KR20200125694A - 바람직한 잎 품질과 함께 변경된 알칼로이드 수준을 갖는 담배 식물 및 제품을 생성하기 위한 조성물 및 방법 - Google Patents

바람직한 잎 품질과 함께 변경된 알칼로이드 수준을 갖는 담배 식물 및 제품을 생성하기 위한 조성물 및 방법 Download PDF

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Abstract

본 개시내용은 오르니틴 데카르복실라제 (ODC) 유전자의 억제를 위해 예를 들어 유도성 프로모터 및 비코딩 RNA를 조합함으로써 저-알칼로이드 담배 식물에서 잎 품질을 개선시키기 위한 방법 및 조성물을 포함한다. 정상인, 억제된 또는 달리 변경된 폴리아민 수준을 갖는 저-알칼로이드 담배 식물 또한 제공된다. 변경된 총 알칼로이드, 니코틴 수준, 상업적으로 허용가능한 잎 등급을 갖는 담배 식물, 육종 또는 트랜스제닉 접근법을 통한 이들의 개발, 및 이들 담배 식물로부터 담배 제품의 제조가 추가로 제공된다.

Description

바람직한 잎 품질과 함께 변경된 알칼로이드 수준을 갖는 담배 식물 및 제품을 생성하기 위한 조성물 및 방법
관련 출원의 상호 참고
본 출원은 2018년 3월 5일에 출원한 미국 가출원 번호 62/638,928을 우선권으로 주장하며, 이는 그의 전문이 본원에 참고로 포함된다.
서열 목록의 포함
88,011 바이트 (엠에스-윈도우(MS-Windows)®에서 측정됨)의 크기로 2019년 3월 4일에 생성되어 "P34584WO00_SL.txt"의 명칭으로 ASCII 파일에 포함된 서열 목록이 본원과 함께 전자적으로 제출되며, 이는 그의 전체가 본원에 참고로 포함된다.
기술분야
본 개시내용은 변경된 총 알칼로이드 및 니코틴 수준 및 상업적으로 허용가능한 잎 등급을 갖는 담배 식물, 육종 또는 트랜스제닉 접근법을 통한 이들의 개발, 및 이들 담배 식물로부터 담배 제품의 제조를 포함한다.
담배는 740만 톤을 초과하는 전세계 생산량으로 세계에서 가장 널리 재배되는 비식용 작물 중 하나이며 (FAOSTAT, 유엔 식량 농업 기구 (FAO) (2014), faostat.fao.org), 생성된 담배 제품은 7천 7백억 달러의 연간 전세계 시장 규모를 갖는다 (Euromonitor International, 2016). 니코틴은 담배 잎에서 축적되는 주요 알칼로이드이다. 니코틴 및 다른 미량 알칼로이드는 또한 담배-특이적 니트로사민 (TSNA)에 대한 전구체이다. 보다 낮은 수준의 니코틴을 갖는 담배 재배종(cultivar)의 개발에 대한 요구가 있다.
상업용 담배 재배종에서, 니코틴은 총 알칼로이드 풀의 90-95% 또는 총 잎 건조 중량의 2-5%를 나타낸다 (Saitoh F, Nona M, Kawashima N (1985). The alkaloid contents of sixty Nicotiana species. Phytochem. 24: 477-480). 니코틴은 뿌리에서 합성되고 (Dawson RF (1942) Accumulation of nicotine in reciprocal grafts of tomato and tobacco. Am. J. Bot. 29: 66-71), 목질부를 통해 (Baldwin IT (1988). The alkaloidal responses of wild tobacco to real and simulated herbivory. Oecologia 77: 378-381) 식물의 지상부로 전위되고 (Hildreth SB, Gehman EA, Yang H, Lu RH, Ritesh KC, Harich KC, Yu S, Lin J, Sandoe JL, Okumoto S, Murphyd, AS, Jeleskoaet JG (2011). Tobacco nicotine uptake permease (NUP1) affects alkaloid metabolism. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 108: 18179-18184), 여기서 잎에 축적되고, 곤충 초식에 대한 반응으로 트리콤에 의해 삼출된다 (Kessler A, Baldwin IT (2002). Plant responses to insect herbivory: the emerging molecular analysis. Annu Rev. Plant Biol. 53: 299-328). 니코틴 생합성은 유전 인자, 식물 발달, 생물적 및 비생물적 스트레스, 식물호르몬 신호 및 작물 관리 관행, 예컨대 토핑 및 흡지에 의해 영향을 받는다 (Wang SS, Shi QM, Li WQ, Niu JF, Li CJ, Zhang FS (2008). Nicotine concentration in leaves of flue-cured tobacco plants as affected by removal of the shoot apex and lateral buds. J. Integr. Plant Bio. 50: 958-964; Shoji T, Hashimoto T (2015). Stress-induced expression of NICOTINE2-locus genes and their homologs encoding Ethylene Response Factor transcription factors in tobacco. Phytochem.113: 41-49). 니코틴 생합성의 유전적 조절은 니코틴 수준에 대해 상승작용 효과를 갖는 2가지 독립적인 유전자좌인 Nic1 및 Nic2와 상관관계가 있지만, Nic1의 효과는 Nic2에 비해 ~2.4배 더 강력하다 (Legg PD, Collins GB (1971). Inheritance of percent total alkaloids in Nicotiana tabacum L. II. Genetic effects of two loci in Burley 21 x LA Burley 21 populations. Can. J. Genet. Cytol. 13: 287-291). 두 유전자좌 모두 니코틴 생합성 경로와 관련이 없는 수많은 다른 유전자의 발현에 영향을 미친다 (Kidd SK, Melillo AA, Lu RH, Reed DG, Kuno N, Uchida K, Furuya M, Jelesko JG (2006). The A and B loci in tobacco regulate a network of stress response genes, few of which are associated with nicotine biosynthesis. Plant Mol. Biol. 60: 699-716; Shoji T, Kajikawa M, Hashimoto T (2010). Clustered transcription factor genes regulate nicotine biosynthesis in tobacco. Plant Cell 22: 3390-3409). 전사 분석을 통해 Nic2 유전자좌가 적어도 7개의 에틸렌 반응 전사 인자 (ERF)를 코딩하는 유전자 클러스터임이 밝혀졌다 (Shoji et al. 2010).
두 유전자좌 중 하나 또는 둘 다의 동형접합성 돌연변이를 이용하여, 감소된 알칼로이드 수준을 갖는 근동질성 버어리(Burley) 21 계통, 즉, 유전자형 nic2를 갖는 고-중간체 (HI) 품종(variety), 유전자형 nic1을 갖는 저-중간체 (LI) 품종, 및 유전자형 nic1nic2를 갖는 저-알칼로이드 (LA) 품종을 생성할 수 있다 (Legg PD, Chaplin JF, Collins GB (1969). Inheritance of percent total alkaloids in Nicotiana tabacum L. J. Hered. 60: 213-217; Legg et al. 1971). LA 버어리 21 식물은 정상-알칼로이드 (NA) 야생형 품종에서 발견되는 총 알칼로이드 수준의 ~5.7%만을 함유한다 (Legg PD, Collins GB, Littion CC (1970). Registration of LA Burley 21 tobacco germplasm. Crop. Sci. 10: 212). LA 식물에서, nic1 및 nic2 돌연변이의 상승작용 효과는 또한 보다 낮은 수율, 지연된 숙성 및 노화, 곤충 초식에 대한 보다 높은 민감성, 및 건조처리(curing) 이후 불량한 최종-생성물 품질을 특징으로 하는 불리한 잎 표현형을 유발한다 (Chaplin JF, Weeks WW (1976). Association between percent total alkaloids and other traits in flue-cured tobacco. Crop Sci. 16: 416-418; Legg et al. 1970; Chaplin JF, Burk LG (1983). Agronomic, chemical, and smoke characteristics of flue-cured tobacco lines with different levels of total alkaloids. Crop Sci. 75: 133-136).
담배 식물의 LA 품종에서 불리한 잎 표현형을 복원하고, (우수하게 만들지 않는 경우) 담배 잎 품질을 유지하면서 변경된 니코틴 수준 (예를 들어, 감소된 니코틴)을 함유하는 담배 식물 및 제품을 개발하는 유전자를 확인하는 것이 요구된다.
한 측면에서, 본 개시내용은 오르니틴 데카르복실라제 (ODC) 유전자의 억제를 위해 비코딩 RNA를 코딩하는 전사가능한 DNA 서열에 작동가능하게 연결된 유도성 프로모터를 포함하는 담배 식물을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 대조군 담배 식물에 비해 보다 낮은 수준의 니코틴 또는 총 알칼로이드를 제공하는 제1 게놈 변형, 및 총 잎 폴리아민 수준, 총 뿌리 폴리아민 수준, 총 잎 엽록소 수준, 잎 면적 단위당 엽육 세포 개수, 및 잎 표피 세포 크기로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 형질의 대등한 수준을 제공하는 제2 게놈 변형을 포함하는 담배 식물 또는 그의 일부분을 제공하며; 상기 대조군 식물은 상기 제1 및 상기 제2 게놈 변형을 둘 다 갖지 않는다.
한 측면에서, 본 개시내용은 담배 식물을 재배하고, 상기 담배 식물에서 푸트레신의 수준을 감소시키고, 상기 담배 식물로부터 잎을 수확하는 것을 포함하는, 감소된-알칼로이드 담배 식물에서 잎 품질을 개선시키는 방법을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 담배 식물을 재배하고, 상기 담배 식물에서 오르니틴 데카르복실라제 (ODC) 유전자의 발현 또는 활성을 억제하고, 상기 담배 식물로부터 잎을 수확하는 것을 포함하는, 감소된-알칼로이드 담배 식물에서 잎 품질을 개선시키는 방법을 제공한다.
한 측면에서, 트랜스진 억제, 돌연변이 유발, 또는 표적화된 게놈 편집을 통해 억제된 MYB8 활성을 갖는 담배 식물이 제공된다.
도 1: 온실에서 재배한 엔. 타바쿰 엘. 씨브이. 버어리 21(N. tabacum L. cv. Burley 21) 정상-알칼로이드 (NA) 야생형 식물 및 3가지 돌연변이성 품종의 표현형 특징분석. 도 1A: 온실에서 재배한 야생형 (NA) 고-중간체 (HI, nic2), 저-중간체 (LI, nic1) 및 저-알칼로이드 (LA, nic1nic2) 계통의 총 엽록소 함량. 엽록소는 상이한 발달 단계: 개화기 이전 (토핑하기 2.5 주 전), 토핑시, 토핑후 1 주째 (WPT), 2.5 WPT 및 수확시에 15 cm보다 긴 모든 잎에서 잎마다 2회 측정되었다. 값은 4개의 생물학적 복제물의 평균이다. 도 1B: 수확시 NA 및 LA 식물의 대표적인 사진이다. 도 1C: 잎 15에서 엽육 세포 개수의 시간-경과 평가. 도 1D: 상이한 식물 발달 단계에 있는 NA 및 LA 식물로부터의 잎 15의 엽육 세포의 현미경 영상. 막대 = 100 μm. A 및 C에서의 값은 6개의 생물학적 복제물의 평균이다. 오차 막대는 평균의 표준 편차를 나타낸다. NA에 대한 통계적 차이가 도시된다: *p<0.05.
도 2: 들판 및 온실에서 재배한 NA 및 LA 식물에서 폴리아민 분석. 도 2A: 토핑후 1 주째에 NA 및 LA 식물 (들판에서 재배한 3개의 생물학적 복제물)의 5개의 잘 확장된 상부 잎으로부터의 유리 (F) 및 접합된 (C) 푸트레신 (Put), 스페르미딘 (Spd) 및 스페르민 (Spm) 함량. 도 2B: 온실에서 재배한 NA 및 LA 식물에서 총 폴리아민 함량의 시간-경과 모니터링. 잎 샘플을 동일한 발단 단계에 있는 잎: 개화기 이전 (잎 12), 토핑시 (잎 19) 및 수확시 잎 (24)로부터 수집하였다. 뿌리 샘플을 토핑시 및 수확시에 수집하였다. 값은 3개의 (A) / 4개의 (B) 생물학적 복제물의 평균이다. 오차 막대는 평균의 표준 편차를 나타낸다. NA에 대한 통계적 차이가 도시된다: *p<0.05; **p<0.005. PA: 폴리아민; FW: 생중량.
도 3: 온실에서 재배한 NA, HI, LI 및 LA 식물의 잎 및 뿌리에서 폴리아민 함량. 개화기 이전 (잎 6), 토핑시 (어린 잎 23, 뿌리) 및 수확시에 (성숙한 잎 23, 뿌리) NA, HI, LI 및 LA 식물의 잎 (도 3A) 및 뿌리 (도 3B)에서 유리 (F) 및 접합된 (C) 푸트레신 (Put), 스페르미딘 (Spd) 및 스페르민 (Spm) 분획이 도시된다. 샘플을 조명한지 4 시간 후에 수집하고, 액체 질소에서 즉시 동결시키고, LC-MS/MS에 의해 분석하였다. 값은 3개의 생물학적 복제물의 평균이다. 오차 막대는 평균의 표준 편차를 나타낸다. 통계적 차이가 도시된다: *p<0.05; **p<0.001, 이는 LI 및 LA 식물이 동일한 조건하에 NA 식물과 유의하게 상이하다는 것을 나타낸다. 뿌리의 경우 토핑시 및 수확시로부터의 샘플만이 이용가능하였다. FW: 생중량.
도 4: 폴리아민 생합성 효소의 활성. 토핑시에 (어린 잎 23, 뿌리) 및 수확시에 (성숙한 잎 23, 뿌리) NA 및 LA 식물의 잎 및 뿌리에서 아르기닌 데카르복실라제 (ADC) (도 4A) 및 오르니틴 데카르복실라제 (ODC) (도 4B) 활성의 분석. 값은 3개의 생물학적 복제물의 평균이다. 오차 막대는 평균의 표준 편차를 나타낸다. NA에 대한 통계적 차이가 도시된다: *p<0.05; **p<0.001.
도 5: 수확시에 비처리된 NA 및 LA 식물, 및 폴리아민 생합성 억제제 및/또는 식물 성장 조절제로 처리된 LA 식물로부터의 잎 23의 대표적인 사진. D-아르기닌 (5 mM)은 ADC의 억제제이고; DFMO (디플루오로메틸오르니틴, 2 mM)는 ODC의 억제제이고, ETH (에테폰(Ethephon)®, 0.5 mM)은 성장 조절제이다.
도 6: 폴리아민 생합성 억제제 및/또는 에테폰®으로 LA 식물의 처리. 토핑시 및 수확시에 비처리된 및 처리된 LA 식물의 잎 (도 6A) 및 뿌리 (도 6B)에서 총, 유리 및 접합된 폴리아민의 비교. 담배 식물을 폴리아민 생합성 억제제 및/또는 에테폰®의 부재하에 (NA 및 LA) 또는 존재하에 (LA) (5 mM D-아르기닌, 2 mM DFMO, 2 mM DFMO/0.5 mM 에테폰® 또는 0.5 mM 에테폰® 단독) 온실에서 재배하였다. D-아르기닌 및 DFMO를 개화기 이전부터 수확시까지 6 주의 기간 동안 주당 3회 적용한 반면에, 에테폰® 처리는 토핑후에 (2.5 주 이후에) 시작하여 수확시까지 하였다. 유전자형 또는 처리당 4개의 생물학적 복제물의 잎 23 또는 뿌리로부터 조명한지 4 시간 후에 샘플을 수집하였다. 비처리된 LA 식물 (회색 막대), 또는 D-아르기닌 (검은색 막대), DFMO (흰색 막대), DFMO/ 에테폰® (수평 줄 막대), 및 에테폰® (디벗 막대)으로 처리된 식물로부터의 평균 폴리아민 함량 사이의 변화 배수가 플롯팅된다. 오차 막대는 평균의 표준 편차를 나타낸다 (n =4). LA/NA의 평균에 대한 통계적 차이가 표시된다: *p<0.05. 적색 선은 NA에서 폴리아민 함량을 나타낸다.
서열의 간단한 걸명
서열식별번호(SEQ ID NO): 1 내지 11은 토핑 반응성 뿌리 특이적인 또는 선호적인 발현에 대한 예시적인 프로모터의 서열을 제시한다.
서열식별번호: 11 내지 21은 토핑 반응성 잎 특이적인 또는 선호적인 발현에 대한 예시적인 프로모터의 서열을 제시한다.
서열식별번호: 22는 오르니틴 데카르복실라제 (ODC)를 억제하는 비코딩 RNA를 코딩하는 예시적인 DNA 구축물의 서열을 제시한다.
서열식별번호: 23 내지 28은 예시적인 담배 ODC 유전자의 cDNA 서열을 제시한다.
서열식별번호: 29 내지 34는 예시적인 ODC 유전자에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호: 35 및 36은 본 개시내용에 따라 ODC 유전자를 표적화하는 2가지 miRNA 서열을 제시한다.
다양한 서열은 뉴클레오티드 서열에서 "N" 또는 아미노산 서열에서 "X"를 포함한다. "N"은 임의의 뉴클레오티드, 예를 들어 A, T, G, C이거나, 또는 1개 이상의 뉴클레오티드의 결실 또는 삽입일 수 있다. 일부 예에서, "N"의 가닥이 도시된다. "N"의 개수가 해당 위치에서 미결정 뉴클레오티드의 실제 개수와 반드시 상관관계가 있는 것은 아니다. 실제 뉴클레오티드 서열은 "N"의 도시된 세그먼트에 비해 더 길거나 또는 더 짧을 수 있다. 유사하게, "X"는 임의의 아미노산 잔기일 수 있거나 또는 1개 이상의 아미노산의 결실 또는 삽입일 수 있다. 다시, "X"의 개수가 해당 위치에서 미결정 아미노산의 실제 개수와 반드시 상관관계가 있는 것은 아니다. 실제 아미노산 서열은 "X"의 도시된 세그먼트에 비해 더 길거나 또는 더 짧을 수 있다. 서열 목록에서 임의의 SEQ ID를 기재하는데 있어서 A, T, G, C의 사용에도 불구하고 (A, U, G, C와 비교하여), SEQ ID가 언급된 문맥에 따라 SEQ ID는 또한 RNA 서열을 지칭할 수 있다.
상세한 설명
달리 정의되지 않는다면, 본원에서 사용된 기술적 및 과학적 용어들은 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 관련 기술분야의 기술자는 여러 방법이 본 개시내용의 실시에서 이용될 수 있음을 인식할 것이다. 본 개시내용은 어떠한 방식으로도 기재된 방법 및 물질을 제한하지 않는다. 본 개시내용의 목적을 위해, 하기 용어가 다음과 같이 정의된다.
예를 들어 모든 특허 및 공보를 비롯하여 본원에서 인용된 임의의 참고문헌은 그들의 전문이 참고로 포함된다.
본원에 사용된 바와 같이, 단수 형태는 문맥상 명확하게 달리 나타내지 않는다면 복수 형태를 포함한다. 예를 들어, 용어 "화합물" 또는 "적어도 1종의 화합물"은 그들의 혼합물을 비롯하여 다수개의 화합물을 포함할 수 있다.
용어 "약"은 대략적으로, 대강, 주위 또는 그의 영역을 의미하게 위해 본원에서 사용된다. 용어 "약"이 수치 범위와 함께 사용되는 경우, 이는 제시된 수치 값의 위아래로 경계를 확장시킴으로써 해당 범위를 수식한다. 의심을 피하기 위해, "약", "적어도", "적어도 약", "최대", "미만", "초과", "이내" 등과 같이 본원에서 사용된 용어 또는 문구가 백분율 수의 일련의 나열 앞에 올 때, 이러한 용어 또는 문구는 상기 일련 또는 나열에서 백분율의 각각의 모든 수를 수식하는 것으로 간주된다.
본원에 사용된 바와 같이, 담배 식물은 니코티아나 타바쿰(Nicotiana tabacum), 니코티아나 암플렉시카울리스(Nicotiana amplexicaulis) PI 271989; 니코티아나 벤타미아나(Nicotiana benthamiana) PI 555478; 니코티아나 비겔로비이(Nicotiana bigelovii) PI 555485; 니코티아나 데브네이(Nicotiana debneyi); 니코티아나 엑셀시오르(Nicotiana excelsior) PI 224063; 니코티아나 글루티노사(Nicotiana glutinosa) PI 555507; 니코티아나 굿스페디이(Nicotiana goodspeedii) PI 241012; 니코티아나 고쎄이(Nicotiana gossei) PI 230953; 니코티아나 헤스페리스(Nicotiana hesperis) PI 271991; 니코티아나 나이티아나(Nicotiana knightiana) PI 555527; 니코티아나 마리티마(Nicotiana maritima) PI 555535; 니코티아나 메갈로시폰(Nicotiana megalosiphon) PI 555536; 니코티아나 누디카울리스(Nicotiana nudicaulis) PI 555540; 니코티아나 파니쿨라타(Nicotiana paniculata) PI 555545; 니코티아나 플룸바기니폴리아(Nicotiana plumbaginifolia) PI 555548; 니코티아나 레판다(Nicotiana repanda) PI 555552; 니코티아나 루스티카(Nicotiana rustica); 니코티아나 수아베올렌스(Nicotiana suaveolens) PI 230960; 니코티아나 실베스트리스(Nicotiana sylvestris) PI 555569; 니코티아나 토멘토사(Nicotiana tomentosa) PI 266379; 니코티아나 토멘토시포르미스(Nicotiana tomentosiformis); 및 니코티아나 트리고노필라(Nicotiana trigonophylla) PI 555572를 비롯하여 이로 제한되지 않는 니코티아나 속으로부터의 임의의 식물일 수 있다.
한 측면에서, 본 개시내용은 오르니틴 데카르복실라제 (ODC) 유전자의 억제를 위해 비코딩 RNA를 코딩하는 전사가능한 DNA 서열에 작동가능하게 연결된 유도성 프로모터를 포함하는 담배 식물 또는 그의 일부분을 제공한다. 한 측면에서, 담배 식물은 니코틴의 감소된 수준을 부여하는 돌연변이 또는 트랜스진을 포함한다. 한 측면에서, 담배 식물은 저-알칼로이드 담배 식물이다. 한 측면에서, 본 개시내용의 담배 식물은 nic1 돌연변이, nic2 돌연변이, 또는 이들 둘 다를 포함한다. 한 측면에서, 담배 식물은 유사한 재배 조건에서 재배할 때 대조군 식물의 니코틴 수준의 1% 미만, 2% 미만, 5% 미만, 8% 미만, 10% 미만, 12% 미만, 15% 미만, 20% 미만, 25% 미만, 30% 미만, 40% 미만, 50% 미만, 60% 미만, 70% 미만, 또는 80% 미만인 수준으로 니코틴을 포함하며, 대조군 식물은 저-니코틴 부여 돌연변이 또는 트랜스진을 제외하고는 담배 식물과 본질적으로 동일한 유전적 백그라운드를 공유한다. 또 다른 측면에서, 담배 식물은 유사한 재배 조건에서 재배할 때 대조군 식물의 니코틴 또는 총 알칼로이드 수준의 1% 미만, 2% 미만, 5% 미만, 8% 미만, 10% 미만, 12% 미만, 15% 미만, 20% 미만, 25% 미만, 30% 미만, 40% 미만, 50% 미만, 60% 미만, 70% 미만, 또는 80% 미만인 수준으로 니코틴 또는 총 알칼로이드를 포함한다. 또 다른 측면에서, 담배 식물은 유사한 재배 조건에서 재배할 때 대조군 식물의 니코틴 수준의 3% 미만, 2.75% 미만, 2.5% 미만, 2.25% 미만, 2.0% 미만, 1.75% 미만, 1.5% 미만, 1.25% 미만, 1% 미만, 0.9% 미만, 0.8% 미만, 0.7% 미만, 0.6% 미만, 0.5% 미만, 0.4% 미만, 0.3% 미만, 0.2% 미만, 0.1% 미만, 및 0.05% 미만으로 이루어진 군으로부터 선택된 총 알칼로이드 수준을 포함하며, 대조군 식물은 저-니코틴 부여 돌연변이 또는 트랜스진을 제외하고는 담배 식물과 본질적으로 동일한 유전적 백그라운드를 공유한다. 또 다른 측면에서, 담배 식물은 유사한 재배 조건에서 재배할 때 대조군 식물의 니코틴 또는 총 알칼로이드 수준의 3% 미만, 2.75% 미만, 2.5% 미만, 2.25% 미만, 2.0% 미만, 1.75% 미만, 1.5% 미만, 1.25% 미만, 1% 미만, 0.9% 미만, 0.8% 미만, 0.7% 미만, 0.6% 미만, 0.5% 미만, 0.4% 미만, 0.3% 미만, 0.2% 미만, 0.1% 미만, 및 0.05% 미만으로 이루어진 군으로부터 선택된 니코틴 또는 총 알칼로이드 수준을 포함한다.
한 측면에서, 담배 식물은 아스파르테이트 옥시다제, 아그마틴 데이미나제 (AIC), 아르기나제, 디아민 옥시다제, 아르기닌 데카르복실라제 (ADC), 메틸푸트레신 옥시다제 (MPO), NADH 데히드로게나제, 오르니틴 데카르복실라제 (ODC), 포스포리보실안트라닐레이트 아이소머라제 (PRAI), 푸트레신 N-메틸트랜스퍼라제 (PMT), 퀴놀레이트 포스포리보실 트랜스퍼라제 (QPT), S-아데노실-메티오닌 신테타제 (SAMS), A622, NBB1, BBL, MYC2, nic1, nic2, 에틸렌 반응 인자 (ERF) 전사 인자, 니코틴 흡수 페르메아제 (NUP), 및 MATE 트랜스포터로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질을 코딩하는 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상, 10개 이상, 11개 이상, 12개 이상, 13개 이상, 14개 이상, 15개 이상, 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상, 20개 이상, 또는 21개 모두의 유전자 또는 유전자좌의 발현 또는 활성을 직접적으로 억제하는 트랜스진 또는 돌연변이를 포함한다. [Dewey and Xie, Molecular genetics of alkaloid biosynthesis in Nicotiana tabacum, Phytochemistry 94 (2013) 10-27]을 참고한다.
한 측면에서, 담배 식물은 ERF32, ERF34, ERF39, ERF189, ERF115, ERF221, ERF104, ERF179, ERF17 및 ERF168로 이루어진 군으로부터 선택된 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상, 또는 10개 모두의 유전자에서 1개 이상의 돌연변이를 추가로 포함한다. 한 측면에서, 담배 식물은 ERF189, ERF115, 또는 이들 둘 다에서 1개 이상의 돌연변이를 추가로 포함한다. 한 측면에서, 담배 식물은 ERF32, ERF34, ERF39, ERF189, ERF115, ERF221, ERF104, ERF179, ERF17 및 ERF168로 이루어진 군으로부터 선택된 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상, 또는 10개 모두의 단백질을 코딩하는 유전자를 표적화하고 억제하는 1개 이상의 트랜스진을 추가로 포함한다.
한 측면에서, 건조처리시 담배 식물은 55 이상, 60 이상, 65 이상, 70 이상, 75 이상, 80 이상, 85 이상, 90 이상, 및 95 이상으로 이루어진 군으로부터 선택된 USDA 등급 지수 값을 갖는 잎을 생성할 수 있다. 또 다른 측면에서, 건조처리시 담배 식물은 유사한 조건에서 재배하고 건조처리할 때 대조군 식물과 대등한 USDA 등급 지수 값을 갖는 잎을 생성할 수 있으며, 대조군 식물은 저-니코틴 부여 돌연변이 또는 트랜스진을 제외하고는 담배 식물과 본질적으로 동일한 유전적 백그라운드를 공유한다. 추가의 측면에서, 건조처리시 담배 식물은 유사한 조건에서 재배할 때 대조군 식물의 USDA 등급 지수 값의 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 또는 적어도 약 98%인 USDA 등급 지수 값을 갖는 잎을 생성할 수 있으며, 대조군 식물은 저-니코틴 부여 돌연변이 또는 트랜스진을 제외하고는 담배 식물과 본질적으로 동일한 유전적 백그라운드를 공유한다. 추가의 측면에서, 건조처리시 담배 식물은 대조군 식물의 USDA 등급 지수 값의 65% 내지 130%, 70% 내지 130%, 75% 내지 130%, 80% 내지 130%, 85% 내지 130%, 90% 내지 130%, 95% 내지 130%, 100% 내지 130%, 105% 내지 130%, 110% 내지 130%, 115% 내지 130%, 또는 120% 내지 130%인 USDA 등급 지수 값을 갖는 잎을 생성할 수 있다. 추가의 측면에서, 건조처리시 담배 식물은 대조군 식물의 USDA 등급 지수 값의 70% 내지 125%, 75% 내지 120%, 80% 내지 115%, 85% 내지 110%, 또는 90% 내지 100%인 USDA 등급 지수 값을 갖는 잎을 생성할 수 있다.
또 다른 측면에서, 건조처리시 담배 식물은 55 이상, 60 이상, 65 이상, 70 이상, 75 이상, 80 이상, 85 이상, 90 이상, 및 95 이상으로 이루어진 군으로부터 선택된 USDA 등급 지수 값을 갖는 잎을 생성할 수 있다. 또 다른 측면에서, 건조처리시 담배 식물은 50 내지 95, 55 내지 95, 60 내지 95, 65 내지 95, 70 내지 95, 75 내지 95, 80 내지 95, 85 내지 95, 90 내지 95, 55 내지 90, 60 내지 85, 65 내지 80, 70 내지 75, 50 내지 55, 55 내지 60, 60 내지 65, 65 내지 70, 70 내지 75, 75 내지 80, 80 내지 85, 85 내지 90, 및 90 내지 95로 이루어진 군으로부터 선택된 USDA 등급 지수 값을 갖는 잎을 생성할 수 있다. 추가의 측면에서, 건조처리시 담배 식물은 대조군 식물의 USDA 등급 지수 값의 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 또는 적어도 약 98%인 USDA 등급 지수 값을 갖는 잎을 생성할 수 있다. 추가의 측면에서, 건조처리시 담배 식물은 대조군 식물의 USDA 등급 지수 값의 65% 내지 130%, 70% 내지 130%, 75% 내지 130%, 80% 내지 130%, 85% 내지 130%, 90% 내지 130%, 95% 내지 130%, 100% 내지 130%, 105% 내지 130%, 110% 내지 130%, 115% 내지 130%, 또는 120% 내지 130%인 USDA 등급 지수 값을 갖는 잎을 생성할 수 있다. 추가의 측면에서, 건조처리시 담배 식물은 대조군 식물의 USDA 등급 지수 값의 70% 내지 125%, 75% 내지 120%, 80% 내지 115%, 85% 내지 110%, 또는 90% 내지 100%인 USDA 등급 지수 값을 갖는 잎을 생성할 수 있다.
한 측면에서, 본 개시내용은 또한 nic1 돌연변이, nic2 돌연변이, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 돌연변이를 포함하는 담배 품종, 재배종 또는 계통을 제공하며, 담배 품종, 재배종 또는 계통은 유사한 재배 조건에서 재배할 때 대조군 담배 품종, 재배종 또는 계통의 잎 등급과 대등한 잎 등급을 가지며, 대조군 담배 품종은 상기 돌연변이를 제외하고는 담배 품종, 재배종 또는 계통과 본질적으로 동일한 유전적 백그라운드를 공유한다.
한 측면에서, 본 개시내용은 3% 미만, 2.75% 미만, 2.5% 미만, 2.25% 미만, 2.0% 미만, 1.75% 미만, 1.5% 미만, 1.25% 미만, 1% 미만, 0.9% 미만, 0.8% 미만, 0.7% 미만, 0.6% 미만, 0.5% 미만, 0.4% 미만, 0.3% 미만, 0.2% 미만, 0.1% 미만, 및 0.05% 미만으로 이루어진 군으로부터 선택된 니코틴 또는 총 알칼로이드 수준을 포함하는 비-트랜스제닉 담배 식물 또는 그의 일부분을 추가로 제공하며, 건조처리시 담배 식물은 50 이상, 55 이상, 60 이상, 65 이상, 70 이상, 75 이상, 80 이상, 85 이상, 90 이상, 및 95 이상의 USDA 등급 지수 값을 갖는 잎을 생성할 수 있다. 또 다른 측면에서, 이러한 비-트랜스제닉 담배 식물은 2.0% 미만의 니코틴 수준을 포함하고, 건조처리시 70 이상의 USDA 등급 지수 값을 갖는 잎을 생성할 수 있다. 추가의 측면에서, 이러한 비-트랜스제닉 담배 식물은 1.0% 미만의 니코틴 수준을 포함하고, 건조처리시 70 이상의 USDA 등급 지수 값을 갖는 잎을 생성할 수 있다.
한 측면에서, 본 개시내용은 또한 비-트랜스제닉 돌연변이를 포함하는 담배 식물 또는 그의 일부분을 제공하며, 비-트랜스제닉 돌연변이는 유사한 재배 조건에서 재배할 때 대조군 식물의 니코틴 수준의 1% 미만, 2% 미만, 5% 미만, 8% 미만, 10% 미만, 12% 미만, 15% 미만, 20% 미만, 25% 미만, 30% 미만, 40% 미만, 50% 미만, 60% 미만, 70% 미만, 또는 80% 미만으로 담배 식물의 니코틴 또는 총 알칼로이드 수준을 감소시키며, 건조처리시 담배 식물은 대조군 식물의 USDA 등급 지수 값과 대등한 USDA 등급 지수 값을 갖는 잎을 생성할 수 있으며, 대조군 식물은 비-트랜스제닉 돌연변이를 제외하고는 담배 식물과 본질적으로 동일한 유전적 백그라운드를 공유한다.
한 측면에서, 본 개시내용은 유전자 또는 유전자좌에서 돌연변이를 포함하는 담배 식물 또는 그의 일부분을 제공하며, LA 버어리 21에는 돌연변이가 부재한다. 한 측면에서, 본원에 제공된 담배 식물은 LA 버어리 21과 비교하여 관심 유전자좌에서 보다 짧은 염색체 이입을 포함한다. 또 다른 측면에서, 본원에 제공된 담배 식물은 관심 유전자좌에서 완전한 유전자 또는 완전한 유전자 코딩 서열의 결실을 포함하지 않는다. 한 측면에서, 본원에 제공된 담배 식물은 관심 유전자좌에서 동형접합성이다. 또 다른 측면에서, 본원에 제공된 담배 식물은 관심 유전자좌에서 이형접합성이다. 한 측면에서, 본원에 제공된 담배 식물은 유전자 또는 관심 유전자좌에서 점 돌연변이, 결실, 삽입, 배가 및 반전으로 이루어진 군으로부터 선택된 돌연변이를 포함한다. 한 측면에서, 본원에 제공된 담배 식물에서 돌연변이는 무작위 돌연변이 유발 및 표적화된 돌연변이 유발로 이루어진 군으로부터 선택된 접근법에 의해 도입된다. 또 다른 측면에서, 본원에 제공된 담배 식물에서 돌연변이는 메가뉴클레아제, 아연 핑거 뉴클레아제, TALEN, 및 CRISPR로 이루어진 군으로부터 선택된 표적화된 돌연변이 유발 접근법에 의해 도입된다.
본원에 사용된 바와 같이, 돌연변이는 유전자에 의해 코딩된 생성물의 발현 또는 활성을 변경시키기 위해 유전자에 도입된 유전성 유전자 변형을 지칭한다. 이러한 변형은 유전자의 임의의 서열 영역에, 예를 들어 프로모터, 5' UTR, 엑손, 인트론, 3' UTR, 또는 종결인자 영역에 있을 수 있다. 한 측면에서, 돌연변이는 유전자 생성물의 발현 또는 활성을 감소시키거나, 억제하거나 또는 제거한다. 또 다른 측면에서, 돌연변이는 유전자 생성물의 발현 또는 활성을 증가시키거나, 상승시키거나, 강화시키거나 또는 증대시킨다. 한 측면에서, 돌연변이는 특정한 담배 품종 또는 재배종에 존재하는 천연 다형체가 아니다. 본원에 사용된 바와 같이, "돌연변이성 대립유전자"는 대립유전자가 돌연변이를 포함하는 유전자좌로부터의 대립유전자를 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같이, "돌연변이원성"은 최종 돌연변이체에 남는 트랜스진을 수반하지 않거나 또는 돌연변이-관련된 트랜스진을 갖지 않는 돌연변이를 생성하는 것을 지칭한다. 한 측면에서, 돌연변이원성은 시스제닉(cisgenic)이다. 또 다른 측면에서, 돌연변이원성은 유전자 또는 게놈 편집을 통한 것이다. 추가의 측면에서, 돌연변이원성은 무작위 돌연변이 유발, 예를 들어 화학적 (예를 들어, EMS) 또는 물리적 (r-방사선) 돌연변이 유발을 통한 것이다.
한 측면에서, 본원에 제공된 담배 식물은 서열식별번호: 23 내지 28로 이루어진 군으로부터 선택된 서열 및 그의 단편과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 동일성을 갖는 코딩 서열을 포함하는 1개 이상의 유전자 내에 1개 이상의 돌연변이를 포함한다. 한 측면에서, 1개 이상의 돌연변이는 서열식별번호: 23 내지 28로 이루어진 군으로부터 선택된 서열 및 그의 단편과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 동일성을 갖는 코딩 서열을 포함하는 1개 이상의 유전자의 발현 또는 활성을 감소시킨다.
한 측면에서, 본원에 제공된 담배 식물은 서열식별번호: 29 내지 34로 이루어진 군으로부터 선택된 서열 및 그의 단편과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 동일성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 1개 이상의 유전자 내에 1개 이상의 돌연변이를 포함한다. 한 측면에서, 1개 이상의 돌연변이는 서열식별번호: 29 내지 34로 이루어진 군으로부터 선택된 서열 및 그의 단편과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 동일성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 1개 이상의 유전자의 발현 또는 활성을 감소시킨다.
LA 버어리 21 (LA BU21로도 지칭됨)은 수회의 역교배를 통해 쿠바 시가 품종으로부터의 저-알칼로이드 유전자(들)을 버어리 21에 도입시킴으로써 생성된 낮은 총 알칼로이드 담배 계통이다 (Legg et al. 1970). 이는 그의 부모 버어리 21이 약 3.5% (건조 중량)인 것에 비해 대략 0.2% 총 알칼로이드 (건조 중량)를 갖는다. LA BU21은 상업적으로 허용가능한 표준보다 훨씬 낮은 잎 등급을 갖는다. LA BU21은 또한 보다 낮은 수율, 지연된 숙성 및 노화, 곤충 초식에 대한 보다 높은 민감성, 및 건조처리 이후 불량한 최종-생성물 품질을 특징으로 하는 다른 불리한 잎 표현형을 나타낸다 (Chaplin and Weeks, 1976; Legg et al. 1970; Chaplin and Burk 1983). LA BU21 잎은 보다 높은 폴리아민 함량, 보다 높은 엽록소 함량 및 잎 면적 단위당 더 많은 엽육 세포와 같은 형질을 추가로 나타낸다.
식물에서, 폴리아민은 발달성, 생리학적 및 대사 과정, 예컨대 세포 성장 및 분열, 스트레스 내성, 맥관 분화, 리그닌 중합, 병원체 방어, 노화 및 숙성에 관여하는 것으로 보고된다 (Fariduddin Q, Varshney P, Yusuf M, Ahmad A (2013) Polyamines: potent modulators of plant responses to stress. J. Plant Interac. 8: 1-16; Kusano T, Suzuki H (2015). Polyamines a universal molecular nexus for growth, survival and specialized metabolism. Tokyo: Springer.). 몇몇 연구는 폴리아민을 식물 세포 노화의 조절에 연관시켰다 (Sobieszczuk-Nowicka, E., Kubala, S., Zmienko, A., Malecka, A., Legocka, J. 2016. From accumulation to degradation: Reprograming polyamine metabolism facilitates dark-induced senescence in Barley leaf cells. Front. Plant Sci. doi: 10.3389/fpls.2015.01198). 과일 및 식물 조직에서, 폴리아민은 엽록체 광계 복합체의 붕괴 및 세포 벽/막 조성에서의 변화를 방지하는 노화-방지 및 숙성-방지 조절제로서 작용한다 (Lester GE (2000). Polyamines and their cellular anti-senescence properties in honey dew musk melon fruit. Plant Sci. 160: 105-112; Mattoo AK, Handa AK (2008). Higher polyamines restore and enhance metabolic memory in ripening fruit. Plant Sci. 174: 386-393; Serafini-Fracassini D, Di Sandro A, Del Duca S (2010). Spermine delays leaf senescence in Lactuca sativa and prevents the decay of chloroplast photosystems. Plant Physiol. Biochem. 48: 602-611). 폴리아민의 보다 높은 수준은 토마토 덩굴의 수명을 증가시키고 (Mehta RA, Cassol T, Li N, Ali N, Handa AK, Mattoo AK (2002). Engineered polyamine accumulation in tomato enhances phytonutrient content, juice quality and vine life. Nat. Biotechnol. 20: 613-618), 지연된 숙성 및 잎 노화는 효모 스페르미딘 신타제를 과발현하는 트랜스제닉 토마토 식물에서 관찰되었다 (Nambeesan S, Datsenka T, Ferruzzi MG, Malladi A, Mattoo AK, Handa AK (2010). Overexpression of yeast spermidine synthase impacts ripening, senescence and decay symptoms in tomato. Plant J. 63: 836-847). 폴리아민은 세포 벽을 안정화시킴으로써 또는 에틸렌, 아브시스산, 시토키닌 및 지베렐린과 같은 식물호르몬과의 누화를 통해 작용할 수 있다 (Kussano and Suzuki 2015).
