KR20200102895A - Animal Identification Method using SNP marker - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 단일염기다형성 마커를 이용한 동물 개체 식별 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 단일염기다형성 마커를 이용한 개 개체 식별 방법에 관한 것이다.The present invention relates to an animal individual identification method using a mononucleotide polymorphism marker, and more particularly, to a dog individual identification method using a monobasic polymorphism marker.
산업과 경제의 급속한 성장으로 인해 크고 작은 사회적/심리적 문제가 야기되었다. 이러한 스트레스, 불안 및 우울증을 완화하기 위해 애완동물을 사육하는 가정이 증가하며, 애완동물에 대한 보험 등 애완 동물 산업이 빠르게 발전하였다. 그러나 애완동물 산업의 성장은 사회적, 윤리적, 산업적인 문제를 야기하였다. The rapid growth of industry and economy has caused large and small social/psychological problems. In order to alleviate such stress, anxiety, and depression, the number of families raising pets has increased, and the pet industry has rapidly developed, such as insurance for pets. However, the growth of the pet industry has caused social, ethical and industrial problems.
그 중에서 애완동물의 분실 및 신원 확인은 큰 문제로 인식되고 있다. 소유주의 의사와는 달리 사고로 인해 애완동물을 분실하는 경우, 외모 등 생김새를 통해서 애완동물의 신원을 확인하는 것은 한계가 있다. 그리고 거주지를 잃고 방황하게 되는 애완동물들은 그들의 공격성과 배설물, 일반 쓰레기를 헤집어 놓는 문제 등을 일으켜 사회적으로 문제가 되고 있다. 더욱이 미국의 경우 야외 동물을 포함하여 전국의 650만 마리의 애완동물이 동물보호센터에 집결되고 있으며, 그 중 매년 150만 마리가 안락사를 당하고 있다. 더불어 영국에서도 2011년 애완동물 보험 사기가 4배 증가하여 사회적 문제가 되고 있다.Among them, the loss and identification of pets are recognized as a big problem. Unlike the owner's doctor, if a pet is lost due to an accident, there is a limit to verifying the pet's identity through appearance, etc. And pets who lose their residence and wander are socially problematic, causing problems such as their aggression, feces, and general trash. Moreover, in the case of the United States, 6.5 million pets, including outdoor animals, are gathered at animal protection centers across the country, of which 1.5 million are euthanized every year. In addition, in the UK, pet insurance fraud increased fourfold in 2011, causing a social problem.
근본적인 문제는 애완동물 소유에 대한 공식 기록이 부족하다는 것이다. The fundamental problem is the lack of official records of pet ownership.
중국에서는 정부 차원에서 애완동물에 대해서 어떠한 신원정보를 데이터베이스화 할 것인지에 대해 검토 중이며, 어떠한 종류의 정보를 신원정보로 사용하는지에 상관없이 애완동물들에게는 일련번호가 부여되어 위와 같은 애완동물 문제를 해결하기 위한 노력이 있을 것이다. In China, the government is reviewing what kind of identity information will be made into a database for pets, and no matter what kind of information is used as identity information, serial numbers are given to pets to solve the above pet problem. There will be an effort to do it.
현재 개발된 방법 중 하나는 피하 마이크로칩 주사(microchip injection)이며 칩에 내장된 일련번호를 통해서 애완동물의 신원을 확인하는 방법이다. 그러나 칩 리더의 사용 및 구매가 용이하기 때문에 이 방법은 범죄자의 대상이 될 수 있다는 우려가 있다. 칩 내의 소유주에 대한 정보는 사기에 쉽게 사용될 수 있으며, 마이크로 칩을 다른 애완동물에게 이식하는 것은 보험 회사가 걱정하는 애완동물 보험 사기의 가능한 다른 경로가 될 수 있다. 뿐만 아니라, 애완동물의 분실이 자의적인 경우 칩은 주인에 의해 애완동물로부터 제거되어, 애완동물로부터 야기되는 여러 사회적인 문제로부터 책임을 지우는데 한계가 있을 것이다.One of the currently developed methods is subcutaneous microchip injection, a method that identifies the pet through the serial number embedded in the chip. However, since the chip reader is easy to use and purchase, there is concern that this method may be the target of criminals. Information about the owners within the chip can be easily used for fraud, and implanting microchips to other pets could be another possible route to pet insurance fraud that insurance companies are concerned about. In addition, if the loss of the pet is arbitrary, the chip is removed from the pet by the owner, and there will be a limit to taking responsibility from various social problems caused by the pet.
이러한 마이크로칩의 한계를 최소화하면서, 애완동물을 식별하기 위한 또 다른 방법은 유전적 마커 기반 방법이다. 이 방법은 개체의 유전정보를 사용함으로 해서, 개체와 등록된 기록만 있다면 전생애 동안에 애완동물을 식별하여 주인을 알 수 있다. 유전적 마커를 기반으로 하는 방법은 유전적 다형성, 이형 접합성 및 계통 발생을 방지하기 위해 다양한 유전 표지자가 사용되었다. 상기 마커에는 상염색체 미소부수체 마커(autosomal microsatellites marker), Y 염색체 마커(Y chromosome markers), 미토콘드리아 DNA(mitochondrial DNA (mtDNA))와 최근에는 단일염기다형성(single nucleotide polymorphisms (SNPs))이 포함된다. 이러한 마커들은 개의 인구와 집단의 변화율을 구별하는데 사용되었다.While minimizing the limitations of these microchips, another method for identifying pets is a genetic marker-based method. This method uses the genetic information of the individual, so that if there is an individual and a registered record, the pet can be identified during its entire life and the owner can be known. Methods based on genetic markers have used various genetic markers to prevent genetic polymorphism, heterozygous and phylogeny. The markers include autosomal microsatellites markers, Y chromosome markers, mitochondrial DNA (mtDNA), and recently single nucleotide polymorphisms (SNPs). . These markers were used to discriminate between population and population rates of change.
현재 다형성 소위성(microsatellites)이 이러한 목적을 위한 선택의 지표이지만, 실용적으로 분석될 수 있는 다형성 소위성 마커를 독립적으로 분리하는 횟수는 제한적이다. 따라서 다형성 소위성 데이터만으로 어떤 종류의 관계를 구별하는 것이 어려울 수 있다. Although currently polymorphic microsatellites are an indicator of choice for this purpose, the number of independent isolations of polymorphic so-called markers that can be analyzed in practice is limited. Therefore, it can be difficult to distinguish some kind of relationship only with polymorphic so-called satellite data.
상기 마커 중 SNP는 게놈에 풍부하고 다형성 소위성 마커와 mtDNA보다 돌연변이율이 낮으며, 일단 발견되면 효율적으로 분석할 수 있다. SNP가 포유류 게놈에서 자주 발생하고 신속하고 대규모이며 경제적인 유전자형 분석(genotyping)에 유용하다는 사실 외에도 생태학, 보전, 인구 및 진화 연구를 위한 효율적인 도구로 사용된다.Among these markers, SNPs are abundant in the genome and have a lower mutation rate than polymorphic so-called markers and mtDNA, and once discovered, they can be efficiently analyzed. In addition to the fact that SNPs occur frequently in the mammalian genome and are useful for rapid, large-scale, and economical genotyping, they are also used as efficient tools for ecological, conservation, population and evolutionary studies.
많은 고 처리량(high-throughput) SNP 유전자형 분석이 현재 이러한 용도로 사용 가능하다. 그 중에서도 iPLEX-pro 시약과 함께 MassARRAY 시스템은 멀티플렉싱(multiplexing) 및 최소한의 분석 설정 비용을 위한 간단한 플랫폼을 제공한다. 그것은 다른 질량을 가진 대립 유전자 특이적 생성물을 생성하기 위한 단일 확장 프라이머와 다중화된 PCR 반응, 모든 SNP 및 작은 시약 양에 대한 보편적 반응 조건을 따른 단일 종결 믹스(single termination mix)와 함께 균질 반응 형식(homogeneous reaction format)을 이용한다.Many high-throughput SNP genotyping are currently available for this purpose. Among them, the MassARRAY system along with iPLEX-pro reagents provides a simple platform for multiplexing and minimal analysis setup costs. It is a homogeneous reaction format with single extension primers and multiplexed PCR reactions to generate allele-specific products of different masses, single termination mixes following universal reaction conditions for all SNPs and small reagent quantities. homogeneous reaction format).
이 기술은 유전자좌 특이적(locus-specific) PCR 반응을 사용하고, 유전자좌 특이적인 프라이머 연장 반응을 일으킨다. 여기서 oligonucleotide primer는 genotyped 된 다형성 부위의 바로 상류(upstream)에 결합(annealing)된다. iPLEX-pro 분석에서 primer와 증폭된 표적 DNA는 대량 변형된 디디옥시뉴클레오티드 터미네이터(dideoxynucleotide terminator)와 함께 배양된다. 프라이머 확장은 변이체 부위의 서열에 따라 수행되며, 단일 상보적인 질량-변형된 염기이다. MALDI-TOF 질량 분석법(MALDI-TOF mass spectrometry)을 사용하여 확장된 프라이머의 질량을 자동으로 계산한다. 프라이머의 질량은 다형성 부위에 존재하는 서열 및 대립 유전자를 나타낸다. MassARRAY 소프트웨어 TyperAnalyzer는 관찰된 프라이머의 질량을 각 반응에 대한 유전자형으로 자동 번역한다.This technique uses a locus-specific PCR reaction and generates a locus-specific primer extension reaction. Here, the oligonucleotide primer is annealed directly upstream of the genotyped polymorphic site. In iPLEX-pro analysis, the primer and amplified target DNA are incubated with a massively modified didioxynucleotide terminator. Primer extension is performed according to the sequence of the variant site and is a single complementary mass-modified base. The mass of the extended primer is automatically calculated using MALDI-TOF mass spectrometry. The mass of the primer indicates the sequence and allele present at the polymorphic site. The MassARRAY software TyperAnalyzer automatically translates the observed primer mass into the genotype for each reaction.
이외에도 TaqMan SNP Genotyping 방법의 OpenArray 시스템도 많이 이용된다.Besides, TaqMan SNP Genotyping method OpenArray system is also widely used.
이에, 본 발명자는 애완동물 중 특정 개를 다른 개들로부터 정확하게 구분하여 식별할 수 있는 단일 염기 다형성(single nucleotide polymorphism, 이하 'SNP'라 함) 마커를 개발하기 위하여 예의 연구를 거듭한 결과, 개체를 식별하여 정확하게 구분할 수 있는 SNP 마커들 및 이의 조합의 유용성을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다. Accordingly, the inventors of the present invention have conducted intensive studies to develop a single nucleotide polymorphism (hereinafter referred to as'SNP') marker that can accurately distinguish and identify a specific dog from other dogs. The present invention was completed by confirming the usefulness of SNP markers that can be identified and accurately distinguished and combinations thereof.
따라서, 본 발명의 목적은 하기 단계를 포함하는 방법에 따라 구성된 개 개체 식별용 SNP 마커 세트를 제공하는 것이다:Accordingly, it is an object of the present invention to provide a set of SNP markers for individual identification of dogs constructed according to a method comprising the following steps:
(a) 개 게놈 데이터 세트에서 혈연 관계를 가지는 개체 및 코호트 크기가 10미만인 품종의 개체의 데이터를 삭제하여 개체 식별용 게놈 데이터 세트를 제조하는 단계;(a) preparing a genomic data set for individual identification by deleting data of an individual having a kinship relationship and an individual of a breed with a cohort size of less than 10 from the dog genome data set;
(b) 상기 개체 식별용 게놈 데이터 세트에서 이대립인자(biallelic)이며, 개 품종 별 대립 유전자 빈도가 40~60%이고, minor allele frequency의 표준편차가 0.25 미만인 SNP를 선별하는 단계;(b) selecting a SNP in the genome data set for individual identification, which is biallelic, has an allele frequency of 40-60% for each dog breed, and a standard deviation of the minor allele frequency of less than 0.25;
(c) 상기 (b) 단계에서 선별된 SNP에서 인접한 SNP의 거리가 1Mbp 이하인 SNP 또는 5' 방향 및 3' 방향으로 각각 90bp 이내에 반복 서열을 가지는 SNP를 제외시키는 단계;(c) excluding SNPs having a distance of 1 Mbp or less of adjacent SNPs in the SNPs selected in step (b), or SNPs having repeating sequences within 90 bp in each of the 5'and 3'directions;
(d) 상기 (c) 단계에서 선별된 SNP를 포함하는 200bp 이내에 변이가 없는 SNP를 선별하는 단계; 및(d) selecting a SNP without mutation within 200bp including the SNP selected in step (c); And
(e) 상기 선별된 SNP를 11개 내지 25개로 조합하여 개 개체 식별용 SNP 마커 세트를 구성하는 단계.(e) constructing a set of SNP markers for individual identification by combining the selected SNPs into 11 to 25.
