KR20210098485A - 키메라 항원 수용체(car)를 발현하는 골수 침윤성 림프구(mil), 이를 제조하는 방법 및 치료에 사용하는 방법 - Google Patents

키메라 항원 수용체(car)를 발현하는 골수 침윤성 림프구(mil), 이를 제조하는 방법 및 치료에 사용하는 방법 Download PDF

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KR20210098485A
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킴벌리 에이. 누난
이반 보렐로
에릭 알. 루츠
라크쉬미 루드라라주
스리칸타 자나
이도 위스
발렌티나 호요스
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윈드밀 테라퓨틱스, 인크.
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Abstract

키메라 항원 수용체("CAR")를 포함하는 골수 침윤성 림프구("MIL")가 제공된다. 일부 양태에서, 실시양태는, MIL을 포함하는 골수를 수득하는 것; 및 키메라 항원 수용체를 인코딩하는 핵산으로 MIL을 형질감염, 형질변환 또는 형질도입하여 CAR-MIL을 생성하는 것을 포함하는, 재조합 MIL을 제조하는 방법에 관한 것이다. 일부 양태에서, 실시양태는 CAR을 포함하는 MIL을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 병태를 치료하는 방법에 관한 것이다.

Description

키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하는 골수 침윤성 림프구(MIL), 이를 제조하는 방법 및 치료에 사용하는 방법
본 발명은 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하는 골수 침윤성 림프구(MIL), 이를 제조하는 방법 및 치료에 사용하는 방법에 관한 것이다.
악성종양을 가진 환자의 대부분은 그들의 질환으로 사망할 것이다. 이들 환자를 치료하는 하나의 접근법은, MIL을 유전적으로 변형하여 키메라 항원 수용체("CAR")의 발현을 통해 종양 세포에서 발현되는 항원을 표적으로 하는 것이다. CAR은 인간 백혈구 항원에 독립적인 방식으로 세포 표면 항원을 인식하도록 디자인된 항원 수용체이다. CD19-표적 접근법을 이용한 성공 외에, 다른 악성종양을 치료하기 위해 CAR을 발현하는 유전적으로 변형된 세포를 사용하려는 시도는 제한적인 성공을 거두었다.
일부 실시양태에서, 키메라 항원 수용체("CAR")를 갖는 골수 침윤성 림프구("MIL" 또는 "MIL™")가 "CAR-MIL" 또는 "CAR-MIL™"으로 본원의 개시 전반에 제공된다. 일부 실시양태에서, CAR는 리간드를 결합할 수 있는 세포외 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, CAR은 세포내 신호전달 연쇄반응을 (예를 들어, MIL에서) 개시할 수 있는 세포내 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, CAR을 포함하는 MIL을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 병태를 치료하는 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 방법은 MIL의 집단을 포함하는 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하고, 이때, MIL의 집단 중 각각의 MIL은 CAR을 포함한다.
일부 실시양태에서, MIL을 포함하는 골수를 수득하는 것; 및 키메라 항원 수용체를 인코딩하는 핵산으로 MIL을 형질감염, 형질변환 또는 형질도입하는 것을 포함하는 재조합 MIL을 제조하는 방법이 제공된다. 골수는 대상체, 예컨대 신생물을 가진 대상체로부터 수득될 수 있다. 대상체는 인간 또는 마우스일 수 있다.
도 1은 GFP 및 CAR 표면 발현 사이의 상관관계를 보여준다.
도 2는 MIL이 효과적으로 형질도입되어 CAR, 구체적으로 CD38, BCMA 및 PSMA CAR을 발현할 수 있음을 보여준다.
도 3은 CAR-MIL이 비-형질도입된 MIL에 비해 유사 기억 표현형을 갖는 것을 보여준다.
도 4는 CD38 CAR-MIL 및 PBL에 대한 종양-특이성 게이팅 전략(gating strategy)을 보여준다.
도 5는 CD38 CAR-MIL이 그들의 내재적 종양-특이성 및 기능성을 보유함을 보여준다.
도 6은 CD38 CAR-MIL이 CD38-발현 8226 종양 세포로 자극되고 공동-배양된 후에 그들의 내재적 종양-특이성 및 기능성을 보유함을 보여준다.
도 7은 BCMA 및 PSMA CAR-MIL 및 PBL에 대한 종양-특이성 게이팅 전략을 보여준다.
도 8은 BCMA CAR-MIL이 그들의 내재적 종양-특이성 및 기능성을 보유함을 보여준다.
도 9는 PSMA CAR-MIL이 PSMA-발현 LNCAP 종양 세포로 자극되고 공동-배양된 후에 그들의 내재적 종양-특이성 및 기능성을 보유함을 보여준다.
도 10은 CD38 CAR(CAR38)-매개된 항원-특이적 사멸을 측정하기 위한 FACS-기반 시험관내(in vitro) 공동-배양 검정을 보여준다.
도 11은 CD38 CAR-MIL이 1차 48시간 공동-배양 사멸 검정에서 CAR-PBL을 능가한다는 것을 보여준다.
도 12는 CD38 CAR-MIL이 1차 48시간 사멸 검정에서 낮은 E:T 비율로 CAR-PBL에 비해 시험관내에서 더 우수한 사멸을 갖는 것을 보여준다.
도 13은 CD38 CAR-MIL이 1차 및 2차 재-시도 사멸 검정에서 CAR-PBL을 능가한다는 것을 보여준다.
도 14는 CAR38 CAR-MIL이 2차 재-시도 사멸 검정에서 낮은 E:T 비율로 CAR-PBL에 비해 더 우수한 시험관내 사멸을 갖는 것을 보여준다.
도 15는 CD38 CAR-MIL이 (48시간 마다) 반복된 시도에 걸쳐서 CAR-PBL에 비해 더 우수한 사멸을 갖는 것을 보여준다.
도 16은 CD38 CAR-MIL이 (1차 시도 7일 후에) 지연된 2차 재-시도 사멸 검정에서 CAR-PBL에 비해 더 우수한 사멸을 갖는 것을 보여준다.
도 17은 BCMA CAR 항원-특이적 사멸을 실시간으로 측정하기 위한 ACEA 시험관내 공동-배양 검정을 보여준다.
도 18은 BCMA CAR-MIL이 ACEA 실시간 사멸 검정에서 낮은 E:T 비율로 CAR-PBL에 비해 더 우수한 시험관내 사멸을 갖는 것을 보여준다.
도 19는 BCMA CAR-MIL이 ACEA 사멸 검정에서 낮은 E:T 비율로 CAR-PBL에 비해 더 우수한 시험관내 사멸을 갖는 것을 보여준다.
도 20은 BCMA CAR-매개된 항원-특이적 사멸을 검출하기 위한 FACS-기반 시험관내 공동-배양 검정을 보여준다.
도 21 BCMA CAR-MIL이 반복된 시도 후에 CAR-PBL에 비해 더 우수한 사멸을 갖는 것을 보여준다.
도 22는 4 가지 인간 전립선암 세포주 및 SW780 방광암 세포주를 스테이닝(staining)한 PSMA를 보여준다.
도 23은 실시간으로 PSMA CAR 항원-특이적 사멸을 측정하기 위한 ACEA 시험관내 공동-배양 검정을 보여준다.
도 24는 1차 시도가 CAR-PBL에 유리한 경우에서 조차 PSMA CAR-MIL이 2차 시도에서 CAR-PBL을 능가한 것을 보여준다.
도 25는 세포내 사이토카인-스테이닝에 의한 CAR 항원 자극-특이적 사이토카인 생성을 측정하는 것을 보여준다.
도 26은 BCMA CAR-MIL이 CAR-PBL에 비해 증가된 IFNγ 및 TNFα 사이토카인 생성을 갖는 것을 보여준다.
도 27은 CD38 CAR-MIL이 CAR-PBL에 비해 증가된 IFNγ 및 TNFα 사이토카인 생성을 갖는 것을 보여준다.
도 28은 단세포 수준에서 BCMA 항원-자극 후 32개의 사이토카인의 생성을 측정하기 위한 과정을 보여준다.
도 29는 BCMA 항원-자극이 CAR-MIL 및 CAR-PBL 모두에서 다기능성 사이토카인-분비 CD4 및 CD8 CART 세포를 유도함을 보여준다.
도 30은 증가된 이펙터(effector), 자극 및 화학유인성(chemoattractive) 사이토카인으로 인해, BCMA 항원-자극 후에 다기능성이 증가된 것을 보여준다.
도 31은 그랜자임 B, IFNγ, IL-8, MIP-1a, 및 MIP-1b가 BCMA 자극 후에 CAR-MIL 및 CAR-PBL에 의해 생성된 지배적 사이토카인임을 보여준다.
도 32는 CAR-MIL이 BCMA-자극 후 CAR-PBL보다 PSI의 더 강력한 상향조절을 갖고, 더 많은 이펙터 및 화학유인성 사이토카인을 생성하는 것을 보여준다.
도 33은 CAR-MIL이 CAR-PBL에 비해 BCMA-자극 후 다기능성 세포 서브세트의 더 높은 증가를 나타냄을 보여준다.
도 34는 항원-자극 후에 CAR-PBL이 CD27 발현을 손실하는 반면 CAR-MIL은 CD27을 유지하는 것을 보여준다.
도 35는 항원-자극 후에 CAR-MIL이 CAR-PBL에 비해 더 적은 PD1 및 TIM-3을 발현하는 것을 보여준다.
도 36은 분석을 위해 선택된 보다 유사한 기준선(baseline) U266 종양 부담을 갖는 46마리의 마우스 대 모두 67마리의 치료된 마우스에 대한 기준선 전구-T 세포 주입 혈청 인간 IgE 수준을 보여준다.
도 37은 46마리의 마우스 각각에 대한 혈청 인간 IgE 동역학(생체내(in vivo) 종양부담 U266의 마커)를 보여준다.
도 38은 BCMA CAR-MIL이 매치된 CAR-PBL보다 생체내에서 더 강함을 보여준다.
도 39는 유세포 분석(flow cytometry, FACS)에 의해 대조군 및 치료된 마우스 유래의 골수에서 인간 CD3+ T 세포 및 CD138+ U266 종양 세포의 수준의 측정을 보여준다.
도 40은 유세포 분석(FACS)에 의해 대조군 및 치료된 마우스 유래의 비장에서 인간 CD3+ T 세포 및 CD138+ 종양 세포의 수준의 측정을 보여준다.
도 41은 PBL에 비해 MIL로 치료된 마우스의 골수에서 더 높은 백분율의 인간 CD3 T 세포 및 더 낮은 백분율의 U266 종양 세포가 검출된 것을 보여준다.
도 42는 PBL에 비해 MIL로 치료된 마우스의 비장에서 더 높은 백분율의 인간 CD3 T 세포 및 더 낮은 백분율의 U266 종양 세포가 검출된 것을 보여준다.
본원은 비제한적으로 혈액 악성종양 및 고형 종양을 포함하는 기타 질환들 중에서도 암을 치료하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 암은 만성 림프구성 백혈병("CLL")과 같은 혈액상(hematological) 악성종양일 수 있다. 본원에서 기재되고 제공되는 조성물 및 방법을 이용하여 치료할 수 있는 다른 질환은 바이러스, 박테리아 및 기생충 감염뿐만 아니라 자가면역질환을 포함한다.
양태는 비제한적으로, 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하도록 형질도입된 골수 침윤성 림프구(MIL)의 입양 세포 이식(adoptive cell transfer) 전략에 관한 것이다. CAR은 원하는 항원(예를 들어, 종양 항원)에 대한 항체-기반 특이성을 MIL 수용체-활성 세포내 도메인과 조합하여 특정 항-종양 세포 면역 활성을 나타내는 키메라 단백질을 생성하는 분자이다.
일부 실시양태에서, CAR-MIL이 항종양 특성을 나타내는 CAR을 발현하도록 조작된 세포(즉, MIL)가 제공된다. CAR을 발현하는 MIL은 본원에서 CAR-MIL 또는 CAR-변형된 MIL로 지칭된다. 일부 실시양태에서, 세포는 이의 표면 상에 항체 결합 도메인을 안정적으로 발현하도록 유전적으로 변형되어, MHC 독립적인 신규 항원 특이성을 부여할 수 있다. 일부 실시양태에서, MIL은 유전적으로 변형되어, 특정 항체의 항원 인식 도메인을 FcγRI 단백질 또는 CD3ζ 사슬의 세포내 도메인과 함께 단일 키메라 단백질로 조합하는 CAR을 안정적으로 발현한다. 예를 들어, CAR은 MIL 항원 수용체 복합체 ζ 사슬(예를 들어, CD3ζ)의 세포내 신호전달 도메인에 융합된 항원-결합 도메인을 갖는 세포외 도메인을 포함하도록 조작될 수 있다. 예를 들어, CAR은 MIL에서 발현될 때, 항원-결합 특이성에 기반하는 항원 인식을 전용(redirecting)할 수 있다. 일부 실시양태에서, 이러한 항원이 악성 B 세포에서 발현되기 때문에 항원은 CD19이다. 일부 실시양태에서, 항원은 CD38, 전립선 특이적 막 항원("PSMA") 또는 B-세포 성숙 항원("BCMA")이다. 다만, 실시양태는 이들 도메인을 표적으로 하는 것으로 한정되지 않는다. 오히려, 실시양태는 동족 항원에 결합될 때 종양 세포에 영향을 주어 종양 세포가 성장에 실패하거나, 죽도록 촉진되거나, 그렇지 않으면 영향을 받아 환자에서 종양 부담이 감소되거나 제거되는, 임의의 항원-결합 모이어티를 포함한다. 항원-결합 모이어티는 하나 이상의 공동자극(costimulatory) 분자 및 ζ 사슬로부터의 세포내 도메인과 융합될 수 있다. 일부 실시양태에서, 항원-결합 모이어티는 CD137(4-1BB) 신호전달 도메인, CD28 신호전달 도메인, CD3ζ 신호 도메인 및 이들의 임의 조합의 군으로부터 선택되는 하나 이상의 세포내 도메인과 융합된다. 항원-결합 모이어티는 또한 CD134(OX40)와 같은 세포내 도메인과 융합될 수 있다. 일부 실시양태에서, CAR은 CD137(4-1BB) 신호전달 도메인을 포함한다. 특정 이론에 얽매이지 않고, 이는, 실시양태가 CAR-매개된 T-세포 반응이 공동자극 도메인의 추가로 보다 향상될 수 있다는 발견에 부분적으로 기초하기 때문이다.
일부 실시양태에서, CAR은 항원 인식 도메인, 막횡단 도메인 및 세포질 도메인을 갖는 세포외 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, CAR 내 도메인 중 하나와 자연적으로 연합되는 막횡단 도메인이 사용된다. 일부 실시양태에서, 막횡단 도메인은, 동일하거나 상이한 표면 막 단백질의 막횡단 도메인에 대한 상기 도메인의 결합을 피하기 위해 아미노산 치환에 의해 변형되거나 선택되어, 수용체 복합체의 다른 구성원과의 상호작용을 최소화할 수 있다. 예를 들어, 막횡단 도메인은 CD8α 힌지 도메인(hinge domain)일 수 있다.
일부 실시양태에서, CAR은 CD19에 결합하는 세포외 리간드 결합 도메인; 막횡단 도메인; 4-1BB 공동자극 신호전달 도메인; 및 세포내 CD3ζ 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, CAR은 PSMA에 결합하는 세포외 리간드 결합 도메인; 막횡단 도메인; 4-1BB 공동자극 신호전달 도메인; 및 세포내 CD3ζ 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, CAR은 BCMA에 결합하는 세포외 리간드 결합 도메인; 막횡단 도메인; 4-1BB 공동자극 신호전달 도메인; 및 세포내 CD3ζ 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, CAR은 CD38을 결합하는 세포외 리간드 결합 도메인; 막횡단 도메인; 4-1BB 공동자극 신호전달 도메인; 및 세포내 CD3ζ 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 막횡단 도메인은 CD3ζ, CD4, CD8 또는 CD28의 막횡단 도메인이다.
세포질 도메인과 관련하여, CAR은, 예를 들어, CD28 및/또는 4-1BB 신호전달 도메인을 그 자체로 포함하도록 디자인될 수 있거나, CAR의 상황(context)에 유용한 임의의 다른 원하는 세포질 도메인(들)과 조합될 수 있다. 일부 실시양태에서, CAR의 세포질 도메인은 CD3ζ의 신호전달 도메인을 추가로 포함하도록 디자인될 수 있다. 예를 들어, CAR의 세포질 도메인은 비제한적으로, CD3ζ, 4-1BB 및 CD28 신호전달 모듈 및 이들의 조합을 포함할 수 있다. 따라서, 실시양태는 CAR-MIL 및 입양 요법(adoptive therapy)을 위한 이의 사용 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, CAR-MIL은 원하는 CAR(예를 들어, 항-CD19, 막횡단 도메인 및 인간 4-1BB를 포함하는 CAR)을 포함하는 렌티바이러스 벡터(lentiviral vector)를 세포에 도입함으로써 생성될 수 있다. CAR-MIL은, 예를 들어, 생체내에서 복제될 수 있는 바, 지속적인 종양 제어로 이어질 수 있는 장기 지속성을 초래한다.
일부 실시양태에서, CAR-MIL의 주입을 이용하여 신생물을 갖는 환자의 치료를 위해 CAR을 발현하는 유전적으로 변형된 MIL을 투여하는 것이 제공된다. 일부 실시양태에서, 자가 주입이 치료에 사용된다. 자가 MIL은 치료가 필요한 환자로부터 수집되고, 본원에 기재되고 당업계에 알려진 방법을 사용하여 활성화되고 증식된 후, 환자에게 다시 주입된다.
일부 실시양태에서, CD3ζ 및 4-1BB 공동자극 도메인 둘 다 포함하는, 항-CD19, 항-CD38, 항-PSMA 또는 항-BCMA CAR을 발현하는 MIL이 사용된다. 일부 예에서, 환자에게 주입된 CAR MIL은 환자 생체내에서 백혈병 세포를 제거할 수 있다. 다만, 실시양태는 CD19, CD38, BSMA 또는 PSMA를 표적으로 하는 MIL 또는 CD3ζ 및/또는 4-1BB 매개 경로를 통한 신호로 한정되지 않는다. 예를 들어, 실시양태는 하나 이상의 세포내 도메인, 예컨대 CD137(4-1BB) 신호전달 도메인, CD28 신호전달 도메인, CD3ζ 신호 도메인 및 이들의 임의의 조합과 융합된 임의의 항원-결합 모이어티를 포함한다.
정의
관사 "a"및 "an"은 관사의 문법적 대상 중 하나 또는 하나 초과(즉, 적어도 하나)를 지칭하기 위해 본원에 사용된다. 예를 들어, "요소"는 하나의 요소 또는 하나 초과의 요소를 의미한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "포함하다", "들을 갖다", "갖다" 및 "포함하다" 및 이들의 동사활용은, 본원에 사용된 바와 같이, "포함하지만 이들로 한정되는 것은 아님"을 의미한다. 다양한 조성물 및 방법이, 다양한 성분 또는 단계를 "포함하는("포함하지만 이것으로 한정되는 것은 아님"을 의미하는 것으로 해석됨)" 측면에서 기재되지만, 조성물, 방법 및 디바이스는 또한 다양한 성분 및 단계로 "필수적으로 구성"되고/되거나 "구성"될 수 있고, 상기 전문용어는 필수적으로 폐쇄된-구성원 그룹을 정의하는 것으로 해석되어야 한다.
본원에 사용된 바와 같은, "활성화"는 검출 가능한 세포 증식을 유도하기에 충분히 자극된 MIL의 상태를 지칭한다. 활성화는 또한 유도된 사이토카인 생성 및 검출가능한 이펙터 기능과 관련될 수 있다. 용어 "활성화된 MIL"은 특히 세포 분열이 일어나고 있는 MIL을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "항체"는 항원과 특이적으로 결합하는 면역글로불린 분자를 지칭한다. 항체는 천연 소스 또는 재조합 소스로부터 유래된 온전한 면역글로불린일 수 있고 온전한 면역글로불린의 면역반응성 일부분일 수 있다. 항체는 예를 들어, 다클론성 항체, 단클론성 항체, Fv, Fab 및 F(ab)2뿐만 아니라 단일쇄 항체 및 인간화 항체를 포함하는 다양한 형태로 존재할 수 있다.
용어 "항체 단편"은 온전한 항체의 일부를 지칭하고 온전한 항체의 항원 결정 가변성 영역을 지칭한다. 항체 단편의 예는 비제한적으로, Fab, Fab', F(ab')2 및 Fv 단편, 선형 항체, scFv 항체 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "항원"은 면역 반응을 유발하는 분자로 정의된다. 이러한 면역 반응은 항체 생산 또는 특정 면역 세포(immunologically-competent cell)의 활성화, 또는 둘 다 수반할 수 있다. 당업자는 사실상 모든 단백질 또는 펩티드를 포함한, 임의의 거대분자가 항원으로 작용할 수 있음을 이해할 것이다. 더욱이, 항원은 재조합 또는 게놈 DNA로부터 유래될 수 있다. 당업자는, 임의의 DNA가 면역 반응을 이끌어 내는 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열 또는 부분적 뉴클레오티드 서열을 포함함에 따라 본원에서 사용되는 용어 "항원"을 인코딩한다는 것을 이해할 것이다. 또한, 당업자는 항원이 유전자의 전장 뉴클레오티드 서열에 의해서만 인코딩될 필요가 없음을 이해할 것이다. 실시양태가 비제한적으로, 하나 초과의 유전자의 부분적 뉴클레오티드 서열의 용도를 포함하고, 이러한 뉴클레오티드 서열이 원하는 면역 반응을 이끌어 내도록 다양한 조합으로 배열된다는 것은 쉽게 드러난다. 더욱이, 당업자는 항원이 "유전자"에 의해 인코딩될 필요가 전혀 없음을 이해할 것이다. 항원이 합성으로 생성될 수 있거나 생물학적 샘플로부터 유래될 수 있다는 것은 쉽게 드러난다. 상기 생물학적 샘플은 비제한적으로, 조직 샘플, 종양 샘플, 세포 또는 생물학적 유체를 포함할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "항-종양 효과"는 종양 부피 감소, 종양 세포 수 감소, 전이 수 감소, 기대 수명 증가 또는 암의 병태와 관련된 다양한 생리학적 증상의 개선에 의해 나타날 수 있는 생물학적 효과를 지칭한다. 또한, "항-종양 효과"는, 우선 종양의 발생을 예방하는 펩티드, 폴리뉴클레오티드, 세포 및 항체의 능력에 의해 나타날 수 있다.
