KR20200130865A

KR20200130865A - 사이토카인 방출 증후군 등의 개선제

Info

Publication number: KR20200130865A
Application number: KR1020207031661A
Authority: KR
Inventors: 요시히로 와타나베; 요시오 다하라; 게이스케 스즈키; 다카유키 미무라; 사오리 오마에
Original assignee: 도리이 야꾸힝 가부시키가이샤
Priority date: 2018-11-29
Filing date: 2019-11-29
Publication date: 2020-11-20
Also published as: WO2020111212A1; JPWO2020111212A1; CN112105362A; US11744830B2; US20210128550A1; KR102267370B1; CA3100681C; CA3100681A1; EP3782625A4; JP6746045B1; EP3782625A1

Abstract

(과제) 사이토카인 방출 증후군, 자기 면역 질환 관련 부작용, 마크로파지 활성화 증후군, 혈구 탐식성 림프 조직구증, 또는 랑게르한스 세포 조직구증에 대한 의약의 제공. (해결 수단) 다음 식 I : 로 나타내는 화합물, 또는 그 약학적으로 허용되는 염을 포함하는, 사이토카인 방출 증후군, 자기 면역 질환 관련 부작용, 마크로파지 활성화 증후군, 혈구 탐식성 림프 조직구증 및 랑게르한스 세포 조직구증으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 개에 대한 의약.]

Description

사이토카인 방출 증후군 등의 개선제

본 발명은, 사이토카인 방출 증후군, 자기 면역 질환 관련 부작용, 마크로파지 활성화 증후군, 혈구 탐식성 림프 조직구증, 또는 랑게르한스 세포 조직구증의 예방, 치료 또는 개선제에 관한 것이다.

최근에는, 암의 치료를 위해서 키메라 항원 수용체 (Chimeric antigen receptor : CAR) 발현 T 세포 (CAR-T 세포) 요법이나 T 세포 수용체 (TCR) 유전자 개변 T 세포 (TCR-T 세포) 요법이라고 불리는 치료법이 시도되고 있다. 또한 이 T 세포 활성화를 통한 암 치료는, 면역 체크 포인트 저해약에 의한 암 치료와, 체내에서 일어나고 있는 면역계의 활성화의 관점에서 공통성이 있다. CAR-T 세포 등의 세포 치료법은, 환자로부터 채취한 T 세포에, 표적능을 가지는 CAR 이나 특정 TCR 을 발현시키는 유전자 개변 기술을 실시한 후, 체내로 되돌리는 자가 T 세포 치료법이다. CAR 등을 발현한 T 세포는, 표적을 발현하는 암 세포를 포함하는 종양 세포를 살상할 (킬러 활성) 뿐만 아니라, 항원에 반복 노출됨으로써 기능적 T 세포의 증식을 효율적으로 확대시킨다. 또한, 살상된 종양 세포가 파괴될 때에 유리된 항원은, 항원 제시 세포에 제시됨으로써 내인성의 T 세포를 자극하여, 활성화를 유도한다. 따라서, CAR-T 세포는, 한 번 수주하면 환자 체내에 생착하여 증식하여, 면역 감시를 촉진시킬 수 있다.

또한, 면역 체크 포인트 저해약은, 면역 체크 포인트 분자 혹은 그 리간드에 결합하여 면역 억제 시그널의 전달을 저해함으로써, 면역 체크 포인트 분자에 의한 암 세포 인식 T 세포의 활성화 억제를 해제하는 약제이다. 임상 응용되고 있는 주된 면역 체크 포인트 저해약은, 항 cytotoxic T-lymphocyte associated antigen 4 (CTLA-4) 항체, 항 programmed system death-1 (PD-1) 항체, 항 programmed death-1 ligand-1 (PD-L1) 항체 등이다.

최근의 연구의 진전에 의해, 단구나 마크로파지의 이상 활성화 및 거기에 수반하는 조직 장애 (MAS, 마크로파지 활성화 증후군이라고도 한다), 혈구 탐식성 림프 조직구증 (HLH) 이나 랑게르한스 세포 조직구증 (LCH) 등이라고 불리는 골 병변 및 피부 병변 혹은 전신 장기 병변이 T 세포의 활성화에 수반하여 발증하는 것이 분명해졌다.

CAR-T 세포 요법에는, 사이토카인 방출 증후군 (cytokine-release syndrome : CRS) 이라고 불리는 문제 (CRS 독성) 가 발생한다. CRS 는, 발열, 저혈압, 저산소증, 뇌부종, 신경 변성 등을 수반하여, 혈중의 사이토카인 레벨이 현저하게 증가하는 상태이다.

CRS 독성은, CAR-T 세포의 암 환자로의 이입에 의해 필발하는 것으로, CAR-T 세포의 적응 또는 시행을 확대하는 데에 있어서, 그 제어가 매우 중요하다⁴⁾ (비특허문헌 1).

CAR-T 세포에 의한 혈액 암 세포나 암 조직의 인식과 파괴의 기전은 명확하지만, CRS 독성의 기전에 대해서는 불명한 점이 많다. CAR-T 세포 요법과 동시에 승인된 Interleukin (IL)-6R 항체 (토실리주맙) 가, CRS 독성을 허용역까지 제어할 수 있는 것으로부터, CRS 독성 기전으로서 IL-6 과잉 생산에 의한 정상 조직의 염증적 장애 기전이 시사되어 있다⁵⁾ (비특허문헌 2).

동일하게 면역 체크 포인트 저해약에 있어서도, 자기 면역 질환 관련 부작용 (irAEs) 이라고 불리는 면역 항진에 수반하여 피부, 소화기계, 내분비계, 신경계 등, 전신의 모든 장기에 염증성의 면역 반응이 발현하는 것이 보고되어 있다 (비특허문헌 10, 11). 치료의 기본은 휴약과 스테로이드 투여이지만 이 irAEs 예방 및 치료약은 이제 시작 단계로, 기존 약제를 포함하여 각종 검토되고 있는 것으로 생각된다.

토실리주맙 투여에 내성인 CRS 독성을 나타내는 환자에 있어서의 IL-6 경로 이외의 염증성 사이토카인류 (TNF-α, IL-18, IL-1β, MCP-1 등) 의 상승이나, 뇌부종 병발에 있어서의 항체약의 부적응 등을 배경으로 하여, CRS 독성에 널리 적응할 수 있는 약제나 신규 CAR 유전자의 개발이 요망되고 있다. 예를 들어, 과잉의 CAR-T 세포의 활성화를 컨트롤하는 것에 의해 CRS 독성을 제어할 수 있다는 착상으로부터, BTK 저해약에 의한 과잉의 CAR-T 세포 활성화의 억제의 시도⁶⁾ (비특허문헌 3) 나, CAR 유전자 내에 「약제 감수성 succide 유전자」 를 끼워 넣음으로써 과잉의 CAR-T 세포의 활성화를 제어하는 시도⁷⁾ (비특허문헌 4) 등이 이루어져 있다.

CRS 독성의 억제에, 현재도 사용되고 있는 스테로이드를 포함하여, 이들 약제 후보는, CAR-T 세포 기능의 억제를 주안으로 하는 것으로, 일시적이라고는 해도, CAR-T 세포에 의한 암 퇴축 효과를 지우는 결과를 유도하게 된다는 중대한 염려가 있다. 위중한 CRS 독성은 치사성인 것으로부터, 어쩔 수 없는 선택지로서, 그들의 적응이 검토되고 있다.

현 상황의 CAR-T 세포 요법이 주로 혈액 암에 한정되고, 고형 암에서는 명확한 성공 결과가 얻어져 있지 않은 상황에서, 보다 강력한 CAR 유전자나 병용약도 검토되고 있다. 예를 들어, 항원의 자극에 의존하여 사이토카인 시그널을 활성화하는 신규의 키메라 항원 수용체의 개발⁸⁾ (비특허문헌 5) 이나, 면역 체크 포인트 저해약인 PD-1/CTLA4 항체와의 병용⁹⁾ (비특허문헌 6) 등, 보다 킬러 활성을 증강시켜 장기 지속을 달성하고자 하는 방책도 시도되고 있다.

그 외에도, 이입하는 CAR-T 세포수의 증가나 항암제 전처리에 의한 CAR-T 세포의 암 조직 액세스의 개선 등도, 현실적인 암 퇴축 효과 증강의 방책이라고 생각된다.

그러한 CAR-T 세포 요법의 개량에 의해, 향후에는 더욱, 병발·필발하는 CRS 독성¹⁴⁾ 의 허용될 수 있는 적절한 제어는 중요한 과제가 될 것으로 생각된다.

그런데, JTE-607 이라고 불리는 화합물 ((-)-에틸 N-{3,5-디클로로-2-하이드록시-4-[2-(4-메틸피페라진-1-일)에톡시]벤조일}-L-페닐알라니네이트) 2 염산염 (특허문헌 1) 은, 염증성 사이토카인 생산을 억제하는 약제 후보로서 창생되었다.

JTE-607 은 염증성 사이토카인 생산을 억제하고, myeloid 계 세포에 선택성을 갖는 화합물로서, 전신성 염증 반응 증후군 (systemic inflammatory response syndrome : SIRS) 환자를 대상으로 하여 제 2 상 시험이 실시되었다. 제 1 상 후기 시험에 있어서는, JTE-607 은 LPS 부하에 있어서의 IL-6, IL-8 등의 염증성 사이토카인 생산을 억제하고, C 반응성 단백 (C-reactive protein : CRP) 상승을 투여량 의존적으로 억제하는 것이 밝혀졌다. 또한, 그 후 in vitro 계에서, 급성 골수성 백혈병 (Acute Myeloid Leukemia : AML) 세포주의 자기 증식을 선택적으로 억제하는 것도 밝혀졌다¹⁾ (비특허문헌 7).

CAR-T 세포 요법에 있어서의 CRS 독성이나 뇌부종 발증에는, 단구/마크로파지의 이상 활성화가 관여할 가능성이 보고되어 있다^{2), 3)} (비특허문헌 8, 9). 그러나 이것은, 임상 상의 사이토카인 생산 프로파일에 있어서, CRS 독성 발현과 IL-6 등 염증성 사이토카인 생산이 동기하고 있는 것이나 토실리주맙에 의한 CRS 독성의 개선 효과에 의해 추정되고 있는 「가설」 에 지나지 않는다. 이 가설을 검증하는 것은, CRS 독성의 특징을 파악하여 적절한 약제 개발을 촉구하는 것에만 머무르지 않고, 토실리주맙 내성 환자에서 사용되는 스테로이드 (프레드니솔론 : PSL) 처방으로 염려되는 CAR-T 세포 억제 (면역 억제) 가 없는 CRS 독성 개선·예방약의 연구 개발로 연결되는 것이 기대된다.

CAR-T 세포는, 일단 체외에서 가공하여 증폭한 T 세포를, 「체내에 대량 이입하는 항암 작용을 갖는 T 이펙터 세포」 로 위치 결정된다.

이 T 이펙터 세포의 과잉 증식은 내생적으로도 일어나는 현상으로, 예를 들어 면역 체크 포인트 저해약 투여에 의한 「내재성 항암 작용 T 이펙터 세포의 과잉 증폭」 이나 바이러스 감염·증폭시에 야기되는 「항바이러스성 T 이펙터 세포의 과잉 증폭」 을 들 수 있다. 이들 치료 및 질환 발증시에 병발하는 irAEs 나 HLH 및 MAS 에 있어서의 마크로파지 이상 활성화·사이토카인 과잉 생산은, CAR-T 세포 요법에 병발하는 CRS 독성과의 공통 사상으로서 파악할 수 있다. 사실, irAEs 에 대한 토실리주맙의 효과가 검토되어, 일정한 효과가 보고되어 있다 (비특허문헌 12).

이들의 부작용 및 질환의 공통 사상을 정리하면, T 이펙터 세포의 과잉 증식과 거기에 병발하는 마크로파지 등의 이상 활성화가, 각각 세포군이 서로 관련·영향을 주고 있는 것은 아닌가 하는 가설이 떠오른다. 따라서, CRS 독성의 해명과 치료법 개발은 곧, 이들 irAEs 나 HLH 및 MAS 증상에 대한 새로운 이해와 적절한 치료약의 개발로 연결되는 것으로 생각된다.

WO97/08133 (실시예 2)

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이와 같은 상황하, CRS, irAEs, HLH, MAS 및 LCH 등에 있어서 이들 질환 또는 증상을 개선하는 방법의 개발이 요망되고 있었다.

본 발명자는, 상기 과제를 해결하기 위해서 예의 검토를 실시한 결과, JTE-607 또는 그 유도체가 상기 질환 또는 증상을 개선하는 것을 알아내고, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

즉, 본 발명은 이하와 같다.

(1) 다음 식 I :

[화학식 1]

〔식 중, R₁ 은, 치환되어 있어도 되는 질소 함유 비방향족 알킬기 또는 치환되어 있어도 되는 질소 함유 복소 고리기를 나타내고, A 는, 단결합, 또는 치환되어 있어도 되고, 또한 사슬 중에 1 혹은 2 이상의 이중 결합 혹은 삼중 결합을 가지고 있어도 되는 탄소수 1 ∼ 10 의 직사슬형 혹은 분기형의 알킬렌기를 나타내고, R₂ 는, 산소 원자, 또는 -CO-, -COO-, -OCO- 혹은 -O-CO-O- 로 나타내는 기를 나타내고, R₃ 은, 동일 또는 상이하고, 수소 원자, 수산기, 할로겐 원자, 또는 치환되어 있어도 되고, 또한 직사슬형 혹은 분기형의 탄소수 1 ∼ 20 의 알킬기를 나타내고 (단, R₃ 의 적어도 1 개는 수소 원자가 아니다), n 은 1 ∼ 4 의 정수를 나타내고, m 은 0 또는 1 ∼ 6 의 정수를 나타내고, R₄ 는, 치환되어 있어도 되는 탄소수 6 ∼ 20 의 아릴기, 치환되어 있어도 되는 복소 고리기, 치환되어 있어도 되는 탄소수 3 ∼ 10 의 시클로알킬기, 치환되어 있어도 되는 탄소수 1 ∼ 20 의 직사슬형 혹은 분기형의 알킬기, 또는 치환되어 있어도 되는 탄소수 1 ∼ 20 의 직사슬형 혹은 분기형의 알콕시기를 나타내고, R₅ 는, 산소 원자, 또는 -CO-, -COO-, -OCO- 혹은 -O-CO-O- 로 나타내는 기를 나타내고, R₆ 은, 수소 원자, 또는 탄소수 1 ∼ 20 의 직사슬형 혹은 분기형의 알킬기, 혹은 치환되어 있어도 되는 탄소수 1 ∼ 20 의 아릴기를 나타낸다.〕

로 나타내는 화합물, 또는 그 약학적으로 허용되는 염을 포함하는, 사이토카인 방출 증후군, 자기 면역 질환 관련 부작용, 마크로파지 활성화 증후군, 혈구 탐식성 림프 조직구증 및 랑게르한스 세포 조직구증으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 개에 대한 의약.

