KR101979145B1 - Microfluidic Device for Incubation of Neural Stem cells and Use Thereof - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 신경줄기세포 배양용 미세유체칩 및 이의 용도에 관한 것이다.The present invention relates to a microfluidic chip for culturing neural stem cells and a use thereof.
신경줄기세포(Neural stem cells, NSCs)는 분화되지 않은 상태로 계속 증식하는 자가 증식(Self-renewal)이 가능한 세포이며, 신경세포(Neuron), 성상교세포(Astrocyte), 희소돌기 아교세포(Oligodendrocyte) 등으로 분화된다. 신경계는 인간의 생명 유지 활동에 필요한 대부분의 능력을 제어하는데 필수적이기 때문에, 신경계에 대한 메커니즘을 조사하는 연구가 많이 필요하다. Neural stem cells (NSCs) are self-renewing cells that continue to proliferate in an undifferentiated state. Neurons, Astrocyte, Oligodendrocyte, etc. Lt; / RTI > Since the nervous system is essential for controlling most of the abilities needed for human life-sustaining activities, a great deal of research is needed to investigate the mechanism of the nervous system.
일반적으로 말초신경계를 구성하는 신경세포의 신경돌기(Axon)가 물리적인 손상을 입었을 때, 일정 시간 후에 재생되어 기능을 회복한다고 알려져 있다. 하지만 정상 상태로 회복하기 위하여 오랜 시간이 걸릴 뿐 아니라, 중추신경계의 경우 신경세포가 손상을 입었을 때 대부분 회복하지 못하고 영구적으로 기능 상실 상태로 간다고 알려져 있다. It is generally known that when the axons of the nerve cells constituting the peripheral nervous system are physically damaged, they are regenerated and restored after a certain period of time. However, it is known that it takes a long time to recover to a normal state, and in the central nervous system, when the nerve cell is damaged, most of it is not recovered, and it is known to go permanently to the functional failure state.
실제 임상의학에서 신경계 질환을 근본적으로 치료하는 특별한 치료 방법이 없으며, 현재는 병에 의한 증상 호전적인 치료를 위한 치료법이 대부분이다. 많은 신경세포 연구가 지속되었지만 뇌는 일반적인 장기보다 복잡한 구조를 가지고 있어서, 2차원 환경에서 배양한 세포들과 실제 뇌의 구조와는 확연한 차이를 가진다. 이러한 문제점을 해결하기 위해 마이크로 시스템을 이용하여 뇌의 구조나 기능을 조금 더 정밀하게 재현하고, 중추 신경계를 모사할 수 있는 신경계통의 세포를 이용하여 다양한 조건에서 배양하는 연구가 활발히 진행 중에 있다. In actual clinical medicine, there is no special treatment method for fundamentally treating the nervous system disease. Currently, most of the treatments for the symptomatic treatment of the disease caused by the disease are present. Although many neuron studies continue, the brain has a more complex structure than a normal organ, so there is a distinct difference between the cells cultured in a two-dimensional environment and the actual brain structure. In order to solve these problems, researches are being actively carried out to reproduce the structures and functions of the brain using a microsystem more precisely and cultivate them under various conditions using cells of the nervous system capable of simulating the central nervous system.
마이크로 시스템은 소량의 유체로 손쉽게 다양한 실험을 진행할 수 있고, 실험에 드는 비용을 감소할 수 있으며, 더욱 정확하고 민감한 데이터를 얻을 수 있는 장점이 있다. 이에, 마이크로 시스템을 사용하여 세포의 미세 환경을 모사하거나, 약물 스크리닝을 하는 등의 연구가 다양하게 진행되고 있다. 마이크로 시스템을 이용한 동물세포 배양 방법이 다수 연구되고 있지만, 이러한 방법들은 중력에 의존하여 세포를 트랩하는 원리를 이용하기 때문에 세포가 웰에서 안정적으로 트랩되지 않고, 화학적인 약물이나 배양액 교체 시에 세포가 쉽게 손실된다는 단점이 있다. Microsystems can easily perform a variety of experiments with a small amount of fluid, reduce the cost of experimentation, and have the advantage of obtaining more accurate and sensitive data. Therefore, various studies such as simulating the microenvironment of a cell using a micro system or performing drug screening have been carried out variously. Although many animal cell culture methods using micro systems have been studied, since these methods depend on the principle of trapping cells depending on gravity, the cells are not stably trapped in the wells, and when the chemical drug or the culture medium is replaced, There is a drawback that it is easily lost.
본 발명자들은 종래 미세유체칩의 기술적인 단점들을 극복하고자 연구 노력하였고, 그 결과, 신경구 크기의 조절이 가능하고, 신경세포 분화 및 신경망 형성이 가능하며 신경망에 대한 약물의 영향을 분석할 수 있는 신경줄기세포 배양용 미세유체칩을 개발하였다. The present inventors have made efforts to overcome the technical shortcomings of the conventional microfluidic chip. As a result, the present inventors have found that it is possible to control the size of the nerve ganglia, to form neural differentiation and neural network, Microfluidic chips for cell culture were developed.
이에, 본 발명의 목적은 신경줄기세포 배양용 미세유체칩을 제공하는 것이다. Accordingly, an object of the present invention is to provide a microfluidic chip for neural stem cell culture.
본 발명의 다른 목적은 신경줄기세포 배양용 미세유체칩을 이용한 신경줄기세포 배양 방법을 제공하는 것이다. Another object of the present invention is to provide a method for culturing neural stem cells using a microfluidic chip for culturing neural stem cells.
본 발명의 다른 목적은 신경줄기세포 배양용 미세유체칩에 신경줄기세포를 배양하여 신경망(neurite network)을 형성시키는 방법을 제공하는 것이다. It is another object of the present invention to provide a method of forming a neurite network by culturing neural stem cells in a microfluidic chip for neural stem cell culture.
본 발명의 또 다른 목적은 신경줄기세포 배양용 미세유체칩을 이용하여 신경계 질환 치료제 약물 후보를 스크리닝 하는 방법을 제공하는 것이다. It is still another object of the present invention to provide a method for screening a drug candidate for a therapeutic agent for neurological diseases using a microfluidic chip for neural stem cell culture.
본 발명은 신경줄기세포 배양용 미세유체칩 및 상기 미세유체칩의 용도에 관한 것이다. The present invention relates to a microfluidic chip for culturing a neural stem cell and a use of the microfluidic chip.
이하 본 발명을 더욱 자세히 설명하고자 한다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail.
기존의 미세유체칩은 신경구를 균일한 크기로 배양하는데 어려움이 있었고 미세유체칩 내에서 신경구를 신경세포로 분화시키고 신경망 형성을 유도하는데 적합하지 않다는 단점이 있었다. 또한, 기존의 미세유체칩에서는 약물을 통하여 신경망을 조절하는 것이 어려우며 실험 방법도 복잡했다. Conventional microfluidic chips have difficulties in cultivating neural goblets to a uniform size, and have disadvantages in that they are not suitable for inducing neuronal differentiation and neuronal differentiation in microfluidic chips. In addition, it is difficult to control the neural network through the drug in the conventional microfluidic chip, and the experimental method is also complicated.
이에, 본 발명자들은 균일한 크기로 신경구를 배양할 수 있으며, 신경세포로의 분화 및 신경망 형성을 조절할 수 있는 미세유체칩을 개발하였다. Accordingly, the present inventors have developed a microfluidic chip capable of culturing neurons in a uniform size and capable of regulating neuronal differentiation and neural network formation.
본 발명의 일 양태는 신경줄기세포 배양용 미세유체칩에 관한 것이다. One aspect of the present invention relates to a microfluidic chip for culturing neural stem cells.
본 발명의 미세유체칩은 미세챔버를 포함하는 미세유체칩으로서, 상기 미세챔버는 신경세포가 트랩되는 마이크로 필라를 포함하는 것일 수 있다. The microfluidic chip of the present invention is a microfluidic chip including a fine chamber, and the fine chamber may include a micropillar in which nerve cells are trapped.
상기 미세챔버는 신경줄기세포가 배양되는 챔버로서, 신경줄기세포 배양을 통해 신경돌기가 형성되는 공간을 의미한다. The microchamber is a chamber in which neural stem cells are cultured, and refers to a space in which neural progenitors are formed through the cultivation of neural stem cells.
배양 중인 신경줄기세포의 가장 큰 특징은 세포가 자유롭게 떠다니는 세포 덩어리 형태의 신경구를 만들면서 증식한다는 것으로, 상기 미세챔버에서 배양되는 신경줄기세포는 신경구(neurosphere) 형태로 주입되는 것일 수 있다. The most prominent feature of neural stem cells in culture is that the cells proliferate while forming free floating nerve-like neurons. Neural stem cells cultured in the microchamber may be injected in the form of neurospheres.
상기 미세챔버는 세포 시료 및 배양액을 공급할 수 있는 주입구(inlet) 및 배양액이 배출될 수 있는 배출구(outlet)을 포함할 수 있다. The fine chamber may include an inlet through which the cell sample and the culture liquid can be supplied, and an outlet through which the culture liquid can be discharged.