용어 "자가-항원(auto-antigen)"은 면역계에 의해 이물질인 것으로 잘못 인식되는 임의의 셀프-항원(self-antigen)을 의미한다. 자가-항원은 비제한적으로, 세포 표면 수용체를 포함하는, 세포 단백질, 인단백질, 세포 표면 단백질, 세포 지질, 핵산, 당단백질을 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "자가면역질환"은 자가면역 반응으로 야기되는 장애로 정의된다. 자가면역질환은 자가-항원에 대한 부적절하고 과도한 반응의 결과이다. 자가면역질환의 예는 비제한적으로, 애디슨 병(Addision's disease), 원형 탈모증, 강직성 척추염, 자가면역성 간염, 자가면역성 이하선염(autoimmune parotitis), 크론병, 당뇨병(1 형), 수포성 표피박리증(dystrophic epidermolysis bullosa), 부고환염, 사구체 신염, 그레이브스병(Graves' disease), 길랑-바레 증후군(Guillain-Barr syndrome), 하시모토 병, 용혈성 빈혈, 전신홍반성 루푸스(systemic lupus erythematosus), 다발성 경화증, 중증 근무력증, 심상성 천포창(pemphigus vulgaris), 건선, 류마티스성 열, 류마티스 관절염, 사르코이드증(sarcoidosis), 피부경화증, 쇼그렌 증후군(Sjogren's syndrome), 척추관절병증(spondyloarthropathies), 갑상선염, 혈관염, 백반증, 점액수종, 악성 빈혈, 궤양성 대장염을 특히 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "자가유래(autologous)"는, 동일한 개체로부터 유래되어, 추후에 상기 개체에게 재-도입될 임의의 물질을 지칭하도록 의도된다.
"동종유래(Allogeneic)"는 동일 종의 다른 동물로부터 유래된 이식편(graft)을 지칭한다.
"이종발생(Xenogeneic)"은 다른 종의 동물로부터 유래된 이식편을 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "암"은 비정상 세포(aberrant cell)의 신속하면서 억제불가인 성장을 특징으로 하는 질환으로 정의된다. 암세포는 국소적으로 또는 혈류와 림프계를 통해 신체의 다른 부분으로 전파될 수 있다. 다양한 암의 예는 비제한적으로, 유방암, 전립선암, 난소암, 자궁경부암, 피부암, 췌장암, 대장암, 신장암, 간암, 뇌암, 림프종, 백혈병, 폐암 등을 포함한다. 치료될 수 있는 암은 혈관생성(vascularizing)되지 않거나 실질적으로 아직 혈관생성되지 않은 종양뿐만 아니라 혈관생성된 종양을 포함한다. 암은 비-고형 종양(예컨대, 혈액상 종양, 예를 들어, 골수종, 백혈병 및 림프종)을 포함할 수 있거나 고형 종양을 포함할 수 있다. 본원에 기재된 바와 같은 CAR로 치료될 암의 종류는, 비제한적으로, 암종, 모세포종 및 육종 및 특정 백혈병 또는 악성 림프종, 양성 및 악성인 종양 및 악성종양(malignancy), 예를 들어, 육종, 암종 및 흑색종을 포함한다. 또한 성인 종양/암 및 소아 종양/암이 포함된다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어인 "공동-자극 리간드"는, MIL에 동족 공동-자극 분자를 특이적으로 결합하여, 예를 들어, 펩티드가 로딩된 MHC 분자를 갖는 TCR/CD3 복합체의 결합에 의해 제공되는 1차 신호 이외에, 비제한적으로, 증식, 활성화, 분화 등을 포함하는, MIL 반응을 매개하는 신호를 제공하는, 항원 제시 세포(예를 들어, aAPC, 수지상 세포, B 세포 등) 상의 분자를 포함한다. 공동-자극 리간드는, 비제한적으로, CD7, B7-1(CD80), B7-2(CD86), PD-L1, PD-L2, 4-1BBL, OX40L, 유도성 공동자극 리간드(ICOS-L), 세포내 접착 분자(ICAM), CD30L, CD40, CD70, CD83, HLA-G, MICA, MICB, HVEM, 림프독소 베타 수용체, 3/TR6, ILT3, ILT4, HVEM, B7-H3와 특이적으로 결합하는 리간드 및 톨(Toll) 리간드 수용체를 결합시키는 항체 또는 아고니스트(agonist)를 포함할 수 있다. 또한, 공동-자극 리간드는 비제한적으로, CD27, CD28, 4-1BB, OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, 림프구 기능-관련 항원-1(LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3 및 CD83과 특이적으로 결합하는 리간드와 같은, MIL에 존재하는 공동-자극 분자와 특이적으로 결합하는 항체를 특히 포함한다.
"공동-자극 분자"는 공동-자극 리간드와 특이적으로 결합하여, MIL에 의한 공동-자극 반응, 예컨대 비제한적으로, 증식을 매개하는 MIL 상의 동족 결합 파트너를 지칭한다. 공동-자극 분자는 비제한적으로, MHC 클래스 I 분자, BTLA 및 톨 리간드 수용체를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, "공동-자극 신호"는 TCR/CD3 결찰(ligation)과 같은 1차 신호와 조합하여 MIL 증식 및/또는 주요 분자의 상향조절 또는 하향조절로 유도하는 신호를 지칭한다.
"질환"은 대상체가 항상성을 유지할 수 없는, 대상체의 건강 상태로서, 질환이 개선되지 않는다면 동물의 건강은 계속 악화된다. 대조적으로, 대상체에서 "장애"란 대상체가 항상성을 유지할 수 있지만, 대상체의 건강 상태가 장애가 없었을 때보다 덜 유리한 건강 상태이다. 치료하지 않고 방치할 때, 장애가 반드시 대상체의 건강 상태를 추가적으로 저하시키는 것은 아니다.
본원에 사용된 바와 같은 "유효량"은 치료 또는 예방적 이점을 제공하는 양을 의미한다.
"인코딩"은, 정의된 뉴클레오티드 서열(즉, rRNA, tRNA 및 mRNA) 또는 정의된 아미노산 서열을 갖는 생물학적 프로세스 및 이로부터 생성되는 생물학적 특성에서 다른 폴리머 및 거대분자의 합성을 위한 템플릿으로 작용하기 위해, 유전자, cDNA 또는 mRNA와 같은, 폴리뉴클레오티드에서 특정 뉴클레오티드 서열의 내재적 특성을 지칭한다. 따라서, 유전자는 그 유전자에 대응하는 mRNA의 전사 및 번역이 세포 또는 다른 생물학적 시스템에서 단백질을 생성하면 단백질을 인코딩한다. mRNA 서열과 동일하고 일반적으로 서열 목록에 제공되는 뉴클레오티드 서열인 코딩 가닥 및 유전자 또는 cDNA의 전사를 위한 템플릿으로 사용되는 비-코딩 가닥 모두는, 그 유전자 또는 cDNA의 단백질 또는 다른 생성물을 인코딩하는 것으로 지칭될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 "내인성(endogenous)"은 유기체, 세포, 조직 또는 시스템으로부터의 임의의 물질 또는 이들의 내부에서 생성된 임의의 물질을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같은 "외인성(exogenous)"은 유기체, 세포, 조직 또는 시스템으로부터 도입되거나 이들의 외부에서 생성된 임의의 물질을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "발현"은 촉진자(promoter)에 의해 구동되는 특정 뉴클레오티드 서열의 전사 및/또는 번역으로 정의된다.
"발현 벡터"는 발현될 뉴클레오티드 서열에 기능 가능하게 연결된 발현 제어 서열을 포함하는 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 지칭한다. 발현 벡터는 발현을 위한 충분한 cis-작용 요소를 포함하고; 발현을 위한 다른 요소는 숙주 세포 또는 시험관내 발현 시스템에 의해 공급 받을 수 있다. 발현 벡터는 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하는 코스미드, 플라스미드(예를 들어, 리포솜에서 드러나거나 함유됨) 및 바이러스(예를 들어, 렌티바이러스, 레트로바이러스, 아데노바이러스 및 아데노-관련 바이러스)와 같은 당업계에 알려진 모든 것들을 포함한다.
"상동성(Homologous)"은 2개의 폴리펩티드 사이 또는 2개의 핵산 분자 사이의 서열 유사성 또는 서열 동일성을 지칭한다. 2개의 비교된 서열 모두의 위치가 동일한 염기 또는 아미노산 단량체 서브유닛에 의해 점유될 경우, 예로서, 2개의 DNA 분자 각각의 위치가 아데닌에 의해 점유되면, 분자는 그 위치에서 상동성이다. 두 서열 사이의 상동 %는 두 서열에 의해 공유된 일치 또는 상동성인 위치의 개수 나누기 비교 위치의 개수 x 100의 함수이다. 예를 들어, 두 서열의 10개 위치 중 6개가 일치하거나 상동성이면 두 서열은 60% 상동성이다. 예를 들어, DNA 서열 ATTGCC 및 TATGGC는 50% 상동을 공유한다. 일반적으로, 최대 상동을 제공하기 위해 두 개의 서열이 정렬될 때 비교가 이루어진다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "면역글로불린" 또는 "Ig,"는 항체로서 기능하는 단백질의 클래스로 정의된다. B 세포에 의해 발현되는 항체는 때때로 BCR(B 세포 수용체) 또는 항원 수용체로 지칭된다. 이러한 단백질 클래스에 포함된 5가지 구성원은 IgA, IgG, IgM, IgD 및 IgE이다.
"단리됨"은 자연적인 상태로부터 변조 또는 제거됨을 의미한다. 예를 들어, 살아있는 동물에 자연적으로 존재하는 핵산 또는 펩티드는 "단리됨"이 아니나, 자연 상태의 공존 물질로부터 부분적으로 또는 완전히 분리된 동일한 핵산 또는 펩티드는 "단리됨"이다. 단리된 핵산 또는 단백질은 실질적으로 정제된 형태로 존재할 수 있거나, 예를 들어 숙주 세포와 같은 비-천연 환경에 존재할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 통상적으로 발생하는 핵산 염기에 대한 다음 약어가 사용된다. "A"는 아데노신을 지칭하고, "C"는 사이토신을 지칭하고, "G"는 구아노신을 지칭하고, "T"는 티미딘을 지칭하고, "U"는 우리딘을 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같은 "렌티바이러스"는 레트로바이러스과(Retroviridae family)의 속을 의미한다. 렌티바이러스는 비-분열 세포를 감염시킬 수 있는 점에서 레트로바이러스 중에서 독특하고; 이들은 상당한 양의 유전 정보를 숙주 세포의 DNA로 전달할 수 있으므로, 이들은 유전자 전달 벡터의 가장 효율적인 방법 중 하나이다. HIV, SIV 및 FIV는 모두 렌티바이러스의 예다. 렌티바이러스로부터 유래된 벡터는 상당한 수준의 생체내 유전자 전달을 달성하기 위한 수단을 제공한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "골수 침윤성 림프구"("MIL")는 골수로부터 유래된 림프구를 지칭한다. 골수 침윤성 림프구("MIL")는 말초 혈액 림프구("PBL")뿐만 아니라 종양 침윤성 림프구("TIL")와 구별가능한 많은 차이를 갖는다. 골수("BM") 미세환경은 풍부한 항원 제시 세포("APC")로 인해 특별한 면역학적 니쉐(niche)이다. 이러한 항원 제시 세포의 존재는 항원의 처리 및 제시를 위해 골수 구획에서 발견되는 더 높은 수준의 중앙 기억 세포를 유지하게 한다(Li JM et al J Immunol. 2009 Dec 15;183(12):7799-809). 이러한 MIL은 기억 마커, 예컨대 CD45RO+ 및 CD62L+를 발현하고, PBL에서 발견되는 기억 세포보다 더 많은 기억 MIL이 있다(Noonan K et al Clin Cancer Res. 2012 Mar 1;18(5):1426-34). 더욱이 MIL은 기억 세포를 항원에 대해 계속해서 대비하게 하는 이들의 능력 때문에 꼭 혈액 악성종양의 "TIL"인 것은 아니다(Beckhove P et al J Clin Invest. 2004 Jul 1; 114(1): 67-76; Castiglioni P et al 6 J Immunol 2008; 180:4956-4964). MIL은 또한 골수 스트로마에서 다량으로 발현되는 동족 항원 스트로마성 유래 인자 1형 ("SDF1")으로 인해 PBL 대응물보다 더 많은 CXCR4를 발현한다(Noonan K et al Cancer Res. 2005 Mar 1;65(5):2026-34). 41BB의 발현은 또한 BM 미세환경의 저산소 특성일 수 있는 점으로 인해, PBL에 비해 MIL에서 증가한다. 또한, MIL은 TIL과는 대조적으로 모든 환자로부터 수확 및 증식될 수 있다(Noonan, K et al Sci Transl Med. 2015 May 20;7(288):288ra78). TIL은 환자의 약 50%에서만 발견되며 환자의 약 25%만이 증식가능한 TIL을 갖고 있다. 말초 혈액 림프구(PBL)와는 대조적으로, MIL은, PBL에는 완전히 없는 특징인 - 고유한 종양 특이성을 설명하는 폭 넓은 내인성 항원 레퍼토리를 갖는다(Noonan et al Clin Cancer Res).
달리 명시되지 않는 한, "아미노산 서열을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열"은 서로의 축중(degenerate) 형태이며 동일한 아미노산 서열을 인코딩하는 모든 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 단백질 및 RNA를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 인트론을 포함할 수 있다.
용어 "기능 가능하게 연결된"은 조절 서열 및 비상동성 핵산 서열 사이에서 후자의 발현을 야기하는 기능적 연결을 지칭한다. 예를 들어, 제1 핵산 서열이 제2 핵산 서열과 기능적 관계에 위치할 때 제1 핵산 서열은 제2 핵산 서열과 기능 가능하게 연결된다. 예를 들어, 촉진자가 코딩 서열의 전사 또는 발현에 영향을 미친다면, 촉진자는 코딩 서열에 기능 가능하게 연결된다. 일반적으로, 동일한 판독 프레임에서 2개의 단백질 코딩 영역을 연결해야만 하는 경우, 기능 가능하게 연결된 DNA 서열은 연속적이다.
용어 "과발현된" 종양 항원 또는 종향 항원의 "과발현"은 조직 또는 기관의 정상적인 세포에서의 발현 수준에 비해 환자의 특정 조직 또는 기관 내의 고형 종양과 같은 질환 영역의 세포에서의 종양 항원의 비정상적인 발현 수준을 나타내기 위해 의도된다. 종양 항원의 과발현을 특징으로 하는 고형 종양 또는 혈액상 악성종양을 갖는 환자는 당업계에 알려진 표준 검정에 의해 결정될 수 있다.
면역원성 조성물의 "비경구" 투여는 예를 들어, 피하(s.c.), 정맥내(i.v.), 근육내(i.m.) 또는 흉골내 주사 또는 주입 기술을 포함한다.
용어 "환자", "대상체", "개체" 등은 본원에서 상호교환적으로 사용되며, 본원에 기재된 방법으로 처리할 수 있는 임의의 동물, 또는 시험관내 또는 인 시투(in situ)에 관계없이, 이의 세포를 지칭한다. 특정 비-제한적인 실시양태에서, 환자, 대상체 또는 개체는 인간이다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "펩티드", "폴리펩티드" 및 "단백질"은 상호교환적으로 사용되며, 펩티드 결합에 의해 공유적으로 연결된 아미노산 잔기로 구성된 화합물을 지칭한다. 단백질 또는 펩티드는 둘 이상의 아미노산을 함유해야 하며, 단백질 또는 펩티드의 서열을 포함할 수 있는 아미노산의 최대 개수에 제한이 있지 않다. 폴리펩티드는 펩티드 결합에 의해 서로 연결된 둘 이상의 아미노산을 포함하는 임의의 펩티드 또는 단백질을 포함한다. 본원에서 사용된 바와 같이, 상기 용어는, 예를 들어, 펩티드, 올리고펩티드 및 올리고머로도 당업계에서 통상적으로 지칭되는 단쇄 및 당업계에서 일반적으로 단백질로 지칭되는 장쇄를 모두 지칭하고, 이들의 많은 종류가 있다. "폴리펩티드"는, 예를 들어, 생물학적 활성 단편, 실질적으로 상동성인 폴리펩티드, 올리고펩티드, 폴리펩티드의 변이체, 동종이량체, 이종이량체, 변성 폴리펩티드, 유도체, 유사체, 융합 단백질을 특히 포함한다. 폴리펩티드는 천연 펩티드, 재조합 펩티드, 합성 펩티드 또는 이들의 조합을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "촉진자"는 폴리뉴클레오티드 서열의 특정 전사를 개시하는 데 요구되는, 세포의 합성 장치(machinery) 또는 도입된 합성 장치에 의해 인식되는 DNA 서열로 정의된다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "촉진자/조절 서열"은 촉진자/조절 서열에 기능 가능하게 연결된 유전자 산물의 발현에 요구되는 핵산 서열을 의미한다. 일부 예에서, 이러한 서열은 코어 촉진자 서열일 수 있고, 다른 예에서, 이 서열은 유전자 산물의 발현에 요구되는 인핸서 서열 및 다른 조절 요소를 포함 수도 있다. 촉진자/조절 서열은, 예를 들어, 조직 특이적 방식으로 유전자 산물을 발현하는 것일 수 있다.
"구성적(constitutive)" 촉진자는 유전자 산물을 인코딩하거나 지정하는 폴리뉴클레오티드와 기능 가능하게 연결될 때, 유전자 산물이 세포의 대부분 또는 모든 생리학적 조건하에 세포에서 생성되게 하는 뉴클레오티드 서열이다.
"유도성" 촉진자는 유전자 산물을 인코딩하거나 지정하는 폴리뉴클레오티드와 기능 가능하게 연결될 때, 실질적으로 촉진자에 상응하는 유도제가 세포에 존재하는 경우에만 유전자 산물이 세포에서 생성되도록 하는 뉴클레오티드 서열이다.
"조직-특이적" 촉진자는 유전자에 의해 인코딩하거나 지정되는 폴리뉴클레오티드와 기능 가능하게 연결될 때, 실질적으로 세포가 촉진자에 해당하는 조직 종류의 세포인 경우에만 유전자 산물이 세포에서 생성되도록 하는 뉴클레오티드 서열이다.
용어 "자극"이란, 자극 분자(예를 들어, TCR/CD3 복합체)가 이의 동족 리간드와 결합함에 따라, 신호 전달 이벤트를 매개하여 유도되는 것, 예컨대, 비제한적으로, TCR/CD3 복합체를 통한 신호 전달을 매개하여 유도되는 1차 반응을 의미한다. 자극은 TGF-β의 하향조절 및/또는 세포골격(cytoskeletal) 구조의 재구성 등과 같은, 특정 분자의 변조된 발현을 매개할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "자극 분자"는 항원 제시 세포 상에 존재하는 동족 자극 리간드와 특이적으로 결합하는 MIL 상의 분자를 의미한다.
본원에 사용된 바와 같은 "자극 리간드"는, 항원 제시 세포(예를 들어, aAPC, 수지상 세포, B 세포 등)에 존재할 때, MIL 상의 동족 결합 파트너(본원에서 "자극 분자"로 지칭됨)와 특이적으로 결합함으로써, 비제한적으로, 활성화, 증식, 면역 반응의 억제 등을 포함하는, MIL에 의한 1차 반응을 매개할 수 있는 리간드를 의미한다. 자극 리간드는 당업계에 잘 알려져 있으며, 특히 펩티드, 항-CD3 항체, 슈퍼아고니스트 항-CD28 항체 및 슈퍼아고니스트 항-CD2 항체로 로딩된 MHC 클래스 I 분자를 포함한다.
용어 "대상체"는 면역 반응이 유도될 수 있는 살아있는 유기체를 포함하는 것으로 의도된다(예를 들어, 포유류). 대상체의 예는 인간, 개, 고양이, 마우스, 래트 및 이들의 유전자 이식 종을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "치료적"은 치료 및/또는 예방을 의미한다. 치료적 효과는 질환 상태의 억제, 관해 또는 근절에 의해 얻어진다.
용어 "치료적 유효량"은 연구자, 수의사, 의사 또는 다른 임상의가 찾고 있는 조직, 시스템 또는 대상체의 생물학적 또는 의학적 반응을 이끌어 낼 것인 대상 화합물의 양을 지칭한다. 용어 "치료적 유효량"은 투여될 때, 치료되고 있는 장애 또는 질환의 하나 이상의 징후 또는 증상의 발병을 예방하거나 어느 정도 경감하기에 충분한 화합물의 양을 포함한다. 치료적 유효량은 화합물, 질환 및 그 중증도 및 치료를 받을 대상체의 연령, 체중 등에 따라 달라질 것이다.
본원에 사용된 바와 같은 용어로서 질환을 "치료"한다는 것은 대상체가 경험한 질환 또는 장애의 적어도 하나의 징후 또는 증상의 빈도 또는 중증도를 감소시키는 것을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "형질감염된" 또는 "형질변환된"또는 "형질도입된"은 외인성 핵산이 숙주 세포로 전달되거나 도입되는 과정을 지칭한다. "형질감염된" 또는 "형질변환된" 또는 "형질도입된" 세포는 외인성 핵산으로 형질감염되거나, 형질변환되거나 형질도입된 것이다. 세포는 1차 대상 세포와 그 자손을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은 어구 "전사 제어하에서" 또는 "기능 가능하게 연결된"은 촉진자가 RNA 중합효소에 의한 전사의 개시 및 폴리뉴클레오티드의 발현을 제어하기 위해 폴리뉴클레오티드와 관련하여 올바른 위치 및 배향(orientation)에 있음을 의미한다.
