JP2023504511A - 変化したアルカロイドレベルを有するタバコ植物およびタバコ製品を作製するための組成物および方法 - Google Patents
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Abstract
本開示は、タバコ植物においてアルカロイドまたはニコチンレベルをコントロールするための組成物および方法を提供する。また、変化した総アルカロイドおよびニコチンレベルと、商業的に許容される葉グレードとを有するタバコ植物を作製するための標的遺伝子（例えば、アルギニンデカルボキシラーゼ（ＡＤＣ）、アスパラギン酸オキシダーゼ（ＡＯ）、またはオルニチンデカルボキシラーゼ（ＯＤＣ））の特定および遺伝子操作、育種またはトランスジェニックアプローチを介した該タバコ植物の開発、ならびに該タバコ植物からのタバコ製品の作製も提供される。TIFF2023504511000019.tif99138
Description
関連出願の相互参照
本出願は、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる、２０１９年１２月３日に出願された米国特許仮出願第６２／９４２，９５７号の優先権の恩典を主張する。
本出願は、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる、２０１９年１２月３日に出願された米国特許仮出願第６２／９４２，９５７号の優先権の恩典を主張する。
配列表の組込み
２８３，１１５バイト（ＭＳ－Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）において測定）であり、２０２０年１２月２日に作成された「Ｐ３４７７５ＷＯ００＿ＳＬ．ｔｘｔ」という名称のファイルに含有される配列表は、本明細書と共に電子的に提出され、参照することによりその全体が組み込まれる。
２８３，１１５バイト（ＭＳ－Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）において測定）であり、２０２０年１２月２日に作成された「Ｐ３４７７５ＷＯ００＿ＳＬ．ｔｘｔ」という名称のファイルに含有される配列表は、本明細書と共に電子的に提出され、参照することによりその全体が組み込まれる。
分野
本開示は、変化した総アルカロイドおよびニコチンレベルと、商業的に許容される葉グレードとを有するタバコ植物、育種またはトランスジェニックアプローチを介した該タバコ植物の開発、ならびに該タバコ植物からのタバコ製品の作製を含む。
本開示は、変化した総アルカロイドおよびニコチンレベルと、商業的に許容される葉グレードとを有するタバコ植物、育種またはトランスジェニックアプローチを介した該タバコ植物の開発、ならびに該タバコ植物からのタバコ製品の作製を含む。
背景
ニコチンは、タバコ葉に蓄積する主要なアルカロイドである。ニコチンおよび他の微量アルカロイド（例えば、ノルニコチン、アナバシン、およびアナタビン）はまた、タバコ特異的ニトロソアミン（ＴＳＮＡ）の前駆体でもある。より低いレベルのニコチンを有するタバコ栽培品種の開発について、需要が存在する。
ニコチンは、タバコ葉に蓄積する主要なアルカロイドである。ニコチンおよび他の微量アルカロイド（例えば、ノルニコチン、アナバシン、およびアナタビン）はまた、タバコ特異的ニトロソアミン（ＴＳＮＡ）の前駆体でもある。より低いレベルのニコチンを有するタバコ栽培品種の開発について、需要が存在する。
商用タバコ栽培品種において、ニコチンは、総アルカロイドプールの９０～９５％、または総葉乾燥重量の２～５％に相当する。ニコチンは、根において合成され、木部を通って植物の地上部（ａｅｒｉａｌ ｐａｒｔ）に転流され、そこで葉に蓄積し、昆虫草食に応答して突起様構造によって滲出される。
葉の表現型に影響を及ぼすことなくアルカロイド、より具体的にはニコチンを低減するために、ならびに（優れたタバコ葉の品質を作らない場合には）タバコ葉の品質を維持しながら、変化したニコチンレベル（例えば、低減したニコチン）を含有するタバコ植物およびタバコ製品を開発するために、操作することができる遺伝子を特定する必要がある。
概要
一局面では、本開示は、遺伝子中の、かつ遺伝子の発現または活性を下方制御する遺伝子改変を含む、改変タバコ植物またはその部分を提供し、該遺伝子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９～３６からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％の同一性を有する核酸配列をコードする。
一局面では、本開示は、遺伝子中の、かつ遺伝子の発現または活性を下方制御する遺伝子改変を含む、改変タバコ植物またはその部分を提供し、該遺伝子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９～３６からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％の同一性を有する核酸配列をコードする。
一局面では、本開示は、遺伝子を標的とする、かつ遺伝子の発現または活性を下方制御する遺伝子改変を含む、改変タバコ植物またはその部分を提供し、該遺伝子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９～３６からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％の同一性を有する核酸配列をコードする。
別の局面では、本開示は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～３６からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するポリヌクレオチド中の非天然変異を含む、改変タバコ植物またはその部分を提供する。
一局面では、本開示は、非コーディングＲＮＡ分子をコードするポリヌクレオチドに機能的に連結された異種プロモーターを含む組換え核酸構築物を含む、改変タバコ植物またはその部分を提供し、該非コーディングＲＮＡ分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９～３６からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するｍＲＮＡに結合することができる。
別の局面では、本開示は、遺伝子中の、かつ遺伝子の発現または活性を下方制御する遺伝子改変を含む、改変タバコ植物またはその部分を提供し、該遺伝子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７～５４からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性または類似性を有するポリペプチドをコードする。
一局面では、本開示は、遺伝子を標的とする、かつ遺伝子の発現または活性を下方制御する遺伝子改変を含む、改変タバコ植物またはその部分を提供し、該遺伝子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７～５４からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性または類似性を有するポリペプチドをコードする。
一局面では、本開示は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７～５４からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性または類似性を有するポリペプチドをコードする核酸配列を有するポリヌクレオチド中の非天然変異を含む、改変タバコ植物またはその部分を提供する。
別の局面では、本開示は、非コーディングＲＮＡ分子をコードするポリヌクレオチドに機能的に連結された異種プロモーターを含む組換え核酸構築物を含む、改変タバコ植物またはその部分を提供し、該非コーディングＲＮＡ分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７～５４からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性または類似性を有するポリペプチドをコードするＲＮＡに結合することができ、該非コーディングＲＮＡ分子は、ポリペプチドの発現を抑制する。
一局面では、本開示は、本明細書に記載されるタバコ植物の集団、本明細書に記載されるタバコ植物由来の乾燥タバコ材料、ならびに該乾燥タバコ材料から作製される再構成タバコ、タバコブレンド物、およびタバコ製品を提供する。
別の局面では、本開示は、以下の工程を含む、低減アルカロイドタバコ植物を作製するための方法を提供する：（ａ）（ｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～３６からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する核酸配列、または（ｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７～５４からなる群から選択されるポリペプチド配列に対して少なくとも９０％の同一性もしくは類似性を有するアミノ酸配列配列、をコードする遺伝子の発現または活性を下方制御する工程；および（ｂ）タバコ植物から葉または種子を収穫する工程。
配列の簡単な説明
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～１８は、アルカロイド生合成に関与する様々な遺伝子のゲノムＤＮＡ配列（プロモーター、５’ＵＴＲ、イントロン、３’ＵＴＲ、およびターミネーターなどの領域を含む）を示す。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～１８は、アルカロイド生合成に関与する様々な遺伝子のゲノムＤＮＡ配列（プロモーター、５’ＵＴＲ、イントロン、３’ＵＴＲ、およびターミネーターなどの領域を含む）を示す。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９～３６は、アルカロイド生合成に関与する様々な遺伝子のｃＤＮＡ配列を示す。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７～５４は、アルカロイド生合成に関与する様々な遺伝子のポリペプチド配列を示す。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５５～６４は、アルカロイド生合成に関与する様々な遺伝子を標的とするための例示的なＲＮＡｉ配列を示す。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６５～８４は、例示的なプライマー配列を示す。
様々な配列は、ヌクレオチド配列中の「Ｎ」またはアミノ酸配列中の「Ｘ」を含んでもよい。「Ｎ」は、任意のヌクレオチド、例えば、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ、または1つもしくは複数のヌクレオチドの欠失もしくは挿入であることができる。いくつかの瞬間には、「Ｎ」の文字列が示される。「Ｎ」の数は、その位置の未決定のヌクレオチドの実際の数と必ずしも相関しない。実際のヌクレオチド配列は、示される「Ｎ」のセグメントよりも長いかまたは短いことができる。同様に、「Ｘ」は、任意のアミノ酸残基、または１つもしくは複数のアミノ酸の欠失もしくは挿入であることができる。再び、「Ｘ」の数は、その位置の未決定のアミノ酸の実際の数と必ずしも相関しない。実際のアミノ酸配列は、示される「Ｘ」のセグメントよりも長いかまたは短いことができる。配列表における任意のＳＥＱ ＩＤを記載する際のＡ、Ｔ、Ｇ、Ｃ（Ａ、Ｕ、Ｇ、Ｃと比較した）の使用にもかかわらず、そのＳＥＱ ＩＤは、ＳＥＱ ＩＤが述べられる文脈に応じて、ＲＮＡ配列を指すこともできる。
詳細な説明
他に定義されなければ、本明細書において使用される技術用語および科学用語は、当業者により一般的に理解されるものと同じ意味を有する。当業者は、多くの方法を本開示の実施において使用できることを認識する。実際、本開示は、記載される方法および材料に何ら限定されない。用語が単数形で提供される場合、本発明者らはまた、その用語の複数形によって記載される開示の局面も企図し、逆もまた同じである。参照することにより組み込まれる参考文献において使用される用語および定義に矛盾がある場合、本出願において使用される用語は、本明細書で与えられる定義を有するものとする。使用される他の技術用語は、様々な技術分野特有の辞書、例えば、「Ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｈｅｒｉｔａｇｅ（登録商標） Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ」（Ｅｄｉｔｏｒｓ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｈｅｒｉｔａｇｅ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｉｅｓ，２０１１，Ｈｏｕｇｈｔｏｎ Ｍｉｆｆｌｉｎ Ｈａｒｃｏｕｒｔ，Ｂｏｓｔｏｎ ａｎｄ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）、「ＭｃＧｒａｗ－Ｈｉｌｌ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｔｅｒｍｓ」 （６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，２００２，ＭｃＧｒａｗ－Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）、または「Ｏｘｆｏｒｄ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｙ」 （６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，２００８，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ ａｎｄ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）によって例証されるような、それらが使用される技術分野におけるその通常の意味を有する。
他に定義されなければ、本明細書において使用される技術用語および科学用語は、当業者により一般的に理解されるものと同じ意味を有する。当業者は、多くの方法を本開示の実施において使用できることを認識する。実際、本開示は、記載される方法および材料に何ら限定されない。用語が単数形で提供される場合、本発明者らはまた、その用語の複数形によって記載される開示の局面も企図し、逆もまた同じである。参照することにより組み込まれる参考文献において使用される用語および定義に矛盾がある場合、本出願において使用される用語は、本明細書で与えられる定義を有するものとする。使用される他の技術用語は、様々な技術分野特有の辞書、例えば、「Ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｈｅｒｉｔａｇｅ（登録商標） Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ」（Ｅｄｉｔｏｒｓ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｈｅｒｉｔａｇｅ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｉｅｓ，２０１１，Ｈｏｕｇｈｔｏｎ Ｍｉｆｆｌｉｎ Ｈａｒｃｏｕｒｔ，Ｂｏｓｔｏｎ ａｎｄ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）、「ＭｃＧｒａｗ－Ｈｉｌｌ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｔｅｒｍｓ」 （６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，２００２，ＭｃＧｒａｗ－Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）、または「Ｏｘｆｏｒｄ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｙ」 （６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，２００８，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ ａｎｄ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）によって例証されるような、それらが使用される技術分野におけるその通常の意味を有する。
例えば、全ての特許および刊行物を含む本明細書において引用されるいずれの参考文献も、その全体が、および各個々の刊行物、特許、または特許出願が参照することにより組み込まれるように具体的にかつ個別に示されるのと同じ程度まで、参照することにより組み込まれる。
選択肢のグループ分けが提示される場合は、選択肢のそのグループ分けを構成するメンバーの任意のおよび全ての組み合わせが、具体的に想定される。例えば、項目がＡ、Ｂ、Ｃ、およびＤからなる群から選択される場合には、本発明者らは、各選択肢を個別に（例えば、Ａのみ、Ｂのみなど）、ならびにＡ、Ｂ、およびＤ；ＡおよびＣ；ＢおよびＣなどのような組み合わせを具体的に想定する。２つまたはそれ以上の項目のリストにおいて使用される場合の「および／または」という用語は、列記される項目のいずれか１つを単独で、または他の列記される項目のいずれか１つもしくは複数との組み合わせで意味する。例えば、「Ａおよび／またはＢ」という表現は、ＡおよびＢのいずれかまたは両方、すなわち、Ａのみ、Ｂのみ、またはＡとＢとの組み合わせを意味するように意図される。「Ａ、Ｂ、および／またはＣ」という表現は、Ａのみ、Ｂのみ、Ｃのみ、ＡとＢとの組み合わせ、ＡとＣとの組み合わせ、ＢとＣとの組み合わせ、またはＡとＢとＣとの組み合わせを意味するように意図される。
数字の範囲が本明細書において提供される場合、範囲は、その範囲の端、およびその範囲の定義された端の間の任意の数字を含むと理解される。例えば、「１～１０」は、１と１０との間の任意の数字、ならびに数字１および数字１０を含む。
本明細書において使用される場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は、文脈が明らかにそうでないことを規定しなければ、複数への言及を含む。例えば、「化合物（ａ ｃｏｍｐｏｕｎｄ）」または「少なくとも１つの化合物」という用語は、その混合物を含めて、複数の化合物を含んでもよい。
「約」という用語は、およそ、だいたい、辺り、またはその近辺を意味するように、本明細書において使用される。「約」という用語が数値範囲と組み合わせて使用される場合、それは、示される数値より上および下に境界を広げることによってその範囲を加減し、プラス１０％またはマイナス１０％を意味するように理解される。例えば、「約１００」は、９０～１１０を含む。
いかなる疑いも回避するために、「約」、「少なくとも」、「少なくとも約」、「最大で」、「未満」、「より多い」、「以内」などのような用語または句が、本明細書において使用され、パーセンテージの数字の一連のリストが後に続く場合、そのような用語または句は、副詞、前置詞、または他の修飾句が各々のおよびあらゆるメンバーの前に再現されるかどうかにかかわらず、一連またはリスト中のパーセントの各々のおよびあらゆる数字を修飾するとみなされる。
本明細書において使用される場合、タバコの「低アルカロイド品種」（「ＬＡ品種」とも称される）は、総アルカロイド（乾燥重量を介して測定）を、１つまたは複数の遺伝子改変を除いて実質的に類似の遺伝的背景の対照タバコ品種における総アルカロイドレベルの２５％未満のレベルまで低減する、１つまたは複数の遺伝子改変を含むタバコ品種を指す。非限定的な例として、ＫＹ１７１が、低アルカロイド品種ＬＡ ＫＹ１７１に対する対照として働き得る。限定されることなく、低アルカロイドタバコ品種は、ＬＡ Ｂｕｒｌｅｙ ２１、ＬＡＦＣ５３、ＬＮ Ｂ＆Ｗ、およびＬＮ ＫＹ１７１を含む。同様に、タバコの「低ニコチン品種」（「ＬＮ品種」とも称される）は、ニコチン（乾燥重量を介して測定）を、１つまたは複数の遺伝子改変を除いて実質的に類似の遺伝的背景の対照タバコ品種におけるニコチンレベルの２５％未満のレベルまで低減する、１つまたは複数の遺伝子改変を含むタバコ品種を指す。
本明細書において使用される場合、「遺伝子改変」とは、植物または植物ゲノムの遺伝子構成の変化を指す。遺伝子改変は、変異誘発、ゲノム編集、遺伝子形質転換、またはそれらの組み合わせを含むがそれに限定されない方法によって、導入することができる。遺伝子改変には、例えば、遺伝子中の変異（例えば、非天然変異）または遺伝子を標的とするトランスジーン（例えば、アルギニンデカルボキシラーゼ（ＡＤＣ）遺伝子を標的とするＡＤＣトランスジーン）が含まれる。本明細書で使用される場合、「標的とする」とは、遺伝子の発現または活性を直接的に上方制御すること、または直接的に下方制御することのいずれかを指す。本明細書で使用される場合、遺伝子の発現または活性に影響を及ぼすトランスジーンの文脈における「直接的に」とは、遺伝子（例えば、プロモーター領域またはＵＴＲ領域）またはそれにコードされる産物（例えば、ｍＲＮＡ分子またはポリペプチド）と、トランスジーンによりコードされる産物（例えば、低分子非コーディングＲＮＡ分子、または転写因子もしくはドミナントネガティブポリペプチドバリアントなどのタンパク質）との間の物理的接触または化学的相互作用を介して、遺伝子に対して発揮される影響を指す。一局面では、トランスジーンは、転写因子を伴うことなく、標的遺伝子の発現または活性に影響を及ぼす（例えば、トランスジーンは、転写因子をコードせず、かつ／または標的遺伝子を次に調節する転写因子の発現もしくは活性を抑制しない）。
本明細書において使用される場合、「変異」とは、遺伝子の参照配列によりコードされる産物の発現または活性を変化させるために遺伝子に導入される、遺伝性の遺伝子改変を指す。ある特定の遺伝子、例えば、アルギニンデカルボキシラーゼ（ＡＤＣ）中の変異は、ＡＤＣ変異体と称される。そのような改変は、遺伝子の任意の配列領域中、例えば、プロモーター、５’ＵＴＲ、エクソン、イントロン、３’ＵＴＲ、またはターミネーター領域中にあり得る。一局面では、変異は、遺伝子産物の発現または活性を低減するか、阻害するか、または排除する。別の局面では、変異は、遺伝子産物の発現または活性を増加させるか、上昇させるか、強くするか、または強化する。一局面では、変異は、特定のタバコ品種または栽培品種に存在する天然の多型ではない。変異を同定する場合、参照配列は、同じタバコ品種または背景に由来するべきであることが認識されている。例えば、変異を含む改変タバコ植物が品種ＴＮ９０由来である場合には、対応する参照配列は、異なるタバコ品種（例えば、Ｋ３２６）からの相同配列ではなく、内因性ＴＮ９０配列でなければならない。一局面では、変異は、「非天然」変異または「天然に存在しない」変異である。本明細書において使用される場合、「非天然」変異または「天然に存在しない」変異とは、ヒトの介入なしに生成される偶発変異ではない、かつそれに対応しない変異を指す。ヒトの介入の非限定的な例には、変異誘発（例えば、化学的変異誘発、電離放射線変異誘発）および標的指向性遺伝子改変（例えば、ＣＲＩＳＰＲベースの方法、ＴＡＬＥＮベースの方法、ジンクフィンガーベースの方法）が含まれる。非天然変異および天然に存在しない変異には、（例えば、植物の生殖細胞系列における異常なＤＮＡ複製を介して）自然に生じる偶発変異は含まれない。
本明細書において使用される場合、タバコ植物は、ニコチアナ・タバカム、ニコチアナ・アンプレキシカウリス（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ａｍｐｌｅｘｉｃａｕｌｉｓ）ＰＩ ２７１９８９；ニコチアナ・ベンサミアナ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）ＰＩ ５５５４７８；ニコチアナ・ビゲロビー（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｂｉｇｅｌｏｖｉｉ）ＰＩ ５５５４８５；ニコチアナ・デブネイ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｄｅｂｎｅｙｉ）；ニコチアナ・エクセルシオル（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｅｘｃｅｌｓｉｏｒ）ＰＩ ２２４０６３；ニコチアナ・グルチノーサ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｇｌｕｔｉｎｏｓａ）ＰＩ ５５５５０７；ニコチアナ・グッドスピーデイ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｇｏｏｄｓｐｅｅｄｉｉ）ＰＩ ２４１０１２；ニコチアナ・ゴセイ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｇｏｓｓｅｉ）ＰＩ ２３０９５３；ニコチアナ・ヘスペリス（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｈｅｓｐｅｒｉｓ）ＰＩ ２７１９９１；ニコチアナ・ナイティアナ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｋｎｉｇｈｔｉａｎａ）ＰＩ ５５５５２７；ニコチアナ・マリティマ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｍａｒｉｔｉｍａ）ＰＩ ５５５５３５；ニコチアナ・メガロシフォン（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｍｅｇａｌｏｓｉｐｈｏｎ）ＰＩ ５５５５３６；ニコチアナ・ヌディカウリス（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｎｕｄｉｃａｕｌｉｓ）ＰＩ ５５５５４０；ニコチアナ・パニクラータ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｐａｎｉｃｕｌａｔａ）ＰＩ ５５５５４５；ニコチアナ・プルムバギニフォリア（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｐｌｕｍｂａｇｉｎｉｆｏｌｉａ）ＰＩ ５５５５４８；ニコチアナ・レパンダ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｒｅｐａｎｄａ）ＰＩ ５５５５５２；ニコチアナ・ルスティカ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｒｕｓｔｉｃａ）；ニコチアナ・スアベオレンス（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｓｕａｖｅｏｌｅｎｓ）ＰＩ ２３０９６０；ニコチアナ・シルベストリス（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｓｙｌｖｅｓｔｒｉｓ）ＰＩ ５５５５６９；ニコチアナ・トメントーサ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔｏｍｅｎｔｏｓａ）ＰＩ ２６６３７９；ニコチアナ・トメントシフォルミス（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔｏｍｅｎｔｏｓｉｆｏｒｍｉｓ）；およびニコチアナ・トリゴノフィラ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔｒｉｇｏｎｏｐｈｙｌｌａ）ＰＩ ５５５５７２を含むがそれに限定されない、ニコチアナ属からの任意の植物由来であり得る。一局面では、本明細書に記載されるタバコ植物は、ニコチアナ・タバカム植物である。
一局面では、本開示は、アルギニンデカルボキシラーゼ（ＡＤＣ）、アスパラギン酸オキシダーゼ（ＡＯ）、またはオルニチンデカルボキシラーゼ（ＯＤＣ）をコードする１つまたは複数の遺伝子の発現または活性を上方制御するかまたは下方制御する遺伝子改変を含む、タバコ植物またはその部分を提供する。本明細書において使用される場合、遺伝子改変による遺伝子の上方制御または下方制御は、遺伝子改変を有する植物を、遺伝子改変を有しない対応する対照植物と比較することによって決定される。
植物
一局面では、本開示は、遺伝子中のまたは遺伝子を標的とする遺伝子改変を含む、改変タバコ植物またはその部分を提供し、該遺伝子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９～３６からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有する核酸配列をコードする。一局面では、本開示は、遺伝子中のまたは遺伝子を標的とする、かつ遺伝子の発現もしくは活性を下方制御する遺伝子改変を含む、改変タバコ植物またはその部分を提供し、該遺伝子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９～３６からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有する核酸配列をコードする。一局面では、下方制御される遺伝子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９～３６からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する核酸配列をコードする。一局面では、下方制御される遺伝子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９、２０、２３～２６、２９、および３０からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する核酸配列をコードする。一局面では、下方制御される遺伝子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９および２０からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する核酸配列をコードする。一局面では、下方制御される遺伝子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３～２６からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する核酸配列をコードする。一局面では、下方制御される遺伝子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５および２６からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する核酸配列をコードする。一局面では、下方制御される遺伝子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９および３０からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する核酸配列をコードする。一局面では、下方制御される遺伝子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９～３６からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列に対して少なくとも９５％の同一性を有する核酸配列をコードする。一局面では、下方制御される遺伝子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９、２０、２３～２６、２９、および３０からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列に対して少なくとも９５％の同一性を有する核酸配列をコードする。一局面では、下方制御される遺伝子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９および２０からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列に対して少なくとも９５％の同一性を有する核酸配列をコードする。一局面では、下方制御される遺伝子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３～２６からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列に対して少なくとも９５％の同一性を有する核酸配列をコードする。一局面では、下方制御される遺伝子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５および２６からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列に対して少なくとも９５％の同一性を有する核酸配列をコードする。一局面では、下方制御される遺伝子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９および３０からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列に対して少なくとも９５％の同一性を有する核酸配列をコードする。一局面では、下方制御される遺伝子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９～３６からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列に対して１００％の同一性を有する核酸配列をコードする。一局面では、下方制御される遺伝子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９、２０、２３～２６、２９、および３０からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列に対して１００％の同一性を有する核酸配列をコードする。一局面では、下方制御される遺伝子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９および２０からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列に対して１００％の同一性を有する核酸配列をコードする。一局面では、下方制御される遺伝子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３～２６からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列に対して１００％の同一性を有する核酸配列をコードする。一局面では、下方制御される遺伝子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５および２６からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列に対して１００％の同一性を有する核酸配列をコードする。一局面では、下方制御される遺伝子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９および３０からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列に対して１００％の同一性を有する核酸配列をコードする。
一局面では、本開示は、遺伝子中のまたは遺伝子を標的とする遺伝子改変を含む、改変タバコ植物またはその部分を提供し、該遺伝子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９～３６からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有する核酸配列をコードする。一局面では、本開示は、遺伝子中のまたは遺伝子を標的とする、かつ遺伝子の発現もしくは活性を下方制御する遺伝子改変を含む、改変タバコ植物またはその部分を提供し、該遺伝子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９～３６からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有する核酸配列をコードする。一局面では、下方制御される遺伝子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９～３６からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する核酸配列をコードする。一局面では、下方制御される遺伝子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９、２０、２３～２６、２９、および３０からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する核酸配列をコードする。一局面では、下方制御される遺伝子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９および２０からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する核酸配列をコードする。一局面では、下方制御される遺伝子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３～２６からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する核酸配列をコードする。一局面では、下方制御される遺伝子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５および２６からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する核酸配列をコードする。一局面では、下方制御される遺伝子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９および３０からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する核酸配列をコードする。一局面では、下方制御される遺伝子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９～３６からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列に対して少なくとも９５％の同一性を有する核酸配列をコードする。一局面では、下方制御される遺伝子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９、２０、２３～２６、２９、および３０からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列に対して少なくとも９５％の同一性を有する核酸配列をコードする。一局面では、下方制御される遺伝子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９および２０からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列に対して少なくとも９５％の同一性を有する核酸配列をコードする。一局面では、下方制御される遺伝子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３～２６からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列に対して少なくとも９５％の同一性を有する核酸配列をコードする。一局面では、下方制御される遺伝子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５および２６からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列に対して少なくとも９５％の同一性を有する核酸配列をコードする。一局面では、下方制御される遺伝子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９および３０からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列に対して少なくとも９５％の同一性を有する核酸配列をコードする。一局面では、下方制御される遺伝子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９～３６からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列に対して１００％の同一性を有する核酸配列をコードする。一局面では、下方制御される遺伝子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９、２０、２３～２６、２９、および３０からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列に対して１００％の同一性を有する核酸配列をコードする。一局面では、下方制御される遺伝子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９および２０からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列に対して１００％の同一性を有する核酸配列をコードする。一局面では、下方制御される遺伝子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３～２６からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列に対して１００％の同一性を有する核酸配列をコードする。一局面では、下方制御される遺伝子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５および２６からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列に対して１００％の同一性を有する核酸配列をコードする。一局面では、下方制御される遺伝子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９および３０からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列に対して１００％の同一性を有する核酸配列をコードする。
