KR20200088878A - 뇌하수체 조직을 포함하는 세포괴의 제조 방법 및 그 세포괴 - Google Patents

뇌하수체 조직을 포함하는 세포괴의 제조 방법 및 그 세포괴 Download PDF

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Abstract

본 발명은 다능성 줄기 세포로부터 뇌하수체 조직을 포함하는 세포괴를 효율적으로 제조하는 기술을 제공하는 것을 과제로 한다.
하기 공정 (1) 및 (2) 를 포함하는, 뇌하수체 조직을 포함하는 세포괴의 제조 방법;
(1) 다능성 줄기 세포를 Wnt 신호 전달 경로 저해 물질의 존재 하에 부유 배양하여 세포 응집체를 형성시키는 제 1 공정,
(2) 제 1 공정에서 얻어진 응집체를 BMP 신호 전달 경로 활성화 물질 및 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질의 존재 하에 부유 배양하여 뇌하수체 조직을 포함하는 세포괴를 얻는 제 2 공정.

Description

뇌하수체 조직을 포함하는 세포괴의 제조 방법 및 그 세포괴
본 발명은 뇌하수체 조직을 포함하는 세포괴의 제조 방법 및 그 세포괴에 관한 것이다. 또한, 신경계 세포 또는 신경 조직, 뇌하수체 조직, 및 간엽계 세포를 포함하는 세포괴에 관한 것이다.
뇌하수체는 두부에 존재하는 내분비 기관이며, 부신피질 자극 호르몬 (ACTH), 성장 호르몬 등 생체의 유지, 성장에 중요한 각종 뇌하수체 호르몬을 생산한다. 뇌하수체의 형성 부전이나 뇌하수체 기능 저하증, 뇌하수체 선종 등의 질환에 의해 뇌하수체 기능 부전이 발생한 경우, 성장 장애, 생식기 관련 이상, 부신이나 갑상선의 이상과 같은 심각한 증상이 발생한다. 일반적으로 장해를 받은 뇌하수체 조직이 자연스럽게 재생 기능을 회복하는 것은 드물다.
특허문헌 1 및 비특허문헌 1, 2 에는 인간 다능성 줄기 세포를 BMP 신호 전달 경로 저해 인자 또는 활성 인자, 소닉 헤지호그 (본 명세서에서 Shh 로 기재할 수 있다) 신호 전달 경로 활성 인자, 및 TGF-β 신호 전달 경로 저해 물질의 존재 하에 분화 유도함으로써 뇌하수체 세포를 포함하는 두부 플라코드 유래 세포를 제조한 것이 보고되고 있다. 그러나 제조된 세포는 이차원으로 배양된 것이며, 기능 발휘에 중요한 생체의 복잡한 뇌하수체 조직의 구조를 재현하지 못하고 있다. 따라서 효율적으로 삼차원의 뇌하수체 조직을 제조할 수 있는 방법이 요구되고 있었다.
특허문헌 1: JP-A-2016-538856
비특허문헌 1: Dincer et al. Cell Reports 5, 1387-1402, 2013. 비특허문헌 2: Zimmer et al. Stem Cell Reports 6, 858-872, 2016
본 발명의 목적은 다능성 줄기 세포로부터 뇌하수체 조직을 포함하는 세포괴를 효율적으로 제조하는 방법을 제공하는 것이다. 특히, 뇌하수체 조직 줄기 세포를 조직 중에 함유하는 고품질 뇌하수체 조직을 포함하는 세포괴를 효율적으로 제조하는 방법을 제공하는 것이다. 구체적으로는, 피더-프리 배양된 다능성 줄기 세포를 출발 재료로 사용할 수 있고, 고가인 재조합 단백질의 사용량을 저감하여 보다 저가로 세포 덩이를 효율적으로 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명자는 상기 과제를 해결하기 위해 검토를 거듭한 결과, 다능성 줄기 세포를 Wnt 신호 전달 경로 저해 물질의 존재 하에 부유 배양하고, BMP 신호 전달 경로 활성화 물질 및 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질을 첨가함으로써 뇌하수체 조직을 포함하는 세포괴를 효율적으로 제조할 수 있는 것을 발견했다. 또한, 상기 Wnt 신호 전달 경로 저해 물질의 존재 하에 부유 배양하기 전에 다능성 줄기 세포를 피더 세포의 비존재 하에 1) TGFβ 패밀리 신호 전달 경로 저해 물질 및/또는 소닉 헤지호그 신호 경로 활성화 물질, 및 2) 미분화 상태 유지 인자를 포함하는 배지에서 배양함으로써 세포괴의 제조 효율을 향상시킬 수 있는 것으로 밝혀졌다. 또한, BMP 신호 전달 경로 활성화 물질의 첨가 조건을 최적화하고, 부유 배양 개시후 72 시간 이내인 최적의 첨가 시기를 동정함으로써, 종래보다 낮은 농도의 BMP4 에 의한 뇌하수체 조직의 분화 유도에 성공했다. 즉, 본 발명은 이하에 관한 것이다.
[1] 하기 공정 (1) 및 (2) 를 포함하는, 뇌하수체 조직을 포함하는 세포괴의 제조 방법;
(1) 다능성 줄기 세포를 Wnt 신호 전달 경로 저해 물질의 존재 하에 부유 배양하여 세포 응집체를 형성시키는 제 1 공정,
(2) 제 1 공정에서 얻어진 응집체를 BMP 신호 전달 경로 활성화 물질 및 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질의 존재 하에 부유 배양하여 뇌하수체 조직을 포함하는 세포괴를 얻는 제 2 공정.
[2] 하기 공정 (a), (1) 및 (2) 를 포함하는, 뇌하수체 조직을 포함하는 세포괴의 제조 방법;
(a) 다능성 줄기 세포를 피더 세포의 비존재 하에 1) TGFβ 패밀리 신호 전달 경로 저해 물질 및/또는 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질, 및 2) 미분화 상태 유지 인자를 포함하는 배지에서 배양하는 공정 a,
(1) 공정 a 에서 배양된 다능성 줄기 세포를 Wnt 신호 전달 경로 저해 물질의 존재 하에 부유 배양하여 세포 응집체를 형성시키는 제 1 공정,
(2) 제 1 공정에서 얻어진 응집체를 BMP 신호 전달 경로 활성화 물질 및 소닉 헤지호그 신호 경로 활성화 물질의 존재 하에 부유 배양하여 뇌하수체 조직을 함유하는 세포괴를 얻는 제 2 공정.
[3] 하기 공정 (1), (2-1) 및 (2-2) 를 포함하는, 뇌하수체 조직을 포함하는 세포괴의 제조 방법;
(1) 다능성 줄기 세포를 Wnt 신호 전달 경로 저해 물질의 존재 하에 부유 배양하여 세포 응집체를 형성시키는 제 1 공정,
(2-1) 제 1 공정에서 얻어진 응집체를 BMP 신호 전달 경로 활성화 물질 및 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질의 존재 하에 부유 배양하는 제 2 공정 (1),
(2-2) 제 2 공정 (1) 에서 부유 배양된 응집체를 BMP 신호 전달 경로 저해 물질의 존재 하에 부유 배양하여 뇌하수체 조직을 포함하는 세포괴를 얻는 제 2 공정 (2).
[4] 하기 공정 (a), (1), (2-1) 및 (2-2) 를 포함하는, 뇌하수체 조직을 포함하는 세포괴의 제조 방법;
(a) 다능성 줄기 세포를 피더 세포의 비존재 하에 1) TGFβ 패밀리 신호 전달 경로 저해 물질 및/또는 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질, 및 2) 미분화 상태 유지 인자를 포함하는 배지에서 배양하는 공정 a,
(1) 공정 a 에서 배양된 다능성 줄기 세포를 Wnt 신호 전달 경로 저해 물질의 존재 하에 부유 배양하여 세포 응집체를 형성시키는 제 1 공정,
(2-1) 제 1 공정에서 얻어진 응집체를 BMP 신호 전달 경로 활성화 물질 및 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질의 존재 하에 부유 배양하는 제 2 공정 (1),
(2-2) 제 2 공정 (1) 에서 얻어진 응집체를 BMP 신호 전달 경로 저해 물질의 존재 하에 부유 배양하여 뇌하수체 조직을 포함하는 세포괴를 얻는 제 2 공정 (2).
[5] 상기 공정 (2) 또는 공정 (2-1) 에서의 BMP 신호 전달 경로 활성화 물질이 상기 공정 (1) 에서 다능성 줄기 세포의 부유 배양 개시시부터 0.5 시간 이후 72 시간 이내에 첨가되는 것을 특징으로 하는 [1] - [4] 중 어느 하나에 기재된 제조 방법.
[6] 상기 공정 (2) 또는 공정 (2-1) 에서의 BMP 신호 전달 경로 활성화 물질이 상기 공정 (1) 에서 형성된 응집체의 표층 세포의 10% 이상이 밀착 결합을 형성하고 있는 기간 내에 첨가되는 것을 특징으로 하는 [1] - [4] 중 어느 하나에 기재된 제조 방법.
[7] 상기 BMP 신호 전달 경로 활성화 물질이 BMP2, BMP4, BMP7 및 GDF7 로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 1 종의 단백질인 [1] - [6] 중 어느 하나에 기재된 제조 방법.
[8] 상기 BMP 신호 전달 경로 활성화 물질이 BMP4 인 [1] - [7] 중 어느 하나에 기재된 제조 방법.
[9] 상기 공정 (2) 또는 공정 (2-1) 에서 부유 배양이 상기 BMP4 의 농도가 10 pM - 5 nM 인 배지에서 이루어지는 것을 특징으로 하는 [8] 에 기재된 제조 방법.
[10] 상기 공정 (2-2) 에서 BMP 신호 전달 경로 저해 물질의 첨가가 상기 공정 (2-1) 에서 BMP 신호 전달 경로 활성화 물질의 첨가로부터 12 시간 이후 20 일 이내에 실시되는 것을 특징으로 하는 [3] - [9] 중 어느 하나에 기재된 제조 방법.
[11] 상기 Wnt 신호 전달 경로 저해 물질이 비고전적 Wnt 경로에 대한 저해 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 [1] - [10] 중 어느 하나에 기재된 제조 방법.
[12] 상기 Wnt 신호 전달 경로 저해 물질이 PORCN 저해제인 것을 특징으로 하는 [1] - [11] 중 어느 하나에 기재된 제조 방법.
[13] 상기 PORCN 저해제가 IWP-2, IWP-3, IWP-4, IWP-L6, IWP-12, LGK-974, Wnt-C59, ETC-159 및 GNF-6231 으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 1 종의 화합물인 것을 특징으로 하는 [12] 에 기재된 제조 방법.
[14] 상기 Wnt 신호 전달 경로 저해 물질이 KY-02111 또는 KY-03-I 인 것을 특징으로 하는 [1] - [11] 중 어느 하나에 기재된 제조 방법.
[15] 상기 Wnt 신호 전달 경로 저해 물질이 TANK 저해제인 것을 특징으로 하는 [1] - [10] 중 어느 하나에 기재된 제조 방법.
[16] 상기 TANK 저해제가 IWR1-endo, XAV939 및 MN-64 로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 1 종의 화합물인 것을 특징으로 하는 [15] 에 기재된 제조 방법.
[17] 상기 공정 (1), (2), (2-1) 및 (2-2) 에서의 부유 배양이 TGFβ 신호 전달 경로 저해 물질의 추가의 존재 하에 수행되는 것을 특징으로 하는 [1] - [16] 중 어느 하나에 기재된 제조 방법.
[18] 상기 TGFβ 신호 전달 경로 저해 물질이 Alk5/TGFβR1 저해제인 것을 특징으로 하는 [17] 에 기재된 제조 방법.
[19] 상기 Alk5/TGFβR1 저해제가 SB431542, SB505124, SB525334, LY2157299, GW788388, LY364947 SD-208, EW-7197, A 83-01 및 RepSox 로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 1 종의 화합물인 것을 특징으로 하는 [18] 에 기재된 제조 방법.