"벡터"는 단리된 핵산을 포함하고 단리된 핵산을 세포 내부로 전달하는 데 사용될 수 있는 물질의 구성이다. 비제한적으로, 선형 폴리뉴클레오티드, 이온성 또는 양친매성 화합물과 관련된 폴리뉴클레오티드, 플라스미드 및 바이러스를 포함하여, 수많은 벡터가 당업계에 알려져 있다. 따라서, 용어 "벡터"는 자율적으로 복제하는 플라스미드 또는 바이러스를 포함한다. 상기 용어는 또한, 예를 들어, 폴리라이신 화합물, 리포좀 등과 같은 핵산의 세포로의 전달을 촉진하는 비-플라스미드 및 비-바이러스 화합물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 바이러스 벡터의 예는 비제한적으로, 아데노바이러스 벡터, 아데노-관련 바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 등을 포함한다.
I. 키메라 항원 수용체
본원은 세포외 및 세포내 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR)를 제공한다. 세포외 도메인은 항원-결합 모이어티로 달리 지칭되는 표적-특이적 결합 요소를 포함한다. 세포내 도메인 또는 그렇지 않으면 세포질 도메인은 공동자극 신호전달 영역 및/또는 ζ사슬의 일부를 포함할 수 있다. 공동자극 신호전달 영역은 공동자극 분자의 세포내 도메인을 포함하는 CAR의 일부를 지칭한다. 공동자극 분자는 항원에 대한 림프구의 효율적인 반응에 요구되는 항원 수용체 또는 이들의 리간드 이외의 세포 표면 분자이다.
스페이서 도메인은 CAR의 세포외 도메인 및 막횡단 도메인 사이 또는 CAR의 세포질 도메인 및 막횡단 도메인 사이에 편입될 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "스페이서 도메인"은 일반적으로 막횡단 도메인을 폴리펩티드 사슬에서 세포외 도메인 또는 세포질 도메인에 연결하는 기능을 하는 아미노산의 스트레치(stretch)를 의미한다. 스페이서 도메인은 300개 이하의 아미노산 또는 2 내지 100개의 아미노산, 예컨대 25 내지 50개의 아미노산을 포함할 수 있다.
II. 세포외 도메인
일부 실시양태에서, CAR은 항원-결합 모이어티로 달리 지칭되는 표적-특이적 결합 요소를 포함한다. 모이어티의 선택은 표적 세포의 표면을 정의하는 리간드의 종류와 개수에 달려 있다. 예를 들어, 항원-결합 도메인은 특정 질환 상태와 관련된 표적 세포에서 세포 표면 마커로 작용하는 리간드를 인식하도록 선택될 수 있다. 따라서, CAR에서 항원-결합 도메인에 대한 리간드로 작용할 수 있는 세포 표면 마커의 예는 바이러스, 박테리아 및 기생충 감염, 자가 면역 질환 및 암 세포와 관련된 것들을 포함한다. 예를 들어, 리간드는 박테리아, 바이러스 또는 기생충의 단백질일 수 있다. 유사하게는, 리간드는 암세포의 표면에서 상향조절되는 단백질일 수 있다.
일부 실시양태에서, CAR은 종양 세포 상의 항원에 특이적으로 결합하는 원하는 항원-결합 모이어티를 조작하는 방식으로 조작되어 관심 종양 항원을 표적할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, "종양 항원" 또는 "과증식성 장애 항원" 또는 "과증식성 장애와 관련된 항원"은 암과 같은 특정 과증식성 장애에 공통되는 항원을 지칭한다. 본원에서 논의된 항원은 단지 예로서 포함된다. 목록은 배타적인 것으로 의도되지 않으며 추가 예는 당업자에게 쉽게 드러날 것이다.
종양 항원은 면역 반응 특히, T-세포 매개 면역 반응을 이끌어 내는 종양 세포에 의해 생성되는 단백질이다. 항원-결합 모이어티의 선택은 치료될 암의 특정 종류에 따라 달라질 것이다. 종양 항원은 당업계에 잘 알려져 있고, 예를 들어, 신경교종-관련 항원, 암배아 항원(CEA), β-인간 융모성 생식선자극호르몬, 알파-태아단백(AFP), 렉틴-반응성 AFP, 티로글로불린, RAGE-1, MN-CA IX, 인간 텔로머라아제 역전사 효소, RU1, RU2(AS), 장 카르복실 에스테라아제, 돌연변이 hsp70-2, M-CSF, 프로스타아제, 전립선-특이적 항원(PSA), PAP, NY-ESO-1, LAGE-1a, p53, 프로스테인, PSMA, Her2/neu, 서바이빈, 텔로머라아제, 전립선-암종 종양 항원-1(PCTA-1), MAGE, ELF2M, 호중구 엘라스타아제, 에프린B2, CD22, 인슐린 성장 인자(IGF)-I, IGF-II, IGF-I 수용체 및 메소텔린을 포함한다.
일부 실시양태에서, 종양 항원은 악성인 종양과 관련된 하나 이상의 항원성 암 에피토프를 포함한다. 악성인 종양은 면역 공격에 대한 표적 항원으로 작용할 수 있는 다수의 단백질을 발현시킨다. 이러한 분자는, 비제한적으로, 조직-특이적 항원, 예컨대 흑색종 내 MART-1, 티로시나아제 및 GP 100, 및 전립선 암 내 전립선산 인산가수분해효소(PAP) 및 전립선-특이적 항원(PSA)을 포함한다. 다른 표적 분자는 형질변환-관련 분자의 군, 예컨대 종양유전자(oncogene) HER-2/Neu/ErbB-2의 군에 속한다. 또 다른 표적 항원의 군은 종양-태아(onco-fetal) 항원, 예컨대 암배아 항원(CEA)이다. B-세포 림프종에서, 종양-특이적 이디오타입(idiotype) 면역글로불린은 개별 종양에 고유한 종양-특이적 면역글로불린 항원을 충실히 구성한다. B-세포 분화 항원, 예컨대 CD19, CD20 및 CD37은 B 세포 림프종에서 표적 항원에 대한 다른 후보이다. 이들 항원 중 일부(예를 들어, CEA, HER-2, CD19, CD20, 이디오타입)는 한정된 성공을 이룬 단클론성 항체를 이용한 수동적 면역치료용 표적으로 이용되었다.
또한, 지칭된 종양 항원의 종류는 종양-특이적 항원(TSA) 또는 종양-관련 항원(TAA)일 수 있다. TSA는 종양 세포에 고유하며 신체의 다른 세포에서는 발생하지 않는다. TAA 관련 항원은 종양 세포에 고유하지 않고 대신 항원에 대한 면역 내성 상태를 유도하지 못하는 조건에서 정상 세포에서도 발현된다. 종양에서 항원의 발현은 면역계가 항원에 반응할 수 있는 조건에서 발생할 수 있다. TAA는 면역계가 미성숙하고 반응할 수 없을 경우, 태아 발달 중에 정상 세포에서 발현되는 항원일 수 있거나, 정상 세포에서는 보통 극도로 낮은 수준으로 존재하되 종양 세포에서는 훨씬 더 높은 수준으로 발현되는 항원일 수 있다.
TSA 또는 TAA 항원의 비제한적인 예는 다음을 포함한다: 분화 항원, 예컨대 MART-1/멜란에이(MART-I), gp100(Pmel 17), 티로시나아제, TRP-1, TRP-2 및 종양-특이적 다분화능(multilineage) 항원, 예컨대 MAGE-1, MAGE-3, BAGE, GAGE-1, GAGE-2, p15; 과발현 암배아 항원, 예컨대 CEA; 과발현 종양유전자 및 돌연변이된 종양-억제 유전자, 예컨대 p53, Ras, HER-2/neu; 염색체전좌(chromosomal translocation)로부터 발생되는 고유한 종양 항원; 예컨대 BCR-ABL, E2A-PRL, H4-RET, IGH-IGK, MYL-RAR; 및 바이러스 항원, 예컨대 엡스타인 바르(Epstein Barr) 바이러스 항원 EBVA 및 인간 유두종바이러스(HPV) 항원 E6 및 E7. 다른 대형의, 단백질-기반 항원은 TSP-180, MAGE-4, MAGE-5, MAGE-6, RAGE, NY-ESO, p185erbB2, p180erbB-3, c-met, nm-23H1, PSA, TAG-72, CA 19-9, CA 72-4, CAM 17.1, NuMa, K-ras, 베타-카테닌, CDK4, Mum-1, p 15, p 16, 43-9F, 5T4, 791Tgp72, 알파-태아단백, 베타-HCG, BCA225, BTAA, CA 125, CA 15-3＼CA 27.29＼BCAA, CA 195, CA 242, CA-50, CAM43, CD68＼P1, CO-029, FGF-5, G250, Ga733＼EpCAM, HTgp-175, M344, MA-50, MG7-Ag, MOV18, NB/70K, NY-CO-1, RCAS1, SDCCAG16, TA-90＼Mac-2 결합 단백질＼사이클로필린 C-관련 단백질, TAAL6, TAG72, TLP 및 TPS를 포함한다.
일부 실시양태에서, CAR의 항원-결합 모이어티 부분은 비제한적으로, CD19, CD20, CD22, ROR1, 메소텔린, CD33/IL3Ra, c-Met, PSMA, 당지질 F77, EGFRvIII, GD-2, MY-ESO-1 TCR, MAGE A3 TCR 등을 포함하는 항원을 표적으로 한다.
표적으로 할 원하는 항원에 따라, CAR은 원하는 항원 표적에 특이적인 적절한 항원 결합 모이어티를 포함하도록 조작될 수 있다. 예를 들어, CD19가 표적이 되어야 하는 원하는 항원이면, CD19에 대한 항체는 CAR 로의 통합을 위한 항원 결합 모이어티로 이용될 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, CAR의 항원-결합 모이어티 부분은 CD19를 표적한다.
CAR의 세포외 도메인은 예를 들어, 본원에 기재된 표적 중 임의의 하나에 결합하는 단일쇄 가변성 단편("scFv")을 포함한다.
세포외 도메인은 당업계에 알려진 매우 다양한 임의의 항원-결합 폴리펩티드일 수 있다. 일부 예에서, 항원-결합 도메인은 단일쇄 Fv("scFv")이다. 다른 항체-기반 인식 도메인(cAb VHH(낙타과 항체 가변성 도메인) 및 인간화 버전, IgNAR VH(상어 항체 가변성 도메인) 및 인간화 버전, sdAb VH(단일 도메인 항체 가변성 도메인) 및 "카멜라이즈드(camelized)" 항체 가변성 도메인이 사용하기에 적합하다. 일부 예에서, 또한, T-세포 수용체(TCR) 기반 인식 도메인, 예컨대, 단일쇄 TCR(scTv, v νβ를 함유하는 단일쇄 2-도메인 TCR)이 사용하기에 적합하다.
당업계에 알려진 다른 세포외 도메인 또한 실시양태에 사용될 수 있다(예를 들어, 본원에 참조로 포함되는 PCT 특허출원공개 제WO 2014/127261호; 미국 특허 제8,975,071호 참조).
III. 막횡단 도메인
막횡단 도메인과 관련하여, CAR은 CAR의 세포외 도메인에 융합된 막횡단 도메인을 포함하도록 디자인될 수 있다. 일부 실시양태에서, CAR의 도메인 중 하나와 자연적으로 연합되는 막횡단 도메인이 사용된다. 일부 예에서, 막횡단 도메인은 동일하거나 상이한 표면 막 단백질의 막횡단 도메인에 대한 이러한 도메인의 결합을 피하기 위해 아미노산 치환에 의해 변형되거나 선택되어, 수용체 복합체의 다른 구성원과의 상호작용을 최소화할 수 있다.
막횡단 도메인은 천연 소스로부터 유래될 수 있거나, 막횡단 도메인은 (예를 들어, α-나선을 형성하는, 알라닌, 발린, 류신 및 이소류신과 같은 18 내지 30개의 소수성 아미노산의 스트레치로부터) 디자인될 수 있다. 소스가 천연인 경우, 도메인은 임의의 막-결합 또는 막횡단 단백질로부터 유래될 수 있다. 특정 용도의 막횡단 영역은 T-세포 수용체의 α, β 또는 ζ 사슬, CD28, CD3 엡실론, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, 또는 CD154로부터 유래될 수 있다(즉, 적어도 이들의 막횡단 영역(들)을 포함할 수 있다). 대안적으로, 막횡단 도메인이 디자인될 수 있으며, 이 경우에는 류신 및 발린과 같은 소수성 잔기를 지배적으로 포함할 것이다. 디자인된 막횡단 도메인의 경우, 페닐알라닌, 트립토판 및/또는 티로신이 막/물 계면 근처에서 발견될 수 있다. 선택적으로, 2 내지 10개의 아미노산 길이의 짧은 올리고- 또는 폴리펩티드 링커가 CAR의 세포질 신호전달 도메인과 막횡단 도메인을 연결할 수 있다. 글리신-세린 스페이서는 특히 적합한 링커를 제공한다.
IV. 세포내 도메인
CAR의 세포질 도메인 또는 그렇지 않으면 세포내 신호전달 도메인은 MIL의 정상 이펙터 기능 중 적어도 하나의 활성화를 담당한다. 용어 "이펙터 기능"은 세포의 특화된 기능을 지칭한다. 예를 들어, MIL의 이펙터 기능은, 사이토카인 분비를 포함하는 헬퍼 활성 또는 세포용해 활성일 수 있다. 따라서 용어 "세포내 신호전달 도메인"은 이펙터 기능 신호를 전달하고 세포가 특화된 기능을 수행하도록 지시하는 단백질의 일부를 지칭한다. 전체 세포내 신호전달 도메인이 사용될 수 있지만, 많은 경우에서 전체 세포내 도메인을 사용할 필요는 없다. 세포내 신호전달 도메인의 절단 부분이 사용될 경우에, 그것이 이펙터 기능 신호를 전달하는 한, 온전한 사슬 대신에 상기 절단 부분이 사용될 수 있다. 따라서, 용어 세포내 신호전달 도메인은 이펙터 기능 신호를 전달하기에 충분한 세포내 신호전달 도메인의 임의의 절단 부분을 포함하는 것을 의미한다.
CAR에 사용하기 위한 세포내 신호전달 도메인의 일부 비-제한적인 예는, T-세포 수용체(TCR)의 세포질 서열 및 항원 수용체 계합(engagement) 후 신호 전달을 개시하기 위해 협력하여 작용하는 공동-수용체뿐만 아니라, 이들 서열의 임의의 유도체 또는 변이체 및 동일한 기능적 능력을 갖는 임의의 합성 서열을 포함한다.
TCR 단독을 통해 생성된 신호는 림프구의 완전 활성화에 불충분하고, 2차 또는 공동-자극 신호도 필요하다. 따라서, MIL 활성화는 TCR을 통해 항원-의존적 1차 활성화를 개시하는 것(1차 세포질 신호전달 서열) 및 2차 또는 공동-자극 신호를 제공하기 위해 항원-독립적 방식으로 작용하는 것(2차 세포질 신호전달 서열)의 두 가지 구별되는 부류의 세포질 신호전달에 의해 매개된다.
1차 세포질 신호전달 서열은 자극 방법 또는 억제 방법으로, TCR 복합체의 1차 활성화를 조절한다. 자극 방식으로 작용하는 1차 세포질 신호전달 서열은 면역 수용체 티로신-기반 활성화 모티프 또는 ITAM으로 알려진 신호전달 모티프를 함유할 수 있다.
사용될 수 있는 1차 세포질 신호전달 서열을 함유하는 ITAM의 예는, 비제한적으로, TCR ζ, FcR 감마, FcR 베타, CD3γ, CD3δ, CD3ε, CD5, CD22, CD79a, CD79b 및 CD66d로부터 유래된 것들을 포함한다. 일부 실시양태에서, CAR의 세포질 신호전달 분자는 CD3ζ로부터 유래된 세포질 신호전달 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, CAR의 세포질 도메인은 그 자체로 CD3ζ 신호전달 도메인을 포함하도록 디자인되거나, CAR의 상황에 유용한 임의의 다른 원하는 세포질 도메인(들)과 조합될 수 있다. 예를 들어, CAR의 세포질 도메인은 CD3ζ 사슬의 일부 및 공동자극 신호전달 영역을 포함할 수 있다. 공동자극 신호전달 영역은 공동자극 분자의 세포내 도메인을 포함하는 CAR의 일부를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 공동자극 분자는, 항원으로의 림프구에 의한 효율적인 반응에 요구되는 항원 수용체 또는 이들의 리간드 이외의 세포 표면 분자이다. 상기 분자의 예는 CD27, CD28, 4-1BB(CD137), OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, 림프구 기능-관련 항원-1(LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3 등을 포함한다. 따라서, 일부 실시양태는 공동-자극 신호전달 요소로서 4-1BB로 예시될 수 있지만, 다른 공동자극 요소도 사용될 수 있다.
CAR의 세포질 신호전달 부분 내의 세포질 신호전달 서열은 무작위 또는 특정 순서로 서로 연결될 수 있다. 선택적으로, 짧은 올리고- 또는 폴리펩티드 링커, 바람직하게는 2 내지 10개 아미노산 길이가 연결을 형성할 수 있다. 글리신-세린은 스페이서는 특히 적합한 링커를 제공한다.
일부 실시양태에서, 세포질 도메인은 CD3ζ의 신호전달 도메인 및 CD28의 신호전달 도메인을 포함하도록 디자인된다. 일부 실시양태에서, 세포질 도메인은 CD3ζ의 신호전달 도메인 및 4-1BB의 신호전달 도메인을 포함하도록 디자인된다. 일부 실시양태에서, 세포질 도메인은 CD3ζ의 신호전달 도메인 및 CD28 및 4-1BB의 신호전달 도메인을 포함하도록 디자인된다.
일부 실시양태에서, CAR 내 세포질 도메인은 4-1BB의 신호전달 도메인 및 CD3ζ의 신호전달 도메인을 포함하도록 디자인된다.
일부 실시양태에서, CAR은 세포외 도메인, 막횡단 도메인, 공동자극 도메인을 포함하는 세포내 도메인 및 신호전달 도메인을 포함한다. 세포외 도메인은 종양 항원에 결합하는 도메인이다. 상기 항원의 예는 비제한적으로, BCMA, PSMA, CD19 및 CD38을 포함한다. 세포외 도메인은 항체, 예컨대 scFV 또는 본원에 기재되거나 당업계에 알려진 다른 종류의 항체일 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포외 도메인은 다라투무맙으로부터 유래된 scFv이다. 일부 실시양태에서, 세포외 도메인은 본원에 기재된 하나 이상의 항원에 결합 할 수 있는 FN3 도메인이다. 일부 실시양태에서, 세포외 도메인은 항원에 자연적으로 결합하는 단백질 또는 단백질의 일부이다.
일부 실시양태에서, 막횡단 도메인은 인간 CD8의 막횡단 도메인이다. 일부 실시양태에서, 막횡단 도메인은 CD3 제타, CD4, CD8 또는 CD28의 막횡단 도메인이다.
일부 실시양태에서, 공동-자극 도메인은 4-1BB 공동-자극 도메인(세포내 신호전달 도메인)이다. 또한, 다른 공동-자극 도메인이 사용될 수 있다. 예를 들어, CD28의 세포내 신호전달 도메인이 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 신호전달 도메인은 CD3ζ로부터의 신호전달 도메인이다.
일부 실시양태에서, CAR은 하기 표에 예시된 바와 같은 구성물을 포함한다.
표 1
CAR 디자인
세포외 도메인 막횡단 도메인 공동-자극 도메인 신호전달 도메인
BCMA CD8, CD3 제타, CD4, 또는 CD28 4-1BB CD3ζ
PSMA CD8, CD3 제타, CD4, 또는 CD28 4-1BB CD3ζ
CD19 CD8, CD3 제타, CD4, 또는 CD28 4-1BB CD3ζ
CD38 CD8, CD3 제타, CD4, 또는 CD28 4-1BB CD3ζ
V. 벡터
CAR을 인코딩하는 천연 또는 합성 핵산의 발현은 전형적으로 CAR 폴리펩티드 또는 이의 일부를 인코딩하는 핵산을 촉진자에 기능 가능하게 연결하고 구성물을 발현 벡터에 통합함으로써 달성된다. 벡터는 복제 및 통합 진핵생물에 적합할 수 있다. 전형적인 클로닝 벡터는 원하는 핵산 서열의 발현 조절에 유용한 전사 및 번역 종결자(terminator), 개시 서열 및 촉진자를 포함한다.
렌티바이러스와 같은 레트로바이러스로부터 유래된 벡터는 이식 유전자의 장기적이고 안정적인 통합 및 딸세포에서의 증식을 가능하게 하기 때문에 장기적인 유전자 전달을 달성하는 데 적합한 도구이다. 렌티바이러스 벡터는 간세포와 같은, 비증식 세포를 형질도입할 수 있다는 점에서 뮤린(murine) 백혈병 바이러스와 같은 종양-레트로바이러스로부터 유래된 벡터에 비해 추가적인 이점을 갖는다. 이들은 또한 낮은 면역원성의 추가 장점을 갖는다.
원하는 분자를 코딩하는 핵산 서열은, 예를 들어, 유전자를 발현하는 세포로부터 라이브러리를 스크리닝하는 것, 이를 포함하는 것으로 알려진 벡터로부터 유전자를 유도하는 것 또는 표준 기술을 사용하여, 이를 함유한 세포 및 조직으로부터 직접 단리하는 것과 같은, 당업계에 알려진 재조합 방법을 이용하여 수득될 수 있다. 대안적으로, 관심 유전자는 클로닝되는 대신 합성적으로 생산될 수 있다.