別の局面では、本開示は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～３６からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するポリヌクレオチド中の非天然変異を含む、改変タバコ植物またはその部分を提供する。一局面では、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、２、５～８、１１、１２、１９、２０、２３～２６、２９、および３０からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するポリヌクレオチド中の非天然変異。一局面では、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、２、１９、および２０からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するポリヌクレオチド中の非天然変異。一局面では、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１および２からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するポリヌクレオチド中の非天然変異。一局面では、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５～８および２３～２６からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するポリヌクレオチド中の非天然変異。一局面では、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７～８および２５～２６からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するポリヌクレオチド中の非天然変異。一局面では、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７～８からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するポリヌクレオチド中の非天然変異。一局面では、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１、１２、２９、および３０からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するポリヌクレオチド中の非天然変異。一局面では、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１および１２からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するポリヌクレオチド中の非天然変異。一局面では、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、２、５～８、１１、１２、１９、２０、２３～２６、２９、および３０からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するポリヌクレオチド中の非天然変異。一局面では、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、２、１９、および２０からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するポリヌクレオチド中の非天然変異。一局面では、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１および２からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するポリヌクレオチド中の非天然変異。一局面では、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５～８および２３～２６からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するポリヌクレオチド中の非天然変異。一局面では、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７～８および２５～２６からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するポリヌクレオチド中の非天然変異。一局面では、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７～８からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するポリヌクレオチド中の非天然変異。一局面では、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１、１２、２９、および３０からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するポリヌクレオチド中の非天然変異。一局面では、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１および１２からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するポリヌクレオチド中の非天然変異。一局面では、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、２、５～８、１１、１２、１９、２０、２３～２６、２９、および３０からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列に対して１００％の同一性を有するポリヌクレオチド中の非天然変異。一局面では、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、２、１９、および２０からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列に対して１００％の同一性を有するポリヌクレオチド中の非天然変異。一局面では、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１および２からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列に対して１００％の同一性を有するポリヌクレオチド中の非天然変異。一局面では、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５～８および２３～２６からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列に対して１００％の同一性を有するポリヌクレオチド中の非天然変異。一局面では、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７～８および２５～２６からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列に対して１００％の同一性を有するポリヌクレオチド中の非天然変異。一局面では、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７～８からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列に対して１００％の同一性を有するポリヌクレオチド中の非天然変異。一局面では、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１、１２、２９、および３０からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列に対して１００％の同一性を有するポリヌクレオチド中の非天然変異。一局面では、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１および１２からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列に対して１００％の同一性を有するポリヌクレオチド中の非天然変異。
一局面では、本開示は、非コーディングＲＮＡ分子をコードするポリヌクレオチドに機能的に連結された異種プロモーターを含む組換え核酸構築物を含む、改変タバコ植物またはその部分を提供し、該非コーディングＲＮＡ分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９～３６からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するｍＲＮＡに結合することができ、該非コーディングＲＮＡ分子は、該ｍＲＮＡのレベルまたは翻訳を抑制する。一局面では、非コーディングＲＮＡ分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９、２０、２３～２６、２９、および３０からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するｍＲＮＡのレベルまたは翻訳を抑制する。一局面では、非コーディングＲＮＡ分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９、２０、２３～２６、２９、および３０からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するｍＲＮＡのレベルまたは翻訳を抑制する。一局面では、非コーディングＲＮＡ分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９、２０、２３～２６、２９、および３０からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列に対して１００％の同一性を有するｍＲＮＡのレベルまたは翻訳を抑制する。
別の局面では、本開示は、遺伝子中のまたは遺伝子を標的とする遺伝子改変を含む、改変タバコ植物またはその部分を提供し、該遺伝子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７～５４からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、または１００％の同一性または類似性を有するポリペプチドをコードする。別の局面では、本開示は、遺伝子中のまたは遺伝子を標的とする、かつ遺伝子の発現もしくは活性を下方制御する遺伝子改変を含む、改変タバコ植物またはその部分を提供し、該遺伝子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７～５４からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、または１００％の同一性または類似性を有するポリペプチドをコードする。一局面では、下方制御される遺伝子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７、３８、４１～４４、４７、および４８からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するポリペプチドをコードする。一局面では、下方制御される遺伝子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７および３８からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するポリペプチドをコードする。一局面では、下方制御される遺伝子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１～４４からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するポリペプチドをコードする。一局面では、下方制御される遺伝子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３～４４からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するポリペプチドをコードする。一局面では、下方制御される遺伝子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７～４８からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するポリペプチドをコードする。一局面では、下方制御される遺伝子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７、３８、４１～４４、４７、および４８からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するポリペプチドをコードする。一局面では、下方制御される遺伝子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７および３８からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するポリペプチドをコードする。一局面では、下方制御される遺伝子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１～４４からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するポリペプチドをコードする。一局面では、下方制御される遺伝子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３～４４からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するポリペプチドをコードする。一局面では、下方制御される遺伝子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７～４８からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するポリペプチドをコードする。一局面では、下方制御される遺伝子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７、３８、４１～４４、４７、および４８からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して１００％の同一性を有するポリペプチドをコードする。一局面では、下方制御される遺伝子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７および３８からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して１００％の同一性を有するポリペプチドをコードする。一局面では、下方制御される遺伝子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１～４４からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して１００％の同一性を有するポリペプチドをコードする。一局面では、下方制御される遺伝子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３～４４からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して１００％の同一性を有するポリペプチドをコードする。一局面では、下方制御される遺伝子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７～４８からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して１００％の同一性を有するポリペプチドをコードする。
一局面では、本開示は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７～５４からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、または１００％の同一性または類似性を有するポリペプチドをコードする核酸配列を有するポリヌクレオチド中の非天然変異を含む、改変タバコ植物またはその部分を提供する。一局面では、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７、３８、４１～４４、４７、および４８からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するポリペプチドをコードする核酸配列を有するポリヌクレオチド中の非天然変異。一局面では、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７および３８からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するポリペプチドをコードする核酸配列を有するポリヌクレオチド中の非天然変異。一局面では、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１～４４からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するポリペプチドをコードする核酸配列を有するポリヌクレオチド中の非天然変異。一局面では、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３～４４からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するポリペプチドをコードする核酸配列を有するポリヌクレオチド中の非天然変異。一局面では、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７～４８からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するポリペプチドをコードする核酸配列を有するポリヌクレオチド中の非天然変異。一局面では、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７、３８、４１～４４、４７、および４８からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するポリペプチドをコードする核酸配列を有するポリヌクレオチド中の非天然変異。一局面では、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７および３８からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するポリペプチドをコードする核酸配列を有するポリヌクレオチド中の非天然変異。一局面では、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１～４４からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するポリペプチドをコードする核酸配列を有するポリヌクレオチド中の非天然変異。一局面では、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３～４４からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するポリペプチドをコードする核酸配列を有するポリヌクレオチド中の非天然変異。一局面では、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７～４８からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するポリペプチドをコードする核酸配列を有するポリヌクレオチド中の非天然変異。一局面では、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７、３８、４１～４４、４７、および４８からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して１００％の同一性を有するポリペプチドをコードする核酸配列を有するポリヌクレオチド中の非天然変異。一局面では、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７および３８からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して１００％の同一性を有するポリペプチドをコードする核酸配列を有するポリヌクレオチド中の非天然変異。一局面では、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１～４４からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して１００％の同一性を有するポリペプチドをコードする核酸配列を有するポリヌクレオチド中の非天然変異。一局面では、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３～４４からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して１００％の同一性を有するポリペプチドをコードする核酸配列を有するポリヌクレオチド中の非天然変異。一局面では、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７～４８からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して１００％の同一性を有するポリペプチドをコードする核酸配列を有するポリヌクレオチド中の非天然変異。
別の局面では、本開示は、非コーディングＲＮＡ分子をコードするポリヌクレオチドに機能的に連結された異種プロモーターを含む組換え核酸構築物を含む、改変タバコ植物またはその部分を提供し、該非コーディングＲＮＡ分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７～５４からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、または１００％の同一性または類似性を有するポリペプチドをコードするＲＮＡに結合することができ、該非コーディングＲＮＡ分子は、該ポリペプチドの発現を抑制する。一局面では、抑制されるポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７、３８、４１～４４、４７、および４８からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性または類似性を有する。一局面では、抑制されるポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７、３８、４１～４４、４７、および４８からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性または類似性を有する。一局面では、抑制されるポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７、３８、４１～４４、４７、および４８からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して１００％の同一性または類似性を有する。
低アルカロイドタバコ
一局面では、低減したレベルのニコチンを付与する遺伝子改変、例えば、アルギニンデカルボキシラーゼ（ＡＤＣ）、アスパラギン酸オキシダーゼ（ＡＯ）、またはオルニチンデカルボキシラーゼ（ＯＤＣ）をコードする１つまたは複数の遺伝子における遺伝子改変を含むタバコ植物。一局面では、本明細書に記載される遺伝子改変を含むタバコ植物は、低アルカロイド品種または植物である。一局面では、本開示のタバコ植物は、ｎｉｃ１変異、ｎｉｃ２変異、またはその両方を含む。一局面では、タバコ植物は、類似の生育条件で生育させた場合の、対照植物のニコチンレベルの１％より下、２％より下、５％より下、８％より下、１０％より下、１２％より下、１５％より下、２０％より下、２５％より下、３０％より下、４０％より下、５０％より下、６０％より下、７０％より下、または８０％より下のレベルのニコチンを含み、該対照植物は、低ニコチンを付与する変異またはトランスジーンを除いて該タバコ植物と本質的に同一の遺伝的背景を共有する。別の局面では、タバコ植物は、類似の生育条件で生育させた場合の、対照植物のニコチンまたは総アルカロイドレベルの１％より下、２％より下、５％より下、８％より下、１０％より下、１２％より下、１５％より下、２０％より下、２５％より下、３０％より下、４０％より下、５０％より下、６０％より下、７０％より下、または８０％より下のレベルのニコチンまたは総アルカロイドを含む。別の局面では、タバコ植物は、類似の生育条件で生育させた場合の、対照植物のニコチンレベルの３％未満、２．７５％未満、２．５％未満、２．２５％未満、２．０％未満、１．７５％未満、１．５％未満、１．２５％未満、１％未満、０．９％未満、０．８％未満、０．７％未満、０．６％未満、０．５％未満、０．４％未満、０．３％未満、０．２％未満、０．１％未満、および０．０５％未満からなる群から選択される総アルカロイドレベルを含み、該対照植物は、低ニコチンを付与する変異またはトランスジーンを除いて該タバコ植物と本質的に同一の遺伝的背景を共有する。別の局面では、タバコ植物は、類似の生育条件で生育させた場合の、対照植物のニコチンまたは総アルカロイドレベルの３％未満、２．７５％未満、２．５％未満、２．２５％未満、２．０％未満、１．７５％未満、１．５％未満、１．２５％未満、１％未満、０．９％未満、０．８％未満、０．７％未満、０．６％未満、０．５％未満、０．４％未満、０．３％未満、０．２％未満、０．１％未満、および０．０５％未満からなる群から選択されるニコチンまたは総アルカロイドレベルを含む。
一局面では、低減したレベルのニコチンを付与する遺伝子改変、例えば、アルギニンデカルボキシラーゼ（ＡＤＣ）、アスパラギン酸オキシダーゼ（ＡＯ）、またはオルニチンデカルボキシラーゼ（ＯＤＣ）をコードする１つまたは複数の遺伝子における遺伝子改変を含むタバコ植物。一局面では、本明細書に記載される遺伝子改変を含むタバコ植物は、低アルカロイド品種または植物である。一局面では、本開示のタバコ植物は、ｎｉｃ１変異、ｎｉｃ２変異、またはその両方を含む。一局面では、タバコ植物は、類似の生育条件で生育させた場合の、対照植物のニコチンレベルの１％より下、２％より下、５％より下、８％より下、１０％より下、１２％より下、１５％より下、２０％より下、２５％より下、３０％より下、４０％より下、５０％より下、６０％より下、７０％より下、または８０％より下のレベルのニコチンを含み、該対照植物は、低ニコチンを付与する変異またはトランスジーンを除いて該タバコ植物と本質的に同一の遺伝的背景を共有する。別の局面では、タバコ植物は、類似の生育条件で生育させた場合の、対照植物のニコチンまたは総アルカロイドレベルの１％より下、２％より下、５％より下、８％より下、１０％より下、１２％より下、１５％より下、２０％より下、２５％より下、３０％より下、４０％より下、５０％より下、６０％より下、７０％より下、または８０％より下のレベルのニコチンまたは総アルカロイドを含む。別の局面では、タバコ植物は、類似の生育条件で生育させた場合の、対照植物のニコチンレベルの３％未満、２．７５％未満、２．５％未満、２．２５％未満、２．０％未満、１．７５％未満、１．５％未満、１．２５％未満、１％未満、０．９％未満、０．８％未満、０．７％未満、０．６％未満、０．５％未満、０．４％未満、０．３％未満、０．２％未満、０．１％未満、および０．０５％未満からなる群から選択される総アルカロイドレベルを含み、該対照植物は、低ニコチンを付与する変異またはトランスジーンを除いて該タバコ植物と本質的に同一の遺伝的背景を共有する。別の局面では、タバコ植物は、類似の生育条件で生育させた場合の、対照植物のニコチンまたは総アルカロイドレベルの３％未満、２．７５％未満、２．５％未満、２．２５％未満、２．０％未満、１．７５％未満、１．５％未満、１．２５％未満、１％未満、０．９％未満、０．８％未満、０．７％未満、０．６％未満、０．５％未満、０．４％未満、０．３％未満、０．２％未満、０．１％未満、および０．０５％未満からなる群から選択されるニコチンまたは総アルカロイドレベルを含む。
一局面では、１つもしくは複数のＡＤＣ、ＡＯ、もしくはＯＤＣ中の遺伝子改変、または１つもしくは複数のＡＤＣ、ＡＯ、もしくはＯＤＣを標的とする遺伝子改変を含むタバコ植物は、アグマチンデイミナーゼ（ＡＩＣ）、アルギナーゼ、ジアミンオキシダーゼ、メチルプトレシンオキシダーゼ（ＭＰＯ）、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ、ホスホリボシルアントラニル酸イソメラーゼ（ＰＲＡＩ）、プトレシンＮ－メチルトランスフェラーゼ（ＰＭＴ）、キノリン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＱＰＴ）、Ｓ－アデノシルメチオニンシンテターゼ（ＳＡＭＳ）、Ａ６２２、ＮＢＢ１、ベルベリンブリッジ酵素様（ＢＢＬ）、ＭＹＣ２、Ｎｉｃ１＿ＥＲＦ、Ｎｉｃ２＿ＥＲＦ、エチレン応答因子（ＥＲＦ）転写因子、ニコチン取り込みパーミアーゼ（ＮＵＰ）、およびＭＡＴＥ輸送体からなる群から選択されるタンパク質をコードする１個もしくはそれ以上、２個もしくはそれ以上、３個もしくはそれ以上、４個もしくはそれ以上、５個もしくはそれ以上、６個もしくはそれ以上、７個もしくはそれ以上、８個もしくはそれ以上、９個もしくはそれ以上、１０個もしくはそれ以上、１１個もしくはそれ以上、１２個もしくはそれ以上、１３個もしくはそれ以上、１４個もしくはそれ以上、１５個もしくはそれ以上、１６個もしくはそれ以上、１７個もしくはそれ以上、１８個もしくはそれ以上、１９個もしくはそれ以上、２０個もしくはそれ以上、または２１個全ての遺伝子または遺伝子座の発現または活性を直接的に抑制するトランスジーンまたは変異をさらに含む。Ｄｅｗｅｙ ａｎｄ Ｘｉｅ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｏｆ ａｌｋａｌｏｉｄ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｉｎ Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ，Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ９４（２０１３）１０－２７を参照されたい。
一局面では、１つもしくは複数のＡＤＣ、ＡＯ、もしくはＯＤＣ遺伝子中の遺伝子改変、または１つもしくは複数のＡＤＣ、ＡＯ、もしくはＯＤＣ遺伝子を標的とする遺伝子改変を含むタバコ植物は、Ｎｉｃ２遺伝子座のＥＲＦ遺伝子（Ｎｉｃ２＿ＥＲＦ）中の変異をさらに含む。一局面では、１つもしくは複数のＡＤＣ、ＡＯ、もしくはＯＤＣ遺伝子中の遺伝子改変、または１つもしくは複数のＡＤＣ、ＡＯ、もしくはＯＤＣ遺伝子を標的とする遺伝子改変を含むタバコ植物は、ＥＲＦ３２、ＥＲＦ３４、ＥＲＦ３９、ＥＲＦ１８９、ＥＲＦ１１５、ＥＲＦ２２１、ＥＲＦ１０４、ＥＲＦ１７９、ＥＲＦ１７、およびＥＲＦ１６８からなる群から選択される１個もしくはそれ以上、２個もしくはそれ以上、３個もしくはそれ以上、４個もしくはそれ以上、５個もしくはそれ以上、６個もしくはそれ以上、７個もしくはそれ以上、８個もしくはそれ以上、９個もしくはそれ以上、または１０個全ての遺伝子中の、１つまたは複数の変異をさらに含む。Ｓｈｏｊｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ，（１０）：３３９０－４０９（２０１０）；およびＫａｊｉｋａｗａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ ｐｈｙｓｉｏｌ．２０１７，１７４：９９９－１０１１を参照されたい。一局面では、タバコ植物は、ＥＲＦ１８９、ＥＲＦ１１５、またはその両方中の１つまたは複数の変異をさらに含む。一局面では、１つもしくは複数のＡＤＣ、ＡＯ、もしくはＯＤＣ遺伝子中の遺伝子改変、または１つもしくは複数のＡＤＣ、ＡＯ、もしくはＯＤＣ遺伝子を標的とする遺伝子改変を含むタバコ植物は、ＥＲＦ３２、ＥＲＦ３４、ＥＲＦ３９、ＥＲＦ１８９、ＥＲＦ１１５、ＥＲＦ２２１、ＥＲＦ１０４、ＥＲＦ１７９、ＥＲＦ１７、およびＥＲＦ１６８からなる群から選択される１個もしくはそれ以上、２個もしくはそれ以上、３個もしくはそれ以上、４個もしくはそれ以上、５個もしくはそれ以上、６個もしくはそれ以上、７個もしくはそれ以上、８個もしくはそれ以上、９個もしくはそれ以上、または１０個全てのタンパク質をコードする遺伝子を標的としかつ抑制する、１つまたは複数のトランスジーンをさらに含む。
一局面では、１つもしくは複数のＡＤＣ、ＡＯ、もしくはＯＤＣ遺伝子中の遺伝子改変、または１つもしくは複数のＡＤＣ、ＡＯ、もしくはＯＤＣ遺伝子を標的とする遺伝子改変を含むタバコ植物は、Ｎｉｃ１遺伝子座のＥＲＦ遺伝子（Ｎｉｃ１＿ＥＲＦ）（またはＷＯ／２０１９／１４０２９７におけるようなＮｉｃ１ｂ遺伝子座）中の変異をさらに含む。ＷＯ／２０１８／２３７１０７もまた参照されたい。一局面では、１つもしくは複数のＡＤＣ、ＡＯ、もしくはＯＤＣ遺伝子中の遺伝子改変、または１つもしくは複数のＡＤＣ、ＡＯ、もしくはＯＤＣ遺伝子を標的とする遺伝子改変を含むタバコ植物は、ＥＲＦ１０１、ＥＲＦ１１０、ＥＲＦｎｅｗ、ＥＲＦ１９９、ＥＲＦ１９、ＥＲＦ１３０、ＥＲＦ１６、ＥＲＦ２９、ＥＲＦ２１０、およびＥＲＦ９１Ｌ２からなる群から選択される２個もしくはそれ以上、３個もしくはそれ以上、４個もしくはそれ以上、５個もしくはそれ以上、６個もしくはそれ以上、または７個もしくはそれ以上の遺伝子中の、１つまたは複数の変異をさらに含む。ＷＯ／２０１９／１４０２９７およびＫａｊｉｋａｗａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ ｐｈｙｓｉｏｌ．２０１７，１７４：９９９－１０１１を参照されたい。一局面では、１つもしくは複数のＡＤＣ、ＡＯ、もしくはＯＤＣ遺伝子中の遺伝子改変、または１つもしくは複数のＡＤＣ、ＡＯ、もしくはＯＤＣ遺伝子を標的とする遺伝子改変を含むタバコ植物は、ＥＲＦｎｅｗ、ＥＲＦ１９９、ＥＲＦ１９、ＥＲＦ２９、ＥＲＦ２１０、およびＥＲＦ９１Ｌ２からなる群から選択される１個もしくはそれ以上、２個もしくはそれ以上、３個もしくはそれ以上、４個もしくはそれ以上、５個もしくはそれ以上、または６個全ての遺伝子中の、１つまたは複数の変異をさらに含む。一局面では、１つもしくは複数のＡＤＣ、ＡＯ、もしくはＯＤＣ遺伝子中の遺伝子改変、または１つもしくは複数のＡＤＣ、ＡＯ、もしくはＯＤＣ遺伝子を標的とする遺伝子改変を含むタバコ植物は、ＥＲＦ１０１、ＥＲＦ１１０、ＥＲＦｎｅｗ、ＥＲＦ１９９、ＥＲＦ１９、ＥＲＦ１３０、ＥＲＦ１６、ＥＲＦ２９、ＥＲＦ２１０、およびＥＲＦ９１Ｌ２からなる群から選択される１個もしくはそれ以上、２個もしくはそれ以上、３個もしくはそれ以上、４個もしくはそれ以上、５個もしくはそれ以上、６個もしくはそれ以上、または７個もしくはそれ以上の遺伝子をコードする遺伝子を標的としかつ抑制する、１つまたは複数のトランスジーンをさらに含む。
一局面では、本明細書において提供されるタバコ植物は、アスパラギン酸オキシダーゼ、アグマチンデイミナーゼ（ＡＩＣ）、アルギナーゼ、ジアミンオキシダーゼ、アルギニンデカルボキシラーゼ（ＡＤＣ）、メチルプトレシンオキシダーゼ（ＭＰＯ）、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ、オルニチンデカルボキシラーゼ（ＯＤＣ）、ホスホリボシルアントラニル酸イソメラーゼ（ＰＲＡＩ）、プトレシンＮ－メチルトランスフェラーゼ（ＰＭＴ）、キノリン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＱＰＴ）、およびＳ－アデノシルメチオニンシンテターゼ（ＳＡＭＳ）、Ａ６２２、ＮＢＢ１、ＢＢＬ、ＭＹＣ２、Ｎｉｃ１＿ＥＲＦ、Ｎｉｃ２＿ＥＲＦ、エチレン応答因子（ＥＲＦ）転写因子、ニコチン取り込みパーミアーゼ（ＮＵＰ）、およびＭＡＴＥ輸送体からなる群から選択されるタンパク質をコードする遺伝子中または遺伝子座中の変異を含む第１のゲノム改変を含み、かつ１つまたは複数のＡＤＣ、ＡＯ、またはＯＤＣ遺伝子を標的とする第２の遺伝子改変をさらに含む。一局面では、本明細書において提供されるタバコ植物は、アスパラギン酸オキシダーゼ、アグマチンデイミナーゼ（ＡＩＣ）、アルギナーゼ、ジアミンオキシダーゼ、アルギニンデカルボキシラーゼ（ＡＤＣ）、メチルプトレシンオキシダーゼ（ＭＰＯ）、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ、オルニチンデカルボキシラーゼ（ＯＤＣ）、ホスホリボシルアントラニル酸イソメラーゼ（ＰＲＡＩ）、プトレシンＮ－メチルトランスフェラーゼ（ＰＭＴ）、キノリン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＱＰＴ）、およびＳ－アデノシルメチオニンシンテターゼ（ＳＡＭＳ）、Ａ６２２、ＮＢＢ１、ＢＢＬ、ＭＹＣ２、Ｎｉｃ１、Ｎｉｃ２、エチレン応答因子（ＥＲＦ）転写因子、ニコチン取り込みパーミアーゼ（ＮＵＰ）、およびＭＡＴＥ輸送体からなる群から選択されるタンパク質をコードする遺伝子または遺伝子座を標的としかつ抑制するトランスジーンを含む第１のゲノム改変を含み、かつ１つまたは複数のＡＤＣ、ＡＯ、またはＯＤＣ遺伝子を標的とする第２の遺伝子改変をさらに含む。
葉の品質／グレード付け
一局面では、本開示は、商業的に許容される葉品質を有する、１つもしくは複数のＡＤＣ、ＡＯ、もしくはＯＤＣ遺伝子中の遺伝子改変、または１つもしくは複数のＡＤＣ、ＡＯ、もしくはＯＤＣ遺伝子を標的とする遺伝子改変を含む、タバコ植物またはその部分を提供する。本開示はまた、他のタバコ形質、例えば、葉グレード指数値に対して負の影響を伴わずに変化したニコチンレベルを有する、ＡＤＣ、ＡＯ、またはＯＤＣの変異体またはトランスジェニックタバコ植物を提供する。一局面では、低ニコチンのＡＤＣ、ＡＯ、またはＯＤＣの変異体またはトランスジェニックタバコ品種は、商業的に許容されるグレードの乾燥タバコを提供する。
一局面では、本開示は、商業的に許容される葉品質を有する、１つもしくは複数のＡＤＣ、ＡＯ、もしくはＯＤＣ遺伝子中の遺伝子改変、または１つもしくは複数のＡＤＣ、ＡＯ、もしくはＯＤＣ遺伝子を標的とする遺伝子改変を含む、タバコ植物またはその部分を提供する。本開示はまた、他のタバコ形質、例えば、葉グレード指数値に対して負の影響を伴わずに変化したニコチンレベルを有する、ＡＤＣ、ＡＯ、またはＯＤＣの変異体またはトランスジェニックタバコ植物を提供する。一局面では、低ニコチンのＡＤＣ、ＡＯ、またはＯＤＣの変異体またはトランスジェニックタバコ品種は、商業的に許容されるグレードの乾燥タバコを提供する。
タバコグレードは、葉の茎上の位置、葉のサイズ、葉の色、葉の均一性および完全性、熟度、感触、弾性、光沢（葉の呈色の強度および深さ、ならびに輝きに関する）、吸湿性（周囲の水分を吸収するおよび保持する、タバコ葉の能力）、ならびに緑色のニュアンスまたは色合いを含むがそれに限定されない、要因に基づいて評価される。葉グレードは、例えば、Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｍａｒｋｅｔｉｎｇ Ｓｅｒｖｉｃｅ ｏｆ ｔｈｅ ＵＳ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅにより刊行されたＯｆｆｉｃｉａｌ Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｇｒａｄｅ（７ Ｕ．Ｓ．Ｃ．§５１１）を使用して決定することができる。例えば、１９９０年１１月５日（５５ Ｆ．Ｒ．４０６４５）に発効されたＯｆｆｉｃｉａｌ Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｇｒａｄｅｓ ｆｏｒ Ｂｕｒｌｅｙ Ｔｏｂａｃｃｏ（Ｕ．Ｓ．Ｔｙｐｅ ３１およびＦｏｒｅｉｇｎ Ｔｙｐｅ ９３）；１９８９年３月２７日（５４ Ｆ．Ｒ．７９２５）に発効されたＯｆｆｉｃｉａｌ Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｇｒａｄｅｓ ｆｏｒ Ｆｌｕｅ－Ｃｕｒｅｄ Ｔｏｂａｃｃｏ（Ｕ．Ｓ．Ｔｙｐｅ １１、１２、１３、１４、およびＦｏｒｅｉｇｎ Ｔｙｐｅ ９２）；１９６５年１月８日（２９ Ｆ．Ｒ．１６８５４）に発効されたＯｆｆｉｃｉａｌ Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｇｒａｄｅｓ ｆｏｒ Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ Ｓｅｅｄｌｅａｆ Ｔｏｂａｃｃｏ（Ｕ．Ｓ．Ｔｙｐｅ ４１）；１９６３年１２月８日（２８ Ｆ．Ｒ．１１７１９および２８ Ｆ．Ｒ．１１９２６）に発効されたＯｆｆｉｃｉａｌ Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｇｒａｄｅｓ ｆｏｒ Ｏｈｉｏ Ｃｉｇａｒ－Ｌｅａｆ Ｔｏｂａｃｃｏ（Ｕ．Ｓ．Ｔｙｐｅ４２、４３、および４４）；１９６９年１１月２０日（３４ Ｆ．Ｒ．１７０６１）に発効されたＯｆｆｉｃｉａｌ Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｇｒａｄｅｓ ｆｏｒ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｃｉｇａｒ－Ｂｉｎｄｅｒ Ｔｏｂａｃｃｏ（Ｕ．Ｓ．Ｔｙｐｅ ５４および５５）；１９６９年１１月２０日（３４ Ｆ．Ｒ．１７０６１）に発効されたＯｆｆｉｃｉａｌ Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｇｒａｄｅｓ ｆｏｒ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｃｉｇａｒ－Ｂｉｎｄｅｒ Ｔｏｂａｃｃｏ（Ｕ．Ｓ．Ｔｙｐｅ ５４および５５）；１９７１年４月に発効されたＯｆｆｉｃｉａｌ Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｇｒａｄｅｓ ｆｏｒ Ｇｅｏｒｇｉａ ａｎｄ Ｆｌｏｒｉｄａ Ｓｈａｄｅ－Ｇｒｏｗｎ Ｃｉｇａｒ－Ｗｒａｐｐｅｒ Ｔｏｂａｃｃｏ（Ｕ．Ｓ．Ｔｙｐｅ ６２）を参照されたい。ＵＳＤＡグレード指数値は、産業上承認されたグレード指数に従って決定することができる。例えば、Ｂｏｗｍａｎ ｅｔ ａｌ，Ｔｏｂａｃｃｏ Ｓｃｉｅｎｃｅ，３２：３９－４０（１９８８）；Ｌｅｇａｃｙ Ｔｏｂａｃｃｏ Ｄｏｃｕｍｅｎｔ Ｌｉｂｒａｒｙ（Ｂａｔｅｓ Ｄｏｃｕｍｅｎｔ ＃５２３２６７８２６－５２３２６７８３３，Ｊｕｌｙ １，１９８８，Ｍｅｍｏｒａｎｄｕｍ ｏｎ ｔｈｅ Ｐｒｏｐｏｓｅｄ Ｂｕｒｌｅｙ Ｔｏｂａｃｃｏ Ｇｒａｄｅ Ｉｎｄｅｘ）；およびＭｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｔｏｂａｃｃｏ Ｉｎｔｅｒｎ．，１９２：５５－５７（全ての前述の参考文献は、推論によりその全体が組み込まれる）を参照されたい。特に定めない限り、ＵＳＤＡグレード指数は、受領された連邦政府グレードの０～１００の数値表現であり、全ての茎上の位置の加重平均である。より高いグレード指数は、より高い品質を指し示す。代替的に、葉グレードは、ハイパースペクトルイメージングを介して決定することができる。例えば、ＷＯ２０１１／０２７３１５（２０１１年３月１０日に公開され、推論によりその全体が組み込まれる）を参照されたい。