(2) 질소 함유 비방향족 복소 고리기가 피페라지닐기 또는 피페리디닐기이고, A 가 탄소수 1 ∼ 10 의 직사슬형의 알킬렌기이고, R₂ 가 산소 원자이고, R₃ 이 동일 또는 상이하게 수소 원자 또는 할로겐 원자이고 (단, R₃ 의 적어도 1 개는 수소 원자가 아니다), R₄ 가 페닐기이고, R₅ 가 -COO- 로 나타내는 기를 나타내고, R₆ 이 탄소수 1 ∼ 10 의 직사슬형의 알킬기인, (1) 에 기재된 의약.

(3) 질소 함유 비방향족 알킬기가 알킬아미노기이고, A 가 탄소수 1 ∼ 10 의 직사슬형의 알킬렌기이고, R₂ 가 산소 원자이고, R₃ 이 동일 또는 상이하게 수소 원자 또는 할로겐 원자이고 (단, R₃ 의 적어도 1 개는 수소 원자가 아니다), R₄ 가 페닐기이고, R₅ 가 -COO- 로 나타내는 기를 나타내고, R₆ 이 탄소수 1 ∼ 10 의 직사슬형의 알킬기인, (1) 에 기재된 의약.

(4) 식 I 로 나타내는 화합물 또는 그 약학적으로 허용되는 염이, 다음 식 II :

[화학식 2]

로 나타내는 화합물 또는 그 약학적으로 허용되는 염인, (1) ∼ (3) 중 어느 한 항에 기재된 의약.

(5) 식 I 로 나타내는 화합물, 또는 그 약학적으로 허용되는 염이, 다음 식 III :

[화학식 3]

으로 나타내는 화합물 또는 그 약학적으로 허용되는 염인 (1) ∼ (4) 중 어느 한 항에 기재된 의약.

(6) 식 I 로 나타내는 화합물, 또는 그 약학적으로 허용되는 염이, 식 III 으로 나타내는 화합물의 염산염인, (1) ∼ (5) 중 어느 한 항에 기재된 의약.

(7) 식 I 로 나타내는 화합물, 또는 그 약학적으로 허용되는 염이, 다음 식 IV :

[화학식 4]

로 나타내는 화합물인 (1) ∼ (6) 중 어느 한 항에 기재된 의약.

(8) 질환 또는 증상이, 면역 체크 포인트 저해약의 사용에서 기인하는 것, 키메라 항원 수용체 발현 T 세포 요법에서 기인하는 것, 개변 T 세포 수용체 발현 T 세포 요법에서 기인하는 것, 또는 감염증, 암 및 자기 면역 질환으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 개에 의해 유발되는 것인, (1) ∼ (7) 중 어느 한 항에 기재된 의약.

(9) 사이토카인의 생산 및 마크로파지의 활성화의 적어도 1 개를 억제하는, (1) ∼ (8) 중 어느 한 항에 기재된 의약.

(10) 사이토카인이, 종양 괴사 인자 (TNF)-α, 인터류킨 (IL)-1β, IL-4, IL-6, IL-8, IL-1RA, IL-2Rα, IL-10, IL-18, 과립구 마크로파지 콜로니 자극 인자 (GM-CSF), 마크로파지 콜로니 자극 인자 (M-CSF), 인슐린 증식 인자 (IGF), 인터페론 (IFN)-γ, IFN-γ 유도 단백 10 (IP-10), 단구 주화성 인자 (MCP)-1, 혈관 내피 증식 인자 (VEGF), 오스테오폰틴 (OPN), Receptor activator of NF-κB ligand (RANKL), 사이토카인 수용체 gp130, 유리형 IL-1 수용체 (sIL-1R)-1, sIL-1R-2, 유리형 IL-6 수용체 (sIL-6R), 유리형 종말 당화 산물 수용체 (sRAGE), 유리형 TNF 수용체 (sTNFR)-1, sTNFR-2, IFN-γ 유도 모노카인 (MIG), 마크로파지 염증 단백 (MIP)-1α 및 MIP-1β 로 이루어지는 것에서 선택되는 적어도 1 개인, (1) ∼ (9) 중 어느 한 항에 기재된 의약.

(11) 사이토카인이, TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-8, IL-18, IFN-γ, MCP-1 및 OPN 으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 개인, (10) 에 기재된 의약.

(12) 사이토카인 방출 증후군, 자기 면역 질환 관련 부작용, 마크로파지 활성화 증후군, 혈구 탐식성 림프 조직구증 및 랑게르한스 세포 조직구증으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 개의 예방 또는 개선을 위한, (1) ∼ (11) 중 어느 한 항에 기재된 의약.

(13) 추가로, 본 발명은, 이하의 양태를 포함한다.

(13-1) 다음 식 I :

[화학식 5]

로 나타내는 화합물, 또는 그 약학적으로 허용되는 염을 포함하는, 사이토카인 방출 증후군, 자기 면역 질환 관련 부작용, 마크로파지 활성화 증후군, 혈구 탐식성 림프 조직구증 및 랑게르한스 세포 조직구증으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 개의 예방제, 치료제 또는 개선제.

(13-2) 상기 식 I (R₁, R₂, R₃, R₄, R₅, R₆, m 및 n 의 정의는 상기와 동일하다) 로 나타내는 화합물, 또는 그 약학적으로 허용되는 염을 포유 동물에 투여하는 것을 포함하는, 사이토카인 방출 증후군, 자기 면역 질환 관련 부작용, 마크로파지 활성화 증후군, 혈구 탐식성 림프 조직구증 및 랑게르한스 세포 조직구증으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 개를 예방, 치료 또는 개선하는 방법.

(13-3) 사이토카인 방출 증후군, 자기 면역 질환 관련 부작용, 마크로파지 활성화 증후군, 혈구 탐식성 림프 조직구증 및 랑게르한스 세포 조직구증으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 개를 예방, 치료 또는 개선하는 의약을 제조하기 위한, 상기 식 I (R₁, R₂, R₃, R₄, R₅, R₆, m 및 n 의 정의는 상기와 동일하다) 로 나타내는 화합물, 또는 그 약학적으로 허용되는 염의 사용.

(13-4) 사이토카인 방출 증후군, 자기 면역 질환 관련 부작용, 마크로파지 활성화 증후군, 혈구 탐식성 림프 조직구증 및 랑게르한스 세포 조직구증으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 개를 예방, 치료 또는 개선에 있어서의 사용을 위한, 상기 식 I (R₁, R₂, R₃, R₄, R₅, R₆, m 및 n 의 정의는 상기와 동일하다) 로 나타내는 화합물, 또는 그 약학적으로 허용되는 염.

(14) 상기 (13) 에 기재된 식 I 의 일 양태에서는, 질소 함유 비방향족 복소 고리기는 피페라지닐기 또는 피페리디닐기이고, A 가 탄소수 1 ∼ 10 의 직사슬형의 알킬렌기이고, R₂ 가 산소 원자이고, R₃ 이 동일 또는 상이하게 수소 원자 또는 할로겐 원자이고 (단, R₃ 의 적어도 1 개는 수소 원자가 아니다), R₄ 가 페닐기이고, R₅ 가 -COO- 로 나타내는 기를 나타내고, R₆ 이 탄소수 1 ∼ 10 의 직사슬형의 알킬기이다.

또한, 다른 양태에서는, 질소 함유 비방향족 알킬기가 알킬아미노기이고, A 가 탄소수 1 ∼ 10 의 직사슬형의 알킬렌기이고, R₂ 가 산소 원자이고, R₃ 이 동일 또는 상이하게 수소 원자 또는 할로겐 원자이고 (단, R₃ 의 적어도 1 개는 수소 원자가 아니다), R₄ 가 페닐기이고, R₅ 가 -COO- 로 나타내는 기를 나타내고, R₆ 이 탄소수 1 ∼ 10 의 직사슬형의 알킬기이다.

상기 (13) 에 기재된 식 I 의 다른 양태에서는, 식 I 로 나타내는 화합물 또는 그 약학적으로 허용되는 염이, 다음 식 II :

[화학식 6]

로 나타내는 화합물 또는 그 약학적으로 허용되는 염이고, 바람직하게는, 다음 식 III :

[화학식 7]

으로 나타내는 화합물 또는 그 약학적으로 허용되는 염이고, 더욱 바람직하게는, 식 I 로 나타내는 화합물, 또는 그 약학적으로 허용되는 염이, 식 III 으로 나타내는 화합물의 염산염이다.

상기 (13) 에 기재된 식 I 의 또 다른 양태에서는, 식 I 로 나타내는 화합물, 또는 그 약학적으로 허용되는 염은, 다음 식 IV :

[화학식 8]

로 나타내는 화합물이다.

(15) 상기 (13) 에 있어서, 질환 또는 증상으로는, 면역 체크 포인트 저해약의 사용에서 기인하는 것, 키메라 항원 수용체 발현 T 세포 요법에서 기인하는 것, 개변 T 세포 수용체 발현 T 세포 요법에서 기인하는 것, 또는 감염증, 암 및 자기 면역 질환으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 개에 의해 유발되는 것이고, 식 I ∼ IV 로 나타내는 화합물 또는 그 약학적으로 허용되는 염은, 사이토카인의 생산 및 마크로파지의 활성화의 적어도 1 개를 억제한다. 여기서, 사이토카인으로는, TNF-α, IL-1β, IL-4, IL-6, IL-8, IL-1RA, IL-2Rα, IL-10, IL-18, GM-CSF, M-CSF, IGF, IFN-γ, IP-10, MCP-1, VEGF, OPN, RANKL, 사이토카인 수용체 gp130, sIL-1R-1, sIL-1R-2, sIL-6R, sRAGE, sTNFR-1, sTNFR-2, MIG, MIP-1α 및 MIP-1β 로 이루어지는 것에서 선택되는 적어도 1 개를 들 수 있고, 바람직하게는, TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-8, IL-18, IFN-γ, MCP-1 및 OPN 으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 개이다.

본 발명에 의해, CRS, irAEs, HLH, MAS 및 LCH 로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 개에 대한 의약이 제공된다. 식 I 에 나타내는 화합물 또는 그 약학적으로 허용되는 염을 포함하는 의약은, 염증성 사이토카인의 방출을 억제하고 이들 증상을 개선 또는 예방하고, 나아가서는 CAR-T 세포 요법이나 면역 체크 포인트 저해약의 효과를, 상대적으로 증강시킬 수 있을 가능성이 있다.

도 1 은, CD8⁺ T 세포의 T 세포 자극 비드에 의한 IFN-γ 생산에 대한 JTE-607 및 PSL 작용을 나타내는 도면이다.
도 2 는, CD14⁺ 세포의 LPS 자극에 의한 IL-6 생산에 대한 JTE-607 및 PSL 작용을 나타내는 도면이다.
도 3 은, CD8⁺ T 세포로부터의 IFN-γ 생산과 CD14⁺ 세포로부터의 IL-6 생산에 대한 JTE-607 및 PSL 작용을 나타내는 도면이다.
도 4 는, 말초혈 단핵구 (PBMC) 의 LPS 자극에 의한 IL-6 생산에 대한 JTE-607 및 PSL 작용을 나타내는 도면이다.
도 5 는, PBMC 의 T 세포 자극 비드 및 LPS 자극에 의한 IL-6 및 IFN-γ 생산에 대한 JTE-607 및 PSL 의 작용을 나타내는 도면이다.
도 6 은, PBMC 의 T 세포 자극 비드 및 LPS 자극에 의한 CRS 독성 평가계에 대한 JTE-607 및 PSL 의 작용을 나타내는 도면이다.
도 7 은, CD4⁺ T 세포 결여 PBMC 의 T 세포 자극 비드 및 LPS 자극에 의한 IL-6 및 IFN-γ 생산에 대한 JTE-607 및 PSL 의 작용을 나타내는 도면이다.
도 8 은, CD4⁺ T 세포 결여 PBMC 의 T 세포 자극 비드 및 LPS 자극에 의한 CRS 독성 평가계에 대한 JTE-607 및 PSL 의 작용을 나타내는 도면이다.
도 9 는, PBMC 의 LPS 자극에 의한 MCP-1 생산에 대한 JTE-607 및 PSL 작용을 나타내는 도면이다.
도 10 은, CD8⁺ T 세포의 T 세포 자극 비드에 의한 TNF-α 생산에 대한 JTE-607 및 PSL 작용을 나타내는 도면이다.
도 11 은, CD14⁺ 세포의 LPS 자극에 의한 TNF-α 생산에 대한 JTE-607 및 PSL 작용을 나타내는 도면이다.
도 12 는, PBMC 의 LPS 자극에 의한 TNF-α 생산에 대한 JTE-607 및 PSL 작용을 나타내는 도면이다.
도 13 은, PBMC 의 LPS 자극에 의한 OPN 생산에 대한 JTE-607, PSL 및 토실리주맙의 작용을 나타내는 도면이다.
도 14 는, PBMC 의 LPS 자극에 의한 IL-1β 생산에 대한 JTE-607, PSL 및 토실리주맙의 작용을 나타내는 도면이다.
도 15 는, LPS 전처치 CD14⁺ 세포의 ATP 자극에 의한 IL-18 생산에 대한 JTE-607, PSL 및 토실리주맙의 작용을 나타내는 도면이다.
도 16 은, 마크로파지의 LPS 자극에 의한 VEGF 생산에 대한 JTE-607, PSL 및 토실리주맙의 작용을 나타내는 도면이다.
도 17 은, CAR-T 세포의 킬러 활성에 대한 CD14⁺ 세포의 작용을 나타내는 도면이다.
도 18 은, CAR-T 세포를 사용한 혼합 배양계의 사이토카인 생산에 대한 CD14⁺ 세포의 작용을 나타내는 도면이다.
도 19 는, CAR-T 세포의 킬러 활성에 대한 JTE-607 및 PSL 의 작용을 나타내는 도면이다.
도 20 은, CAR-T 세포를 사용한 CRS 독성 평가계에서의 IL-6 및 IFN-γ 생산에 대한 JTE-607 및 PSL 의 작용을 나타내는 도면이다.
도 21 은, CAR-T 세포를 사용한 CRS 독성 평가계에서의 MCP-1 생산에 대한 JTE-607, PSL 및 토실리주맙의 작용을 나타내는 도면이다.
도 22 는, CAR-T 세포를 사용한 CRS 독성 평가계에서의 IL-8 생산에 대한 JTE-607, PSL 및 토실리주맙의 작용을 나타내는 도면이다.
도 23 은, CAR-T 세포를 사용한 CRS 독성 평가계에서의 TNF-α 생산에 대한 JTE-607, PSL 및 토실리주맙의 작용을 나타내는 도면이다.
도 24 는, CAR-T 세포를 사용한 CRS 독성 평가계에서의 IL-1β 생산에 대한 JTE-607, PSL 및 토실리주맙의 작용을 나타내는 도면이다.
도 25 는, CAR-T 세포를 사용한 CRS 독성 평가계에서의 IL-18 생산에 대한 JTE-607, PSL 및 토실리주맙의 작용을 나타내는 도면이다.
도 26 은, 본 발명의 화합물의 작용 기전의 개요를 나타내는 도면이다.