본 발명의 다른 목적은 상기 개 개체 식별용 SNP 마커 세트를 검출 또는 증폭할 수 있는 제제를 포함하는 개 개체 식별용 조성물을 제공하는 것이다. Another object of the present invention is to provide a composition for identification of dogs comprising an agent capable of detecting or amplifying the set of SNP markers for identification of dogs.
본 발명의 다른 목적은 상기 개 개체 식별용 조성물을 포함하는 개 개체 식별용 키트를 제공하는 것이다. Another object of the present invention is to provide a kit for identification of individual dogs comprising the composition for identification of individual dogs.
본 발명의 다른 목적은 상기 SNP 마커 세트를 포함하는 개 개체 식별을 위한 검출방법을 제공하는 것이다. Another object of the present invention is to provide a detection method for identifying individual dogs comprising the SNP marker set.
본 발명의 다른 목적은 (a) 개체를 식별하고자 하는 개로부터 핵산을 분리하는 단계; 및 (b) 서열번호 1 내지 25로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 폴리뉴클레오티드에서 11번째 염기 서열을 상기 분리된 핵산에서 확인하는 단계를 포함하는 개 개체 식별 방법을 제공하는 것이다. Another object of the present invention is (a) isolating a nucleic acid from a dog for which an individual is to be identified; And (b) identifying the eleventh nucleotide sequence in the isolated nucleic acid from one or more polynucleotides selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1 to 25.
상기 본 발명의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 하기 단계를 포함하는 방법에 따라 구성된 개 개체 식별용 SNP 마커 세트를 제공한다:In order to achieve the object of the present invention, the present invention provides a set of SNP markers for identification of dogs constructed according to a method comprising the following steps:
(a) 개 게놈 데이터 세트에서 혈연 관계를 가지는 개체 및 코호트 크기가 10미만인 품종의 개체의 데이터를 삭제하여 개체 식별용 게놈 데이터 세트를 제조하는 단계;(a) preparing a genomic data set for individual identification by deleting data of an individual having a kinship relationship and an individual of a breed with a cohort size of less than 10 from the dog genome data set;
(b) 상기 개체 식별용 게놈 데이터 세트에서 이대립인자(biallelic)이며, 개 품종 별 대립 유전자 빈도가 40~60%이고, minor allele frequency의 표준편차가 0.25 미만인 SNP를 선별하는 단계;(b) selecting a SNP in the genome data set for individual identification, which is biallelic, has an allele frequency of 40-60% for each dog breed, and a standard deviation of the minor allele frequency of less than 0.25;
(c) 상기 (b) 단계에서 선별된 SNP에서 인접한 SNP의 거리가 1Mbp 이하인 SNP 또는 5' 방향 및 3' 방향으로 각각 90bp 이내에 반복 서열을 가지는 SNP를 제외시키는 단계;(c) excluding SNPs having a distance of 1 Mbp or less of adjacent SNPs in the SNPs selected in step (b), or SNPs having repeating sequences within 90 bp in each of the 5'and 3'directions;
(d) 상기 (c) 단계에서 선별된 SNP를 포함하는 200bp 이내에 변이가 없는 SNP를 선별하는 단계; 및(d) selecting a SNP without mutation within 200bp including the SNP selected in step (c); And
(e) 상기 선별된 SNP를 11개 내지 25개로 조합하여 개 개체 식별용 SNP 마커 세트를 구성하는 단계.(e) constructing a set of SNP markers for individual identification by combining the selected SNPs into 11 to 25.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 상기 개 개체 식별용 SNP 마커 세트를 검출 또는 증폭할 수 있는 제제를 포함하는 개 개체 식별용 조성물을 제공한다.In order to achieve another object of the present invention, the present invention provides a composition for identification of dogs comprising an agent capable of detecting or amplifying the set of SNP markers for identification of dogs.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 상기 개 개체 식별용 조성물을 포함하는 개 개체 식별용 키트를 제공한다. In order to achieve another object of the present invention, the present invention provides a kit for identification of dogs comprising the composition for identification of dogs.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 상기 SNP 마커 세트를 포함하는 개 개체 식별을 위한 검출방법을 제공한다. In order to achieve another object of the present invention, the present invention provides a detection method for identifying individual dogs comprising the SNP marker set.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 (a) 개체를 식별하고자 하는 개로부터 핵산을 분리하는 단계; 및 (b) 서열번호 1 내지 25로 이루어진 군에서 선택된 11종 이상의 폴리뉴클레오티드에서 11번째 염기 서열을 상기 분리된 핵산에서 확인하는 단계를 포함하는 개 개체 식별 방법을 제공한다. In order to achieve another object of the present invention, the present invention comprises the steps of: (a) isolating a nucleic acid from a dog for which an individual is to be identified; And (b) identifying an 11th nucleotide sequence in the isolated nucleic acid from 11 or more polynucleotides selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1 to 25.
이하 본 발명을 상세히 설명한다. Hereinafter, the present invention will be described in detail.
본 발명은 하기 단계를 포함하는 방법에 따라 구성된 개 개체 식별용 SNP 마커 세트를 제공한다:The present invention provides a set of SNP markers for identification of dogs constructed according to a method comprising the following steps:
(a) 개 게놈 데이터 세트에서 혈연 관계를 가지는 개체 및 코호트 크기가 10미만인 품종의 개체의 데이터를 삭제하여 개체 식별용 게놈 데이터 세트를 제조하는 단계;(a) preparing a genomic data set for individual identification by deleting data of an individual having a kinship relationship and an individual of a breed with a cohort size of less than 10 from the dog genome data set;
(b) 상기 개체 식별용 게놈 데이터 세트에서 이대립인자(biallelic)이며, 개 품종 별 대립 유전자 빈도가 40~60%이고, minor allele frequency의 표준편차가 0.25 미만인 SNP를 선별하는 단계;(b) selecting a SNP in the genome data set for individual identification, which is biallelic, has an allele frequency of 40-60% for each dog breed, and a standard deviation of the minor allele frequency of less than 0.25;
(c) 상기 (b) 단계에서 선별된 SNP에서 인접한 SNP의 거리가 1Mbp 이하인 SNP 또는 5' 방향 및 3' 방향으로 각각 90bp 이내에 반복 서열을 가지는 SNP를 제외시키는 단계;(c) excluding SNPs having a distance of 1 Mbp or less of adjacent SNPs in the SNPs selected in step (b), or SNPs having repeating sequences within 90 bp in each of the 5'and 3'directions;
(d) 상기 (c) 단계에서 선별된 SNP를 포함하는 200bp 이내에 변이가 없는 SNP를 선별하는 단계; 및(d) selecting a SNP without mutation within 200bp including the SNP selected in step (c); And
(e) 상기 선별된 SNP를 11개 내지 25개로 조합하여 개 개체 식별용 SNP 마커 세트를 구성하는 단계.(e) constructing a set of SNP markers for individual identification by combining the selected SNPs into 11 to 25.
본 발명은 개 개체를 구분하여 식별할 수 있는 개 개체 식별용 SNP 마커 세트를 제공하며, 상기 개 개체 식별용 SNP 마커 세트는 상기 (a) 내지 (e) 단계를 통해서 선별이 되는 것을 특징으로 한다. The present invention provides a set of SNP markers for dog individual identification capable of distinguishing and discriminating dog individuals, and the set of SNP markers for dog individual identification is characterized in that the selection is performed through steps (a) to (e). .
본 발명의 상기 (a) 단계에서는 현재까지 보고된 개 게놈 데이터 또는 향후 추가로 보고될 개 게놈 데이터 등 발명을 실시하는 시점에서 공개되어 있는 개 게놈 데이터를 수집한 후, 혈연 관계를 갖는 개체 및 품종별 코호트 크기가 10 미만인 품종의 개체의 게놈 데이터를 삭제하는 단계이다. In the step (a) of the present invention, after collecting dog genome data published at the time of the invention, such as dog genome data reported to date or dog genome data to be reported further in the future, individuals and breeds having a kinship relationship This is the step of deleting genomic data of individuals of varieties with star cohort size less than 10.
상기 (a) 단계를 통해 이후의 단계에서 동일 품종 내 개체간 또는 품종간 식별력이 낮은 SNP가 선별이 되는 것을 1차적으로 방지할 수 있다. Through the step (a), it is possible to primarily prevent SNPs with low discrimination between individuals within the same breed or between varieties in subsequent steps from being selected.
상기 (a) 단계에서의 개 게놈 데이터는 공지된 데이터베이스를 통해서 입수할 수 있으며, 상기 공지된 데이터베이스의 비제한적인 예시로 NHGRI Dog genome project, DOGSD, Dog SNP CanFam 등을 들 수 있다. The dog genome data in step (a) can be obtained through a known database, and non-limiting examples of the known database include NHGRI Dog genome project, DOGSD, Dog SNP CanFam, and the like.
본 발명의 상기 (a) 단계에서는 대립 유전자 빈도(Allele frequency)가 높은 SNP 마커를 우선 선별함으로써 마커 조합에 따른 genotype 경우의 수를 최대화할 수 있는 마커를 선별하는 단계이다. In the step (a) of the present invention, a SNP marker having a high allele frequency is first selected to select a marker capable of maximizing the number of genotype cases according to the marker combination.
상기 (b) 단계는 상기 (a) 단계에서 제조된 개 게놈 데이터로부터 SNP 마커를 1차적으로 선별하는 단계로서, 이대립인자(biallelic)이며, 개 품종 별 대립 유전자 빈도가 40~60%이고, 소수 대립 유전자 빈도(minor allele frequency)의 표준편차가 0.25 미만인 SNP를 선별하는 단계이다. The step (b) is a step of firstly selecting the SNP marker from the dog genomic data prepared in step (a), which is a biallelic, and the allele frequency for each dog breed is 40-60%, This is the step of selecting SNPs with a standard deviation of less than 0.25 of the minor allele frequency.
바람직하게는, 상기 (b) 단계는 50%에 가까운 대립 유전자 빈도를 나타내는 SNP를 선별함으로써 SNP 조합에 따른 경우의 수를 최대화할 수 있는 SNP를 선별하기 위한 단계이다. 바람직하게는 SNP가 이대립인자(biallelic)이며, 개 품종 별 대립 유전자 빈도가 40~60%이고, 품종별 빈도를 구하였을 때, 소수 대립 유전자 빈도(minor allele frequency)의 표준편차가 0.25 미만인 SNP를 선별한다. Preferably, the step (b) is a step for selecting SNPs that can maximize the number of cases according to the SNP combination by selecting SNPs having an allele frequency close to 50%. Preferably, the SNP is a biallelic, the allele frequency for each dog breed is 40-60%, and when the frequency for each breed is calculated, the standard deviation of the minor allele frequency is less than 0.25. Screen.
상기 (c) 단계는 상기 (b) 단계에서 1차적으로 선별된 SNP 마커로부터 인접한 SNP와의 거리가 1Mbp 이하인 SNP 또는 선별된 SNP를 기준으로 5'-말단 및 3'-말단 방향으로 90bp 이내에 반복 서열을 갖는 SNP를 제외시키는 단계이다. The step (c) is a repeat sequence within 90 bp in the 5'-end and 3'-end directions based on the SNP or the selected SNP having a distance of 1 Mbp or less from the SNP marker first selected in step (b). This is the step of excluding SNPs having.