一局面では、本明細書に記載されるＡＤＣ、ＡＯ、またはＯＤＣの変異体またはトランスジェニックタバコ植物は、乾燥させた場合に、５５またはそれ以上、６０またはそれ以上、６５またはそれ以上、７０またはそれ以上、７５またはそれ以上、８０またはそれ以上、８５またはそれ以上、９０またはそれ以上、および９５またはそれ以上からなる群から選択されるＵＳＤＡグレード指数値を有する葉を生成することができる。別の局面では、タバコ植物は、乾燥させた場合に、類似の条件で生育および乾燥させた場合の対照植物のＵＳＤＡグレード指数値と同等のＵＳＤＡグレード指数値を有する葉を生成することができ、該対照植物は、低ニコチンを付与する変異またはＡＤＣ、ＡＯ、もしくはＯＤＣを標的とするトランスジーンを除いて該タバコ植物と本質的に同一の遺伝的背景を共有する。さらなる局面では、タバコ植物は、乾燥させた場合に、類似の条件で生育させた場合の対照植物のＵＳＤＡグレード指数値の少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９８％のＵＳＤＡグレード指数値を有する葉を生成することができ、該対照植物は、低ニコチンを付与する変異またはトランスジーンを除いて該タバコ植物と本質的に同一の遺伝的背景を共有する。さらなる局面では、タバコ植物は、乾燥させた場合に、対照植物のＵＳＤＡグレード指数値の６５％～１３０％、７０％～１３０％、７５％～１３０％、８０％～１３０％、８５％～１３０％、９０％～１３０％、９５％～１３０％、１００％～１３０％、１０５％～１３０％、１１０％～１３０％、１１５％～１３０％、または１２０％～１３０％のＵＳＤＡグレード指数値を有する葉を生成することができる。さらなる局面では、タバコ植物は、乾燥させた場合に、対照植物のＵＳＤＡグレード指数値の７０％～１２５％、７５％～１２０％、８０％～１１５％、８５％～１１０％、または９０％～１００％のＵＳＤＡグレード指数値を有する葉を生成することができる。
別の局面では、本明細書に記載されるＡＤＣ、ＡＯ、またはＯＤＣの変異体またはトランスジェニックタバコ植物は、乾燥させた場合に、５５またはそれ以上、６０またはそれ以上、６５またはそれ以上、７０またはそれ以上、７５またはそれ以上、８０またはそれ以上、８５またはそれ以上、９０またはそれ以上、および９５またはそれ以上からなる群から選択されるＵＳＤＡグレード指数値を有する葉を生成することができる。別の局面では、タバコ植物は、乾燥させた場合に、５０～９５、５５～９５、６０～９５、６５～９５、７０～９５、７５～９５、８０～９５、８５～９５、９０～９５、５５～９０、６０～８５、６５～８０、７０～７５、５０～５５、５５～６０、６０～６５、６５～７０、７０～７５、７５～８０、８０～８５、８５～９０、および９０～９５からなる群から選択されるＵＳＤＡグレード指数値を有する葉を生成することができる。さらなる局面では、タバコ植物は、乾燥させた場合に、対照植物のＵＳＤＡグレード指数値の少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９８％のＵＳＤＡグレード指数値を有する葉を生成することができる。さらなる局面では、タバコ植物は、乾燥させた場合に、対照植物のＵＳＤＡグレード指数値の６５％～１３０％、７０％～１３０％、７５％～１３０％、８０％～１３０％、８５％～１３０％、９０％～１３０％、９５％～１３０％、１００％～１３０％、１０５％～１３０％、１１０％～１３０％、１１５％～１３０％、または１２０％～１３０％のＵＳＤＡグレード指数値を有する葉を生成することができる。さらなる局面では、タバコ植物は、乾燥させた場合に、対照植物のＵＳＤＡグレード指数値の７０％～１２５％、７５％～１２０％、８０％～１１５％、８５％～１１０％、または９０％～１００％のＵＳＤＡグレード指数値を有する葉を生成することができる。
一局面では、本開示は、３％未満、２．７５％未満、２．５％未満、２．２５％未満、２．０％未満、１．７５％未満、１．５％未満、１．２５％未満、１％未満、０．９％未満、０．８％未満、０．７％未満、０．６％未満、０．５％未満、０．４％未満、０．３％未満、０．２％未満、０．１％未満、および０．０５％未満からなる群から選択されるニコチンまたは総アルカロイドレベルを含む、ＡＤＣ、ＡＯ、またはＯＤＣの変異体またはトランスジェニックタバコ植物またはその部分を提供し、該タバコ植物は、乾燥させた場合に、５０またはそれ以上、５５またはそれ以上、６０またはそれ以上、６５またはそれ以上、７０またはそれ以上、７５またはそれ以上、８０またはそれ以上、８５またはそれ以上、９０またはそれ以上、および９５またはそれ以上のＵＳＤＡグレード指数値を有する葉を生成することができる。別の局面では、そのようなＡＤＣ、ＡＯ、またはＯＤＣの変異体またはトランスジェニックタバコ植物は、２．０％未満のニコチンレベルを含み、かつ、乾燥させた場合に、７０またはそれ以上のＵＳＤＡグレード指数値を有する葉を生成することができる。さらなる局面では、そのようなＡＤＣ、ＡＯ、またはＯＤＣの変異体またはトランスジェニックタバコ植物は、１．０％未満のニコチンレベルを含み、かつ、乾燥させた場合に、７０またはそれ以上のＵＳＤＡグレード指数値を有する葉を生成することができる。
一局面では、本開示はまた、ＡＤＣ、ＡＯ、またはＯＤＣの変異またはトランスジーンを含む、ＡＤＣ、ＡＯ、またはＯＤＣの変異体またはトランスジェニックタバコ植物またはその部分を提供し、該ＡＤＣ、ＡＯ、またはＯＤＣの変異またはトランスジーンは、タバコ植物のニコチンまたは総アルカロイドレベルを、類似の生育条件で生育させた場合の対照植物のニコチンレベルの１％より下、２％より下、５％より下、８％より下、１０％より下、１２％より下、１５％より下、２０％より下、２５％より下、３０％より下、４０％より下、５０％より下、６０％より下、７０％より下、または８０％より下まで低減し、該タバコ植物は、乾燥させた場合に、対照植物のＵＳＤＡグレード指数値と同等のＵＳＤＡグレード指数値を有する葉を生成することができ、かつ、該対照植物は、ＡＤＣ、ＡＯ、またはＯＤＣの変異またはトランスジーンを除いて該タバコ植物と本質的に同一の遺伝的背景を共有する。
ＬＡ葉の表現型
ＬＡ Ｂｕｒｌｅｙ ２１（ＬＡ ＢＵ２１としても参照される）は、いくつかの戻し交雑を通じたキューバシガー品種からＢｕｒｌｅｙ ２１への低アルカロイド遺伝子の組込みによって産生された低い総アルカロイドのタバコ株である。それは、その親であるＢｕｒｌｅｙ ２１の約３．５％（乾燥重量）と比較して、およそ０．２％の総アルカロイド（乾燥重量）を有する。ＬＡ ＢＵ２１は、商業的に許容される基準よりかなり低い葉グレードを有する。ＬＡ ＢＵ２１はまた、より低い収率、遅延した成熟および老化、昆虫草食に対するより高い感受性、ならびに乾燥後の不良な最終製品の品質により特徴付けられる、他の好ましくない葉の表現型も呈する。ＬＡ ＢＵ２１葉はさらに、より高いポリアミン含有量、より高いクロロフィル含有量、および単位葉面積当たりのより多い葉肉細胞などの形質を呈する。ＬＡ ＢＵ２１葉の表現型のより多くの特徴については、ＵＳ２０１９／０２７１０００を参照されたい。
ＬＡ Ｂｕｒｌｅｙ ２１（ＬＡ ＢＵ２１としても参照される）は、いくつかの戻し交雑を通じたキューバシガー品種からＢｕｒｌｅｙ ２１への低アルカロイド遺伝子の組込みによって産生された低い総アルカロイドのタバコ株である。それは、その親であるＢｕｒｌｅｙ ２１の約３．５％（乾燥重量）と比較して、およそ０．２％の総アルカロイド（乾燥重量）を有する。ＬＡ ＢＵ２１は、商業的に許容される基準よりかなり低い葉グレードを有する。ＬＡ ＢＵ２１はまた、より低い収率、遅延した成熟および老化、昆虫草食に対するより高い感受性、ならびに乾燥後の不良な最終製品の品質により特徴付けられる、他の好ましくない葉の表現型も呈する。ＬＡ ＢＵ２１葉はさらに、より高いポリアミン含有量、より高いクロロフィル含有量、および単位葉面積当たりのより多い葉肉細胞などの形質を呈する。ＬＡ ＢＵ２１葉の表現型のより多くの特徴については、ＵＳ２０１９／０２７１０００を参照されたい。
一局面では、本開示は、低ニコチンまたは低アルカロイドを付与する変異またはトランスジーン（例えば、１つもしくは複数のＡＤＣ、ＡＯ、もしくはＯＤＣ中の遺伝子改変、または１つもしくは複数のＡＤＣ、ＡＯ、もしくはＯＤＣを標的とする遺伝子改変）を含み、かつ、同じ変異またはトランスジーンを含まない対照植物の同等の葉と比べて、同等のレベルの１つまたは複数のポリアミンを含む葉を生成することができる、タバコ植物またはその部分を提供する。一局面では、同等のレベルの１つまたは複数のポリアミンとは、同じ変異またはトランスジーンを含まない対照植物の同等の葉におけるレベルの２０％以内、１７．５％以内、１５％以内、１２．５％以内、１０％以内、７．５％以内、５％以内、２．５％以内、または１％以内である。一局面では、同等のレベルの１つまたは複数のポリアミンとは、同じ変異またはトランスジーンを含まない対照植物の同等の葉におけるレベルの０．５％～１％、１％～２％、２％～３％、３％～４％、４％～５％、５％～６％、６％～７％、７％～８％、８％～９％、９％～１０％、１１％～１２％、１２％～１３％、１３％～１４％、１４％～１５％、１５％～１６％、１６％～１７％、１７％～１８％、１８％～１９％、または１９％～２０％である。さらなる局面では、同等のレベルの１つまたは複数のポリアミンとは、同じ変異またはトランスジーンを含まない対照植物の同等の葉におけるレベルの０．５％～５％、５％～１０％、または１０％～２０％である。
一局面では、本開示は、同じ変異またはトランスジーンを含まない対照植物の同等の葉と比べて、同等のクロロフィルレベルを含む葉を生成することができる、ＡＤＣ、ＡＯ、またはＯＤＣの変異体またはトランスジェニックタバコ植物またはその部分を提供する。一局面では、同等のクロロフィルレベルとは、同じ変異またはトランスジーンを含まない対照植物の同等の葉におけるレベルの２０％以内、１７．５％以内、１５％以内、１２．５％以内、１０％以内、７．５％以内、５％以内、２．５％以内、または１％以内である。一局面では、同等のクロロフィルレベルとは、同じ変異またはトランスジーンを含まない対照植物の同等の葉におけるレベルの０．５％～１％、１％～２％、２％～３％、３％～４％、４％～５％、５％～６％、６％～７％、７％～８％、８％～９％、９％～１０％、１１％～１２％、１２％～１３％、１３％～１４％、１４％～１５％、１５％～１６％、１６％～１７％、１７％～１８％、１８％～１９％、または１９％～２０％である。さらなる局面では、同等のクロロフィルレベルとは、同じ変異またはトランスジーンを含まない対照植物の同等の葉におけるレベルの０．５％～５％、５％～１０％、または１０％～２０％である。
一局面では、本開示は、同じ変異またはトランスジーンを含まない対照植物の同等の葉と比べて、同等の数の単位葉面積当たりの葉肉細胞を含む葉を生成することができる、ＡＤＣ、ＡＯ、またはＯＤＣの変異体またはトランスジェニックタバコ植物またはその部分を提供する。一局面では、同等の数の単位葉面積当たりの葉肉細胞とは、同じ変異またはトランスジーンを含まない対照植物の同等の葉におけるレベルの２０％以内、１７．５％以内、１５％以内、１２．５％以内、１０％以内、７．５％以内、５％以内、２．５％以内、または１％以内である。一局面では、同等の数の単位葉面積当たりの葉肉細胞とは、同じ変異またはトランスジーンを含まない対照植物の同等の葉におけるレベルの０．５％～１％、１％～２％、２％～３％、３％～４％、４％～５％、５％～６％、６％～７％、７％～８％、８％～９％、９％～１０％、１１％～１２％、１２％～１３％、１３％～１４％、１４％～１５％、１５％～１６％、１６％～１７％、１７％～１８％、１８％～１９％、または１９％～２０％である。さらなる局面では、同等の数の単位葉面積当たりの葉肉細胞とは、同じ変異またはトランスジーンを含まない対照植物の同等の葉におけるレベルの０．５％～５％、５％～１０％、または１０％～２０％である。
一局面では、本開示は、同じ変異またはトランスジーンを含まない対照植物の同等の葉と比べて、同等の表皮細胞サイズを含む葉を生成することができる、ＡＤＣ、ＡＯ、またはＯＤＣの変異体またはトランスジェニックタバコ植物またはその部分を提供する。一局面では、同等の表皮細胞サイズとは、同じ変異またはトランスジーンを含まない対照植物の同等の葉におけるレベルの２０％以内、１７．５％以内、１５％以内、１２．５％以内、１０％以内、７．５％以内、５％以内、２．５％以内、または１％以内である。一局面では、同等の表皮細胞サイズとは、同じ変異またはトランスジーンを含まない対照植物の同等の葉におけるレベルの０．５％～１％、１％～２％、２％～３％、３％～４％、４％～５％、５％～６％、６％～７％、７％～８％、８％～９％、９％～１０％、１１％～１２％、１２％～１３％、１３％～１４％、１４％～１５％、１５％～１６％、１６％～１７％、１７％～１８％、１８％～１９％、または１９％～２０％である。さらなる局面では、同等の表皮細胞サイズとは、同じ変異またはトランスジーンを含まない対照植物の同等の葉におけるレベルの０．５％～５％、５％～１０％、または１０％～２０％である。
一局面では、本開示は、同じ変異またはトランスジーンを含まない対照植物の同等の葉と比べて、同等の葉収率を含む葉を生成することができる、ＡＤＣ、ＡＯ、またはＯＤＣの変異体またはトランスジェニックタバコ植物またはその部分を提供する。一局面では、同等の葉収率とは、同じ変異またはトランスジーンを含まない対照植物の同等の葉におけるレベルの２０％以内、１７．５％以内、１５％以内、１２．５％以内、１０％以内、７．５％以内、５％以内、２．５％以内、または１％以内である。一局面では、同等の葉収率とは、同じ変異またはトランスジーンも含まない対照植物の同等の葉におけるレベルの０．５％～１％、１％～２％、２％～３％、３％～４％、４％～５％、５％～６％、６％～７％、７％～８％、８％～９％、９％～１０％、１１％～１２％、１２％～１３％、１３％～１４％、１４％～１５％、１５％～１６％、１６％～１７％、１７％～１８％、１８％～１９％、または１９％～２０％である。さらなる局面では、同等の葉収率とは、同じ変異またはトランスジーンを含まない対照植物の同等の葉におけるレベルの０．５％～５％、５％～１０％、または１０％～２０％である。
一局面では、本開示は、同じ変異またはトランスジーンを含まない対照植物の同等の葉と比べて、同等の昆虫草食感受性を呈する、ＡＤＣ、ＡＯ、またはＯＤＣの変異体またはトランスジェニックタバコ植物またはその部分を提供する。一局面では、同等の昆虫草食感受性とは、同じ変異またはトランスジーンを含まない対照植物の同等の葉におけるレベルの２０％以内、１７．５％以内、１５％以内、１２．５％以内、１０％以内、７．５％以内、５％以内、２．５％以内、または１％以内である。一局面では、同等の昆虫草食感受性とは、同じ変異またはトランスジーンを含まない対照植物の同等の葉におけるレベルの０．５％～１％、１％～２％、２％～３％、３％～４％、４％～５％、５％～６％、６％～７％、７％～８％、８％～９％、９％～１０％、１１％～１２％、１２％～１３％、１３％～１４％、１４％～１５％、１５％～１６％、１６％～１７％、１７％～１８％、１８％～１９％、または１９％～２０％である。さらなる局面では、同等の昆虫草食感受性とは、同じ変異またはトランスジーンを含まない対照植物の同等の葉におけるレベルの０．５％～５％、５％～１０％、または１０％～２０％である。
昆虫草食感受性レベルは、当技術分野において公知の方法によって、例えば、昆虫摂食アッセイ（ｉｎｓｅｃｔ ｆｅｅｄｉｎｇ ａｓｓａｙ）においてアッセイすることができる。手短に言えば、水中０．７％寒天の１／４インチの層を、１００ｍｍペトリ皿に加えて固化させる。葉ディスクを、ペトリ皿の蓋から切り、プレートに置いて、寒天中にそっと押し入れる。葉ディスクは、４～５の葉ステージの植物から採取する。主な中肋を除外するために、ディスクは葉身のみから採取する。植物の最も大きな４枚の葉の各々から単一のディスクを採取して、植物当たり４つのレプリケートを作製する。４つの植物を、合計１６の生物学的レプリケート試験ラインのために試料採取する。二齢ステージの１匹の青虫（例えば、ヘリオディス属（Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ）の種、ヘリコベルパ属（Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ）の種）を葉に加え、４８時間、周囲温度で摂食させる。４８時間後に、青虫の幼虫を秤量し、最終的な幼虫重量を記録する。
一局面では、タバコ植物またはその部分は、対照タバコ植物と比べて、より低いレベルのニコチンまたは総アルカロイドを提供する第１のゲノム改変（例えば、１つもしくは複数のＡＤＣ、ＡＯ、もしくはＯＤＣ遺伝子中の、または１つもしくは複数のＡＤＣ、ＡＯ、もしくはＯＤＣ遺伝子を標的とする）と、総葉ポリアミンレベル、総根ポリアミンレベル、総葉クロロフィルレベル、葉面積単位当たりの葉肉細胞数、および葉表皮細胞サイズからなる群から選択される、同等のレベルの１つまたは複数の形質を提供する第２のゲノム改変とを含み、かつ該対照植物は、第１のゲノム改変と第２のゲノム改変を両方とも有しない。一局面では、タバコ植物またはその部分は、対照タバコ植物と比べて、より低いレベルのニコチンまたは総アルカロイドを提供する第１のゲノム改変（例えば、１つもしくは複数のＡＤＣ、ＡＯ、もしくはＯＤＣ遺伝子中の、または１つもしくは複数のＡＤＣ、ＡＯ、もしくはＯＤＣ遺伝子を標的とする）と、同等のレベルの総葉ポリアミンレベルを提供する第２のゲノム改変とを含み、該対照植物は、第１のゲノム改変と第２のゲノム改変を両方とも有しない。一局面では、タバコ植物またはその部分は、対照タバコ植物と比べて、より低いレベルのニコチンまたは総アルカロイドを提供する第１のゲノム改変（例えば、１つもしくは複数のＡＤＣ、ＡＯ、もしくはＯＤＣ遺伝子中の、または１つもしくは複数のＡＤＣ、ＡＯ、もしくはＯＤＣ遺伝子を標的とする）と、同等のレベルの総根ポリアミンレベルを提供する第２のゲノム改変とを含み、該対照植物は、第１のゲノム改変と第２のゲノム改変を両方とも有しない。一局面では、タバコ植物またはその部分は、対照タバコ植物と比べて、より低いレベルのニコチンまたは総アルカロイドを提供する第１のゲノム改変（例えば、１つもしくは複数のＡＤＣ、ＡＯ、もしくはＯＤＣ遺伝子中の、または１つもしくは複数のＡＤＣ、ＡＯ、もしくはＯＤＣ遺伝子を標的とする）と、同等のレベルの総葉クロロフィルレベルを提供する第２のゲノム改変とを含み、該対照植物は、第１のゲノム改変と第２のゲノム改変を両方とも有しない。一局面では、タバコ植物またはその部分は、対照タバコ植物と比べて、より低いレベルのニコチンまたは総アルカロイドを提供する第１のゲノム改変（例えば、１つもしくは複数のＡＤＣ、ＡＯ、もしくはＯＤＣ遺伝子中の、または１つもしくは複数のＡＤＣ、ＡＯ、もしくはＯＤＣ遺伝子を標的とする）と、同等のレベルの葉面積単位当たりの葉肉細胞数を提供する第２のゲノム改変とを含み、該対照植物は、第１のゲノム改変と第２のゲノム改変を両方とも有しない。一局面では、タバコ植物またはその部分は、対照タバコ植物と比べて、より低いレベルのニコチンまたは総アルカロイドを提供する第１のゲノム改変（例えば、１つもしくは複数のＡＤＣ、ＡＯ、もしくはＯＤＣ遺伝子中の、または１つもしくは複数のＡＤＣ、ＡＯ、もしくはＯＤＣ遺伝子を標的とする）と、同等のレベルの葉表皮細胞サイズを提供する第２のゲノム改変とを含み、該対照植物は、第１のゲノム改変と第２のゲノム改変を両方とも有しない。一局面では、第２のゲノム改変は、ＡＤＣ、ＡＯ、もしくはＯＤＣ遺伝子中にあるか、またはＡＤＣ、ＡＯ、もしくはＯＤＣ遺伝子を標的とする。
一局面では、第１のゲノム改変、第２のゲノム改変、またはその両方は、トランスジーン、変異、またはその両方を含む。一局面では、ゲノム改変、第２のゲノム改変、またはその両方は、トランスジーンを含む。一局面では、第１のゲノム改変、第２のゲノム改変、またはその両方は、変異を含む。一局面では、第１のゲノム改変、第２のゲノム改変、またはその両方は、トランスジーンに基づいていない。一局面では、第１のゲノム改変、第２のゲノム改変、またはその両方は、変異に基づいていない。
一局面では、本明細書において提供されるタバコ植物は、対照タバコ植物と比べて、低減した量の総コンジュゲート型ポリアミンを葉に含む。一局面では、本明細書において提供されるタバコ植物は、対照タバコ植物と比べて、低減した量の総コンジュゲート型ポリアミンを根に含む。本明細書で使用される、コンジュゲート型ポリアミンには、１つまたは複数のフェニルプロパノイド、例えばフェルラ酸、コーヒー酸、およびクマル酸（ｃｏｕｒｍａｒｉｃ ａｃｉｄ）とコンジュゲートした遊離ポリアミン（例えば、プトレシン、スペルミン、および／またはスペルミジン）からなるバックボーンを含有するフェノールアミドなどの可溶性コンジュゲート型ポリアミンが含まれるが、それに限定されない。コンジュゲート型ポリアミンにはまた、リグニンなどの構造ポリマー中に組み込まれた不溶性コンジュゲート型ポリアミンも含まれるが、それに限定されない。一局面では、本明細書において提供されるタバコ植物は、対照タバコ植物と比べて、低減した量の総遊離ポリアミン（例えば、プトレシン、スペルミン、およびスペルミジン）を葉に含む。一局面では、本明細書において提供されるタバコ植物は、対照タバコ植物と比べて、低減した量の総コンジュゲート型ポリアミンを根に含む。一局面では、本明細書において提供されるタバコ植物は、対照タバコ植物と比べて低減した量の総コンジュゲート形態の、プトレシン、スペルミジン、およびスペルミンからなる群から選択される１つまたは複数のポリアミンを葉に含む。一局面では、本明細書において提供されるタバコ植物は、対照タバコ植物と比べて低減した量の総コンジュゲート形態の、プトレシン、スペルミジン、およびスペルミンからなる群から選択される１つまたは複数のポリアミンを根に含む。一局面では、本明細書において提供されるタバコ植物は、対照タバコ植物と比べて低減した量の総遊離形態の、プトレシン、スペルミジン、およびスペルミンからなる群から選択される１つまたは複数のポリアミンを葉に含む。一局面では、本明細書において提供されるタバコ植物は、対照タバコ植物と比べて低減した量の総コンジュゲート形態の、プトレシン、スペルミジン、およびスペルミンからなる群から選択される１つまたは複数のポリアミンを根に含む。
一局面では、本明細書に記載されるタバコ植物の特徴または形質は、開花直前、摘心時、摘心してから１週間後（ＷＰＴ）、２ＷＰＴ、３ＷＰＴ、４ＷＰＴ、５ＷＰＴ、６ＷＰＴ、７ＷＰＴ、８ＷＰＴ、および収穫時からなる群から選択される時に測定される。一局面では、第１のゲノム改変と第２のゲノム改変とを含む、本明細書において提供されるタバコ植物は、対照植物由来の葉の葉グレードと同等の葉グレードを有する葉を生成することができる。一局面では、第１のゲノム改変と第２のゲノム改変とを含む、本明細書において提供されるタバコ植物は、対照植物と同等の総葉収率を有する。
化学的測定値
「アルカロイド」は、植物中に天然に存在する複雑な窒素含有化合物であり、ヒトおよび動物において薬理学的効果を有する。「ニコチン」は、市販のシガレットタバコにおける主要な天然アルカロイドであり、ニコチアナ・タバカムにおけるアルカロイド含有量の約９０パーセントを占める。タバコにおける他の主要なアルカロイドとしては、コチニン、ノルニコチン、ミオスミン、ニコチリン、アナバシン、およびアナタビンが挙げられる。微量のタバコアルカロイドとしては、ニコチン－ｎ－オキシド、Ｎ－メチルアナタビン、Ｎ－メチルアナバシン、シュードオキシニコチン、２，３ジピリジル、およびその他が挙げられる。
「アルカロイド」は、植物中に天然に存在する複雑な窒素含有化合物であり、ヒトおよび動物において薬理学的効果を有する。「ニコチン」は、市販のシガレットタバコにおける主要な天然アルカロイドであり、ニコチアナ・タバカムにおけるアルカロイド含有量の約９０パーセントを占める。タバコにおける他の主要なアルカロイドとしては、コチニン、ノルニコチン、ミオスミン、ニコチリン、アナバシン、およびアナタビンが挙げられる。微量のタバコアルカロイドとしては、ニコチン－ｎ－オキシド、Ｎ－メチルアナタビン、Ｎ－メチルアナバシン、シュードオキシニコチン、２，３ジピリジル、およびその他が挙げられる。
一局面では、本明細書において提供されるＡＤＣ、ＡＯ、またはＯＤＣの変異体またはトランスジェニックタバコ植物は、類似の生育条件で生育させた場合の、遺伝子改変を有しない対照タバコ植物と比較して、より低いレベルの、コチニン、ノルニコチン、ミオスミン、ニコチリン、アナバシン、およびアナタビンからなる群から選択される１つまたは複数のアルカロイドを提供する遺伝子改変を含む。一局面では、より低いアルカロイドまたはニコチンレベルとは、対照タバコ植物のアルカロイドまたはニコチンレベルの１％より下、２％より下、５％より下、８％より下、１０％より下、１２％より下、１５％より下、２０％より下、２５％より下、３０％より下、４０％より下、５０％より下、６０％より下、７０％より下、または８０％より下のアルカロイドまたはニコチンレベルを指す。別の局面では、より低いアルカロイドまたはニコチンレベルとは、対照タバコ植物のアルカロイドまたはニコチンレベルの約０．５％～１％、１％～２％、２％～３％、３％～４％、４％～５％、５％～６％、６％～７％、７％～８％、８％～９％、９％～１０％、１１％～１２％、１２％～１３％、１３％～１４％、１４％～１５％、１５％～１６％、１６％～１７％、１７％～１８％、１８％～１９％、１９％～２０％、２１％～２２％、２２％～２３％、２３％～２４％、２４％～２５％、２５％～２６％、２６％～２７％、２７％～２８％、２８％～２９％、または２９％～３０％のアルカロイドまたはニコチンレベルを指す。さらなる局面では、より低いアルカロイドまたはニコチンレベルとは、対照タバコ植物のアルカロイドまたはニコチンレベルの約０．５％～５％、５％～１０％、１０％～２０％、２０％～３０％のアルカロイドまたはニコチンレベルを指す。
一局面では、本明細書において提供されるＡＤＣ、ＡＯ、またはＯＤＣの変異体またはトランスジェニックタバコ植物は、乾燥重量に基づいて約０．０１％、０．０２％、０．０５％、０．７５％、０．１％、０．１５％、０．２％、０．３％、０．３５％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１％、１．１％、１．２％、１．３％、１．４％、１．５％、１．６％、１．７％、１．８％、１．９％、２％、２．１％、２．２％、２．３％、２．４％、２．５％、２．６％、２．７％、２．８％、２．９％、３％、３．１％、３．２％、３．３％、３．４％、３．５％、３．６％、３．７％、３．８％、３．９％、４％、５％、６％、７％、８％、および９％からなる群から選択される平均ニコチンまたは総アルカロイドレベルを含む。別の局面では、本明細書において提供されるタバコ植物は、乾燥重量に基づいて約０．０１％～０．０２％、０．０２％～０．０５％、０．０５％～０．７５％、０．７５％～０．１％、０．１％～０．１５％、０．１５％～０．２％、０．２％～０．３％、０．３％～０．３５％、０．３５％～０．４％、０．４％～０．５％、０．５％～０．６％、０．６％～０．７％、０．７％～０．８％、０．８％～０．９％、０．９％～１％、１％～１．１％、１．１％～１．２％、１．２％～１．３％、１．３％～１．４％、１．４％～１．５％、１．５％～１．６％、１．６％～１．７％、１．７％～１．８％、１．８％～１．９％、１．９％～２％、２％～２．１％、２．１％～２．２％、２．２％～２．３％、２．３％～２．４％、２．４％～２．５％、２．５％～２．６％、２．６％～２．７％、２．７％～２．８％、２．８％～２．９％、２．９％～３％、３％～３．１％、３．１％～３．２％、３．２％～３．３％、３．３％～３．４％、３．４％～３．５％、および３．５％～３．６％からなる群から選択される平均ニコチンまたは総アルカロイドレベルを含む。さらなる局面では、本明細書において提供されるタバコ植物は、乾燥重量に基づいて約０．０１％～０．１％、０．０２％～０．２％、０．０３％～０．３％、０．０４％～０．４％、０．０５％～０．５％、０．７５％～１％、０．１％～１．５％、０．１５％～２％、０．２％～３％、および０．３％～３．５％からなる群から選択される平均ニコチンまたは総アルカロイドレベルを含む。
特に定めない限り、タバコ植物、品種、栽培品種、または株についての本明細書において述べられるアルカロイド、ポリアミン、もしくはニコチンレベル（もしくは別の葉の化学もしくは特性の特徴）の測定値または葉グレード指数値は、例えば、単一の植物の複数の葉の平均、または単一の品種、栽培品種、もしくは株由来のタバコ植物の集団からの平均測定値を含む、平均測定値を指す。特に定めない限り、本明細書に記載されるタバコ植物のニコチン、アルカロイド、またはポリアミンレベル（または別の葉の化学もしくは特性の特徴）は、摘心後に葉番号３、４、および５から収集されたプールされた葉試料において摘心してから２週間後に測定される。別の局面では、タバコ植物のニコチン、アルカロイド、またはポリアミンレベル（または別の葉の化学もしくは特性の特徴）は、ニコチン、アルカロイド、またはポリアミン（または別の葉の化学もしくは特性の特徴）の最も高いレベルを有する葉において摘心後に測定される。一局面では、タバコ植物のニコチン、アルカロイド、またはポリアミンレベルは、葉番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０において摘心後に測定される。別の局面では、タバコ植物のニコチン、アルカロイド、またはポリアミンレベル（または別の葉の化学もしくは特性の特徴）は、葉番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、および３０からなる群から選択される連続する葉番号を有する２つまたはそれ以上の葉のプールにおいて摘心後に測定される。別の局面では、タバコ植物のニコチン、アルカロイド、またはポリアミンレベル（または別の葉の化学もしくは特性の特徴）は、１～５、６～１０、１１～１５、１６～２０、２１～２５、および２６～３０からなる群から選択される葉番号を有する葉において摘心後に測定される。別の局面では、タバコ植物のニコチン、アルカロイド、またはポリアミンレベル（または別の葉の化学もしくは特性の特徴）は、１～５、６～１０、１１～１５、１６～２０、２１～２５、および２６～３０からなる群から選択される葉番号を有する２つまたはそれ以上の葉のプールにおいて摘心後に測定される。別の局面では、タバコ植物のニコチン、アルカロイド、またはポリアミンレベル（または別の葉の化学もしくは特性の特徴）は、１～５、６～１０、１１～１５、１６～２０、２１～２５、および２６～３０からなる群から選択される葉番号を有する３つまたはそれ以上の葉のプールにおいて摘心後に測定される。
アルカロイドレベルは、当技術分野において公知の方法によって、例えば、気体－液体クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、ラジオイムノアッセイ、および酵素結合免疫吸着アッセイに基づく定量化によってアッセイすることができる。例えば、ニコチンアルカロイドレベルは、キャピラリーカラムおよびＦＩＤ検出器を備えた気体－液体クロマトグラフィーを使用する方法のための、ＣＯＲＥＳＴＡ Ｒｅｃｏｍｍｅｎｄｅｄ Ｍｅｔｈｏｄ Ｎｏ．７，１９８７およびＩＳＯ規格（ＩＳＯ ＴＣ １２６Ｎ ３９４ Ｅ。Ｈｉｂｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ １００：８２６－３５（１９９２）もまた参照されたい）に基づくＧＣ－ＦＩＤ法によって測定することができる。特に定めない限り、本明細書に記載される全てのアルカロイドレベルは、ＣＯＲＥＳＴＡ Ｍｅｔｈｏｄ Ｎｏ ６２，Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｉｃｏｔｉｎｅ ｉｎ Ｔｏｂａｃｃｏ ａｎｄ Ｔｏｂａｃｃｏ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｂｙ Ｇａｓ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｆｅｂｒｕａｒｙ ２００５による方法、ならびにＦｅｄｅｒａｌ Ｒｅｇｉｓｔｅｒ Ｖｏｌ．６４，Ｎｏ．５５ Ｍａｒｃｈ ２３，１９９９において刊行された（およびＶｏｌ．７４，Ｎｏ．４，Ｊａｎｕａｒｙ ７，２００９において補正された）Ｃｅｎｔｅｒｓ ｆｏｒ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ａｎｄ ＰｒｅｖｅｎｔｉｏｎのＰｒｏｔｏｃｏｌ ｆｏｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｎｉｃｏｔｉｎｅ，Ｔｏｔａｌ Ｍｏｉｓｔｕｒｅ ａｎｄ ｐＨ ｉｎ Ｓｍｏｋｅｌｅｓｓ Ｔｏｂａｃｃｏ Ｐｒｏｄｕｃｔｓにおいて定義される方法を使用して測定される。
代替的に、タバコの総アルカロイドは、Ｓｋａｌａｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｃｏ（Ｗｅｓｔ Ｃｈｅｓｔｅｒ，ＰＡ）により改作され、Ｃｏｌｌｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｔｏｂａｃｃｏ Ｓｃｉｅｎｃｅ １３：７９－８１（１９６９）により記載されている、タバコ試料の分析のために開発されたセグメントフロー比色法を使用して測定することができる。手短に言えば、タバコの試料を乾燥させ、粉砕し、抽出した後に、総アルカロイドおよび還元糖の分析を行う。方法では次いで、酢酸／メタノール／水抽出および脱色用の木炭が用いられる。総アルカロイドの決定は、有色複合体を形成するための芳香族アミンの存在下での塩化シアノゲンとニコチンアルカロイドとの反応に基づき、該複合体が４６０ｎｍで測定される。特に定めない限り、本明細書に示される総アルカロイドレベルまたはニコチンレベルは、乾燥重量に基づく（例えば、総アルカロイドのパーセントまたはニコチンのパーセント）。
本明細書において使用される場合、葉の番号付けは、タバコの茎上の葉の位置に基づき、葉番号１は、摘心後の最も古い葉（基部）であり、最も高い葉番号は、最も若い葉（先端部）に割り当てられる。
平均測定値（例えば、アルカロイドもしくはニコチンレベルまたは葉のグレード付け）を決定するためのタバコ植物の集団またはタバコ葉の集合物は、任意のサイズ、例えば、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、または５０であることができる。産業上承認された標準的なプロトコールに従って、平均測定値またはグレード指数値が決定される。
本明細書において使用される場合、「摘心」とは、タバコ植物が栄養成熟に近くかつ生殖生長の開始辺りにある時の、ＳＡＭ、花、および数枚までの隣接する葉を含む、茎の頂部の除去を指す。典型的には、タバコ植物は、つぼみステージ（花が現れ始めた直後）において摘心される。例えば、温室または野外生育のタバコ植物は、植物の５０％が少なくとも１つの開いた花を有する時に摘心することができる。タバコ植物の摘心は、頂芽優勢の喪失を結果としてもたらし、かつアルカロイド産生の増大も誘導する。
典型的には、タバコ植物のニコチン、アルカロイド、またはポリアミンレベル（または別の葉の化学もしくは特性の特徴）は、摘心してから約２週間後に測定される。他の時点もまた使用され得る。一局面では、タバコ植物のニコチン、アルカロイド、またはポリアミンレベル（または別の葉の化学もしくは特性の特徴）は、摘心してから約１、２、３、４、または５週間後に測定される。別の局面では、タバコ植物のニコチン、アルカロイド、またはポリアミンレベル（または別の葉の化学もしくは特性の特徴）は、摘心してから約３、５、７、１０、１２、１４、１７、１９、または２１日後に測定される。
本明細書において使用される場合、「類似の生育条件」とは、生育のためおよび２つまたはそれ以上の植物遺伝子型の間の意味のある比較を行うための類似の環境条件および／または耕種学的実施であって、環境条件および耕種学的実施のいずれも、２つまたはそれ以上の植物遺伝子型の間に観察される任意の差異に寄与しないか、または該差異を説明しないような、類似の環境条件および／または耕種学的実施を指す。環境条件としては、例えば、光、温度、水（湿度）、ならびに栄養物（例えば、窒素およびリン）が挙げられる。耕種学的実施としては、例えば、種まき、切取り（ｃｌｉｐｐｉｎｇ）、切落し（ｕｎｄｅｒｃｕｔｔｉｎｇ）、移植、摘心、および株分けが挙げられる。Ｔｏｂａｃｃｏ，Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｄａｖｉｓ ＆ Ｎｉｅｌｓｅｎ，ｅｄｓ．，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｏｘｆｏｒｄ（１９９９），ｐｐ ７０－１０３のＣｈａｐｔｅｒ ４Ｂおよび４Ｃを参照されたい。
本明細書において使用される場合、「同等の葉」とは、類似のサイズ、形状、齢、および／または茎上の位置を有する葉を指す。
芳香／風味
一局面では、本明細書において提供されるＡＤＣ、ＡＯ、またはＯＤＣの変異体またはトランスジェニックタバコ植物は、類似の生育条件で生育させた場合の対照タバコ植物と比較して、類似のレベルの、３－メチル吉草酸、吉草酸、イソ吉草酸、ラブダノイド、センブラノイド、糖エステル、および還元糖からなる群から選択される１つまたは複数のタバコ芳香化合物を含む。
一局面では、本明細書において提供されるＡＤＣ、ＡＯ、またはＯＤＣの変異体またはトランスジェニックタバコ植物は、類似の生育条件で生育させた場合の対照タバコ植物と比較して、類似のレベルの、３－メチル吉草酸、吉草酸、イソ吉草酸、ラブダノイド、センブラノイド、糖エステル、および還元糖からなる群から選択される１つまたは複数のタバコ芳香化合物を含む。
本明細書において使用される場合、タバコ芳香化合物は、タバコの煙の風味および芳香と関連付けられる化合物である。これらの化合物としては、３－メチル吉草酸、吉草酸、イソ吉草酸、センブラノイドおよびラブダノイドジテルペン、ならびに糖エステルが挙げられるがそれに限定されない。タバコ芳香化合物の濃度は、ガスクロマトグラフィー質量分析（ＧＣ－ＭＳ）、核磁気共鳴分光法、液体クロマトグラフィー連結質量分析が挙げられるがそれに限定されない当技術分野における任意の公知の代謝物プロファイリング方法により測定され得る。Ｔｈｅ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｍｅｔａｂｏｌｏｍｉｃｓ、ＷｅｃｋｗｅｒｔｈおよびＫａｈｌ編、（Ｗｉｌｅｙ－Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ）（Ｍａｙ ２８、２０１３）を参照。
本明細書において使用される場合、「還元糖」は、遊離のまたは潜在的に遊離のアルデヒドまたはケトン基を有する任意の糖（単糖または多糖）である。グルコースおよびフルクトースは、煙のｐＨを低減することおよび「遊離」の非プロトン化ニコチンの量を効果的に低減することにより、シガレットの煙中のニコチン緩衝剤として作用する。還元糖は、例えば、ニコチンおよび他のタバコアルカロイドの知覚的影響を改変することにより、煙の風味の均衡を取る。糖含有量とアルカロイド含有量との逆の関係性が、タバコ品種にわたり、同じ品種内において、および栽培条件により引き起こされる同じ植物株内において報告されている。還元糖レベルは、Ｓｋａｌａｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｃｏ（Ｗｅｓｔ Ｃｈｅｓｔｅｒ、ＰＡ）により採用されるようなタバコ試料の分析のために開発され、Ｄａｖｉｓ、Ｔｏｂａｃｃｏ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０：１３９－１４４（１９７６）により記載されているセグメントフロー比色法を使用して測定され得る。例えば、試料は、炭酸ナトリウム溶液に対して透析される。銅ネオクプロインが試料に添加され、溶液が加熱される。銅ネオクプロインキレートは糖の存在下で還元されて有色複合体を結果としてもたらし、該複合体は４６０ｎｍにおいて測定される。
ＴＳＮＡ
また別の局面では、提供されるタバコ植物は、ニコチンデメチラーゼをコードする１つまたは複数の遺伝子座（例えば、ＣＹＰ８２Ｅ４、ＣＹＰ８２Ｅ５、ＣＹＰ８２Ｅ１０）中の１つまたは複数の変異をさらに含み、これは、ニコチンデメチラーゼをコードする１つまたは複数の遺伝子座中の１つまたは複数の変異を欠いた対照植物と比較して、低減した量のノルニコチンを付与する（米国特許第８，３１９，０１１号；同第８，１２４，８５１号；同第９，１８７，７５９号；同第９，２２８，１９４号；同第９，２２８，１９５号；同第９，２４７，７０６号を参照されたい）。一局面では、記載される改変タバコ植物は、同等の条件下で生育および乾燥させた場合の対照植物と比較して、低減したニコチンデメチラーゼ活性をさらに含む。さらなる局面では、提供されるタバコ植物は、上昇したレベルの１つまたは複数の酸化防止剤を提供する１つまたは複数の変異またはトランスジーンをさらに含む（米国特許出願公開第２０１８／０１１９１６３号およびＷＯ２０１８／０６７９８５を参照されたい）。別の局面では、提供されるタバコ植物は、低減したレベルの１つまたは複数のタバコ特異的ニトロソアミン（ＴＳＮＡ）（例えば、Ｎ’－ニトロソノルニコチン（ＮＮＮ）、４－メチルニトロソアミノ－ｌ－（３－ピリジル）－ｌ－ブタノン（ＮＮＫ）、Ｎ’－ニトロソアナタビン（ＮＡＴ）Ｎ’－ニトロソアナバシン（ＮＡＢ））を提供する１つまたは複数の変異またはトランスジーンをさらに含む。
また別の局面では、提供されるタバコ植物は、ニコチンデメチラーゼをコードする１つまたは複数の遺伝子座（例えば、ＣＹＰ８２Ｅ４、ＣＹＰ８２Ｅ５、ＣＹＰ８２Ｅ１０）中の１つまたは複数の変異をさらに含み、これは、ニコチンデメチラーゼをコードする１つまたは複数の遺伝子座中の１つまたは複数の変異を欠いた対照植物と比較して、低減した量のノルニコチンを付与する（米国特許第８，３１９，０１１号；同第８，１２４，８５１号；同第９，１８７，７５９号；同第９，２２８，１９４号；同第９，２２８，１９５号；同第９，２４７，７０６号を参照されたい）。一局面では、記載される改変タバコ植物は、同等の条件下で生育および乾燥させた場合の対照植物と比較して、低減したニコチンデメチラーゼ活性をさらに含む。さらなる局面では、提供されるタバコ植物は、上昇したレベルの１つまたは複数の酸化防止剤を提供する１つまたは複数の変異またはトランスジーンをさらに含む（米国特許出願公開第２０１８／０１１９１６３号およびＷＯ２０１８／０６７９８５を参照されたい）。別の局面では、提供されるタバコ植物は、低減したレベルの１つまたは複数のタバコ特異的ニトロソアミン（ＴＳＮＡ）（例えば、Ｎ’－ニトロソノルニコチン（ＮＮＮ）、４－メチルニトロソアミノ－ｌ－（３－ピリジル）－ｌ－ブタノン（ＮＮＫ）、Ｎ’－ニトロソアナタビン（ＮＡＴ）Ｎ’－ニトロソアナバシン（ＮＡＢ））を提供する１つまたは複数の変異またはトランスジーンをさらに含む。