이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.

1. 개요

본 발명은, 다음 식 I :

[화학식 9]

로 나타내는 화합물, 또는 그 약학적으로 허용되는 염을 포함하는, 사이토카인 방출 증후군 (CRS), 자기 면역 질환 관련 부작용 (irAEs), 마크로파지 활성화 증후군 (MAS), 혈구 탐식성 림프 조직구증 (HLH) 및 랑게르한스 세포 조직구증 (LCH) 으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 개에 대한 의약으로, 이들 질환 또는 증상의 예방 또는 개선제로서, 또한 각종 첨가물을 포함하는 의약 조성물로서 사용할 수 있다.

식 I 에 나타내는 화합물 또는 그 약학적으로 허용되는 염 (총칭하여 「본 발명의 화합물」 이라고도 한다) 에 있어서, 본 발명자는, CD19-CAR-T 세포의 표적 세포 인식 및 항 CD3 항체 및 항 CD28 항체를 공유 결합시킨 자기 비드 (T 세포 자극 비드) 에 의한 CD8⁺ T 세포 활성화를 통한 CRS 독성을 재현하는 평가계를 구축하고, 당해 화합물 (예를 들어 JTE-607) 의 작용을, 기존 약인 PSL 의 작용과 비교 검토하였다. 그 결과, PSL 에서는 T 세포 기능의 억제가 우위 (면역 억제 : CAR-T 세포 기능이나 CD8⁺ 기능의 억제) 이지만, IL-6 등의 염증성 사이토카인 생산 억제 작용이 약했던 데에 반하여, JTE-607 에서는, IL-6 등의 염증성 사이토카인류의 생산을 용량 의존적으로 강하게 억제하는 특징을 나타내고, CAR-T 세포나, CD4⁺ 기능, CD8⁺ 기능에 대한 작용 (표적 암 세포 상해능, IFN-γ 생산능 등) 은 한정적이고 용량 의존성도 확인되지 않았다. 또한 JTE-607 은, IL-6 생산 억제뿐만 아니라, IL-18 및 Osteopontin (OPN) 생산도 용량 의존적으로 억제하지만, 토실리주맙에서는 이들 사이토카인 생산 억제 작용은 확인되지 않았다.

본 발명의 화합물의 작용 메커니즘을 도 26 에 나타낸다. 도 26 에 있어서 내인성 T 이펙터 세포가 과잉으로 반응하면, 단구/마크로파지 활성화를 수반하는 일련의 질환 또는 증상을 유도한다 (도 26, 파선부의 하측). 본 발명의 화합물은, 이들 질환 또는 증상을 예방 또는 개선 (치료를 포함한다) 하기 위해서 사용할 수 있다.

이상으로부터, 본 발명의 화합물은, CRS, irAEs, HLH, MAS 및 LCH 로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 개의 질환 또는 증상에 대한 의약으로서, 예를 들어 CAR-T 세포 요법으로 병발하는 CRS 독성의 개선·예방에 유효한 치료 툴이 된다. 따라서, 본 발명은, 본 발명의 화합물, 또는 본 발명의 화합물을 포함하는 의약을, CRS, irAEs, HLH, MAS 및 LCH 로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 개의 질환 또는 증상을 갖는 환자에게 투여하는 공정을 포함하는, 당해 질환 또는 증상의 예방 방법 또는 개선 혹은 치료 방법을 제공한다.

또한, T 세포의 잠재 기능의 증강약인 bi-specific 항체나 PD1/CTLA4 항체 등의 면역 체크 포인트 저해약 투여로 병발하는 고사이토카인 혈증형 증상에 있어서도, 증강된 T 세포 기능에 현저한 영향을 주지 않고 이들 CRS 형 증상인 irAEs 를 개선할 수 있다.

여기서, 「예방」 이란, 상기 질환 또는 증상의 소인을 가질 수 있지만, 아직 가지고 있는 것으로 진단되어 있지 않은 환자에 있어서, 상기 질환 또는 증상이 일어나는 것을 억제하는 것을 의미한다.

「치료」 란, 상기 질환 또는 증상을 저해하는 것, 즉, 이들의 진행을 저지, 지연 또는 소실시키는 것을 의미한다.

「개선」 이란, 상기 질환 또는 증상을 완화하는 것, 즉, 상기 질환 또는 증상의 후퇴, 또는 증상의 진행의 역전을 일으키는 것을 의미한다.

2. 화합물 또는 그 약학적으로 허용되는 염

본 발명에 있어서, CRS, irAEs, HLH, MAS 및 LCH 로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 개의 질환 또는 증상에 대한 의약 (예를 들어 이들 질환의 예방, 치료 또는 개선제) 으로서 사용되는 유효 성분이 되는 화합물은, 다음 식 I 에 나타내는 것이다. 본 발명의 화합물에 있어서, 식 I 에 나타내는 것을, 「화합물 (I)」 이라고도 한다.

[화학식 10]

식 중, R₁ 은, 질소 함유 비방향족 알킬기 또는 치환되어 있어도 되는 질소 함유 복소 고리기를 나타낸다.

A 는, 단결합, 또는 치환되어 있어도 되고, 또한 사슬 중에 1 혹은 2 이상의 이중 결합 혹은 삼중 결합을 가지고 있어도 되는 탄소수 1 ∼ 20 의 직사슬형 혹은 분기형의 알킬렌기를 나타낸다. A 는, 탄소수 1 ∼ 6 의 직사슬형 알킬렌기가 바람직하고, 에틸렌기인 것이 더욱 바람직하다.

R₂ 는, 산소 원자, 또는 -CO-, -COO-, -OCO- 혹은 -O-CO-O- 로 나타내는 기를 나타낸다.

R₃ 은, 동일 또는 상이하고, 수소 원자, 수산기, 할로겐 원자, 또는 치환되어 있어도 되고, 또한 직사슬형 혹은 분기형의 탄소수 1 ∼ 20 의 알킬기를 나타낸다. 단, R₃ 의 적어도 1 개는 수소 원자가 아니다.

n 은 1 ∼ 4 의 정수를 나타내고, 3 인 것이 바람직하고, 그 중의 2 개가 할로겐 원자, 다른 1 개가 수산기인 것이 더욱 바람직하다.

R₄ 는, 치환되어 있어도 되는 탄소수 6 ∼ 20 의 아릴기, 치환되어 있어도 되는 복소 고리기, 치환되어 있어도 되는 탄소수 3 ∼ 10 의 시클로알킬기, 치환되어 있어도 되는 탄소수 1 ∼ 20 의 직사슬형 혹은 분기형의 알킬기, 또는 치환되어 있어도 되는 탄소수 1 ∼ 20 의 직사슬형 혹은 분기형의 알콕시기를 나타낸다. m 은 0 또는 1 ∼ 6 의 정수를 나타내고, 2 인 것이 바람직하다.

R₅ 는, 산소 원자, 또는 -CO-, -COO-, -OCO- 혹은 -O-CO-O- 로 나타내는 기를 나타내고, -COO- 로 나타내는 기인 것이 바람직하다.

R₆ 은, 수소 원자, 또는 탄소수 1 ∼ 20 의 직사슬형 혹은 분기형의 알킬기, 혹은 치환되어 있어도 되는 탄소수 6 ∼ 20 의 아릴기를 나타내지만, 탄소수 1 ∼ 6 의 직사슬형 알킬기가 바람직하고, 에틸기인 것이 더욱 바람직하다.

「질소 함유 비방향족 알킬기」 란, 적어도 1 개의 질소 원자를 갖는, 탄소수 1 ∼ 10 의 알킬기이고, 예를 들어 메틸아미노기를 들 수 있다.

「질소 함유 비방향족 복소 고리기」 란, 적어도 1 개의 질소 원자를 갖고, 황 원자 또는 산소 원자를 가지고 있어도 되는 3 ∼ 7 원의 비방향족 복소 고리기를 의미하고, 이들은 벤젠 고리와 축합하고 있어도 된다. 구체적으로는 아지리디닐기, 티아제티디닐기, 아제티디닐기, 피롤리디닐기, 피롤리닐기, 이미다졸리디닐기, 이미다졸리닐기, 피라졸리디닐기, 피라졸리닐기, 모르폴리닐기, 모르폴리노기, 옥사지닐기, 티아지닐기, 피페라지닐기, 피페리딜기, 피페리지노기, 디옥사제피닐기, 티아제피닐기, 디아제피닐기, 퍼하이드로디아제피닐기, 아제피닐기, 퍼하이드로아제피닐기, 인돌리닐기, 이소인돌리닐기 등을 들 수 있다. 바람직하게는 아지리디닐기, 아제티디닐기, 피롤리디닐기, 피라졸리디닐기, 모르폴리닐기, 모르폴리노기, 피페라지닐기, 피페리딜기, 피페리지노기, 퍼하이드로아제피닐기이고, 특히 바람직하게는 피페라지닐기, 피페리딜기이다.

「알킬렌기」 란, 직사슬 또는 분기형의 사슬 중에 1 또는 2 이상의 이중 결합 또는 삼중 결합을 가지고 있어도 되는 알킬렌기를 의미하고, 탄소수 1 ∼ 20 의 직사슬형 혹은 분기형의 알킬렌기로는, 예를 들어, 메틸렌기, 에틸렌기, 트리메틸렌기, 테트라메틸렌기, 펜타메틸렌기, 헥사메틸렌기, 헵타메틸렌기, 옥타메틸렌기, 노나메틸렌기, 데카메틸렌기, 디메틸메틸렌기, 디에틸메틸렌기, 프로필렌기, 메틸에틸렌기, 에틸에틸렌기, 프로필에틸렌기, 이소프로필에틸렌기, 메틸펜타메틸렌기, 에틸헥사메틸렌기, 디메틸에틸렌기, 메틸트리메틸렌기, 디메틸트리메틸렌기, 비닐렌기, 프로페닐렌기, 부테닐렌기, 부타디에닐렌기, 펜테닐렌기, 펜타디에닐렌기, 헥세닐렌기, 헥사디에닐렌기, 헥사트리에닐렌기, 헵테닐렌기, 헵타디에닐렌기, 헵타트리에닐렌기, 옥테닐렌기, 옥타디에닐렌기, 옥타트리에닐렌기, 옥타테트라에닐렌기, 프로피닐렌기, 부티닐렌기, 펜티닐렌기, 메틸프로피닐렌기 등을 들 수 있다.

바람직하게는, 메틸렌기, 에틸렌기, 트리메틸렌기, 테트라메틸렌기, 펜타메틸렌기, 헥사메틸렌기, 헵타메틸렌기, 옥타메틸렌기, 노나메틸렌기, 데카메틸렌기, 비닐렌기, 프로페닐렌기, 부테닐렌기, 부타디에닐렌기, 펜테닐렌기, 펜타디에닐렌기, 헥세닐렌기, 헥사디에닐렌기, 헥사트리에닐렌기, 헵테닐렌기, 헵타디에닐렌기, 헵타트리에닐렌기, 옥테닐렌기, 옥타디에닐렌기, 옥타트리에닐렌기, 옥타테트라에닐렌기, 프로피닐렌기, 부티닐렌기, 펜티닐렌기 등의 직사슬의 알킬렌기이고, 더욱 바람직하게는 메틸렌기, 에틸렌기, 트리메틸렌기, 테트라메틸렌기, 펜타메틸렌기, 헥사메틸렌기 등의 탄소수 1 ∼ 6 개의 직사슬의 알킬렌기이다.

「알킬기」 는, 직사슬형, 분기 사슬형, 또는 그들의 조합으로 이루어지는 알킬기이고, 탄소수 1 ∼ 20 개이고, 바람직하게는 탄소수 1 ∼ 10 개 또는 1 ∼ 6 개이다.

상기 알킬기로는, 예를 들어, 메틸기, 에틸기, n-프로필기, 이소프로필기, n-부틸기, 이소부틸기, s-부틸기, tert-부틸기, n-펜틸기, 이소펜틸기, 2-메틸부틸기, 네오펜틸기, 1-에틸프로필기, n-헥실기, 이소헥실기, 4-메틸펜틸기, 3-메틸펜틸기, 2-메틸펜틸기, 1-메틸펜틸기, 3,3-디메틸부틸기, 2,2-디메틸부틸기, 1,1-디메틸부틸기, 1,2-디메틸부틸기, 1,3-디메틸부틸기, 2,3-디메틸부틸기, 2-에틸부틸기, n-헵틸기, n-옥틸기, n-노닐기, n-데실기, n-운데실기, n-도데실기, n-트리데실기, n-테트라데실기, n-펜타데실기, n-헥사데실기, n-헵타데실기, n-옥타데실기, n-노나데실기, n-에이코실기 등을 들 수 있다. 알콕시기는 탄소수 1 ∼ 20 개의 알콕시기이고, 알콕시기의 알킬 부분은 상기에 설명한 알킬기와 동일하다.

탄소수 6 ∼ 20 의 아릴기로는, 예를 들어 페닐기, 1-나프틸기, 2-나프틸기, 인데닐기, 비페닐기, 안트릴기, 페난트릴기 등을 들 수 있다.

복소 고리기는, 적어도 1 개의 질소 원자, 황 원자 또는 산소 원자를 가지고 있어도 되는 3 ∼ 7 원의 비방향족 복소 고리기를 의미하고, 구체적 치환기는, 「질소 함유 비방향족 복소 고리기」 의 항에서 설명한 내용과 동일하다.

탄소수 3 ∼ 10 의 시클로알킬기로는, 예를 들어 시클로프로필기, 시클로부틸기, 시클로펜틸기, 시클로헥실기, 시클로헵틸기, 시클로옥틸기 등을 들 수 있다.