한 염색체에 위치하는 2개의 SNPs간 거리가 아주 멀다면, 감수분열 과정에서 교차(Crossover)가 빈번히 발생하는데 이때 재조합은 단일염기수준이 아니라 큰 블록의 단위로 일어나게 되며 이렇게 함께 유전되는 단위를 Haplotype이라 한다. 재조합의 일어남으로써 서로 다른 조합의 haplotype이 독립적으로 발생하게 되는데 이처럼 독립적으로 가능한 조합이 모두 발생하는 경우 두 SNPs는 linkage equilibrium(LE, 연관평형) 상태에 있다고 한다. 그러나 SNPs간의 거리가 매우 가깝다면 2개의 SNPs는 서로 연관되어 다음 세대에 같이 전달되게 되어, 이러한 SNP들은 개체 선별을 위한 마커로서 적합하지 않을 수 있다. 따라서, 상기 (c) 단계를 통해서 이러한 부적합한 마커가 선별되는 것을 배제할 수 있다.If the distance between two SNPs located on one chromosome is very long, crossover occurs frequently during meiosis. At this time, recombination occurs in units of large blocks rather than single base levels, and the unit inherited together is called Haplotype. do. As recombination takes place, different combinations of haplotypes occur independently. When all of these independently possible combinations occur, the two SNPs are said to be in a linkage equilibrium (LE, linkage equilibrium) state. However, if the distance between the SNPs is very close, the two SNPs are related to each other and are transmitted together to the next generation, so these SNPs may not be suitable as markers for individual selection. Therefore, it can be excluded that such an inappropriate marker is selected through the step (c).
또한, 특정 SNP 주변에 반복 서열이 존재할 경우 향후 플랭킹 시퀀스(flanking sequence)가 타겟 서열에 바인딩할 때 부정적인 영향이 있을 수 있다. 따라서, 상기 (c) 단계를 통해서 이와 같은 가능성이 존재하는 SNP가 선별되는 것을 배제할 수 있다. In addition, if a repeating sequence exists around a specific SNP, there may be a negative effect when the flanking sequence binds to the target sequence in the future. Therefore, it can be excluded that SNPs having such a possibility are selected through the step (c).
상기 (d) 단계는 상기 (c) 단계에서 선별된 SNP 마커를 기준으로 200bp 이내에 변이가 없는 SNP 마커를 선별함으로써, 향후 플랭킹 시퀀스(flanking sequence)가 타겟 서열에 바인딩할 때 미칠 수 있는 부정적인 영향을 최소화할 수 있는 SNP 마커를 선별하는 단계이다. In the step (d), by selecting the SNP marker without mutation within 200bp based on the SNP marker selected in step (c), the negative effect that may have when the flanking sequence binds to the target sequence in the future This is the step of selecting a SNP marker that can minimize
한편, 본 발명에서 (b) 단계 내지 (d) 단계는 순서에 따라 또는 동시에 수행될 수 있으며, 순서에 따르는 경우 (b), (c), (d) 순서에 따라서 또는 순서를 변경하여 수행될 수도 있다. 본 발명에서의 SNP 마커의 선별은 하기 선정 기준 및 제외 기준에 따라 수행된 것일 수 있다.On the other hand, in the present invention, steps (b) to (d) may be performed according to an order or simultaneously, and if the order is followed, (b), (c), (d) may be performed according to the order or by changing the order. May be. The selection of the SNP marker in the present invention may be performed according to the following selection criteria and exclusion criteria.
<선정 기준><Selection criteria>
이대립인자(biallelic) 일 것;Be biased;
개 품종 별 대립 유전자 빈도가 40~60%일 것;The frequency of alleles for each dog breed should be 40-60%;
품종별 빈도의 minor allele frequency의 표준편차가 0.25 미만일 것;The standard deviation of the minor allele frequency of each variety should be less than 0.25;
SNP를 기준으로 200bp 이내에 변이가 없을 것;There should be no mutation within 200bp based on SNP;
<제외 기준><Exclusion criteria>
두 개의 인접한 SNP의 거리가 1Mbp 이하인 경우;When the distance between two adjacent SNPs is 1 Mbp or less;
5' 방향 및 3' 방향으로 각각 90bp 이내에 반복 서열을 가지는 경우.In the case of having a repeating sequence within 90bp in each of the 5'direction and the 3'direction.
상기 (e) 단계는 상기 (a) 내지 (d) 단계에서 선별된 SNP 마커들 중에서 개 개체 식별을 위한 최적의 마커 세트를 조합하는 단계이다. The step (e) is a step of combining an optimal set of markers for individual identification among the SNP markers selected in steps (a) to (d).
본 발명의 상기 (e) 단계에서 마커 세트에 포함이 되는 SNP 마커의 개수는 특별히 제한되는 것은 아니지만, 개 개체를 모두 구분하여 식별할 수 있는 경우의 수가 형성되도록 구성하는 것이 바람직하다. 이론적으로는, 상기 (b) 단계에서 이대립인자의 품종 별 대립 유전자 빈도가 50%에 근접한 SNP 마커를 선별했기 때문에 n개의 마커로 이루어진 세트로는 3n 개의 경우의 수 조합이 가능하다. The number of SNP markers included in the marker set in step (e) of the present invention is not particularly limited, but it is preferable to configure the number of cases in which all individual individuals can be classified and identified. Theoretically, in step (b), SNP markers having an allele frequency of close to 50% for each variety of different alleles were selected, so the number of combinations of 3 n cases is possible with a set of n markers.
다만, 개 개체를 식별할 때 SNP 마커 이외에 개의 혈액형(개의 혈액형은 현재까지 13종이 알려져 있음), 품종, 외형상 특징, 체중, 성별 및 나이 등도 함께 고려가 될 수 있기 때문에, 이들 식별 요소들을 추가로 고려하여 개 개체 식별용 SNP 마커 세트에 포함되는 SNP 마커의 개수를 적절히 조절할 수 있다. 특히, 혈액형, 품종, 외형상 특징, 체중, 성별, 나이 등의 특징을 고려할 때, 유전적 차이에 의한 식별은 95%이상인 경우 개체 식별이 가능하다. However, when identifying a dog individual, in addition to the SNP marker, the dog's blood type (13 types of dog blood types are known so far), breed, appearance characteristics, weight, sex, and age can be considered together, so these identification factors are added. In consideration of as, the number of SNP markers included in the SNP marker set for individual identification can be appropriately adjusted. In particular, when considering characteristics such as blood type, breed, appearance characteristics, weight, sex, and age, individual identification is possible when the identification by genetic difference is 95% or more.
본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 (a) 내지 (d) 단계를 통해서 선별된 마커들 중 11종 이상을 조합하여 마커 세트를 구성하였을 때 개 개체간 식별능이 95% 이상임을 확인하였고, 마커 23종 이상을 조합하여 마커 세트를 구성하였을 때에는 개체간 식별능이 100%에 가까운 것을 확인했다. According to an embodiment of the present invention, when a marker set was formed by combining at least 11 types of markers selected through steps (a) to (d), it was confirmed that the discrimination ability between dogs was 95% or more, and the marker When a marker set was formed by combining 23 or more types, it was confirmed that the discrimination ability between individuals was close to 100%.
따라서, 바람직하게는 상기 (e) 단계에서 SNP 마커 세트에 포함되는 SNP 마커는 11개 이상, 12개 이상, 13개 이상, 14개 이상, 15개 이상, 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상, 20개 이상, 21개 이상, 22개 이상, 23개 이상, 24개 이상 또는 25개 이상일 수 있다. Therefore, preferably, the SNP markers included in the SNP marker set in step (e) are 11 or more, 12 or more, 13 or more, 14 or more, 15 or more, 16 or more, 17 or more, 18 It may be more than, 19 or more, 20 or more, 21 or more, 22 or more, 23 or more, 24 or more, or 25 or more.
마커 세트에 포함이 되는 SNP 마커의 개수가 증가될수록 개체 식별을 위한 경우의 수가 증가되어 그 정확도가 향상될 수 있으나, 일정한 개수를 초과할 때부터는 마커의 증가에 따른 정확도 향상에 한계가 있고 분석 비용 및 분석 시간이 점차 증거하여 경제적인 측면에서 바람직하지 않을 수 있다. As the number of SNP markers included in the marker set increases, the number of cases for individual identification increases, and its accuracy may improve. And analysis time is gradually evidenced, which may be undesirable in terms of economy.
본 발명의 일실시예에 따르면 상기 (a) 내지 (d) 단계에서 선별된 마커들 중 25종을 선별하여 구성된 SNP 마커 세트가 100%의 개체 식별력을 나타내었기 때문에 본 발명의 상기 SNP 마커 세트에는 11종 내지 25종의 SNP 마커, 더 바람직하게는 13종 내지 25종의 SNP 마커, 가장 바람직하게는 25종의 SNP 마커가 포함이 될 수 있다. According to an embodiment of the present invention, since the SNP marker set constituted by selecting 25 types of the markers selected in steps (a) to (d) showed 100% individual identification, the SNP marker set of the
본 발명에서 사용되는 용어, “SNP, 단일염기다형성(single nucleotide polymorphism)”은 게놈에서 단일염기(A, T, C 또는 G)가 동일종의 개체들 사이 또는 한 개체(individual)의 쌍염색체 사이에 다른 경우 발생하는 DNA 서열의 다양성을 의미한다. 예를 들어, 서로 다른 개체의 세 개의 DNA 단편들(예:AAGT[A/A]AG, AAGT[A/G]AG, AAGT[G/G]AG)처럼 단일염기에서 차이를 포함하는 경우, 두 개의 대립 유전자(A 또는 G)라고 부르며, 일반적으로 거의 모든 SNPs는 두 개의 대립 유전자를 가진다. 한 집단(population) 내에서, SNP는 소수 대립 유전자 빈도(minor allele frequency, MAF; 특정 집단에서 발견되는 유전자위치(locus)에서 가장 낮은 대립인자 빈도)로 할당될 수 있다. 단일염기는 폴리뉴클레오티드 서열에 변화(대체), 제거(결실) 또는 첨가(삽입)될 수 있으며, SNP는 번역 프레임의 변화를 유발할 수 있다. 본 명세서에서, 상기 “SNP 마커”는 “SNP”와 혼용되어 명명될 수 있다.The term “SNP, single nucleotide polymorphism” used in the present invention means that a single base (A, T, C, or G) in the genome is between individuals of the same species or between individual dichromosomes. It refers to the diversity of DNA sequences occurring in different cases. For example, three DNA fragments from different individuals (eg, AAGT[A/A]AG, AAGT[A/G]AG, AAGT[G/G]AG) that contain differences in a single base, They are called two alleles (A or G), and generally almost all SNPs have two alleles. Within a population, SNPs can be assigned a minor allele frequency (MAF; the lowest allele frequency at a locus found in a particular population). Single bases can be changed (replaced), removed (deleted) or added (inserted) to the polynucleotide sequence, and SNPs can cause changes in the translation frame. In the present specification, the “SNP marker” may be named interchangeably with “SNP”.
본 발명에서 사용되는 용어, “마커(marker)”는 바이오 마커를 의미하며 본 발명에서는 특히 개 개체를 식별할 수 있는 표지로서의 의미를 갖는다. The term “marker” used in the present invention refers to a biomarker, and in the present invention, particularly, it has a meaning as a label capable of identifying a dog individual.
본 발명은 또한 상기 (a) 내지 (e) 단계에 의하여 선별된 서열번호 1 내지 25로 이루어진 군에서 선택된 11종 이상의 폴리뉴클레오티드에서 11번째 염기를 포함하는 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상, 10개 이상의 연속적인 염기로 이루어진 폴리뉴클레오티드 또는 이와 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는 개 개체 식별용 SNP 마커 세트를 제공한다. The present invention also includes 5 or more, 6 or more, 7 or more, including the 11th base in 11 or more polynucleotides selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1 to 25 selected by steps (a) to (e) It provides a set of SNP markers for individual identification comprising a polynucleotide consisting of 8 or more, 9 or more, or 10 or more consecutive bases or a polynucleotide complementary thereto.
