KR20200112512A - Concentration Gradient Microfluidic Chip and Use Thereof - Google Patents

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KR20200112512A
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선웅
모성준
이종민
이주현
김은중
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서강대학교산학협력단
고려대학교 산학협력단
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Abstract

The present invention relates to a concentration gradient microfluidic chip and uses thereof. A microfluidic chip of the present invention is capable of culturing and differentiating stem cells, forming and fixing neurospheres, and analyzing a treatment effect of each treatment drug concentration interval since in a single chip, a drug and a culture medium injected through a drug inlet and a culture medium inlet, which are located asymmetrically in a drug channel and a culture medium channel, respectively move to a central channel and form a concentration gradient within the central channel through diffusion. In addition, the microfluidic chip of the present invention can be used for research on various neurological diseases related to neural stem cells, neurons, and neural networks, and thus can be used as a very useful tool in the field of drug screening related to neurological diseases.

Description

농도구배 미세유체칩 및 이의 용도{Concentration Gradient Microfluidic Chip and Use Thereof}Concentration Gradient Microfluidic Chip and Use Thereof}

본 발명은 농도구배 미세유체칩 및 이의 용도에 관한 것이다.The present invention relates to a concentration gradient microfluidic chip and a use thereof.

신경줄기세포(Neural stem cells, NSCs)는 분화되지 않은 상태로 계속 증식하는 자가 증식(Self-renewal)이 가능한 세포이며, 신경세포(Neuron), 성상교세포(Astrocyte), 희소돌기 아교세포(Oligodendrocyte) 등으로 분화된다. 신경계는 인간의 생명 유지 활동에 필요한 대부분의 능력을 제어하는데 필수적이기 때문에, 신경계에 대한 메커니즘을 조사하는 연구가 많이 필요하다. Neural stem cells (NSCs) are cells capable of self-renewal that continue to proliferate in an undifferentiated state, and are neurons (Neuron), astrocytes (Astrocytes), oligodendrocytes, etc. Is differentiated into Since the nervous system is essential for controlling most of the abilities required for human life-sustaining activities, a lot of research is needed to investigate the mechanisms of the nervous system.

일반적으로 말초신경계를 구성하는 신경세포의 신경돌기(Axon)가 물리적인 손상을 입었을 때, 일정 시간 후에 재생되어 기능을 회복한다고 알려져 있다. 하지만 정상 상태로 회복하기 위하여 오랜 시간이 걸릴 뿐 아니라, 중추신경계의 경우 신경세포가 손상을 입었을 때 대부분 회복하지 못하고 영구적으로 기능 상실 상태로 간다고 알려져 있다. In general, it is known that when a neurite (Axon) of nerve cells constituting the peripheral nervous system is physically damaged, it is regenerated after a certain time to recover its function. However, it takes a long time to recover to a normal state, and it is known that in the case of the central nervous system, when nerve cells are damaged, most of them cannot recover and permanently lose their function.

실제 임상의학에서 신경계 질환을 근본적으로 치료하는 특별한 치료 방법이 없으며, 현재는 병에 의한 증상 호전적인 치료를 위한 치료법이 대부분이다. 많은 신경세포 연구가 지속되었지만 뇌는 일반적인 장기보다 복잡한 구조를 가지고 있어서, 2차원 환경에서 배양한 세포들과 실제 뇌의 구조와는 확연한 차이를 가진다. 이러한 문제점을 해결하기 위해 마이크로 시스템을 이용하여 뇌의 구조나 기능을 조금 더 정밀하게 재현하고, 중추 신경계를 모사할 수 있는 신경계통의 세포를 이용하여 다양한 조건에서 배양하는 연구가 활발히 진행 중에 있다. In actual clinical medicine, there is no special treatment method to fundamentally treat neurological diseases, and currently, most treatments for symptomatic improvement due to disease are currently used. Although many neuronal studies have been continued, the brain has a more complex structure than general organs, so the cells cultured in a two-dimensional environment have a marked difference from the structure of the actual brain. In order to solve this problem, researches on culturing under various conditions using cells of the nervous system capable of reproducing the structure or function of the brain using a micro system more precisely and capable of simulating the central nervous system are actively in progress.

마이크로 시스템은 소량의 유체로 손쉽게 다양한 실험을 진행할 수 있고, 실험에 드는 비용을 감소할 수 있으며, 더욱 정확하고 민감한 데이터를 얻을 수 있는 장점이 있다. 이에, 마이크로 시스템을 사용하여 세포의 미세 환경을 모사하거나, 약물 스크리닝을 하는 등의 연구가 다양하게 진행되고 있다. 마이크로 시스템을 이용한 동물세포 배양 방법이 다수 연구되고 있지만, 이러한 방법들은 중력에 의존하여 세포를 트랩하는 원리를 이용하기 때문에 세포가 웰에서 안정적으로 트랩되지 않고, 화학적인 약물이나 배양액 교체 시에 세포가 쉽게 손실된다는 단점이 있다. The micro system has the advantage of being able to easily perform various experiments with a small amount of fluid, reduce the cost of experiments, and obtain more accurate and sensitive data. Accordingly, various studies such as using a micro system to simulate the microenvironment of cells or screening for drugs are being conducted. Although a number of methods of culturing animal cells using microsystems are being studied, these methods depend on gravity to trap cells, so the cells are not stably trapped in the wells, and the cells are not trapped in the wells. The disadvantage is that it is easily lost.

기존의 미세유체칩은 신경구의 크기가 균일하지 않고, 신경구가 임의적으로 배열되기 때문에 신경망을 형성하기에 부적절하였다. 또한, 농도구배를 형성하기 위한 기존의 방법에서는 세포가 배양되는 챔버에 유체의 흐름이 직접적으로 관여하여 세포에 대한 손상과 유체의 속도에 대한 제약이 존재하였다. 따라서 이러한 문제점이 개선된 농도구배 미세유체칩의 개발이 필요하다.Existing microfluidic chips were inappropriate for forming a neural network because the size of the neurospheres was not uniform and the neurospheres were randomly arranged. In addition, in the conventional method for forming the concentration gradient, the flow of fluid is directly involved in the chamber in which the cells are cultured, so that damage to the cells and restrictions on the velocity of the fluid exist. Therefore, there is a need to develop a concentration gradient microfluidic chip that has improved these problems.

본 발명자들은 종래 미세유체칩의 기술적인 단점들을 극복하고자 연구 노력하였다. 그 결과, 줄기세포의 배양 및 분화가 가능하고, 신경구의 형성 및 고정이 가능하며, 단일 칩에서 약물 채널과 배양액 채널의 비대칭 유입부를 통해 주입된 약물 및 배양액에 의해 농도구배가 형성되어 치료 약물의 농도구간별 치료 효과를 분석할 수 있는 농도구배 미세유체칩을 개발하였다. The present inventors have made efforts to overcome the technical shortcomings of the conventional microfluidic chip. As a result, cultivation and differentiation of stem cells is possible, formation and fixation of neurospheres is possible, and a concentration gradient is formed by the drug and the culture medium injected through the asymmetric inlet of the drug channel and the culture medium channel in a single chip. A concentration gradient microfluidic chip was developed that can analyze the treatment effect by concentration section.

이에, 본 발명의 목적은 줄기세포의 배양 또는 분화용 농도구배 미세유체칩을 제공하는 것이다. Accordingly, an object of the present invention is to provide a concentration gradient microfluidic chip for culturing or differentiating stem cells.

본 발명의 다른 목적은 상기 미세유체칩을 이용한 줄기세포 배양 또는 분화 방법을 제공하는 것이다. Another object of the present invention is to provide a stem cell culture or differentiation method using the microfluidic chip.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 미세유체칩에 줄기세포를 배양하여 신경망(neurite network)을 형성시키는 방법을 제공하는 것이다. Another object of the present invention is to provide a method of forming a neural network by culturing stem cells on the microfluidic chip.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 미세유체칩을 이용하여 신경계질환 치료제 약물 후보를 스크리닝 하는 방법을 제공하는 것이다. Another object of the present invention is to provide a method for screening a drug candidate for treating neurological diseases using the microfluidic chip.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 미세유체칩을 이용하여 신경계질환 치료제의 농도에 따른 효과 분석 방법을 제공하는 것이다. Another object of the present invention is to provide a method for analyzing effects according to the concentration of a therapeutic agent for neurological diseases using the microfluidic chip.

본 발명은 줄기세포의 배양 또는 분화용 농도구배 미세유체칩 및 상기 미세유체칩의 용도에 관한 것이다. The present invention relates to a concentration gradient microfluidic chip for culturing or differentiating stem cells, and to a use of the microfluidic chip.

이하 본 발명을 더욱 자세히 설명하고자 한다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail.

기존의 미세유체칩은 신경구를 균일한 크기로 배양하는데 어려움이 있었고 신경구가 임의적으로 배열되기 때문에 신경망을 형성하기에 부적절하였다. 또한, 미세유체칩 내에서 농도구배를 형성하기 위한 기존 방법에서는 세포가 배양되는 챔버가 유체의 흐름에 직접적으로 영향을 받아 세포가 손상을 입거나, 유체 속도에 따른 제약이 있었다. Existing microfluidic chips had difficulty in culturing neurospheres in a uniform size, and because neurospheres were randomly arranged, it was inappropriate to form a neural network. In addition, in the conventional method for forming a concentration gradient in a microfluidic chip, the chamber in which the cells are cultured is directly affected by the flow of the fluid, so that the cells are damaged, or there is a limitation according to the fluid velocity.

이에, 본 발명자들은 줄기세포의 배양 및 분화가 가능하고, 신경구의 형성 및 고정이 가능하며, 단일 칩에서 약물 채널과 배양액 채널의 비대칭 유입부를 통해 주입된 약물 및 배양액에 의해 농도구배가 형성되어 치료 약물의 농도구간별 치료 효과를 분석할 수 있는 농도구배 미세유체칩을 개발함으로써 본 발명을 완성하였다. Accordingly, the present inventors can cultivate and differentiate stem cells, form and fix neurospheres, and treat by forming a concentration gradient by the drug and culture fluid injected through the asymmetric inlet of the drug channel and the culture medium channel in a single chip. The present invention was completed by developing a concentration gradient microfluidic chip capable of analyzing the therapeutic effect of each drug concentration section.