대부분의 식물에서, 푸트레신은 오르니틴 데카르복실라제 (ODC)에 의해 오르니틴으로부터 또는 아르기닌 데카르복실라제 (ADC)에 의해 개시되는 3가지 효소 단계를 통해 아르기닌으로부터 직접적으로 합성될 수 있다 (Michael AJ, Furze JM, Rhodes MJ, Burtin D (1996). Molecular cloning and functional identification of a plant ornithine decarboxylase cDNA. Biochem. J. 314: 241-248; Piotrowski M, Janowitz T, Kneifel H (2003). Plant C-N hydrolases and the identification of a plant N-carbamoylputrescine amidohydrolase involved in polyamine biosynthesis J. Biol. Chem. 278: 1708-1712; Illingworth C, Mayer MJ, Elliot K, Hanfrey C, Walton NJ, Michael AJ (2003). The diverse bacterial origins of the Arabidopsis polyamine biosynthetic pathway FEBS Letters 549: 26-30). 이전의 연구는 푸트레신에 대한 ADC 경로가 담배의 알칼로이드 프로파일에 대해서는 단지 미미한 효과를 갖지만, ODC 경로가 니코틴 생합성에서 주요한 역할을 한다고 제시하였다 (Chintapakorn Y, Hamill JD (2007). Antisense-mediated reduction in ADC activity causes minor alterations in the alkaloid profile of cultured hairy root and regenerated transgenic plants of Nicotiana tabacum. Phytochem. 68: 2465-2479; DeBoer KD, Dalton HL, Edward FJ, Hamill JD (2011). RNAi-mediated down-regulation of ornithine decarboxylase (ODC) leads to reduced nicotine and increased anatabine levels in transgenic Nicotiana tabacum L. Phytochem. 72: 344-355; DeBoer KD, Dalton HL, Edward FJ, Ryan SM, Hamill JD (2013). RNAi-mediated down-regulation of ornithine decarboxylase (ODC) impedes wound-stress stimulation of anabasine synthesis in Nicotiana glauca. Phytochem. 86: 21-28; Dalton HL, Blomstedt CK, Neale AD, Gleadow R, DeBoer KD, Hamill JD (2016). Effects of down-regulating ornithine decarboxylase upon putrescine-associated metabolism and growth in Nicotiana tabacum L. J. Exp. Bot. 67: 3367-3381). 푸트레신은 각각 효소 스페르미딘 신타제 및 스페르민 신타제에 의해 촉매되는 반응에서 탈카르복실화된 S-아데노실메티오닌 (SAM)으로부터 유래된 아미노프로필 기의 연속 부가에 의해 스페르미딘으로 전환된 다음, 스페르민으로 전환된다. SAM은 또한 에틸렌의 생합성에 대한 기질이며 (Tiburcio AF, Altabella T, Bitrian M, Alcazar R (2014). The roles of polyamines during the lifespan of plants: from development to stress. Planta 240: 1-18), 이는 노화 및 과일 숙성을 조절한다 (Fluhr R, Mattoo AK (1996). Ethylene - biosynthesis and perception. Crit. Rev. Plant Sci. 15:479-523). 폴리아민 및 에틸렌 생합성 경로는 공통 전구체 SAM에 대해 경쟁하지만, 특히 식물 성장에서부터 숙성/노화로의 발달 전환 동안에 반대되는 발달 효과를 갖는다 (Nambeesan S, Handa AK, Mattoo AK (2008). Polyamines and regulation of ripening and senescence. In: Paliyath G, Murr DP, Handa AK, Lurie S (eds) Postharvest biology and technology of fruits, vegetables and flowers. Willey-Blackwell Publ, Ames. pp 319-340, Harpaz-Saad S, Yoon GM, Mattoo AK, Kieber JJ (2012). The formation of ACC and competition between polyamines and ethylene for SAM. Annu. Plant Reviews. 44: 53-81, Gupta A, Pal RK, Rajam MV (2013). Delayed ripening and improved fruit processing quality in tomato by RNAi-mediated silencing of three homologs of 1-aminopropane-1-carboxylate synthase gene. J. Plant Physiol. 170: 987-995). 토마토 (Saftner RA, Baldi BG (1990). Polyamine levels and tomato fruit development: possible interaction with ethylene. Plant Physiol. 92: 547-550; Morilla A, Garcia JM, Albi MA (1996). Free polyamine contents and decarboxylase activities during tomato development and ripening. J. Agri. Food Chem. 44: 2608-2611) 및 아보카도 (Kushad MM, Yelenosky G, Knight R (1988). Interrelationship of polyamine and ethylene biosynthesis during avocado fruit development and ripening. Plant Physiol. 87:463-467)에서 과일 숙성의 개시 동안에는 폴리아민 수준이 감소하고, 에틸렌 수준이 증가하며, 이는 폴리아민 생합성에 대한 에틸렌의 상호 길항 효과 및 그 반대의 경우를 반영한다 (Harpaz-Saad et al. 2012; Anwar R, Mattoo A, HandaA (2015). Polyamine interactions with plant hormones: crosstalk at several levels in Kusano T, Suzuki H (eds). Polyamines a Universal Molecular Nexus for Growth, Survival and Specialized Metabolism. Tokyo: Springer. pp 267-303). 그러나, 숙성-특이적 E8 프로모터의 조절하에 효모 S-아데노실메티오닌 데카르복실라제 (SAMDC)를 발현하는 트랜스제닉 토마토 식물은 과일 숙성 동안에 에틸렌 및 폴리아민의 보다 높은 수준을 동시에 제공하였고, 이는 이 시스템에서 SAM에 대한 임의의 경쟁의 부재를 나타낸다 (Mehta RA, Cassol T, Li N, Ali N, Handa AK, Mattoo AK (2002). Engineered polyamine accumulation in tomato enhances phytonutrient content, juice quality and vine life. Nat. Biotechnol. 20: 613-618).
임의의 과학적 이론에 구애되지 않고, LA 담배 식물에서 니코틴 생합성의 억제는 니코틴, 폴리아민 및 에틸렌 경로 사이의 누화에 영향을 미칠 수 있고, 푸트레신의 축적을 일으킬 수 있다. 이는 다시 에틸렌 생합성을 억제하면서 보다 높은 폴리아민 스페르미딘 및 스페르민에 대한 대사 플럭스를 증가시켜, 잎 숙성 및 노화에 대해 극적인 효과를 유발한다.
한 측면에서, 본 개시내용은 저-니코틴 또는 저-알칼로이드-부여 돌연변이 또는 트랜스진을 포함하고, 동일한 돌연변이 또는 트랜스진을 포함하지 않는 대조군 식물의 대등한 잎에 비해 대등한 수준의 1종 이상의 폴리아민을 포함하는 잎을 생성할 수 있는 담배 식물 또는 그의 일부분을 제공한다. 한 측면에서, 1종 이상의 폴리아민의 대등한 수준은 동일한 돌연변이 또는 트랜스진을 포함하지 않는 대조군 식물의 대등한 잎에서의 수준의 20%, 17.5%, 15%, 12.5%, 10%, 7.5%, 5%, 2.5% 또는 1% 이내이다. 한 측면에서, 1종 이상의 폴리아민의 대등한 수준은 동일한 돌연변이 또는 트랜스진을 포함하지 않는 대조군 식물의 대등한 잎에서의 수준의 0.5% 내지 1%, 1% 내지 2%, 2% 내지 3%, 3% 내지 4%, 4% 내지 5%, 5% 내지 6%, 6% 내지 7%, 7% 내지 8%, 8% 내지 9%, 9% 내지 10%, 11% 내지 12%, 12% 내지 13%, 13% 내지 14%, 14% 내지 15%, 15% 내지 16%, 16% 내지 17%, 17% 내지 18%, 18% 내지 19%, 또는 19% 내지 20%이다. 추가의 측면에서, 1종 이상의 폴리아민의 대등한 수준은 동일한 돌연변이 또는 트랜스진을 포함하지 않는 대조군 식물의 대등한 잎에서의 수준의 0.5% 내지 5%, 5% 내지 10%, 또는 10% 내지 20%이다.
한 측면에서, 본 개시내용은 저-니코틴 또는 저-알칼로이드-부여 돌연변이 또는 트랜스진을 포함하고, 동일한 돌연변이 또는 트랜스진을 포함하지 않는 대조군 식물의 대등한 잎에 비해 대등한 엽록소 수준을 포함하는 잎을 생성할 수 있는 담배 식물 또는 그의 일부분을 제공한다. 한 측면에서, 대등한 엽록소 수준은 동일한 돌연변이 또는 트랜스진을 포함하지 않는 대조군 식물의 대등한 잎에서의 수준의 20%, 17.5%, 15%, 12.5%, 10%, 7.5%, 5%, 2.5% 또는 1% 이내이다. 한 측면에서, 대등한 엽록소 수준은 동일한 돌연변이 또는 트랜스진을 포함하지 않는 대조군 식물의 대등한 잎에서의 수준의 0.5% 내지 1%, 1% 내지 2%, 2% 내지 3%, 3% 내지 4%, 4% 내지 5%, 5% 내지 6%, 6% 내지 7%, 7% 내지 8%, 8% 내지 9%, 9% 내지 10%, 11% 내지 12%, 12% 내지 13%, 13% 내지 14%, 14% 내지 15%, 15% 내지 16%, 16% 내지 17%, 17% 내지 18%, 18% 내지 19%, 또는 19% 내지 20%이다. 추가의 측면에서, 대등한 엽록소 수준은 동일한 돌연변이 또는 트랜스진을 포함하지 않는 대조군 식물의 대등한 잎에서의 수준의 0.5% 내지 5%, 5% 내지 10%, 또는 10% 내지 20%이다.
한 측면에서, 본 개시내용은 저-니코틴 또는 저-알칼로이드-부여 돌연변이 또는 트랜스진을 포함하고, 동일한 돌연변이 또는 트랜스진을 포함하지 않는 대조군 식물의 대등한 잎에 비해 잎 면적 단위당 엽육 세포의 대등한 개수를 포함하는 잎을 생성할 수 있는 담배 식물 또는 그의 일부분을 제공한다. 한 측면에서, 잎 면적 단위당 엽육 세포의 대등한 개수는 동일한 돌연변이 또는 트랜스진을 포함하지 않는 대조군 식물의 대등한 잎에서의 수준의 20%, 17.5%, 15%, 12.5%, 10%, 7.5%, 5%, 2.5% 또는 1% 이내이다. 한 측면에서, 잎 면적 단위당 엽육 세포의 대등한 개수는 동일한 돌연변이 또는 트랜스진을 포함하지 않는 대조군 식물의 대등한 잎에서의 수준의 0.5% 내지 1%, 1% 내지 2%, 2% 내지 3%, 3% 내지 4%, 4% 내지 5%, 5% 내지 6%, 6% 내지 7%, 7% 내지 8%, 8% 내지 9%, 9% 내지 10%, 11% 내지 12%, 12% 내지 13%, 13% 내지 14%, 14% 내지 15%, 15% 내지 16%, 16% 내지 17%, 17% 내지 18%, 18% 내지 19%, 또는 19% 내지 20%이다. 추가의 측면에서, 잎 면적 단위당 엽육 세포의 대등한 개수는 동일한 돌연변이 또는 트랜스진을 포함하지 않는 대조군 식물의 대등한 잎에서의 수준의 0.5% 내지 5%, 5% 내지 10%, 또는 10% 내지 20%이다.
한 측면에서, 본 개시내용은 저-니코틴 또는 저-알칼로이드-부여 돌연변이 또는 트랜스진을 포함하고, 동일한 돌연변이 또는 트랜스진을 포함하지 않는 대조군 식물의 대등한 잎에 비해 대등한 표피 세포 크기를 포함하는 잎을 생성할 수 있는 담배 식물 또는 그의 일부분을 제공한다. 한 측면에서, 대등한 표피 세포 크기는 동일한 돌연변이 또는 트랜스진을 포함하지 않는 대조군 식물의 대등한 잎에서의 수준의 20%, 17.5%, 15%, 12.5%, 10%, 7.5%, 5%, 2.5% 또는 1% 이내이다. 한 측면에서, 대등한 표피 세포 크기는 동일한 돌연변이 또는 트랜스진을 포함하지 않는 대조군 식물의 대등한 잎에서의 수준의 0.5% 내지 1%, 1% 내지 2%, 2% 내지 3%, 3% 내지 4%, 4% 내지 5%, 5% 내지 6%, 6% 내지 7%, 7% 내지 8%, 8% 내지 9%, 9% 내지 10%, 11% 내지 12%, 12% 내지 13%, 13% 내지 14%, 14% 내지 15%, 15% 내지 16%, 16% 내지 17%, 17% 내지 18%, 18% 내지 19%, 또는 19% 내지 20%이다. 추가의 측면에서, 대등한 표피 세포 크기는 동일한 돌연변이 또는 트랜스진을 포함하지 않는 대조군 식물의 대등한 잎에서의 수준의 0.5% 내지 5%, 5% 내지 10%, 또는 10% 내지 20%이다.
한 측면에서, 본 개시내용은 저-니코틴 또는 저-알칼로이드-부여 돌연변이 또는 트랜스진을 포함하고, 동일한 돌연변이 또는 트랜스진을 포함하지 않는 대조군 식물의 대등한 잎에 비해 대등한 잎 수율을 포함하는 잎을 생성할 수 있는 담배 식물 또는 그의 일부분을 제공한다. 한 측면에서, 대등한 잎 수율은 동일한 돌연변이 또는 트랜스진을 포함하지 않는 대조군 식물의 대등한 잎에서의 수준의 20%, 17.5%, 15%, 12.5%, 10%, 7.5%, 5%, 2.5% 또는 1% 이내이다. 한 측면에서, 대등한 잎 수율은 동일한 돌연변이 또는 트랜스진을 포함하지 않는 대조군 식물의 대등한 잎에서의 수준의 0.5% 내지 1%, 1% 내지 2%, 2% 내지 3%, 3% 내지 4%, 4% 내지 5%, 5% 내지 6%, 6% 내지 7%, 7% 내지 8%, 8% 내지 9%, 9% 내지 10%, 11% 내지 12%, 12% 내지 13%, 13% 내지 14%, 14% 내지 15%, 15% 내지 16%, 16% 내지 17%, 17% 내지 18%, 18% 내지 19%, 또는 19% 내지 20%이다. 추가의 측면에서, 대등한 잎 수율은 동일한 돌연변이 또는 트랜스진을 포함하지 않는 대조군 식물의 대등한 잎에서의 수준의 0.5% 내지 5%, 5% 내지 10%, 또는 10% 내지 20%이다.
한 측면에서, 본 개시내용은 저-니코틴 또는 저-알칼로이드-부여 돌연변이 또는 트랜스진을 포함하고, 동일한 돌연변이 또는 트랜스진을 포함하지 않는 대조군 식물의 대등한 잎에 비해 대등한 곤충 초식 민감성을 나타내는 담배 식물 또는 그의 일부분을 제공한다. 한 측면에서, 대등한 곤충 초식 민감성은 동일한 돌연변이 또는 트랜스진을 포함하지 않는 대조군 식물의 대등한 잎에서의 수준의 20%, 17.5%, 15%, 12.5%, 10%, 7.5%, 5%, 2.5% 또는 1% 이내이다. 한 측면에서, 대등한 곤충 초식 민감성은 동일한 돌연변이 또는 트랜스진을 포함하지 않는 대조군 식물의 대등한 잎에서의 수준의 0.5% 내지 1%, 1% 내지 2%, 2% 내지 3%, 3% 내지 4%, 4% 내지 5%, 5% 내지 6%, 6% 내지 7%, 7% 내지 8%, 8% 내지 9%, 9% 내지 10%, 11% 내지 12%, 12% 내지 13%, 13% 내지 14%, 14% 내지 15%, 15% 내지 16%, 16% 내지 17%, 17% 내지 18%, 18% 내지 19%, 또는 19% 내지 20%이다. 추가의 측면에서, 대등한 곤충 초식 민감성은 동일한 돌연변이 또는 트랜스진을 포함하지 않는 대조군 식물의 대등한 잎에서의 수준의 0.5% 내지 5%, 5% 내지 10%, 또는 10% 내지 20%이다.
곤충 초식 민감성 수준은 관련 기술분야에서 공지된 방법에 의해, 예를 들어 곤충 섭식 검정으로 검정될 수 있다. 간략히, 물 중 0.7% 한천의 1/4 인치 층을 100mm 페트리 접시에 첨가하고, 응고시킨다. 잎 디스크를 페트리 접시 뚜껑으로부터 절단하고, 플레이트에 놓고, 한천에 부드럽게 밀어 넣는다. 잎 디스크는 4-5 잎 단계의 식물로부터 취한다. 주요 주맥을 배제시키기 위해 디스크를 옆편으로부터만 취한다. 단일 디스크를 식물의 가장 큰 4개의 잎 각각으로부터 취하여, 식물당 4개의 복제물을 생성한다. 총 16개의 생물학적 복제물 시험 라인을 위해 4개의 식물을 샘플링한다. 두번째 누에 나이의 단일 버드웜을 잎에 첨가하고, 주위 온도에서 48 시간 동안 섭식시킨다. 48 시간 후에, 버드웜 유충의 무게를 재고, 최종 유충의 무게를 기록한다.
달리 명시되지 않는다면, 담배 식물, 품종, 재배종 또는 계통에 대해 본원에서 언급된 알칼로이드, 폴리아민 또는 니코틴 수준 (또는 또 다른 잎 화학 또는 성질 특징분석) 또는 잎 등급 지수 값의 측정치는 예컨대 평균 측정치, 예를 들어 문맥에 따라, 단일 식물의 다중 잎의 평균, 또는 단일 품종, 재배종 또는 계통의 담배 식물 집단으로부터의 평균 측정치를 지칭할 수 있다. 한 측면에서, 담배 식물의 니코틴, 알칼로이드 또는 폴리아민 수준 (또는 또 다른 잎 화학 또는 성질 특징분석)은 토핑 후에 잎 번호 3, 4 및 5로부터 수집한 풀링된 잎 샘플에서 토핑 후에 측정된다. 또 다른 측면에서, 담배 식물의 니코틴, 알칼로이드 또는 폴리아민 수준 (또는 또 다른 잎 화학 또는 성질 특징분석)은 가장 높은 수준의 니코틴, 알칼로이드 또는 폴리아민 (또는 또 다른 잎 화학 또는 성질 특징분석)을 갖는 잎에서 토핑 후에 측정된다. 한 측면에서, 담배 식물의 니코틴, 알칼로이드 또는 폴리아민 수준은 잎 번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30에서 토핑 후에 측정된다. 또 다른 측면에서, 담배 식물의 니코틴, 알칼로이드 또는 폴리아민 수준 (또는 또 다른 잎 화학 또는 성질 특징분석)은 잎 번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 및 30으로 이루어진 군으로부터 선택된 연속적인 잎 번호를 갖는 2개 이상의 잎의 풀에서 토핑 후에 측정된다. 또 다른 측면에서, 담배 식물의 니코틴, 알칼로이드 또는 폴리아민 수준 (또는 또 다른 잎 화학 또는 성질 특징분석)은 1 내지 5, 6 내지 10, 11 내지 15, 16 내지 20, 21 내지 25, 및 26 내지 30으로 이루어진 군으로부터 선택된 잎 번호를 갖는 잎에서 토핑 후에 측정된다. 또 다른 측면에서, 담배 식물의 니코틴, 알칼로이드 또는 폴리아민 수준 (또는 또 다른 잎 화학 또는 성질 특징분석)은 1 내지 5, 6 내지 10, 11 내지 15, 16 내지 20, 21 내지 25, 및 26 내지 30으로 이루어진 군으로부터 선택된 잎 번호를 갖는 2개 이상의 잎의 풀에서 토핑 후에 측정된다. 또 다른 측면에서, 담배 식물의 니코틴, 알칼로이드 또는 폴리아민 수준 (또는 또 다른 잎 화학 또는 성질 특징분석)은 1 내지 5, 6 내지 10, 11 내지 15, 16 내지 20, 21 내지 25, 및 26 내지 30으로 이루어진 군으로부터 선택된 잎 번호를 갖는 3개 이상의 잎의 풀에서 토핑 후에 측정된다.
알칼로이드 수준은 관련 기술분야에 공지된 방법에 의해, 예를 들어 기체-액체 크로마토그래피, 고성능 액체 크로마토그래피, 방사선-면역검정, 및 효소-결합 면역흡착 검정을 기반으로 하는 정량화에 의해 검정될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 잎 넘버링은 담배대 상의 잎 위치를 기반으로 하며, 잎 번호 1은 토핑 후에 가장 늙은 잎 (바닥쪽)이고, 가장 높은 잎 번호는 가장 어린 잎 (맨끝쪽)에 배정된다.
평균 측정치 (예를 들어, 알칼로이드 또는 니코틴 수준 또는 잎 등급)를 결정하기 위한 담배 식물의 집단 또는 담배 잎의 수집은 임의의 크기, 예를 들어 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40 또는 50개일 수 있다. 평균 측정치 또는 등급 지수 값을 결정하기 위해 산업상 허용되는 표준 프로토콜을 따른다.
본원에 사용된 바와 같이, "토핑"은 담배 식물이 거의 식물 성숙이고 대략 번식 성장의 시작일 때 SAM, 꽃, 및 몇개 이하의 인접한 잎을 비롯하여 줄기 꼭대기를 제거하는 것을 지칭한다. 전형적으로, 담배 식물은 싹 단계 (꽃이 나타나기 시작한 직후)에 토핑한다. 예를 들어, 온실 또는 들판-재배 담배 식물은 식물의 50%가 적어도 1개의 열린 꽃을 가질 때 토핑할 수 있다. 담배 식물의 토핑은 정단 우위를 상실시키고, 또한 증가된 알칼로이드 생성을 유도한다.
전형적으로, 담배 식물의 니코틴, 알칼로이드 또는 폴리아민 수준 (또는 또 다른 잎 화학 또는 성질 특징분석)은 토핑후 약 2 주째에 측정된다. 다른 시점 또한 이용될 수 있다. 한 측면에서, 담배 식물의 니코틴, 알칼로이드 또는 폴리아민 수준 (또는 또 다른 잎 화학 또는 성질 특징분석)은 토핑후 약 1, 2, 3, 4 또는 5 주째에 측정된다. 또 다른 측면에서, 담배 식물의 니코틴, 알칼로이드 또는 폴리아민 수준 (또는 또 다른 잎 화학 또는 성질 특징분석)은 토핑후 약 3, 5, 7, 10, 12, 14, 17, 19 또는 21 일째에 측정된다.
본원에 사용된 바와 같이, "유사한 재배 조건"은 2가지 이상의 식물 유전자형의 성장 및 이들 사이의 의미있는 비교를 위한 유사한 환경 조건 및/또는 농업 관행을 지칭하며, 따라서 환경 조건 및 농업 관행은 2가지 이상의 식물 유전자형 사이에서 관찰된 임의의 차이에 기여하지도 않고 이를 설명하지도 않는다. 환경 조건에는 예를 들어 빛, 온도, 물 (습도) 및 영양분 (예를 들어, 질소 및 인)이 포함된다. 농업 관행에는 예를 들어 씨 뿌리기, 클립핑, 언더커팅, 옮겨 심기, 토핑, 및 곁순 따기가 포함된다. [Chapters 4B and 4C of Tobacco, Production, Chemistry and Technology, Davis & Nielsen, eds., Blackwell Publishing, Oxford (1999), pp 70-103]을 참고한다.
본원에 사용된 바와 같이, "대등한 잎"은 유사한 크기, 형태, 나이 및/또는 줄기 위치를 갖는 잎을 지칭한다.
한 측면에서, 본 개시내용은 오르니틴 데카르복실라제 (ODC) 유전자의 억제를 위해 비코딩 RNA를 코딩하는 전사가능한 DNA 서열에 작동가능하게 연결된 유도성 프로모터를 포함하는 담배 식물 또는 그의 일부분을 제공한다. 한 측면에서, 유도성 프로모터는 토핑-유도성 프로모터이다. 한 측면에서, 유도성 프로모터는 또한 조직-특이적인 또는 조직-선호적인 프로모터이다. 한 측면에서, 조직-특이적인 또는 조직-선호적인 프로모터는 새싹, 뿌리, 잎, 줄기, 꽃, 흡지, 근단, 엽육 세포, 표피 세포, 및 맥관구조로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 조직 또는 기관에 대해 특이적이거나 또는 선호적이다. 추가의 측면에서, 토핑 유도성 프로모터는 담배 니코틴 데메틸라제 유전자, 예를 들어 CYP82E4, CYP82E5 또는 CYP82E10으로부터의 프로모터 서열을 포함한다.
프로모터에 작동가능하게 연결된 코딩 서열 또는 유전자 (예컨대 트랜스진)의 발현 패턴과 관련하여 다양한 기준에 따라 분류되는, 예컨대 구성적, 발달성, 조직-특이적인, 조직-선호적인, 유도성 등의 다양한 유형의 프로모터가 본원에서 사용될 수 있다. 식물에서 모든 또는 대부분의 조직에서 전사를 개시하는 프로모터는 "구성적" 프로모터로 지칭된다. 특정한 발달 기간 또는 단계 동안에 전사를 개시하는 프로모터는 "발달성" 프로모터로 지칭된다. 다른 식물 조직에 비해 식물의 특정 조적에서 발현이 증강되는 프로모터는 "조직-증강된" 또는 "조직-선호적인" 프로모터로 지칭된다. 따라서, "조직-선호적인" 프로모터는 식물의 특정한 조직(들)에서 비교적 높은 또는 우세한 발현을 유발하지만, 식물의 다른 조직(들)에서는 보다 낮은 수준의 발현을 유발한다. 식물의 특정한 조직(들) 내에서 발현하고 다른 식물 조직에서는 거의 또는 전혀 발현하지 않는 프로모터는 "조직-특이적인" 프로모터로 지칭된다. 식물의 특정한 세포 유형에서 발현하는 프로모터는 "세포 유형 특이적인" 프로모터로 지칭된다. "유도성" 프로모터는 환경적 자극, 예컨대 추위, 가뭄, 열 또는 빛, 또는 다른 자극, 예컨대 상처 또는 화학적 적용에 대한 반응으로 전사를 개시하는 프로모터이다. 프로모터는 또한 이종성, 상동성, 키메라, 합성 등과 같이 그의 기원의 관점에서 분류될 수 있다. "이종성" 프로모터는 그의 회합된 전사가능한 서열, 코딩 서열, 또는 유전자 (또는 트랜스진)와 관련하여 상이한 기원을 갖고/거나, 형질전환될 식물 종에서 천연 발생하지 않는 프로모터 서열이다. 용어 "이종성"은 더욱 광범위하게는 2종 이상의 DNA 분자 또는 서열의 조합이 천연에서 정상적으로 발견되지 않을 때 이러한 조합을 포함한다. 예를 들어, 2종 이상의 DNA 분자 또는 서열이 상이한 게놈에서 또는 동일한 게놈의 상이한 유전자좌에서 정상적으로 발견되는 경우, 또는 천연에서 동일하게 조합되지 않는 경우, 이들은 서로에 대해 이종성이다.
한 측면에서, 유도성 프로모터는 뿌리 특이적인 또는 선호적인 발현을 제공한다. 한 측면에서, 뿌리 특이적인 또는 선호적인 유도성 프로모터는 서열식별번호: 1-11로 이루어진 군으로부터 선택된 서열 및 그의 기능적 단편을 포함한다. 표 1은 서열식별번호: 1-11에 의해 유도된 추정된 잎 대 뿌리 특이적 발현 수준의 비교를 제공한다.
한 측면에서, 유도성 프로모터는 잎 특이적인 또는 선호적인 발현을 제공한다. 한 측면에서, 잎 특이적인 또는 선호적인 유도성 프로모터는 서열식별번호: 12-21로 이루어진 군으로부터 선택된 서열 및 그의 기능적 단편을 포함한다. 표 2는 서열식별번호: 12-21에 의해 제공된 추정된 잎 대 뿌리 특이적 발현 수준의 비교를 제공한다.
표 1: 토핑-반응성 뿌리 특이적인 또는 선호적인 발현에 대한 예시적인 유도성 프로모터
Figure pct00001
표 2: 토핑-반응성 잎 특이적인 또는 선호적인 발현에 대한 예시적인 유도성 프로모터
Figure pct00002
한 측면에서, 유도성 프로모터는 작동가능하게 연결된 전사가능한 DNA 서열에 대해 이종성이다. 한 측면에서, 전사가능한 DNA 서열은 마이크로RNA (miRNA), 안티-센스 RNA, 소형 간섭 RNA (siRNA), 트랜스-작용 siRNA (ta-siRNA), 및 헤어핀 RNA (hpRNA)로 이루어진 군으로부터 선택된 비코딩 RNA를 코딩한다. 한 측면에서, 비코딩 RNA는 서열식별번호: 35 및 36으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열 및 그의 임의의 부분과 적어도 99.9%, 적어도 99.5%, 적어도 99%, 적어도 98%, 적어도 97%, 적어도 96%, 적어도 95%, 적어도 94%, 적어도 93%, 적어도 92%, 적어도 91%, 적어도 90%, 적어도 85%, 적어도 80%, 또는 적어도 75% 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 한 측면에서, 비코딩 RNA는 서열식별번호: 22와 적어도 99%, 적어도 97%, 적어도 95%, 적어도 90%, 적어도 85%, 적어도 80%, 또는 적어도 75% 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 ODC RNAi 구축물로 제공된다.
"알칼로이드"는 식물에서 천연 발생하는 복잡한 질소-함유 화합물이며, 인간 및 동물에서 약리학적 효과를 갖는다. "니코틴"은 상용화된 궐련 담배에서 주요 천연 알칼로이드이고, 니코티아나 타바쿰에서 알칼로이드 함량의 약 90%를 차지한다. 담배에서 다른 주요 알칼로이드에는 코티닌, 노르니코틴, 미오스민, 니코티린, 아나바신 및 아나타빈이 포함된다. 미량의 담배 알칼로이드에는 니코틴-n-옥시드, N-메틸 아나타빈, N-메틸 아나바신, 슈도옥시니코틴, 2,3 디피리딜 등이 포함된다.
한 측면에서, 본원에 제공된 담배 식물은 유사한 재배 조건에서 재배할 때 nic1 돌연변이 및/또는 nic2 돌연변이가 없는 대조군 담배 식물과 비교하여 총 알칼로이드 또는 개별 알칼로이드의 보다 낮은 수준을 포함한다. 또 다른 측면에서, 본원에 제공된 담배 식물은 유사한 재배 조건에서 재배할 때 대조군 담배 식물과 비교하여 코티닌, 노르니코틴, 미오스민, 니코티린, 아나바신 및 아나타빈으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 알칼로이드의 보다 낮은 수준을 포함한다. 한 측면에서, 보다 낮은 알칼로이드 또는 니코틴 수준은 대조군 담배 식물의 알칼로이드 또는 니코틴 수준의 1% 미만, 2% 미만, 5% 미만, 8% 미만, 10% 미만, 12% 미만, 15% 미만, 20% 미만, 25% 미만, 30% 미만, 40% 미만, 50% 미만, 60% 미만, 70% 미만, 또는 80% 미만의 알칼로이드 또는 니코틴 수준을 지칭한다. 또 다른 측면에서, 보다 낮은 알칼로이드 또는 니코틴 수준은 대조군 담배 식물의 알칼로이드 또는 니코틴 수준의 약 0.5% 내지 1%, 1% 내지 2%, 2% 내지 3%, 3% 내지 4%, 4% 내지 5%, 5% 내지 6%, 6% 내지 7%, 7% 내지 8%, 8% 내지 9%, 9% 내지 10%, 11% 내지 12%, 12% 내지 13%, 13% 내지 14%, 14% 내지 15%, 15% 내지 16%, 16% 내지 17%, 17% 내지 18%, 18% 내지 19%, 19% 내지 20%, 21% 내지 22%, 22% 내지 23%, 23% 내지 24%, 24% 내지 25%, 25% 내지 26%, 26% 내지 27%, 27% 내지 28%, 28% 내지 29%, 또는 29% 내지 30%의 알칼로이드 또는 니코틴 수준을 지칭한다. 추가의 측면에서, 보다 낮은 알칼로이드 또는 니코틴 수준은 대조군 담배 식물의 알칼로이드 또는 니코틴 수준의 약 0.5% 내지 5%, 5% 내지 10%, 10% 내지 20%, 20% 내지 30%의 알칼로이드 또는 니코틴 수준을 지칭한다.
알칼로이드 수준은 관련 기술분야에 공지된 방법, 예를 들어 기체-액체 크로마토그래피, 고성능 액체 크로마토그래피, 방사선-면역검정, 및 효소-결합 면역흡착 검정을 기반으로 하는 정량화에 의해 검정될 수 있다. 예를 들어, 니코틴성 알칼로이드 수준은 CORESTA 권장 방법 번호 7, 1987 및 ISO 표준 (ISO TC 126N 394 E)을 기반으로 하는 GC-FID 방법에 의해 측정될 수 있다. 모세관 컬럼 및 FID 검출기를 구비한 기체-액체 크로마토그래피를 이용하는 방법에 대해서는 [Hibi et al.,　Plant Physiology 100: 826-35 (1992)] 또한 참고한다. 달리 명시되지 않는다면, 본원에 기재된 모든 알칼로이드 수준은 [CORESTA Method No 62, Determination of Nicotine in Tobacco and Tobacco Products by Gas Chromatographic Analysis, February 2005]에 따른 방법, 및 [Centers for Disease Control and Prevention's Protocol for Analysis of Nicotine, Total Moisture and pH in Smokeless Tobacco Products, as published in the Federal Register Vol. 64, No. 55 March 23, 1999 (and as amended in Vol. 74, No. 4, January 7, 2009]에 정의된 방법을 이용하여 측정된다.
대안적으로, 담배 총 알칼로이드는 스칼라 인스트루먼트 코 (Skalar Instrument Co, 펜실베니아주 웨스트 체스터)에 의해 개조되고, [Collins et al., Tobacco Science 13:79-81 (1969)]에 의해 기재된 바와 같이 담배 샘플의 분석을 위해 개발된 분절-흐름 비색 방법을 이용하여 측정될 수 있다. 간략히, 총 알칼로이드 및 환원당을 분석하기 전에 담배 샘플을 건조시키고, 분쇄하고, 추출한다. 이어서, 상기 방법은 탈색을 위해 아세트산/메탄올/물 추출 및 목탄을 사용한다. 총 알칼로이드의 결정은 460 nm에서 측정되는 착색된 복합체를 형성하도록 방향족 아민의 존재하에 염화시아노겐과 니코틴 알칼로이드의 반응을 기반으로 하였다. 달리 명시되지 않는다면, 본원에 도시된 총 알칼로이드 수준 또는 니코틴 수준은 건조 중량 기준이다 (예를 들어, % 총 알칼로이드 또는 % 니코틴).
한 측면에서, 본원에 제공된 담배 식물은 유사한 재배 조건에서 재배할 때 nic1 돌연변이 및/또는 nic2 돌연변이가 없는 대조군 담배 식물과 비교하여 보다 낮은 수준의 니코틴을 포함한다. 한 측면에서, 보다 낮은 니코틴 수준은 대조군 담배 식물의 평균 니코틴 수준의 1% 미만, 2% 미만, 5% 미만, 8% 미만, 10% 미만, 12% 미만, 15% 미만, 20% 미만, 25% 미만, 30% 미만, 40% 미만, 50% 미만, 60% 미만, 70% 미만, 또는 80% 미만인 평균 니코틴 수준을 지칭한다. 또 다른 측면에서, 보다 낮은 니코틴 수준은 대조군 담배 식물의 평균 니코틴 수준의 약 0.5% 내지 1%, 1% 내지 2%, 2% 내지 3%, 3% 내지 4%, 4% 내지 5%, 5% 내지 6%, 6% 내지 7%, 7% 내지 8%, 8% 내지 9%, 9% 내지 10%, 11% 내지 12%, 12% 내지 13%, 13% 내지 14%, 14% 내지 15%, 15% 내지 16%, 16% 내지 17%, 17% 내지 18%, 18% 내지 19%, 19% 내지 20%, 21% 내지 22%, 22% 내지 23%, 23% 내지 24%, 24% 내지 25%, 25% 내지 26%, 26% 내지 27%, 27% 내지 28%, 28% 내지 29%, 또는 29% 내지 30%인 평균 니코틴 수준을 지칭한다. 추가의 측면에서, 보다 낮은 니코틴 수준은 대조군 담배 식물의 평균 니코틴 수준의 약 0.5% 내지 5%, 5% 내지 10%, 10% 내지 20%, 20% 내지 30%인 평균 니코틴 수준을 지칭한다.
한 측면에서, 본원에 제공된 담배 식물은 건조 중량 기준으로 약 0.01%, 0.02%, 0.05%, 0.75%, 0.1%, 0.15%, 0.2%, 0.3%, 0.35%, 0.4%, 0.5%, 0.6%, 0.7%, 0.8%, 0.9%, 1%, 1.1%, 1.2%, 1.3%, 1.4%, 1.5%, 1.6%, 1.7%, 1.8%, 1.9%, 2%, 2.1%, 2.2%, 2.3%, 2.4%, 2.5%, 2.6%, 2.7%, 2.8%, 2.9%, 3%, 3.1%, 3.2%, 3.3%, 3.4%, 3.5%, 3.6%, 3.7%, 3.8%, 3.9%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8% 및 9%로 이루어진 군으로부터 선택된 평균 니코틴 또는 총 알칼로이드 수준을 포함한다. 또 다른 측면에서, 본원에 제공된 담배 식물은 건조 중량 기준으로 약 0.01% 내지 0.02%, 0.02% 내지 0.05%, 0.05% 내지 0.75%, 0.75% 내지 0.1%, 0.1% 내지 0.15%, 0.15% 내지 0.2%, 0.2% 내지 0.3%, 0.3% 내지 0.35%, 0.35% 내지 0.4%, 0.4% 내지 0.5%, 0.5% 내지 0.6%, 0.6% 내지 0.7%, 0.7% 내지 0.8%, 0.8% 내지 0.9%, 0.9% 내지 1%, 1% 내지 1.1%, 1.1% 내지 1.2%, 1.2% 내지 1.3%, 1.3% 내지 1.4%, 1.4% 내지 1.5%, 1.5% 내지 1.6%, 1.6% 내지 1.7%, 1.7% 내지 1.8%, 1.8% 내지 1.9%, 1.9% 내지 2%, 2% 내지 2.1%, 2.1% 내지 2.2%, 2.2% 내지 2.3%, 2.3% 내지 2.4%, 2.4% 내지 2.5%, 2.5% 내지 2.6%, 2.6% 내지 2.7%, 2.7% 내지 2.8%, 2.8% 내지 2.9%, 2.9% 내지 3%, 3% 내지 3.1%, 3.1% 내지 3.2%, 3.2% 내지 3.3%, 3.3% 내지 3.4%, 3.4% 내지 3.5%, 및 3.5% 내지 3.6%로 이루어진 군으로부터 선택된 평균 니코틴 또는 총 알칼로이드 수준을 포함한다. 추가의 측면에서, 본원에 제공된 담배 식물은 건조 중량 기준으로 약 0.01% 내지 0.1%, 0.02% 내지 0.2%, 0.03% 내지 0.3%, 0.04% 내지 0.4%, 0.05% 내지 0.5%, 0.75% 내지 1%, 0.1% 내지 1.5%, 0.15% 내지 2%, 0.2% 내지 3%, 및 0.3% 내지 3.5%로 이루어진 군으로부터 선택된 평균 니코틴 또는 총 알칼로이드 수준을 포함한다.