본 발명에서, 상기 SNP 마커 세트는 서열번호 1 내지 25로 표시되는 폴리뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택된 11종 이상의 폴리뉴클레오티드의 11번째 염기를 포함하는 5개 이상의 연속적인 염기로 이루어진 폴리뉴클레오티드일 수 있으며, 바람직하게는 서열번호 1 내지 25로 표시되는 폴리뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택된 11종 이상의 폴리뉴클레오티드의 11번째 염기를 포함하는 5개 내지 100개의 연속적인 염기로 이루어진 폴리뉴클레오티드일 수 있으며, 더 바람직하게는 서열번호 1 내지 25로 표시되는 폴리뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택된 11종 이상의 폴리뉴클레오티드의 11번째 염기를 포함하는 10개 내지 100개의 연속적인 염기로 이루어진 폴리뉴클레오티드일 수 있다. In the present invention, the SNP marker set may be a polynucleotide consisting of 5 or more consecutive bases including the 11th base of 11 or more polynucleotides selected from the group consisting of polynucleotides represented by SEQ ID NOs: 1 to 25, Preferably, it may be a polynucleotide consisting of 5 to 100 consecutive bases including the 11th base of 11 or more polynucleotides selected from the group consisting of polynucleotides represented by SEQ ID NOs: 1 to 25, and more preferably It may be a polynucleotide consisting of 10 to 100 consecutive bases including the 11th base of 11 or more polynucleotides selected from the group consisting of polynucleotides represented by SEQ ID NOs: 1 to 25.
또는, 상기 SNP 마커 세트를 구성하는 각각의 SNP 마커는 하기 표 1에 기재된 SNP 마커이며, 이들 정보에 기재된 개 게놈 상의 위치 및 그 주변의 서열에 대해서는 당업자가 용이하게 개 게놈 데이터베이스를 통해서 이해될 수 있다. Alternatively, each SNP marker constituting the SNP marker set is a SNP marker described in Table 1 below, and the position on the dog genome described in these information and the sequence around it can be easily understood by those skilled in the art through a dog genome database. have.
본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 서열번호 1 내지 25로 표시되는 폴리뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택된 11종 이상의 폴리뉴클레오티드 각각의 11번째 염기 서열 조합을 통하여 특정 개체를 95% 이상 식별할 수 있음을 확인하였다. According to an embodiment of the present invention, 95% or more of a specific individual can be identified through a combination of the 11th nucleotide sequence of each of 11 or more polynucleotides selected from the group consisting of polynucleotides represented by SEQ ID NOs: 1 to 25. Confirmed.
본 발명에서 상기 11종 이상이란, 예를 들어 11종, 12종, 13종, 14종, 15종, 16종, 17종, 18종, 19종, 20종, 21종, 22종, 23종, 24종 또는 25종일 수 있다. In the present invention, the above 11 types or more means, for example, 11 types, 12 types, 13 types, 14 types, 15 types, 16 types, 17 types, 18 types, 19 types, 20 types, 21 types, 22 types, 23 types , 24 types or 25 types may be used.
본 발명의 다른 일실시예에 따르면, 상기 서열번호 1 내지 25로 표시되는 폴리뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택된 22종 이상의 폴리뉴클레오티드 각각의 11번째 염기 서열 조합을 통하여 특정 개체를 약 100%로 식별할 수 있음을 확인하였고, 상기 서열번호 1 내지 25로 표시되는 폴리뉴클레오티드 각각의 11번째 염기 서열 조합을 통하여 특정 개체를 100%로 식별할 수 있음을 확인하였다. According to another embodiment of the present invention, a specific individual can be identified by about 100% through a combination of the 11th nucleotide sequence of each of 22 or more polynucleotides selected from the group consisting of polynucleotides represented by SEQ ID NOs: 1 to 25. It was confirmed that there is, and it was confirmed that a specific individual can be identified as 100% through the 11th nucleotide sequence combination of each of the polynucleotides represented by SEQ ID NOs: 1 to 25.
따라서, 바람직하게는 상기 SNP 마커는 서열번호 1 내지 25로 표시되는 폴리뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택된 22종 이상의 폴리뉴클레오티드의 11번째 염기를 포함하는 5개 내지 100개의 연속적인 염기로 이루어진 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 본 발명에서 상기 22종 이상이란, 예를 들어 22종, 23종, 24종 또는 25종일 수 있다. Therefore, preferably, the SNP marker may be a polynucleotide consisting of 5 to 100 consecutive bases including the 11th base of 22 or more polynucleotides selected from the group consisting of polynucleotides represented by SEQ ID NOs: 1 to 25. have. In the present invention, the above 22 types or more may be, for example, 22 types, 23 types, 24 types or 25 types.
가장 바람직하게는 상기 SNP 마커는 서열번호 1 내지 25로 표시되는 폴리뉴클레오티드 각각의 11번째 염기를 포함하는 5개 내지 100개의 연속적인 염기로 이루어진 폴리뉴클레오티드일 수 있다. Most preferably, the SNP marker may be a polynucleotide consisting of 5 to 100 consecutive bases including the 11th base of each of the polynucleotides represented by SEQ ID NOs: 1 to 25.
본 발명은 상기 서열번호 1 내지 25의 각 SNP 위치의 염기 변이체에 관한 것이나, 이러한 SNP 염기 변이가 이중가닥의 gDNA(genomic DNA)에서 발견되는 경우, 상기한 폴리뉴클레오타이드 서열에 대하여 상보적인 폴리뉴클레오타이드 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 따라서 상보적인 폴리뉴클레오타이드 서열에서 SNP 위치의 염기도 본 발명의 SNP 마커가 될 수 있다.The present invention relates to base variants of each SNP position of SEQ ID NOs: 1 to 25, but when such SNP base mutations are found in double-stranded gDNA (genomic DNA), a polynucleotide sequence complementary to the polynucleotide sequence described above It is interpreted to include also. Therefore, the base of the SNP position in the complementary polynucleotide sequence may also be the SNP marker of the present invention.
본 발명에서 이용되는 염기서열은, 생물학적으로 균등 활성을 갖는 변이를 고려한다면, 서열목록에 기재된 서열과 실질적인 동일성(substantial identity)을 나타내는 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기 용어, “실질적인 동일성”은 본 발명의 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인(align)하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 60%의 상동성, 더욱 구체적으로 70%의 상동성, 더더욱 구체적으로 80%의 상동성, 가장 구체적으로 90%의 상동성을 나타내는 서열을 의미한다.The nucleotide sequence used in the present invention is interpreted as including a sequence showing substantial identity to the sequence listed in the sequence listing, if considering a mutation having biologically equivalent activity. The term “substantial identity” means that the sequence of the present invention and any other sequence are aligned to correspond as much as possible, and when the aligned sequence is analyzed using an algorithm commonly used in the art, the minimum It means a sequence that shows 60% homology, more specifically 70% homology, even more specifically 80% homology, and most specifically 90% homology.
본 발명에서, 용어 "대립유전자(allele)"는 한 쌍의 상동염색체(homologous chromosome)의 좌위(locus)에 서로 대립(짝)을 이루어 위치하는 염기 서열로서 서로 다른 대립유전자는 때때로 서로 다른 특성(형질)을 나타낼 수도 있다.In the present invention, the term "allele" is a base sequence located in opposition to each other (pair) at the locus of a pair of homologous chromosomes. Different alleles sometimes have different characteristics ( Trait).
본 발명에서 용어, "뉴클레오티드"는 “염기”와 동일한 의미로 사용되며, 단일 가닥 또는 이중 가닥 형태로 존재하는 디옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드이며, 특별하게 다르게 언급되어 있지 않은 한 자연의 뉴클레오티드의 유사체를 포함한다 (Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York (1980); Uhlman 및 Peyman, Chemical Reviews, 90:543-584 (1990)).In the present invention, the term "nucleotide" is used with the same meaning as "base", and is a deoxyribonucleotide or ribonucleotide present in a single-stranded or double-stranded form, and includes analogues of natural nucleotides unless specifically stated otherwise. (Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York (1980); Uhlman and Peyman, Chemical Reviews, 90:543-584 (1990)).
본 명세서에서, 용어 "(숫자)(A, T, G 또는 C)"는 어느 한 유전자 서열의 (숫자)번째 염기가 (A, T, G 또는 C)인 것을 의미하며, 예를 들면 "282C"는 282번째 염기가 C인 것을 의미한다.In the present specification, the term "(number) (A, T, G or C)" means that the (number)-th base of any one gene sequence is (A, T, G or C), for example, "282C "Means that the 282th base is C.
본 명세서에서, 용어 "(숫자)(A, T, G 또는 C)>(A, T, G 또는 C)"는 상동 염색체의 각 일배체형의 특정 대립유전자 서열에서 (숫자)번째 염기가 한쪽은 부등호 왼쪽의 (A, T, G 또는 C)이고 다른 한쪽은 부등호 오른쪽의 (A, T, G 또는 C)인 이형접합 유전적 변이를 의미하며, 예를 들면 "282C>T"는 상동 염색체의 각 일배체형의 특정 대립유전자 서열에서 282번째 염기가 한쪽은 C이고 다른 한쪽은 T인 이형접합 유전적 변이를 의미한다. 이때, 부등호는 이러한 유전적 변이의 발생 빈도 우열을 의미한다.In the present specification, the term "(number) (A, T, G or C)> (A, T, G or C)" refers to the (number) th base in the specific allele sequence of each haplotype of the homologous chromosome. (A, T, G or C) on the left side of the inequality sign and the other side (A, T, G, or C) on the right side of the inequality sign means a heterozygous genetic variation. For example, "282C>T" refers to a homologous chromosome. In the specific allele sequence of each haplotype, the 282th base refers to a heterozygous genetic variation in which one is C and the other is T. In this case, the inequality sign means the superiority and inferiority in the frequency of occurrence of this genetic variation.
또한, 본 명세서에서 SNP를 나타내는 [X/Y]의 경우 염기 X가 염기 Y로 점돌연변이된 SNP임을 의미한다In addition, in the case of [X/Y] representing SNP in the present specification, it means that base X is a point-mutated SNP with base Y.
본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 서열번호 1 내지 25로 표시되는 각 폴리뉴클레오티드의 11번째 염기에서의 SNP 조합은 식별 대상 개체에서 모두 다르게 나타나 개체 식별용 SNP 마커로서의 유용성 및 재현성이 확인되었다. According to an embodiment of the present invention, SNP combinations at the 11th base of each polynucleotide represented by SEQ ID NOs: 1 to 25 are all different in the individual to be identified, and utility and reproducibility as a SNP marker for individual identification were confirmed.
본 발명은 또한 상기 개 개체 식별용 SNP 마커를 검출 또는 증폭할 수 있는 제제를 포함하는 개 개체 식별용 조성물을 제공한다. The present invention also provides a composition for identification of dogs comprising an agent capable of detecting or amplifying the SNP marker for identification of dogs.
본 발명에서 사용되는 용어, “증폭”은 어떤 세포에서 특정한 형질발현을 활발히 하기 위하여 그 형질을 지배하는 유전자 또는 유전자군을 포함하는 염색체부분이 특이적으로 복제를 반복해서 그 수를 증가시키는 것을 말한다.The term "amplification" as used in the present invention refers to increasing the number of chromosomal portions containing genes or gene groups that govern the trait in order to activate specific expression in certain cells by repeating specific replication. .
본 발명에서 사용되는 용어, “SNP 마커를 검출할 수 있는 제제”는 상기 SNP 마커 조성물에 포함된 SNP 마커에 특이적으로 결합하여 인식할 수 있도록 하거나 상기 SNP를 검출하여 증폭시킬 수 있는 제제를 의미한다.The term used in the present invention, “an agent capable of detecting a SNP marker” refers to an agent capable of specifically binding and recognizing the SNP marker contained in the SNP marker composition or detecting and amplifying the SNP. do.
이의 비제한적인 예로, 상기 제제는 상기 SNP 마커가 포함된 다형성 부위에 특이적으로 결합할 수 있는 프로브(probe) 또는 상기 SNP 마커 부위를 특징적으로 검출하거나, SNP 마커를 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 특이적으로 검출하여 증폭할 수 있는 프라이머(primer) 또는 프라이머 세트일 수 있다.As a non-limiting example thereof, the agent is a probe capable of specifically binding to a polymorphic site containing the SNP marker, or characteristically detecting the SNP marker site, or a polynucleotide containing a SNP marker or a complement thereof. It may be a primer or a set of primers capable of specifically detecting and amplifying a specific polynucleotide.