[20] 상기 TGFβ 신호 전달 경로 저해 물질이 SMAD3 저해제인 것을 특징으로 하는 [17] 에 기재된 제조 방법.
[21] 상기 SMAD3 저해제가 SIS3 인 것을 특징으로 하는 [20] 에 기재된 제조 방법.
[22] 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질이 SAG, 퍼모파민 (Purmorphamine) 및 GSA-10 로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 1 종의 화합물인 것을 특징으로 하는 [1] - [21] 중 어느 하나에 기재된 제조 방법.
[23] 상기 공정 (a) 에서 배지에 포함된 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질의 농도가 10 nM 내지 700 nM 의 SAG 에 상당하는 소닉 헤지호그 신호 전달 촉진 활성을 갖는 농도인 것을 특징으로 하는 [22] 에 기재된 제조 방법.
[24] 상기 공정 (2) 또는 공정 (2-1) 의 배지에 포함된 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질의 농도가 100 nM 내지 3 μM 의 SAG 에 상당하는 소닉 헤지호그 신호 전달 촉진 활성을 갖는 농도인 것을 특징으로 하는, [22] 또는 [23] 에 기재된 제조 방법.
[25] 상기 BMP 신호 전달 경로 저해 물질은 I 형 BMP 수용체 저해제를 포함하는 [3] - [24] 중 어느 하나에 기재된 제조 방법.
[26] 상기 I 형 BMP 수용체 저해제는 K02288, 도르소모르핀 (Dorsomorphin), LDN-193189, LDN-212854, LDN-214117, ML347, DMH1 및 DMH2 로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나인 [25] 에 기재의 제조 방법.
[27] 상기 I 형 BMP 수용체 저해제는 K02288 을 포함하고, 상기 K02288 의 농도가 10 nM - 50 μM 인 배지에서 상기 공정 (2-2) 를 개시하는 [25] 또는 [26] 에 기재된 제조 방법.
[28] 상기 공정 (1), (2), (2-1) 및 (2-2) 로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 공정이 FGF 신호 전달 경로 활성화 물질의 존재 하에 수행되는 것을 특징으로 하는 [1] - [27] 중 어느 하나에 기재된 제조 방법.
[29] 상기 공정 (2-2) 가 FGF 신호 전달 경로 활성화 물질의 존재 하에 수행되는 것을 특징으로 하는 [3] - [27] 중 어느 하나에 기재된 제조 방법.
[30] 상기 FGF 신호 전달 경로 활성화 물질은 FGF2 및 FGF8, 및 이들의 변이체로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나를 포함하는, [28] 또는 [29] 에 기재된 제조 방법.
[31] 상기 공정 (1), (2), (2-1) 및 (2-2) 로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 공정이 Wnt 신호 전달 경로 활성화 물질의 존재 하에 수행되는 것을 특징으로 하는 [1] - [30] 중 어느 하나에 기재된 제조 방법.
[32] 상기 Wnt 신호 전달 경로 활성화 물질이 상기 공정 (1) 에서 첨가되는 Wnt 신호 전달 경로 저해 물질의 작용점보다 하류의 신호 전달 인자에 작용하는 것을 특징으로 하는 [31] 에 기재된 제조 방법.
[33] 상기 Wnt 신호 전달 경로 활성화 물질이 고전적 Wnt 경로를 활성화시키는 물질인 것을 특징으로 하는, [31] 또는 [32] 에 기재된 제조 방법.
[34] 상기 고전적 Wnt 경로를 활성화시키는 물질이 β-카테닌의 분해를 억제하고, 안정화를 촉진하는 작용을 갖는 것을 특징으로 하는 [31] - [33] 중 어느 하나에 기재된 제조 방법.
[35] 상기 Wnt 신호 전달 경로 활성화 물질이 GSK3 저해제인 것을 특징으로 하는, [31] - [34] 중 어느 하나에 기재된 제조 방법.
[36] 상기 Wnt 신호 전달 경로 저해 물질이 PORCN 저해제이며, 상기 Wnt 신호 전달 경로 활성화 물질이 GSK3 저해제인 것을 특징으로 하는, [31] - [35] 중 어느 하나에 기재된 제조 방법.
[37] 상기 GSK3 저해제가 CHIR99021, CHIR98014, TWS119, SB216763, SB415286, BIO, AZD2858, AZD1080, AR-A014418, TDZD-8, LY2090314, IM-12, 인디루빈 (Indirubin), 비키닌 (Bikinin), A 1070722, 3F8, 켄파울론 (Kenpaullone), 10Z-히메니알디신 (Hymenialdisine), 인디루빈-3'-옥심, NSC 693868, TC-G 24, TCS 2002, TCS 21311, CP21R7 및 이들 화합물의 유도체로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나를 포함하는 [31] - [36] 중 어느 하나에 기재된 제조 방법.
[38] 상기 GSK3 저해제는 CHIR99021 를 포함하고, 상기 공정 (1), (2), (2-1) 및 (2-2) 로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 공정에 첨가되는 상기 CHIR99021 의 농도가 10 nM - 50 μM 인, [31] - [37] 중 어느 하나에 기재된 제조 방법.
[39] 상기 Wnt 신호 전달 경로 활성화 물질이 BML-284 및 SKL2001 로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나를 포함하는 [31] - [34] 중 어느 하나에 기재된 제조 방법.
[40] 상기 공정 (1) 에서 실시되는 부유 배양이 무혈청 배지를 이용한 부유 배양인 것을 특징으로 하는 [1] - [39] 중 어느 하나에 기재된 제조 방법.
[41] 상기 무혈청 배지가 혈청 대체물을 포함하는 것을 특징으로 하는 [40] 에 기재된 제조 방법.
[42] 상기 공정 (1) 에서 실시되는 부유 배양이 분산 처리된 다능성 줄기 세포를 이용하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 [1] - [41] 중 어느 하나에 기재된 제조 방법.
[43] 상기 공정 (1) 에서 실시되는 부유 배양이 ROCK 저해제의 존재 하에 실시되는 것을 특징으로 하는 [1] - [42] 중 어느 하나에 기재된 제조 방법.
[44] 상기 공정 (1) 에서 첨가되는 ROCK 저해제의 농도가 1 nM 내지 1 mM 의 Y-27632 에 상당하는 세포 보호능을 갖는 농도인 것을 특징으로 하는 [43] 에 기재된 제조 방법.
[45] 상기 공정 (1), (2), (2-1) 및 (2-2) 로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 공정에서 부유 배양이 Notch 신호 저해제의 존재 하에 추가로 이루어지는 것을 특징으로 하는 [1] - [44] 중 어느 하나에 기재된 제조 방법.
[46] 상기 Notch 신호 저해제가 γ 세크레타아제 저해제인 [45] 에 기재된 제조 방법.
[47] 상기 γ 세크레타아제 저해제가 DAPT 인 [46] 에 기재된 제조 방법.
[48] 상기 공정 (1), (2), (2-1) 및 (2-2) 로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 공정에서 부유 배양이 덱사메타손 (dexamethasone) 의 추가의 존재 하에 수행되는 것을 특징으로 하는 [1] - [47] 중 어느 하나에 기재된 제조 방법.
[49] 상기 다능성 줄기 세포가 영장류 다능성 줄기 세포인 것을 특징으로 하는 [1] - [48] 중 어느 하나에 기재된 제조 방법.
[50] 상기 영장류 다능성 줄기 세포가 인간 다능성 줄기 세포인 것을 특징으로 하는 [49] 에 기재된 제조 방법.
[51] [1] - [50] 중 어느 하나에 기재된 제조 방법에 의해 얻어지는 뇌하수체 조직을 포함하는 세포괴.
[52] 하기 공정 (1) - (3) 을 포함하는, 뇌하수체 조직의 제조 방법;
(1) 다능성 줄기 세포를 Wnt 신호 전달 경로 저해 물질의 존재 하에 부유 배양하여 세포 응집체를 형성시키는 제 1 공정,
(2) 제 1 공정에서 얻어진 응집체를 BMP 신호 전달 경로 활성화 물질 및 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질의 존재 하에 부유 배양하여 뇌하수체 조직을 포함하는 세포괴를 얻는 제 2 공정,
(3) 제 2 공정에서 얻어진 세포괴로부터 뇌하수체 조직을 회수하는 제 3 공정.
[53] 하기 공정 (1), (2-1), (2-2) 및 (3) 을 포함하는, 뇌하수체 조직의 제조 방법;
(1) 다능성 줄기 세포를 Wnt 신호 전달 경로 저해 물질의 존재 하에 부유 배양하여 세포 응집체를 형성시키는 제 1 공정,
(2-1) 제 1 공정에서 얻어진 응집체를 BMP 신호 전달 경로 활성화 물질 및 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질의 존재 하에 부유 배양하는 제 2 공정 (1),
(2-2) 제 2 공정 (1) 에서 부유 배양된 응집체를 BMP 신호 전달 경로 저해 물질의 존재 하에 부유 배양하여 뇌하수체 조직을 포함하는 세포괴를 얻는 제 2 공정 (2),
(3) 제 2 공정 (2) 에서 얻어진 세포괴로부터 뇌하수체 조직을 회수하는 제 3 공정.
[54] [52] 또는 [53] 에 기재된 제조 방법에 의해 얻어지는 뇌하수체 조직.
[55] 1) 신경계 세포 또는 신경 조직, 2) 뇌하수체 조직 및 3) 간엽계 세포를 포함하는 세포괴.
[56] 상기 3) 간엽계 세포가 네스틴 (Nestin), 비멘틴 (Vimentin), 카드헤린(Cadherin)-11, 라미닌 (Laminin), CD44, CD90 및 CD105 로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 1 종의 간엽계 세포 마커를 발현하는 것을 특징으로 하는 [55] 에 기재된 세포괴.
[57] 1) 신경계 세포 또는 신경 조직, 2) 뇌하수체 조직 및 4) 신경 능선 세포 또는 신경 능선 유래 세포를 포함하는 세포괴.
[58] 상기 4) 신경 능선 세포가 네스틴, Sox10, Slug, Snail, Pax3, Zic1, FoxD3, p75 NTR, HNK-1, CHD7, Numb 및 Ascl1 로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 1 종의 신경 능선 세포 마커를 발현하는 것을 특징으로 하는 [57] 에 기재된 세포괴.
[59] 표면이 비(非)신경 상피 조직으로 덮히고, 비신경 상피 조직의 적어도 일부에 2) 뇌하수체 조직이 형성되는 것을 특징으로 하는 [55] - [58] 중 어느 한 항 세포괴.
[60] 상기 비신경 상피 조직이 사이토케라틴, E-카드헤린 및 EpCAM 로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 1 종의 비신경 상피 조직 마커를 발현하는 것을 특징으로 하는 [59] 에 기재된 세포괴.
[61] 상기 비신경 상피 조직은 1) 신경계 세포 또는 신경 조직 및 3) 간엽계 세포 중 적어도 하나를 피복하고 있는 것을 특징으로 하는, [55] 또는 [56] 에 기재된 세포괴.
[62] 상기 비신경 상피 조직은 1) 신경계 세포 또는 신경 조직 및 4) 신경 능선 세포 또는 신경 능선 유래 세포 중 적어도 하나를 피복하고 있는 것을 특징으로 하는, [57] 또는 [58] 에 기재된 세포괴.
[63] 상기 3) 간엽계 세포가 세포괴의 표면을 피복하고 있는 비신경 상피 조직과 세포괴의 내부에 존재하는 1) 신경계 세포 또는 신경 조직 사이에 존재하는 것을 특징으로 하는 [61] 에 기재된 세포괴.
[64] 상기 4) 신경 능선 세포 또는 신경 능선 유래 세포가 세포괴의 표면을 피복하고 있는 비신경 상피 조직과 세포괴의 내부에 존재하는 1) 신경계 세포 또는 신경 조직 사이에 존재하는 것을 특징으로 하는 [62] 에 기재된 세포괴.