본 개시내용은 또한 다른 담배 형질, 예를 들어 잎 등급 지수 값에 대해 부정적인 영향이 없이 변경된 니코틴 수준을 갖는 담배 식물을 제공한다. 한 측면에서, 저-니코틴 또는 니코틴-무함유 담배 품종은 상업적으로 허용가능한 등급의 건조처리된 담배를 제공한다. 담배 등급은 잎 줄기 위치, 잎 크기, 잎 색상, 잎 균일성 및 완전성, 숙성도, 질감, 탄력성, 광택 (잎의 착색 강도 및 깊이 뿐만 아니라 윤기와 관련하여), 흡습성 (담배 잎이 주위 수분을 흡수하고 보유하는 능력), 및 녹색의 미묘한 차이 또는 색조를 비롯하여 이로 제한되지 않는 인자를 기반으로 하여 평가된다. 잎 등급은 예를 들어 미국 농무부의 농업 마케팅 서비스(Agricultural Marketing Service of the US Department of Agriculture)에 의해 발행된 공식 표준 등급 (7 U.S.C. §511)을 이용하여 결정된다. 예를 들어, 버어리 담배에 대한 공식 표준 등급 (미국 유형 31 및 외국 유형 93) (1990년 11월 5일 발효됨) (55 F.R. 40645); 열-건조처리된 담배에 대한 공식 표준 등급 (미국 유형 11, 12, 13, 14 및 외국 유형 92) (1989년 3월 27일에 발효됨) (54 F.R. 7925); 펜실베니아 떡잎 담배에 대한 공식 표준 등급 (미국 유형 41) (1965년 1월 8일에 발효됨) (29 F.R. 16854); 오하이오 시가-잎 담배에 대한 공식 표준 등급 (미국 유형 42, 43, 및 44) (1963년 12월 8일에 발효됨) (28 F.R. 11719 및 28 F.R. 11926); 위스콘신 시가-바인더 담배에 대한 공식 표준 등급 (미국 유형 54 및 55) (1969년 11월 20일에 발효됨) (34 F.R. 17061); 위스콘신 시가-바인더 담배에 대한 공식 표준 등급 (미국 유형 54 및 55) (1969년 11월 20일에 발효됨) (34 F.R. 17061); 조지아 및 플로리다 응달-재배 시가-래퍼 담배에 대한 공식 표준 등급 (미국 유형 62), (1971년 4월에 발효됨)을 참고한다. USDA 등급 지수 값은 산업상 허용되는 등급 지수에 따라 결정될 수 있다. 예를 들어, [Bowman et al., Tobacco Science, 32:39-40(1988); Legacy Tobacco Document Library (Bates Document #523267826-523267833, July 1, 1988, Memorandum on the Proposed Burley Tobacco Grade Index); 및 Miller et al., 1990, Tobacco Intern., 192:55-57]을 참고한다 (상기 모든 참고문헌은 그들의 전문이 참고로 포함됨). 한 측면에서, USDA 등급 지수는 제공된 연방 등급의 0-100 수치 표현이고, 모든 줄기 위치의 가중 평균이다. 등급 지수가 높을 수록 더 높은 품질을 나타낸다. 대안적으로, 잎 등급은 하이퍼-스펙트럼 영상화를 통해 결정될 수 있다. 예를 들어, WO 2011/027315 (2011년 3월 10일 공개, 그의 전문이 참고로 포함됨)를 참고한다. 대등한 잎 등급 지수는 유사한 줄기 위치로부터의 잎과 비교할 때 적절한 대조군 또는 비교자보다 30% 넘게 높거나 낮게 달라지지 않는 잎 등급 지수를 나타낸다. 한 측면에서, 대등한 잎 등급 지수는 유사한 줄기 위치로부터의 잎과 비교할 때 적절한 대조군 또는 비교자보다 25%, 20%, 15%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% 또는 1% 넘게 높거나 낮게 달라지지 않는다.
한 측면에서, 본원에 제공된 담배 식물은 유사한 재배 조건에서 재배할 때 대조군 담배 식물과 비교하여 3-메틸발레르산, 발레르산, 이소발레르산, 랩데노이드, 셈브레노이드, 당 에스테르, 및 환원당으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 담배 향 화합물의 유사한 수준을 포함한다. 또 다른 측면에서, 본원에 제공된 담배 식물은 3-메틸발레르산, 발레르산, 이소발레르산, 랩데노이드, 셈브레노이드, 당 에스테르, 및 환원당으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 담배 향 화합물의 수준에 대해 영향을 미치지 않는 nic1 돌연변이, nic2 돌연변이, 또는 이들의 조합을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 담배 향 화합물은 담배 연기의 풍미 및 향과 연관된 화합물이다. 이들 화합물에는 3-메틸발레르산, 발레르산, 이소발레르산, 셈브레노이드 및 랩데노이드 디테르펜, 및 당 에스테르가 포함되나 이로 제한되지 않는다. 담배 향 화합물의 농도는 관련 기술분야에 공지된 임의의 대사물 프로파일링 방법, 예컨대 비제한적으로 기체 크로마토그래피 질량 분광법 (GC-MS), 핵자기 공명 분광학, 액체 크로마토그래피-연결된 질량 분광법에 의해 측정될 수 있다. [The Handbook of Plant Metabolomics, edited by Weckwerth and Kahl, (Wiley-Blackwell) (May 28, 2013)]을 참고한다.
본원에 사용된 바와 같이, "환원당(들)"은 유리의 또는 잠재적으로 유리의 알데히드 또는 케톤 기를 갖는 임의의 당 (단당류 또는 다당류)이다. 글루코스 및 프럭토스는 연기 pH를 감소시키고 "유리의" 비양성자화된 니코틴의 양을 효과적으로 감소시킴으로써 궐련 연기에서 니코틴 완충제로서 작용한다. 환원당은 예를 들어 니코틴 및 다른 담배 알칼로이드의 감각적 영향을 수정함으로써 연기 풍미의 균형을 맞춘다. 당 함량과 알칼로이드 함량 사이의 역의 관계는 담배 품종에 따라, 동일한 품종 내에서, 및 식재 조건에 의해 유발되는 동일한 식물 계통 내에서 보고되었다. 환원당 수준은 스칼라 인스트루먼트 코 (펜실베니아주 웨스트 체스터)에 의해 개조되고 [Davis, Tobacco Science 20:139-144 (1976)]에 의해 기재된 바와 같이 담배 샘플의 분석을 위해 개발된 분절-흐름 비색 방법을 이용하여 측정될 수 있다. 예를 들어, 샘플을 탄산나트륨 용액에 대해 투석한다. 구리 네오쿠프로인을 샘플에 첨가하고, 용액을 가열한다. 구리 네오쿠프로인 킬레이트를 당의 존재하에 환원시켜, 460 nm에서 측정되는 착색된 복합체를 생성한다.
한 측면에서, 본원에 제공된 담배 식물은 nic1 및/또는 nic2 유전자좌로부터의 1개 이상의 유전자 활성을 감소시키거나 또는 제거하는, nic1 및/또는 nic2 유전자좌에서의 1개 이상의 천연적으로 존재하지 않는 돌연변이성 대립유전자를 포함한다. 한 측면에서, 이들 돌연변이성 대립유전자는 보다 낮은 니코틴 수준을 유발한다. 돌연변이성 nic1 및/또는 nic2 대립유전자는 무작위 또는 표적화된 돌연변이 유발 접근법을 비롯하여 관련 기술분야에 공지된 임의의 방법에 의해 도입될 수 있다.
이러한 돌연변이 유발 방법에는 비제한적으로 종자를 에틸 메틸술페이트 (EMS) (Hildering and Verkerk, In, The use of induced mutations in plant breeding. Pergamon press, pp 317-320, 1965) 또는 UV-방사선, X-선, 및 고속 중성자 조사로 처리 (예를 들어, [Verkerk, Neth. J. Agric. Sci. 19:197-203, 1971; 및 Poehlman, Breeding Field Crops, Van Nostrand Reinhold, New York (3.sup.rd ed), 1987] 참고), 트랜스포손 태그 부착 (Fedoroff et al., 1984; 미국 특허 번호 4,732,856 및 미국 특허 번호 5,013,658), 뿐만 아니라 T-DNA 삽입 방법 (Hoekema et al., 1983; 미국 특허 번호 5,149,645)이 포함된다. EMS-유도된 돌연변이 유발은 게놈의 길이에 걸쳐 무작위 점 돌연변이를 화학적으로 유도하는 것으로 이루어진다. 고속 중성자 돌연변이 유발은 이중 가닥 DNA 파괴를 통해 큰 결실을 유발하는 중성자 충격에 종자를 노출시키는 것으로 이루어진다. 트랜스포손 태그 부착은 내인성 유전자 내에 트랜스포손을 삽입시켜 상기 유전자의 발현을 감소시키거나 또는 제거하는 것을 포함한다. 담배 유전자에 존재할 수 있는 돌연변이의 유형에는 예를 들어 점 돌연변이, 결실, 삽입, 배가, 및 반전이 포함된다. 이러한 돌연변이는 바람직하게는 담배 유전자의 코딩 영역에 존재하지만; 담배 유전자의 프로모터 영역, 및 인트론, 또는 비번역 영역에서의 돌연변이 또한 바람직할 수 있다.
또한, 선택된 PCR 생성물의 변성 HPLC 또는 선택적 엔도뉴클레아제 소화를 이용하여, 화학적으로 유도된 돌연변이에 대해 스크리닝하는 빠르고 자동화가능한 방법인 TILLING (게놈에서 유도된 국소 병변 표적화) 또한 본 개시내용에 적용가능하다. [McCallum et al. (2000) Nat. Biotechnol. 18:455-457]을 참고한다. 유전자 발현에 영향을 미치거나 또는 유전자의 기능을 방해하는 돌연변이는 관련 기술분야에 널리 공지된 방법을 이용하여 결정될 수 있다. 유전자 엑손에서 삽입 돌연변이는 보통 삭제-돌연변이체를 생성한다. 보존된 잔기에서의 돌연변이는 단백질의 기능을 억제하는데 특히 효과적일 수 있다. 한 측면에서, 담배 식물은 미국 가출원 번호 62/616,959 및 62/625,878 (둘 다 그들의 전문이 참고로 포함됨)에 기재된 1개 이상의 NCG 유전자에서 넌센스 (예를 들어, 정지 코돈) 돌연변이를 포함한다.
한 측면에서, 본 개시내용은 또한 상업적으로 허용가능한 잎 품질을 유지하면서 변경된 니코틴 수준을 갖는 담배 계통을 제공한다. 이들 계통은 정확한 게놈 조작 기술, 예를 들어 전사 활성인자-유사 이펙터 뉴클레아제 (TALEN), 메가뉴클레아제, 아연 핑거 뉴클레아제, 및 일정한 간격을 두고 주기적으로 분포하는 짧은 회문 반복부 (CRISPR)/Cas9 시스템, CRISPR/Cpf1 시스템, CRISPR/Csm1 시스템, 및 이들의 조합을 통해 nic1 및/또는 nic2 유전자좌에서 있는 1개 이상의 유전자에 돌연변이를 도입함으로써 생성될 수 있다 (예를 들어, 미국 특허 출원 공보 2017/0233756 참고). 예를 들어, [Gaj et al., Trends in Biotechnology, 31(7):397-405 (2013)]를 참고한다.
돌연변이된 담배 식물의 스크리닝 및 선택은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 임의의 방법을 통해 이루어질 수 있다. 스크리닝 및 선택 방법의 예에는 써던 분석, 폴리뉴클레오티드의 검출을 위한 PCR 증폭, 노던 블롯, RNase 보호, 프라이머-확장, RNA 전사체의 검출을 위한 RT-PCR 증폭, 생어(Sanger) 시퀀싱, 차세대 시퀀싱 기술 (예를 들어, 일루미나(Illumina), 팩바이오(PacBio), 이온 토렌트(Ion Torrent), 454), 폴리펩티드 및 폴리뉴클레오티드의 효소 또는 리보자임 활성의 검출을 위한 효소적 검정, 및 단백질 겔 전기영동, 웨스턴 블롯, 면역침전, 및 폴리펩티드의 검출을 위한 효소-결합된 면역검정이 포함되나 이로 제한되지 않는다. 폴리펩티드 및/또는 폴리뉴클레오티드의 존재 또는 발현을 검출하기 위해 현장 혼성화, 효소 염색, 및 면역염색과 같은 다른 기술 또한 이용할 수 있다. 언급된 모든 기술을 수행하는 방법은 공지되어 있다.
한 측면에서, 본원에 제공된 담배 식물 또는 식물 게놈은 메가뉴클레아제, 아연-핑거 뉴클레아제 (ZFN), 전사 활성인자-유사 이펙터 뉴클레아제 (TALEN), CRISPR/Cas9 뉴클레아제, CRISPR/Cpf1 뉴클레아제, 또는 CRISPR/Csm1 뉴클레아제로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레아제에 의해 돌연변이되거나 또는 편집된다.
한 측면에서, nic1 돌연변이, nic2 돌연변이, 또는 이들 둘 다를 포함하는 본원에 제공된 담배 식물은 조기-노화 형질을 제공하는 트랜스진 또는 돌연변이를 추가로 포함한다. 한 측면에서, 조기-노화 형질을 제공하는 돌연변이는 옐로우 버어리1 (yellow burley1, -yb1)이다. 한 측면에서, 조기-노화 형질을 제공하는 돌연변이는 옐로우 버어리2 (-yb2)이다. 한 측면에서, 조기-노화 형질을 제공하는 돌연변이는 페일 옐로우 (pale yellow, PY)이다.
한 측면에서, 담배 식물 또는 그의 일부분은 대조군 담배 식물에 비해: 보다 낮은 수준의 니코틴 또는 총 알칼로이드를 제공하는 제1 게놈 변형, 및 총 잎 폴리아민 수준, 총 뿌리 폴리아민 수준, 총 잎 엽록소 수준, 잎 면적 단위당 엽육 세포 개수, 및 잎 표피 세포 크기로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 형질의 대등한 수준을 제공하는 제2 게놈 변형을 포함하고; 대조군 식물은 제1 및 제2 게놈 변형을 둘 다 갖지 않는다. 한 측면에서, 담배 식물 또는 그의 일부분은 대조군 담배 식물에 비해: 보다 낮은 수준의 니코틴 또는 총 알칼로이드를 제공하는 제1 게놈 변형, 및 대등한 수준의 총 잎 폴리아민 수준을 제공하는 제2 게놈 변형을 포함하고, 대조군 식물은 제1 및 제2 게놈 변형을 둘 다 갖지 않는다. 한 측면에서, 담배 식물 또는 그의 일부분은 대조군 담배 식물에 비해: 보다 낮은 수준의 니코틴 또는 총 알칼로이드를 제공하는 제1 게놈 변형, 및 대등한 수준의 총 뿌리 폴리아민 수준을 제공하는 제2 게놈 변형을 포함하고, 대조군 식물은 제1 및 제2 게놈 변형을 둘 다 갖지 않는다. 한 측면에서, 담배 식물 또는 그의 일부분은 대조군 담배 식물에 비해: 보다 낮은 수준의 니코틴 또는 총 알칼로이드를 제공하는 제1 게놈 변형, 및 대등한 수준의 총 잎 엽록소 수준을 제공하는 제2 게놈 변형을 포함하고, 대조군 식물은 제1 및 제2 게놈 변형을 둘 다 갖지 않는다. 한 측면에서, 담배 식물 또는 그의 일부분은 대조군 담배 식물에 비해: 보다 낮은 수준의 니코틴 또는 총 알칼로이드를 제공하는 제1 게놈 변형, 및 대등한 수준의 잎 면적 단위당 엽육 세포 개수를 제공하는 제2 게놈 변형을 포함하고, 대조군 식물은 제1 및 제2 게놈 변형을 둘 다 갖지 않는다. 한 측면에서, 담배 식물 또는 그의 일부분은 대조군 담배 식물에 비해: 보다 낮은 수준의 니코틴 또는 총 알칼로이드를 제공하는 제1 게놈 변형, 및 대등한 수준의 잎 표피 세포 크기를 제공하는 제2 게놈 변형을 포함하고, 대조군 식물은 제1 및 제2 게놈 변형을 둘 다 갖지 않는다.
한 측면에서, 제1 게놈 변형, 제2 게놈 변형, 또는 이들 둘 다는 트랜스진, 돌연변이, 또는 이들 둘 다를 포함한다. 한 측면에서, 게놈 변형, 제2 게놈 변형, 또는 이들 둘 다는 트랜스진을 포함한다. 한 측면에서, 제1 게놈 변형, 제2 게놈 변형, 또는 이들 둘 다는 돌연변이를 포함한다. 한 측면에서, 제1 게놈 변형, 제2 게놈 변형, 또는 이들 둘 다는 트랜스진-기반이 아니다. 한 측면에서, 제1 게놈 변형, 제2 게놈 변형, 또는 이들 둘 다는 돌연변이-기반이 아니다.
한 측면에서, 본원에 제공된 담배 식물은 대조군 담배 식물에 비해 보다 낮은 수준의 니코틴을 제공하는 제1 게놈 변형을 포함한다. 한 측면에서, 본원에 제공된 담배 식물은 nic1 돌연변이, nic2 돌연변이, 또는 이들 둘 다를 포함하는 제1 게놈 변형을 포함한다. 한 측면에서, 본원에 제공된 담배 식물은 Nic1 유전자좌를 표적화하는 트랜스진, Nic2 유전자좌를 표적화하는 트랜스진, 또는 이들 둘 다를 포함한다.
한 측면에서, 본원에 제공된 담배 식물은 아스파르테이트 옥시다제, 아그마틴 데이미나제 (AIC), 아르기나제, 디아민 옥시다제, 아르기닌 데카르복실라제 (ADC), 메틸푸트레신 옥시다제 (MPO), NADH 데히드로게나제, 오르니틴 데카르복실라제 (ODC), 포스포리보실안트라닐레이트 아이소머라제 (PRAI), 푸트레신 N-메틸트랜스퍼라제 (PMT), 퀴놀레이트 포스포리보실 트랜스퍼라제 (QPT), 및 S-아데노실-메티오닌 신테타제 (SAMS), A622, NBB1, BBL, MYC2, Nic1, Nic2, 에틸렌 반응 인자 (ERF) 전사 인자, 니코틴 흡수 페르메아제 (NUP), 및 MATE 트랜스포터로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질을 코딩하는 유전자 또는 유전자좌에서 돌연변이를 포함하는 제1 게놈 변형을 포함한다. 한 측면에서, 본원에 제공된 담배 식물은 아스파르테이트 옥시다제, 아그마틴 데이미나제 (AIC), 아르기나제, 디아민 옥시다제, 아르기닌 데카르복실라제 (ADC), 메틸푸트레신 옥시다제 (MPO), NADH 데히드로게나제, 오르니틴 데카르복실라제 (ODC), 포스포리보실안트라닐레이트 아이소머라제 (PRAI), 푸트레신 N-메틸트랜스퍼라제 (PMT), 퀴놀레이트 포스포리보실 트랜스퍼라제 (QPT), 및 S-아데노실-메티오닌 신테타제 (SAMS), A622, NBB1, BBL, MYC2, Nic1, Nic2, 에틸렌 반응 인자 (ERF) 전사 인자, 니코틴 흡수 페르메아제 (NUP), 및 MATE 트랜스포터로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질을 코딩하는 유전자 또는 유전자좌를 표적화하고 억제하는 트랜스진을 포함하는 제1 게놈 변형을 포함한다.
한 측면에서, 본원에 제공된 담배 식물은 ERF32, ERF34, ERF39, ERF189, ERF115, ERF221, ERF104, ERF179, ERF17 및 ERF168로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질을 코딩하는 유전자 또는 유전자좌에서 돌연변이를 포함하는 제1 게놈 변형을 포함한다. 한 측면에서, 본원에 제공된 담배 식물은 ERF32, ERF34, ERF39, ERF189, ERF115, ERF221, ERF104, ERF179, ERF17 및 ERF168로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질을 코딩하는 유전자 또는 유전자좌를 표적화하고 억제하는 트랜스진을 포함하는 제1 게놈 변형을 포함한다.
한 측면에서, 제공된 담배 식물 또는 식물 게놈은 NCG1 내지 NCG35로 이루어진 군으로부터 선택된 1개 이상의 NCG 유전자에서 1개 이상의 돌연변이를 갖도록 돌연변이되거나 또는 편집되고, 1개 이상의 돌연변이는 1개 이상의 NCG 유전자의 활성 또는 발현을 감소시키거나 또는 제거한다. 한 측면에서, 제공된 담배 식물 또는 식물 게놈은 NCG1, NCG2, NCG11, NCG12, NCG13, NCG15, NCG16, NCG17, NCG21, NCG22, NCG24, NCG26, NCG29, NCG30 및 NCG35로 이루어진 군으로부터 선택된 1개 이상의 NCG 유전자에서 1개 이상의 돌연변이를 갖도록 돌연변이되거나 또는 편집되고, 1개 이상의 돌연변이는 1개 이상의 NCG 유전자의 활성 또는 발현을 감소시키거나 또는 제거한다. 한 측면에서, 제공된 담배 식물 또는 식물 게놈은 NCG1 내지 NCG21로 이루어진 군으로부터 선택된 1개 이상의 NCG 유전자에서 1개 이상의 돌연변이를 갖도록 돌연변이되거나 또는 편집되고, 1개 이상의 돌연변이는 1개 이상의 NCG 유전자의 활성 또는 발현을 감소시키거나 또는 제거한다. 한 측면에서, 제공된 담배 식물 또는 식물 게놈은 NCG1, NCG2, NCG11, NCG12, NCG15, NCG16 및 NCG17로 이루어진 군으로부터 선택된 1개 이상의 NCG 유전자에서 1개 이상의 돌연변이를 갖도록 돌연변이되거나 또는 편집되고, 1개 이상의 돌연변이는 1개 이상의 NCG 유전자의 활성 또는 발현을 감소시키거나 또는 제거한다. 한 측면에서, 제공된 담배 식물 또는 식물 게놈은 NCG2, NCG12, NCG15, NCG16 및 NCG17로 이루어진 군으로부터 선택된 1개 이상의 NCG 유전자에서 1개 이상의 돌연변이를 갖도록 돌연변이되거나 또는 편집되고, 1개 이상의 돌연변이는 1개 이상의 NCG 유전자의 활성 또는 발현을 감소시키거나 또는 제거한다. 한 측면에서, 제공된 담배 식물 또는 식물 게놈은 NCG12, NCG15, NCG16 및 NCG17로 이루어진 군으로부터 선택된 1개 이상의 NCG 유전자에서 1개 이상의 돌연변이를 갖도록 돌연변이되거나 또는 편집되고, 1개 이상의 돌연변이는 1개 이상의 NCG 유전자의 활성 또는 발현을 감소시키거나 또는 제거한다. 또 다른 측면에서, 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상 또는 5개 이상의 NCG 돌연변이를 갖는 편집된 또는 돌연변이된 담배 식물은 ERF189, ERF115, ERF221, ERF104, ERF179, ERF17 및 ERF168로 이루어진 군으로부터 선택된 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상 또는 5개 이상의 ERF 유전자에서 1개 이상의 돌연변이를 추가로 포함하고, 1개 이상의 돌연변이는 1개 이상의 ERF 유전자의 활성 또는 발현을 감소시키거나 또는 제거한다.
한 측면에서, 제공된 담배 식물 또는 식물 게놈은 NCG1 내지 NCG35로 이루어진 군으로부터 선택된 2개 이상의 NCG 유전자에서 2개 이상의 돌연변이를 갖도록 돌연변이되거나 또는 편집되고, 2개 이상의 돌연변이는 2개 이상의 NCG 유전자의 활성 또는 발현을 감소시키거나 또는 제거한다. 한 측면에서, 제공된 담배 식물 또는 식물 게놈은 NCG1, NCG2, NCG11, NCG12, NCG13, NCG15, NCG16, NCG17, NCG21, NCG22, NCG24, NCG26, NCG29, NCG30 및 NCG35로 이루어진 군으로부터 선택된 2개 이상의 NCG 유전자에서 2개 이상의 돌연변이를 갖도록 돌연변이되거나 또는 편집되고, 2개 이상의 돌연변이는 2개 이상의 NCG 유전자의 활성 또는 발현을 감소시키거나 또는 제거한다. 한 측면에서, 제공된 담배 식물 또는 식물 게놈은 NCG1 내지 NCG21로 이루어진 군으로부터 선택된 2개 이상의 NCG 유전자에서 2개 이상의 돌연변이를 갖도록 돌연변이되거나 또는 편집되고, 2개 이상의 돌연변이는 1개 이상의 NCG 유전자의 활성 또는 발현을 감소시키거나 또는 제거한다. 한 측면에서, 제공된 담배 식물 또는 식물 게놈은 NCG1, NCG2, NCG11, NCG12, NCG15, NCG16 및 NCG17로 이루어진 군으로부터 선택된 2개 이상의 NCG 유전자에서 2개 이상의 돌연변이를 갖도록 돌연변이되거나 또는 편집되고, 2개 이상의 돌연변이는 1개 이상의 NCG 유전자의 활성 또는 발현을 감소시키거나 또는 제거한다. 한 측면에서, 제공된 담배 식물 또는 식물 게놈은 NCG2, NCG12, NCG15, NCG16 및 NCG17로 이루어진 군으로부터 선택된 2개 이상의 NCG 유전자에서 2개 이상의 돌연변이를 갖도록 돌연변이되거나 또는 편집되고, 2개 이상의 돌연변이는 2개 이상의 NCG 유전자의 활성 또는 발현을 감소시키거나 또는 제거한다. 한 측면에서, 제공된 담배 식물 또는 식물 게놈은 NCG12, NCG15, NCG16 및 NCG17로 이루어진 군으로부터 선택된 2개 이상의 NCG 유전자에서 2개 이상의 돌연변이를 갖도록 돌연변이되거나 또는 편집되고, 2개 이상의 돌연변이는 2개 이상의 NCG 유전자의 활성 또는 발현을 감소시키거나 또는 제거한다. 또 다른 측면에서, 2개 이상의 NCG 돌연변이를 갖는 편집된 또는 돌연변이된 담배 식물은 ERF189, ERF115, ERF221, ERF104, ERF179, ERF17 및 ERF168로 이루어진 군으로부터 선택된 2개 이상의 ERF 유전자에서 2개 이상의 돌연변이를 추가로 포함하고, 2개 이상의 돌연변이는 2개 이상의 ERF 유전자의 활성 또는 발현을 감소시키거나 또는 제거한다.
한 측면에서, 제공된 담배 식물 또는 식물 게놈은 NCG1 내지 NCG35로 이루어진 군으로부터 선택된 3개 이상의 NCG 유전자에서 3개 이상의 돌연변이를 갖도록 돌연변이되거나 또는 편집되고, 3개 이상의 돌연변이는 3개 이상의 NCG 유전자의 활성 또는 발현을 감소시키거나 또는 제거한다. 한 측면에서, 제공된 담배 식물 또는 식물 게놈은 NCG1, NCG2, NCG11, NCG12, NCG13, NCG15, NCG16, NCG17, NCG21, NCG22, NCG24, NCG26, NCG29, NCG30 및 NCG35로 이루어진 군으로부터 선택된 3개 이상의 NCG 유전자에서 3개 이상의 돌연변이를 갖도록 돌연변이되거나 또는 편집되고, 3개 이상의 돌연변이는 3개 이상의 NCG 유전자의 활성 또는 발현을 감소시키거나 또는 제거한다. 한 측면에서, 제공된 담배 식물 또는 식물 게놈은 NCG1 내지 NCG21로 이루어진 군으로부터 선택된 3개 이상의 NCG 유전자에서 3개 이상의 돌연변이를 갖도록 돌연변이되거나 또는 편집되고, 3개 이상의 돌연변이는 3개 이상의 NCG 유전자의 활성 또는 발현을 감소시키거나 또는 제거한다. 한 측면에서, 제공된 담배 식물 또는 식물 게놈은 NCG1, NCG2, NCG11, NCG12, NCG15, NCG16 및 NCG17로 이루어진 군으로부터 선택된 3개 이상의 NCG 유전자에서 3개 이상의 돌연변이를 갖도록 돌연변이되거나 또는 편집되고, 3개 이상의 돌연변이는 3개 이상의 NCG 유전자의 활성 또는 발현을 감소시키거나 또는 제거한다. 한 측면에서, 제공된 담배 식물 또는 식물 게놈은 NCG2, NCG12, NCG15, NCG16 및 NCG17로 이루어진 군으로부터 선택된 3개 이상의 NCG 유전자에서 3개 이상의 돌연변이를 갖도록 돌연변이되거나 또는 편집되고, 3개 이상의 돌연변이는 3개 이상의 NCG 유전자의 활성 또는 발현을 감소시키거나 또는 제거한다. 한 측면에서, 제공된 담배 식물 또는 식물 게놈은 NCG12, NCG15, NCG16 및 NCG17로 이루어진 군으로부터 선택된 3개 이상의 NCG 유전자에서 3개 이상의 돌연변이를 갖도록 돌연변이되거나 또는 편집되고, 3개 이상의 돌연변이는 3개 이상의 NCG 유전자의 활성 또는 발현을 감소시키거나 또는 제거한다. 또 다른 측면에서, 3개 이상의 NCG 돌연변이를 갖는 편집된 또는 돌연변이된 담배 식물은 ERF189, ERF115, ERF221, ERF104, ERF179, ERF17 및 ERF168로 이루어진 군으로부터 선택된 3개 이상의 ERF 유전자에서 3개 이상의 돌연변이를 추가로 포함하고, 3개 이상의 돌연변이는 3개 이상의 ERF 유전자의 활성 또는 발현을 감소시키거나 또는 제거한다.
한 측면에서, 제공된 담배 식물 또는 식물 게놈은 NCG1 내지 NCG35로 이루어진 군으로부터 선택된 4개 이상의 NCG 유전자에서 4개 이상의 돌연변이를 갖도록 돌연변이되거나 또는 편집되고, 4개 이상의 돌연변이는 4개 이상의 NCG 유전자의 활성 또는 발현을 감소시키거나 또는 제거한다. 한 측면에서, 제공된 담배 식물 또는 식물 게놈은 NCG1, NCG2, NCG11, NCG12, NCG13, NCG15, NCG16, NCG17, NCG21, NCG22, NCG24, NCG26, NCG29, NCG30 및 NCG35로 이루어진 군으로부터 선택된 4개 이상의 NCG 유전자에서 4개 이상의 돌연변이를 갖도록 돌연변이되거나 또는 편집되고, 4개 이상의 돌연변이는 4개 이상의 NCG 유전자의 활성 또는 발현을 감소시키거나 또는 제거한다. 한 측면에서, 제공된 담배 식물 또는 식물 게놈은 NCG1 내지 NCG21로 이루어진 군으로부터 선택된 4개 이상의 NCG 유전자에서 4개 이상의 돌연변이를 갖도록 돌연변이되거나 또는 편집되고, 4개 이상의 돌연변이는 4개 이상의 NCG 유전자의 활성 또는 발현을 감소시키거나 또는 제거한다. 한 측면에서, 제공된 담배 식물 또는 식물 게놈은 NCG1, NCG2, NCG11, NCG12, NCG15, NCG16 및 NCG17로 이루어진 군으로부터 선택된 4개 이상의 NCG 유전자에서 4개 이상의 돌연변이를 갖도록 돌연변이되거나 또는 편집되고, 4개 이상의 돌연변이는 4개 이상의 NCG 유전자의 활성 또는 발현을 감소시키거나 또는 제거한다. 한 측면에서, 제공된 담배 식물 또는 식물 게놈은 NCG2, NCG12, NCG15, NCG16 및 NCG17로 이루어진 군으로부터 선택된 4개 이상의 NCG 유전자에서 4개 이상의 돌연변이를 갖도록 돌연변이되거나 또는 편집되고, 4개 이상의 돌연변이는 4개 이상의 NCG 유전자의 활성 또는 발현을 감소시키거나 또는 제거한다. 한 측면에서, 제공된 담배 식물 또는 식물 게놈은 NCG12, NCG15, NCG16 및 NCG17로 이루어진 군으로부터 선택된 4개 이상의 NCG 유전자에서 4개 이상의 돌연변이를 갖도록 돌연변이되거나 또는 편집되고, 4개 이상의 돌연변이는 4개 이상의 NCG 유전자의 활성 또는 발현을 감소시키거나 또는 제거한다. 또 다른 측면에서, 4개 이상의 NCG 돌연변이를 갖는 편집된 또는 돌연변이된 담배 식물은 ERF189, ERF115, ERF221, ERF104, ERF179, ERF17 및 ERF168로 이루어진 군으로부터 선택된 4개 이상의 ERF 유전자에서 4개 이상의 돌연변이를 추가로 포함하고, 4개 이상의 돌연변이는 4개 이상의 ERF 유전자의 활성 또는 발현을 감소시키거나 또는 제거한다.
한 측면에서, 제공된 담배 식물 또는 식물 게놈은 NCG1 내지 NCG35로 이루어진 군으로부터 선택된 1개 이상의 NCG 유전자를 표적화하는 1개 이상의 트랜스진을 포함하고, 1개 이상의 트랜스진은 1개 이상의 NCG 유전자의 활성 또는 발현을 감소시키거나 또는 제거한다. 한 측면에서, 제공된 담배 식물 또는 식물 게놈은 NCG1, NCG2, NCG11, NCG12, NCG13, NCG15, NCG16, NCG17, NCG21, NCG22, NCG24, NCG26, NCG29, NCG30 및 NCG35로 이루어진 군으로부터 선택된 1개 이상의 NCG 유전자를 표적화하는 1개 이상의 트랜스진을 포함하고, 1개 이상의 트랜스진은 1개 이상의 NCG 유전자의 활성 또는 발현을 감소시키거나 또는 제거한다. 한 측면에서, 제공된 담배 식물 또는 식물 게놈은 NCG1 내지 NCG21로 이루어진 군으로부터 선택된 1개 이상의 NCG 유전자를 표적화하는 1개 이상의 트랜스진을 포함하고, 1개 이상의 트랜스진은 1개 이상의 NCG 유전자의 활성 또는 발현을 감소시키거나 또는 제거한다. 한 측면에서, 제공된 담배 식물 또는 식물 게놈은 NCG1, NCG2, NCG11, NCG12, NCG15, NCG16 및 NCG17로 이루어진 군으로부터 선택된 1개 이상의 NCG 유전자를 표적화하는 1개 이상의 트랜스진을 포함하고, 1개 이상의 트랜스진은 1개 이상의 NCG 유전자의 활성 또는 발현을 감소시키거나 또는 제거한다. 한 측면에서, 제공된 담배 식물 또는 식물 게놈은 NCG2, NCG12, NCG15, NCG16 및 NCG17로 이루어진 군으로부터 선택된 1개 이상의 NCG 유전자를 표적화하는 1개 이상의 트랜스진을 포함하고, 1개 이상의 트랜스진은 1개 이상의 NCG 유전자의 활성 또는 발현을 감소시키거나 또는 제거한다. 한 측면에서, 제공된 담배 식물 또는 식물 게놈은 NCG12, NCG15, NCG16 및 NCG17로 이루어진 군으로부터 선택된 1개 이상의 NCG 유전자를 표적화하는 1개 이상의 트랜스진을 포함하고, 1개 이상의 트랜스진은 1개 이상의 NCG 유전자의 활성 또는 발현을 감소시키거나 또는 제거한다. 또 다른 측면에서, 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상 또는 5개 이상의 NCG-표적화 트랜스진을 갖는 담배 식물은 ERF189, ERF115, ERF221, ERF104, ERF179, ERF17 및 ERF168로 이루어진 군으로부터 선택된 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상 또는 5개 이상의 ERF 유전자에서 1개 이상의 돌연변이를 추가로 포함하고, 1개 이상의 돌연변이는 1개 이상의 ERF 유전자의 활성 또는 발현을 감소시키거나 또는 제거한다. 또 다른 측면에서, 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상 또는 5개 이상의 NCG-표적화 트랜스진을 갖는 담배 식물은 ERF189, ERF115, ERF221, ERF104, ERF179, ERF17 및 ERF168로 이루어진 군으로부터 선택된 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상 또는 5개 이상의 ERF 유전자를 표적화하는 1개 이상의 트랜스진을 추가로 포함하고, 1개 이상의 ERF-표적화 트랜스진은 1개 이상의 ERF 유전자의 활성 또는 발현을 감소시키거나 또는 제거한다.
한 측면에서, 제공된 담배 식물 또는 식물 게놈은 NCG1 내지 NCG35로 이루어진 군으로부터 선택된 2개 이상의 NCG 유전자를 표적화하는 2개 이상의 트랜스진을 포함하고, 2개 이상의 트랜스진은 2개 이상의 NCG 유전자의 활성 또는 발현을 감소시키거나 또는 제거한다. 한 측면에서, 제공된 담배 식물 또는 식물 게놈은 NCG1, NCG2, NCG11, NCG12, NCG13, NCG15, NCG16, NCG17, NCG21, NCG22, NCG24, NCG26, NCG29, NCG30 및 NCG35로 이루어진 군으로부터 선택된 2개 이상의 NCG 유전자를 표적화하는 2개 이상의 트랜스진을 포함하고, 2개 이상의 트랜스진은 2개 이상의 NCG 유전자의 활성 또는 발현을 감소시키거나 또는 제거한다. 한 측면에서, 제공된 담배 식물 또는 식물 게놈은 NCG1 내지 NCG21로 이루어진 군으로부터 선택된 2개 이상의 NCG 유전자를 표적화하는 2개 이상의 트랜스진을 포함하고, 2개 이상의 트랜스진은 1개 이상의 NCG 유전자의 활성 또는 발현을 감소시키거나 또는 제거한다. 한 측면에서, 제공된 담배 식물 또는 식물 게놈은 NCG1, NCG2, NCG11, NCG12, NCG15, NCG16 및 NCG17로 이루어진 군으로부터 선택된 2개 이상의 NCG 유전자를 표적화하는 2개 이상의 트랜스진을 포함하고, 2개 이상의 트랜스진은 1개 이상의 NCG 유전자의 활성 또는 발현을 감소시키거나 또는 제거한다. 한 측면에서, 제공된 담배 식물 또는 식물 게놈은 NCG2, NCG12, NCG15, NCG16 및 NCG17로 이루어진 군으로부터 선택된 2개 이상의 NCG 유전자를 표적화하는 2개 이상의 트랜스진을 포함하고, 2개 이상의 트랜스진은 2개 이상의 NCG 유전자의 활성 또는 발현을 감소시키거나 또는 제거한다. 한 측면에서, 제공된 담배 식물 또는 식물 게놈은 NCG12, NCG15, NCG16 및 NCG17로 이루어진 군으로부터 선택된 2개 이상의 NCG 유전자를 표적화하는 2개 이상의 트랜스진을 포함하고, 2개 이상의 트랜스진은 2개 이상의 NCG 유전자의 활성 또는 발현을 감소시키거나 또는 제거한다. 또 다른 측면에서, 2개 이상의 NCG-표적화 트랜스진을 갖는 담배 식물은 ERF189, ERF115, ERF221, ERF104, ERF179, ERF17 및 ERF168로 이루어진 군으로부터 선택된 2개 이상의 ERF 유전자에서 2개 이상의 돌연변이를 추가로 포함하고, 2개 이상의 돌연변이는 2개 이상의 ERF 유전자의 활성 또는 발현을 감소시키거나 또는 제거한다. 또 다른 측면에서, 2개 이상의 NCG-표적화 트랜스진을 갖는 담배 식물은 ERF189, ERF115, ERF221, ERF104, ERF179, ERF17 및 ERF168로 이루어진 군으로부터 선택된 2개 이상의 ERF 유전자를 표적화하는 2개 이상의 트랜스진을 추가로 포함하고, 2개 이상의 ERF-표적화 트랜스진은 2개 이상의 ERF 유전자의 활성 또는 발현을 감소시키거나 또는 제거한다.
한 측면에서, 제공된 담배 식물 또는 식물 게놈은 NCG1 내지 NCG35로 이루어진 군으로부터 선택된 3개 이상의 NCG 유전자를 표적화하는 3개 이상의 트랜스진을 포함하고, 3개 이상의 트랜스진은 3개 이상의 NCG 유전자의 활성 또는 발현을 감소시키거나 또는 제거한다. 한 측면에서, 제공된 담배 식물 또는 식물 게놈은 NCG1, NCG2, NCG11, NCG12, NCG13, NCG15, NCG16, NCG17, NCG21, NCG22, NCG24, NCG26, NCG29, NCG30 및 NCG35로 이루어진 군으로부터 선택된 3개 이상의 NCG 유전자를 표적화하는 3개 이상의 트랜스진을 포함하고, 3개 이상의 트랜스진은 3개 이상의 NCG 유전자의 활성 또는 발현을 감소시키거나 또는 제거한다. 한 측면에서, 제공된 담배 식물 또는 식물 게놈은 NCG1 내지 NCG21로 이루어진 군으로부터 선택된 3개 이상의 NCG 유전자를 표적화하는 3개 이상의 트랜스진을 포함하고, 3개 이상의 트랜스진은 3개 이상의 NCG 유전자의 활성 또는 발현을 감소시키거나 또는 제거한다. 한 측면에서, 제공된 담배 식물 또는 식물 게놈은 NCG1, NCG2, NCG11, NCG12, NCG15, NCG16 및 NCG17로 이루어진 군으로부터 선택된 3개 이상의 NCG 유전자를 표적화하는 3개 이상의 트랜스진을 포함하고, 3개 이상의 트랜스진은 3개 이상의 NCG 유전자의 활성 또는 발현을 감소시키거나 또는 제거한다. 한 측면에서, 제공된 담배 식물 또는 식물 게놈은 NCG2, NCG12, NCG15, NCG16 및 NCG17로 이루어진 군으로부터 선택된 3개 이상의 NCG 유전자를 표적화하는 3개 이상의 트랜스진을 포함하고, 3개 이상의 트랜스진은 3개 이상의 NCG 유전자의 활성 또는 발현을 감소시키거나 또는 제거한다. 한 측면에서, 제공된 담배 식물 또는 식물 게놈은 NCG12, NCG15, NCG16 및 NCG17로 이루어진 군으로부터 선택된 3개 이상의 NCG 유전자를 표적화하는 3개 이상의 트랜스진을 포함하고, 3개 이상의 트랜스진은 3개 이상의 NCG 유전자의 활성 또는 발현을 감소시키거나 또는 제거한다. 또 다른 측면에서, 3개 이상의 NCG-표적화 트랜스진을 갖는 담배 식물은 ERF189, ERF115, ERF221, ERF104, ERF179, ERF17 및 ERF168로 이루어진 군으로부터 선택된 3개 이상의 ERF 유전자에서 3개 이상의 돌연변이를 추가로 포함하고, 3개 이상의 돌연변이는 3개 이상의 ERF 유전자의 활성 또는 발현을 감소시키거나 또는 제거한다. 또 다른 측면에서, 3개 이상의 NCG-표적화 트랜스진을 갖는 담배 식물은 ERF189, ERF115, ERF221, ERF104, ERF179, ERF17 및 ERF168로 이루어진 군으로부터 선택된 3개 이상의 ERF 유전자를 표적화하는 3개 이상의 트랜스진을 추가로 포함하고, 3개 이상의 ERF-표적화 트랜스진은 3개 이상의 ERF 유전자의 활성 또는 발현을 감소시키거나 또는 제거한다.