상기 미세챔버는 100 μm 내지 250 μm, 100 μm 내지 240 μm, 100 μm 내지 230 μm, 100 μm 내지 220 μm, 100 μm 내지 210 μm, 100 μm 내지 200 μm, 100 μm 내지 190 μm, 100 μm 내지 180 μm, 100 μm 내지 170 μm, 100 μm 내지 160 μm, 100 μm 내지 150 μm, 110 μm 내지 250 μm, 110 μm 내지 240 μm, 110 μm 내지 230 μm, 110 μm 내지 220 μm, 110 μm 내지 210 μm, 110 μm 내지 200 μm, 110 μm 내지 190 μm, 110 μm 내지 180 μm, 110 μm 내지 170 μm, 110 μm 내지 160 μm, 110 μm 내지 150 μm, 120 μm 내지 250 μm, 120 μm 내지 240 μm, 120 μm 내지 230 μm, 120 μm 내지 220 μm, 120 μm 내지 210 μm, 120 μm 내지 200 μm, 120 μm 내지 190 μm, 120 μm 내지 180 μm, 120 μm 내지 170 μm, 120 μm 내지 160 μm, 120 μm 내지 150 μm, 130 μm 내지 250 μm, 130 μm 내지 240 μm, 130 μm 내지 230 μm, 130 μm 내지 220 μm, 130 μm 내지 210 μm, 130 μm 내지 200 μm, 130 μm 내지 190 μm, 130 μm 내지 180 μm, 130 μm 내지 170 μm, 130 μm 내지 160 μm, 130 μm 내지 150 μm, 140 μm 내지 250 μm, 140 μm 내지 240 μm, 140 μm 내지 230 μm, 140 μm 내지 220 μm, 140 μm 내지 210 μm, 140 μm 내지 200 μm, 140 μm 내지 190 μm, 140 μm 내지 180 μm, 140 μm 내지 170 μm, 140 μm 내지 160 μm, 140 μm 내지 150 μm, 150 μm 내지 250 μm, 150 μm 내지 240 μm, 150 μm 내지 230 μm, 150 μm 내지 220 μm, 150 μm 내지 210 μm, 150 μm 내지 200 μm, 150 μm 내지 190 μm, 150 μm 내지 180 μm, 150 μm 내지 170 μm 또는 150 μm 내지 160 μm의 높이로 제조될 수 있고, 예를 들어, 150 μm의 높이로 제조될 수 있다. Wherein the microchamber has a thickness of 100 to 250 μm, 100 to 240 μm, 100 μm to 230 μm, 100 μm to 220 μm, 100 μm to 210 μm, 100 μm to 200 μm, 100 μm to 190 μm, 110 to 250 μm, 110 to 240 μm, 110 to 230 μm, 110 μm to 220 μm, 110 μm to 210 μm, 100 μm to 170 μm, 100 μm to 160 μm, 100 μm to 150 μm, 110 μm to 200 μm, 110 μm to 190 μm, 110 μm to 180 μm, 110 μm to 170 μm, 110 μm to 160 μm, 110 μm to 150 μm, 120 μm to 250 μm, 120 μm to 240 μm and 120 μm 120 to 200 占 퐉, 120 to 180 占 퐉, 120 to 170 占 퐉, 120 to 160 占 퐉, 120 占 퐉 to 150 占 퐉 130 占 퐉 to 250 占 퐉, 130 占 퐉 to 240 占 퐉, 130 占 퐉 to 230 占 퐉, 130 占 퐉 to 220 占 퐉, 130 占 퐉 to 210 占 퐉, 130 占 퐉 200 占 퐉, 130 占 퐉 190 占 퐉, 130 占 퐉 18 130 μm to 160 μm, 130 μm to 150 μm, 140 μm to 250 μm, 140 μm to 240 μm, 140 μm to 230 μm, 140 μm to 220 μm, 140 μm to 210 μm 140 to 200 μm, 140 to 190 μm, 140 to 180 μm, 140 μm to 170 μm, 140 μm to 160 μm, 140 μm to 150 μm, 150 μm to 250 μm, 150 μm to 240 μm and 150 from 150 to 200 μm, from 150 to 190 μm, from 150 μm to 180 μm, from 150 μm to 170 μm, or from 150 μm to 160 μm And can be manufactured, for example, at a height of 150 [mu] m.
상기 미세챔버는 다각형인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 상기 다각형은 삼각형, 사각형 또는 육각형인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 예를 들어, 정삼각형, 이등변삼각형, 직각삼각형, 정사각형, 직사각형, 사다리꼴, 마름모, 또는 정육각형인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.The fine chamber may be polygonal, but is not limited thereto. The polygon may be triangular, square, or hexagonal, but is not limited thereto. For example, the polygon may be an equilateral triangle, an isosceles triangle, a right triangle, a square, a rectangle, a trapezoid, a rhombus, It is not.
상기 미세챔버의 크기는 1.0 mm ⅹ 20.0 mm, 1.0 mm ⅹ 19.0 mm, 1.0 mm ⅹ 18.0 mm, 1.0 mm ⅹ 17.0 mm, 1.0 mm ⅹ 16.0 mm, 1.0 mm ⅹ 15.0 mm, 1.0 mm ⅹ 14.0 mm, 1.0 mm ⅹ 13.0 mm, 1.0 mm ⅹ 12.0 mm, 1.0 mm ⅹ 11.0 mm, 1.0 mm ⅹ 10.0 mm, 1.0 mm ⅹ 9.0 mm, 1.0 mm ⅹ 8.5 mm, 1.1 mm ⅹ 20.0 mm, 1.1 mm ⅹ 19.0 mm, 1.1 mm ⅹ 18.0 mm, 1.1 mm ⅹ 17.0 mm, 1.1 mm ⅹ 16.0 mm, 1.1 mm ⅹ 15.0 mm, 1.1 mm ⅹ 14.0 mm, 1.1 mm ⅹ 13.0 mm, 1.1 mm ⅹ 12.0 mm, 1.1 mm ⅹ 11.0 mm, 1.1 mm ⅹ 10.0 mm, 1.1 mm ⅹ 9.0 mm, 1.1 mm ⅹ 8.5 mm, 1.2 mm ⅹ 20.0 mm, 1.2 mm ⅹ 19.0 mm, 1.2 mm ⅹ 18.0 mm, 1.2 mm ⅹ 17.0 mm, 1.2 mm ⅹ 16.0 mm, 1.2 mm ⅹ 15.0 mm, 1.2 mm ⅹ 14.0 mm, 1.2 mm ⅹ 13.0 mm, 1.2 mm ⅹ 12.0 mm, 1.2 mm ⅹ 11.0 mm, 1.2 mm ⅹ 10.0 mm, 1.2 mm ⅹ 9.0 mm, 1.2 mm ⅹ 8.5 mm, 1.3 mm ⅹ 20.0 mm, 1.3 mm ⅹ 19.0 mm, 1.3 mm ⅹ 18.0 mm, 1.3 mm ⅹ 17.0 mm, 1.3 mm ⅹ 16.0 mm, 1.3 mm ⅹ 15.0 mm, 1.3 mm ⅹ 14.0 mm, 1.3 mm ⅹ 13.0 mm, 1.3 mm ⅹ 12.0 mm, 1.3 mm ⅹ 11.0 mm, 1.3 mm ⅹ 10.0 mm, 1.3 mm ⅹ 9.0 mm, 1.3 mm ⅹ 8.5 mm, 1.4 mm ⅹ 20.0 mm, 1.4 mm ⅹ 19.0 mm, 1.4 mm ⅹ 18.0 mm, 1.4 mm ⅹ 17.0 mm, 1.4 mm ⅹ 16.0 mm, 1.4 mm ⅹ 15.0 mm, 1.4 mm ⅹ 14.0 mm, 1.4 mm ⅹ 13.0 mm, 1.4 mm ⅹ 12.0 mm, 1.4 mm ⅹ 11.0 mm, 1.4 mm ⅹ 10.0 mm, 1.4 mm ⅹ 9.0 mm, 1.4 mm ⅹ 8.5 mm, 1.5 mm ⅹ 20.0 mm, 1.5 mm ⅹ 19.0 mm, 1.5 mm ⅹ 18.0 mm, 1.5 mm ⅹ 17.0 mm, 1.5 mm ⅹ 16.0 mm, 1.5 mm ⅹ 15.0 mm, 1.5 mm ⅹ 14.0 mm, 1.5 mm ⅹ 13.0 mm, 1.5 mm ⅹ 12.0 mm, 1.5 mm ⅹ 11.0 mm, 1.5 mm ⅹ 10.0 mm 또는 1.5 mm ⅹ 9.0 mm 일 수 있고, 예를 들어, 1.5 mm ⅹ 8.5 mm 일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. The size of the fine chamber is 1.0 mm x 20.0 mm, 1.0 mm x 19.0 mm, 1.0 mm x 18.0 mm, 1.0 mm x 17.0 mm, 1.0 mm x 16.0 mm, 1.0 mm x 15.0 mm, 1.0 mm x 14.0 mm, 1.0 mm Ⅹ 13.0 mm, 1.0 mm ⅹ 12.0 mm, 1.0 mm ⅹ 11.0 mm, 1.0 mm ⅹ 10.0 mm, 1.0 mm ⅹ 9.0 mm, 1.0 mm ⅹ 8.5 mm, 1.1 mm ⅹ 20.0 mm, 1.1 mm ⅹ 19.0 mm, 1.1 mm ⅹ 18.0 1.1 mm ⅹ 16.0 mm, 1.1 mm ⅹ 15.0 mm, 1.1 mm ⅹ 14.0 mm, 1.1 mm ⅹ 13.0 mm, 1.1 mm ⅹ 12.0 mm, 1.1 mm ⅹ 11.0 mm, 1.1 mm ⅹ 10.0 mm, 1.1 mm ⅹ 9.0 mm, 1.1 mm ⅹ 8.5 mm, 1.2 mm ⅹ 20.0 mm, 1.2 mm ⅹ 19.0 mm, 1.2 mm ⅹ 18.0 mm, 1.2 mm ⅹ 17.0 mm, 1.2 mm ⅹ 16.0 mm, 1.2 mm ⅹ 15.0 mm, 1.2 mm 1.2 mm ⅹ 9.0 mm, 1.2 mm ⅹ 8.5 mm, 1.3 mm ⅹ 20.0 mm, 1.3 mm ⅹ 19.0 mm, 1.2 mm ⅹ 11.0 mm, 1.2 mm ⅹ 11.0 mm, 1.2 mm ⅹ 10.0 mm, 1.2 mm ⅹ 9.0 mm, 1.2 mm ⅹ 13.0 mm, mm, 1.3 mm ⅹ 18.0 mm, 1.3 mm ⅹ 17.0 mm, 1.3 mm ⅹ 16.0 mm, 1.3 mm ⅹ 15.0 mm, 1.3 mm ⅹ 14.0 mm, 1.3 mm ⅹ 13.0 mm, 1.3 mm ⅹ 12.0 mm, 1.3 mm ⅹ 11 1.4 mm ⅹ 20.0 mm, 1.4 mm ⅹ 19.0 mm, 1.4 mm ⅹ 18.0 mm, 1.4 mm ⅹ 17.0 mm, 1.4 mm ⅹ 16.0 mm, 1.3 mm ⅹ 9.0 mm, 1.3 mm ⅹ 8.5 mm, mm, 1.4 mm ⅹ 15.0 mm, 1.4 mm ⅹ 14.0 mm, 1.4 mm ⅹ 13.0 mm, 1.4 mm ⅹ 12.0 mm, 1.4 mm ⅹ 11.0 mm, 1.4 mm ⅹ 10.0 mm, 1.4 mm ⅹ 9.0 mm, 1.4 mm ⅹ 8.5 mm, 1.5 mm ⅹ 20.0 mm, 1.5 mm ⅹ 19.0 mm, 1.5 mm ⅹ 18.0 mm, 1.5 mm ⅹ 17.0 mm, 1.5 mm ⅹ 16.0 mm, 1.5 mm ⅹ 15.0 mm, 1.5 mm ⅹ 14.0 mm, 1.5 mm ⅹ 13.0 mm, 1.5 mm X 12.0 mm, 1.5 mm x 11.0 mm, 1.5 mm x 10.0 mm, or 1.5 mm x 9.0 mm, for example, 1.5 mm x 8.5 mm, but is not limited thereto.