[65] 상기 비신경 상피 조직이 구강 상피 또는 그 전구체 조직임을 특징으로 하는 [59] - [64] 중 어느 하나에 기재된 세포괴.
[66] 상기 2) 뇌하수체 조직이 뇌하수체 호르몬 생산 세포를 포함하는 것을 특징으로 하는 [55] - [65] 중 어느 하나에 기재된 세포괴.
[67] 상기 뇌하수체 호르몬 생산 세포가 성장 호르몬 (GH) 생산 세포, 프로락틴 (PRL) 생산 세포 및 부신피질 자극 호르몬 (ACTH) 생산 세포로 이루어진 군에서 선택되는 1 종 이상인 것을 특징으로 하는 [66] 에 기재된 세포괴.
[68] 상기 뇌하수체 조직이 뇌하수체 조직 줄기 세포를 포함하는 것을 특징으로 하는 [55] - [67] 중 어느 하나에 기재된 세포괴.
[69] 상기 뇌하수체 조직 줄기 세포가 Sox2, Sox9, E-카드헤린, 네스틴, S100β, GFRα2, Prop1, CD133, β-카테닌, Klf4, Oct4, Pax6, 콕사키바이러스 및 아데노바이러스 공통 수용체 (CXADR), PRRX1/2, 에프린(Ephrin)-B2 및 ACE 로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 1 종의 뇌하수체 조직 줄기 세포 마커를 발현하는 것을 특징으로 하는 [68] 에 기재된 세포괴.
[70] 상기 뇌하수체 조직 줄기 세포가 뇌하수체 틈새를 형성하고 있는 것을 특징으로 하는 [68] 또는 [69] 에 기재된 세포괴.
[71] 상기 1) 신경계 세포 또는 신경 조직이 복측 간뇌 또는 시상하부의 세포 또는 조직임을 특징으로 하는 [55] - [70] 중 어느 하나에 기재된 세포괴.
[72] 상기 1) 신경계 세포 또는 신경 조직이 N-카드헤린 양성 신경 상피 조직임을 특징으로 하는 [71] 에 기재된 세포괴.
[73] 상기 신경 상피 조직의 내부에 뇌실양의 공포가 형성되고, 당해 공포에 접하고 있는 신경 상피 조직의 면이 aPKC-제타 양성 정단면인 것을 특징으로 하는, [72] 에 기재된 세포괴.
[74] [1] - [50] 중 어느 한 항에 기재된 방법에 의해 제조되는 세포괴 또는 [52] 에 기재된 방법에 의해 제조되는 뇌하수체 조직과 시험 물질을 접촉시키는 공정과, 당해 시험 물질이 세포괴 또는 뇌하수체 조직에 미치는 영향을 측정하는 공정을 포함하는 시험 물질의 독성 또는 약효 평가 방법.
[75] [1] - [50] 중 어느 한 항에 기재된 방법에 의해 제조되는 세포괴 또는 [52] 에 기재된 방법에 의해 제조되는 뇌하수체 조직을 포함하는 시험 물질의 독성 또는 약효 평가용 시약.
[76] [52] 에 기재된 방법에 의해 제조되는 뇌하수체 조직의 유효량을 이식을 필요로 하는 대상에 이식하는 공정을 포함하는 뇌하수체 장애로 인한 비인간 동물의 질환의 치료 방법.
[77] [1] - [50] 중 어느 한 항에 기재된 방법에 의해 제조되는 세포괴 또는 [52] 에 기재된 방법에 의해 제조되는 뇌하수체 조직을 포함하는 뇌하수체의 장애로 인한 질환의 치료약.
본 발명에 의하면, 다능성 줄기 세포로부터 뇌하수체 조직을 포함하는 세포괴를 효율적으로 제조할 수 있다.
[도 1-1] 도 1-1 상단은 실시예 1 에서 인간 ES 세포로부터의 뇌하수체 조직을 포함하는 세포괴를 만들 때의 수순을 모식적으로 나타낸 도면이다. 하단 A 및 B 는 실시예 1 에서 부유 배양 개시 28 일 후의 세포괴의 도립 현미경 명시야 관찰상을 나타내는 도면이다. 하단 C-K 는 실시예 1 에서 부유 배양 개시 28 일 후의 세포괴의 각 세포 마커의 발현 상황을 면역 형광 염색으로 조사한 결과를 나타내는 도면이다. C - E 는 Lhx3, Nkx2.1 및 그의 핵 염색상을 각각 나타낸다. F - H 는 Lhx3, Nkx2.1 및 그의 핵 염색상을 각각 나타낸다. I - K 는 aPKC, 라미닌 및 그의 핵 염색상을 각각 나타낸다.
[도 1-2] 도 1-2 의 L - X 는 실시예 1 에서 부유 배양 개시후 28 일 후의 세포괴의 각 세포 마커의 발현 상황을 면역 형광 염색으로 조사한 결과를 나타내는 도면이다. L - N 은 Sox3, EpCAM 및 그의 핵 염색상을 각각 나타낸다. O - Q 는 Tbx3, βIII 튜불린 (βIII Tub) 및 그의 핵 염색상을 각각 나타낸다. S - U 는 Emx2, 네스틴 및 그의 핵 염색상을 각각 나타낸다. V-X 는 Pitx1, 범-사이토케라틴 (Pan-CK) 및 그의 핵 염색상을 각각 나타낸다. 하단 Y 는 배양 28 일째의 뇌하수체 조직을 포함하는 세포괴의 구조를 모식적으로 나타낸 도면이다.
[도 2] 도 2 상단은 실시예 2 에서 인간 ES 세포로부터의 뇌하수체 조직을 포함하는 세포괴를 만들 때의 수순을 모식적으로 나타낸 도면이다. 하단 A, B 는 실시예 2 에서 부유 배양 개시 70 일 후의 세포괴의 도립 현미경 명시야 관찰상을 나타내는 도면이다. 하단 C-J 는 부유 배양 개시 70 일 후, 또는 84 일 후의 세포괴의 각 세포 마커의 발현 상황을 면역 형광 염색으로 조사한 결과를 나타내는 도면이다. C 및 D 는 ACTH 및 그의 핵 염색상을 각각 나타낸다. E - G 는, 프로락틴 (PRL), 범-사이토케라틴 (PanCK) 및 그의 핵 염색상을 각각 나타낸다. H - J 는 성장 호르몬 (GH), 범-사이토케라틴 (PanCK) 및 그의 핵 염색상을 각각 나타낸다.
[도 3] 도 3 상단은 참고예 1 에서 인간 ES 세포로부터의 뇌하수체 조직을 포함하는 세포괴를 BMP4 의 첨가 시기를 바꾸어 만들 때의 수순을 모식적으로 나타낸 도면이다. 하단 A - D 는 참고예 1 에서 부유 배양 개시 10 일 후의 세포괴의 도립 현미경 명시야 관찰상을 나타내는 도면이다. A 는 BMP4 를 첨가하지 않은 컨트롤 세포, B - D 는 각각 부유 배양을 개시하고 1, 2, 3 일째에 BMP4 를 첨가한 세포로부터 형성되는 부유 배양 개시 10 일 후의 세포괴의 도립 현미경 명시야 관찰상을 나타내는 도면이다.
[도 4] 도 4 상단은 실시예 3 에서 인간 ES 세포로부터 세포 응집체를 제조할 때의 수순을 모식적으로 나타낸 도면이다. 하단 A 및 B 는 각각 실시예 3 에서 부유 배양 개시 2 및 3 일 후의 세포 응집체의 도립 현미경 명시야 관찰상을 나타내는 도면이다. 하단 C-H 는 부유 배양 개시 2 일 후, 또는 3 일 후의 세포 응집체의 각 세포 마커의 발현 상황을 면역 형광 염색으로 조사한 결과를 나타내는 도면이다. C 는 부유 배양 개시 2 일 후, F 는 부유 배양 개시 3 일 후의 세포 응집체의 ZO-1 염색상이다. D 는 부유 배양 개시 2 일 후, G 는 부유 배양 개시 3 일 후의 세포 응집체의 Sox2 염색상이다. E 는 C 및 D 에 대한, H 는 F 및 G 에 대한 핵의 대비 염색상이다.
[도 5] 도 5 상단은 실시예 4 에서 인간 ES 세포로부터의 뇌하수체 조직을 포함하는 세포괴를 SAG 의 첨가 농도를 바꾸어 만들 때의 수순을 모식적으로 나타낸 도면이다. 하단 A - H 는 실시예 4 에서 부유 배양 개시 28 일 후의 세포괴의 도립 현미경 명시야 관찰상을 나타내는 도면이다. A 는 SAG 를 첨가하지 않은 컨트롤 세포, B - H 는 각각 부유 배양 개시 2 일째에 100, 300, 500, 700 nM, 1, 2, 5 μM 의 SAG 을 첨가한 세포로부터 형성되는 부유 배양 개시 28 일 후에 세포괴의 도립 현미경 명시야 관찰상을 나타내는 도면이다.
[도 6] 도 6 상단은 실시예 5 에서 인간 ES 세포로부터의 뇌하수체 조직을 포함하는 세포괴의 제조에서 부유 배양 개시 전의 화합물에 의한 전처리의 효과를 확인하는 수순을 모식적으로 나타낸 도 있다. 하단 A - D 는 실시예 5 에서 부유 배양 개시 28 일 후의 세포괴의 도립 현미경 명시야 관찰상을 나타내는 도면이다. A 는 화합물에 의한 전처리를 실시하지 않은 세포괴, B 는 300 nM SAG 에서 전처리를 실시한 세포괴, C 는 5 μM SB431542 로 전처리를 실시한 세포괴, D 는 SAG 및 SB431542 을 동시에 첨가하여 전처리를 실시한 세포괴이다.
[도 7] 도 7 상단은 실시예 6 에서 인간 ES 세포로부터의 뇌하수체 조직을 포함하는 세포괴의 제조에 있어서 각 Wnt 신호 전달 경로 저해 물질의 효과를 확인하는 단계를 개략적으로 나타낸 도면이다. 하단 A - H 는 실시예 6 에서 부유 배양 개시 28 일 후의 세포괴의 도립 현미경 명시야 관찰상을 나타내는 도면이다. A 는 Wnt 신호 전달 경로 저해 물질 또는 SB431542 을 첨가하지 않은 컨트롤, B 는 SB431542 을 첨가하고 Wnt 신호 전달 경로 저해 물질을 첨가하지 않은 조건, C-H 는 각각 부유 배양 개시시에 Wnt 신호 전달 경로 저해 물질을 그 종류를 바꾸어 첨가하여 추가로 부유 배양을 실시하고 부유 배양 개시후 28 일째의 세포괴의 도립 현미경 명시야 관찰상을 나타내는 도면이다.
[도 8] 도 8 상단은 실시예 7 에서 인간 ES 세포로부터의 뇌하수체 조직을 포함하는 세포괴를 BMP4 의 첨가 농도를 바꾸어 만들 때의 수순을 모식적으로 나타낸 도면이다. 하단 A - D 는 실시예 7 에서 부유 배양 개시 28 일 후의 세포괴의 도립 현미경 명시야 관찰상을 나타내는 도면이다. A 는 BMP4 를 첨가하지 않은 컨트롤, B - D 는 각각 부유 배양 개시후 2 일째에, 농도를 바꾸어 (0.5 nM, 1.5 nM, 5 nM) BMP4 를 첨가하여 추가로 부유 배양을 실시하고 부유 배양 개시후 28 일째의 세포괴의 도립 현미경 명시야 관찰상을 나타내는 도면이다.
