저산소 활성화된 골수 침윤성 림프구의 집단의 약 80 % 내지 약 100 %가 CD3를 발현하는 것인, 조성물
  32. 제30항에 있어서,
    저산소 활성화된 골수 침윤성 림프구의 집단의 약 85 % 내지 약 100 %가 CD3를 발현하는 것인, 조성물.
  33. 제30항에 있어서,
    저산소 활성화된 골수 침윤성 림프구의 집단의 약 90 % 내지 약 100 %가 CD3를 발현하는 것인, 조성물.
  34. 제30항에 있어서,
    조성물 내 존재하는 CD4+:CD8+ T 세포의 비율이 약 2:1인 것인, 조성물.
  35. 제30항에 있어서,
    세포 집단은
    (a) 골수 샘플을 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체와 함께 약 1 % 내지 약 3 %의 산소의 저산소 환경에서 배양하여 활성화된 골수 침윤성 림프구를 생산하는 단계; 및
    (b) 활성화된 골수 침윤성 림프구를 정상 산소 환경에서 IL-2의 존재에서 배양하여 조성물을 생산하는 단계;
    에 의해 전립선 암을 갖는 대상체로부터 얻어진 골수 샘플로부터 얻어질 수 있는 것인, 조성물.
  36. 제30항에 있어서,
    MIL은 전립선 암 특이적인 것인, 조성물.
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