상기 미세챔버는 폴리디메틸실록산(poly(dimethylsiloxane), PDMS), 폴리메틸메타크릴레이트(polymethylmethacrylate, PMMA), 폴리아크릴레이트(polyacrylates), 폴리카보네이트(polycarbonates) 및 폴리사이클릭올레핀(polycyclic olefins)으로 이루어진 군으로부터 선택된 1 종 이상으로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 예를 들어, 상기 미세챔버는 폴리디메틸실록산(poly(dimethylsiloxane), PDMS)로 이루어진 것일 수 있다. The fine chamber may be made of a material selected from the group consisting of polydimethylsiloxane (PDMS), polymethylmethacrylate (PMMA), polyacrylates, polycarbonates, and polycyclic olefins. , But is not limited thereto. For example, the fine chamber may be made of polydimethylsiloxane (PDMS).
상기 미세챔버는 마이크로 필라를 포함할 수 있다. The microchamber may include a micropillar.
상기 마이크로 필라는 미세챔버로 주입된 신경줄기세포가 트랩되어 배양되는 공간을 의미한다. The micropillar means a space in which neural stem cells injected into a microchamber are trapped and cultured.
상기 마이크로 필라에 의해 미세챔버를 통해 마이크로 필라 구조 내로 주입되는 세포 시료 및 배양액으로부터 세포가 트랩되어 유실되는 것을 방지할 수 있다. 세포 배양액 교체 또는 약물 처리를 위해 미세챔버 내로 배양액 또는 약물을 주입하는 경우, 압력과 유속에 의해 세포 유실 또는 손상이 발생할 수 있으나, 마이크로 필라에 의해 미세챔버 내에서 유체의 흐름이 차단되어 세포 유실을 방지하고, 높은 세포 생존율을 유지할 수 있도록 한다. It is possible to prevent cells from being trapped and lost from a cell sample and culture fluid injected into the micropillar structure through the microchambers by the micropilars. When a culture medium or drug is injected into a microchamber for cell culture fluid replacement or drug treatment, cell loss or damage may occur due to pressure and flow rate, but fluid flow in the microchamber is blocked by micropilamera, And maintain high cell viability.
상기 마이크로 필라는 각각 이격된 4개의 유닛으로 구성되며, 상기 4개 유닛은 U자 형태로 미세챔버 내에 배열될 수 있다. The micropillar may be composed of four units spaced apart from each other, and the four units may be arranged in a microchamber in a U-shape.
상기 4개 유닛은 제1유닛, 제2유닛, 제3유닛 및 제4유닛을 포함하고, 제1유닛부터 차례대로 U자 형태로 배열될 수 있다. 마이크로 필라의 폭은 제1유닛 및 제4유닛의 배열을 통해 결정될 수 있다. The four units include a first unit, a second unit, a third unit and a fourth unit, and may be arranged in a U-shape in order from the first unit. The width of the micropillar can be determined through the arrangement of the first unit and the fourth unit.
상기 제1유닛 및 제2유닛, 제2유닛 및 제3유닛, 그리고 제3유닛 및 제4유닛은 10 μm 내지 50 μm, 10 μm 내지 45 μm, 10 μm 내지 40 μm, 10 μm 내지 35 μm, 10 μm 내지 30 μm, 15 μm 내지 50 μm, 15 μm 내지 45 μm, 15 μm 내지 40 μm, 15 μm 내지 35 μm, 15 μm 내지 30 μm, 20 μm 내지 50 μm, 20 μm 내지 45 μm, 20 μm 내지 40 μm, 20 μm 내지 35 μm, 20 μm 내지 30 μm, 25 μm 내지 50 μm, 25 μm 내지 45 μm, 25 μm 내지 40 μm, 25 μm 내지 35 μm 또는 25 μm 내지 30 μm의 간격으로 배열될 수 있고, 예를 들어, 30 μm의 간격으로 배열될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. The first and second units, the second and third units, and the third and fourth units may have a thickness ranging from 10 탆 to 50 탆, 10 탆 to 45 탆, 10 탆 to 40 탆, 10 탆 to 35 탆, 15 占 퐉 to 45 占 퐉, 15 占 퐉 to 40 占 퐉, 15 占 퐉 to 35 占 퐉, 15 占 퐉 to 30 占 퐉, 20 占 퐉 to 50 占 퐉, 20 占 퐉 to 45 占 퐉, 20 占 퐉 To 20 μm to 35 μm, 20 μm to 30 μm, 25 μm to 50 μm, 25 μm to 45 μm, 25 μm to 40 μm, 25 μm to 35 μm or 25 μm to 30 μm And may, for example, be arranged at intervals of 30 [mu] m, but are not limited thereto.
상기 마이크로 필라의 폭은 50 μm 내지 300 μm, 50 μm 내지 280 μm, 50 μm 내지 260 μm, 50 μm 내지 240 μm, 50 μm 내지 220 μm, 50 μm 내지 200 μm, 50 μm 내지 190 μm, 50 μm 내지 180 μm, 50 μm 내지 170 μm, 50 μm 내지 160 μm, 50 μm 내지 150 μm, 75 μm 내지 300 μm, 75 μm 내지 280 μm, 75 μm 내지 260 μm, 75 μm 내지 240 μm, 75 μm 내지 220 μm, 75 μm 내지 200 μm, 75 μm 내지 190 μm, 75 μm 내지 180 μm, 75 μm 내지 170 μm, 75 μm 내지 160 μm, 75 μm 내지 150 μm, 100 μm 내지 300 μm, 100 μm 내지 280 μm, 100 μm 내지 260 μm, 100 μm 내지 240 μm, 100 μm 내지 220 μm, 100 μm 내지 200 μm, 100 μm 내지 190 μm, 100 μm 내지 180 μm, 100 μm 내지 170 μm, 100 μm 내지 160 μm, 100 μm 내지 150 μm, 110 μm 내지 300 μm, 110 μm 내지 280 μm, 110 μm 내지 260 μm, 110 μm 내지 240 μm, 110 μm 내지 220 μm, 110 μm 내지 200 μm, 110 μm 내지 190 μm, 110 μm 내지 180 μm, 110 μm 내지 170 μm, 110 μm 내지 160 μm, 110 μm 내지 150 μm, 120 μm 내지 300 μm, 120 μm 내지 280 μm, 120 μm 내지 260 μm, 120 μm 내지 240 μm, 120 μm 내지 220 μm, 120 μm 내지 200 μm, 120 μm 내지 190 μm, 120 μm 내지 180 μm, 120 μm 내지 170 μm, 120 μm 내지 160 μm, 120 μm 내지 150 μm, 130 μm 내지 300 μm, 130 μm 내지 280 μm, 130 μm 내지 260 μm, 130 μm 내지 240 μm, 130 μm 내지 220 μm, 130 μm 내지 200 μm, 130 μm 내지 190 μm, 130 μm 내지 180 μm, 130 μm 내지 170 μm, 130 μm 내지 160 μm, 130 μm 내지 150 μm, 140 μm 내지 300 μm, 140 μm 내지 280 μm, 140 μm 내지 260 μm, 140 μm 내지 240 μm, 140 μm 내지 220 μm, 140 μm 내지 200 μm, 140 μm 내지 190 μm, 140 μm 내지 180 μm, 140 μm 내지 170 μm, 140 μm 내지 160 μm, 140 μm 내지 150 μm, 150 μm 내지 300 μm, 150 μm 내지 280 μm, 150 μm 내지 260 μm, 150 μm 내지 240 μm, 150 μm 내지 220 μm, 150 μm 내지 200 μm, 150 μm 내지 190 μm, 150 μm 내지 180 μm, 150 μm 내지 170 μm 또는 150 μm 내지 160 μm로 제조될 수 있고, 예를 들어, 150 μm로 제조될 수 있다.The width of the micropillar may be in the range of 50 to 300 μm, 50 to 280 μm, 50 to 260 μm, 50 μm to 240 μm, 50 μm to 220 μm, 50 μm to 200 μm, 50 μm to 190 μm, 50 μm 75 to 250 mu m, 75 mu m to 240 mu m, 75 mu m to 220 mu m, and a thickness of 100 mu m to 180 mu m, 50 mu m to 170 mu m, 50 mu m to 160 mu m, 50 mu m to 150 mu m, 75 mu m to 300 mu m, 75 μm to 150 μm, 100 μm to 300 μm, 100 μm to 280 μm, 75 μm to 200 μm, 75 μm to 190 μm, 75 μm to 180 μm, 75 μm to 170 μm, 75 μm to 160 μm, 100 占 퐉 to 260 占 퐉, 100 占 퐉 to 240 占 퐉, 100 占 퐉 to 220 占 퐉, 100 占 퐉 to 200 占 퐉, 100 占 퐉 to 190 占 퐉, 100 占 퐉 to 180 占 퐉, 100 占 퐉 to 170 占 퐉, 110 to 200 mu m, 110 to 190 mu m, 110 to 180 mu m, 110 mu m to 300 mu m, 110 mu m to 280 mu m, 110 mu m to 260 mu m, 110 mu m to 240 mu m, 110 mu m to 220 mu m, μm, 1 120 占 퐉 to 250 占 퐉, 120 占 퐉 to 240 占 퐉, 120 占 퐉 to 220 占 퐉, 120 占 퐉 120 to 150 占 퐉, 130 to 300 占 퐉, 130 to 280 占 퐉, 130 占 퐉 to 260 占 퐉, 200 占 퐉 to 200 占 퐉, 120 占 퐉 to 190 占 퐉, 120 占 퐉 to 180 占 퐉, 120 占 퐉 to 170 占 퐉, 120 占 퐉 to 160 占 퐉, 130 탆 to 130 탆, 130 탆 to 240 탆, 130 탆 to 220 탆, 130 탆 to 200 탆, 130 탆 to 190 탆, 130 탆 to 180 탆, 130 탆 to 170 탆, 130 탆 to 160 탆, 140 to 300, 140 to 280, 140 to 260, 140 to 240, 140 to 220, 140 to 200, 140 to 190, 140 to 180, 140 150 to 250 μm, 150 μm to 240 μm, 150 μm to 220 μm, 150 μm to 20 μm, in the range of from 200 μm to 170 μm, 140 μm to 160 μm, 140 μm to 150 μm, 150 μm to 300 μm, 150 μm to 280 μm, 150 μm to 190 μm, 150 μm to 180 μm, 150 μm to 170 μm, or 150 μm to 160 μm, for example, 150 μm.