[도 9] 도 9 상단은 실시예 8 에서 인간 ES 세포로부터의 뇌하수체 조직을 포함하는 세포괴의 제조에 있어서의 각 TGFβ 신호 전달 경로 저해 물질의 효과를 확인하는 단계를 개략적으로 나타낸 도면이다. 하단 A - G 는 실시예 8 에서 부유 배양 개시 28 일 후의 세포괴의 도립 현미경 명시야 관찰상을 나타내는 도면이다. A 는 TGFβ 신호 전달 경로 저해 물질 또는 IWP-2 를 첨가하지 않은 컨트롤, B 는 IWP-2 를 첨가하고 TGFβ 신호 전달 경로 저해 물질을 첨가하지 않은 조건, C - G 는 각각 부유 배양 개시시에 TGFβ 신호 전달 경로 저해 물질을 그 종류와 농도를 바꾸어 첨가하여 추가로 부유 배양을 실시하고 부유 배양 개시후 28 일째의 세포괴의 도립 현미경 명시야 관찰상을 나타내는 도면이다.
[도 10] 도 10 상단은 실시예 9 에서 인간 iPS 세포로부터 뇌하수체 조직을 포함하는 세포괴를 만들 때의 수순을 모식적으로 나타낸 도면이다. 하단 A 및 B 는 실시예 9 에서 부유 배양 개시 28 일 후의 세포괴의 도립 현미경 명시야 관찰상을 나타내는 도면이다. 하단 C-R 은 부유 배양 개시 28 일 후의 세포괴의 각 세포 마커의 발현 상황을 면역 형광 염색으로 조사한 결과를 나타내는 도면이다. C - F 는 Lhx3, Nkx2.1, EpCAM 의 염색상 및 그의 핵 염색상을 각각 나타낸다. G - J 는 Six1, Pitx2, 범-사이토케라틴 (PanCK) 의 염색상 및 그의 핵 염색상을 각각 나타낸다. K - N 은 Bf1, Sox2, E-카드헤린 의 염색상 및 그의 핵 염색상을 각각 나타낸다. O - R 은 네스틴, βIII 튜불린 (βIII Tub), 비멘틴 의 염색상 및 그의 핵 염색상을 각각 나타낸다.
[도 11] 도 11 상단은 실시예 10 에 있어서, 인간 iPS 세포로부터 신경 조직 및 비신경 상피 조직을 포함하는 세포괴를 만들 때의 수순을 모식적으로 나타낸 도면이다. 하단 A - D 는 실시예 10 에서 부유 배양 개시 13 일 후의 세포괴의 도립 현미경 명시야 관찰상을 나타내는 도면이다. 하단 E - P 는 부유 배양 개시 13 일 후의 세포괴의 각 세포 마커의 발현 상황을 면역 형광 염색으로 조사한 결과를 나타내는 도면이다. E - G 및 K - M 은 Dlx5, N-카드헤린 의 염색상 및 그의 핵 염색상을 각각 나타낸다. H - J 및 N - P 는 Six1, E-카드헤린 의 염색상 및 그의 핵 염색상을 각각 나타낸다.
[도 12] 도 12Q - AB 는 도 11 에 이어 실시예 10 에서 부유 배양 개시 13 일 후의 세포괴의 각 세포 마커의 발현 상황을 면역 형광 염색으로 조사한 결과를 나타내는 도면이다. Q - S 및 W - Y 는 Dlx5, N-카드헤린 의 염색상 및 그의 핵 염색상을 각각 나타낸다. T - V 및 Z - AB 는 Six1, E-카드헤린 의 염색상 및 그의 핵 염색상을 각각 나타낸다.
[도 13] 도 13 상단은 실시예 11 에 있어서, 인간 iPS 세포로부터 뇌하수체 조직을 포함하는 세포괴를 만들 때의 수순을 모식적으로 나타낸 도면이다. 하단 A 는 실시예 11 에서 부유 배양 개시 28 일 후의 세포괴의 도립 현미경 명시야 관찰상을 나타내는 도면이다. 하단 B - I 는 부유 배양 개시 28 일 후의 세포괴의 각 세포 마커의 발현 상황을 면역 형광 염색으로 조사한 결과를 나타내는 도면이다. B - E 및 F - I 는 Lhx3, Nkx2.1, E-카드헤린 의 염색상 및 그의 핵 염색상을 각각 나타낸다.
[도 14] 도 14J - V 는 도 13 에 이어 실시예 11 에서 부유 배양 개시 28 일 후의 세포괴의 각 세포 마커의 발현 상황을 면역 형광 염색으로 조사한 결과를 나타내는 도면이다. J - M 은 네스틴, Pitx2, Sox2 의 염색상 및 그의 핵 염색상을 각각 나타낸다. N - P 는 Six1, 비멘틴 의 염색상 및 그의 핵 염색상을 각각 나타낸다. Q - S 는 Rx, N-카드헤린 의 염색상 및 그의 핵 염색상을 각각 나타낸다. T - V 는 Tbx3, 범-사이토케라틴의 염색상 및 그의 핵 염색상을 각각 나타낸다.
[도 15] 도 15 상단은 실시예 12 에 있어서, 인간 iPS 세포로부터 뇌하수체 조직을 포함하는 세포괴를 만들 때의 수순을 모식적으로 나타낸 도면이다. 하단 A - D 는 실시예 12 에서 부유 배양 개시 28 일 후의 세포괴의 도립 현미경 명시야 관찰상을 나타내는 도면이다. 하단 E - L 은 부유 배양 개시 28 일 후의 세포괴의 각 세포 마커의 발현 상황을 면역 형광 염색으로 조사한 결과를 나타내는 도면이다. E - H 및 I - L 은 Lhx3, Nkx2.1, E-카드헤린 의 염색상 및 그의 핵 염색상을 각각 나타낸다.
[도 16] 도 16M - Y 는 도 15 에 이어 실시예 12 에서 부유 배양 개시 28 일 후의 세포괴의 각 세포 마커의 발현 상황을 면역 형광 염색으로 조사한 결과를 나타내는 도면이다. M - P 는 네스틴, Pitx2, Sox2 의 염색상 및 그의 핵 염색상을 각각 나타낸다. Q - S 는 Six1, 비멘틴 의 염색상 및 그의 핵 염색상을 각각 나타낸다. T - V 는 Rx, N-카드헤린 의 염색상 및 그의 핵 염색상을 각각 나타낸다. W - Y 는 Tbx3, 범-사이토케라틴의 염색상 및 그의 핵 염색상을 각각 나타낸다.
발명을 실시하기 위한 형태
1. 정의
본 발명에서 "줄기 세포" 는 분화능 및 분화능을 유지하는 증식능 (특히 자기 복제능) 을 가진 미분화 세포를 의미한다. 줄기 세포는 분화능에 따라 다능성 줄기 세포 (pluripotent stem cell), 복능성 줄기 세포 (multipotent stem cell), 단능성 줄기 세포 (unipotent stem cell) 등의 아집단이 포함된다. 다능성 줄기 세포는 인 비트로 (in vitro) 배양하는 것이 가능하고 생체를 구성하는 모든 세포 (삼배엽 (외배엽, 중배엽, 내배엽) 유래의 조직) 로 분화할 수 있는 능력 (분화 다능성 (pluripotency)) 을 갖는 줄기 세포를 말한다. 복능성 줄기 세포는 모든 종류는 아니지만 복수종의 조직과 세포로 분화할 수 있는 능력을 가진 줄기 세포를 의미한다. 단능성 줄기 세포는 특정 조직이나 세포로 분화할 수 있는 능력을 가진 줄기 세포를 의미한다.
다능성 줄기 세포는 수정란, 복제 배아, 생식 줄기 세포, 조직 줄기 세포, 체세포 등으로부터 유도할 수 있다. 다능성 줄기 세포로 배아 줄기 세포 (ES 세포: Embryonic stem cell), EG 세포 (Embryonic germ cell), 유도 다능성 줄기 세포 (iPS 세포: induced pluripotent stem cell) 등을 들 수 있다. 간엽계 줄기 세포 (mesenchymal stem cell; MSC) 에서 얻은 Muse 세포 (Multi-lineage differentiating Stress Enduring cell) 및 생식 세포 (예를 들어, 고환) 에서 제작된 GS 세포도 다능성 줄기 세포에 포함된다. 배아 줄기 세포는 1981 년에 처음 수립된 1989 년 이후 녹아웃 마우스 제작에도 응용되고 있다. 1998 년에 인간 배아 줄기 세포가 수립되어 재생 의학에 이용되고 있다. ES 세포는 내부 세포괴를 피더 세포 상에서 또는 LIF 를 포함하는 배지에서 배양함으로써 제조할 수 있다. ES 세포의 제조 방법은, 예를 들어, WO96/22362, WO02/101057, US5,843,780, US6,200,806, US6,280,718 등에 기재되어 있다. 배아 줄기 세포는 소정의 기관에서 구할 수 있으며, 시판품을 구입할 수 있다. 예를 들어, 인간 배아 줄기 세포인 KhES-1, KhES-2 및 KhES-3 은 Kyoto University's Institute for Frontier Medical Sciences 에서 입수가능하다. 마우스 배아 줄기 세포인 EB5 세포는 Incorporated Administrative Agency RIKEN 에서, 마우스 배아 줄기 세포인 D3 주는 ATCC 에서 입수가능하다. ES 세포의 하나인 핵 이식 ES 세포 (ntES 세포) 는 세포주를 제거한 난자에 체세포의 세포핵을 이식해 만든 복제 배아에서 수립할 수 있다.
EG 세포는 원시 생식 세포를 mSCF, LIF 및 bFGF 를 포함하는 배지 중에서 배양함으로써 제조할 수 있다 (Cell, 70: 841-847, 1992).
본 발명에서 "유도 다능성 줄기 세포" 는 체세포를 공지의 방법 등에 의해 초기화 (reprogramming) 하여 다능성을 유도한 세포이다. 구체적으로는 섬유아세포와 말초 혈액 단핵구 등 분화된 체세포를 Oct3/4, Sox2, Klf4, Myc (c-Myc, N-Myc, L-Myc), Glis1, Nanog, Sall4, lin28 및 Esrrb 등을 포함하는 초기화 유전자 군에서 선택되는 복수의 유전자의 조합의 발현에 의해 초기화하여 다분화능을 유도한 세포를 들 수 있다. 2006 년에, Yamanaka 등에 의해 마우스 세포에서 유도 다능성 줄기 세포가 수립되었다 (Cell, 2006, 126(4), pp.663-676). 2007 년에, 유도 다능성 줄기 세포는 또한 인간의 섬유아세포에서 수립되었고, 배아 줄기 세포와 유사한 다능성과 자기 복제능을 갖는다 (Cell, 2007, 131(5), pp.861-872; Science, 2007, 318(5858), pp.1917-1920; Nat. Biotechnol., 2008, 26(1), pp.101-106). 유도 다능성 줄기 세포로 유전자 발현에 의한 직접 초기화로 제조하는 방법 이외에, 화합물의 첨가 등에 의해 체세포로부터 유도 다능성 줄기 세포를 유도할 수도 있다 (Science, 2013, 341, pp. 651-654).
유도 다능성 줄기 세포를 제조할 때 사용되는 체세포로는 특별히 한정은 없지만, 조직 유래의 섬유아세포, 혈구계 세포 (예를 들어, 말초 혈액 단핵구와 T 세포), 간세포, 췌장 세포, 장 상피 세포, 평활근 세포 등을 들 수 있다.
유도 다능성 줄기 세포를 제조할 때 여러 종류의 유전자 (예를 들어, Oct3/4, Sox2, Klf4, 및 Myc 의 4 인자) 의 발현에 의해 초기화하는 경우, 유전자를 발현시키기 위한 수단은 특별히 한정되지 않는다. 상기 수단으로는 바이러스 벡터 (예를 들어, 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 센다이바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 아데노 수반 바이러스 벡터) 를 이용한 감염법, 플라스미드 벡터 (예를 들어, 플라스미드 벡터, 에피소말 벡터) 를 이용한 유전자 도입법 (예를 들어, 인산 칼슘법, 리포펙션법, 레트로넥틴법, 일렉트로포레이션법), RNA 벡터를 이용한 유전자 도입법 (예를 들어, 인산 칼슘법, 리포펙션법, 일렉트로포레이션법), 및 단백질의 직접 주입법 등을 들 수 있다.