한 측면에서, 제공된 담배 식물 또는 식물 게놈은 NCG1 내지 NCG35로 이루어진 군으로부터 선택된 4개 이상의 NCG 유전자를 표적화하는 4개 이상의 트랜스진을 포함하고, 4개 이상의 트랜스진은 4개 이상의 NCG 유전자의 활성 또는 발현을 감소시키거나 또는 제거한다. 한 측면에서, 제공된 담배 식물 또는 식물 게놈은 NCG1, NCG2, NCG11, NCG12, NCG13, NCG15, NCG16, NCG17, NCG21, NCG22, NCG24, NCG26, NCG29, NCG30 및 NCG35로 이루어진 군으로부터 선택된 4개 이상의 NCG 유전자를 표적화하는 4개 이상의 트랜스진을 포함하고, 4개 이상의 트랜스진은 4개 이상의 NCG 유전자의 활성 또는 발현을 감소시키거나 또는 제거한다. 한 측면에서, 제공된 담배 식물 또는 식물 게놈은 NCG1 내지 NCG21로 이루어진 군으로부터 선택된 4개 이상의 NCG 유전자를 표적화하는 4개 이상의 트랜스진을 포함하고, 4개 이상의 트랜스진은 4개 이상의 NCG 유전자의 활성 또는 발현을 감소시키거나 또는 제거한다. 한 측면에서, 제공된 담배 식물 또는 식물 게놈은 NCG1, NCG2, NCG11, NCG12, NCG15, NCG16 및 NCG17로 이루어진 군으로부터 선택된 4개 이상의 NCG 유전자를 표적화하는 4개 이상의 트랜스진을 포함하고, 4개 이상의 트랜스진은 4개 이상의 NCG 유전자의 활성 또는 발현을 감소시키거나 또는 제거한다. 한 측면에서, 제공된 담배 식물 또는 식물 게놈은 NCG2, NCG12, NCG15, NCG16 및 NCG17로 이루어진 군으로부터 선택된 4개 이상의 NCG 유전자를 표적화하는 4개 이상의 트랜스진을 포함하고, 4개 이상의 트랜스진은 4개 이상의 NCG 유전자의 활성 또는 발현을 감소시키거나 또는 제거한다. 한 측면에서, 제공된 담배 식물 또는 식물 게놈은 NCG12, NCG15, NCG16 및 NCG17로 이루어진 군으로부터 선택된 4개 이상의 NCG 유전자를 표적화하는 4개 이상의 트랜스진을 포함하고, 4개 이상의 트랜스진은 4개 이상의 NCG 유전자의 활성 또는 발현을 감소시키거나 또는 제거한다. 또 다른 측면에서, 4개 이상의 NCG-표적화 트랜스진을 갖는 담배 식물은 ERF189, ERF115, ERF221, ERF104, ERF179, ERF17 및 ERF168로 이루어진 군으로부터 선택된 4개 이상의 ERF 유전자에서 4개 이상의 돌연변이를 추가로 포함하고, 4개 이상의 돌연변이는 4개 이상의 ERF 유전자의 활성 또는 발현을 감소시키거나 또는 제거한다. 또 다른 측면에서, 4개 이상의 NCG-표적화 트랜스진을 갖는 담배 식물은 ERF189, ERF115, ERF221, ERF104, ERF179, ERF17 및 ERF168로 이루어진 군으로부터 선택된 4개 이상의 ERF 유전자를 표적화하는 4개 이상의 트랜스진을 추가로 포함하고, 4개 이상의 ERF-표적화 트랜스진은 4개 이상의 ERF 유전자의 활성 또는 발현을 감소시키거나 또는 제거한다.
한 측면에서, 본원에 제공된 담배 식물은 오르니틴 데카르복실라제 (ODC) 유전자의 억제를 위해 비코딩 RNA를 코딩하는 전사가능한 DNA 서열에 작동가능하게 연결된 유도성 프로모터를 포함하는 제2 게놈 변형을 포함한다. 또 다른 측면에서, 트랜스진 억제, 돌연변이 유발, 또는 표적화된 게놈 편집을 통해 억제된 MYB8 활성을 갖는 담배 식물이 제공된다. 간단함을 위해, 본원에서 ODC 억제 (예를 들어, 임의의 특정한 유형의 프로모터 작동가능하게 연결됨)를 언급하는 모든 예시는 MYB8 억제에 동등하게 적용가능하다.
한 측면에서, 본원에 제공된 담배 식물은 대조군 담배 식물에 비해 잎에서 총 접합된 폴리아민의 감소된 양을 포함한다. 한 측면에서, 본원에 제공된 담배 식물은 대조군 담배 식물에 비해 뿌리에서 총 접합된 폴리아민의 감소된 양을 포함한다. 본원에서 사용되는, 접합된 폴리아민에는 가용성의 접합된 폴리아민, 예컨대 1종 이상의 페닐프로파노이드, 예컨대 페룰산, 카페산 및 코우마르산에 접합된 유리 폴리아민 (예를 들어, 푸트레신, 스페르민, 및/또는 스페르미딘)으로 이루어진 백본을 함유하는 페놀아미드가 포함되나 이로 제한되지 않는다. 접합된 폴리아민에는 또한 구조 중합체, 예컨대 리그닌에 포함된 불용성의 접합된 폴리아민이 포함되나 이로 제한되지 않는다. 한 측면에서, 본원에 제공된 담배 식물은 대조군 담배 식물에 비해 잎에서 총 유리 폴리아민 (예를 들어, 푸트레신, 스페르민, 및 스페르미딘)의 감소된 양을 포함한다. 한 측면에서, 본원에 제공된 담배 식물은 대조군 담배 식물에 비해 뿌리에서 총 접합된 폴리아민의 감소된 양을 포함한다. 한 측면에서, 본원에 제공된 담배 식물은 대조군 담배 식물에 비해 잎에서 푸트레신, 스페르미딘 및 스페르민으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 폴리아민의 총 접합된 형태의 감소된 양을 포함한다. 한 측면에서, 본원에 제공된 담배 식물은 대조군 담배 식물에 비해 뿌리에서 푸트레신, 스페르미딘 및 스페르민으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 폴리아민의 총 접합된 형태의 감소된 양을 포함한다. 한 측면에서, 본원에 제공된 담배 식물은 대조군 담배 식물에 비해 잎에서 푸트레신, 스페르미딘 및 스페르민으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 폴리아민의 총 유리 형태의 감소된 양을 포함한다. 한 측면에서, 본원에 제공된 담배 식물은 대조군 담배 식물에 비해 뿌리에서 푸트레신, 스페르미딘 및 스페르민으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 폴리아민의 총 접합된 형태의 감소된 양을 포함한다.
한 측면에서, 본원에 기재된 담배 식물의 특징 또는 형질은 개화기 직전, 토핑시, 토핑후 1 주째 (WPT), 2 WPT, 3 WPT, 4 WPT, 5 WPT, 6 WPT, 7 WPT, 8 WPT, 및 수확시로 이루어진 군으로부터 선택된 시기에 측정된다. 한 측면에서, 제1 및 제2 게놈 변형을 포함하는 본원에 제공된 담배 식물은 대조군 식물로부터의 잎과 대등한 잎 등급을 갖는 잎을 생성할 수 있다. 한 측면에서, 제1 및 제2 게놈 변형을 포함하는 본원에 제공된 담배 식물은 대조군 식물과 대등한 총 잎 수율을 갖는다.
본원에 사용된 바와 같이, "편집" 또는 "게놈 편집"은 내인성 식물 게놈 핵산 서열의 적어도 1, 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9 또는 적어도 10개 뉴클레오티드의 표적화된 돌연변이 유발, 또는 내인성 식물 게놈 핵산 서열의 제거 또는 교체를 지칭한다. 한 측면에서, 제공된 편집된 핵산 서열은 내인성 핵산 서열과 적어도 99.9%, 적어도 99.5%, 적어도 99%, 적어도 98%, 적어도 97%, 적어도 96%, 적어도 95%, 적어도 94%, 적어도 93%, 적어도 92%, 적어도 91%, 적어도 90%, 적어도 85%, 적어도 80%, 또는 적어도 75% 서열 동일성을 갖는다. 한 측면에서, 제공된 편집된 핵산 서열은 서열식별번호: 23-28 및 그의 단편과 적어도 99.9%, 적어도 99.5%, 적어도 99%, 적어도 98%, 적어도 97%, 적어도 96%, 적어도 95%, 적어도 94%, 적어도 93%, 적어도 92%, 적어도 91%, 적어도 90%, 적어도 85%, 적어도 80%, 또는 적어도 75% 서열 동일성을 갖는다. 또 다른 측면에서, 제공된 편집된 핵산 서열은 서열식별번호: 29-34로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드와 적어도 99.9%, 적어도 99.5%, 적어도 99%, 적어도 98%, 적어도 97%, 적어도 96%, 적어도 95%, 적어도 94%, 적어도 93%, 적어도 92%, 적어도 91%, 적어도 90%, 적어도 85%, 적어도 80%, 또는 적어도 75% 서열 동일성을 갖는다.
메가뉴클레아제, ZFN, TALEN, CRISPR/Cas9, CRISPR/Csm1 및 CRISPR/Cpf1은 게놈 서열의 표적 부위에서 이중 가닥 DNA 파손을 유도하며, 이후에 이는 상동성 재조합 (HR) 또는 비-상동성 말단-결합 (NHEJ)의 자연적인 과정에 의해 복구된다. 이어서, 절단된 부위에서 서열 변형이 일어나고, 이는 NHEJ의 경우 유전자 파괴를 일으키는 결실 또는 삽입, 또는 HR에 의한 공여자 핵산 서열의 통합을 포함할 수 있다. 한 측면에서, 제공된 방법은 공여자 폴리뉴클레오티드와 함께 HR을 통해 식물 게놈에서 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 적어도 9개, 적어도 10개, 10개 초과의 뉴클레오티드를 돌연변이시키 위해 제공된 뉴클레아제에 의해 식물 게놈을 편집하는 것을 포함한다. 한 측면에서, 제공된 돌연변이는 뉴클레아제를 사용하여 게놈 편집에 의해 발생한다. 또 다른 측면에서, 제공된 돌연변이는 비-상동성 말단-결합 또는 상동성 재조합에 의해 발생한다.
한 측면에서, 제공된 돌연변이는 1종 이상의 항산화제에 대해 관심 유전자, 예를 들어 생합성 효소, 조절성 전사 인자, 트랜스포터, 이화성 효소, 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자의 발현 또는 활성을 활성화시키는 우성 돌연변이를 제공한다.
미생물에서 흔히 확인되는 메가뉴클레아제는 높은 활성 및 긴 인식 서열 (> 14 bp)을 가져서 표적 DNA의 부위-특이적 소화를 일으키는 독특한 효소이다. 천연 발생 메가뉴클레아제의 조작된 형태는 전형적으로 연장된 DNA 인식 서열 (예를 들어, 14 내지 40 bp)을 갖는다. 메가뉴클레아제의 DNA 인식 및 절단 기능이 단일 도메인에서 얽혀 있기 때문에, 메가뉴클레아제의 조작은 ZFN 및 TALEN에 비해 더욱 어려울 수 있다. 독특한 서열을 인식하고 개선된 뉴클레아제 활성을 갖는 신규한 메가뉴클레아제 변이체를 생성하기 위해 돌연변이 유발 및 고처리량 스크리닝을 위한 특별한 방법이 이용되었다.
ZFN은 FokI 제한 엔도뉴클레아제의 절단 도메인에 융합된 조작된 아연 핑거 DNA-결합 도메인으로 이루어진 합성 단백질이다. ZFN은 아연 핑거 DNA-결합 도메인의 변형을 위해 이중 가닥 DNA의 거의 모든 긴 스트레치를 절단하도록 고안될 수 있다. ZFN은 표적 DNA 서열에 결합하도록 조작된 아연 핑거 어레이에 융합된 FokI 엔도뉴클레아제의 비특이적인 DNA 절단 도메인으로 구성된 단량체로부터 이합체를 형성한다.
ZFN의 DNA-결합 도메인은 전형적으로 3-4개의 아연-핑거 어레이로 구성된다. 표적 DNA에 대한 부위-특이적인 결합에 기여하는 아연 핑거 ∞-나선의 시작에 대해 위치 -1, +2, +3 및 +6에 있는 아미노산을 특이적 표적 서열에 맞게 변화시키고 맞춤화시킬 수 있다. 다른 아미노산은 상이한 서열 특이성을 갖는 ZFN을 생성하기 위해 컨센서스 백본을 형성한다. ZFN에 대한 표적 서열을 선택하는 규칙은 관련 기술분야에 공지되어 있다.
FokI 뉴클레아제 도메인은 DNA를 절단하기 위해 이합체화를 필요로 하고, 따라서 절단 부위의 반대쪽 DNA 가닥 (5-7 bp만큼 분리됨)에 결합하기 위해 C-말단 영역을 가진 2개의 ZFN이 필요하다. 2개-ZF-결합 부위가 회문식인 경우, ZFN 단량체는 표적 부위를 절단할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 ZFN은 광범위하고, 또 다른 ZFN의 도움없이 이중 가닥 DNA를 절단할 수 있는 단량체성 ZFN을 포함한다. 용어 ZFN은 또한 동일한 부위에서 DNA를 절단하기 위해 함께 작용하도록 조작된 ZFN의 쌍 중 하나 또는 두 구성원 모두를 지칭하기 위해 사용된다.
임의의 과학적 이론에 구애되지 않고, 아연 핑거 도메인의 DNA-결합 특이성은 원칙적으로 다양한 방법 중 하나를 이용하여 재조작될 수 있기 때문에, 맞춤화된 ZFN은 이론적으로 거의 모든 유전자 서열을 표적화하도록 구축될 수 있다. 아연 핑거 도메인을 조작하기 위해 공개적으로 이용가능한 방법에는 문맥-의존성 어셈블리(Context-dependent Assembly, CoDA), 올리고머화된 풀 조작(Oligomerized Pool Engineering, OPEN), 및 모듈 어셈블리가 포함된다.
TALEN은 전사 활성인자-유사 이펙터 (TALE) DNA 결합 도메인을 FokI 뉴클레아제 도메인에 융합시킴으로써 생성된 인공 제한 효소이다. TALEN 쌍의 각각의 구성원이 표적 부위를 플랭킹하는 DNA 부위에 결합할 때, FokI 단량체가 이합체화하고, 표적 부위에서 이중 가닥 DNA 파괴를 유발한다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 TALEN은 광범위하고, 또 다른 TALEN의 도움없이 이중 가닥 DNA를 절단할 수 있는 단량체성 TALEN을 포함한다. 용어 TALEN은 또한 동일한 부위에서 DNA를 절단하기 위해 함께 작용하도록 조작된 TALEN의 쌍 중 하나 또는 두 구성원 모두를 지칭하기 위해 사용된다.
전사 활성인자-유사 이펙터 (TALE)는 실질적으로 모든 DNA 서열에 결합하도록 조작될 수 있다. TALE 단백질은 크산토모나스(Xanthomonas) 속의 다양한 식물 박테리아 병원체로부터 유래된 DNA-결합 도메인이다. 크산토모나스 병원체는 감염 동안에 TALE를 숙주 식물 세포로 분비한다. TALE는 핵으로 이동하고, 여기서 이는 숙주 게놈에서 특이적 유전자의 프로모터 영역에서 특이적 DNA 서열의 프로모터 영역에서 특이적 DNA 서열을 인식하고 그에 결합한다. TALE는 33-34개 아미노산의 13-28개 반복 단량체로 구성된 중심 DNA-결합 도메인을 갖는다. 위치 12 및 13의 초가변 아미노산 잔기를 제외하고는 각각의 단량체의 아미노산은 고도로 보존된다. 2개의 가변 아미노산은 반복-가변 이중잔기 (repeat-variable diresidue, RVD)로 불린다. RVD의 아미노산 쌍 NI, NG, HD 및 NN은 각각 아데닌, 티민, 시토신 및 구아닌/아데닌을 우선적으로 인식하고, RVD의 조정은 연속적인 DNA 염기를 인식할 수 있다. 아미노산 서열과 DNA 인식 사이의 이러한 간단한 관계는 적절한 RVD를 함유하는 반복 세그먼트의 조합을 선택함으로써 특이적 DNA 결합 도메인의 조작을 가능하게 하였다.
야생형 FokI 절단 도메인 외에도, 돌연변이를 갖는 FokI 절단 도메인의 변이체가 절단 특이성 및 절단 활성을 개선시키기 위해 고안되었다. FokI 도메인은 이합체로서 기능하며, 적절한 배향 및 간격을 갖는 표적 게놈에서의 부위에 대해 독특한 DNA 결합 도메인을 갖는 2가지 구축물을 필요로 한다. TALEN DNA 결합 도메인과 FokI 절단 도메인 사이의 아미노산 잔기의 개수 및 2가지 개별 TALEN 결합 부위 사이의 염기의 개수 둘 다 높은 활성 수준을 달성하기 위한 파라미터이다.
TALE 결합 도메인의 아미노산 서열과 DNA 인식 사이의 관계는 고안가능한 단백질을 허용한다. DNA 웍스(DNA Works)와 같은 소프트웨어 프로그램을 이용하여 TALE 구축물을 고안할 수 있다. TALE 구축물을 고안하는 다른 방법은 관련 기술분야의 기술자에게 공지되어 있다. [Doyle et al., Nucleic Acids Research (2012) 40: W117-122.; Cermak et al., Nucleic Acids Research (2011). 39:e82; 및 tale-nt.cac.cornell.edu/about]을 참고한다.
CRISPR/Cas9 시스템, CRISPR/Csm1, 또는 CRISPR/Cpf1 시스템은 FokI-기반 방법인 ZFN 및 TALEN에 대한 대안이다. CRISPR 시스템은 표적 부위에서 DNA 서열을 인식하도록 상보적 염기쌍 형성을 이용하는 RNA-유도된 조작된 뉴클레아제를 기반으로 한다.
CRISPR/Cas9, CRISPR/Csm1, 및 CRISPR/Cpf1 시스템은 박테리아 및 고세균의 적응성 면역계의 일부이고, 서열-의존성 방식으로 외래 DNA를 절단함으로써 이들을 바이러스와 같은 침입 핵산으로부터 보호한다. 면역력은 CRISPR 유전자좌의 근위 말단에서 2개의 인접한 반복부 사이의 스페이서로서 공지된 침입 DNA의 짧은 단편을 통합시킴으로써 획득된다. 스페이서를 비롯한 CRISPR 어레이는 침입 DNA와의 후속적인 접촉 동안에 전사되고, 대략 40 nt 길이의 소형 간섭 CRISPR RNA (crRNA)로 가공되고, 이는 트랜스-활성화 CRISPR RNA (tracrRNA)와 조합되어 Cas9 뉴클레아제를 활성화시키고 유도한다. 이는 침입 DNA에서 프로토스페이서로 공지된 상동성 이중 가닥 DNA 서열을 절단한다. 절단을 위한 전제 조건은 표적 DNA의 하류에 보존된 프로토스페이서-인접한 모티프 (PAM)의 존재이며, 이는 일반적으로 서열 5-NGG-3을 갖지만, 덜 빈번하게는 NAG를 갖는다. 특이성은 PAM의 대략 12개 염기 상류에 있는 소위 "시드 서열"에 의해 제공되며, 이는 RNA와 표적 DNA 사이에서 일치해야 한다. Cpf1 및 Csm1은 Cas9와 유사한 방식으로 작용하지만, Cpf1 및 Csm1은 tracrRNA를 필요로 하지 않는다.
여전히 또 다른 측면에서, 제공된 담배 식물은 니코틴 데메틸라제를 코딩하는 1개 이상의 유전자좌에서 1개 이상의 돌연변이가 결여된 대조군 식물과 비교하여 감소된 양의 노르니코틴을 부여하는, 니코틴 데메틸라제를 코딩하는 1개 이상의 유전자좌 (예를 들어, CYP82E4, CYP82E5, CYP82E10)에서 1개 이상의 돌연변이를 추가로 포함한다 (미국 특허 번호 8,319,011; 8,124,851; 9,187,759; 9,228,194; 9,228,195; 9,247,706 참고). 한 측면에서, 기재된 변형된 담배 식물은 대등한 조건하에 재배하고 건조처리한 대조군 식물과 비교하여 감소된 니코틴 데메틸라제 활성을 추가로 포함한다. 추가의 측면에서, 제공된 담배 식물은 1종 이상의 항산화제의 상승된 수준을 제공하는 1개 이상의 돌연변이 또는 트랜스진을 추가로 포함한다 (미국 특허 출원 번호 15/727,523 및 PCT 출원 번호 PCT/US2017/055618 참고). 또 다른 측면에서, 제공된 담배 식물은 감소된 수준의 하나 이상의 TSNA (예컨대 N'-니트로소노르니코틴 (NNN), 4-메틸니트로소아미노-1-(3-피리딜)-1-부타논 (NNK), N'-니트로소아나타빈 (NAT) N'-니트로소아나바신 (NAB))를 제공하는 1개 이상의 돌연변이 또는 트랜스진을 추가로 포함한다.
본 개시내용은 또한 식물, 특히 니코티아나 속의 식물, 예컨대 다양한 상업적 품종의 담배 식물에서 폴리아민 생합성 또는 그의 조절에 관여하는 1개 이상의 유전자의 발현 또는 기능을 억제하는 조성물 및 방법을 제공한다.
한 측면에서, 본 개시내용은 ODC 억제 서열을 포함하는 이종성 발현 카세트를 포함하는 담배 식물 또는 그의 일부분을 제공한다. 또 다른 측면에서, 담배 식물 또는 그의 일부분은 서열식별번호: 23-28로 이루어진 군으로부터 선택된 서열 및 그의 단편과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 유전자의 억제 서열을 포함하는 이종성 발현 카세트를 포함하고, 억제 서열은 식물 세포에서 기능성인 프로모터에 작동가능하게 연결되고, 억제 서열은 서열식별번호: 23-28로 이루어진 군으로부터 선택된 서열 및 그의 단편과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 동일성을 갖는 서열의 적어도 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79 또는 80개 뉴클레오티드의 단편과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "억제하다", "억제" 및 "억제하는"은 관심 유전자 생성물 (예를 들어, 표적 유전자 생성물)의 발현 또는 기능을 감소시키는 관련 기술분야에 공지되거나 또는 본원에 기재된 임의의 방법으로서 정의된다. "억제"는 2가지 식물, 예를 들어 유전자 변경된 식물과 야생형 식물 사이의 비교의 맥락일 수 있다. 대안적으로, 표적 유전자 생성물의 발현 또는 기능의 억제는 동일한 식물 내의 식물 세포, 세포 기관, 기관, 조직, 또는 식물 부분 사이에서 또는 상이한 식물 사이에서의 비교의 맥락일 수 있으며, 동일한 식물 또는 식물 부분 내의 발달 또는 시간 단계 사이에 또는 식물 또는 식물 부분 사이에서의 비교를 포함한다. "억제"는 유전자 생성물의 기능 및 생성의 완전한 제거를 비롯하여 관심 유전자 생성물의 기능 또는 생성의 임의의 상대적인 감소를 포함한다. 용어 "억제"는 표적 유전자 생성물의 번역 및/또는 전사 또는 표적 유전자 생성물의 기능적 활성을 하향 조절하는 임의의 방법 또는 조성물을 포괄한다. 한 측면에서, 변형된 식물에서 1개 이상의 유전자의 mRNA 또는 단백질 수준은 돌연변이성이 아니거나 또는 해당 유전자의 발현을 억제하도록 유전자 변형되지 않은 식물에서 동일한 유전자의 mRNA 또는 단백질 수준의 95% 미만, 90% 미만, 80% 미만, 70% 미만, 60% 미만, 50% 미만, 40% 미만, 30% 미만, 20% 미만, 10% 미만, 5% 미만, 4% 미만, 3% 미만, 2% 미만, 또는 1% 미만이다.
용어 "억제 서열"은 식물에서 Nic1b 유전자좌로부터 니코틴 생합성에 관여하는 유전자의 발현 또는 기능을 억제할 수 있는 임의의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열, 예컨대 전장 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열, 말단 절단된 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열, 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열의 단편, 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열의 변이체, 센스-배향 뉴클레오티드 서열, 안티센스-배향 뉴클레오티드 서열, 센스- 또는 안티센스-배향 뉴클레오티드 서열의 보체, 뉴클레오티드 서열의 반전된 영역, 뉴클레오티드 서열의 헤어핀, 이중 가닥 뉴클레오티드 서열, 단일 가닥 뉴클레오티드 서열, 이들의 조합물 등을 포괄한다. 용어 "폴리뉴클레오티드 서열"에는 RNA, DNA, 화학적으로 변형된 핵산, 핵산 유사체, 이들의 조합물의 서열 등이 포함된다.
억제 서열은 표적 유전자 생성물의 명칭으로 지정된다. 따라서, "ODC 억제 서열"은, 예를 들어 전사 및/또는 번역의 수준에서, 식물에서 폴리아민 생합성 조절에 관여하는 ODC 유전자의 발현을 억제할 수 있거나, 또는 유전자 생성물의 기능을 억제할 수 있는 억제 서열을 지칭한다. 문구 "결합할 수 있는"이 폴리뉴클레오티드 억제 서열과 관련하여 사용될 때, 이는 억제 서열 자체가 억제 효과를 발휘하거나, 또는 억제 서열이 억제 뉴클레오티드 분자 (예를 들어, 헤어핀 RNA, miRNA, 또는 이중 가닥 RNA 폴리뉴클레오티드)를 코딩하거나 또는 억제 폴리펩티드 (예를 들어, 표적 유전자 생성물의 발현 또는 기능을 억제하는 폴리펩티드)를 코딩하고, 그의 전사 (예를 들어, 헤어핀 RNA, miRNA, 또는 이중 가닥 RNA 폴리뉴클레오티드를 코딩하는 억제 서열의 경우) 또는 그의 전사 및 번역 (억제 폴리펩티드를 코딩하는 억제 서열의 경우) 후에, 각각 전사된 또는 번역된 생성물이 표적 유전자 생성물에 대해 억제 효과를 발휘하는 (예를 들어, 표적 유전자 생성물의 발현 또는 기능을 억제하는) 것을 의미하는 것으로 의도된다.
개시된 ODC 억제 서열은 관련 기술분야에 공지된 임의의 침묵 경로 또는 메카니즘, 예컨대 비제한적으로, 센스 억제/공동 억제, 안티센스 억제, 이중 가닥 RNA (dsRNA) 간섭, 헤어핀 RNA 간섭 및 인트론-함유 헤어핀 RNA 간섭, 앰플리콘-매개된 간섭, 리보자임, 소형 간섭 RNA, 인공 또는 합성 마이크로RNA, 및 인공 트랜스-작용 siRNA를 통해 유전자 침묵을 촉발시키는 서열일 수 있다. ODC 억제 서열은 원하는 결과에 따라 본 개시내용의 단백질을 코딩하는 적어도 약 20개 뉴클레오티드, 약 50개 뉴클레오티드, 약 70개 뉴클레오티드, 약 100개 뉴클레오티드, 약 150개 뉴클레오티드, 약 200개 뉴클레오티드, 약 250개 뉴클레오티드, 약 300개 뉴클레오티드, 약 350개 뉴클레오티드, 약 400개 뉴클레오티드에서부터 전장 폴리뉴클레오티드까지의 범위일 수 있다. 한 측면에서, ODC 억제 서열은 약 50 내지 약 400개 뉴클레오티드, 약 70 내지 약 350개 뉴클레오티드, 약 90 내지 약 325개 뉴클레오티드, 약 90 내지 약 300개 뉴클레오티드, 약 90 내지 약 275개 뉴클레오티드, 약 100 내지 약 400개 뉴클레오티드, 약 100 내지 약 350개 뉴클레오티드, 약 100 내지 약 325개 뉴클레오티드, 약 100 내지 약 300개 뉴클레오티드, 약 125 내지 약 300개 뉴클레오티드, 또는 약 125 내지 약 275개 뉴클레오티드 길이의 단편일 수 있다.
용어 "폴리뉴클레오티드"의 사용은 본 개시내용을 DNA를 포함하는 폴리뉴클레오티드로 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 폴리뉴클레오티드가 리보뉴클레오티드, 및 리보뉴클레오티드 및 데옥시리보뉴클레오티드의 조합물을 포함한다는 것을 인식할 것이다. 이러한 데옥시리보뉴클레오티드 및 리보뉴클레오티드에는 천연 발생 분자 및 합성 유사체 둘 다 포함된다. 본 개시내용의 폴리뉴클레오티드는 단일 가닥 형태, 이중 가닥 형태, 헤어핀, 줄기-및-루프 구조 등을 비롯하여 이로 제한되지 않는 서열의 모든 형태를 포괄한다.
한 측면에서, 본 개시내용은 담배 세포에서 기능성이고, 서열식별번호: 23 내지 28로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열 및 그의 단편과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 RNA에 결합할 수 있는 RNA 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 재조합 DNA 구축물을 제공하며, 여기서 RNA 분자는 폴리펩티드의 발현을 억제한다. 한 측면에서, RNA 분자는 마이크로RNA, siRNA, 및 트랜스-작용 siRNA로 이루어진 군으로부터 선택된다. 또 다른 측면에서, 재조합 DNA 구축물은 이중 가닥 RNA를 코딩한다. 또한, 이들 재조합 DNA 구축물을 포함하는 트랜스제닉 담배 식물 또는 그의 일부분, 건조처리된 담배 물질, 또는 담배 제품이 제공된다. 한 측면에서, 이들 트랜스제닉 식물, 건조처리된 담배 물질, 또는 담배 제품은 재조합 DNA 구축물이 없는 대조군 담배 식물과 비교하여 보다 낮은 수준의 니코틴을 포함한다. 추가로, 담배 식물을 임의의 이들 재조합 DNA 구축물로 형질전환시키는 것을 포함하는, 담배 식물의 니코틴 수준을 감소시키는 방법이 제공된다.
본원에 사용된 바와 같이, "작동가능하게 연결된"은 2개 이상의 요소들 사이의 기능적 연결을 지칭한다. 예를 들어, 관심 폴리뉴클레오티드와 조절 서열 (예를 들어, 프로모터) 사이의 기능적 연결은 관심 폴리뉴클레오티드의 발현을 가능하게 하는 기능적 연결이다. 작동가능하게 연결된 요소들은 연속적이거나 비연속적일 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이 서열과 관련하여 사용될 때, "이종성"은 외래 종으로부터 기원하거나, 또는 동일한 종으로부터인 경우에는 의도적인 인간 개입에 의해 조성물 및/또는 게놈 위치에서 그의 본래 형태로부터 실질적으로 변형된 형태인 서열을 지칭한다. 상기 용어는 또한 핵산 구축물에도 적용되며, 본원에서 "폴리뉴클레오티드 구축물" 또는 "뉴클레오티드 구축물"로도 지칭된다. 이러한 방식으로, "이종성" 핵산 구축물은 외래 종으로부터 기원하거나, 또는 동일한 종으로부터인 경우에는 의도적인 인간 개입에 의해 조성물 및/또는 게놈 위치에서 그의 본래 형태로부터 실질적으로 변형된 형태인 구축물을 의미하는 것으로 의도된다. 이종성 핵산 구축물에는 예를 들어 트랜스제닉 식물의 또 다른 관심 식물로의 형질전환 방법 또는 후속적인 육종을 통해, 식물 또는 그의 식물 부분에 도입된 재조합 뉴클레오티드 구축물이 포함되나 이로 제한되지 않는다. 한 측면에서, 사용된 프로모터는 프로모터에 의해 유도된 서열에 대해 이종성이다. 또 다른 측면에서, 사용된 프로모터는 담배에 대해 이종성이다. 추가의 측면에서, 사용된 프로모터는 담배 고유의 것이다.
한 측면에서, 기재된 변형된 담배 식물은 시스제닉 식물이다. 본원에 사용된 바와 같이, "시스제네시스(cisgenesis)" 또는 "시스제닉"은 모든 성분 (예를 들어, 프로모터, 공여자 핵산, 선택 유전자)이 오직 식물 기원인 (즉, 식물 기원이 아닌 성분은 사용되지 않음) 식물, 식물 세포, 또는 식물 게놈의 유전자 변형을 지칭한다. 한 측면에서, 제공된 변형된 식물, 식물 세포, 또는 식물 게놈은 시스제닉이다. 제공된 시스제닉 식물, 식물 세포, 및 식물 게놈은 즉사 사용가능한 담배 계통으로 이어질 수 있다. 또 다른 측면에서, 제공된 변형된 담배 식물은 비-담배 유전 물질 또는 서열을 포함하지 않는다.
본원에 사용된 바와 같이, "유전자 발현"은 유전자 생성물의 전사 및/또는 번역을 비롯하여 유전자 생성물의 생합성 또는 생성을 지칭한다.
한 측면에서, 재조합 DNA 구축물 또는 발현 카세트는 또한 트랜스제닉 세포의 선택을 위해 선택가능한 마커 유전자를 포함할 수 있다. 선택가능한 마커 유전자에는 항생제 내성을 코딩하는 유전자, 예컨대 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 II (NEO) 및 히그로마이신 포스포트랜스퍼라제 (HPT)를 코딩하는 것들, 뿐만 아니라 제초제 화합물, 예컨대 글루포시네이트 암모늄, 브로목시닐, 이미다졸리논, 및 2,4-디클로로페녹시아세테이트 (2,4-D)에 대한 내성을 부여하는 유전자가 포함되나 이로 제한되지 않는다. 추가의 선택가능한 마커에는 표현형 마커, 예컨대 β-갈락토시다제 및 형광 단백질, 예컨대 녹색 형광 단백질 (GFP)이 포함된다.
한 측면에서, 재조합 DNA 구축물 또는 발현 카세트는 구성적 프로모터, 유도성 프로모터, 및 조직-선호적인 프로모터 (예를 들어, 잎-특이적인 또는 뿌리-특이적인 프로모터)로 이루어진 군으로부터 선택된 프로모터를 포함한다. 예시적인 구성적 프로모터에는 Rsyn7 프로모터의 코어 프로모터 및 미국 특허 번호 6,072,050에 개시된 다른 구성적 프로모터; 코어 CaMV 35S 프로모터 (Odell et al. (1985) Nature 313:810-812); 유비퀴틴 (Christensen et al. (1989) Plant Mol. Biol. 12:619-632 및 Christensen et al. (1992) Plant Mol. Biol. 18:675-689); pEMU (Last et al. (1991) Theor. Appl. Genet. 81:581-588); MAS (Velten et al. (1984) EMBO J 3:2723-2730); ALS 프로모터 (미국 특허 번호 5,659,026) 등이 포함된다. 예시적인 화학-유도성 프로모터에는 살리실산에 의해 활성화되는 담배 PR-1a 프로모터가 포함된다. 다른 관심 화학-유도성 프로모터에는 스테로이드-반응성 프로모터 (예를 들어, [Schena et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:10421-10425 및 McNellis et al. (1998) Plant J. 14(2):247-257]에 기재된 글루코코르티코이드-유도성 프로모터 참고) 및 테트라시클린-유도성 프로모터 (예를 들어, [Gatz et al. (1991) Mol. Gen. Genet. 227:229-237], 및 미국 특허 번호 5,814,618 및 5,789,156 참고)가 포함된다. 사용될 수 있는 추가의 예시적인 프로모터는 열-조절된 유전자 발현, 빛-조절된 유전자 발현 (예를 들어, 완두콩 rbcS-3A; 옥수수 rbcS 프로모터; 완두콩에서 발견되는 엽록소 alb-결합 단백질 유전자; 또는 Arabssu 프로모터), 호르몬-조절된 유전자 발현 (예를 들어, 밀의 Em 유전자로부터의 아브시스산 (ABA) 반응성 서열; ABA-유도성 HVA1 및 HVA22, 및 보리 및 아라비돕시스(Arabidopsis)의 rd29A 프로모터); 및 상처-유도된 유전자 발현 (예를 들어, wunl), 기관 특이적인 유전자 발현 (예를 들어, 괴경-특이적인 저장 단백질 유전자; 기재된 옥수수로부터의 23-kDa 제인 유전자; 또는 강낭콩(French bean) (ß-파세올린 유전자), 또는 병원체-유도성 프로모터 (예를 들어, PR-1, prp-1 또는 (ß-1,3 글루카나제 프로모터, 밀의 진균-유도성 wirla 프로모터, 및 선충-유도성 프로모터, 각각 담배 및 파슬리의 TobRB7-5A 및 Hmg-1)을 담당하는 것들이다.
한 측면에서, 제공된 담배 식물은 니코틴 생합성 또는 수송에 관여하는 유전자의 활성의 증가된 또는 감소된 발현을 추가로 포함한다. 니코틴 생합성에 관여하는 유전자에는 아르기닌 데카르복실라제 (ADC), 메틸푸트레신 옥시다제 (MPO), NADH 데히드로게나제, 오르니틴 데카르복실라제 (ODC), 포스포리보실안트라닐레이트 아이소머라제 (PRAI), 푸트레신 N-메틸트랜스퍼라제 (PMT), 퀴놀레이트 포스포리보실 트랜스퍼라제 (QPT), 및 S-아데노실-메티오닌 신테타제 (SAMS)가 포함되나 이로 제한되지 않는다. 니코틴산 유도체와 메틸피롤리듐 양이온 사이의 축합 단계를 촉매하는 니코틴 신타제는 2가지 후보 유전자 (A622 및 NBB1)가 제안되었지만 아직 밝혀지지 않았다. US 2007/0240728 A1 및 US 2008/ 0120737A1을 참고한다. A622는 이소플라본 리덕타제-유사 단백질을 코딩한다. 또한, 몇몇 트랜스포터는 니코틴의 전위에 관여할 수 있다. 트랜스포터 유전자, 즉, MATE가 클로닝되고 특징분석되었다 (Morita et al., PNAS 106:2447-52 (2009)).
한 측면에서, 제공된 담배 식물은 대조군 담배 식물과 비교하여 PMT, MPO, QPT, ADC, ODC, PRAI, SAMS, BBL, MATE, A622, 및 NBB1로 이루어진 군으로부터 선택된 생성물을 코딩하는 1개 이상의 유전자의 mRNA, 단백질, 또는 이들 둘 다의 증가된 또는 감소된 수준을 추가로 포함한다. 또 다른 측면에서, 제공된 담배 식물은 PMT, MPO, QPT, ADC, ODC, PRAI, SAMS, BBL, MATE, A622, 및 NBB1로 이루어진 군으로부터 선택된 생성물을 코딩하는 1개 이상의 유전자의 발현을 직접적으로 억제하는 트랜스진을 추가로 포함한다. 또 다른 측면에서, 제공된 담배 식물은 PMT, MPO, QPT, ADC, ODC, PRAI, SAMS, BBL, MATE, A622, 및 NBB1로 이루어진 군으로부터 선택된 생성물을 코딩하는 1개 이상의 유전자의 발현 또는 활성을 억제하는 트랜스진 또는 돌연변이를 추가로 포함한다. 또 다른 측면에서, 제공된 담배 식물은 PMT, MPO, QPT, ADC, ODC, PRAI, SAMS, BBL, MATE, A622, 및 NBB1로 이루어진 군으로부터 선택된 생성물을 코딩하는 1개 이상의 유전자를 과발현하는 트랜스진을 추가로 포함한다.
관련 기술분야에 공지된 임의의 적합한 형질전환 방법을 이용하여 담배 식물을 기재된 재조합 구축물 또는 발현 카세트로 형질전환시키는 것 또한 개시된다. 폴리뉴클레오티드 서열을 담배 식물에 도입시키는 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있으며, 안정한 형질전환 방법, 일시적인 형질전환 방법, 및 바이러스-매개된 방법에 포함되나 이로 제한되지 않는다. "안정한 형질전환"은 식물에 도입된 관심 뉴클레오티드 구축물을 식물의 게놈에 통합시키는 형질전환을 지칭하며, 그의 자손에 의해 유전될 수 있다. "일시적인 형질전환"은 서열이 식물에 도입되고, 식물에서 일시적으로만 발현되거나 또는 일시적으로만 존재하는 것을 의미하는 것으로 의도된다.