또한, 발현 구성물은 표준 유전자 전달 프로토콜을 사용하여, 핵산 면역화 및 유전자 치료를 위해 사용될 수 있다. 유전자 전달 방법은 당업계에 알려져 있다(예를 들어, 본원에 참조로 포함되는, 미국 특허 제5,399,346호, 제5,580,859호, 제5,589,466호 참조). 일부 실시양태에서, 실시양태는 유전자 치료 벡터를 제공한다. 핵산 서열은 또한 비제한적으로, CRISPR과 같은 유전자 편집 기술을 사용하여 삽입될 수 있다.
핵산은 다수 종류의 벡터로 클로닝 될 수 있다. 예를 들어, 핵산은 비제한적으로, 플라스미드, 파지미드(phagemid), 파지 유도체, 동물 바이러스 및 코스미드를 포함하는 벡터로 클로닝 될 수 있다. 특히 관심있는 벡터는 발현 벡터, 복제 벡터, 프로브 생성 벡터 및 시퀀싱 벡터를 포함한다.
발현 벡터는 바이러스 벡터의 형태로 세포에 제공될 수 있다. 바이러스 벡터 기술은 당업계에 잘 알려져 있으며, 예를 들어 Green & Sambrook (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (4th ed., 2012)) 및 다른 바이러스학 및 분자 생물학 매뉴얼에 기재되어 있다. 벡터로서 유용한 바이러스는, 비제한적으로, 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스, 헤르페스 바이러스 및 렌티바이러스를 포함한다. 일반적으로, 적합한 벡터는 적어도 하나의 유기체에서 기능하는 복제 기점, 촉진자 서열, 편리한 제한 엔도뉴클레아제 사이트 및 하나 이상의 선택가능 마커를 함유한다(예를 들어, 제WO 01/96584호; 제WO 01/29058호; 및 미국 특허 제6,326,193호).
포유류 세포로의 유전자 전달을 위해 다수의 바이러스 기반 시스템이 개발되었다. 예를 들어, 레트로바이러스는 유전자 전달 시스템을 위한 편리한 플랫폼을 제공한다. 선택된 유전자는 당업계에 알려진 기술을 사용하여, 벡터에 삽입되고 레트로바이러스 입자에 패키징될 수 있다. 그 후, 재조합 바이러스는 단리되고, 생체내 또는 생체외(ex vivo)로 대상체의 세포에 전달될 수 있다. 일부 실시양태에서, 아데노바이러스 벡터가 사용된다. 일부 실시양태에서, 렌티바이러스 벡터가 사용된다.
추가 조절 요소(예를 들어, 촉진자 및 인핸서)는 전사 개시 빈도를 조절한다. 비록 다수의 촉진자가 시작 사이트의 다운스트림 기능 요소도 함유하는 것으로 최근에 나타났지만, 전형적으로는, 이들이 시작 사이트의 업스트림에 30-100,000 bp로 위치된다. 촉진자 요소들 사이의 간격은 종종 유연하므로, 요소들이 서로에 대해 반전되거나 움직일 때, 촉진자 기능이 보존된다. 티미딘 키나아제(tk) 촉진자에서, 촉진자 요소 사이의 간격은 활성 감소가 시작되기 전에 50 bp로 이격됨으로써 증가될 수 있다. 촉진자에 따라, 개별 요소는 협력적으로 또는 독립적으로 기능하여 전사를 활성화시킬 수 있다.
적합한 촉진자의 하나의 예는 즉각적인 초기 거대세포바이러스(CMV) 촉진자 서열이다. 이 촉진자 서열은 이에 기능 가능하게 연결된 임의의 폴리뉴클레오티드 서열의 높은 수준의 발현을 유도할 수 있는 강력한 항시성 촉진자 서열이다. 적합한 촉진자의 또 다른 예는 신장 생장 인자(Elongation Growth Factor)-1α(EF-1α)이다. 다만, 비제한적으로, 시미안(simian) 바이러스 40(SV40) 초기 촉진자, 마우스 유방 종양 바이러스(MMTV), 인간 면역결핍 바이러스(HIV) 긴 말단 반복순서(long terminal repeat, LTR) 촉진자, MoMuLV 촉진자, 아비안 백혈병 바이러스 촉진자, 엡스타인-바르 바이러스 초기 즉각적 촉진자, 라우스(Rous) 육종 바이러스 촉진자뿐만 아니라, 인간 유전자 촉진자, 예컨대, 비제한적으로, 액틴 촉진자, 미오신 촉진자, 헤모글로빈 촉진자 및 크레아틴 키나아제 촉진자를 포함하는, 다른 항시성 촉진자 서열 또한 사용될 수 있다. 촉진자는 항시성 촉진자로 한정되지 않는다. 또한, 유도성 촉진자가 사용될 수 있다. 유도성 촉진자의 사용은 그러한 발현이 바람직할 때, 기능 가능하게 연결된 폴리뉴클레오티드 서열의 발현을 켜거나 발현을 원치 않을 때 발현을 끌 수 있는 분자 스위치를 제공한다. 유도성 촉진자의 예는, 비제한적으로, 메탈로티오닌 촉진자, 글루코코르티코이드 촉진자, 프로게스테론 촉진자 및 테트라사이클린 촉진자를 포함한다.
또한, CAR 폴리펩티드 또는 이의 일부의 발현을 평가하기 위해, 세포 내로 도입될 발현 벡터는, 선택가능 마커 유전자 또는 리포터 유전자(reporter gene) 또는 둘 모두를 함유하여, 바이러스 벡터를 통해 형질감염 또는 감염되려는 세포의 집단으로부터 발현 세포의 식별과 선택을 용이하게 할 수 있다. 다른 양태에서, 선택가능 마커는 별개의 DNA 조각에 운반될 수 있고 공동-형질감염 절차에 사용될 수 있다. 선택가능 마커 및 리포터 유전자 모두 숙주 세포에서 발현을 가능하게 하는 적절한 조절 서열 옆에 위치할 수 있다. 유용한 선택가능 마커는, 예를 들어, 네오(neo) 등과 같은 항생제-내성 유전자를 포함한다.
리포터 유전자는 잠재적으로 형질감염된 세포를 식별하고 조절 서열의 기능성을 평가하기 위해 사용된다. 일반적으로, 리포터 유전자는, 수용 유기체(recipient organism) 또는 조직에 존재하지 않거나 그에 의해 발현되지 않으면서, 일부 용이하게 검출가능한 특성, 예를 들어, 효소 활성에 의해 발현을 나타내는 폴리펩티드를 인코딩하는 유전자이다. 리포터 유전자의 발현은 DNA가 수용 세포(recipient cell)에 도입된 후 적절한 시간에 검정된다. 적합한 리포터 유전자는 루시퍼라아제, 베타-갈락토시다아제, 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라아제, 분비된 알칼리성 포스파타아제 또는 녹색 형광성 단백질 유전자를 인코딩하는 유전자를 포함할 수 있다(예를 들어, Ui-Tei et al., 2000 FEBS Letters 479 : 79-82). 일부 실시양태에서, 리포터 유전자는 m체리(mCherry)이다.
유전자를 세포에 도입하고 발현하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 발현 벡터의 문맥에서, 벡터는 당업계의 임의의 방법에 의해 숙주 세포, 예를 들어, 포유동물, 박테리아, 효모 또는 곤충 세포로 용이하게 도입될 수 있다. 예를 들어, 발현 벡터는 물리적, 화학적 또는 생물학적 수단에 의해 숙주 세포로 전달될 수 있다.
폴리뉴클레오티드를 숙주 세포 내로 도입하기 위한 물리적 방법은 인산 칼슘 침전, 리포펙션, 유전자 충격(particle bombardment), 미세주입, 전기천공 등을 포함한다. 벡터 및/또는 외인성 핵산을 포함하는 세포를 생산하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다(예를 들어, Green & Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (4th ed., 2012) 참조).
관심 폴리뉴클레오티드를 숙주 세포 내로 도입하기 위한 생물학적 방법은 DNA 및 RNA 벡터의 사용을 포함한다. 바이러스 벡터, 특히 레트로바이러스 벡터는 포유류 세포 내로 유전자를 삽입하기 위해 널리 사용되는 방법이 되었다. 다른 바이러스 벡터는 렌티바이러스, 폭스바이러스(poxvirus), 단순 헤르페스바이러스 I, 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스 등으로부터 유래될 수 있다(예를 들어, 미국 특허 제5,350,674호 및 제5,585,362호 참조).
핵산을 숙주 세포 내로 도입하기 위한 화학적 수단은 콜로이드 분산 시스템, 예컨대, 거대분자 복합체, 나노캡슐, 마이크로스피어, 비드 및 수중유(oil-in-water) 현탁액, 마이셀, 혼합 마이셀 및 리포솜을 포함한 지질-기반 시스템을 포함한다. 시험관내 및 생체내 전달 비히클로 사용하기 위한 예시적인 콜로이드 시스템은 리포솜(예를 들어, 인공 막 소수포)이다.
비-바이러스 전달 시스템이 활용되는 경우에, 예시적인 전달 비히클은 리포솜이다. 숙주 세포 내로 핵산의 도입을 위해 지질 제형의 사용이 고려된다(시험관내, 생체외, 또는 생체내). 또 다른 양태에서, 핵산은 지질과 연합될 수 있다. 지질과 연합된 핵산은 리포솜의 수용성 내부에 캡슐화될 수 있거나, 리포솜의 지질 이중층 내에 산재될 수 있거나, 리포솜 및 올리고뉴클레오티드 둘 모두와 관련된 연결 분자를 통해 리포솜에 부착될 수 있거나, 리포솜에 포획될 수 있거나, 리포솜과 복합화될 수 있거나, 지질을 함유하는 용액 중에 분산될 수 있거나, 지질과 혼합될 수 있거나, 지질과 조합될 수 있거나, 지질 중 현탁액으로 함유될 수 있거나, 마이셀과 함께 함유되거나 복합화될 수 있거나, 그렇지 않으면 지질과 연합될 수 있다. 지질, 지질/DNA 또는 지질/발현 벡터 관련 조성물은 용액 중 임의의 특정 구조에 한정되지 않는다. 이들은 예를 들어, 마이셀과 같은 이중층 구조에 존재하거나 "붕괴된(collapsed)" 구조로 존재할 수 있다. 이들은 또한 단순히 용액에 산재될 수 있어, 크기나 모양이 균일하지 않은 응집체를 형성할 가능성이 있다.
VI. 골수 침윤성 림프구
MIL의 증식 및 유전적 변형 이전에, MIL의 소스는 대상체로부터 수득된다. 혈액 악성종양 및 고형 종양을 포함하는, 임의의 다수 종류의 암을 가진 환자에서, T 세포는 말초 혈액에 비해 종양 특이성이 높아진 골수 미세환경으로부터 쉽게 수득될 수 있다(예를 들어, 참조로 포함되는 미국 특허출원 공개 제US 2011/0223146호 참조). 혈액상 악성종양을 가진 대상체의 이러한 2가지 다른 구획에서 수득된 T 세포를 비교함으로써, 골수 흡인물로부터 수득된 골수 침윤성 림프구(MIL)의 올리고클론 제한이 관찰된다. 항-CD3/CD28 항체-접합 자성 비드를 포함하는 것과 같은 방법은 골수 세포를 시험관내 활성화시키고 증식시키는 데 사용되어, 활성화된 MIL을 생성할 수 있다. 활성화된 MIL은 검사된 모든 환자에서 말초 혈액 림프구에 비해 더 큰 증식과 향상된 종양 활성을 나타낸다. 이러한 발견은 다음을 시사한다: 1) 골수는 종양-특이적 T 세포의 저장소이고; 2) MIL은 (전이성 흑색종에서 관찰된 한정된 수에 비해) 연구된 모든 환자에서 활성화되고 증식될 수 있고; 3) 이러한 세포는 주입시 골수로 이동하고; 4) NOD/SCID 마우스에 입양 이식 후 최대 200일 동안 지속되고; 5) 활성화된 MIL은 사전-확립된 질환을 근절하고 골수종 줄기세포 전구체를 표적할 수 있으므로, 광범위한 항원 인식을 내포한다.
전체 골수 세포 집단의 소수를 나타내는 T-세포는 거의 완전한 골수의 존재하에 증식될 수 있다. 최대 종양-T 세포 접촉을 보장하기 위해, 흡인된 골수를 림프구 분리 미디엄(Lymphocyte Separation Medium) 밀도 구배에서 분획될 수 있으며 세포는 거의 적혈구 펠릿의 수준까지 수집될 수 있다. 이 분리 방법은 적혈구와 호중구만 실질적으로 제거하여 거의 완전한 골수를 제공하여, T 세포뿐만 아니라 종양 세포를 모두 수집한다. T-세포는 T-세포 특이적 분리 단계 및 종양 세포 분리 단계 없이 증식될 수 있다. 세포 종류 특이적 분리 단계는, 예를 들어, 항체 또는 다른 세포-종류 특이적 검출가능한 라벨을 사용한 세포 라벨링 및 형광 활성화 세포 분류(FACS)를 사용한 분류를 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 상기 라벨링 및 세포 분류 방법 없이 실행될 수 있다.
비드로 활성화하기 위해, 비드-T 세포 접촉은 바람직하게는 배양의 처음 24-48시간 동안 최대화된다. T-세포는 집단에서 전체 세포 중 소수만을 나타내므로, T-세포와 항체 코팅된 비드의 접촉은, 비드 대 세포가 약 1:1 내지 약 5:1, 바람직하게는 비드 대 세포가 약 2:1 내지 4:1, 보다 바람직하게는 비드 대 세포가 약 2.5:1 내지 3.5: 1의 범위의 충분한 수의 비드 대 세포를 사용하여 촉진된다. 이러한 비율은 개시된 비드에 적용가능하며, 비드의 크기 및/또는 비드상의 항체 밀도의 변화는 비드:세포 비율을 변경할 수 있다.
일부 실시양태에서, 세포 배양을 위한 디바이스가 활용될 수 있고, 이는 아주 근접한 중력에 의해 세포 및 비드의 수집을 촉진하기 위한 매끄럽고, 단단한 둥근 바닥 표면을 제공한다(예를 들어, 본원에 참조로 포함되는 미국 특허출원 공개 제US 2011/0223146호 참고). 상기 디바이스는 지지대 위에 놓이는 밀폐된 세포 용기를 포함한다. 비드의 존재하에 적어도 배양의 처음 3일 동안, 용기는 바람직하게는 비드와 세포 사이의 접촉을 보다 촉진하기 위해 고정된다(즉, 흔들림이나 회전이 없음). 이러한 단계 및 조건은 비드를 사용하여 종양-특이적 MIL의 증식을 최대화하는 데 바람직하여, 치료적으로 유용할 충분한 세포의 생산을 가능하게 한다. 또한, 이러한 배양 조건은 종양 세포의 성장을 촉진하지 않고 T 세포의 성장을 촉진한다.
MIL의 몇 가지 속성은 그들을 면역치료에 적합한 후보로 만든다. 구체적으로, 본원에 기재된 조건하에, 이들은 PBL보다 자극시 더 빠르게 증식되고, 활성화시 편향된 T-세포 레퍼토리를 유지하는 바, 어쩌면 이는 증대된 종양 특이성을 시사하는 것일 수 있다. 미활성화된 MIL이 자가유래 종양(autologous tumor)에 대하여 극심한 반응저하(hyporesponsiveness)를 나타내는 반면에, T 세포를 활성화시키고 증식하고 종양 반응성을 현저하게 향상시키는 능력은 이러한 배경에서 T-세포 무반응(unresponsiveness)을 매개하는 추정 메커니즘으로서 결실 내성에 대해 반박한다. 더욱이, 활성화된 MIL은 비악성 조혈 요소에 대하여 교차-반응이 거의 없는 종양 특이성을 나타내고, CXCR-4의 더 높은 발현을 가지며, SDF-I에 대한 더 큰 반응성을 가지고, 이는 골수에 대한 MIL의 증가된 이동(migratory) 능력을 시사한다. 종합하면, 이러한 발견은, 성숙한 말단 분화 형질 세포와 그 전구체 모두에 존재하는 광범위의 종양 항원을 표적하는 것으로 여겨지고, 입양 면역치료의 항종양 면역을 최대화하기 위해 필요할 기능인 - 골수 구획으로의 이동을 촉진하는 것으로 여겨지는 케모카인 수용체를 갖는, 기억/이펙터 표현형을 가진 골수-침윤성 T 세포를 활성화하고 증식하는 능력을 보여준다.
MIL의 활성 및 증식은 이전에 보고된 두 가지 현상에 기반되었다: 종양 침윤성-림프구의 향상된 종양 특이성(Rosenberg et al. Science 1986; 233 : 1318) 및 흑색종(Letsch et al. Cancer Res 2003;63:5582-6), 유방암(Feuerer et al. Nat Med 2001;7:452) 및 골수도 종양 미세환경을 나타내는 질환(Dhodapkar et al. Proc Natl Acad Sci U S A 2002;99:13009)인 - 다발성 골수종을 가진 환자의 골수에서 종양-반응성 T 세포의 실증.
본원은 MIL의 무반응을 극복하고 활성화된 PBL과 비교하여 종양 특이성을 현저하게 증가시키는 수단으로서 MIL을 활성화하고 증식하는 능력을 제공한다. 골수 미세환경에서 종양의 존재는 활성화된 MIL의 항원 특이성을 보존하는 데 중요한 역할을 할 수 있다. 몇 가지 가설이 활성화된 PBL에 비해 활성화된 MIL의 증가된 반응성을 설명할 수 있다. 메커니즘에 얽매이지 않고, 골수에서 항원의 지속성이 기억 반응의 유지에 필수적일 수 있음이 제안된다. 항-CD3/CD28 항체-코팅된 비드 활성화는 골수 T-세포 집단에서 내성을 역전시킬 수 있다. 유사하게는, 플레이트 결합 및/또는 가용성 CD3 및/또는 CD28이 활성화를 위해 사용될 수 있다. 다만, MIL을 활성화하는 수단은 특별히 한정되지 않고, 임의의 적합한 활성화 방법이 다양한 실시양태에서 사용될 수 있다. 본원에서 입증된 바와 같이, 활성화된 MIL의 종양 특이성은 T-세포 활성화 동안 항원의 존재에 의존적이었다. 또한, 골수는 위험 신호(감염, 염증, 자가면역 및 암)의 존재하에 반응성 림프여포를 통해 1차 면역 반응과 2차 반응을 모두 올릴 수 있는 기능성 림프 기관이다.
골수종 환자의 T 세포는 VB T-세포 수용체 레퍼토리의 상당한 편향(skewing)을 보인다. 이러한 편향은 현저한 종양 특이성을 갖는 T 세포의 선택적 생성(outgrowth) 또는 상당한 종양 부담을 가진 환자의 특징인 난해한 근본적 T 세포 결함의 결과를 시사한다. 후자의 경우, 항-CD3/CD28 항체-접합 자성 비드를 이용한 PBL의 다클론성 자극의 이점은 정상적인 T 세포 레퍼토리를 복원하여 임의의 근본적 T 세포 결함을 교정하는 능력이다. 대조적으로, 만약 특정 VB 패밀리의 올리고클론 발현이 종양 특이성을 갖는 T 세포의 존재를 반영한다면, 유지된 항종양 활성 및 T-세포 수용체 레퍼토리 편항을 갖는 이러한 T 세포 풀(pool)의 활성화 및 증식이 바람직할 수 있다. 본원에서 입증된 바와 같이, PBL은 항-CD3/CD28 항체-접합 자성 비드로 활성화 및 증식시 VB T-세포 레퍼토리를 정상화한 반면, MIL은 VB 제한을 유지하였다. 활성화된 MIL의 향상된 종양-특이적 반응을 고려할 때, 이들의 v편향된 T-세포 레퍼토리는 더 우수한 종양 인식을 시사할 수 있다. 메커니즘에 얽매이지 않고, T-세포 증식 동안에 VB 편향 정도를 보전하면서도, 가능하다면 증가시키는 것이 중요할 수 있다.
항-CD3/CD28 항체-접합 자성 비드로 MIL의 활성화 및 증식은 강한 항종양 활성을 발생시키고, 이러한 증식 동안 항원의 지속성은 종양 특이성을 유지(그리고 증강)하는 데 상당히 중요할 수 있다. 또한, Dhodapkar et al. (2002)은 골수종 환자에서 MIL의 역할을 연구하였다. 본 출원의 결과물과 유사하게, 새로 단리된 MIL 또는 PBL은 자가 종양 또는 종양 펩티드로 자극시 활성을 나타내지 않았다. 다만, 이 연구는, 종양-펄스(pulse) 처리된 수지상 세포와 함께 12 내지 16 일의 인큐베이션 후 효소-연결 면역점 검정에서 말초 혈액 및 골수 구획으로부터 수득된 T 세포들 간에는 유의미한 차이가 없음을 확인했고, 반면에 본 출원의 시스템에서는 검사된 모든 검정에서 활성화된 PBL에 비해 활성화된 MIL의 항종양 반응이 10배 더 크다는 것이 관찰되었다. 이러한 불일치한 결과는 MIL의 수지상 세포 활성화와 비교할 때 항-CD3/CD28 비드 자극의 효능과 관련이 있을 수 있다. 메커니즘에 얽매이지 않고, 활성화되고 증식된 MIL 배양에서 종양-반응성 T 세포의 빈도가 증가하는 것처럼 보이는 것은 종양-반응성 T 세포의 내성 파괴 및 기능 회복을 반영할 수 있다. 더욱이, 골수 미세환경 내에서 MIL의 자극은 이러한 결과를 설명할 수 있는 또 다른 중요한 인자이다.
음성 선택에 의한 MIL 집단의 농축(Enrichment)은 음성으로 선택된 세포에 고유한 표면 마커를 지향하는 항체의 조합으로 달성될 수 있다. 하나의 방법은 음성으로 선택된 세포에 존재하는 세포 표면 마커를 지향하는 단클론성 항체의 칵테일을 사용하는 음성 자성 면역부착(immunoadherence) 또는 유세포 분석을 통한 세포 분류 및/또는 선택이다. 예를 들어, 음성 선택에 의해 CD4+ 세포를 농축시키기 위해 단클론성 항체 칵테일은 전형적으로 CD14, CD20, CD11b, CD16, HLA-DR 및 CD8에 대한 항체를 포함한다.