変異タイプ
一局面では、本開示は、ＡＤＣ、ＡＯ、またはＯＤＣ遺伝子中の非天然変異（例えば、「ＡＤＣ変異体」、「ＡＯ変異体」、または「ＯＤＣ変異体」中のような）を含む、タバコ植物またはその部分を提供する。一局面では、非天然変異は、ナンセンス変異、ミスセンス変異、フレームシフト変異、スプライス部位変異、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される１つまたは複数の変異タイプを含む。本明細書において使用される場合、「ナンセンス変異」とは、核酸配列によるアミノ酸配列に未成熟終止コドンを導入する、核酸配列への変異を指す。本明細書において使用される場合、「ミスセンス変異」とは、核酸配列によりコードされるアミノ酸配列内に置換を引き起こす、核酸配列への変異を指す。本明細書において使用される場合、「フレームシフト変異」とは、核酸配列をアミノ酸配列に翻訳するためのフレームをシフトする、核酸配列への挿入または欠失を指す。「スプライス部位変異」とは、イントロンがタンパク質翻訳のために保持されるようにさせる、または代替的に、エクソンがタンパク質翻訳から排除されるようにさせる、核酸配列中の変異を指す。スプライス部位変異は、ナンセンス変異、ミスセンス変異、またはフレームシフト変異を引き起こし得る。
一局面では、本開示は、ＡＤＣ、ＡＯ、またはＯＤＣ遺伝子中の非天然変異（例えば、「ＡＤＣ変異体」、「ＡＯ変異体」、または「ＯＤＣ変異体」中のような）を含む、タバコ植物またはその部分を提供する。一局面では、非天然変異は、ナンセンス変異、ミスセンス変異、フレームシフト変異、スプライス部位変異、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される１つまたは複数の変異タイプを含む。本明細書において使用される場合、「ナンセンス変異」とは、核酸配列によるアミノ酸配列に未成熟終止コドンを導入する、核酸配列への変異を指す。本明細書において使用される場合、「ミスセンス変異」とは、核酸配列によりコードされるアミノ酸配列内に置換を引き起こす、核酸配列への変異を指す。本明細書において使用される場合、「フレームシフト変異」とは、核酸配列をアミノ酸配列に翻訳するためのフレームをシフトする、核酸配列への挿入または欠失を指す。「スプライス部位変異」とは、イントロンがタンパク質翻訳のために保持されるようにさせる、または代替的に、エクソンがタンパク質翻訳から排除されるようにさせる、核酸配列中の変異を指す。スプライス部位変異は、ナンセンス変異、ミスセンス変異、またはフレームシフト変異を引き起こし得る。
遺伝子のコーディング領域中の変異（例えば、エクソン変異）は、変異したメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）がタンパク質またはポリペプチドに翻訳される場合に、短縮型タンパク質またはポリペプチドを結果としてもたらし得る。一局面では、本開示は、タンパク質またはポリペプチドの短縮を結果としてもたらす変異を提供する。本明細書において使用される場合、「短縮型」タンパク質またはポリペプチドは、内因性対照タンパク質またはポリペプチドと比較して、少なくとも１つ少ないアミノ酸を含む。例えば、内因性プロテインＡが１００アミノ酸を含む場合には、プロテインＡの短縮バージョンは、１～９９アミノ酸を含み得る。
いかなる科学理論によっても限定されないが、タンパク質またはポリペプチドの短縮を引き起こす１つの方法は、内因性遺伝子のｍＲＮＡ転写物中の未成熟終止コドンの導入によるものである。一局面では、本開示は、内因性遺伝子のｍＲＮＡ転写物中の未成熟終止コドンを結果としてもたらす変異を提供する。本明細書において使用される場合、「終止コドン」とは、タンパク質翻訳の終了を合図する、ｍＲＮＡ転写物内のヌクレオチドトリプレットを指す。「未成熟終止コドン」とは、内因性ｍＲＮＡ転写物中の正常の終止コドン位置よりも早く（例えば、５’側に）位置付けられる終止コドンを指す。限定的であることなく、「ＵＡＧ」、「ＵＡＡ」、「ＵＧＡ」、「ＴＡＧ」、「ＴＡＡ」、および「ＴＧＡ」を含むいくつかの終止コドンが、当技術分野において公知である。
一局面では、本明細書において提供される変異は、ヌル変異を含む。本明細書において使用される場合、「ヌル変異」とは、変異を含む遺伝子によりコードされるタンパク質に完全な機能喪失を付与する変異、または代替的に、ゲノム遺伝子座によりコードされる低分子ＲＮＡに完全な機能喪失を付与する変異を指す。ヌル変異は、ｍＲＮＡ転写物産生の欠如、低分子ＲＮＡ転写物産生の欠如、タンパク質機能の欠如、またはそれらの組み合わせを引き起こし得る。
本明細書において提供される変異は、内因性遺伝子の任意の部分に位置付けられ得る。一局面では、本明細書において提供される変異は、内因性遺伝子のエクソン内に位置付けられる。別の局面では、本明細書において提供される変異は、内因性遺伝子のイントロン内に位置付けられる。さらなる局面では、本明細書において提供される変異は、内因性遺伝子の５’－非翻訳領域（ＵＴＲ）内に位置付けられる。また別の局面では、本明細書において提供される変異は、内因性遺伝子の３’－ＵＴＲ内に位置付けられる。さらに別の局面では、本明細書において提供される変異は、内因性遺伝子のプロモーター内に位置付けられる。さらに別の局面では、本明細書において提供される変異は、内因性遺伝子のターミネーター内に位置付けられる。
一局面では、内因性遺伝子中の変異は、変異を欠いた内因性遺伝子と比較して、発現レベルの低減を結果としてもたらす。別の局面では、内因性遺伝子中の変異は、変異を欠いた内因性遺伝子と比較して、発現レベルの増加を結果としてもたらす。
一局面では、非天然変異は、対照タバコ植物における遺伝子の発現と比較して、発現レベルの低減を結果としてもたらす。一局面では、非天然変異は、対照タバコ植物における遺伝子の発現と比較して、発現レベルの増加を結果としてもたらす。
さらなる局面では、内因性遺伝子中の変異は、変異を欠いた内因性遺伝子によりコードされるタンパク質またはポリペプチドと比較して、変異を有する内因性遺伝子によりコードされるタンパク質またはポリペプチドによる活性レベルの低減を結果としてもたらす。さらなる局面では、内因性遺伝子中の変異は、変異を欠いた内因性遺伝子によりコードされるタンパク質またはポリペプチドと比較して、変異を有する内因性遺伝子によりコードされるタンパク質またはポリペプチドによる活性レベルの増加を結果としてもたらす。
一局面では、非天然変異は、非天然変異を欠いたポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質またはポリペプチドと比較して、非天然変異を含むポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質またはポリペプチドによる活性レベルの低減を結果としてもたらす。別の局面では、非天然変異は、非天然変異を欠いたポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質またはポリペプチドと比較して、非天然変異を含むポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質またはポリペプチドによる活性レベルの増加を結果としてもたらす。
一局面では、本明細書に提供される変異は、関心対象の遺伝子、例えば、１つまたは複数のＡＤＣ、ＡＯ、またはＯＤＣ遺伝子の発現を活性化するか、またはその活性を上昇させる優性変異体を提供する。
遺伝子発現のレベルは、当技術分野において日常的に調べられている。非限定的な例として、遺伝子発現は、定量的逆転写酵素ＰＣＲ（ｑＲＴ－ＰＣＲ）、ＲＮＡシークエンシング、またはノーザンブロットを用いて測定することができる。一局面では、遺伝子発現は、ｑＲＴ－ＰＣＲを用いて測定される。別の局面では、遺伝子発現は、ノーザンブロットを用いて測定される。別の局面では、遺伝子発現は、ＲＮＡシークエンシングを用いて測定される。
ＡＤＣ、ＡＯ、またはＯＤＣの変異体タバコ植物は、ランダムまたは標的指向性変異誘発アプローチを含む当技術分野において公知の任意の方法により作製され得る。そのような変異誘発方法としては、エチルメチルスルフェート（ＥＭＳ）（ＨｉｌｄｅｒｉｎｇおよびＶｅｒｋｅｒｋ、Ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ｉｎｄｕｃｅｄ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｐｌａｎｔ ｂｒｅｅｄｉｎｇ．Ｐｅｒｇａｍｏｎ ｐｒｅｓｓ、ｐｐ ３１７－３２０、１９６５）またはＵＶ照射、Ｘ線、および高速中性子照射（例えば、Ｖｅｒｋｅｒｋ、Ｎｅｔｈ．Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｓｃｉ．１９：１９７－２０３、１９７１；およびＰｏｅｈｌｍａｎ、Ｂｒｅｅｄｉｎｇ Ｆｉｅｌｄ Ｃｒｏｐｓ、Ｖａｎ Ｎｏｓｔｒａｎｄ Ｒｅｉｎｈｏｌｄ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（３．ｓｕｐ．ｒｄ ｅｄ）、１９８７を参照）、トランスポゾンタグ付加（Ｆｅｄｏｒｏｆｆ ｅｔ ａｌ．、１９８４；米国特許第４，７３２，８５６号および米国特許第５，０１３，６５８号）を用いる種子の処理の他に、Ｔ－ＤＮＡ挿入方法論（Ｈｏｅｋｅｍａ ｅｔ ａｌ．、１９８３；米国特許第５，１４９，６４５号）が挙げられるがそれに限定されない。ＥＭＳ誘導変異誘発は、ゲノムの長さにわたりランダムな点変異を化学的に誘導することからなる。高速中性子変異誘発は、種子を中性子衝撃に曝露することからなり、中性子衝撃は二本鎖ＤＮＡ切断を通じて大きな欠失を引き起こす。トランスポゾンタグ付加は、内因性遺伝子内にトランスポゾンを挿入して遺伝子の発現を低減または除去することを含む。タバコ遺伝子中に存在し得る変異の種類としては、例えば、点変異、欠失、挿入、重複、および逆位が挙げられる。そのような変異は、望ましくは、タバコ遺伝子のコーディング領域中に存在するが、タバコ遺伝子のプロモーター領域、およびイントロン、または非翻訳領域中の変異もまた望ましいことがある。
加えて、変性ＨＰＬＣまたは選択されるＰＣＲ産物の選択的なエンドヌクレアーゼ消化を使用する、化学的に誘導される変異のためのスクリーニングの迅速かつ自動化可能な方法、ＴＩＬＬＩＮＧ（Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｌｏｃａｌ Ｌｅｓｉｏｎｓ Ｉｎ Ｇｅｎｏｍｅｓ）もまた本開示に応用可能である。ＭｃＣａｌｌｕｍ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１８：４５５－４５７を参照。遺伝子発現に影響するまたは遺伝子の機能に干渉する変異は、当技術分野において周知の方法を使用して決定され得る。遺伝子エクソン中の挿入変異は、通常、ヌル変異体を結果としてもたらす。保存された残基中の変異は、タンパク質の機能の阻害において特に効果的であり得る。一局面では、タバコ植物は、米国仮特許出願第62/616,959号及び第62/625,878号（いずれもその全体が参照により本明細書に組み入れられる）に記載の１つまたは複数のＮＣＧ遺伝子中のナンセンス（例えば、終止コドン）変異を含む。
一局面では、本開示はまた、商業的に許容される葉品質を維持しながら変化したニコチンレベルを有するタバコ株を提供する。一局面では、このような株は、精密なゲノム操作技術、例えば、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、およびｃｌｕｓｔｅｒｅｄ ｒｅｇｕｌａｒｌｙ－ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ ｓｈｏｒｔ ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ ｒｅｐｅａｔｓ（ＣＲＩＳＰＲ）／Ｃａｓ９システム、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１システム、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｓｍ１システム、およびそれらの組み合わせを介して１つまたは複数のＡＤＣ、ＡＯ、またはＯＤＣ遺伝子中に変異を導入することにより産生され得る（例えば、米国特許出願公開第２０１７／０２３３７５６号を参照）。例えば、Ｇａｊ ｅｔ ａｌ．、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、３１（７）：３９７－４０５（２０１３）を参照。Anzalone et al.（「Search-and-replace genome editing without double-stranded breaks or donor DNA」 Nature, 21 October 2019 (doi[dot]org/10.1038/s41586-019-1711-4)）によって記載された、RNAプログラム可能なニッカーゼ（例えば、修飾Cas9）と融合した逆転写酵素を使用するプライム編集方法論は、１つまたは複数のADC、AO、またはODC遺伝子に突然変異を導入するためにも使用可能である。
変異誘発されたタバコ植物のスクリーニングおよび選択は、当業者に公知の任意の方法論を介してもよい。スクリーニングおよび選択の方法論の例としては、サザン解析、ポリヌクレオチドの検出のためのＰＣＲ増幅、ノーザンブロット、RNase保護、プライマー伸長、ＲＮＡ転写物の検出のためのＲＴ－ＰＣＲ増幅、サンガーシークエンシング、次世代シークエンシング技術（例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ、ＰａｃＢｉｏ、Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ、４５４）、ポリペプチドおよびポリヌクレオチドの酵素またはリボザイム活性の検出のための酵素アッセイ、ならびにポリペプチドを検出するためのタンパク質ゲル電気泳動、ウエスタンブロット、免疫沈降、および酵素結合イムノアッセイが挙げられるがそれに限定されない。インサイチューハイブリダイゼーション、酵素染色、および免疫染色などの他の技術もまた、ポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチドの存在または発現を検出するために使用され得る。参照される全ての技術を行うための方法は公知である。
一局面では、本明細書において提供されるタバコ植物または植物ゲノムは、ゲノム編集技術によって、例えば、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ヌクレアーゼ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１ヌクレアーゼ、またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃｓｍ１ヌクレアーゼからなる群から選択されるヌクレアーゼにより変異誘発または編集される。
本明細書において使用される場合、「編集」または「ゲノム編集」は、内因性の植物ゲノム核酸配列の少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、もしくは少なくとも１０ヌクレオチドの標的指向性変異誘発、または内因性の植物ゲノム核酸配列の除去もしくは置換を指す。一局面では、提供される編集された核酸配列は、内因性核酸配列と少なくとも９９．９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９％、少なくとも９８％、少なくとも９７％、少なくとも９６％、少なくとも９５％、少なくとも９４％、少なくとも９３％、少なくとも９２％、少なくとも９１％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、または少なくとも７５％の配列同一性を有する。一局面では、提供される編集された核酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～３６およびその断片と少なくとも９９．９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９％、少なくとも９８％、少なくとも９７％、少なくとも９６％、少なくとも９５％、少なくとも９４％、少なくとも９３％、少なくとも９２％、少なくとも９１％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、または少なくとも７５％の配列同一性を有する。
メガヌクレアーゼ、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｓｍ１およびＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１は、ゲノム配列の標的部位において二本鎖ＤＮＡ切断を誘導し、それは次に、相同組換え（ＨＲ）または非相同末端結合（ＮＨＥＪ）の天然のプロセスにより修復される。次に、切断された部位において配列改変が行われ、それは、ＮＨＥＪの場合に遺伝子破壊を結果としてもたらす欠失もしくは挿入、またはＨＲによるドナー核酸配列の組込みを含み得る。一局面では、提供される方法は、提供されるヌクレアーゼを用いて植物ゲノムを編集して、ドナーポリヌクレオチドを用いるＨＲを介して植物ゲノム中の少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０ヌクレオチド、または１０ヌクレオチド超を変異させる工程を含む。一局面では、提供される変異は、ヌクレアーゼを使用するゲノム編集により引き起こされる。別の局面では、提供される変異は、非相同末端結合または相同組換えにより引き起こされる。
一般的に微生物において同定されるメガヌクレアーゼは、標的ＤＮＡの部位特異的な消化を結果としてもたらす高い活性および長い認識配列（＞１４ｂｐ）を有する特有の酵素である。天然に存在するメガヌクレアーゼの操作型は、典型的には、伸長されたＤＮＡ認識配列（例えば、１４～４０ｂｐ）を有する。メガヌクレアーゼの操作は、ＺＦＮおよびＴＡＬＥＮの操作より困難であり得、その理由は、メガヌクレアーゼのＤＮＡ認識と切断機能が単一ドメインにおいて絡み合っているからである。特有の配列を認識しかつ向上したヌクレアーゼ活性を有する新規のメガヌクレアーゼバリアントを作製するために変異誘発およびハイスループットスクリーニングの特別の方法が使用されている。
ＺＦＮは、ＦｏｋＩ制限エンドヌクレアーゼの切断ドメインに融合した操作されたジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインからなる合成タンパク質である。ＺＦＮは、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインの改変のために二本鎖ＤＮＡの任意の長さと言ってよい長さのストレッチを切断するように設計され得る。ＺＦＮは、標的ＤＮＡ配列に結合するように操作されたジンクフィンガーアレイに融合したＦｏｋＩエンドヌクレアーゼの非特異的なＤＮＡ切断ドメインから構成される単量体から二量体を形成する。
ＺＦＮのＤＮＡ結合ドメインは、典型的には、３～４個のジンクフィンガーアレイから構成される。標的ＤＮＡへの部位特異的な結合に寄与するジンクフィンガ∞－ヘリックスの開始に対して－１、＋２、＋３、および＋６の位置のアミノ酸を変更およびカスタマイズして、特定の標的配列に適合させることができる。他のアミノ酸はコンセンサス骨格を形成して、異なる配列特異性を有するＺＦＮを生成する。ＺＦＮ用の標的配列を選択するための規則は当技術分野において公知である。
ＦｏｋＩヌクレアーゼドメインは、ＤＮＡを切断するために二量体化を必要とし、したがって、Ｃ末端領域を有する２つのＺＦＮは、切断部位の対向するＤＮＡ鎖（５～７ｂｐだけ分離されている）に結合することが必要とされる。２－ＺＦ－結合部位がパリンドロームの場合、ＺＦＮ単量体は標的部位を切断することができる。ＺＦＮという用語は、本明細書において使用される場合、広義のものであり、別のＺＦＮからの補助なしで二本鎖ＤＮＡを切断できる単量体ＺＦＮを含む。ＺＦＮという用語はまた、同じ部位においてＤＮＡを切断するために一緒に働くように操作された一対のＺＦＮの１つまたは両方のメンバーを指すために使用される。
いかなる科学理論によっても限定されないが、ジンクフィンガードメインのＤＮＡ結合特異性は様々な方法の１つを使用して原理的に再操作され得るので、カスタマイズされたＺＦＮは理論的に、ほぼすべての遺伝子配列を標的とするように構築され得る。ジンクフィンガードメインを操作するための公開されている方法としては、Ｃｏｎｔｅｘｔ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ａｓｓｅｍｂｌｙ（ＣｏＤＡ）、Ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｚｅｄ Ｐｏｏｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（ＯＰＥＮ）、およびＭｏｄｕｌａｒ Ａｓｓｅｍｂｌｙが挙げられる。
ＴＡＬＥＮは、転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）ＤＮＡ結合ドメインをＦｏｋＩヌクレアーゼドメインに融合させることにより生成される人工的な制限酵素である。ＴＡＬＥＮペアの各メンバーが標的部位に隣接するＤＮＡ部位に結合する場合、ＦｏｋＩ単量体は二量体化して標的部位において二本鎖ＤＮＡ切断を引き起こす。ＴＡＬＥＮという用語は、本明細書において使用される場合、広義のものであり、別のＴＡＬＥＮの補助なしで二本鎖ＤＮＡを切断できる単量体ＴＡＬＥＮを含む。ＴＡＬＥＮという用語はまた、同じ部位においてＤＮＡを切断するために一緒に働く一対のＴＡＬＥＮの１つまたは両方のメンバーを指すために使用される。
転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）は、実際的に任意のＤＮＡ配列に結合するように操作され得る。ＴＡＬＥタンパク質は、キサントモナス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）属の様々な植物細菌性病原体に由来するＤＮＡ結合ドメインである。キサントモナス病原体は、感染の間に宿主植物細胞中にＴＡＬＥを分泌する。ＴＡＬＥは核に移動し、そこで宿主ゲノム中の特定の遺伝子のプロモーター領域中の特定のＤＮＡ配列のプロモーター領域中の特定のＤＮＡ配列を認識してそれに結合する。ＴＡＬＥは、３３～３４アミノ酸の１３～２８個のリピートモノマーから構成される中心のＤＮＡ結合ドメインを有する。各単量体のアミノ酸は、位置１２および１３における超可変アミノ酸残基を除いて高度に保存されている。２つの可変アミノ酸は反復可変二残基（ＲＶＤ）と呼ばれる。ＲＶＤのアミノ酸ペアＮＩ、ＮＧ、ＨＤ、およびＮＮはそれぞれ、アデニン、チミン、シトシン、およびグアニン／アデニンを優先的に認識し、ＲＶＤのモジュレーションは、連続するＤＮＡ塩基を認識することができる。アミノ酸配列とＤＮＡ認識とのこの単純な関係性は、適切なＲＶＤを含有するリピートセグメントの組み合わせを選択することによる特定のＤＮＡ結合ドメインの操作を可能とした。
野生型ＦｏｋＩ切断ドメインの他に、変異を有するＦｏｋＩ切断ドメインのバリアントが、切断特異性および切断活性を向上させるために設計されている。ＦｏｋＩドメインは二量体として機能し、適切な配向および空間的配置を有する標的ゲノム中の部位のための特有のＤＮＡ結合ドメインを有する２つの構築物を必要とする。ＴＡＬＥＮ ＤＮＡ結合ドメインとＦｏｋＩ切断ドメインとの間のアミノ酸残基の数および２つの個々のＴＡＬＥＮ結合部位の間の塩基数の両方は、高レベルの活性を達成するためのパラメータである。
ＴＡＬＥ結合ドメインのアミノ酸配列とＤＮＡ認識との関係性は、設計可能なタンパク質を可能とする。ＤＮＡ Ｗｏｒｋｓなどのソフトウェアプログラムを使用してＴＡＬＥ構築物を設計することができる。ＴＡＬＥ構築物を設計する他の方法は当業者に公知である。Ｄｏｙｌｅ ｅｔ ａｌ，、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２０１２）４０：Ｗ１１７－１２２．；Ｃｅｒｍａｋ ｅｔ ａｌ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２０１１）．３９：ｅ８２；およびｔａｌｅ－ｎｔ．ｃａｃ．ｃｏｒｎｅｌｌ．ｅｄｕ／ａｂｏｕｔを参照。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システム、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｓｍ１、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１システム、またはプライム編集システム（Anzalone et al.を参照されたい）は、ＦｏｋＩベースの方法のＺＦＮおよびＴＡＬＥＮの代替である。ＣＲＩＳＰＲシステムは、標的部位におけるＤＮＡ配列を認識するために相補的塩基対形成を使用するＲＮＡガイド操作型ヌクレアーゼに基づく。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｓｍ１、およびＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１システムは、細菌および古細菌の適応免疫系の部分であり、配列依存的な方式で外来ＤＮＡを切断することによりウイルスなどの侵入性核酸からそれらを保護する。免疫は、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の近位末端における２つの隣接リピートの間のスペーサーとして公知の侵入性ＤＮＡの短い断片の組込みにより獲得される。スペーサーを含むＣＲＩＳＰＲアレイは、侵入性ＤＮＡとのその後の遭遇の間に転写され、約４０ｎｔの長さの低分子干渉ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）にプロセシングされ、ｃｒＲＮＡはトランス活性化ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）と合わさってＣａｓ９ヌクレアーゼを活性化およびガイドする。これは侵入性ＤＮＡ中のプロトスペーサーとして公知の相同的二本鎖ＤＮＡ配列を切断する。切断のための必要条件は、標的ＤＮＡの下流の保存されたプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の存在であり、これは通常、配列５－ＮＧＧ－３、より低い頻度でＮＡＧを有する。特異性は、ＰＡＭの約１２塩基上流のいわゆる「シード配列」により提供され、これはＲＮＡと標的ＤＮＡとの間でマッチしなければならない。Ｃｐｆ１およびＣｓｍ１はＣａｓ９と類似の方式で作用するが、Ｃｐｆ１およびＣｓｍ１はｔｒａｃｒＲＮＡを必要とする。
Ａｎｚａｌｏｎｅ ｅｔ ａｌ．によって記載されているプライム編集システムは、ＲＮＡでプログラム可能なニッカーゼに融合した逆転写酵素をプライム編集伸長ガイドＲＮＡ（ｐｒｉｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｅｘｔｅｎｄｅｄ ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ）（ｐｅｇＲＮＡ）と共に使用して、ｐｅｇＲＮＡから、標的となるゲノム遺伝子座に遺伝子情報を直接的にコピーする。
トランスジーン
本開示はまた、植物、特に、様々な商用品種のタバコ植物を含むニコチアナ属の植物において、１つまたは複数のＡＤＣ、ＡＯ、またはＯＤＣ遺伝子の発現または機能を活性化するかまたは阻害するための組成物および方法も提供する。
本開示はまた、植物、特に、様々な商用品種のタバコ植物を含むニコチアナ属の植物において、１つまたは複数のＡＤＣ、ＡＯ、またはＯＤＣ遺伝子の発現または機能を活性化するかまたは阻害するための組成物および方法も提供する。
本明細書において使用される場合、「阻害する」、「阻害」、および「阻害すること」という用語は、関心対象の遺伝子産物（例えば、標的遺伝子産物）の発現または機能を減少させる、当技術分野において公知のまたは本明細書に記載される任意の方法として定義される。「阻害」は、２つの植物の間の、例えば、遺伝学的に変化した植物対野生型植物の比較の文脈におけるものであり得る。代替的に、標的遺伝子産物の発現または機能の阻害は、同じ植物内のまたは異なる植物間の植物細胞、細胞小器官、器官、組織、または植物部分の間での比較の文脈におけるものであり得、同じ植物内もしくは植物部分内のまたは植物間もしくは植物部分間の発達ステージまたは時間的ステージの間での比較を含む。「阻害」は、関心対象の遺伝子産物の機能または産生の完全な除去までのおよびその完全な除去を含む、その遺伝子産物の機能または産生の任意の相対的な減少を含む。「阻害」という用語は、標的遺伝子産物の翻訳および／もしくは転写または標的遺伝子産物の機能的活性を下方制御する、任意の方法または組成物を包含する。一局面では、改変植物における１つまたは複数の遺伝子のｍＲＮＡまたはタンパク質レベルは、変異体ではない植物またはその遺伝子の発現を阻害するように遺伝子改変されていない植物における、同じ遺伝子のｍＲＮＡまたはタンパク質レベルの９５％未満、９０％未満、８０％未満、７０％未満、６０％未満、５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、１０％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、または１％未満である。
「ポリヌクレオチド」という用語の使用は、ＤＮＡを含むポリヌクレオチドに本開示を限定するようには意図されない。当業者は、ポリヌクレオチドが、リボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドとデオキシリボヌクレオチドとの組み合わせを含み得ることを認識している。そのようなデオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドは、天然に存在する分子および合成アナログを両方とも含む。本開示のポリヌクレオチドはまた、一本鎖形態、二本鎖形態、ヘアピン、ステム－アンド－ループ構造などを含むがそれに限定されない、全ての形態の配列も包含する。
一局面では、本開示は、タバコ細胞において機能性であり、かつＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７～５４およびその断片からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＲＮＡに結合することができるＲＮＡ分子をコードするポリヌクレオチドに機能的に連結された、プロモーターを含む組換えＤＮＡ構築物を提供し、かつ該ＲＮＡ分子は、ポリペプチドの発現を抑制する。一局面では、ＲＮＡ分子は、マイクロＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、およびトランス作動性ｓｉＲＮＡからなる群から選択される。別の局面では、組換えＤＮＡ構築物は、二本鎖ＲＮＡをコードする。これらの組換えＤＮＡ構築物を含むトランスジェニックタバコ植物もしくはその部分、乾燥タバコ材料、またはタバコ製品もまた提供される。一局面では、これらのトランスジェニック植物、乾燥タバコ材料、またはタバコ製品は、組換えＤＮＡ構築物を有しない対照タバコ植物と比較して、より低いレベルのニコチンを含む。タバコ植物のニコチンレベルを低減する方法がさらに提供され、該方法は、タバコ植物をこれらの組換えＤＮＡ構築物のいずれかで形質転換する工程を含む。
本明細書において使用される場合、「機能的に連結された」とは、２つまたはそれ以上のエレメントの間の機能性連結を指す。例えば、関心対象のポリヌクレオチドと調節配列（例えば、プロモーター）との間の機能的な連結は、関心対象のポリヌクレオチドの発現を可能にする機能性連結である。機能的に連結されたエレメントは、連続であってもよく、または非連続であってもよい。
本明細書において使用される場合、かつ配列に関して使用される場合、「異種」とは、外来種を起源とするか、または、同じ種由来の場合には、計画的なヒトの介入により組成および／もしくはゲノム位置においてその天然の形態から実質的に改変されている配列を指す。この用語はまた、本明細書において「ポリヌクレオチド構築物」または「ヌクレオチド構築物」とも称される核酸構築物にも適用可能である。このようにして、「異種」核酸構築物は、外来種を起源とするか、または、同じ種由来の場合には、計画的なヒトの介入により組成および／もしくはゲノム位置においてその天然の形態から実質的に改変されている構築物を意味するように意図される。異種核酸構築物には、例えば、形質転換法、またはトランスジェニック植物と関心対象の別の植物とのその後の育種を介して、植物またはその植物部分に導入された組換えヌクレオチド構築物が含まれるが、それに限定されない。一局面では、使用されるプロモーターは、プロモーターにより駆動される配列にとって異種である。別の局面では、使用されるプロモーターは、タバコにとって異種である。さらなる局面では、使用されるプロモーターは、タバコにとって天然である。
一局面では、記載される改変タバコ植物は、シスジェニック植物である。本明細書において使用される場合、「シスジェネシス」または「シスジェニック」とは、全ての成分（例えば、プロモーター、ドナー核酸、選択遺伝子）が植物のみを起源とする（すなわち、非植物起源の成分は使用されない）植物、植物細胞、または植物ゲノムの遺伝子改変を指す。一局面では、提供される改変植物、植物細胞、または植物ゲノムは、シスジェニックである。提供されるシスジェニック植物、植物細胞、および植物ゲノムは、使用準備済みのタバコ株に繋がり得る。別の局面では、提供される改変タバコ植物は、いかなる非タバコの遺伝物質または配列も含まない。
本明細書において使用される場合、「遺伝子発現」とは、遺伝子産物の転写および／または翻訳を含む、遺伝子産物の生合成または産生を指す。
一局面では、組換えＤＮＡ構築物または発現カセットはまた、トランスジェニック細胞の選択のための選択可能マーカー遺伝子も含むことができる。選択可能マーカー遺伝子としては、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ（ＮＥＯ）およびハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＨＰＴ）をコードする遺伝子などの抗生物質抵抗性をコードする遺伝子、ならびに、グルホシネートアンモニウム、ブロモキシニル、イミダゾリノン、および２，４－ジクロロフェノキシアセタート（２，４－Ｄ）などの除草性化合物に対して抵抗性を付与する遺伝子が挙げられるが、それに限定されない。追加の選択可能マーカーとしては、β－ガラクトシダーゼなどの表現型マーカー、および緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）などの蛍光タンパク質が挙げられる。
一局面では、提供されるタバコ植物は、ニコチン生合成または輸送に関与する遺伝子の活性の発現の増加または低減をさらに含む。ニコチン生合成に関与する遺伝子としては、アルギニンデカルボキシラーゼ（ＡＤＣ）、メチルプトレシンオキシダーゼ（ＭＰＯ）、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ、オルニチンデカルボキシラーゼ（ＯＤＣ）、ホスホリボシルアントラニル酸イソメラーゼ（ＰＲＡＩ）、プトレシンＮ－メチルトランスフェラーゼ（ＰＭＴ）、キノリン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＱＰＴ）、およびＳ－アデノシル－メチオニンシンテターゼ（ＳＡＭＳ）が挙げられるが、それに限定されない。ニコチン酸誘導体とメチルピロリニウム陽イオンとの縮合段階を触媒するニコチンシンターゼは、解明されていないが、２つの候補遺伝子（Ａ６２２およびＮＢＢ１）が提唱されている。ＵＳ２００７／０２４０７２８Ａ１およびＵＳ２００８／０１２０７３７Ａ１を参照されたい。Ａ６２２は、イソフラボン還元酵素様タンパク質をコードする。加えて、いくつかの輸送体が、ニコチンの移行に関与し得る。ＭＡＴＥと命名された輸送体遺伝子が、クローニングおよび特徴決定されている（Ｍｏｒｉｔａ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ １０６：２４４７－５２（２００９））。
一局面では、提供されるタバコ植物は、対照タバコ植物と比較して、ＰＭＴ、ＭＰＯ、ＱＰＴ、ＡＤＣ、ＯＤＣ、ＰＲＡＩ、ＳＡＭＳ、ＢＢＬ、ＭＡＴＥ、Ａ６２２、およびＮＢＢ１からなる群から選択される産物をコードする１つまたは複数の遺伝子の増加したレベルまたは低減したレベルのｍＲＮＡ、タンパク質、またはその両方をさらに含む。別の局面では、提供されるタバコ植物は、ＰＭＴ、ＭＰＯ、ＱＰＴ、ＡＤＣ、ＯＤＣ、ＰＲＡＩ、ＳＡＭＳ、ＢＢＬ、ＭＡＴＥ、Ａ６２２、およびＮＢＢ１からなる群から選択される産物をコードする１つまたは複数の遺伝子の発現を直接的に抑制するトランスジーンをさらに含む。別の局面では、提供されるタバコ植物は、ＰＭＴ、ＭＰＯ、ＱＰＴ、ＡＤＣ、ＯＤＣ、ＰＲＡＩ、ＳＡＭＳ、ＢＢＬ、ＭＡＴＥ、Ａ６２２、およびＮＢＢ１からなる群から選択される産物をコードする１つまたは複数の遺伝子の発現または活性を抑制するトランスジーンまたは変異をさらに含む。別の局面では、提供されるタバコ植物は、ＰＭＴ、ＭＰＯ、ＱＰＴ、ＡＤＣ、ＯＤＣ、ＰＲＡＩ、ＳＡＭＳ、ＢＢＬ、ＭＡＴＥ、Ａ６２２、およびＮＢＢ１からなる群から選択される産物をコードする１つまたは複数の遺伝子を過剰発現するトランスジーンをさらに含む。
当技術分野において公知の任意の好適な形質転換法を使用する、記載される組換え構築物または発現カセットでのタバコ植物の形質転換もまた開示される。ポリヌクレオチド配列をタバコ植物に導入するための方法は、当技術分野において公知であり、安定な形質転換法、一過性の形質転換法、およびウイルス媒介性の方法が挙げられるが、それに限定されない。「安定な形質転換」とは、植物に導入された関心対象のヌクレオチド構築物が、植物のゲノム中に組み込まれ、その子孫に遺伝することができる形質転換を指す。「一過性の形質転換」とは、配列が、植物に導入され、一時的に発現されるだけであるか、または一過性に植物中に存在するだけであることを意味するように意図される。
ポリヌクレオチドを本開示の植物細胞に導入する好適な方法としては、マイクロインジェクション（Ｃｒｏｓｓｗａｙ ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ４：３２０－３３４）、エレクトロポレーション（Ｓｈｉｌｌｉｔｏ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５３：３１３－３３６；Ｒｉｇｇｓ ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８３：５６０２－５６０６）、アグロバクテリウム媒介性形質転換（米国特許第５，１０４，３１０号、同第５，１４９，６４５号、同第５，１７７，０１０号、同第５，２３１，０１９号、同第５，４６３，１７４号、同第５，４６４，７６３号、同第５，４６９，９７６号、同第４，７６２，７８５号、同第５，００４，８６３号、同第５，１５９，１３５号、同第５，５６３，０５５号、および同第５，９８１，８４０号）、直接的な遺伝子移入（Ｐａｓｚｋｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．（１９８４）ＥＭＢＯ Ｊ．３：２７１７－２７２２）、および衝撃粒子加速（ｂａｌｌｉｓｔｉｃ ｐａｒｔｉｃｌｅ ａｃｃｅｌｅｒａｔｉｏｎ）（例えば、米国特許第４，９４５，０５０号、同第５，１４１，１３１号、同第５，８８６，２４４号、同第５，８７９，９１８号、および同第５，９３２，７８２号；Ｔｏｍｅｓ ｅｔ ａｌ．（１９９５），Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ，Ｔｉｓｓｕｅ，ａｎｄ Ｏｒｇａｎ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，ｅｄ．Ｇａｍｂｏｒｇ ａｎｄ Ｐｈｉｌｌｉｐｓ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ）；ＭｃＣａｂｅ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：９２３－９２６を参照されたい）が挙げられる。Ｗｅｉｓｓｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．２２：４２１－４７７；Ｃｈｒｉｓｔｏｕ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．８７：６７１－６７４（ダイズ）；ＭｃＣａｂｅ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：９２３－９２６（ダイズ）；Ｆｉｎｅｒ ａｎｄ ＭｃＭｕｌｌｅｎ（１９９１）Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．２７Ｐ：１７５－１８２（ダイズ）；Ｓｉｎｇｈ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．９６：３１９－３２４（ダイズ）；Ｄｅ Ｗｅｔ ｅｔ ａｌ．（１９８５），Ｔｈｅ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｏｖｕｌｅ Ｔｉｓｓｕｅｓ，ｅｄ．Ｃｈａｐｍａｎ ｅｔ ａｌ．（Ｌｏｎｇｍａｎ，Ｎ．Ｙ．），ｐｐ．１９７－２０９（花粉）；Ｋａｅｐｐｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ ９：４１５－４１８およびＫａｅｐｐｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．８４：５６０－５６６（ウィスカー媒介性形質転換）；Ｄ’Ｈａｌｌｕｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ４：１４９５－１５０５（エレクトロポレーション）もまた参照されたい。