본 발명에서 상기 “프라이머”는 적합한 온도 및 적합한 완충액 내에서 적합한 조건(즉, 4종의 다른 뉴클레오시드 트리포스페이트 및 중합반응 효소) 하에서 주형-지시 DNA 합성의 개시점으로 작용할 수 있는 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드를 의미한다. 프라이머의 적합한 길이는 다양한 요소, 예컨대, 온도와 프라이머의 용도에 따라 변화가 있을 수 있다. 또한, 프라이머의 서열은 주형의 일부 서열과 완전하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 주형과 혼성화되어 프라이머 고유의 작용을 할 수 있는 범위 내에서의 충분한 상보성을 가지면 충분하다. 따라서 본 발명에서의 프라이머는 주형인 유전자의 뉴클레오타이드 서열에 완벽하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 이 유전자 서열에 혼성화되어 프라이머 작용을 할 수 있는 범위 내에서 충분한 상보성을 가지면 충분하다. 또한, 본 발명에 따른 프라이머는 유전자 증폭 반응에 이용될 수 있는 것이 바람직하다. 상기 증폭 반응은 핵산 분자를 증폭하는 반응을 말하며, 이러한 유전자의 증폭 반응들에 대해서는 당업계에 잘 알려져 있고, 예컨대, 중합효소 연쇄반응(PCR), 역전사 중합효소 연쇄반응(RT-PCR), 리가아제 연쇄반응(LCR), 전자 중재 증폭(TMA), 핵산 염기서열 기판 증폭(NASBA) 등이 포함될 수 있다.In the present invention, the “primer” is a single-stranded strand capable of serving as an initiation point for template-directed DNA synthesis under suitable conditions (ie, 4 different nucleoside triphosphates and polymerases) in a suitable buffer It means an oligonucleotide. The suitable length of the primer may vary depending on various factors, such as temperature and the application of the primer. In addition, the sequence of the primer does not need to have a sequence that is completely complementary to some of the sequences of the template, and it is sufficient to have sufficient complementarity within a range capable of hybridizing with the template to perform a unique function of the primer. Therefore, the primer in the present invention does not need to have a sequence that is completely complementary to the nucleotide sequence of the gene as a template, and it is sufficient if it has sufficient complementarity within the range capable of hybridizing to this gene sequence to function as a primer. In addition, it is preferable that the primers according to the present invention can be used in a gene amplification reaction. The amplification reaction refers to a reaction to amplify a nucleic acid molecule, and the amplification reactions of such genes are well known in the art, for example, polymerase chain reaction (PCR), reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR), and ligase. Aase chain reaction (LCR), electron mediated amplification (TMA), nucleic acid sequence substrate amplification (NASBA), and the like may be included.
또한 상기 “프로브”는 자연의 또는 변형된 모노머 또는 연쇄(linkages)의 선형 올리고머를 의미하며, 디옥시리보뉴클레오타이드 및 리보뉴클레오타이드를 포함하고 타켓 뉴클레오타이드 서열에 특이적으로 혼성화할 수 있으며, 자연적으로 존재하거나 또는 인위적으로 합성된 것을 말한다. 본 발명에 따른 프로브는 단일쇄일 수 있으며, 바람직하게는 올리고디옥시리보뉴클레오티드일 수 있다. 본 발명의 프로브는 자연 dNMP(즉, dAMP, dGMP, dCMP 및 dTMP), 뉴클레오타이드 유사체 또는 유도체를 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 프로브는 리보뉴클레오타이드도 포함할 수 있다.In addition, the “probe” refers to a natural or modified monomer or a linear oligomer of linkages, including deoxyribonucleotides and ribonucleotides, and can specifically hybridize to a target nucleotide sequence, and may exist naturally or artificially It is synthesized with The probe according to the present invention may be a single chain, preferably an oligodeoxyribonucleotide. The probe of the present invention may contain natural dNMP (ie, dAMP, dGMP, dCMP and dTMP), nucleotide analogs or derivatives. In addition, the probe of the present invention may also contain a ribonucleotide.
이때, 상기 프라이머의 서열은 PCR 조건, 센스 및 안티센스 프라이머의 길이는 당업계에 공지된 것을 기초로 변형하여 사용할 수 있다.In this case, the sequence of the primers may be modified and used based on PCR conditions, and the length of the sense and antisense primers are known in the art.
구체적인 예로, 메틸화, 캡화, 뉴클레오타이드의 치환 또는 뉴클레오타이드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있을 수 있다.Specific examples include methylation, capation, substitution of nucleotides or modifications between nucleotides, for example, uncharged linkers (e.g., methyl phosphonate, phospholiester, phosphoroamidate, carbamate, etc.) or charged linkers. (E.g., phosphorothioate, phosphorodithioate, etc.).
구체적인 예로, 상기 프라이머의 서열은 SNP 마커에 대한 특이성 및 결합력이 향상될 수 있도록 변형 가능하며, 동일한 SNP 마커에 대하여 서로 다른 염기 서열을 갖는 복수 개의 프라이머를 사용할 수 있다. 더욱 구체적인 예로, 각 프라이머의 길이는 이의 말단에 반복되는 염기를 첨가하여 조절할 수 있으며, 그 염기의 종류는 A, T, G, C 또는 이들의 조합일 수 있으나, 반복되는 서열을 갖는 한, 염기의 종류는 제한이 없다. As a specific example, the sequence of the primers can be modified to improve specificity and avidity for the SNP marker, and a plurality of primers having different nucleotide sequences for the same SNP marker may be used. As a more specific example, the length of each primer can be adjusted by adding a repeating base to its end, and the type of the base may be A, T, G, C, or a combination thereof, but as long as it has a repeating sequence, the base There are no restrictions on the type of.
본 발명은 또한 상기 개 개체 식별용 조성물을 포함하는 개 개체 식별용 키트를 제공한다. The present invention also provides a kit for identification of dogs comprising the composition for identification of dogs.
본 발명의 상기 키트는 본 발명에서 제공하는 SNP 마커를 검출하여 확인함으로써 개 개체를 구분하여 식별할 수 있다. The kit of the present invention can distinguish and identify dog individuals by detecting and confirming the SNP marker provided by the present invention.
구체적인 예로, 상기 키트는 PCR을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 PCR 키트일 수 있다. 예를들어, PCR 키트는, 상기 SNP 마커에 대한 특이적인 각각의 프라이머 외에도 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 디옥시뉴클레오타이드(dNTPs), 디디옥시뉴클레오타이드(ddNTPs), Taq-폴리머라아제 및 역전사효소와 같은 효소, DNase, RNAse 억제제, DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다. 또한 정량 대조군으로 사용되는 유전자에 특이적인 프라이머 쌍을 포함할 수 있다.As a specific example, the kit may be a PCR kit including essential elements necessary to perform PCR. For example, the PCR kit includes, in addition to each primer specific for the SNP marker, a test tube or other suitable container, a reaction buffer (varies in pH and magnesium concentration), deoxynucleotides (dNTPs), didioxynucleotides (ddNTPs). , Taq-polymerase and enzymes such as reverse transcriptase, DNase, RNAse inhibitors, DEPC-water, sterile water, and the like. In addition, a primer pair specific to a gene used as a quantitative control may be included.
본 발명은 또한, (a) 개체를 식별하고자 하는 개로부터 핵산을 분리하는 단계; 및 (b) 서열번호 1 내지 25로 표시되는 폴리뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택된 11종 이상의 SNP 마커에서 11번째 염기 서열을 상기 분리된 핵산에서 확인하는 단계를 포함하는 개 개체 식별 방법을 제공한다. The present invention also includes the steps of: (a) isolating a nucleic acid from a dog for which an individual is to be identified; And (b) identifying an 11th nucleotide sequence in the isolated nucleic acid from 11 or more SNP markers selected from the group consisting of polynucleotides represented by SEQ ID NOs: 1 to 25.
상기 (a) 단계에서 핵산은 식별 대상이 되는 개로부터 수득된 시료로부터 분리될 수 있으며, 예를 들어 개의 혈액, 표피, 소변, 분변, 피모, 타액, 구강세포, 근육 및 장기로 이루어진 군에서 선택된 시료로부터 분리될 수 있다. 상기 시료에서 게놈 DNA의 추출은 당업계에서 통상적으로 사용되는 페놀/클로로포름 추출법, SDS 추출법, CTAB 분리법 또는 상업적으로 판매되는DNA 추출 키트를 이용하여 수행할 수 있다.In the step (a), the nucleic acid may be isolated from a sample obtained from a dog to be identified, for example, selected from the group consisting of dog blood, epidermis, urine, feces, coat, saliva, oral cells, muscles and organs. It can be separated from the sample. The extraction of genomic DNA from the sample may be performed using a phenol/chloroform extraction method, SDS extraction method, CTAB separation method, or a commercially available DNA extraction kit commonly used in the art.
상기 분리된 핵산을 주형으로 하고, 이에 특이적인 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭할 수 있다. 표적 핵산을 증폭하는 방법은 중합효소연쇄반응(PCR), 리가아제 연쇄반응(ligase chain reaction), 핵산 서열 기재 증폭(nucleic acid sequence-based amplification), 전사기재 증폭 시스템(transcription-based amplification system), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification) 또는 Qβ 복제효소(replicase)를 통한 증폭 또는 당업계에 알려진 핵산 분자를 증폭하기 위한 임의의 기타 적당한 방법이 있다. 이 중에서, PCR이란 중합효소를 이용하여 표적 핵산에 특이적으로 결합하는 프라이머 세트로부터 표적 핵산을 증폭하는 방법이다. 이러한 PCR 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 상업적으로 이용가능한 키트를 이용할 수도 있다. PCR은 PCR 반응에 필요한 당업계에 공지된 여러 성분을 포함하는 PCR 반응 혼합액을 이용하여 수행될 수 있다.Using the isolated nucleic acid as a template, a target sequence may be amplified by performing an amplification reaction using a primer set specific thereto. Methods of amplifying target nucleic acids include polymerase chain reaction (PCR), ligase chain reaction, nucleic acid sequence-based amplification, transcription-based amplification system, There are strand displacement amplification or amplification via Qβ replicase or any other suitable method for amplifying nucleic acid molecules known in the art. Among them, PCR is a method of amplifying a target nucleic acid from a primer set that specifically binds to a target nucleic acid using a polymerase. Such PCR methods are well known in the art, and commercially available kits may be used. PCR may be performed using a PCR reaction mixture containing various components known in the art for PCR reaction.
본 발명의 방법에 있어서, 상기 단계 (b)는 특정 서열을 규명, 즉 SNP 부위의 염기를 확인하는 데 이용되는 당업계에 공지된 다양한 방법을 응용하여 실시될 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 응용될 수 있는 기술은, 형광 인 시투 혼성화(FISH), DNA 서열결정, PFGE 분석, 서던 블롯 분석, 단일-가닥 컨퍼메이션 분석(SSCA, Orita et al., PNAS, USA 86:2776(1989)), RNase 보호 분석(Finkelstein et al., Genomics, 7:167(1990)), 닷트 블롯 분석, 변성 구배젤 전기영동(DGGE, Wartell et al., Nucl.Acids Res., 18:2699(1990)), 뉴클레오타이드 미스매치를 인식하는 단백질 (예: E. coli의 mutS 단백질)을 이용하는 방법(Modrich, Ann. Rev. Genet., 25:229-253(1991)), 대립 유전자 특이적 프로브 혼성화 방법(allele-specific probe hybridization), 대립 유전자 특이적 증폭 방법(allele-specific amplification), 5' 뉴클레아제 분해법(5' nuclease digestion), 분자 비콘 어세이법(molecular beacon assay), 올리고뉴클레오티드 결합 어세이법 (oligonucleotide ligation assay), 크기 분석법(size analysis), 단일 가닥 배좌 다형성법(single-stranded conformation polymorphism), 대립형-특이 PCR, 매스 어레이법(mass array)에 의한 분석을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.In the method of the present invention, the step (b) may be carried out by applying various methods known in the art used to identify a specific sequence, that is, to determine the base of the SNP site. For example, techniques that can be applied to the present invention include fluorescence in situ hybridization (FISH), DNA sequencing, PFGE analysis, Southern blot analysis, single-stranded conformation analysis (SSCA, Orita et al., PNAS, USA). 86:2776 (1989)), RNase protection assay (Finkelstein et al., Genomics, 7:167 (1990)), dot blot analysis, denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE, Wartell et al., Nucl.Acids Res., 18:2699 (1990)), a method using a protein that recognizes nucleotide mismatch (e.g., mutS protein of E. coli) (Modrich, Ann. Rev. Genet., 25:229-253 (1991)), allele Specific probe hybridization method (allele-specific probe hybridization), allele-specific amplification method (allele-specific amplification), 5'nuclease digestion (5' nuclease digestion), molecular beacon assay (molecular beacon assay), Includes analysis by oligonucleotide ligation assay, size analysis, single-stranded conformation polymorphism, allele-specific PCR, and mass array However, it is not limited thereto.