본 발명의 일 양태는 (a) 세포 배양 채널로서 마이크로 필라(micro pillar)를 포함하는 중앙 채널; 및One aspect of the present invention includes (a) a central channel comprising a micro pillar as a cell culture channel; And

(b) 약물 공급 채널로서 약물 주입구를 포함하는 약물 채널; 및 배양액 공급 채널로서 배양액 주입구를 포함하는 배양액 채널을 포함하는 사이드 채널을 포함하는 줄기세포 배양용 농도구배 미세유체칩으로서, (b) a drug channel including a drug inlet as a drug supply channel; And as a concentration gradient microfluidic chip for culturing stem cells comprising a side channel including a culture medium channel including a culture medium injection port as a culture medium supply channel,

상기 사이드 채널은 상기 중앙 채널에 연결되는 것인, 줄기세포의 배양 또는 분화용 농도구배 미세유체칩에 관한 것이다. The side channel relates to a concentration gradient microfluidic chip for culture or differentiation of stem cells, which is connected to the central channel.

상기 줄기세포는 유도만능줄기세포 또는 신경줄기세포일 수 있다. The stem cells may be induced pluripotent stem cells or neural stem cells.

상기 중앙 채널은 줄기세포가 배양되는 챔버로서, 줄기세포 배양을 통해 신경돌기가 형성되는 공간을 의미한다. The central channel is a chamber in which stem cells are cultured, and refers to a space in which neurites are formed through stem cell culture.

상기 중앙 채널은 세포 시료를 공급할 수 있는 주입구(inlet)를 포함할 수 있다. The central channel may include an inlet through which a cell sample can be supplied.

상기 중앙 채널 및 사이드 채널은 100 μm 내지 250 μm, 100 μm 내지 240 μm, 100 μm 내지 230 μm, 100 μm 내지 220 μm, 100 μm 내지 210 μm, 100 μm 내지 200 μm, 100 μm 내지 190 μm, 100 μm 내지 180 μm, 100 μm 내지 170 μm, 100 μm 내지 160 μm, 100 μm 내지 150 μm, 110 μm 내지 250 μm, 110 μm 내지 240 μm, 110 μm 내지 230 μm, 110 μm 내지 220 μm, 110 μm 내지 210 μm, 110 μm 내지 200 μm, 110 μm 내지 190 μm, 110 μm 내지 180 μm, 110 μm 내지 170 μm, 110 μm 내지 160 μm, 110 μm 내지 150 μm, 120 μm 내지 250 μm, 120 μm 내지 240 μm, 120 μm 내지 230 μm, 120 μm 내지 220 μm, 120 μm 내지 210 μm, 120 μm 내지 200 μm, 120 μm 내지 190 μm, 120 μm 내지 180 μm, 120 μm 내지 170 μm, 120 μm 내지 160 μm, 120 μm 내지 150 μm, 130 μm 내지 250 μm, 130 μm 내지 240 μm, 130 μm 내지 230 μm, 130 μm 내지 220 μm, 130 μm 내지 210 μm, 130 μm 내지 200 μm, 130 μm 내지 190 μm, 130 μm 내지 180 μm, 130 μm 내지 170 μm, 130 μm 내지 160 μm, 130 μm 내지 150 μm, 140 μm 내지 250 μm, 140 μm 내지 240 μm, 140 μm 내지 230 μm, 140 μm 내지 220 μm, 140 μm 내지 210 μm, 140 μm 내지 200 μm, 140 μm 내지 190 μm, 140 μm 내지 180 μm, 140 μm 내지 170 μm, 140 μm 내지 160 μm, 140 μm 내지 150 μm, 150 μm 내지 250 μm, 150 μm 내지 240 μm, 150 μm 내지 230 μm, 150 μm 내지 220 μm, 150 μm 내지 210 μm, 150 μm 내지 200 μm, 150 μm 내지 190 μm, 150 μm 내지 180 μm, 150 μm 내지 170 μm 또는 150 μm 내지 160 μm의 높이로 제조될 수 있고, 예를 들어, 150 μm의 높이로 제조될 수 있다. The central and side channels are 100 μm to 250 μm, 100 μm to 240 μm, 100 μm to 230 μm, 100 μm to 220 μm, 100 μm to 210 μm, 100 μm to 200 μm, 100 μm to 190 μm, 100 μm to 180 μm, 100 μm to 170 μm, 100 μm to 160 μm, 100 μm to 150 μm, 110 μm to 250 μm, 110 μm to 240 μm, 110 μm to 230 μm, 110 μm to 220 μm, 110 μm to 210 μm, 110 μm to 200 μm, 110 μm to 190 μm, 110 μm to 180 μm, 110 μm to 170 μm, 110 μm to 160 μm, 110 μm to 150 μm, 120 μm to 250 μm, 120 μm to 240 μm , 120 μm to 230 μm, 120 μm to 220 μm, 120 μm to 210 μm, 120 μm to 200 μm, 120 μm to 190 μm, 120 μm to 180 μm, 120 μm to 170 μm, 120 μm to 160 μm, 120 μm to 150 μm, 130 μm to 250 μm, 130 μm to 240 μm, 130 μm to 230 μm, 130 μm to 220 μm, 130 μm to 210 μm, 130 μm to 200 μm, 130 μm to 190 μm, 130 μm to 180 μm, 130 μm to 170 μm, 130 μm to 160 μm, 130 μm to 150 μm, 140 μm to 250 μm, 140 μm to 240 μm, 140 μm to 230 μm, 140 μm to 220 μm, 140 μm to 210 μm , 140 μm to 200 μm, 140 μm to 190 μm, 140 μm to 180 μm, 140 μm to 170 μm, 140 μm to 160 μm, 140 μm to 150 μm, 150 μm to 250 μm, 150 μm to 240 μm, 150 μm to 230 μm, 150 μm to 220 μm, 150 μm to 210 μm, 150 μm to 200 μm, 150 μm to 190 μm, 150 μm to 180 μm , 150 μm to 170 μm or 150 μm to 160 μm in height, for example, 150 μm in height.

상기 중앙 채널 및 사이드 채널은 폴리디메틸실록산(poly(dimethylsiloxane): PDMS), 폴리메틸메타크릴레이트(polymethylmethacrylate: PMMA), 폴리아크릴레이트(polyacrylates), 폴리카보네이트(polycarbonates) 및 폴리사이클릭올레핀(polycyclic olefins)으로 이루어진 군으로부터 선택된 1 종 이상으로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 예를 들어, 상기 중앙 채널 및 사이드 채널은 폴리디메틸실록산(poly(dimethylsiloxane): PDMS)로 이루어진 것일 수 있다. The central and side channels are polydimethylsiloxane (PDMS), polymethylmethacrylate (PMMA), polyacrylates, polycarbonates, and polycyclic olefins. ) May be made of one or more selected from the group consisting of, but is not limited thereto. For example, the center channel and the side channel may be made of poly(dimethylsiloxane) (PDMS).

상기 중앙 채널은 줄기세포가 트랩되는 마이크로 필라를 포함한다. The central channel includes micro pillars into which stem cells are trapped.

상기 마이크로 필라는 중앙 채널로 주입된 줄기세포가 트랩되어 배양되는 공간을 의미한다. The micro-pillar refers to a space in which stem cells injected through a central channel are trapped and cultured.

상기 마이크로 필라에 의해 중앙 채널로 주입되는 세포 시료로부터 세포가 트랩되어 배양액 및 약물 주입에 따라 발생하는 유체 흐름에 의해 세포가 유실되는 것을 방지할 수 있다. 세포 배양액 교체 또는 약물 처리를 위해 미세챔버 내로 배양액 또는 약물을 주입하는 경우, 압력과 유속에 의해 세포 유실 또는 손상이 발생할 수 있으나, 마이크로 필라에 의해 미세챔버 내에서 유체의 흐름이 차단되어 세포 유실을 방지하고, 높은 세포 생존율을 유지할 수 있도록 한다. Cells are trapped from the cell sample injected into the central channel by the micro pillars, and thus cells may be prevented from being lost due to a fluid flow generated by the injection of a culture medium and a drug. In the case of injecting a culture medium or a drug into the microchamber for replacement of cell culture medium or drug treatment, cell loss or damage may occur due to pressure and flow rate, but the flow of fluid in the microchamber is blocked by the micro pillars to prevent cell loss. Prevent and maintain high cell viability.

상기 마이크로 필라는 각각 이격된 4개의 유닛으로 구성되며, 상기 4개 유닛은 U자 형태로 미세챔버 내에 배열될 수 있다. The micro pillars are composed of four units spaced apart from each other, and the four units may be arranged in a microchamber in a U-shape.

상기 4개 유닛은 제1유닛, 제2유닛, 제3유닛 및 제4유닛을 포함하고, 제1유닛부터 차례대로 U자 형태로 배열될 수 있다. 마이크로 필라의 폭은 제1유닛 및 제4유닛의 배열을 통해 결정될 수 있다. The four units include a first unit, a second unit, a third unit, and a fourth unit, and may be arranged in a U-shape sequentially from the first unit. The width of the micro pillars may be determined through the arrangement of the first unit and the fourth unit.

상기 제1유닛 및 제2유닛, 제2유닛 및 제3유닛, 그리고 제3유닛 및 제4유닛은 10 μm 내지 50 μm, 10 μm 내지 45 μm, 10 μm 내지 40 μm, 10 μm 내지 35 μm, 10 μm 내지 30 μm, 15 μm 내지 50 μm, 15 μm 내지 45 μm, 15 μm 내지 40 μm, 15 μm 내지 35 μm, 15 μm 내지 30 μm, 20 μm 내지 50 μm, 20 μm 내지 45 μm, 20 μm 내지 40 μm, 20 μm 내지 35 μm, 20 μm 내지 30 μm, 25 μm 내지 50 μm, 25 μm 내지 45 μm, 25 μm 내지 40 μm, 25 μm 내지 35 μm 또는 25 μm 내지 30 μm의 간격으로 배열될 수 있고, 예를 들어, 30 μm의 간격으로 배열될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. The first and second units, second and third units, and the third and fourth units are 10 μm to 50 μm, 10 μm to 45 μm, 10 μm to 40 μm, 10 μm to 35 μm, 10 μm to 30 μm, 15 μm to 50 μm, 15 μm to 45 μm, 15 μm to 40 μm, 15 μm to 35 μm, 15 μm to 30 μm, 20 μm to 50 μm, 20 μm to 45 μm, 20 μm To 40 μm, 20 μm to 35 μm, 20 μm to 30 μm, 25 μm to 50 μm, 25 μm to 45 μm, 25 μm to 40 μm, 25 μm to 35 μm or 25 μm to 30 μm It may be, for example, may be arranged at intervals of 30 μm, but is not limited thereto.

