KR20200104360A - 핵산-함유 지질 나노-입자 및 그의 용도 - Google Patents

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KR20200104360A
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cells
linear
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exogenous
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시노부 구와에
사토루 마츠모토
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다케다 야쿠힌 고교 가부시키가이샤
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Abstract

본 발명은 하기 (a) 내지 (c) 를 함유하는 지질 나노입자를 제공한다:
(a) 키메라 항원 수용체 (CAR) 또는 외인성 T 세포 수용체 (TCR) 를 코딩하는 핵산;
(b) 양이온성 지질; 및
(c) 비-양이온성 지질.
본 발명은 또한 지질 나노입자를 생체 내 또는 생체 외 T 세포에 도입함으로써 수득된 CAR- 또는 외인성 TCR-발현 면역세포, 및 암 등과 같은 질환에 대한 면역세포를 사용하는 생체 내 또는 생체 외 치료 접근법을 제공한다.

Description

핵산-함유 지질 나노-입자 및 그의 용도
본 발명은 키메라 항원 수용체 또는 T 세포 수용체를 코딩하는 핵산을 함유하는 지질 나노입자, 지질 나노입자를 사용하여 관심 면역세포에서 키메라 항원 수용체 또는 외인성 T 세포 수용체를 발현시키는 방법, 이의 약학적 용도 등에 관한 것이다.
키메라 항원 수용체 (CAR) 또는 암 항원-특이적 킬러 T 세포에서 유래한 T 세포 수용체 (TCR) 의 유전자가 도입된 CAR-T 세포 또는 TCR-T 세포를 이용한 암 면역요법의 연구 개발이 빠르게 진행되고 있다. 미국에서 승인된 Kymriah (상표명) 및 Yescarta (상표명) 와 같은 현재의 CAR-T 세포 요법은 일반적으로 렌티 바이러스 벡터와 같은 바이러스 벡터를 사용하여 생체 외에서 CAR 유전자를 갖는 환자로부터 수집된 T 세포를 트랜스펙션시켜 CAR-T 세포를 제조하고, CAR-T 세포를 환자에게 투여하는 것을 포함한다. 그러나, 이 방법은 세포 배양 및 바이러스 벡터의 조제 비용으로 인해 제조 비용이 높아진다는 문제가 있다. CAR 또는 외인성 TCR 을 생체 내에서, T 세포와 같은 면역세포에 선택적으로 도입하는 것이 가능하다면, 생체 외에서 조제할 필요가 없고, 생산 비용이 낮은 CAR- 또는 TCR-면역세포 요법이 제공될 수 있다. 또한, CAR 또는 외인성 TCR 을 높은 제조 비용을 요구하는 바이러스 벡터를 사용하지 않고 생체 외에서 T 세포와 같은 면역세포에 선택적으로 도입할 수 있다면, 바이러스 잔류물 시험 비용 등이 제거될 것이고, 제조 비용이 저렴한 CAR- 또는 TCR-면역세포 요법이 제공될 수 있다.
CAR-코딩 플라스미드 DNA 및 항-CD3 항체 단편과 공액된 비-양이온성 중합체로 코팅된 양이온성 중합체의 응집체를 함유하는 나노입자 (특허 문헌 1 , 비-특허 문헌 1), 또는 공극 내에 CAR-코딩 DNA 를 캡슐화하는 메조포러스 실리카를 함유하고 항-CD3 항체로 변형된 표면을 갖는 지질로 코팅된 나노담체 (특허 문헌 2) 를 사용하는, CAR 의 T 세포 내로의 생체 외 또는 생체 내 트랜스펙션이 보고되고 있다.
그 외에도, 내부 공극 구조를 갖지 않고 비-양이온성 헬퍼 지질인 양이온성 지질, 및 표적 세포로의 전달을 위한 리간드로 구성된 "지질 나노입자 (LNP)" 에 표적 siRNA 를 캡슐화함으로써 siRNA 를 표적 세포에 전달하는 기술이 보고되었다. 예를 들어, 표적 리간드로서 항-CD4 항체 단편을 사용함에 의한 CD45 에 대한 siRNA 의 T 세포 내로의 생체 외 또는 생체 내 트랜스펙션이 보고되어 있다 (특허 문헌 3, 비-특허 문헌 2).
그러나, 현재까지, CAR 또는 외인성 TCR 을 코딩하는 핵산 (예를 들어, mRNA, DNA) 이 LNP 를 사용하여 T 세포와 같은 면역세포 내에 선택적으로 도입되었다는 보고는 없다.
US 2017/0296676 US 2016/0145348 WO 2016/189532
Nature Nanotechnology 12, 813-820 (2017) ACS Nano, 2015, 9(7), 6706-6716
본 발명의 목적은 생체 내 또는 생체 외에서 T 세포와 같은 면역세포 내에 CAR 또는 외인성 TCR 을 선택적으로 효율적으로 도입하여, 제조 비용이 낮은 CAR- 또는 TCR-면역세포 요법을 제공할 수 있는 신규한 트랜스펙션 기술을 제공하는 것이다. 본 발명의 또다른 목적은 바이러스 단백질에 의한 항원성 문제를 피하는 보다 안전한 CAR- 또는 TCR-면역세포 요법을 제공하는 것이다.
본 발명자들은 상술한 목적을 달성하기 위해 집중적인 연구를 수행하였으며, LNP 를 이용하여 생체 내 및 생체 외에서, CAR 또는 외인성 TCR 을 코딩하는 핵산을 선택적으로 T 세포와 같은 면역세포 내에 효과적으로 도입하는 데 성공하였으며, 그 결과 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명은 하기의 것을 제공한다.
[1] 하기 (a) 내지 (c) 를 포함하는 지질 나노입자:
(a) 키메라 항원 수용체 또는 외인성 T 세포 수용체를 코딩하는 핵산;
(b) 양이온성 지질; 및
(c) 비-양이온성 지질.
[2] [1] 에 있어서, 상기 양이온성 지질이 식 (I) 로 나타난 화합물인 지질 나노입자:
Figure pct00001
[식 중,
L1 은 C1-22 알킬렌기, C2-22 알케닐렌기 또는 C3-22 알카디에닐렌기이고,
n 은 0 또는 1 의 정수이고,
R1 은 하기와 같고:
(1) 수소 원자,
(2) 선형 C1-22 알킬기 및 선형 C2-22 알케닐기로부터 선택되는 1 또는 2 개의 치환기로 임의로 치환된 선형 C1-22 알킬기,
(3) 선형 C1-22 알킬기 및 선형 C2-22 알케닐기로부터 선택되는 1 또는 2 개의 치환기로 임의로 치환된 선형 C2-22 알케닐기, 또는
(4) 선형 C1-22 알킬기 및 선형 C2-22 알케닐기로부터 선택되는 1 또는 2 개의 치환기로 임의로 치환된 선형 C3-22 알카디에닐기,
R2 는 -CH2-O-CO-R5, -CH2-CO-O-R5 또는 -R5 이고,
R3 은 -CH2-O-CO-R6, -CH2-CO-O-R6 또는 -R6 이고,
R4 는 수소 원자, -CH2-O-CO-R7, -CH2-CO-O-R7 또는 -R7 이고,
R5, R6 및 R7 은 각각 독립적으로 하기와 같고:
(1) 선형 C1-22 알킬기 및 선형 C2-22 알케닐기로부터 선택되는 1 또는 2 개의 치환기로 임의로 치환된 선형 C1-22 알킬기,
(2) 선형 C1-22 알킬기 및 선형 C2-22 알케닐기로부터 선택되는 1 또는 2 개의 치환기로 임의로 치환된 선형 C2-22 알케닐기, 또는
(3) 선형 C1-22 알킬기 및 선형 C2-22 알케닐기로부터 선택되는 1 또는 2 개의 치환기로 임의로 치환된 선형 C3-22 알카디에닐기,
R8 및 R9 는 각각 독립적으로, C1-6 알킬기임],
또는 이의 염.
[3] [1] 또는 [2] 에 있어서, 상기 핵산이 mRNA 또는 DNA 인 지질 나노입자.
[4] [1] 내지 [3] 중 어느 하나에 있어서, 상기 비-양이온성 지질이 인지질, 콜레스테롤 및/또는 PEG 지질인 지질 나노입자.
[5] [1] 내지 [4] 중 어느 하나에 있어서, 상기 지질 나노입자가 표면 상의 T 세포를 표적으로 할 수 있는 리간드를 갖는 지질 나노입자.
[6] [5] 에 있어서, 상기 리간드가 CD3 에 대한 항체, CD4 에 대한 항체, CD8 에 대한 항체 및 CD28 에 대한 항체로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 항체의 항원 결합 도메인을 포함하는 리간드인 지질 나노입자.
[7] [5] 에 있어서, 상기 리간드가 CD3 에 대한 항체 및/또는 CD28 에 대한 항체의 항원 결합 도메인을 포함하는 리간드인 지질 나노입자.
[8] [5] 에 있어서, 상기 리간드가 CD3 에 대한 항체 및 CD28 에 대한 항체의 항원 결합 도메인을 포함하는 리간드인 지질 나노입자.
[9] [1] 내지 [8] 중 어느 하나의 지질 나노입자를 포함하는 의약.
[10] [9] 에 있어서, 의약이 암의 예방약 또는 치료약인 의약.
[11] [9] 에 있어서, 의약이 키메라 항원 수용체 또는 외인성 T 세포 수용체 유전자를 생체 내 면역세포에 도입하여 이의 발현을 유도하는 의약.
[12] [9] 에 있어서, 의약이 키메라 항원 수용체 또는 외인성 T 세포 수용체 유전자를 생체 내 T 세포에 도입하여 이의 발현을 유도하는 의약.
[13] 포유동물에게 [1] 내지 [8] 중 어느 하나의 지질 나노입자를 투여하는 것을 포함하는, 포유동물의 생체 내 면역세포에 수용체를 도입함으로써 키메라 항원 수용체 또는 외인성 T 세포 수용체를 발현시키는 방법.
[14] 포유동물에게 [1] 내지 [8] 중 어느 하나의 지질 나노입자를 투여하는 것을 포함하는, 포유동물의 생체 내 T 세포에 수용체를 도입함으로써 키메라 항원 수용체 또는 외인성 T 세포 수용체를 발현시키는 방법.
[15] 포유동물에게 [1] 내지 [8] 중 어느 하나의 지질 나노입자를 투여하는 것을 포함하는, 포유동물에서 암을 예방 또는 치료하는 방법.
[16] [1] 내지 [8] 중 어느 하나에 있어서, 암의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 지질 나노입자.
[17] 암의 예방제 또는 치료제의 제조에서의 [1] 내지 [8] 중 어느 하나의 지질 나노입자의 용도.
[18] [1] 내지 [8] 중 어느 하나의 지질 나노입자를 포함하는, 키메라 항원 수용체 또는 외인성 T 세포 수용체의 발현을 유도하기 위한 조성물.
[19] 생체 외 면역세포를 포함하는 배양물에 [1] 내지 [8] 중 어느 하나의 지질 나노입자를 첨가함으로써 수득되고 키메라 항원 수용체 또는 외인성 T 세포 수용체를 발현하는 생체 외 면역세포.
[20] 생체 외 T 세포를 포함하는 배양물에 [1] 내지 [8] 중 어느 하나의 지질 나노입자를 첨가함으로써 수득되고 키메라 항원 수용체 또는 외인성 T 세포 수용체를 발현하는 생체 외 T 세포.
[21] 생체 외 면역세포를 포함하는 배양물에 [1] 내지 [8] 중 어느 하나의 지질 나노입자를 첨가함으로써 수득되고 키메라 항원 수용체 또는 외인성 T 세포 수용체를 발현하는 생체 외 면역세포를 포함하는 의약.
[22] 생체 외 T 세포를 포함하는 배양물에 [1] 내지 [8] 중 어느 하나의 지질 나노입자를 첨가함으로써 수득되고 키메라 항원 수용체 또는 외인성 T 세포 수용체를 발현하는 생체 외 T 세포를 포함하는 의약.
[23] [21] 또는 [22] 에 있어서, 의약이 암의 예방약 또는 치료약인 의약.
[24] [21] 또는 [22] 에 있어서, 의약이 아폽토시스 유도약인 의약.
[25] 생체 외 면역세포를 포함하는 배양물에 [1] 내지 [8] 중 어느 하나의 지질 나노입자를 첨가하는 것을 포함하는, 생체 외 면역세포에 수용체를 도입함으로써 키메라 항원 수용체 또는 외인성 T 세포 수용체를 발현시키는 방법.
[26] 생체 외 T 세포를 포함하는 배양물에 [1] 내지 [8] 중 어느 하나의 지질 나노입자를 첨가하는 것을 포함하는, 생체 외 T 세포에서 키메라 항원 수용체 또는 외인성 T 세포 수용체를 발현시키는 방법.
[27] 생체 외 면역세포를 포함하는 배양물에 [1] 내지 [8] 중 어느 하나의 지질 나노입자를 첨가함으로써 수득되고 키메라 항원 수용체 또는 외인성 T 세포 수용체를 발현하는 생체 외 면역세포를 포유동물에 투여하는 것을 포함하는, 포유동물에서 암을 예방 또는 치료하는 방법.
[28] 생체 외 T 세포를 포함하는 배양물에 [1] 내지 [8] 중 어느 하나의 지질 나노입자를 첨가함으로써 수득되고 키메라 항원 수용체 또는 외인성 T 세포 수용체를 발현하는 생체 외 T 세포를 포유동물에 투여하는 것을 포함하는, 포유동물에서 암을 예방 또는 치료하는 방법.
[29] 생체 외 면역세포가 생체 외 면역세포를 포함하는 배양물에 [1] 내지 [8] 중 어느 하나의 지질 나노입자를 첨가함으로써 수득되고 키메라 항원 수용체 또는 외인성 T 세포 수용체를 발현하는, 암의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 생체 외 면역세포.
[30] 생체 외 T 세포가 생체 외 T 세포를 포함하는 배양물에 [1] 내지 [8] 중 어느 하나의 지질 나노입자를 첨가함으로써 수득되고 키메라 항원 수용체 또는 외인성 T 세포 수용체를 발현하는, 암의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 생체 외 T 세포.
[31] 생체 외 면역세포가 생체 외 면역세포를 포함하는 배양물에 [1] 내지 [8] 중 어느 하나의 지질 나노입자를 첨가함으로써 수득되고 키메라 항원 수용체 또는 외인성 T 세포 수용체를 발현하는, 암의 예방제 또는 치료제의 제조에서의 생체 외 면역세포의 용도.
[32] 생체 외 T 세포가 생체 외 T 세포를 포함하는 배양물에 [1] 내지 [8] 중 어느 하나의 지질 나노입자를 첨가함으로써 수득되고 키메라 항원 수용체 또는 외인성 T 세포 수용체를 발현하는, 암의 예방제 또는 치료제의 제조에서의 생체 외 T 세포의 용도.
[33] 생체 외 면역세포를 포함하는 배양물에 [1] 내지 [8] 중 어느 하나의 지질 나노입자를 첨가하는 단계를 포함하는, 키메라 항원 수용체 또는 외인성 T 세포 수용체를 발현하는 생체 외 면역세포를 포함하는 의약을 제조하는 방법.
[34] 생체 외 T 세포를 포함하는 배양물에 [1] 내지 [8] 중 어느 하나의 지질 나노입자를 첨가하는 단계를 포함하는, 키메라 항원 수용체 또는 외인성 T 세포 수용체를 발현하는 생체 외 T 세포를 포함하는 의약을 제조하는 방법.
본 발명에 따르면, CAR 또는 외인성 TCR 을 생체 외에서 뿐 아니라 생체 내에서, T 세포와 같은 면역세포에 선택적으로 효과적으로 도입할 수 있고, 생산 비용이 낮은 CAR- 또는 TCR-면역세포 요법이 제공될 수 있다. 또한, 바이러스 벡터가 사용되지 않기 때문에, 바이러스 단백질에 의한 항원성의 문제를 피할 수 있다.
도 1 은 hCD3/hCD28- 화합물 12 -pcDNA3.1-hCD19CAR 로 트랜스펙션된 배양된 인간 1 차 T 세포에서 CD19 CAR 발현의 유세포측정 분석 결과를 보여준다.
도 2 는 hCD3/hCD28- 화합물 21-pcDNA3.1-hCD19CAR 및 hCD3/hCD28- 화합물 35-pcDNA3.1-hCD19CAR 로 트랜스펙션된 배양된 인간 1 차 T 세포에서 CD19 CAR 발현의 유세포측정 분석 결과를 보여준다.
도 3 은 CD19 CAR 로 트랜스펙션된 배양된 인간 1 차 T 세포의 첨가에 의한 Nalm-6 및 Daudi 의 세포독성 비율을 보여준다.
(본 발명의 상세한 설명)
1. 본 발명의 지질 나노입자 (LNP)
본 발명은 하기 (a) 내지 (c) 를 함유하는 지질 나노입자를 제공한다:
(a) 키메라 항원 수용체 (CAR) 또는 외인성 T 세포 수용체 (TCR) 를 코딩하는 핵산;
(b) 양이온성 지질; 및
(c) 비-양이온성 지질
(이하, "본 발명의 지질 나노입자", "본 발명의 LNP" 라고도 함).
본 명세서에서, "지질 나노입자 (LNP)" 는 평균 직경이 1 ㎛ 미만이고 전술한 (b) 및 (c) 로 구성된 분자 조립체에서 작은 다공성 구조 (예를 들어, 메조포러스 물질) 가 없는 입자를 말한다.