본 명세서에 있어서, 어느 관능기에 대하여 「치환기를 가지고 있어도 된다」 또는 「치환되어 있어도 된다」 라고 하는 경우에는, 특별히 언급하는 경우를 제외하고, 그 관능기가 화학적으로 가능한 위치에 1 개 또는 2 개 이상의 「치환기」 를 갖는 경우가 있는 것을 의미한다. 관능기에 존재하는 치환기의 종류, 치환기의 개수, 및 치환 위치는 특별히 한정되지 않고, 2 개 이상의 치환기가 존재하는 경우에는, 그것들은 동일해도 되고 상이해도 된다. 관능기에 존재하는 「치환기」 로는, 예를 들어, 알킬기, 알케닐기, 알키닐기, 알콕시기, 아릴기, 할로겐 원자, 옥소기, 티옥소기, 니트로기, 니트로소기, 시아노기, 이소시아노기, 시아나토기, 티오시아나토기, 이소시아나토기, 이소티오시아나토기, 하이드록시기, 술파닐기, 카르복시기, 술파닐카르보닐기, 옥살로기, 메소옥살로기, 티오카르복시기, 디티오카르복시기, 카르바모일기, 티오카르바모일기, 술포기, 술파모일기, 술피노기, 술피나모일기, 술페노기, 술페나모일기, 포스포노기, 하이드록시포스포닐기, 헤테로 고리기, 헤테로 고리-옥시기, 알킬술파닐기, 아실기, 아미노기, 히드라지노기, 히드라조노기, 디아제닐기, 우레이도기, 티오우레이도기, 구아니디노기, 아미디노기, 아지드기, 이미노기, 하이드록시아미노기, 하이드록시이미노기, 아미노옥시기, 디아조기, 세미카르바지노기, 세미카르바조노기, 알로파닐기, 히단토일기, 포스파노기, 포스포로소기, 포스포기, 보릴기, 실릴기, 스타닐기, 세라닐기, 옥사이드기 등을 들 수 있지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.

화합물 (I) 의 염으로는, 무기산 또는 유기산과의 염 (산 부가 염) 을 들 수 있다.

무기산으로는, 예를 들어, 염산, 황산, 인산, 브롬화수소산, 질산 등을 들 수 있고, 유기산으로는, 예를 들어, 옥살산, 말레산, 푸마르산, 말산, 타르타르산, 숙신산, 시트르산, 아세트산, 락트산, 메탄술폰산, 파라톨루엔술폰산, 벤조산, 발레르산, 말론산, 니코틴산, 프로피온산 등을 들 수 있다.

본 발명의 바람직한 산 부가 염은, 염산과의 염이고, 더욱 바람직하게는 2 염산염이다.

화합물 (I) 에는, 부제 탄소에 기초하는 1 또는 2 이상의 입체 이성체가 존재할 수 있다. 본 발명은, 당해 이성체 및 그 혼합물도 포함한다. 또한, 화합물 (I) 또는 그 약학적으로 허용되는 염의 수화물, 약리적으로 허용되는 유기 용매 (예를 들어, 에탄올 등) 와의 용매화물, 그리고 프로드러그도 본 발명에 포함된다.

「프로드러그」 란, 화학적 또는 대사적으로 분해할 수 있는 기를 갖고, 생체에 투여된 후, 원의 화합물로 복원하여 본래의 약효를 나타내는 본 발명 화합물의 유도체로, 공유 결합에 의하지 않는 복합체 및 염을 포함한다.

화합물 (I) 의 프로드러그로는, 화합물 (I) 의 카르복실기가, 에틸기, 피발로일옥시메틸기, 1-(아세틸옥시)에틸기, 1-(에톡시카르보닐옥시)에틸기, 1-(시클로헥실옥시카르보닐옥시)에틸기, 카르복실메틸기, (5-메틸-2-옥소-1,3-디옥솔-4-일)메틸기, 페닐기, o-톨릴기 등으로 수식된 화합물 등을 들 수 있다. 또한, 화합물 (I) 의 수산기가, 아세틸기, 프로피오닐기, 이소부티릴기, 피발로일기, 벤조일기, 4-메틸벤조일기, 디메틸카르바모일기, 술포기로 수식된 화합물 등을 들 수 있다.

본 발명에 있어서, 화합물 (I) 은, 바람직하게는 다음 식 III :

[화학식 11]

으로 나타내는 (-)-에틸 N-{3,5-디클로로-2-하이드록시-4-[2-(4-메틸피페라진-1-일)에톡시]벤조일}-L-페닐알라니네이트 (즉, N-{3,5-디클로로-2-하이드록시-4-[2-(4-메틸피페라진-1-일)에톡시]벤조일}-L-페닐알라닌에틸에스테르) 또는 그 약리학적으로 허용되는 염을 들 수 있다.

더욱 바람직하게는, 본 발명에 있어서 사용되는 화합물은, 상기 식 II 로 나타내는 화합물의 산 부가 염 (예를 들어 2 염산염) 이고, 더욱 바람직하게는 식 IV

[화학식 12]

로 나타내는 화합물이다.

당해, 식 IV 로 나타내는 화합물은, (-)-에틸 N-{3,5-디클로로-2-하이드록시-4-[2-(4-메틸피페라진-1-일)에톡시]벤조일}-L-페닐알라니네이트 2 염산염 (즉, N-{3,5-디클로로-2-하이드록시-4-[2-(4-메틸피페라진-1-일)에톡시]벤조일}-L-페닐알라닌에틸에스테르 2 염산염) 이고, 별명 「JTE-607」 이라고도 한다.

본 발명의 화합물은, 동물 (예를 들어, 래트, 마우스, 토끼, 돼지, 고양이, 개, 소, 말, 원숭이, 인간 등의 포유 동물) 에 있어서 생산되는 각종 염증성 사이토카인의 생산을 억제한다.

특히, 본 발명에 있어서는, CRS, irAEs, HLH, MAS 및 LCH 중 1 개 또는 복수의 질환 또는 증상에 대한 의약으로서 유효하다.

예를 들어, 인간의 사이토카인 방출 증후군에서는, 특히, CAR-T 세포 요법에 있어서의 CRS 및 뇌부종에 있어서 유효하다. 따라서, 본 발명의 화합물은, CAR-T 세포 요법과 조합하여 사용할 수 있다. 「조합하여」 란, 본 발명의 화합물을 CAR-T 세포 요법과 병용하는 것을 의미하지만, 조합하여 사용하는 시기는 특별히 한정되는 것이 아니고, CAR-T 세포 요법 전, CAR-T 세포 요법 중 및 CAR-T 세포 요법 후의 어느 시기여도 된다. irAEs, HLH, MAS 및 LCH 에 대해서도 CRS 와 동일하게, 이들 질환 또는 증상의 치료에 사용되는 약제 또는 치료법과 병용하여 본 발명의 화합물을 사용할 수 있다.

본 발명의 화합물은, 사이토카인의 생산 억제, 마크로파지의 활성화의 억제 또는 사이토카인의 생산 및 마크로파지의 활성화의 양자를 억제할 수 있다. 여기서, 「마크로파지의 활성화」 란, 각종 사이토카인, 세포 상해성 프로테아제나 활성 산소종 등의 과잉 방출, 나아가서는 옵소닌 작용이나 탐식능의 항진 등을 의미한다.

「사이토카인」 으로는, 예를 들어 종양 괴사 인자 (TNF)-α, IL-1β, IL-4, IL-6, IL-8, IL-1RA, IL-2Rα, IL-10, IL-18, 과립구 마크로파지 콜로니 자극 인자 (GM-CSF), 마크로파지 콜로니 자극 인자 (M-CSF), 인슐린 증식 인자 (IGF), 인터페론 (IFN)-γ, IFN-γ 유도 단백 10 (IP-10), 단구 주화성 인자 (MCP)-1, 혈관 내피 증식 인자 (VEGF), 오스테오폰틴 (OPN), Receptor activator of NF-κB ligand (RANKL), 사이토카인 수용체 gp130, 유리형 IL-1 수용체 (sIL-1R)-1, sIL-1R-2, 유리형 IL-6 수용체 (sIL-6R), 유리형 종말 당화 산물 수용체 (sRAGE), 유리형 TNF 수용체 (sTNFR)-1, sTNFR-2, IFN-γ 유도 모노카인 (MIG), 마크로파지 염증 단백 (MIP)-1α, MIP-1β 등을 들 수 있다.

irAEs 란, 주로 면역 체크 포인트 저해약의 투여에 의해 면역 전반이 과잉으로 활성화됨으로써, 자기 자신을 공격하여, 여러 가지 자기 면역 질환의 증상을 일으키는 것을 말한다. 주된 증상으로는, 간질성 폐질환, 대장염, 갑상선 기능 저하증, 간 장애, 발심, 하수체염, 당뇨병, 신기능 장애, 말초 신경 장애, 중증 근무력증 등 전신의 모든 장기에서 보고되어 있다.

HLH 는, 살세포 과립 및 그 방출에 관련되는 유전자의 이상에 의해 발증하는 질환을 말한다. 고사이토카인 혈증에 수반하는 조직 상해 및 마크로파지의 증식 등의 병리상 (像) 을 특징으로 한다. HLH 에 관련된 염증성 사이토카인은 IFN-γ, IL-1β, IL-6, IL-18, TNF-α 등이 보고되어 있다.

MAS 란, 외인자 (바이러스, 세균, 진균 등의 감염 인자나 약제) 나 내인자 (자기 세포의 아포토시스/네크로시스 (apoptosis/necrosis) 에 의해 발생하는 파쇄물 등), 예를 들어 바이러스 반응성 T 세포 이펙터의 증식·활성화에 수반하여, 마크로파지의 이상 활성화에 의한 염증성 사이토카인의 과잉 상태에 의한 치사적인 병태를 말한다. MAS 에 관련된 염증성 사이토카인은 IFN-γ, IL-1β, IL-6, IL-18, TNF-α 등이 보고되어 있다. HLH 와 MAS 는 유사하고, HLH 가 병리학적 진단에 의해 확정되는 데에 반하여, MAS 는 생리학적 진단에 의해 확정된다. 어느 병태에 있어서도 마크로파지의 활성화가 중요한 포인트가 된다.

LCH¹³⁾ 란, 랑게르한스 세포가, 피부나 뼈·림프절 등에서 비정상적으로 증가하는 병태를 말한다. 병변 부위에는 랑게르한스 세포 이외에 호산구나 림프구, 마크로파지, 파골 세포형 거세포 등의 염증 세포 침윤이 있고, 이들이 서로 활성화하여, OPN, RANKL, IL-18, CC 모티브 케모카인 2 (CCL2) 등을 대표로 하는 염증성 사이토카인/케모카인이 다량으로 분비되어, 조직 파괴가 발생하는 것이 알려져 있다.

이들 질환 또는 증상은, 면역 체크 포인트 저해약의 사용, 키메라 항원 수용체 발현 T 세포 요법, 개변 T 세포 수용체 발현 T 세포 요법 등에 의해 기인하는 것이고, 혹은, 감염증, 암 및 자기 면역 질환의 어느 것 또는 조합에 의해 유발된다.

면역 체크 포인트 저해약이란, 면역 체크 포인트 분자 (자기에 대한 면역 응답을 억제함과 함께 과잉의 면역 반응을 억제하는 분자군) 또는 그 리간드에 결합하여 면역 억제 시그널의 전달을 저해함으로써, 면역 체크 포인트 분자에 의한 T 세포의 활성화 억제를 해제하는 약제로, 예를 들어 항 CTLA-4 항체, 항 PD-1 항체, 항 PD-L1 항체 등을 들 수 있다.

CAR-T 세포 요법은, 환자로부터 채취한 T 세포에 표적능을 가지는 키메라 항원 수용체 (CAR) 를 발현시키는 유전자 개변을 실시한 후, 체내로 되돌린다고 하는, 자가 T 세포 치료법이다.

개변 T 세포 수용체 발현 T (TCAR-T) 세포 요법은, 예를 들어 암 항원 에피토프를 특정 인간 백혈구 항원 (HLA) 구속성으로 인식하는 특정 TCR 유전자를, 체외에서 이펙터 T 세포에 유전자 도입하고, 증폭한 후에 체내에 투여하는 요법으로, CAR-T 세포 요법과 유사한 세포 요법이다.

상기 (1) 에 기재한 의약의 바람직한 양태로서, 이하가 예시된다.

· 키메라 항원 수용체 발현 T 세포 요법에서 기인하는, 사이토카인 방출 증후군, 마크로파지 활성화 증후군 및 혈구 탐식성 림프 조직구증으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 개에 대한 의약.

· 키메라 항원 수용체 발현 T 세포 요법에서 기인하는 사이토카인 방출 증후군에 대한 의약.

· 키메라 항원 수용체 발현 T 세포 요법에서 기인하는 마크로파지 활성화 증후군에 대한 의약.

· 키메라 항원 수용체 발현 T 세포 요법에서 기인하는 혈구 탐식성 림프 조직구증에 대한 의약.

· 키메라 항원 수용체 발현 T 세포 요법과 조합하여 사용하기 위한, 식 I 로 나타내는 화합물, 또는 그 약학적으로 허용되는 염을 포함하는, 사이토카인 방출 증후군, 마크로파지 활성화 증후군 및 혈구 탐식성 림프 조직구증으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 개에 대한 의약.

· 개변 T 세포 수용체 발현 T 세포 요법에서 기인하는, 사이토카인 방출 증후군, 마크로파지 활성화 증후군 및 혈구 탐식성 림프 조직구증으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 개에 대한 의약.

· 개변 T 세포 수용체 발현 T 세포 요법에서 기인하는 사이토카인 방출 증후군에 대한 의약.

· 개변 T 세포 수용체 발현 T 세포 요법에서 기인하는 마크로파지 활성화 증후군에 대한 의약.

· 개변 T 세포 수용체 발현 T 세포 요법에서 기인하는 혈구 탐식성 림프 조직구증에 대한 의약.

· 개변 T 세포 수용체 발현 T 세포 요법과 조합하여 사용하기 위한, 식 I 로 나타내는 화합물, 또는 그 약학적으로 허용되는 염을 포함하는, 사이토카인 방출 증후군, 마크로파지 활성화 증후군 및 혈구 탐식성 림프 조직구증으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 개에 대한 의약.

여기서, 「키메라 항원 수용체 발현 T 세포 요법에서 기인하는 사이토카인 방출 증후군에 대한 의약」 및 「개변 T 세포 수용체 발현 T 세포 요법에서 기인하는 사이토카인 방출 증후군에 대한 의약」 으로서, TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-8, IFN-γ 및 MCP-1 로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 개의, 보다 바람직하게는 복수의, 사이토카인의 생산을 억제하는 의약이 바람직하다.

· 마크로파지 활성화 증후군에 대한 의약.

여기서, TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-18, IFN-γ 및 MCP-1 로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 개의, 보다 바람직하게는 복수의, 사이토카인의 생산을 억제하는 의약이 바람직하다.