상기 마이크로 필라의 폭은 50 μm 내지 300 μm, 50 μm 내지 280 μm, 50 μm 내지 260 μm, 50 μm 내지 240 μm, 50 μm 내지 220 μm, 50 μm 내지 200 μm, 50 μm 내지 190 μm, 50 μm 내지 180 μm, 50 μm 내지 170 μm, 50 μm 내지 160 μm, 50 μm 내지 150 μm, 75 μm 내지 300 μm, 75 μm 내지 280 μm, 75 μm 내지 260 μm, 75 μm 내지 240 μm, 75 μm 내지 220 μm, 75 μm 내지 200 μm, 75 μm 내지 190 μm, 75 μm 내지 180 μm, 75 μm 내지 170 μm, 75 μm 내지 160 μm, 75 μm 내지 150 μm, 100 μm 내지 300 μm, 100 μm 내지 280 μm, 100 μm 내지 260 μm, 100 μm 내지 240 μm, 100 μm 내지 220 μm, 100 μm 내지 200 μm, 100 μm 내지 190 μm, 100 μm 내지 180 μm, 100 μm 내지 170 μm, 100 μm 내지 160 μm, 100 μm 내지 150 μm, 110 μm 내지 300 μm, 110 μm 내지 280 μm, 110 μm 내지 260 μm, 110 μm 내지 240 μm, 110 μm 내지 220 μm, 110 μm 내지 200 μm, 110 μm 내지 190 μm, 110 μm 내지 180 μm, 110 μm 내지 170 μm, 110 μm 내지 160 μm, 110 μm 내지 150 μm, 120 μm 내지 300 μm, 120 μm 내지 280 μm, 120 μm 내지 260 μm, 120 μm 내지 240 μm, 120 μm 내지 220 μm, 120 μm 내지 200 μm, 120 μm 내지 190 μm, 120 μm 내지 180 μm, 120 μm 내지 170 μm, 120 μm 내지 160 μm, 120 μm 내지 150 μm, 130 μm 내지 300 μm, 130 μm 내지 280 μm, 130 μm 내지 260 μm, 130 μm 내지 240 μm, 130 μm 내지 220 μm, 130 μm 내지 200 μm, 130 μm 내지 190 μm, 130 μm 내지 180 μm, 130 μm 내지 170 μm, 130 μm 내지 160 μm, 130 μm 내지 150 μm, 140 μm 내지 300 μm, 140 μm 내지 280 μm, 140 μm 내지 260 μm, 140 μm 내지 240 μm, 140 μm 내지 220 μm, 140 μm 내지 200 μm, 140 μm 내지 190 μm, 140 μm 내지 180 μm, 140 μm 내지 170 μm, 140 μm 내지 160 μm, 140 μm 내지 150 μm, 150 μm 내지 300 μm, 150 μm 내지 280 μm, 150 μm 내지 260 μm, 150 μm 내지 240 μm, 150 μm 내지 220 μm, 150 μm 내지 200 μm, 150 μm 내지 190 μm, 150 μm 내지 180 μm, 150 μm 내지 170 μm 또는 150 μm 내지 160 μm로 제조될 수 있고, 예를 들어, 150 μm로 제조될 수 있다.The width of the micro pillars is 50 μm to 300 μm, 50 μm to 280 μm, 50 μm to 260 μm, 50 μm to 240 μm, 50 μm to 220 μm, 50 μm to 200 μm, 50 μm to 190 μm, 50 μm To 180 μm, 50 μm to 170 μm, 50 μm to 160 μm, 50 μm to 150 μm, 75 μm to 300 μm, 75 μm to 280 μm, 75 μm to 260 μm, 75 μm to 240 μm, 75 μm to 220 μm, 75 μm to 200 μm, 75 μm to 190 μm, 75 μm to 180 μm, 75 μm to 170 μm, 75 μm to 160 μm, 75 μm to 150 μm, 100 μm to 300 μm, 100 μm to 280 μm, 100 μm to 260 μm, 100 μm to 240 μm, 100 μm to 220 μm, 100 μm to 200 μm, 100 μm to 190 μm, 100 μm to 180 μm, 100 μm to 170 μm, 100 μm to 160 μm, 100 μm To 150 μm, 110 μm to 300 μm, 110 μm to 280 μm, 110 μm to 260 μm, 110 μm to 240 μm, 110 μm to 220 μm, 110 μm to 200 μm, 110 μm to 190 μm, 110 μm to 180 μm, 110 μm to 170 μm, 110 μm to 160 μm, 110 μm to 150 μm, 120 μm to 300 μm, 120 μm to 280 μm, 120 μm to 260 μm, 120 μm to 240 μm, 120 μm to 220 μm, 120 μm to 200 μm, 120 μm to 190 μm, 120 μm to 180 μm, 120 μm to 170 μm, 120 μm to 160 μm, 120 μm to 150 μm, 130 μm to 300 μm, 130 μm to 280 μm, 130 μm to 260 μm, 130 μm to 240 μm, 130 μm to 220 μm, 130 μm to 200 μm, 130 μm to 190 μm, 130 μm to 180 μm, 130 μm to 170 μm, 130 μm To 160 μm, 130 μm to 150 μm, 140 μm to 300 μm, 140 μm to 280 μm, 140 μm to 260 μm, 140 μm to 240 μm, 140 μm to 220 μm, 140 μm to 200 μm, 140 μm to 190 μm, 140 μm to 180 μm, 140 μm to 170 μm, 140 μm to 160 μm, 140 μm to 150 μm, 150 μm to 300 μm, 150 μm to 280 μm, 150 μm to 260 μm, 150 μm to 240 μm, 150 μm to 220 μm, 150 μm to 200 μm, 150 μm to 190 μm, 150 μm to 180 μm, 150 μm to 170 μm or 150 μm to 160 μm, for example, 150 μm to be prepared I can.

상기 미세챔버 내에 배열되는 마이크로 필라 간의 간격 비율은 0.1 내지 10:1, 0.1 내지 9:1, 0.1 내지 8:1, 0.1 내지 7:1, 0.1 내지 6:1, 0.1 내지 5:1, 0.1 내지 4:1, 0.1 내지 3:1, 0.1 내지 2:1, 0.1 내지 1:1, 0.5 내지 10:1, 0.5 내지 9:1, 0.5 내지 8:1, 0.5 내지 7:1, 0.5 내지 6:1, 0.5 내지 5:1, 0.5 내지 4:1, 0.5 내지 3:1, 0.5 내지 2:1, 0.5 내지 1:1, 1 내지 10:1, 1 내지 9:1, 1 내지 8:1, 1 내지 7:1, 1 내지 6:1, 1 내지 5:1, 1 내지 4:1, 1 내지 3:1 또는 1 내지 2:1인 것일 수 있고, 예를 들어, 1:1인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. The spacing ratio between the micro pillars arranged in the microchamber is 0.1 to 10:1, 0.1 to 9:1, 0.1 to 8:1, 0.1 to 7:1, 0.1 to 6:1, 0.1 to 5:1, 0.1 to 4:1, 0.1 to 3:1, 0.1 to 2:1, 0.1 to 1:1, 0.5 to 10:1, 0.5 to 9:1, 0.5 to 8:1, 0.5 to 7:1, 0.5 to 6: 1, 0.5 to 5:1, 0.5 to 4:1, 0.5 to 3:1, 0.5 to 2:1, 0.5 to 1:1, 1 to 10:1, 1 to 9:1, 1 to 8:1, It may be 1 to 7:1, 1 to 6:1, 1 to 5:1, 1 to 4:1, 1 to 3:1 or 1 to 2:1, for example, it may be 1:1 However, it is not limited thereto.

상기 미세유체칩은 약물 공급 채널로서 약물 주입구를 포함하는 약물 채널; 및 배양액 공급 채널로서 배양액 주입구를 포함하는 배양액 채널을 포함하는 사이드 채널을 포함할 수 있다. The microfluidic chip includes a drug channel including a drug injection port as a drug supply channel; And a side channel including a culture solution channel including a culture solution injection port as a culture solution supply channel.

상기 사이드 채널에서 약물 주입구 및 배양액 주입구의 폭은 30 μm 내지 300 μm, 30 μm 내지 250 μm, 30 μm 내지 200 μm, 30 μm 내지 150 μm, 30 μm 내지 140 μm, 30 μm 내지 130 μm, 30 μm 내지 120 μm, 30 μm 내지 110 μm, 30 μm 내지 100 μm, 50 μm 내지 300 μm, 50 μm 내지 250 μm, 50 μm 내지 200 μm, 50 μm 내지 150 μm, 50 μm 내지 140 μm, 50 μm 내지 130 μm, 50 μm 내지 120 μm, 50 μm 내지 110 μm, 50 μm 내지 100 μm, 70 μm 내지 300 μm, 70 μm 내지 250 μm, 70 μm 내지 200 μm, 70 μm 내지 150 μm, 70 μm 내지 140 μm, 70 μm 내지 130 μm, 70 μm 내지 120 μm, 70 μm 내지 110 μm, 70 μm 내지 100 μm, 80 μm 내지 300 μm, 80 μm 내지 250 μm, 80 μm 내지 200 μm, 80 μm 내지 150 μm, 80 μm 내지 140 μm, 80 μm 내지 130 μm, 80 μm 내지 120 μm, 80 μm 내지 110 μm, 80 μm 내지 100 μm, 90 μm 내지 300 μm, 90 μm 내지 250 μm, 90 μm 내지 200 μm, 90 μm 내지 150 μm, 90 μm 내지 140 μm, 90 μm 내지 130 μm, 90 μm 내지 120 μm, 90 μm 내지 110 μm 또는 90 μm 내지 100 μm로 제조될 수 있고, 예를 들어, 100 μm로 제조될 수 있다.The width of the drug injection port and the culture solution injection port in the side channel is 30 μm to 300 μm, 30 μm to 250 μm, 30 μm to 200 μm, 30 μm to 150 μm, 30 μm to 140 μm, 30 μm to 130 μm, 30 μm To 120 μm, 30 μm to 110 μm, 30 μm to 100 μm, 50 μm to 300 μm, 50 μm to 250 μm, 50 μm to 200 μm, 50 μm to 150 μm, 50 μm to 140 μm, 50 μm to 130 μm, 50 μm to 120 μm, 50 μm to 110 μm, 50 μm to 100 μm, 70 μm to 300 μm, 70 μm to 250 μm, 70 μm to 200 μm, 70 μm to 150 μm, 70 μm to 140 μm, 70 μm to 130 μm, 70 μm to 120 μm, 70 μm to 110 μm, 70 μm to 100 μm, 80 μm to 300 μm, 80 μm to 250 μm, 80 μm to 200 μm, 80 μm to 150 μm, 80 μm To 140 μm, 80 μm to 130 μm, 80 μm to 120 μm, 80 μm to 110 μm, 80 μm to 100 μm, 90 μm to 300 μm, 90 μm to 250 μm, 90 μm to 200 μm, 90 μm to 150 μm, 90 μm to 140 μm, 90 μm to 130 μm, 90 μm to 120 μm, 90 μm to 110 μm, or 90 μm to 100 μm may be prepared, for example, 100 μm.