양성 또는 음성 선택에 의해 원하는 세포 집단의 단리를 위해, 세포 및 표면(예를 들어, 비드와 같은 입자)의 농도가 달라질 수 있다. 특정 실시양태에서, 세포 및 비드의 최대 접촉을 보장하기 위해, 비드 및 세포가 함께 혼합되는 부피를 상당히 감소시키는 것이 바람직할 수 있다(즉, 세포의 농도 증가).
일부 실시양태에서, 더 낮은 농도의 세포를 사용하는 것이 바람직할 수 있다. MIL과 표면(예를 들어, 비드와 같은 입자)의 혼합물을 상당히 희석함으로써, 입자 및 세포 간의 상호작용이 최소화된다. 이것은 입자에 결합될 원하는 항원을 높은 양으로 발현하는 세포를 위해 선택된다.
또한, 본원은 본원에 기재된 바와 같은 증식된 세포가 필요할 수 있는 시기 이전 기간에 대상체로부터의 MIL을 포함하는 샘플의 수집을 제공한다. 따라서, 증식될 세포의 소스는 필요한 임의의 시점에 수집될 수 있고, MIL과 같은 원하는 세포는 단리되고 동결되어, 추후에, 본원에 기재된 것과 같은 MIL 요법으로부터 혜택을 받을 수 있을 많은 질환 또는 병태용으로 MIL 요법에 사용된다. 일부 실시양태에서, MIL을 포함하는 샘플은 일반적으로 건강한 대상체로부터 채취된다. 일부 실시양태에서, MIL을 포함하는 샘플은 질환이 발병할 위험이 있기는 하지만 질환이 아직 발병하지 않은 일반적으로 건강한 대상체로부터 채취하고, 관심 세포는 단리되고 동결되어 추후에 사용된다. 일부 실시양태에서, MIL은 증식되고, 동결되고 나중에 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 샘플은 본원에 기재된 바와 같은 특정 질환의 진단 직후이되 임의의 치료 전에 환자로부터 수집된다. 일부 실시양태에서, 세포는, 비제한적으로 제제(agent), 예컨대, 나탈리주맙, 에팔리주맙, 항바이러스제, 화학요법, 방사선, 면역억제제, 예컨대 사이클로스포린, 아자티오프린, 메토트렉세이트, 마이코페놀레이트 및 FK506, 항체, 또는 다른 면역억제제(immunoablative agent), 예컨대 CAMPATH, 항-CD3 항체, 사이톡산, 플루다라빈, 사이클로스포린, FK506, 라파마이신, 마이코페놀산(mycophenolic acid), 스테로이드, FR901228, 및 조사(irradiation)를 이용한 치료를 포함하여, 많은 관련 치료 양상 이전에, 대상체로부터 MIL을 포함하는 샘플로부터 단리된다. 이러한 약물은 칼슘 의존적 포스파타아제 칼시뉴린(사이클로스포린 및 FK506)을 억제하거나, 성장 인자 유도 신호전달(라파마이신)에 중요한 p70S6 키나아제를 억제한다. 일부 실시양태에서, 세포는 환자를 위해 단리되고, 화학요법제, 예컨대 플루다라빈, 외부-빔 방사선 요법(XRT), 사이클로포스파미드 또는 항체, 예컨대 OKT3 또는 CAMPATH를 사용하는 MIL 삭마 요법(ablative therapy), 골수 또는 줄기세포 이식과 함께(예를 들어, 사전에, 동시에 또는 후속하여), 추후에 사용하기 위해 동결된다. 일부 실시양태에서, 세포는 CD20과 반응하는 제제, 예를 들어, 리툭산과 같은 B-세포 삭마 요법 후 치료를 위해, 이전에 단리되고 추후 사용을 위해 동결될 수 있다.
일부 실시양태에서, MIL은 치료 직후 환자로부터 수득된다. 이와 관련하여, 특정 암 치료, 특히 면역계를 손상시키는 약물로 치료한 후, 환자가 정상적으로 치료에서 회복되는 기간 동안의 치료 직후에, 이들의 생체외 증식 능력을 위해 수득된 MIL의 품질이 최적이거나 개선될 수 있음이 관찰되었다. 마찬가지로, 본원에 기재된 방법을 사용한 생체외 조작 후, 이들 세포는 향상된 생착 및 생체내 증식을 위한 바람직한 상태에 있을 수 있다. 따라서 MIL은 이러한 회복 단계 중에 수집될 수 있다.
MIL은 미국 특허 제6,352,694호; 제6,534,055호; 제6,905,680호; 제6,692,964호; 제5,858,358호; 제6,887,466호; 제6,905,681호; 제7,144,575호; 제7,067,318호; 제7,172,869호; 제7,232,566호; 제7,175,843호; 제5,883,223호; 제6,905,874호; 제6,797,514호; 제6,867,041호; 및 미국 특허출원 공개 제20060121005호(본원에 참조로 포함됨)에 기재된 바와 같은 방법을 일반적으로 사용하여 활성화되고 증식될 수 있다.
일부 실시양태에서, MIL은 그것에 부착된, CD3/TCR 복합체 관련 신호를 자극하는 제제, 및 MIL 표면 상의 공동-자극 분자를 자극하는 리간드를 갖는 표면과의 접촉에 의해 증식된다. 특히, MIL 집단은 본원에 기재된 바와 같이, 예컨대 항-CD3 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 표면에 고정된 항-CD2 항체와의 접촉에 의해, 또는 칼슘 이온운반체(ionophore)와 함께 단백질 키나아제 C 활성화제(예를 들어, 브라이오스타틴(bryostatin))와의 접촉에 의해 자극될 수 있다. MIL 표면 상의 보조 분자의 공동-자극을 위해, 보조 분자를 결합하는 리간드가 사용된다. 예를 들어, MIL 집단은 MIL의 증식을 자극하기에 적절한 조건에서, 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체와 접촉될 수 있다. CD4+ MIL 또는 CD8+ MIL, 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체의 증식을 자극한다. 항-CD28 항체의 예는 9.3, B-T3, XR-CD28(프랑스 브장송 소재, 디아클론(Diaclone))을 포함하며, 당업계에 통상적으로 알려진 다른 방법으로 사용될 수 있다(Berg et al., Transplant Proc. 30(8):3975-3977, 1998; Haanen et al., J. Exp. Med. 190(9):13191328, 1999; Garland et al., J. Immunol Meth. 227(1-2):53-63, 1999).
특정 실시양태에서, MIL에 대한 1차 자극 신호 및 공동-자극 신호는 상이한 프로토콜에 의해 제공될 수 있다. 예를 들어, 각 신호를 제공하는 제제는 용액 중에 있거나 표면에 커플링될 수 있다. 표면에 커플링될 때, 제제는 동일 표면 (즉, "시스" 형태로) 또는 별개 표면(즉, "트랜스" 형태로)에 커플링될 수 있다. 대안적으로, 하나의 제제는 표면 및 용액 중 다른 제제에 커플링될 수 있다. 일부 실시양태에서, 공동-자극 신호를 제공하는 제제는 세포 표면에 결합되고, 1차 활성화 신호를 제공하는 제제는 용액 중에 있거나 표면에 커플링된다. 특정 실시양태에서, 두 제제는 용액 중에 있을 수 있다. 일부 실시양태에서, 제제는 가용성 형태일 수 있고, 이어서, 표면, 예컨대 Fc 수용체를 발현하는 세포 또는 항체 또는 다른 제제에 결합할 다른 결합제에 교차-연결될 수 있다(특히, MIL을 활성화하고 증식하는 데 사용하기 위해 고려되는 인공 항원 제시 세포(aAPC)에 대한, 본원에 참조로 포함되는, 미국 특허출원 공개 제20040101519호 및 제20060034810호를 전반적으로 참조).
일부 실시양태에서, 두 가지 제제는 동일 비드, 즉 "시스" 또는 별개 비드, 즉 "트랜스"인 비드 상에 고정된다. 예를 들어, 1차 활성화 신호를 제공하는 제제는 항-CD3 항체 또는 이의 항원-결합 단편이며, 공동-자극 신호를 제공하는 제제는 항-CD28 항체 또는 이의 항원-결합 단편이고; 두 제제 모두가 동일 분자량으로 동일 비드에 공동-고정된다. 일부 실시양태에서, CD4+ MIL 증식 및 MIL 성장을 위해 비드에 결합된 각 항체의 1:1의 비율이 사용된다. 일부 실시양태에서, 비드에 결합된 항 CD3:CD28 항체의 비율은 1:1의 비율을 사용하여 관찰되는 증식과 비교하여 MIL 증식 증가가 관찰되도록 사용된다. 일부 실시양태에서 1:1의 비율을 사용하여 관찰되는 증식과 비교해 약 1 내지 약 3배의 증가가 관찰된다. 일부 실시양태에서, 비드에 결합된 CD3:CD28 항체의 비율은 100:1 내지 1:100 및 그 사이의 모든 정수 값이다. 일부 실시양태에서, 항-CD3 항체보다 더 많은 항-CD28 항체가 입자에 결합되며, 즉, CD3:CD28의 비율은 1 미만이다. 일부 실시양태에서, 비드에 결합된 항 CD28 항체 대 항 CD3 항체의 비율은 2:1보다 크다. 일부 실시양태에서, 비드에 결합된 항체의 CD3:CD28 비율 1:100이 이용된다. 일부 실시양태에서, 비드에 결합된 항체의 CD3:CD28 비율 1:75가 이용된다. 일부 실시양태에서, 비드에 결합된 항체의 CD3:CD28 비율 1:50가 이용된다. 일부 실시양태에서, 비드에 결합된 항체의 CD3:CD28 비율 1:30이 이용된다. 일부 실시양태에서, 비드에 결합된 항체의 CD3:CD28 비율 1:10이 이용된다. 일부 실시양태에서, 비드에 결합된 항체의 CD3:CD28 비율 1:3 가 이용된다. 일부 실시양태에서, 비드에 결합된 항체의 CD3:CD28 비율 3:1이 이용된다.
1:500 내지 500:1 및 그 사이의 임의의 정수 값의 입자 대 세포의 비율을 이용하여 MIL을 자극할 수 있다. 당업자가 쉽게 이해할 수 있는 바와 같이, 입자 대 세포의 비율은 표적 세포에 대한 입자 크기에 의존할 수 있다. 예를 들어, 작은 크기의 비드는 몇 개의 세포만 결합할 수 있는 반면 더 큰 비드는 많이 결합할 수 있다. 특정 실시양태에서 세포 대 입자의 비율은 1:100 내지 100:1의 범위 및 그 사이의 임의의 정수 값이고, 추가 실시양태에서 비율은 1:9 내지 9:1 및 그 사이의 임의의 정수 값을 포함하고, MIL을 자극하기 위해 사용될 수도 있다. 항-CD3- 및 항-CD28-커플링 입자 대 MIL 자극을 초래하는 세포의 비율은 상술한 바와 같이 다양할 수 있지만, 특정 값은 비제한적으로, 1:100, 1:50, 1:40, 1:30, 1:20, 1:10, 1:9, 1:8, 1:7, 1:6, 1:5, 1:4, 1:3, 1:2, 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 10:1 및 15:1를 포함한다. 일부 실시양태에서, 비율은 세포 당 적어도 1:1 입자이다. 일부 실시양태에서, 1:1 이하의 입자 대 세포 비율이 이용된다. 일부 실시양태에서, 입자:세포 비율은 1:5이다. 일부 실시양태에서, 입자 대 세포의 비율은 자극 일수에 따라 달라질 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 입자 대 세포의 비율은 첫째 날에 1:1 내지 1:10이고, 그 후 추가 입자가 최대 10일 동안, 매일마다 또는 격일마다 최종 비율 1:1 내지 1:10로 세포에 추가된다. 일부 실시양태에서, 입자 대 세포의 비율은 자극 첫째 날에 1:1이고, 자극의 셋째 날과 다섯째 날에 1:5로 조정된다. 일부 실시양태에서, 입자는 자극의 첫째 날에 1:1 및 자극의 셋째 날 및 다섯째 날에 1:5의 최종 비율에 기반하여 매일 또는 격일로 첨가된다. 일부 실시양태에서, 입자 대 세포의 비율은 자극 첫째 날에 2:1이고 자극의 셋째 날 및 다섯째 날에 1:10으로 조정된다. 일부 실시양태에서, 입자는 자극의 첫째 날에 1:1 및 자극의 셋째 날 및 다섯째 날에 1:10의 최종 비율에 기반하여 매일 또는 격일로 첨가된다. 당업자는 다양한 다른 비율이 또한 사용될 수 있음을 이해할 것이다. 예를 들어 비율은 입자 크기와 세포 크기 및 종류에 따라 달라질 것이다.
일부 실시양태에서, MIL은 제제-코팅된 비드와 조합되고, 비드 및 세포는 연속적으로 분리되고, 그 후 세포가 배양된다. 일부 실시양태에서, 배양 전에 제제-코팅된 비드 및 세포는 분리되지 않지만 함께 배양된다. 일부 실시양태에서, 비드 및 세포는 먼저 자력과 같은 힘의 인가에 의해 농축되어 세포 표면 마커의 결찰을 증가시켜 세포 자극을 유도한다.
예를 들어, 세포 표면 단백질은 항-CD3 및 항-CD28이 부착된 상자성(paramagnetic) 비드(3x28 비드)가 MIL과 접촉하도록 함으로써 결찰될 수 있다. 일부 실시양태에서 세포 및 비드(예를 들어, 1:1 비율의 다이나비드(DYNABEADS)® M-450 CD3/CD28 T 상자성 비드)는 완충액, 바람직하게는 PBS(칼슘 및 마그네슘과 같은 2가 양이온 없음)에서 조합된다. 당업자는 임의의 세포 농도가 이용될 수 있음을 쉽게 이해할 수 있다. 예를 들어, 표적 세포는 샘플에서 매우 희귀할 수 있고 단지 0.01%의 샘플만을 포함하거나 전체 샘플(즉, 100%)이 관심 표적 세포를 포함할 수 있다. 따라서, 임의의 세포 개수가 사용될 수 있다. 특정 실시양태에서, 세포 및 입자의 최대 접촉을 보장하기 위해 입자 및 세포가 함께 혼합되는 부피를 상당히 감소시키는 것이 바람직할 수 있다(즉, 세포의 농도 증가). 예를 들어, 일부 실시양태에서, 약 20 억개 세포/ml의 농도가 이용된다. 일부 실시양태에서, 1 억개 초과 세포/ml가 이용된다. 일부 실시양태에서, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 또는 5000 만개 세포/ml의 세포 농도가 이용된다. 일부 실시양태에서, 7500, 8000, 8500, 9000, 9500 또는 1 억개 세포/ml의 세포 농도가 이용된다. 일부 실시양태에서, 1.25 또는 1.50 억개 세포/ml의 농도가 이용될 수 있다. 고농도를 이용하면 세포 수율, 세포 활성화 및 세포 증식이 증가할 수 있다. 또한, 고농도의 세포 사용은, CD28-음성 세포와 같은 관심 표적 항원을 약하게 발현시킬 수 있는 세포의 더 효율적인 포획을 가능하게 한다. 이러한 세포 집단은 치료적 가치를 가질 수 있고 특정 실시양태에서 수득되는 것이 바람직할 것이다.
일부 실시양태에서, 혼합물은 수 시간(약 3시간) 내지 약 14일 동안 또는 그 사이의 임의의 시간상 정수 값 동안 배양될 수 있다. 일부 실시양태에서, 혼합물은 21일 동안 배양될 수 있다. 일부 실시양태에서 비드 및 MIL은 약 8일 동안 함께 배양된다. 일부 실시양태에서, 비드 및 MIL은 2-3일 동안 함께 배양된다. 또한 MIL의 배양 시간이 60일 이상일 수 있도록 몇 가지 자극 사이클이 요망될 수 있다. MIL 배양에 적합한 조건은, 혈청(예를 들어, 소 태아 또는 인간 혈청), 인터루킨-2(IL-2), 인슐린, IFN-γ, IL-4, IL-7, GM-CSF, IL-10, IL-12, IL-15, TGFβ, 및 TNF-α 또는 또는 당업자에게 알려진 세포 성장용 다른 첨가제를 포함한, 증식 및 생존력에 필요한 인자를 함유할 수 있는 적절한 배지(예를 들어, 최소 필수 배지(Minimal Essential Media) 또는 RPMI 배지 1640 또는 X-비보 15(X-vivo 15), (론자(Lonza)))를 포함한다. 세포의 성장을 위한 다른 첨가제는, 비제한적으로, 계면활성제, 플라스마네이트(plasmanate) 및 환원제, 예컨대 N-아세틸-시스테인 및 2-머캅토에탄올을 포함한다. 배지는, 아미노산, 피루브산 나트륨 및 비타민의 무혈청 첨가 또는 적절한 양의 혈청(또는 혈장) 또는 정의된 호르몬 세트 및/또는 MIL의 성장과 증식에 충분한 양의 사이토카인(들)으로 보충된, RPMI 1640, AIM-V, DMEM, MEM, α-MEM, F-12, X-비보 15 및 X-비보 20, 옵티마이저(Optimizer)를 포함할 수 있다. 항생제, 예를 들어, 페니실린 및 스트렙토마이신은 대상체에게 주입될 세포의 배양이 아니라, 실험적인 배양에만 포함된다. 표적 세포는 성장을 지원하는 데 필요한 조건, 예를 들어 적절한 온도(예를 들어, 37℃) 및 분위기(예를 들어, 공기 및 5%의 CO2)에서 유지된다.
CD4 및 CD8 마커 외에도 다른 표현형 마커는 상당히 다르지만, 대부분 세포 증식 프로세스 과정 중에 재현가능하게 다르다. 따라서 이러한 재현성은 활성화된 MIL 생성물을 특정 목적에 맞게 조정할 수 있는 능력을 가능하게 한다.
추가적으로, 종양 침윤성 림프구를 제조하는 방법을 사용하여 MIL을 제조할 수 있다. 예를 들어, 고용량의 IL-2 성장 조건을 사용하여 "신생의" TIL을 생성할 수 있으며, 이러한 방법은 MIL을 제조하는 데 적용할 수 있다(예를 들어, 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 제8,383,099호 참조).
일부 실시양태에서, 또한 MIL은 저산소 조건에서 활성화되고/되거나 증식될 수 있다. 저산소 조건에서 MIL을 성장시키는 예는, 예를 들어 제WO2016037054호에서 확인할 수 있으며, 이는 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
일부 실시양태에서, 방법은 대상체로부터의 골수, 림프구 및/또는 골수 침윤성 림프구("MIL")에서 세포를 제거하는 것; 저산소 환경에서 세포를 인큐베이션하여 활성화된 MIL을 생성하는 것; 및 활성화된 MIL을 대상체에게 투여하는 것을 포함할 수 있다. 세포는 또한 본원에 기재된 항-CD3/항-CD28 항체 및 사이토카인의 존재하에 활성화될 수 있다. 또한, 사이토카인을 사용하여 본원에 기재된 바와 같은 MIL을 활성화할 수 있다. CAR을 인코딩하는 핵산 분자, 예컨대 본원에 기재된 것들 중 하나는 MIL이 저산소 환경에서 인큐베이션되기 전 또는 후에 세포 내로 형질감염되거나 감염될 수 있다.
저산소 환경은 약 7% 미만의 산소, 예컨대 약 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 또는 1% 미만의 산소를 포함할 수 있다. 예를 들어, 저산소 환경은 약 0% 산소 내지 약 7% 산소, 예컨대 약 0% 산소 내지 약 6% 산소, 약 0% 산소 내지 약 3% 산소, 약 0% 산소 내지 약 2% 산소, 약 0% 산소 내지 약 1% 산소를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 저산소 환경은 약 1% 내지 약 7% 산소를 포함한다. 일부 실시양태에서, 저산소 환경은 약 1% 내지 약 5%의 산소이다. 일부 실시양태에서, 저산소 환경은 약 0.5% 내지 약 1.5%의 산소이다. 일부 실시양태에서, 저산소 환경은 약 0.5% 내지 약 2%의 산소이다. 저산소 환경은 약 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 또는 약 0% 산소 및 이러한 양의 사이에 있는 이들의 분수 전체를 포함할 수 있다.
저산소 환경에서 MIL을 인큐베이션하는 것은 MIL을 예를 들어, 조직 배양 배지에서 적어도 약 1시간, 예컨대 적어도 약 12시간, 18시간, 24시간, 30시간, 36시간, 42시간, 48시간, 60시간, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 13일, 또는 심지어 적어도 약 14일 동안 인큐베이션하는 것을 포함할 수 있다. 배양은 MIL을 약 1시간 내지 약 30일, 예컨대 1일 내지 약 20일, 약 1일 내지 약 14일, 또는 약 1일 내지 약 12일 동안 인큐베이션하는 것을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 저산소 환경에서 MIL을 인큐베이션하는 것은 MIL을 저산소 환경에서 약 2일 내지 약 5일 동안 인큐베이션하는 것을 포함한다. 방법은 MIL을 저산소 환경에서 약 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 13일 또는 14일 동안 인큐베이션하는 것을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 방법은 MIL을 저산소 환경에서 약 3일 동안 인큐베이션하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 MIL을 저산소 환경에서 약 2일 내지 약 4일 동안 인큐베이션하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 MIL을 저산소 환경에서 약 3일 내지 약 4일 동안 인큐베이션하는 것을 포함한다.
일부 실시양태에서, 방법은 예를 들어, 저산소 환경에서 MIL을 인큐베이션한 후에, MIL을 정상산소 환경에서 인큐베이션하는 것을 더 포함한다.
정상산소 환경은 적어도 약 7%의 산소일 수 있다. 정상산소 환경은 약 8% 산소 내지 약 30% 산소, 약 10% 산소 내지 약 30% 산소, 약 15% 산소 내지 약 25% 산소, 약 18% 산소 내지 약 24% 산소, 약 19% 산소 내지 약 23% 산소, 또는 약 20% 산소 내지 약 22% 산소일 수 있다. 일부 실시양태에서, 정상산소 환경은 약 21%의 산소일 수 있다.