폴리뉴클레오티드를 본 개시내용의 식물 세포에 도입시키는 적합한 방법에는 미량주사 (Crossway et al. (1986) Biotechniques 4:320-334), 전기천공 (Shillito et al. (1987) Meth. Enzymol. 153:313-336; Riggs et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:5602-5606), 아그로박테리움(Agrobacterium)-매개된 형질전환 (미국 특허 번호 5,104,310, 5,149,645, 5,177,010, 5,231,019, 5,463,174, 5,464,763, 5,469,976, 4,762,785, 5,004,863, 5,159,135, 5,563,055, 및 5,981,840), 직접적인 유전자 전달 (Paszkowski et al. (1984) EMBO J. 3:2717-2722), 및 탄도 입자 가속화 (예를 들어, 미국 특허 번호 4,945,050, 5,141,131, 5,886,244, 5,879,918, 및 5,932,782; [Tomes et al. (1995) in Plant Cell, Tissue, and Organ Culture Fundamental Methods, ed. Gamborg and Phillips (Springer-Verlag, Berlin); McCabe et al. (1988) Biotechnology 6:923-926] 참고)가 포함된다. 또한, [Weissinger et al. (1988) Ann. Rev. Genet. 22:421-477; Christou et al. (1988) Plant Physiol. 87:671-674 (soybean); McCabe et al. (1988) Bio/Technology 6:923-926 (soybean); Finer and McMullen (1991) In Vitro Cell Dev. Biol. 27P: 175-182 (soybean); Singh et al. (1998) Theor. Appl. Genet. 96:319-324 (soybean); De Wet et al. (1985) in The Experimental Manipulation of Ovule Tissues, ed. Chapman et al. (Longman, N.Y.), pp. 197-209 (pollen); Kaeppler et al. (1990) Plant Cell Reports 9:415-418 and Kaeppler et al. (1992) Theor. Appl. Genet. 84:560-566 (whisker-mediated transformation); D'Halluin et al. (1992) Plant Cell 4:1495-1505 (electroporation)]을 참고한다.
또 다른 측면에서, 식물을 바이러스 또는 바이러스 핵산과 접촉시킴으로써 식물에 재조합 구축물 또는 발현 카세트를 도입시킬 수 있다. 일반적으로, 이러한 방법은 본 개시내용의 발현 카세트를 바이러스 DNA 또는 RNA 분자 내에 포함시키는 것을 수반한다. 발현 카세트에서 사용하기 위한 프로모터는 또한 바이러스 RNA 폴리머라제에 의한 전사에 이용되는 프로모터를 포괄하는 것으로 인식된다. 폴리뉴클레오티드를 식물에 도입시키고, 바이러스 DNA 또는 RNA 분자를 비롯하여 그에 코딩된 단백질을 발현시키는 방법이 관련 기술분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 미국 특허 번호 5,889,191, 5,889,190, 5,866,785, 5,589,367, 5,316,931, 및 [Porta et al. (1996) Molecular Biotechnology 5:209-221]을 참고한다.
기관발생이건 배발생이건 간에 클론 방법을 이용하여 후속적으로 증식될 수 있는 임의의 식물 조직을 재조합 구축물 또는 발현 카세트에 의해 형질전환시킬 수 있다. "기관발생"이란, 새싹 및 뿌리가 분열조직 중심으로부터 순차적으로 발달하는 과정인 것으로 의도된다. "배발생"이란, 새싹 및 뿌리가 체세포이건 생식세포이건 간에 동시 방식으로 (순차적이지 않음) 함께 발달하는 과정인 것으로 의도된다. 기재된 다양한 형질전환 프로토콜에 대해 적합한 예시적인 조직에는 캘러스 조직, 기존 분열조직 (예를 들어, 정단 분열조직, 곁눈, 및 뿌리 분열조직) 및 유도된 분열조직 (예를 들어, 자옆 분열조직 및 배축 분열조직), 배축, 자옆, 잎 디스크, 화분, 배아 등이 포함되나 이로 제한되지 않는다.
한 측면에서, 제공된 담배 식물은 열-건조처리된 담배, 공기-건조처리된 담배, 진한 공기-건조처리된 담배, 진한 불-건조처리된 담배, 갈파오(Galpao) 담배, 및 오리엔탈(Oriental) 담배로 이루어진 군으로부터 선택된 담배 유형으로부터의 것이다. 또 다른 측면에서, 제공된 담배 식물은 버어리 담배, 메릴랜드(Maryland) 담배, 및 진한 담배로 이루어진 군으로부터 선택된 담배 유형으로부터의 것이다.
한 측면에서, 제공된 담배 식물은 열-건조처리된 담배 백그라운드를 갖거나, 또는 본원에 기재된 하나 이상의 열-건조처리된 담배 특징을 나타낸다. 열-건조처리된 담배 (버지니아(Virginia) 또는 연한 담배로도 불림)는 전세계 담배 생산의 대략 40%를 차지한다. 열-건조처리된 담배는 건조처리 동안에 도달하는 금빛 황색 내지 짙은 오렌지색 때문에 종종 "연한 담배"로도 지칭된다. 열-건조처리된 담배는 가볍고 연한 향 및 맛을 갖는다. 열-건조처리된 담배는 일반적으로 당이 많고, 유분이 적다. 주요 열-건조처리된 담배 재배 국가는 아르헨티나, 브라질, 중국, 인도, 탄자니아 및 미국이다. 한 측면에서, 제공된 저-알칼로이드 또는 저-니코틴 담배 식물 또는 종자는 CC 13, CC 27, CC 33, CC 37, CC 65, CC 67, CC 700, GF 318, GL 338, GL 368, GL 939, K 346, K 399, K326, NC 102, NC 196, NC 291, NC 297, NC 299, NC 471, NC 55, NC 606, NC 71, NC 72, NC 92, PVH 1118, PVH 1452, PVH 2110, 스파이트 168, 스파이트 220, 스파이트 225, 스파이트 227, 스파이트 236으로 이루어진 군으로부터 선택된 열-건조처리된 담배 백그라운드, 및 상기 품종 중 어느 하나로부터 본질적으로 유래된 임의의 품종을 갖는다. 또 다른 측면에서, 제공된 저-알칼로이드 또는 저-니코틴 담배 식물 또는 종자는 코커(Coker) 48, 코커 176, 코커 371-골드, 코커 319, 코커 347, GL 939, K 149, K326, K 340, K 346, K 358, K 394, K 399, K 730, NC 27NF, NC 37NF, NC 55, NC 60, NC 71, NC 72, NC 82, NC 95, NC 297, NC 606, NC 729, NC 2326, 맥네어(McNair) 373, 맥네어 944, Ox 207, Ox 414 NF, 레암스(Reams) 126, 레암스 713, 레암스 744, RG 8, RG 11, RG 13, RG 17, RG 22, RG 81, RG H4, RG H51, 스파이트 H-20, 스파이트 G-28, 스파이트 G-58, 스파이트 G-70, 스파이트 G-108, 스파이트 G-111, 스파이트 G-117, 스파이트 168, 스파이트 179, 스파이트 NF-3, Va 116, Va 182로 이루어진 군으로부터 선택된 열-건조처리된 담배 백그라운드, 및 상기 품종 중 어느 하나로부터 본질적으로 유래된 임의의 품종을 갖는다. WO 2004/041006 A1을 참고한다. 추가의 측면에서, 저-알칼로이드 또는 저-니코틴 담배 식물, 종자, 잡종, 품종 또는 계통은 K326, K346, 및 NC196으로 이루어진 군으로부터 선택된 임의의 열 건조처리된 백그라운드를 갖는다.
한 측면에서, 제공된 담배 식물은 공기-건조처리된 담배 백그라운드를 갖거나 또는 본원에 기재된 하나 이상의 공기-건조처리된 담배 특징을 나타낸다. 공기-건조처리된 담배에는 버어리, 메릴랜드 및 진한 담배가 포함된다. 일반적인 인자는 건조처리가 주로 열 및 습도의 인공적인 공급이 없다는 것이다. 버어리 담배는 연한 내지 진한 갈색을 갖고, 유분이 많고, 당이 적다. 버어리 담배는 헛간에서 공기-건조처리된다. 주요 버어리 재배 국가는 아르헨티나, 브라질, 이탈리아, 말라위 및 미국이다. 메릴랜드 담배는 매우 푹신하고, 양호한 연소 성질, 낮은 니코틴 및 중성 향을 갖는다. 주요 메릴랜드 재배 국가에는 미국 및 이탈리아가 포함된다. 한 측면에서, 제공된 저-알칼로이드 또는 저-니코틴 담배 식물 또는 종자는 클레이(Clay) 402, 클레이 403, 클레이 502, Ky 14, Ky 907, Ky 910, Ky 8959, NC 2, NC 3, NC 4, NC 5, NC 2000, TN 86, TN 90, TN 97, R 610, R 630, R 711, R 712, NCBH 129, Bu 21xKy 10, HB04P, Ky 14xL 8, Kt 200, 뉴턴(Newton) 98, 페디고(Pedigo) 561, Pf561 및 Va 509로 이루어진 군으로부터 선택된 버어리 담배 백그라운드를 갖는다. 추가의 측면에서, 저-알칼로이드 또는 저-니코틴 담배 식물, 종자, 잡종, 품종 또는 계통은 TN 90, KT 209, KT 206, KT212, 및 HB 4488로 이루어진 군으로부터 선택된 임의의 버어리 백그라운드를 갖는다. 또 다른 측면에서, 제공된 저-알칼로이드 또는 저-니코틴 담배 식물 또는 종자는 Md 10, Md 40, Md 201, Md 609, Md 872 및 Md 341로 이루어진 군으로부터 선택된 메릴랜드 담배 백그라운드를 갖는다.
한 측면에서, 제공된 담배 식물은 진한 공기-건조처리된 담배 백그라운드를 갖거나 또는 본원에 기재된 하나 이상의 진한 공기-건조처리된 담배 특징을 나타낸다. 진한 공기-건조처리된 담배는 진한 공기-건조처리된 담배에 그의 중간 내지 진한 갈색 및 구별되는 향을 제공하는 그의 건조처리 과정에 의해 주로 다른 유형과 구별된다. 진한 공기-건조처리된 담배는 씹는 담배 및 스너프의 제조에서 주로 사용된다. 한 측면에서, 제공된 저-알칼로이드 또는 저-니코틴 담배 식물 또는 종자는 수마트라(Sumatra), 자팀(Jatim), 도미니칸 쿠바노(Dominican Cubano), 베수키(Besuki), 온 서커(One sucker), 그린 리버(Green River), 버지니아 일광-건조처리, 및 파라구안 파싸도(Paraguan Passado)로 이루어진 군으로부터 선택된 진한 공기-건조처리된 담배 백그라운드를 갖는다.
한 측면에서, 제공된 담배 식물은 진한 불-건조처리된 담배 백그라운드를 갖거나 또는 본원에 기재된 하나 이상의 진한 불-건조처리된 담배 특징을 나타낸다. 진한 불-건조처리된 담배는 일반적으로 밀폐된 건조처리 헛간의 바닥에서 저연소성 장작불에 의해 건조처리된다. 그들의 잎은 당 함량이 낮지만 니코틴 함량이 높다. 진한 불-건조처리된 담배는 파이프 블렌드, 궐련, 씹는 담배, 스너프 및 강한 맛 시가를 제조하기 위해 사용된다. 진한 불-건조처리된 담배에 대한 주요 재배 지역은 미국 테네시주, 켄터키주 및 버지니아주이다. 한 측면에서, 제공된 저-알칼로이드 또는 저-니코틴 담배 식물 또는 종자는 내로우 리프 마돌(Narrow Leaf Madole), 개선된 마돌, 톰 로쓴 마돌(Tom Rosson Madole), 뉴턴 VH 마돌, 리틀 크리텐든(Little Crittenden), 그린 우드(Green Wood), 리틀 우드(Little Wood), 스몰 스톡 블랙 매머드(Small Stalk Black Mammoth), DT 508, DT 518, DT 592, KY 171, DF 911, DF 485, TN D94, TN D950, VA 309, 및 VA 359로 이루어진 군으로부터 선택된 진한 불-건조처리된 담배 백그라운드를 갖는다.
한 측면에서, 제공된 담배 식물은 오리엔탈 담배 백그라운드를 갖거나 또는 하나 이상의 오리엔탈 담배 특징을 나타낸다. 오리엔탈 담배는 전형적으로 터키, 그리스, 불가리아, 마케도니아, 시리아, 레바논, 이탈리아 및 루마니아와 같은 지중해 동부 지역에서 재배되기 때문에, 이들은 그리스, 아로마 및 터키 담배로도 지칭된다. 오늘날 오리엔탈 품종의 특징인 작은 식물 및 잎 크기, 뿐만 아니라 그의 독특한 향 성질은 지난 수 세기에 걸쳐 발달한 열악한 토양 및 스트레스성 기후 조건에 대한 식물의 적응 결과이다. 한 측면에서, 제공된 저-알칼로이드 또는 저-니코틴 담배 식물 또는 종자는 이즈미르(Izmir), 카테리니(Katerini), 삼순(Samsun), 베스마(Basma) 및 크루모브그라드(Krumovgrad), 트라브존(Trabzon), 테살리안(Thesalian), 타소바(Tasova), 시놉(Sinop), 이즈미트(Izmit), 헨덱(Hendek), 에디르네(Edirne), 셈딘리(Semdinli), 아미얀만(Adiyanman), 예일라닥(Yayladag), 이스켄데룬(Iskenderun), 두즈세(Duzce), 마케도니안(Macedonian), 마브라(Mavra), 프릴렙(Prilep), 바프라(Bafra), 부르사(Bursa), 부칵(Bucak), 비틀리스(Bitlis), 발리케시르(Balikesir)로 이루어진 군으로부터 선택된 오리엔탈 담배 백그라운드, 및 상기 품종 중 어느 하나로부터 본질적으로 유래된 임의의 품종을 갖는다.
한 측면에서, 저-알칼로이드 또는 저-니코틴 담배 식물, 종자, 잡종, 품종 또는 계통은 본질적으로 BU 64, CC 101, CC 200, CC 27, CC 301, CC 400, CC 500, CC 600, CC 700, CC 800, CC 900, 코커 176, 코커 319, 코커 371 골드, 코커 48, CU 263, DF911, 갈파오 담배, GL 26H, GL 350, GL 600, GL 737, GL 939, GL 973, HB 04P, K 149, K 326, K 346, K 358, K394, K 399, K 730, KDH 959, KT 200, KT204LC, KY 10, KY 14, KY 160, KY 17, KY 171, KY 907, KY907LC, KTY14 x L8 LC, 리틀 크리텐든, 맥네어 373, 맥네어 944, msKY 14xL8, 내로우 리프 마돌, NC 100, NC 102, NC 2000, NC 291, NC 297, NC 299, NC 3, NC 4, NC 5, NC 6, NC7, NC 606, NC 71, NC 72, NC 810, NC BH 129, NC 2002, 닐 스미쓰(Neal Smith) 마돌, OXFORD 207, '페리큐(Perique)' 담배, PVH03, PVH09, PVH19, PVH50, PVH51, R 610, R 630, R 7-11, R 7-12, RG 17, RG 81, RG H51, RGH 4, RGH 51, RS 1410, 스파이트 168, 스파이트 172, 스파이트 179, 스파이트 210, 스파이트 220, 스파이트 225, 스파이트 227, 스파이트 234, 스파이트 G-28, 스파이트 G-70, 스파이트 H-6, 스파이트 H20, 스파이트 NF3, TI 1406, TI 1269, TN 86, TN86LC, TN 90, TN 97, TN97LC, TN D94, TN D950, TR (톰 로슨) 마돌, VA 309, 또는 VA359, 메릴랜드 609, HB3307PLC, HB4488PLC, KT206LC, KT209LC, KT210LC, KT212LC, R610LC, PVH2310, NC196, KTD14LC, KTD6LC, KTD8LC, PD7302LC, PD7305LC, PD7309LC, PD7318LC, PD7319LC, PD7312LC, ShireyLC의 유전적 백그라운드, 또는 관련 기술분야에 공지된 표준 담배 육종에 따른 임의의 상업적인 담배 품종으로부터 유래되거나 또는 그를 갖는다.
진한 공기-건조처리된, 버어리, 메릴랜드, 진한 불-건조처리된 또는 오리엔탈 유형의 상기 언급된 모든 특이적 품종은 단지 예시적인 목적을 위해 나열된다. 임의의 추가의 진한 공기-건조처리된, 버어리, 메릴랜드, 진한 불-건조처리된, 오리엔탈 품종 또한 본 출원에서 고려된다.
기재된 담배 식물의 집단 또한 제공된다. 한 측면에서, 담배 식물의 집단은 에이커당 약 5,000 내지 약 8000, 약 5,000 내지 약 7,600, 약 5,000 내지 약 7,200, 약 5,000 내지 약 6,800, 약 5,000 내지 약 6,400, 약 5,000 내지 약 6,000, 약 5,000 내지 약 5,600, 약 5,000 내지 약 5,200, 약 5,200 내지 약 8,000, 약 5,600 내지 약 8,000, 약 6,000 내지 약 8,000, 약 6,400 내지 약 8,000, 약 6,800 내지 약 8,000, 약 7,200 내지 약 8,000, 또는 약 7,600 내지 약 8,000개 식물의 식재 밀도를 갖는다. 또 다른 측면에서, 담배 식물의 집단은 낮은 내지 중간 비옥도를 갖는 토양 유형에 있다.
기재된 담배 식물로부터의 종자의 컨테이너 또한 제공된다. 본 개시내용의 담배 종자의 컨테이너는 임의의 개수, 중량 또는 부피의 종자를 함유할 수 있다. 예를 들어, 컨테이너는 적어도 약 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000개 이상의 종자 또는 이들 초과를 함유할 수 있다. 대안적으로, 컨테이너는 적어도 약 1 온스, 5 온스, 10 온스, 1 파운드, 2 파운드, 3 파운드, 4 파운드, 5 파운드 이상의 종자 또는 이들 초과를 함유할 수 있다. 담배 종자의 컨테이너는 관련 기술분야에서 입수가능한 임의의 컨테이너일 수 있다. 비제한적인 예로서, 컨테이너는 박스, 백, 패킷, 파우치, 테이프 롤, 튜브 또는 보틀일 수 있다.
기재된 저-알칼로이드 또는 저-니코틴 담배 식물로부터 제조된 건조처리된 담배 물질 또한 제공된다. 보다 높은 수준의 총 알칼로이드 또는 니코틴을 갖는 기재된 담배 식물로부터 제조된 건조처리된 담배 물질을 추가로 제공한다.
"건조처리"는 수분을 감소시키고 엽록소를 파괴하여 담배 잎에 금색을 제공하고 전분을 당으로 전환시키는 노화 과정이다. 따라서, 건조처리된 담배는 수확된 녹색 잎에 비해 보다 높은 환원당 함량 및 보다 낮은 전분 함량을 갖는다. 한 측면에서, 제공된 녹색 잎 담배는 통상적인 수단을 이용하여 건조처리될 수 있으며, 예를 들어 열-건조처리, 헛간-건조처리, 불-건조처리, 공기-건조처리 또는 일광-건조처리될 수 있다. 예를 들어, 상이한 유형의 건조처리 방법의 기재에 대해 [Tso (1999, Chapter 1 in Tobacco, Production, Chemistry and Technology, Davis & Nielsen, eds., Blackwell Publishing, Oxford)]를 참고한다. 건조처리된 담배는 일반적으로 목재 드럼 (예를 들어, 혹스헤드) 또는 판지 곽에서 압축된 조건하에 수년 동안 (예를 들어, 2 내지 5년) 10% 내지 약 25% 범위의 수분 함량에서 숙성된다. 미국 특허 번호 4,516,590 및 5,372,149를 참고한다. 이어서, 건조처리된 및 숙성된 담배를 추가로 가공할 수 있다. 추가의 가공에는 다양한 온도에서 증기를 도입하거나 하지 않고 진공하에 담배 컨디셔닝, 저온살균 및 발효가 포함된다. 발효는 전형적으로 높은 초기 수분 함량, 열 발생, 및 건조 중량의 10 내지 20% 손실을 특징으로 한다. 예를 들어, 미국 특허 번호 4,528,993, 4,660,577, 4,848,373, 5,372,149; 미국 공개 번호 2005/0178398; 및 [Tso (1999, Chapter 1 in Tobacco, Production, Chemistry and Technology, Davis & Nielsen, eds., Blackwell Publishing, Oxford)]를 참고한다. 건조처리되고, 숙성되고, 발효된 담배를 추가로 가공할 수 있다 (예를 들어, 절단, 썰기, 확장, 또는 블렌딩). 예를 들어, 미국 특허 번호 4,528,993; 4,660,577; 및 4,987,907을 참고한다. 한 측면에서, 본 개시내용의 건조처리된 담배 물질은 일광-건조처리된다. 또 다른 측면에서, 본 개시내용의 건조처리된 담배 물질은 열-건조처리, 공기-건조처리 또는 불-건조처리된다.
본 개시내용의 담배 계통, 품종 또는 잡종으로부터 수득된 담배 물질을 이용하여 담배 제품을 제조할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, "담배 제품"은 인간 사용 또는 소비를 위해 의도된 담배로부터 제조되거나 유래된 임의의 제품으로 정의된다.
제공된 담배 제품에는 비제한적으로 궐련 제품 (예를 들어, 궐련 및 비디(bidi) 궐련), 시가 제품 (예를 들어, 시가 랩핑 담배 및 시가릴로), 파이프 담배 제품, 담배로부터 유래된 제품, 담배-유래된 니코틴 제품, 무연 담배 제품 (예를 들어, 습식 스너프, 건식 스너프, 및 씹는 담배), 필름, 츄어블, 탭, 성형된 부품, 겔, 소모품, 불용성 매트릭스, 중공 형태, 재구성된 담배, 확장된 담배 등이 포함된다. 예를 들어, 미국 특허 공개 번호 US 2006/0191548을 참고한다.
본원에 사용된 바와 같이, "궐련"은 "막대" 및 "충전제"를 갖는 담배 제품을 지칭한다. 궐련 "막대"는 궐련 페이퍼, 필터, 플러그 랩 (여과 물질을 함유하기 위해 사용됨), 궐련 페이퍼 (충전제 포함)를 필터에 고정하는 팁핑 페이퍼, 및 이들 성분들을 함께 고정하는 모든 접착제를 포함한다. "충전제"는 (1) 모든 담배, 예컨대 비제한적으로 재구성된 및 확장된 담배, (2) 비-담배 대체물 (예컨대 비제한적으로, 궐련 페이퍼 내에 감긴 담배에 수반될 수 있는 허브, 비-담배 식물 물질 및 다른 향신료), (3) 케이싱, (4) 향료, 및 (5) 모든 다른 첨가제 (담배 및 대체물에 혼합되고, 궐련 내에 감겨 있음)를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, "재구성된 담배"는 담배 가루 및 다른 담배 스크랩 물질로부터 제조되고, 시트 형태로 가공되고, 담배와 닮은 스트립으로 절단되는 담배 충전제의 일부를 지칭한다. 비용 절감 외에도, 재구성된 담배는 암모니아와 당 사이의 반응을 이용하여 풍미를 발달시켜 궐련 맛에 기여한다는 점에서 매우 중요하다.
본원에 사용된 바와 같이, "확장된 담배"는 담배가 "팽창"하여 감소된 밀도 및 더 큰 충전 용량을 생성하도록 적합한 기체의 확장을 통해 가공된 담배 충전제의 일부를 지칭한다. 이는 궐련에 사용된 담배의 중량을 감소시킨다.
본 개시내용의 식물로부터 유래된 담배 제품에는 또한 궐련 및 다른 흡연 물품, 특히 필터 요소를 포함하는 이들 흡연 물품이 포함되며, 흡연가능한 물질의 막대는 담배 블렌드 내에 건조처리된 담배를 포함한다. 한 측면에서, 본 개시내용의 담배 제품은 시가릴로, 비환기식 리세스 필터 궐련, 통기식 리세스 필터 궐련, 시가, 스너프, 파이프 담배, 시가 담배, 궐련 담배, 씹는 담배, 잎 담배, 후카 담배, 썰은 담배, 및 절단 담배로 이루어진 군으로부터 선택된다. 또 다른 측면에서, 본 개시내용의 담배 제품은 무연 담배 제품이다. 무연 담배 제품은 연소되지 않으며, 씹는 담배, 습식 무연 담배, 스누스, 및 건식 스너프가 포함되나 이로 제한되지 않는다. 씹는 담배는 전형적으로 큰 파우치-유사 팩키지에 포장되고 플러그 또는 트위스트로 사용되는 굵게 분할된 담배 잎이다. 습식 무연 담배는 느슨한 형태 또는 파우치 형태로 제공되고, 전형적으로 원형 캔에 포장되고, 성인용 담배 소비자의 뺨과 잇몸 사이에 놓이는 핀치 또는 파우치로서 사용되는, 습식의 더욱 미세하게 분할된 담배이다. 스누스는 열 처리된 무연 담배이다. 건식 스너프는 입에 놓이거나 또는 코로 사용되는 미세하게 분쇄된 담배이다. 추가의 측면에서, 본 개시내용의 담배 제품은 루즈 리프 씹는 담배, 플러그 씹는 담배, 습식 스너프, 및 비강 스너프로 이루어진 군으로부터 선택된다. 여전히 또 다른 측면에서, 본 개시내용의 담배 제품은 전자 가열 궐련, 전자 궐련, 전자 기화 장치로 이루어진 군으로부터 선택된다.
한 측면에서, 본 개시내용의 담배 제품은 블렌딩된 담배 제품일 수 있다. 한 측면에서, 블렌딩된 담배 제품은 건조처리된 담배 물질을 포함한다. 한 측면에서, 건조처리된 담배 물질은 중량 기준으로 담배 블렌드에서 건조처리된 담배의 약 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%를 구성한다. 한 측면에서, 건조처리된 담배 물질은 부피 기준으로 담배 블렌드에서 건조처리된 담배의 약 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%를 구성한다.
한 측면에서, 본 개시내용의 담배 제품은 저-니코틴 담배 제품일 수 있다. 추가의 측면에서, 본 개시내용의 담배 제품은 약 3 mg/g 미만의 수준으로 노르니코틴을 포함할 수 있다. 예를 들어, 이러한 제품에서 노르니코틴 함량은 약 3.0 mg/g, 2.5 mg/g, 2.0 mg/g, 1.5 mg/g, 1.0 mg/g, 750 μg/g, 500 pg/g, 250 pg/g, 100 pg/g, 75 pg/g, 50 pg/g, 25 pg/g, 10 pg/g, 7.0 pg/g, 5.0 pg/g, 4.0 pg/g, 2.0 pg/g, 1.0 pg/g, 0.5 pg/g, 0.4 pg/g, 0.2 pg/g, 0.1 pg/g, 0.05 pg/g, 0.01 pg/g일 수 있거나 또는 검출 불가능할 수 있다.
한 측면에서, 제공된 건조처리된 담배 물질 또는 담배 제품은 건조 중량 기준으로 약 0.01%, 0.02%, 0.05%, 0.75%, 0.1%, 0.15%, 0.2%, 0.3%, 0.35%, 0.4%, 0.5%, 0.6%, 0.7%, 0.8%, 0.9%, 1%, 1.1%, 1.2%, 1.3%, 1.4%, 1.5%, 1.6%, 1.7%, 1.8%, 1.9%, 2%, 2.1%, 2.2%, 2.3%, 2.4%, 2.5%, 2.6%, 2.7%, 2.8%, 2.9%, 3%, 3.1%, 3.2%, 3.3%, 3.4%, 3.5%, 3.6%, 3.7%, 3.8%, 3.9%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8% 및 9%로 이루어진 군으로부터 선택된 평균 니코틴 또는 총 알칼로이드 수준을 포함한다. 또 다른 측면에서, 제공된 건조처리된 담배 물질 또는 담배 제품은 건조 중량 기준으로 약 0.01% 내지 0.02%, 0.02% 내지 0.05%, 0.05% 내지 0.75%, 0.75% 내지 0.1%, 0.1% 내지 0.15%, 0.15% 내지 0.2%, 0.2% 내지 0.3%, 0.3% 내지 0.35%, 0.35% 내지 0.4%, 0.4% 내지 0.5%, 0.5% 내지 0.6%, 0.6% 내지 0.7%, 0.7% 내지 0.8%, 0.8% 내지 0.9%, 0.9% 내지 1%, 1% 내지 1.1%, 1.1% 내지 1.2%, 1.2% 내지 1.3%, 1.3% 내지 1.4%, 1.4% 내지 1.5%, 1.5% 내지 1.6%, 1.6% 내지 1.7%, 1.7% 내지 1.8%, 1.8% 내지 1.9%, 1.9% 내지 2%, 2% 내지 2.1%, 2.1% 내지 2.2%, 2.2% 내지 2.3%, 2.3% 내지 2.4%, 2.4% 내지 2.5%, 2.5% 내지 2.6%, 2.6% 내지 2.7%, 2.7% 내지 2.8%, 2.8% 내지 2.9%, 2.9% 내지 3%, 3% 내지 3.1%, 3.1% 내지 3.2%, 3.2% 내지 3.3%, 3.3% 내지 3.4%, 3.4% 내지 3.5%, 및 3.5% 내지 3.6%로 이루어진 군으로부터 선택된 평균 니코틴 또는 총 알칼로이드 수준을 포함한다. 추가의 측면에서, 제공된 건조처리된 담배 물질 또는 담배 제품은 건조 중량 기준으로 약 0.01% 내지 0.1%, 0.02% 내지 0.2%, 0.03% 내지 0.3%, 0.04% 내지 0.4%, 0.05% 내지 0.5%, 0.75% 내지 1%, 0.1% 내지 1.5%, 0.15% 내지 2%, 0.2% 내지 3%, 및 0.3% 내지 3.5%로 이루어진 군으로부터 선택된 평균 니코틴 또는 총 알칼로이드 수준을 포함한다.
본 개시내용은 또한 바람직한 수준의 총 알칼로이드 또는 니코틴을 포함하는, 예를 들어 저-니코틴 또는 니코틴-무함유인 담배 계통, 재배종 또는 품종을 육종하는 방법을 제공한다. 육종은 임의의 공지된 절차를 통해 수행될 수 있다. 바람직한 형질 또는 대립유전자를 담배 식물에 전달하거나 육종시키기 위해 마커-보조된 선택 (MAS) 육종 프로그램에서 DNA 핑거프린팅, SNP 맵핑, 일배체형 맵핑 또는 유사한 기술을 이용할 수 있다. 예를 들어, 육종가는 F1 잡종 식물을 사용하거나 또는 F1 잡종 식물을 농업적으로 바람직한 유전자형을 갖는 다른 공여자 식물과 추가로 교배하여 F2 또는 역교배 세대에서 분리 집단을 생성할 수 있다. 관련 기술분야에 공지되거나 또는 나열된 기술 중 하나를 이용하여 F2 또는 역교배 세대에서 식물을 원하는 농업적 형질 또는 바람직한 화학적 프로파일에 대해 스크리닝할 수 있다. 예상된 유전 패턴 또는 이용된 MAS 기술에 따라, 원하는 개별 식물의 확인에 도움이 되도록 각각의 역교배 주기 이전에 선택된 식물의 자가-수분을 수행할 수 있다. 반복 부모의 원하는 표현형이 회복될 때까지 역교배 또는 다른 육종 절차를 반복할 수 있다. 본 개시내용의 반복 부모는 열-건조처리된 품종, 버어리 품종, 진한 공기-건조처리된 품종, 진한 불-건조처리된 품종, 또는 오리엔탈 품종일 수 있다. 다른 육종 기술은 예를 들어 [Wernsman, E. A., and Rufty, R. C. 1987. Chapter Seventeen. Tobacco. Pages 669-698 In: Cultivar Development. Crop Species. W. H. Fehr (ed.), MacMillan Publishing Go., Inc., New York, N.Y.]에서 확인할 수 있고, 이들의 전문이 본원에 참고로 포함된다.
기재된 담배 식물을 사용하는 식물 육종 프로그램의 결과는 본 개시내용의 유용한 계통, 품종, 재배종, 자손, 근친교배 및 잡종을 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "품종"은 동일한 종의 다른 식물로부터 이들을 구별하는 일정한 특징을 공유하는 식물의 집단을 지칭한다. 품종은 항상 그런 것은 아니지만 종종 상업적으로 판매된다. 품종은 1가지 이상의 독특한 형질을 보유하지만, 추가로 해당 품종 내에서 개체들 사이에 매우 작은 전반적인 변이를 특징으로 한다. "순수한 계통" 품종은 수 세대의 자가-수분 및 선택에 의해, 또는 조직 또는 세포 배양 기술을 이용하여 단일 부모로부터 식물 증식에 의해 생성될 수 있다. 품종은 본질적으로 또 다른 계통 또는 품종으로부터 유래될 수 있다. [International Convention for the Protection of New Varieties of Plants (Dec. 2, 1961, as revised at Geneva on Nov. 10, 1972; on Oct. 23, 1978; and on Mar. 19, 1991)]에서 정의된 바와 같이, a) 초기 품종의 유전자형 또는 유전자형의 조합으로부터 발생한 본질적인 특징의 발현을 유지하면서, 주로 초기 품종으로부터 유래되거나 또는 초기 품종으로부터 주로 유래된 품종으로부터 유래된 경우; b) 초기 품종으로부터 명백하게 구별가능한 경우; 및 c) 유래 행위로 인한 차이를 제외하고, 초기 품종의 유전자형 또는 유전자형의 조합으로부터 발생한 본질적인 특징의 발현에서 초기 품종과 일치하는 경우, 품종은 초기 품종으로부터 "본질적으로 유래된다". 예를 들어 천연 또는 유도된 돌연변이체, 체세포영양계 변이체, 초기 품종 식물, 역교배 또는 형질전환으로부터의 변이 개체의 선택에 의해 본질적으로 유래된 품종이 수득될 수 있다. 제1 담배 품종, 및 본질적으로 제1 품종이 유래되는 제2 담배 품종은 본질적으로 동일한 유전적 백그라운드를 갖는 것으로 고려된다. 품종과 구별되는 "계통"은 예를 들어 식물 연구에서 비상업적으로 사용되는 식물의 그룹을 흔히 지칭한다. 다른 형질에 대해서는 개체들 사이에 다소 변이가 있을 수 있지만, 계통은 전형적으로 1가지 이상의 관심 형질에 대해 개체들 사이에 전반적인 변이를 거의 나타내지 않는다.
본원에 사용된 바와 같이, "유전자좌"는 다형성 핵산, 형질 결정인자, 유전자 또는 마커가 위치하는 염색체 영역이다. 본 개시내용의 유전자좌는 집단에서 1가지 이상의 다형성을 포함하며; 예를 들어 대안적인 대립유전자가 일부 개체에 존재한다. 본원에 사용된 바와 같이, "대립유전자"는 특정한 유전자좌에 있는 대안적인 핵산 서열을 지칭한다. 대립유전자의 길이는 1개 뉴클레오티드 염기만큼 작을 수 있지만, 전형적으로 더 크다. 예를 들어, 제1 대립유전자는 1개의 염색체 상에서 발생할 수 있는 반면에, 예를 들어 이형접합성 개체의 상이한 염색체에 대해, 또는 집단에서 상이한 동형접합성 또는 이형접합성 개체 사이에서 발생하는 바와 같이, 제2 대립유전자는 제2 상동성 염색체 상에서 발생한다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "염색체 간격"은 단일 염색체 상에 존재하는 게놈 DNA의 연속적인 선형 범위를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, "이입" 또는 "이입하다"는 유전적 유전자좌의 원하는 대립유전자를 하나의 유전적 백그라운드로부터 또 다른 백그라운드로 전이시키는 것을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, "교배된" 또는 "교배"는 수정을 통해 자손 (예를 들어 세포, 종자 또는 식물)을 생성하는 것을 의미하고, 식물 사이의 교배 (번식) 및 자가 수정 (자가 수분)을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, "역교배하다" 및 "역교배"는 자손 식물을 그의 부모 중 하나와 반복적으로 다시 교배하는 과정을 지칭한다. 역교배 계획에서, "공여자" 부모는 이입될 원하는 유전자 또는 유전자좌를 갖는 부모 식물을 지칭한다. "수용자" 부모 (1회 이상 사용됨) 또는 "반복" 부모 (2회 이상 사용됨)는 유전자 또는 유전자좌가 이입될 부모 식물을 지칭한다. 초기 교배는 F1 세대를 제공한다. 용어 "BC1"은 반복 부모의 두번째 사용을 지칭하고, "BC2"는 반복 부모의 세번째 사용 등을 지칭한다. 한 측면에서, 역교배는 반복적으로 수행되고, 각각의 연속적인 역교배 세대의 자손 개체는 그 자체로 동일한 부모 유전자형과 역교배된다.
본원에 사용된 바와 같이, "전환된 단일 유전자" 또는 "단일 유전자 전환"은 역교배로 공지된 식물 육종 기술을 이용하여 또는 유전자 조작을 통해 개발된 식물을 지칭하며, 품종에 전이된 단일 유전자 외에도 품종의 본질적으로 원하는 모든 형태학적 및 생리학적 특징이 역교배 기술을 통해 또는 유전자 조작을 통해 회복된다.
본원에 사용된 바와 같이, "엘리트 품종"은 우수한 농업적 성능을 위해 육종 및 선택으로부터 선택된 임의의 품종을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, 마커-보조된 선택 또는 육종과 관련하여 "선택하는" 또는 "선택"은 특정한 사전 결정된 기준을 기반으로 하여 일반적으로 집단으로부터 원하는 개체를 고르거나 선택하는 행위를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "형질"은 유전자형에 의해 영향을 받을 수 있는 세포 또는 기관의 하나 이상의 검출가능한 특징을 지칭한다. 표현형은 육안으로, 또는 관련 기술분야에 공지된 임의의 다른 평가 수단, 예를 들어 현미경, 생화학 분석, 게놈 분석, 특정한 질환 내성에 대한 검정 등에 의해 관찰될 수 있다. 일부 경우에, 표현형은 단일 유전자 또는 유전적 유전자좌, 예를 들어 "단일 유전자 형질"에 의해 직접적으로 제어된다. 다른 경우에, 표현형은 몇몇 유전자의 결과이다.
본 개시내용의 임의의 담배 식물이 예를 들어 관련 기술분야에 공지된 기술을 이용하여 유전자 구축물 또는 트랜스진에 의한 형질전환에 의해 추가의 농업상 바람직한 형질을 추가로 포함할 수 있는 것으로 이해된다. 비제한적으로, 원하는 형질의 예는 제초제 내성, 해충 내성, 질환 내성; 높은 수율; 높은 등급 지수 값; 건조처리성; 건조처리 품질; 기계적 수확성; 보유 능력; 잎 품질; 키, 식물 성숙 (예를 들어, 조기 성숙, 조기 내지 중간 성숙, 중간 성숙, 중간 내지 후기 성숙, 또는 후기 성숙); 줄기 크기 (예를 들어, 소형, 중형 또는 대형 줄기); 또는 식물당 잎 개수 (예를 들어, 소형 (예를 들어, 5-10개 잎), 중형 (예를 들어, 11-15개 잎), 또는 대형 (예를 들어, 16-21개 잎)), 또는 임의의 조합이다. 한 측면에서, 개시된 저-니코틴 또는 니코틴-무함유 담배 식물 또는 종자는 1종 이상의 살충 단백질, 예를 들어 바실루스 투린기엔시스(Bacillus thuringiensis)의 결정 단백질 또는 바실루스 세레우스(Bacillus cereus)로부터의 식물 살충 단백질, 예컨대 VIP3을 발현하는 하나 이상의 트랜스진을 포함한다 (예를 들어, [Estruch et al. (1997)　Nat. Biotechnol .15:137] 참고). 또 다른 측면에서, 담배 식물은 갈색 줄기 마름병에 대한 내성 (미국 특허 번호 5,689,035) 또는 포낭 선충에 대한 내성 (미국 특허 번호 5,491,081)을 부여하는 이입된 형질을 추가로 포함한다.