상기 사이드 채널에서 약물 주입구와 배양액 주입구는 비대칭적으로 위치하는 것일 수 있다. In the side channel, the drug injection port and the culture solution injection port may be positioned asymmetrically.

상기 약물 채널 및 배양액 공급 채널은 각각 약물 및 배양액이 배출될 수 있는 배출구를 추가적으로 포함할 수 있다. The drug channel and the culture solution supply channel may additionally include an outlet through which the drug and the culture solution can be discharged.

상기 배출구의 폭은 300 μm 내지 2,000 μm, 300 μm 내지 1,800 μm, 300 μm 내지 1,600 μm, 300 μm 내지 1,400 μm, 300 μm 내지 1,200 μm, 300 μm 내지 1,100 μm, 300 μm 내지 1,000 μm, 500 μm 내지 2,000 μm, 500 μm 내지 1,800 μm, 500 μm 내지 1,600 μm, 500 μm 내지 1,400 μm, 500 μm 내지 1,200 μm, 500 μm 내지 1,100 μm, 500 μm 내지 1,000 μm, 700 μm 내지 2,000 μm, 700 μm 내지 1,800 μm, 700 μm 내지 1,600 μm, 700 μm 내지 1,400 μm, 700 μm 내지 1,200 μm, 700 μm 내지 1,100 μm, 700 μm 내지 1,000 μm, 900 μm 내지 2,000 μm, 900 μm 내지 1,800 μm, 900 μm 내지 1,600 μm, 900 μm 내지 1,400 μm, 900 μm 내지 1,200 μm, 900 μm 내지 1,100 μm 또는 900 μm 내지 1,000 μm로 제조될 수 있고, 예를 들어, 1,000 μm로 제조될 수 있다.The width of the outlet is 300 μm to 2,000 μm, 300 μm to 1,800 μm, 300 μm to 1,600 μm, 300 μm to 1,400 μm, 300 μm to 1,200 μm, 300 μm to 1,100 μm, 300 μm to 1,000 μm, 500 μm to 2,000 μm, 500 μm to 1,800 μm, 500 μm to 1,600 μm, 500 μm to 1,400 μm, 500 μm to 1,200 μm, 500 μm to 1,100 μm, 500 μm to 1,000 μm, 700 μm to 2,000 μm, 700 μm to 1,800 μm , 700 μm to 1,600 μm, 700 μm to 1,400 μm, 700 μm to 1,200 μm, 700 μm to 1,100 μm, 700 μm to 1,000 μm, 900 μm to 2,000 μm, 900 μm to 1,800 μm, 900 μm to 1,600 μm, 900 μm to 1,400 μm, 900 μm to 1,200 μm, 900 μm to 1,100 μm, or 900 μm to 1,000 μm may be prepared, for example, 1,000 μm.

상기 사이드 채널은 측면에 배치된 상호 연결 홈을 통해 중앙 채널에 연결되어 약물 및 배양액의 이동을 가능하게 한다. The side channel is connected to the central channel through an interconnection groove disposed on the side to enable the movement of drugs and culture solutions.

상기 상호 연결 홈의 폭은 50 μm 내지 200 μm, 50 μm 내지 150 μm, 50 μm 내지 140 μm, 50 μm 내지 130 μm, 50 μm 내지 120 μm, 50 μm 내지 110 μm, 50 μm 내지 100 μm, 70 μm 내지 200 μm, 70 μm 내지 150 μm, 70 μm 내지 140 μm, 70 μm 내지 130 μm, 70 μm 내지 120 μm, 70 μm 내지 110 μm, 70 μm 내지 100 μm, 80 μm 내지 200 μm, 80 μm 내지 150 μm, 80 μm 내지 140 μm, 80 μm 내지 130 μm, 80 μm 내지 120 μm, 80 μm 내지 110 μm, 80 μm 내지 100 μm, 90 μm 내지 200 μm, 90 μm 내지 150 μm, 90 μm 내지 140 μm, 90 μm 내지 130 μm, 90 μm 내지 120 μm, 90 μm 내지 110 μm 또는 90 μm 내지 100 μm로 제조될 수 있고, The width of the interconnection groove is 50 μm to 200 μm, 50 μm to 150 μm, 50 μm to 140 μm, 50 μm to 130 μm, 50 μm to 120 μm, 50 μm to 110 μm, 50 μm to 100 μm, 70 μm to 200 μm, 70 μm to 150 μm, 70 μm to 140 μm, 70 μm to 130 μm, 70 μm to 120 μm, 70 μm to 110 μm, 70 μm to 100 μm, 80 μm to 200 μm, 80 μm to 150 μm, 80 μm to 140 μm, 80 μm to 130 μm, 80 μm to 120 μm, 80 μm to 110 μm, 80 μm to 100 μm, 90 μm to 200 μm, 90 μm to 150 μm, 90 μm to 140 μm , 90 μm to 130 μm, 90 μm to 120 μm, 90 μm to 110 μm, or 90 μm to 100 μm,

길이는 100 μm 내지 350 μm, 100 μm 내지 300 μm, 100 μm 내지 290 μm, 100 μm 내지 280 μm, 100 μm 내지 270 μm, 100 μm 내지 260 μm, 100 μm 내지 250 μm, 150 μm 내지 350 μm, 150 μm 내지 300 μm, 150 μm 내지 290 μm, 150 μm 내지 280 μm, 150 μm 내지 270 μm, 150 μm 내지 260 μm, 150 μm 내지 250 μm, 180 μm 내지 350 μm, 180 μm 내지 300 μm, 180 μm 내지 290 μm, 180 μm 내지 280 μm, 180 μm 내지 270 μm, 180 μm 내지 260 μm, 180 μm 내지 250 μm, 210 μm 내지 350 μm, 210 μm 내지 300 μm, 210 μm 내지 290 μm, 210 μm 내지 280 μm, 210 μm 내지 270 μm, 210 μm 내지 260 μm, 210 μm 내지 250 μm, 240 μm 내지 350 μm, 240 μm 내지 300 μm, 240 μm 내지 290 μm, 240 μm 내지 280 μm, 240 μm 내지 270 μm, 240 μm 내지 260 μm 또는 240 μm 내지 250 μm로 제조될 수 있으며, Lengths are 100 μm to 350 μm, 100 μm to 300 μm, 100 μm to 290 μm, 100 μm to 280 μm, 100 μm to 270 μm, 100 μm to 260 μm, 100 μm to 250 μm, 150 μm to 350 μm, 150 μm to 300 μm, 150 μm to 290 μm, 150 μm to 280 μm, 150 μm to 270 μm, 150 μm to 260 μm, 150 μm to 250 μm, 180 μm to 350 μm, 180 μm to 300 μm, 180 μm To 290 μm, 180 μm to 280 μm, 180 μm to 270 μm, 180 μm to 260 μm, 180 μm to 250 μm, 210 μm to 350 μm, 210 μm to 300 μm, 210 μm to 290 μm, 210 μm to 280 μm, 210 μm to 270 μm, 210 μm to 260 μm, 210 μm to 250 μm, 240 μm to 350 μm, 240 μm to 300 μm, 240 μm to 290 μm, 240 μm to 280 μm, 240 μm to 270 μm, 240 μm to 260 μm or 240 μm to 250 μm can be prepared,

높이는 100 μm 내지 250 μm, 100 μm 내지 220 μm, 100 μm 내지 190 μm, 100 μm 내지 170 μm, 100 μm 내지 150 μm, 120 μm 내지 250 μm, 120 μm 내지 220 μm, 120 μm 내지 190 μm, 120 μm 내지 170 μm, 120 μm 내지 150 μm, 140 μm 내지 250 μm, 140 μm 내지 220 μm, 140 μm 내지 190 μm, 140 μm 내지 170 μm 또는 140 μm 내지 150 μm로 제조될 수 있다. Height 100 μm to 250 μm, 100 μm to 220 μm, 100 μm to 190 μm, 100 μm to 170 μm, 100 μm to 150 μm, 120 μm to 250 μm, 120 μm to 220 μm, 120 μm to 190 μm, 120 μm to 170 μm, 120 μm to 150 μm, 140 μm to 250 μm, 140 μm to 220 μm, 140 μm to 190 μm, 140 μm to 170 μm, or 140 μm to 150 μm.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 사이드 채널은 폭 100 μm, 길이 250 μm, 높이 150 μm의 상호 연결 홈을 통해 중앙 채널에 연결될 수 있다. According to one embodiment of the present invention, the side channel may be connected to the central channel through an interconnection groove having a width of 100 μm, a length of 250 μm, and a height of 150 μm.