別の局面では、組換え構築物または発現カセットは、植物をウイルスまたはウイルス核酸と接触させることによって、植物に導入されてもよい。概して、そのような方法は、本開示の発現カセットをウイルスＤＮＡまたはＲＮＡ分子内に組み込む工程を含む。発現カセットにおける使用のためのプロモーターはまた、ウイルスＲＮＡポリメラーゼによる転写のために利用されるプロモーターを包含することが認識されている。ウイルスＤＮＡまたはＲＮＡ分子を含む、ポリヌクレオチドを植物に導入し、それにコードされるタンパク質を発現させるための方法は、当技術分野において公知である。例えば、米国特許第５，８８９，１９１号、同第５，８８９，１９０号、同第５，８６６，７８５号、同第５，５８９，３６７号、同第５，３１６，９３１号、およびＰｏｒｔａ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ５：２０９－２２１を参照されたい。
器官発生によろうと胚発生によろうと、クローン法を使用してその後に繁殖させることができる任意の植物組織は、組換え構築物または発現カセットで形質転換されてもよい。「器官発生」により、シュートおよび根が***組織の中心から逐次的に発達するプロセスが意図される。「胚発生」により、シュートおよび根が、体細胞からであろうと配偶子からであろうと、協調した様式で（逐次的ではなく）一緒に発達するプロセスが意図される。記載される様々な形質転換プロトコールに好適である例示的な組織としては、カルス組織、既存の***性組織（例えば、頂端***組織、腋芽、および根端***組織）ならびに誘導性***組織（例えば、子葉***組織および胚軸***組織）、胚軸、子葉、葉盤、花粉、ならびに胚などが挙げられるが、それに限定されない。
プロモーター
一局面では、本開示は、１つまたは複数のＡＤＣ、ＡＯ、またはＯＤＣ遺伝子を標的とするトランスジーン（例えば、「ＡＤＣトランスジェニック植物」、「ＡＯトランスジェニック植物」、または「ＯＤＣトランスジェニック植物」中のような）を含む、タバコ植物またはその部分を提供する。様々なタイプのプロモーターを、本明細書に記載されるＡＤＣ、ＡＯ、またはＯＤＣのトランスジーンまたは組換え核酸において使用することができ、これらは、プロモーター、例えば、構成的プロモーター、発達プロモーター、組織特異的プロモーター、組織選好性プロモーター、誘導性プロモーターなどに機能的に連結されたコーディング配列または遺伝子（トランスジーンを含む）の発現のパターンに関連する、様々な判断基準に従って分類される。植物の全てのまたはほとんどの組織において転写を開始するプロモーターは、「構成的」プロモーターと称される。発達のある特定の期間またはステージ中に転写を開始するプロモーターは、「発達」プロモーターと称される。その発現が、植物のある特定の組織において他の植物組織と比べて増強されるプロモーターは、「組織増強」または「組織選好性」プロモーターと称される。したがって、「組織選好性」プロモーターは、植物の特異的な組織において相対的により高いかまたは優先的な発現を引き起こすが、植物の他の組織においてはより低いレベルの発現を有する。植物の特異的な組織内で発現し、他の植物組織においては発現がわずかであるかまたは発現がないプロモーターは、「組織特異的」プロモーターと称される。植物のある特定の細胞タイプにおいて発現するプロモーターは、「細胞タイプ特異的」プロモーターと称される。「誘導性」プロモーターとは、寒さ、乾燥、熱、もしくは光などの環境刺激、または傷もしくは化学物質の適用などの他の刺激に応答して、転写を開始するプロモーターである。異種である、同種である、キメラである、合成であるなどのように、その起源の点で分類されるプロモーターもまた、本明細書で使用される。「異種」プロモーターとは、その会合している転写可能な配列、コーディング配列、もしくは遺伝子（もしくはトランスジーン）と比べて異なる起源を有する、かつ／または形質転換される植物種に天然に存在しない、プロモーター配列である。「異種」という用語は、より広範には、２つまたはそれ以上のＤＮＡ分子または配列の組み合わせが天然では通常見出されない場合の、そのような組み合わせを含む。例えば、２つまたはそれ以上のＤＮＡ分子または配列は、それらが、異なるゲノムにもしくは同じゲノム中の異なる遺伝子座に通常見出される場合には、または天然で同一のように組み合わされていない場合には、互いに異種であろう。
一局面では、本開示は、１つまたは複数のＡＤＣ、ＡＯ、またはＯＤＣ遺伝子を標的とするトランスジーン（例えば、「ＡＤＣトランスジェニック植物」、「ＡＯトランスジェニック植物」、または「ＯＤＣトランスジェニック植物」中のような）を含む、タバコ植物またはその部分を提供する。様々なタイプのプロモーターを、本明細書に記載されるＡＤＣ、ＡＯ、またはＯＤＣのトランスジーンまたは組換え核酸において使用することができ、これらは、プロモーター、例えば、構成的プロモーター、発達プロモーター、組織特異的プロモーター、組織選好性プロモーター、誘導性プロモーターなどに機能的に連結されたコーディング配列または遺伝子（トランスジーンを含む）の発現のパターンに関連する、様々な判断基準に従って分類される。植物の全てのまたはほとんどの組織において転写を開始するプロモーターは、「構成的」プロモーターと称される。発達のある特定の期間またはステージ中に転写を開始するプロモーターは、「発達」プロモーターと称される。その発現が、植物のある特定の組織において他の植物組織と比べて増強されるプロモーターは、「組織増強」または「組織選好性」プロモーターと称される。したがって、「組織選好性」プロモーターは、植物の特異的な組織において相対的により高いかまたは優先的な発現を引き起こすが、植物の他の組織においてはより低いレベルの発現を有する。植物の特異的な組織内で発現し、他の植物組織においては発現がわずかであるかまたは発現がないプロモーターは、「組織特異的」プロモーターと称される。植物のある特定の細胞タイプにおいて発現するプロモーターは、「細胞タイプ特異的」プロモーターと称される。「誘導性」プロモーターとは、寒さ、乾燥、熱、もしくは光などの環境刺激、または傷もしくは化学物質の適用などの他の刺激に応答して、転写を開始するプロモーターである。異種である、同種である、キメラである、合成であるなどのように、その起源の点で分類されるプロモーターもまた、本明細書で使用される。「異種」プロモーターとは、その会合している転写可能な配列、コーディング配列、もしくは遺伝子（もしくはトランスジーン）と比べて異なる起源を有する、かつ／または形質転換される植物種に天然に存在しない、プロモーター配列である。「異種」という用語は、より広範には、２つまたはそれ以上のＤＮＡ分子または配列の組み合わせが天然では通常見出されない場合の、そのような組み合わせを含む。例えば、２つまたはそれ以上のＤＮＡ分子または配列は、それらが、異なるゲノムにもしくは同じゲノム中の異なる遺伝子座に通常見出される場合には、または天然で同一のように組み合わされていない場合には、互いに異種であろう。
一局面では、本明細書に記載される組換えＤＮＡ構築物または発現カセット（またはそのような構築物もしくはカセットを含有する植物）は、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、および組織選好性プロモーター（例えば、葉特異的または根特異的プロモーター）からなる群から選択されるプロモーターを含む。例示的な構成的プロモーターとしては、Ｒｓｙｎ７プロモーターのコアプロモーターおよび米国特許第６，０７２，０５０号に開示されている他の構成的プロモーター；コアＣａＭＶ ３５Ｓプロモーター（Ｏｄｅｌｌ ｅｔ ａｌ．（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ ３１３：８１０－８１２）；ユビキチン（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１２：６１９－６３２およびＣｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８：６７５－６８９）；ｐＥＭＵ（Ｌａｓｔ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．８１：５８１－５８８）；ＭＡＳ（Ｖｅｌｔｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９８４）ＥＭＢＯ Ｊ ３：２７２３－２７３０）；ＡＬＳプロモーター（米国特許第５，６５９，０２６号）などが挙げられる。例示的な化学物質誘導性プロモーターとしては、サリチル酸によって活性化されるタバコＰＲ－１ａプロモーターが挙げられる。他の関心対象の化学物質誘導性プロモーターとしては、ステロイド応答性プロモーター（例えば、Ｓｃｈｅｎａ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：１０４２１－１０４２５およびＭｃＮｅｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｐｌａｎｔ Ｊ．１４（２）：２４７－２５７におけるグルココルチコイド誘導性プロモーターを参照されたい）およびテトラサイクリン誘導性プロモーター（例えば、Ｇａｔｚ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２２７：２２９－２３７、ならびに米国特許第５，８１４，６１８号および同第５，７８９，１５６号を参照されたい）が挙げられる。使用され得る追加の例示的なプロモーターは、熱調節性遺伝子発現、光調節性遺伝子発現（例えば、エンドウマメｒｂｃＳ－３Ａ；トウモロコシｒｂｃＳプロモーター；エンドウマメにおいて見出されるクロロフィルａｌｂ結合タンパク質遺伝子；もしくはＡｒａｂｓｓｕプロモーター）、ホルモン調節性遺伝子発現（例えば、コムギのＥｍ遺伝子由来のアブシジン酸（ＡＢＡ）応答性配列；オオムギおよびシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）のＡＢＡ誘導性のＨＶＡ１およびＨＶＡ２２、およびｒｄ２９Ａプロモーター）；ならびに創傷誘導性遺伝子発現（例えば、ｗｕｎｌのもの）、器官特異的遺伝子発現（例えば、塊茎特異的貯蔵タンパク質遺伝子；により記載されるトウモロコシ由来の２３ｋＤａゼイン遺伝子；もしくはインゲンマメ（β－ファセオリン遺伝子）を担うプロモーター、または病原体誘導性プロモーター（例えば、ＰＲ－１、ｐｒｐ－１、もしくは（β－１，３グルカナーゼプロモーター、コムギの真菌誘導性ｗｉｒｌａプロモーター、ならびに線虫誘導性プロモーター、それぞれタバコ乾燥パセリのＴｏｂＲＢ７－５ＡおよびＨｍｇ－１）である。
一局面では、誘導性プロモーターを含むＡＤＣ、ＡＯ、またはＯＤＣトランスジーン。一局面では、誘導性プロモーターは、摘心誘導性プロモーターである。一局面では、誘導性プロモーターはまた、組織特異的プロモーターまたは組織選好性プロモーターである。一局面では、組織特異的プロモーターまたは組織選好性プロモーターは、シュート、根、葉、茎、花、吸器、根端、葉肉細胞、表皮細胞、および脈管構造からなる群から選択される１つまたは複数の組織または器官に特異的であるか、または好ましい。さらなる局面では、摘心誘導性プロモーターは、タバコニコチンデメチラーゼ遺伝子、例えば、ＣＹＰ８２Ｅ４、ＣＹＰ８２Ｅ５、またはＣＹＰ８２Ｅ１０に由来するプロモーター配列を含む。一局面では、誘導性プロモーターは、根特異的発現または根選好性発現を提供する。例示的な根特異的または根選好性の誘導性プロモーターは、米国特許出願公開第２０１９／０２７１０００号において見出され得る。一局面では、誘導性プロモーターは、葉特異的発現または葉選好性発現を提供する。例示的な葉特異的または葉選好性の誘導性プロモーターは、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１９／０２７１００号において見出され得る。
一局面では、誘導性プロモーターは、機能的に連結された転写可能なＤＮＡ配列にとって異種である。一局面では、転写可能なＤＮＡ配列は、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、アンチセンスＲＮＡ、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、トランス作動性ｓｉＲＮＡ（ｔａ－ｓｉＲＮＡ）、およびヘアピンＲＮＡ（ｈｐＲＮＡ）からなる群から選択される非コーディングＲＮＡをコードする。一局面では、非コーディングＲＮＡは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～３６、５５～６４、およびその任意の部分からなる群から選択される配列に対して１００％、少なくとも９９．９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９％、少なくとも９８％、少なくとも９７％、少なくとも９６％、少なくとも９５％、少なくとも９４％、少なくとも９３％、少なくとも９２％、少なくとも９１％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、または少なくとも７５％の同一性または相補性を有するヌクレオチド配列を含む。
一局面では、非コーディングＲＮＡは、少なくとも１８個、少なくとも１９個、少なくとも２０個、少なくとも２１個、少なくとも２２個、少なくとも２３個、少なくとも２４個、少なくとも２５個、少なくとも２６個、少なくとも２７個、少なくとも２８個、少なくとも２９個、少なくとも３０個、少なくとも３１個、少なくとも３２個、少なくとも３３個、少なくとも３４個、または少なくとも３５個のヌクレオチドを含む。一局面では、非コーディングＲＮＡ配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～３６および５５～６４からなる群から選択される配列の少なくとも１８個、少なくとも１９個、少なくとも２０個、少なくとも２１個、少なくとも２２個、少なくとも２３個、少なくとも２４個、少なくとも２５個、少なくとも２６個、少なくとも２７個、少なくとも２８個、少なくとも２９個、少なくとも３０個、少なくとも３１個、少なくとも３２個、少なくとも３３個、少なくとも３４個、または少なくとも３５個の連続するヌクレオチドに対して少なくとも８０％の相補性を含む。一局面では、非コーディングＲＮＡ配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～３６および５５～６４からなる群から選択される配列の少なくとも１８個、少なくとも１９個、少なくとも２０個、少なくとも２１個、少なくとも２２個、少なくとも２３個、少なくとも２４個、少なくとも２５個、少なくとも２６個、少なくとも２７個、少なくとも２８個、少なくとも２９個、少なくとも３０個、少なくとも３１個、少なくとも３２個、少なくとも３３個、少なくとも３４個、または少なくとも３５個の連続するヌクレオチドに対して少なくとも９０％の相補性を含む。一局面では、非コーディングＲＮＡ配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～３６および５５～６４からなる群から選択される配列の少なくとも１８個、少なくとも１９個、少なくとも２０個、少なくとも２１個、少なくとも２２個、少なくとも２３個、少なくとも２４個、少なくとも２５個、少なくとも２６個、少なくとも２７個、少なくとも２８個、少なくとも２９個、少なくとも３０個、少なくとも３１個、少なくとも３２個、少なくとも３３個、少なくとも３４個、または少なくとも３５個の連続するヌクレオチドに対して少なくとも９５％の相補性を含む。一局面では、非コーディングＲＮＡ配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～３６および５５～６４からなる群から選択される配列の少なくとも１８個、少なくとも１９個、少なくとも２０個、少なくとも２１個、少なくとも２２個、少なくとも２３個、少なくとも２４個、少なくとも２５個、少なくとも２６個、少なくとも２７個、少なくとも２８個、少なくとも２９個、少なくとも３０個、少なくとも３１個、少なくとも３２個、少なくとも３３個、少なくとも３４個、または少なくとも３５個の連続するヌクレオチドに対して１００％の相補性を含む。
タバコタイプ
一局面では、提供されるタバコ植物は、熱風乾燥タバコ、空気乾燥タバコ、暗色空気乾燥タバコ、暗色火力乾燥タバコ、Ｇａｌｐａｏタバコ、およびＯｒｉｅｎｔａｌタバコからなる群から選択されるタバコ種からのものである。別の局面では、提供されるタバコ植物は、Ｂｕｒｌｅｙタバコ、Ｍａｒｙｌａｎｄタバコ、およびダークタバコからなる群から選択されるタバコ種からのものである。
一局面では、提供されるタバコ植物は、熱風乾燥タバコ、空気乾燥タバコ、暗色空気乾燥タバコ、暗色火力乾燥タバコ、Ｇａｌｐａｏタバコ、およびＯｒｉｅｎｔａｌタバコからなる群から選択されるタバコ種からのものである。別の局面では、提供されるタバコ植物は、Ｂｕｒｌｅｙタバコ、Ｍａｒｙｌａｎｄタバコ、およびダークタバコからなる群から選択されるタバコ種からのものである。
一局面において、提供されるタバコ植物は、熱風乾燥タバコの背景にあるか、または本明細書に記載する1つまたは複数の熱風乾燥タバコの特徴を示す。熱風乾燥タバコ（「Ｖｉｒｇｉｎｉａ」または「ブライト」タバコとも呼ばれる）は、世界のタバコ生産のおよそ４０％を占める。熱風乾燥タバコは、乾燥の間に達するゴールデンイエローからディープオレンジの色のため、多くの場合に「ブライトタバコ」とも称される。熱風乾燥タバコは、軽い、鮮烈な芳香および味を有する。熱風乾燥タバコは、概して、糖分が高くかつ油分が低い。主要な熱風乾燥タバコ生育国は、アルゼンチン、ブラジル、中国、インド、タンザニア、および米国である。一局面では、本明細書において提供されるタバコ植物もしくは種子または改変タバコ植物もしくは種子は、表１に列記される品種、および前述の品種のいずれか１つに本質的に由来する任意の品種からなる群から選択される、熱風乾燥タバコ品種のものである。ＷＯ ２００４／０４１００６ Ａ１を参照されたい。さらなる局面では、本明細書において提供される改変タバコ植物または種子は、Ｋ３２６、Ｋ３４６、およびＮＣ１９６からなる群から選択される熱風乾燥タバコ品種におけるものである。
（表１）熱風乾燥タバコ品種
一局面において、提供されるタバコ植物は、空気乾燥タバコの背景にあるか、または本明細書に記載する1つまたは複数の空気乾燥タバコの特徴を示す。空気乾燥タバコとしては、「Ｂｕｒｌｅｙ」、「Ｍａｒｙｌａｎｄ」、および「ダーク」タバコが挙げられる。空気乾燥タバコを結びつける共通の因子は、乾燥が主として、熱および湿度の人工的な供給源なしで行われることである。Ｂｕｒｌｅｙタバコは、ライトブラウンからダークブラウンの色であり、油分が高く、かつ糖分が低い。Ｂｕｒｌｅｙタバコは、典型的には、納屋の中で空気乾燥される。主要なＢｕｒｌｅｙ生育国としては、アルゼンチン、ブラジル、イタリア、マラウイ、および米国が挙げられる。
Ｍａｒｙｌａｎｄタバコは、極めてふっくらしており、良好な燃焼特性、低いニコチン、および中立的な芳香を有する。主要なＭａｒｙｌａｎｄ生育国としては、米国およびイタリアが挙げられる。
一局面では、本明細書において提供されるタバコ植物もしくは種子または改変タバコ植物もしくは種子は、表２に列記されるタバコ品種、および前述の品種のいずれか１つに本質的に由来する任意の品種からなる群から選択される、Ｂｕｒｌｅｙタバコ品種のものである。さらなる局面では、本明細書において提供される改変タバコ植物または種子は、ＴＮ ９０、ＫＴ ２０９、ＫＴ ２０６、ＫＴ２１２、およびＨＢ ４４８８からなる群から選択されるＢｕｒｌｅｙ品種におけるものである。
（表２）Ｂｕｒｌｅｙタバコ品種
別の局面では、本明細書において提供されるタバコ植物もしくは種子または改変タバコ植物もしくは種子は、表３に列記されるタバコ品種、および前述の品種のいずれか１つに本質的に由来する任意の品種からなる群から選択される、Ｍａｒｙｌａｎｄタバコ品種のものである。
（表３）Ｍａｒｙｌａｎｄタバコ品種
一局面において、提供されるタバコ植物は、暗色空気乾燥タバコの背景にあるか、または本明細書に記載する1つまたは複数の暗色空気乾燥タバコの特徴を示す。暗色空気乾燥タバコは、主として、暗色空気乾燥タバコにミディアムブラウンからダークブラウンの色および独特の芳香を与えるその乾燥プロセスにより、他のタバコタイプから区別される。暗色空気乾燥タバコは主に、噛みタバコおよび嗅ぎタバコの産生において使用される。一局面では、本明細書において提供される改変タバコ植物または種子は、Ｓｕｍａｔｒａ、Ｊａｔｉｍ、Ｄｏｍｉｎｉｃａｎ Ｃｕｂａｎｏ、Ｂｅｓｕｋｉ、Ｏｎｅ ｓｕｃｋｅｒ、Ｇｒｅｅｎ Ｒｉｖｅｒ、Ｖｉｒｇｉｎｉａ太陽乾燥種、およびＰａｒａｇｕａｎ Ｐａｓｓａｄｏ、ならびに前述の品種のいずれか１つに本質的に由来する任意の品種からなる群から選択される、暗色空気乾燥タバコ品種のものである。
一局面において、提供されるタバコ植物は、暗色火力乾燥タバコの背景にあるか、または本明細書に記載する1つまたは複数の暗色火力乾燥タバコの特徴を示す。暗色火力乾燥タバコは、概して、閉鎖乾燥納屋の床上で低燃木の火を用いて乾燥される。暗色火力乾燥タバコは、典型的には、パイプブレンド物、シガレット、噛みタバコ、嗅ぎタバコ、および強い味のシガーを作製するために使用される。暗色火力乾燥タバコの主要な生育地域は、米国におけるテネシー、ケンタッキー、およびバージニアである。一局面では、本明細書において提供されるタバコ植物もしくは種子または改変タバコ植物もしくは種子は、表４に列記されるタバコ品種、および前述の品種のいずれか１つに本質的に由来する任意の品種からなる群から選択される暗色火力乾燥タバコ品種のものである。
（表４）暗色火力乾燥タバコ品種
一局面において、提供されるタバコ植物は、Ｏｒｉｅｎｔａｌタバコの背景にあるか、または本明細書に記載する1つまたは複数のＯｒｉｅｎｔａｌタバコの特徴を示す。Ｏｒｉｅｎｔａｌタバコは、トルコ、ギリシャ、ブルガリア、マケドニア、シリア、レバノン、イタリア、およびルーマニアなどの東地中海地域において典型的に生育されるという事実に起因して、ギリシャ、アロマ、およびトルコタバコとも称される。Ｏｒｉｅｎｔａｌタバコ品種の小さい植物サイズ、小さい葉サイズ、および特有の芳香特性は、それらが発達してきた乏しい土壌およびストレスが多い気候の条件へのそれらの適合の結果である。一局面では、本明細書において提供されるタバコ植物もしくは種子または改変タバコ植物もしくは種子は、表５に列記されるタバコ品種、および前述の品種のいずれか１つに本質的に由来する任意の品種からなる群から選択されるＯｒｉｅｎｔａｌタバコ品種のものである。
（表５）Ｏｒｉｅｎｔａｌタバコ品種
一局面では、本明細書において提供されるタバコ植物もしくは種子または改変タバコ植物もしくは種子は、表６に列記されるタバコ品種、および前述の品種のいずれか１つに本質的に由来する任意の品種からなる群から選択されるシガータバコ品種のものである。
（表６）シガータバコ品種
一局面では、本明細書において提供されるタバコ植物もしくは種子または改変タバコ植物もしくは種子は、表７に列記されるタバコ品種、および前述の品種のいずれか１つに本質的に由来する任意の品種からなる群から選択されるタバコ品種のものである。
（表７）他のタバコ品種
一局面では、本明細書に記載される改変タバコ植物、種子、または細胞は、表１、表２、表３、表４、表５、表６、および表７に列記されるタバコ品種からなる群から選択される品種に由来する。
一局面では、低アルカロイドまたは低ニコチンのタバコ植物、種子、ハイブリッド、品種、または株は、以下に本質的に由来するか、または以下の遺伝的背景にある：ＢＵ ６４、ＣＣ １０１、ＣＣ ２００、ＣＣ ２７、ＣＣ ３０１、ＣＣ ４００、ＣＣ ５００、ＣＣ ６００、ＣＣ ７００、ＣＣ ８００、ＣＣ ９００、Ｃｏｋｅｒ １７６、Ｃｏｋｅｒ ３１９、Ｃｏｋｅｒ ３７１ Ｇｏｌｄ、Ｃｏｋｅｒ ４８、ＣＵ ２６３、ＤＦ９１１、Ｇａｌｐａｏタバコ、ＧＬ ２６Ｈ、ＧＬ ３５０、ＧＬ ６００、ＧＬ ７３７、ＧＬ ９３９、ＧＬ ９７３、ＨＢ ０４Ｐ、Ｋ １４９、Ｋ ３２６、Ｋ ３４６、Ｋ ３５８、Ｋ３９４、Ｋ ３９９、Ｋ ７３０、ＫＤＨ ９５９、ＫＴ ２００、ＫＴ２０４ＬＣ、ＫＹ １０、ＫＹ １４、ＫＹ １６０、ＫＹ １７、ＫＹ １７１、ＫＹ ９０７、ＫＹ９０７ＬＣ、ＫＴＹ１４×Ｌ８ ＬＣ、Ｌｉｔｔｌｅ Ｃｒｉｔｔｅｎｄｅｎ、ＭｃＮａｉｒ ３７３、ＭｃＮａｉｒ ９４４、ｍｓＫＹ １４ｘＬ８、Ｎａｒｒｏｗ Ｌｅａｆ Ｍａｄｏｌｅ、ＮＣ １００、ＮＣ １０２、ＮＣ ２０００、ＮＣ ２９１、ＮＣ ２９７、ＮＣ ２９９、ＮＣ ３、ＮＣ ４、ＮＣ ５、ＮＣ ６、ＮＣ７、ＮＣ ６０６、ＮＣ ７１、ＮＣ ７２、ＮＣ ８１０、ＮＣ ＢＨ １２９、ＮＣ ２００２、Ｎｅａｌ Ｓｍｉｔｈ Ｍａｄｏｌｅ、ＯＸＦＯＲＤ ２０７、「Ｐｅｒｉｑｕｅ」タバコ、ＰＶＨ０３、ＰＶＨ０９、ＰＶＨ１９、ＰＶＨ５０、ＰＶＨ５１、Ｒ ６１０、Ｒ ６３０、Ｒ ７－１１、Ｒ ７－１２、ＲＧ １７、ＲＧ ８１、ＲＧ Ｈ５１、ＲＧＨ ４、ＲＧＨ ５１、ＲＳ １４１０、Ｓｐｅｉｇｈｔ １６８、Ｓｐｅｉｇｈｔ １７２、Ｓｐｅｉｇｈｔ １７９、Ｓｐｅｉｇｈｔ ２１０、Ｓｐｅｉｇｈｔ ２２０、Ｓｐｅｉｇｈｔ ２２５、Ｓｐｅｉｇｈｔ ２２７、Ｓｐｅｉｇｈｔ ２３４、Ｓｐｅｉｇｈｔ Ｇ－２８、Ｓｐｅｉｇｈｔ Ｇ－７０、Ｓｐｅｉｇｈｔ Ｈ－６、Ｓｐｅｉｇｈｔ Ｈ２０、Ｓｐｅｉｇｈｔ ＮＦ３、ＴＩ １４０６、ＴＩ １２６９、ＴＮ ８６、ＴＮ８６ＬＣ、ＴＮ ９０、ＴＮ ９７、ＴＮ９７ＬＣ、ＴＮ Ｄ９４、ＴＮ Ｄ９５０、ＴＲ（Ｔｏｍ Ｒｏｓｓｏｎ） Ｍａｄｏｌｅ、ＶＡ ３０９、もしくはＶＡ３５９、Ｍａｒｙｌａｎｄ ６０９、ＨＢ３３０７ＰＬＣ、ＨＢ４４８８ＰＬＣ、ＫＴ２０６ＬＣ、ＫＴ２０９ＬＣ、ＫＴ２１０ＬＣ、ＫＴ２１２ＬＣ、Ｒ６１０ＬＣ、ＰＶＨ２３１０、ＮＣ１９６、ＫＴＤ１４ＬＣ、ＫＴＤ６ＬＣ、ＫＴＤ８ＬＣ、ＰＤ７３０２ＬＣ、ＰＤ７３０５ＬＣ、ＰＤ７３０９ＬＣ、ＰＤ７３１８ＬＣ、ＰＤ７３１９ＬＣ、ＰＤ７３１２ＬＣ、ＳｈｉｒｅｙＬＣ、または当技術分野において公知の標準的なタバコ育種技術による任意の商用タバコ品種。
暗色空気乾燥、Ｂｕｒｌｅｙ、Ｍａｒｙｌａｎｄ、暗色火力乾燥、またはＯｒｉｅｎｔａｌ種の全ての上記の特定の品種は、例示的な目的のためにのみ列記されている。任意の追加の暗色空気乾燥、Ｂｕｒｌｅｙ、Ｍａｒｙｌａｎｄ、暗色火力乾燥、またはＯｒｉｅｎｔａｌ品種もまた本出願において想定される。
記載されるタバコ植物の集団もまた提供される。一局面では、タバコ植物の集団は、１エーカー当たり約５，０００～約８，０００、約５，０００～約７，６００、約５，０００～約７，２００、約５，０００～約６，８００、約５，０００～約６，４００、約５，０００～約６，０００、約５，０００～約５，６００、約５，０００～約５，２００、約５，２００～約８，０００、約５，６００～約８，０００、約６，０００～約８，０００、約６，４００～約８，０００、約６，８００～約８，０００、約７，２００～約８，０００、または約７，６００～約８，０００個の植物の栽植密度を有する。別の局面では、タバコ植物の集団は、低い～中程度の肥沃度を有する土壌型において存在する。
記載されるタバコ植物からの種子の容器もまた提供される。本開示のタバコ種子の容器は、任意の数、重量、または体積の種子を含有してもよい。例えば、容器は、少なくとも約１００、少なくとも約２００、少なくとも約３００、少なくとも約４００、少なくとも約５００、少なくとも約６００、少なくとも約７００、少なくとも約８００、少なくとも約９００、少なくとも約１０００、少なくとも約１５００、少なくとも約２０００、少なくとも約２５００、少なくとも約３０００、少なくとも約３５００、少なくとも約４０００、もしくはそれ以上、または約１００より多い、約２００より多い、約３００より多い、約４００より多い、約５００より多い、約６００より多い、約７００より多い、約８００より多い、約９００より多い、約１０００より多い、約１５００より多い、約２０００より多い、約２５００より多い、約３０００より多い、約３５００より多い、約４０００個より多い、もしくはそれ以上の種子を含有し得る。代替的に、容器は、少なくとも約５０グラム、少なくとも約１００グラム、少なくとも約２００グラム、少なくとも約３００グラム、少なくとも約４００グラム、少なくとも約５００グラム、少なくとも約６００グラム、少なくとも約７００グラム、少なくとも約８００グラム、少なくとも約９００グラム、少なくとも約１０００グラム、少なくとも約１５００グラム、少なくとも約２０００グラム、少なくとも約２５００グラム、少なくとも約３０００グラム、少なくとも約３５００グラム、少なくとも約４０００グラム、もしくはそれ以上、または約５０グラム超、約１００グラム超、約２００グラム超、約３００グラム超、約４００グラム超、約５００グラム超、約６００グラム超、約７００グラム超、約８００グラム超、約９００グラム超、約１０００グラム超、約１５００グラム超、約２０００グラム超、約２５００グラム超、約３０００グラム超、約３５００グラム超、約４０００グラム超、もしくはそれ以上の種子を含有し得る。タバコ種子の容器は、当技術分野において利用可能な任意の容器であってもよい。非限定的な例として、容器は、箱、バッグ、小包、ポーチ、テープロール、チューブ、またはボトルであってもよい。
乾燥／製品
記載される低アルカロイドまたは低ニコチンのタバコ植物から作製された乾燥タバコ材料もまた提供される。より高いレベルの総アルカロイドまたはニコチンを有する記載されるタバコ植物から作製された乾燥タバコ材料がさらに提供される。
記載される低アルカロイドまたは低ニコチンのタバコ植物から作製された乾燥タバコ材料もまた提供される。より高いレベルの総アルカロイドまたはニコチンを有する記載されるタバコ植物から作製された乾燥タバコ材料がさらに提供される。
「乾燥」は、水分を低減し、かつ、タバコ葉に黄金色を与えかつそれによりデンプンが糖に変換されるクロロフィルの分解をもたらす熟成プロセスである。乾燥タバコは、したがって、収穫された緑色の葉と比較してより高い還元糖含有量およびより低いデンプン含有量を有する。一局面では、提供される緑色の葉のタバコは、従来の手段、例えば、熱風乾燥、納屋乾燥、火力乾燥、空気乾燥、または太陽乾燥を使用して乾燥され得る。例えば、異なる種類の乾燥方法の説明のために、Ｔｓｏ（１９９９、Ｃｈａｐｔｅｒ １、Ｔｏｂａｃｃｏ，Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｄａｖｉｓ ＆ Ｎｉｅｌｓｅｎ編、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、Ｏｘｆｏｒｄ）を参照。乾燥タバコは、通常、１０％～約２５％の範囲内の水分含有量において数年（例えば、２～５年）にわたり圧縮条件において木製ドラム（例えば、大だる）または段ボール箱中で熟成される。米国特許第４，５１６，５９０号および同第５，３７２，１４９号を参照。乾燥および熟成されたタバコは次にさらに加工され得る。さらなる加工としては、様々な温度での蒸気の導入ありまたはなしでの真空下でのタバコのコンディショニング、低温殺菌、および発酵が挙げられる。発酵は、典型的には、高い初期水分含有量、熱生成、および乾燥重量の１０～２０％の損失により特徴付けられる。例えば、米国特許第４，５２８，９９３号、同第４，６６０，５７７号、同第４，８４８，３７３号、同第５，３７２，１４９号；米国特許出願公開第２００５／０１７８３９８号；およびＴｓｏ（１９９９、Ｃｈａｐｔｅｒ １、Ｔｏｂａｃｃｏ，Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｄａｖｉｓ ＆ Ｎｉｅｌｓｅｎ編、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、Ｏｘｆｏｒｄ）を参照。乾燥、熟成、および発酵されたタバコはさらに加工（例えば、切断、細断、膨化、またはブレンド）され得る。例えば、米国特許第４，５２８，９９３号、同第４，６６０，５７７号、および同第４，９８７，９０７号を参照。一局面では、本開示の乾燥タバコ材料は太陽乾燥されている。別の局面では、本開示の乾燥タバコ材料は、熱風乾燥、空気乾燥、または火力乾燥されている。
本開示のタバコ株、品種またはハイブリッドから得られるタバコ材料は、タバコ製品を作製するために使用され得る。本明細書において使用される場合、「タバコ製品」は、ヒトでの使用または消費が意図されるタバコから作製または派生された任意の製品として定義される。
提供されるタバコ製品としては、シガレット製品（例えば、シガレットおよびビディシガレット）、シガー製品（例えば、葉巻タバコ（ｃｉｇａｒ ｗｒａｐｐｉｎｇ ｔｏｂａｃｃｏ）およびシガリロ）、パイプタバコ製品、タバコに由来する製品、タバコ由来ニコチン製品、無煙タバコ製品（例えば、湿潤嗅ぎタバコ、乾燥嗅ぎタバコ、および噛みタバコ）、フィルム、チュワブル、タブ、成形部分、ゲル、消費可能単位、不溶性マトリックス、中空形状、再構成タバコ、ならびに膨化タバコなどが挙げられるがそれに限定されない。例えば、米国特許出願公開第２００６／０１９１５４８号を参照。
本明細書において使用される場合、「シガレット」は、「ロッド」および「フィラー」を有するタバコ製品を指す。シガレット「ロッド」は、シガレットペーパー、フィルター、プラグラップ（フィルター材料を含有するために使用される）、シガレットペーパー（フィラーを含む）をフィルターに保持するチップペーパー、およびこれらの成分を一緒に保持する全ての接着剤を含む。「フィラー」としては、（１）再構成タバコおよび膨化タバコが挙げられるがそれに限定されない全てのタバコ、（２）非タバコ代用品（シガレットペーパー内に巻かれたタバコを伴ってもよいハーブ、非タバコ植物材料および他のスパイスが挙げられるがそれに限定されない）、（３）ケーシング、（４）風味物質、ならびに（５）全ての他の添加物（タバコおよび代用品に混合され、シガレット中に巻かれる）が挙げられる。
本明細書において使用される場合、「再構成タバコ」は、シート形態に加工され、かつタバコに似せるように細片に切断された、タバコ塵および他のタバコ屑材料から作製されたタバコフィラーの部分を指す。コストの節約に加えて、再構成タバコは、アンモニアと糖との反応を使用する風味発生の加工からシガレットの味に対するその寄与のために非常に重要である。
本明細書において使用される場合、「膨化タバコ」は、タバコが「膨らむ」ように好適な気体の膨張を通じて加工されて、低減された密度およびより大きい充填能力を結果としてもたらすタバコフィラーの部分を指す。それは、シガレットにおいて使用されるタバコの重量を低減する。
本開示の植物に由来するタバコ製品としてはまた、シガレットと、特にフィルター要素を含む、他の喫煙物品とが挙げられ、喫煙可能材料のロッドがタバコブレンド物内に乾燥タバコを含む。一局面では、本開示のタバコ製品は、シガリロ、非通気式リセスフィルターシガレット、通気式リセスフィルターシガレット、シガー、嗅ぎタバコ、パイプタバコ、シガータバコ、シガレットタバコ、噛みタバコ、葉タバコ、水タバコ、刻みタバコ、およびカットタバコからなる群から選択される。別の局面では、本開示のタバコ製品は無煙タバコ製品である。無煙タバコ製品は燃焼されず、噛みタバコ、湿潤無煙タバコ、スヌース、および乾燥嗅ぎタバコが挙げられるがそれに限定されない。噛みタバコは、典型的には大きいパウチ様パッケージ中に包装されてプラグまたはツイストにおいて使用される粗く分割されたタバコ葉である。湿潤無煙タバコは、ルース（ｌｏｏｓｅ）形態またはパウチ形態において提供される湿潤の、より微細に分割されたタバコであり、典型的には、丸缶中に包装され、成人タバコ消費者の頬と歯肉との間に置かれるピンチとしてまたはパウチ中で使用される。スヌースは、熱処理される無煙タバコである。乾燥嗅ぎタバコは、口の中に置かれるかまたは経鼻的に使用される微細に粉砕されたタバコである。さらなる局面では、本開示のタバコ製品は、ルーズリーフ噛みタバコ、プラグ噛みタバコ、湿潤嗅ぎタバコ、および鼻嗅ぎタバコからなる群から選択される。さらに別の局面では、本開示のタバコ製品は、電子加熱シガレット、ｅ－シガレット、電子的気化デバイスからなる群から選択される。
一局面では、本開示のタバコ製品は、ブレンドされたタバコ製品であり得る。一局面では、ブレンドされたタバコ製品は、乾燥タバコ材料を含む。一局面では、乾燥タバコ材料は、重量でタバコブレンド中の乾燥タバコのおよそ少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％を構成する。一局面では、乾燥タバコ材料は、体積でタバコブレンド中の乾燥タバコのおよそ少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％を構成する。
一局面では、本開示のタバコ製品は低ニコチンタバコ製品であり得る。さらなる局面では、本開示のタバコ製品は、約３ｍｇ／ｇ未満のレベルのノルニコチンを含んでもよい。例えば、そのような製品中のノルニコチン含有量は、約３．０ｍｇ／ｇ、２．５ｍｇ／ｇ、２．０ｍｇ／ｇ、１．５ｍｇ／ｇ、１．０ｍｇ／ｇ、７５０μｇ／ｇ、５００ｐｇ／ｇ、２５０ｐｇ／ｇ、１００ｐｇ／ｇ、７５ｐｇ／ｇ、５０ｐｇ／ｇ、２５ｐｇ／ｇ、１０ｐｇ／ｇ、７．０ｐｇ／ｇ、５．０ｐｇ／ｇ、４．０ｐｇ／ｇ、２．０ｐｇ／ｇ、１．０ｐｇ／ｇ、０．５ｐｇ／ｇ、０．４ｐｇ／ｇ、０．２ｐｇ／ｇ、０．１ｐｇ／ｇ、０．０５ｐｇ／ｇ、０．０１ｐｇ／ｇ、または検出不可能であり得る。
一局面では、提供される乾燥タバコ材料またはタバコ製品は、乾燥重量に基づいて約０．０１％、０．０２％、０．０５％、０．７５％、０．１％、０．１５％、０．２％、０．３％、０．３５％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１％、１．１％、１．２％、１．３％、１．４％、１．５％、１．６％、１．７％、１．８％、１．９％、２％、２．１％、２．２％、２．３％、２．４％、２．５％、２．６％、２．７％、２．８％、２．９％、３％、３．１％、３．２％、３．３％、３．４％、３．５％、３．６％、３．７％、３．８％、３．９％、４％、５％、６％、７％、８％、および９％からなる群から選択される平均ニコチンまたは総アルカロイドレベルを含む。別の局面では、提供される乾燥タバコ材料またはタバコ製品は、乾燥重量に基づいて約０．０１％～０．０２％、０．０２％～０．０５％、０．０５％～０．７５％、０．７５％～０．１％、０．１％～０．１５％、０．１５％～０．２％、０．２％～０．３％、０．３％～０．３５％、０．３５％～０．４％、０．４％～０．５％、０．５％～０．６％、０．６％～０．７％、０．７％～０．８％、０．８％～０．９％、０．９％～１％、１％～１．１％、１．１％～１．２％、１．２％～１．３％、１．３％～１．４％、１．４％～１．５％、１．５％～１．６％、１．６％～１．７％、１．７％～１．８％、１．８％～１．９％、１．９％～２％、２％～２．１％、２．１％～２．２％、２．２％～２．３％、２．３％～２．４％、２．４％～２．５％、２．５％～２．６％、２．６％～２．７％、２．７％～２．８％、２．８％～２．９％、２．９％～３％、３％～３．１％、３．１％～３．２％、３．２％～３．３％、３．３％～３．４％、３．４％～３．５％、および３．５％～３．６％からなる群から選択される平均ニコチンまたは総アルカロイドレベルを含む。さらなる局面では、提供される乾燥タバコ材料またはタバコ製品は、乾燥重量に基づいて約０．０１％～０．１％、０．０２％～０．２％、０．０３％～０．３％、０．０４％～０．４％、０．０５％～０．５％、０．７５％～１％、０．１％～１．５％、０．１５％～２％、０．２％～３％、および０．３％～３．５％からなる群から選択される平均ニコチンまたは総アルカロイドレベルを含む。
本開示は、開示されるタバコ植物由来のタバコ材料を含むタバコ製品を製造する方法をさらに提供する。一局面では、方法は、タバコ植物から作製された熟成されたタバコ材料をコンディショニングして、約１２．５％～約１３．５％から約２１％までその水分含有量を増加させ、コンディショニングされたタバコ材料をブレンドして、望ましいブレンド物を産生する工程を含む。一局面では、タバコ製品を製造する方法は、ブレンド物をケーシングまたは風味付けする工程をさらに含む。概して、ケーシングプロセスの間に、ケーシングまたはソース材料をブレンド物に加えて、化学組成の均衡を取ることによりそれらの品質を増強し、かつある特定の所望の風味の特徴を発生させる。ケーシングプロセスについてのさらなる詳細は、Ｔｏｂａｃｃｏ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｌ．Ｄａｖｉｓ ａｎｄ Ｍ．Ｎｉｅｌｓｅｎ，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９９において見出され得る。
提供されるタバコ材料はまた、熱処理（例えば、クッキング、トースティング）、風味付け、酵素処理、膨張、および／または乾燥が挙げられるがそれに限定されない方法を使用して加工され得る。発酵タバコおよび非発酵タバコの両方が、これらの技術を使用して加工され得る。好適な加工タバコの例としては、暗色空気乾燥、暗色火力乾燥、ｂｕｒｌｅｙ、熱風乾燥、およびシガーフィラーまたはラッパーの他に、葉全体から茎を取り除く操作（ｗｈｏｌｅ ｌｅａｆ ｓｔｅｍｍｉｎｇ ｏｐｅｒａｔｉｏｎ）からの製品が挙げられる。一局面では、タバコ繊維は、新鮮重量に基づいて最大７０％のダークタバコを含む。例えば、タバコは、米国特許出願公開第２００４／０１１８４２２号または同第２００５／０１７８３９８号に記載されるような加熱、蒸し、および／または低温殺菌段階によってコンディショニングされ得る。
提供されるタバコ材料は、発酵に供され得る。発酵は、典型的には、高い初期水分含有量、熱生成、および乾燥重量の１０～２０％の損失により特徴付けられる。例えば、米国特許第４，５２８，９９３号；同第４，６６０，５７７号；同第４，８４８，３７３号；および同第５，３７２，１４９号を参照されたい。葉の芳香の改良に加えて、発酵は、葉の色および感触のいずれかまたは両方を変化させ得る。また、発酵プロセスの間に、発生ガスが産生され得、酸素が取り込まれ得、ｐＨが変更され得、かつ保持される水の量が変更され得る。例えば、米国特許出願公開第２００５／０１７８３９８号およびＴｓｏ（１９９９，Ｃｈａｐｔｅｒ １，Ｔｏｂａｃｃｏ，Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｄａｖｉｓ ＆ Ｎｉｅｌｓｅｎ，ｅｄｓ．，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｏｘｆｏｒｄ）を参照されたい。乾燥タバコ、または乾燥および発酵タバコは、口腔製品への組込みの前にさらに加工（例えば、切断、膨化、ブレンド、ミーリング加工、または粉砕）され得る。タバコは、一部の場合には、コポリマーならびに任意で香料および他の添加物と混合する前に、４８～５０重量パーセントのオーブン揮発分（ｏｖｅｎ ｖｏｌａｔｉｌｅｓ）含有量を有するロングカットの発酵乾燥湿潤タバコである。
一局面では、提供されるタバコ材料は、所望のサイズに加工され得る。一局面では、タバコ繊維は、２００マイクロメートル未満の平均繊維サイズを有するように加工され得る。一局面では、タバコ繊維は、７５～１２５マイクロメートルである。別の局面では、タバコ繊維は、７５マイクロメートルまたはそれ未満のサイズを有するように加工される。一局面では、タバコ繊維は、ロングカットのタバコを含み、これは、約１０カット／インチから約１１０カット／インチまでの幅および約０．１インチから約１インチまでの長さにカットまたは細断され得る。ダブルカットタバコ繊維は、ダブルカットタバコ繊維の約７０％が、－２０メッシュ～８０メッシュの間のメッシュサイズを落ちるような粒子サイズの範囲を有し得る。