본 개시내용은 또한 변경된 니코틴 또는 총 알칼로이드 수준을 포함하지만, 이러한 니코틴 수준 변경없이 상응하는 초기 담배 식물의 수율과 대등한 수율을 갖는 담배 식물을 제공한다. 한 측면에서, 저-니코틴 또는 니코틴-무함유 담배 품종은 약 1200 내지 3500, 1300 내지 3400, 1400 내지 3300, 1500 내지 3200, 1600 내지 3100, 1700 내지 3000, 1800 내지 2900, 1900 내지 2800, 2000 내지 2700, 2100 내지 2600, 2200 내지 2500, 및 2300 내지 2400 lb/에이커로 이루어진 군으로부터 선택된 수율을 제공한다. 또 다른 측면에서, 저-니코틴 또는 니코틴-무함유 담배 품종은 약 1200 내지 3500, 1300 내지 3500, 1400 내지 3500, 1500 내지 3500, 1600 내지 3500, 1700 내지 3500, 1800 내지 3500, 1900 내지 3500, 2000 내지 3500, 2100 내지 3500, 2200 내지 3500, 2300 내지 3500, 2400 내지 3500, 2500 내지 3500, 2600 내지 3500, 2700 내지 3500, 2800 내지 3500, 2900 내지 3500, 3000 내지 3500, 및 3100 내지 3500 lb/에이커로 이루어진 군으로부터 선택된 수율을 제공한다. 추가의 측면에서, 저-니코틴 또는 니코틴-무함유 담배 식물은 nic1b 돌연변이, nic2 돌연변이, Nic1b 트랜스진, Nic2 트랜스진, 또는 이들의 조합을 제외하고는 본질적으로 동일한 유전적 백그라운드를 갖는 대조군 식물의 수율의 65% 내지 130%, 70% 내지 130%, 75% 내지 130%, 80% 내지 130%, 85% 내지 130%, 90% 내지 130%, 95% 내지 130%, 100% 내지 130%, 105% 내지 130%, 110% 내지 130%, 115% 내지 130%, 또는 120% 내지 130%인 수율을 제공한다. 추가의 측면에서, 저-니코틴 또는 니코틴-무함유 담배 식물은 nic1 돌연변이, nic2 돌연변이, Nic1 트랜스진, Nic2 트랜스진, 또는 이들의 조합을 제외하고는 본질적으로 동일한 유전적 백그라운드를 갖는 대조군 식물의 수율의 70% 내지 125%, 75% 내지 120%, 80% 내지 115%, 85% 내지 110%, 또는 90% 내지 100%인 수율을 제공한다.
한 측면에서, 담배 식물 (예를 들어, 저-니코틴, 니코틴-무함유, 또는 저-알칼로이드 담배 품종)은 보다 낮은 수율, 지연된 숙성 및 노화, 곤충 초식에 대해 보다 높은 민감성, 토핑후 증가된 폴리아민 함량, 보다 높은 엽록소, 잎 면적 단위당 더 많은 엽육 세포, 및 건조처리후 불량한 최종-생성물 품질로 이루어진 군으로부터 선택된 LA BU21 형질 중 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상 또는 모두를 나타내지 않는다. 한 측면에서, 개시된 담배 식물 (예를 들어, 저-니코틴, 니코틴-무함유, 또는 저-알칼로이드 담배 품종)은 보다 낮은 수율, 지연된 숙성 및 노화, 곤충 초식에 대해 보다 높은 민감성, 토핑후 증가된 폴리아민 함량, 보다 높은 엽록소, 잎 면적 단위당 더 많은 엽육 세포, 및 건조처리후 불량한 최종-생성물 품질로 이루어진 군으로부터 선택된 LA BU21 형질 중 2개 이상을 나타내지 않는다. 한 측면에서, 개시된 담배 식물 (예를 들어, 저-니코틴, 니코틴-무함유, 또는 저-알칼로이드 담배 품종)은 보다 낮은 수율, 지연된 숙성 및 노화, 곤충 초식에 대해 보다 높은 민감성, 토핑후 증가된 폴리아민 함량, 보다 높은 엽록소, 잎 면적 단위당 더 많은 엽육 세포, 및 건조처리후 불량한 최종-생성물 품질로 이루어진 군으로부터 선택된 LA BU21 형질 중 3개 이상을 나타내지 않는다. 한 측면에서, 개시된 담배 식물 (예를 들어, 저-니코틴, 니코틴-무함유, 또는 저-알칼로이드 담배 품종)은 보다 낮은 수율, 지연된 숙성 및 노화, 곤충 초식에 대해 보다 높은 민감성, 토핑후 증가된 폴리아민 함량, 보다 높은 엽록소, 잎 면적 단위당 더 많은 엽육 세포, 및 건조처리후 불량한 최종-생성물 품질로 이루어진 군으로부터 선택된 LA BU21 형질 중 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상 또는 모두를 LA BU21, LAFC53 또는 LN KY171에 비해 보다 낮은 수준으로 나타낸다. 한 측면에서, 개시된 담배 식물 (예를 들어, 저-니코틴, 니코틴-무함유, 또는 저-알칼로이드 담배 품종)은 보다 낮은 수율, 지연된 숙성 및 노화, 곤충 초식에 대해 보다 높은 민감성, 토핑후 증가된 폴리아민 함량, 보다 높은 엽록소, 잎 면적 단위당 더 많은 엽육 세포, 및 건조처리후 불량한 최종-생성물 품질로 이루어진 군으로부터 선택된 LA BU21 형질 중 2개 이상을 LA BU21, LAFC53 또는 LN KY171에 비해 보다 낮은 수준으로 나타낸다. 한 측면에서, 개시된 담배 식물 (예를 들어, 저-니코틴, 니코틴-무함유, 또는 저-알칼로이드 담배 품종)은 보다 낮은 수율, 지연된 숙성 및 노화, 곤충 초식에 대해 보다 높은 민감성, 토핑후 증가된 폴리아민 함량, 보다 높은 엽록소, 잎 면적 단위당 더 많은 엽육 세포, 및 건조처리후 불량한 최종-생성물 품질로 이루어진 군으로부터 선택된 LA BU21 형질 중 3개 이상 또는 모두를 LA BU21, LAFC53 또는 LN KY171에 비해 보다 낮은 수준으로 나타낸다.
한 측면에서, 변형된 담배 식물 (예를 들어, 저-니코틴, 니코틴-무함유, 또는 저-알칼로이드 담배 품종)은 수율, 숙성 및 노화, 곤충 초식에 대한 민감성, 토핑후 폴리아민 함량, 엽록소 수준, 잎 면적 단위당 엽육 세포 개수, 및 건조처리후 최종-생성물 품질로 이루어진 군으로부터 선택된 형질에 실질적으로 영향을 미치지 않고 원하는 형질 (예를 들어, 저-니코틴, 니코틴-무함유, 또는 저-알칼로이드)을 부여하는 변형을 포함한다.
한 측면에서, 변형된 담배 식물은 원하는 형질 (예를 들어, 저-니코틴, 니코틴-무함유, 또는 저-알칼로이드)을 부여하는 변형을 포함하고, 비변형된 대조군 식물과 실질적으로 대등한 형질을 추가로 포함하고, 형질은 수율, 숙성 및 노화, 곤충 초식에 대한 민감성, 토핑후 폴리아민 함량, 엽록소 수준, 잎 면적 단위당 엽육 세포 개수, 및 건조처리후 최종-생성물 품질로 이루어진 군으로부터 선택된다.
한 측면에서, 변형된 담배 식물은 원하는 형질 (예를 들어, 저-니코틴, 니코틴-무함유, 또는 저-알칼로이드)을 부여하는 변형을 포함하고, 비변형된 대조군 식물의 수율에 비해 80% 초과, 85% 초과, 90% 초과, 95% 초과, 100% 초과, 105% 초과, 110% 초과, 115% 초과, 120% 초과, 125% 초과, 130% 초과, 135% 초과, 또는 140% 초과인 수율을 추가로 포함한다. 한 측면에서, 개시된 변형된 담배 식물은 원하는 형질 (예를 들어, 저-니코틴, 니코틴-무함유, 또는 저-알칼로이드)을 부여하는 변형을 포함하고, 비변형된 대조군 식물의 수율에 비해 70% 내지 140%, 75% 내지 135%, 80% 내지 130%, 85% 내지 125%, 90% 내지 120%, 95% 내지 115%, 또는 100% 내지 110%인 수율을 추가로 포함한다. 한 측면에서, 개시된 변형된 담배 식물은 원하는 형질 (예를 들어, 저-니코틴, 니코틴-무함유, 또는 저-알칼로이드)을 부여하는 변형을 포함하고, 비변형된 대조군 식물의 수율에 비해 70% 내지 80%, 75% 내지 85%, 80% 내지 90%, 85% 내지 95%, 90% 내지 100%, 95% 내지 105%, 105% 내지 115%, 110% 내지 120%, 115% 내지 125%, 120% 내지 130%, 125 내지 135%, 또는 130% 내지 140%인 수율을 추가로 포함한다.
한 측면에서, 변형된 담배 식물은 원하는 형질 (예를 들어, 저-니코틴, 니코틴-무함유, 또는 저-알칼로이드)을 부여하는 변형을 포함하고, 비변형된 대조군 식물의 토핑후 폴리아민 함량에 비해 80% 초과, 85% 초과, 90% 초과, 95% 초과, 100% 초과, 105% 초과, 110% 초과, 115% 초과, 120% 초과, 125% 초과, 130% 초과, 135% 초과, 또는 140% 초과인 토핑후 폴리아민 함량을 추가로 포함한다. 한 측면에서, 개시된 변형된 담배 식물은 원하는 형질 (예를 들어, 저-니코틴, 니코틴-무함유, 또는 저-알칼로이드)을 부여하는 변형을 포함하고, 비변형된 대조군 식물의 토핑후 폴리아민 함량에 비해 70% 내지 140%, 75% 내지 135%, 80% 내지 130%, 85% 내지 125%, 90% 내지 120%, 95% 내지 115%, 또는 100% 내지 110%인 토핑후 폴리아민 함량을 추가로 포함한다. 한 측면에서, 개시된 변형된 담배 식물은 원하는 형질 (예를 들어, 저-니코틴, 니코틴-무함유, 또는 저-알칼로이드)을 부여하는 변형을 포함하고, 비변형된 대조군 식물의 토핑후 폴리아민 함량에 비해 70% 내지 80%, 75% 내지 85%, 80% 내지 90%, 85% 내지 95%, 90% 내지 100%, 95% 내지 105%, 105% 내지 115%, 110% 내지 120%, 115% 내지 125%, 120% 내지 130%, 125 내지 135%, 또는 130% 내지 140%인 토핑후 폴리아민 함량을 추가로 포함한다.
한 측면에서, 변형된 담배 식물은 원하는 형질 (예를 들어, 저-니코틴, 니코틴-무함유, 또는 저-알칼로이드)을 부여하는 변형을 포함하고, 비변형된 대조군 식물의 엽록소 수준에 비해 80% 초과, 85% 초과, 90% 초과, 95% 초과, 100% 초과, 105% 초과, 110% 초과, 115% 초과, 120% 초과, 125% 초과, 130% 초과, 135% 초과, 또는 140% 초과인 엽록소 수준을 추가로 포함한다. 한 측면에서, 개시된 변형된 담배 식물은 원하는 형질 (예를 들어, 저-니코틴, 니코틴-무함유, 또는 저-알칼로이드)을 부여하는 변형을 포함하고, 비변형된 대조군 식물의 엽록소 수준에 비해 70% 내지 140%, 75% 내지 135%, 80% 내지 130%, 85% 내지 125%, 90% 내지 120%, 95% 내지 115%, 또는 100% 내지 110%인 엽록소 수준을 추가로 포함한다. 한 측면에서, 개시된 변형된 담배 식물은 원하는 형질 (예를 들어, 저-니코틴, 니코틴-무함유, 또는 저-알칼로이드)을 부여하는 변형을 포함하고, 비변형된 대조군 식물의 엽록소 수준에 비해 70% 내지 80%, 75% 내지 85%, 80% 내지 90%, 85% 내지 95%, 90% 내지 100%, 95% 내지 105%, 105% 내지 115%, 110% 내지 120%, 115% 내지 125%, 120% 내지 130%, 125 내지 135%, 또는 130% 내지 140%인 엽록소 수준을 추가로 포함한다.
한 측면에서, 변형된 담배 식물은 원하는 형질 (예를 들어, 저-니코틴, 니코틴-무함유, 또는 저-알칼로이드)을 부여하는 변형을 포함하고, 비변형된 대조군 식물의 잎 면적 단위당 엽육 세포 개수에 비해 80% 초과, 85% 초과, 90% 초과, 95% 초과, 100% 초과, 105% 초과, 110% 초과, 115% 초과, 120% 초과, 125% 초과, 130% 초과, 135% 초과, 또는 140% 초과인 잎 면적 단위당 엽육 세포 개수를 추가로 포함한다. 한 측면에서, 개시된 변형된 담배 식물은 원하는 형질 (예를 들어, 저-니코틴, 니코틴-무함유, 또는 저-알칼로이드)을 부여하는 변형을 포함하고, 비변형된 대조군 식물의 잎 면적 단위당 엽육 세포 개수에 비해 70% 내지 140%, 75% 내지 135%, 80% 내지 130%, 85% 내지 125%, 90% 내지 120%, 95% 내지 115%, 또는 100% 내지 110%인 잎 면적 단위당 엽육 세포 개수를 추가로 포함한다. 한 측면에서, 개시된 변형된 담배 식물은 원하는 형질 (예를 들어, 저-니코틴, 니코틴-무함유, 또는 저-알칼로이드)을 부여하는 변형을 포함하고, 비변형된 대조군 식물의 잎 면적 단위당 엽육 세포 개수에 비해 70% 내지 80%, 75% 내지 85%, 80% 내지 90%, 85% 내지 95%, 90% 내지 100%, 95% 내지 105%, 105% 내지 115%, 110% 내지 120%, 115% 내지 125%, 120% 내지 130%, 125 내지 135%, 또는 130% 내지 140%인 잎 면적 단위당 엽육 세포 개수를 추가로 포함한다.
한 측면에서, 저-니코틴 또는 니코틴-무함유 담배 품종은 기계 수확에 적합하다. 또 다른 측면에서, 개시된 저-니코틴 또는 니코틴-무함유 담배 품종은 기계적으로 수확된다.
한 측면에서, 담배 식물을 재배하고; 담배 식물에서 푸트레신의 수준을 감소시키고, 담배 식물로부터 잎을 수확하는 것을 포함하는, 감소된-알칼로이드 담배 식물에서 잎 품질을 개선시키는 방법이 제공된다.
한 측면에서, 담배 식물을 재배하고; 담배 식물에서 오르니틴 데카르복실라제 (ODC) 유전자의 발현 또는 활성을 억제하고, 담배 식물로부터 잎을 수확하는 것을 포함하는, 감소된-알칼로이드 담배 식물에서 잎 품질을 개선시키는 방법이 제공된다. 한 측면에서, 억제 단계는 2, 4, 6 또는 8 WPT 이내에다. 한 측면에서, 억제 단계는 담배 식물의 토핑 이전 및 이후 둘 다에 ODC 유전자를 억제하는 것을 포함한다. 한 측면에서, 억제 단계는 화학적 억제제의 사용을 포함하지 않는다. 한 측면에서, 억제 단계는 오르니틴 데카르복실라제 (ODC) 유전자의 억제를 위해 비코딩 RNA의 발현을 유도함으로써 달성된다. 한 측면에서, 억제 단계는 ODC 억제제를 담배 식물에 적용하는 것을 포함한다. 한 측면에서, 억제는 ODC 억제제를 담배 식물에 적용함으로써 달성된다. 한 측면에서, ODC 억제제는 DFMO이다.
한 측면에서, 제공된 담배 식물은 잡종 식물이다. 잡종은 제1 품종의 자성 부모 식물 (예를 들어, 종자 부모)의 자가-수분을 방지하고, 제2 품종의 웅성 부모 식물로부터의 화분이 자성 부모 식물과 수정하도록 허용하고, F1 잡종 종자가 자성 식물에서 형성되도록 함으로써 생성될 수 있다. 자성 식물의 자가-수분은 꽃 발달의 초기 단계에서 꽃의 번식 기능을 없앰으로써 방지될 수 있다. 대안적으로, 웅성 불임의 형태를 이용하여 자성 부모 식물 상에서 화분 형성을 방지할 수 있다. 예를 들어, 웅성 불임은 웅성 불임 (MS), 또는 트랜스제닉 웅성 불임 (트랜스진이 작은 홀씨 형성 및/또는 화분 형성을 억제함), 또는 자가-불화합성에 의해 생성될 수 있다. MS를 함유하는 자성 부모 식물이 특히 유용하다. 자성 부모 식물이 MS인 측면에서, 화분은 번식가능한 웅성 식물로부터 수확될 있고, MS 자성 부모 식물의 암술머리에 수동으로 적용될 수 있으며, 생성된 F1 종자가 수확된다.
식물을 이용하여 단일-교배 담배 F1 잡종을 형성할 수 있다. 웅성 부모 식물로부터의 화분을 번식능력을 없앤 자성 부모 식물 또는 웅성 불임인 자성 부모 식물에 수동으로 옮겨서, F1 종자를 형성한다. 대안적으로, 단일-교배 F1 잡종이 자성 부모로서 사용되고 상이한 웅성 부모와 교배되는 것인 3-방향 교배를 수행할 수 있다. 또 다른 대안으로, 2회의 상이한 단일-교배의 F1 자손을 스스로 교배시키는 것인 이중-교배 잡종을 생성할 수 있다. 이중-교배 잡종을 형성할 때 자성 부모의 자가-수분을 방지하기 위해 자가-불화합성을 이용하는 것이 특히 유리하다.
한 측면에서, 저-니코틴 또는 니코틴-무함유 담배 품종은 웅성 불임이다. 또 다른 측면에서, 저-니코틴 또는 니코틴-무함유 담배 품종은 세포질 웅성 불임이다. 웅성 불임 담배 식물은 관련 기술분야에 공지된 임의의 방법에 의해 생성될 수 있다. 웅성 불임 담배를 생성하는 방법이 [Wernsman, E. A., and Rufty, R. C. 1987. Chapter Seventeen. Tobacco. Pages 669-698 In: Cultivar Development. Crop Species. W. H. Fehr (ed.), MacMillan Publishing Go., Inc., New York, N.Y. 761 pp]에 기재되어 있다.
추가의 측면에서, 제공된 담배 부분에는 잎, 줄기, 뿌리, 종자, 꽃, 화분, 꽃밥, 배주, 작은 꽃자루, 과일, 분열조직, 자옆, 배축, 꼬투리, 배아, 배유, 외식편, 캘러스, 조직 배양물, 새싹, 세포, 및 원형질체가 포함되나 이로 제한되지 않는다. 한 측면에서, 제공된 담배 부분은 종자를 포함하지 않는다. 한 측면에서, 본 개시내용은 번식 물질이 아니며 식물의 자연적인 번식을 매개하지 않는 담배 식물 세포, 조직 및 기관을 제공한다. 또 다른 측면에서, 본 개시내용은 또한 번식 물질이며 식물의 자연적인 번식을 매개하는 담배 식물 세포, 조직 및 기관을 제공한다. 또 다른 측면에서, 본 개시내용은 광합성을 통해 스스로 유지할 수 없는 담배 식물 세포, 조직 및 기관을 제공한다. 또 다른 측면에서, 본 개시내용은 체세포 담배 식물 세포를 제공한다. 생식 세포와는 달리 체세포 세포는 식물 번식을 매개하지 않는다.
제공된 세포, 조직 및 기관은 종자, 과일, 잎, 자옆, 배축, 분열조직, 배아, 배유, 뿌리, 새싹, 줄기, 꼬투리, 꽃, 화서, 대, 작은 꽃자루, 화주, 암술머리, 꽃받침, 꽃잎, 화피편, 화분, 꽃밥, 화사, 씨방, 배주, 과피, 체관부, 맥관 조직으로부터의 것일 수 있다. 또 다른 측면에서, 본 개시내용은 담배 식물 엽록체를 제공한다. 추가의 측면에서, 본 개시내용은 표피 세포, 기공 세포, 잎 또는 근모, 저장근 또는 괴경을 제공한다. 또 다른 측면에서, 본 개시내용은 담배 원형질체를 제공한다.
통상의 기술자는, 담배 식물이 무성 번식 또는 식물 증식을 통해서가 아니라 종자를 통해 자연적으로 번식한다는 것을 이해한다. 한 측면에서, 본 개시내용은 담배 배유를 제공한다. 또 다른 측면에서, 본 개시내용은 담배 배유 세포를 제공한다. 추가의 측면에서, 본 개시내용은 인간 개입없이는 번식할 수 없는 웅성 또는 자성 불임 담배 식물을 제공한다.
한 측면에서, 본 개시내용은 서열식별번호: 23-28로 이루어진 군으로부터 선택된 서열 및 그의 단편과 적어도 약 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 포함하는 핵산 분자를 제공한다. 한 측면에서, 본 개시내용은 서열식별번호: 29-34로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 약 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 포함하는 폴리펩티드 또는 단백질을 제공한다. 또 다른 측면에서, 본 개시내용은 서열식별번호: 29-34로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 단백질의 생물학적으로 활성인 변이체를 제공한다. 본 개시내용의 단백질의 생물학적으로 활성인 변이체는 1-15개 아미노산 잔기만큼 적은, 10개, 9개, 8개, 7개, 6개, 5개, 4개, 3개, 2개 또는 1개 아미노산 잔기만큼 적은 것에 의해 해당 단백질과 상이할 수 있다. ODC 경로로부터의 유전자 또는 단백질의 오르소로그 유전자 또는 단백질 또한 제공된다. "오르소로그"는 공통된 조상 유전자로부터 유래된 유전자이며, 종 분화의 결과로서 상이한 종에서 발견되는 것이다. 오르소로그는 뉴클레오티드 서열 및/또는 단백질 서열 수준에서 적어도 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 초과의 서열 동일성 또는 유사성을 공유한다. 오르소로그의 기능은 종종 종들 사이에서 고도로 보존된다.
본원에 사용된 바와 같이, 2가지 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열과 관련하여 용어 "서열 동일성" 또는 "동일성"은 특정한 비교 범위에 걸쳐 최대 대응을 위해 정렬될 때 두 서열에서 동일한 잔기를 지칭한다. % 서열 동일성이 단백질과 관련하여 이용되는 경우, 동일하지 않은 잔기 위치가 종종 보존적 아미노산 치환에 의해 동일하지 않은 것으로 인식되고, 아미노산 잔기는 유사한 화학적 특성 (예를 들어, 전하 또는 소수성)을 갖는 다른 아미노산 잔기로 대체되고, 따라서 분자의 기능적 특성을 변화시키지 않는다. 서열이 보존적 치환에서 차이가 있을 때, % 서열 동일성은 치환의 보존적 성질을 보정하기 위해 상향 조정될 수 있다. 이러한 보존적 치환에서 상이한 서열은 "서열 유사성" 또는 "유사성"을 갖는 것으로 고려된다.
제공된 핵산 분자, 폴리펩티드 또는 단백질은 단리될 수 있거나 또는 실질적으로 정제될 수 있다. "단리된" 또는 "정제된" 핵산 분자, 폴리펩티드, 단백질 또는 그의 생물학적으로 활성인 부분은 그의 천연 발생 환경에서 발견되는 바와 같이 폴리뉴클레오티드 또는 단백질을 정상적으로 수반하거나 또는 그와 상호작용하는 성분들을 실질적으로 또는 본질적으로 함유하지 않는다. 예를 들어, 단리된 또는 정제된 폴리뉴클레오티드 또는 단백질은 재조합 기술에 의해 생성되는 경우 다른 세포 물질 또는 세포 배지를 실질적으로 함유하지 않거나, 또는 화학적으로 합성되는 경우 화학적 전구체 또는 다른 화학물질을 실질적으로 함유하지 않는다.
본 개시내용은 개시된 담배 식물로부터의 담배 물질을 포함하는 담배 제품을 제조하는 방법을 추가로 제공한다. 한 측면에서, 상기 방법은 담배 식물로부터 제조된 숙성된 담배 물질을 컨디셔닝하여 그의 수분 함량을 약 12.5% 내지 약 13.5%에서 약 21%로 증가시키고, 컨디셔닝된 담배 물질을 블렌딩하여 바람직한 블렌드를 생성하는 것을 포함한다. 한 측면에서, 담배 제품의 제조 방법은 블렌드를 케이싱하거나 풍미화시키는 것을 추가로 포함한다. 일반적으로, 케이싱 과정 동안에, 케이싱 또는 소스 물질을 블렌드에 첨가하여, 화학적 조성의 균형을 이룸으로써 그들의 품질을 증강시키고, 특정한 원하는 풍미 특징을 개발한다. 케이싱 과정에 대한 추가의 상세한 내용은 [Tobacco Production, Chemistry and Technology, Edited by L. Davis and M. Nielsen, Blackwell Science, 1999]에서 확인할 수 있다.
제공된 담배 물질은 또한 열 처리 (예를 들어, 쿠킹, 토스팅), 풍미화, 효소 처리, 확장 및/또는 건조처리를 비롯하여 이로 제한되지 않는 방법을 이용하여 가공될 수 있다. 발효된 및 발효되지 않은 담배는 이들 기술을 이용하여 가공될 수 있다. 적합한 가공된 담배의 예에는 진한 공기-건조처리된, 진한 불 건조처리된, 버어리, 열 건조처리된, 및 시가 충전제 또는 래퍼, 뿐만 아니라 전체 잎 줄기치기 작업으로부터 생성물이 포함된다. 한 측면에서, 담배 섬유는 생중량 기준으로 최대 70% 진한 담배를 포함한다. 예를 들어, 담배는 미국 공개 번호 2004/0118422 또는 2005/0178398에 기재된 가열, 스웨팅 및/또는 저온살균 단계에 의해 컨디셔닝될 수 있다.
제공된 담배 물질은 발효될 수 있다. 전형적으로 발효는 높은 초기 수분 함량, 열 발생, 및 10 내지 20%의 건조 중량 손실을 특징으로 한다. 예를 들어, 미국 특허 번호 4,528,993; 4,660,577; 4,848,373; 및 5,372,149를 참고한다. 잎의 향을 변경하는 것 외에도, 발효는 잎의 색상 및 질감 중 하나 또는 둘 다를 변화시킬 수 있다. 또한, 발효 과정 동안에, 방출 기체가 생성될 수 있고, 산소가 흡수될 수 있고, pH가 변할 수 있으며, 보유된 수분의 양이 변화될 수 있다. 예를 들어, 미국 공개 번호 2005/0178398 및 [Tso (1999, Chapter 1 in Tobacco, Production, Chemistry and Technology, Davis & Nielsen, eds., Blackwell Publishing, Oxford)]를 참고한다. 건조처리된, 또는 건조처리되고 발현된 담배는 경구 제품으로 포함되기 전에 추가로 가공될 수 있다 (예를 들어, 절단, 확장, 블렌딩, 분쇄 또는 세분). 일부 경우에, 공중합체 및 임의적으로 풍미제 및 다른 첨가제와 혼합하기 전에 담배는 48 내지 50 중량%의 오븐 휘발성 물질 함량을 갖는 긴 절단된 발효된 건조처리된 습식 담배이다.
한 측면에서, 제공된 담배 물질은 원하는 크기로 가공될 수 있다. 한 측면에서, 담배 섬유는 200 마이크로미터 미만의 평균 섬유 크기를 갖도록 가공될 수 있다. 한 측면에서, 담배 섬유는 75 내지 125 마이크로미터이다. 또 다른 측면에서, 담배 섬유는 75 마이크로미터 이하의 크기를 갖도록 가공된다. 한 측면에서, 담배 섬유는 약 10개 절단/인치 내지 약 110개 절단/인치의 폭 및 약 0.1 인치 내지 약 1 인치의 길이로 절단되거나 썰어질 수 있는 긴 절단 담배를 포함한다. 이중 절단 담배 섬유는 이중 절단 담배 섬유의 약 70%가 -20 메쉬 내지 80 메쉬의 메쉬 크기에 속하도록 하는 범위의 입자 크기를 가질 수 있다.
제공된 담배 물질은 약 10 중량% 이상; 약 20 중량% 이상; 약 40 중량% 이상; 약 15 중량% 내지 약 25 중량%; 약 20 중량% 내지 약 30 중량%; 약 30 중량% 내지 약 50 중량%; 약 45 중량% 내지 약 65 중량%; 또는 약 50 중량% 내지 약 60 중량%의 총 오븐 휘발성 물질 함량을 갖도록 가공될 수 있다. 관련 기술분야의 기술자는 "습식" 담배가 전형적으로 약 40 중량% 내지 약 60 중량% (예를 들어, 약 45 중량% 내지 약 55 중량%, 또는 약 50 중량%)의 오븐 휘발성 물질 함량을 갖는 담배를 지칭한다는 것을 이해할 것이다. 본원에 사용된 바와 같이, "오븐 휘발성 물질"은 110℃의 예열된 강제 통풍 오븐에서 3.25 시간 동안 샘플을 건조시킨 후에 샘플에 대한 % 중량 손실을 계산함으로써 결정된다. 경구 제품은 경구 제품을 제조하기 위해 사용된 담배 섬유의 오븐 휘발성 물질 함량과는 상이한 전체 오븐 휘발성 물질 함량을 가질 수 있다. 기재된 가공 단계는 오븐 휘발성 물질 함량을 감소시키거나 또는 증가시킬 수 있다.
지금까지 본 개시내용을 일반적으로 기재하였지만, 이는 설명의 방식으로 제공된 하기 실시예를 참고하여 더욱 용이하게 이해될 것이며, 하기 실시예는 달리 명시하지 않는다면 본 개시내용을 제한하는 것으로 의도되지 않는다.
본 개시내용의 예시적인 실시양태는 다음과 같다.
실시양태 1. 오르니틴 데카르복실라제 (ODC) 유전자의 억제를 위해 비코딩 RNA를 코딩하는 전사가능한 DNA 서열에 작동가능하게 연결된 유도성 프로모터를 포함하는 담배 식물.
실시양태 2. 실시양태 1에 있어서, 상기 담배 식물이 감소된 니코틴 수준을 부여하는 돌연변이 또는 트랜스진을 포함하는 것인 담배 식물.
실시양태 3. 실시양태 1 또는 2에 있어서, 상기 담배 식물이 저-알칼로이드 담배 식물인 담배 식물.
실시양태 4. 실시양태 1-3 중 어느 하나에 있어서, 상기 담배 식물이 nic1 돌연변이, nic2 돌연변이, 또는 이들 둘 다를 포함하는 것인 담배 식물.
실시양태 5. 실시양태 1-4 중 어느 하나에 있어서, 상기 담배 식물이 아스파르테이트 옥시다제, 아그마틴 데이미나제 (AIC), 아르기나제, 디아민 옥시다제, 아르기닌 데카르복실라제 (ADC), 메틸푸트레신 옥시다제 (MPO), NADH 데히드로게나제, 오르니틴 데카르복실라제 (ODC), 포스포리보실안트라닐레이트 아이소머라제 (PRAI), 푸트레신 N-메틸트랜스퍼라제 (PMT), 퀴놀레이트 포스포리보실 트랜스퍼라제 (QPT), S-아데노실-메티오닌 신테타제 (SAMS), A622, NBB1, BBL, MYC2, Nic1, Nic2, 에틸렌 반응 인자 (ERF) 전사 인자, 니코틴 흡수 페르메아제 (NUP), 및 MATE 트랜스포터로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질을 코딩하는 유전자 또는 유전자좌에서 돌연변이를 포함하는 것인 담배 식물.
실시양태 6. 실시양태 1-5 중 어느 하나에 있어서, 상기 담배 식물이 ERF32, ERF34, ERF39, ERF189, ERF115, ERF221, ERF104, ERF179, ERF17 및 ERF168로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질을 코딩하는 유전자 또는 유전자좌에서 돌연변이를 포함하는 것인 담배 식물.
실시양태 7. 실시양태 1-6 중 어느 하나에 있어서, 상기 담배 식물이 아스파르테이트 옥시다제, 아그마틴 데이미나제 (AIC), 아르기나제, 디아민 옥시다제, 아르기닌 데카르복실라제 (ADC), 메틸푸트레신 옥시다제 (MPO), NADH 데히드로게나제, 오르니틴 데카르복실라제 (ODC), 포스포리보실안트라닐레이트 아이소머라제 (PRAI), 푸트레신 N-메틸트랜스퍼라제 (PMT), 퀴놀레이트 포스포리보실 트랜스퍼라제 (QPT), S-아데노실-메티오닌 신테타제 (SAMS), A622, NBB1, BBL, MYC2, Nic1, Nic2, 에틸렌 반응 인자 (ERF) 전사 인자, 니코틴 흡수 페르메아제 (NUP), 및 MATE 트랜스포터로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질을 코딩하는 유전자를 표적화하고 억제하는 트랜스진을 포함하는 것인 담배 식물.
실시양태 8. 실시양태 1-7 중 어느 하나에 있어서, 상기 담배 식물이 ERF32, ERF34, ERF39, ERF189, ERF115, ERF221, ERF104, ERF179, ERF17 및 ERF168로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질을 코딩하는 유전자를 표적화하거나 또는 억제하는 트랜스진을 포함하는 것인 담배 식물.
실시양태 9. 실시양태 1-8 중 어느 하나에 있어서, 상기 담배 식물이 상기 돌연변이 또는 상기 트랜스진을 포함하지 않는 대조군 식물의 대등한 잎에 비해 대등한 수준의 1종 이상의 폴리아민을 포함하는 잎을 생성할 수 있는 것인 담배 식물.
실시양태 10. 실시양태 1-9 중 어느 하나에 있어서, 상기 대등한 수준이 상기 대조군에서의 수준의 20%, 17.5%, 15%, 12.5%, 10%, 7.5%, 5%, 2.5% 또는 1% 내에 있는 것인 담배 식물.
실시양태 11. 실시양태 1-10 중 어느 하나에 있어서, 상기 담배 식물이 상기 돌연변이 또는 상기 트랜스진을 포함하지 않는 대조군 식물의 대등한 잎에 비해 대등한 엽록소 수준을 포함하는 잎을 생성할 수 있는 것인 담배 식물.
실시양태 12. 실시양태 1-11 중 어느 하나에 있어서, 상기 대등한 엽록소 수준이 상기 대조군에서의 수준의 20%, 17.5%, 15%, 12.5%, 10%, 7.5%, 5%, 2.5% 또는 1% 내에 있는 것인 담배 식물.
실시양태 13. 실시양태 1-12 중 어느 하나에 있어서, 상기 담배 식물이 상기 돌연변이 또는 상기 트랜스진을 포함하지 않는 대조군 식물의 대등한 잎에 비해 잎 면적 단위당 엽육 세포의 대등한 개수를 포함하는 잎을 생성할 수 있는 것인 담배 식물.
실시양태 14. 실시양태 1-13 중 어느 하나에 있어서, 상기 잎 면적 단위당 대등한 엽육 세포가 상기 대조군에서의 수준의 20%, 17.5%, 15%, 12.5%, 10%, 7.5%, 5%, 2.5% 또는 1% 내에 있는 것인 담배 식물.
실시양태 15. 실시양태 1-14 중 어느 하나에 있어서, 상기 담배 식물이 상기 돌연변이 또는 상기 트랜스진을 포함하지 않는 대조군 식물의 대등한 잎에 비해 대등한 표피 세포 크기를 포함하는 잎을 생성할 수 있는 것인 담배 식물.
실시양태 16. 실시양태 1-15 중 어느 하나에 있어서, 상기 대등한 표피 세포 크기가 상기 대조군에서의 수준의 20%, 17.5%, 15%, 12.5%, 10%, 7.5%, 5%, 2.5% 또는 1% 내에 있는 것인 담배 식물.
실시양태 17. 실시양태 1-16 중 어느 하나에 있어서, 상기 담배 식물이 상기 돌연변이 또는 상기 트랜스진을 포함하지 않는 대조군 식물의 대등한 잎에 비해 대등한 잎 수율을 포함하는 것인 담배 식물.
실시양태 18. 실시양태 1-17 중 어느 하나에 있어서, 상기 대등한 잎 수율이 상기 대조군에서의 수준의 20%, 17.5%, 15%, 12.5%, 10%, 7.5%, 5%, 2.5% 또는 1% 내에 있는 것인 담배 식물.
실시양태 19. 실시양태 1-18 중 어느 하나에 있어서, 상기 담배 식물이 상기 돌연변이 또는 상기 트랜스진을 포함하지 않는 대조군 식물의 대등한 잎에 비해 대등한 곤충 초식 민감성을 나타내는 것인 담배 식물.
실시양태 20. 실시양태 1-19 중 어느 하나에 있어서, 상기 오르니틴 데카르복실라제 (ODC) 유전자가 서열식별번호: 29-34로 이루어진 군으로부터 선택된 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 또는 100% 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열을 코딩하는 것인 담배 식물.
실시양태 21. 실시양태 1-20 중 어느 하나에 있어서, 상기 ODC 유전자가 서열식별번호: 23-28로 이루어진 군으로부터 선택된 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 또는 100% 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 담배 식물.
실시양태 22. 실시양태 1-21 중 어느 하나에 있어서, 상기 유도성 프로모터가 토핑-유도성 프로모터인 담배 식물.
실시양태 23. 실시양태 1-22 중 어느 하나에 있어서, 상기 유도성 프로모터가 또한 조직-특이적인 또는 조직-선호적인 프로모터인 담배 식물.
실시양태 24. 실시양태 1-23 중 어느 하나에 있어서, 상기 조직-특이적인 또는 조직-선호적인 프로모터가 새싹, 뿌리, 잎, 줄기, 꽃, 흡지, 근단, 엽육 세포, 표피 세포, 및 맥관구조로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 조직 또는 기관에 대해 특이적인 또는 선호적인 것인 담배 식물.
실시양태 25. 실시양태 1-24 중 어느 하나에 있어서, 상기 유도성 프로모터가 뿌리 특이적인 또는 선호적인 발현을 조절하는 것인 담배 식물.
실시양태 26. 실시양태 1-25 중 어느 하나에 있어서, 상기 유도성 프로모터가 서열식별번호: 1-11로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 것인 담배 식물.
실시양태 27. 실시양태 1-26 중 어느 하나에 있어서, 상기 유도성 프로모터가 잎 특이적인 또는 선호적인 발현을 조절하는 것인 담배 식물.
실시양태 28. 실시양태 1-27 중 어느 하나에 있어서, 상기 유도성 프로모터가 서열식별번호: 12-21로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 것인 담배 식물.
실시양태 29. 실시양태 1-28 중 어느 하나에 있어서, 상기 유도성 프로모터가 상기 전사가능한 DNA 서열에 대해 이종성인 담배 식물.
실시양태 30. 실시양태 1-29 중 어느 하나에 있어서, 상기 비코딩 RNA가 마이크로RNA (miRNA), 안티-센스 RNA, 소형 간섭 RNA (siRNA), 트랜스-작용 siRNA (ta-siRNA), 및 헤어핀 RNA (hpRNA)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 담배 식물.
실시양태 31. 실시양태 1-30 중 어느 하나에 있어서, 상기 비코딩 RNA가 서열식별번호: 35 및 36으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 또는 100% 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 담배 식물.
실시양태 32. 실시양태 1-31 중 어느 하나에 있어서, 상기 비코딩 RNA가 서열식별번호: 22와 적어도 90% 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 ODC RNAi 구축물로 제공되는 것인 담배 식물.
실시양태 33. nic1 돌연변이, nic2 돌연변이, 또는 이들 둘 다를 포함하고, 조기-노화 형질을 제공하는 트랜스진 또는 돌연변이를 추가로 포함하는 담배 식물 또는 그의 일부분.
실시양태 34. 실시양태 33에 있어서, 조기-노화 형질을 제공하는 상기 돌연변이가 옐로우 버어리1 (-yb1)인 담배 식물.
실시양태 35. 실시양태 33 또는 34에 있어서, 조기-노화 형질을 제공하는 상기 돌연변이가 옐로우 버어리2 (-yb2)인 담배 식물.
실시양태 36. 실시양태 33-35 중 어느 하나에 있어서, 조기-노화 형질을 제공하는 상기 돌연변이가 페일 옐로우 (PY)인 담배 식물.
실시양태 37. 대조군 담배 식물에 비해 하기를 포함하는 담배 식물 또는 그의 일부분이며:
a. 보다 낮은 수준의 니코틴 또는 총 알칼로이드를 제공하는 제1 게놈 변형, 및
b. 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 형질의 대등한 수준을 제공하는 제2 게놈 변형
i. 총 잎 폴리아민 수준,
ii. 총 뿌리 폴리아민 수준,
iii. 총 잎 엽록소 수준,
iv. 잎 면적 단위당 엽육 세포 개수, 및
v. 잎 표피 세포 크기;
상기 대조군 식물은 상기 제1 및 상기 제2 게놈 변형을 둘 다 갖지 않는 것인 담배 식물 또는 그의 일부분.
실시양태 38. 대조군 담배 식물에 비해 하기를 포함하는 담배 식물 또는 그의 일부분이며:
a. 보다 낮은 수준의 니코틴 또는 총 알칼로이드를 제공하는 제1 게놈 변형, 및
b. 대등한 수준의 총 잎 폴리아민 수준을 제공하는 제2 게놈 변형,
상기 대조군 식물은 상기 제1 및 상기 제2 게놈 변형을 둘 다 갖지 않는 것인 담배 식물 또는 그의 일부분.
실시양태 39. 대조군 담배 식물에 비해 하기를 포함하는 담배 식물 또는 그의 일부분이며:
a. 보다 낮은 수준의 니코틴 또는 총 알칼로이드를 제공하는 제1 게놈 변형, 및
b. 대등한 수준의 총 뿌리 폴리아민 수준을 제공하는 제2 게놈 변형,
상기 대조군 식물은 상기 제1 및 상기 제2 게놈 변형을 둘 다 갖지 않는 것인 담배 식물 또는 그의 일부분.