상기 사이드 채널에는 5 내지 20개, 5 내지 18개, 5 내지 16개, 5 내지 14개, 5 내지 13개, 5 내지 12개, 5 내지 11개, 7 내지 20개, 7 내지 18개, 7 내지 16개, 7 내지 14개, 7 내지 13개, 7 내지 12개, 7 내지 11개, 9 내지 20개, 9 내지 18개, 9 내지 16개, 9 내지 14개, 9 내지 13개, 9 내지 12개, 9 내지 11개, 10 내지 20개, 10 내지 18개, 10 내지 16개, 10 내지 14개, 10 내지 13개, 10 내지 12개 또는 10 내지 11개, 예를 들어, 11개의 상호 연결 홈이 배치될 수 있다. The side channels include 5 to 20, 5 to 18, 5 to 16, 5 to 14, 5 to 13, 5 to 12, 5 to 11, 7 to 20, 7 to 18, 7 To 16, 7 to 14, 7 to 13, 7 to 12, 7 to 11, 9 to 20, 9 to 18, 9 to 16, 9 to 14, 9 to 13, 9 To 12, 9 to 11, 10 to 20, 10 to 18, 10 to 16, 10 to 14, 10 to 13, 10 to 12 or 10 to 11, for example 11 Interconnecting grooves may be arranged.

상기 약물 채널의 약물 주입구 및 배양액 채널의 배양액 주입구를 통해 각각 약물 및 배양액이 주입되며, 주입된 약물 및 배양액이 상호 연결 홈을 통해 중앙 채널로 이동하며 확산을 통해 중앙 채널 내에서 농도구배를 형성할 수 있다. The drug and the culture solution are respectively injected through the drug injection port of the drug channel and the culture solution injection port of the culture solution channel, and the injected drug and culture solution move to the central channel through the interconnection groove and form a concentration gradient within the central channel through diffusion. I can.

본 발명의 다른 양태는 상기 미세유체칩을 이용한 줄기세포의 배양 또는 분화 방법에 관한 것이다. Another aspect of the present invention relates to a method for culturing or differentiating stem cells using the microfluidic chip.

상기 미세유체칩은 줄기세포 배양 및 분화에 이용될 수 있다.The microfluidic chip may be used for stem cell culture and differentiation.

상기 미세유체칩을 이용한 줄기세포 배양 또는 분화 방법은 중앙 채널의 주입구를 통해 중앙 채널로 세포를 함유한 배양액을 주입하여 마이크로 필라에 세포를 트랩하는 단계를 포함할 수 있다. The stem cell culture or differentiation method using the microfluidic chip may include the step of trapping the cells in the micropillars by injecting a culture solution containing cells into the central channel through an inlet of the central channel.

본 발명의 미세유체칩은 특히 신경구 형태의 신경줄기세포의 배양에 적용될 수 있으며, 배양액의 변경을 통해 신경줄기세포의 분화를 유도할 수 있다. The microfluidic chip of the present invention can be particularly applied to cultivation of neural stem cells in the form of neurospheres, and differentiation of neural stem cells can be induced by changing the culture medium.

또한, 본 발명의 미세유체칩은 유도만능줄기세포의 배양에 적용될 수 있으며, 배양액의 변경을 통해 운동신경세포로의 분화를 유도할 수 있다. In addition, the microfluidic chip of the present invention can be applied to culture of induced pluripotent stem cells, and differentiation into motor neurons can be induced by changing the culture medium.

본 발명의 또 다른 양태는 상기 미세유체칩에 줄기세포를 배양하여 신경망(neurite network)을 형성시키는 방법에 관한 것이다. Another aspect of the present invention relates to a method of forming a neural network by culturing stem cells on the microfluidic chip.

상기 줄기세포는 유도만능줄기세포 또는 신경줄기세포일 수 있다. The stem cells may be induced pluripotent stem cells or neural stem cells.

상기 미세유체칩은 유도만능줄기세포 또는 신경줄기세포 배양을 통해 신경망을 형성시키는데 이용될 수 있다.The microfluidic chip may be used to form a neural network through culture of induced pluripotent stem cells or neural stem cells.

상기 미세유체칩에 유도만능줄기세포 또는 신경줄기세포를 배양하여 신경세포로의 분화를 유도하는 경우, 신경세포로부터 신경돌기가 효과적으로 형성되며 그에 따라 이격되어 있는 마이크로 필라 사이에 신경망이 형성된다. When the induced pluripotent stem cells or neural stem cells are cultured on the microfluidic chip to induce differentiation into nerve cells, neural processes are effectively formed from the neural cells, thereby forming a neural network between the spaced micro pillars.

본 발명의 또 다른 양태는 상기 미세유체칩을 이용하여 신경계질환 치료제 약물 후보를 스크리닝 하는 방법에 관한 것이다. Another aspect of the present invention relates to a method of screening a drug candidate for treating neurological diseases using the microfluidic chip.

상기 미세유체칩은 유도만능줄기세포 또는 신경줄기세포 배양을 통해 신경세포로의 분화를 유도할 수 있으며, 상기 신경세포에 신경계질환 치료제 약물 후보를 처리하여 약물에 따른 신경세포의 반응을 확인함으로써 약물의 효능을 평가할 수 있다.The microfluidic chip can induce differentiation into nerve cells through cultivation of induced pluripotent stem cells or neural stem cells, and by treating the nerve cells with a drug candidate for treating neurological diseases, the reaction of the nerve cells according to the drug is confirmed. Efficacy can be evaluated.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 미세유체칩에 유도만능줄기세포 또는 신경줄기세포를 배양하여 신경세포로의 분화를 유도한 다음, 신경세포를 사멸 또는 손상시키는 약물을 처리하고 신경계질환 치료제 약물 후보를 처리한 후 약물 후보 처리에 따른 신경세포의 반응을 확인하여 상기 약물 후보가 신경세포의 사멸 또는 손상을 억제시키는 경우, 상기 약물 후보가 신경계 질환 치료제의 후보물질인 것으로 판단할 수 있다.According to one embodiment of the present invention, by culturing induced pluripotent stem cells or neural stem cells on the microfluidic chip to induce differentiation into nerve cells, then treatment with drugs that kill or damage nerve cells, and drug candidates for neurological diseases When the drug candidate suppresses the death or damage of the nerve cell by checking the response of the neuron according to the treatment of the drug candidate after treatment, it may be determined that the drug candidate is a candidate material for a therapeutic agent for neurological diseases.

상기 신경계 질환은 신경 퇴행성 질환, 뇌경색, 뇌종양, 뇌염, 뇌외상, 편두통, 다발성경화증, 뇌변성질환, 허혈에 의한 질환 또는 뇌출혈에 의한 질환을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. The neurological diseases may include neurodegenerative diseases, cerebral infarction, brain tumors, encephalitis, brain trauma, migraine, multiple sclerosis, brain degenerative diseases, diseases due to ischemia, or diseases due to cerebral hemorrhage, but are not limited thereto.

상기 신경 퇴행성 질환은 알츠하이머병, 헌팅톤 병, 파킨슨 병 또는 근위축성 측삭 경화증일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. The neurodegenerative disease may be Alzheimer's disease, Huntington's disease, Parkinson's disease, or amyotrophic lateral sclerosis, but is not limited thereto.

본 발명의 또 다른 양태는 상기 미세유체칩을 이용하여 신경계질환 치료제의 농도에 따른 효과를 분석하는 방법에 관한 것이다. Another aspect of the present invention relates to a method of analyzing the effect according to the concentration of a neurological disease therapeutic agent using the microfluidic chip.

상기 미세유체칩에서 약물 채널과 배양액 채널에 각각 비대칭적으로 위치한 약물 주입구 및 배양액 주입구를 통해 주입된 약물 및 배양액이 중앙 채널로 이동하여 확산을 통해 중앙 채널 내에서 농도구배를 형성하므로 주입된 약물의 농도 구간별 신경세포의 반응을 확인함으로써 약물의 효과를 분석할 수 있다.In the microfluidic chip, the drug and the culture solution injected through the drug injection port and the culture solution injection port located asymmetrically in the drug channel and the culture solution channel respectively move to the central channel and form a concentration gradient within the central channel through diffusion. It is possible to analyze the effect of the drug by checking the response of the nerve cells for each concentration section.

본 발명은 농도구배 미세유체칩 및 이의 용도에 관한 것으로, 본 발명의 미세유체칩은 줄기세포의 배양 및 분화가 가능하고, 신경구의 형성 및 고정이 가능하며, 단일 칩에서 약물 채널과 배양액 채널에 각각 비대칭적으로 위치한 약물 주입구 및 배양액 주입구를 통해 주입된 약물 및 배양액이 중앙 채널로 이동하여 확산을 통해 중앙 채널 내에서 농도구배를 형성하므로 치료 약물의 농도구간별 치료 효과를 분석할 수 있다. 또한, 본 발명의 미세유체칩은 신경줄기세포, 신경세포, 신경망 형성과 관련된 다양한 신경계질환 연구에 사용될 수 있으며 신경계질환과 관련된 약물 스크리닝 분야에서 매우 유용한 도구로 사용될 수 있다. The present invention relates to a concentration gradient microfluidic chip and its use, wherein the microfluidic chip of the present invention is capable of culturing and differentiating stem cells, forming and fixing neurospheres, and using a single chip for drug channels and culture media channels. Since the drug and the culture medium injected through the asymmetrically located drug injection port and the culture solution injection port move to the central channel and form a concentration gradient within the central channel through diffusion, it is possible to analyze the treatment effect of each concentration section of the therapeutic drug. In addition, the microfluidic chip of the present invention can be used for research on various neurological diseases related to neural stem cells, neurons, and neural networks, and can be used as a very useful tool in the field of drug screening related to neurological diseases.