상기 미세챔버 내에 배열되는 마이크로 필라 간의 간격 비율은 0.1 내지 10:1, 0.1 내지 9:1, 0.1 내지 8:1, 0.1 내지 7:1, 0.1 내지 6:1, 0.1 내지 5:1, 0.1 내지 4:1, 0.1 내지 3:1, 0.1 내지 2:1, 0.1 내지 1:1, 0.5 내지 10:1, 0.5 내지 9:1, 0.5 내지 8:1, 0.5 내지 7:1, 0.5 내지 6:1, 0.5 내지 5:1, 0.5 내지 4:1, 0.5 내지 3:1, 0.5 내지 2:1, 0.5 내지 1:1, 1 내지 10:1, 1 내지 9:1, 1 내지 8:1, 1 내지 7:1, 1 내지 6:1, 1 내지 5:1, 1 내지 4:1, 1 내지 3:1 또는 1 내지 2:1인 것일 수 있고, 예를 들어, 1:1인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. The micropilars arranged in the microchambers may have a spacing ratio of 0.1 to 10: 1, 0.1 to 9: 1, 0.1 to 8: 1, 0.1 to 7: 1, 0.1 to 6: 1, 0.1 to 5: 0.5 to 8: 1, 0.5 to 7: 1, 0.5 to 6: 1, 0.1 to 3: 1, 0.1 to 2: 1, 0.1 to 1: 1, 0.5 to 10: 1 to 5: 1, 0.5 to 4: 1, 0.5 to 3: 1, 0.5 to 2: 1, 0.5 to 1: 1, 1 to 10: 1, 1 to 9: 1 to 7: 1, 1 to 6: 1, 1 to 5: 1, 1 to 4: 1, 1 to 3: 1 or 1 to 2: 1, However, the present invention is not limited thereto.
본 발명의 다른 양태는 신경줄기세포 배양용 미세유체칩을 이용한 신경줄기세포 배양 방법에 관한 것이다. Another aspect of the present invention relates to a method for culturing neural stem cells using a microfluidic chip for culturing neural stem cells.
상기 미세유체칩은 신경줄기세포 배양에 이용될 수 있다.The microfluidic chip can be used for neural stem cell culture.
상기 미세유체칩을 이용한 신경줄기세포 배양 방법은 주입구를 통해 미세채널로 세포를 함유한 배양액을 주입하여 마이크로 필라에 세포를 트랩하는 단계를 포함할 수 있다. The method of culturing a neural stem cell using the microfluidic chip may include a step of injecting a culture solution containing cells into a microchannel through an injection port to trap cells in the micropilars.
본 발명의 미세유체칩은 특히 신경구 형태의 신경줄기세포의 배양에 적용될 수 있으며, 미세채널에 포함된 주입구 및 배출구를 통해 배양액의 변경을 통해 신경줄기세포의 분화를 유도할 수 있다. The microfluidic chip of the present invention can be applied to the cultivation of neural stem cells in the form of neurons, and the differentiation of neural stem cells can be induced by changing the culture medium through the inlet and outlet included in the microchannel.
본 발명의 다른 양태는 신경줄기세포 배양용 미세유체칩에 신경줄기세포를 배양하여 신경망(neurite network)을 형성시키는 방법에 관한 것이다. Another aspect of the present invention relates to a method of forming a neurite network by culturing neural stem cells in a microfluidic chip for neural stem cell culture.
상기 미세유체칩은 신경줄기세포 배양을 통해 신경망을 형성시키는데 이용될 수 있다.The microfluidic chip can be used to form a neural network through neural stem cell culture.
상기 신경줄기세포 배양 방법으로 세포를 배양하여 신경줄기세포의 분화를 유도하는 경우, 신경세포로부터 신경돌기가 효과적으로 형성되며 그에 따라 이격되어 있는 마이크로 필라 사이에 신경망이 형성된다. When the cells are cultured by the above-mentioned neural stem cell culture method to induce the differentiation of neural stem cells, neurons are effectively formed from the neurons, and thus a neural network is formed between the separated micro pillars.
본 발명의 또 다른 양태는 신경줄기세포 배양용 미세유체칩을 이용하여 신경계질환 치료제 약물 후보를 스크리닝 하는 방법에 관한 것이다. Another aspect of the present invention relates to a method for screening a drug candidate for a therapeutic agent for a neurological disease using a microfluidic chip for culturing a neural stem cell.
상기 미세유체칩은 신경줄기세포 배양을 통해 신경세포로의 분화를 유도할 수 있으며, 상기 신경세포에 신경계질환 치료제 약물 후보를 처리하여 약물에 따른 신경세포의 반응을 확인함으로써 약물의 효능을 평가할 수 있다.The microfluidic chip can induce differentiation into neurons through the cultivation of neural stem cells, and the drug efficacy can be evaluated by treating the neurons with a drug candidate for a therapeutic agent for a neurological disease to confirm the response of the neuron according to the drug .
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 미세유체칩에 신경줄기세포를 배양하여 신경세포로의 분화를 유도한 다음, 신경세포를 사멸 또는 손상시키는 약물을 처리하고 신경계 질환 치료제 약물 후보를 처리한 후 약물 후보 처리에 따른 신경세포의 반응을 확인하여 상기 약물 후보가 신경세포의 사멸 또는 손상을 억제시키는 경우, 상기 약물 후보가 신경계 질환 치료제의 후보물질인 것으로 판단할 수 있다.According to one embodiment of the present invention, neural stem cells are cultured in the microfluidic chip to induce differentiation into neurons, and then the drug that kills or damages neurons is treated, a drug candidate for a therapeutic agent for a neurological disease is treated, When the drug candidates inhibit the death or damage of the neuron by confirming the response of the neuron according to the candidate treatment, it can be judged that the drug candidate is a candidate substance for a therapeutic agent for a neurological disease.
상기 신경계 질환은 신경 퇴행성 질환, 뇌경색, 뇌종양, 뇌염, 뇌외상, 편두통, 다발성경화증, 뇌변성질환, 허혈에 의한 질환 또는 뇌출혈에 의한 질환을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. The neurological diseases may include neurodegenerative diseases, cerebral infarction, brain tumors, encephalitis, brain trauma, migraine, multiple sclerosis, brain degenerative diseases, diseases caused by ischemia, or diseases caused by cerebral hemorrhage.
상기 신경 퇴행성 질환은 알츠하이머병, 헌팅톤 병, 파킨슨 병 또는 근위축성 측삭 경화증일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. The neurodegenerative disease can be, but is not limited to, Alzheimer's disease, Huntington's disease, Parkinson's disease or amyotrophic lateral sclerosis.
본 발명은 신경줄기세포 배양용 미세유체칩 및 상기 미세유체칩의 용도에 관한 것으로, 본 발명에 따른 미세유체칩에서는 균일한 크기로 신경구 형성이 가능하고, 신경세포로의 분화 및 신경망 형성이 가능하다. 본 발명의 미세유체칩은 신경줄기세포, 신경세포, 신경망 형성과 관련된 다양한 신경계 질환 연구에 사용될 수 있으며 신경계 질환과 관련된 약물 스크리닝 분야에서 매우 유용한 도구로 사용될 수 있다. The present invention relates to a microfluidic chip for culturing a neural stem cell and a use of the microfluidic chip. In the microfluidic chip according to the present invention, it is possible to form a neuron in a uniform size, and to differentiate into a neuron and form a neural network . The microfluidic chip of the present invention can be used in various neurological diseases related to the formation of neural stem cells, neurons, and neural networks and can be used as a very useful tool in drug screening related to neurological diseases.