본 발명의 지질 나노입자의 구성 요소 (a) 내지 (c) 를 하기에 설명한다.
(a) 키메라 항원 수용체 (CAR) 또는 외인성 T 세포 수용체 (TCR) 를 코딩하는 핵산
(a-1) CAR 을 코딩하는 핵산
CAR 은 T 세포 신호 전달 도메인에 커플링된 항체의 항원-결합 도메인 (예를 들어, scFv) 을 함유하는 인공적으로 구축된 하이브리드 단백질이다. CAR 은 비-MHC-제한된 방식으로 T 세포의 특이성 및 반응성을 선택된 표적으로 전환시키는 모노클로날 항체의 항원-결합 특성을 이용하는 능력을 특징으로 한다. 비 MHC-제한된 항원 인식은 CAR-발현 T 세포에 항원 프로세싱과 독립적으로 항원을 인식하는 능력을 부여하여, 종양 탈출의 주요 메커니즘을 우회한다. 또한, T 세포에서 발현될 때, CAR 은 유리하게는 내인성 TCR α 사슬 및 β 사슬과 이량체화되지 않는다.
본 발명의 지질 나노입자에 사용된 CAR 은 표적 면역세포 (예를 들어, T 세포, NK 세포, NKT 세포, 단핵구, 대식세포, 수지상 세포 등) 가 인식해야 하는 표면 항원 (예를 들어, 암 항원 펩티드, 암세포 등에서 발현이 촉진된 표면 수용체) 을 특이적으로 인식할 수 있는 항체의 항원-결합 도메인, 세포외 힌지 도메인, 막관통 도메인 및 세포내 T 세포 신호 전달 도메인을 포함한다.
항원-결합 도메인에 의해 특이적으로 인식되는 표면 항원의 예는, 제한 없이, 다양한 암 (예를 들어, 급성 림프구성 암, 폐포 횡문근육종, 방광암, 골암, 뇌암 (예를 들어, 수모세포종), 유방암, 항문, 항문관 또는 항문직장 암, 눈의 암, 간내 담관암, 관절 암, 자궁경부, 담낭 또는 흉막 암, 코, 비강 또는 중이 암, 구강암, 외음부 암, 만성 골수암, 대장 암, 식도암, 자궁경부암, 섬유육종, 소화관 카르티노이드 종양, 두경부암 (예를 들어, 두경부 편평 상피 세포 암), 하인두암, 신장암, 후두암, 백혈병 (예를 들어, 급성 림프모구성 백혈병, 급성 림프구성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병, 급성 골수성 백혈병), 액성 종양, 간암, 폐암 (예를 들어, 비-소세포 폐암), 림프종 (예를 들어, 호지킨 림프종, 비-호지킨 림프종, 확산성 대형 B 세포 림프종, 여포성 림프종), 악성 중피종, 비만세포종, 흑색종, 다발성 골수종, 비인두암, 난소암, 췌장암; 복막암, 장암 및 장간막암; 인두암, 전립선암, 직장암, 신장암, 피부암, 소장암, 연조직암, 고형 종양, 위암, 고환암, 갑상선암, 요도암 등에서 촉진된 발현을 나타내는 표면 수용체, 예를 들어 CD19, EGF 수용체, BCMA, CD30, Her2, ROR1, MUC16, CD20, 메소텔린, B-세포 돌연변이 안티텐 (BCMA), CD123, CD3, 전립선 특이적 막 항원 (PSMA), CD33, MUC-1, CD138, CD22, GD2, PD-L1, CEA, 콘드로이틴 설페이트 프로테오글리칸-4, IL-13 수용체 α 사슬, IgG κ 경쇄 및 암 항원 펩티드 (예를 들어, WT1, GPC3, MART-1, gp100, NY-ESO-1, MAGE-A4 등으로부터 유도된 펩티드) 를 포함한다.
본 발명에서 사용되는 항원-결합 도메인은 표적 항원을 특이적으로 인식할 수 있는 항체 단편이라면 특별히 제한되지 않는다. CAR 의 제조 용이성을 고려하면, 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역이 링커 펩티드를 통해 연결된 단일-사슬 항체 (scFv) 가 바람직하다. 단일-사슬 항체에서 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역의 구성은 이들이 기능성 항원-결합 도메인을 재구성할 수 있는 한 특별히 제한되지는 않는다. 이들은 일반적으로 N-말단 측으로부터 경쇄 가변 영역, 링커 펩티드 및 중쇄 가변 영역의 순서로 설계될 수 있다. 링커 펩티드로서, 단일-사슬 항체의 제조에 전형적으로 사용되는 공지된 링커 펩티드가 사용될 수 있다. 예를 들어, 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역을 코딩하는 DNA 는 항체-생성 세포로부터 각각 경쇄 유전자 및 중쇄 유전자를 클로닝하고 이를 주형 등으로서 PCR 을 수행하거나 기존 항체의 서열 정보로부터 이들을 화학적으로 합성함으로써 제조될 수 있다. 단일-사슬 항체를 코딩하는 DNA 는 각각의 수득된 DNA 단편을 적절한 방법에 의해 DNA 인코딩 링커 펩티드와 라이게이션함으로써 수득될 수 있다. 항원-결합 도메인의 N-말단 측에는 바람직하게는 CAR 을 면역세포 표면에 제시하기 위해 리더 서열이 추가로 첨가된다.
세포외 힌지 도메인 및 막관통 도메인으로서, 관련 기술 분야에서 일반적으로 사용되는 T 세포 표면 분자-유래 도메인이 적절하게 사용될 수 있다. 예를 들어, 이들은 CD8α 및 CD28 로부터 유래된 도메인을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.
세포내 신호 전달 도메인의 예는 CD3ζ 사슬을 갖는 것들, 막관통 도메인과 CD3ζ 사슬 사이에 CD28, CD134, CD137, Lck, DAP10, ICOS, 4-1BB 등의 공동-자극 모티프를 추가로 갖는 것들, 및 둘 이상의 공동-자극 모티프를 갖는 것들을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 관련 기술 분야에서 일반적으로 사용되는 모든 도메인을 조합하여 사용할 수 있다.
세포외 힌지 도메인, 막관통 도메인 및 세포내 신호화 도메인을 코딩하는 핵산 서열 정보는 관련 기술 분야에 잘 알려져 있다. 당업자는 이러한 정보에 기초하여 T 세포로부터 각 도메인을 코딩하는 DNA 단편을 용이하게 얻을 수 있다.
CAR 을 코딩하는 DNA 는 통상의 방법에 의해, 이렇게 수득된 항원 결합 도메인, 세포외 힌지 도메인, 막관통 도메인 및 세포내 신호 전달 도메인을 각각 코딩하는 DNA 단편을 연결함으로써 수득될 수 있다.
수득된 CAR 을 코딩하는 DNA 는 그대로 또는 적합한 링커 및/또는 핵 전위 신호 등을 첨가한 후, T 세포에 기능성 프로모터를 함유하는 발현 벡터, 바람직하게는 플라스미드 벡터에 삽입될 수 있다. T 세포에서의 기능성 프로모터의 예는 포유동물 세포에서의 구성 SRα 프로모터, SV40 프로모터, LTR 프로모터, CMV (사이토메갈로바이러스) 프로모터, RSV (유육종 바이러스) 프로모터, MoMuLV (몰로니 마우스 백혈병 바이러스), LTR, HSV-TK (단순 헤르페스 바이러스 티미딘 키나제) 프로모터 등을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 또한, T 세포에서 특이적으로 발현되는 CD3, CD4 및 CD8 과 같은 유전자 프로모터도 사용될 수 있다.
CAR 을 코딩하는 RNA, 바람직하게는 mRNA 는 주형으로서 상기 언급된 CAR 을 인코딩하는 DNA 를 함유하는 발현 벡터를 사용하여 자체 공지된 시험관 내 전사 시스템에서 mRNA 로의 전사에 의해 제조될 수 있다.
(a-2) 외인성 TCR 을 코딩하는 핵산
본 명세서에서, "T 세포 수용체 (TCR)" 는 TCR 사슬의 이량체 (α- 사슬, β-사슬) 로 구성되고 항원 또는 항원-HLA (인간 백혈구 유형 항원) (MHC; 주요 조직 적합성 복합체) 복합체를 인식하고 자극성 신호를 T 세포로 전달하는 수용체를 의미한다. 각각의 TCR 사슬은 가변 영역 및 불변 영역으로 구성되며, 가변 영역은 3 개의 상보성 결정 영역 (CDR1, CDR2, CDR3) 을 포함한다. 본 발명에 사용되는 TCR 은 TCR 의 α 및 β 사슬이 이종이량체를 구성하는 것뿐만 아니라 이들이 단독이량체를 구성하는 것들을 포함한다. 또한, TCR 은 일부 또는 모든 불변 영역이 결실된 것, 재조합 아미노산 서열을 갖는 것, 및 가용성 TCR 을 갖는 것 등을 포함한다.
"외인성 TCR" 은 본 발명의 지질 나노입자의 표적 세포인 T 세포에 대해 외인성인 것을 의미한다. 외인성 TCR 의 아미노산 서열은 본 발명의 지질 나노입자의 표적 세포인 T 세포에 의해 발현된 내인성 TCR 의 아미노산 서열과 동일하거나 상이할 수 있다.
본 발명의 지질 나노입자에 사용되는 TCR 을 코딩하는 핵산은 표적 T 세포에 의해 인식될 표면 항원 (예를 들어, 암 항원 펩티드 등) 을 특이적으로 인식할 수 있는 TCR 의 α 사슬 및 β 사슬을 코딩하는 핵산이다.
핵산은 자체 공지의 방법에 의해 제조할 수 있다. 원하는 TCR 의 아미노산 서열 또는 핵산 서열이 공지된 경우, 본 발명의 TCR 의 전장 또는 일부를 코딩하는 DNA 는 예를 들어 DNA 가닥 또는 RNA 가닥을 화학적으로 합성함으로써, 또는 PCR 방법 또는 Gibson 조립 방법에 의해 합성된, 부분적으로 중첩된 올리고-DNA 짧은 가닥을 연결함으로써, 서열에 기초하여 구축될 수 있다.
원하는 TCR 의 서열이 알려지지 않은 경우, 예를 들어, 관심 T 세포는 관심 TCR 을 발현하는 T 세포를 함유하는 세포 집단으로부터 단리되고, TCR 을 코딩하는 핵산은 T 세포로부터 수득될 수 있다. 구체적으로, T 세포를 함유하는 세포 집단 (예를 들어, PBMC) 은 유기체 (예를 들어, 인간) 로부터 수집되고, 세포 집단은 세포 집단을 자극하면서 표적 TCR 에 의해 인식되는 세포 표면 항원의 에피토프의 존재 하에서 배양되고, 세포 표면 항원을 발현하는 세포를 특이적으로 인식하는 T 세포는 공지된 방법에 의해, 그리고 세포 표면 항원을 발현하는 세포에 대한 특이성 및 CD8 및 CD4 와 같은 세포 표면 항원을 지표로 사용하여 세포 집단으로부터 선택될 수 있다. T 세포의 세포 표면 항원을 발현하는 세포에 대한 특이성은 예를 들어 덱스트로머 어세이, ELISPOT 어세이, 세포독성 어세이 등에 의해 측정될 수 있다. T 세포를 함유하는 상기 언급된 세포 집단은 바람직하게는, 예를 들어 관심있는 TCR 에 의해 인식되는 세포 표면 항원을 발현하는 다수의 세포를 갖는 유기체 (예를 들어, 암과 같은 질환을 가진 환자, 또는 항원의 에피토프와 접촉된 T 세포-함유 집단 또는 에피토프로 펄스된 수지상 세포) 로부터 수집된다.
본 발명의 핵산은 통상적인 방법에 의해 상기 언급된 단리된 T 세포로부터 DNA 를 추출하고, DNA 를 주형으로 사용하여 TCR 의 불변 영역의 핵산 서열에 기초하여 TCR 유전자를 증폭 및 클로닝함으로써 수득될 수 있다. 이것은 또한, 세포로부터 RNA 를 추출하고 통상적인 방법으로 cDNA 를 합성하고, TCR α 사슬 및 β 사슬의 불변 영역을 각각 코딩하는 핵산에 상보적인 안티센스 프라이머를 사용하여 주형으로서 cDNA 로 5'-RACE (cDNA 말단의 빠른 증폭) 를 수행함으로써 제조될 수 있다. 5'-RACE는 공지된 방법으로 수행될 수 있고, 예를 들어 SMART PCR cDNA 합성 키트 (Clontech 제조) 와 같은 시판 키트를 사용하여 수행될 수 있다. 수득된 TCR 의 α 사슬 및 β 사슬을 코딩하는 DNA 는 상기 언급된 CAR 을 코딩하는 DNA 와 동일한 방법으로 적절한 발현 벡터에 삽입될 수 있다. α 사슬을 코딩하는 DNA 및 β 사슬을 코딩하는 DNA 는 동일한 벡터 또는 별도의 벡터에 삽입될 수 있다. 동일한 벡터에 삽입될 때, 발현 벡터는 폴리시스트로닉 또는 모노시스트로닉 방식으로 두 가닥을 모두 발현할 수 있다. 전자의 경우, IRES 또는 FMV 2A 와 같은 폴리시스트로닉 발현을 허용하는 개재 서열이 두 가닥을 암호화하는 DNA 사이에 삽입된다.
또한, TCR 의 각 가닥을 코딩하는 RNA, 바람직하게는 mRNA 는 예를 들어, 발현 벡터를 주형으로 사용함으로써 상기 언급된 CAR 을 코딩하는 RNA 와 동일한 방식으로 제조될 수 있다.
(b) 양이온성 지질
본 명세서에서, "양이온성 지질" 은 생리적 pH 와 같은 선택된 pH 에서 순 양전하를 갖는 지질을 의미한다. 본 발명의 지질 나노입자에서 사용되는 양이온성 지질은 특별히 제한되지 않는다. 예를 들어, WO 2015/011633, WO 2016/021683, WO 2011/153493, WO 2013/126803, WO 2010/054401, WO 2010/042877, WO 2016/104580, WO 2015/005253, WO 2014/007398, WO 2017/117528, WO 2017/075531, WO 2017/00414, WO 2015/199952, US 2015/0239834 등에 기재된 양이온성 지질 등이 언급될 수 있다.
바람직한 양이온성 지질은 하기 구조식으로 표시되며 WO 2015/011633 에 기재되어 있다.
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005
Figure pct00006
Figure pct00007
Figure pct00008
Figure pct00009
및 이의 염.
상기 언급된 양이온성 지질 중에서도, 하기 구조식으로 표시되는 양이온성 지질이 보다 바람직하다.
Figure pct00010
및 이의 염.
바람직한 양이온성 지질은 하기 구조식으로 표시되며 WO 2016/021683 에 기재되어 있다. 하기로 나타내는 화합물:
Figure pct00011
[식 중,
W 는 식 -NR1R2 또는 식 -N+R3R4R5(Z-) 이고,
R1 및 R2 는 각각 독립적으로, C1-4 알킬기 또는 수소 원자이고,
R3, R4 및 R5 는 각각 독립적으로, C1-4 알킬기이고,
Z- 는 음이온이고,
X 는 임의로 치환된 C1-6 알킬렌기이고,
YA, YB 및 YC 는 각각 독립적으로 임의로 치환된 메틴기이고,
LA, LB 및 LC 는 각각 독립적으로 임의로 치환된 메틸렌기 또는 결합이고,
RA1, RA2, RB1, RB2, RC1 및 RC2 는 각각 독립적으로 임의로 치환된 C4-10 알킬기임],
또는 이의 염.
보다 바람직하게는, 하기 구조식으로 표시되는 양이온성 지질이 언급될 수 있다.
Figure pct00012
Figure pct00013
Figure pct00014
Figure pct00015
Figure pct00016
Figure pct00017
Figure pct00018
Figure pct00019
Figure pct00020
Figure pct00021
및 이의 염.
상기 언급된 양이온성 지질 중에서, 보다 바람직한 양이온성 지질은 하기 구조식으로 표시된다.
Figure pct00022
Figure pct00023
및
Figure pct00024
및 이의 염.
또다른 바람직한 구현예에서, 하기 화학식 (II) 로 표시되는 양이온성 지질 (이하 "화합물 (II)" 로도 지칭됨) 이 언급될 수 있다. 하기로 나타내는 화합물:
Figure pct00025
[식 중,
n 은 2 내지 5 의 정수이고,
R 은 선형 C1-5 알킬기, 선형 C7-11 알케닐기 또는 선형 C11 알카디에닐기이며,
물결 선은 각각 독립적으로 시스형 또는 트랜스형 결합을 나타냄],
또는 이의 염.
보다 바람직하게는, 하기 구조식으로 표시되는 양이온성 지질이 언급될 수 있다.
Figure pct00026
Figure pct00027
Figure pct00028
Figure pct00029
Figure pct00030
Figure pct00031
및 이의 염.
상기 언급된 양이온성 지질 중에서, 보다 바람직한 양이온성 지질은 하기 구조식으로 표시된다.
Figure pct00032
및 이의 염.
화합물 (II) 는, 예를 들어 하기 제조 방법에 의해 제조될 수 있다. 화합물 (II) 중에서, 양쪽 물결 선이 시스형 결합인 화합물 및 물결 선 중 하나 또는 둘 모두가 트랜스형 결합인 화합물은 하기에 나타낸 것과 유사한 제조 방법에 의해 제조될 수 있다. 특히, 에스테르화 공정에서 목적하는 화합물 (II) 의 구조에 따라 적절한 출발 물질을 사용하여 목적하는 구조를 갖는 화합물 (II) 를 합성할 수 있다. 화합물 (II) 의 염은 무기 염기, 유기 염기, 유기산, 염기성 또는 산성 아미노산과 적절히 혼합하여 얻을 수 있다.