도 1a는 본 발명의 일 실시예에 따른 농도구배 미세유체칩의 모식도이다.
도 1b는 본 발명의 일 실시예에 따른 농도구배 미세유체칩에 대한 사진이다.
도 1c는 본 발명의 일 실시예에 따른 신경구를 고정하는 바구니 모양의 마이크로 필라에 대한 사진이다.
도 1d는 본 발명의 일 실시예에 따른 미세유체칩 내 중앙채널에 패터닝되는 마이크로 필라에 대한 상세 배치도이다.
도 2a는 본 발명의 일 실시예에 따른 농도구배가 형성되는 미세유체칩의 3차원 시뮬레이션 결과를 나타낸다.
도 2b는 본 발명의 일 실시예에 따른 농도구배 미세유체칩에서 세포가 배양되는 중앙 채널에서의 농도구간별 시뮬레이션 결과를 나타낸다.
도 2c는 본 발명의 일 실시예에 따른 농도구배 미세유체칩에서 세포가 배양되는 중앙 채널의 4, 5번 구간에서의 시뮬레이션 결과와 실험값을 비교한 사진이다.
도 2d는 본 발명의 일 실시예에 따른 농도구배 미세유체칩에서 세포가 배양되는 중앙 채널의 3, 4, 5번 구간에서의 시뮬레이션 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 2e는 본 발명의 일 실시예에 따른 농도구배 미세유체칩에서 세포가 배양되는 중앙 채널의 3, 4, 5번 구간에서의 형광다이를 주입한 후 시간별 형광사진이다.
도 2f는 본 발명의 일 실시예에 따른 농도구배 미세유체칩에서 세포가 배양되는 중앙 채널의 4번 구간에서의 시뮬레이션과 실험값을 비교한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 3a는 본 발명의 일 실시예에 따라 농도구배 미세유체칩에 근위축성 측삭경화증 iPSC를 배양하고 세포 생존율을 확인하기 위해 live & dead 어세이를 실시하여 형광현미경으로 촬영한 결과이다.
도 3b는 도 3a의 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 3c는 본 발명의 일 실시예에 따라 농도구배 미세유체칩에 근위축성 측삭경화증 iPSC를 7일 동안 배양한 후, 공초점 현미경으로 촬영한 결과이다.
도 3d는 본 발명의 일 실시예에 따라 농도구배 미세유체칩에 근위축성 측삭경화증 iPSC를 7일 동안 배양한 후, 탑시가르긴을 처리하고 공초점 현미경으로 촬영한 결과이다.
도 3e는 본 발명의 일 실시예에 따라 농도구배 미세유체칩에 근위축성 측삭경화증 iPSC를 7일 동안 배양한 후, 탑시가르긴 및 리루졸을 처리하고 공초점 현미경으로 촬영한 결과이다.
도 4a는 본 발명의 일 실시예에 따라 농도구배 미세유체칩에 근위축성 측삭경화증 iPSC를 배양하고 공초점 현미경으로 촬영한 결과이다.
도 4b는 본 발명의 일 실시예에 따라 농도구배 미세유체칩에 근위축성 측삭경화증 iPSC를 배양하고 탑시가르긴을 처리한 다음, 공초점 현미경으로 촬영한 결과이다.
도 4c는 본 발명의 일 실시예에 따라 농도구배 미세유체칩에 근위축성 측삭경화증 iPSC를 배양하고 탑시가르긴 및 리루졸을 처리한 다음, 공초점 현미경으로 촬영한 결과이다.
도 4d는 본 발명의 일 실시예에 따라 농도구배 미세유체칩에 근위축성 측삭경화증 iPSC를 배양하고 리루졸 처리 농도에 따른 마이크로 필라 구간별 근위축성 측삭경화증 iPSC의 신경돌기 길이를 측정한 결과이다.
도 4e는 본 발명의 일 실시예에 따라 농도구배 미세유체칩에 근위축성 측삭경화증 iPSC를 배양하고 리루졸 처리 농도에 따른 마이크로 필라 구간별 Tuj1 positive 세포비율(%)을 측정한 결과이다. 1A is a schematic diagram of a concentration gradient microfluidic chip according to an embodiment of the present invention.
1B is a photograph of a concentration gradient microfluidic chip according to an embodiment of the present invention.
1C is a photograph of a basket-shaped micro pillar fixing a nerve sphere according to an embodiment of the present invention.
1D is a detailed layout diagram of a micro pillar patterned in a central channel in a microfluidic chip according to an embodiment of the present invention.
2A shows the results of a 3D simulation of a microfluidic chip in which a concentration gradient is formed according to an embodiment of the present invention.
2B shows a simulation result for each concentration section in a central channel in which cells are cultured in a concentration gradient microfluidic chip according to an embodiment of the present invention.
2C is a photograph comparing simulation results and experimental values in sections 4 and 5 of a central channel in which cells are cultured in a concentration gradient microfluidic chip according to an embodiment of the present invention.
2D is a graph showing simulation results in sections 3, 4, and 5 of a central channel in which cells are cultured in a concentration gradient microfluidic chip according to an embodiment of the present invention.
2E is a fluorescence photograph of a concentration gradient microfluidic chip according to an embodiment of the present invention after injection of a fluorescent die in sections 3, 4, and 5 of a central channel in which cells are cultured.
2F is a graph showing a result of comparing simulation and experimental values in section 4 of a central channel in which cells are cultured in a concentration gradient microfluidic chip according to an embodiment of the present invention.
FIG. 3A is a result of culturing amyotrophic lateral sclerosis iPSC on a concentration gradient microfluidic chip according to an embodiment of the present invention, and performing live & dead assays to check cell viability, and photographed with a fluorescence microscope.
3B is a graph showing the results of FIG. 3A.
3C is a result of culturing amyotrophic lateral sclerosis iPSC on a concentration gradient microfluidic chip for 7 days and then photographed with a confocal microscope according to an embodiment of the present invention.
3D is a result of culturing amyotrophic lateral sclerosis iPSC on a concentration gradient microfluidic chip according to an embodiment of the present invention for 7 days, then treated with tapsigargin and photographed with a confocal microscope.
FIG. 3E is a result of culturing amyotrophic lateral sclerosis iPSC on a concentration gradient microfluidic chip for 7 days, treated with tapsigargin and rizol, and photographed with a confocal microscope according to an embodiment of the present invention.
4A is a result of culturing amyotrophic lateral sclerosis iPSC on a concentration gradient microfluidic chip according to an embodiment of the present invention and photographed with a confocal microscope.
FIG. 4B is a result of culturing amyotrophic lateral sclerosis iPSC on a concentration gradient microfluidic chip according to an embodiment of the present invention, treated with Tpsigargin, and then photographed with a confocal microscope.
FIG. 4C is a result of culturing amyotrophic lateral sclerosis iPSC on a concentration gradient microfluidic chip according to an embodiment of the present invention, treated with tapsigargin and rizol, and then photographed with a confocal microscope.
Figure 4d is a result of culturing amyotrophic lateral sclerosis iPSC on a concentration gradient microfluidic chip according to an embodiment of the present invention, and measuring the neurite length of amyotrophic lateral sclerosis iPSC by micropillar section according to the concentration of rizol treatment.
FIG. 4E is a result of culturing amyotrophic lateral sclerosis iPSC on a concentration gradient microfluidic chip according to an embodiment of the present invention and measuring the percentage of Tuj1 positive cells per micropillar section according to the concentration of rizol treatment.

이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail by the following examples. However, these examples are for illustrative purposes only, and the scope of the present invention is not limited by these examples.

실시예 1. 미세유체칩의 설계 및 제작Example 1. Design and fabrication of microfluidic chip

약물 농도에 따른 근위축성 측삭경화증 환자 유래 유도만능줄기세포의 거동을 분석하기 위한 농도구배 미세유체칩을 개발하였다. 미세유체칩은 반도체 제조공정인 포토리소그래피(Photolithography) 기술을 이용하여 제작하였다. A concentration gradient microfluidic chip was developed to analyze the behavior of induced pluripotent stem cells derived from patients with amyotrophic lateral sclerosis according to drug concentration. The microfluidic chip was manufactured using photolithography, a semiconductor manufacturing process.

미세유체칩은 유도만능줄기세포의 운동신경세포로의 분화와 신경망 형성을 위한 중앙 채널과 농도구배 형성을 위한 중앙 채널 양 옆의 약물 채널 및 배양액 채널을 포함하는 사이드 채널로 구성되어 있다. 이 중앙 채널은 세포가 배양되는 챔버이며, 신경구를 균일하게 배열하기 위한 마이크로 필라(150 μm 폭)가 일정한 간격으로 패터닝 되어있다.The microfluidic chip is composed of a central channel for differentiation of induced pluripotent stem cells into motor neurons and formation of a neural network, and a side channel including a drug channel and a culture medium channel on both sides of the central channel for forming a concentration gradient. This central channel is a chamber in which cells are cultured, and micro-pillars (150 μm wide) are patterned at regular intervals to evenly arrange neurospheres.

중앙 채널과 사이드 채널에서 150 μm 높이의 챔버를 만들기 위하여 AutoCAD(Autodesk)를 사용하여 신경구를 잡을 수 있는 마이크로 필라를 포함하는 포토 마스크를 만들고, Su-8 포토레지스트(Photoresist)가 도포된 4인치 실리콘 웨이퍼(Wanxiang SliconPeak Electronics)를 스핀 코트하여(2,000 rpm, 60초) 65℃의 온도에서 20분 동안 프리 베이크한 후 95℃의 온도에서 50분 동안 소프트 베이크 하였다. 그렇게 처리된 실리콘 웨이퍼의 포토레지스터는 UV 광선에 마스크필름을 통과하여 30초 동안 노출시켰다. To create a 150 μm high chamber in the center and side channels, a photomask containing micro pillars capable of holding nerve spheres was made using AutoCAD (Autodesk), and a 4-inch silicon coated with Su-8 photoresist Wafers (Wanxiang SliconPeak Electronics) were spin-coated (2,000 rpm, 60 seconds), pre-baked at 65°C for 20 minutes, and then soft baked at 95°C for 50 minutes. The photoresist of the silicon wafer thus treated was exposed to UV rays through the mask film for 30 seconds.

자외선(UV) 노광 및 포스트 베이크 단계 후에, SU-8 디벨로퍼(Microchem corp.)를 사용하여 현상되지 않은 포토 레지스트를 제거하였다. 이러한 방법으로 패터닝된 실리콘 웨이퍼는 트라이메틸클로로실레인(Chlorotrimethylsilane, Sigma Aldrich)을 사용하여 전처리하였다. 그 후 실리콘 중합체와 경화제(Microchem Corp)의 혼합물(10:1 비율)을 사용하여 실리콘 웨이퍼 위에 부어 PDMS(Polydimethylsiloxane) 스탬프를 생성하였다. 마이크로 패턴화된 실리콘 웨이퍼 위의 PDMS 프리-폴리머 용액을 30분 동안 진공 챔버에 넣어 공기 방울을 제거한 후 80℃에서 2시간 동안 경화시켰다. 경화된 PDMS 스탬프는 실리콘 웨이퍼로부터 조심스럽게 떼어 실험을 진행하였다. 신경구를 배양할 수 있는 미세유체칩은 챔버와 농도구배를 형성할 수 있는 비대칭의 사이드 채널을 포함하고 있는 PDMS와 2x2 cm의 유리(glass)에 산소 플라즈마(Femto Scientific) 결합을 사용하여 수직으로 결합되었다. After ultraviolet (UV) exposure and post bake steps, the undeveloped photoresist was removed using a SU-8 developer (Microchem corp.). The silicon wafer patterned in this way was pretreated using trimethylchlorosilane (Sigma Aldrich). Thereafter, a mixture of a silicone polymer and a curing agent (Microchem Corp) (10:1 ratio) was poured onto a silicon wafer to produce a PDMS (Polydimethylsiloxane) stamp. The PDMS pre-polymer solution on the micro-patterned silicon wafer was placed in a vacuum chamber for 30 minutes to remove air bubbles, and then cured at 80° C. for 2 hours. The cured PDMS stamp was carefully removed from the silicon wafer to perform the experiment. Microfluidic chip that can cultivate neurospheres is vertically bonded to PDMS and 2x2 cm glass with an asymmetric side channel that can form a chamber and a concentration gradient using oxygen plasma (Femto Scientific) bonding. Became.