실시양태 40. 대조군 담배 식물에 비해 하기를 포함하는 담배 식물 또는 그의 일부분이며:
a. 보다 낮은 수준의 니코틴 또는 총 알칼로이드를 제공하는 제1 게놈 변형, 및
b. 대등한 수준의 총 잎 엽록소 수준을 제공하는 제2 게놈 변형,
상기 대조군 식물은 상기 제1 및 상기 제2 게놈 변형을 둘 다 갖지 않는 것인 담배 식물 또는 그의 일부분.
실시양태 41. 대조군 담배 식물에 비해 하기를 포함하는 담배 식물 또는 그의 일부분이며:
a. 보다 낮은 수준의 니코틴 또는 총 알칼로이드를 제공하는 제1 게놈 변형, 및
b. 대등한 수준의 잎 면적 단위당 엽육 세포 개수를 제공하는 제2 게놈 변형,
상기 대조군 식물은 상기 제1 및 상기 제2 게놈 변형을 둘 다 갖지 않는 것인 담배 식물 또는 그의 일부분.
실시양태 42. 대조군 담배 식물에 비해 하기를 포함하는 담배 식물 또는 그의 일부분이며:
a. 보다 낮은 수준의 니코틴 또는 총 알칼로이드를 제공하는 제1 게놈 변형, 및
b. 대등한 수준의 잎 표피 세포 크기를 제공하는 제2 게놈 변형,
상기 대조군 식물은 상기 제1 및 상기 제2 게놈 변형을 둘 다 갖지 않는 것인 담배 식물 또는 그의 일부분.
실시양태 43. 실시양태 37-42 중 어느 하나에 있어서, 상기 담배 식물이 상기 대조군 담배 식물에 비해 잎에서 총 접합된 폴리아민의 감소된 양을 포함하는 것인 담배 식물 또는 그의 일부분.
실시양태 44. 실시양태 37-43 중 어느 하나에 있어서, 상기 담배 식물이 상기 대조군 담배 식물에 비해 뿌리에서 총 접합된 폴리아민의 감소된 양을 포함하는 것인 담배 식물 또는 그의 일부분.
실시양태 45. 실시양태 37-44 중 어느 하나에 있어서, 상기 담배 식물이 상기 대조군 담배 식물에 비해 잎에서 총 유리 폴리아민의 감소된 양을 포함하는 것인 담배 식물 또는 그의 일부분.
실시양태 46. 실시양태 37-45 중 어느 하나에 있어서, 상기 담배 식물이 상기 대조군 담배 식물에 비해 뿌리에서 총 접합된 폴리아민의 감소된 양을 포함하는 것인 담배 식물 또는 그의 일부분.
실시양태 47. 실시양태 37-46 중 어느 하나에 있어서, 상기 담배 식물이 상기 대조군 담배 식물에 비해 잎에서 푸트레신, 스페르미딘 및 스페르민으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 폴리아민의 총 접합된 형태의 감소된 양을 포함하는 것인 담배 식물 또는 그의 일부분.
실시양태 48. 실시양태 37-47 중 어느 하나에 있어서, 상기 담배 식물이 상기 대조군 담배 식물에 비해 뿌리에서 푸트레신, 스페르미딘 및 스페르민으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 폴리아민의 총 접합된 형태의 감소된 양을 포함하는 것인 담배 식물 또는 그의 일부분.
실시양태 49. 실시양태 37-48 중 어느 하나에 있어서, 상기 담배 식물이 상기 대조군 담배 식물에 비해 잎에서 푸트레신, 스페르미딘 및 스페르민으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 폴리아민의 총 유리 형태의 감소된 양을 포함하는 것인 담배 식물 또는 그의 일부분.
실시양태 50. 실시양태 37-49 중 어느 하나에 있어서, 상기 담배 식물이 상기 대조군 담배 식물에 비해 뿌리에서 푸트레신, 스페르미딘 및 스페르민으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 폴리아민의 총 접합된 형태의 감소된 양을 포함하는 것인 담배 식물 또는 그의 일부분.
실시양태 51. 실시양태 37-50 중 어느 하나에 있어서, 상기 제1 게놈 변형이 상기 대조군 담배 식물에 비해 니코틴의 보다 낮은 수준을 제공하는 것인 담배 식물 또는 그의 일부분.
실시양태 52. 실시양태 37-51 중 어느 하나에 있어서, 상기 제1 게놈 변형, 상기 제2 게놈 변형, 또는 이들 둘 다가 트랜스진, 돌연변이, 또는 이들 둘 다를 포함하는 것인 담배 식물 또는 그의 일부분.
실시양태 53. 실시양태 37-52 중 어느 하나에 있어서, 상기 제1 게놈 변형, 상기 제2 게놈 변형, 또는 이들 둘 다가 트랜스진을 포함하는 것인 담배 식물 또는 그의 일부분.
실시양태 54. 실시양태 37-53 중 어느 하나에 있어서, 상기 제1 게놈 변형, 상기 제2 게놈 변형, 또는 이들 둘 다가 돌연변이를 포함하는 것인 담배 식물 또는 그의 일부분.
실시양태 55. 실시양태 37-54 중 어느 하나에 있어서, 상기 제1 게놈 변형, 상기 제2 게놈 변형, 또는 이들 둘 다가 트랜스진-기반이 아닌 것인 담배 식물 또는 그의 일부분.
실시양태 56. 실시양태 37-55 중 어느 하나에 있어서, 상기 제1 게놈 변형, 상기 제2 게놈 변형, 또는 이들 둘 다가 돌연변이-기반이 아닌 것인 담배 식물 또는 그의 일부분.
실시양태 57. 실시양태 37-56 중 어느 하나에 있어서, 상기 제1 게놈 변형이 nic1 돌연변이, nic2 돌연변이, 또는 이들 둘 다를 포함하는 것인 담배 식물 또는 그의 일부분.
실시양태 58. 실시양태 37-57 중 어느 하나에 있어서, 상기 제1 게놈 변형이 Nic1 유전자좌를 표적화하는 트랜스진, Nic2 유전자좌를 표적화하는 트랜스진, 또는 이들 둘 다를 포함하는 것인 담배 식물 또는 그의 일부분.
실시양태 59. 실시양태 37-58 중 어느 하나에 있어서, 상기 제2 게놈 변형이 오르니틴 데카르복실라제 (ODC) 유전자, MYB8 유전자, 또는 이들 둘 다의 억제를 위해 비코딩 RNA를 코딩하는 전사가능한 DNA 서열을 포함하는 것인 담배 식물 또는 그의 일부분.
실시양태 60. 실시양태 37-59 중 어느 하나에 있어서, 상기 전사가능한 DNA 서열이 구성적 프로모터, 발달성 프로모터, 조직-특이적인 프로모터, 조직-선호적인 프로모터, 유도성 프로모터, 및 이들의 임의의 조합물로 이루어진 군으로부터 선택된 이종성 프로모터에 작동가능하게 연결되는 것인 담배 식물 또는 그의 일부분.
실시양태 61. 실시양태 37-60 중 어느 하나에 있어서, 상기 제2 게놈 변형이 디아민 옥시다제의 과발현, 아르기닌 데카르복실라제의 억제, 또는 이들 둘 다를 포함하는 것인 담배 식물 또는 그의 일부분.
실시양태 62. 실시양태 37-61 중 어느 하나에 있어서, 상기 제1 게놈 변형이 아스파르테이트 옥시다제, 아그마틴 데이미나제 (AIC), 아르기나제, 디아민 옥시다제, 아르기닌 데카르복실라제 (ADC), 메틸푸트레신 옥시다제 (MPO), NADH 데히드로게나제, 오르니틴 데카르복실라제 (ODC), 포스포리보실안트라닐레이트 아이소머라제 (PRAI), 푸트레신 N-메틸트랜스퍼라제 (PMT), 퀴놀레이트 포스포리보실 트랜스퍼라제 (QPT), 및 S-아데노실-메티오닌 신테타제 (SAMS), A622, NBB1, BBL, MYC2, Nic1, Nic2, 에틸렌 반응 인자 (ERF) 전사 인자, 니코틴 흡수 페르메아제 (NUP), 및 MATE 트랜스포터로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질을 코딩하는 유전자 또는 유전자좌에서 돌연변이를 포함하는 것인 담배 식물 또는 그의 일부분.
실시양태 63. 실시양태 37-62 중 어느 하나에 있어서, 상기 제1 게놈 변형이 ERF32, ERF34, ERF39, ERF189, ERF115, ERF221, ERF104, ERF179, ERF17 및 ERF168로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질을 코딩하는 유전자 또는 유전자좌에서 돌연변이를 포함하는 것인 담배 식물 또는 그의 일부분.
실시양태 64. 실시양태 37-63 중 어느 하나에 있어서, 상기 제1 게놈 변형이 아스파르테이트 옥시다제, 아그마틴 데이미나제 (AIC), 아르기나제, 디아민 옥시다제, 아르기닌 데카르복실라제 (ADC), 메틸푸트레신 옥시다제 (MPO), NADH 데히드로게나제, 오르니틴 데카르복실라제 (ODC), 포스포리보실안트라닐레이트 아이소머라제 (PRAI), 푸트레신 N-메틸트랜스퍼라제 (PMT), 퀴놀레이트 포스포리보실 트랜스퍼라제 (QPT), 및 S-아데노실-메티오닌 신테타제 (SAMS), A622, NBB1, BBL, MYC2, Nic1, Nic2, 에틸렌 반응 인자 (ERF) 전사 인자, 니코틴 흡수 페르메아제 (NUP), 및 MATE 트랜스포터로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질을 코딩하는 유전자 또는 유전자좌를 표적화하고 억제하는 트랜스진을 포함하는 것인 담배 식물 또는 그의 일부분.
실시양태 65. 실시양태 37-64 중 어느 하나에 있어서, 상기 제1 게놈 변형이 ERF32, ERF34, ERF39, ERF189, ERF115, ERF221, ERF104, ERF179, ERF17 및 ERF168로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질을 코딩하는 유전자 또는 유전자좌를 표적화하고 억제하는 트랜스진을 포함하는 것인 담배 식물 또는 그의 일부분.
실시양태 66. 실시양태 37-65 중 어느 하나에 있어서, 상기 보다 낮은 수준이 개화기 직전, 토핑시, 토핑후 1 주째 (WPT), 2 WPT, 3 WPT, 4 WPT, 5 WPT, 6 WPT, 7 WPT, 8 WPT, 및 수확시로 이루어진 군으로부터 선택된 시기에 측정되는 것인 담배 식물 또는 그의 일부분.
실시양태 67. 실시양태 37-66 중 어느 하나에 있어서, 상기 대등한 수준이 개화기 직전, 토핑시, 토핑후 1 주째 (WPT), 2 WPT, 3 WPT, 4 WPT, 5 WPT, 6 WPT, 7 WPT, 8 WPT, 및 수확시로 이루어진 군으로부터 선택된 시기에 측정되는 것인 담배 식물 또는 그의 일부분.
실시양태 68. 실시양태 37-67 중 어느 하나에 있어서, 상기 담배 식물이 상기 대조군 식물로부터의 잎과 대등한 잎 등급을 갖는 잎을 생성할 수 있는 것인 담배 식물 또는 그의 일부분.
실시양태 69. 실시양태 37-68 중 어느 하나에 있어서, 상기 담배 식물이 상기 대조군 식물과 대등한 총 잎 수율을 갖는 것인 담배 식물 또는 그의 일부분.
실시양태 70. 이전의 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 상기 담배 식물이 3% 미만, 2.75% 미만, 2.5% 미만, 2.25% 미만, 2.0% 미만, 1.75% 미만, 1.5% 미만, 1.25% 미만, 1% 미만, 0.9% 미만, 0.8% 미만, 0.7% 미만, 0.6% 미만, 0.5% 미만, 0.4% 미만, 0.3% 미만, 0.2% 미만, 0.1% 미만, 및 0.05% 미만으로 이루어진 군으로부터 선택된 니코틴 수준을 포함하는 것인 담배 식물 또는 그의 일부분.
실시양태 71. 실시양태 37-70 중 어느 하나에 있어서, 상기 담배 식물이 대등한 재배 조건에서 재배할 때 상기 대조군 식물의 니코틴 수준의 1% 미만, 2% 미만, 5% 미만, 8% 미만, 10% 미만, 12% 미만, 15% 미만, 20% 미만, 25% 미만, 30% 미만, 40% 미만, 50% 미만, 60% 미만, 70% 미만, 또는 80% 미만인 수준으로 니코틴을 포함하는 것인 담배 식물 또는 그의 일부분.
실시양태 72. 이전의 실시양태 중 어느 하나의 담배 식물의 집단.
실시양태 73. 이전의 실시양태 중 어느 하나의 담배 식물로부터 건조처리된 담배 물질.
실시양태 74. 실시양태 73에 있어서, 상기 건조처리된 담배 물질이 열 건조처리, 공기 건조처리, 불 건조처리, 및 일광 건조처리로 이루어진 군으로부터 선택된 건조처리 과정에 의해 제조되는 것인 건조처리된 담배 물질.
실시양태 75. 실시양태 73 또는 74의 상기 건조처리된 담배 물질을 포함하는 담배 블렌드.
실시양태 76. 실시양태 73-75 중 어느 하나에 있어서, 상기 건조처리된 담배 물질이 중량 기준으로 상기 담배 블렌드 중에서 건조처리된 담배의 약 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%를 구성하는 것인 담배 블렌드.
실시양태 77. 실시양태 73-76 중 어느 하나에 있어서, 상기 건조처리된 담배 물질이 부피 기준으로 상기 담배 블렌드 중에서 건조처리된 담배의 약 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%를 구성하는 것인 담배 블렌드.
실시양태 78. 실시양태 73-77 중 어느 하나의 건조처리된 담배 물질을 포함하는 담배 제품.
실시양태 79. 실시양태 78에 있어서, 상기 담배 제품이 궐련, 시가릴로, 비환기식 리세스 필터 궐련, 통기식 리세스 필터 궐련, 시가, 스너프, 파이프 담배, 시가 담배, 궐련 담배, 씹는 담배, 잎 담배, 썰은 담배, 및 절단 담배로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 담배 제품.
실시양태 80. 실시양태 78 또는 79에 있어서, 상기 담배 제품이 루즈 리프 씹는 담배, 플러그 씹는 담배, 습식 스너프, 및 비강 스너프로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 담배 제품.
실시양태 81. a. 담배 식물을 재배하고;
b. 상기 담배 식물에서 푸트레신의 수준을 감소시키고,
c. 상기 담배 식물로부터 잎을 수확하는 것을 포함하는,
감소된-알칼로이드 담배 식물에서 잎 품질을 개선시키는 방법.
실시양태 82. a. 담배 식물을 재배하고;
b. 상기 담배 식물에서 오르니틴 데카르복실라제 (ODC) 유전자의 발현 또는 활성을 억제하고,
c. 상기 담배 식물로부터 잎을 수확하는 것을 포함하는,
감소된-알칼로이드 담배 식물에서 잎 품질을 개선시키는 방법.
실시양태 83. 실시양태 81 또는 82에 있어서, 상기 억제가 2, 4, 6 또는 8 WPT 이내인 방법.
실시양태 84. 실시양태 81-83 중 어느 하나에 있어서, 상기 억제가 상기 담배 식물을 토핑하기 전 및 후 둘 다에 상기 ODC 유전자를 억제하는 것을 포함하는 것인 방법.
실시양태 85. 실시양태 82-84 중 어느 하나에 있어서, 상기 억제가 화학적 억제제의 사용을 포함하지 않는 것인 방법.
실시양태 86. 실시양태 82-85 중 어느 하나에 있어서, 상기 억제가 ODC 억제제를 상기 담배 식물에 적용하는 것을 포함하는 것인 방법.
실시양태 87. 실시양태 82-86 중 어느 하나에 있어서, 상기 억제가 ODC 억제제를 상기 담배 식물에 적용하는 것인 방법.
실시양태 88. 실시양태 82-87 중 어느 하나에 있어서, 상기 ODC 억제제가 DFMO인 방법.
실시양태 89. 실시양태 82-88 중 어느 하나에 있어서, 상기 억제가 상기 오르니틴 데카르복실라제 (ODC) 유전자의 억제를 위해 비코딩 RNA의 발현을 유도하는 것인 방법.
실시양태 90. 실시양태 82-89 중 어느 하나에 있어서, 상기 방법이 질소 비료를 감소시키거나 또는 질산염을 감소시키는 것을 추가로 포함하는 것인 방법.
실시예
실시예 1: 식물 물질 및 일반적인 재배 조건
니코티아나 타바쿰 엘. 씨브이. 버어리 21 야생형 NA, 뿐만 아니라 HI (nic2), LI (nic1) 및 LA (nic1nic2) 근동질성 품종의 종자를 노쓰 캐롤라이나 스테이트 유니버시티(North Carolina State University)의 유에스 니코티아나 점플라즘 콜렉션(US Nicotiana Germplasm Collection)으로부터 입수하였고, 모든 온실 실험에서 사용하였다. 27/23℃ 낮/밤 온도 및 16 시간 광주기 (~200 mmol s-1 m-2; λ = 400-700 nm)에서 70% 상대 습도에서 온실 조건하에 화분에서 종자를 발아시켰다. 5 주령의 담배 묘목을 표준 기질 (아인하이츠에르데(Einheitserde), 독일 프뢴덴베르크)을 갖는 13-L 화분으로 옮겼다. 식물을 4 시간마다 ~5 분 동안 작동하는 연속 점적 관개 시스템에 부착하였고, 16 시간 광주기 동안 5 min h-1 동안 16% 질소를 함유하는 0.7% (w/v) 퍼티 2 메가(Ferty 2 Mega) (풀란타 뒨게미텔(Planta Duengemittel), 독일 레겐스타우프)로 관개시키고, 추가 4 주 동안 재배하였다. 식물의 50%가 적어도 1개의 열린 꽃을 가졌을 때 온실 식물을 토핑하였다. 토핑 이후, 식물을 토핑후 30 일 째에 수확할 때까지 추가 4-7 주 동안 재배하였다. 폴리아민 분석을 위해 사용된 담배 잎을 3가지 시점: 개화기 이전 (6.5 주령의 식물), 토핑, 즉, 꽃 꼭대기의 제거 직전 (9 주령의 식물), 및 수확시에 (13 주령의 식물, 토핑후 4 주째) 온실-재배 식물로부터 수집하였다. 뿌리 샘플을 토핑 및 수확시에 수집하였다. LA 및 NA 담배 식물을 들판에서 에이커당 135 단위의 질소하에서 재배하였고, 폴리아민 분석을 위해 토핑후 1 주째에 샘플링하였다.
폴리아민 생합성 억제제로 처리하기 위해, 5 mM D-아르기닌 (아코스(AKos), 독일 스타이넨), 2 mM DFMO (신켐 어그 앤 코. 카게(Synchem Ug & Co. KG), 독일 펠스베르크) 단독 또는 0.5 mM 에테폰®과의 조합, 또는 0.5 mM 에테폰® 단독 (머크 카게아아(Merck KGaA), 독일 다름슈타트)을 매일 관개를 위해 사용된 물과 동일한 양으로 희석하고, 점적 관개 시스템 대신에 9 am, 12 am, 3 pm 및 6 pm에 4 시간마다 주 3회로 LA 식물에 적용하였다. D-아르기닌 및 DFMO로의 처리는 개화기 이전에 (식물이 여전히 식물 재배 단계에 있을 때 토핑하기 ~2.5 주 전에) 시작하여 수확할 때까지 6 주 동안 한 반면에, 에테폰®은 토핑시에서부터 수확시까지 (총 4 주) 적용하여 LA 식물의 조기 노화를 피하였다. 억제제당 12개의 식물을 처리하였다. NA 식물을 대조군으로서 사용하였고, LA 식물과 동일한 방식으로 처리하였다. 실험 절차 및 데이터에 대한 더욱 상세한 기재는 [Noelke G, et al. Polyamines delay leaf maturation in low-alkaloid tobacco varieties.　Plant Direct.　2018;2:1-12]을 참고한다.
실시예 2: 엽록소 측정
SPAD-502 플러스 장치 (미놀타 카메라 코.(Minolta Camera Co.), 일본 오사카)를 사용하여 적색 및 적외선 영역에서 잎 흡광도를 측정함으로써 엽록소 함량을 결정하였다. 엽록소를 5가지 재배 단계: 개화기 이전 (6.5 주령의 식물 및 토핑하기 2.5 주 전), 토핑시, 1 및 2.5 WPT, 및 수확시 (토핑후 30 일째) 개화기 이전에 각각의 계통으로부터 무작위로 선택된 6개의 식물로부터의 모든 완전히 확장된 (길이 >15 cm) 잎 (잎 6-26)에서 상이한 위치에서 동일한 날에 2회 측정하였다. 총 엽록소 함량은 식물당 측정된 모든 잎 엽록소 값의 평균으로서 계산하여, 잎 위치의 영향을 최소화하였다.
실시예 3: 잎 세포 현미경 검사
상이한 발달 단계에서 (개화기 이전, 토핑시, 1 WPT 및 수확시) 6개의 생물학적 복제물로부터의 잎 15로부터 절단된 4개의 잎 디스크 (1 cm2)를 슬라이드 상에 장착하고, 10x 공기 대물렌즈를 구비한 레이카(Leica) DM R 현미경 (레이카, 독일 베츨라)을 이용하여 영상화하였다. 영상을 이미지제이(ImageJ) 및 아도브 포토샵(Adobe Photoshop) CS5.1 소프트웨어에 가져와서, 단위 면적당 세포를 포토샵 CS5의 카운트 툴(Count Tool)을 사용하여 카운팅하였다. 모든 영상에 걸쳐 세포를 3회 카운팅하기 위해 표준 면적을 지정하였고, 임의의 세포를 두번 카운팅하지 않도록 주의하였다.
실시예 4: ODC 및 ADC 활성의 결정
효소 활성을 결정하기 위해, 3개의 생물학적 복제물의 잎 23으로부터 수집된 500 mg의 담배 잎 조직을 1 ml HEPES 추출 완충제 (100 mM HEPES, 2 mM 디티오트레이톨 (DTT), 1 mM EDTA, pH 7.5) 중에서 분쇄하고, 분쇄하는 동안 100 mg의 폴리비닐피롤리돈을 첨가하였다. 원심분리한 후에 (13,000 g, 10 min, 4℃), [Capell et al. (1998)]에 의해 기재된 동위원소 방법을 이용하여 14CO2의 방출을 측정함으로써 효소 활성을 측정하였다. L-[1-14C]Arg 및 L-[1-14C]Orn을 방사성 기질로서 사용하였다.
실시예 5: 폴리아민 추출 및 분석
폴리아민 분석을 위해, 150 μg의 잎 또는 뿌리 물질을 상이한 발달 단계: 개화기 이전 (잎 6 및 12, 바닥에서부터 넘버링), 토핑시 (잎 19 및 23 및 뿌리) 및 수확시에 (잎 23 및 24 및 뿌리) 온실에서 재배한 식물로부터 수확하였다. 3개의 생물학적 복제물로부터 4 시간 조명후에 샘플을 수집하였고, 액체 질소 중에서 급랭시켰다. 들판-재배 식물의 경우, 3개의 생물학적 복제물로부터의 5개의 잘 확장된 상부 잎으로부터 잎 물질을 수집하였다. 식물 물질을 1.6 ml 사전 냉각된 10% (v/v) 과염소산 중에서 분쇄하고, 4℃에서 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 추출물을 10 초 동안 볼텍싱하고, 원심분리한 후에 (16,000 g, 15 min, 4℃), 800 μl의 상청액을 100 μl의 1 mM 헥사메틸렌디아민과 혼합하였다. 이어서, 10 μl의 투명한 상청액을 새로운 2-ml 튜브로 옮기고, 유리 폴리아민의 단실화를 위해 폴리아민을 200 μl의 시클로헥산으로 추출하였다. 접합된 폴리아민의 추출을 위해, 펠렛을 1600 μl의 1 M NaOH 및 200 μl의 1 mM 헥사메틸렌디아민 중에 재현탁시키고, 상기와 같이 원심분리하였다. 투명한 상청액 (200 μl)을 12 M HCl을 함유하는 2-ml 유리 앰풀로 옮기고, 혼합하고, 접합된 폴리아민의 가수분해를 위해 110℃에서 16 시간 동안 밤새 인큐베이션하였다. 유리 및 접합된 폴리아민의 단실화를 [Flores and Galston (1982)]에 기재된 바와 같이 단실 클로라이드를 사용하여 수행하였다.
단실화된 폴리아민을 LC-MS/MS에 의해 측정하였다. 모든 실험은 HPLC 애질런트(Agilent) 1200 시스템 (발트브론(Waldbronn), 독일)에 커플링된 3200 큐트랩(QTRAP)™ 질량 분광계 (사이엑스(Sciex), 독일 다름슈타트) 상에서 수행하였다. 질량 분광계에 전기분무 이온화 소스를 장착하였다. 800 μl/min의 유속에서 상응하는 보호 컬럼을 갖는 80 Å 공극 크기, 4 μm 입자 크기 및 50 mm x 2.0 mm 내경의 치수를 갖는 역상 시너지 퓨전(Synergi Fusion) (페노메넥스(Phenomenex), 독일 아샤펜부르크) 상에서 샘플을 분리하였다. 컬럼 오븐을 30℃로 가열하였다. 용리를 위해, 용매 A는 94.9% (v/v) 물, 5% (v/v) 아세토니트릴, 0.1% (v/v) 포름산을 포함하였고, 용매 B는 94.9% (v/v) 아세토니트릴, 5% (v/v) 물, 0.1% (v/v) 포름산을 포함하였다. 용리 프로파일에 따른 용리를 이용하였다: 1 분, 60% 용매 A/40% 용매 B 유지; 3 분, 100% 용매 B로 선형 증가, 3 분 100% 용매 B에서 유지; 0.1 분 내에 60% 용매 A/40% 용매 B로 급속한 선형 감소; 1 분 동안 유지. 총 작동 시간은 8 분이었고, 각각의 작동에서 주입된 샘플 부피는 10 μl이었다.
질량 분광계를 Q1 및 Q3에서 단위 분해능으로 설정하였다. 모든 측정치를 다중 반응 모니터링 방식으로 캡쳐하였다. 화합물 최적화를 위해, 단실화 프로토콜에 따라 표준을 준비하고, 50:50 (v/v) 메탄올/물 중에 희석하고, 이온 소스에 직접 연결된 시린지 펌프를 사용하여 10 μl/min의 유속으로 주입하였다. 디클러스터링 전위, 충돌 에너지, 충돌 세포 유입 전위, 충돌 세포 방출 전위 및 유입 전위를 자동화된 화합물 최적화를 이용하여 모든 화합물에 대해 최적화하였다 (표 3). 이온 소스 파라미터를 설정하였다: 모세관 전압 = 5.5 kV, 가열기 기체 온도 = 500℃, 커튼 기체 = 30 psi, 네불라이징 기체 = 70 psi, 건조 기체 = 70 psi, 및 충돌 기체 = 중간. 각각의 피분석물에 대해, 하나의 전이는 정량화를 위해 사용되었고, 또 다른 것은 정성자(qualifier)로서 사용되었다. 획득된 데이터는 애널리스트(Analyst) v1.6 (사이엑스)을 이용하여 가공하였다. 3200 큐트랩의 질량 보정은 제조자의 지침에 따라 폴리프로필렌 글리콜 표준 (저농도/고농도 PPG를 갖는 표준 화학 키트, 사이엑스)을 이용하여 달성하였다.
표 3: 폴리아민 정량화를 위한 화합물 파라미터. DP = 디클러스터링 전위, CE = 충돌 에너지, CEP = 충돌 세포 유입 전위, CXP = 충돌 세포 방출 전위, EP = 유입 전위.
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실시예 6: 통계적 분석
유전자형들 사이의 차이는 엑셀(Excel) 소프트웨어 (마이크로소프트(Microsoft), 미국 위싱턴주 레드몬드)를 이용하여 일원 분산 분석 (ANOVA)에 이어서 사후 본페로니(post-hoc Bonferroni) 검사에 적용함으로써 결정되었다. 양측 t-검사를 적용하였다. p-값 < 0.05는 통계적으로 유의한 것으로 고려되었다.
실시예 7: 잎 숙성 동안에 4가지 품종 사이에서 생화학적 및 형태학적 차이
버어리 21 NA, HI, LI 및 LA 계통에서 노화의 진행을 잎에서 엽록소 a 및 b의 손실을 측정함으로써 모니터링하였다. 엽록소 수준은 토핑후 1 주째에 (WPT) 모든 유전자형에서 유의하게 감소하였다 (p<0.01) (도 1A). 그러나, LI 및 LA 식물의 잎은 2.5 WPT (두 유전자형 모두에서 22% 더 많이) 및 수확시에 (LI 및 LA 잎에서 각각 36% 및 44% 더 많이) NA 대조군에 비해 유의하게 (p<0.001) 더 높은 수준의 엽록소를 함유하였고, 이는 NA 대조군에 비해 더 느린 엽록소 분해를 나타낸다. 엽록소의 손실은 NA 식물의 잎에서의 형태학적 변화와 상관관계가 있었고, 즉, 이들은 주름지고, 가죽같으며, 누른 잎마름병을 가진 반면에, LA 잎은 매끈하고, 반짝이고, 녹색으로 유지되었다 (도 1B).
LA 및 NA 계통에서 구별되는 잎 형태를 고려하여, 엽육 세포의 크기 및 형태를 상이한 시점에서 조사하였다. 개화기 이전에, LA 식물의 잎 15 (바닥에서부터 넘버링)는 NA 식물에 비해 더 작고 더 풍부한 엽육 세포 (잎 면적 단위당 더 많은 세포)를 가졌다 (도 1C/D). 해당 시점에서부터 수확시까지, 단위 면적당 잎 엽육 세포의 개수는 NA 및 LA 계통 둘 다에서 유사한 속도로 감소하였지만, LA 식물은 숙성 동안에 유의하게 (p<0.05) 더 많은 개수의 엽육 세포를 유지하였다. 단위 면적당 엽육 세포 개수에서의 가장 큰 차이 (NA 대조군과 비교하여 LA 식물에서 54% 더 많은 세포)가 잎 발달의 초기 단계 (개화기 이전)에서 관찰되었다. LI 식물은 또한 NA 식물에 비해 더 많은 엽육 세포를 함유하였지만, LA 식물에서 관찰되는 정도는 아니었고, HI 및 NA 계통 사이에서 엽육 세포 개수에서의 유의한 차이는 없었다 (데이터는 도시되지 않음).
실시예 8: LA 식물은 NA 식물에 비해 더 높은 수준의 폴리아민을 축적한다
폴리아민 생합성에 대한 nic1nic2 이중 돌연변이의 영향을 조사하기 위해, NA 및 LA 식물에서 유리 및 접합된 푸트레신, 스페르미딘 및 스페르민의 수준을 액체 크로마토그래피 직렬식 질량 분광법 (LC-MS/MS)에 의해 비교하였다. 첫번째로, 폴리아민 함량을 들판-재배 식물의 잎 16-18에서 분석하였다. 1 WPT에서, 총 폴리아민 함량은 NA 식물과 비교하여 LA 식물에서 유의하게 더 높았다 (1.9배, p<0.001) (도 2A). 조성 분석은 LA 식물의 잎에서 유의하게 더 높은 수준의 유리 푸트레신 (1.4배, p<0.05), 접합된 푸트레신 (2.3배, p<0.005) 및 접합된 스페르미딘 (1.9배, (p<0.005) 수준을 나타내었고, 이는 폴리아민 생합성 경로가 nic1nic2 이중 돌연변이체에 의해 강력하게 유도되거나 또는 기질이 니코틴으로 추가로 가공되지 않아서 이들 물질이 축적된다는 것을 나타낸다. 대조적으로, LA 식물에서 유리 스페르미딘의 수준은 NA 식물에 비해 낮았지만, 상기 차이는 통계적으로 유의하지 않았다 (p>0.05).
폴리아민 생합성에 대한 다양한 환경 인자의 효과를 최소화하기 위해, 추가의 실험을 온도, 빛 및 습도의 관점에서 평균 들판 조건을 반영하는 제어된 온실 조건하에 수행하였다 (데이터는 도시되지 않음). 수확시에 (토핑후 30 일째) 온실에서 NA 및 LA 식물의 표현형은 식물 키, 잎 개수 및 잎 형태의 관점에서 들판에서 재배한 그들의 대응물과 유사하였다 (데이터는 도시되지 않음). 각각의 잎/뿌리 샘플을 식물마다 및 시점마다 1번만 수집하도록 실험을 고안함으로써 폴리아민 생합성에 대한 상처의 영향을 최소화시켰다. 동일한 발달 단계에 있는 잎에서 (즉, 개화기 이전의 잎 12, 토핑시의 잎 19 및 수확시의 잎 24) 총 폴리아민 함량의 시간-경과 모니터링은 NA 대조군과 비교하여 개화기 이전 (1.5배) 및 수확시에 (2.1배) LA 식물에서 유의하게 (p<0.05) 더 높은 수준의 폴리아민을 나타내었다 (도 2B). LA 식물은 또한 NA 대조군과 비교하여 토핑시 (2.4배) 및 수확시에 (1.4배) 뿌리에서 유의하게 (p<0.05) 더 높은 수준의 총 폴리아민을 축적하였다 (도 2B)
실시예 9: 폴리아민 생합성에 대한 nic1nic2 이중 돌연변이의 효과
4가지 품종의 선택된 잎 (개화기 이전의 잎 6, 토핑시의 어린 잎 23 및 수확시의 성숙한 잎 23)에서 폴리아민 조성물의 비교 분석에 의해, 개화기 이전에 계통 LI 및 LA가 NA 대조군에 비해 유의하게 (p<0.05) 더 높은 수준의 유리 푸트레신을 함유하였고 (각각 1.6배 및 4.2배 더 높음), 훨씬 더 높은 수준의 접합된 푸트레신을 함유한 것으로 (각각 2.1배 및 5배 도 높음) 나타났다 (도 3A). 접합된 푸트레신 및 스페르미딘 분획은 4가지 모든 품종에서 숙성 동안에 연속적으로 증가하였지만, NA 대조군에 비해 LI 및 LA 식물에서 유의하게 더 높게 유지되었다 (도 3A). 폴리아민 함량에서의 가장 큰 차이는 수확시의 LA 잎에서 관찰되었으며, 유리 푸트레신에서 1.8배 증가, 접합된 푸트레신에서 2.9배 증가 및 접합된 스페르미딘에서 2.4배 증가를 비롯하여, NA 대조군에 비해 총 폴리아민 수준에서 2.1배 증가가 관찰되었다. 그러나, NA 및 HI 품종 사이에는 유의한 차이가 없었으며, 이는 nic2 단일 돌연변이가 폴리아민 축적에 대해 보다 낮은 영향을 미쳤음을 나타낸다.
토핑시에, LA 식물의 뿌리는 NA 식물에 비해 유의하게 (p<0.05) 더 높은 수준의 유리 푸트레신, 접합된 푸트레신 및 접합된 스페르미딘을 함유하였고 (각각 2.6배, 2.9배 및 2.5배 증가), 이러한 차이는 수확시에도 관찰되었다 (각각 1.6배, 1.4배 및 2.5배 증가) (도 3B).
실시예 10: 폴리아민 생합성 경로는 LA 식물에서 더욱 활성이다
푸트레신 생합성에 대한 ADC 및 ODC의 상대적인 기여를 토핑시 및 수확시에 NA 및 LA 식물의 잎 (잎 23) 및 뿌리에서 각각의 효소의 활성을 측정함으로써 평가하였다. ADC 및 ODC 활성은 두 계통 모두에서 기관-특이적 및 발달 단계-특이적 방식으로 변하였다 (도 4). ADC 활성이 두 계통 모두에서 잎에서는 높고 뿌리에서는 최소였던 반면에, ODC 활성은 더 어린 잎 및 뿌리에서 더 높았고, 이는 ODC가 뿌리에서 푸트레신 생합성을 주로 담당한다는 것을 나타낸다. ADC 활성은 토핑시 및 수확시에 NA 대조군에 비해 LA 식물의 잎에서 유의하게 더 높았다 (1.4배, p<0.05) (도 4A). 유사하게, ODC 활성은 토핑시 (1.8배) 및 수확시에 (1.7배) 뿌리에서, 및 토핑시에 (1.5배) 어린 잎에서 NA 대조군에 비해 LA 식물에서 유의하게 더 높았다 (p<0.05) (도 4B).
실시예 11: LA 품종에서 폴리아민 생합성의 억제
LA 품종에서 더 높은 폴리아민 수준과 바람직하지 않은 잎 형태 사이의 상관관계를 고려하여, ADC 및 ODC를 억제하는 화학물질로 식물을 처리하는 효과를 평가하였다. 예비 실험은 적절한 억제제 농도, 적용 시간, 처리 강도 및 지속시간을 정의하였다 (데이터는 도시되지 않음). 유리 및 접합된 푸트레신의 수준은 개화기 이전 및 수확시에 NA 대조군에 비해 LA 식물에서 유의하게 더 높았으며 (도 3), 따라서 ADC 억제제 D-아르기닌 및 ODC 억제제 디플루오로메틸오르니틴 (DFMO)을 토핑하기 2.5 주 전에 적용하기 시작하여 수확할 때까지 계속 처리하였다. 또한, 식물 성장 조절제 에테폰®을 단독으로 또는 DFMO와 조합하여 사용하여, 에틸렌의 방출을 통해 숙성을 가속시켰다. 노화의 조기 유도를 피하기 위해, 에테폰®을 토핑시부터 수확할 때까지 적용하였다.
DFMO 및 DFMO/에테폰® 처리는 형태학적 표현형의 부분적인 개선을 달성하였고, 따라서 LA 식물의 잎은 NA 잎의 일부 특징 (주름 및 엽록소 분해)을 갖는 반면에, 에테폰® 단독으로의 처리는 엽록소 함량을 감소시켰지만, 잎 형태에는 영향을 미치지 않았다 (도 5). 개화기 이전에 DFMO 처리의 시작은 재배 정지를 일으켰고, 상기 처리를 토핑시에 시작할 때에는 재배 정지가 관찰되지 않았다 (데이터는 도시되지 않음). D-아르기닌 처리는 LA 식물의 엽록소 수준 또는 형태에 영향을 미치지 않았다.
폴리아민 수준의 분석에 의해, 토핑하기 2.5 주 전에 DFMO 처리가 LA 잎에서 총 폴리아민의 수준을 2.1배만큼 증가시켰고, 이는 주로 더 높은 수준의 접합된 푸트레신 및 접합된 스페르미딘을 반영하는 것으로 나타났다 (도 6A). 이러한 더 높은 비율의 접합된 폴리아민은 DFMO 및 DFMO/에테폰®으로 처리된 식물에서 수확시까지 유지되었다. 대조적으로, 에테폰® 단독으로의 처리는 수확시에 총 폴리아민 수준에서의 유의한 감소를 유도하였고, 이는 주로 유리 및 접합된 푸트레신의 감소를 반영하였다. 뿌리에서, DFMO 처리는 주로 유리 및 접합된 푸트레신 및 접합된 스페르미딘의 감소로 인해 토핑시 (1.5배) 및 수확시에 (1.4배) LA 식물의 총 폴리아민 함량을 유의하게 감소시켰다 (p<0.05) (도 6B). 이러한 감소는 에테폰®의 첨가에 의해 되돌려지지 않았다. 잎에서의 효과와는 대조적으로, 에테폰® 단독의 처리는 뿌리의 폴리아민 함량에 대해 영향을 미치지 않았다. D-아르기닌 처리는 LA 식물의 폴리아민 함량에 대해 영향을 미치지 않았다. 따라서, 뿌리에서 폴리아민의 손실은 뿌리에서 푸트레신 생합성을 담당하는 주요 효소인 ODC 활성의 억제를 반영한다.
실시예 12: 유전자 조작에 의한 폴리아민 수준의 변경
nic1 nic2 돌연변이성 백그라운드에서 ODC 활성을 억제하기 위해 변형된 담배 식물을 준비하였다. 토핑-반응성 프로모터 (예를 들어, 서열식별번호: 1 내지 21)를 사용하여 ODC RNAi 카세트 (예를 들어, 서열식별번호: 22)를 유도하여, 하나 이상의 ODC 유전자 (예를 들어, 서열식별번호: 23 내지 34에 제시된 코딩 서열 또는 단백질 서열)의 억제를 달성하였다. 트랜스제닉 식물을 생성하고, 예를 들어 총 잎 폴리아민 수준, 총 뿌리 폴리아민 수준, 총 잎 엽록소 수준, 잎 면적 단위당 엽육 세포 개수, 잎 표피 세포 크기, 및 건조처리된 잎 등급을 비롯하여 잎 표현형에 대해 평가하였다.
nic1 nic2 돌연변이성 버어리 백그라운드에서 MYB8 유전자의 발현 및 활성을 조절하기 위해 변형된 담배 식물을 또한 준비하였다. MYB8은 니코티아나 아테뉴아타(Nicotiana attenuata)에서 3가지 히드록시신나모일-조효소 A:폴리아민 트랜스퍼라제를 활성화시킴으로써 유도성 페놀아미드 수준을 제어하는 것으로 보고되었다. [Onkokesung et al., Plant Physiology 158 (1) 389-407 (2012)]를 참고한다. 구성적 프로모터 또는 토핑-반응성 프로모터 (예를 들어, 서열식별번호: 1 내지 21)를 사용하여 MYB8 RNAi 카세트 또는 MYB8 cDNA 서열을 유도하여, 각각 억제 또는 과발현을 달성하였다. 트랜스제닉 식물을 생성하고, 예를 들어 총 잎 폴리아민 수준, 총 뿌리 폴리아민 수준, 총 잎 엽록소 수준, 잎 면적 단위당 엽육 세포 개수, 잎 표피 세포 크기, 및 건조처리된 잎 등급을 비롯하여 잎 표현형에 대해 평가하였다.