· 혈구 탐식성 림프 조직구증에 대한 의약.

여기서, TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-8, IL-18, IFN-γ 및 MCP-1 로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 개의, 보다 바람직하게는 복수의, 사이토카인의 생산을 억제하는 의약이 바람직하다.

· 면역 체크 포인트 저해약의 사용에서 기인하는 자기 면역 질환 관련 부작용에 대한 의약.

여기서, TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-18 및 IFN-γ 로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 개의, 보다 바람직하게는 복수의, 사이토카인의 생산을 억제하는 의약이 바람직하다.

· 자기 면역 질환에 의해 유발되는 랑게르한스 세포 조직구증에 대한 의약.

여기서, IL-18, MCP-1 및 OPN 으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 개의, 보다 바람직하게는 복수의, 사이토카인의 생산을 억제하는 의약이 바람직하다.

· 또한, 「식 I 로 나타내는 화합물, 또는 그 약학적으로 허용되는 염을 포함하는, 사이토카인 방출 증후군, 자기 면역 질환 관련 부작용, 마크로파지 활성화 증후군, 혈구 탐식성 림프 조직구증 및 랑게르한스 세포 조직구증으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 개에 대한 의약」 으로서, IL-18, MCP-1 및 OPN 으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 개의, 보다 바람직하게는 복수의, 사이토카인의 생산을 억제하는 의약이 바람직하다.

본 발명의 화합물은, CRS, irAEs, HLH, MAS 및 LCH 로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 개에 대한 의약 (예를 들어 예방, 치료 또는 개선제) 으로서 그대로 투여할 수도 있지만, 본 발명의 일 양태에 있어서는, 의약 조성물로서 투여된다. 본 발명의 화합물을 유효 성분으로서 함유하는 의약 조성물로서 사용하는 경우에는, 당해 의약 조성물은, 통상적으로, 약리학적으로 허용되는 첨가제, 예를 들어 약리학적으로 허용되는 담체, 부형제, 희석제, 증량제, 붕괴제, 안정제, 보존제, 완충제, 유화제, 방향제, 착색제, 감미제, 점조제, 교미제, 용해 보조제 및/ 또는 그 밖의 첨가제 (예를 들어, 물, 식물유, 알코올 (예를 들어 에탄올 또는 벤질알코올), 폴리에틸렌글리콜, 글리세롤트리아세테이트, 젤라틴, 락토오스, 탄수화물, 스테아르산마그네슘, 탤크, 라놀린, 백색 바셀린 등) 와 혼합하여, 정제, 환제, 산제, 과립제, 좌제, 주사제, 점안제, 액제, 캡슐제, 트로키제, 에어졸제, 엘릭시르제, 현탁제, 유제, 시럽제 등의 제형으로 할 수 있다.

경구 투여에서는, 미세 분말 또는 과립의 형태로, 희석제, 분산제 및/또는 표면 활성제를 포함하고 있어도 되고, 예를 들어, 수중, 시럽 중, 건조 상태에서의 캡슐 혹은 분포 중, 현탁제를 포함해도 되는 비수성 용액 혹은 현탁액 중, 또는 결합제 및 활제를 포함하고 있어도 되는 정제 중에 존재하고 있어도 된다. 감미제, 교미제, 보존제 (예를 들어, 항균성 보존제), 현탁제, 점조제 및/또는 유화제도 의약 조성물 중에 존재하고 있어도 된다.

비경구 투여에서는, 의약 조성물은 액제 또는 현탁제의 제형이고, 본 발명의 화합물 (예를 들어 화합물 (III)) 및 정제수를 함유할 수 있다. 액제 또는 현탁제에 포함되어 있어도 되는 성분으로는, 보존제 (예를 들어, 항균성 보존제), 완충제, 그들의 용액 및 혼합물을 들 수 있다. 의약 조성물의 성분은, 1 이상의 기능을 발휘해도 된다. 의약 조성물은, 1 용량 또는 복수 용량의 용기, 예를 들어, 시일된 바이알 및 앰플에 넣어 동결 건조 상태로 보존할 수 있고, 사용 전에 살균된 액상 담체 (예를 들어, 물이나 생리 식염수) 에 첨가하면 된다. 바람직한 양태로는, 본 발명의 화합물 (예를 들어 화합물 (III) 또는 그 약학적으로 허용되는 염) 은, D-만니톨과 함께 함유하는 동결 건조 제제로서 제제된다. 동결 건조 제제는, 바람직하게는 사용 전에 생리 식염수로 희석된다.

본 발명의 화합물을 함유하는 의약 조성물은, 의약 분야에서 주지의 방법, 예를 들어, 게나로 (Gennaro) 등, 「레밍톤의 제약 과학」 1990년, 제 18 판, 맥 출판 (Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th ed., MackPublishing CO., 1990), 특히 제 8 장 「의약 제제와 그 제조 (Part 8 : Pharmaceutical Preparation and their Manufacture) 에 기재된 방법에 의해, 조제할 수 있다. 당해 방법은 본 발명의 화합물을 의약 조성물의 다른 성분과 함께 회합시키는 공정을 포함한다.

본 발명의 의약은, 적당한 방법으로 투여할 수 있고, 투여 루트는 특별히 한정되는 것은 아니다. 예를 들어, 경구, 구강 내, 비강 내, 경피, 주사, 서방, 제어 방출, 이온 도입 (iontophoresis), 초음파 도입 (sonophoresis) 을 들 수 있다. 주사는 특별히 한정되지 않지만, 정맥 내 (intravenous), 근육 내 (intramuscular), 피하 (subcutaneous), 복강 내 (intraperitoneal), 수강 내 (intraspinal), 거미막하 내 (intrathecal), 뇌실 내 (intracerebroventricular), 동맥 (intraarterial) 내, 그 밖의 주사 루트 등의 비경구 루트를 들 수 있다. 비경구 투여에서는, 의약 조성물을 액상 또는 비액상의 살균한 주사 제제로 할 수 있고, 바람직하게는, 정맥 내 주사 제제이다.

본 발명의 화합물의 적절한 투여량은, 환자의 타입이나 증상, 투여 경로, 성차, 체중 등에 따라 변화한다. 성인의 경구 투여의 경우, 예를 들어, 본 발명의 화합물 (특히 화합물 (III) 또는 그 약학적으로 허용되는 염) 의 1 일의 용량으로서, 통상적으로 약 0.01 ∼ 1,000 ㎎ (예를 들어, 0.05 ∼ 900 ㎎, 바람직하게는 0.1 ∼ 100 ㎎) 이다.

본 발명의 화합물 (특히 화합물 (III) 또는 그 약학적으로 허용되는 염) 이 성인에게 정맥 내 투여되는 경우, 예를 들어, 1 일의 용량으로서, 통상적으로, 약 0.01 ∼ 100 ㎎/㎏ (예를 들어, 약 0.01 ∼ 95 ㎎/㎏, 바람직하게는 약 0.01 ∼ 50 ㎎/㎏) 이고, 1 회 또는 수회 (예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 회 또는 그 이상) 로 나누어 투여할 수 있다. 혹은, 본 발명의 화합물 (특히 화합물 (III) 또는 그 약학적으로 허용되는 염) 은, 기간 (예를 들어, 수시간 내지 1 일 또는 그 이상) 을 선택하여, 지속 정맥 내 투여해도 된다. 지속 투여의 1 일 총 투여량은, 통상적으로, 비지속 정맥 내 투여에서 사용되는 1 일 투여량과 동일하다.

실시예

이하, 실시예에 의해 본 발명을 더욱 구체적으로 설명한다. 단, 본 발명의 범위는 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1

1. 방법

1.1 재료

1.1.1 세포

Cryopreserved 인간 PBMC (PBMC) : BIOPREDIC

CD3/CD28 시그널 서열 함유 CD19-CAR-T 세포 (CAR-T 세포) : 도쿄 대학 의과학 연구소 분자 요법 분야로부터 제공

CD19 발현 K562 세포주 (표적 세포) : 도쿄 대학 의과학 연구소 분자 요법 분야로부터 제공

인간 Monocyte (단구) : BIOPREDIC

Lenti-X293T 세포 : Clontech

1.1.2 시약

RPMI1640 배지 : Thermo fisher (Gibco)

Fetal Bovine Serum (FBS) : Thermo fisher (Gibco)

D-PBS (-) : 와코 순약 공업

에틸렌디아민사아세트산이수소이나트륨 2 수화물 (EDTA) : 쥰세이 화학

Albumin from bovine serum (BSA) : SIGMA

디메틸 술폭시드 (DMSO) : SIGMA

페니실린-스트렙토마이신-글루타민 (Penicillin-Streptomycin-Glutamine) : Thermo fisher

2-메르캅토에탄올 (2-Mercaptoethanol) : SIGMA

Trypan Blue Stain 0.4 ％ (트리판 블루 용액) : Thermo fisher (Gibco)

1 ㏖/ℓ HEPES 완충 용액 : 나칼라이 테스크

1 ㏖/ℓ 수산화나트륨 용액 (Sodium Hydroxide Solution) : FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation

CD4 MicroBeads 인간 : Miltenyi Biotec

CD8 MicroBeads 인간 : Miltenyi Biotec

CD14 MicroBeads 인간 : Miltenyi Biotec

MACS BSA Stock 용액 : Miltenyi Biotec

AutoMACS Rinsing 용액 : Miltenyi Biotec

Dynabeads 인간 T-Activator CD3/28 (T 세포 자극 비드) : Thermo fisher (Gibco)

리컴비넌트 인간 M-CSF : Pepro Tech

리컴비넌트 인간 IFN-γ : Pepro Tech

JTE-607 dihydrochloride (카탈로그명으로서의 기재) : Tocris Cat. No.5185

프레드니솔론 (PSL) : 와코 순약 공업 Cat. No. 165-11491

토실리주맙 : absolute antibody Cat. No.L6529-1MG

Lipopilysaccharides from Escherichia coli 055 : B55(LPS) : SIGMA

아데노신 5'-삼인산이나트륨염 수화물 (ATP) : SIGMA

인간 IFN-γ DuoSet ELISA : R & D 시스템

인간 IL-6 DuoSet ELISA : R & D 시스템

인간 CCL2/MCP-1 DuoSet ELISA : R & D 시스템

인간 TNF-α DuoSet ELISA : R & D 시스템

인간 OPN DuoSet ELISA : R & D 시스템

인간 IL-1β DuoSet ELISA : R & D 시스템

인간 IL-18 DuoSet ELISA : R & D 시스템

인간 VEGF DuoSet ELISA : R & D 시스템 인간 IL-8 DuoSet ELISA : R & D 시스템

DuoSet ELISA Ancillary Reagent Kit 2 : R & D 시스템

HQPlex Premixed Analyte Kit (멀티플렉스 어세이) : Bay bioscience

In-Fusion HD 클로닝 키트 : 다카라 바이오

1.1.3 기재

MidiMACS Separator : Miltenyi Biotec

MidiMACS-LS columns (분리용 칼럼) : Miltenyi Biotec

폴리프로필렌 코니컬 튜브 (튜브) : FALCON

조직 배양 플레이트, 96 웰, 플랫 보텀 with 저증발 뚜껑 (96 웰 플레이트) : FALCON

1.1.4 시액

10 ％ FBS RPMI (배지) :

RPMI1640 에, 비동화 FBS 50 ㎖, 페니실린-스트렙토마이신-글루타민 5 ㎖, 0.1 M 2-메르캅토에탄올 250 ㎕ 를 첨가하고, 전체량을 500 ㎖ 로 하였다. 4 ℃ 에서 보존하고, 사용 전에 항온조에서 37 ℃ 로 가온하여 사용하였다.

2 mM EDTA, 0.5 ％ BSA-PBS (MACS 완충액) :

D-PBS (-) 44 ㎖ 에, 5 ％ BSA 용액 5 ㎖ 및 100 mM EDTA 용액 1 ㎖ 를 첨가하였다. 조제 후에는 4 ℃ 에서 보존하였다.

1.1.5 기기

항온조 : Thermal ROBO TR-1A, AS ONE

원심기 : AX-320, TOMY

CO₂ 인큐베이터 : MCO-170AICUVH, PANASONIC

플레이트 리더 : SPECTRAmax 384plus, Molecular Devices

FACSVerse^TM 플로 사이토메트리 : Becton, Dickinson and Company

EnSpire 2300 : 퍼킨 엘머 재팬

1.2 방법

1.2.1 CD8⁺ T 세포의 T 세포 자극 비드에 의한 IFN-γ 생산에 대한 JTE-607 및 PSL 의 작용

동결 PBMC 를 37 ℃ 항온조에서 빠르게 해동시켜, 배지가 들어간 튜브에 첨가하였다. 원심 분리 (실온, 300 g, 10 분간) 를 실시하고, 상청을 제거 후, 배지에 현탁하고, 일부를 트리판 블루 용액과 혼합하고, 생세포수의 계측을 실시하였다. 세포 현탁액을 원심 분리 (실온, 300 g, 10 분간) 하고, 상청 제거 후, 세포 1 × 10⁷ 세포 당 MACS 완충액 80 ㎕ 를 첨가하여 현탁 후, 추가로 인간 CD8 MicroBeads 20 ㎕ 를 첨가하였다. 빙상에서 15 분간 정치 (靜置) 시킨 후, MACS 완충액 2 ㎖ 를 첨가하고, 원심 분리 (실온, 300 g, 10 분간) 하여, 상청을 제거하였다.

여기에 MACS 완충액 500 ㎕ 를 첨가하고, 세포를 현탁한 후, 분리용 칼럼을 사용하여 CD8⁺ 세포를 분리하였다. CD8⁺ 세포의 획분에 배지를 첨가하고, 15 ㎖ 로 하여 원심 분리 (실온, 300 g, 10 분간) 를 실시하였다. 상청을 제거하고, 배지 1 ㎖ 에 현탁하여, 생세포수의 계측을 실시하였다. 1 × 10⁶ 세포/㎖ 가 되도록 배지를 첨가한 세포 현탁액을 96 웰 플레이트에 100 ㎕/웰로 파종 (1 × 10⁵ 세포/웰) 하고, CO₂ 인큐베이터 내에 1 ∼ 2 시간 정치시켰다.

0.12 ％ DMSO 용액, JTE-607 용액 (최종 농도 10, 30, 100, 300 nM) 또는 PSL 용액 (최종 농도 0.03, 0.3, 3, 30 μM) 을 50 ㎕/웰 첨가하고, T 세포 자극 비드 10 ㎕/웰 (T 세포 자극 비드 원액 2 ㎕ 상당) 및 배지 40 ㎕/웰을 첨가하여 CO₂ 인큐베이터 내에서 3 일간 배양하여, 배양 상청을 회수하였다.