도 1a는 본 발명의 일 실시예에 따른 미세유체칩의 모식도이다.
도 1b는 본 발명의 일 실시예에 따른 미세유체칩에 대한 사진이다.
도 1c는 본 발명의 일 실시예에 따른 신경구를 잡는 바구니 모양의 마이크로 필라에 대한 형광사진이다.
도 1d는 본 발명의 일 실시예에 따른 미세유체칩 내 미세채널에 대한 모식도이다.
도 1e는 본 발명의 일 실시예에 따른 미세유체칩 내 미세채널에 패터닝되는마이크로 필라에 대한 배치도이다.
도 2a는 본 발명의 일 실시예에 따른 신경구 세포 주입 후 세포의 생존율 확인을 위한 세포 생존 분석 형광 사진이다.
도 2b는 본 발명의 일 실시예에 따른 마이크로 필라의 폭에 대한 사진이다.
도 2c는 본 발명의 일 실시예에 따른 75 μm 폭의 마이크로 필라에 배양한 세포 고정 사진이다.
도 2d는 본 발명의 일 실시예에 따른 150 μm 폭의 마이크로 필라에 배양한 세포 고정 사진이다.
도 2e는 본 발명의 일 실시예에 따른 300 μm 폭의 마이크로 필라에 배양한 세포 고정 사진이다.
도 2f는 본 발명의 일 실시예에 따라 미세유체칩에 세포 주입 1일 및 3일 후 세포 생존율을 분석한 그래프이다.
도 2g는 본 발명의 일 실시예에 따라 마이크로 필라의 폭 변화에 대한 신경구 세포의 크기를 분석한 그래프이다.
도 2h는 본 발명의 일 실시예에 따라 마이크로 필라의 폭 변화에 대한 신경구 세포의 종횡비를 분석한 그래프이다.
도 3a는 본 발명의 일 실시예에 따라 Glass 표면에서 배양한 신경줄기세포를 공초점현미경으로 촬영한 사진이다.
도 3b는 본 발명의 일 실시예에 따라 미세유체칩 표면에서 배양한 신경줄기세포를 공초점현미경으로 촬영한 사진(저배율)이다.
도 3c는 본 발명의 일 실시예에 따라 미세유체칩 표면에서 배양한 신경줄기세포를 공초점현미경으로 촬영한 사진(고배율)이다.
도 3d는 본 발명의 일 실시예에 따라 세포의 배양 표면 차이에 의한 신경돌기의 길이를 분석한 그래프이다.
도 3e는 본 발명의 일 실시예에 따라 세포의 배양 표면 차이에 의한 신경돌기의 개수를 분석한 그래프이다.
도 4a는 본 발명의 일 실시예에 따라 Glass 표면에서 배양한 신경세포를 공초점현미경으로 촬영한 사진이다.
도 4b는 본 발명의 일 실시예에 따라 Glass 표면에서 배양한 신경세포를 Thapsigargin 처리 후 공초점현미경으로 촬영한 사진이다.
도 4c는 본 발명의 일 실시예에 따라 미세유체칩 표면에서 배양한 신경세포를 Thapsigargin 처리 후 공초점현미경으로 촬영한 사진이다.
도 4d는 본 발명의 일 실시예에 따라 미세유체칩 표면에서 배양한 신경세포를 공초점현미경을 촬영한 사진(저배율)이다.
도 5a는 본 발명의 일 실시예에 따라 세포의 배양 표면 차이에 의한 신경돌기의 길이를 분석한 그래프이다.
도 5b는 본 발명의 일 실시예에 따라 세포의 배양 표면 차이에 의한 신경돌기의 개수를 분석한 그래프이다.
도 5c는 본 발명의 일 실시예에 따라 세포의 배양 표면 차이에 의한 신경세포의 Apoptosis의 비율을 분석한 그래프이다. 1A is a schematic diagram of a microfluidic chip according to an embodiment of the present invention.
1B is a photograph of a microfluidic chip according to an embodiment of the present invention.
1C is a fluorescence photograph of a basket-shaped micropilar holding a nerve root according to an embodiment of the present invention.
1D is a schematic view of a microchannel in a microfluidic chip according to an embodiment of the present invention.
FIG. 1E is a layout view of a micropillar that is patterned on a microchannel in a microfluidic chip according to an embodiment of the present invention.
FIG. 2A is a fluorescence image showing cell viability for confirming cell survival rate after neural cell injection according to an embodiment of the present invention. FIG.
2B is a photograph of the width of a micropillar according to an embodiment of the present invention.
FIG. 2c is a photograph of cells fixed on a micropillar of 75 .mu.m width according to an embodiment of the present invention.
FIG. 2d is a photograph of cells fixed on a micropillar of 150 .mu.m width according to an embodiment of the present invention. FIG.
FIG. 2E is a photograph of cells fixed on a 300 μm wide micropillar according to an embodiment of the present invention.
FIG. 2f is a graph showing cell survival rates after 1 and 3 days of cell injection into a microfluidic chip according to an embodiment of the present invention.
FIG. 2G is a graph illustrating the size of neural cells according to the width of a micropillar according to an embodiment of the present invention. FIG.
FIG. 2h is a graph illustrating an aspect ratio of neural cells according to an embodiment of the present invention. FIG.
FIG. 3A is a photograph of a neural stem cell cultured on a glass surface by a confocal microscope according to an embodiment of the present invention. FIG.
FIG. 3B is a photograph (low magnification) of a neurofilament cell cultured on the surface of a microfluidic chip according to an embodiment of the present invention, taken by a confocal microscope.
3C is a photograph (high magnification) of a neurofilament cell cultured on the surface of a microfluidic chip according to an embodiment of the present invention, taken by a confocal microscope.
FIG. 3D is a graph illustrating the length of neurite by the difference in culture surface of a cell according to an embodiment of the present invention.
FIG. 3E is a graph illustrating the number of neurites by the difference in culture surface of cells according to an embodiment of the present invention.
4A is a photograph of a nerve cell cultured on a glass surface by a confocal microscope according to an embodiment of the present invention.
FIG. 4B is a photograph of a neuron cultured on a glass surface by a confocal microscope after Thapsigargin treatment according to an embodiment of the present invention. FIG.
FIG. 4c is a photograph of a nerve cell cultured on the surface of a microfluidic chip according to an embodiment of the present invention, after a treatment with Thapsigargin and then taking a confocal microscope.
FIG. 4D is a photograph (low magnification) of a nerve cell cultured on the surface of a microfluidic chip according to an embodiment of the present invention, taken by a confocal microscope.
FIG. 5A is a graph illustrating the length of a neuron due to a difference in culture surface of a cell according to an embodiment of the present invention. FIG.
FIG. 5B is a graph illustrating the number of neurites by the difference in culture surface of cells according to an embodiment of the present invention. FIG.
FIG. 5c is a graph showing the percentage of apoptosis of neurons due to differences in culture surface of cells according to an embodiment of the present invention. FIG.
이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to the following examples. However, these examples are only for illustrating the present invention, and the scope of the present invention is not limited by these examples.
실시예 1. 미세유체칩의 설계 및 제작Example 1. Design and fabrication of microfluidic chip
신경줄기세포를 분화시켜 신경돌기로 네트워크를 형성하기 위한 미세유체칩을 개발하였다. 신경줄기세포의 성장과 분화를 유도하기 위한 미세유체칩의 챔버를 패터닝하기 위하여 반도체 제조공정인 포토리소그래피(Photolithography) 기술을 이용하였다. 150 μm 높이의 챔버를 만들기 위하여 AutoCAD(Autodesk)를 사용하여 신경구를 잡을 수 있는 마이크로 필라를 포함하는 포토 마스크를 만들고, Su-8 포토레지스트(Photoresist)가 도포된 4인치 실리콘 웨이퍼(Wanxiang SliconPeak Electronics)를 스핀 코트하여(2,000 rpm, 60초) 65℃의 온도에서 20분 동안 프리 베이크한 후 95℃의 온도에서 50분 동안 소프트 베이크 하였다. 그렇게 처리된 실리콘 웨이퍼의 포토레지스터는 UV 광선에 마스크필름을 통과하여 30초 동안 노출시켰다. We have developed a microfluidic chip to differentiate neural stem cells and form networks with neurites. Photolithography, a semiconductor manufacturing process, was used to pattern the chambers of the microfluidic chip to induce the growth and differentiation of neural stem cells. A photomask including a micropillar was prepared using AutoCAD (Autodesk) to create a chamber with a height of 150 μm, and a 4-inch silicon wafer (Wanxiang SliconPeak Electronics) coated with Su-8 photoresist Was spin-coated (2,000 rpm, 60 seconds), pre-baked at a temperature of 65 DEG C for 20 minutes, and then soft-baked at a temperature of 95 DEG C for 50 minutes. The photoresist of the silicon wafer thus treated was exposed to UV light through the mask film for 30 seconds.