Figure pct00033
상기 언급된 제조 방법에서의 각 단계에서 사용되는 원료 또는 시약, 및 수득되는 화합물은 각각 염을 형성할 수 있다.
각 공정에서 수득되는 화합물이 유리 화합물인 경우, 이 화합물은 당업계에서의 자체 공지의 방법에 의해, 목적으로 하는 염으로 전환될 수 있다. 반대로, 각 공정에서 수득되는 화합물이 염인 경우, 이 염은 당업계에서의 자체 공지의 방법에 의해, 유리 형태 또는 목적으로 하는 또다른 유형의 염으로 전환될 수 있다.
각 공정에서 수득되는 화합물은 이의 반응 용액의 형태로, 또는 미정제 생성물로서 수득한 후에, 직접 다음 반응에서 사용될 수 있다. 대안적으로, 각 공정에서 수득되는 화합물은 통상적인 방법에 따라서, 농축, 결정화, 재결정화, 증류, 용매 추출, 분류, 또는 크로마토그래피와 같은 분리 수단에 의해, 반응 혼합물로부터 단리 및/또는 정제될 수 있다.
각 공정에 대한 원료 또는 시약 화합물이 시판되고 있는 경우에는, 시판품을 그대로 사용할 수 있다.
각 공정의 반응에 있어서, 반응 시간은 사용되는 시약 또는 용매에 따라 상이할 수 있으며, 달리 명시하지 않는 한, 일반적으로 1 분 내지 48 시간, 바람직하게는 10 분 내지 8 시간이다.
각 공정의 반응에 있어서, 반응 온도는 사용되는 시약 또는 용매에 따라 상이할 수 있으며, 달리 명시하지 않는 한, 일반적으로 -78℃ 내지 300℃, 바람직하게는 -78℃ 내지 150℃ 이다.
각 공정의 반응에 있어서, 압력은 사용되는 시약 또는 용매에 따라 상이할 수 있으며, 달리 명시하지 않는 한, 통상적으로 1 atm 내지 20 atm, 바람직하게는 1 atm 내지 3 atm 이다.
각 단계의 반응에서, 예를 들어, Biotage Initiator 와 같은 마이크로파 합성 장치가 사용될 수 있다. 반응 온도는 사용되는 시약 또는 용매에 따라 상이할 수 있으며, 달리 명시하지 않는 한, 일반적으로 실온 내지 300℃, 바람직하게는 실온 내지 250℃, 보다 바람직하게는 50℃ 내지 250℃ 이다. 반응 시간은 사용되는 시약 또는 용매에 따라 상이할 수 있으며, 달리 명시하지 않는 한, 일반적으로 1 분 내지 48 시간, 바람직하게는 1 분 내지 8 시간이다.
각 공정의 반응에 있어서, 시약은 달리 명시하지 않는 한, 기질에 대해서 0.5 당량 내지 20 당량, 바람직하게는 0.8 당량 내지 5 당량으로 사용된다. 시약을 촉매로서 사용하는 경우, 시약은 기질에 대해서 0.001 당량 내지 1 당량, 바람직하게는 0.01 당량 내지 0.2 당량으로 사용된다. 시약이 또한 반응 용매로서 제공되는 경우, 시약은 용매의 양으로 사용된다.
반응의 각 공정에 있어서, 반응은 달리 명시하지 않는 한, 용매없이 또는 적절한 용매 중에 용해 또는 현탁시킴으로써 수행된다. 용매의 특정한 예는 하기를 포함한다.
알코올: 메탄올, 에탄올, 이소프로판올, 이소부탄올, tert-부틸 알코올, 2-메톡시에탄올 등;
에테르: 디에틸 에테르, 디이소프로필 에테르, 디페닐 에테르, 테트라히드로 푸란, 1,2-디메톡시에탄 등;
방향족 탄화수소: 클로로벤젠, 톨루엔, 자일렌 등;
포화 탄화수소: 시클로헥산, 헥산, 헵탄 등;
아미드: N,N-디메틸포름아미드, N-메틸피롤리돈 등;
할로겐화된 탄화수소: 디클로로메탄, 사염화탄소 등;
니트릴: 아세토니트릴 등;
설폭시드: 디메틸 설폭시드 등;
방향족 유기 염기: 피리딘 등;
산 무수물: 아세트산 무수물 등;
유기 산: 포름산, 아세트산, 트리플루오로아세트산 등;
무기 산: 염산, 황산 등;
에스테르: 에틸 아세테이트, 이소프로필 아세테이트 에스테르 등;
케톤: 아세톤, 메틸에틸 케톤 등;
물.
이들 용매의 2 종 이상을 적절한 비율의 혼합물로서 사용할 수 있다.
염기를 사용하는 각 반응 단계에서, 사용될 수 있는 염기의 예는 하기에 열거된 것들이다.
무기 염기: 수산화나트륨, 수산화칼륨, 수산화마그네슘 등;
염기성 염: 탄산나트륨, 탄산칼슘, 탄산수소나트륨 등;
유기 염기: 트리에틸아민, 디에틸아민, 피리딘, 4-디메틸아미노피리딘, N,N-디메틸아닐린, 1,4-디아자바이시클로[2.2.2]옥탄, 1,8-디아자바이시클로[5.4.0]-7-운데센, 이미다졸, 피페리딘 등;
금속 알콕시드: 나트륨 에톡시드, 칼륨 tert-부톡시드, 나트륨 tert-부톡시드 등;
알칼리 금속 수소화물: 수소화나트륨 등;
금속 아미드: 나트륨 아미드, 리튬 디이소프로필아미드, 리튬 헥사메틸디실라지드 등;
유기 리튬: n-부틸리튬, sec-부틸리튬 등.
산 또는 산 촉매를 사용하는 각 반응 단계에서, 하기 산 또는 산 촉매가 사용된다.
무기 산: 염산, 황산, 질산, 브롬화수소산, 인산 등;
유기 산: 아세트산, 트리플루오로아세트산, 시트르산, p-톨루엔설폰산, 10-캄포르 설폰산 등;
루이스 산: 삼불화 붕소 디에틸 에테르 착물, 요오드화아연, 무수 염화알루미늄, 무수 염화아연, 무수 염화철 등.
달리 언급되지 않는 한, 각각의 반응 단계는 하기 문헌에 기재된 바와 같이, 당업계에 공지된 표준 방법에 따라 수행될 수 있다: Jikken Kagaku Koza (Encyclopedia of Experimental Chemistry in English), 5th Ed., Vol. 13 to Vol. 19 (the Chemical Society of Japan 편집); Shin Jikken Kagaku Koza (New Encyclopedia of Experimental Chemistry in English), Vol. 14 to Vol. 15 (the Chemical Society of Japan 편집); Fine Organic Chemistry, 2nd Ed. Revised (L. F. Tietze, Th. Eicher, Nankodo); Organic Name Reactions; The Reaction Mechanism and Essence, Revised (Hideo Togo, Kodansha); Organic Syntheses Collective Volume I-VII (John Wiley & Sons, Inc.); Modern Organic Synthesis in the Laboratory: A Collection of Standard Experimental Procedures (Jie Jack Li, Oxford University Press); Comprehensive Heterocyclic Chemistry III, Vol. 1 to Vol. 14 (Elsevier Japan KK); Strategic Applications of Named Reactions in Organic Synthesis (Kiyoshi Tomioka 번역, Kagaku-Dojin Publishing); Comprehensive Organic Transformations (VCH Publishers, Inc.), 1989; 등.
각 공정에 있어서, 관능기의 보호 또는 탈보호 반응은 당업계에서의 자체 공지의 방법, 예를 들어, 하기 문헌에 기재된 방법에 따라 수행될 수 있다: “Protective Groups in Organic Synthesis, 4th Ed.” (Theodora W. Greene, Peter G. M. Wuts), Wiley-Interscience, 2007; “Protecting Groups, 3rd Ed.” (P.J. Kocienski) Thieme, 2004); 등.
알코올 등에서의 히드록시기 또는 페놀성 히드록시기에 대한 보호기의 예는: 메톡시메틸 에테르, 벤질 에테르, p-메톡시벤질 에테르, t-부틸디메틸실릴 에테르, t-부틸디페닐실릴 에테르, 및 테트라히드로피라닐 에테르 등의 에테르-유형 보호기; 아세트산 에스테르 등의 카르복실산 에스테르-유형 보호기; 메탄설폰산 에스테르 등의 설폰산 에스테르-유형 보호기; 및 t-부틸 카보네이트 등의 탄산 에스테르-유형 보호기를 포함한다.
알데히드에서의 카르보닐기에 대한 보호기의 예는: 디메틸아세탈 등의 아세탈-유형 보호기; 및 시클릭 1,3-디옥산 등의 시클릭 아세탈-유형 보호기를 포함한다.
케톤에서의 카르보닐기의 보호기의 예는: 디메틸케탈 등의 케탈-유형 보호기; 시클릭 1,3-디옥산 등의 시클릭 케탈-유형 보호기; O-메틸옥심 등의 옥심-유형 보호기; 및 N,N-디메틸히드라존 등의 히드라존-유형 보호기를 포함한다.
카르복실기에 대한 보호기의 예는: 메틸 에스테르 등의 에스테르-유형 보호기; 및 N,N-디메틸아미드 등의 아미드-유형 보호기를 포함한다.
티올에 대한 보호기의 예는: 벤질 티오에테르 등의 에테르-유형 보호기; 및 티오아세트산 에스테르, 티오카르보네이트 및 티오카바메이트 등의 에스테르-유형 보호기를 포함한다.
아미노기 또는 방향족 헤테로사이클, 예컨대 이미다졸, 피롤 또는 인돌에 대한 보호기의 예는: 벤질 카바메이트 등의 카바메이트-유형 보호기; 아세트아미드 등의 아미드-유형 보호기; N-트리페닐메틸아민 등의 알킬아민-유형 보호기; 및 메탄설폰아미드 등의 설폰아미드-유형 보호기를 포함한다.
보호기는 당업계에서의 자체 공지의 방법, 예를 들어, 산, 염기, 자외선, 히드라진, 페닐히드라진, 나트륨 N-메틸디티오카바메이트, 테트라부틸암모늄 플루오라이드, 팔라듐 아세테이트 또는 트리알킬실릴 할라이드 (예를 들어, 트리메틸실릴 요오다이드 또는 트리메틸실릴 브로마이드) 를 사용하는 방법 또는 환원 방법에 의해 제거될 수 있다.
환원 반응을 사용하는 각 단계에서, 사용될 수 있는 환원제의 예는: 리튬 알루미늄 수소화물, 나트륨 트리아세톡시보로히드라이드, 나트륨 시아노보로히드라이드, 디이소부틸 알루미늄 수소화물 (DIBAL-H), 나트륨 보로히드라이드 및 테트라메틸암모늄 트리아세톡시보로히드라이드 등의 금속 수소화물; 보란-테트라히드로푸란 착물 등의 보란; 레이니 니켈; 레이니 코발트; 수소; 및 포름산을 포함한다. 예를 들어, 레이니-니켈 또는 레이니 코발트는 수소 또는 포름산의 존재 하에 사용될 수 있다. 탄소-탄소 이중 결합 또는 삼중 결합을 환원시키는 경우에 있어서, 팔라듐-탄소 또는 린들라 (Lindlar) 촉매와 같은 촉매를 사용하는 방법이 사용될 수 있다.
산화 반응을 이용하는 각 단계에서, 사용될 수 있는 산화제의 예는: m-클로로퍼벤조산 (MCPBA), 과산화수소 및 t-부틸 히드로퍼옥시드 등의 과산; 테트라부틸암모늄 퍼클로레이트 등의 퍼클로레이트; 나트륨 클로레이트 등의 클로레이트; 나트륨 클로라이트 등의 클로라이트; 나트륨 페리오데이트 등의 페리오데이트; 요오도실벤젠 등의 고-원자가 (high-valent) 요오드 시약; 이산화망간 및 과망간산칼륨 등의 망간 시약; 납 테트라아세테이트 등의 납 시약; 피리디늄 클로로크로메이트 (PCC), 피리디늄 디크로메이트 (PDC) 및 존스 시약 등의 크롬 시약; N-브로모숙신이미드 (NBS) 등의 할로겐 화합물; 산소; 오존; 삼산화황-피리딘 착물; 오스뮴 테트록시드; 이산화셀레늄; 및 2,3-디클로로-5,6-디시아노-1,4-벤조퀴논 (DDQ) 을 포함한다.
라디칼 고리화 반응을 이용하는 각 단계에서, 사용될 수 있는 라디칼 개시제의 예는: 아조비스이소부티로니트릴 (AIBN) 등의 아조 화합물; 4-4'-아조비스-4-시아노펜탄산 (ACPA) 등의 수용성 라디칼 개시제; 공기 또는 산소의 존재 하의 트리에틸보론; 및 벤조일 퍼옥시드를 포함한다. 사용되는 라디칼 개시제의 예는 트리부틸스타난, 트리스트리메틸실릴실란, 1,1,2,2-테트라페닐디실란, 디페닐실란 및 사마륨 요오다이드를 포함한다.
비티히 (Wittig) 반응을 이용하는 각 단계에서, 사용될 수 있는 비티히 (Wittig) 시약의 예는 알킬리덴포스포란을 포함한다. 알킬리덴포스포란은 당업계에서의 자체 공지의 방법, 예를 들어 포스포늄 염과 강 염기 사이의 반응에 의해 제조될 수 있다.
호르너-에몬스 (Horner-Emmons) 반응을 이용하는 각 단계에서, 사용될 수 있는 시약의 예는 메틸 디메틸포스포노아세테이트 및 에틸 디에틸포스포노아세테이트 등의 포스포노아세트산 에스테르, 및 알칼리 금속 수소화물 및 유기 리튬 등의 염기를 포함한다.
프리에델-크래프트 (Friedel-Crafts) 반응을 사용하는 각 단계에서, 사용될 수 있는 시약의 예는 루이스 산 및 산 클로라이드 또는 알킬화제 (예를 들어, 알킬 할라이드, 알코올 및 올레핀) 를 포함한다. 대안적으로, 루이스 산 대신에 유기 산 또는 무기 산을 사용할 수 있고, 산 클로라이드 대신에 무수 아세트산과 같은 산 무수물을 사용할 수 있다.
방향족 친핵성 치환 반응을 사용하는 각 단계에서, 친핵체 (예를 들어, 아민 또는 이미다졸) 및 염기 (예를 들어, 염기성 염 또는 유기 염기) 가 시약으로서 사용될 수 있다.
탄소음이온을 사용하는 친핵성 부가 반응, 탄소음이온을 사용하는 친핵성 1,4-부가 반응 (마이클 (Michael) 부가 반응) 또는 탄소음이온을 사용하는 친핵성 치환 반응을 사용하는 각 공정에서, 탄소음이온을 발생시키기 위해 사용될 수 있는 염기의 예는 유기 리튬 시약, 금속 알콕시드, 무기 염기 및 유기 염기를 포함한다.
그리나드 반응을 사용하는 각 단계에서, 사용될 수 있는 그리냐드 시약의 예는 페닐 마그네슘 브로마이드 등의 아릴 마그네슘 할라이드, 및 메틸 마그네슘 브로마이드, 이소프로필마그네슘 브로마이드 등의 알킬 마그네슘 할라이드를 포함한다. 그리나드 시약은 당업계에서의 자체 공지의 방법, 예를 들어, 용매로서 에테르 또는 테트라히드로푸란 중에, 알킬 할라이드 또는 아릴 할라이드와 금속 마그네슘 사이의 반응에 의해 제조될 수 있다.
크뇌페나겔 (Knoevenagel) 축합 반응을 사용하는 각 단계에서, 시약으로서 2 개 전자-구인 기에 의해 측면 위치한 활성 메틸렌 화합물 (예를 들어, 말론산, 디에틸 말로네이트 또는 말로노니트릴) 및 염기 (예를 들어, 유기 염기, 금속 알콕시드 또는 무기 염기) 가 사용될 수 있다.
빌스마이어-해크 (Vilsmeier-Haack) 반응을 사용하는 각 공정에서, 포스포릴 클로라이드 및 아미드 유도체 (예를 들어, N,N-디메틸포름아미드) 가 시약으로서 사용될 수 있다.
알코올, 알킬 할라이드 또는 설폰산 에스테르의 아지드화 반응을 사용하는 각 단계에서, 사용될 수 있는 아지드화제의 예는 디페닐포스포릴아지드 (DPPA), 트리메틸실릴아지드 및 나트륨 아지드를 포함한다. 예를 들어, 알코올의 아지드화의 경우에 있어서, 디페닐포스포릴아지드 및 1,8-디아자비시클로[5,4.0]운데크-7-엔 (DBU) 을 사용하는 방법, 트리메틸실릴아지드 및 루이스 산을 사용하는 방법 등이 사용될 수 있다.