예를 들어, 본 발명에 있어서, 상기 단계 (b)는 특정 서열을 규명하는 데 이용되는 질량의 변화를 측정하여 SNP 지노타이핑(genotyping) 분석을 할 수 있는 매스 어레이법에 의한 분석에 의해 수행될 수 있으며, 이 분석은 마커가 인지할 수 있는 유전자 변이 부분에서 서로 다른 단일 염기가 연장됨에 따라 질량의 변화가 생기면서 유전자 변이가 있는지 없는지를 판별하게 된다. 매스 어레이법에 의한 분석은 PCR로 SNP 사이트의 DNA 서열을 증폭 한 다음 단일 증폭 프라이머를 사용하여 PCR 산물을 증폭시켜 프라이머가 한베이스 만 확장되도록 한다. 확장된 생성물을 TOF (time of flight)로 분석하고, 염기의 분자량 차이에 따라 SNP를 분류하고, SNP 사이트의 대립 유전자 빈도를 계산하여 분석을 수행한다.For example, in the present invention, the step (b) may be performed by an analysis by a mass array method capable of performing SNP genotyping analysis by measuring a change in mass used to identify a specific sequence. In this analysis, a change in mass occurs as different single bases are extended in the region of the genetic variation that can be recognized by the marker, thereby determining whether there is a genetic variation. Analysis by mass array method amplifies the DNA sequence of the SNP site by PCR, and then amplifies the PCR product using a single amplification primer so that only one base of the primer is extended. The extended product is analyzed by TOF (time of flight), the SNP is classified according to the difference in molecular weight of the base, and the allele frequency of the SNP site is calculated to perform the analysis.
디데옥시뉴클레오티드는 분자량이 상이하며, 이는 질량분광계를 이용하는 단일-염기 신장 방법의 기본 원리가 되며, 신장된 올리고뉴클레오티드 프라이머의 질량을 근거로 하여 SNP 지노타이핑 분석은 예를 들어 매트릭스-보조 레이저 흡수/이온화 비행 시간 질량 분광계 (MALDI-TOF, matrix assisted laser desorption ionization-time of flight)를 통해 수행될 수 있다.Dideoxynucleotides differ in molecular weight, which is the basic principle of the single-base extension method using a mass spectrometer, and SNP genotyping analysis based on the mass of the elongated oligonucleotide primer can be performed, for example, by matrix-assisted laser absorption/ The ionization time of flight mass spectrometer (MALDI-TOF, matrix assisted laser desorption ionization-time of flight) can be performed.
MALDI-TOF 에 의한 미니서열분석 또는 마이크로서열분석은 통상의 기술자가 용이하게 이해하고, 이를 적절하게 변형하여 실시할 수 있으며, 예를 들어, MALDI-TOF 기법은 일부 변형하여 Sequenom사의 Mass Array Technology 또는 Agena bioscience사의 MassARRAY 시스템 등을 이용할 수 있다.The mini-sequencing analysis or micro-sequencing analysis by MALDI-TOF can be easily understood by a person skilled in the art, and can be performed by appropriately modifying it. For example, the MALDI-TOF technique is partially modified and Sequenom's Mass Array Technology or Agena bioscience's MassARRAY system can be used.
본 발명에서 상기 11종 이상이란, 예를 들어 11종, 12종, 13종, 14종, 15종, 16종, 17종, 18종, 19종, 20종, 21종, 22종, 23종, 24종 또는 25종일 수 있다. In the present invention, the above 11 types or more means, for example, 11 types, 12 types, 13 types, 14 types, 15 types, 16 types, 17 types, 18 types, 19 types, 20 types, 21 types, 22 types, 23 types , 24 types or 25 types may be used.
바람직하게는 상기 (b) 단계에서는 서열번호 1 내지 25로 표시되는 폴리뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택된 11종 이상의 SNP 마커에서 11번째 염기 서열을 상기 분리된 핵산에서 확인함으로써 개 개체 식별할 수 있다. 상기 22종 이상이란, 예를 들어 22종, 23종, 24종 또는 25종일 수 있다. Preferably, in step (b), the individual can be identified by confirming the eleventh nucleotide sequence in the separated nucleic acid from 11 or more SNP markers selected from the group consisting of polynucleotides represented by SEQ ID NOs: 1 to 25. The above 22 types or more may be, for example, 22 types, 23 types, 24 types or 25 types.
가장 바람직하게는, 상기 (b) 단계에서는 서열번호 1 내지 25의 폴리뉴클레오티드 각각에서 11번째 염기 서열을 상기 분리된 핵산에서 확인함으로써 개 개체를 식별할 수 있다.Most preferably, in step (b), the individual can be identified by confirming the eleventh nucleotide sequence in each of the polynucleotides of SEQ ID NOs: 1 to 25 in the isolated nucleic acid.
본 발명의 상기 개 개체 식별 방법은 상기 (b) 단계 이후에 개의 품종, 혈액형, 외형상 특징, 체중, 성별 및 나이로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 정보를 확인하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. The dog individual identification method of the present invention may further include the step of confirming one or more types of information selected from the group consisting of dog breed, blood type, appearance characteristics, weight, sex, and age after step (b). .
본 발명에서 상기 개의 품종은 그 종류가 특별히 제한되는 것은 아니나, 바람직하게는 비글(Beagle), 워터도그(Water dog), 말티즈(Maltese), 포메리안(Pomerian), 푸들(Poddle), 요크셔테리어(Yorkshireterrier), 시츄(Sichuan), 닥스훈트(Dachshund) 및 이들의 교잡종으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. In the present invention, the breed of the dog is not particularly limited, but preferably, Beagle, Water dog, Maltese, Pomerian, Poodle (Poddle), Yorkshire Terrier ( Yorkshireterrier), Shichuan, Dachshund, and hybrids thereof.
본 발명에서의 상기 개 개체 식별 결과는 당업계에 공지된 통상의 리포트 수단, 형식 및/또는 방법에 의해서 의뢰인에게 전달될 수 있으며, 예를 들어, 식별 결과는 전화, 편지, 이메일, 웹페이지 공개 등의 수단에 의해서 검사결과를 전달할 수 있다. The individual identification result in the present invention may be transmitted to the client by a conventional report means, format and/or method known in the art. For example, the identification result may be published by phone, letter, email, or web page. Inspection results can be delivered by means such as.
검사 결과는 필요에 따라서 식별 정도에 대한 수치화를 제공하거나, 식별 결과만을 제공할 수 있으며, 검사 결과에 접속될 수 있는 URL 주소 또는 바코드 (2차원 바코드 포함)의 형태도 포함될 수 있다. 아울러, 검사결과에는 개에 대한 정보 뿐만 아니라, 견주에 대한 정보도 아울러 포함될 수 있다If necessary, the inspection result may provide a numerical value for the degree of identification or may provide only the identification result, and may include a URL address or barcode (including a two-dimensional barcode) that can be accessed by the inspection result. In addition, the test result may include not only information about the dog, but also information about the dog's head.
본 발명이 제공하는 SNP 마커 및 이들의 조합을 이용하면 검출 대상 개체(개)를 다른 개체(개)로부터 정확하게 구분하여 식별할 수 있어, 개의 개체 식별 및 이력 관리에 매우 유용하게 활용될 수 있다. When the SNP markers and combinations thereof provided by the present invention are used, the object to be detected (dog) can be accurately distinguished from other individuals (dogs), and thus can be very usefully used in dog individual identification and history management.
도 1은 본 발명에 따른 마커 세트를 이용하여 식별하는 과정에 대한 하나의 예를 워크 플로우(Work flow) 형식으로 나타낸 것이다.
도 2는 6 마리의 개 세포주를 포함한 18 마리의 개 샘플에서 본 발명에 따른 마커를 선별한 것을 나타낸 것이다.
도 3은 샘플(18x2)의 유전자형 데이터(genotype data)를 나타낸 결과이다.
도 4는 25 개의 SNP 마커의 쌍으로 정렬(Pairwise-Alignment)에 대한 박스 플롯(box-plot) 결과이다.
도 5는 25 개의 SNP 마커 중에서 1개 내지 15개를 임의로 제거하여 조합을 하였을 때에 동일한 ID의 개를 식별할 수 있는 비율을 나타낸 도면이다. 1 shows an example of a process of identifying using a marker set according to the present invention in a form of a work flow.
2 shows the selection of the marker according to the present invention in 18 dog samples including 6 dog cell lines.
3 is a result showing genotype data of a sample (18x2).
4 is a box-plot result for pairwise-alignment of 25 SNP markers.
FIG. 5 is a diagram showing the ratio of identifying dogs of the same ID when 1 to 15 of 25 SNP markers are arbitrarily removed and combined.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 이에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, preferred embodiments are presented to aid in understanding the present invention. However, the following examples are provided for easier understanding of the present invention, and the content of the present invention is not limited thereby.
실험예 Experimental example
마커의 선별Selection of markers
개들의 게놈 정보는 2017년과 2018년에 발행된 NHGRI Dog Genome 프로젝트에서 다운로드 받았는데 2017년의 약 1355 개의 개 게놈 데이터와 2018년의 722 개의 개 게놈 데이터로 구성되었다. 약 127 개의 개 게놈 데이터를 iDOG (DOGSD)에서 다운로드 받았다. 참조 게놈은 CanFam 3.1.199에서 사용되었으며 개 품종 정보는 Dogbreedchart (http://www.dogbreedchart.com/)에서 수집되었다. 일반 명칭은 NHGRI Dog Genome 프로젝트와 Dogbreedchart 사이에서 추출되었다. 계통 별 정보는 계통 별 SNP를 사용하여 추정되었는데, 현재 품종 당 이용 가능한 표본 크기가 상대적으로 작기 때문에 전체 표식 선정 과정에 근친 교배 효과를 피할 수 있었다. 추후에 코호트 크기가 10 미만인 품종은 제거하여 ~ 66 품종만 남기었다. 결과적으로 품종 별 대립 유전자 빈도 (40 % ~ 60 %)와 표준 편차 (SD <0.25)에 근거하여 후보 마커를 선별하였다. 다른 선별 기준은 5'- 및 3 '말단 모두에서 100 뉴클레오타이드 근처의 말단에서 1-10bp 길이를 갖는 단 한 번의 반복을 허용하였다. 마커는 임의의 두 마커 사이의 거리를 기반으로 하여 1Mbps 이상으로 무작위로 선택하였다. 선택된 후보 마커에게서 플러스 및 마이너스 100bp 내에서 변이는 발견되지 않았다. 마지막으로, 이대립인자성(biallelic) 마커만 선택되었다. 모든 선별 단계 후에 총 25 개의 마커가 테스트를 위해 선택되었다.The genome information of dogs was downloaded from the NHGRI Dog Genome project published in 2017 and 2018, which consisted of about 1355 dog genome data from 2017 and 722 dog genome data from 2018. About 127 dog genomic data were downloaded from iDOG (DOGSD). The reference genome was used in CanFam 3.1.199 and dog breed information was collected from Dogbreedchart (http://www.dogbreedchart.com/). The generic name was extracted between the NHGRI Dog Genome project and Dogbreedchart. Line-by-line information was estimated using line-specific SNPs. Since the currently available sample size per cultivar is relatively small, the inbreeding effect could be avoided in the entire process of label selection. Later, cultivars with a cohort size of less than 10 were removed, leaving only ~66 cultivars. As a result, candidate markers were selected based on the allele frequency (40% ~ 60%) and standard deviation (SD <0.25) for each variety. Another selection criterion allowed only one repetition with a length of 1-10 bp at the end near 100 nucleotides at both the 5'- and 3'ends. Markers were randomly selected at 1 Mbps or more based on the distance between any two markers. No variations were found within plus and minus 100 bp in the selected candidate marker. Finally, only biallelic markers were selected. A total of 25 markers were selected for testing after all screening steps.