자외선(UV) 노광 및 포스트 베이크 단계 후에, SU-8 디벨로퍼(Microchem corp.)를 사용하여 현상되지 않은 포토 레지스트를 제거하였다. 이러한 방법으로 패터닝된 실리콘 웨이퍼는 트라이메틸클로로실레인(Chlorotrimethylsilane, Sigma Aldrich)을 사용하여 전처리하였다. 그 후 실리콘 중합체와 경화제(Microchem Corp)의 혼합물(10:1 비율)을 사용하여 실리콘 웨이퍼 위에 부어 PDMS(Polydimethylsiloxane) 스탬프를 생성하였다. 마이크로 패턴화된 실리콘 웨이퍼 위의 PDMS 프리-폴리머 용액을 30분 동안 진공 챔버에 넣어 공기 방울을 제거한 후 80℃에서 2시간 동안 경화시켰다. 경화된 PDMS 스탬프는 실리콘 웨이퍼로부터 조심스럽게 떼어 실험을 진행하였다. 신경구를 배양할 수 있는 미세유체칩은 챔버를 포함하고 있는 PDMS와 2x2 cm의 유리(glass)에 산소 플라즈마(Femto Scientific) 결합을 사용하여 수직으로 결합되었다. After the ultraviolet (UV) exposure and post-bake steps, the undeveloped photoresist was removed using an SU-8 Developer (Microchem corp.). Silicon wafers patterned in this manner were pretreated with chlorotrimethylsilane (Sigma Aldrich). Then, a mixture of silicon polymer and a curing agent (Microchem Corp) (ratio of 10: 1) was poured onto a silicon wafer to produce a PDMS (Polydimethylsiloxane) stamp. The PDMS pre-polymer solution on the micropatterned silicon wafer was placed in a vacuum chamber for 30 minutes to remove air bubbles and cured at 80 ° C for 2 hours. The cured PDMS stamp was carefully removed from the silicon wafer and the experiment was carried out. Microfluidic chips capable of culturing the neural nerves were coupled vertically using PDMS containing a chamber and 2x2 cm glass with Femto Scientific coupling.
도 1a에서 확인할 수 있듯이, 신경줄기세포 분화와 신경돌기 네트워크 형성 조절을 위한 미세유체칩은 마이크로 채널로 구성되어 있다. 직선채널은 신경구가 배양되는 챔버이며 150 μm 폭의 신경구를 수월하게 고정하여 신경구를 배양하기 위하여 높이 150 μm를 가지도록 설계되었다. 신경줄기세포와 배양액을 혼합하여 주입구를 통해 신경구를 주입하여 마이크로 필라에 균일하게 들어가도록 하였다. As shown in FIG. 1A, a microfluidic chip for controlling neurite stem cell differentiation and neurite network formation is composed of microchannels. The linear channel is a chamber in which the nerve root is cultured and is designed to have a height of 150 μm in order to nerve the neurons by fixing the 150 μm wide neurons. The neural stem cells and the culture solution were mixed and injected through the injection port to uniformly enter the micropillars.
또한, 신경구가 균일하게 배열될 수 있도록 바구니 모양의 마이크로 필라(150 μm 폭)(PDMS)가 일정한 간격으로 패터닝 되어있다(도 1a). 이러한 마이크로 필라는 20개로 구성되어 관찰하고자 하는 적은 수의 신경구 숫자를 쉽게 제한할 수 있다. In addition, basket-shaped micro pillars (150 mu m wide) (PDMS) are patterned at regular intervals so that the nerve nerves can be uniformly arranged (Fig. 1A). These micropills consist of 20, which can easily limit the number of neurons to be observed.
또한, 원하는 부분에 신경구를 위치시키는데 사용되었으며, 배양액의 교체나 면역염색 과정에서 유체의 흐름에 의해 떠내려가는 신경구의 유실을 막을 수 있도록 설계하였다. 하나의 선으로 연결되어 신경구를 담는 모양의 마이크로 필라가 아니라, 4개의 선으로 구성되어 유체가 선과 선 사이의 간격으로 빠져나가면서 난류의 생성을 억제할 수 있게 설계되었다(도 1c). 그로 인해, 마이크로 필라와 유체가 부딪치면서 생길 수 있는 난류로 신경구가 유체의 흐름에 의해 유실되지 않도록 설계하였다.It was also used to position neural nerves at the desired site and was designed to prevent the loss of neural nerves floating by fluid flow during culture fluid replacement and immunohistochemical staining. It consists of four lines rather than a micropillar that is connected by a single line to hold the nerve fibers, and the fluid is designed to escape at the interval between the lines and the line to suppress the generation of turbulence (FIG. Therefore, it was designed so that the nerves would not be lost by the flow of the fluid due to the turbulence caused by the collision with the fluid.
실시예 2. 신경줄기세포 배양 및 분화Example 2. Culturing and differentiation of neural stem cells
2-1. 신경줄기세포 배양2-1. Neural stem cell culture
신경줄기세포를 얻기 위하여 E12 C57BL / 6 마우스(Daehan Biolink)의 대뇌 피질과 척수 조직을 절개하고 accutase(Innovation Cell Technology)와 함께 37℃에서 5분간 배양하였다. 대뇌 피질 세포를 초저부착 표면 세포 배양 플레이트에서 배양하고 N2, 2% B27 보충제 및 1% 페니실린 - 스트렙토 마이신을 함유하는 DMEM / F12 배지에서 염기성 섬유 아세포 성장 인자 및 표피 성장 인자가 섞인 배양액을 이용하여 3일 동안 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 신경구(neurosphere)로 유지시켰다. To obtain neural stem cells, cerebral and spinal cord tissues of E12 C57BL / 6 mice (Daehan Biolink) were dissected and incubated with accutase (Innovation Cell Technology) at 37 ° C for 5 minutes. Cerebral cortical cells were cultured in ultra low adherent surface cell culture plates and cultured in DMEM / F12 medium containing N2, 2% B27 supplement and 1% penicillin-streptomycin using a culture medium containing basic fibroblast growth factor and epidermal growth factor The cells were maintained in neurospheres in a 5% CO 2 incubator at 37 ° C for one day.
3일 동안 배양하였을 때 신경구의 크기는 약 100-150 μm이며, 비접착세포 상태로 배양하여 자연스럽게 형성된 신경구를 마이크로 필라가 패터닝된 챔버에 주입하였다. 미세유체칩 상에 주입된 신경구는 매일 배양액을 교체하고 6일 동안 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 배양하여 신경줄기세포의 분화를 확인하였다. When cultured for 3 days, the size of the nerve nerve was about 100-150 μm. The nerve cells were naturally cultured in the non-adherent cell state and injected into the chamber where the micropillar was patterned. Neurons injected onto the microfluidic chip were replaced every day and cultured in a 5% CO 2 incubator at 37 ° C for 6 days to confirm neural stem cell differentiation.
신경줄기세포 분화 조절을 위한 기능성 미세유체칩에서의 신경구 생존율을 확인하기 위하여 미세유체칩에 신경구를 로딩한 후 1일과 3일차에 Live & Dead assay(Calcein AM, Ethidium homodimer-1, Invitrogen)를 사용하여 분석하였다. 신경구는 5 ml의 PBS에 calcein AM 2 μl와 ethidium homodimer 10 μl이 녹아 있는 용액을 200 μl를 주입하여 40분간 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 배양하였다. 공 초점 레이저 스캐닝 현미경(LSM 710, Carl Zeiss)을 사용하여 살아있는 세포와 죽은 세포의 형광 이미지를 관찰하고 촬영하였다.In order to confirm the neural survival rate in the functional microfluidic chip for the regulation of neural stem cell differentiation, the neurite was loaded on the microfluidic chip and the Live & Dead assay (Calcein AM, Ethidium homodimer-1, Invitrogen) Respectively. Neurons were cultured in a 5% CO 2 incubator at 37 ° C for 40 min by injecting 200 μl of a solution of 2 μl of calcein AM and 10 μl of ethidium homodimer in 5 ml of PBS. Fluorescence images of living and dead cells were observed and photographed using a confocal laser scanning microscope (LSM 710, Carl Zeiss).
2-2. 신경줄기세포 생존율 확인2-2. Confirm survival rate of neural stem cells
PDMS는 작은 구멍들을 통해 기체의 교환이 이루어진다고 알려져 있어 바이오칩에 많이 사용되는 물질이다. 하지만 PDMS의 표면처리나 PDMS의 두께 등 여러 조건에 따라 기체교환이 잘 이루어지지 않는 경우도 있다. 신경줄기세포가 미세유체칩에서 잘 자라는지 확인하기 위하여 생존율 확인 연구를 진행하였다. PDMS is widely used in biochips because it is known that gas exchange is made through small holes. However, depending on various conditions such as surface treatment of PDMS or thickness of PDMS, gas exchange may not be performed well. Survival rate studies were performed to confirm that neural stem cells were well grown on the microfluidic chip.
먼저 150 μm 폭 마이크로 필라가 패터닝된 미세유체칩에 신경줄기세포 유래 신경구를 주입하였다. 신경구가 일정하게 마이크로 필라에 고정된 것을 확인한 후, 24시간 마다 배양액을 교체하여 신경구가 분화할 수 있는 환경을 유지하였다. First, neural stem cell-derived neurons were injected into a microfluidic chip patterned with a 150 μm wide micropillar. After confirming that the neural nerves were fixed to the micro pillars constantly, the culture medium was changed every 24 hours to maintain the environment in which the neural nerves could be differentiated.
신경구를 미세유체칩에 주입 후 배양된 신경구의 생존율을 알아보기 위해 Live & Dead assay(calcein AM, ethidium homodimer-1)로 염색하여 1일차, 3일차의 신경구의 생존율을 확인한 결과, 도 2f 및 표 1에서 확인할 수 있듯이, 90% 이상의 세포가 대부분 생존한 것을 확인하였다. 이로 인하여 신경줄기세포 분화와 신경돌기 네트워크 형성 조절을 위한 기능성 미세유체칩이 신경줄기세포 분화를 위한 환경을 제공할 수 있다는 것을 확인하였다. To determine the survival rate of the cultured neural nerves after injecting the neural nerve into the microfluidic chip, the survival rates of the neurons of the 1st and 3rd day were stained with Live & Dead assay (calcein AM, ethidium homodimer-1) 1, it was confirmed that more than 90% of the cells survived. It was confirmed that the functional microfluidic chip for the neural stem cell differentiation and neurite outgrowth formation regulation can provide an environment for neural stem cell differentiation.