실시예 13: 육종 집단
저-알칼로이드 담배 잡종, 품종 또는 계통은 버어리 유형, 진한 유형, 열-건조처리된 유형, 메릴랜드 유형 또는 오리엔탈 유형 담배로 제조될 수 있거나, 또는 본질적으로 BU 64, CC 101, CC 200, CC 27, CC 301, CC 400, CC 500, CC 600, CC 700, CC 800, CC 900, 코커 176, 코커 319, 코커 371 골드, 코커 48, CU 263, DF911, 갈파오 담배, GL 26H, GL 350, GL 600, GL 737, GL 939, GL 973, HB 04P, K 149, K 326, K 346, K 358, K394, K 399, K 730, KDH 959, KT 200, KT204LC, KY 10, KY 14, KY 160, KY 17, KY 171, KY 907, KY907LC, KTY14 x L8 LC, 리틀 크리텐든, 맥네어 373, 맥네어 944, msKY 14xL8, 내로우 리프 마돌, NC 100, NC 102, NC 2000, NC 291, NC 297, NC 299, NC 3, NC 4, NC 5, NC 6, NC7, NC 606, NC 71, NC 72, NC 810, NC BH 129, NC 2002, 닐 스미쓰 마돌, OXFORD 207, '페리큐' 담배, PVH03, PVH09, PVH19, PVH50, PVH51, R 610, R 630, R 7-11, R 7-12, RG 17, RG 81, RG H51, RGH 4, RGH 51, RS 1410, 스파이트 168, 스파이트 172, 스파이트 179, 스파이트 210, 스파이트 220, 스파이트 225, 스파이트 227, 스파이트 234, 스파이트 G-28, 스파이트 G-70, 스파이트 H-6, 스파이트 H20, 스파이트 NF3, TI 1406, TI 1269, TN 86, TN86LC, TN 90, TN 97, TN97LC, TN D94, TN D950, TR (톰 로쓴) 마돌, VA 309, 또는 VA359, 메릴랜드 609, HB3307PLC, HB4488PLC, KT206LC, KT209LC, KT210LC, KT212LC, R610LC, PVH2310, NC196, KTD14LC, KTD6LC, KTD8LC, PD7302LC, PD7305LC, PD7309LC, PD7318LC, PD7319LC, PD7312LC, ShireyLC, 또는 관련 기술분야에 공지된 표준 담배 육종 기술에 따른 임의의 상업적인 담배 품종으로부터 유래될 수 있다.
SEQUENCE LISTING <110> ALTRIA CLIENT SERVICES LLC <120> COMPOSITIONS AND METHODS FOR PRODUCING TOBACCO PLANTS AND PRODUCTS HAVING ALTERED ALKALOID LEVELS WITH DESIRABLE LEAF QUALITY <130> P34584WO00 <140> <141> <150> 62/638,928 <151> 2018-03-05 <160> 36 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 2001 <212> DNA <213> Nicotiana sp. <400> 1 cttttaccta aacttaaata ttggccttat gcacgggcat caactcgcgt attactaaga 60 agaaagaaga acggctcctc gtctcccatg tcggcctctg gaactcttaa tataaccgcc 120 gacagacaaa accggctggt ctctcactgt ttcttatcct cagaattatt atgaacataa 180 actaaagtac ctatctcttg ttttctcatt tcacaccatt tttttcttca cttcacactt 240 ggtctcaatc aaataaaaaa cagcaaccgc cttagcttgt tgtcttcttc actactccac 300 ttgtccctag agttccccaa aaatatcaag ctaagaaaaa gttaactaaa gaagagaata 360 tatgggagct gaggtttctt tcataagctg accgactctt tatttggcgg cgcttatttt 420 atttattact tcaaaagaaa agttcttttt gttttccttt tttataattt tcaactccca 480 acttgtgtgt gttgtctaaa tgtctatata taaatatgta tataacggtt tgtttaagaa 540 acttgcattg gtactggttt gttcttgtca 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900 gcatcgcgcg taccttgagg ctagtagaaa agaaaagtat gatagtatat gagtaacgtg 960 ttggaaatta agggaaggaa agaaaatttt ctttacatcc aaatttgaaa gttatttgac 1020 gtcatcgaga tgacggccat gttcaagttt tccacaaata atgtgaaaag aaaaagaaga 1080 agacacacac tgtgtttggt tttattatag ttttttcttt tagagaattg attgtacaaa 1140 ttattataag aaatagtata atataagatt tagaaataag attattagaa aaaacaaaca 1200 tcaaaaagta tttattttaa tttctttttc caatggacat tcccattctt ctgaaacaac 1260 atagataaaa atatgaaagc aaaaattatc agatcgttta atgcagataa tattaattaa 1320 cacattaacc ataaccaata ttttatttaa aaaaagcaca actgctagat caaaaaagtg 1380 tttaacttca tgcattgaca attttttaaa ataattttgc agcatcaggt aaaatatttt 1440 ttcttcgttt cccaccctgt gtacggtata cacgggtact tatattgggg cccaactaaa 1500 ttcggattcg tccggagaag tcccacattg gggcataaag cgctccctga cgaaggcgac 1560 tccataccca tggacttgaa cccgagacct ttggttaagg atgaacgaga cctccggtgc 1620 caggtaaaat attggtaact gcttatataa gtttaatatg gtaacctgag ccgaaggtct 1680 atcggaaaca gactttctgc cctatcaggg taggggtaag gtctgcatac acagtaccct 1740 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tacatttaac agcgtaaaat ggacggatat ttgggagagc agatttccat tggtccataa 660 gagaaacaac ttcacccaaa tctaacacgt aaaaaggttg tttctcatct tgtaattttt 720 gggttatgat tgataacatg aaatcttgga gggcatctct tgagagaggg atgacttttc 780 tggtaccgtt ttccgccgcc gccgctgtag gtgaagctcc gccgcctatt gtggactgaa 840 gaatggc 847 <210> 23 <211> 1302 <212> DNA <213> Nicotiana sp. <400> 23 atggccggcc aaacaatcat cgtttccggg ttgaacccgg cggccattct tcagtccaca 60 attggcggcg gagcttctcc tacagcggcg gcggcggcgg aaaacggcac cagaaaagtc 120 atccctctct caagagatgc cttacaagat ttcatgttat caatcataac ccaaaaatta 180 caagatgaga aacaaccttt ttacgtgcta gacttgggtg aggttgtttc tcttatggac 240 caatggaaat ctgctctccc aaatatccgt ccattttacg ctgttaaatg taaccctgaa 300 ccgtcgttcc tttcaatttt atctgctatg ggctcaaatt ttgattgtgc tagccgagct 360 gaaattgagt atgttttatc tcttggcatt tcacctgacc gtattgtttt cgcaaatcca 420 tgcaaaccgg aatccgatat tatttttgca gcaaaagttg gggtgaatct tacaacctat 480 gattctgaag acgaggttta caagatccga aagcatcacc cgaaatccga actcttgctc 540 cgcatcaagc ccatgctcga cggcaacgcg agatgcccaa tgggcccgaa atacggcgcg 600 cttccagaag aagtcgaccc gctgctccgg gcagctcaag ccgcccgtct caccgtatcc 660 ggcgtctcat tccacatcgg tagcggagat gccgattcaa acgcttatct cggcgccata 720 gccgcggcta aggaagtgtt tgaaacagct gctaaactcg ggatgtcgaa aatgactgtt 780 ctagacgtcg gcggcgggtt tacatccggc caccagttca caaccgccgc cgtcgccgtt 840 aaatcagctt taaaacaaca cttcgatgac gaaccggagt tgacaatcat agctgaaccg 900 ggtcggtttt ttgcagagac ggcgtttact ttggcaacga cgattatagg gaaaagagtg 960 aggggtgaat tgagggagta ttggattaac gacgggctgt acggttcgat gaactgtgta 1020 ctttacgacc atgcgacggt gaatgcaacg ccgttagctg ttctgtcgaa tcgtagtaac 1080 gttacctgcg gcgggtcgaa aacgtttccg acgactgtgt ttgggcccac ttgtgatgct 1140 cttgatactg ttttaaggga ttaccagtta ccggagctgc aggttaatga ttggctggtt 1200 tttcctaata tgggtgctta tactaaagct gctgggtcca attttaatgg atttaatact 1260 tccgccattg ttactcacct cgcttattct tatccaagct ga 1302 <210> 24 <211> 1299 <212> DNA <213> Nicotiana sp. <400> 24 atggccggcc aaacaataat cgtttccggg ttgaacccgg cggccattct tcagtccaca 60 ataggcggcg gagcttcacc tacagcggcg gcggcggaaa acggtaccag aaaagtcatc 120 cctctctcaa gagatgccct ccaagatttc atgttatcaa tcataaccca aaaattacaa 180 gatgagaaac aaccttttta cgtgttagat ttgggtgaag ttgtttctct tatggaccaa 240 tggaaatctg ctctcccaaa tatccgtcca ttttacgctg ttaaatgtaa ccctgaaccg 300 tcgttccttt caattttatc tgctatgggc tcaaattttg attgtgctag ccgagctgaa 360 attgagtacg ttttgtccct tggcatttca cctgaccgta ttgtttttgc aaatccatgc 420 aaaccggaat ccgatattat ttttgcagca aaagttgggg tgaatttaac aacgtacgat 480 tcagaagacg aggtttacaa gatccgaaag catcacccga aatccgaact cttgctccga 540 atcaagccaa tgttcgacgg caacgcgagg tgcccaatgg gtccaaaata cggcgcgctt 600 ccagaagaag tcgagccgct gctccgggca gctcaggccg cccggctcac cgtctccggt 660 gtctccttcc acatcggcag cggagatgcc gattcaaacg cttatctcgg cgccatagcc 720 gcggctaagg aagtgtttga aacagctgct aaactcggta tgtcgaaaat gactgttcta 780 gacgtcggcg gcgggtttac atccggccac cagttcacaa ccgccgccgt cgctgttaga 840 tcagctttaa aacaacactt cgatgatcaa ccggagttga caatcatagc tgaaccgggc 900 cggttttttg cggagactgc gtttacttta gcgacgacga ttatagggaa aagagtgagg 960 ggagaattga gggagtattg gattaacgac gggttgtacg gttcgatgaa ctgtgtactt 1020 tacgaccatg cgacggtgaa tgcaacgccg ttagctgttt tgtcgaatcg tactaacgtt 1080 acctgcggcg ggtcgaaaac gtttccgacg actgtgtttg ggcccacttg tgatgctctt 1140 gatactgttt taagggatta ccagttaccg gagctgcagg ttaatgattg gctagttttt 1200 cctaatatgg gtgcttatac taaagctgct gggtccaatt ttaatggatt taatacgtcc 1260 gccattgtta ctcacctcgc ttatgcttat ccaagctga 1299 <210> 25 <211> 807 <212> DNA <213> Nicotiana sp. <400> 25 atgccagatt taatccgttc aattgcagag aaccatgaag ctggccagcc attttatctc 60 atggatttgg ctataattga aaagctaatg gacaaatgga accattcttt tccaaatata 120 aaacctttct atgctgtgaa atgcaacacc gaacctgctc ttcttactaa actagccaaa 180 ttgggtgcaa attttgattg tgctagccaa ctagaaatag aaaccgtctt aaatctcgaa 240 attggcccaa accaaatcat atttgctaac ccatgcaaag ctatttccca catcaaatac 300 gcagccaatg ttggggtcaa tctcacaact tttgattcca aacttgaaat tgacaagatc 360 aagaaatggc acccacattg tcatttgttg cttcgagtta aagcgcctaa tgatagcggc 420 gcattacgtc ccctgggaaa aaaattcggc gtgctaccag aagaagttga gccactactg 480 cattacgctt gtaatgtggt cgggctaaaa gttgtaggcg tttcatttca tgttggatct 540 atagcacaaa atcctagcat ttatcgcgag gcgattgcag ctgctagggc cgtttttgat 600 gttgctgatc atcttcgaat gcctaaaatg caaattttaa acattggtgg aggatttaga 660 tcaacaccat tgttcgagga aatagctagt gtagtaaacg aggcagtcca agattatttt 720 cccatgacta atttaacaat atttgcagag ccagggcggt ttttttgcag aaacggaatt 780 tacgttagtc gctcatgtga ttggtaa 807 <210> 26 <211> 1140 <212> DNA <213> Nicotiana sp. <400> 26 atgccagatt taatccgttc aattgcagag aaccatgaag ctggccagcc attttatctc 60 atggatttgg ctataattga aaagctaatg gacaaatgga accattcttt tccaaatata 120 aaacctttct atgctgtgaa atgcaacagc gaacctgctc ttcttactaa actagccaaa 180 ttgggtgcaa attttgattg tgctagccaa ctagaaatag aaaccgtctt aaatctcgga 240 attagcccaa accaaatcat atttgctaac ccatgcaaag ctatttccca catcaaatac 300 gcagccaatg ttagggtcaa tctcacaact tttgattcca aacttgaaat tgacaagatc 360 aagaaacggc acccacattg tcatttgttg cttcgagtta aagcgcctaa tgatagtggc 420 gcattacgtc ccctgggaaa aaaattcggc gtgctaccag aagaagttga gccactactg 480 cattacgctt gtaatgtggt cgggctaaaa gttgtaggcg tttcatttca tgttggatct 540 atagcacaaa atcctagcat ttatcgcgag gcgattgcag ctgctagggc cgtttttgat 600 gttgctgatc atcttcgaat gcctaaaatg caaattttaa acattggtgg aggatttaga 660 tcaacaccat tgttcgagga aatagctagt gtagtaaacg aggcagtcca agattatttt 720 cccatgacta atttaacaat atttgcagag ccagggcggt tttttgcaga aacggcattt 780 acgttagtcg ctcatgtgat tggtaaaaga gttagaggtg agaaaataga atattggatt 840 gatgaaggga tttatggatc atttaggcca acactttata atagttgttt tgtgggtata 900 aagccattgt tacttcaggt aacagaaaaa tcttgtcaaa tttatgagtc aactatttat 960 ggaccaagtt gtgactcact tgatgcagtg gctattgaca taaacttgcc ggagcttcat 1020 ttggatgacc tgatagtgtt ttctaatatg ggtgcatatt caacatgtgg aggaactaag 1080 ttcaatggat ttgatatgtt atctacacct gcctatcttg ttaactcaaa ttctagctaa 1140 <210> 27 <211> 1140 <212> DNA <213> Nicotiana sp. <400> 27 atgccagatt taatccgttc aattgcagaa aaccatgaag ctggccagcc attttatcta 60 cttgatttgg ctataattga aaagcttatg gacaaatgga accattcttt tccaaatatg 120 aaacctttct atgctgtgaa atgcaacact gaacctgcac ttcttactaa actagccaaa 180 ttgggtgcaa attttgattg tgctagccaa ctagaaatag aaaccgtctt aaatctcgga 240 attagcccaa accaaatcat atttgctaac ccatgcaaag ctatttccca catcaaatac 300 gcagccactg ttggggtcaa tctcacaact tttgattcca aacttgaaat tgacaagatc 360 aagaaatggc aaccacaatg tcatttgttg cttcgaatta aagcccctag tgatagtggc 420 gcgttacgtc ccctgggaaa aaaatttggt gtattaccag aagaagttga gccattactg 480 cattatgctt ataatgtggt agggctgaaa gttgtaggcg tttcatttca cgttggatct 540 atagcacaag atcccagcat ttatcgcgag gcgattgcaa ctgctaggac cgtgtttgat 600 gttgttgatc atcttcgaat gcctaaaatg cagattttaa acattggtgg aggatttaga 660 tcaacaccat tgttcgagga aatagctagt gtggtaaatg aagcagtcca agattatttt 720 tccatgccta atttaacaat atttgcagag ccaggacggt tttttgcgga gacagccttt 780 acattagtca ctcatgtgat tggtaaaaga gttagaggtg aaaaaataga gtattggatt 840 gatgaaggga tttatggatc atttaggcca acactttata atagttgttt tgtgggtata 900 aaaccattgt tacgtcaggt aacagaaaaa tcttgtcaaa tttgtgagtc aactatttat 960 ggaccaagtt gtgactcact tgatgcagta gctattgaca taaaattgcc agagcttcat 1020 ttggatgacc tgatagtgtt ttacaacatg ggcgcatatt caatatgcgg aggaactaaa 1080 ttcaatggat ttgatatgtt atctacacct acctatcttg ttaacgcaaa ctctagctaa 1140 <210> 28 <211> 1053 <212> DNA <213> Nicotiana sp. <400> 28 atggacaaat ggaaccattc ttttccaaat ataaaacctt tctatgctgt gaaatgcaac 60 agtgaacctg cacttcttac taaactagcc aaattgggtg caaattttga ttgtgctagc 120 caactagaga tcgagaccgt cttaaatctc ggaattagcc ccaaccaaat catatttgct 180 aacccatgca aagctatttc ccacattaaa tacgcagcca atgttggggt caatctcaca 240 acttttgatt caaaacttga aattgacaag atcaagaaat ggcacccaca atgtcattta 300 ttgcttcgaa ttaaagcccc tagtgatagt ggctcgttac gtcccctggg aaaaaaattc 360 ggcgcgttac cagaagaagt tgagccacta ctgcattacg cttgtaatat ggtcgggcta 420 aaagttgtag gcgtttcatt tcacgttgga tctatagcac aagatcccag catttatcgc 480 gaggcgattg cagctgctag gaccgtgttt gatgttgctg atcatcttcg aatgcctaaa 540 atgcaaattt tagacattgg tggaggattt agatcgacac cattgttcga ggaaatagct 600 agtgtagtaa aaaaagcagt ccaagattat ttacccttgc ccaacttaac attatttgca 660 gagccagggc ggttttttgc agaaacggcc tttactttag tcactcatgt gattggtaaa 720 agagttagag gtgagaaaat agagtattgg attgatgaag ggatttatgg atcatttagg 780 ccaacgcttt acaatagttg ttttgtgggt attaagccat ttttacgtca ggttgaagaa 840 aaatcttgtc aaatatgtga gtcaactatt tatggaccaa gttgtgactc acttgatgca 900 gtggctattg acataaaatt gcccgagctt catttggatg atctgatagt gttttataac 960 atgggcgcat attcaatatg tggaggaact aagttcaatg gatttgatat gttatctacc 1020 cctatctatc ttgttaattc aaattcaagc taa 1053 <210> 29 <211> 433 <212> PRT <213> Nicotiana sp. <400> 29 Met Ala Gly Gln Thr Ile Ile Val Ser Gly Leu Asn Pro Ala Ala Ile 1 5 10 15 Leu Gln Ser Thr Ile Gly Gly Gly Ala Ser Pro Thr Ala Ala Ala Ala 20 25 30 Ala Glu Asn Gly Thr Arg Lys Val Ile Pro Leu Ser Arg Asp Ala Leu 35 40 45 Gln Asp Phe Met Leu Ser Ile Ile Thr Gln Lys Leu Gln Asp Glu Lys 50 55 60 Gln Pro Phe Tyr Val Leu Asp Leu Gly Glu Val Val Ser Leu Met Asp 65 70 75 80 Gln Trp Lys Ser Ala Leu Pro Asn Ile Arg Pro Phe Tyr Ala Val Lys 85 90 95 Cys Asn Pro Glu Pro Ser Phe Leu Ser Ile Leu Ser Ala Met Gly Ser 100 105 110 Asn Phe Asp Cys Ala Ser Arg Ala Glu Ile Glu Tyr Val Leu Ser Leu 115 120 125 Gly Ile Ser Pro Asp Arg Ile Val Phe Ala Asn Pro Cys Lys Pro Glu 130 135 140 Ser Asp Ile Ile Phe Ala Ala Lys Val Gly Val Asn Leu Thr Thr Tyr 145 150 155 160 Asp Ser Glu Asp Glu Val Tyr Lys Ile Arg Lys His His Pro Lys Ser 165 170 175 Glu Leu Leu Leu Arg Ile Lys Pro Met Leu Asp Gly Asn Ala Arg Cys 180 185 190 Pro Met Gly Pro Lys Tyr Gly Ala Leu Pro Glu Glu Val Asp Pro Leu 195 200 205 Leu Arg Ala Ala Gln Ala Ala Arg Leu Thr Val Ser Gly Val Ser Phe 210 215 220 His Ile Gly Ser Gly Asp Ala Asp Ser Asn Ala Tyr Leu Gly Ala Ile 225 230 235 240 Ala Ala Ala Lys Glu Val Phe Glu Thr Ala Ala Lys Leu Gly Met Ser 245 250 255 Lys Met Thr Val Leu Asp Val Gly Gly Gly Phe Thr Ser Gly His Gln 260 265 270 Phe Thr Thr Ala Ala Val Ala Val Lys Ser Ala Leu Lys Gln His Phe 275 280 285 Asp Asp Glu Pro Glu Leu Thr Ile Ile Ala Glu Pro Gly Arg Phe Phe 290 295 300 Ala Glu Thr Ala Phe Thr Leu Ala Thr Thr Ile Ile Gly Lys Arg Val 305 310 315 320 Arg Gly Glu Leu Arg Glu Tyr Trp Ile Asn Asp Gly Leu Tyr Gly Ser 325 330 335 Met Asn Cys Val Leu Tyr Asp His Ala Thr Val Asn Ala Thr Pro Leu 340 345 350 Ala Val Leu Ser Asn Arg Ser Asn Val Thr Cys Gly Gly Ser Lys Thr 355 360 365 Phe Pro Thr Thr Val Phe Gly Pro Thr Cys Asp Ala Leu Asp Thr Val 370 375 380 Leu Arg Asp Tyr Gln Leu Pro Glu Leu Gln Val Asn Asp Trp Leu Val 385 390 395 400 Phe Pro Asn Met Gly Ala Tyr Thr Lys Ala Ala Gly Ser Asn Phe Asn 405 410 415 Gly Phe Asn Thr Ser Ala Ile Val Thr His Leu Ala Tyr Ser Tyr Pro 420 425 430 Ser <210> 30 <211> 432 <212> PRT <213> Nicotiana sp. <400> 30 Met Ala Gly Gln Thr Ile Ile Val Ser Gly Leu Asn Pro Ala Ala Ile 1 5 10 15 Leu Gln Ser Thr Ile Gly Gly Gly Ala Ser Pro Thr Ala Ala Ala Ala 20 25 30 Glu Asn Gly Thr Arg Lys Val Ile Pro Leu Ser Arg Asp Ala Leu Gln 35 40 45 Asp Phe Met Leu Ser Ile Ile Thr Gln Lys Leu Gln Asp Glu Lys Gln 50 55 60 Pro Phe Tyr Val Leu Asp Leu Gly Glu Val Val Ser Leu Met Asp Gln 65 70 75 80 Trp Lys Ser Ala Leu Pro Asn Ile Arg Pro Phe Tyr Ala Val Lys Cys 85 90 95 Asn Pro Glu Pro Ser Phe Leu Ser Ile Leu Ser Ala Met Gly Ser Asn 100 105 110 Phe Asp Cys Ala Ser Arg Ala Glu Ile Glu Tyr Val Leu Ser Leu Gly 115 120 125 Ile Ser Pro Asp Arg Ile Val Phe Ala Asn Pro Cys Lys Pro Glu Ser 130 135 140 Asp Ile Ile Phe Ala Ala Lys Val Gly Val Asn Leu Thr Thr Tyr Asp 145 150 155 160 Ser Glu Asp Glu Val Tyr Lys Ile Arg Lys His His Pro Lys Ser Glu 165 170 175 Leu Leu Leu Arg Ile Lys Pro Met Phe Asp Gly Asn Ala Arg Cys Pro 180 185 190 Met Gly Pro Lys Tyr Gly Ala Leu Pro Glu Glu Val Glu Pro Leu Leu 195 200 205 Arg Ala Ala Gln Ala Ala Arg Leu Thr Val Ser Gly Val Ser Phe His 210 215 220 Ile Gly Ser Gly Asp Ala Asp Ser Asn Ala Tyr Leu Gly Ala Ile Ala 225 230 235 240 Ala Ala Lys Glu Val Phe Glu Thr Ala Ala Lys Leu Gly Met Ser Lys 245 250 255 Met Thr Val Leu Asp Val Gly Gly Gly Phe Thr Ser Gly His Gln Phe 260 265 270 Thr Thr Ala Ala Val Ala Val Arg Ser Ala Leu Lys Gln His Phe Asp 275 280 285 Asp Gln Pro Glu Leu Thr Ile Ile Ala Glu Pro Gly Arg Phe Phe Ala 290 295 300 Glu Thr Ala Phe Thr Leu Ala Thr Thr Ile Ile Gly Lys Arg Val Arg 305 310 315 320 Gly Glu Leu Arg Glu Tyr Trp Ile Asn Asp Gly Leu Tyr Gly Ser Met 325 330 335 Asn Cys Val Leu Tyr Asp His Ala Thr Val Asn Ala Thr Pro Leu Ala 340 345 350 Val Leu Ser Asn Arg Thr Asn Val Thr Cys Gly Gly Ser Lys Thr Phe 355 360 365 Pro Thr Thr Val Phe Gly Pro Thr Cys Asp Ala Leu Asp Thr Val Leu 370 375 380 Arg Asp Tyr Gln Leu Pro Glu Leu Gln Val Asn Asp Trp Leu Val Phe 385 390 395 400 Pro Asn Met Gly Ala Tyr Thr Lys Ala Ala Gly Ser Asn Phe Asn Gly 405 410 415 Phe Asn Thr Ser Ala Ile Val Thr His Leu Ala Tyr Ala Tyr Pro Ser 420 425 430 <210> 31 <211> 268 <212> PRT <213> Nicotiana sp. <400> 31 Met Pro Asp Leu Ile Arg Ser Ile Ala Glu Asn His Glu Ala Gly Gln 1 5 10 15 Pro Phe Tyr Leu Met Asp Leu Ala Ile Ile Glu Lys Leu Met Asp Lys 20 25 30 Trp Asn His Ser Phe Pro Asn Ile Lys Pro Phe Tyr Ala Val Lys Cys 35 40 45 Asn Thr Glu Pro Ala Leu Leu Thr Lys Leu Ala Lys Leu Gly Ala Asn 50 55 60 Phe Asp Cys Ala Ser Gln Leu Glu Ile Glu Thr Val Leu Asn Leu Glu 65 70 75 80 Ile Gly Pro Asn Gln Ile Ile Phe Ala Asn Pro Cys Lys Ala Ile Ser 85 90 95 His Ile Lys Tyr Ala Ala Asn Val Gly Val Asn Leu Thr Thr Phe Asp 100 105 110 Ser Lys Leu Glu Ile Asp Lys Ile Lys Lys Trp His Pro His Cys His 115 120 125 Leu Leu Leu Arg Val Lys Ala Pro Asn Asp Ser Gly Ala Leu Arg Pro 130 135 140 Leu Gly Lys Lys Phe Gly Val Leu Pro Glu Glu Val Glu Pro Leu Leu 145 150 155 160 His Tyr Ala Cys Asn Val Val Gly Leu Lys Val Val Gly Val Ser Phe 165 170 175 His Val Gly Ser Ile Ala Gln Asn Pro Ser Ile Tyr Arg Glu Ala Ile 180 185 190 Ala Ala Ala Arg Ala Val Phe Asp Val Ala Asp His Leu Arg Met Pro 195 200 205 Lys Met Gln Ile Leu Asn Ile Gly Gly Gly Phe Arg Ser Thr Pro Leu 210 215 220 Phe Glu Glu Ile Ala Ser Val Val Asn Glu Ala Val Gln Asp Tyr Phe 225 230 235 240 Pro Met Thr Asn Leu Thr Ile Phe Ala Glu Pro Gly Arg Phe Phe Cys 245 250 255 Arg Asn Gly Ile Tyr Val Ser Arg Ser Cys Asp Trp 260 265 <210> 32 <211> 379 <212> PRT <213> Nicotiana sp. <400> 32 Met Pro Asp Leu Ile Arg Ser Ile Ala Glu Asn His Glu Ala Gly Gln 1 5 10 15 Pro Phe Tyr Leu Met Asp Leu Ala Ile Ile Glu Lys Leu Met Asp Lys 20 25 30 Trp Asn His Ser Phe Pro Asn Ile Lys Pro Phe Tyr Ala Val Lys Cys 35 40 45 Asn Ser Glu Pro Ala Leu Leu Thr Lys Leu Ala Lys Leu Gly Ala Asn 50 55 60 Phe Asp Cys Ala Ser Gln Leu Glu Ile Glu Thr Val Leu Asn Leu Gly 65 70 75 80 Ile Ser Pro Asn Gln Ile Ile Phe Ala Asn Pro Cys Lys Ala Ile Ser 85 90 95 His Ile Lys Tyr Ala Ala Asn Val Arg Val Asn Leu Thr Thr Phe Asp 100 105 110 Ser Lys Leu Glu Ile Asp Lys Ile Lys Lys Arg His Pro His Cys His 115 120 125 Leu Leu Leu Arg Val Lys Ala Pro Asn Asp Ser Gly Ala Leu Arg Pro 130 135 140 Leu Gly Lys Lys Phe Gly Val Leu Pro Glu Glu Val Glu Pro Leu Leu 145 150 155 160 His Tyr Ala Cys Asn Val Val Gly Leu Lys Val Val Gly Val Ser Phe 165 170 175 His Val Gly Ser Ile Ala Gln Asn Pro Ser Ile Tyr Arg Glu Ala Ile 180 185 190 Ala Ala Ala Arg Ala Val Phe Asp Val Ala Asp His Leu Arg Met Pro 195 200 205 Lys Met Gln Ile Leu Asn Ile Gly Gly Gly Phe Arg Ser Thr Pro Leu 210 215 220 Phe Glu Glu Ile Ala Ser Val Val Asn Glu Ala Val Gln Asp Tyr Phe 225 230 235 240 Pro Met Thr Asn Leu Thr Ile Phe Ala Glu Pro Gly Arg Phe Phe Ala 245 250 255 Glu Thr Ala Phe Thr Leu Val Ala His Val Ile Gly Lys Arg Val Arg 260 265 270 Gly Glu Lys Ile Glu Tyr Trp Ile Asp Glu Gly Ile Tyr Gly Ser Phe 275 280 285 Arg Pro Thr Leu Tyr Asn Ser Cys Phe Val Gly Ile Lys Pro Leu Leu 290 295 300 Leu Gln Val Thr Glu Lys Ser Cys Gln Ile Tyr Glu Ser Thr Ile Tyr 305 310 315 320 Gly Pro Ser Cys Asp Ser Leu Asp Ala Val Ala Ile Asp Ile Asn Leu 325 330 335 Pro Glu Leu His Leu Asp Asp Leu Ile Val Phe Ser Asn Met Gly Ala 340 345 350 Tyr Ser Thr Cys Gly Gly Thr Lys Phe Asn Gly Phe Asp Met Leu Ser 355 360 365 Thr Pro Ala Tyr Leu Val Asn Ser Asn Ser Ser 370 375 <210> 33 <211> 379 <212> PRT <213> Nicotiana sp. <400> 33 Met Pro Asp Leu Ile Arg Ser Ile Ala Glu Asn His Glu Ala Gly Gln 1 5 10 15 Pro Phe Tyr Leu Leu Asp Leu Ala Ile Ile Glu Lys Leu Met Asp Lys 20 25 30 Trp Asn His Ser Phe Pro Asn Met Lys Pro Phe Tyr Ala Val Lys Cys 35 40 45 Asn Thr Glu Pro Ala Leu Leu Thr Lys Leu Ala Lys Leu Gly Ala Asn 50 55 60 Phe Asp Cys Ala Ser Gln Leu Glu Ile Glu Thr Val Leu Asn Leu Gly 65 70 75 80 Ile Ser Pro Asn Gln Ile Ile Phe Ala Asn Pro Cys Lys Ala Ile Ser 85 90 95 His Ile Lys Tyr Ala Ala Thr Val Gly Val Asn Leu Thr Thr Phe Asp 100 105 110 Ser Lys Leu Glu Ile Asp Lys Ile Lys Lys Trp Gln Pro Gln Cys His 115 120 125 Leu Leu Leu Arg Ile Lys Ala Pro Ser Asp Ser Gly Ala Leu Arg Pro 130 135 140 Leu Gly Lys Lys Phe Gly Val Leu Pro Glu Glu Val Glu Pro Leu Leu 145 150 155 160 His Tyr Ala Tyr Asn Val Val Gly Leu Lys Val Val Gly Val Ser Phe 165 170 175 His Val Gly Ser Ile Ala Gln Asp Pro Ser Ile Tyr Arg Glu Ala Ile 180 185 190 Ala Thr Ala Arg Thr Val Phe Asp Val Val Asp His Leu Arg Met Pro 195 200 205 Lys Met Gln Ile Leu Asn Ile Gly Gly Gly Phe Arg Ser Thr Pro Leu 210 215 220 Phe Glu Glu Ile Ala Ser Val Val Asn Glu Ala Val Gln Asp Tyr Phe 225 230 235 240 Ser Met Pro Asn Leu Thr Ile Phe Ala Glu Pro Gly Arg Phe Phe Ala 245 250 255 Glu Thr Ala Phe Thr Leu Val Thr His Val Ile Gly Lys Arg Val Arg 260 265 270 Gly Glu Lys Ile Glu Tyr Trp Ile Asp Glu Gly Ile Tyr Gly Ser Phe 275 280 285 Arg Pro Thr Leu Tyr Asn Ser Cys Phe Val Gly Ile Lys Pro Leu Leu 290 295 300 Arg Gln Val Thr Glu Lys Ser Cys Gln Ile Cys Glu Ser Thr Ile Tyr 305 310 315 320 Gly Pro Ser Cys Asp Ser Leu Asp Ala Val Ala Ile Asp Ile Lys Leu 325 330 335 Pro Glu Leu His Leu Asp Asp Leu Ile Val Phe Tyr Asn Met Gly Ala 340 345 350 Tyr Ser Ile Cys Gly Gly Thr Lys Phe Asn Gly Phe Asp Met Leu Ser 355 360 365 Thr Pro Thr Tyr Leu Val Asn Ala Asn Ser Ser 370 375 <210> 34 <211> 350 <212> PRT <213> Nicotiana sp. <400> 34 Met Asp Lys Trp Asn His Ser Phe Pro Asn Ile Lys Pro Phe Tyr Ala 1 5 10 15 Val Lys Cys 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Leu Val Thr His Val Ile Gly Lys 225 230 235 240 Arg Val Arg Gly Glu Lys Ile Glu Tyr Trp Ile Asp Glu Gly Ile Tyr 245 250 255 Gly Ser Phe Arg Pro Thr Leu Tyr Asn Ser Cys Phe Val Gly Ile Lys 260 265 270 Pro Phe Leu Arg Gln Val Glu Glu Lys Ser Cys Gln Ile Cys Glu Ser 275 280 285 Thr Ile Tyr Gly Pro Ser Cys Asp Ser Leu Asp Ala Val Ala Ile Asp 290 295 300 Ile Lys Leu Pro Glu Leu His Leu Asp Asp Leu Ile Val Phe Tyr Asn 305 310 315 320 Met Gly Ala Tyr Ser Ile Cys Gly Gly Thr Lys Phe Asn Gly Phe Asp 325 330 335 Met Leu Ser Thr Pro Ile Tyr Leu Val Asn Ser Asn Ser Ser 340 345 350 <210> 35 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 35 ttggctagga gagtcagaag tg 22 <210> 36 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 36 tcatcgaacg cttgttcccg tg 22

Claims (20)

  1. 오르니틴 데카르복실라제 (ODC) 유전자의 억제를 위해 비코딩 RNA를 코딩하는 전사가능한 DNA 서열에 작동가능하게 연결된 유도성 프로모터를 포함하는 담배 식물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 담배 식물이 상기 돌연변이 또는 상기 트랜스진을 포함하지 않는 대조군 식물의 대등한 잎에 비해 적어도 20% 이내인 1종 이상의 폴리아민의 수준을 포함하는 잎을 생성할 수 있는 것인 담배 식물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 담배 식물이 상기 돌연변이 또는 상기 트랜스진을 포함하지 않는 대조군 식물의 대등한 잎에 비해 적어도 20% 이내인 엽록소 수준을 포함하는 잎을 생성할 수 있는 것인 담배 식물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 담배 식물이 상기 돌연변이 또는 상기 트랜스진을 포함하지 않는 대조군 식물의 대등한 잎에 비해 적어도 20% 이내인 잎 면적 단위당 엽육 세포의 개수를 포함하는 잎을 생성할 수 있는 것인 담배 식물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 담배 식물이 상기 돌연변이 또는 상기 트랜스진을 포함하지 않는 대조군 식물의 대등한 잎에 비해 적어도 20% 이내인 표피 세포 크기를 포함하는 잎을 생성할 수 있는 것인 담배 식물.
  6. 제1항에 있어서, 상기 담배 식물이 상기 돌연변이 또는 상기 트랜스진을 포함하지 않는 대조군 식물의 대등한 잎에 비해 적어도 20% 이내인 잎 수율을 포함하는 것인 담배 식물.
  7. 제1항에 있어서, 상기 오르니틴 데카르복실라제 (ODC) 유전자가 서열식별번호: 29, 30, 31, 32, 33 및 34로 이루어진 군으로부터 선택된 서열과 적어도 80% 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열을 코딩하는 것인 담배 식물.
  8. 제7항에 있어서, 상기 ODC 유전자가 서열식별번호: 23, 24, 25, 26, 27 및 28로 이루어진 군으로부터 선택된 서열과 적어도 90% 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 담배 식물.
  9. 제1항에 있어서, 상기 유도성 프로모터가 서열식별번호: 1-, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 및 21로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 것인 담배 식물.
  10. 제1항에 있어서, 상기 비코딩 RNA가 서열식별번호: 35 및 36으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열과 적어도 90% 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 담배 식물.
  11. 제10항에 있어서, 상기 비코딩 RNA가 서열식별번호: 22와 적어도 90% 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 ODC RNAi 구축물로 제공되는 것인 담배 식물.
  12. 대조군 담배 식물과 비교하여 하기를 포함하는 담배 식물 또는 그의 일부분이며:
    a. 보다 낮은 수준의 니코틴 또는 총 알칼로이드를 제공하는 제1 게놈 변형, 및
    b. 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 형질의 대등한 수준을 제공하는 제2 게놈 변형
    i. 총 잎 폴리아민 수준,
    ii. 총 뿌리 폴리아민 수준,
    iii. 총 잎 엽록소 수준,
    iv. 잎 면적 단위당 엽육 세포 개수, 및
    v. 잎 표피 세포 크기;
    상기 대조군 식물은 상기 제1 및 상기 제2 게놈 변형을 둘 다 갖지 않는 것인 담배 식물 또는 그의 일부분.
  13. 제12항에 있어서, 상기 담배 식물이 상기 대조군 담배 식물에 비해 잎 또는 뿌리에서 감소된 양의 총 유리 폴리아민을 포함하는 것인 담배 식물 또는 그의 일부분.
  14. 제12항에 있어서, 상기 담배 식물이 상기 대조군 식물로부터의 잎과 대등한 잎 등급을 갖는 잎을 생성할 수 있는 것인 담배 식물 또는 그의 일부분.
  15. 제1항의 담배 식물로부터의 건조처리된 담배 물질.
  16. 제15항의 건조처리된 담배 물질을 포함하는 담배 제품.
  17. 제16항에 있어서, 상기 담배 제품이 궐련, 시가릴로, 비환기식 리세스 필터 궐련, 통기식 리세스 필터 궐련, 시가, 스너프, 파이프 담배, 시가 담배, 궐련 담배, 씹는 담배, 잎 담배, 썰은 담배, 루즈 리프 씹는 담배, 플러그 씹는 담배, 습식 스너프, 비강 스너프, 및 절단 담배로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 담배 제품.
  18. 제12항의 담배 식물로부터 건조처리된 담배 물질.
  19. 제18항의 건조처리된 담배 물질을 포함하는 담배 제품.
  20. 제19항에 있어서, 상기 담배 제품이 궐련, 시가릴로, 비환기식 리세스 필터 궐련, 통기식 리세스 필터 궐련, 시가, 스너프, 파이프 담배, 시가 담배, 궐련 담배, 씹는 담배, 잎 담배, 썰은 담배, 루즈 리프 씹는 담배, 플러그 씹는 담배, 습식 스너프, 비강 스너프, 및 절단 담배로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 담배 제품.
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