중앙 채널은 세포가 배양되는 챔버이며 150 μm 폭의 신경구를 수월하게 고정하여 신경구를 배양하기 위하여 높이 150 μm를 가지도록 설계되었다. 신경줄기세포와 배양액을 혼합하여 주입구를 통해 신경구를 주입하여 마이크로 필라에 균일하게 들어가도록 하였다. The central channel is a chamber in which cells are cultured, and it is designed to have a height of 150 μm to cultivate neurospheres by easily fixing 150 μm-wide neurospheres. The neural stem cells and the culture solution were mixed, and the neural sphere was injected through the injection port to uniformly enter the micropillar.

또한, 신경구가 균일하게 배열될 수 있도록 바구니 모양의 마이크로 필라(150 μm 폭)(PDMS)가 일정한 간격으로 패터닝 되어있다(도 1c). 배양액의 교체나 면역염색 과정에서 유체의 흐름에 의해 떠내려가는 신경구의 유실을 막을 수 있도록 설계하였다. 하나의 선으로 연결되어 신경구를 담는 모양의 마이크로 필라가 아니라, 4개의 선으로 구성되어 유체가 선과 선 사이의 간격으로 빠져나가면서 난류의 생성을 억제할 수 있게 설계하였다(도 1c). 그로 인해, 마이크로 필라와 유체가 부딪치면서 생길 수 있는 난류로 인한 신경구 유실이 발생하지 않는다. In addition, basket-shaped micro pillars (150 μm wide) (PDMS) are patterned at regular intervals so that the neurospheres can be uniformly arranged (Fig. 1c). It is designed to prevent the loss of neurospheres floating away by the flow of fluid during the process of replacing the culture medium or immunostaining. It was designed to suppress the generation of turbulence as the fluid escapes at the interval between the line and the line, rather than a micro-pillar in the shape of a single line to contain nerve spheres (Fig. 1c). Therefore, loss of nerve spheres due to turbulence that may occur when the micropillar and fluid collide with each other does not occur.

사이드 채널은 약물 채널과 배양액 채널을 포함하며, 유입부 100 μm 폭, 배출부 1,000 μm 폭, 높이 150 μm를 가지도록 설계되었다. 사이드 채널에 각각 배열된 11개의 상호 연결 홈(100 μm 폭, 250 μm 길이, 150 μm 높이)을 통해 중앙채널과 연결되도록 하였다. 비대칭의 유입부를 이용하여 중앙 채널에 층류를 생성하고 약물의 확산을 통해 농도구배를 형성하도록 하였다(도 1a). The side channel includes a drug channel and a culture medium channel, and is designed to have an inlet part 100 μm wide, an outlet part 1,000 μm wide, and a height 150 μm. It was connected to the center channel through 11 interconnecting grooves (100 μm width, 250 μm length, 150 μm height) arranged in each side channel. Laminar flow was created in the central channel using an asymmetric inlet and a concentration gradient was formed through diffusion of the drug (Fig. 1a).

실시예 2. 미세유체칩의 농도구배 확인Example 2. Confirmation of the concentration gradient of the microfluidic chip

농도구배는 컴퓨터 시뮬레이션을 통해서 속도를 최적화 하였으며, 형광다이(fluorescein isothiocyanate-dextran)를 미세유체칩에 주입하여, 시간대별로 안정적인 농도구배를 형성하고 유지하는지 형광현미경을 통해 관찰하였다. 컴퓨터 시뮬레이션 결과를 통해 각 구간별 농도구배를 분석하고, 형광사진의 형광강도를 측정하여 비교하였다(도 2d, 2f). 그 결과 시뮬레이션결과와 비교하여 비슷한 농도구배를 형성하고 유지하는 것을 확인하였다(도 2e). The concentration gradient was optimized through a computer simulation, and a fluorescent die (fluorescein isothiocyanate-dextran) was injected into the microfluidic chip, and it was observed through a fluorescence microscope whether a stable concentration gradient was formed and maintained over time. The concentration gradient for each section was analyzed through the computer simulation results, and the fluorescence intensity of the fluorescent photographs was measured and compared (FIGS. 2d and 2f). As a result, it was confirmed that a similar concentration gradient was formed and maintained in comparison with the simulation result (Fig. 2e).

실시예 3. 유도만능줄기세포 배양 및 약물 효과 분석Example 3. Induced pluripotent stem cell culture and drug effect analysis

3-1. 유도만능줄기세포 배양3-1. Induced pluripotent stem cell culture

근위축성 측삭경화증(Amyotrophic lateral sclerosis: ALS) 환자유래 유도만능줄기세포를 중앙 채널의 세포주입부를 통해 로딩하여 마이크로 필라에 균일하게 고정시켰다. 하루 한번 배양액을 교체하며 7일간 배양한 후, 1일과 7일차에 미세유체칩 내에서 배양된 세포의 생존율을 확인하기 위해 Live & Dead assay(Calcein AM, Ethidium homodimer-1, Invitrogen)를 사용하여 분석하였다. 그 결과, 배양 1일 및 7일차에 90% 이상의 대부분 세포가 살아있음을 확인하였다(도 3a 및 도 3b).Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) patient-derived induced pluripotent stem cells were loaded through the cell injection part of the central channel and uniformly fixed to the micro-pillars. After culturing for 7 days by changing the culture medium once a day, analysis using Live & Dead assay (Calcein AM, Ethidium homodimer-1, Invitrogen) to check the survival rate of cells cultured in the microfluidic chip on days 1 and 7 I did. As a result, it was confirmed that 90% or more of most of the cells were alive on the 1st and 7th days of culture (FIGS. 3A and 3B).

3-2. 약물 효과 분석3-2. Drug effect analysis

근위축성 측삭경화증 환자유래 유도만능줄기세포에 대한 약물의 효과를 확인하기 위해 미세유체칩에서 상기 세포를 7일간 배양하여 운동신경세포로 분화시킨 후 농도구배 없이 약물을 처리하였다.In order to confirm the effect of the drug on induced pluripotent stem cells derived from patients with amyotrophic lateral sclerosis, the cells were cultured on a microfluidic chip for 7 days to differentiate into motor neurons, and then treated with the drug without a concentration gradient.

유도만능줄기세포에서 운동신경세포로의 분화는 미세유체칩에 라미닌(Laminin, invirogen) 코팅을 통하여 신경조직과 유사한 미세환경을 제공해주고, 배양액에 레티노산(Retinoic acid, sigma Aldrich) 0.1 μM, Purmorphamine(sigma Aldrich) 1 μM 을 첨가하여 유도하였다.Differentiation of induced pluripotent stem cells into motor neurons provides a microenvironment similar to neural tissue through laminin (invirogen) coating on microfluidic chips, and 0.1 μM of retinoic acid (sigma Aldrich) in the culture medium, Purmorphamine (sigma Aldrich) was induced by adding 1 μM.

신경독성약물은 신경조직에 독성을 유발하거나 중독성을 나타낼 수 있으며, 신경독소는 발달중인 신경 조직과 성숙한 신경 조직에서 기능적 악영향을 끼칠 수 있는 약물이다. 신경독성약물의 일반적인 예로는 납, 에탄올, 글루탐산염, 산화질소, 보톡스 등이 있다. 글루탐산의 과 농도를 유발하는 탑시가르긴 (Thapsigargin)은 소포체의 작용을 멈춰, 세포를 사멸하는 연구에 자주 사용되는 신경독성물질이다. Neurotoxic drugs can cause toxicity or addiction to nerve tissues, and neurotoxins are drugs that can have a functional adverse effect on developing and mature nervous tissues. Typical examples of neurotoxic drugs include lead, ethanol, glutamate, nitric oxide, and botox. Thapsigargin, which induces glutamic acid concentration, is a neurotoxic substance frequently used in studies to kill cells by stopping the action of the endoplasmic reticulum.

탑시가르긴은 thapsia garganica에서 추출되는 신경독성약물로서 포유류 세포에서 칼슘의 농도를 조절하여 종양 촉진제로 작용하는 연구에 자주 쓰이는 신경독성약물의 종류이다. 세포에 탑시가르긴을 처리하게 되면 세포 내에서 칼슘 (Ca2+)이온 채널의 활성을 억제하게 되어 칼슘이 소포체 내로 유입되지 못하고 세포 내(Cytoplasm)에 남아있게 되어 세포 내의 칼슘 농도가 높게 유지 된다. 이러한 상태에서 칼슘의 농도가 부족해진 소포체에서 산화환원조절, 칼슘 조절, 단백질 과대 발현에 의해 단백질의 접힘이 느려지는 상태(Unfolded proteins)가 되는데, 이러한 상태를 소포체성 스트레스 반응(ER stress)이라고 부른다. Thapsigargin is a neurotoxic drug extracted from thapsia garganica, and is a kind of neurotoxic drug frequently used in research that acts as a tumor promoter by controlling the concentration of calcium in mammalian cells. When the cells are treated with thapsigargin, the activity of the calcium (Ca 2+ ) ion channel is inhibited in the cell, so that calcium does not enter the endoplasmic reticulum and remains in the cell (Cytoplasm), thereby maintaining a high calcium concentration in the cell . In this state, the vesicles with insufficient calcium concentration become unfolded proteins due to redox regulation, calcium regulation, and protein overexpression, which is called ER stress. .