2-3. 마이크로 필라의 최적화2-3. Optimization of Micropillar
신경구를 고정하는 마이크로 필라의 폭을 최적화 하기 위하여 각각의 폭(75, 150, 300 μm)을 가지는 마이크로 필라에 신경구를 주입하여 신경구의 트랩을 확인하였다. 마이크로 필라의 폭에 따른 신경구의 폭과 종횡비의 정량화는 Image J 소프트웨어로 분석되었다.In order to optimize the width of the micropillars fixing the nerve nerves, nerve plugs were injected into the micropillars of each width (75, 150, and 300 μm) to confirm the traps of the neurons. The quantification of the width and aspect ratio of the nerve fibers according to the width of the micropillar was analyzed with Image J software.
도 2c에서 확인할 수 있듯이, 75 μm 폭의 마이크로 필라의 경우, 형성된 신경구에 비해 마이크로 필라가 너무 작아서 작은 크기의 일부 신경구만이 트랩되었으며, 대부분의 신경구가 제대로 트랩되지 않고 밖으로 빠져 나오는 것을 확인하였다. 또한, 도 2h에서 확인할 수 있듯이, 신경구의 종횡비를 관찰하였을 때, 75 μm 폭의 마이크로 필라의 경우, 세로로 긴 타원형을 유지하는 것을 확인하였다. As shown in FIG. 2C, in the case of the micropillar having a width of 75 μm, the micropillar was so small as compared with the formed nerve nerve, that only a small nerve was trapped, and most of the nerve nerve was not trapped properly but was pulled out. Further, as can be seen from FIG. 2h, when the aspect ratio of the neurons was observed, it was confirmed that the micropillar having a width of 75 占 퐉 maintained a longitudinal oval shape.
도 2e에서 확인할 수 있듯이, 300 μm 폭의 마이크로 필라의 경우, 신경구가 가득 차지 않았다. 평균적인 신경구의 크기가 300 μm에 미치지 못하고 200 μm의 크기를 가지는 것을 확인하였다. 또한, 도 2h에서 확인할 수 있듯이, 종횡비를 관찰하였을 때, 300 μm 폭의 마이크로 필라의 경우, 가로가 긴 타원형에 가깝게 신경구가 트랩된 것을 확인하였다. As can be seen from FIG. 2E, in the case of a 300 μm wide micropillar, the nerve fibers were not filled. The average size of the neurons was less than 300 μm and the size was 200 μm. As can be seen in FIG. 2h, when the aspect ratio was observed, it was confirmed that, in the case of a micropillar having a width of 300 μm, the nerve was trapped close to the long elliptical shape.
그에 비해 150 μm 폭의 마이크로 필라의 경우, 도 2d에서 확인할 수 있듯이, 신경구의 폭이 평균적으로 150 μm의 폭을 가진 것으로 확인하였다. 또한, 도 2h에서 확인할 수 있듯이, 신경구의 종횡비를 조사하였을 때, 150 μm 폭의 마이크로 필라의 경우, 원형에 가까운 형태를 띠고 있었다. 이러한 결과를 토대로 150 μm의 마이크로 필라가 신경세포를 가장 균일한 크기로 조절할 수 있다는 것을 확인하였다. On the other hand, in the case of a micropillar having a width of 150 μm, as shown in FIG. 2D, it was confirmed that the width of the nerve nerve was 150 μm on average. Further, as shown in FIG. 2h, when the aspect ratio of the nerve root was examined, the micropillar having a width of 150 μm had a circular shape. Based on these results, it was confirmed that the 150 μm micropillar can control neurons to the most uniform size.
실시예 3. 마이크로 필라 유무에 따른 세포 분화 비교Example 3. Comparison of cell differentiation according to presence or absence of micropillars
미세유체칩에 있어서 마이크로 필라 유무에 따른 세포 분화를 비교하기 위해 상기 실시예 1에서 제조한 본 발명의 미세유체칩과 마이크로 필라가 패터닝 되어 있지 않은 Glass 표면의 대조군에 신경구를 배양하였다. In order to compare the cell differentiation with microfilaments in the microfluidic chip, the microfluidic chip of the present invention prepared in Example 1 and the glass surface on which the micropillar was not patterned were cultured in the control group.
도 3d 및 표 2에서 확인할 수 있듯이, Glass 표면의 대조군과 미세채널 및 마이크로 필라를 포함하는 본 발명의 미세유체칩에 각각 신경구를 6일 동안 배양하여 측정한 신경구의 신경돌기 길이는 각각 약 200 μm 및 약 170 μm를 나타냈다. As can be seen from FIG. 3D and Table 2, the neurite lengths of the neurons measured by culturing the neurite for 6 days on the microfluidic chip of the present invention including the control surface of the glass surface and the microchannels and micropillars were about 200 μm And about 170 [mu] m.
도 3e 및 표 3에서 확인할 수 있듯이, Glass 표면의 대조군과 마이크로 채널 및 마이크로 필라를 포함하는 본 발명의 미세유체칩에서 배양한 신경구의 신경돌기 개수는 각각 약 56개 및 약 50개로 유사하게 나타났다. As shown in FIG. 3E and Table 3, the number of neurites of the neurons cultured in the microfluidic chip of the present invention including the glass surface and the microchannels and micropillars were about 56 and about 50, respectively.
Glass 표면의 대조군과 마이크로 채널 및 마이크로 필라를 포함하는 본 발명의 미세유체칩에서 배양한 신경구의 신경돌기 길이 및 개수는 유사하게 나타났고, 이를 통해 본 발명의 미세유체칩이 신경세포로 분화할 수 있는 환경을 제공할 수 있다는 것을 확인하였다.The neurite length and number of the neurons cultured in the microfluidic chip of the present invention including the control surface of the glass surface and the microchannel and the micropillar were similar, and the microfluidic chip of the present invention was able to differentiate into neurons And that it can provide an environment where
실시예 4. 신경줄기세포의 분화 확인Example 4. Confirmation of differentiation of neural stem cells
4-1. 면역염색4-1. Immunodiffusion
신경줄기세포의 분화를 확인하기 위해 대뇌 피질에서 유도된 신경세포를 4% 파라 포름알데히드로 30분간 처리하여 세포를 고정하였다. 고정된 신경세포는 DPBS로 2번 세척과정을 거친 후 실온에서 DPBS 용액 1% triton X-100으로 20분간 처리하여 세포막의 단백질을 용해시켜 염색에 필요한 물질들이 잘 들어가도록 해준다. 또한, 신경구는 비 특이적인 단백질 결합을 줄이기 위해 실온에서 4시간 동안 DPBS용액 6% BSA(Sigma-Aldrich)로 차단되었다. 이어서 4℃에서 신경성세포를 특이적으로 결합하는 일차 항체인 Tuj1(Anti-neuronal class - Tubulin, Stem cell technology)과 칼슘이온의 영향으로 세포사멸의 경로로 가고 있는 세포에게 나오는 ATF3 인자와 특이적으로 결합하는 일차 항체인 Anti-ATF3(Activating Trans-Cription Factor 3)를 세포에 처리하였다. 이렇게 염색을 마친 신경세포는 DPBS로 2번 세척한 후, 4℃에서 4시간 동안 Alexa Flour 488 접합 2차 항체(Invitrogen)와 함께 배양하였다. 다시 DPBS로 2번 세척한 후, 세포 핵을 DAPI(4,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride, Invitrogen)로 염색하였다. 이렇게 면역염색과정을 거친 신경세포를 공 초점 레이저 주사 현미경(Carl Zeiss)을 이용하여 촬영하였다.To confirm the differentiation of neural stem cells, neurons in the cerebral cortex were treated with 4% paraformaldehyde for 30 minutes to fix the cells. Fixed neurons are washed twice with DPBS and treated with
4-2. 신경줄기세포 분화 확인4-2. Confirmation of neural stem cell differentiation
신경독성약물은 신경조직에 독성을 유발하거나 중독성을 나타낼 수 있으며, 신경독소는 발달중인 신경 조직과 성숙한 신경 조직에서 기능적 악영향을 끼칠 수 있는 약물이다. 신경독성약물의 일반적인 예로는 납, 에탄올, 글루탐산염, 산화질소, 보톡스 등이 있다. 글루탐산의 과 농도를 유발하는 탑시가르긴 (Thapsigargin)은 소포체의 작용을 멈춰, 세포를 사멸하는 연구에 자주 사용되는 신경독성물질이다. Neurotoxic drugs can cause toxicity or toxicity to nerve tissue, and neurotoxins are drugs that can adversely affect developmental nervous tissue and mature nervous tissue. Common examples of neurotoxic drugs include lead, ethanol, glutamate, nitric oxide, botox, and the like. Thapsigargin, which causes hyperactivity of glutamic acid, is a neurotoxic agent frequently used in research to stop the action of the endoplasmic reticulum and to kill cells.
탑시가르긴은 thapsia garganica에서 추출되는 신경독성약물로서 포유류 세포에서 칼슘의 농도를 조절하여 종양 촉진제로 작용하는 연구에 자주 쓰이는 신경독성약물의 종류이다. 세포에 탑시가르긴을 처리하게 되면 세포 내에서 칼슘(Ca2+)이온 채널의 활성을 억제하게 되어 칼슘이 소포체 내로 유입되지 못하고 세포 내(Cytoplasm)에 남아있게 되어 세포 내의 칼슘 농도가 높게 유지 된다. 이러한 상태에서 칼슘의 농도가 부족해진 소포체에서 산화환원조절, 칼슘 조절, 단백질 과대 발현에 의해 단백질의 접힘이 느려지는 상태(Unfolded proteins)가 되는데, 이러한 상태를 소포체성 스트레스 반응(ER stress)이라고 부른다. Toscigarin is a neurotoxic drug derived from thapsia garganica, a class of neurotoxic drugs commonly used in studies that act as a tumor promoter by regulating the concentration of calcium in mammalian cells. When cells are treated with topical ghrelin, the activity of calcium (Ca 2+ ) ion channel is inhibited in the cells, calcium is not introduced into the endoplasmic reticulum but remains in the cytoplasm, and the intracellular calcium concentration is kept high . Under these conditions, the unfolded proteins are formed by the redox regulation, the calcium regulation and the protein overexpression in the deficient endoplasmic reticulum. This state is called the ER stress (ER stress) .