본 발명에 사용되는 다능성 줄기 세포는 바람직하게는 ES 세포 또는 유도 다능성 줄기 세포이다.
복능성 줄기 세포로 조혈 줄기 세포, 신경 줄기 세포, 망막 줄기 세포, 뇌하수체 줄기 세포, 간엽계 줄기 세포 등의 조직 줄기 세포 (조직 줄기 세포, 조직 특이적 줄기 세포 또는 체세포 줄기 세포라고도 함) 를 들 수 있다.
유전자 변형된 다능성 줄기 세포는 예를 들어, 상동 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있다. 변형되는 염색체 상의 유전자로는, 예를 들어 세포 마커 유전자, 조직 적합성 항원 유전자, 신경계 세포의 장애로 인한 질환 관련 유전자 등을 들 수 있다. 염색체 상의 표적 유전자의 변형은 Manipulating the Mouse Embryo, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1994); Gene Targeting, A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press (1993); Biomanual Series 8, Gene Targeting, Making of Mutant Mouse using ES cell, YODOSHA CO., LTD. (1995); 등에 기재된 방법을 이용하여 할 수 있다.
구체적으로는, 예를 들어, 변형하는 표적 유전자 (예를 들어, 세포 마커 유전자, 조직 적합성 항원 유전자 및 질병 관련 유전자 등) 의 게놈 유전자를 단리하고, 분리된 게놈 유전자를 이용하여 표적 유전자를 상동 재조합하기 위한 타겟 벡터를 제작한다. 제작된 타겟 벡터를 줄기 세포에 도입하여, 표적 유전자와 타겟 벡터 사이에서 상동 재조합을 일으킨 세포를 선택하여 염색체 상의 유전자가 변형된 줄기 세포를 제작할 수 있다.
표적 유전자의 게놈 유전자를 분리하는 방법으로는, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987-1997) 등에 기재된 공지의 방법을 들 수 있다. 게놈 DNA 라이브러리 스크리닝 시스템 (Genome Systems 제) 과 Universal GenomeWalker Kits (CLONTECH 제) 등을 이용하여 표적 유전자의 게놈 유전자를 분리할 수 있다.
표적 유전자를 상동 재조합하기 위한 타겟 벡터의 제작 및 상동 재조합체의 효율적인 선별은 Gene Targeting, A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press (1993); Biomanual Series 8, Gene Targeting, Making of Mutant Mouse using ES cell, YODOSHA CO., LTD. (1995); 등에 기재된 방법에 따라 할 수 있다. 타겟 벡터는 리플레이스먼트형 또는 인서트형 중에서 사용할 수 있다. 선별 방법은 포지티브 선택, 프로모터 선택, 네거티브 선택 또는 폴리A 선택 등의 방법을 이용할 수 있다.
선별된 세포주 중에서 목적으로 하는 상동 재조합체를 선택하는 방법으로는 게놈 DNA 에 대한 서던 하이브리드화 방법이나 PCR 법 등을 들 수 있다.
본 발명에서 "포유 동물" 에는 설치류, 유제류, 육식류, 영장류 등이 포함된다. 설치류에는 마우스, 래트, 햄스터, 기니피그 등이 포함된다. 유제류에는 돼지, 소, 염소, 말, 양 등이 포함된다. 육식류에는 개, 고양이 등이 포함된다. 본 발명에서 "영장류" 는 영장류에 속하는 포유 동물을 말하며, 영장류로는 여우 원숭이, 로리스, 및 투파이 등의 원원류와, 원숭이, 유인원, 인간 등의 진원류를 들 수 있다.
본 발명에 사용되는 다능성 줄기 세포는 포유류 다능성 줄기 세포이며, 바람직하게는 설치류 (예를 들어, 마우스, 래트) 또는 영장류 (예를 들어, 인간, 원숭이) 의 다능성 줄기 세포이며, 가장 바람직하게는 인간 다능성 줄기 세포이다.
본 발명에서 "신호 전달" 은 세포막 등에 존재하는 수용체 단백질이 화학 물질 등과 결합하여 구조 변화를 일으켜 그것을 자극하여 순차적으로 세포 내로 전달하여 최종적으로 유전자 발현 또는 채널의 개구 등의 반응을 이끌어내는 과정이나기구 등의, 세포의 생화학적 자극에 대한 정보 전달, 증폭, 처리, 응답 메카니즘을 나타낸다. 본 발명에서 "신호 전달의 하류" 는 일련의 신호 전달에 관련된 인자 중 어느 인자에 대해 시간적, 인과적으로 후의 과정에서 인산화 등의 생화학적인 변화를 받는 상대적인 관계를 나타낸다. 예를 들어, 일련의 신호 전달의 메커니즘 중에서 인자 A 가 인자 B 를 인산화함으로써 후속 신호 전달이 발생한다면, 인자 B 는 인자 A 의 하류 신호 전달 인자이다.
본 발명에서 "세포 접착 (Cell adhesion)" 은 세포와 세포 간의 접착 및 세포와 세포외 기질과의 접착을 말한다. 인비트로 인공 배양 환경 하에서 발생하는 세포의 배양 기재 등에의 접착도 세포 접착에 포함된다. 세포 접착의 종류로 고정 결합 (anchoring junction), 연락 결합 (communicating junction), 폐쇄 결합 (occluding junction) 을 들 수 있다.
본 발명에서 "밀착 결합 (Tight junction)" 은 세포 간의 접착 중 척추 동물과 척삭 동물에서 볼 수 있는 폐쇄 결합을 나타낸다. 밀착 결합은 상피 세포 사이에 형성된다. 생체 유래의 조직 중 및 본 발명의 제조 방법 등으로 만든 세포괴 중에 밀착 결합이 존재하고 있는지는, 예를 들어 밀착 접합의 구성 성분에 대한 항체 (항-클로딘 항체, 항-ZO-1 항체 등) 를 이용한 면역 조직 화학 등의 방법에 의해 검출할 수 있다.
본 발명에서 "부유 배양" 또는 "부유 배양법" 은 세포, 세포 응집체 또는 세포괴가 배양액에 부유하고 있는 상태를 유지하면서 배양하는 것 및 당해 배양하는 방법을 말한다. 즉, 부유 배양은 세포, 세포 응집체 또는 세포괴를 배양 기재 등에 접착시키지 않는 조건으로 행하며, 배양 기재 등에 접착시키는 조건 하에 수행되는 배양 (접착 배양 또는 접착 배양법) 은 부유 배양의 범주에 포함되지 않는다. 이 경우, 세포의 접착은 세포, 세포 응집체 또는 세포괴와 배양 기재 사이에 세포 접착의 일종인 강력한 세포-기질 간의 결합 (cell-substratum junction) 이 있는 것을 말한다. 보다 상세하게는, 부유 배양은 세포, 세포 응집체 또는 세포괴와 배양 기재 등과의 사이에 강력한 세포-기질 간의 결합을 만들지 않는 조건 하에서의 배양을 말하며, 접착 배양은 세포, 세포 응집체 또는 세포괴와 배양 기재 등과의 사이에 강력한 세포-기질 간의 결합을 만들게 하는 조건 하에서의 배양을 말한다.
부유 배양 중인 세포 응집체 또는 세포괴에서, 세포와 세포 사이에 면접착이 형성된다. 부유 배양 중인 세포 응집체 또는 세포괴에서, 세포-기질 간의 결합이 배양 기재 등과의 사이에 거의 형성되지 않거나 형성되어 있어도 그 기여가 작다. 일부 양태에서, 부유 배양 중인 세포 응집체 또는 세포괴는 내재의 세포-기질 간의 결합이 응집체 또는 세포괴의 내부에 존재하지만, 세포-기질 간의 결합이 배양 기재 등과의 사이에 거의 형성되지 않거나 형성되어 있어도 그 기여가 작다.
세포와 세포가 면 접착 (plane attachment) 하는 것은 세포와 세포가 면에서 접착하는 것을 말한다. 보다 상세하게는, 세포와 세포가 면 접착하는 것은 어느 세포의 표면적 중 다른 세포의 표면에 접착하는 비율이 예를 들어, 1% 이상, 바람직하게는 3% 이상, 보다 바람직하게는 5% 이상인 것을 말한다. 세포의 표면은 막을 염색하는 시약 (예를 들어, DiI) 에 의한 염색, 세포 접착 인자 (예를 들어, E-카드헤린 과 N-카드헤린) 의 면역 조직 화학 등의 방법에 의해 검출할 수 있다.
부유 배양할 때 사용되는 배양기는 "부유 배양하는" 것이 가능한 것이면 특별히 한정되지 않고, 당업자라면 적절히 결정하는 것이 가능하다. 이러한 배양기로는 예를 들어, 플라스크, 조직 배양용 플라스크, 디쉬, 페트리 디쉬, 조직 배양용 디쉬, 멀티디쉬, 마이크로플레이트, 마이크로웰 플레이트, 마이크로포어, 멀티플레이트, 멀티웰 플레이트, 챔버 슬라이드, 샬레, 튜브, 트레이, 배양 백, 스피너 플라스크 및 롤러 병을 들 수 있다. 이러한 배양기는 부유 배양을 가능하게 하기 위해 세포 비접착성인 것이 바람직하다. 세포 비접착성 배양기로는 배양기 표면이 세포와의 접착성을 향상시킬 목적으로 인공적으로 처리 (예를 들어, 기저막 표품, 라미닌, 엔탁틴, 콜라겐, 젤라틴 등의 세포외 매트릭스 등이나, 폴리리신, 폴리오르니틴 등의 고분자 등에 의해 코팅 처리하거나, 양전하 처리 등의 표면 처리) 되지 않는 것 등을 사용할 수 있다. 세포 비접착성 배양기로는 배양기 표면이 세포와의 접착성을 저하시킬 목적으로 인공적으로 처리 (예를 들어, MPC 폴리머 등의 초친수성 처리, 단백질 저흡착 처리 등) 된 물건 등을 사용할 수 있다. 스피너 플라스크와 롤러 병 등을 이용하여 회전 배양할 수 있다. 배양기의 배양면은 평평한 바닥도 좋고, 요철이 있어도 좋다.
본 발명에서 세포 배양에 사용되는 배지는 동물 세포 배양에 통상적으로 사용되는 배지를 기초 배지로 제조할 수 있다. 기초 배지로는, 예를 들어, BME 배지, BGJb 배지, CMRL 1066 배지, Glasgow MEM 배지, Improved MEM Zinc Option 배지, IMDM 배지, Medium 199 배지, Eagle MEM 배지, αMEM 배지, DMEM 배지, F-12 배지, DMEM/F12 배지, IMDM/F12 배지, 햄 배지, RPMI 1640 배지, Fischer's 배지 또는 이들의 혼합 배지 등 동물 세포 배양에 사용될 수 있는 배지를 들 수 있다.
다능성 줄기 세포의 배양은 상기 기초 배지를 기반으로 한 다능성 줄기 세포 배양용 배지, 바람직하게는 공지의 배아 줄기 세포 및/또는 유도 다능성 줄기 세포용 배지 및 피더-프리 하에서 다능성 줄기 세포를 배양하는 배지를 사용할 수 있다. 예를 들어 Essential 8 배지와 TeSR 배지, mTeSR 배지, mTeSR-E8 배지, StemFit 배지 등의 피더-프리 배지를 들 수 있다.
본 발명에서 "무혈청 배지" 는 무조정 또는 미정제 혈청이 포함되지 않은 배지를 의미한다. 본 발명은 정제된 혈액 유래 성분과 동물 조직 유래 성분 (예를 들어, 성장 인자) 이 혼입되어 있는 배지도, 무조정 또는 미정제 혈청을 포함하지 않는 한 무혈청 배지에 포함된다.