회수한 배양 상청은, 인간 IFN-γ DuoSet ELISA 를 사용하여 IFN-γ 의 정량을 실시하였다.

1.2.2 CD14⁺ 세포의 LPS 자극에 의한 IL-6 생산에 대한 JTE-607 및 PSL 의 작용

동결 PBMC 를 37 ℃ 항온조에서 빠르게 해동시켜, 배지가 들어간 튜브에 첨가하였다. 원심 분리 (실온, 300 g, 10 분간) 를 실시하고, 상청을 제거 후, 배지에 재현탁하여, 생세포수의 계측을 실시하였다. 세포 현탁액을 원심 분리 (실온, 300 g, 10 분간) 하고, 상청 제거 후, MACS 완충액을 첨가하여 현탁 후, 추가로 인간 CD14 MicroBeads 를 첨가하였다. 빙상에서 15 분간 정치시킨 후, MACS 완충액을 첨가하고, 원심 분리 (실온, 300 g, 10 분간) 하여, 상청을 제거하였다.

여기에 MACS 완충액을 첨가하고, 세포를 현탁한 후, 분리용 칼럼을 사용하여 CD14⁺ 세포를 분리하였다. CD14⁺ 세포의 획분에 배지를 첨가하고, 원심 분리 (실온, 300 g, 10 분간) 를 실시하였다. 상청을 제거하고, 배지 1 ㎖ 에 현탁하여, 생세포수의 계측을 실시하였다. 배지를 첨가하여 2.4 × 10⁵ 또는 3 × 10⁵ 세포/㎖ 세포 현탁액을 조제하고, 96 웰 플레이트에 파종 (2.4 × 10⁴ 세포/웰) 하고, CO₂ 인큐베이터 내에 1 ∼ 2 시간 정치하였다.

0.12 ％ DMSO 용액, JTE-607 용액 (최종 농도 10, 30, 100, 300 nM) 또는 PSL 용액 (최종 농도 0.03, 0.3, 3, 30 μM) 을 첨가하고, 추가로 LPS 용액 (최종 농도 3 ng/㎖) 을 첨가, CO₂ 인큐베이터 내에 3 일간 정치 후, 배양 상청을 회수하였다.

회수한 배양 상청은, 인간 IL-6 DuoSet ELISA 를 사용하여 IL-6 의 정량을 실시하였다.

1.2.3 PBMC 의 LPS 자극에 의한 IL-6 생산에 대한 JTE-607 및 PSL 의 작용

동결 PBMC 를 37 ℃ 항온조에서 빠르게 해동시켜, 배지가 들어간 튜브에 첨가하였다. 원심 분리 (실온, 300 g, 10 분간) 를 실시하고, 상청을 제거 후, 재차 배지 10 ㎖ 에 현탁하여, 생세포수의 계측을 실시하였다. 원심 분리 (실온, 300 g, 10 분간) 하고, 상청 제거 후, 1 × 10⁶ 세포/㎖ 가 되도록 배지를 첨가하고, 세포를 현탁하였다. 이 세포 현탁액을 96 웰 플레이트에 100 ㎕/웰로 파종 (1 × 10⁵ 세포/웰) 하였다. 0.12 ％ DMSO 용액, JTE-607 용액 (최종 농도 10, 30, 100, 300 nM) 또는 PSL 용액 (최종 농도 0.03, 0.3, 3, 30 μM) 을 30 ㎕/웰 첨가하고, LPS 용액을 5 ㎕/웰 첨가하였다 (최종 농도 3 ng/㎖). CO₂ 인큐베이터 내에서 3 일간 배양하여, 배양 상청을 회수하였다.

1.2.4 PBMC 에서의 T 세포 자극 비드 및 LPS 자극에 의한 CRS 독성 평가계에 대한 JTE-607 및 PSL 의 작용

동결 PBMC 를 37 ℃ 항온조에서 빠르게 해동시켜, 배지가 들어간 튜브에 첨가하였다. 원심 분리 (실온, 300 g, 10 분간) 를 실시하고, 상청을 제거 후, 재차 배지 10 ㎖ 에 현탁하여, 생세포수의 계측을 실시하였다. 원심 분리 (실온, 300 g, 10 분간) 하고, 상청 제거 후, 1 × 10⁶ 세포/㎖ 가 되도록 배지를 첨가하고, 세포를 현탁하였다. 이 세포 현탁액을 96 웰 플레이트에 100 ㎕/웰로 파종 (1 × 10⁵ 세포/웰) 하고, CO₂ 인큐베이터 내에 1 ∼ 2 시간 정치시켰다.

0.12 ％ DMSO 용액, JTE-607 용액 (최종 농도 10, 30, 100, 300 nM) 또는 PSL 용액 (최종 농도 0.03, 0.3, 3, 30 μM) 을 50 ㎕/웰 첨가하고, T 세포 자극 비드 10 ㎕/웰 (T 세포 자극 비드 원액 2 ㎕ 상당) 및 LPS 용액 (최종 농도 3 ng/㎖) 40 ㎕/웰을 첨가하였다. CO₂ 인큐베이터 내에서 3 일간 배양하여, 배양 상청을 회수하였다.

회수한 배양 상청은, 인간 IFN-γ DuoSet ELISA 및 인간 IL-6 DuoSet ELISA 를 사용하여 IFN-γ 및 IL-6 의 정량을 실시하였다.

1.2.5 CD4⁺ T 세포 결여 PBMC 에서의 T 세포 자극 비드 및 LPS 자극에 의한 CRS 독성 평가계에 대한 JTE-607 및 PSL 의 작용

동결 인간 PBMC 를 37 ℃ 항온조에서 빠르게 해동시켜, 배지가 들어간 튜브에 첨가하였다. 원심 분리 (실온, 300 g, 10 분간) 를 실시하고, 상청을 제거 후, 재차 배지 10 ㎖ 에 현탁하여, 생세포수의 계수를 실시하였다. 나머지의 세포 현탁액을 원심 분리 (실온, 300 g, 10 분간) 하고, 상청 제거 후, 세포 1 × 10⁷ 세포 당 MACS 완충액 80 ㎕ 및 인간 CD4 MicroBeads 20 ㎕ 를 첨가하여 현탁을 실시하였다. 빙상에서 15 분간 정치시키고, MACS 완충액 2 ㎖ 을 첨가하고, 원심 분리 (실온, 300 g, 10 분간) 하여, 상청을 제거하였다. MACS 완충액 500 ㎕ 를 첨가하고, 세포를 현탁한 후, 분리용 칼럼을 사용하여 CD4^- 세포 (CD4⁺ 세포의 통과 획분) 를 분리하였다. CD4^- 세포의 획분에 배지를 첨가하고, 15 ㎖ 로 하여 원심 분리 (실온, 300 g, 10 분간) 를 실시하고, 상청을 제거 후, 재차 배지 1 ㎖ 에 현탁하여, 생세포수의 계측을 실시하였다. 1 × 10⁶ 세포/㎖ 가 되도록 배지를 첨가한 세포 현탁액을 96 웰 플레이트에 100 ㎕/웰로 파종 (1 × 10⁵ 세포/웰) 하고, CO₂ 인큐베이터 내에 1 ∼ 2 시간 정치시켰다.

0.12 ％ DMSO 용액, JTE-607 용액 (최종 농도 10, 30, 100, 300 nM) 또는 PSL 용액 (최종 농도 0.03, 0.3, 3, 30 μM) 을 50 ㎕/웰 첨가하고, T 세포 자극 비드 10 ㎕/웰 (T 세포 자극 비드 원액 2 ㎕ 상당) 및 LPS 용액 (최종 농도 3 ng/㎖) 40 ㎕/웰을 첨가하여 CO₂ 인큐베이터 내에서 3 일간 배양하여, 배양 상청을 회수하였다.

1.2.6 CD14⁺ 세포의 LPS 자극에 의한 MCP-1 생산에 대한 JTE-607 및 PSL 의 작용

여기에 MACS 완충액을 첨가하고, 세포를 현탁한 후, 분리용 칼럼을 사용하여 CD14⁺ 세포를 분리하였다. CD14⁺ 세포의 획분에 배지를 첨가하고, 원심 분리 (실온, 300 g, 10 분간) 를 실시하였다. 상청을 제거하고, 배지 1 ㎖ 에 현탁하여, 생세포수의 계측을 실시하였다. 배지를 첨가하여 2.4 × 10⁵ 또는 3 × 10⁵ 세포/㎖ 세포 현탁액을 조제하고, 96 웰 플레이트에 파종 (2.4 × 10⁴ 세포/웰) 하여, CO₂ 인큐베이터 내에 1 ∼ 2 시간 정치하였다.

회수한 배양 상청은, 인간 CCL2/MCP-1 DuoSet ELISA 를 사용하여 MCP-1 의 정량을 실시하였다.

1.2.7 CD8⁺ T 세포의 T 세포 자극 비드에 의한 TNF-α 생산에 대한 JTE-607 및 PSL 의 작용

1.2.1 에서 회수한 배양 상청을, 인간 TNF-α DuoSet ELISA 를 사용하여 TNF-α 의 정량을 실시하였다.

1.2.8 CD14⁺ 세포의 LPS 자극에 의한 TNF-α 생산에 대한 JTE-607 및 PSL 의 작용

1.2.2 에서 회수한 배양 상청을, 인간 TNF-α DuoSet ELISA 를 사용하여 TNF-α 의 정량을 실시하였다.

1.2.9 PBMC 의 LPS 자극에 의한 TNF-α 생산에 대한 JTE-607 및 PSL 의 작용

1.2.10 CD14⁺ 세포의 LPS 자극에 의한 OPN 생산에 대한 JTE-607, PSL 및 토실리주맙의 작용

동결 PBMC 를 37 ℃ 항온조에서 빠르게 해동시켜, 배지가 들어간 튜브에 첨가하였다. 원심 분리 (실온, 300 g, 10 분간) 를 실시하고, 상청을 제거 후, 배지에 재현탁하여, 생세포수의 계측을 실시하였다. 세포 현탁액을 원심 분리 (실온, 300 g, 10 분간) 하고, 상청 제거 후, MACS 완충액을 첨가하여 현탁 후, 추가로 인간 CD14 MicroBeads 를 첨가하였다. 빙상에서 15 분간 정치시킨 후, MACS 완충액을 첨가하고, 원심 분리 (실온, 300 g, 10 분간) 하여, 상청을 제거하였다. 여기에 MACS 완충액을 첨가하고, 세포를 현탁한 후, 분리용 칼럼을 사용하여 CD14⁺ 세포를 분리하였다. CD14⁺ 세포의 획분에 배지를 첨가하고, 원심 분리 (실온, 300 g, 10 분간) 를 실시하였다. 상청을 제거하고, 배지 1 ㎖ 에 현탁하여, 생세포수의 계측을 실시하였다. 배지를 첨가하여 2.4 × 10⁵ 또는 3 × 10⁵ 세포/㎖ 세포 현탁액을 조제하고, 96 웰 플레이트에 파종 (2.4 × 10⁴ 세포/웰) 하여, CO₂ 인큐베이터 내에 1 ∼ 2 시간 정치하였다.

0.12 ％ DMSO 용액, JTE-607 용액 (최종 농도 10, 30, 100, 300 nM), PSL 용액 (최종 농도 0.03, 0.3, 3, 30 μM) 또는 토실리주맙 (최종 농도 10, 100, 1000 ng/㎖) 을 첨가하고, 추가로 LPS 용액 (최종 농도 500 ng/㎖) 을 첨가, CO₂ 인큐베이터 내에 3 일간 정치 후, 배양 상청을 회수하였다.

회수한 배양 상청은, 인간 OPN DuoSet ELISA 를 사용하여 OPN 의 정량을 실시하였다.

1.2.11 CD14⁺ 세포의 LPS 자극에 의한 IL-1β 생산에 대한 JTE-607, PSL 및 토실리주맙의 작용

1.2.10 에서 회수한 배양 상청을, 인간 IL-1β DuoSet ELISA 를 사용하여 IL-1β 의 정량을 실시하였다.

1.2.12 LPS 전처치 CD14⁺ 세포로부터의 ATP 자극에 의한 IL-18 생산에서의 JTE-607, PSL 및 토실리주맙의 작용

여기에 MACS 완충액을 첨가하고, 세포를 현탁한 후, 분리용 칼럼을 사용하여 CD14⁺ 세포를 분리하였다. CD14⁺ 세포의 획분에 배지를 첨가하고, 원심 분리 (실온, 300 g, 10 분간) 를 실시하였다. 상청을 제거하고, 배지 1 ㎖ 에 현탁하여, 생세포수의 계측을 실시하였다. 배지를 첨가하여 2 × 10⁶ 세포/㎖ 로 조제한 세포 현탁액을 96 웰 플레이트에 파종 (1 × 10⁵ 세포/웰) 하고, CO₂ 인큐베이터 내에 1 ∼ 2 시간 정치하였다. CD14⁺ 세포 (1 x10⁵ 세포/웰) 를 96 웰 플랫 보텀 플레이트에 파종하고, 0.12 ％ DMSO 용액, JTE-607 용액 (최종 농도 10, 30, 100, 300 nM), PSL 용액 (최종 농도 0.03, 0.3, 3, 30 μM) 또는 토실리주맙 (최종 농도 10, 100, 1000 ng/㎖) 을 첨가하여 30 분간, 37 ℃ 에서 인큐베이트하였다. 그 후, LPS (최종 농도 500 ng/㎖) 로 6 시간, 37 ℃ 에서 자극하고, ATP 용액 (최종 농도 5 mM) 을 첨가하고, 추가로 CO₂ 인큐베이터 내에 2 시간 정치하여, 배양 상청을 회수하였다.

회수한 배양 상청은, 인간 IL-18 DuoSet ELISA 를 사용하여 IL-18 의 정량을 실시하였다.

1.2.13 마크로파지의 LPS 자극에 의한 VEGF 생산에 대한 JTE-607, PSL 및 토실리주맙의 작용

CD14⁺ 세포를 20 ng/㎖ M-CSF 가 들어간 RPMI 배지에서 37 ℃ 에서 5 일간 배양하여, 마크로파지로 분화 유도하였다 (그 동안, 2 일에 1 회 20 ng/㎖ M-CSF 가 들어간 RPMI 배지를 추가하였다). 마크로파지를 5 × 10⁵ 세포/㎖ 로 96 웰 플레이트에 파종하고, JTE-607 용액 (최종 농도 10, 30, 100, 300 nM), PSL 용액 (최종 농도 0.03, 0.3, 3, 30 μM) 또는 토실리주맙 (최종 농도 10, 100, 1000 ng/㎖) 을 첨가하고, 첨가 후 37 ℃ 에서 30 분간 인큐베이트하였다. 그 후, RPMI 배지만, 또는 LPS (최종 농도 100 ng/㎖) 로 37 ℃ 에서 3 일간 자극하고, 배양 상청을 회수하였다.