환원성 아민화 반응을 사용하는 각 단계에서, 사용될 수 있는 환원제의 예는 나트륨 트리아세톡시보로히드라이드, 나트륨 시아노보로히드라이드, 수소 및 포름산을 포함한다. 기질이 아민 화합물인 경우, 사용될 수 있는 카르보닐 화합물의 예는 p-포름알데히드뿐만 아니라 아세트알데히드와 같은 알데히드 및 시클로헥사논과 같은 케톤을 포함한다. 기질이 카르보닐 화합물인 경우, 사용될 수 있는 아민의 예는 암모니아 및 메틸아민과 같은 1 차 아민, 및 디메틸아민과 같은 2 차 아민을 포함한다.
미츠노부 (Mitsunobu) 반응을 사용하는 각 단계에서, 아조디카르복실산 에스테르 (예를 들어, 디에틸 아조디카르복실레이트 (DEAD) 및 디이소프로필 아조디카르복실레이트 (DIAD)) 및 트리페닐포스핀이 시약으로서 사용될 수 있다.
에스테르화, 아미드화 또는 우레화 반응을 사용하는 각 단계에서, 사용될 수 있는 시약의 예는 산 클로라이드 또는 산 브로마이드와 같은 아실 할라이드, 및 산 무수물, 활성 에스테르 또는 설페이트 에스테르와 같은 활성 카르복실산을 포함한다. 카르복실산에 대한 활성화제의 예는: 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필) 카르보디이미드 히드로클로라이드 (WSCD) 등의 카르보디이미드 축합제; 4-(4,6-디메톡시-1,3,5-트리아진-2-일)-4-메틸모르폴리늄 클로라이드-n-수화물 (DMT-MM) 등의 트리아진 축합제; 1,1-카르보닐디이미다졸 (CDI) 등의 탄산 에스테르 축합제; 디페닐포스포릴아지드 (DPPA); 벤조트리아졸-1-일옥시-트리스디메틸아미노포스포늄 염 (BOP 시약); 2-클로로-1-메틸-피리디늄 요오다이드 (무카이야마 (Mukaiyama) 시약); 티오닐 클로라이드; 에틸 클로로포르메이트 등의 저급 알킬 할로포르메이트; O-(7-아자벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트 (HATU); 황산; 및 이의 조합을 포함한다. 카르보디이미드 축합제를 사용하는 경우, 1-히드록시벤조트리아졸 (HOBt), N-히드록시숙신이미드 (HOSu), 디메틸아미노피리딘 (DMAP) 등과 같은 첨가제를 반응에 첨가하는 것이 유리할 수 있다.
커플링 반응을 이용하는 각 단계에서, 사용될 수 있는 금속 촉매의 예는 팔라듐 (II) 아세테이트, 테트라키스(트리페닐포스핀) 팔라듐 (0), 디클로로비스(트리페닐포스핀) 팔라듐 (II), 디클로로비스(트리에틸포스핀) 팔라듐 (II), 트리스(디벤질리덴아세톤) 디팔라듐 (0), 1,1'-비스(디페닐포스피노) 페로센 팔라듐 (II) 클로라이드 및 팔라듐 (II) 아세테이트 등의 팔라듐 화합물; 테트라키스(트리페닐포스핀) 니켈 (0) 등의 니켈 화합물; 트리스(트리페닐포스핀) 로듐 (III) 클로라이드 등의 로듐 화합물; 코발트 화합물; 구리 산화물 및 구리 (I) 요오다이드 등의 구리 화합물; 및 백금 화합물을 포함한다. 반응에 염기의 첨가가 또한 유리할 수 있다. 이러한 염기의 예는 무기 염기 및 염기성 염을 포함한다.
티오카르보닐화 반응을 이용하는 각 단계에서, 디포스포러스 펜타설파이드가 전형적으로 티오카르보닐화제로서 사용된다. 디포스포러스 펜타설파이드 대신에, 2,4-비스(4-메톡시페닐)-1,3,2,4-디티아디포스페탄-2,4-디설파이드 (로손 (Lawesson) 시약) 와 같은 1,3,2,4-디티아디포스페탄-2,4-디설파이드 구조를 갖는 시약이 사용될 수 있다.
볼-지글러 (Wohl-Ziegler) 반응을 이용하는 각 단계에서, 사용될 수 있는 할로겐화제의 예는 N-요오도석신이미드, N-브로모석신이미드 (NBS), N-클로로석신이미드 (NCS), 브롬 및 설푸릴 클로라이드를 포함한다. 반응은, 열, 빛, 벤조일 퍼옥사이드 또는 아조비스이소부티로니트릴 등과 같은 라디칼 개시제의 추가의 첨가에 의해 가속화될 수 있다.
히드록시기의 할로겐화 반응을 이용하는 각 단계에서, 사용될 수 있는 할로겐화제의 예는 히드로할산 또는 무기산의 산 할라이드를 포함하고; 예로는 염산, 염화티오닐 및 염소화를 위한 포스포러스 옥시클로라이드 및 브롬화를 위한 48% 브롬화수소산을 포함한다. 부가적으로, 트리페닐포스핀 및 사염화탄소 또는 사브롬화탄소 등의 작용에 의해, 알코올로부터 알킬 할라이드를 수득하는 방법을 또한 사용할 수 있다. 대안적으로는, 알코올의 설폰산 에스테르로의 변환 및 브롬화리튬, 염화리튬 또는 요오드화나트륨과의 후속 반응을 포함하는 2 단계 반응을 통해 알킬 할라이드를 합성하는 방법을 또한 사용할 수 있다.
아르부조프 (Arbuzov) 반응을 이용하는 각 단계에서, 사용될 수 있는 시약의 예는 브로모에틸 아세테이트와 같은 알킬 할라이드 및 트리에틸포스파이트 및 트리(이소프로필)포스파이트와 같은 포스파이트를 포함한다.
설폰-에스테르화 반응을 수행하는 각 단계에서, 사용되는 설포닐화제의 예는 메탄설포닐 클로라이드, p-톨루엔설포닐 클로라이드, 메탄설폰산 무수물 및 p-톨루엔설폰산 무수물 및 트리플루오로메탄설폰산 무수물을 포함한다.
가수분해 반응을 이용하는 각 단계에서, 산 또는 염기가 시약으로서 사용될 수 있다. t-부틸 에스테르의 산 가수분해 반응을 수행하는 경우에 있어서, 포름산, 트리에틸실란 등의 시약이, 부생성물인 t-부틸 양이온을 환원적으로 트래핑하기 위해 첨가될 수 있다.
탈수 반응을 사용하는 각 단계에서, 사용될 수 있는 탈수제의 예는 황산, 디포스포러스 펜타옥시드, 인 옥시클로라이드, N,N'-디시클로헥실카르보디이미드, 알루미나 및 폴리인산을 포함한다.
또다른 바람직한 구현예에서, 하기 화학식 (III) 으로 표시되는 양이온성 지질 (이하 "화합물 (III)" 으로도 지칭됨) 이 언급될 수 있다. 하기로 나타내는 화합물:
Figure pct00034
[식 중,
n1 은 2 내지 6 의 정수이고,
n2 는 0 내지 2 의 정수이고,
n3 는 0 내지 2 의 정수이고,
L 은 -C(O)O- 또는 -NHC(O)O- 이고,
Ra 는 선형 C5-13 알킬기, 선형 C13-17 알케닐기 또는 선형 C17 알카디에닐기이며,
Rb 는 선형 C2-9 알킬기이며,
Rc 는 수소 원자 또는 선형 C2-9 알킬기이고,
Rd 는 수소 원자 또는 선형 C2-9 알킬기이고,
Re 는 선형 C2-9 알킬기이며,
Rf 는 선형 C2-9 알킬기임],
또는 이의 염.
보다 바람직하게는, 양이온성 지질로 표시되는 하기 구조식을 언급할 수 있다.
Figure pct00035
Figure pct00036
Figure pct00037
Figure pct00038
Figure pct00039
및 이의 염.
상기 언급된 양이온성 지질 중에서도, 하기 구조식으로 표시되는 양이온성 지질이 보다 바람직하다.
Figure pct00040
Figure pct00041
및 이의 염.
화합물 (III) 는, 예를 들어 하기 제조 방법에 의해 제조될 수 있다. 특히, 에스테르화 공정에서 목적하는 화합물 (III) 의 구조에 따라 적절한 출발 물질을 사용하여 목적하는 구조를 갖는 화합물 (I) 을 합성할 수 있다. 화합물 (III) 의 염은 무기 염기, 유기 염기, 유기산, 염기성 또는 산성 아미노산과 적절히 혼합하여 얻을 수 있다.
Figure pct00042
Figure pct00043
Figure pct00044
상기 식에서, P1, P2, P3, P4, P5 및 P6 은 각각 독립적으로 보호기이고, 화합물 (A) 는 식:
Figure pct00045
이고, 화합물 (B) 는 식:
Figure pct00046
이고, R1 은
Figure pct00047
이고, 화합물 (C) 는 식:
Figure pct00048
이고, R2 는
Figure pct00049
이고, 나머지 기호는 각각 상기 정의된 바와 같다.
상기 언급된 제조 방법에서 각각의 단계의 반응에 사용되는 출발 물질 및 시약 및 반응 조건은 화합물 (II) 의 제조 방법에서 상기 기재된 것과 동일할 수 있다.
또다른 구현예에서, 하기 구조식으로 표시되며 WO 2011/153493 에 기재되는 양이온성 지질이 언급될 수 있다.
Figure pct00050
Figure pct00051
Figure pct00052
Figure pct00053
Figure pct00054
Figure pct00055
Figure pct00056
Figure pct00057
Figure pct00058
Figure pct00059
Figure pct00060
Figure pct00061
Figure pct00062
Figure pct00063
Figure pct00064
Figure pct00065
Figure pct00066
Figure pct00067
Figure pct00068
Figure pct00069
Figure pct00070
Figure pct00071
Figure pct00072
Figure pct00073
Figure pct00074
Figure pct00075
Figure pct00076
Figure pct00077
Figure pct00078
Figure pct00079
Figure pct00080
Figure pct00081
Figure pct00082
Figure pct00083
Figure pct00084
Figure pct00085
Figure pct00086
Figure pct00087
Figure pct00088
Figure pct00089
Figure pct00090
Figure pct00091
Figure pct00092
Figure pct00093
Figure pct00094
Figure pct00095
Figure pct00096
Figure pct00097
Figure pct00098
Figure pct00099
Figure pct00100
Figure pct00101
Figure pct00102
및 이의 염.
상기 언급된 양이온성 지질 중에서도, 하기 구조식으로 표시되는 양이온성 지질이 보다 바람직하다.
Figure pct00103
및 이의 염.
또다른 구현예에서, 하기 구조식으로 표시되며 WO 2013/126803 에 기재되는 양이온성 지질이 언급될 수 있다
Figure pct00104
Figure pct00105
Figure pct00106
Figure pct00107
Figure pct00108
및 이의 염.
상기 언급된 양이온성 지질 중에서도, 하기 구조식으로 표시되는 양이온성 지질이 보다 바람직하다.
Figure pct00109
및 이의 염.
또다른 구현예에서, Dong et al. (Proc Natl Acad Sci U S A. 2014 Apr 15; 111(15):5753) 에 기재된 하기 반응식에 의해 합성된 양이온성 지질 K-E12, H-A12, Y-E12, G-O12, K-A12, R-A12, cKK-E12, cPK-E12, PK1K-E12, PK500-E12, cQK-E12, cKK-A12, KK-A12, PK-4K-E12, cWK-E12, PK500-O12, PK1K-O12, cYK-E12, cDK-E12, cSK-E12, cEK-E12, cMK-E12, cKK-O12, cIK-E12, cKK-E10, cKK-E14, 및 cKK-E16 이 언급될 수 있다.
Figure pct00110
상기 언급된 양이온성 지질 중에서, cKK-E12, cKK-E14 가 보다 바람직하다.
또다른 구현예에서, Love KT et al. (Proc Natl Acad Sci U S A. 2010 May 25; 107(21):9915) 에 기재된 하기 반응식에 의해 합성된 양이온성 지질 C14-98, C18-96, C14-113, C14-120, C14-120, C14-110, C16-96, 및 C12-200 가 언급될 수 있다.
Figure pct00111
상기 언급된 양이온성 지질 중에서, C14-110, C16-96 및 C12-200 가 보다 바람직하다.
특히 바람직한 구현예에서, 하기 화학식 (I) 로 표시되는 양이온성 지질 (이하 "화합물 (I)" 로도 지칭됨) 이 언급될 수 있다.
Figure pct00112
[식 중,
L1 은 C1-22 알킬렌기, C2-22 알케닐렌기 또는 C3-22 알카디에닐렌기이고,
n 은 0 또는 1 의 정수이고,
R1 은 하기와 같고:
(1) 수소 원자,
(2) 선형 C1-22 알킬기 및 선형 C2-22 알케닐기로부터 선택되는 1 또는 2 개의 치환기로 임의로 치환된 선형 C1-22 알킬기,
(3) 선형 C1-22 알킬기 및 선형 C2-22 알케닐기로부터 선택되는 1 또는 2 개의 치환기로 임의로 치환된 선형 C2-22 알케닐기, 또는
(4) 선형 C1-22 알킬기 및 선형 C2-22 알케닐기로부터 선택되는 1 또는 2 개의 치환기로 임의로 치환된 선형 C3-22 알카디에닐기,
R2 는 -CH2-O-CO-R5, -CH2-CO-O-R5 또는 -R5 이고,
R3 은 -CH2-O-CO-R6, -CH2-CO-O-R6 또는 -R6 이고,
R4 는 수소 원자, -CH2-O-CO-R7, -CH2-CO-O-R7 또는 -R7 이고,
R5, R6 및 R7 은 각각 독립적으로 하기와 같고:
(1) 선형 C1-22 알킬기 및 선형 C2-22 알케닐기로부터 선택되는 1 또는 2 개의 치환기로 임의로 치환된 선형 C1-22 알킬기,
(2) 선형 C1-22 알킬기 및 선형 C2-22 알케닐기로부터 선택되는 1 또는 2 개의 치환기로 임의로 치환된 선형 C2-22 알케닐기, 또는
(3) 선형 C1-22 알킬기 및 선형 C2-22 알케닐기로부터 선택되는 1 또는 2 개의 치환기로 임의로 치환된 선형 C3-22 알카디에닐기,
R8 및 R9 는 각각 독립적으로, C1-6 알킬기임],
또는 이의 염.
L1 은 C1-22 알킬렌기, C2-22 알케닐렌기 또는 C3-22 알카디에닐렌기이다.
L1 은 바람직하게 C1-22 알킬렌기이다.
L1 은 더욱 바람직하게 C1-12 알킬렌기이다.
L1 은 추가로 바람직하게 C1-6 알킬렌기이다.
n 은 0 또는 1 의 정수이다.
n 은 바람직하게는 1 의 정수이다.
R1 은 하기와 같다:
(1) 수소 원자,
(2) 선형 C1-22 알킬기 및 선형 C2-22 알케닐기로부터 선택되는 1 또는 2 개의 치환기로 임의로 치환된 선형 C1-22 알킬기,
(3) 선형 C1-22 알킬기 및 선형 C2-22 알케닐기로부터 선택되는 1 또는 2 개의 치환기로 임의로 치환된 선형 C2-22 알케닐기, 또는
(4) 선형 C1-22 알킬기 및 선형 C2-22 알케닐기로부터 선택되는 1 또는 2 개의 치환기로 임의로 치환된 선형 C3-22 알카디에닐기.
R1 은 바람직하게는 하기와 같다:
(1) 수소 원자,
(2) 1 또는 2 개의 선형 C1-22 알킬기 (바람직하게는 선형 C6-12 알킬기) 에 의해 임의로 치환된 선형 C1-22 알킬기 (바람직하게는 선형 C6-12 알킬기), 또는
(3) 1 또는 2 개의 선형 C2-22 알케닐기 (바람직하게는 선형 C6-12 알케닐기) 에 의해 임의로 치환된 선형 C2-22 알케닐기 (바람직하게는 선형 C6-12 알케닐기).
R1 은 특히 바람직하게는 수소 원자이다.
R2 는 -CH2-O-CO-R5, -CH2-CO-O-R5 또는 -R5 이다.
R2 는 바람직하게는 -CH2-O-CO-R5 또는 -R5 이다.
R2 는 더욱 바람직하게는 -CH2-O-CO-R5 이다.
R3 은 -CH2-O-CO-R6, -CH2-CO-O-R6 또는 -R6 이다.
R3 은 바람직하게는 -CH2-O-CO-R6 또는 -R6 이다.
R3 은 더욱 바람직하게는 -CH2-O-CO-R6 이다.
R4 는 수소 원자, -CH2-O-CO-R7, -CH2-CO-O-R7 또는 -R7 이다.
R4 는 바람직하게는 수소 원자 또는 -CH2-O-CO-R7 이다.
R4 는 더욱 바람직하게는 -CH2-O-CO-R7 이다.
R5, R6 및 R7 은 각각 독립적으로 하기와 같다:
(1) 선형 C1-22 알킬기 및 선형 C2-22 알케닐기로부터 선택되는 1 또는 2 개의 치환기로 임의로 치환된 선형 C1-22 알킬기,
(2) 선형 C1-22 알킬기 및 선형 C2-22 알케닐기로부터 선택되는 1 또는 2 개의 치환기로 임의로 치환된 선형 C2-22 알케닐기, 또는
(3) 선형 C1-22 알킬기 및 선형 C2-22 알케닐기로부터 선택되는 1 또는 2 개의 치환기로 임의로 치환된 선형 C3-22 알카디에닐기.