탑시가르긴에 의해 유발된 소포체성 스트레스 반응 상태에서 ATF3 전사 인자가 증가하게 되고, 이러한 메커니즘이 계속될 경우 세포 사멸을 유도하게 된다. 특히 탑시가르긴은 ALS 환자 모델을 확립하는 연구에 자주 사용하는 약물이다. ALS 환자에서 세포 내 칼슘의 증가는 글루탐산 염에 의한 흥분 독성 때문이거나 미토콘드리아 기능 결핍 때문에 주로 발생된다. The ATF3 transcription factor is increased in the endoplasmic reticulum-stressed state induced by Toposhigargin, and this mechanism leads to apoptosis. In particular, Topixigargin is a drug often used in studies to establish ALS patient models. The increase in intracellular calcium in ALS patients is mainly due to excitotoxicity due to glutamate or to a deficiency in mitochondrial function.
대조군의 신경구와 미세유체칩에서 배양된 신경구에 각각 4.5 μM 탑시가르긴을 첨가한 배양액을 1시간 동안 처리한 후 각각의 신경돌기와 신경구를 면역염색하고 공 초점 현미경을 이용하여 관찰하였다. 그 후 공 초점 현미경으로 촬영한 사진을 Image J로 분석하여 그래프로 나타냈다. The neurons in the control group and the neurons cultured in the microfluidic chip were treated with 4.5 μM Tissigarin for 1 hour, and the neurites and neurons were immunostained and examined using a confocal microscope. Then, photographs taken with a confocal microscope were analyzed by Image J and plotted as a graph.
도 5a 및 표 4에서 확인할 수 있듯이, 탑시가르긴을 처리하지 않은 신경구에 비하여 탑시가르긴을 처리한 신경구의 길이가 평균적으로 약 200 μm에서 약 150-170 μm로 감소하였다. As can be seen in FIGS. 5A and 4, the length of the neurons treated with Topshi gaulin decreased from about 200 μm to about 150-170 μm on average, as compared to the non-Tshigargin-treated neurons.
도 5b 및 표 5에서 확인할 수 있듯이, 탑시가르긴을 처리하지 않은 신경구에 비하여 탑시가르긴을 처리한 신경구의 신경돌기 개수 또한 평균적으로 약 70개에서 50개 미만으로 줄어드는 경향을 관찰하였다. As can be seen in FIGS. 5B and 5, the number of neurites of the neurons treated with Topshi gargins also decreased from about 70 to less than 50 on the average, compared to the Neurons not treated with Toposhigargin.
또한, 탑시가르긴에 의한 신경세포의 Apoptosis를 확인하기 위해 면역염색으로 Anti-ATF3를 이용하여 ATF3 전사인자를 형광 염색 하였다. 이러한 과정을 거친 신경구를 공 초점 현미경으로 촬영한 사진을 분석하여 ATF3 전사인자의 개수를 비교하였다. In addition, ATF3 transcription factor was fluorescently stained with anti-ATF3 in immunostaining in order to confirm apoptosis of nerve cell by Topshiagarin. The number of ATF3 transcription factors was compared by analyzing photographs taken with a confocal microscope.
도 5c 및 표 6에서 확인할 수 있듯이, 대조군에 비해 약물 처리군에서 ATF3 positive 세포가 약 4%에서 약 15-16%로 4배 가까이 증가하여, 탑시가르긴을 처리한 신경구와 신경돌기가 세포 사멸된 것이 확인되었다. As can be seen from FIG. 5C and Table 6, ATF3 positive cells were increased about 4 to 15-16% in the drug-treated group compared with the control group, and the neurospheres and neurites, .
상기 결과를 통해 마이크로 필라를 포함하는 본 발명의 미세유체칩에서 신경구의 위치 조절이 가능하고, 신경망을 형성한 신경구에 탑시가르긴을 처리하여 세포 사멸을 확인할 수 있다는 것을 규명하였다. The above results demonstrate that the microfluidic chip of the present invention including the micropilam can regulate the position of the nerve root, and the neuron forming the neural network can treat the cell death by treating the nerve root with Thyssigargin.
본 발명의 미세유체칩 내에서 탑시가르긴을 처리한 신경구에서 약물에 의하여 신경돌기가 감소한 것을 확인하였고, 이는 본 발명의 미세유체칩 내에서 약물의 평가가 가능하다는 것을 의미한다. 따라서, 본 발명의 미세유체칩은 근위축성 측삭 경화증(ALS), 파킨슨 병과 같은 뇌질환에 대한 약물 스크리닝 뿐만 아니라 다양한 질병 약물을 스크리닝 하는 분야에 응용될 수 있다.In the microfluidic chip of the present invention, it was confirmed that the neurites were reduced by the drug in the neurosphere treated with Topsigargin, which means that evaluation of the drug in the microfluidic chip of the present invention is possible. Accordingly, the microfluidic chip of the present invention can be applied not only to drug screening for brain diseases such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and Parkinson's disease, but also to screening various disease drugs.
또한, 본 발명의 미세유체칩은 줄기세포, 신경세포, 신경돌기 네트워크 형성과 관련된 다양한 뇌를 모사한 질병 연구에 사용될 수 있으며 화학공학, 생명공학 분야에서 매우 다양한 응용이 가능할 것으로 기대된다.In addition, the microfluidic chip of the present invention can be used for the study of diseases that simulate various brain related to the formation of stem cells, nerve cells, and neurite networks, and it is expected that a wide variety of applications are possible in the fields of chemical engineering and biotechnology.
Claims (10)
상기 미세챔버는 신경줄기세포가 고정되는 마이크로 필라를 포함하며, 상기 마이크로 필라는 U자 형태로 배열된 제1유닛, 제2유닛, 제3유닛 및 제4유닛을 포함하고, 상기 제1유닛 및 제2유닛; 제2유닛 및 제3유닛; 및 제3유닛 및 제4유닛은 25 μm 내지 35 μm 간격으로 배열되며, 상기 제1유닛 및 제4유닛은 130 μm 내지 170 μm 간격으로 배열되어 상기 마이크로 필라의 폭을 형성하는 것인,
신경줄기세포 배양용 미세유체칩.
A microfluidic chip comprising a fine chamber,
Wherein the microchamber comprises a micropillar to which neural stem cells are fixed, the micropillar comprising a first unit, a second unit, a third unit and a fourth unit arranged in a U-shape, 2 units; A second unit and a third unit; And the third unit and the fourth unit are arranged at intervals of 25 mu m to 35 mu m and the first unit and the fourth unit are arranged at intervals of 130 mu m to 170 mu m to form the width of the micropillar.
Microfluidic chip for neural stem cell culture.
The microfluidic chip for culturing a neural stem cell according to claim 1, wherein the microchamber includes an inlet and an outlet.
The microfluidic chip for culturing a neural stem cell according to claim 1, wherein the fine chamber has a height of 100 μm to 250 μm.
The method of claim 1, wherein the microchamber is selected from the group consisting of polydimethylsiloxane (PDMS), polymethylmethacrylate (PMMA), polyacrylates, polycarbonates, and polycyclic olefins wherein the microfluidic chip is composed of at least one selected from the group consisting of polycyclic olefins.
A method for culturing neural stem cells using the microfluidic chip for culturing neural stem cells according to any one of claims 1 and 5 to 7.
A method for forming a neurite network by culturing neural stem cells in a microfluidic chip for culturing neural stem cells according to any one of claims 1 and 5 to 7.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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| KR1020180011581A KR101979145B1 (en) | 2018-01-30 | 2018-01-30 | Microfluidic Device for Incubation of Neural Stem cells and Use Thereof |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020180011581A KR101979145B1 (en) | 2018-01-30 | 2018-01-30 | Microfluidic Device for Incubation of Neural Stem cells and Use Thereof |
Publications (1)
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| KR101979145B1 true KR101979145B1 (en) | 2019-05-15 |
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ID=66579274
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020180011581A KR101979145B1 (en) | 2018-01-30 | 2018-01-30 | Microfluidic Device for Incubation of Neural Stem cells and Use Thereof |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
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Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2013507922A (en) * | 2009-10-12 | 2013-03-07 | コーニング インコーポレイテッド | Microfluidic device for cell culture |
| KR20150056551A (en) * | 2012-09-19 | 2015-05-26 | 도꾸리쯔교세이호징 가가꾸 기쥬쯔 신꼬 기꼬 | Formation and use of neuronal network, and neuron seeding device |
| JP2015515263A (en) * | 2012-02-29 | 2015-05-28 | フリューダイム コーポレーション | Methods, systems, and devices for capturing and processing multiple single cells using microfluidics |
-
2018
- 2018-01-30 KR KR1020180011581A patent/KR101979145B1/en active IP Right Grant
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2013507922A (en) * | 2009-10-12 | 2013-03-07 | コーニング インコーポレイテッド | Microfluidic device for cell culture |
| JP2015515263A (en) * | 2012-02-29 | 2015-05-28 | フリューダイム コーポレーション | Methods, systems, and devices for capturing and processing multiple single cells using microfluidics |
| KR20150056551A (en) * | 2012-09-19 | 2015-05-26 | 도꾸리쯔교세이호징 가가꾸 기쥬쯔 신꼬 기꼬 | Formation and use of neuronal network, and neuron seeding device |
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