提供されるタバコ材料は、約１０重量％もしくはそれ以上、約２０重量％もしくはそれ以上、約４０重量％もしくはそれ以上、約１５重量％～約２５重量％、約２０重量％～約３０重量％、約３０重量％～約５０重量％、約４５重量％～約６５重量％、または約５０重量％～約６０重量％の総オーブン揮発分含有量を有するように加工され得る。当業者は、「湿潤」タバコが、典型的には、約４０重量％～約６０重量％（例えば、約４５重量％～約５５重量％、または約５０重量％）のオーブン揮発分含有量を有するタバコを指すことを認識している。本明細書において使用される場合、「オーブン揮発分」は、１１０℃に予め温めた強制通風オーブン中で３．２５時間にわたり試料を乾燥した後の試料の重量損失のパーセンテージを算出することによって決定される。口腔製品は、口腔製品を作製するために使用されるタバコ繊維のオーブン揮発分含有量とは異なる全体的なオーブン揮発分含有量を有し得る。記載される加工段階は、オーブン揮発分含有量を低減させ得るかまたは増加させ得る。
育種
本開示はまた、望ましいレベルの総アルカロイドまたはニコチン、例えば、低ニコチンまたはニコチン非含有、および望ましい葉の品質またはグレードレベルを含むタバコ株、栽培品種、または品種を育種するための方法を提供する。育種は、任意の公知の手法を介して実行され得る。ＤＮＡフィンガープリンティング、ＳＮＰマッピング、ハプロタイプマッピング、または類似の技術は、望ましい形質またはアレルをタバコ植物に移入または育種するためにマーカー補助選択（ＭＡＳ）育種プログラムにおいて使用されてもよい。例えば、育種家は、Ｆ１ハイブリッド植物を使用してまたはＦ１ハイブリッド植物を耕種学的に望ましい遺伝子型を有する他のドナー植物とさらに交雑してＦ２または戻し交雑世代において分離集団を作製することができる。Ｆ２または戻し交雑世代における植物は、当技術分野において公知のまたは本明細書において列記される技術の１つを使用して、所望の耕種学的形質または望ましい化学的プロファイルについてスクリーニングされ得る。期待される遺伝パターンまたは使用されるＭＡＳ技術に依存して、所望の個々の植物の同定を補助するために戻し交雑の各サイクルの前に選択された植物の自家受粉が行われ得る。戻し交雑または他の育種手法は、反復親（ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ ｐａｒｅｎｔ）の所望の表現型が回収されるまで反復され得る。本開示における反復親は、熱風乾燥品種、Ｂｕｒｌｅｙ品種、暗色空気乾燥品種、暗色火力乾燥品種、またはＯｒｉｅｎｔａｌ品種であり得る。他の育種技術は、例えば、Ｗｅｒｎｓｍａｎ，Ｅ．Ａ．およびＲｕｆｔｙ，Ｒ．Ｃ．１９８７．Ｃｈａｐｔｅｒ Ｓｅｖｅｎｔｅｅｎ．Ｔｏｂａｃｃｏ．Ｐａｇｅｓ ６６９－６９８ Ｉｎ：Ｃｕｌｔｉｖａｒ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｃｒｏｐ Ｓｐｅｃｉｅｓ．Ｗ．Ｈ．Ｆｅｈｒ（編）、ＭａｃＭｉｌｌａｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｇｏ．，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．（参照することにより全体が本明細書に組み込まれる）において見出され得る。
本開示はまた、望ましいレベルの総アルカロイドまたはニコチン、例えば、低ニコチンまたはニコチン非含有、および望ましい葉の品質またはグレードレベルを含むタバコ株、栽培品種、または品種を育種するための方法を提供する。育種は、任意の公知の手法を介して実行され得る。ＤＮＡフィンガープリンティング、ＳＮＰマッピング、ハプロタイプマッピング、または類似の技術は、望ましい形質またはアレルをタバコ植物に移入または育種するためにマーカー補助選択（ＭＡＳ）育種プログラムにおいて使用されてもよい。例えば、育種家は、Ｆ１ハイブリッド植物を使用してまたはＦ１ハイブリッド植物を耕種学的に望ましい遺伝子型を有する他のドナー植物とさらに交雑してＦ２または戻し交雑世代において分離集団を作製することができる。Ｆ２または戻し交雑世代における植物は、当技術分野において公知のまたは本明細書において列記される技術の１つを使用して、所望の耕種学的形質または望ましい化学的プロファイルについてスクリーニングされ得る。期待される遺伝パターンまたは使用されるＭＡＳ技術に依存して、所望の個々の植物の同定を補助するために戻し交雑の各サイクルの前に選択された植物の自家受粉が行われ得る。戻し交雑または他の育種手法は、反復親（ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ ｐａｒｅｎｔ）の所望の表現型が回収されるまで反復され得る。本開示における反復親は、熱風乾燥品種、Ｂｕｒｌｅｙ品種、暗色空気乾燥品種、暗色火力乾燥品種、またはＯｒｉｅｎｔａｌ品種であり得る。他の育種技術は、例えば、Ｗｅｒｎｓｍａｎ，Ｅ．Ａ．およびＲｕｆｔｙ，Ｒ．Ｃ．１９８７．Ｃｈａｐｔｅｒ Ｓｅｖｅｎｔｅｅｎ．Ｔｏｂａｃｃｏ．Ｐａｇｅｓ ６６９－６９８ Ｉｎ：Ｃｕｌｔｉｖａｒ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｃｒｏｐ Ｓｐｅｃｉｅｓ．Ｗ．Ｈ．Ｆｅｈｒ（編）、ＭａｃＭｉｌｌａｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｇｏ．，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．（参照することにより全体が本明細書に組み込まれる）において見出され得る。
記載されるタバコ植物を使用する植物育種プログラムの結果としては、本開示の有用な株、栽培品種、品種、子孫、近交系、およびハイブリッドが挙げられる。本明細書において使用される場合、「品種」という用語は、同じ種の他の植物からそれらを分離する一定の特徴を共有する植物の集団を指す。品種は、常にではないが多くの場合に、商業的に販売される。１つまたは複数の特徴的な形質を有するが、品種は、その品種内の個体間の非常に小さい全体的なバリエーションによりさらに特徴付けられる。「純粋株」品種は、組織または細胞培養技術を使用して単一の親からの自家受粉および選択、または栄養繁殖のいくつかの世代により作製されてもよい。品種は、別の株または品種に本質的に由来し得る。Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｅｗ Ｖａｒｉｅｔｉｅｓ ｏｆ Ｐｌａｎｔｓ（１９６１年１２月２日；１９７２年１１月１０日、１９７８年１０月２３日、および１９９１年３月１９日にＧｅｎｅｖａにおいて改訂）により定義されるように、品種は、（ａ）主に初期品種、または初期品種の遺伝子型もしくは遺伝子型の組み合わせの結果としてもたらされる本質的な特徴の発現を保持しながら、主に初期品種に由来する品種に由来し、（ｂ）初期品種から明確に区別可能であり、かつ（ｃ）誘導という行為の結果としてもたらされる差異を除いて、初期品種の遺伝子型または遺伝子型の組み合わせの結果としてもたらされる本質的な特徴の発現において初期品種と合致する場合に、初期品種に「本質的に由来する」。本質的に由来する品種は、例えば、天然のもしくは誘導された変異体、体細胞繁殖系バリアント、初期品種の植物からのバリアント個体の選択、戻し交雑、または形質転換により得られ得る。第１のタバコ品種および第１の品種が本質的に由来する第２のタバコ品種は、本質的に同一の遺伝的背景を有すると考えられる。品種から区別されるような「株」は、最も多くの場合に、非商業的に、例えば植物研究において使用される植物の群を表す。株は、典型的には、１つまたは複数の関心対象の形質について個体間の全体的なバリエーションをほとんど示さないが、他の形質について個体間で何らかのバリエーションがあってもよい。
本開示の任意のタバコ植物は、例えば、当技術分野において公知の技術を使用する遺伝子構築物またはトランスジーンを用いる形質転換により、追加の耕種学的に望ましい形質をさらに含み得ることが理解される。非限定的に、所望の形質の例は、除草剤抵抗性、有害生物抵抗性、耐病性；高い収率；高いグレード指数値；治癒可能性；乾燥品質；機械的収穫可能性；保持能力；葉品質；高さ、植物成熟度（例えば、早期成熟、早期成熟から中程度成熟、中程度成熟、中程度成熟から後期成熟、もしくは後期成熟）；茎サイズ（例えば、小さい、中程度、もしくは大きい茎）；または植物１つ当たりの葉数（例えば、少ない（例えば、５～１０枚の葉）、中程度（例えば、１１～１５枚の葉）、または多数（例えば、１６～２１枚）の葉）、または任意の組み合わせである。一局面では、開示される低ニコチンまたはニコチン非含有のタバコ植物または種子は、１つまたは複数の殺虫タンパク質、例えば、バチルス・チューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）の結晶タンパク質またはバチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ）からの栄養殺虫タンパク質、例えば、ＶＩＰ３などを発現する１つまたは複数のトランスジーンを含む（例えば、Ｅｓｔｒｕｃｈ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５：１３７を参照）。別の局面では、タバコ植物は、落葉病への抵抗性（米国特許第５，６８９，０３５号）またはシスト線虫への抵抗性（米国特許第５，４９１，０８１号）を付与する移入された形質をさらに含む。
本開示はまた、変化したニコチンまたは総アルカロイドレベルを含むがそのようなニコチンレベルの変化を有しない対応する初期タバコ植物の収率と同等の収率を有するタバコ植物を提供する。一局面では、低ニコチンまたはニコチン非含有タバコ品種は、約１２００～３５００、１３００～３４００、１４００～３３００、１５００～３２００、１６００～３１００、１７００～３０００、１８００～２９００、１９００～２８００、２０００～２７００、２１００～２６００、２２００～２５００、および２３００～２４００ポンド／エーカーからなる群から選択される収率を提供する。別の局面では、低ニコチンまたはニコチン非含有タバコ品種は、約１２００～３５００、１３００～３５００、１４００～３５００、１５００～３５００、１６００～３５００、１７００～３５００、１８００～３５００、１９００～３５００、２０００～３５００、２１００～３５００、２２００～３５００、２３００～３５００、２４００～３５００、２５００～３５００、２６００～３５００、２７００～３５００、２８００～３５００、２９００～３５００、３０００～３５００、および３１００～３５００ポンド／エーカーからなる群から選択される収率を提供する。さらなる局面では、低ニコチンまたはニコチン非含有タバコ植物は、低ニコチンまたはニコチン非含有形質を提供する遺伝子改変を除いて本質的に同一の遺伝的背景を有する対照植物の収率の６５％～１３０％、７０％～１３０％、７５％～１３０％、８０％～１３０％、８５％～１３０％、９０％～１３０％、９５％～１３０％、１００％～１３０％、１０５％～１３０％、１１０％～１３０％、１１５％～１３０％、または１２０％～１３０％の収率を提供する。さらなる局面では、低ニコチンまたはニコチン非含有タバコ植物は、低ニコチンまたはニコチン非含有形質を提供する遺伝子改変を除いて本質的に同一の遺伝的背景を有する対照植物の収率の７０％～１２５％、７５％～１２０％、８０％～１１５％、８５％～１１０％、または９０％～１００％の収率を提供する。
一局面では、ＡＤＣ、ＡＯ、またはＯＤＣの変異体またはトランスジェニックタバコ植物は、低アルカロイド背景対照と比較して増加した収率、低アルカロイド背景対照と比較して加速された成熟および老化、低アルカロイド背景対照と比較して低減した昆虫草食に対する感受性、ならびに低アルカロイド背景対照と比較して低減した摘心後のポリアミン含有量からなる群から選択される形質の１つもしくはそれ以上、２つもしくはそれ以上、３つもしくはそれ以上、または全てを呈する。一局面では、低アルカロイド背景におけるＡＤＣ、ＡＯ、またはＯＤＣの変異体またはトランスジェニックタバコ植物は、ＬＡ ＢＵ２１と比較して増加した収率、ＬＡ ＢＵ２１と比較して加速された成熟および老化、ＬＡ ＢＵ２１と比較して低減した昆虫草食に対する感受性、ならびにＬＡ ＢＵ２１と比較して低減した摘心後のポリアミン含有量からなる群から選択される形質の１つもしくはそれ以上、２つもしくはそれ以上、３つもしくはそれ以上、または全てを呈する。
一局面では、ＡＤＣ、ＡＯ、またはＯＤＣの変異体またはトランスジェニックタバコ植物（例えば、低ニコチン、ニコチン非含有、または低アルカロイドのタバコ品種）は、より低い収率、遅延した葉の成熟および老化、昆虫草食に対するより高い感受性、増加した摘心後のポリアミン含有量、より高いクロロフィル、単位葉面積当たりのより多い葉肉細胞、ならびに乾燥後の不良な最終製品の品質からなる群から選択されるＬＡ ＢＵ２１形質の１つもしくはそれ以上、２つもしくはそれ以上、３つもしくはそれ以上、または全てを呈しない。一局面では、開示されるタバコ植物（例えば、低ニコチン、ニコチン非含有、または低アルカロイドのタバコ品種）は、より低い収率、遅延した成熟および老化、昆虫草食に対するより高い感受性、増加した摘心後のポリアミン含有量、より高いクロロフィル、単位葉面積当たりのより多い葉肉細胞、ならびに乾燥後の不良な最終製品の品質からなる群から選択されるＬＡ ＢＵ２１形質の２つまたはそれ以上を呈しない。一局面では、開示されるタバコ植物（例えば、低ニコチン、ニコチン非含有、または低アルカロイドのタバコ品種）は、より低い収率、遅延した成熟および老化、昆虫草食に対するより高い感受性、増加した摘心後のポリアミン含有量、より高いクロロフィル、単位葉面積当たりのより多い葉肉細胞、ならびに乾燥後の不良な最終製品の品質からなる群から選択されるＬＡ ＢＵ２１形質の３つまたはそれ以上を呈しない。一局面では、開示されるタバコ植物（例えば、低ニコチン、ニコチン非含有、または低アルカロイドのタバコ品種）は、ＬＡ ＢＵ２１、ＬＡＦＣ５３、またはＬＮ ＫＹ１７１と比較してより低いレベルで、より低い収率、遅延した成熟および老化、昆虫草食に対するより高い感受性、増加した摘心後のポリアミン含有量、より高いクロロフィル、単位葉面積当たりのより多い葉肉細胞、ならびに乾燥後の不良な最終製品の品質からなる群から選択されるＬＡ ＢＵ２１形質の１つもしくはそれ以上、２つもしくはそれ以上、３つもしくはそれ以上、または全てを呈する。一局面では、開示されるタバコ植物（例えば、低ニコチン、ニコチン非含有、または低アルカロイドのタバコ品種）は、ＬＡ ＢＵ２１、ＬＡＦＣ５３、またはＬＮ ＫＹ１７１と比較してより低いレベルで、より低い収率、遅延した成熟および老化、昆虫草食に対するより高い感受性、増加した摘心後のポリアミン含有量、より高いクロロフィル、単位葉面積当たりのより多い葉肉細胞、ならびに乾燥後の不良な最終製品の品質からなる群から選択されるＬＡ ＢＵ２１形質の２つまたはそれ以上を呈する。一局面では、開示されるタバコ植物（例えば、低ニコチン、ニコチン非含有、または低アルカロイドのタバコ品種）は、ＬＡ ＢＵ２１、ＬＡＦＣ５３、またはＬＮ ＫＹ１７１と比較してより低いレベルで、より低い収率、遅延した成熟および老化、昆虫草食に対するより高い感受性、増加した摘心後のポリアミン含有量、より高いクロロフィル、単位葉面積当たりのより多い葉肉細胞、ならびに乾燥後の不良な最終製品の品質からなる群から選択されるＬＡ ＢＵ２１形質の３つもしくはそれ以上、または全てを呈する。
一局面では、改変タバコ植物（例えば、低ニコチン、ニコチン非含有、または低アルカロイドのタバコ品種）は、ＡＤＣ、ＡＯ、またはＯＤＣ遺伝子改変、および収率、成熟および老化、昆虫の草食に対する感受性、摘心後のポリアミン含有量、クロロフィルレベル、単位葉面積当たりの葉肉細胞数、ならびに乾燥後の最終製品の品質からなる群から選択される形質に実質的に影響することなく所望の形質（例えば、低ニコチン、ニコチン非含有、または低アルカロイド）を付与するさらなる遺伝子改変を含む。
一局面では、ＡＤＣ、ＡＯ、またはＯＤＣの変異体またはトランスジェニックタバコ植物は、所望の形質（例えば、低ニコチン、ニコチン非含有、または低アルカロイド）を付与する改変を含み、かつ非改変の対照植物と実質的に同等の形質をさらに含み、該形質は、収率、成熟および老化、昆虫の草食に対する感受性、摘心後のポリアミン含有量、クロロフィルレベル、単位葉面積当たりの葉肉細胞数、ならびに乾燥後の最終製品の品質からなる群から選択される。
一局面では、提供されるタバコ植物はハイブリッド植物である。ハイブリッドは、第１の品種の雌性親植物（例えば、種子親）の自家受粉を予防して、第２の品種の雄性親植物からの花粉が雌性親植物に授精することを可能とし、Ｆ１ハイブリッド種子が雌性植物において形成されることを可能とすることにより産生され得る。雌性植物の自家受粉は、早期の花発達ステージにおいて花を除雄することにより予防され得る。代替的に、花粉形成は、雄性不稔性の形態を使用して雌性親植物において予防され得る。例えば、雄性不稔性は、トランスジーンが小胞子形成および／もしくは花粉形成を阻害する雄性不稔性（ＭＳ）、もしくはトランスジェニック雄性不稔性、または自家不和合性により生じ得る。ＭＳを含有する雌性親植物は特に有用である。雌性親植物がＭＳである局面では、花粉が雄性稔性植物から収穫され、ＭＳ雌性親植物の柱頭に手動で適用されてもよく、結果として生じたＦ１種子が収穫される。
植物は、単交雑タバコＦ１ハイブリッドを形成するために使用され得る。雄性親植物からの花粉は、Ｆ１種子を形成するために、除雄された雌性親植物または雄性不稔性の雌性親植物に手動で移動される。代替的に、単交雑Ｆ１ハイブリッドが雌性親として使用されて異なる雄性親と交雑される三系交雑が実行され得る。別の代替として、２つの異なる単交雑のＦ１子孫がそれら自体で交雑される二重交雑ハイブリッドが作製され得る。二重交雑ハイブリッドを形成する場合の雌性親の自家受粉を予防するための特定の利点のために自家不和合性が使用され得る。
一局面では、低ニコチンまたはニコチン非含有のタバコ品種は雄性不稔性である。別の局面では、低ニコチンまたはニコチン非含有のタバコ品種は細胞質雄性不稔性である。雄性不稔性のタバコ植物は、当技術分野において公知の任意の方法により産生されてもよい。雄性不稔性のタバコを産生する方法は、Ｗｅｒｎｓｍａｎ，Ｅ．Ａ．およびＲｕｆｔｙ，Ｒ．Ｃ．１９８７．Ｃｈａｐｔｅｒ Ｓｅｖｅｎｔｅｅｎ．Ｔｏｂａｃｃｏ．Ｐａｇｅｓ ６６９－６９８ Ｉｎ：Ｃｕｌｔｉｖａｒ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｃｒｏｐ Ｓｐｅｃｉｅｓ．Ｗ．Ｈ．Ｆｅｈｒ（編）、ＭａｃＭｉｌｌａｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｇｏ．，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．７６１ ｐｐに記載されている。
さらなる局面では、提供されるタバコ部分としては、葉、茎、根、種子、花、花粉、葯、胚珠、小花柄、果実、***組織、子葉、胚軸、さや、胚、内乳、外植片、カルス、組織培養物、シュート、細胞、およびプロトプラストが挙げられるがそれに限定されない。一局面では、提供されるタバコ部分は種子を含まない。一局面では、本開示は、生殖材料ではなく、かつ植物の天然の生殖を媒介しないタバコ植物の細胞、組織、および器官を提供する。別の局面では、本開示はまた、生殖材料であり、かつ植物の天然の生殖を媒介するタバコ植物の細胞、組織、および器官を提供する。別の局面では、本開示は、光合成を介して維持され得ないタバコ植物の細胞、組織、および器官を提供する。別の局面では、本開示は、体細胞性タバコ植物細胞を提供する。体細胞は、生殖細胞系列細胞とは異なり、植物生殖を媒介しない。
提供される細胞、組織、および器官は、種子、果実、葉、子葉、胚軸、***組織、胚、内乳、根、シュート、茎、さや、花、花序、茎、小花柄、花柱、柱頭、花托、花弁、がく、花粉、葯、花糸、子房、胚珠、果皮、師部、管束組織からのものであり得る。別の局面では、本開示は、タバコ植物葉緑体を提供する。さらなる局面では、本開示は、表皮細胞、気孔細胞、葉毛もしくは根毛、貯蔵根、または塊茎を提供する。別の局面では、本開示は、タバコプロトプラストを提供する。
タバコ植物は、無性生殖または栄養繁殖を介してではなく、種子を介して天然に生殖することを当業者は理解する。一局面では、本開示は、タバコ内乳を提供する。別の局面では、本開示は、タバコ内乳細胞を提供する。さらなる局面では、本開示は、ヒトの介入なしでは生殖できない雄性または雌性不稔性タバコ植物を提供する。当業者はさらに、乾燥タバコは生物を構成せず、成長や繁殖の能力がないことを理解する。
核酸／ポリペプチド
一局面では、本開示は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～３６およびその断片からなる群から選択される配列に対して少なくとも約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を含む核酸分子を提供する。一局面では、本開示は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７～５４からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性または類似性を含むポリペプチドまたはタンパク質を提供する。別の局面では、本開示は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７～５４からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質の生物学的に活性を有するバリアントを提供する。本開示のタンパク質の生物学的に活性を有するバリアントは、わずか１～１５アミノ酸残基、わずか１０、わずか９、わずか８、わずか７、わずか６、わずか５、わずか４、わずか３、わずか２、またはわずか１アミノ酸残基だけそのタンパク質から異なっていてもよい。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～５４からなる群から選択される配列を含む遺伝子またはタンパク質のオルソロガスな遺伝子またはタンパク質もまた提供される。「オルソログ」とは、共通の祖先遺伝子に由来し、かつ種分化の結果として異なる種において見出される遺伝子である。オルソログは、ヌクレオチド配列および／またはタンパク質配列のレベルで、少なくとも６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性または類似性を共有し得る。オルソログの機能は、多くの場合に種間で高度に保存されている。
一局面では、本開示は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～３６およびその断片からなる群から選択される配列に対して少なくとも約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を含む核酸分子を提供する。一局面では、本開示は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７～５４からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性または類似性を含むポリペプチドまたはタンパク質を提供する。別の局面では、本開示は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７～５４からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質の生物学的に活性を有するバリアントを提供する。本開示のタンパク質の生物学的に活性を有するバリアントは、わずか１～１５アミノ酸残基、わずか１０、わずか９、わずか８、わずか７、わずか６、わずか５、わずか４、わずか３、わずか２、またはわずか１アミノ酸残基だけそのタンパク質から異なっていてもよい。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～５４からなる群から選択される配列を含む遺伝子またはタンパク質のオルソロガスな遺伝子またはタンパク質もまた提供される。「オルソログ」とは、共通の祖先遺伝子に由来し、かつ種分化の結果として異なる種において見出される遺伝子である。オルソログは、ヌクレオチド配列および／またはタンパク質配列のレベルで、少なくとも６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性または類似性を共有し得る。オルソログの機能は、多くの場合に種間で高度に保存されている。
本明細書において使用される場合、２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の文脈における「配列同一性」または「同一性」という用語は、指定される比較ウインドウにわたる最大の一致のためにアライメントされた場合に同じである、２つの配列中の残基を参照する。配列同一性のパーセンテージがタンパク質に関して使用される場合、同一ではない残基位置は、多くの場合に保存的アミノ酸置換によって異なり、その場合、アミノ酸残基は、類似の化学的特性（例えば、電荷または疎水性）を有する他のアミノ酸残基に置換されており、したがって分子の機能的特性を変化させないことが認識されている。配列が保存的置換で異なる場合、配列同一性パーセントは、置換の保存的性質について補正するために上方に調整されてもよい。そのような保存的置換によって異なる配列は、「配列類似性」または「類似性」を有するとみなされる。本明細書に提供される任意のタンパク質配列について、周知の保存的アミノ酸置換の１つまたは複数の結果として１つまたは複数のアミノ酸が異なる、機能的なホモログタンパク質もまた企図され、例えば、バリンはアラニンの保存的置換物であり、スレオニンはセリンの保存的置換物である。天然の配列内のアミノ酸に対する保存的置換は、天然に存在するアミノ酸が属するクラスの他のメンバーから選択することができる。これらの様々なクラス内の代表的なアミノ酸としては、以下が挙げられるが、それに限定されない：（１）アスパラギン酸およびグルタミン酸などの酸性（負に荷電した）アミノ酸；（２）アルギニン、ヒスチジン、およびリジンなどの塩基性（正に荷電した）アミノ酸；（３）グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、およびグルタミンなどの中性極性アミノ酸；ならびに（４）アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、およびメチオニンなどの中性非極性（疎水性）アミノ酸。天然のアミノ酸配列内のアミノ酸に対する保存された置換物は、天然に存在するアミノ酸が属する群の他のメンバーから選択することができる。例えば、脂肪族側鎖を有するアミノ酸の群は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシンであり；脂肪族ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸の群は、セリンおよびスレオニンであり；アミド含有側鎖を有するアミノ酸の群は、アスパラギンおよびグルタミンであり；芳香族側鎖を有するアミノ酸の群は、フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファンであり；塩基性側鎖を有するアミノ酸の群は、リジン、アルギニン、およびヒスチジンであり；ならびに硫黄含有側鎖を有するアミノ酸の群は、システインおよびメチオニンである。天然で保存的なアミノ酸置換の群は、バリン－ロイシン、バリン－イソロイシン、フェニルアラニン－チロシン、リジン－アルギニン、アラニン－バリン、アスパラギン酸－グルタミン酸、およびアスパラギン－グルタミンである。本開示のさらなる局面は、天然の配列における１つまたは複数のアミノ酸の欠失または挿入の結果として、記載されるタンパク質配列のものとは１つまたは複数のアミノ酸が異なるタンパク質を含む。
提供される核酸分子、ポリペプチド、またはタンパク質は、単離されるかまたは実質的に精製されることができる。「単離された」または「精製された」核酸分子、ポリペプチド、タンパク質、またはその生物学的に活性を有する部分は、その天然に存在する環境において見出されるような、ポリヌクレオチドまたはタンパク質に通常付随するかまたはそれと相互作用する成分を、実質的にまたは本質的に含まない。例えば、単離されたまたは精製されたポリヌクレオチドまたはタンパク質は、組換え技術により産生される場合に他の細胞材料もしくは培養培地を実質的に含まず、または化学合成される場合に化学的前駆体もしくは他の化学物質を実質的に含まない。
本開示を今しがた大まかに説明してきたが、定めない限り、例証として提供され、かつ本開示を限定するようには意図されない以下の実施例を参照することによって、同じことがより容易に理解される。
実施例１：ＲＮＡｉアプローチ
植物アルカロイドは、植物界全体に広く分布している窒素含有代謝物の大きな群を構成している。ニコチアナ・タバカムＬ．（タバコ）のアルカロイド、特にニコチンは、昔から、生物学、商業、社会、および医学において広範にわたる注目を集めてきた二次代謝物である（Ｔｓｏ ａｎｄ Ｊｅｆｆｒｅｙ １９６１；Ｌｅｅｔｅ １９７７；Ｗａｌｌｅｒ ａｎｄ Ｎｏｗａｃｋｉ １９７８；Ｂａｌｄｗｉｎ １９８９；Ｄｅｗｅｙ ａｎｄ Ｘｉｅ ２０１３；Ｐａｔｒａ ｅｔ ａｌ．２０１３）。商用タバコ栽培品種は、典型的には、総乾燥バイオマス重量の２～６％のレベルでアルカロイドを産生する。典型的な商用タバコ植物において、ニコチンは、総アルカロイドプールの約９０％を占め（Ｔａｙｏｕｂ ｅｔ ａｌ．２０１５；Ｍｏｇｈｂｅｌ ｅｔ ａｌ．２０１７）、二次アルカロイドであるノルニコチン（ニコチンの脱メチル化誘導体）、アナタビン、およびアナバシンが、残りのほとんどを占める（Ｓａｉｔｏｈ ｅｔ ａｌ．１９８５；Ｓｉｓｓｏｎ ａｎｄ Ｓｅｖｅｒｓｏｎ １９９０）。シークエンシングおよび分子生物学における最近の進歩は、これらの二次代謝物の生合成を担う酵素をコードする遺伝子の大多数の特徴決定をもたらしている（Ｄｅｗｅｙ ａｎｄ Ｘｉｅ ２０１３）。
植物アルカロイドは、植物界全体に広く分布している窒素含有代謝物の大きな群を構成している。ニコチアナ・タバカムＬ．（タバコ）のアルカロイド、特にニコチンは、昔から、生物学、商業、社会、および医学において広範にわたる注目を集めてきた二次代謝物である（Ｔｓｏ ａｎｄ Ｊｅｆｆｒｅｙ １９６１；Ｌｅｅｔｅ １９７７；Ｗａｌｌｅｒ ａｎｄ Ｎｏｗａｃｋｉ １９７８；Ｂａｌｄｗｉｎ １９８９；Ｄｅｗｅｙ ａｎｄ Ｘｉｅ ２０１３；Ｐａｔｒａ ｅｔ ａｌ．２０１３）。商用タバコ栽培品種は、典型的には、総乾燥バイオマス重量の２～６％のレベルでアルカロイドを産生する。典型的な商用タバコ植物において、ニコチンは、総アルカロイドプールの約９０％を占め（Ｔａｙｏｕｂ ｅｔ ａｌ．２０１５；Ｍｏｇｈｂｅｌ ｅｔ ａｌ．２０１７）、二次アルカロイドであるノルニコチン（ニコチンの脱メチル化誘導体）、アナタビン、およびアナバシンが、残りのほとんどを占める（Ｓａｉｔｏｈ ｅｔ ａｌ．１９８５；Ｓｉｓｓｏｎ ａｎｄ Ｓｅｖｅｒｓｏｎ １９９０）。シークエンシングおよび分子生物学における最近の進歩は、これらの二次代謝物の生合成を担う酵素をコードする遺伝子の大多数の特徴決定をもたらしている（Ｄｅｗｅｙ ａｎｄ Ｘｉｅ ２０１３）。
タバコのゲノム配列の有用性、ならびにニコチン生合成経路に関与する構造遺伝子および調節遺伝子の多くの知識（Ｋａｊｉｋａｗａ ｅｔ ａｌ．２０１７）は、生合成経路を混乱させ、それにより葉アルカロイド含有量を変化させるように、タバコ遺伝子発現を操る可能性をもたらした。例えば、Ｋａｊｉｋａｗａ ｅｔ ａｌ．（２０１７）は、系統発生的分析および発現分析について報告し、これは、レギュロンを形成し、かつジャスモン酸応答性エチレン応答因子（ＥＲＦ）転写因子の制御下で動作する、ニコチン生合成経路の一連の構造遺伝子を明らかにした。
重要なポリアミン前駆体であるプトレシンは、酵素オルニチンデカルボキシラーゼ（ＯＤＣ）の活性を介してオルニチンに由来し、恐らくアルギニンデカルボキシラーゼ（ＡＤＣ）の活性を介してアルギニンに由来すると考えられている。プトレシンは、ニコチアナ・タバカムおよび関連種においてニコチンのピロリジン環を生成するための反応物として働き得る。Ｎ．タバカムにおけるアルギニン生合成経路を試験するために、Ｃｈｉｎｔａｐａｋｏｒｎ ａｎｄ Ｈａｍｉｌｌ（２００７）は、タバコの毛根培養システムと共にアンチセンスアプローチを使用して、形質転換植物においてＡＤＣ活性を下方制御した。彼らは、ニコチンの濃度が、ＡＤＣ－アンチセンス株のニコチン含有量が対照におけるニコチン含有量よりも約２０％低い時である生育のより後のステージを除いて、そのそれぞれの培養サイクルのほとんどを通して、アンチセンス－ＡＤＣ株および対照株において同等であることを見出した（Ｃｈｉｎｔａｐａｋｏｒｎ ａｎｄ Ｈａｍｉｌｌ（２００７））。彼らは、典型的にはＮ．タバカムにおいて２番目に豊富なアルカロイドであるアナタビンのレベルが、２つのＡＤＣ－アンチセンス株において、培養サイクルの後のステージで対照と比較してわずかに上昇していることを見出した。彼らの研究は、ＡＤＣ媒介性のプトレシンへの経路が、ニコチン合成のためのピロリジン環を提供する際に役割を果たすが、最も重要ではないことを示唆した。
Ｎ．タバカムにおけるオルニチン生合成経路について試験するために、ＤｅＢｏｅｒ ｅｔ ａｌ（２０１１）は、毛根培養システムと共にＲＮＡｉ方法論も使用して、Ｎ．タバカムにおいてＯＤＣ転写物レベルを下方制御した。彼らは、トランスジェニック組織のアルカロイドプロファイルに対する顕著な影響を観察し、ＯＤＣ転写物の下方制御は、培養された毛根およびインタクトの温室生育植物の両方において、より低いニコチンおよび増加したアナタビンレベルをもたらした。彼らは、オルニチン代謝物およびＯＤＣ触媒性のプトレシンへの生合成経路が、ニコチン生合成においておよびＮ．タバカムにおけるニコチン：アナタビン比の定義において、ＡＤＣ媒介性経路よりも重要であると結論付けた。これらの知見は、ニコチアナ・グラウカ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｇｌａｕｃａ）におけるオルニチンデカルボキシラーゼ（ＯＤＣ）発現のＲＮＡｉ媒介性下方制御が、ニコチンおよびアナバシンの生合成および蓄積の周知の創傷ストレス刺激を妨げることを示した、ＤｅＢｏｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１３）によってさらに確証される。
ここでは、ＲＮＡｉ技術を適用するため、ならびにアルギニンデカルボキシラーゼ、アグマチンデイミナーゼ、アスパラギン酸オキシダーゼ、アルギナーゼ、オルニチンデカルボキシラーゼ、およびＳ’アデノシル－Ｌ：－メチオニン（ＳＡＭ）シンターゼを含む、ニコチアナ・タバカムにおけるいくつかのアルカロイド生合成関連遺伝子の発現を下方制御するために、体系的な努力を行う。この努力は、ニコチン生合成におけるこれらの様々な遺伝子と経路との間の相互作用の、より統合された理解を達成することを助ける。
実施例２：植物材料
本研究において使用される植物材料は、ニコチアナ・タバカム、ｃｖ Ｋ３２６－ＡＬＣＳ３（野生型タバコ）である。Ｄｉｘｉｅカップ中のインビトロ小植物を、ビタミンおよび３０ｇＬ－１スクロースを補給した固形ムラシゲ・スクーグ（ＭＳ；１９６２）寒天培地上での種子発芽および初期生育後に取得する。幼植物は、１６／８時間の光周期下で２４℃に維持する（図１ａ）。
本研究において使用される植物材料は、ニコチアナ・タバカム、ｃｖ Ｋ３２６－ＡＬＣＳ３（野生型タバコ）である。Ｄｉｘｉｅカップ中のインビトロ小植物を、ビタミンおよび３０ｇＬ－１スクロースを補給した固形ムラシゲ・スクーグ（ＭＳ；１９６２）寒天培地上での種子発芽および初期生育後に取得する。幼植物は、１６／８時間の光周期下で２４℃に維持する（図１ａ）。
安定な形質転換のために、これらのタバコ幼植物由来の１ｃｍ×１ｃｍの葉片にトランスジェニックアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）を、葉を５分間、１ｇＬ－１酵母エキス、５ｇＬ－１肉エキス、５ｇＬ－１バクトペプトン、５ｇＬ－１スクロース、４９２．８ｍｇＬ－１ＭｇＳＯ４－７Ｈ２Ｏ、および０．２ｍＭのアセトシリンゴンを含有するｐＨ６．８の２５ｍＬ ＹＥＢ細胞懸濁液に浸漬する時に感染させる。ＹＥＢ培地中のＡ．ツメファシエンス細胞の光学密度（ＯＤ６００）は、０．８～１である。浸漬した後、葉片を、滅菌Ｗｈａｔｍａｎ紙で穏やかに吸い取って乾燥させ、次いで、ＭＳ培地を含有するペトリ寒天プレートに移して、暗闇で２日間インキュベートする。
選択および再生のために、処理された葉片を、５００ｍｇＬ－１セフォタキシム、１５０ｍｇＬ－１カナマイシン、１ｍｇＬ－１６－ベンジルアミノプリン（ＢＡ）、１ｍｇＬ－１チアミン－ＨＣｌ、および１００ｍｇＬ－１ｍｙｏイノシトールを補給したＭＳ培地を含有する寒天プレートに移す。選択下での３ラウンドの移動が、再生個体（ｒｅｇｅｎｅｒａｎｔ）の発根を可能にするのに十分であり、再生個体を、５００ｍｇＬ－１セフォタキシムおよび１５０ｍｇＬ－１カナマイシンを含有するＤｉｘｉｅカップ中のＭＳ寒天培地に移す。カナマイシンの存在下での選択および再生のこれらの段階後に得られた小植物は、Ｔ０形質転換体世代であると考えられる。
Ｄｉｘｉｅカップ中でのおよそ５週間の生育後の発根した形質転換体を、温室中の土壌に移し、周囲日光条件下で栽培する（図１ｂ）。開花後に、Ｔ１種子を収集し、滅菌し、カタログ化し、カナマイシン選択下で発芽させ、１５０ｍｇＬ－１カナマイシンの存在下で、インビトロのＤｉｘｉｅカップ中で個別に栽培する。これらのＴ１小植物を、Ｔ１形質転換体世代として、後で温室に移す。
温室中でのＴ１タバコ植物の摘心は、それらが開花し始めた時に適用する。このアプローチにおいて、花の頭および上部から最初の完全に広がった葉までのシュートを除去する。２週間のさらなる生育および葉の広がりの後に、上部から３番目および４番目の葉を、分析のために収穫する。
実施例３：細菌およびプラスミド
タバコ植物を形質転換するために、９系統のアグロバクテリウム・ツメファシエンスＬＢＡ４４０４を生成して使用する：野生型対照、ならびにＲＮＡｉ配列をコードするそれぞれのヌクレオチドと、細菌および植物形質転換体の両方において選択可能マーカーとして働く抗生物質選択（カナマイシン）のための配列とを有するバイナリー植物発現ベクターｐ４５－２－７－１を保有する８つの操作された系統。これらの配列には、プロモーターとして働く構成的なキャッサバ葉脈モザイクウイルス（Ｃａｓｓａｖａ Ｖｅｉｎ Ｍｏｓａｉｃ Ｖｉｒｕｓ）（ＣｓＶＭＶ）が先行し、ノパリンシンターゼ遺伝子（ＮＯＳ）ターミネーターがその後に続く。
タバコ植物を形質転換するために、９系統のアグロバクテリウム・ツメファシエンスＬＢＡ４４０４を生成して使用する：野生型対照、ならびにＲＮＡｉ配列をコードするそれぞれのヌクレオチドと、細菌および植物形質転換体の両方において選択可能マーカーとして働く抗生物質選択（カナマイシン）のための配列とを有するバイナリー植物発現ベクターｐ４５－２－７－１を保有する８つの操作された系統。これらの配列には、プロモーターとして働く構成的なキャッサバ葉脈モザイクウイルス（Ｃａｓｓａｖａ Ｖｅｉｎ Ｍｏｓａｉｃ Ｖｉｒｕｓ）（ＣｓＶＭＶ）が先行し、ノパリンシンターゼ遺伝子（ＮＯＳ）ターミネーターがその後に続く。
ＲＮＡｉの設計は、表８に列記されるタンパク質をコードする転写物配列に基づく。関心対象の遺伝子（オルニチンデカルボキシラーゼ －ＯＤＣ、アルギニンデカルボキシラーゼ －ＡＤＣ、アスパラギン酸オキシダーゼ －ＡＯ、Ｓ－アデノシルメチオニンシンテターゼ －ＳＡＭＳ、アグマチンデイミナーゼ －ＡＩＣ、およびアルギナーゼ －ＡＲＧ）のコーディング領域を、内部ＮＴ３．１データベースから取り出す。上述の遺伝子のｃＤＮＡ配列、および対応するヌクレオチド配列を伴うＲＮＡｉ構築物の設計を、表９に示す。関心対象の各遺伝子について、約２３０ｂｐ～３５０ｂｐの特有の領域を選択し、それぞれ、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）アクチン－１１遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＢＴ００５５９３．１）の第２イントロンにわたってフォワード方向およびリバース方向で挿入する。標的遺伝子における高い配列類似性のために、ＯＤＣ－１ａとＯＤＣ－１ｂとは、１つのＲＮＡｉ構築物（ＯＤＣ－ＲＮＡｉ）によって標的とされ得る。同様に、ＡＤＣ－１ａとＡＤＣ－１ｂとは、１つのＲＮＡｉ構築物（ＡＤＣ－ＲＮＡｉ）によって標的とされ得る。カセット全体を、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）で合成し、キャッサバ葉脈モザイクウイルスプロモーターおよびノパリンシンターゼターミネーターの制御下にクローニングする。バイナリーベクターは、トランスジェニック植物選択のためのカナマイシン抵抗性遺伝子であるＮＰＴＩＩを含有する。プラスミド配列を、以下の２セットのプライマーを用いたＰＣＲおよびサンガーシークエンシングによって検証する：ＣＳＶＭＶ－ＦとＩｎｔｒｏｎ－Ｒ、およびＩｎｔｒｏｎ－ＦとＮｏｓＴ－Ｒ（表１０を参照されたい）。次いで、プラスミドでアグロバクテリウム・ツメファシエンスを形質転換し、陽性クローンをタバコの形質転換に使用する。アスパラギン酸オキシダーゼおよびＳＡＭシンターゼは、それぞれ、２つおよび３つのＲＮＡｉ構築物の設計、構築、および使用を伴う。他のＲＮＡｉ構築物については、単一のＲＮＡｉ構築物のみを使用する。
（表８）本明細書で操られるアルカロイド生合成遺伝子についての遺伝子名、ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ、およびロケーター番号。ＲＮＡｉ構築物を設計し（１２ページの補足資料を参照されたい）、アグロバクテリウム・ツメファシエンス形質転換を通してニコチアナ・タバカムの核ゲノムに注入する。
（表９）本明細書で操られるアルカロイド生合成遺伝子の遺伝子名および配列。 ゲノムＤＮＡ配列は、プロモーター、５’ＵＴＲ、イントロン、３’ＵＴＲ、およびターミネーターなどの領域を含む。ＲＮＡｉ配列とは、逆位反復ＲＮＡｉをコードするカセットを生成するために使用される遺伝子特異的配列を指す。示されるように、ある特定のＲＮＡｉ配列は、複数の遺伝子を、これらの遺伝子配列の高い類似性のために標的とすることができる。
実施例４：アグロインフィルトレーション
ほぼ同じ発達ステージの高さ約１５ｃｍの温室栽培タバコ植物を、様々なＲＮＡｉ構築物での一過性発現実験に使用する。インフィルトレーションのために、２８℃で生育させた細胞とのアグロバクテリウム・ツメファシエンスの一晩培養物を遠心分離し、細胞ペレットを、最終ＯＤ６００＝０．５になるように、アグロインフィルトレーション緩衝液（１０ｍＭ ＭＥＳ、ｐＨ＝５．７、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、および０．２ｍＭアセトシリンゴン）に再懸濁する。細胞を、この培地において３時間、振盪せずにインキュベートする。野生型対照を含み、アグロバクテリウムタイプ当たり最低３枚の葉に、アグロバクテリウム混合物を含む３ｍＬ滅菌シリンジの先端を葉の背軸側に押し込むことによって浸透させる（図２）。アグロインフィルトレーションされた葉を、２日間のインキュベーション後に収穫し、液体窒素中で凍結し、その後、使用する準備ができるまで－８０℃で保存する。