R5, R6 및 R7 은 각각 독립적으로 바람직하게는 하기와 같다:
(1) 1 또는 2 개의 선형 C1-22 알킬기 (바람직하게는 선형 C1-10 알킬기) 에 의해 임의로 치환된 선형 C1-22 알킬기 (바람직하게는 선형 C4-18 알킬기),
(2) 선형 C2-22 알케닐기 (바람직하게는 선형 C4-18 알케닐기), 또는
(3) 선형 C3-22 알카디에닐기 (바람직하게는 선형 C4-18 알카디에닐기).
R5, R6 및 R7 은 각각 독립적으로 더욱 바람직하게는 하기와 같다:
(1) 1 또는 2 개의 선형 C1-22 알킬기 (바람직하게는 선형 C1-10 알킬기) 에 의해 임의로 치환된 선형 C1-22 알킬기 (바람직하게는 선형 C4-18 알킬기), 또는
(2) 선형 C2-22 알케닐기 (바람직하게는 선형 C4-18 알케닐기).
R8 및 R9 는 각각 독립적으로, C1-6 알킬기이다.
R8 및 R9 는 각각 독립적으로, C1-3 알킬기 (바람직하게는 메틸) 이다.
바람직하게는, 화합물 (I) 은 상기 언급된 화학식 (I) 의 화합물이고,
식 중,
L1 은 C1-22 알킬렌기 (바람직하게는 C1-12 알킬렌기, 더욱 바람직하게는 C1-6 알킬렌기) 이고,
n 은 1 의 정수이고,
R1 은 하기와 같고:
(1) 수소 원자,
(2) 1 또는 2 개의 선형 C1-22 알킬기 (바람직하게는 선형 C6-12 알킬기) 에 의해 임의로 치환된 선형 C1-22 알킬기 (바람직하게는 선형 C6-12 알킬기), 또는
(3) 1 또는 2 개의 선형 C2-22 알케닐기 (바람직하게는 선형 C6-12 알케닐기) 에 의해 임의로 치환된 선형 C2-22 알케닐기 (바람직하게는 선형 C6-12 알케닐기),
R2 는 -CH2-O-CO-R5 또는 -R5 이고,
R3 은 -CH2-O-CO-R6 또는 -R6 이고,
R4 는 수소 원자 또는 -CH2-O-CO-R7 이고,
R5, R6 및 R7 은 각각 독립적으로 하기와 같고:
(1) 1 또는 2 개의 선형 C1-22 알킬기 (바람직하게는 선형 C1-10 알킬기) 에 의해 임의로 치환된 선형 C1-22 알킬기 (바람직하게는 선형 C4-18 알킬기),
(2) 선형 C2-22 알케닐기 (바람직하게는 선형 C4-18 알케닐기), 또는
(3) 선형 C3-22 알카디에닐기 (바람직하게는 선형 C4-18 알카디에닐기),
R8 및 R9 는 각각 독립적으로, C1-6 알킬기 (바람직하게는 C1-3 알킬기, 특히 바람직하게는 메틸) 이다.
더욱 바람직하게는, 화합물 (I) 은 상기 언급된 화학식 (I) 의 화합물이고,
식 중,
L1 은 C1-12 알킬렌기 (바람직하게는 C1-6 알킬렌기) 이고,
n 은 1 의 정수이고,
R1 은 수소 원자이고,
R2 는 -CH2-O-CO-R5 이고,
R3 은 -CH2-O-CO-R6 이고,
R4 는 -CH2-O-CO-R7 이고,
R5, R6 및 R7 은 각각 독립적으로 하기와 같고:
(1) 1 또는 2 개의 선형 C1-22 알킬기 (바람직하게는 선형 C1-10 알킬기) 에 의해 임의로 치환된 선형 C1-22 알킬기 (바람직하게는 선형 C4-18 알킬기),
(2) 선형 C2-22 알케닐기 (바람직하게는 선형 C4-18 알케닐기), 또는
(3) 선형 C3-22 알카디에닐기 (바람직하게는 선형 C4-18 알카디에닐기),
R8 및 R9 는 각각 독립적으로, C1-6 알킬기 (바람직하게는 C1-3 알킬기, 특히 바람직하게는 메틸) 이다.
더욱 바람직하게는, 화합물 (I) 은 상기 언급된 화학식 (I) 의 화합물이고,
식 중,
L1 은 C1-6 알킬렌기이고,
n 은 1 의 정수이고,
R1 은 수소 원자이고,
R2 는 -CH2-O-CO-R5 이고,
R3 은 -CH2-O-CO-R6 이고,
R4 는 -CH2-O-CO-R7 이고,
R5, R6 및 R7 은 각각 독립적으로 하기와 같고:
(1) 1 또는 2 개의 선형 C1-22 알킬기 (바람직하게는 선형 C1-10 알킬기) 에 의해 임의로 치환된 선형 C1-22 알킬기 (바람직하게는 선형 C4-18 알킬기), 또는
(2) 선형 C2-22 알케닐기 (바람직하게는 선형 C4-18 알케닐기),
R8 및 R9 는 각각 독립적으로, C1-3 알킬기 (바람직하게는 메틸) 이다.
상기 언급된 각각의 구조식으로 나타난 화합물의 염은 바람직하게는 약리학적으로 허용가능한 염이다. 이의 예는 무기 염기와의 염 (예를 들어, 나트륨 염, 칼륨 염 등의 알칼리 금속 염; 칼슘 염, 마그네슘 염 등의 알칼리 토금속 염; 알루미늄 염, 암모늄 염), 유기 염기와의 염 (예를 들어, 트리메틸아민, 트리에틸아민, 피리딘, 피콜린, 에탄올아민, 디에탄올아민, 트리에탄올아민, 트로메타민[트리스(히드록시메틸)메틸아민], tert-부틸아민, 시클로헥실아민, 벤질아민, 디시클로헥실아민, N,N-디벤질 에틸렌디아민과의 염), 무기 산과의 염 (예를 들어, 불화 수소산, 염산, 브롬화 수소산, 요오드화 수소산, 질산, 황산, 인산과의 염), 유기 산과의 염 (포름산, 아세트산, 트리플루오로아세트산, 프탈산, 푸마르산, 옥살산, 타르타르산, 말레산, 시트르산, 석신산, 말산, 메탄설폰산, 벤젠설폰산, p-톨루엔설폰산과의 염), 염기성 아미노산과의 염 (아르기닌, 라이신, 오르니틴과의 염) 또는 산성 아미노산과의 염 (아스파르트산, 글루탐산과의 염) 을 포함한다.
본 발명의 지질 나노입자에 존재하는 총 지질에 대한 양이온성 지질의 비율 (몰%) 은 예를 들어, 약 10% 내지 약 80%, 바람직하게는 약 20% 내지 약 70%, 보다 바람직하게는 약 40% 내지 약 60% 이지만; 이 비율은 여기에 제한되지 않는다.
단 하나의 유형의 상기 언급된 양이온성 지질이 사용될 수 있거나 이의 둘 이상의 유형이 조합으로 사용될 수 있다. 다중 양이온성 지질이 사용되는 경우, 전체 양이온성 지질의 비는 바람직하게는 상기 언급된 바와 같다.
(c) 비-양이온성 지질
본 명세서에서, "비-양이온성 지질" 은 양이온성 지질 이외의 지질을 의미하며, 생리학적 pH 등과 같은 선택된 pH 에서 순 양전하를 갖지 않는 지질이다. 본 발명의 지질 나노입자에 사용되는 비-양이온성 지질의 예는 인지질, 스테로이드, PEG 지질 등을 포함한다.
CAR 또는 외인성 TCR 을 코딩하는 핵산의 표적 면역세포로의 전달을 향상시키기 위해, 인지질은 핵산을 안정적으로 유지하고 세포막 (플라즈마 막 및 소기관 막) 과의 융합을 억제하지 않는 한 특별히 제한되지 않는다. 예를 들어, 포스파티딜 콜린, 포스파티딜 에탄올아민, 포스파티딜 세린, 포스파티딜 이노시톨, 포스파티드산, 팔미토일올레오일포스파티딜 콜린, 리소포스파티딜 콜린, 리소포스파티딜 에탄올아민, 디팔미토일포스파티딜 콜린, 디올레오일포스파티딜 콜린, 디스테아로일포스파티딜 콜린, 디리놀레노일포스파티딜 콜린 등이 언급될 수 있다.
바람직한 인지질은 디스테아로일포스파티딜 콜린 (DSPC), 디올레오일포스파티딜 콜린 (DOPC), 디팔미토일포스파티딜 콜린 (DPPC), 디올레오일포스파티딜 글리세롤 (DOPG), 팔미토일올레오일포스파티딜 글리세롤 (POPG), 디팔미토일포스파티딜 글리세롤 (DPPG), 디올레오일-포스파티딜 에탄올아민 (DOPE), 팔미토일올레오일포스파티딜 콜린 (POPC), 팔미토일올레오일-포스파티딜 에탄올아민 (POPE) 및 디올레오일포스파티딜 에탄올아민 4-(N-말레이미드 메틸)-시클로헥산-1-카르복실레이트 (DOPE-mal), 더욱 바람직하게는 DOPC, DPPC, POPC, 및 DOPE 를 포함한다.
본 발명의 지질 나노입자에 존재하는 총 지질에 대한 인지질의 비율 (몰%) 은 예를 들어, 약 0% 내지 약 90%, 바람직하게는 약 5% 내지 약 30%, 보다 바람직하게는 약 8% 내지 약 15% 일 수 있다.
단 하나의 유형의 상기 언급된 인지질이 사용될 수 있거나 이의 둘 이상의 유형이 조합으로 사용될 수 있다. 다중 인지질이 사용되는 경우, 전체 인지질의 비는 바람직하게는 상기 언급된 바와 같다.
스테로이드로서, 콜레스테롤, 5α-콜레스타놀, 5β-코프로스타놀, 콜레스테릴-(2'-히드록시)-에틸에테르, 콜레스테릴-(4'-히드록시)-부틸에테르, 6-케토콜레스타놀, 5α-콜레스탄, 콜레스테논, 5α-콜레스타논, 5β-콜레스타논 및 콜레스테릴 데카노에이트, 바람직하게는 콜레스테롤이 언급될 수 있다.
본 발명의 지질 나노입자에 존재하는 총 지질에 대한 스테로이드의 비율 (몰%) 은 예를 들어, 약 10% 내지 약 60%, 바람직하게는 약 12% 내지 약 58%, 보다 바람직하게는 약 20% 내지 약 55% 일 수 있다. 단 하나의 유형의 상기 언급된 스테로이드가 사용될 수 있거나 이의 둘 이상의 유형이 조합으로 사용될 수 있다. 다중 스테로이드가 사용되는 경우, 전체 스테로이드의 비는 바람직하게는 상기 언급된 바와 같다.
본 명세서에서, "PEG 지질" 은 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 및 지질의 임의의 복합체를 의미한다. PEG 지질은 본 발명의 지질 나노입자의 응집을 억제하는 효과를 갖는 한 특별히 제한되지 않는다. 예를 들어, 디알킬옥시프로필과 공액된 PEG (PEG-DAA), 디아실글리세롤과 공액된 PEG (PEG-DAG) (예를 들어, SUNBRIGHT GM-020 (NOF CORPORATION)), 인지질과 공액된 PEG, 예컨대 포스파티딜에탄올아민 (PEG-PE), 세라마이드와 공액된 PEG (PEG-Cer), 콜레스테롤과 공액된 PEG (PEG-콜레스테롤) 또는 이들의 유도체, 또는 이들의 혼합물, mPEG2000-1,2-디-O-알킬-sn3-카르보모일글리세리드 (PEG-C-DOMG), 1-[8'-(1,2-디미리스토일-3-프로판옥시)-카르복스아미드-3',6-디옥사옥타닐]카르바모일-ω-메틸-폴리(에틸렌 글리콜) (2KPEG-DMG) 등이 언급될 수 있다. 바람직한 PEG 지질은 PEG-DGA, PEG-DAA, PEG-PE, PEG-Cer, 및 이들의 혼합물, 보다 바람직하게는 PEG-디데실 옥시프로필 공액체, PEG-디라우릴 옥시프로필 공액체, PEG-디미리스틸 옥시프로필 공액체, PEG-디팔미틸 옥시프로필 공액체, PEG-디스테아릴 옥시프로필 공액체 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 PEG-DAA 공액체를 포함한다.
메톡시기 이외에, 후술하는 T 세포 표적화 리간드에 결합하기 위한 말레이미드기, N-히드록시석신이미딜기 등이 PEG 의 자유 말단으로서 사용될 수 있다. 예를 들어, SUNBRIGHT DSPE-0201MA 또는 SUNBRIGHT DSPE-0201MA (NOF) 는 T 세포-표적화 리간드에 결합하기 위한 작용기를 갖는 PEG 지질로서 사용될 수 있다 (종종 본 명세서에서 "말단 반응성 PEG 지질"로서 지칭됨).
본 발명의 지질 나노입자에 존재하는 총 지질에 대한 PEG 지질의 비율 (몰%) 은 예를 들어, 약 0% 내지 약 20%, 바람직하게는 약 0.1% 내지 약 5%, 보다 바람직하게는 약 0.7% 내지 약 2% 일 수 있다.
상기 언급된 총 PEG 지질 중의 말단 반응성 PEG 지질의 비율 (몰%) 은 예를 들어, 약 10% 내지 약 100%, 바람직하게는 약 20% 내지 약 100%, 보다 바람직하게는 약 30% 내지 약 100% 이다.
단 하나의 유형의 상기 언급된 PEG 지질이 사용될 수 있거나 이의 둘 이상의 유형이 조합으로 사용될 수 있다. 다중 PEG 지질이 사용되는 경우, 전체 PEG 지질의 비는 바람직하게는 상기 언급된 바와 같다.
본 발명의 지질 나노입자는 면역 세포, 특히 획득된 면역성 중에서 세포 면역성을 담당하는 T 세포, 선천성 면역성을 담당하는 NK 세포, 단핵구, 대식세포, 수지상 세포 등, 및 NK 세포의 특성을 갖는 T 세포인 NKT 세포에서 CAR 또는 외인성 TCR 의 유전자 전달 및 발현에 사용된다. 따라서, 본 발명의 지질 나노입자는 특히 생체 내에서 표적화된 면역세포로의 효율적인 전달을 위해, 지질 나노입자를 면역세포, 특히 T 세포에 표적화할 수 있는 리간드를 추가로 함유할 수 있다.
(d) 지질 나노입자를 T 세포로 표적화할 수 있는 리간드
본 발명의 지질 나노입자를 T 세포에 표적화할 수 있는 리간드는 T 세포에서 특이적으로 또는 고도로 발현되는 표면 분자를 특이적으로 인식할 수 있는 한 특별히 제한되지 않는다. 바람직하게는, 이것은 CD3, CD4, CD8 또는 CD28 에 대한 항체의 하나 이상의 항원 결합 도메인을 함유하는 것을 포함하고, 더욱 바람직하게는 이것은 항-CD3 항체 및/또는 항-CD28 항체의 항원 결합 도메인을 함유하는 것을 포함한다. T 세포로의 생체 내 전달을 위한 특히 바람직한 예는 항-CD3 항체의 항원-결합 도메인 만을 함유하는 것이다. 여기서, "항원-결합 도메인" 은 상기 언급된 CAR 을 구성하는 항원-결합 도메인과 동의어이다. 그러나, CAR 은 이를 코딩하는 핵산으로서 제조될 필요가 있기 때문에, 제한이 발생하고 단일-사슬 항체가 일반적으로 많은 경우에 사용된다. T 세포 표적화 리간드로서의 항원-결합 도메인은 본 발명의 지질 나노입자에 단백질 상태로 함유되어 있기 때문에, 단일-사슬 항체 뿐만 아니라 임의의 다른 항체 단편, 예컨대 완전한 항체 분자, Fab, F(ab')2, Fab', Fv, 환원 항체 (rIgG), dsFv, sFv, 디아바디, 트리아바디 등이 또한 바람직하게 사용될 수 있다. Fc 모이어티가 없는 Fab' 는 특히 생체 내 표적 면역세포로의 전달을 위해 바람직하게 사용될 수 있다. 이들 항체 단편은 완전한 항체 (예를 들어, IgG) 를 환원제 (예를 들어, 2-메르캅토에탄올, 디티오트레이톨) 또는 펩티다아제 (예를 들어, 파파인, 펩신, 피신) 로 처리하거나, 또는 유전자 재조합 조작을 사용하여 제조될 수 있다.
T-세포 표적화 리간드가 완전한 항체 분자인 경우, 시판되는 항-CD3, CD4, CD8, CD28 항체 등이 사용될 수 있거나, 리간드는 항체를 생성하는 세포의 배양물로부터 단리될 수 있다. 한편, 리간드가 상기 언급된 항원-결합 도메인 (항체 단편) 중 어느 하나인 경우, 항원-결합 도메인을 코딩하는 핵산, 예컨대 항-CD3, CD4, CD8, CD28 항체 등은 상기 CAR 을 구성하는 항원-결합 도메인을 코딩하는 핵산에서와 동일한 방식으로 단리되고 항원-결합 도메인이 동일한 것을 사용하여 재조합적으로 생산될 수 있다.
본 발명의 지질 나노입자에서, T 세포-표적화 리간드는 지질 나노입자의 표면 상에 존재하는 한 어떠한 방식으로든 외부 쉘에 결합할 수 있다. 예를 들어, 말단 반응성 PEG 지질이 비-양이온성 지질로서 함유되는 경우, 리간드는 PEG 의 말단에 첨가될 수 있다. 예를 들어, 리간드 (항체) 로 표지된 지질 나노입자는 PEG 지질 (예를 들어, SUNBRIGHT DSPE-0200MA) 을 상기 언급된 환원 항체의 티올 기와 말단에 도입된 말레이미드기와 반응시킴으로써 제조될 수 있다 (종종 "항체-LNP"로 언급됨).