본 발명에서 선정된 25종의 마커를 하기 표 1에 나타내었다. 하기 표에서 [X/Y]는 염기 X가 염기 Y로 점돌연변이된 SNP임을 의미한다. The 25 markers selected in the present invention are shown in Table 1 below. In the following table, [X/Y] means that base X is a point-mutated SNP with base Y.
상기 각 SNP 마커의 구체적인 서열정보는 다음과 같다:The specific sequence information of each SNP marker is as follows:
(서열번호 1) AGGTCTCACT[A/G]TCAGTTGGGA(SEQ ID NO: 1) AGGTCTCACT[A/G]TCAGTTGGGA
(서열번호 2) GTTGTGGGAA[A/G]GCTCTTGTTT(SEQ ID NO: 2) GTTGTGGGAA[A/G]GCTCTTGTTT
(서열번호 3) CAACTGGCCC[A/T]TTGTGCAGAC(SEQ ID NO: 3) CAACTGGCCC[A/T]TTGTGCAGAC
(서열번호 4) TAAGACACTT[C/T]TGTGTGTGAA(SEQ ID NO: 4) TAAGACACTT[C/T]TGTGTGTGAA
(서열번호 5) TGACGGGTTG[C/T]ACAAGGAAGC(SEQ ID NO: 5) TGACGGGTTG[C/T]ACAAGGAAGC
(서열번호 6) GTTTTAACCA[C/T]CATCTTCAGG(SEQ ID NO: 6) GTTTTAACCA[C/T]CATCTTCAGG
(서열번호 7) CTTGTTAGCT[A/G]TCCTTATCAC(SEQ ID NO: 7) CTTGTTAGCT[A/G]TCCTTATCAC
(서열번호 8) CCCCTCGCCC[A/G]GTACCCCAGG(SEQ ID NO: 8) CCCCTCGCCC[A/G]GTACCCCAGG
(서열번호 9) CACAGTGCTC[C/T]TAAGATGCTG(SEQ ID NO: 9) CACAGTGCTC[C/T]TAAGATGCTG
(서열번호 10) TTAATAGCAA[C/T]CACACATACT(SEQ ID NO: 10) TTAATAGCAA[C/T]CACACATACT
(서열번호 11) CTCTGCCACC[A/G]TTGGCCTGGA(SEQ ID NO: 11) CTCTGCCACC[A/G]TTGGCCTGGA
(서열번호 12) GGGCCCTGAC[C/T]GCTCTAGTCC(SEQ ID NO: 12) GGGCCCTGAC[C/T]GCTCTAGTCC
(서열번호 13) GAGGATAGGG[A/G]TTATGCAAAT(SEQ ID NO: 13) GAGGATAGGG[A/G]TTATGCAAAT
(서열번호 14) CCACTTGCTC[A/G]GAGGCGGAAT(SEQ ID NO: 14) CCACTTGCTC[A/G]GAGGCGGAAT
(서열번호 15) GATATTTGGG[G/T]TAGTGGAACA(SEQ ID NO: 15) GATATTTGGG[G/T]TAGTGGAACA
(서열번호 16) GAAATGAGGA[C/T]GGTTTGAGAA(SEQ ID NO: 16) GAAATGAGGA[C/T]GGTTTGAGAA
(서열번호 17) CATCAGAAAA[A/C]ACAAGTGAAG(SEQ ID NO: 17) CATCAGAAAA[A/C]ACAAGTGAAG
(서열번호 18) TGGTCCCGCC[A/G]TCATCTATTT(SEQ ID NO: 18) TGGTCCCGCC[A/G]TCATCTATTT
(서열번호 19) AATGCTCAAC[A/G]GTAAAACCCA(SEQ ID NO: 19) AATGCTCAAC[A/G]GTAAAACCCA
(서열번호 20) GTCACTCTGT[G/T]AGCCTATCAA(SEQ ID NO: 20) GTCACTCTGT[G/T]AGCCTATCAA
(서열번호 21) TATTGTCACA[C/T]AGAGGTAGTG(SEQ ID NO: 21) TATTGTCACA[C/T]AGAGGTAGTG
(서열번호 22) AGATACATTC[C/T]ATTCACTCAG(SEQ ID NO: 22) AGATACATTC[C/T]ATTCACTCAG
(서열번호 23) AGGGAGTACA[A/G]AGTACCTTGG(SEQ ID NO: 23) AGGGAGTACA[A/G]AGTACCTTGG
(서열번호 24) CAGACATATC[C/T]TGGGTGAGAA(SEQ ID NO: 24) CAGACATATC[C/T]TGGGTGAGAA
(서열번호 25) TGGATAAGAG[A/G]CTACAGGTAG(SEQ ID NO: 25) TGGATAAGAG[A/G]CTACAGGTAG
분석 디자인Analysis design
30-plex iPLEX pro genotyping을 위한 정방향(forward), 역방향(reverse) 및 연장(extension) primer는 AgenaCx Assay Design Suite를 사용하여 디자인되었다. 고급 매개 변수에서, Amplicon PCR 프라이머 포텐셜(potential), Extend primer 포텐셜(potential) 및 거짓 프라이밍(False priming) 및 헤어핀/이량체 연장(Hairpin/dimer extension) 모두에 대한 다중 평가 포텐셜(Multiplex evaluation potential)은 0.9의 컷오프(cut-off)로 설정되었다. 최적의 용융 온도는 60 ℃로 선택되었고, 질량 범위는 3000-10,000Da로 선택되었으며, 분석물의 최소 질량 차이는 10Da 이 나도록 선택되었다. 실험 검증에서, 프라이머는 적용 범위(coverage) 및 콜-레이트(call-rate)에 기초하여 제거되었다. 마지막으로 높은 적용 범위와 낮은 콜-레이트를 기준으로 단일 25-plex 분석법을 최종 선택하였다.Forward, reverse, and extension primers for 30-plex iPLEX pro genotyping were designed using AgenaCx Assay Design Suite. In advanced parameters, the Amplicon PCR primer potential, Extend primer potential and Multiple evaluation potential for both False priming and Hairpin/dimer extension are: It was set to a cut-off of 0.9. The optimum melting temperature was chosen to be 60 °C, the mass range was chosen to be 3000-10,000 Da, and the minimum mass difference of the analyte was chosen to be 10 Da. In experimental validation, primers were removed based on coverage and call-rate. Finally, a single 25-plex assay was finally selected based on high coverage and low coll-rate.
개의 DNA 준비DNA preparation in dogs
면봉을 이용하여 개의 구강에서 샘플을 채취하고, 이로부터 QIAamp DNA Mini 키트를 사용하여 제조사 프로토콜에 따라 gDNA를 추출하였다. 2μl 당 적어도 10ng /웰이 필요하였다. 각각의 샘플에 대해 적어도 5 ng/μL의 희석 배수를 만들었다. 유효성 검정 실험을 위해 18 개의 샘플을 중복하여 사용하였으며 이들 중 표1에 나타낸 1~6번은 세포주이며, 7~12번은 개의 구강에서 채취한 샘플이다(표 2).A sample was taken from the dog's mouth using a cotton swab, and gDNA was extracted from it using the QIAamp DNA Mini kit according to the manufacturer's protocol. At least 10 ng/well per 2 μl was required. A dilution factor of at least 5 ng/μL was made for each sample. For the efficacy assay experiment, 18 samples were used in duplicate. Among them, Nos. 1 to 6 shown in Table 1 are cell lines, and Nos. 7 to 12 are samples taken from the mouth of a dog (Table 2).
프라이머 풀링(Primer pooling), PCR, SAP 처리 & 연장Primer pooling, PCR, SAP treatment & extension
25-플렉스 PCR 증폭을 위해, 25개의 정방향 및 25개의 역방향 프라이머를 100μM의 비축물(stock)에서 모았다. 다중 PCR 증폭은 제조자의 프로토콜에 따라 수행하였다. 그 후, SAP 처리를 수행하였다. 25-플렉스 연장 반응의 경우, 처음 25 개의 연장 프라이머를 100μM의 비축물에서 모았다. iPLEX Pro 연장 칵테일 믹스는 RNAse free water 0.62μl, iPLEX buffer plus 0.2μl, iPLEX termination mix 0.2μl, iPLEX 프로-효소(iPLEX pro-enzyme) 0.04μl 및 1.88μl 연장 프라이머 믹스(extend primer mix)를 첨가하여 사전 준비하였다. 제조사 프로토콜에 따라 열 순환기 프로그래밍(thermal cycler programming)을 사용하였다. For 25-plex PCR amplification, 25 forward and 25 reverse primers were pooled in a 100 μM stock. Multiple PCR amplification was performed according to the manufacturer's protocol. Then, SAP treatment was performed. For the 25-plex extension reaction, the first 25 extension primers were collected in a stock of 100 μM. iPLEX Pro extension cocktail mix was added with 0.62 μl of RNAse free water, 0.2 μl of iPLEX buffer plus, 0.2 μl of iPLEX termination mix, 0.04 μl of iPLEX pro-enzyme, and 1.88 μl of extend primer mix. I prepared in advance. Thermal cycler programming was used according to the manufacturer's protocol.
데이터 분석Data analysis
TyperAnalyzer 소프트웨어는 일단 칩이 활성화되면 유전자형 영역 보고서를 제공한다. 이는 또한 분석 요약 및 샘플 요약을 제공한다.TyperAnalyzer software provides a genotype region report once the chip is activated. It also provides an analysis summary and a sample summary.
Mass ArrayMass Array
고 처리량(high-throughput)으로 SNP를 분석하기 위하여, Complete iPLEX pro genotyping mass array (10 X 96 CPM)분석을 수행하였다. 본 발명에 사용된 Complete iPLEX pro genotyping mass array는 한번에 mass array를 한 장에서 최대 2장까지 동시에 실험할 수 있으므로, 192개의 시료를 25 개의 SNP를 동시에 분석하는 것이 가능하다. In order to analyze SNPs with high-throughput, Complete iPLEX pro genotyping mass array (10
분석을 위해서 먼저 핵산 샘플을 준비하였다. 이를 위하여 시료로부터 DNA를 분리하여 원하는 부위를 multiplex PCR 로 증폭한 뒤, SAP 처리 후 기존에 남아있는 PCR 성분인 증폭반응에 이용될 수 있는 dNTP를 제거하고, extension primer 를 넣어주어 extension 반응을 유도하여 변이 위치에 1개의 base가 연장되도록 반응하여 시료를 준비하였다. 준비된 시료가 준비된 플레이트를 Mass Array 기기에 넣고, complete iPLEX pro genotyping massarray chip 을 기기에 넣어주고 제공된 기기 작동 절차에 따라 각 웰(well) 안에 포함된 extension 된 primer 의 mass를 측정하여 각 추출된 DNA 의 genotype을 판별하였다. For analysis, a nucleic acid sample was first prepared. To this end, DNA is separated from the sample, the desired site is amplified by multiplex PCR, dNTP, which can be used in the amplification reaction, which remains after SAP treatment, is removed, and extension primer is added to induce extension reaction. A sample was prepared by reacting to extend one base at the mutation position. Put the prepared sample prepared plate into the Mass Array device, insert the complete iPLEX pro genotyping massarray chip into the device, and measure the mass of the extended primer included in each well according to the provided device operating procedure. The genotype was determined.