ほぼ同じ発達ステージの高さ約１５ｃｍの温室栽培タバコ植物を、様々なＲＮＡｉ構築物での一過性発現実験に使用する。インフィルトレーションのために、２８℃で生育させた細胞とのアグロバクテリウム・ツメファシエンスの一晩培養物を遠心分離し、細胞ペレットを、最終ＯＤ６００＝０．５になるように、アグロインフィルトレーション緩衝液（１０ｍＭ ＭＥＳ、ｐＨ＝５．７、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、および０．２ｍＭアセトシリンゴン）に再懸濁する。細胞を、この培地において３時間、振盪せずにインキュベートする。野生型対照を含み、アグロバクテリウムタイプ当たり最低３枚の葉に、アグロバクテリウム混合物を含む３ｍＬ滅菌シリンジの先端を葉の背軸側に押し込むことによって浸透させる（図２）。アグロインフィルトレーションされた葉を、２日間のインキュベーション後に収穫し、液体窒素中で凍結し、その後、使用する準備ができるまで－８０℃で保存する。
実施例５：アルカロイドの抽出
本明細書において例示されるデータ全てについて、総葉アルカロイド抽出を、新鮮なまたは凍結された葉材料を用いて行う。１ｃｍ×１ｃｍの新鮮な葉片または５０ｍｇの凍結乾燥葉材料を、１ｍＬの１００％メタノールにおいて浸軟させ、この溶媒の存在下で２時間インキュベートする。この時間中に、試料を超音波氷水浴に供する。破片をペレット化するための短時間の遠心分離の後、上清を収集して、５００μＬの２％（ｖ：ｖ）Ｈ２ＳＯ４で酸性化し、疎水性中性化合物を、ＣＨＣｌ３（２×５００μＬ）で除去する。その後、残りの極性画分を、２００μＬのＮＨ４ＯＨ（２５％）の添加で塩基性化し、アルカロイドをＣＨＣｌ３（３×５００μＬ）で抽出する。有機溶媒（ＣＨＣｌ３）を蒸発させ、試料を、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）の前にサンプルを純粋なメタノールに溶解するか、または比色分析のためにリン酸緩衝液（７１．６ｇＬ－１のＮａ２ＨＰＯ３、ｐＨ ４．７）に溶解する。
本明細書において例示されるデータ全てについて、総葉アルカロイド抽出を、新鮮なまたは凍結された葉材料を用いて行う。１ｃｍ×１ｃｍの新鮮な葉片または５０ｍｇの凍結乾燥葉材料を、１ｍＬの１００％メタノールにおいて浸軟させ、この溶媒の存在下で２時間インキュベートする。この時間中に、試料を超音波氷水浴に供する。破片をペレット化するための短時間の遠心分離の後、上清を収集して、５００μＬの２％（ｖ：ｖ）Ｈ２ＳＯ４で酸性化し、疎水性中性化合物を、ＣＨＣｌ３（２×５００μＬ）で除去する。その後、残りの極性画分を、２００μＬのＮＨ４ＯＨ（２５％）の添加で塩基性化し、アルカロイドをＣＨＣｌ３（３×５００μＬ）で抽出する。有機溶媒（ＣＨＣｌ３）を蒸発させ、試料を、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）の前にサンプルを純粋なメタノールに溶解するか、または比色分析のためにリン酸緩衝液（７１．６ｇＬ－１のＮａ２ＨＰＯ３、ｐＨ ４．７）に溶解する。
実施例６：総アルカロイドの定量
本明細書において例示されるデータ全てについて、Ｐａｔｅｌ ｅｔ ａｌ．（２０１５），Ｉｎｔ Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ ７：２４９－２５１によって開発された分光光度法を、いくつかの改変を伴って適用する。簡潔に言えば、各々の単一の新鮮な葉ディスクまたは５０ｍｇの凍結乾燥葉材料から抽出されたアルカロイドを、２００μＬのリン酸緩衝液（ｐＨ ４．７）に再懸濁し、２００μＬのブロモクレゾールグリーン溶液（ＢＣＧ）（１ｍＭストック）と混合し、次いで、４００μＬのクロロホルムを添加してアルカロイドを抽出する。最後に、溶液の吸収スペクトルを、３５０～５５０ｎｍの領域においてＵＶ－ＶＩＳ Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＵＶ－１８００分光光度計で測定する（図３、上）。較正曲線を、溶液中のニコチンの濃度の関数として、４１５ｎｍでの最大吸光度から構築するる。ニコチンは、タバコ葉における最も豊富なアルカロイドであるため、この較正曲線のための選り抜きの分子として選択される。較正曲線は、４００μＬの体積中に０．３７５、０．７５、１．５０、３、６、および１２μｇのニコチンを含み、標準として働いた（図３、下）。
本明細書において例示されるデータ全てについて、Ｐａｔｅｌ ｅｔ ａｌ．（２０１５），Ｉｎｔ Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ ７：２４９－２５１によって開発された分光光度法を、いくつかの改変を伴って適用する。簡潔に言えば、各々の単一の新鮮な葉ディスクまたは５０ｍｇの凍結乾燥葉材料から抽出されたアルカロイドを、２００μＬのリン酸緩衝液（ｐＨ ４．７）に再懸濁し、２００μＬのブロモクレゾールグリーン溶液（ＢＣＧ）（１ｍＭストック）と混合し、次いで、４００μＬのクロロホルムを添加してアルカロイドを抽出する。最後に、溶液の吸収スペクトルを、３５０～５５０ｎｍの領域においてＵＶ－ＶＩＳ Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＵＶ－１８００分光光度計で測定する（図３、上）。較正曲線を、溶液中のニコチンの濃度の関数として、４１５ｎｍでの最大吸光度から構築するる。ニコチンは、タバコ葉における最も豊富なアルカロイドであるため、この較正曲線のための選り抜きの分子として選択される。較正曲線は、４００μＬの体積中に０．３７５、０．７５、１．５０、３、６、および１２μｇのニコチンを含み、標準として働いた（図３、下）。
実施例７：直接的なニコチンの検出および定量
本明細書において例示されるデータ全てについて、葉におけるニコチンの具体的なレベルを定量するために、５０ｍｇの凍結乾燥材料から抽出されたアルカロイドを、水素炎イオン化検出器（ＦＩＤ）を備えたＳｈｉｍａｄｚｕ ＧＣ－２０１４ガスクロマトグラフィー装置でのＧＣ－ＦＩＤ分析に供する。３０ｍ、０．３２ｍｍ ＩＤ、および０．２５μｍのフィルムの厚さの溶融シリカキャピラリーカラム（Ｒｔｘ－５ Ｒｅｓｔｅｃｋ）を、１ｍＬ ｍｉｎ－１の流速で、キャリアガスとしてのＮ２と共に使用する。温度プロファイルは、２９０℃まで１２℃ ｍｉｎ－１の温度上昇率がその後続く、６０℃である。注入器および検出器の温度は２９０℃に設定し、注入体積は８μＬであり、スプリットは２０：１に設定する（図４）。この分析は、ニコチン濃度に対する装置の線形応答および１２．５μｇニコチンｍＬ－１の検出限界を示す。
本明細書において例示されるデータ全てについて、葉におけるニコチンの具体的なレベルを定量するために、５０ｍｇの凍結乾燥材料から抽出されたアルカロイドを、水素炎イオン化検出器（ＦＩＤ）を備えたＳｈｉｍａｄｚｕ ＧＣ－２０１４ガスクロマトグラフィー装置でのＧＣ－ＦＩＤ分析に供する。３０ｍ、０．３２ｍｍ ＩＤ、および０．２５μｍのフィルムの厚さの溶融シリカキャピラリーカラム（Ｒｔｘ－５ Ｒｅｓｔｅｃｋ）を、１ｍＬ ｍｉｎ－１の流速で、キャリアガスとしてのＮ２と共に使用する。温度プロファイルは、２９０℃まで１２℃ ｍｉｎ－１の温度上昇率がその後続く、６０℃である。注入器および検出器の温度は２９０℃に設定し、注入体積は８μＬであり、スプリットは２０：１に設定する（図４）。この分析は、ニコチン濃度に対する装置の線形応答および１２．５μｇニコチンｍＬ－１の検出限界を示す。
実施例８：ゲノムＤＮＡ ＰＣＲおよびＲＴ－ｑＰＣＲ
陽性ＲＮＡｉ形質転換体を特定して検証するために、カナマイシン選択可能マーカーの存在を、Ｐｈｉｒｅ Ｐｌａｎｔ Ｄｉｒｅｃｔ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｔｈｅｒｍｏ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ）を用いるゲノムＤＮＡ ＰＣＲによって試験する。ＰＣＲ反応のための実験条件は、以下であった：９５℃で５分間、次いで９５℃で６０秒間；６０℃で３０秒間；７２℃で６０秒間を含む３５サイクル、および７２℃で５分間。アグロインフィルトレーション後のタバコ葉における標的遺伝子の存在を、アガロースゲル（１％）においてゲノムＤＮＡ ＰＣＲ産物を分離することによって検証する。伸長因子１ａ（ＥＦ－１ａ）を、核にコードされる参照遺伝子として、発現の正規化に使用する。ＲＴ－ｑＰＣＲについては、２μＬのｃＤＮＡを使用し、各試料を以下の条件下で、三連で実施する：９５℃で２分間、次いで９５℃で１０秒間；６０℃で２０秒間；７２℃で２０秒間を含む３５サイクル、および７２℃で２分間。
陽性ＲＮＡｉ形質転換体を特定して検証するために、カナマイシン選択可能マーカーの存在を、Ｐｈｉｒｅ Ｐｌａｎｔ Ｄｉｒｅｃｔ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｔｈｅｒｍｏ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ）を用いるゲノムＤＮＡ ＰＣＲによって試験する。ＰＣＲ反応のための実験条件は、以下であった：９５℃で５分間、次いで９５℃で６０秒間；６０℃で３０秒間；７２℃で６０秒間を含む３５サイクル、および７２℃で５分間。アグロインフィルトレーション後のタバコ葉における標的遺伝子の存在を、アガロースゲル（１％）においてゲノムＤＮＡ ＰＣＲ産物を分離することによって検証する。伸長因子１ａ（ＥＦ－１ａ）を、核にコードされる参照遺伝子として、発現の正規化に使用する。ＲＴ－ｑＰＣＲについては、２μＬのｃＤＮＡを使用し、各試料を以下の条件下で、三連で実施する：９５℃で２分間、次いで９５℃で１０秒間；６０℃で２０秒間；７２℃で２０秒間を含む３５サイクル、および７２℃で２分間。
植物材料からの全ＲＮＡを、ＴＲＩ Ｒｅａｇｅｎｔ（登録商標）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いて単離する。ｃＤＮＡを、ＤＮａｓｅ Ｉ，ＲＮａｓｅ－ｆｒｅｅ（Ｔｈｅｒｍｏ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ）で処理された１μｇの全ＲＮＡから調製し、Ｍ－ＭｕＬＶ逆転写酵素（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ（登録商標）Ｉｎｃ．）で合成する。幼植物における発現レベルは、ＣＦＸ９６ ＴｏｕｃｈリアルタイムＰＣＲ検出システム（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）で試験する。反応混合物は、Ｌｕｎａ（登録商標）Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｑＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＮＥＢ）で調製し、各試料を以下の条件下で、三連で実施する：９５℃で２分間、次いで９５℃で１０秒間；６０℃で２０秒間；７２℃で２０秒間を含む４０サイクル、およびその後の融解曲線。これらの実験のために、様々な関心対象の遺伝子に特異的なプライマーを、Ｐｒｉｍｅｒ－ＢＬＡＳＴの援助で設計する（表１０）。
（表１０）様々な関心対象の遺伝子に特異的なプライマーおよび他のプライマー。プライマーＩＤがコード化されている。例えば、ＯＤＣ＿ｑＰＣＲ＿ＦＷは、ＯＤＣ遺伝子のためのｑＰＣＲにおいて使用されるフォワードプライマーを表す。プライマーは、全ての相同遺伝子が単一のプライマーペアによって認識されるように設計されている。
実施例９：ポリアミンの抽出および定量
本明細書において例示されるデータ全てについて、遊離ポリアミンを抽出するために、２５０ｍｇの新鮮な葉を均質化し、氷上で３０分間、１ｍＬの５％過塩素酸とインキュベートする。混合物を１２，０００ｇで１０分間、４℃で遠心分離し、０．８ｍＬの上清を新しい２ｍＬチューブに移す。この上清を、０．８ｍＬの過飽和炭酸ナトリウム溶液、４０μＬの０．５ｍＭ １，７－ヘプタンジアミン（ＨＤＴ）、および１０μＬのイソブチルクロロホルマートと混合する。３５℃で３０分間のインキュベーション後に、２００μＬのトルエンを添加し、よく混合し、１０，０００ｇで１分間遠心分離する。有機層の１００μＬのアリコートを、ＧＣ－ＦＩＤによる分析に使用する。
本明細書において例示されるデータ全てについて、遊離ポリアミンを抽出するために、２５０ｍｇの新鮮な葉を均質化し、氷上で３０分間、１ｍＬの５％過塩素酸とインキュベートする。混合物を１２，０００ｇで１０分間、４℃で遠心分離し、０．８ｍＬの上清を新しい２ｍＬチューブに移す。この上清を、０．８ｍＬの過飽和炭酸ナトリウム溶液、４０μＬの０．５ｍＭ １，７－ヘプタンジアミン（ＨＤＴ）、および１０μＬのイソブチルクロロホルマートと混合する。３５℃で３０分間のインキュベーション後に、２００μＬのトルエンを添加し、よく混合し、１０，０００ｇで１分間遠心分離する。有機層の１００μＬのアリコートを、ＧＣ－ＦＩＤによる分析に使用する。
ＧＣ－ＦＩＤ分析を、上記のように、水素炎イオン化検出器（ＦＩＤ）を備えたＳｈｉｍａｄｚｕ ＧＣ－２０１４ガスクロマトグラフィー装置で行う。この場合の温度プロファイルは、１３分間保持される３２０℃まで、３０℃ ｍｉｎ－１の温度上昇率がその後続く、１１０℃である。注入器および検出器の温度は２５０℃に設定し、注入体積は８μＬであり、スプリットは１５：１に設定する。較正曲線は、プトレシン（ＰＵＴ）、カダベリン（ＣＡＤ）、ＨＤＴ様内部標準、スペルミジン（Ｓｐｄ）、およびスペルミン（Ｓｐｍ）を用いて実行する。較正曲線は、これらの化合物の各々について１０、５、２．５、１．２５、および０．６２５ｍＭの濃度で上記の標準と共に測定する。
実施例１０：一過性発現の評価
それぞれの遺伝子発現に対するＲＮＡｉ構築物の効果を評価するために、同じ発達ステージにおけるタバコ植物由来の葉を、一過性発現の測定のためにアグロインフィルトレーションする。それぞれのＲＮＡｉ構築物（表８）を有する９つの異なるアグロバクテリウム・ツメファシエンス系統（Ａｔ－ＡＤＣ、Ａｔ－ＡＩＣ、Ａｔ－ＡＯ１、Ａｔ－ＡＯ２、Ａｔ－ＡＲＧ、Ａｔ－ＯＤＣ、Ａｔ－ＳＡＭＳ１、Ａｔ－ＳＡＭＳ２、およびＡｔ－ＳＡＭＳ３）ならびに対照系統を用いて、タバコ植物に接種する。プラスミドとの２日のインキュベーション後に、接種された葉を収穫し、液体窒素中で凍結し、使用する準備ができるまで－８０℃で保存する。全ＲＮＡを各葉試料から抽出し、ＲＴ－ｑＰＣＲ分析を行う。ｍＲＮＡレベルでの遺伝子発現のレベルを、対照のレベルと比較した、ＲＮＡｉ構築物の存在下での各遺伝子転写物のパーセンテージとして報告する。以下のレベルが認められる（平均値±標準誤差）：ＡＤＣ＝８８％（±１０％）、ＡＩＣ＝３３％（±２８％）、ＡＯ１＝６３％（±１４％）、ＡＯ２＝６７％（±３０％）、ＡＲＧ＝８４％（±１５％）、ＯＤＣ＝６２％（±１５％）、ＳＡＭＳ１＝６２％（±１０％）、ＳＡＭＳ２＝７０％（±１６％）、ＳＡＭＳ３＝６７％（±１７％）。これらの結果は、対応する遺伝子発現に対するＲＮＡｉ構築物の影響についての初期評価を提供する。
それぞれの遺伝子発現に対するＲＮＡｉ構築物の効果を評価するために、同じ発達ステージにおけるタバコ植物由来の葉を、一過性発現の測定のためにアグロインフィルトレーションする。それぞれのＲＮＡｉ構築物（表８）を有する９つの異なるアグロバクテリウム・ツメファシエンス系統（Ａｔ－ＡＤＣ、Ａｔ－ＡＩＣ、Ａｔ－ＡＯ１、Ａｔ－ＡＯ２、Ａｔ－ＡＲＧ、Ａｔ－ＯＤＣ、Ａｔ－ＳＡＭＳ１、Ａｔ－ＳＡＭＳ２、およびＡｔ－ＳＡＭＳ３）ならびに対照系統を用いて、タバコ植物に接種する。プラスミドとの２日のインキュベーション後に、接種された葉を収穫し、液体窒素中で凍結し、使用する準備ができるまで－８０℃で保存する。全ＲＮＡを各葉試料から抽出し、ＲＴ－ｑＰＣＲ分析を行う。ｍＲＮＡレベルでの遺伝子発現のレベルを、対照のレベルと比較した、ＲＮＡｉ構築物の存在下での各遺伝子転写物のパーセンテージとして報告する。以下のレベルが認められる（平均値±標準誤差）：ＡＤＣ＝８８％（±１０％）、ＡＩＣ＝３３％（±２８％）、ＡＯ１＝６３％（±１４％）、ＡＯ２＝６７％（±３０％）、ＡＲＧ＝８４％（±１５％）、ＯＤＣ＝６２％（±１５％）、ＳＡＭＳ１＝６２％（±１０％）、ＳＡＭＳ２＝７０％（±１６％）、ＳＡＭＳ３＝６７％（±１７％）。これらの結果は、対応する遺伝子発現に対するＲＮＡｉ構築物の影響についての初期評価を提供する。
実施例１１：ゲノム形質転換体のスクリーニング
約１２０のＴ０ ＲＮＡｉおよび対照植物を、それらが約１０ｃｍの高さに達するまで、最初にインビトロで実験室において栽培する。これらを、抗生物質抵抗性について選択し、ＲＮＡｉトランスジーンの存在についてＰＣＲ分析によってさらに試験する。それらを、土壌における生育のため、および自家受精によるＴ１種子生成のために温室に移す。Ｔ１種子を、収穫し、滅菌し、かつカナマイシンの存在下で、最初にインビトロで実験室において発芽させる。発出するＴ１幼植物由来の葉試料を試験して、ＲＴ－ｑＰＣＲによって標的遺伝子発現のレベルを評価する（図５）。転写物レベルを、野生型における対応する転写物レベルの割合（％）としてプロットし、こうして、Ｔ１ ＲＮＡｉ形質転換体タバコ植物における遺伝子発現の尺度、およびまた遺伝子発現下方制御に対するＲＮＡｉアプローチの有効性の尺度を提供する。結果は、ＡＤＣ、ＡＩＣ、ＡＯ、およびＯＤＣのＲＮＡｉ形質転換に由来する全ての独立した事象株について、野生型における転写物レベルの１％という低さに達する、実質的により低い転写物レベルを示す（図５）。ＡＲＧおよびＳＡＭＳの形質転換体株は、混合したかつ／または一貫していない結果を示し、いくつかの株は野生型と同等の転写物レベルを有し、他の株は実質的により低いレベルを示す。より低いレベルの標的遺伝子の発現を有する、各形質転換事象由来の最低３つの植物を、温室におけるさらなる生育およびその後の分析のために選択する。合計で、９つのＲＮＡｉ構築物を含む３６株および野生型を評価する。各ＲＮＡｉ構築物による形質転換体の具体的な数を、表１１および図５（ＲＮＡｉ形質転換体株）に示す。ＡＤＣ、ＡＯ２、およびＳＡＭＳ１については、独立した事象由来の３株のみを検討するが、ＯＤＣ ＲＮＡｉ形質転換体については、独立した事象由来の６株を検討する。他のＲＮＡｉ形質転換体の場合は、独立した事象由来の中間の数の株を検討する（表１１）。
約１２０のＴ０ ＲＮＡｉおよび対照植物を、それらが約１０ｃｍの高さに達するまで、最初にインビトロで実験室において栽培する。これらを、抗生物質抵抗性について選択し、ＲＮＡｉトランスジーンの存在についてＰＣＲ分析によってさらに試験する。それらを、土壌における生育のため、および自家受精によるＴ１種子生成のために温室に移す。Ｔ１種子を、収穫し、滅菌し、かつカナマイシンの存在下で、最初にインビトロで実験室において発芽させる。発出するＴ１幼植物由来の葉試料を試験して、ＲＴ－ｑＰＣＲによって標的遺伝子発現のレベルを評価する（図５）。転写物レベルを、野生型における対応する転写物レベルの割合（％）としてプロットし、こうして、Ｔ１ ＲＮＡｉ形質転換体タバコ植物における遺伝子発現の尺度、およびまた遺伝子発現下方制御に対するＲＮＡｉアプローチの有効性の尺度を提供する。結果は、ＡＤＣ、ＡＩＣ、ＡＯ、およびＯＤＣのＲＮＡｉ形質転換に由来する全ての独立した事象株について、野生型における転写物レベルの１％という低さに達する、実質的により低い転写物レベルを示す（図５）。ＡＲＧおよびＳＡＭＳの形質転換体株は、混合したかつ／または一貫していない結果を示し、いくつかの株は野生型と同等の転写物レベルを有し、他の株は実質的により低いレベルを示す。より低いレベルの標的遺伝子の発現を有する、各形質転換事象由来の最低３つの植物を、温室におけるさらなる生育およびその後の分析のために選択する。合計で、９つのＲＮＡｉ構築物を含む３６株および野生型を評価する。各ＲＮＡｉ構築物による形質転換体の具体的な数を、表１１および図５（ＲＮＡｉ形質転換体株）に示す。ＡＤＣ、ＡＯ２、およびＳＡＭＳ１については、独立した事象由来の３株のみを検討するが、ＯＤＣ ＲＮＡｉ形質転換体については、独立した事象由来の６株を検討する。他のＲＮＡｉ形質転換体の場合は、独立した事象由来の中間の数の株を検討する（表１１）。
総アルカロイド含有量の予備測定を、表１１で参照されるＴ１ Ｄｉｘｉｅカップ幼植物の各々において行う。図６は、温室に移すために選択したこれらの３６株の値を示す。この早期栄養ステージにおいては、ＡＯ１ ＲＮＡｉ株と、ＯＤＣ ＲＮＡｉ株のいくつかのみが、野生型対照（ＷＴ）と比較して、有意により低い総アルカロイド含有量を示す。対照的に、全てのＡＯ２ ＲＮＡｉ株およびＳＡＭＳ ＲＮＡｉ株は、野生型（ＷＴ）よりも有意に高いアルカロイド含有量の値を示す。その後の測定は、早期出芽ステージ後に温室において生育させた成熟植物で、より後の発達ステージで行う（図７）。この植物発達ステージでは、有意により高いアルカロイド含有量の値を示し続けたＡＯ２株およびＡＤＣ株のいくつかを除いて、トランスジェニック株のほとんどにおける総アルカロイドの含有量は、対照（ＷＴ）と比較して低い。
（表１１）成熟タバコ植物由来の完全に広がった葉において検出される、最も低いレベルの転写物を有するＲＮＡｉ構築物およびＲＮＡｉ形質転換体株
実施例１２：葉のニコチン分析
ニコチンの定量のために、花の頭および上部から最初の完全に広がった葉までのシュートを除去する。この摘心の２週間後に、上部から３番目および４番目の葉を収穫し、中肋を除去し、葉を液体窒素中で凍結して凍結乾燥する。試料を粉砕し、総アルカロイド抽出に使用する。各Ｔ１株由来の３つの生物学的レプリケートにおける葉の平均ニコチン含有量を、図８に示す。ＡＯ１－ＲＮＡｉおよびＡＯ２－ＲＮＡｉを発現する形質転換体は全て、対照（ＷＴ）と比較して最も低い値のニコチンを有する。対照は、ＤＷのｇ当たり３．９±１．３ｍｇのＮＣＴを有していた。ＡＯ１－ＲＮＡｉ株のニコチン含有量範囲は、ＤＷのｇ当たり０～０．２６ｍｇ ＮＣＴの間で変動する。ＡＯ２－ＲＮＡｉ株のニコチン含有量範囲は、ＤＷのｇ当たり０．３０～０．６４ｍｇ ＮＣＴの間で変動する。次に最も有意なニコチン含有量の抑制は、ＯＤＣ－ＲＮＡｉ株１、１３、１４、および１５において観察される。また、ＡＤＣ－ＲＮＡｉは、野生型ニコチン含有量よりも低い、少なくとも２つの株を有する。対照的に、株ＡＩＣ－ＲＮＡｉ、ＡＲＧ－ＲＮＡｉ、およびＳＡＭＳ２－ＲＮＡｉは、野生型対照と比較して有意な差を示さない。
ニコチンの定量のために、花の頭および上部から最初の完全に広がった葉までのシュートを除去する。この摘心の２週間後に、上部から３番目および４番目の葉を収穫し、中肋を除去し、葉を液体窒素中で凍結して凍結乾燥する。試料を粉砕し、総アルカロイド抽出に使用する。各Ｔ１株由来の３つの生物学的レプリケートにおける葉の平均ニコチン含有量を、図８に示す。ＡＯ１－ＲＮＡｉおよびＡＯ２－ＲＮＡｉを発現する形質転換体は全て、対照（ＷＴ）と比較して最も低い値のニコチンを有する。対照は、ＤＷのｇ当たり３．９±１．３ｍｇのＮＣＴを有していた。ＡＯ１－ＲＮＡｉ株のニコチン含有量範囲は、ＤＷのｇ当たり０～０．２６ｍｇ ＮＣＴの間で変動する。ＡＯ２－ＲＮＡｉ株のニコチン含有量範囲は、ＤＷのｇ当たり０．３０～０．６４ｍｇ ＮＣＴの間で変動する。次に最も有意なニコチン含有量の抑制は、ＯＤＣ－ＲＮＡｉ株１、１３、１４、および１５において観察される。また、ＡＤＣ－ＲＮＡｉは、野生型ニコチン含有量よりも低い、少なくとも２つの株を有する。対照的に、株ＡＩＣ－ＲＮＡｉ、ＡＲＧ－ＲＮＡｉ、およびＳＡＭＳ２－ＲＮＡｉは、野生型対照と比較して有意な差を示さない。
実施例１３：ポリアミンプロファイル
ポリアミンの決定のための試料を、ニコチン分析用の試料の場合と同様に、摘心された植物から採取する。図９ａは、様々なＲＮＡｉ株における平均プトレシン含有量を示す。野生型と比較して、ＡＤＣ－ＲＮＡｉ株およびＯＤＣ－ＲＮＡｉ株は、有意により低い含有量のＰＵＴを有し、他方、ＡＩＣ－ＲＮＡｉ株、ＡＲＧ－ＲＮＡｉ株、およびＳＡＭＳ－ＲＮＡｉ株は、対照において測定されたレベルと等価のプトレシンのレベルを有する（図９Ａ、ＷＴ）。プトレシンレベルは、ＯＤＣ－ＲＮＡｉ株よりもＡＤＣ－ＲＮＡｉ株においてより低いように見えるが、２つの測定値における不確定性（エラーバー）によって、そのような明確な結論を引き出すことが阻止される。ＲＮＡｉ形質転換体のスペルミジン（図９ｂ）およびカダベリン（図９Ｃ）の含有量は、統計的に対照の含有量から不変である。
ポリアミンの決定のための試料を、ニコチン分析用の試料の場合と同様に、摘心された植物から採取する。図９ａは、様々なＲＮＡｉ株における平均プトレシン含有量を示す。野生型と比較して、ＡＤＣ－ＲＮＡｉ株およびＯＤＣ－ＲＮＡｉ株は、有意により低い含有量のＰＵＴを有し、他方、ＡＩＣ－ＲＮＡｉ株、ＡＲＧ－ＲＮＡｉ株、およびＳＡＭＳ－ＲＮＡｉ株は、対照において測定されたレベルと等価のプトレシンのレベルを有する（図９Ａ、ＷＴ）。プトレシンレベルは、ＯＤＣ－ＲＮＡｉ株よりもＡＤＣ－ＲＮＡｉ株においてより低いように見えるが、２つの測定値における不確定性（エラーバー）によって、そのような明確な結論を引き出すことが阻止される。ＲＮＡｉ形質転換体のスペルミジン（図９ｂ）およびカダベリン（図９Ｃ）の含有量は、統計的に対照の含有量から不変である。
実施例１４：ＲＮＡｉ形質転換体の葉の表現型
葉の表現型における差異が、様々な形質転換体と野生型対照との間で認められる。全てのＡＩＣ－ＲＮＡｉ株において（図１０ａ）、完全に広がった最も古い（下の）葉は、黄色、および次いで赤褐色の呈色への時期尚早な変化を示す。それらは最初に、同心性の輪紋を発達させ、これが、拡大して合併し、老化を思い出させる組織のより大きな葉の区域を形成する。概して、成熟した最も古い（下の）葉の光合成生存率は、ＡＩＣ－ＲＮＡｉ構築物を発現する植物において負の影響を受ける。この現象学は、下葉に限定されており、アルカロイド、ニコチン、およびポリアミンの分析のために試料採取された葉を含めて、これらの植物の上葉には影響を及ぼさないように見える。
葉の表現型における差異が、様々な形質転換体と野生型対照との間で認められる。全てのＡＩＣ－ＲＮＡｉ株において（図１０ａ）、完全に広がった最も古い（下の）葉は、黄色、および次いで赤褐色の呈色への時期尚早な変化を示す。それらは最初に、同心性の輪紋を発達させ、これが、拡大して合併し、老化を思い出させる組織のより大きな葉の区域を形成する。概して、成熟した最も古い（下の）葉の光合成生存率は、ＡＩＣ－ＲＮＡｉ構築物を発現する植物において負の影響を受ける。この現象学は、下葉に限定されており、アルカロイド、ニコチン、およびポリアミンの分析のために試料採取された葉を含めて、これらの植物の上葉には影響を及ぼさないように見える。
ＡＯ１－ＲＮＡｉ株のいくつかのみにおいて（図１０ｂ）、完全に広がった最も古い（下の）葉はまた、黄色に変わり、白い斑点を発達させ、これは後に、赤褐色になる。この表現型を発達させる株（ＡＯ１株７、１０、および１１）は、上葉において最も低いレベルのニコチン含有量を有する株である。興味深いことに、ＡＯ－２－ＲＮＡｉ植物のいずれも、早期老化表現型を発達させない。
上記のこれらの呈色変化は、これらの形質転換体の最も古い葉に影響を及ぼすのに対して、アルカロイドおよびニコチンの分析のために収穫される上部から３番目および４番目の葉を含む、より上位の葉は、野生型対照と非常によく似て、正常に緑色の色素沈着および他の点で健康な表現型を有することに注目すべきである。
実施例１５：植物データの結論
上記の例示される結果は、タバコ葉におけるニコチン含有量が、ＲＮＡｉ形状でアルギニンデカルボキシラーゼ（ＡＤＣ）、オルニチンデカルボキシラーゼ（ＯＤＣ）、およびアスパラギン酸オキシダーゼ（ＡＯ）を発現する植物において最大限減衰されることを示す。ＯＤＣの結果は、酵素オルニチンデカルボキシラーゼ（ＯＤＣ）によって触媒されるオルニチンからプトレシンへの反応（図１１）が、アルカロイドおよびニコチンの生合成および蓄積における重要な段階であることを支持する。結果はまた、ニコチン酸およびニコチンアミドの代謝経路もまた、図１１に模式的に示される推定プロセスにおいて、ニコチンの合成および蓄積において重要であることを示す。逆に、結果は、アルギニンおよびプロリンの代謝の段階、ならびにアグマチンデイミナーゼ（ＡＩＣ）およびアルギナーゼ（ＡＲＧ）を含む関連した酵素（図１１）は、葉のニコチンレベルの決定において有意な役割を果たさないという考えを強くする。中間のニコチン減衰効果が、Ｓ’アデノシル－Ｌ：－メチオニン（ＳＡＭ）シンターゼ酵素のＲＮＡｉ媒介性下方制御時に認められ、メチオニンからスペルミジンへ、プトレシンへもまた、ニコチンの合成および蓄積に寄与し得ることを示唆する。要約すると、本明細書に提示される結果は、様々な異なる酵素によって触媒される複数の異なる生合成経路が、タバコの商用栽培品種においてニコチン生合成に向けて基質を供給し得ることを示唆する。
上記の例示される結果は、タバコ葉におけるニコチン含有量が、ＲＮＡｉ形状でアルギニンデカルボキシラーゼ（ＡＤＣ）、オルニチンデカルボキシラーゼ（ＯＤＣ）、およびアスパラギン酸オキシダーゼ（ＡＯ）を発現する植物において最大限減衰されることを示す。ＯＤＣの結果は、酵素オルニチンデカルボキシラーゼ（ＯＤＣ）によって触媒されるオルニチンからプトレシンへの反応（図１１）が、アルカロイドおよびニコチンの生合成および蓄積における重要な段階であることを支持する。結果はまた、ニコチン酸およびニコチンアミドの代謝経路もまた、図１１に模式的に示される推定プロセスにおいて、ニコチンの合成および蓄積において重要であることを示す。逆に、結果は、アルギニンおよびプロリンの代謝の段階、ならびにアグマチンデイミナーゼ（ＡＩＣ）およびアルギナーゼ（ＡＲＧ）を含む関連した酵素（図１１）は、葉のニコチンレベルの決定において有意な役割を果たさないという考えを強くする。中間のニコチン減衰効果が、Ｓ’アデノシル－Ｌ：－メチオニン（ＳＡＭ）シンターゼ酵素のＲＮＡｉ媒介性下方制御時に認められ、メチオニンからスペルミジンへ、プトレシンへもまた、ニコチンの合成および蓄積に寄与し得ることを示唆する。要約すると、本明細書に提示される結果は、様々な異なる酵素によって触媒される複数の異なる生合成経路が、タバコの商用栽培品種においてニコチン生合成に向けて基質を供給し得ることを示唆する。
実施例１６：ランダム変異誘発
タバコ植物のランダム変異誘発は、エチルメタンスルホナート（ＥＭＳ）変異誘発または高速中性子衝撃を用いて行われる。ＥＭＳ変異誘発は、ゲノムの長さにわたってランダムな点変異を化学的に誘導することからなる。高速中性子変異誘発は、種子を中性子衝撃に曝露することからなり、これは、二本鎖ＤＮＡ切断を通じて大きな欠失を引き起こす。
タバコ植物のランダム変異誘発は、エチルメタンスルホナート（ＥＭＳ）変異誘発または高速中性子衝撃を用いて行われる。ＥＭＳ変異誘発は、ゲノムの長さにわたってランダムな点変異を化学的に誘導することからなる。高速中性子変異誘発は、種子を中性子衝撃に曝露することからなり、これは、二本鎖ＤＮＡ切断を通じて大きな欠失を引き起こす。
ＥＭＳ変異誘発のために、１グラム（およそ１０，０００種子）のＴｅｎｎｅｓｓｅｅ９０タバコ（ＴＮ９０）種子を、０．１％Ｔｗｅｅｎにおいて１５分間洗浄し、次いで３０ｍｌのｄｄＨ２Ｏに２時間浸す。次いで、１５０μｌの０．５％ＥＭＳ（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｍ－０８８０）を種子／ｄｄＨ２Ｏ溶液中に混合し、８～１２時間（３０ｒｐｍで回転しながら）フードの下、室温（ＲＴ；およそ２０℃）でインキュベートする。次いで、液体を種子から除去して、除染および処分のために１Ｍ ＮａＯＨ中に一晩混合する。次いで、種子を１００ｍｌ ｄｄＨ２Ｏで２～４時間、２回洗浄する。次いで、洗浄された種子を、０．１％寒天溶液に懸濁した。
寒天溶液中のＥＭＳ処理された種子を、フラット（ｆｌａｔ）中の水に浸されたＣａｒｏｌｉｎａ’ｓ Ｃｈｏｉｃｅ Ｔｏｂａｃｃｏ Ｍｉｘ（Ｃａｒｏｌｉｎａ Ｓｏｉｌ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｋｉｎｓｔｏｎ，ＮＣ）上に、約２０００種子／フラットで均一に広げる。次いで、フラットをプラスチックラップで覆い、生育チャンバーに置く。幼植物が土壌から出てきたら、プラスチックラップに穴を開けて、湿度を徐々に低下させる。プラスチックラップは、２週間後に完全に除去する。フラットを温室に移動し、ＮＰＫ肥料で施肥する。幼植物を、フロートトレイ中に再び差し込み、移植サイズまで生育させる。その後、植物を畑に移植する。生育中に、植物は自家受粉して、Ｍ１種子を形成する。成熟ステージで、５つのさく果を各植物から収穫し、各植物由来の種子のセットに個別の呼称を与える。これは、Ｍ１集団を形成する。各Ｍ０植物由来のＭ１種子の複合物を生育させ、Ｍ１植物由来の葉を、ＤＮＡ抽出のために収集する。標的遺伝子を増幅し、変異特定のためにシークエンシングする。変異を、ＡＤＣ、ＡＯ、およびＯＤＣ遺伝子全てに焦点を合わせて、表８および９に列記される遺伝子の各々において特定する。より高次の変異の組み合わせもまた、例えば、両方ともＡＤＣ遺伝子、両方ともＯＤＣ遺伝子中の二重変異体、または３つ全てＡＯ遺伝子中の三重変異体を達成するために作製する。
実施例１７：標的指向性変異誘発
低ニコチンを有するタバコ株は、正確なゲノム操作技術、例えば、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、およびＣＲＩＳＰＲ（Ｃａｓ９システム、Ｃｐｆ１システム、またはＣｓｍ１システム）を介して、表８および９に列記される標的遺伝子の各々においておよびその辺りに変異を導入することによって作製される。ゲノム改変は、ＴＮ９０、Ｋ３２６、およびＮａｒｒｏｗ Ｌｅａｆ Ｍａｄｏｌｅなどの商用タバコ品種においてなされる。表８および９に列記される全ての遺伝子が編集され、ＡＤＣ、ＡＯ、およびＯＤＣ遺伝子に焦点を合わせる。
低ニコチンを有するタバコ株は、正確なゲノム操作技術、例えば、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、およびＣＲＩＳＰＲ（Ｃａｓ９システム、Ｃｐｆ１システム、またはＣｓｍ１システム）を介して、表８および９に列記される標的遺伝子の各々においておよびその辺りに変異を導入することによって作製される。ゲノム改変は、ＴＮ９０、Ｋ３２６、およびＮａｒｒｏｗ Ｌｅａｆ Ｍａｄｏｌｅなどの商用タバコ品種においてなされる。表８および９に列記される全ての遺伝子が編集され、ＡＤＣ、ＡＯ、およびＯＤＣ遺伝子に焦点を合わせる。
例えば、ＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡを、特異的な標的配列を認識するように設計して合成する。次いで、ガイドＲＮＡ、およびＣａｓ９、Ｃｐｆ１、またはＣｓｍ１タンパク質をコードする付随する核酸（ＤＮＡプラスミド形態としてまたはｍＲＮＡ形態としてのいずれか）を用いて、タバコプロトプラストを形質転換する。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９／Ｃｐｆ１／Ｃｓｍ１リボ核タンパク質複合体は、特異的なＮＣＧ標的配列を認識し、二本鎖切断（ＤＳＢ）を導入する。内因性非相同末端結合（ＮＨＥＪ）ＤＮＡ修復システムは、ＤＳＢを修正し、これが、ヌクレオチドの欠失、挿入、または置換を導入して、潜在的な機能喪失変異を結果としてもたらし得る。代替的に、所望の配列を有するドナー核酸分子が、ＣＲＩＳＰＲ標的部位でまたはその辺りで所望の配列を導入するための鋳型分子として働くように、プロトプラスト形質転換に含まれる。
タバコプロトプラストは、生育チャンバー中のマゼンタボックスにおいて生育するＴＮ９０タバコ葉から単離する。３～４週齢の植物由来の十分に広がった葉（５ｃｍ）を、葉の中央部分から０．５～１ｍｍの葉細片にカットする。葉細片を、細片の両側を少し浸すことによって、調製された酵素溶液（１％セルラーゼＲ１０、０．２５％マセロザイム（ｍａｃｅｒｏｚｙｍｅ）Ｒ１０、０．４Ｍマンニトール、２０ｍＭ ＫＣｌ、２０ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ５．７）、１０ｍＭ ＣａＣｌ２、０．１％ＢＳＡ）中に移す。葉細片を、デシケーターを用いて暗所で３０分間真空浸透させ、暗所で４時間から一晩、室温で振盪せずに消化を続ける。プロトプラストを、１００μｍのナイロンフィルターで濾過し、３ｍｌのＬｙｍｐｈｏｐｒｅｐで精製する。プロトプラストを遠心分離し、Ｗ５ｎ溶液（１５４ｍＭ ＮａＣｌ、１２５ｍＭ ＣａＣｌ２、５ｍＭ ＫＣｌ、２ｍＭ ＭＥＳ、９９１ｍｇ／ｌグルコース、ｐＨ５．７）で洗浄し、５×１０５／ｍｌの濃度でＷ５ｎ溶液に懸濁する。プロトプラストを、重力によりチューブの底に沈殿するように氷上で３０分間保つ。Ｗ５ｎ溶液を移動させ、プロトプラストを、室温でＰ２溶液に再懸濁する。５０μｌのＤＮＡ（１０～２０μｇのプラスミド）、５００μｌのプロトプラスト（２×１０５のプロトプラスト）、および５５０μｌのＰＥＧ溶液（４０％、ｖ／ｖ １０ｍｌ ４ｇ ＰＥＧ４０００、０．２Ｍマンニトール、０．１Ｍ ＣａＣｌ２）を、１５－ｍｌマイクロチューブにおいて穏やかに混合し、混合物を室温で５分間インキュベートする。
プロトプラストを、ペレット化し、１ｍｌの２×８ＥＮ１（８ＥＮ１：ＮＨ４ＮＯ３を含まないＭＳ塩、ＭＳビタミン、０．２％ｍｙｏ－イノシトール、４ｍＭ ＭＥＳ、１ｍｇ／ｌ ＮＡＡ、１ｍｇ／ｌ ＩＡＡ、０．５Ｍマンニトール、０．５ｍｇ／ｌ ＢＡＰ、１．５％スクロース）で再懸濁する。形質転換されたプロトプラストを、等量の低融点アガロース（ＬＭＡ）でゼリー状にし、ビーズを形成するように０．２ｍｌのプロトプラスト－ＬＡＭを滴下する。１０ｍｌの８ＥＮ１をビーズに添加し、７日で、５ｍｌの８ＥＮ１を取り出し、５ｍｌの８ＥＮ２（０．２５Ｍマンニトールを含む８ＥＮ１）を添加する；さらに７日（１４日）後に、１０ｍｌの８ＥＮ２を取り出し、１０ｍｌの８ＥＮ２を添加する；さらに７日（２１日）で、５ｍｌの８ＥＮ２を取り出し、５ｍｌの８ＥＮ３（３％スクロースを含み、マンニトールを含まない８ＥＮ１）を添加する；さらに７日（２８日）後に、１０ｍｌの８ＥＮ３を取り出し、１０ｍｌの８ＥＮ３を添加する。マイクロカルスの生育まで、プロトプラストを２週間保つ。カルスを、約５ｍｍに達するまで（通常は約２週間）ＮＣＭ固形培地に移す。カルスを、ＴＯＭ－Ｋａｎ固形培地に移してシュートを生育させ、形質転換されたタバコ植物を、本明細書に記載される方法を用いて再生させた。カルスまたは再生された植物を、標的遺伝子中の所望の変異を有する遺伝子編集事象について試験して選択する。機能喪失アレル（例えば、早期終止コドンもしくはフレームシフト）または他のタイプの変異（例えば、機能獲得もしくは新形態）の両方が、生成される。
実施例１８：関連参考文献
Claims (150)
- （ａ）遺伝子中の遺伝子改変；または
（ｂ）該遺伝子を標的とする遺伝子改変
を含む、改変タバコ植物またはその部分であって、
該遺伝子改変が、該遺伝子の発現または活性を下方制御し、該遺伝子が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９～３６からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有する核酸配列をコードする、
改変タバコ植物またはその部分。 - 前記遺伝子改変が、前記遺伝子中にある、請求項１に記載の改変タバコ植物またはその部分。
- 前記遺伝子改変が、前記遺伝子を標的とする、請求項１に記載の改変タバコ植物またはその部分。
- 前記ポリヌクレオチド配列が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９、２０、２３～２６、２９、および３０からなる群から選択される、請求項１～３のいずれか一項に記載の改変タバコ植物またはその部分。
- 前記改変タバコ植物が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９および２０からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有する核酸配列をコードする該改変タバコ植物における全ての遺伝子中の遺伝子改変または該全ての遺伝子を標的とする遺伝子改変を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の改変タバコ植物またはその部分。
- 前記改変タバコ植物が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３～２６からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有する核酸配列をコードする該改変タバコ植物における全ての遺伝子中の遺伝子改変または該全ての遺伝子を標的とする遺伝子改変を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の改変タバコ植物またはその部分。
- 前記改変タバコ植物が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５および２６からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有する核酸配列をコードする該改変タバコ植物における全ての遺伝子中の遺伝子改変または該全ての遺伝子を標的とする遺伝子改変を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の改変タバコ植物またはその部分。
- 前記改変タバコ植物が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９および３０からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有する核酸配列をコードする該改変タバコ植物における全ての遺伝子中の遺伝子改変または該全ての遺伝子を標的とする遺伝子改変を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の改変タバコ植物またはその部分。
- ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～３６からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するポリヌクレオチド中に非天然変異を含む、改変タバコ植物またはその部分。
- 前記ポリヌクレオチド配列が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、２、５～８、１１、１２、１９、２０、２３～２６、２９、および３０からなる群から選択される、請求項９に記載の改変タバコ植物またはその部分。
- 前記改変タバコ植物が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、２、１９、および２０からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有する該改変タバコ植物におけるポリヌクレオチドの各々において非天然変異を含む、請求項９に記載の改変タバコ植物またはその部分。