탑시가르긴에 의해 유발된 소포체성 스트레스 반응 상태에서 ATF3 전사 인자가 증가하게 되고, 이러한 메커니즘이 계속될 경우 세포 사멸을 유도하게 된다. 특히 탑시가르긴은 근위축성 측삭경화증 환자 모델을 확립하는 연구에 자주 사용하는 약물이다. 근위축성 측삭경화증 환자에서 세포 내 칼슘의 증가는 글루탐산 염에 의한 흥분 독성 때문이거나 미토콘드리아 기능 결핍 때문에 주로 발생된다. In the endoplasmic stress response state induced by thapsigargin, the ATF3 transcription factor increases, and if this mechanism continues, apoptosis is induced. In particular, tapsigargin is a drug frequently used in studies to establish a patient model for amyotrophic lateral sclerosis. In patients with amyotrophic lateral sclerosis, the increase in intracellular calcium is mainly due to excitotoxicity caused by glutamate or mitochondrial deficiency.

근위축성 측삭경화증을 유도하기 위해 탑시가르긴(Thapsigargin: TG)(1 μM)을 미세유체칩 약물 채널의 약물 주입구를 통해 주입하여 6시간 동안 처리하였고, 근위축성 측삭경화증을 치료하기 위한 치료 약물인 리루졸(Riluzole)(1 μM)을 주입하여 2일 동안 처리하였다. 그 결과, 약물을 처리하지 않은 대조군에서는 근위축성 측삭경화증 환자유래 유도만능줄기세포가 운동신경세포로 분화하고, 신경망이 잘 형성되는 것을 확인하였다(도 3c). 탑시가르긴을 처리하면 운동신경세포의 손상이 일어나 신경돌기들이 파괴되어 질병이 유도되고(도 3d), 리루졸을 처리하면 신경돌기들이 회복되는 현상을 공초점 현미경을 통해 확인하였다(도 3e). To induce amyotrophic lateral sclerosis, Thapsigargin (TG) (1 μM) was injected through the drug inlet of the microfluidic chip drug channel and treated for 6 hours, which is a therapeutic drug to treat amyotrophic lateral sclerosis. Rirusol (Riluzole) (1 μM) was injected and treated for 2 days. As a result, it was confirmed that in the control group not treated with the drug, induced pluripotent stem cells derived from amyotrophic lateral sclerosis patients differentiated into motor neurons, and neural networks were well formed (FIG. 3C). Treatment with thapsigargin caused damage to motor neurons, destroying neurites and inducing disease (Fig. 3d), and treatment with rizole to recover neurites was confirmed through a confocal microscope (Fig. 3e). .

3-3. 농도구배에 따른 약물 효과 분석3-3. Drug effect analysis according to concentration gradient

농도구배 미세유체칩을 이용하여 근위축성 측삭경화증이 유도된 운동신경세포에서 치료약물 농도에 따른 치료효과를 분석하였다. A concentration gradient microfluidic chip was used to analyze the therapeutic effect according to the concentration of the therapeutic drug in motor neurons induced amyotrophic lateral sclerosis.

미세유체칩에서 근위축성 측삭경화증 환자 유래 유도만능줄기세포를 7일간 배양하여 운동신경세포로 분화시킨 다음 탑시가르긴(1 μM)을 6시간 동안 처리하여 근위축성 측삭경화증을 유도하였고, 치료약물인 리루졸(1 μM)을 2일간 처리하여 치료효과를 각 마이크로 필라의 농도구간별로 분석하였다. 그 결과, 리루졸이 99%(1 μM)의 농도로 효과를 미치는 1, 2, 3번 마이크로 필라의 운동신경세포는 신경돌기의 길이가 회복되었고, Tuj1 positive 세포비율이 증가하여 신경돌기의 발현이 높은 것을 알 수 있었다. 반면에, 치료약물이 거의 영향을 미치지 못하여 2%(0.02 μM)의 농도로 효과를 받는 7, 8번 마이크로 필라의 운동신경세포는 신경돌기의 길이가 많이 손상되고, Tuj1 positive 세포비율이 감소하여, 신경돌기의 발현이 매우 낮은 현상을 확인하였다. 또한, 리루졸이 72%(0.7 μM)의 농도로 효과를 미치는 4, 6번 마이크로 필라의 운동신경세포는 신경돌기의 길이가 회복되고, Tuj1 positive 세포비율이 증가하여, 신경돌기의 발현이 높게 나타나는 현상을 관찰하였다. 반면에 43%(0.4 μM)의 농도로 효과를 미치는 5번 마이크로 필라의 운동신경세포는 신경돌기의 길이가 많이 손상되고, Tuj1 positive 세포비율이 감소하여, 신경돌기의 발현이 낮아졌다. 이를 통해 리루졸 0.7 내지 1 μM 농도에서 운동신경세포의 신경돌기가 회복되어 근위축성 측삭경화증에 대하여 치료 효과를 나타낸다는 것을 확인하였다(도 4d). Induced pluripotent stem cells derived from amyotrophic lateral sclerosis patients were cultured on a microfluidic chip for 7 days to differentiate into motor neurons, and then treated with tapsigargin (1 μM) for 6 hours to induce amyotrophic lateral sclerosis. Rirusol (1 μM) was treated for 2 days and the treatment effect was analyzed for each concentration section of each micro-pillar. As a result, the motor neurons of micropillars 1, 2, and 3, where rizol had an effect at a concentration of 99% (1 μM), recovered the length of the neurite, and the proportion of Tuj1 positive cells increased, resulting in the expression of neurite. I could see this high. On the other hand, the motor neurons of micropillars 7, 8, which are effective at a concentration of 2% (0.02 μM) because the therapeutic drug hardly affects the length of the neurite, and the proportion of Tuj1 positive cells decreases. , It was confirmed that the expression of neurite is very low. In addition, the motor neurons of micropillars 4 and 6, where rirusol has an effect at a concentration of 72% (0.7 μM), recovers the length of the neurite and increases the proportion of Tuj1 positive cells, resulting in high neurite expression. The phenomenon that appears was observed. On the other hand, in the motor neurons of micropillar 5, which had an effect at a concentration of 43% (0.4 μM), the length of the neurite was greatly damaged, the proportion of Tuj1 positive cells decreased, and the expression of the neurite was lowered. Through this, it was confirmed that neurites of motor neurons were restored at a concentration of 0.7 to 1 μM of riluzole, thereby exhibiting a therapeutic effect for amyotrophic lateral sclerosis (FIG. 4D).

본 발명의 미세유체칩을 이용하면 단일 칩 내에서 유도만능줄기세포의 운동신경세포로의 분화와 신경망 형성을 효과적으로 유도할 수 있으며, 추가적으로 약물의 농도구배를 형성하여 약물의 농도에 따른 효과를 분석할 수 있다.The use of the microfluidic chip of the present invention can effectively induce differentiation of induced pluripotent stem cells into motor neurons and neural network formation within a single chip, and additionally form a concentration gradient of the drug to analyze the effect according to the concentration of the drug. can do.

Claims (11)

(a) 세포 배양 채널로서 마이크로 필라(micro pillar)를 포함하는 중앙 채널; 및
(b) 약물 공급 채널로서 약물 주입구를 포함하는 약물 채널; 및 배양액 공급 채널로서 배양액 주입구를 포함하는 배양액 채널을 포함하는 사이드 채널을 포함하는 줄기세포 배양용 농도구배 미세유체칩으로서,
상기 사이드 채널은 상기 중앙 채널에 연결되는 것인, 줄기세포의 배양 또는 분화용 농도구배 미세유체칩.
(a) a central channel comprising micro pillars as cell culture channels; And
(b) a drug channel including a drug inlet as a drug supply channel; And as a concentration gradient microfluidic chip for culturing stem cells comprising a side channel including a culture medium channel including a culture medium injection port as a culture medium supply channel,
The side channel is connected to the central channel, the concentration gradient microfluidic chip for culturing or differentiation of stem cells.
 제 1 항에 있어서, 상기 약물 주입구와 상기 배양액 주입구는 비대칭적으로 위치하는 것인, 줄기세포의 배양 또는 분화용 농도구배 미세유체칩.
The microfluidic chip according to claim 1, wherein the drug injection port and the culture solution injection port are located asymmetrically.
 제 1 항에 있어서, 상기 미세유체칩은 배양액 및 약물 주입에 의해 농도구배를 형성하는 것인, 줄기세포의 배양 또는 분화용 농도구배 미세유체칩.
The microfluidic chip according to claim 1, wherein the microfluidic chip forms a concentration gradient by injecting a culture medium and a drug.
 제 1 항에 있어서, 상기 마이크로 필라의 폭은 100 μm 내지 250 μm인 것인, 줄기세포의 배양 또는 분화용 농도구배 미세유체칩.
The microfluidic chip according to claim 1, wherein the width of the micro pillars is 100 μm to 250 μm.
 제 1 항에 있어서, 상기 마이크로 필라는 각각 이격된 4개의 유닛으로 구성되는 것인, 줄기세포의 배양 또는 분화용 농도구배 미세유체칩.
The microfluidic chip according to claim 1, wherein the micro-pillars are composed of four units spaced apart from each other.
 제 5 항에 있어서, 상기 4개 유닛은 U자 형태로 배열되는 것인, 줄기세포의 배양 또는 분화용 농도구배 미세유체칩.
The microfluidic chip according to claim 5, wherein the four units are arranged in a U-shape.
 제 1 항에 있어서, 상기 줄기세포는 유도만능줄기세포 또는 신경줄기세포인 것인, 줄기세포의 배양 또는 분화용 농도구배 미세유체칩.
The microfluidic chip according to claim 1, wherein the stem cells are induced pluripotent stem cells or neural stem cells.
 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항의 미세유체칩을 이용한 줄기세포의 배양 또는 분화 방법.
A method for culturing or differentiating stem cells using the microfluidic chip of any one of claims 1 to 7.
 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항의 미세유체칩에 줄기세포를 배양하여 신경망(neurite network)을 형성시키는 방법.
A method of forming a neural network by culturing stem cells on the microfluidic chip of any one of claims 1 to 7.
 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항의 미세유체칩을 이용하여 신경계질환 치료제 약물 후보를 스크리닝 하는 방법.
A method for screening a drug candidate for treating neurological diseases by using the microfluidic chip of any one of claims 1 to 7.
 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항의 미세유체칩을 이용한 신경계질환 치료제의 농도에 따른 효과 분석 방법. A method for analyzing the effect according to the concentration of the therapeutic agent for neurological diseases using the microfluidic chip of any one of claims 1 to 7.
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