품질 관리Quality Management
샘플 콜레이트(call rate)가 96 % -100 %인 경우 즉, 25 건의 콜(call) 중에서 하나의 노-콜(no-call)이 있을 경우 샘플은 품질 관리를 통과한 것으로 간주되었다. 샘플 콜레이트가 96 % 미만, 즉 2 번 이상의 노-콜(no-call) 샘플은 품질 제어에 실패한 것으로 간주되었다. 이 경우 샘플의 재처리가 필요하였다.When the sample call rate is 96%-100%, that is, when there is one no-call out of 25 calls, the sample was considered to have passed quality control. No-call samples with a sample collate of less than 96%,
실시예 1: 후보 마커 선별Example 1: Selection of candidate markers
도 1과 같이, 후보 마커를 선별하였고 이때 도 2와 같이 다른 개의 샘플을 식별하였다. 6개의 세포주를 포함한 총 18개의 개 샘플을 모집하였다. 후보 마커는 6 마리의 개 세포주를 포함한 18 마리의 개 샘플에서 테스트되었고, 이 중 14 개의 샘플, 3 개의 샘플 및 1 개의 샘플은 각각 100 %, 97.22 % 및 89 %의 적용 범위를 가지는 것을 확인하였다(표 3).As shown in FIG. 1, candidate markers were selected, and at this time, different samples were identified as shown in FIG. 2. A total of 18 samples including 6 cell lines were recruited. Candidate markers were tested in 18 dog samples including 6 dog cell lines, of which 14 samples, 3 samples and 1 sample were found to have coverage of 100%, 97.22% and 89%, respectively. (Table 3).
마찬가지로 12 개의 표본, 5 개의 표본 및 1 개의 표본은 각각 100 %, 96 % 및 92 % 콜레이트를 가지는 것을 확인하였다(표 4).Similarly, it was confirmed that 12 samples, 5 samples and 1 sample had 100%, 96% and 92% cholate, respectively (Table 4).
유전자 일련번호 20의 분석의 경우 "37_18379068" 중 36개의 샘플(18개의 샘플은 중복)에서 4 번의 노-콜을 보여주었던 것처럼, 25개의 모든 assays는 0에서 한번의 노-콜로 양호한 것으로 판명되었다(표 3). 실험에 사용한 개 샘플의 특성 정보는 상기 표 2에 나타내었다. 약 12 개의 개 구강 내 면봉 샘플과 6 개의 개 세포주 샘플을 본 실험에 사용하였다. 더불어 36 샘플(18 샘플 중복)의 유전자형 데이터를 도 3에 나타내었다. 이때 노란색 상자는 노-콜을 나타낸다.As for the analysis of gene
실시예 2: 재현성 검증Example 2: Reproducibility verification
재현성을 확인하기 위해, 18개의 샘플을 중복하여 사용하였고, 2개의 상이한 실험 플레이트를 상이한 시간에 제조하였다. 샘플의 콜레이트를 표 5에 나타내었다. 그 결과 표 5와 같이, 본 발명에 따른 마커는 높은 재현성을 보여주는 것을 확인하였다.To confirm reproducibility, 18 samples were used in duplicate, and two different experimental plates were prepared at different times. The cholate of the sample is shown in Table 5. As a result, as shown in Table 5, it was confirmed that the marker according to the present invention shows high reproducibility.
번호number
실시예 3: 쌍으로 정렬(Pairwise-Alignment)Example 3: Pairwise-Alignment
가장 좋은 매치(match)를 찾기 위해, 25 개의 마커들 사이에서 쌍으로 정렬(pairwise alignment)을 수행하여 그 결과를 도 4에 나타내었다. (DUP:중복(Duplicates), PO: 친자(Parent-Offspring), FS:완전한 형제자매(Full-Sibling), 2nd:2번째 친족관계(2nd Kinship)).In order to find the best match, pairwise alignment was performed between 25 markers and the results are shown in FIG. 4. (DUP: Duplicates, PO: Parent-Offspring, FS: Full-Sibling, 2nd: 2nd Kinship).
도 4의 박스-플롯(box-plot)은 ~ 97.16 % 인 쌍둥이(twins) 또는 반복 샘플 사이의 동일성을 나타낸다. 패밀리 내 동일성(identity)은 ~ 100 %이다. 더불어 하기 수학식 1을 사용하여 쌍으로 정렬을 계산하였다(G: Genotype, i:i차 마커, n:총 마커 사이즈).The box-plot in FIG. 4 shows the identity between twins or repeat samples, which is ˜97.16%. The identity within the family is ~100%. In addition, the alignment was calculated in pairs using the following Equation 1 (G: Genotype, i: order i marker, n: total marker size).
[수학식 1][Equation 1]
실시예 4: SNP 마커의 조합 및 노콜의 영향Example 4: Influence of Combination of SNP Markers and No Call
무작위 선택 마커를 연속적으로 제거하여 얻은 동일한 개들의 백분율을 도 5에 나타내었다. 이는 실험적 오류(no-call)가 2k 개의 분류 능력에 미치는 영향을 보여준다. The percentage of identical dogs obtained by successively removing randomly selected markers is shown in FIG. 5. This shows the effect of experimental error (no-call) on the 2k classification ability.
도 5의 결과를 참고할 때, 상기 본원발명에서 선별된 25종의 마커들 중에서 선택된 11종 이상의 마커 조합을 통하여 특정 개체를 96% 이상 식별할 수 있어 그 유용성을 확인할 수 있었다. 특히, 25종의 마커들 중에서 선택된 22종 이상의 마커 조합을 이용할 경우 거의 100%에 가까운 개체 식별률(identification(%))을 얻을 수 있었다. Referring to the results of FIG. 5, it was possible to identify a specific individual by 96% or more through a combination of 11 or more markers selected from among 25 markers selected in the present invention, and thus its usefulness could be confirmed. In particular, when using a combination of 22 or more markers selected from 25 types of markers, an individual identification rate (%) close to 100% could be obtained.
본 발명이 제공하는 SNP 마커 및 이들의 조합을 이용하면 검출 대상 개체(개)를 다른 개체(개)로부터 정확하게 구분하여 식별할 수 있어, 개의 개체 식별 및 이력 관리에 매우 유용하게 활용될 수 있어 관련 산업분야에서의 이용가능성이 매우 높다. If the SNP marker provided by the present invention and a combination thereof are used, the object to be detected (dog) can be accurately distinguished from other individuals (dogs), and thus it can be very usefully used for individual identification and history management of dogs. It has very high availability in the industrial field.
<110> EONEDIAGNOMICS CO., LTD <120> Animal Identification Method using SNP marker <130> NP19-0024P <150> KR 1020190021454 <151> 2019-02-22 <160> 25 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NCBI dbSNP rs9003200 <220> <221> allele <222> (11) <223> A or G <400> 1 aggtctcact ntcagttggg a 21 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NCBI dbSNP rs24505456 <220> <221> allele <222> (11) <223> A or G <400> 2 gttgtgggaa ngctcttgtt t 21 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NCBI dbSNP rs24453667 <220> <221> allele <222> (11) <223> A or T <400> 3 caactggccc nttgtgcaga c 21 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NCBI dbSNP rs22165472 <220> <221> allele <222> (11) <223> C or T <400> 4 taagacactt ntgtgtgtga a 21 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NCBI dbSNP rs22185491 <220> <221> allele <222> (11) <223> C or T <400> 5 tgacgggttg nacaaggaag c 21 <210> 6 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<213> Artificial Sequence <220> <223> NCBI dbSNP rs23263269 <220> <221> allele <222> (11) <223> C or T <400> 16 gaaatgagga nggtttgaga a 21 <210> 17 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NCBI dbSNP rs23289625 <220> <221> allele <222> (11) <223> A or C <400> 17 catcagaaaa nacaagtgaa g 21 <210> 18 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NCBI dbSNP rs9161359 <220> <221> allele <222> (11) <223> A or G <400> 18 tggtcccgcc ntcatctatt t 21 <210> 19 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NCBI dbSNP rs23486614 <220> <221> allele <222> (11) <223> A or G <400> 19 aatgctcaac ngtaaaaccc a 21 <210> 20 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NCBI dbSNP rs23679340 <220> <221> allele <222> (11) <223> G or T <400> 20 gtcactctgt nagcctatca a 21 <210> 21 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NCBI dbSNP rs23705227 <220> <221> allele <222> (11) <223> C or T <400> 21 tattgtcaca nagaggtagt g 21 <210> 22 <211> 21 <212> DNA 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Claims (11)
(a) 개 게놈 데이터 세트에서 혈연 관계를 가지는 개체 및 코호트 크기가 10미만인 품종의 개체의 데이터를 삭제하여 개체 식별용 게놈 데이터 세트를 제조하는 단계;
(b) 상기 개체 식별용 게놈 데이터 세트에서 이대립인자(biallelic)이며, 개 품종 별 대립 유전자 빈도가 40~60%이고, minor allele frequency의 표준편차가 0.25 미만인 SNP를 선별하는 단계;
(c) 상기 (b) 단계에서 선별된 SNP에서 인접한 SNP의 거리가 1Mbp 이하인 SNP 또는 5' 방향 및 3' 방향으로 각각 90bp 이내에 반복 서열을 가지는 SNP를 제외시키는 단계;
(d) 상기 (c) 단계에서 선별된 SNP를 포함하는 200bp 이내에 변이가 없는 SNP를 선별하는 단계; 및
(e) 상기 선별된 SNP를 11개 내지 25개로 조합하여 개 개체 식별용 SNP 마커 세트를 구성하는 단계.
A set of SNP markers for identification of dog individuals constructed according to a method comprising the following steps:
(a) preparing a genomic data set for individual identification by deleting data of an individual having a kinship relationship and an individual of a breed with a cohort size of less than 10 from the dog genome data set;
(b) selecting SNPs in the genome data set for individual identification, which are biallelic, have an allele frequency of 40-60% for each dog breed, and a standard deviation of the minor allele frequency of less than 0.25;
(c) excluding SNPs having a distance of 1 Mbp or less of adjacent SNPs in the SNPs selected in step (b), or SNPs having repeating sequences within 90 bp in each of the 5'and 3'directions;
(d) selecting a SNP without mutation within 200bp including the SNP selected in step (c); And
(e) constructing a set of SNP markers for individual identification by combining the selected SNPs into 11 to 25.
The method of claim 1, wherein the SNP marker comprises a polynucleotide consisting of 5 or more consecutive bases including the 11th base in 11 or more polynucleotides selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1 to 25, or a polynucleotide complementary thereto. A set of SNP markers for individual identification of dogs, characterized in that.
A composition for identification of dogs comprising an agent capable of detecting or amplifying the set of SNP markers for identification of dogs of any one of claims 1 to 3.
The dog individual according to claim 4, wherein the agent capable of detecting or amplifying the SNP marker is a primer or probe that specifically binds to the SNP marker or amplifies a polynucleotide containing the SNP marker. Identification composition.
Dog individual identification kit comprising the composition of claim 4.
(b) 서열번호 1 내지 25로 표시되는 폴리뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택된 11종 이상의 SNP 마커에서 11번째 염기 서열을 상기 분리된 핵산에서 확인하는 단계를 포함하는 개 개체 식별 방법.
(a) isolating the nucleic acid from the dog for which the individual is to be identified; And
(b) a method for identifying a dog, comprising the step of identifying an 11th nucleotide sequence from the isolated nucleic acid from 11 or more SNP markers selected from the group consisting of polynucleotides represented by SEQ ID NOs: 1 to 25.
The dog individual according to claim 7, wherein in the step (a), the nucleic acid is isolated from at least one selected from the group consisting of dog blood, epidermis, urine, feces, coat, saliva, oral cells, muscles and organs. Identification method.
The method of claim 7, wherein the method of determining the 11th nucleotide sequence in the polynucleotide is fluorescence in situ hybridization (FISH), DNA sequencing, PFGE analysis, Southern blot analysis, single-stranded conformation analysis (SSCA), RNase protection. Analysis, dot blot analysis, denatured gradient gel electrophoresis (DGGE), a method using a protein that recognizes nucleotide mismatches, an allele-specific probe hybridization, an allele-specific amplification method (allele- specific amplification), 5'nuclease digestion, molecular beacon assay, oligonucleotide ligation assay, size analysis, single-stranded conformation Polymorphism (single-stranded conformation polymorphism), allele-specific PCR method and mass array method (mass array), characterized in that selected from the group consisting of individual identification method.
The dog of claim 7, further comprising the step of confirming at least one type of information selected from the group consisting of dog breed, blood type, appearance characteristics, weight, sex, and age after step (b). Object identification method.
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