회수한 배양 상청은, 인간 VEGF DuoSet ELISA 를 사용하여 VEGF 의 정량을 실시하였다.

1.2.14 CAR-T 세포의 킬러 활성에 대한 CD14⁺ 세포의 작용

FMC63 scFv, CD28 의 힌지 도메인, 막 관통 도메인, 세포질 도메인 및 CD3-ζ 세포질 도메인을 사용하여, Kochenderfer 등의 방법¹⁵⁾ 에 기초하여 항 CD19 CAR 의 구축을 실시하였다. 서열은 GenBank (HM852952) 로부터 입수하고, IDT 코돈 최적화 툴 (http : //sg.igtdna.com/CodonOpt) 을 사용하여 FMC63 내부의 BamHI 인식 서열을 제외하였다. 최적화한 FMC63-28z 서열을 화학 합성하고, 이하의 프라이머 세트를 사용하여 폴리머라아제 연쇄 반응 (PCR) 에 의해 증폭하였다.

5'CGCTACCGTCGTCGAATTCGCCGCCACCATGCTTC3' (서열 번호 1)

5'GAAGTTCGTGCTCCGGGATCCCGCGAGGGGGCAG3' (서열 번호 2)

PCR 산물을, In-Fusion HD 클로닝 키트를 사용하여, 렌티바이러스 플라스미드 CSII-EF-MCS-2A-eGFP 의 멀티 클로닝 사이트 (EcoRI 및 BamHI) 에 삽입하여, CSII-EF-FMC63-28z-2A-eGFP 를 얻었다. 렌티바이러스 벡터는, CSII-EF-FMC63-28z-2A-eGFP 와 패키징 플라스미드 (pMDLg/p.RRE, pRSV-rev 및 pMD.G) 를 Lenti-X293T 세포로 모두 트랜스펙션하여 제작하였다. 제작한 렌티바이러스 벡터를 항 CD3 항체, 항 CD28 항체 및 IL-2 로 자극한 말초혈 단핵구에 감염시켜, CD3 양성 및 eGFP 양성 분획을 FACS 소팅하여 CAR-T 세포로 하였다.

Kochenderfer 등의 방법¹⁵⁾ 에 기초하여 인간 CD19 의 오픈 리딩 프레임을 합성하여, 이하의 프라이머를 사용하는 PCR 에 의해 증폭하였다.

5'-ccggttcgaattcgccatATGCCACCTCCCGCCTC-3' (서열 번호 3)

5'-cgatgttaactctagatcaCCTGGGTGCTCCAGGTGC-3' (서열 번호 4)

PCR 산물을, In-Fusion HD 클로닝 키트를 사용하여, EcoRI 및 XbaI 부위를 사용하여 렌티바이러스 골격 플라스미드 CSII-EF-MCS 에 삽입하여, CSII-EF-hCD19 를 얻었다. 또한, 반딧불이 루시페라아제 (fLuc) 발현 플라스미드는, fLuc cDNA 를 이하의 프라이머 세트를 이용하여 pmirGLO 플라스미드 (Promega 사) 를 주형으로 하여 PCR 에 의해 증폭하였다.

5'-GAATTCGCCACCATGGAAGATGCCAA -3' (서열 번호 5)

5'-GGATCCCACGGCGATCTTGCCGCC-3' (서열 번호 6)

PCR 산물을 EcoRI 및 BamHI 로 절단 후, CSII-EF-MCS-2A-eGFP 의 멀티 클로닝 사이트에 삽입하여 CSII-EF-fLuc-2A-eGFP 를 얻었다. 렌티바이러스 벡터는, CSII-EF-hCD19 또는 CSII-EF-fLuc-2A-eGFP 와 패키징 플라스미드 (pMDLg/p.RRE, pRSV-rev 및 pMD.G) 를 Lenti-X293T 세포로 모두 트랜스펙션하여 제작하였다. 제작한 렌티바이러스 벡터는 K562 세포에 감염시켜, CD19 및 eGFP 양성 분획을 FACS 소팅하여 표적 세포로 하였다.

표적 세포 (3 × 10³ 세포/웰) 를 96 웰 플레이트에 파종하고, 거기에 E/T 비가 0, 0.1, 0.3, 1, 3 및 10 이 되도록 CAR-T 세포를 첨가한 배양계에, CD14⁺ 세포 (1.5 × 10⁴ 세포/웰) 를 첨가 또는 비첨가의 조건으로 3 일간 인큐베이트하였다. 그 후, 루시페라아제 활성을 EnSpire 2300 을 사용하여 발광 강도를 검출하였다.

1.2.15 CAR-T 세포를 사용한 혼합 배양계의 사이토카인 생산에 대한 CD14⁺ 세포의 작용

CAR-T 세포 (5 × 10⁴ 세포/웰) 및 표적 세포 (1 × 10⁴ 세포/웰) 를 96 웰 플레이트에 파종한 것에, CD14⁺ 세포 (1 × 10⁴ 세포/웰) 를 첨가 또는 비첨가의 조건으로 인큐베이트하였다. 배양 개시 후, 0, 4, 24, 48 및 72 시간 후의 상청을 회수하고, 상청 중의 IFN-γ, TNF-α, MCP-1, IL-6 및 IL-4 를 FACS 의 멀티플렉스 어세이로 측정하였다.

1.2.16 CAR-T 세포의 킬러 활성에 대한 JTE-607 및 PSL 의 작용

CAR-T 세포 (5 × 10⁴ 세포/웰), 표적 세포 (1 × 10⁴ 세포/웰) 및 CD14⁺ 세포 (5 × 10⁴ 세포/웰) 를 96 웰 플레이트에 파종하고, JTE-607 용액 (최종 농도 0.1, 1, 10, 100, 1000 nM), PSL 용액 (최종 농도 0.1, 1, 10, 100 μM) 을 첨가하여 2 일간 인큐베이트하였다. 그 후, 루시페라아제 활성을, EnSpire 2300 을 사용하여 발광 강도에 의해 검출하였다.

1.2.17 CAR-T 세포를 사용한 CRS 독성 평가계에서의 JTE-607, PSL 및 토실리주맙의 작용

CAR-T 세포 (1.5 × 10⁴ 세포/웰), 표적 세포 (3 × 10³ 세포/웰) 와 단구 (1.5 × 10⁴ 세포/웰) 를 96 웰 플레이트에 파종하고, JTE-607 용액 (최종 농도 1, 10, 100, 1000 nM), PSL 용액 (최종 농도 0.1, 1, 10, 100 μM) 또는 토실리주맙 용액 (최종 농도 0.1, 1, 10, 100 ㎍/㎖) 을 첨가하여 인큐베이트하였다. 배양 개시 72 시간 후에 상청을 회수하고, 상청 중의 각종 사이토카인을 FACS 의 멀티플렉스 어세이로 측정하였다.

1.3 결과

1.3.1 CD8⁺ T 세포의 T 세포 자극 비드에 의한 IFN-γ 등 생산에 대한 JTE-607 및 PSL 의 작용

JTE-607 은 T 세포 자극 비드에 의한 CD8⁺ T 세포로부터의 IFN-γ 생산에 대하여 현저한 억제 작용을 나타내지 않았다 (IC₅₀ 값 = > 300 nM). 한편, PSL 은 당해 IFN-γ 생산을 농도 의존적으로 억제하였다 (IC₅₀ 값 = 0.1494 μM). JTE-607 은 CD8⁺ T 세포에 대한 직접적인 작용은 약한 것이 분명해졌다 (도 1, 도 3 및 표 1).

1.3.2 CD14⁺ 세포의 LPS 자극에 의한 IL-6 생산에 대한 JTE-607 및 PSL 의 작용

CD14⁺ 세포로부터의 IL-6 생산에 대한 JTE-607 및 PSL 의 작용을 평가하였다. JTE-607 및 PSL 모두 억제 활성을 나타내, IC₅₀ 값은 52.9 nM, 0.151 μM 이었다. JTE-607 은 지금까지 보고되어 있었던 바와 같이 myeloid 계 세포에 대하여 작용을 나타내는 것이 분명해졌다 (도 2, 도 3 및 표 1).

1.3.3 PBMC 의 LPS 자극에 의한 IL-6 생산에 대한 JTE-607 및 PSL 의 작용

PBMC 로부터의 IL-6 생산에 대한 JTE-607 및 PSL 의 작용을 평가하였다. JTE-607 및 PSL 모두 억제 활성을 나타내, IC₅₀ 값은 17.7 nM, 0.176 μM 이었다 (도 4 및 표 1).

1.3.4 PBMC 에서의 T 세포 자극 비드 및 LPS 자극에 의한 CRS 독성 평가계에 대한 JTE-607 및 PSL 의 작용

T 세포 자극 비드 및 LPS 의 공자극에 의한 PBMC 로부터의 IL-6 및 IFN-γ 생산에 대한 JTE-607 및 PSL 의 작용을 평가하였다. JTE-607 은, 공자극에 의한 IL-6 및 IFN-γ 생산을 농도 의존적으로 억제하여, 그 IC₅₀ 값은 IL-6 이 40.4 nM, IFN-γ 가 50.1 nM 이었다. 또한, IL-6 과 IFN-γ 의 IC₅₀ 값에 대한 비 (ratio) 는 0.81 이었다. 한편, PSL 은 IL-6 생산보다 IFN-γ 생산을 강하게 억제하였다. JTE-607 은, T 세포 기능에 강하게 작용하는 PSL 과는 상이한 것이 분명해졌다 (도 5, 도 6 및 표 1).

1.3.5 CD4⁺ T 세포 결여 PBMC 에서의 T 세포 자극 비드 및 LPS 자극에 의한 CRS 독성 평가계에 대한 JTE-607 및 PSL 의 작용

T 세포 자극 비드 및 LPS 의 공자극계에 있어서의 CD4⁺ T 세포의 관여를 분명하게 하기 위하여 PBMC 로부터 CD4⁺ T 세포를 제거한 CD4⁺ T 세포 결여 PBMC 를 사용하여 JTE-607 및 PSL 의 작용을 평가하였다. JTE-607 은, 공자극에 의한 IL-6 및 IFN-γ 생산을 농도 의존적으로 억제하고, 그 IC₅₀ 값은 동일한 정도 (IL-6 IC₅₀ 값 = 42.2 nM, IFN-γ IC₅₀ 값 = 80.9 nM) 였다. 또한, IL-6 과 IFN-γ 의 IC₅₀ 값에 대한 비 (ratio) 는 0.52 이고, JTE-607 은 IL-6 생산 저해 작용에 편재된 작용을 나타냈다. 한편, PSL 은 IFN-γ 생산을 농도 의존적으로 억제 (IC₅₀ 값 = 0.042 μM) 했지만, IL-6 생산은 억제하지 않았다 (도 7, 도 8 및 표 1). PBMC 와 CD4⁺ T 세포 결여 PBMC 를 사용한 검토에 있어서 동일한 결과를 취득할 수 있었기 때문에, T 세포 자극 비드 및 LPS 의 공자극계에 있어서 CD4⁺ T 세포의 관여는 낮은 것으로 생각되었다.

1.3.6 CD14⁺ 세포의 LPS 자극에 의한 MCP-1 생산에 대한 JTE-607 및 PSL 의 작용

CD14⁺ 세포로부터의 MCP-1 생산에 대한 JTE-607 및 PSL 의 작용을 평가하였다. JTE-607 및 PSL 모두 억제 활성을 나타내, IC₅₀ 값은 각각 21.3 nM, 6.598 μM 이었다. JTE-607 은 MCP-1 생산 저해를 통하여 강한 마크로파지 활성화 저해 작용을 나타내는 것이 시사되었다 (도 9 및 표 1).

1.3.7 CD8⁺ T 세포의 T 세포 자극 비드에 의한 TNF-α 생산에 대한 JTE-607 및 PSL 의 작용

T 세포 자극 비드에 의한 CD8⁺ T 세포로부터의 TNF-α 생산에 대하여, PSL 의 억제 작용 (IC₅₀ 값 = 0.0348 μM) 과 비교하여, JTE-607 의 억제 작용 (IC₅₀ 값 = 231.4 nM) 은 약한 것이 분명해졌다 (도 10 및 표 1).

1.3.8 CD14⁺ 세포의 LPS 자극에 의한 TNF-α 생산에 대한 JTE-607 및 PSL 의 작용

LPS 자극에 의한 CD14⁺ 세포로부터의 TNF-α 생산에 대하여, PSL 은 억제 작용이 확인되었다 (IC₅₀ 값 = 0.0417 μM). 한편, JTE-607 은 첨가 농도에 의존하여 억제 작용을 나타내지만 IC₅₀ 값의 산출에는 이르지 않았다. 일반적으로 CD14⁺ 세포로부터의 TNF-α 생산은 자극 직후부터 일과성으로 상승하는 것이 알려져 있다. 이번 측정에 사용한 배양 상청은 IL-6 과 같이 점차 증가하는 사이토카인의 지적 평가 조건하에서 실시하고 있고, TNF-α 는 생산량이 저하하고 있는 조건에서의 평가였기 때문에 JTE-607 의 명확한 억제가 확인되지 않은 것으로 생각되었다 (도 11 및 표 1).

1.3.9 PBMC 의 LPS 자극에 의한 TNF-α 생산에 대한 JTE-607 및 PSL 의 작용

JTE-607 및 PSL 모두 억제 활성을 나타내, 그 IC₅₀ 값은 30.7 nM, 0.073 μM 이었다 (도 12 및 표 1). 여러 가지 세포가 혼재하고 있는 PBMC 에 있어서는 상호적으로 서로 자극함으로써 지속적인 생산이 확인되기 때문에 JTE-607 은 억제 작용을 나타낸 것으로 생각되었다.

1.3.10 CD14⁺ 세포의 LPS 자극에 의한 OPN 생산에 대한 JTE-607, PSL 및 토실리주맙의 작용

CD14⁺ 세포로부터의 OPN 생산에 대한 JTE-607, PSL 및 토실리주맙의 작용을 평가하였다. JTE-607 은 억제 활성을 나타내, IC₅₀ 값은 132.1 nM 이었다. 한편, PSL 및 토실리주맙에는 OPN 생산 억제 작용은 확인되지 않았다 (도 13 및 표 1). JTE-607 은, OPN 생산 저해를 통하여, LCH 병변에서 볼 수 있는 파골 세포 활성화를 저해하는 것이 시사되었다.