- 前記改変タバコ植物が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１および２からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有する該改変タバコ植物におけるポリヌクレオチドの各々において非天然変異を含む、請求項９に記載の改変タバコ植物またはその部分。
- 前記改変タバコ植物が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５～８および２３～２６からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有する該改変タバコ植物におけるポリヌクレオチドの各々において非天然変異を含む、請求項９に記載の改変タバコ植物またはその部分。
- 前記改変タバコ植物が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７～８および２５～２６からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有する該改変タバコ植物におけるポリヌクレオチドの各々において非天然変異を含む、請求項９に記載の改変タバコ植物またはその部分。
- 前記改変タバコ植物が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７～８からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有する該改変タバコ植物におけるポリヌクレオチドの各々において非天然変異を含む、請求項９に記載の改変タバコ植物またはその部分。
- 前記改変タバコ植物が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１、１２、２９、および３０からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有する該改変タバコ植物におけるポリヌクレオチドの各々において非天然変異を含む、請求項９に記載の改変タバコ植物またはその部分。
- 前記改変タバコ植物が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１および１２からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有する該改変タバコ植物におけるポリヌクレオチドの各々において非天然変異を含む、請求項９に記載の改変タバコ植物またはその部分。
- 非コーディングＲＮＡ分子をコードするポリヌクレオチドに機能的に連結された異種プロモーターを含む組換え核酸構築物を含む、改変タバコ植物またはその部分であって、
該非コーディングＲＮＡ分子が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９～３６からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するｍＲＮＡに結合することができ、該非コーディングＲＮＡ分子が、該ｍＲＮＡのレベルまたは翻訳を抑制する、
改変タバコ植物またはその部分。 - 前記ポリヌクレオチド配列が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９、２０、２３～２６、２９、および３０からなる群から選択される、請求項１８に記載の改変タバコ植物またはその部分。
- （ａ）遺伝子中の遺伝子改変；または
（ｂ）該遺伝子を標的とする遺伝子改変
を含む、改変タバコ植物またはその部分であって、
該遺伝子改変が、該遺伝子の発現または活性を下方制御し、該遺伝子が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７～５４からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、または１００％の同一性または類似性を有するポリペプチドをコードする、
改変タバコ植物またはその部分。 - 前記遺伝子改変が、前記遺伝子中にある、請求項２０に記載の改変タバコ植物またはその部分。
- 前記遺伝子改変が、前記遺伝子を標的とする、請求項２０に記載の改変タバコ植物またはその部分。
- 前記アミノ酸配列が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７、３８、４１～４４、４７、および４８からなる群から選択される、請求項２０～２３のいずれか一項に記載の改変タバコ植物またはその部分。
- 前記改変タバコ植物が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７および３８からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、または１００％の同一性または類似性を有するポリペプチドをコードする該改変タバコ植物における全ての遺伝子中の遺伝子改変または該全ての遺伝子を標的とする遺伝子改変を含む、請求項２０～２３のいずれか一項に記載の改変タバコ植物またはその部分。
- 前記改変タバコ植物が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１～４４からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、または１００％の同一性または類似性を有するポリペプチドをコードする該改変タバコ植物における全ての遺伝子中の遺伝子改変または該全ての遺伝子を標的とする遺伝子改変を含む、請求項２０～２３のいずれか一項に記載の改変タバコ植物またはその部分。
- 前記改変タバコ植物が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３～４４からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、または１００％の同一性または類似性を有するポリペプチドをコードする該改変タバコ植物における全ての遺伝子中の遺伝子改変または該全ての遺伝子を標的とする遺伝子改変を含む、請求項２０～２３のいずれか一項に記載の改変タバコ植物またはその部分。
- 前記改変タバコ植物が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７～４８からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、または１００％の同一性または類似性を有するポリペプチドをコードする該改変タバコ植物における全ての遺伝子中の遺伝子改変または該全ての遺伝子を標的とする遺伝子改変を含む、請求項２０～２３のいずれか一項に記載の改変タバコ植物またはその部分。
- ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７～５４からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、または１００％の同一性または類似性を有するポリペプチドをコードする核酸配列を有するポリヌクレオチド中に非天然変異を含む、改変タバコ植物またはその部分。
- 前記アミノ酸配列が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７、３８、４１～４４、４７、および４８からなる群から選択される、請求項２８に記載の改変タバコ植物またはその部分。
- 前記改変タバコ植物が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７および３８からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するポリペプチドをコードする該改変タバコ植物におけるポリヌクレオチドの各々において非天然変異を含む、請求項２８に記載の改変タバコ植物またはその部分。
- 前記改変タバコ植物が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１～４４からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するポリペプチドをコードする該改変タバコ植物におけるポリヌクレオチドの各々において非天然変異を含む、請求項２８に記載の改変タバコ植物またはその部分。
- 前記改変タバコ植物が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３～４４からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するポリペプチドをコードする該改変タバコ植物におけるポリヌクレオチドの各々において非天然変異を含む、請求項２８に記載の改変タバコ植物またはその部分。
- 前記改変タバコ植物が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７～４８からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するポリペプチドをコードする該改変タバコ植物におけるポリヌクレオチドの各々において非天然変異を含む、請求項２８に記載の改変タバコ植物またはその部分。
- 非コーディングＲＮＡ分子をコードするポリヌクレオチドに機能的に連結された異種プロモーターを含む組換え核酸構築物を含む、改変タバコ植物またはその部分であって、
該非コーディングＲＮＡ分子が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７～５４からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、または１００％の同一性または類似性を有するポリペプチドをコードするＲＮＡに結合することができ、該非コーディングＲＮＡ分子が、該ポリペプチドの発現を抑制する、
改変タバコ植物またはその部分。 - 前記アミノ酸配列が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７、３８、４１～４４、４７、および４８からなる群から選択される、請求項３４に記載の改変タバコ植物またはその部分。
- 前記タバコ植物が、ニコチアナ・タバカム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ）植物である、請求項１～３５のいずれか一項に記載の改変タバコ植物またはその部分。
- 前記改変タバコ植物が、前記遺伝子改変または変異または組換え核酸構築物を有しない対照植物と比べて、低減したレベルのニコチンを含む、請求項３６に記載の改変タバコ植物またはその部分。
- 前記改変タバコ植物が、低アルカロイドタバコ植物である、請求項３７に記載の改変タバコ植物またはその部分。
- 前記改変タバコ植物が、乾燥させた場合に、類似の条件で生育および乾燥させた場合の前記対照植物の同等の葉のＵＳＤＡグレード指数値と同等のまたはより高いＵＳＤＡグレード指数値を有する葉を生成する、請求項３７に記載の改変タバコ植物またはその部分。
- より高いＵＳＤＡグレード指数値が、前記対照植物の前記同等の葉のＵＳＤＡグレード指数値よりも少なくとも２００％、１５０％、１００％、９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１７．５％、１５％、１２．５％、１０％、７．５％、または５％高い、請求項３９に記載の改変タバコ植物またはその部分。
- 前記改変タバコ植物が、ジアミンオキシダーゼ、メチルプトレシンオキシダーゼ（ＭＰＯ）、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ、ホスホリボシルアントラニル酸イソメラーゼ（ＰＲＡＩ）、プトレシンＮ－メチルトランスフェラーゼ（ＰＭＴ）、キノリン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＱＰＴ）、Ａ６２２、ＮＢＢ１、ＢＢＬ、ＭＹＣ２、Ｎｉｃ１＿ＥＲＦ、Ｎｉｃ２＿ＥＲＦ、エチレン応答因子（ＥＲＦ）転写因子、ニコチン取り込みパーミアーゼ（ＮＵＰ）、およびＭＡＴＥ輸送体からなる群から選択されるタンパク質をコードする遺伝子または遺伝子座において変異をさらに含む、請求項３７に記載の改変タバコ植物またはその部分。
- 前記改変タバコ植物が、ジアミンオキシダーゼ、メチルプトレシンオキシダーゼ（ＭＰＯ）、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ、ホスホリボシルアントラニル酸イソメラーゼ（ＰＲＡＩ）、プトレシンＮ－メチルトランスフェラーゼ（ＰＭＴ）、キノリン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＱＰＴ）、Ａ６２２、ＮＢＢ１、ＢＢＬ、ＭＹＣ２、Ｎｉｃ１＿ＥＲＦ、Ｎｉｃ２＿ＥＲＦ、エチレン応答因子（ＥＲＦ）転写因子、ニコチン取り込みパーミアーゼ（ＮＵＰ）、およびＭＡＴＥ輸送体からなる群から選択されるタンパク質をコードする遺伝子を標的としかつ抑制するトランスジーンをさらに含む、請求項３７に記載の改変タバコ植物またはその部分。
- 前記トランスジーンが、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、アンチセンスＲＮＡ、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、トランス作動性ｓｉＲＮＡ（ｔａ－ｓｉＲＮＡ）、およびヘアピンＲＮＡ（ｈｐＲＮＡ）からなる群から選択される非コーディングＲＮＡをコードする、請求項４２に記載の改変タバコ植物またはその部分。
- 前記タバコ植物が、前記遺伝子改変または変異または組換え核酸構築物を有しない対照植物の同等の葉と比べて、同等のレベルの１つまたは複数のポリアミンを含む葉を生成することができる、請求項３７～４３のいずれか一項に記載の改変タバコ植物またはその部分。
- 前記同等のレベルが、対照植物の前記同等の葉におけるレベルの２０％以内、１７．５％以内、１５％以内、１２．５％以内、１０％以内、７．５％以内、５％以内、２．５％以内、または１％以内である、請求項４４に記載の改変タバコ植物またはその部分。
- 前記タバコ植物が、前記遺伝子改変または変異または組換え核酸構築物を有しない対照植物の同等の葉と比べて、同等のクロロフィルレベルを含む葉を生成することができる、請求項３７～４３のいずれか一項に記載の改変タバコ植物またはその部分。
- 前記同等のクロロフィルレベルが、対照植物の前記同等の葉におけるレベルの２０％以内、１７．５％以内、１５％以内、１２．５％以内、１０％以内、７．５％以内、５％以内、２．５％以内、または１％以内である、請求項４６に記載の改変タバコ植物またはその部分。
- 前記タバコ植物が、前記遺伝子改変または変異または組換え核酸構築物を有しない対照植物の同等の葉と比べて、同等の数の単位葉面積当たりの葉肉細胞を含む葉を生成することができる、請求項３７～４３のいずれか一項に記載の改変タバコ植物またはその部分。
- 前記同等の単位葉面積当たりの葉肉細胞が、対照植物の前記同等の葉における単位葉面積当たりの葉肉細胞の２０％以内、１７．５％以内、１５％以内、１２．５％以内、１０％以内、７．５％以内、５％以内、２．５％以内、または１％以内である、請求項４８に記載の改変タバコ植物またはその部分。
- 前記タバコ植物が、前記遺伝子改変または変異または組換え核酸構築物を有しない対照植物の同等の葉と比べて、同等の表皮細胞サイズを含む葉を生成することができる、請求項３７～４３のいずれか一項に記載の改変タバコ植物またはその部分。
- 前記同等の表皮細胞サイズが、対照植物の前記同等の葉における表皮細胞サイズの２０％以内、１７．５％以内、１５％以内、１２．５％以内、１０％以内、７．５％以内、５％以内、２．５％以内、または１％以内である、請求項５０に記載の改変タバコ植物またはその部分。
- 前記タバコ植物が、前記遺伝子改変または変異または組換え核酸構築物を有しない対照植物の同等の葉と比べて、同等の葉収率を呈する葉を生成することができる、請求項３７～４３のいずれか一項に記載の改変タバコ植物またはその部分。
- 前記同等の葉収率が、対照植物の前記同等の葉における葉収率の２０％以内、１７．５％以内、１５％以内、１２．５％以内、１０％以内、７．５％以内、５％以内、２．５％以内、または１％以内である、請求項５２に記載の改変タバコ植物またはその部分。
- 前記タバコ植物が、前記遺伝子改変または変異または組換え核酸構築物を有しない対照植物の同等の葉と比べて、同等の昆虫草食感受性を呈する、請求項３７～４３のいずれか一項に記載の改変タバコ植物またはその部分。
- 前記遺伝子改変が、非コーディングＲＮＡを含むかまたはコードする、請求項１～５４のいずれか一項に記載の改変タバコ植物またはその部分。
- 前記非コーディングＲＮＡが、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、アンチセンスＲＮＡ、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、トランス作動性ｓｉＲＮＡ（ｔａ－ｓｉＲＮＡ）、およびヘアピンＲＮＡ（ｈｐＲＮＡ）からなる群から選択される、請求項５５に記載の改変タバコ植物またはその部分。
- 前記遺伝子改変または異種プロモーターが、誘導性プロモーターを含む、請求項１、１８、２０、および３５のいずれか一項に記載の改変タバコ植物またはその部分。
- 前記遺伝子改変または異種プロモーターが、組織特異的プロモーターまたは組織選好性プロモーターを含む、請求項１、１８、２０、および３５のいずれか一項に記載の改変タバコ植物またはその部分。
- 前記遺伝子改変または異種プロモーターが、構成的プロモーターを含む、請求項１、１８、２０、および３５のいずれか一項に記載の改変タバコ植物またはその部分。
- 前記誘導性プロモーターが、摘心誘導性プロモーターである、請求項５７に記載の改変タバコ植物またはその部分。
- 前記誘導性プロモーターがまた、組織特異的プロモーターまたは組織選好性プロモーターである、請求項５７に記載の改変タバコ植物またはその部分。
- 前記組織特異的プロモーターまたは組織選好性プロモーターが、シュート、根、葉、茎、花、吸枝、根端、葉肉細胞、表皮細胞、および脈管構造からなる群から選択される１つまたは複数の組織または器官に特異的であるかまたは好ましい、請求項５８または６１に記載の改変タバコ植物またはその部分。
- 前記誘導性プロモーターが、根特異的発現または根選好性発現を調節する、請求項５７に記載の改変タバコ植物またはその部分。
- 前記誘導性プロモーターが、葉特異的発現または葉選好性発現を調節する、請求項５７に記載の改変タバコ植物またはその部分。
- 前記遺伝子改変が、下方制御される遺伝子のゲノム配列中の非天然変異を含む、請求項１および２０のいずれか一項に記載の改変タバコ植物またはその部分。
- 前記変異が、プロモーター領域またはタンパク質コーディング領域中にある、請求項６５に記載の改変タバコ植物またはその部分。
- 前記タバコ植物が、乾燥させた場合に、７０またはそれ以上のＵＳＤＡグレード指数値を有する葉を生成することができる、請求項３７～６６のいずれか一項に記載のタバコ植物またはその部分。
- 前記タバコ植物が、乾燥させた場合に、類似の条件で生育および乾燥させた場合の対照植物のＵＳＤＡグレード指数値と同等のＵＳＤＡグレード指数値を有する葉を生成することができ、該対照植物が、前記遺伝子改変または変異または組換え核酸構築物を除いて該タバコ植物と本質的に同一の遺伝的背景を共有する、請求項３７～６６のいずれか一項に記載のタバコ植物またはその部分。
- 前記同等のＵＳＤＡグレード指数値が、対照植物の前記同等の葉のＵＳＤＡグレード指数値の２０％以内、１７．５％以内、１５％以内、１２．５％以内、１０％以内、７．５％以内、５％以内、２．５％以内、または１％以内である、請求項６８に記載のタバコ植物またはその部分。
- 前記タバコ植物が、前記遺伝子改変または変異または組換え核酸構築物がない対照植物由来の葉の葉グレードと同等の葉グレードを有する葉を生成することができる、請求項３７～６６のいずれか一項に記載のタバコ植物またはその部分。
- 前記タバコ植物が、前記遺伝子改変または変異または組換え核酸構築物を有しない対照植物と同等の総葉収率を有する、請求項３７～７０のいずれか一項に記載のタバコ植物またはその部分。
- 前記タバコ植物が、３％未満、２．７５％未満、２．５％未満、２．２５％未満、２．０％未満、１．７５％未満、１．５％未満、１．２５％未満、１％未満、０．９％未満、０．８％未満、０．７％未満、０．６％未満、０．５％未満、０．４％未満、０．３％未満、０．２％未満、０．１％未満、および０．０５％未満からなる群から選択されるニコチンレベルを含む、前記請求項のいずれか一項に記載のタバコ植物またはその部分。
- 前記タバコ植物が、同等の生育条件で生育させた場合の、前記遺伝子改変または変異または組換え核酸構築物を有しない対照植物のニコチンレベルの１％より下、２％より下、５％より下、８％より下、１０％より下、１２％より下、１５％より下、２０％より下、２５％より下、３０％より下、４０％より下、５０％より下、６０％より下、７０％より下、または８０％より下のレベルのニコチンを含む、請求項３７～７２のいずれか一項に記載のタバコ植物またはその部分。
- 前記請求項のいずれか一項に記載のタバコ植物の集団。
- 前記請求項のいずれか一項に記載のタバコ植物に由来する、乾燥タバコ材料。
- 熱風乾燥、空気乾燥、火力乾燥、および太陽乾燥からなる群から選択される乾燥プロセスによって作製される、請求項７５に記載の乾燥タバコ材料。
- 請求項７５に記載の乾燥タバコ材料を含む、再構成タバコ。
- 請求項７５に記載の乾燥タバコ材料を含む、タバコブレンド物。
- 前記乾燥タバコ材料が、重量で前記タバコブレンド物中の乾燥タバコのおよそ少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％を構成する、請求項７８に記載のタバコブレンド物。
- 前記乾燥タバコ材料が、体積で前記タバコブレンド物中の乾燥タバコのおよそ少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％を構成する、請求項７８に記載のタバコブレンド物。
- 請求項７５に記載の乾燥タバコ材料を含む、タバコ製品。
- 無煙タバコ製品である、請求項８１に記載のタバコ製品。
- 加熱式タバコ製品である、請求項８１に記載のタバコ製品。
- シガレット、シガリロ、非通気式リセスフィルターシガレット、通気式リセスフィルターシガレット、シガー、嗅ぎタバコ、パイプタバコ、シガータバコ、シガレットタバコ、噛みタバコ、葉タバコ、刻みタバコ、およびカットタバコからなる群から選択される、請求項８１に記載のタバコ製品。
- 再構成タバコ、ルーズリーフ噛みタバコ、プラグ噛みタバコ、湿潤嗅ぎタバコ、スヌース、および鼻嗅ぎタバコからなる群から選択される、請求項８１に記載のタバコ製品。
- 低減アルカロイドタバコ植物を作製するための方法であって、
ａ．ｉ．ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～３６からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、もしくは１００％の同一性を有する核酸配列、または
ｉｉ．ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７～５４からなる群から選択されるポリペプチド配列に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、もしくは１００％の同一性もしくは類似性を有するアミノ酸配列
をコードする遺伝子の発現または活性を下方制御する工程；および
ｂ．該タバコ植物から葉または種子を収穫する工程
を含む、方法。 - 改変タバコ植物を作製する方法であって、
（ａ）少なくとも１つのタバコ細胞において、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７～５４からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％同一または類似のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする内因性核酸配列において非天然変異を誘導する工程；
（ｂ）工程（ａ）由来の該非天然変異を含む少なくとも１つのタバコ細胞を選択する工程；および
（ｃ）工程（ｂ）において選択された該少なくとも１つのタバコ細胞から、少なくとも１つの改変タバコ植物を再生する工程
を含む、方法。 - 改変タバコ植物を作製する方法であって、
（ａ）少なくとも１つのタバコ細胞に組換えＤＮＡ構築物を導入する工程であって、該組換えＤＮＡ構築物が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７～５４からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％同一または類似のポリペプチドをコードする内因性核酸配列に結合してその発現を低減することができる少なくとも１つの低分子ＲＮＡ分子をコードする核酸に機能的に連結された異種プロモーターを含む、工程；
（ｂ）該組換えＤＮＡ構築物を含む少なくとも１つのタバコ細胞を選択する工程；および
（ｃ）工程（ｂ）において選択された該少なくとも１つのタバコ細胞から、少なくとも１つの改変タバコ植物を再生する工程
を含む、方法。 - 改変タバコ植物を作製する方法であって、
（ａ）少なくとも１つのタバコ細胞に組換えＤＮＡ構築物を導入する工程であって、該組換えＤＮＡ構築物が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７～５４からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％同一または類似のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸配列に機能的に連結された異種プロモーターを含む、工程；
（ｂ）該組換えＤＮＡ構築物を含む少なくとも１つのタバコ細胞を選択する工程；および
（ｃ）工程（ｂ）において選択された該少なくとも１つのタバコ細胞から、少なくとも１つの改変タバコ植物を再生する工程
を含む、方法。 - 前記少なくとも１つの改変タバコ植物が、前記変異を欠いた対照タバコ植物と比較して、少なくとも１つのアルカロイドの量の低減を含む、請求項８７に記載の方法。
- 前記少なくとも１つの改変タバコ植物が、前記組換えＤＮＡ構築物を欠いた対照タバコ植物と比較して、少なくとも１つのアルカロイドの量の低減を含む、請求項８８または８９に記載の方法。
- 前記内因性核酸配列が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～１８からなる群から選択される配列に対して少なくとも８０％同一である、請求項８７～８９のいずれか一項に記載の方法。
- 前記内因性核酸配列が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９～３６からなる群から選択される配列に対して少なくとも８０％同一である、請求項８７～８９のいずれか一項に記載の方法。
- 前記少なくとも１つのアルカロイドが、アナバシン、アナタビン、ニコチン、およびノルニコチンからなる群から選択される、請求項９０または９１に記載の方法。
- 前記少なくとも１つのアルカロイドの量の低減が、少なくとも１％の低減を含む、請求項９０または９１に記載の方法。
- 前記非天然変異が、挿入、欠失、置換、重複、および逆位からなる群から選択される変異を含む、請求項８７に記載の方法。
- 前記非天然変異が、ナンセンス変異、ミスセンス変異、フレームシフト変異、およびスプライス部位変異からなる群から選択される変異を含む、請求項８７に記載の方法。
- 前記非天然変異が、ヌル変異を含む、請求項８７に記載の方法。
- 前記非天然変異が、前記ポリペプチドの短縮を結果としてもたらす、請求項８７に記載の方法。
- 前記非天然変異が、プロモーター、５’－非翻訳領域（ＵＴＲ）、エクソン、イントロン、３’－ＵＴＲ、およびターミネーターからなる群から選択される配列領域中の変異を含む、請求項８７に記載の方法。
- 前記誘導する工程が、化学的変異原、放射線照射、トランスポゾン、アクロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、およびヌクレアーゼからなる群から選択される作用物質の使用を含む、請求項８７に記載の方法。
- 前記ヌクレアーゼが、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ヌクレアーゼ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１ヌクレアーゼ、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓＸヌクレアーゼ、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓＹヌクレアーゼ、Ｃｓｍ１ヌクレアーゼ、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項１０１に記載の方法。
- 前記化学的変異原が、エチルメタンスルホナートを含む、請求項１０１に記載の方法。
- 前記放射線照射が、ガンマ線、Ｘ線、または電離放射線を含む、請求項１０１に記載の方法。
- 前記低分子ＲＮＡ分子が、二本鎖ＲＮＡ、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、トランス作動性ｓｉＲＮＡ、およびマイクロＲＮＡからなる群から選択される、請求項８８に記載の方法。
- 前記少なくとも１つの低分子ＲＮＡ分子が、１８ヌクレオチド～３０ヌクレオチドを含む、請求項８８に記載の方法。
- 前記少なくとも１つの低分子ＲＮＡ分子が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９～３６からなる群から選択される配列に対して少なくとも９０％同一の核酸配列を含む、請求項８８に記載の方法。
- 前記プロモーターが、構成的プロモーター、組織選好性プロモーター、組織特異的プロモーター、および誘導性プロモーターからなる群から選択されるプロモーターを含む、請求項８８または８９に記載の方法。
- 前記組織選好性プロモーターが、根選好性プロモーターを含む、請求項１０８に記載の方法。
- 前記組織特異的プロモーターが、根特異的プロモーターを含む、請求項１０８に記載の方法。
- 前記構成的プロモーターが、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓプロモーター、ユビキチンプロモーター、アクチンプロモーター、オパインプロモーター、およびアルコールデヒドロゲナーゼプロモーターからなる群から選択される、請求項１０８に記載の方法。
- 前記少なくとも１つのタバコ細胞が、タバコプロトプラスト細胞である、請求項８７～８９のいずれか一項に記載の方法。
- 前記少なくとも１つのタバコ細胞が、タバコカルス細胞である、請求項８７～８９のいずれか一項に記載の方法。
- 前記少なくとも１つのタバコ細胞が、種子細胞、果実細胞、葉細胞、子葉細胞、胚軸細胞、***組織細胞、胚細胞、内乳細胞、根細胞、シュート細胞、茎（ｓｔｅｍ）細胞、花細胞、花序細胞、茎（ｓｔａｌｋ）細胞、小花柄細胞、花柱細胞、柱頭細胞、花托細胞、花弁細胞、がく細胞、花粉細胞、葯細胞、花糸細胞、子房細胞、胚珠細胞、果皮細胞、および師部細胞からなる群から選択される、請求項８７～８９のいずれか一項に記載の方法。
- （ｄ）工程（ｃ）において再生された前記改変タバコ植物を生育させる工程
をさらに含む、請求項８７～８９のいずれか一項に記載の方法。 - （ｅ）工程（ｄ）において生育させた前記改変タバコ植物を、第２のタバコ植物と交雑する工程；および
（ｆ）工程（ｅ）における交雑から、少なくとも１つの種子を取得する工程
をさらに含む、請求項１１５に記載の方法。 - 前記非天然変異が、同等の条件下で生育させた場合の該変異を欠いた対照タバコ植物と比較して、前記少なくとも１つの改変タバコ植物における前記内因性核酸配列の発現の低減を結果としてもたらす、請求項８７に記載の方法。
- 前記発現の低減が、少なくとも５％の低減を含む、請求項１１７に記載の方法。
- 前記非天然変異が、同等の条件下で生育させた場合の該変異を欠いた対照タバコ植物と比較して、前記少なくとも１つの改変タバコ植物における前記内因性核酸配列の発現の増加を結果としてもたらす、請求項８７に記載の方法。
- 前記発現の増加が、少なくとも５％の増加を含む、請求項１１９に記載の方法。
- 前記非天然変異が、同等の条件下で生育させた場合の該変異を欠いた対照タバコ植物と比較して、前記少なくとも１つの改変タバコ植物における前記ポリペプチドの活性の低減を結果としてもたらす、請求項８７に記載の方法。
- 前記活性の低減が、少なくとも５％の低減を含む、請求項１２１に記載の方法。
- 前記非天然変異が、同等の条件下で生育させた場合の該変異を欠いた対照タバコ植物と比較して、前記少なくとも１つの改変タバコ植物における前記ポリペプチドの活性の増加を結果としてもたらす、請求項８７に記載の方法。
- 前記活性の増加が、少なくとも５％の増加を含む、請求項１２３に記載の方法。
- 前記改変タバコ植物が、熱風乾燥品種、ブライト品種、Ｂｕｒｌｅｙ品種、Ｖｉｒｇｉｎｉａ品種、Ｍａｒｙｌａｎｄ品種、ダーク品種、Ｏｒｉｅｎｔａｌ品種、およびＴｕｒｋｉｓｈ品種からなる群から選択されるタバコ品種のものである、請求項８７～８９のいずれか一項に記載の方法。
- 前記改変タバコ植物が、表１～７に列記される品種からなる群から選択される品種のものである、請求項８７～８９のいずれか一項に記載の方法。
- 前記改変タバコ植物がハイブリッドである、請求項８７～８９のいずれか一項に記載の方法。
- 前記改変タバコ植物が、雄性不稔性または細胞質雄性不稔性である、請求項８７～８９のいずれか一項に記載の方法。
- 前記改変タバコ植物が雌性不稔性である、請求項８７～８９のいずれか一項に記載の方法。
- 前記改変タバコ植物が、同等の条件下で生育させた場合の前記非天然変異を欠いた対照タバコ植物と比較して、同等のまたはより良好な葉グレードを含む、請求項８７に記載の方法。
- 前記改変タバコ植物が、同等の条件下で生育させた場合の前記組換えＤＮＡ構築物を欠いた対照タバコ植物と比較して、同等のまたはより良好な葉グレードを含む、請求項８８または８９に記載の方法。
- 改変タバコ植物由来の乾燥タバコ材料を使用してタバコ製品を調製する工程を含む方法であって、該改変タバコ植物が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７～５４からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％同一または類似のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする内因性核酸配列において非天然変異を含む、方法。
- 改変タバコ植物由来の乾燥タバコ材料を使用してタバコ製品を調製する工程を含む方法であって、該改変タバコ植物が、少なくとも１つのタバコ細胞への組換えＤＮＡ構築物を含み、該組換えＤＮＡ構築物が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７～５４からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％同一または類似のポリペプチドをコードする内因性核酸配列に結合してその発現を低減することができる少なくとも１つの低分子ＲＮＡ分子をコードする核酸に機能的に連結された異種プロモーターを含む、方法。
- 改変タバコ植物由来の乾燥タバコ材料を使用してタバコ製品を調製する工程を含む方法であって、該改変タバコ植物が、少なくとも１つのタバコ細胞への組換えＤＮＡ構築物を含み、該組換えＤＮＡ構築物が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７～５４からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％同一または類似のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸配列に機能的に連結された異種プロモーターを含む、方法。
- 前記乾燥タバコ材料が、乾燥葉材料、乾燥茎材料、またはその両方を含む、請求項１３２～１３４のいずれか一項に記載の方法。
- 前記乾燥タバコ材料が、熱風乾燥タバコ材料、空気乾燥タバコ材料、火力乾燥タバコ材料、および太陽乾燥タバコ材料を含む、請求項１３２～１３４のいずれか一項に記載の方法。
- 前記タバコ製品が、シガレット、クレテック、ビディシガレット、シガー、シガリロ、非通気式シガレット、通気式リセスフィルターシガレット、パイプタバコ、嗅ぎタバコ、スヌース、噛みタバコ、湿潤無煙タバコ、ファインカット噛みタバコ、ロングカット噛みタバコ、パウチ噛みタバコ製品、ガム、タブレット、ロゼンジ、および溶解ストリップからなる群から選択される、請求項１３２～１３４のいずれか一項に記載の方法。
- 前記タバコ製品が無煙タバコ製品である、請求項１３２～１３４のいずれか一項に記載の方法。
- 前記無煙タバコ製品が、ルーズリーフ噛みタバコ、プラグ噛みタバコ、湿潤嗅ぎタバコ、鼻嗅ぎタバコ、乾燥嗅ぎタバコ、およびスヌースからなる群から選択される、請求項１３８に記載の方法。
- 前記乾燥タバコ材料が、熱風乾燥品種、ブライト品種、Ｂｕｒｌｅｙ品種、Ｖｉｒｇｉｎｉａ品種、Ｍａｒｙｌａｎｄ品種、ダーク品種、Ｇａｌｐａｏ品種、Ｏｒｉｅｎｔａｌ品種、およびＴｕｒｋｉｓｈ品種からなる群から選択されるタバコ品種のものである、請求項１３２～１３４のいずれか一項に記載の方法。
- 前記内因性核酸配列が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～３６からなる群から選択される配列に対して少なくとも８０％同一の配列を含む、請求項１３２～１３４のいずれか一項に記載の方法。
- タバコ細胞を組換えＤＮＡ構築物で形質転換する工程を含む方法であって、該組換えＤＮＡ構築物が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７～５４からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％同一または類似のポリペプチドをコードする内因性核酸配列に結合してその発現を低減することができる少なくとも１つの低分子ＲＮＡ分子をコードする核酸に機能的に連結された異種プロモーターを含む、方法。
- タバコ細胞を組換えＤＮＡ構築物で形質転換する工程を含む方法であって、該組換えＤＮＡ構築物が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７～５４からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％同一または類似のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸配列に機能的に連結された異種プロモーターを含む、方法。
- 改変タバコ植物を作製するための方法であって、
（ａ）第１のタバコ品種の少なくとも１つのタバコ植物を、第２のタバコ品種の少なくとも１つのタバコ植物と交雑して、少なくとも１つの子孫タバコ種子を産生する工程であって、該第１のタバコ品種の該少なくとも１つのタバコ植物が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７～５４からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％同一または類似のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする内因性核酸配列において非天然変異を含み、該変異が、同じ品種の対照タバコ植物における該内因性核酸配列中には存在しない、工程；および
（ｂ）該非天然変異を含む、少なくとも１つの子孫タバコ種子、または該少なくとも１つの子孫タバコ種子から発芽した植物を選択する工程
を含む、方法。 - 改変タバコ植物を作製するための方法であって、
（ａ）第１のタバコ品種の少なくとも１つのタバコ植物を、第２のタバコ品種の少なくとも１つのタバコ植物と交雑して、少なくとも１つの子孫タバコ種子を産生する工程であって、該第１のタバコ品種の該少なくとも１つのタバコ植物が、組換えＤＮＡ構築物を含み、該組換えＤＮＡ構築物が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７～５４からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％同一または類似のポリペプチドをコードする内因性核酸配列に結合してその発現を低減することができる少なくとも１つの低分子ＲＮＡ分子をコードする核酸に機能的に連結された異種プロモーターを含み、該組換えＤＮＡ構築物が、同じ品種の対照タバコ植物における該内因性核酸配列中には存在しない、工程；および
（ｂ）該組換えＤＮＡ構築物を含む、少なくとも１つの子孫タバコ種子、または該少なくとも１つの子孫タバコ種子から発芽した植物を選択する工程
を含む、方法。 - 改変タバコ植物を作製するための方法であって、
（ａ）第１のタバコ品種の少なくとも１つのタバコ植物を、第２のタバコ品種の少なくとも１つのタバコ植物と交雑して、少なくとも１つの子孫タバコ種子を産生する工程であって、該第１のタバコ品種の該少なくとも１つのタバコ植物が、組換えＤＮＡ構築物を含み、該組換えＤＮＡ構築物が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７～５４からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％同一または類似のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸配列に機能的に連結された異種プロモーターを含み、該組換えＤＮＡ構築物が、同じ品種の対照タバコ植物における該核酸配列中には存在しない、工程；および
（ｂ）該組換えＤＮＡ構築物を含む、少なくとも１つの子孫タバコ種子、または該少なくとも１つの子孫タバコ種子から発芽した植物を選択する工程
を含む、方法。 - 工程（ｂ）における前記発芽した植物が、同等の条件下で生育させた場合の前記対照タバコ植物と比較して、少なくとも１つのアルカロイドの量の低減を含む、請求項１４４～１４６のいずれか一項に記載の方法。
- 前記少なくとも１つのアルカロイドが、アナバシン、アナタビン、ニコチン、およびノルニコチンからなる群から選択される、請求項１４７に記載の方法。
- 前記少なくとも１つのアルカロイドの量の低減が、少なくとも１％の低減を含む、請求項１４７または１４８に記載の方法。
- 前記内因性核酸配列が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～３６からなる群から選択される配列に対して少なくとも８０％同一の配列を含む、請求項１４４～１４６のいずれか一項に記載の方法。
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