무혈청 배지는 혈청 대체물을 함유하고 있다. 혈청 대체물로는 예를 들어, 알부민, 트랜스페린, 지방산, 콜라겐 전구체, 미량 원소, 2-메르캅토에탄올 또는 3' 티올글리세롤, 또는 이들의 균등물 등을 적절히 함유하는 것을 들 수 있다. 그러한 혈청 대체물은 예를 들어, WO98/30679 에 기재된 방법에 의해 제조할 수 있다. 혈청 대체물로는 시판품을 이용하고 있다. 그러한 시판 혈청 대체물로서, 예를 들어 Knockout™ 혈청 대체물 (Life Technologies 사제: 이하, KSR 로 표기하기도 한다), 화학적으로 결정된 지질 농축물 (Life Technologies 사제), Glutamax™ (Life Technologies 사제), B27 (Life Technologies 사제), 및 N2 (Life Technologies 사제) 을 들 수 있다.
부유 배양에 사용된 무혈청 배지는 적절히 지방산 또는 지질, 아미노산 (예를 들어, 비필수 아미노산), 비타민, 성장 인자, 사이토카인, 항산화제, 2-메르캅토에탄올, 피루브산, 완충제, 무기 염류 등을 함유하고 있다.
조제의 곤란을 회피하기 위해, 이러한 무혈청 배지로 시판 KSR (라이프 테크놀로지 (Life Technologies) 사제) 를 적량 (예를 들어, 약 0.5% 내지 약 30%, 바람직하게는 약 1% 내지 약 20%) 첨가한 무혈청 배지 (예를 들어, F-12 배지와 IMDM 배지의 1:1 혼합액에 1 × 화학적으로 결정된 지질 농축물, 5% KSR 및 450 μM 1-모노티오글리세롤을 첨가한 배지) 를 사용할 수 있다. 또한 KSR 동등품으로 JP-A-2001-508302 에 개시된 배지를 들 수 있다.
본 발명에서 "혈청 배지" 는 무조정 또는 미정제 혈청을 포함하는 배지를 의미한다. 당해 배지는 지방산 또는 지질, 아미노산 (예를 들어, 비필수 아미노산), 비타민, 성장 인자, 사이토카인, 항산화제, 2-메르캅토에탄올, 1-모노티오글리세롤, 피루브산, 완충제, 무기 염류 등을 함유할 수 있다. 예를 들어, 마트리겔 등의 기저막 표품을 사용하여 다능성 줄기 세포를 망막 조직 등으로 분화 유도하는 경우에는, 혈청 배지를 사용할 수 있다 (Cell Stem Cell, 10(6), 771-775 (2012)).
본 발명의 배양은 바람직하게는 제노프리 조건 하에 열린다. "제노프리" 는 배양 중인 세포의 생물종과 다른 생물종 유래의 성분이 배제된 조건을 의미한다.
본 발명에 사용 배지는 화학적으로 미결정된 성분의 혼입을 회피하는 관점에서, 바람직하게는 함유 성분이 화학적으로 결정된 배지 (Chemically defined medium; CDM) 이다.
본 발명에서 "기저막 (Basement membrane)" 양의 구조는 세포외 기질로 구성된 얇은 막 모양의 구조를 의미한다. 기저막은 생체에서는 상피 세포의 기저측 (basal) 에 형성된다. 기저막 성분으로는 IV 형 콜라겐, 라미닌, 헤파란 황산 프로테오글리칸 (퍼레칸), 엔탁틴/니도겐, 사이토카인, 성장 인자 등을 들 수 있다. 생체 유래의 조직 중 및 본 발명의 제조 방법 등으로 제조된 세포괴 중에 기저막이 존재하고 있는지는, 예를 들어 PAM 염색 등의 조직 염색 및 기저막의 구성 성분에 대한 항체 (항-라미닌 항체, 항-IV 형 콜라겐 항체 등) 를 이용한 면역 조직 화학 등의 방법에 의해 검출할 수 있다.
본 발명에서 "기저막 표품" 은 그 위에 기저막 형성능을 갖는 원하는 세포를 파종하여 배양한 경우, 상피 세포 같은 세포 형태, 분화, 증식, 운동, 기능 발현 등을 제어하는 기능을 갖는 기저막 구성 성분을 포함하는 것을 말한다. 예를 들어, 본 발명에 따라 제조된 세포 및 조직을 분산시키고 나아가 접착 배양할 때, 기저막 표품의 존재 하에서 배양할 수 있다. 여기에서 "기저막 구성 성분" 이라 함은 동물의 조직에서 상피 세포층과 간질 세포층 등의 사이에 존재하는 얇은 막 모양을 한 세포외 매트릭스 분자를 말한다. 기저막 표품은 예를 들어 기저막을 통해 지지체에 접착하고 있는 기저막 형성능을 갖는 세포를 상기 세포의 지질 용해능을 갖는 용액 및 알칼리 용액 등을 이용하여 지지체에서 제거함으로써 제조할 수 있다. 기저막 표품의 예로는 기저막 조제물로 시판되고 있는 상품 (예를 들어, Matrigel™ (Becton, Dickinson and Company: 이하, 마트리겔로 표기하기도 한다)) 와 Geltrex™ (Life Technologies 사제), 및 기저막 성분으로 공지된 세포외 기질 분자 (예를 들어, 라미닌, IV 형 콜라겐, 헤파란 황산 프로테오글리칸, 및 엔탁틴) 를 들 수 있다.
본 발명에서 Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) 마우스 육종 등의 조직 또는 세포에서 추출, 가용화된 마트리겔 (Corning 사제) 등의 기저막 표품을 세포 및 조직의 배양에 이용할 수 있다. 마찬가지로 세포 배양에 사용하는 기저막 성분으로 인간 가용화 양막 (Bioresource Application Institute, Co. 사제), HEK293 세포에 의해 생산된 인간 재조합 라미닌 (BioLamina 사제), 인간 재조합 라미닌 단편 (Nippi, Inc. 사제), 인간 재조합 비트로넥틴 (Thermo Fisher 사제) 등도 사용할 수 있다. 다른 생물종 유래 성분 혼입을 회피하는 관점 및 감염증의 위험을 회방하는 관점에서, 바람직하게는 성분이 명백한 재조합 단백질을 사용한다.
본 발명에서 "물질 X 를 포함하는 배지" 및 "물질 X 의 존재" 는 각각 외래성 (exogenous) 의 물질 X 가 첨가된 배지 또는 외래성 물질 X 를 포함하는 배지 및 외래성 물질 X 의 존재를 의미한다. 외래성 물질 X 는 예를 들어 배지에 존재하는 세포 또는 조직이 당해 물질 X 를 내재적 (endogenous) 으로 발현, 분비 혹은 생산하는 내재적인 물질 X 와 구별된다.
예를 들어, "소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질을 포함하는 배지" 는 외래성 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질이 첨가된 배지 또는 외래성 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질을 포함하는 배지를 의미한다.
본 발명에서 "피더 세포" 는 줄기 세포를 배양할 때 공존하는 당해 줄기 세포 이외의 세포이다. 다능성 줄기 세포의 미분화 유지 배양에 이용되는 피더 세포로는, 예를 들어, 마우스 섬유아세포 (MEF), 인간 섬유아세포, 또는 SNL 세포 등을 들 수 있다. 피더 세포로 증식 억제 처리한 피더 세포가 바람직하다. 증식 억제 처리로는 증식 억제제 (예를 들어, 마이토마이신 C) 처리 또는 UV 조사 등을 들 수 있다. 다능성 줄기 세포의 미분화 유지 배양에 이용되는 피더 세포는 체액성 인자 (바람직하게는 미분화 상태 유지 인자) 의 분비 및 세포 접착용 스카폴드 (세포외 기질) 의 생성에 의해 다능성 줄기 세포 미분화 유지에 기여한다.
본 발명에서 세포의 "응집체" (aggregate) 는 배지에 분산되어 있던 세포가 집합하여 형성된 덩어리이며, 세포끼리 접착하고 있는 덩어리를 말한다. 세포괴, 배양체 (Embryoid body), 스피어 (Sphere), 스페로이드 (Spheroid), 오르가노이드 (Organoid) 도 세포 응집체에 포함된다. 바람직하게는 세포의 응집체에서 세포끼리 면접착하고 있다. 일부 양태에서, 응집체의 일부분 혹은 전부에서 세포들이 세포-세포 간의 결합 (cell-cell junction) 및/또는 세포 접착 (cell adhesion), 예를 들어 접착 결합 (adherence junction) 을 형성하고 있는 경우가 있다. 본 발명에서 "응집체" 로 구체적으로는 하기 "2. 뇌하수체 조직을 포함하는 세포괴의 제조 방법" 의 제 1 공정에서 생성하는 부유 배양 개시시에 분산되어 있던 세포가 형성하는 응집체를 들 수 있다.
본 발명에서 "균일한 응집체" 란 여러 응집체를 배양할 때 각 응집체의 크기가 일정하다는 것을 의미하고 응집체의 크기를 최대 지름의 길이로 평가하는 경우, 균일한 응집체는 최대 지름의 길이의 분산이 작은 것을 의미한다. 보다 구체적으로는 응집체 집단 전체 중 75% 이상의 응집체가 해당 응집괴 집단의 최대 지름의 평균치 ± 100%, 바람직하게는 평균치 ± 50% 의 범위 내, 보다 바람직하게는 평균치 ± 20% 의 범위 내에 있는 것을 의미한다.
본 발명에서 "균일한 응집체를 형성시킨다" 는 세포를 집합시켜 세포의 응집체를 형성시켜 부유 배양할 때 일정 수의 분산된 세포를 신속하게 응집시킴으로써 크기가 균일한 세포의 응집체를 형성시키는 것을 말한다.
"분산" 은 세포와 조직을 효소 처리와 물리적 처리 등의 분산 처리에 의해 작은 세포 단편 (2 세포 이상 100 세포 이하, 바람직하게는 50 세포 이하) 또는 단일 세포까지 분리시키는 것을 말한다. 일정 수의 분산된 세포는 세포 단편 또는 단일 세포를 일정 개수 모아 놓은 것을 말한다.
다능성 줄기 세포를 분산시키는 방법으로는 예를 들어, 기계적 분산 처리, 세포 분산액 처리, 세포 보호제 첨가 처리를 들 수 있다. 이러한 처리를 사용하여 측정할 수 있다. 바람직하게는 세포 분산액 처리하고, 이어서 기계적 분산 처리를 하면 좋다.
기계적 분산 처리 방법으로는 피펫 처리 또는 스크레이퍼로 긁어내는 작업을 들 수 있다.
세포 분산액 처리에 사용되는 세포 분산액으로는 예를 들어, 트립신, 콜라게나아제, 히알루로니다아제, 엘라스타아제, 프로나아제, DNase 또는 파파인 등의 효소류 및 에틸렌디아민테트라아세트산 등의 킬레이트제 중 하나를 포함하는 용액을 들 수 있다. 시판의 세포 분산액 예를 들어, Accumax (Innovative cell technologies 사제) 와 TrypLE Select (Life Technologies 사제) 를 이용할 수도 있다.
세포 보호제 첨가 처리에 사용되는 세포 보호제로서, FGF 신호 전달 경로 활성화 물질, 헤파린, ROCK 저해 물질, 혈청 또는 혈청 대체물을 들 수 있다. 바람직한 세포 보호제로는 ROCK 저해 물질을 들 수 있다.
예를 들어, 다능성 줄기 세포를 분산시키는 방법으로 다능성 줄기 세포의 콜로니를 세포 보호제로서 ROCK 저해 물질의 존재 하에서 세포 분산액 (Accumax) 으로 처리하고, 피펫팅 (pipetting) 으로 추가로 분산시키는 방법을 들 수 있다.