본 발명의 지질 나노입자가 NK 세포 및 수지상 세포와 같은 T 세포 이외의 면역세포로의 유전자 전달에 사용되는 경우, 지질 나노입자는 심지어 면역 세포를 표적화하기 위한 리간드가 없는 경우에도 지질 나노입자의 표면에 효과적으로 전달될 수 있다. 또한 지질 나노입자의 표면에는 각 면역 세포의 표면에서 발현되는 분자에 적합한 표적화 리간드가 있을 수 있다. 예를 들어, NK 세포의 경우, CD16 및 CD56 에 대한 항체의 항원-결합 도메인을 함유하는 것들이 제한없이 언급될 수 있다.
2. 본 발명의 지질 나노입자의 제조
본 발명의 지질 나노입자는, 예를 들어 US9,404,127 에 기재된 방법에 의해 제조될 수 있다. 지질 나노입자가 T 세포-표적화 리간드를 추가로 함유하는 경우, 이것은 지질 나노입자의 제조 후 T 세포-표적화 리간드를 화학적으로 결합시킴으로써 제조될 수 있다. WO 2016/021683 에 기재된 바와 같이, 예를 들어 상기 언급된 성분 (b) 및 (c) 의 유기 용매 용액을 제조하고, 유기 용매 용액을 물 또는 (a) 의 완충액과 혼합하여 지질 나노입자를 제조하고, 이어서 T 세포-표적화 리간드가 화학적으로 결합되어 이를 제조한다. 양이온성 지질, 인지질, 콜레스테롤 및 PEG 지질의 혼합비 (몰비) 는, 예를 들어 40 내지 60:0 내지 20:0 내지 50:0 내지 5 이지만, 이에 제한되지는 않는다. PEG 지질이 비-양이온성 지질로서 블렌딩되고 T 세포-표적화 리간드가 PEG 의 말단에 첨가되는 경우, PEG 지질과 리간드의 혼합비 (몰비) 는, 예를 들어 20:1 내지 1:20 일 수 있다. 상기 언급된 PEG 지질은 말단 반응성 PEG 를 약 10% 내지 약 100% 의 비율 (몰%) 로 함유할 수 있다. 상기 언급된 혼합은 피펫, 미세 유체 혼합 시스템 (예를 들어, Asia 미세유체 시스템 (Syrris)) 또는 Nanoassemblr (Precision Nanosystems) 를 사용하여 수행될 수 있다. 수득된 지질 입자는 겔 여과, 투석 또는 멸균 여과에 의해 정제될 수 있다.
유기 용매 용액 중 총 지질 성분의 농도는 바람직하게는 0.5 내지 100 mg/mL 이다.
유기 용매로서는, 예를 들어 메탄올, 에탄올, 1-프로판올, 2-프로판올, 1-부탄올, tert-부탄올, 아세톤, 아세토니트릴, N,N-디메틸포름아미드, 디메틸설폭시드 또는 이들의 혼합물이 언급될 수 있다. 유기 용매는 0 내지 20% 의 물 또는 완충액을 함유할 수 있다. 완충액으로서, 산성 완충액 (예를 들어, 아세테이트 완충액, 시트레이트 완충액) 또는 중성 완충액 (예를 들어, 4-(2-히드록시에틸)-1-피페라진에탄설폰산, (HEPE) 완충액, 트리스(히드록시메틸)아미노메탄 (Tris) 완충액, 포스페이트 완충액, 포스페이트 완충 식염수 (PBS)) 가 언급될 수 있다.
미세 유체 혼합 시스템이 혼합에 사용되는 경우, 1 부피부 (part by volume) 의 유기 용매 용액을 1 내지 5 부피부의 물 또는 완충액과 혼합하는 것이 바람직하다. 또한, 상기 시스템에서, 혼합물 (유기 용매 용액과 물 또는 완충액의 혼합 용액) 의 유속은 바람직하게는 0.1 내지 10 mL/분이고, 온도는 바람직하게는 4 내지 45℃ 이다.
전술한 바와 같이 지질 입자 분산액을 제조하는 경우, CAR 또는 외인성 TCR 을 코딩하는 핵산을 물 또는 완충액에 첨가함으로써 성분 (a) 내지 (d) 를 함유하는 분산액을 제조할 수 있다. 물 또는 완충액 중의 활성 성분의 농도를 0.05 내지 2.0 mg/mL 로 하는 방식으로 핵산을 첨가하는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명의 지질 나노입자는 자체 공지된 방법에 의해 지질 입자 분산액을 핵산과 혼합함으로써 제조될 수 있다.
본 발명의 지질 나노입자에서, 핵산의 함량은 바람직하게는 1 내지 20 중량% 이다. 함량은 Quant-iTTMRibogreen® (Invitrogen) 를 사용하여 측정할 수 있다. 본 발명의 지질 나노입자에서, 핵산의 캡슐화 비율은 계면활성제 (예를 들어, Triton-X100) 의 첨가 유무에 따른 형광 강도의 차이에 기초하여 계산될 수 있다.
분산 매질은 투석에 의해 물 또는 완충액으로 대체될 수 있다. 투석을 위해, 분자량 컷오프 10 내지 20K 의 한외여과막을 사용하여 4℃ 내지 실온에서 수행한다. 투석이 반복적으로 수행될 수 있다. 투석을 위해, 접선 유동 여과가 사용될 수 있다.
상기 언급된 바와 같이 얻어진 본 발명의 지질 나노입자 중의 핵산과 지질의 비율 (중량비) 은 약 0.01 내지 약 0.2 이다.
본 발명의 지질 나노입자의 평균 입자 크기는 바람직하게는 10 내지 200 nm 이다. 지질 입자의 평균 입자 크기는 자가상관 함수의 누적 분석에서 예를 들어 Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments) 를 사용하여 계산될 수 있다.
3. 본 발명의 지질 나노입자와 함께 도입된 생체 외 면역세포
본 발명은 살아있는 유기체로부터 수집된 면역세포 (본 명세서에서 "생체 외 면역세포" 라고도 언급됨) 를 본 발명의 지질 나노입자와 접촉시키고 CAR 또는 외인성 TCR 을 코딩하는 핵산을 T 세포 내로 도입함에 의한 CAR 또는 외인성 TCR 을 발현하는 생체 외 면역세포의 제조 방법, 및 이 방법에 의해 수득된 생체 외 면역세포를 제공한다. 본원에 사용된 바와 같이, "면역세포" 는 일부 작용 기작 (즉, 면역 이펙터 세포) 에 의해 암 세포 등과 같은 표적 세포 (병원성 세포) 를 손상시킬 수 있는 세포인 한 특별히 제한되지 않는다. 이의 예는 획득된 면역성 중 세포 면역성을 담당하는 T 세포, 선천성 면역성을 담당하는 NK 세포, 단핵구, 대식세포, 수지상 세포 등, 및 NK 세포의 특성을 갖는 T 세포인 NKT 세포를 포함한다. 하나의 바람직한 구현예에서, 면역 세포는 T 세포일 수 있다. 살아있는 유기체로부터 수집된 T 세포는 또한 본 명세서에서 "생체 외 T 세포" 로 지칭된다. 다른 바람직한 구현예에서, 면역세포는 NK 세포, 대식세포, 수지상 세포 등과 같이 선천성 면역을 담당할 수 있다. T 세포는 HLA 유형이 일치하더라도 동종이계 (allo) 이식에 의해 GVHD 를 유발할 위험이 상당히 높은 것으로 간주되는 반면, allo-NK 세포 등은 GVHD 를 유발하지 않는 것으로 간주된다. 따라서, 다양한 HLA-유형 allo 생체 외 면역세포의 제조는 기성품의 사용을 허용한다. CAR-NK 세포는 예를 들어 US2016/0096892, Mol Ther. 25(8): 1769-1781 (2017) 등에, CAR-수지상 세포, CAR-대식세포 등은 예를 들어 WO 2017/019848, eLIFE. 2018 e36688 등에 기재되어 있다.
또다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 지질 나노입자를 함유하는 CAR 또는 외인성 TCR 의 발현을 유도하기 위한 조성물을 제공한다.
본 발명의 지질 나노입자가 도입되는 면역세포 (예를 들어, T 세포) 는 단리된 특정 면역세포 (예를 들어, T 세포) 이거나, 이들이 면역세포 (예를 들어, T 세포) 를 함유하는 세포 집단 또는 그의 전구 세포인 한, 예를 들어, 림프구 및 다능성 세포를 포함하는 림프구의 전구 세포와 같은 불균일한 세포 집단일 수 있다. 본 발명에서, "림프구" 는 척추동물의 면역계에서 백혈구의 서브유형 중 하나를 의미한다. 림프구의 예는 T 세포, B 세포 및 자연 살해 세포 (NK 세포), 바람직하게는 단리 및 정제된 T 세포를 포함한다. 본 발명에서, "T 세포" 는 림프 기관, 말초 혈액 등에서 발견되는 하나의 유형의 백혈구이며, 주로 흉선에서 분화 및 성숙 및 TCR 의 발현을 특징으로 하는 림프구의 하나의 카테고리를 지칭한다. 본 발명에 사용될 수 있는 T 세포의 예는 CD8-양성 세포인 세포독성 T 세포 (CTL), CD4-양성 세포인 헬퍼 T 세포, 조절 T 세포 및 이펙터 T 세포, 바람직하게는 세포독성 T 세포를 포함한다.
상기 언급된 림프구는, 예를 들어 인간 또는 비인간 포유동물의 말초 혈액, 골수 및 제대혈로부터 수집될 수 있다. 본 발명의 지질 나노입자와 함께 도입된 생체 외 면역세포 (예를 들어, 생체 외 T 세포) 가 암과 같은 질환의 치료에 사용될 때, 세포 집단은 바람직하게는 치료될 사람 또는 치료될 대상의 유형과 일치하는 유형의 HLA 를 가진 공여자로부터 수확된다.
다능성 세포를 포함하는 림프구 전구 세포의 예는 배아 줄기 세포 (ES 세포), 유도된 다능성 줄기 세포 (iPS 세포), 배아 암 세포 (EC 세포), 배아 생식 세포 (EG 세포), 조혈 줄기 세포, 자가-재생 능력을 상실한 다능성 전구 세포 (다능 전구세포: MMP), 공통 골수-림프구 전구 세포 (MLP), 골수 전구 세포 (MP), 과립구 단핵 전구 세포 (GMP), 대식세포-수지상 세포 전구 세포 (MDP), 수지상 세포 전구 세포 (DCP) 등을 포함한다. 다능성 세포 등과 같은 미분화된 세포는 자체 공지된 방법에 의해 다양한 면역세포, 예를 들어 T 세포로 분화될 수 있다.
생체 외 면역세포를 본 발명의 지질 나노입자와 접촉시키는 방법에 대한 특별한 제한은 없으며, 예를 들어, 본 발명의 지질 나노입자는 면역세포의 전형적인 배지에 첨가될 수 있다. 대안적으로는, 도입 효율을 높이기 위해, 예를 들어 칼슘 포스페이트 공-침전법, PEG 법, 전기천공법, 미세주입법, 리포펙틴법 등을 조합하여 사용할 수 있다.
본 발명의 지질 나노입자가 특히 외인성 TCR 을 활성 성분으로 코딩하는 핵산을 함유하는 경우, T 세포에 의해 본래 발현되는 내인성 TCR α 사슬 및 TCR β 사슬의 발현은 외인성 TCR 의 발현 증가, 미스페이링된 TCR 의 출현 억제, 또는 자가-반응성의 억제의 견지에서, siRNA 에 의해 억제될 수 있다. 상기 언급된 핵산이 방법에 적용되는 경우, 외인성 TCR 에 대한 siRNA 의 영향을 피하기 위해, TCR 을 코딩하는 핵산의 염기 서열은 바람직하게는, 내인성 TCRα 및 TCRβ 사슬의 발현을 억제하는 siRNA 가 작용하는, RNA 에 상응하는 염기 서열과 상이한 서열 (코돈 전환 유형 서열) 이다. 이에 대한 반응은, 예를 들어 WO 2008/153029 에 기재되어 있다. 상기 언급된 염기 서열은 TCR 을 코딩하는 자연적으로 획득된 핵산에 침묵 돌연변이를 도입하거나 인공적으로 설계된 핵산을 화학적으로 합성함으로써 생성될 수 있다. 대안적으로, 내인성 TCR 사슬과의 미스페어링을 피하기 위해, 외인성 TCR 을 코딩하는 핵산의 불변 영역의 일부 또는 전부는 인간 이외의 동물, 예를 들어 마우스로부터 유래된 불변 영역으로 대체될 수 있다.
4. 본 발명의 지질 나노입자, 또는 지질 나노입자와 함께 도입된 생체 외 면역세포를 함유하는 의약
본 발명은 본 발명의 지질 나노입자, 또는 지질 나노입자와 함께 도입된 생체 외 면역세포 (예를 들어, 생체 외 T 세포) 를 함유하는 의약 (이하, "본 발명의 의약" 으로 약칭함) 을 제공한다.
(4-1. 본 발명의 지질 나노입자와 함께 도입된 생체 외 면역세포를 함유하는 의약)
CAR 또는 외인성 TCR 을 발현시킴으로써, 본 발명의 지질 나노입자와 함께 도입된 면역세포 (예를 들어, T 세포) 는 CAR 또는 외인성 TCR 에 의해 특이적으로 인식되는 표면 항원을 발현하는 세포를 특이적으로 인식하고 이들을 사멸시킬 수 있다 (예를 들어, 아폽토시스의 유도). 따라서, 암세포 등의 질환 세포에서 특이적으로 발현되거나 또는 발현이 향상된 표면 분자를 유효 성분으로 인식하는 CAR 또는 외인성 TCR 을 코딩하는 핵산을 표면 항원으로서 함유함으로써, 본 발명의 지질 나노입자가 도입된 생체 외 면역세포는 암 등과 같은 질환의 예방 또는 치료에 사용될 수 있고, 포유동물 (인간 또는 다른 포유동물 (예를 들어, 마우스, 래트, 햄스터, 토끼, 고양이, 개, 소, 양, 원숭이, 바람직하게는 인간)) 에게 안전하게 투여될 수 있다.
(4-2. 본 발명의 지질 나노입자를 함유하는 의약)
본 발명의 지질 나노입자를 함유하는 본 발명의 의약은 지질 나노입자를 공지된 약학적으로 허용되는 담체 (부형제, 희석제, 증량제, 결합제, 윤활제, 유동 보조제, 붕해제, 계면활성제 등을 포함함) 및 통상적인 첨가제 등과 혼합함으로써 약학 조성물로서 바람직하게 제조된다. 부형제는 당업자에게 널리 공지되어 있으며, 예를 들어 포스페이트-완충 식염수 (예를 들어, 0.01M 포스페이트, 0.138M NaCl, 0.0027M KCl, pH 7.4), 히드로클로라이드, 히드로브로메이트, 포스페이트, 설페이트 등의 무기산 염을 함유하는 수용액, 식염수, 글리콜, 에탄올 등의 용액, 및 아세테이트, 프로피오네이트, 말로네이트, 벤조에이트 등의 유기산의 염을 포함한다. 또한, 습윤제 또는 유화제와 같은 보조제 및 pH 완충제가 또한 사용될 수 있다. 또한, 현탁제, 보존제, 안정제 및 분산제와 같은 제조 보조제가 또한 사용될 수 있다. 대안적으로, 상기 언급된 약학 조성물은 사용 전에 적합한 멸균 액체로 재구성되는 건조 형태일 수 있다. 약학 조성물은 그것이 제조되는 형태 (정제, 알약, 캡슐, 분말, 과립, 시럽, 에멀젼, 현탁액 등과 같은 경구제; 주사, 점적 수혈, 외부 제제, 좌제 등 등의 비경구제) 에 따라 전신 또는 국소로 경구 또는 비경구 투여될 수 있다. 비경구 투여의 경우, 정맥내 투여, 피내 투여, 피하 투여, 직장 투여, 경피 투여 등이 가능하다. 주사가능한 형태로 사용될 때, 허용가능한 완충제, 가용화제, 등장화제 등이 또한 첨가될 수 있다.
본 발명의 지질 나노입자를 함유하는 본 발명의 의약의 용량은, 예를 들어, 투여량 당 1 kg 체중 당, CAR 또는 외인성 TCR 을 코딩하는 핵산의 양으로서 0.001 mg 내지 10 mg 의 범위이다. 예를 들어, 인간 환자에게 투여될 때, 투여량은 체중이 60 kg 인 환자에 대해 0.0001 내지 50 mg 의 범위이다. 상기 언급된 투여량은 일례이며, 사용되는 핵산의 유형, 투여 대상 또는 환자의 투여 경로, 연령, 체중, 증상 등에 따라 적절히 선택할 수 있다.
포유동물 (예를 들어, 인간 또는 다른 포유동물 (예를 들어, 마우스, 랫트, 햄스터, 토끼, 고양이, 개, 소, 양, 원숭이), 바람직하게는 인간) 에 투여함으로써, 본 발명의 지질 나노입자를 함유하는 본 발명의 의약은 동물의 신체에서 면역세포, 예를 들어 T 세포 (본 명세서에서 "생체 내 면역세포" 또는 "생체 내 T 세포" 라고도 함) 에서 CAR 또는 외인성 TCR 의 발현을 유도할 수 있다. 생체 내 면역세포는 CAR 또는 외인성 TCR 에 의해 표적화된 표면 항원을 발현하는 암 세포 등을 특이적으로 인식하고, 병에 걸린 세포를 사멸시킴으로써, 질환에 대한 예방 또는 치료 효과를 입증한다.