1.3.11 CD14⁺ 세포의 LPS 자극에 의한 IL-1β 생산에 대한 JTE-607, PSL 및 토실리주맙의 작용

JTE-607 은 IL-1β 생산 억제 활성을 나타내, IC₅₀ 값은 3.45 nM 이었다. 한편, PSL 및 토실리주맙에는 IL-1β 생산 억제 작용은 확인되지 않았다 (도 14 및 표 1). JTE-607 에는 PSL 및 토실리주맙 등의 기존 약과는 상이한 작용이 있는 것이 시사되었다.

1.3.12 LPS 전처치 CD14⁺ 세포로부터의 ATP 자극에 의한 IL-18 생산에서의 JTE-607, PSL 및 토실리주맙의 작용

LPS 전처치 CD14⁺ 세포로부터의 IL-18 생산에 대한 JTE-607, PSL 및 토실리주맙의 작용을 평가하였다. JTE-607 은 억제 활성을 나타내, IC₅₀ 값은 2.40 nM 이었다. 한편, PSL 및 토실리주맙에는 IL-18 생산 억제 작용은 확인되지 않았다 (도 15 및 표 1). JTE-607 은, IL-18 생산을 저해함으로써, 높은 IL-18 생산을 특징으로 하는 질환군의 병태를 개선하는 것이 시사되었다. IL-18 은, IL-6 에 독립적으로 고생산이 유지되는 염증성 사이토카인으로, 토실리주맙 투여로 감추어지는 염증성 병태에 대한 JTE-607 작용이 시사되었다.

1.3.13 마크로파지의 LPS 자극에 의한 VEGF 생산에 대한 JTE-607, PSL 및 토실리주맙의 작용

마크로파지로부터의 VEGF 생산에 대하여 PSL 은 강한 작용을 나타내고, 최저 평가 농도의 30 nM 에 있어서도 50 ％ 이상의 억제율이었기 때문에 IC₅₀ 값의 산출에는 이르지 않았다. 한편, JTE-607 은 억제 경향은 확인되지만 그 작용은 마지널이었다. 토실리주맙에 있어서는 VEGF 생산 억제 작용은 확인되지 않았다 (도 16 및 표 1).

1.3.14 CAR-T 세포의 암세포 인식을 기점으로 하는 CRS 독성의 in vitro 평가계

CRS 독성으로 연결되는 사이토카인 유리를 검출하기 위해서, CAR-T 세포의 표적 세포 인식 (킬러 활성) 의 배양계와, 거기에 말초혈 CD14⁺ 세포를 첨가한 배양계를 비교하였다. 표적 세포에 대한 킬러 활성에 대해서는, CD14⁺ 세포 공존 배양에서는 CD14⁺ 비첨가 배양에 비하여 상승하였다 (도 17).

다음으로, CD14⁺ 세포 비첨가 및 첨가 배양에 있어서의 각종 사이토카인 생산을 경시적으로 정량하였다. CAR-T 세포에서 유래하는 사이토카인의 IFN-γ 생산은 크게 다르지 않았다. 한편으로, IL-6 이나 MCP-1 생산은, 수배 내지 10 배 이상의 생산이 확인되어, CD14⁺ 세포의 활성화 상태가 현저한 것을 반영하는 결과로 생각되었다 (도 18). 참고로, IL-6 및 MCP-1 모두 CRS 독성의 중증화를 예측 그리고 판정하는 바이오 마커로서 보고¹⁶⁾ 되어 있다. 이상, 3 종류의 세포 「CAR-T 세포, 표적 세포 및 CD14⁺ 세포」 혼합 배양계는, CAR-T 세포 요법에 있어서의 "표적 암 세포 킬러 활성" 과 "CRS 독성" 을 동시에 평가하는 것이 가능한 in vitro 배양계인 것으로 생각되었다.

1.3.15 CAR-T 세포의 킬러 활성에 대한 JTE-607 및 PSL 의 작용

CAR-T 세포의 킬러 활성에 대하여, PSL 은 농도에 따라 억제 작용을 나타내지만, JTE-607 은 영향을 미치지 않았다 (도 19).

1.3.16 CAR-T 세포를 사용한 CRS 독성 평가계에서의 JTE-607, PSL 및 토실리주맙 작용

킬러 활성 평가시의 배양 상청 중의 각 사이토카인에 대한 평가를 실시하였다. IFN-γ 생산에 대하여, JTE-607 과 PSL 은 동일한 정도의 억제 활성이 확인되었다. IL-6 생산에 대하여, JTE-607 의 IC₅₀ 값은 187.5 nM 이었다. 한편, PSL 은 억제 작용을 나타내지 않았다 (도 20 및 표 2). MCP-1 생산에 대하여, JTE-607 은 농도 의존적인 억제 작용을 나타내, 그 IC₅₀ 값은 37.6 nM 이었다. 또한 PSL 의 IC₅₀ 값은 71.8 μM 이었다. 한편, 토실리주맙은 억제 작용을 나타내지 않았다 (도 21 및 표 2). IL-8 생산에 대하여, JTE-607 은 억제 작용을 나타내, 그 IC₅₀ 값은 153.8 nM 이었다. 한편으로 PSL 및 토실리주맙은 억제 작용을 나타내지 않았다 (도 22 및 표 2). TNF-α 및 IL-1β 에 대하여, JTE-607 은 억제 작용을 나타내, 그 IC₅₀ 값은 각각 413.1 nM, 358.9 nM 이었다. 한편으로 PSL 및 토실리주맙은 억제 작용을 나타내지 않았다 (도 23, 도 24 및 표 2). IL-18 에 대해서는 이번 평가한 조건에서는 거의 생산이 확인되지 않아 평가에는 이르지 않았다 (도 25 및 표 2).

「내재성 T 이펙터 세포의 과잉 활성화에 수반하는 각종 부작용·증상 (irAEs, HLH, MAS 등) 발증의 개념도」 를 도 26 에 나타냈다.

면역 체크 포인트 저해약이나 바이러스 감염 등에 의해 과잉 증폭하는 T 이펙터 세포는, 공존하는 조직 상재성 마크로파지나 항원 제시 세포 등과 서로 영향을 주어, 항암 작용·항바이러스 작용에 더하여 자기 면역 질환 관련 부작용 등을 일으킨다. 프레드니솔론 (PSL) 에 의한 면역 억제 작용은, 그들 부작용 및 증상을 개선하지만, 동시에 항암·항바이러스 작용 T 이펙터 기능도 전면적으로 저해한다.

한편, 토실리주맙이 마크로파지 활성화에 의한 과잉 생산되는 IL-6 의 저해를 목적으로 하여 사용되어, 자기 면역 질환 관련 부작용의 경감·개선이 기대된다. JTE-607 은, 보다 폭넓게 마크로파지 이상 활성화를 저해하는 것이 기대되고, 또한 T 이펙터 세포의 억제가 한정적인 것을 나타냈다. 이 도면 제시의 배경이 되는 발견은, T 세포 반응 (CD3 ＋ CD28 자극 반응계) 과 단구·마크로파지 반응 (LPS 등의 자극 반응계) 의 단독 배양 및 신규의 조합 배양계의 결과에 나타나 있다.

이상으로부터 도 26 에서는, JTE-607 이 주요한 T 이펙터 세포 기능에 크게 영향을 주지 않고, 마크로파지 활성화를 억제하여 장기 상해를 개선하는 효과가 기대되는 것을 나타내고 있다.

참고 문헌

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서열표 프리텍스트

서열 번호 1 ∼ 6 : 합성 DNA

SEQUENCE LISTING <110> TORII PHARMACEUTICAL CO., LTD. <120> An agent for improving cytokine release syndrome, etc. <130> G2137WO <150> JP2018-223377 <151> 2018-11-29 <150> JP2019-165013 <151> 2019-09-11 <160> 6 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic DNA <400> 1 cgctaccgtc gtcgaattcg ccgccaccat gcttc 35 <210> 2 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic DNA <400> 2 gaagttcgtg ctccgggatc ccgcgagggg gcag 34 <210> 3 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic DNA <400> 3 ccggttcgaa ttcgccatat gccacctccc gcctc 35 <210> 4 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic DNA <400> 4 cgatgttaac tctagatcac ctgggtgctc caggtgc 37 <210> 5 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic DNA <400> 5 gaattcgcca ccatggaaga tgccaa 26 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic DNA <400> 6 ggatcccacg gcgatcttgc cgcc 24

Claims

다음 식 I :

〔식 중, R₁ 은, 치환되어 있어도 되는 질소 함유 비방향족 알킬기 또는 치환되어 있어도 되는 질소 함유 복소 고리기를 나타내고, A 는, 단결합, 또는 치환되어 있어도 되고, 또한 사슬 중에 1 혹은 2 이상의 이중 결합 혹은 삼중 결합을 가지고 있어도 되는 탄소수 1 ∼ 10 의 직사슬형 혹은 분기형의 알킬렌기를 나타내고, R₂ 는, 산소 원자, 또는 -CO-, -COO-, -OCO- 혹은 -O-CO-O- 로 나타내는 기를 나타내고, R₃ 은, 동일 또는 상이하고, 수소 원자, 수산기, 할로겐 원자, 또는 치환되어 있어도 되고, 또한 직사슬형 혹은 분기형의 탄소수 1 ∼ 20 의 알킬기를 나타내고 (단, R₃ 의 적어도 1 개는 수소 원자가 아니다), n 은 1 ∼ 4 의 정수를 나타내고, m 은 0 또는 1 ∼ 6 의 정수를 나타내고, R₄ 는, 치환되어 있어도 되는 탄소수 6 ∼ 20 의 아릴기, 치환되어 있어도 되는 복소 고리기, 치환되어 있어도 되는 탄소수 3 ∼ 10 의 시클로알킬기, 치환되어 있어도 되는 탄소수 1 ∼ 20 의 직사슬형 혹은 분기형의 알킬기, 또는 치환되어 있어도 되는 탄소수 1 ∼ 20 의 직사슬형 혹은 분기형의 알콕시기를 나타내고, R₅ 는, 산소 원자, 또는 -CO-, -COO-, -OCO- 혹은 -O-CO-O- 로 나타내는 기를 나타내고, R₆ 은, 수소 원자, 또는 탄소수 1 ∼ 20 의 직사슬형 혹은 분기형의 알킬기, 혹은 치환되어 있어도 되는 탄소수 1 ∼ 20 의 아릴기를 나타낸다.〕
로 나타내는 화합물, 또는 그 약학적으로 허용되는 염을 포함하는, 사이토카인 방출 증후군, 자기 면역 질환 관련 부작용, 마크로파지 활성화 증후군, 혈구 탐식성 림프 조직구증 및 랑게르한스 세포 조직구증으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 개에 대한 의약.
제 1 항에 있어서,
질소 함유 비방향족 복소 고리기가 피페라지닐기 또는 피페리디닐기이고, A 가 탄소수 1 ∼ 10 의 직사슬형의 알킬렌기이고, R₂ 가 산소 원자이고, R₃ 이 동일 또는 상이하게 수소 원자 또는 할로겐 원자이고 (단, R₃ 의 적어도 1 개는 수소 원자가 아니다), R₄ 가 페닐기이고, R₅ 가 -COO- 로 나타내는 기를 나타내고, R₆ 이 탄소수 1 ∼ 10 의 직사슬형의 알킬기인, 의약.
제 1 항에 있어서,
질소 함유 비방향족 알킬기가 알킬아미노기이고, A 가 탄소수 1 ∼ 10 의 직사슬형의 알킬렌기이고, R₂ 가 산소 원자이고, R₃ 이 동일 또는 상이하게 수소 원자 또는 할로겐 원자이고 (단, R₃ 의 적어도 1 개는 수소 원자가 아니다), R₄ 가 페닐기이고, R₅ 가 -COO- 로 나타내는 기를 나타내고, R₆ 이 탄소수 1 ∼ 10 의 직사슬형의 알킬기인, 의약.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
식 I 로 나타내는 화합물 또는 그 약학적으로 허용되는 염이, 다음 식 II :

로 나타내는 화합물 또는 그 약학적으로 허용되는 염인, 의약.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
식 I 로 나타내는 화합물, 또는 그 약학적으로 허용되는 염이, 다음 식 III :

으로 나타내는 화합물 또는 그 약학적으로 허용되는 염인, 의약.
제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
식 I 로 나타내는 화합물, 또는 그 약학적으로 허용되는 염이, 식 III 으로 나타내는 화합물의 염산염인, 의약.
제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
식 I 로 나타내는 화합물, 또는 그 약학적으로 허용되는 염이, 다음 식 IV :

로 나타내는 화합물인, 의약.
제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서,
질환 또는 증상이, 면역 체크 포인트 저해약의 사용에서 기인하는 것, 키메라 항원 수용체 발현 T 세포 요법에서 기인하는 것, 개변 T 세포 수용체 발현 T 세포 요법에서 기인하는 것, 또는 감염증, 암 및 자기 면역 질환으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 개에 의해 유발되는 것인, 의약.
제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서,
사이토카인의 생산 및 마크로파지의 활성화의 적어도 1 개를 억제하는, 의약.
제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서,
사이토카인이, 종양 괴사 인자 (TNF)-α, 인터류킨 (IL)-1β, IL-4, IL-6, IL-8, IL-1RA, IL-2Rα, IL-10, IL-18, 과립구 마크로파지 콜로니 자극 인자 (GM-CSF), 마크로파지 콜로니 자극 인자 (M-CSF), 인슐린 증식 인자 (IGF), 인터페론 (IFN)-γ, IFN-γ 유도 단백 10 (IP-10), 단구 주화성 인자 (MCP)-1, 혈관 내피 증식 인자 (VEGF), 오스테오폰틴 (OPN), Receptor activator of NF-κB ligand (RANKL), 사이토카인 수용체 gp130, 유리형 IL-1 수용체 (sIL-1R)-1, sIL-1R-2, 유리형 IL-6 수용체 (sIL-6R), 유리형 종말 당화 산물 수용체 (sRAGE), 유리형 TNF 수용체 (sTNFR)-1, sTNFR-2, IFN-γ 유도 모노카인 (MIG), 마크로파지 염증 단백 (MIP)-1α 및 MIP-1β 로 이루어지는 것에서 선택되는 적어도 1 개인, 의약.
제 10 항에 있어서,
사이토카인이, TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-8, IL-18, IFN-γ, MCP-1 및 OPN 으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 개인, 의약.
제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서,
사이토카인 방출 증후군, 자기 면역 질환 관련 부작용, 마크로파지 활성화 증후군, 혈구 탐식성 림프 조직구증 및 랑게르한스 세포 조직구증으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 개의 예방, 치료 또는 개선을 위한, 의약.