본 발명의 제조 방법에 있어서는, 다능성 줄기 세포를 신속하게 집합시켜 다능성 줄기 세포의 응집체를 형성시키는 것이 바람직하다. 이와 같이 다능성 줄기 세포의 응집체를 형성시키면 형성된 응집체에서 분화 유도되는 세포에서 상피양의 구조를 재현성 있게 형성시킬 수 있다. 응집체를 형성시키는 실험적인 작업으로는 예를 들어, 웰이 작은 플레이트 (예를 들어, 웰의 바닥 면적이 평평한 바닥 환산으로 0.1 - 2.0 ㎠ 정도의 플레이트) 와 마이크로포어 등을 이용하여 작은 공간에 세포를 가두는 방법, 작은 원심 튜브를 이용하여 단시간 원심하여 세포를 응집시키는 방법을 들 수 있다. 웰이 작은 플레이트로, 예를 들어 24 웰 플레이트 (면적이 평평한 바닥 환산으로 1.88 ㎠ 정도), 48 웰 플레이트 (면적이 평평한 바닥 환산으로 1.0 ㎠ 정도), 96 웰 플레이트 (면적이 평평한 바닥 환산으로 0.35 ㎠ 정도, 내경 6 - 8 ㎜ 정도), 및 384 웰 플레이트를 들 수 있다. 바람직하게는 96 웰 플레이트를 들 수 있다. 웰이 작은 플레이트의 모양으로 웰을 위에서 보았을 때의 저면의 모양은 다각형, 사각형, 타원, 원형을 들 수 있으며, 바람직하게는 원형을 들 수 있다. 웰이 작은 플레이트의 모양으로 웰을 옆에서 봤을 때 저면의 형상으로는 외주부가 높고 내부 요면이 낮은 구조가 바람직하며, 예를 들어, U 바닥, V 바닥 또는 M 바닥을 들 수 있으며, 바람직하게는 U 바닥 또는 V 바닥, 가장 바람직하게는 V 바닥을 들 수 있다. 웰이 작은 플레이트로, 세포 배양 디쉬 (예를 들어, 60 ㎜ - 150 ㎜ 디쉬, 배양 플라스크) 의 저면에 요철 또는, 움푹한 곳이 있는 것을 사용해도 좋다. 웰이 작은 플레이트의 저면은 세포 비접착성 저면, 바람직하게는 상기 세포 비접착성 코팅 저면을 이용하는 것이 바람직하다.
다능성 줄기 세포의 응집체가 형성된 것이나, 응집체를 형성하는 각 세포에서 상피양의 구조가 형성된 것은 응집체의 크기 및 세포수, 거시적 형태, 조직 염색 분석에 의한 미시적 형태 및 균일성, 분화 및 미분화 마커의 발현 및 균일성, 분화 마커의 발현 제어 및 동시성, 분화 효율의 응집체 간의 재현성 등에 따라 판단하는 것이 가능하다.
본 발명에서 "조직" 은 형태나 성질이 다른 복수 종류의 세포가 일정한 패턴으로 입체적으로 배치된 구조를 가지는 세포 집단의 구조를 가리킨다.
본 발명에서 "신경 조직" 은 발생기 또는 성체기의 대뇌, 중뇌, 간뇌, 소뇌, 척수, 망막, 말초 신경 등의 신경계 세포에 의해 구성된 조직을 의미한다. 신경 조직은 계층 구조를 가진 상피 구조 (신경 상피) 를 형성할 수 있으며, 신경 조직 중의 신경 상피는 광학 현미경을 이용한 명시야 관찰에 의해 존재량을 평가할 수 있다.
본 발명에서 "간뇌" 는 제 3 뇌실에 접한 중추 신경계의 신경 조직을 가리킨다. 간뇌에는 시상상부, 시상, 시상하부, 뇌하수체 등의 조직이 포함된다.
본 발명에서 "시상하부" 는 뇌하수체에 접한 간뇌의 한 영역을 가리킨다. 시상하부는 또한 배측 시상하부 및 복측 시상하부 영역화 된다. 시상하부는 Rx, Vax1 및 Six3 과 같은 마커를 이용하여 식별할 수 있다. 배측 시상하부는 Otp, Brn2 및 바소프레신과 같은 마커를 이용하여 식별할 수 있다. 복측 시상하부는 Nkx2.1 및 SF1 과 같은 마커를 이용하여 식별할 수 있다.
본 발명에서 "뇌실" 은 중추 신경 조직에 의해 형성된 강소를 말한다. 생체에서는 통상 뇌척수액 등의 조직액으로 채워져 있는 무세포성 구조이며, 신경 조직의 정단면 측이 뇌실에 면해 있다. 뇌실을 둘러싼 뇌실 주위 층은 신경 줄기 세포가 존재하고 발생기에 세포 증식과 뉴런 생산이 일어나는 영역이다. 본 발명의 제조 방법으로 제조되는 세포괴 및 조직 중에 뇌실이 포함되는지 여부는, 예를 들어 중추 신경 조직 마커 (Bf1, Pax6 등) 및 정단면 마커 (PKC-제타 등) 를 이용한 면역 조직 화학 등의 방법에 의해 검출할 수 있다.
본 발명에서 "신경계 세포 (Neural cell)" 는 외배엽 유래 조직 중 표피계 세포 이외의 세포를 나타낸다. 즉, 신경계 전구 세포, 뉴런 (신경계 세포), 아교 세포, 신경 줄기 세포, 뉴런 전구 세포 및 아교 전구 세포 등의 세포를 포함한다. 신경계 세포는 아래 언급된 망막 조직을 구성하는 세포 (망막 세포), 망막 전구 세포, 망막층 특이적 신경 세포, 신경 망막 세포, 망막 색소 상피 세포도 포함된다. 신경계 세포는 네스틴, TuJ1, PSA-NCAM, N-카드헤린 등을 마커로 사용하여 식별할 수 있다.
뉴런은 신경 회로를 형성하여 정보 전달에 기여하는 기능적인 세포이며, TuJ1, Dcx, 및 HuC/D 등의 미성숙 신경 세포 마커, 및/또는 Map2, 및 NeuN 등의 성숙 신경 세포 마커의 발현을 지표로 동정할 수 있다.
아교 세포 (glial cell) 로, 아스트로사이트, 올리고덴드로사이트, 뮐러 아교 세포 등을 들 수 있다. 아스트로사이트의 마커로는 GFAP 를 들 수 있고, 올리고덴드로사이트의 마커로는 o4 를 들 수 있고, 뮐러 아교 세포 마커로는 CRALBP 등을 들 수 있다.
신경 줄기 세포는 신경 세포와 아교 세포의 분화능 (다분화능) 과 다분화능을 유지하는 증식능 (자기 복제능이라고도 한다) 을 가진 세포이다. 신경 줄기 세포의 마커로는 네스틴, Sox2, Musashi, Hes 패밀리, CD133 등을 들 수 있다; 그러나, 이러한 마커는 일반적으로 기원/전구 세포 마커이며 신경 줄기 세포 특이적 마커는 고려하지 않는다. 신경 줄기 세포의 수는 뉴로스피어 어세이 및 클로날 어세이 등에 의해 평가할 수 있다.
뉴런 전구 세포는 증식능을 가지고, 신경계 세포를 생산하고, 아교 세포를 생산하지 않는 세포이다. 뉴런 전구 세포 마커로는 Tbr2, Tα1 등을 들 수 있다. 또는 미성숙 신경계 세포 마커 (TuJ1, Dcx, HuC/D) 양성 및 증식 마커 (Ki67, pH3, MCM) 양성 세포를 뉴런 전구 세포로 분류할 수 있다.
아교 전구 세포는 증식능을 갖고, 아교 세포를 생산하고, 신경계 세포를 생산하지 않는 세포이다.
신경계 전구 세포 (Neural Precursor cell) 는 신경 줄기 세포, 뉴런 전구 세포 및 아교 전구 세포를 포함하는 전구 세포의 집합체이며, 증식능과 뉴런 및 아교 세포 생산능을 가진다. 신경계 전구 세포는 네스틴, GLAST, Sox2, Sox1, Musashi, Pax6 등을 마커로 식별할 수 있다. 또는 신경계 세포 마커 양성 및 증식 마커 (Ki67, pH3, MCM) 양성 세포를 뉴런 전구 세포로 분류할 수 있다.
본 발명에서 "비신경 상피 조직" 은 상피 구조를 갖는 조직 중 신경 상피 조직 이외의 조직을 나타낸다. 상피 조직은 외배엽, 중배엽, 내배엽, 영양 외배엽 중의 배엽으로부터 형성된다. 상피 조직은 상피, 중피, 내피가 포함된다. 비신경 상피 조직에 포함된 조직의 예로는 표피, 각막 상피, 비강 상피, 구강 상피, 기관 상피, 기관지 상피, 기도 상피, 신상피, 신피질 상피, 태반 상피 등을 들 수 있다.
상피 조직은 통상 다양한 세포간 결합에 의해 연결되어 있으며, 단층 또는 중층화된 계층 구조를 갖는 조직을 형성한다. 이러한 상피 조직의 유무를 확인하고 존재량의 정량은 광학 현미경으로 관찰하거나 상피 세포 마커에 대한 항체 (항-E-카드헤린 항체, 항-N-카드헤린 항체, 항-EpCAM 항체 등) 를 이용한 면역 조직 화학 등의 방법에 의해 가능하다.
본 발명에서 "상피 세포 극성 (epithelial polarity)" 은 상피 세포 내에 공간적으로 형성되어 있는 구성 성분 및 세포 기능의 분포의 편차를 나타낸다. 예를 들어, 각막 상피 세포는 안구의 최외층에 국재하고, 정단측 (apical) 에는 누액을 보유하는 막 결합형 뮤신 (MUC-1, 4, 16) 등의 정단측 특이적인 단백질을 발현하고, 기저측 (basal) 에는 기저막에 접착하는 α6 인테그린, β1 인테그린 등의 기저측 특이적인 단백질을 발현하고 있다.
생체 유래의 조직 중 및 본 발명의 제조 방법 등으로 제조된 세포괴 중의 상피 세포 및 상피 조직 상피 세포 극성이 존재하는지 여부는 Phalloidin, 정단측 마커 (항-MUC-1 항체, 항-PKC-제타 항체 등) 및 기저측 마커 (항-α6 인테그린 항체, 항-β1 인테그린 항체 등) 를 이용한 면역 조직 화학 등의 방법에 의해 검출할 수 있다.
본 발명에서 "플라코드 (placode)" 라 함은 주로 척추 동물의 발생 과정에서 표피 외배엽의 일부가 두꺼워져 형성되는 기관의 시원체의 수를 나타낸다. 플라코드에서 유래하는 조직으로는 수정체, 코, 내이, 삼차 신경, 선성 뇌하수체 등을 들 수 있다. 플라코드 또는 그 전구체 조직 (preplacode region) 의 마커로는 Six1, Six4, Dlx5, Eya2, Emx2, Bf1 등을 들 수 있다.
본 발명에서 "뇌하수체 플라코드" 는 배발생 과정에서 표피 외배엽의 영역에 형성되는 두꺼워진 구조이며, 뇌하수체 전구 세포 마커를 발현하는 것을 말한다. 뇌하수체 전구 세포 마커로는 Lim3, Pitx1/2, Islet1/2 등을 들 수 있다. 뇌하수체 플라코드는 Lim3, Pitx1 및 Islet1/2 로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나, 바람직하게는 모든 뇌하수체 전구 세포 마커를 발현한다. 뇌하수체 플라코드가 함입하여, 발생 도중 주머니 모양의 구조인 라트케낭 (Rathke's pouch) 을 형성하고, 발생이 더 진행되면 선성 뇌하수체를 형성한다.