정상산소 환경에서 MIL을 인큐베이션하는 것은, MIL을, 예를 들어, 조직 배양 배지에서, 적어도 약 1시간, 예컨대, 적어도 약 12시간, 18시간, 24시간, 30시간, 36시간, 42시간, 48시간, 60시간, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 13일, 또는 심지어 적어도 약 14일 동안 인큐베이션하는 것을 포함할 수 있다. 배양은 MIL을 약 1시간 내지 약 30일, 예컨대 약 1일 내지 약 20일, 약 1일 내지 약 14일, 약 1일 내지 약 12일, 또는 약 2일 내지 약 12일 동안 인큐베이션하는 것을 포함할 수 있다.
특정 실시양태에서, 재조합 키메라 항원 수용체("CAR")를 발현하는 MIL이 제공된다. MIL은 증식 및 활성화 전, 도중 또는 후에 CAR을 발현하도록 변형될 수 있다. 특정 실시양태에서, CAR은 BCMA, PSMA, CD19 또는 CD38을 표적 수용체로 포함한다. 특정 양태에서, 실시양태는 재조합 MIL을 제조하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 MIL을 포함하는 골수를 수득하는 단계; 및 키메라 항원 수용체를 인코딩하는 핵산으로 MIL을 형질감염, 형질변환 또는 형질도입하는 단계를 포함한다. 추가적인 양태에서, 실시양태는 대상체에게 CAR을 포함하는 재조합 MIL을 치료적 유효량으로 투여함으로써, 대상체에서 병태를 치료하는 방법에 관한 것이다.
일부 실시양태에서, MIL 및/또는 말초 혈액 림프구(PBL)는 본원에 기재된 방법을 사용하여, 환자 골수 및 혈액 샘플로부터 각각 활성화 및 증식될 수 있다. T 세포 표현형 마커(CD3, CD4 및 CD8)는 증식 전, 후의 유세포 분석을 특징으로 할 것이다. 활성화 방법은 미국 공개 번호 제20180200367호, 제20180185434호, 제20170266232호, 제20170258838호, 제20160331781호, 제20150320798호, 제20110223146호 및 제20140255433호에 기재된 것을 포함하여, 당업계에 알려져 있고, 이들 각각은 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
일부 실시양태에서, 종양-특이적 T 세포는 기능적 검정을 이용하여 증식된 MIL 및/또는 PBL에서 정량화될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 자가유래 항원-제시 세포(APC)는 선택된 암 세포주로부터의 용해물로 펄스 처리되고 CFSE-라벨링된 MIL 또는 PBL과 함께 공동-배양될 수 있다. 배지 단독 또는 선택된 세포주 용해물로 펄스 처리된 APC는 음성 대조군으로 사용될 수 있다. 종양-특이적 세포는 예를 들어, IFNγ-생성 CFSE-낮음, CD3+ 집단으로 정의될 수 있다.
본원에 기재된 CAR-변형된 MIL 세포는 포유동물에서 생체외 면역화 및/또는 생체내 요법을 위한 백신의 일종으로 작용할 수 있다. 포유동물은 인간일 수 있다.
생체외 면역화와 관련하여, 세포를 포유동물에 투여하기 전에 시험관내에서 다음 중 적어도 하나가 발생한다: i) 세포의 증식, ii) CAR을 인코딩하는 핵산을 세포에 도입 및/또는 iii) 세포의 동결보존(cryopreservation).
생체외 절차는 당업계에 잘 알려져 있으며 이하에서 보다 충분히 논의된다. 간략하게는, 세포를 인간과 같은 포유동물로부터 단리하고, 유전적으로 변형된, 즉, 본원에 기재된 바와 같이 CAR을 발현하는 벡터로, 시험관내 형질도입 또는 형질감염시킨다. CAR-변형된 세포는 포유류 수용자에게 투여되어 치료적 이점을 제공할 수 있다. 포유류 수용자는 인간일 수 있고, CAR-변형된 세포는 수용자에 대해 자가유래된 것일 수 있다. 대안적으로, 세포는 수용자에 대해 동종유래, 동계(syngeneic) 또는 이종발생된 것일 수 있다.
일부 실시양태에서, 세포는, 정상산소 환경에 위치된 후 또는 정상산소 환경에 위치되기 전에, 본원에 기재된 CAR을 인코딩하는 핵산 분자로 형질감염 또는 감염된다.
일부 실시양태에서, 골수 샘플은 골수 침습(bone marrow involvement)의 양이 다양한 선택 암 환자로부터 수집된다. 또한, 환자의 서브세트로부터 매치된 말초 혈액은 골수 흡인 시에 수집될 것이다. 일부 실시양태에서, 골수 샘플은 적혈구를 제거하기 위해 원심분리된다. 일부 실시양태에서, 골수 샘플은 성분채집(apheresis)되거나 이에 의해 수득되지 않는다. 일부 실시양태에서, 골수 샘플은 말초 혈액 림프구("PBL")를 포함하지 않거나 골수 샘플은 PBL이 실질적으로 없다. MIL은 예를 들어 미국 공개 제20180200367호, 제20180185434호, 제20170266232호, 제20170258838호, 제20160331781호, 제20150320798호, 제20110223146호 및 제20140255433호에 기재된 절차에 따라 단리될 수 있으며, 이들 각각은 그 전체가 본원에 참조로 포함된다. 이러한 방법은 TIL로 알려지게 된 것과 동일하지 않은 세포를 위해 선택한다. 따라서, MIL은 TIL이 아니다.
일부 실시양태에서, 그 후, 세포는 플레이트, 플라스크 또는 백에 플레이팅될 수 있다. 일부 실시양태에서, 저산소 조건은 저산소 챔버 또는 세포 배양 백을 95%의 질소와 5%의 CO2 가스 혼합물로 3분 동안 플러싱함으로써 달성될 수 있다. 이는, 예를 들어, 용기 내에 1-2% 이하의 O2 가스를 야기할 수 있다. 그 후, 세포는 본원에 기재된 바와 같이 배양되거나 본원에 참조로 포함되는 제WO2016037054호의 실시예에서와 같이 배양될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 CAR을 포함하는 저산소 MIL이 제공된다. 일부 실시양태에서, 저산소 MIL은 약 0.5% 내지 약 5%의 산소 가스의 환경에 있다. 일부 실시양태에서, 저산소 MIL은 약1% 내지 약 2%의 산소 가스의 환경에 있다. 일부 실시양태에서, 저산소 MIL은 약1% 내지 약 3%의 산소 가스의 환경에 있다. 일부 실시양태에서, 저산소 MIL은 약1% 내지 약 4%의 산소 가스의 환경에 있다. 저산소 MIL은 본원에 기재된 것과 같은 저산소 환경에서, 본원에 기재된 것과 같은 시간 주기 동안 인큐베이션된 MIL이다. 또한, 본원에 기재된 바와 같이, 저산소 MIL은 항-CD3/항-CD28 비드 또는 다른 유사한 활성화 시약의 존재하에 활성화될 수 있다. 따라서, CAR을 포함하는 저산소 MIL은 활성화된-저산소 MIL일 수 있다.
세포(또는 모세포)는 CAR을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터로 형질감염, 형질변환 또는 형질도입될 수 있다. 벡터는 렌티바이러스 벡터(LV)일 수 있다. 예를 들어, LV는 특이적 항체의 항원 인식 도메인을 CD3ζ, CD28, 4-1BB 또는 이들의 임의의 조합의 세포내 도메인과 조합하는 CAR을 인코딩한다. 따라서, 일부 예에서, 형질도입된 MIL은 CAR-매개 T-세포 반응을 이끌어 낼 수 있다.
CAR을 옮기는 벡터는 일반적인 형질감염 방법에 의해 MIL 내로 형질감염된다. MIL 내로 감염되거나 형질감염될 수 있는 한, 모든 바이러스 벡터가 사용될 수 있다. 형질감염, 형질변환 또는 형질도입은 MIL의 증식/활성화에 관하여 0일 차 또는 1일 차, 2일 차, 3일 차, 4일 차, 5일 차, 6일 차 또는 7일 차에 이루어질 수 있다. 증식 후 10일 차 내지 14일 차에, MIL은 CAR을 발현한다. 이러한 MIL은 CD3 양성이고 IFNγ를 발현한다. 또한, 활성화된 MIL은 활성화 방법에 따라 상이한 비율로 CD4 및 CD8을 발현한다.
MIL은 증식/활성화 후 7일 차, 8일 차, 9일 차, 10일 차, 11일 차, 12일 차, 13일 차 또는 14일 차에 수확된다. 활성화 및 수확된 MIL은 세척되고, 계수되고, CD3, CD4, CD8 및 GFP을 위해 표현형화될 수 있다. 이들은 추후 사용을 위해 앨리쿼트화(aliquoted)되고 동결될 수 있다.
VII. 치료 방법
본원은 1차 MIL의 특이성을 종양 항원에 전용시키기 위한 CAR의 용도를 제공한다. 따라서, 일부 실시양태에서, CAR을 발현하는 MIL을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 포유동물에서 표적 세포 집단 또는 조직에 대한 MIL-매개된 면역반응을 자극시키기 위한 방법이 제공되고, 여기서 CAR은, 소정의 표적과 특이적으로 상호작용하는 결합 모이어티, 예를 들어 인간 CD3ζ의 세포내 도메인을 포함하는 ζ 사슬 부분 및 공동자극 신호전달 영역을 포함한다.
일부 실시양태에서, MIL을 유전적으로 변형하여 CAR을 발현하고, 이를 필요로 하는 수용자에게 CAR-MIL을 주입하는 세포 요법(cellular therapy)이 제공된다. 주입된 세포는 수용자에서 종양 세포(또는 다른 표적)를 사멸시킬 수 있다. 항체 요법과 달리, CAR-MIL은 생체내에서 복제할 수 있어 지속적 종양 조절로 이어질 수 있는 장기 지속성을 초래한다.
일부 실시양태에서, CAR-MIL은 왕성한 생체내 MIL 증식을 겪을 수 있고 연장된 시간량 동안 지속될 수 있다.
치료될 수 있는 암은 혈관생성되지 않거나 실질적으로 아직 혈관생성되지 않은 종양뿐만 아니라 혈관생성된 종양을 포함한다. 암은 비-고형 종양(예컨대, 혈액상 종양, 예를 들어 백혈병 및 림프종)을 포함하거나, 고형 종양일 수 있다. CAR로 치료될 암의 종류는 비제한적으로, 암종, 모세포종 및 육종 및 특정 백혈병 또는 악성 림프종, 양성 및 악성인 종양, 및 악성종양 예를 들어, 육종, 암종 및 흑색종을 포함한다. 또한 성인 종양/암 및 소아 종양/암이 포함된다.
혈액 암은 혈액 또는 골수의 암이다. 혈액상(또는 혈행성(hematogenous)) 암의 예는 백혈병을 포함하고, 이는 급성 백혈병(예컨대, 급성 림프구성 백혈병, 급성 림프모구성 백혈병("ALL"), 급성 골수세포 백혈병, 급성 골수 백혈병 및 골수모세포성, 전골수성, 골수단핵구성, 단핵구성 및 적백혈병), 만성 백혈병(예컨대, 만성 골수세포(과립구) 백혈병, 만성 골수성 백혈병 및 만성 림프구성 백혈병), 진성 적혈구증가증(polycythemia vera), 림프종, 호지킨병, 비호지킨 림프종(무통성 및 고등급 형태), 다발성 골수종, 발덴스트롬 마크로글로불린혈증(Waldenstrom's macroglobulinemia), 중쇄병, 골수이형성증후군, 모발상세포 백혈병 및 골수형성이상증을 포함한다.
고형 종양은 대개 낭포 또는 액체 영역을 함유하지 않는 비정상 종양 덩어리이다. 고형 종양은 양성 또는 악성일 수 있다. 상이한 종류의 고형 종양은 이를 형성하는 세포 종류에 따라 명명된다(예컨대, 육종, 암종 및 림프종). 육종 및 암종과 같은 고형 종양의 예는, 섬유육종, 점액육종, 지방육종, 연골육종, 골육종 및 다른 육종, 활막종, 중피종, 유잉 종양(Ewing's tumor), 평활근육종, 횡문근육종, 결장 암종, 악성 림프종, 췌장암, 유방암, 폐암, 난소암, 전립선암, 간세포암종, 편평세포암종, 기저세포암종, 선암종(adenocarcinoma), 한선암종(sweat gland carcinoma), 갑상선수질암종(medullary thyroid carcinoma), 갑상선유두암종(papillary thyroid carcinoma), 크롬친화성세포종 피지선암종(pheochromocytomas sebaceous gland carcinoma), 유두암종(papillary carcinoma), 유두 선암종(papillary adenocarcinomas), 수질 암종, 기관지 암종, 신장세포 암종, 간세포암, 담관 암종, 융모막암종, 윌름스 종양(Wilms' tumor), 자궁경부암, 고환암, 정상피종, 방광 암종, 흑색종 및 CNS 종양(예컨대 신경교종(예컨대 뇌줄기 신경교종 및 혼합 신경교종), 교모세포종(다형성 교모세포종(glioblastoma multiforme)으로도 알려짐) 별아교세포종, CNS 림프종, 배아세포종, 수모세포종, 신경초종 두개인두종, 상의세포종(ependymoma), 송과체종, 혈관모세포종, 속귀신경집종(acoustic neuroma), 핍지교종, 메난지오마(menangioma), 신경모세포종, 망막모세포종 및 뇌 전이)을 포함한다.
일부 실시양태에서, CAR의 항원 결합 모이어티 일부는 특정 암을 치료하기 위해 디자인된다. 예를 들어, CD19를 표적하기 위해 디자인된 CAR은, 비제한적으로, 전구-B 급성 림프모구성 백혈병("ALL")(소아 적응증), 성인 ALL, 외투 세포 림프종, 미만성 거대 B-세포 림프종, 동종 골수이식 후 구제(salvage) 등을 포함하는 암 또는 장애를 치료하는 데 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, CAR은 CD22를 표적하도록 디자인되어, 미만성 거대 B-세포 림프종을 치료할 수 있다.
일부 실시양태에서, 암 및 장애는 비제한적으로, CD19, CD20, CD22, 및 ROR1을 표적으로 하는 CAR의 조합을 사용하여 치료될 수 있는 전구-B ALL(소아 징후), 성인 ALL, 외투 세포 림프종, 미만성 거대 B-세포 림프종, 동종 골수이식 후 구제 등을 포함한다.
일부 실시양태에서, CAR은 메소텔린을 표적하도록 디자인되어, 중피종, 췌장암, 난소암 등을 치료할 수 있다.
일부 실시양태에서, CAR은 CD33/IL3Ra을 표적하도록 디자인되어 급성 골수성 백혈병 등을 치료할 수 있다.
일부 실시양태에서, CAR은 c-Met을 표적하도록 디자인되어 삼중 음성 유방암, 비소세포폐암 등을 치료할 수 있다.
일부 실시양태에서, CAR은 PSMA를 표적하도록 디자인되어 전립선암 등을 치료할 수 있다.
일부 실시양태에서, CAR은 당지질 F77을 표적하도록 디자인되어 전립선암 등을 치료할 수 있다.
일부 실시양태에서, CAR은 EGFRvIII를 표적하도록 디자인되어 교모세포종 등을 치료할 수 있다.
일부 실시양태에서, CAR은 GD-2를 표적하도록 디자인되어 신경모세포종, 흑색종 등을 치료할 수 있다.
일부 실시양태에서, CAR은 NY-ESO-1 TCR을 표적하도록 디자인되어 골수종, 육종, 흑색종 등을 치료할 수 있다.
일부 실시양태에서, CAR은 MAGE A3 TCR을 표적하도록 디자인되어 골수종, 육종, 흑색종 등을 치료할 수 있다.
그러나, 실시양태는 본원에 개시된 항원 표적 및 질환으로만 한정되는 것으로 해석되어서는 안된다. 오히려, 실시양태는 질환을 치료하기 위해 CAR이 사용될 수 있는 질환과 관련된 임의의 항원 표적을 포함하는 것으로 해석되어야 한다.
또한, CAR-변형된 MIL은 인간과 같은 대상체에서 생체외 면역화 및/또는 생체내 치료를 위한 일종의 백신으로 작용할 수 있다.
생체외 면역화와 관련하여, 세포를 포유동물에 투여하기 전에 시험관내에서 다음 중 적어도 하나가 발생한다: i) 세포의 증식, ii) CAR을 인코딩하는 핵산을 세포에 도입, 및/또는 iii) 세포의 동결 보존. 일부실시양태에서, 모든 단계는 세포를 포유동물에 투여하기 전에 수행된다.
생체외 절차는 당업계에 잘 알려져 있으며 이하에서 보다 충분히 논의된다. 간략하게는, 세포를 포유동물(예컨대, 인간)로부터 단리하고, 본원에 기재된 CAR을 발현하는 벡터로, 유전적으로 변형시킨다(즉, 시험관내 형질도입 또는 형질감염). CAR-MIL은 포유류 수용자에게 투여되어 치료적 이점을 제공할 수 있다. 포유류 수용자는 인간일 수 있고, CAR-MIL은 수용자에 대해 자가유래된 것일 수 있다. 대안적으로, 세포는 수용자에 대해 동종유래, 동계 또는 이종발생된 것일 수 있다.
생체외 면역화의 측면에서 세포-기반 백신을 사용하는 것 외에도, 본원은 환자 내 항원에 대해 지시되는 면역 반응을 이끌어 내기 위한 생체내 면역화용 조성물 및 방법을 제공한다.
일반적으로, 본원에 기재된 바와 같이 활성화되고 증식된 세포는 면역손상된 개체에서 발생하는 질환의 치료 및 예방에 활용될 수 있다. 일부 실시양태에서, CAR-변형된 MIL은 CCL의 치료에 사용된다. 일부 실시양태에서, 세포는 CCL 발병에 대한 위험이 있는 환자의 치료에 사용된다. 따라서, 치료적 유효량의 CAR-변형된 MIL을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 CCL의 치료 또는 예방을 위한 방법이 제공된다.
CAR-변형된 MIL은 단독으로 또는 약학 조성물로서 희석제 및/또는 다른 성분, 예컨대 IL-2 또는 다른 사이토카인 또는 세포 집단과 조합되어 투여될 수 있다. 간략하게는, 약학 조성물은 하나 이상의 약학적 또는 생리학적으로 허용가능한 담체, 희석제 또는 부형제와 조합되어, 본원에 기재된 바와 같은 표적 세포 집단을 포함할 수 있다. 상기 조성물은 완충액, 예컨대 중성 완충 식염수, 인산염 완충 식염수 등; 탄수화물, 예컨대 포도당, 만노스, 수크로스 또는 덱스트란, 만니톨; 단백질; 폴리펩티드 또는 아미노산, 예컨대 글리신; 항산화제; 킬레이트제, 예컨대 EDTA 또는 글루타티온; 보조제(예를 들어, 수산화알루미늄); 및 방부제를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 조성물은 정맥내 투여를 위해 제형화될 수 있다.
약학 조성물은 치료(또는 예방)될 질환에 적합한 방식으로 투여될 수 있다. 적절한 투여량은 임상 시험에 의해 결정될 수 있지만, 투여의 양 및 빈도는 환자의 상태, 환자의 질환의 종류와 중증도와 같은 인자에 의해 결정될 것이다.
"면역학적 유효량", "항-종양 유효량", "종양-억제 유효량" 또는 "치료량"이 표시될 때, 투여될 조성물의 정확한 양은, 연령, 체중, 종양 크기, 감염 또는 전이 정도, 환자(대상체)의 상태의 개인차를 고려하여 의사에 의해 결정될 수 있다. 일반적으로, 본원에 기재된 MIL을 포함하는 약학 조성물은 104 내지 109 세포/kg 체중, 바람직하게는 105 내지 106 세포/kg 체중의 투여량으로 투여될 수 있고, 이들 범위 내의 모든 정수 값을 포함할 수 있다. MIL 조성물은 또한 이러한 투여량으로 다회 투여될 수 있다. 세포는 면역치료에서 일반적으로 알려진 주입 기술을 이용하여 투여될 수 있다(예를 들어, Rosenberg et al., New Eng. J. of Med. 319:1676, 1988참조). 특정 환자에 대한 최적의 투여량 및 치료 요법은 질환의 징후에 대해 환자를 모니터링하고 이에 따라 치료를 조정함으로써, 의학 분야에 숙련된 자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
대상 조성물의 투여는 에어로졸 흡입, 주사, 섭취, 수혈, 피하주입(implantation) 또는 이식을 포함하는 임의의 편리한 방식으로 수행될 수 있다. 본원에 기재된 조성물은 환자에게, 피하, 피부내, 종양내, 비강내, 골수내, 근육내, 정맥내(i.v.) 주사 또는 복강내로 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, MIL 조성물은 피부내 또는 피하 주사에 의해 환자에게 투여된다. 일부 실시양태에서, MIL 조성물은 정맥내 주사에 의해 투여된다. MIL의 조성물은, 예를 들어, 종양, 림프절 또는 감염 부위에 직접 주사될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법 또는 MIL이 치료적 수준으로 증식되는 당업계에 알려진 다른 방법을 사용하여 활성화되고 증식된 세포는, 비제한적으로, 제제를 이용한 치료, 예컨대 항바이러스 치료제, 시도포비어(cidofovir) 및 인터루킨-2, 시타라빈(Cytarabine)(ARA-C로도 알려짐) 또는 MS 환자를 위한 나탈리주맙 치료 또는 건선 환자를 위한 에팔리주맙 치료 또는 PML 환자를 위한 다른 치료를 포함하여, 많은 관련 치료 양상과 함께(예를 들어, 전에, 동시에 또는 후에) 환자에게 투여된다. 일부 실시양태에서, MIL은 화학요법, 방사선, 면역억제제, 예컨대 사이클로스포린, 아자티오프린, 메토트렉세이트, 마이코페놀레이트 및 FK506, 항체 또는 다른 면역 제거제, 예컨대 CAM PATH, 항-CD3 항체 또는 다른 항체 요법, 사이톡신(cytoxin), 플루다리빈, 사이클로스포린, FK506, 라파마이신, 마이코페놀산, 스테로이드, FR901228, 사이토카인 및 조사와 조합되어 사용될 수 있다. 이러한 약물은 칼슘 의존적 포스파타아제 칼시뉴린(사이클로스포린 및 FK506)을 억제하거나, 성장 인자 유도 신호전달(라파마이신)에 중요한 p70S6 키나아제를 억제한다(Liu et al., Cell 66:807-815, 1991; Henderson et al., Immun 73:316-321, 1991; Bierer et al., Curr. Opin. Immun 5:763-773, 1993). 일부 실시양태에서, 세포 조성물은 화학요법제, 예컨대 플루다라빈, 외부-빔 방사선 요법(XRT), 사이클로포스파미드 또는 항체, 예컨대 OKT3 또는 CAMPATH를 사용하는 MIL 삭마 요법, 골수 이식과 함께(예를 들어, 전에, 동시에 또는 후속하여) 환자에게 투여된다. 일부 실시양태에서, 세포 조성물은 CD20과 반응하는 제제, 예를 들어 리툭산과 같은 B-세포 삭마 요법 후 투여된다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 대상체는 고용량 화학요법으로 표준 치료를 받은 후 말초 혈액 줄기세포 이식을 받을 수 있다. 일부 실시양태에서, 이식 후, 대상체는 본원에 기재된 증식된 면역 세포의 주입을 받는다. 일부 실시양태에서, 증식된 세포는 수술 전 또는 후에 투여된다.