활성 성분으로서 본 발명의 지질 나노입자와 함께 도입된 생체 외 면역세포를 함유하는 의약의 경우, 면역세포는 대상체에게 투여하기 전에 적절한 배지 및/또는 자극 분자를 사용하여 배양 및/또는 자극될 수 있다. 자극 분자는 사이토카인, 적합한 단백질 및 다른 성분을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. T 세포의 경우, 사이토카인의 예는 IL-2, IL-7, IL-12, IL-15, IFN-γ 등을 포함하고, 바람직하게는 IL-2 가 사용될 수 있다. 배지 중의 IL-2 의 농도는 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어, 바람직하게는 0.01 내지 1×105U/mL, 보다 바람직하게는 1 내지 1×104U/mL 이다. 적합한 단백질의 예는 CD3 리간드, CD28 리간드 및 항-IL-4 항체를 포함한다. 렉틴과 같은 림프구 자극 인자도 추가될 수 있다. 또한, 혈청 또는 혈장이 배지에 첨가될 수 있다. 배지에 첨가되는 이들의 양은 특별히 제한되지 않지만, 0 부피% 내지 20 부피% 가 예시되고, 사용되는 혈청 또는 혈장의 양은 배양 단계에 따라 변경될 수 있다. 예를 들어, 혈청 또는 혈장 농도는 단계적으로 감소될 수 있다. 혈청 및 혈장은 자가 또는 비-자가로부터 유래될 수 있지만, 안전성 측면에서 자가 유래가 바람직하다.
활성 성분으로서 본 발명의 지질 나노입자와 함께 도입된 생체 외 면역세포를 함유하는 의약은 바람직하게는 대상체에게 비경구 투여된다. 비경구 투여 방법은 정맥내, 동맥, 근육내, 복강내 및 피하 투여를 포함한다. 투여량은 대상체의 상태, 체중, 연령 등에 따라 선택되지만, 체중 60 kg 의 대상체에 투여하여 투여량 당, 일반적으로 1×106 - 1×1010 세포, 바람직하게는 1×107 - 1×109 세포, 더욱 바람직하게는 5×107 - 5×108 세포를 달성한다. 의약은 단일 투여량 또는 다중 투여량으로 투여될 수 있다. 본 발명의 지질 나노입자와 함께 활성 성분으로서 도입된 생체 외 면역세포를 함유하는 본 발명의 의약은 주사제 또는 주입제와 같은 비경구 투여에 적합한 공지된 형태일 수 있다. 의약은 적절하게 약학적으로 허용되는 부형제를 함유할 수 있다. 약학적으로 허용되는 부형제는 상기 기재된 것을 포함한다. 의약은 세포를 안정적으로 유지하기 위해 식염수, 포스페이트-완충 식염수 (PBS), 배지 등을 함유할 수 있다. 배지는 특별히 제한되지 않으며, 그 예로는 RPMI, AIM-V, X-VIVO10 등이 포함되나, 이에 제한되지는 않는다. 또한, 안정화를 위해 약학적으로 허용되는 담체 (예를 들어, 인간 혈청 알부민), 보존제 등이 의약에 첨가될 수 있다.
본 발명의 의약은 암에 대한 예방약 또는 치료약일 수 있다. 본 발명의 의약의 적용 표적이 되는 암은 특별히 한정되지 않는다. 이의 예는, 제한 없이, 급성 림프구성 암, 폐포 횡문근육종, 방광암, 골암, 뇌암 (예를 들어, 수모세포종), 유방암, 항문, 항문관 또는 항문직장 암, 눈의 암, 간내 담관암, 관절 암, 자궁경부, 담낭 또는 흉막 암, 코, 비강 또는 중이 암, 구강암, 외음부 암, 만성 골수암, 대장 암, 식도암, 자궁경부암, 섬유육종, 소화관 카르티노이드 종양, 두경부암 (예를 들어, 두경부 편평 상피 세포 암), 하인두암, 신장암, 후두암, 백혈병 (예를 들어, 급성 림프모구성 백혈병, 급성 림프구성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병, 급성 골수성 백혈병), 액성 종양, 간암, 폐암 (예를 들어, 비-소세포 폐암), 림프종 (예를 들어, 호지킨 림프종, 비-호지킨 림프종, 확산성 대형 B 세포 림프종, 여포성 림프종), 악성 중피종, 비만세포종, 흑색종, 다발성 골수종, 비인두암, 난소암, 췌장암; 복막암, 장암 및 장간막암; 인두암, 전립선암, 직장암, 신장암, 피부암, 소장암, 연조직암, 고형 종양, 위암, 고환암, 갑상선암, 요도암 등을 포함한다.
본 발명은 단시 예시인 실시예를 참조하여 하기에 보다 상세하게 설명되며, 이것은 본 발명의 범위를 제한하지 않는다.
[실시예]
실시예 1
(항체의 환원 처리)
9.21 mg/ml 항-CD3 항체 (Bio X Cell) (111 ㎕) 을 10 mM DTT 수용액 (12.3 ㎕) 과 혼합하였다. 유사하게, 6.73 mg/ml IgG2a 항체 (Bio X Cell) (149 ㎕) 을 10 mM DTT 수용액 (16.6 ㎕) 과 혼합하였다. 각 항체와 DTT 의 혼합물을 볼텍스에 의해 혼합하여 실온에서 30 분 동안 반응을 수행하였다. 반응 혼합물을 HPLC (컬럼: TSKgel G2000SWXL 7.8 mm×30 cm, TOSOH, 이동상: PBS) 로 분획화하여 환원된 항체를 함유하는 분획 용액을 수득하였다. 분획 용액을 Amicon 0.5 ml-10K 를 사용하여 초원심분리하였다. 농축물 중의 항체 단백질 및 티올 기의 농도는 각각 230 nm 에서의 흡광도 및 N-(7-디메틸아미노-4-메틸쿠마린-3-일)말레이미드 (DACM) 와의 형광 비색 반응에 의해 측정되었다. 환원된 항-CD3 항체의 수율은 단백질 농도 1.75 mg/ml, 티올기 농도 5.14 μM 로, 176 ㎕ 이었고, 환원된 IgG2a 항체의 수율은 단백질 농도 5.19 mg/ml, 티올기 농도 45.1 μM 으로, 86 ㎕ 이었다.
실시예 2
(말레이미드-LNP 의 제조)
지질 혼합물 (양이온성 지질:DPPC:콜레스테롤:SUNBRIGHT GM-020:SUNBRIGHT DSPE-020 MA=60:10.6:28:1.4:1, 몰비) 을 90% EtOH, 10% 물에 용해시켜 7.0 mg/ml 지질 용액을 수득하였다. 양이온성 지질로서, WO 2016/021683 에 기재된 3-((5-(디메틸아미노)펜타노일)옥시)-2,2-비스(((3-펜틸옥타노일)옥시)메틸)프로필 3-펜틸옥타노에이트 (화합물 7) 및 N,N,N-트리메틸-5-옥소-5-(3-((3-펜틸옥타노일)옥시)-2,2-비스(((3-펜틸옥타노일)옥시)메틸)프로폭시)펜탄-1-아미늄 요오다이드 (화합물 8) 을 59.1:0.9 (몰비) 로 혼합하여 사용하였다. 세포내 신호 전달 도메인으로서 4-1BB 및 Cd3ζ 를 갖는 CD19-표적화된 CAR 을 코딩하는 mRNA 를 10 mM 2-모르폴리노에탄설폰산 (MES) 완충액 (pH 5.0) 에 용해시켜 0.2 mg/ml 핵산 용액을 수득하였다. 수득된 지질 용액 및 핵산 용액을 3 ㎖/분:6 ㎖/분의 유속 비로 Nanoassemblr 장치 (Precision Nanosystems) 에 의해 실온에서 혼합하여 조성물을 함유하는 분산액을 수득하였다. 수득된 분산액을 물에 대해 실온에서 1 시간 동안 및 PBS 에 대해 4℃ 에서 48 시간 동안 Slyde-A-Lyzer (20k 분획 분자량, Thermo Scientific) 를 사용하여 투석하였다. 연속적으로, 투석액을 0.2 ㎛ 시린지 필터 (Iwaki) 를 통해 여과하고 4℃ 에서 보존하였다.
실시예 3
(환원된 항체와 말레이미드-LNP 의 결합 반응)
말레이미드-LNP 분산액을, 말레이미드에 대해 환원된 항체 1/20 몰 농도로 환원된 항체 용액과 함께 혼합하고, 실온에서 4 시간 동안 정치시켰다. 그 후, 혼합물을 정제 단계까지 4℃ 에서 저장하였다.
실시예 4
(항체-LNP 의 겔 여과 정제)
환원된 항체 및 말레이미드-LNP 의 반응 혼합물을 겔 여과 컬럼 Sepharose CL-4B (Cat No. 17-0150-01/GE Healthcare) 에 로딩하고, 이동상으로서 D-PBS (-) 로 분획화하였다. 이어서, 각 분획의 단백질 농도를 측정하여 관심있는 항체-LNP 를 함유하는 분획을 확인하였다. 항체-LNP 를 0.2 ㎛ 시린지 필터를 통해 여과하고 4℃ 에서 저장하였다.
실시예 5
(CD8+ T 세포의 생체 외 트랜스펙션)
C57BL/6J 마우스로부터 비장을 수집하고 ACK 용해 완충액 (Biosource) 에 분산시켜 마우스 비장세포를 제공한다. 수득된 마우스 비장세포를 1 ng/ml 인터류킨 7 및 2 ㎍/ml 콘카발린 A 를 함유하는 완전한 RPMI 1640 배지에서 2 일 동안 배양하고, 마우스 CD8+ T 세포는 Ficoll 밀도 구배 원심분리를 사용하여 사멸 세포를 제거하고 CD8 음성 분리 키트 (Stemcell Technologies) 를 사용하여 처리함으로써 분리된다. 수득된 마우스 CD8+ T 세포를 10 ng/ml 인터류킨 2 및 항체-LNP 를 함유하는 완전한 RPMI 1640 배지에서 분산 및 배양하여 CAR 또는 외인성 TCR 로 마우스 CD8+ T 세포를 트랜스펙션시켰다.
동일한 방식으로, CD8+ T 세포는 구매한 배양된 인간 1 차 T 세포로부터 분리되고 인간 CD8+ T 세포는 CAR 또는 외인성 TCR 로 트랜스펙션된다.
실시예 6
(CAR-T 세포의 시험관 내 세포독성 평가)
세포독성을 평가할 세포인 CD19 를 강제로 발현하는 인간 만성 골수성 백혈병 세포주 K562 세포를 막 염료 PKH-26 (Sigma-Aldrich) 으로 표지하고, 10% 태아 송아지 혈청을 함유하는 RPMI 배지로 세척하고, 배지에서 1 x 10^5 세포/ml 로 분산시키고 배양하였다. 표지된 세포독성 평가 세포를 96-웰 플레이트에 분배하고 배양하였다. 세포를 CAR-T 세포와 혼합하고 37℃ 에서 3 시간 동안 배양하고, Annexin V-Brilliant Violet 421 (BioLegend) 로 염색하고, 유세포측정을 수행하여 아폽토시스 세포를 정량하였다.
실시예 7
(생체 내 항암 활성 평가 시험)
루시페라제를 안정적으로 발현하는 K562-CD19 세포를 꼬리 정맥으로부터 6 주령 NOD-SCID 마우스에 투여하고, 마우스를 1 주일 동안 사육하여 마우스 혈액암 모델을 제조한다. 이어서, 항체-LNP 를 사용하여 생체 외에서 CAR 을 코딩하는 핵산을 트랜스펙션하여 얻은 1x10^6 인간 CAR-T 세포를 꼬리 정맥을 통한 투여에 의해 3 주 동안 주 당 1 회 투여한다. CAR-T 세포에 의한 암 세포의 감소는 생체 내 발광 이미지화 시스템 IVIS (PerkinElmer) 를 사용한 측정에 의해 평가된다.
실시예 8
(양이온성 지질을 이용하는 말레이미드-LNP 의 제조)
지질 혼합물 (양이온성 지질:DPPC:콜레스테롤:SUNBRIGHT GM-020:SUNBRIGHT DSPE-020 MA=60:10.6:28:1.4:1, 몰비) 을 90% EtOH, 10% 25 mM 아세테이트 완충액 pH 4.0 에 용해시켜 10 mg/ml 지질 용액을 수득하였다. 양이온성 지질로서, 3-((5-(디메틸아미노)펜타노일)옥시)-2,2-비스 (((9Z)-테트라데카-9-에노일 옥시)메틸)프로필 (9Z)-테트라데카-9-에노에이트 (화합물 12), 2-(((4-(디메틸아미노)부타노일)옥시)메틸)-2-((도데카노일옥시)메틸)프로판-1,3-디일 (9Z,9'Z)비스-테트라데카-9-에노에이트 (화합물 21) 및 2-(((4,5-디부틸노나노일)옥시)메틸)-2-(((5-(디메틸아미노)펜타노일)옥시)메틸)프로판-1,3-디일 디데카노에이트 (화합물 35) 이 사용되었다. CD19-표적화된 CAR 을 코딩하는 pcDNA3.1-hCD19CAR 를 10 mM 2-모르폴리노에탄설폰산 (MES) 완충액 (pH 5.5) 에 용해시켜 0.2 mg/ml 핵산 용액을 수득하였다. WO 2013/126712 에서 인용된 CD19 IgG4 28z 서열을 pcDNA3.1 (Thermo Fisher Scientific) 의 다중 클로닝 부위에 통합함으로써 pcDNA3.1-hCD19CAR 을 제조하였다. 수득된 지질 용액 및 핵산 용액을 3 ml/분:6 ml/분의 유속 비로 Nanoassemblr 장치 (Precision Nanosystems) 에 의해 실온에서 혼합하여 조성물을 함유하는 분산액을 수득하였다. 수득된 분산액을 물에 대해 실온에서 1 시간 동안 및 PBS 에 대해 4℃ 에서 48 시간 동안 Slyde-A-Lyzer (20k 분획 분자량, Thermo Scientific) 를 사용하여 투석하였다. 연속적으로, 투석액을 0.2 ㎛ 시린지 필터 (Iwaki) 를 통해 여과하고 4℃ 에서 보존하였다.
(말레이미드-LNP 의 핵산 농도 측정 및 추정 말레이미드 농도의 계산)
말레이미드-LNP 를 0.5% Triton X-100 에 용해시키고, Quant-iTTM PicoGreenTM dsDNA Assay Kit (Thermo Fisher Scientific) 를 사용하여 pDNA 농도를 측정하였다. Triton X-100 을 첨가하지 않고 측정한 pDNA 농도를 LNP 에 캡슐화되지 않은 pDNA 의 농도로서 취하고, LNP 에서 pDNA 의 캡슐화 비율을 계산하였다. 추정 말레이미드 농도는 측정된 pDNA 농도에 말레이미드-PEG-지질 (DSPE-020MA) 의 충전 비를 곱함으로써 계산되었다. 수득된 값은 표 1 에 제시된다.
[표 1]
Figure pct00113
(2 종의 혼합된 환원된 항체와 말레이미드-LNP 의 결합 반응)
DTT 로 환원된 동일량의 항-인간 CD3 항체 (BE0001-2, BioXCell) 및 항-인간/원숭이 CD28 항체 (BE0248, BioXCell) 를 말레이미드-LNP 의 말레이미드에 대해 1/20 몰량으로 혼합하였다. 말레이미드-LNP 및 환원된 항체의 농도 및 부피는 표 2 에 제시된다. 혼합물을 실온에서 4 시간 동안 방치한 후 정제 단계까지 4℃ 에서 저장하였다.
[표 2]
Figure pct00114
(항체-LNP 의 겔 여과 정제)
환원된 항체 및 말레이미드-LNP 의 반응 혼합물을 겔 여과 컬럼 Sepharose CL-4B (Cat No. 17-0150-01/GE Healthcare) 에 로딩하고, 이동상으로서 D-PBS (-) 로 분획화하였다. 이어서, 각 분획의 단백질 농도를 측정하여 관심있는 항체-LNP 를 함유하는 분획을 확인하였다. 항체-LNP 를 0.2 ㎛ 시린지 필터를 통해 여과하고 4℃ 에서 저장하였다. 수득된 항체-LNP 의 입자 크기는 Zetasizer Nano ZS (Malvern Panalytical) 에 의해 측정하였다. 핵산 및 항체 단백질의 농도는 각각, Quant-iTTM PicoGreenTM dsDNA Assay Kit (Thermo Fisher Scientific) 및 ATTO-TAGTM FQ Amine-Derivatization Kit (Thermo Fisher Scientific) 를 사용하여 측정하였다. 각 분석 결과의 값을 표 3 에 나타낸다.