환자에게 투여될 치료를 위한 투여량은 치료될 병태의 정확한 특성 및 치료의 수용자에 따라 달라질 것이다. 인간 투여를 위한 투여량의 스케일링(scaling)은 당업계에 용인되는 실무에 따라 수행될 수 있다. 예를 들어, CAMPATH에 대한 용량은 일반적으로 성인 환자에 대해 1 내지 약 100 mg의 범위일 수 있고, 보통 1 내지 30일의 기간 동안 매일 투여된다. 일부 실시양태에서, 일부 예로서, 최대 40 mg/일의 더 큰 용량 사용될 수 있지만, 1일 용량은 1 내지 10 mg/일이다(미국 특허 제6,120,766호에 기재됨).
VIII. 대상체
대상체는 MIL을 갖는 임의의 유기체일 수 있다. 예를 들어, 대상체는 설치류, 개, 고양이, 돼지, 양, 소, 말 및 영장류로부터 선택될 수 있다. 대상체는 마우스 또는 인간일 수 있다.
대상체는 신생물을 가질 수 있다. 신생물은 양성 신생물, 악성 신생물 또는 2차 신생물일 수 있다. 신생물은 암일 수 있다. 신생물은 림프종 또는 백혈병, 예컨대, 만성 림프구성 백혈병("CLL") 또는 급성 림프모구성 백혈병("ALL")일 수 있다. 대상체는 교모세포종, 수모세포종, 유방암, 두경부암, 신장암, 난소암, 카포시 육종(Kaposi's sarcoma), 급성 골수성 백혈병, 및 B-리니지(lineage) 악성종양을 가질 수 있다. 대상체는 다발성골수종을 가질 수 있다.
대상체는 급성 골수성 백혈병, 선암종, 골육종, 림프모구성 백혈병, 림프종, B-세포 림프종, B-세포 비-호지킨 림프종, B-리니지 악성 림프종, 유방암, 난소암, 자궁경부암, 대장암, 상피암, 교모세포종, 신경교종, 호지킨 림프종, 무통성 B-세포 림프종, 백혈병, 림프종, 폐암, 외투 세포 림프종, 수모세포종, 흑색종, 신경모세포종, 전립선암, 소포성 림프종, 신장 세포 암종, 횡문근육종을 갖는다.
본원에 기술된 바와 같이, 1) CAR-변형된 MIL의 생성 가능성, 2) CAR-MIL이 CAR-PBL에 부족했던 것인 - 기능적인 능력 및 내재적 종양 항원-특이성을 보유하는 것 및 3) CAR-MIL이 매치된 CAR-PBL보다 더 효율적으로 시험관내 사멸하는 것이 입증되었다. 이러한 데이터가 시사하는 바는, CAR-MIL이 더 나은 항원 특이적 사멸을 제공할 수 있지만, 보다 중요하게는 내인성 항원 레퍼토리를 표적으로 함으로써 이들이 항원 이탈 변이체를 통한 재발 위험을 방지하거나 최소화하여 CAR 입양 T 세포 요법의 전반적인 효능을 증가시킬 수 있다는 점이다.
실시예
이하의 실시예는 본원에 기재된 방법 및 조성물을 예시하지만 한정하지는 않는다. 당업자에게 명백한 치료에 있어서 정상적으로 접하게되는 다양한 조건 및 매개변수의 다른 적절한 수정 및 조정은 실시양태의 사상과 범위 내에 있다.
실시예 1: 골수의 수집
암 환자로부터 IRB 승인된 사전 동의하에 장골능(iliac crest)으로부터 골수 샘플을 수집하였다. 피콜(ficoll) 구배를 이용하여 적혈구를 골수로부터 제거하였다. 일부 실험의 경우, 다발성 골수종 환자(n=11)로부터 골수 샘플을 수집하였다. 환자의 서브세트(n=8)의 경우, 골수 흡인시 매치된 말초 혈액도 수집하였다. MIL 및 PBL을 본원에 제공된 바와 같이 활성화하고, 증식하고 및 형질도입하였다. MIL 및 PBL을 환자 골수 및 혈액 샘플로부터 각각 유도하였다. 골수 단핵 세포 및 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 활성화 및 증식 시점까지 액체 질소에서 10X106 세포/ml로 동결하였다.
실시예 2: CAR 디자인
2세대 4-1BB-CD3ζ CD38 CAR을 CAR38로 지칭되는 다라투무맙으로부터 유래된 scFv를 사용하여 생성하였다:
Figure pct00001
BCMA 및 PSMA CAR 구성물은 하기와 같다:
Figure pct00002
BCMA-특이적 CAR은 뮤린 항-인간 BCMA 항체 클론 C11D5.3으로부터 유래된 scFv를 이용한다. 이러한 BCMA scFv를 이용하는 CAR은 본래 Carpenter RO, Evbuomwan MO, Pittaluga S, et al. Clin. Cancer Res. 2013 19(8):2048-2060에서 보고되었다.
PSMA-특이적 CAR은 인간 항-인간 PSMA 항체 J591로부터 유래된 scFv를 이용한다. 이러한 PSMA scFv를 이용하는 CAR은 본래 Santoro SP, Kim S, Motz GT, et al. Cancer Immunol Res. 2105 3(1):68-84에서 보고되었다.
실시예 3: MIL의 증식 및 활성화
증식 0일 차("D0") 또는 첫째 날에, 이전에 동결한 골수를 배지에 천천히 해동하고, 세척하고, 생존활성과 회복과 함께 수득하여 셀 카운트(cell count) 하였다. 활성화를 위해, MIL을 IL-2 단독 또는 IL-7, IL-15, IL-21의 조합의 존재하에 배양하였다. MIL을 하기 항체 조합을 사용하여 항체-접합된 자성 비드의 존재하에 배양하였다:
항-CD3/항-CD28,
항-CD2/항-CD3/항-CD28 사합체, 또는
초-작용(Hyper-Act) CD3/CD28 폴리머.
CAR-MIL로 치료할 암의 종류에 따라, 활성화 방법을 최적화할 수 있다. IL-2를 200IU/ml로 배양 배지에 첨가한다. 그 후, 세포를 U-하부 플레이트(bottom plate) 또는 백(bag)에 넣고, 3일("D+3" 또는 "D3")까지 저산소 조건에서 37℃로 배양한다.
저산소 챔버 또는 세포 배양 백을 95%의 질소와 5%의 CO2 가스 혼합물로 3분 동안 플러싱(flushing)함으로써 저산소 조건을 달성한다. 이는, 예를 들어, 용기(receptacle) 내에 1-2% 이하의 O2 가스를 야기한다. 그 후, 세포를 3일 동안, 즉, D+3까지 세포 배양 배지로 저산소 환경(1%-3%의 산소)에서 인큐베이션한다.
D+3에, 세포/플레이트를 200IU/ml의 IL-2 및 다른 사이토카인, 즉 각각 0-500 IU/ml 사이에서 변할 수 있는 양의 IL-7, IL-15, IL-21 또는 조합의 존재하에 정상산소 환경으로 옮긴다.
성장 조건에 따라, 현미경 및/또는 셀 카운트에서 육안 검사한 후, 블라스트(blast)를 갖는 활발하게 성장하는 샘플을 신선한 배지 + 사이토카인에 대해 1:1로 분할한다. 분할할 필요가 없는 샘플은 배지 변경이 필요할 것인 바, 배지 체적의 절반을 새로운 배지 + 사이토카인으로 대체한다.
세포 농도, 크기 및 생존활성에 따라, MIL을 D+7 내지 D+14 사이 중 임의의 일자에 수확한다.
수확 직후, 활성화를 위해 CD3/28를 사용하였거나 세포 배양 배지로 세척한 경우, 증식이 초작용 클라우드제트(Cloudz) 시약에 기반하거나 이것으로 세척된 경우, 증식이 폴리머 기반인 경우, MIL을 자석 상에서 탈-비드화한다.,
실시예 4: MIL로 CAR 형질도입
MIL을, D0, D+3 또는 D+5에 렌티바이러스 CAR로 형질도입하거나 감염시킨다. CAR은, 표적 수용체로서 CD38 또는 CD19 또는 BCMA 또는 PSMA 구성물이다. 로트(lot)의 역가(titer)와 농도에 따라 첨가하는 렌티바이러스의 양을 선결한다. 예를 들어, 200 ul의 배지에 200K MIL이 있는 96-웰 U 바닥 플레이트는 바이러스 종류 및 사용되는 로트 역가에 따라 웰당 2 ul - 20 ul 사이의 바이러스를 수용할 수 있다.
각 CAR 구성물에 대해, GFP 및 CAR이 1:1 분자 비율로 동일하게 발현되도록, T2a 절단 서열을 사용해서 GFP를 CAR에 연결하여, GFP가 형질도입과 CAR 발현의 마커로 사용될 수 있게 하였다. 제1 단계로서 비오틴화된 BCMA(BCMA-비오틴)를 이용한 후, 제2 단계로서 스트렙타비딘-PE-Cy7(SA-PE-Cy7)로 세포를 라벨링함으로써, BCMA-CAR 표면 발현을 분석하였다. 비-형질도입 및 BCMA-CAR-형질도입 PBL의 1세트를 실시예로 나타낸다(도 1 참조).
매치된 MIL 및 PBL에 대한 CAR 형질도입 효율은 3개의 CAR 각각에 대해 도 2에 도시되어 있다. 짝을 이룬 T-테스트를 사용하여 평균 형질도입 효율 및 p 값을 계산하였다. 형질도입 효율은 CAR의 어느 것에서도 MIL과 PBL 사이에 유의미하게 상이하지 않았다. 구체적으로, 매치된 MIL 및 PBL 짝 8개에 대한 CAR38-형질도입 효율이 나타나 있고, 여기서 평균은 CAR-MIL 및 CAR-PBL 각각, 50.5% 및 61.1%이다. p값은 0.20이다. 12개의 매치된 짝에 대한 BCMA 형질도입 효율은 각각 46.4% 및 47.4%였으며, p값은 0.86였고, 11개의 매치된 짝의 PSMA 형질도입 효율은 각각 37.3% 및 40.1%였고, p 값은 0.68이었다.
성장하는 MIL의 일부는 미형질도입되어 남아있고, 즉 CAR로 감염되지 않고, 대조군 또는 미형질도입된(NT) MIL의 역할을 한다. 이것은 플레이트에서만 성장할 때 가능하다. 형질도입된 CAR-형질도입 MIL을 비-형질도입 MIL과 비교할 때, 유사한 기억 표현형이 발견되었다. 도 3은 3명의 다발성 골수종 환자로부터 매치된 비-형질도입 및 CD38 CAR-형질도입 MIL의 데이터를 도시한다. 데이터는 CAR을 표현하도록 MIL을 조작하면 기억 표현형을 유의미하게 변경하지 않는다는 것을 보여준다.
4일 차부터, D+7 내지 D+14 사이의 임의의 일자일 수 있는 수확의 선택 일자까지, 유세포 분석에 의한 셀 카운트, 생존활성 및 표현형 분석을 위해 MIL의 앨리쿼트를 취한다. MIL이 활발하게 성장하는 경우, 세포 농도를 이상적으로 유지하기 위해 필요로 되는 바에 따라 사이토카인이 있는 배지를 투여할 수 있다. D+7에, MIL을 D+10까지 충분한 배지 및 충분한 사이토카인으로 1:4 또는 4배로 분할한다. 10-14 일의 MIL 증식 후, MIL이 CAR을 발현하는 바, CAR-MIL로 지칭한다. 이들 활성화된 CD3 양성 CAR-MIL은 IFNγ를 발현한다. 또한, 활성화된 MIL은 대상체 및 활성화 방법에 따라 다른 비율로 CD4와 CD8을 발현한다.
활성화된 MIL을 유세포 분석에 의해 형질도입된 MIL 및 T 세포 기억 마커의 백분율로 CD3, CD4, CD8 및 GFP에 대해 세척, 계수 및 표현형화한다. 그 후, 활성화된 MIL을 동결 배지에서 앨리쿼트화하고, 튜브 또는 백에서 동결하고 추후 사용까지 LN2 동결기에 보관한다.
실시예 5: CAR-MIL의 내인성 TCR-매개된 종양 특이성
종양 특이적 T 세포를 앞서 기재한 기능 검정을 사용하여 비-형질도입된 미변형된 및 형질도입된 CAR-변형 MIL 및 PBL에서 정량화하였다(Noonan et al., Sci. Transl. Med. (2015) 7(288) 참조). 간략하게는, 자가유래 항원-제시 세포(APC)를 다발성 골수종 암 세포주로부터의 용해물과 함께 펄스 처리하고, CFSE-라벨링된 MIL 또는 PBL과 공동-배양하였다. 배지 단독 또는 방광암 세포주 용해물로 펄스 처리된 APC를 음성 대조군으로 사용하였다. CD38에 대한 종양-특이성 게이팅 전략은 도 4에 도시하며, BCMA 및 PSMA에 대한 전략은 도 7에 도시된다. 종양-특이적 T 세포를 IFNγ-생성 CFSE-낮음, CD3+ 집단으로 규정하였다. 매치된 미변형 MIL과 비교하여 CD38 CAR-MIL에서 동일하거나 더 많은 수의 종양 항원-특이적 IFNγ-생성 T 세포를 측정하였고(도 5 및 6 참조), 이는, CD38-발현 8226 종양 세포와 공동 배양되고 자극되기 전에(도 5 및 6) 그리고 그 후에(도 6), CD38 CAR-MIL이 이들의 내재적 종양-특이성과 기능성을 보유함을 보여준다. 도 7에 도시된 데이터는 H929 및 U266 골수종 용해물로 펄스 처리된 자가유래 골수 APC와 공동-배양된 하나의 대표적인 다발성 골수종 PSMA CAR-MIL 샘플에 대한 것이다. 유사하게, 도 8 및 9는 BCMA 및 PSMA CAR MIL에 대한 결과를 입증한다. 종양 항원-특이적 T 세포는 미변형 또는 변형 PBL에서 검출되지 않았다. 따라서, CAR의 항원-특이성에 상관없이, CAR-MIL은 CAR을 통한 자극 전과 후 모두에서 이들의 내재적 종양-특이성 및 기능성을 보유한다.
이 결과는 MIL에서 CAR을 발현하는 가능성을 입증한다. 이 데이터는 CAR-MIL이 PBL-CAR이 가질 것으로 생각되지 않는 특성인 - 이들의 내인성 종양 항원-특이적 T 세포 수용체를 통해 반응하는 능력과 이들의 내재적 종양 항원-특이성을 보유함을 입증한다. 따라서, MIL은 유사한 지위에 있는 PBL에 비해 우수한 사멸 능력을 갖는다.
실시예 6: CAR-매개 항원 사멸 측정을 위한 FAC-기반 세포독성
CAR-MIL의 시험관내 세포용해 잠재력을, 유세포 분석(FACS)을 통해서 또는 ACEA x 셀리전스(Celligence) RTCA 플랫폼을 실시간으로 사용하여 분석되는 공동-배양 사멸 검정으로 평가하였다. 도 10-24는 수행된 공동-배양 사멸 검정을 설명하며, 매치된 CAR-PBL과 비교하여 다양한 조건에서 사멸시키는 CAR-MIL의 능력을 도시한다.
FACS-기반 세포독성 검정을 사용하여 CD38 CAR-매개 항원-특이적 사멸을 측정하였다(도 10). 1차 시도의 경우, 비-형질도입(NT) 및 CD38 CAR-형질도입 MIL 및 PBL을 1:1 내지 1:10 범위의 CART:표적 비율로 표적 세포와 함께 공동-인큐베이션하였다. FACS를 사용하여 48시간에 사멸된 표적 세포의 %를 측정하였다(도 10 및 11 참조). 재-시도의 경우, 1차 시도에 사용된 동일한 수의 표적 세포를 1차 시도 개시 48시간 후에 추가하고, 48시간이 지나서(1차 시도 시작 후 96시간) FACS로 사멸을 분석하였다(도13). 4개의 표적 세포를 사용하였다: 2개의 CD38-발현 세포주: 8266 및 CD38을 발현하도록 유전적으로 변형된 K562(K562-CD38); 및 2개의 CD38-음성 세포주: CRISPR-cas9(CD38KO8226) 및 야생형 미변형 K562(K562)를 사용하여 녹-아웃된 CD38을 갖는 변형된 8226 세포주. 도 10 및 11은 본 검정에 의해, 오직 CD38 CAR-발현 이펙터가 사멸시키고, 이들이 오직 CD38+ 표적을 사멸시킴을 도시한다.
또한, 도 14-16은 재-시도에서 세포용해 사멸 검정의 결과를 도시한다. 이러한 결과는 CD38 CAR-MIL이 1차 시도 2일 후(도 14), 1차 시도 7일 후(도 16) 및 2일마다 반복된 시도 후(도 15), 재-시도하였을 때, PBL에 비해 더 우수한 사멸을 입증하는 것을 보여준다. 1차 시도에 대한 이펙터 대 표적 비율(E:T 비율)은 1:10(도 14 및 15) 또는 1:1(도 16)이었고; 1차 8226 시도 2일 후(도 14 및 15) 또는 7일 후(도 16) 5X105 8226 세포로 웰을 재-시도하고, 재-시도 2일 후 FACS로 사멸을 측정하였다.
ACEA x셀리전스 RTCA 공동-배양 검정의 결과를 도 17-19에 도시하였다. 본 검정은 실시간으로 CAR-특이적 사멸을 측정한다. 본 검정에서, 표적 세포가 사멸되면 임피던스가 떨어진다. 도 17은 사멸이 BCMA CAR의 발현에 의존적임을 도시한다. BCMA CAR-MIL은 표적 세포를 사멸(적색 선)시키고, 반면, 비-형질도입된 MIL은 그렇게하지 않는다(녹색 선)(도 17 참조). 표적 및 이펙터에 비해 표적 단독 간 임피던스 차이는 시간에 따른 사멸%를 계산하는 데 사용된다. 도 18은 BCMA CAR-MIL 및 PBL의 하나의 대표적인 매치된 짝에 대한 시간 경과에 따른 사멸 %를 도시한다. 도 19는 BCMA CAR-MIL을 낮은 E:T 비율로 죽이는 CAR-PBL 능력에 비교한 공동-배양 검정 결과를 도시하며, 여기서 표적은 BCMA(K562-BCMA) 및 RPMI8226 세포를 발현하도록 유전적으로 변형된 K562 세포이다. 10개의 매치된 짝의 경우 둘의 비율은 1:10 E:T였다. 매치된 짝은 선으로 연결된다. CAR-MIL은 10짝 중 7짝에서 더 잘 사멸시킨다.
FACS-기반 세포독성 검정을 사용하여 BCMA CAR-매개된 항원-특이적 사멸을 측정하였다(도 20). 본 검정에서, K562-BCMA 표적 세포를 이펙터 세포와 공동-배양하기 전에 셀트레이스 바이올렛(CellTrace Violet)으로 라벨링한다. 도 20에서 입증된 바와 같이, 비-형질도입된 MIL에 비해 CAR-MIL과의 공동-배양 후, 셀트레이스 바이올렛-라벨링된 생(live) K562-BCMA 표적 세포의 개수 간 차이를 이용하여, CAR-특이적 %사멸을 계산한다. 도 21에서, 0일 차, 이어서 2일 후, 다시 7일 후, 사멸 측정하기 전에 시도가 이루어졌다. 결과는 도 21에 도시되어 있다.
PSMA에 대한 PSMA 스테이닝 및 ACEA 공동-배양 사멸 검정의 결과는 도 22-24에 도시되어 있다. FACS 스테이닝 결과는 4개의 인간 전립선암 세포주 및 SW780 방광암 세포주에 대한 도 22에 도시되어 있다. PSMA CAR 항원-특이적 사멸의 실시간 측정에 대한 ACEA 공동-배양 검정 결과는 도 23에 도시되어 있다. 다시 말하면, 표적 세포가 사멸되면 임피던스가 떨어진다. 사멸은 CAR 및 항원-의존적이다. 오직 PSMA CAR-MIL이 사멸시키고 이들은 오직 LnCap PSMA+ 표적을 사멸시킨다. 표적 및 이펙터에 비해 표적 단독 간 임피던스 차이는 시간에 따른 사멸%를 계산하는 데 사용된다. 도 24는 5일 간격으로 3회 시도된 PSMA CAR-MIL 및 PBL의 매치된 두 짝의 시간 경과에 따른 사멸을 도시한다. 데이터는 1차 시도가 CAR-PBL에 유리한 경우에서 조차 PSMA CAR-MIL이 2차 시도에서 CAR-PBL을 능가한 것을 보여준다.
실시예 7: CAR-MIL의 특성해석(Characterization)
CAR-발현 MIL의 대부분은, CD3에 의하여, T 세포이다. 도 34는 CD38+ RPMI8226 종양 세포와 공동-배양 전(0일 차), 2일 후, 및 7일 후에, 3명의 다발성 골수종 환자로부터의 CD38 CAR-MIL 및 CAR-PBL의 3개의 매치된 짝에서 CD27+ CD4+ 및 CD27+CD8+ T 세포의 백분율을 도시한다. CD27 발현은 CAR38-MIL의 CD4+ 및 CD8+ T 세포에서 증가하지만 항원 노출 후 PBL에서 감소한다. 이러한 결과는 CAR-MIL이 CAR-PBL에 비해 증가된 줄기 세포-유사 특성을 갖는다는 것을 시사한다. 도 35는 CD38+ RPMI8226 종양 세포와 공동-배양 전(0일 차), 2일 후 및 7일 후에 3명의 다발성 골수종 환자로부터의 CD38 CAR-MIL 및 CAR-PBL의 3개의 매치된 짝에서 PD1+TIM3+ CD4+ 및 CD8+ T 세포의 백분율을 도시한다. 더 적은 CD4+ 및 CD8+ T 세포가 항원 노출 후 PBL에 비해 CAR-MIL에서 PD-1 및 TIM-3을 공동-발현한다. 이러한 결과는 항원 노출 후 CAR-MIL이 CAR-PBL에 비해 덜 소모됨을 시사한다. CAR 항원 자극-특이적 사이토카인 생성을 BCMA 및 CD38에 대한 세포내 사이토카인-스테이닝으로 측정하였고; 대표적인 결과가 도 25에 도시되어 있다. BCMA CAR-MIL 및 CD38 CAR-MIL은 CAR-PBL에 비해 증가된 IFNγ 및 TNFα 사이토카인 생성을 보여준다(도 26 및 27). K562 세포를 발현하는 CD38 및 BCMA와 공동-배양의 24시간 후 CAR T 세포에서 IFNγ 및 TNFα 생성을 측정하였다. 도 27에서 매치된 짝은 색으로 부호화되고 선으로 연결된다. 항원-특이적 IFNγ CD3의 백분율은 생 CD3+ IFNγ+ TNFα+의 백분율과 동일하다
실시예 8: 이소플렉시스(Isoplexis) 데이터
CART-조작된 MIL은 이소플렉시스 단세포 기술을 사용을 통해 매치된 말초 혈액 대응물보다 더욱 다기능적인 것으로 밝혀졌다. 이 기술을 사용하여, 단세포 수준에서 BCMA 항원-자극 후 32개의 사이토카인 생성 측정을 수행하였다(도 28 참조). 첫 단계는 밀테니아이(Miltenyi) 비드를 사용하여 매치된 CAR-MIL 및 CAR-PBL로부터 단리된 CD4+ 및 CD8+ T 세포에 대한 샘플을 농축하는 것이다. 다음 단계는 항원으로 자극하는 것이다. 단리된 CD4+ 및 CD8+ CART 세포를 K562-BCMA 또는 K562-NGFR 대조군 표적 세포로 37℃, 5% CO2에서 20시간 동안 자극한다. 마지막으로 샘플을 로딩하고 이소라이트(IsoLight)를 실행한다. 밀테니아이 비드를 사용하여 K562 표적 세포를 제거하고, 샘플을 이소라이트 분석용 이소코드 칩(IsoCode Chip)에 로딩한다.
그 결과, 32-플렉스 단세포, T 세포 사이토카인 반응 패널이 생성된다. 기능성 군 별로 색으로 부호화된 32개의 사이토카인은 다음과 같다:
Figure pct00003
이소플렉시스 이소라이트 32-플렉스 검정을 BCMA CAR-MIL 및 PBL의 6개의 매치된 짝에서 실행하였다. 그 결과, BCMA 항원-자극은 CAR-MIL 및 CAR-PBL 모두에서 다기능성 사이토카인-생성 CD4 및 CD8 CART 세포를 유도하는 것으로 밝혀졌다(도 29 참조). 세포 당 2 이상의 사이토카인을 분비하는 세포의 백분율로 정의된, 다기능성은, 각 샘플로부터의 CD4+(도 29의 상단 그래프) 및 CD8+(도 29의 하단 그래프) CART 세포에 대해 도시된다. NGFR 대조군 이상의 BCMA 항원-특이적 다기능성 유도를 나타내는 샘플은 화살표로 표시된다. 분비된 사이토카인의 세기를 곱한 다기능성 세포의 백분율로 정의된, 다기능성 세기 인덱스(Polyfunctional Strength Index, PSI)는 각 샘플의 CD4+(도 30의 상단) 및 CD8+(도 30의 하단) CART 세포에 대해 도시된다. 다시 말하면, NGFR 대조군 이상의 BCMA 항원-특이적 다기능성 유도를 나타내는 샘플은 화살표로 표시된다.
도 31은 그랜자임 B, IFNγ, IL-8, MIP-1a 및 MIP-1b가 BCMA 자극 후 CAR-MIL 및 CAR-PBL에 의해 생성되는 지배적 사이토카인임을 도시한다. PSI 조성은 샘플의 총 다기능성 세기에 대한 각 사이토카인의 기여도를 세분화하여, 샘플의 PSI를 유도하는 사이토카인을 나타낸다. CAR-MIL 및 CAR-PBL의 하나의 대표적인 매치된 짝에 대한 데이터가 도 31에 도시된다.
도 32는 비록 CAR-MIL이 조절, 염증 및 자극 사이토카인의 유사한 생성을 갖지만 CAR-PBL보다 더 많은 이펙터와 화학유인성 사이토카인을 생성함을 도시한다. CD4 T 세포는 MIL과 PBL 모두에서 CD8 T 세포보다 더 높은 PSI를 갖는다. 도 33은 CAR-MIL이 CAR-PBL에 비해 BCMA-자극 후에 다기능성 세포 서브세트가 더 많이 증가하는 것을 도시한다. 점은 단세포를 나타내고, 원이 넓을수록 서브세트의 지배성에 대해 색상이 가중된다. PBL(오렌지색)에 비해 MIL(청색)이 보다 풍부한 고도로 상향조절된 다기능성 서브세트가 원으로 표시된다. MIL- 및 PBL-유래 CART 다기능성 서브세트는 그랜자임 B, IFN-g, IL-8, MIP-1a 및 MIP-1b를 포함한 다양한 사이토카인을 기반으로 차별화된다.
요약하면, CAR-MIL 및 CAR-PBL 모두로부터의 CD4 및 CD8 T 세포는 NGFR 대조군에 비해, BCMA 자극에 대한 반응으로 다기능성(세포 당 2+ 사이토카인 분비) 및 다기능성 세기 인덱스(PSI)의 항원-특이적 증가를 입증하였다. CAR-PBL과 비교할 때, CAR-MIL은 CD4 및 CD8 T 세포 모두에서 증가된 다기능성과 증가된 PSI를 입증하였다. CAR-MIL은 매치된 CAR-PBL이 그렇게 하지 못한 경우에서 조차 상당한 다기능성을 입증하였다(매치된 짝 3319/3320 및 3873/3874). CAR-MIL에서 향상된 PSI는 그랜자임 B, IFN-g, IL-8, MIP-1a 및 MIP-1b를 포함한 항종양 활성과 관련된 이펙터, 자극 및 화학유인성 단백질에 의해 우세하였다. 유사한 단백질의 향상된 분비와 증가된 PSI는 CD19-특이적 CAR-T 요법으로 치료된 비-호지킨 림프종을 가진 환자에서 개선된 임상 반응과 관련된 것으로 보고되었다.
실시예 9: 생채내 BCMA CAR-MIL 대 CAR-PBL
67 NSG 마우스는 5 x 106의 U266 세포로 시도하였다(0일 차). U266 시도 하루 전, 마우스에 200 라드(rad)를 조사하였다(-1일 차). 24일 차로, MIL/PBL 주입한 아침에 마우스에게 100 라드를 가하였다. 마우스를 임의로 순서를 정하고, U266 종양 시도(challenge)(24일 차) 후 24일 째 늦은 오후에 투여하여 치료하였다. ELISA로 인간 혈청 IgE 수준을 측정하여 U266 종양-진행을 모니터링하였다. 치료 4일 전(20일 차)에 기준선 전-처리 인간 IgE 혈청을 측정하였다. 치료 후 7일 째(31일 차)(도 36-8 참조) 및 그 후 종양-제거 또는 안락사까지 매 7일마다, 인간 IgE를 측정하였다. 종양-진행이 마비의 징후를 나타낼 때 마우스를 안락사시켰다. 안락사 시점에(T 세포 주입 3-6주 후), 골수 및 비장을 수확하고, 유세포 분석을 사용하여 인간 CD3+ T 세포 및 CD138+ 종양 세포의 수준을 정량화하였다(도 39-42 참조).
Figure pct00004
이러한 데이터는 BCMA CAR-MIL이 매치된 CAR-PBL보다 생체내에서 더 강하다는 것을 보여준다. 혈청 hIgE는 U266 iv 시도 38일, 45일 및 52일 후 또는 T 세포 주입 14, 21 및 28일 후 CAR-PBL 고용량으로 치료된 마우스와 비교하여 BCMA CAR-MIL 고용량 치료된 마우스에서 유의미하게 더 낮았다. 저용량의 CAR-MIL이 저용량 CAR-PBL보다 유의미하게 좋지는 않았지만, 고용량 CAR-PBL에 대해 비교가능하게 수행하였다(도 38 참조).
FACS를 사용하여, 대조군 및 치료된 마우스로부터의 골수 및 비장에서 인간 CD3+ T 세포 및 CD138+ 종양 세포의 수준을 측정하였다(도 39 및 40 참조). 이러한 결과는 PBL에 비해 MIL로 치료된 마우스의 골수(도 41 참조) 및 비장(도 42 참조)에서 더 높은 비율의 인간 CD3 T 세포 및 더 낮은 비율의 U266 종양 세포가 검출되었음을 보여준다.
실시예 10: CAR-MIL을 사용하여 CD19 발현 암치료(CD19+4-1BB+CD3ζ)
림프종 또는 급성 림프모구성 백혈병과 같은, CD19를 발현하는 암을 가진 대상체로부터 MIL을 수득한다. 간략하게는, 대상체로부터 골수 샘플을 수득한 후, 표 1에 예시된 바와 같이, 세포를 CD19 특이적 세포외 도메인을 갖는 CAR 구성물을 인코딩하는 렌티바이러스로 형질감염/감염시킨다. 또한, 본원에 참조로 포함되는 제WO2016037054호에 기재된 바와 같은 항-CD3/항-CD28 비드 및 사이토카인의 존재하에, 저산소/정상산소 조건에서 세포를 활성화하고 증식시킨다. 활성화되고 증식된 MIL을 CD19를 발현하는 암을 가진 대상체에게 투여한다. 대상체의 암을 치료한다.
실시예 11: CAR-MIL을 사용하여 PSMA 발현 암 치료(PSMA+4-1BB+CD3ζ)
전립선 암과 같은 PSMA를 발현하는 암을 가진 대상체로부터 MIL을 수득한다. 간략하게는, 골수 샘플을 대상체로부터 수득한 후, 표 1에 예시된 바와 같이, 세포를 PSMA 특이적 세포외 도메인을 갖는 CAR 구성물을 인코딩하는 렌티바이러스로 형질감염/감염시킨다. 또한, 본원에 참조로 포함되는 제WO2016037054호에 기재된 바와 같은 항-CD3/항-CD28 비드 및 사이토카인의 존재하에, 저산소/정상산소 조건에서 세포를 활성화하고 증식시킨다. 활성화되고 증식된 MIL을 PSMA를 발현하는 암을 가진 대상체에게 투여한다. 대상체의 암을 치료한다.
실시예 12: CAR-MIL을 사용하여 BCMA 발현 암 치료(BCMA+4-1BB+CD3ζ)
다발성 골수종과 같이, BCMA를 발현하는 암을 가진 대상체로부터 MIL을 수득한다. 간략하게는, 골수 샘플을 대상체로부터 수득한 후, 표 1에 예시된 바와 같이, 세포를 BCMA 특이적 세포외 도메인을 갖는 CAR 구성물을 인코딩하는 렌티바이러스로 형질감염/감염시킨다. 또한, 본원에 참조로 포함되는 제WO2016037054호에 기재된 바와 같은 항-CD3/항-CD28 비드 및 사이토카인의 존재하에, 저산소/정상산소 조건에서 세포를 활성화하고 증식시킨다. 활성화되고 증식된 MIL을 BCMA를 발현하는 암을 가진 대상체에게 투여한다. 대상체의 암을 치료한다.
실시예 13: CAR-MIL을 사용하여 B-세포 림프종 치료
B-세포 림프종을 가진 대상체로부터 MIL을 수득한다. 간략하게는, 골수 샘플을 대상체로부터 수득한 후, 본원에 참조로 포함되는 제WO2016037054호에 기재된 바와 같은 항-CD3/항-CD28 비드 및 사이토카인의 존재하에, 저산소 조건에서 세포를 인큐베이션한다. CD19의 세포외 도메인, CD19의 막횡단 도메인, CD3ζ 및 4-1BB의 세포내 도메인을 포함하는 CAR을 인코딩하는 핵산 분자를 MIL로 형질감염시킨다. 그 후, 세포를 정상산소 조건에서 성장시키고, 증식되게 한다. 활성화되고 증식된 MIL을 B-세포 림프종을 가진 대상체에게 투여한다. 대상체의 B-세포 림프종이 관해된다. 요악하면, 본원에 제공된 실시양태 및 실시예는 CAR을 발현하는 세포가 암 치료에 효과적으로 사용될 수 있음을 입증한다.
실시예 14: CAR-MIL을 사용하여 다발성 골수종 치료
다발성 골수종을 가진 대상체로부터 MIL을 수득한다. 간략하게는, 골수 샘플을 대상체로부터 수득한 후, 본원에 참조로 포함되는 제WO2016037054호에 기재된 바와 같은 항-CD3/항-CD28 비드 및 사이토카인의 존재하에, 저산소 조건에서 세포를 인큐베이션한다. CD38의 세포외 도메인, CD8의 막횡단 도메인, CD3ζ 및 4-1BB의 세포내 도메인을 포함하는 CAR을 인코딩하는 핵산 분자를 MIL로 형질감염시킨다. 그 후, 세포를 정상산소 조건에서 성장시키고, 증식되게 한다. 활성화되고 증식된 MIL을 다발성 골수종을 가진 대상체에게 투여한다. 대상체의 다발성 골수종이 관해된다.
본 명세서에 언급되고/되거나 출원 데이터 시트에 열거된 CAS 번호를 포함한, 모든 미국 특허, 미국 특허 출원 공보, 미국 특허 출원, 외국 특허, 외국 특허 출원 및 비-특허 간행물은 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.

Claims (34)

  1. 리간드에 결합할 수 있는 세포외 도메인; 및
    세포내 신호전달 연쇄반응(cascade)을 개시할 수 있는 세포내 도메인
    을 포함하는 키메라 항원 수용체("CAR")
    를 포함하는, 골수 침윤성 림프구(MIL)인, 세포.
  2. 제1항에 있어서, 세포는 CD3+인 세포.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 세포는 CD4+인 세포.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 세포는 CD8+인 세포.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 세포는 CD45RO+인 세포.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 세포는 CD62L+인 세포.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 세포는 CXCR4+인 세포.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 세포는 4-1BB+인 세포.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 세포는 인터페론 γ+인 세포.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 세포는 CD138+인 세포.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 세포는 CD33+인 세포.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 세포는 CD34-인 세포.
  13. 제1항에 있어서, 리간드는 종양성신생 세포(neoplastic cell)에서 발현되는 분자인 세포.
  14. 제13항에 있어서, 리간드는 신경교종-관련 항원, 암배아 항원(CEA), β-인간융모성 생식선자극호르몬, 알파-태아단백(AFP), 렉틴-반응성 AFP, 티로글로불린, RAGE-1, MN-CA IX, 인간 텔로머라아제 역전사 효소, RU1, RU2(AS), 장 카르복실 에스테라아제, 돌연변이 hsp70-2, M-CSF, 프로스타아제, 전립선-특이적 항원("PSA"), 전립선산 인산가수분해효소("PAP"), NY-ESO-1, LAGE-1a, p53, 프로스테인(prostein), PSMA, Her2/neu, 서바이빈(survivin), 텔로머라아제, 전립선-암종 종양 항원-1(PCTA-1), MAGE, ELF2M, 호중구 엘라스타아제, 에프린B2(ephrinB2), CD22, 인슐린 성장 인자(IGF)-I, IGF-II, IGF-I 수용체, 메소텔린(mesothelin), MART-1, 티로시나아제(tyrosinase), GP 100, HER-2/Neu/ErbB-2, CD19, CD20, CD37, MART-1/멜란에이(MelanA)("MART-I"), gp100(Pmel 17), TRP-1, TRP-2, MAGE-1, MAGE-3, BAGE, GAGE-1, GAGE-2, p15, p53, Ras, BCR-ABL, E2A-PRL, H4-RET, IGH-IGK, MYL-RAR, EBVA, E6, E7, TSP-180, MAGE-4, MAGE-5, MAGE-6, RAGE, NY-ESO, p185erbB2, p180erbB-3, c-met, nm-23H1, PSA, TAG-72, CA 19-9, CA 72-4, CAM 17.1, NuMa, K-ras, 베타-카테닌, CDK4, Mum-1, p 15, p 16, 43-9F, 5T4, 791Tgp72, 알파-태아단백, 베타-HCG, BCA225, BTAA, CA 125, CA 15-3＼CA 27.29＼BCAA, CA 195, CA 242, CA-50, CAM43, CD68＼P1, CO-029, FGF-5, G250, Ga733＼EpCAM, HTgp-175, M344, MA-50, MG7-Ag, MOV18, NB/70K, NY-CO-1, RCAS1, SDCCAG16, TA-90＼Mac-2 결합 단백질＼사이클로필린 C-관련 단백질, TAAL6, TAG72, TLP 또는 TPS인 세포.
  15. 제13항에 있어서, 리간드는 CD19, CD20, CD22, ROR1, 메소텔린, CD33/IL3Ra, c-Met, BCMA, PSMA, 당지질 F77, EGFRvIII, GD-2, MY-ESO-1 TCR 또는 MAGE A3 TCR인 세포.
  16. 제13항에 있어서, 리간드는 α-엽산 수용체, 탄산무수화효소 9("CAIX"), CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD38, CD44, CD44v6, CD44v7, CD44v7, 암배아 항원("CEA"), 상피 성장 인자-2("EGF-2"), 상피 당단백 40("EGF-40"), 수용체 티로신-단백질 키나아제 erbB-2(HER2; Neu; CD340), 수용체 티로신-단백질 키나아제 erbB-3(HER3), 수용체 티로신-단백질 키나아제 erbB-4(HER4), 엽산-결합 단백질("FBP"), 태아 아세틸콜린수용체, GD2, GD3, 인터루킨-13 수용체 서브유닛 알파-2("IL-13Rα2"), 키나아제 삽입 도메인 수용체("KDR"; CD309), κ-경쇄, 루이스 얀티젠(Lewis Yantigen)("LeY"), L1 세포 부착 분자, MAGE-A1, 메소텔린, 뮤신 1, 세포 표면 관련("MUC1"), 전립선 줄기세포 항원, 전립선-특이적 막 항원, 종양-관련 당단백질 72("TAG-72") 또는 VEGF-R2인 세포.
  17. 제13항에 있어서, 리간드는 병원체에 의해 발현된 분자인 세포.
  18. 제17항에 있어서, 병원체는 바이러스, 박테리아, 진균, 기생충 또는 비로이드인 세포.
  19. 제13항에 있어서, CAR의 세포외 도메인은 단일쇄 가변성 단편("scFv") 도메인을 포함하는 세포.
  20. 제13항에 있어서, CAR의 세포내 도메인은 CD3ζ, 4-1BB 및/또는 CD28의 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 세포.
  21. 제13항의 세포를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 병태를 치료하는 방법.
  22. MIL을 포함하는 골수를 수득하는 것; 및
    키메라 항원 수용체를 인코딩하는 핵산으로 MIL을 형질감염, 형질변환 또는 형질도입하는 것
    을 포함하는 재조합 MIL을 제조하는 방법.
  23. 제22항에 있어서, 골수는 대상체로부터 수득되는 것인 방법.
  24. 제23항에 있어서, 대상체는 신생물(neoplasm)을 갖는 것인 방법.
  25. 제23항에 있어서, 대상체는 자가면역질환을 갖는 것인 방법.
  26. 제23항에 있어서, 대상체는 병원체에 의해 야기된 감염을 갖는 것인 방법.
  27. 제22항에 있어서, MIL을 활성화하는 것을 더 포함하는 방법.
  28. 제22항에 있어서, MIL을 증식하는 것을 더 포함하는 방법.
  29. 제22항에 있어서, 복수의 재조합 MIL을 제조하는 것을 포함하는 방법.
  30. 제23항에 있어서, 키메라 항원 수용체를 인코딩하는 핵산으로 MIL을 형질감염, 형질변환 또는 형질도입하기 전에, 저산소 조건에서 MIL을 인큐베이션하는 것을 더 포함하는 방법.
  31. 제30항에 있어서, 저산소 조건은 약 0.5% 내지 약 5%의 산소 가스를 포함하는 것인 방법.
  32. 제31항에 있어서, 저산소 조건은 약 1% 내지 약 2%의 산소 가스를 포함하는 것인 방법.
  33. 제30항에 있어서, 키메라 항원 수용체를 인코딩하는 핵산으로 MIL을 형질감염, 형질변환 또는 형질도입한 후에, 정상산소 조건에서 MIL을 인큐베이션하는 것을 더 포함하는 방법.
  34. 제30항에 있어서, 저산소 조건에서 MILS를 인큐베이션하는 동안 MIL을 항-CD3/항-CD28 비드와 접촉시키는 것을 더 포함하는 방법.
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