[표 3]
Figure pct00115
실시예 9
(항체-LNP 를 사용한 배양된 인간 1 차 T 세포에 대한 CD19 CAR 트랜스펙션 시험)
인간 Pan-T 세포 (AccuCell 인간 말초 혈액 Pan-T 세포, 음성 선별) 를 배지와 함께 1.1×106 세포/ml 로 제조하고, 96-웰 플레이트에 90 ㎕/웰로 시딩하였다. 30 ng/ml 농도의 재조합 IL-2 (Thermo Fisher Scientific) 가 보충된 X-VIVO10 (Lonza) 를 배지로서 사용하였다. 연속해서, 30 μg/ml pcDNA3.1-hCD19CAR 의 농도로 PBS 로 희석된 10 ㎕ 의 항체-LNP 를 배지에 첨가하고, 세포를 37℃ 에서 5% CO2 인큐베이터에서 3 일 및 6 일 동안 배양하였다.
(유세포측정법에 의한 CD19CAR 발현 평가)
96-웰 플레이트에서 배양된, 배양된 인간 1 차 T 세포를 1.5 ml 튜브에 수집하고, 재조합 인간 CD19 단백질, Fc 키메라 활성, 비오틴 (Abcam) (2 ㎕) 을 첨가하고, 혼합물을 얼음 위에 30 분 동안 정치시켰다. 이어서, 200 ㎕ 의 1% FBS 가 첨가된 Cell Wash (BD) 를 첨가하고, 혼합물을 300×g 에서 5 분 동안 원심분리하여 2 회 세척하고, 상청액을 제거하고 세포를 100 ㎕ 의 1% FBS, Cell Wash 에 분산시켰다. 세포 분산액에 0.2 ㎕ 의 Brilliant Violet 421 Streptavidin 를 첨가하고, 피펫팅에 의해 혼합한 후, 분산액을 얼음 위에 30 분 동안 정치시켰다. 염색된 세포를 200 ㎕ 의 1% FBS Cell Wash 으로 3 회 세척 및 원심분리하고, 여과하고, 200 ㎕ 의 1% FBS Cell Wash 에 분산시키고, LSRFortessa (BD) 에 의해 유세포측정 분석을 수행하였다.
hCD3/hCD28-화합물 12-pcDNA3.1-hCD19CAR 로 트랜스펙션된 배양된 인간 1 차 T 세포에서 유세포측정 분석에 의한 CD19 CAR 발현 분석의 결과가 도 1 에 제시된다. 항체-LNP 를 첨가한 후 3 일 및 6 일째 CD19 CAR-양성 비율은 각각 51.9% 및 41.7% 였으며, CAR-양성 세포는 바이러스 벡터에 의한 유전자 전달과 비교하여 충분한 효율로 수득되었다.
hCD3/hCD28-화합물 21-pcDNA3.1-hCD19CAR 및 hCD3/hCD28-화합물 35-pcDNA3.1-hCD19CAR 로 트랜스펙션된 배양된 인간 1 차 T 세포에서 유세포측정 분석에 의한 CD19 CAR 발현 분석의 결과가 도 2 에 제시된다. 항체-LNP 첨가 후 3 일째의 CD19 CAR-양성 비율은 각각 5.12% 및 47.0% 였다.
실시예 10
(항체-LNP 에 의해 CD19 CAR 로 트랜스펙션된 배양된 인간 1 차 T 세포에 의한 암 세포독성 평가)
표적 세포로서 DELFIA 세포독성 어세이 키트 (Perkin Elmer) 로 표지된 인간 프리 B 세포주 NALM-6 및 인간 버킷 (Burkitt) 림프종 세포주 Daudi 를 96-웰 U 바닥 플레이트 상에 1×104 세포/100 ㎕/웰의 세포 밀도로 시딩하였다. 배지로는, 10% FBS-함유 RPMI (페놀 레드 무함유) 를 사용하였다. 이어서, 다른 섹션에 기재된 방법에 의해 hCD3/hCD28-화합물 12-pcDNA3.1-hCD19CAR 에 의해 CD19CAR 로 트랜스펙션된 배양된 인간 1 차 T 세포 (항체-LNP 의 첨가 3 일 후 CD19CAR 양성 비율: 19%) 를 표적 세포와의 세포 수 비가 0 내지 16 이 되도록 100 ㎕ 의 배지에 분산하여 이펙터 세포로서 첨가하였다. 표적 세포와 이펙터 세포의 혼합 3 시간 후에, 20 ㎕ 의 배양 상청액을 수집하였다. 유로퓸 용액 (Eu) (20 ㎕) 을 수집된 배양 상청액에 첨가하고, 손상된 표적 세포로부터 방출된 킬레이트제 TDA 및 Eu 의 복합체에 의해 방출된 형광 강도로부터 세포독성율을 계산하였다.
CD19 CAR 로 트랜스펙션된 인간 1 차 T 세포의 첨가로 인한 Nalm-6 및 Daudi 의 세포독성율이 도 3 에 제시된다.
실시예 11
(환원된 Fab' 의 제조)
말레이미드-LNP 에 공액될 환원된 Fab' 는 Pierce F(ab')2 Preparation Kit (Thermo Fisher Scientific) 를 사용하여 항-마우스 CD3ε 항체 (BE0001-1, BioXCell) 및 항-마우스 CD28 항체 (BE0015-1, BioXCell) 로부터 제조되었다. 1 ml 의 1.75 mg/ml F(ab')2 를 7.86 mg/ml 항-마우스 CD3ε 항체 (0.5 ml) 로부터 수득하였다. 0.62 ml 의 0.97 mg/ml F(ab')2 를 3.86 mg/ml 항-마우스 CD28 항체 (0.5 ml) 로부터 수득하였다. 각각의 F(ab')2 를 40 mM 의 농도에서 환원제로서 2-아미노에탄티올 p-톨루엔설포네이트와 혼합하고 혼합물을 37℃ 에서 1 시간 동안 정치시켰다. 수득된 Fab' 를 Zeba Spin Desalting Columns, 7K MWCO-0.5 ml (Thermo Fischer Scientific) 에 의해 정제하고 말레이미드-LNP 와 반응할 때까지 4℃ 에 저장하였다. Fab' 단백질 및 티올 기의 농도는 각각 230 nm 에서의 흡광도 및 N-(7-디메틸아미노-4-메틸쿠마린-3-일)말레이미드 (DACM) 와의 형광 비색 반응에 의해 측정되었다.
실시예 12
(환원된 Fab' 와 말레이미드-LNP 의 결합 반응)
환원된 항-마우스 CD3εFab' 및 항-마우스 CD28 Fab' 를 상기 언급된 방법에 의해 제조된 말레이미드-LNP 의 말레이미드에 1/20 몰량으로 혼합하였다. 혼합물을 실온에서 4 시간 동안 방치한 후 정제 단계까지 4℃ 에서 저장하였다.
실시예 13
(환원된 Fab'-LNP 의 겔 여과 정제)
환원된 Fab' 및 말레이미드-LNP 의 반응 혼합물을 겔 여과 컬럼 Sepharose CL-4B (Cat No. 17-0150-01/GE Healthcare) 에 로딩하고, 이동상으로서 D-PBS (-) 로 분획화하였다. 이어서, 각 분획의 단백질 농도를 측정하여 관심있는 Fab'-LNP 를 함유하는 분획을 확인하였다. Fab'-LNP 를 0.2 ㎛ 시린지 필터를 통해 여과하고 4℃ 에서 저장하였다. 수득된 항체-LNP 의 입자 크기는 Zetasizer Nano ZS (Malvern Panalytical) 에 의해 측정하였다. 핵산 및 항체 단백질의 농도는 각각, Quant-iTTM PicoGreenTM dsDNA Assay Kit (Thermo Fisher Scientific) 및 ATTO-TAGTM FQ Amine-Derivatization Kit (Thermo Fisher Scientific) 를 사용하여 측정하였다.
본 발명의 지질 나노입자는 생체 외 뿐만 아니라 생체 내에서도 CAR 또는 외인성 TCR 를 효과적으로, T 세포를 선택적으로 도입할 수 있고, 따라서 낮은 생산 비용으로 CAR-T 또는 TCR-T 세포 요법을 제공할 수 있다. 또한, 바이러스 벡터가 사용되지 않기 때문에, 바이러스 단백질에 의한 항원성의 문제를 피할 수 있고, 이것은 암 면역요법에 대한 신규한 플랫폼으로서 매우 유용하다.
본원은 일본에 출원된 일본 특허출원 2017-252616 (출원일: 2017 년 12 월 27 일) 을 기초로 하며, 그 내용은 본 명세서에 모두 참조로서 포함된다.

Claims (34)

  1. 하기 (a) 내지 (c) 를 포함하는 지질 나노입자:
    (a) 키메라 항원 수용체 또는 외인성 T 세포 수용체를 코딩하는 핵산;
    (b) 양이온성 지질; 및
    (c) 비-양이온성 지질.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 양이온성 지질이 식 (I) 로 나타난 화합물인 지질 나노입자:
    Figure pct00116

    [식 중,
    L1 은 C1-22 알킬렌기, C2-22 알케닐렌기 또는 C3-22 알카디에닐렌기이고,
    n 은 0 또는 1 의 정수이고,
    R1 은 하기와 같고:
    (1) 수소 원자,
    (2) 선형 C1-22 알킬기 및 선형 C2-22 알케닐기로부터 선택되는 1 또는 2 개의 치환기로 임의로 치환된 선형 C1-22 알킬기,
    (3) 선형 C1-22 알킬기 및 선형 C2-22 알케닐기로부터 선택되는 1 또는 2 개의 치환기로 임의로 치환된 선형 C2-22 알케닐기, 또는
    (4) 선형 C1-22 알킬기 및 선형 C2-22 알케닐기로부터 선택되는 1 또는 2 개의 치환기로 임의로 치환된 선형 C3-22 알카디에닐기,
    R2 는 -CH2-O-CO-R5, -CH2-CO-O-R5 또는 -R5 이고,
    R3 은 -CH2-O-CO-R6, -CH2-CO-O-R6 또는 -R6 이고,
    R4 는 수소 원자, -CH2-O-CO-R7, -CH2-CO-O-R7 또는 -R7 이고,
    R5, R6 및 R7 은 각각 독립적으로 하기와 같고:
    (1) 선형 C1-22 알킬기 및 선형 C2-22 알케닐기로부터 선택되는 1 또는 2 개의 치환기로 임의로 치환된 선형 C1-22 알킬기,
    (2) 선형 C1-22 알킬기 및 선형 C2-22 알케닐기로부터 선택되는 1 또는 2 개의 치환기로 임의로 치환된 선형 C2-22 알케닐기, 또는
    (3) 선형 C1-22 알킬기 및 선형 C2-22 알케닐기로부터 선택되는 1 또는 2 개의 치환기로 임의로 치환된 선형 C3-22 알카디에닐기,
    R8 및 R9 는 각각 독립적으로, C1-6 알킬기임],
    또는 이의 염.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 핵산이 mRNA 또는 DNA 인 지질 나노입자.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 비-양이온성 지질이 인지질, 콜레스테롤 및/또는 PEG 지질인 지질 나노입자.
  5. 제 1 항에 있어서, 상기 지질 나노입자가 표면 상의 T 세포를 표적으로 할 수 있는 리간드를 갖는 지질 나노입자.
  6. 제 5 항에 있어서, 상기 리간드가 CD3 에 대한 항체, CD4 에 대한 항체, CD8 에 대한 항체 및 CD28 에 대한 항체로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 항체의 항원 결합 도메인을 포함하는 리간드인 지질 나노입자.
  7. 제 5 항에 있어서, 상기 리간드가 CD3 에 대한 항체 및/또는 CD28 에 대한 항체의 항원 결합 도메인을 포함하는 리간드인 지질 나노입자.
  8. 제 5 항에 있어서, 상기 리간드가 CD3 에 대한 항체 및 CD28 에 대한 항체의 항원 결합 도메인을 포함하는 리간드인 지질 나노입자.
  9. 제 1 항에 따른 지질 나노입자를 포함하는 의약.
  10. 제 9 항에 있어서, 의약이 암의 예방약 또는 치료약인 의약.
  11. 제 9 항에 있어서, 의약이 키메라 항원 수용체 또는 외인성 T 세포 수용체 유전자를 생체 내 면역세포에 도입하여 이의 발현을 유도하는 의약.
  12. 제 9 항에 있어서, 의약이 키메라 항원 수용체 또는 외인성 T 세포 수용체 유전자를 생체 내 T 세포에 도입하여 이의 발현을 유도하는 의약.
  13. 포유동물에게 제 1 항에 따른 지질 나노입자를 투여하는 것을 포함하는, 포유동물의 생체 내 면역세포에 수용체를 도입함으로써 키메라 항원 수용체 또는 외인성 T 세포 수용체를 발현시키는 방법.
  14. 포유동물에게 제 1 항에 따른 지질 나노입자를 투여하는 것을 포함하는, 포유동물의 생체 내 T 세포에 수용체를 도입함으로써 키메라 항원 수용체 또는 외인성 T 세포 수용체를 발현시키는 방법.
  15. 포유동물에게 제 1 항에 따른 지질 나노입자를 투여하는 것을 포함하는, 포유동물에서 암을 예방 또는 치료하는 방법.
  16. 제 1 항에 있어서, 암의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 지질 나노입자.
  17. 암의 예방제 또는 치료제의 제조에서의 제 1 항에 따른 지질 나노입자의 용도.
  18. 제 1 항에 따른 지질 나노입자를 포함하는, 키메라 항원 수용체 또는 외인성 T 세포 수용체의 발현을 유도하기 위한 조성물.
  19. 생체 외 면역세포를 포함하는 배양물에 제 1 항에 따른 지질 나노입자를 첨가함으로써 수득되고 키메라 항원 수용체 또는 외인성 T 세포 수용체를 발현하는 생체 외 면역세포.
  20. 생체 외 T 세포를 포함하는 배양물에 제 1 항에 따른 지질 나노입자를 첨가함으로써 수득되고 키메라 항원 수용체 또는 외인성 T 세포 수용체를 발현하는 생체 외 T 세포.
  21. 생체 외 면역세포를 포함하는 배양물에 제 1 항에 따른 지질 나노입자를 첨가함으로써 수득되고 키메라 항원 수용체 또는 외인성 T 세포 수용체를 발현하는 생체 외 면역세포를 포함하는 의약.
  22. 생체 외 T 세포를 포함하는 배양물에 제 1 항에 따른 지질 나노입자를 첨가함으로써 수득되고 키메라 항원 수용체 또는 외인성 T 세포 수용체를 발현하는 생체 외 T 세포를 포함하는 의약.
  23. 제 21 항에 있어서, 의약이 암의 예방약 또는 치료약인 의약.
  24. 제 21 항에 있어서, 의약이 아폽토시스 유도약인 의약.
  25. 생체 외 면역세포를 포함하는 배양물에 제 1 항에 따른 지질 나노입자를 첨가하는 것을 포함하는, 생체 외 면역세포에 수용체를 도입함으로써 키메라 항원 수용체 또는 외인성 T 세포 수용체를 발현시키는 방법.
  26. 생체 외 T 세포를 포함하는 배양물에 제 1 항에 따른 지질 나노입자를 첨가하는 것을 포함하는, 생체 외 T 세포에서 키메라 항원 수용체 또는 외인성 T 세포 수용체를 발현시키는 방법.
  27. 생체 외 면역세포를 포함하는 배양물에 제 1 항에 따른 지질 나노입자를 첨가함으로써 수득되고 키메라 항원 수용체 또는 외인성 T 세포 수용체를 발현하는 생체 외 면역세포를 포유동물에 투여하는 것을 포함하는, 포유동물에서 암을 예방 또는 치료하는 방법.
  28. 생체 외 T 세포를 포함하는 배양물에 제 1 항에 따른 지질 나노입자를 첨가함으로써 수득되고 키메라 항원 수용체 또는 외인성 T 세포 수용체를 발현하는 생체 외 T 세포를 포유동물에 투여하는 것을 포함하는, 포유동물에서 암을 예방 또는 치료하는 방법.
  29. 생체 외 면역세포가 생체 외 면역세포를 포함하는 배양물에 제 1 항에 따른 지질 나노입자를 첨가함으로써 수득되고 키메라 항원 수용체 또는 외인성 T 세포 수용체를 발현하는, 암의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 생체 외 면역세포.
  30. 생체 외 T 세포가 생체 외 T 세포를 포함하는 배양물에 제 1 항에 따른 지질 나노입자를 첨가함으로써 수득되고 키메라 항원 수용체 또는 외인성 T 세포 수용체를 발현하는, 암의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 생체 외 T 세포.
  31. 생체 외 면역세포가 생체 외 면역세포를 포함하는 배양물에 제 1 항에 따른 지질 나노입자를 첨가함으로써 수득되고 키메라 항원 수용체 또는 외인성 T 세포 수용체를 발현하는, 암의 예방제 또는 치료제의 제조에서의 생체 외 면역세포의 용도.
  32. 생체 외 T 세포가 생체 외 T 세포를 포함하는 배양물에 제 1 항에 따른 지질 나노입자를 첨가함으로써 수득되고 키메라 항원 수용체 또는 외인성 T 세포 수용체를 발현하는, 암의 예방제 또는 치료제의 제조에서의 생체 외 T 세포의 용도.
  33. 생체 외 면역세포를 포함하는 배양물에 제 1 항에 따른 지질 나노입자를 첨가하는 단계를 포함하는, 키메라 항원 수용체 또는 외인성 T 세포 수용체를 발현하는 생체 외 면역세포를 포함하는 의약을 제조하는 방법.
  34. 생체 외 T 세포를 포함하는 배양물에 제 1 항에 따른 지질 나노입자를 첨가하는 단계를 포함하는, 키메라 항원 수용체 또는 외인성 T 세포 수용체를 발현하는 생체 외 T 세포를 포함하는 의약을 제조하는 방법.
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