본 발명에서 "선성 뇌하수체" 는 적어도 1 종의 전엽 또는 중엽의 뇌하수체 세포를 포함하는 조직을 말한다. 뇌하수체 세포에는 생리 기능을 조절하는 호르몬을 생산하는 뇌하수체 호르몬 생산 세포와 비(非)호르몬 생산 세포가 포함된다. 뇌하수체 호르몬 생산 세포로는 성장 호르몬 (GH) 생산 세포, 프로락틴 (PRL) 생산 세포, 부신피질 자극 호르몬 (ACTH) 생산 세포, 갑상선 자극 호르몬 (TSH) 생산 세포, 난포 자극 호르몬 (FSH) 생산 세포, 황체화 호르몬 (LH) 생산 세포 등의 전엽을 구성하는 세포; 멜라닌 세포 자극 호르몬 (MSH) 생산 세포 등의 중엽을 구성하는 세포를 들 수 있다. 비호르몬 생산 세포의 예에는 혈관 내피 세포, 원피 세포, 여포 성상 세포, 뇌하수체 줄기 세포, 뇌하수체 전구 세포가 포함된다.
한 양태에서, 선성 뇌하수체는 성장 호르몬 (GH) 생산 세포, 프로락틴 (PRL) 생산 세포 및 부신피질 자극 호르몬 (ACTH) 생산 세포로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 1 종, 바람직하게는 2 종, 더욱 바람직하게는 3 종의 뇌하수체 호르몬 생산 세포를 포함한다. 또다른 양태에서, 선성 뇌하수체는 성장 호르몬 (GH) 생산 세포, 프로락틴 (PRL) 생산 세포, 부신피질 자극 호르몬 (ACTH) 생산 세포, 갑상선 자극 호르몬 (TSH) 생산 세포, 난포 자극 호르몬 (FSH) 생산 세포 및 황체화 호르몬 (LH) 생산 세포로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 1 종, 바람직하게는 2 종 이상 (2, 3, 4, 5 또는 6 종) 의 뇌하수체 호르몬 생산 세포를 포함한다. 생체 유래의 조직 중 및 본 발명의 제조 방법 등으로 만든 세포괴 중에 선성 뇌하수체와 뇌하수체 호르몬 생산 세포가 포함되어 있는지 여부는 성장 호르몬 (GH) 생산 세포 마커 (항-Pit1 항체, 항-GH 항체 등), 프로락틴 (PRL) 생산 세포 마커 (항-Pit1 항체, 항-PRL 항체 등), 부신피질 자극 호르몬 (ACTH) 생산 세포 마커 (항-T-Pit 항체, 항-NeuroD1 항체, 항-ACTH 항체 등), 갑상선 자극 호르몬 (TSH) 생산 세포 마커 (항-GATA2 항체, 항-ACTH 항체 등), 난포 자극 호르몬 (FSH) 생산 세포 및 황체화 호르몬 (LH) 생산 세포 마커 (항-GATA2 항체, 항-SF1 항체, 항-FSH 항체, 항-LH 항체 등) 를 이용한 면역 조직 화학 및 분비된 호르몬에 대한 ELISA 등의 방법에 의해 검출할 수 있다.
본 발명에서 "뇌하수체 줄기 세포" 는 뇌하수체에 존재하는 뇌하수체 조직의 재생과 뇌하수체 호르몬 생산 세포의 공급에 기여하는 미분화된 복능성 줄기 세포, 전구 세포의 수를 말한다. 본 발명의 제조 방법으로 제조되는 세포괴 및 조직 중에 뇌하수체 줄기 세포가 포함되어 있는지는, 예를 들어 Sox2, Sox9, E-카드헤린, 네스틴, S100β, GFRα2, Prop1, CD133, β-카테닌, Klf4, Oct4, Pax6, 콕사키바이러스 및 아데노바이러스 공통 수용체 (CXADR), PRRX1/2, 에프린-B2, ACE, YAP1, TAZ 등의 뇌하수체 줄기 세포 마커 및 Ki67 인산화 히스톤 H3, MCM 등의 세포 증식 마커에 대한 항체를 이용한 면역 조직 화학, BrdU, EdU, IdU 등의 핵산 아날로그를 이용한 증식 세포 표시화 어세이, 형광 표지 디펩티드 (β-알라닐-라이실-N-7-아미노-4-메틸쿠마린-3-아세트산) 의 ptake 어세이; 증식된 세포 표지화 어세이, u, 뇌하수체 스피어 (pitusphere) 형성 어세이 등의 방법을 통해 감지할 수 있다.
본 발명에서 "틈새" 또는 "줄기 세포 틈새" 는 줄기 세포의 증식, 분화, 성질의 유지 등에 관한 미세 환경을 말한다. 생체의 틈새의 예로는 조혈 줄기 세포 틈새, 모낭 줄기 세포 틈새, 장관 상피 줄기 세포 틈새, 근육 줄기 세포 틈새, 뇌하수체 틈새 등을 들 수 있다. 이러한 틈새에서 각 조직 특유의 줄기 세포 틈새를 제공하는 지지 세포가 존재하고, 지지 세포가 제공하는 사이토카인, 케모카인, 세포외 기질, 세포 접착 인자, 세포간 신호 전달 인자 등에 의해 줄기 세포가 유지되고 있다.
본 발명에서 "뇌하수체 틈새" 는 뇌하수체 줄기 세포의 증식, 분화, 성질의 유지 등에 관한 미세 환경을 말한다. 뇌하수체 틈새로는 발생기의 주머니 모양의 라트케낭 중공부의 흔적으로 뇌하수체 전엽과 중엽 사이에 남아 있는 잔류 공동 (라트케 열구) 주변에 존재하는 Maginal Cell Layer (MCL) 틈새 및 뇌하수체 전엽에 산재해 있는 실질층 (Parenchymal) 틈새를 들 수 있다.
본 발명에서 "신경 능선" 은 척추 동물의 초기 발생에서 표피 외배엽과 신경판에 형성되는 구조를 나타내고, "신경 능선 세포 또는 신경 능선 유래 세포" 는 신경 능선에 존재하는 세포 내지 신경 능선 유래 유주, 분화된 세포를 나타낸다. 신경 능선 유래 세포로는 예를 들어 말초 신경계의 신경계 세포, 지지 세포, 색소 세포, 내분비 세포, 평활근, 두부 골격 세포, 간엽계 세포 등을 들 수 있다. 본 발명의 제조 방법으로 제조되는 세포괴 및 조직 중에 신경 능선 세포 및 신경 능선 유래 세포가 포함될지 여부는 네스틴, Sox10, Sox9, Slug, Snail, Twist, FoxD3, TFAP2, Pax3, Pax7, HNK-1, 및 p75NTR 등 신경 능선 세포 마커에 대한 항체를 이용한 면역 조직 화학 등의 방법에 의해 검출할 수 있다.
본 발명에서 "간엽계 세포" 는 주로 중배엽 및 신경 능선에서 파생하는 결합 조직을 형성하는 비상피성 세포이다. 이러한 세포 중 일부는 간엽계 줄기 세포로 호칭되는 복능성 체성 줄기 세포이다. 본 발명의 제조 방법으로 제조되는 세포괴 및 조직 중에 간엽계 세포가 포함될지 여부는 네스틴, 비멘틴, 카드헤린-11, 라미닌, CD44 등 간엽계 세포 마커에 대한 항체를 이용한 면역 조직 화학 등의 방법에 의해 검출할 수 있다. 간엽계 줄기 세포가 포함될지 여부는 CD9, CD13, CD29, CD44, CD55, CD59, CD73, CD105, CD140b, CD166, VCAM-1, STRO-1 c-Kit, Sca-1, Nucleostemin, CDCP1, BMPR2, BMPR1A 및 BPMR1B 등 간엽계 줄기 세포 마커에 대한 항체를 이용한 면역 조직 화학 등의 방법에 의해 검출할 수 있다.
2. 뇌하수체 조직을 포함하는 세포괴의 제조 방법
본 발명은 뇌하수체 조직을 포함하는 세포괴 및 그 제조 방법을 제공한다. 이하, 본 발명의 제조 방법으로도 칭한다.
본 발명의 제조 방법의 일 태양은 하기 공정 (1) 및 (2) 를 포함하는, 뇌하수체 조직을 포함하는 세포괴의 제조 방법이다.
(1) 다능성 줄기 세포를 Wnt 신호 전달 경로 저해 물질의 존재 하에 부유 배양하여 세포 응집체를 형성시키는 제 1 공정,
(2) 제 1 공정에서 얻어진 응집체를 BMP 신호 전달 경로 활성화 물질 및 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질의 존재 하에 부유 배양하여 뇌하수체 조직을 포함하는 세포괴를 얻는 제 2 공정.
본 발명의 제조 방법의 바람직한 양태는 하기 공정 (a), (1) 및 (2) 를 포함하는, 뇌하수체 조직을 포함하는 세포괴의 제조 방법이다.
(a) 다능성 줄기 세포를 피더 세포의 비존재 하에 1) TGFβ 패밀리 신호 전달 경로 저해 물질 및/또는 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질, 및 2) 미분화 상태 유지 인자를 포함하는 배지에서 배양하는 공정 a,
(1) 공정 a 에서 배양된 세포를 Wnt 신호 전달 경로 저해 물질의 존재 하에 부유 배양하여 세포 응집체를 형성시키는 제 1 공정,
(2) 제 1 공정에서 얻어진 응집체를 BMP 신호 전달 경로 활성화 물질 및 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질의 존재 하에 부유 배양하여 뇌하수체 조직을 함유하는 세포괴를 얻는 제 2 공정.
본 발명의 제조 방법의 더 바람직한 양태는 하기 공정 (1), (2-1) 및 (2-2) 를 포함하는, 뇌하수체 조직을 포함하는 세포괴의 제조 방법이다.
(1) 다능성 줄기 세포를 Wnt 신호 전달 경로 저해 물질의 존재 하에 부유 배양하여 세포 응집체를 형성시키는 제 1 공정,
(2-1) 제 1 공정에서 얻어진 응집체를, BMP 신호 전달 경로 활성화 물질 및 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질의 존재 하에 부유 배양하는 제 2 공정 (1),
(2-2) 제 2 공정 (1) 에서 부유 배양된 응집체를, BMP 신호 전달 경로 저해 물질의 존재 하에 부유 배양하여 뇌하수체 조직을 포함하는 세포괴를 얻는 제 2 공정 (2).
본 발명의 제조 방법의 새로운 일 태양은 하기 공정 (a), (1), (2-1) 및 (2-2) 를 포함하는, 뇌하수체 조직을 포함하는 세포괴의 제조 방법이다.
(a) 다능성 줄기 세포를 피더 세포의 비존재 하에 1) TGFβ 패밀리 신호 전달 경로 저해 물질 및/또는 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질, 및 2) 미분화 상태 유지 인자를 포함하는 배지에서 배양하는 공정 a,
(1) 공정 a 에서 배양된 세포를 Wnt 신호 전달 경로 저해 물질의 존재 하에 부유 배양하여 세포 응집체를 형성시키는 제 1 공정,
(2-1) 제 1 공정에서 수집한 응집체를 BMP 신호 전달 경로 활성화 물질 및 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질의 존재 하에 부유 배양하는 제 2 공정 (1),
(2-2) 제 2 공정에서 부유 배양된 응집체를 BMP 신호 전달 경로 저해 물질의 존재 하에 부유 배양하여 뇌하수체 조직을 포함하는 세포괴를 얻는 제 2 공정 (2).
<공정 (a)>
다능성 줄기 세포를 피더 세포의 비존재 하에 1) TGFβ 패밀리 신호 전달 경로 저해 물질 및/또는 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질, 및 2) 미분화 상태 유지 인자를 포함하는 배지에서 배양하는 a 공정에 대해 설명한다.
공정 (a) 에서 다능성 줄기 세포를 TGFβ 패밀리 신호 전달 경로 저해 물질 및/또는 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질로 처리한 후, 제 1 공정에서 부유 배양에 적용했을 때, 다능성 줄기 세포의 상태가 변하고, 비신경 상피 조직의 형성 효율이 개선되고, 응집체의 질이 향상되고, 분화가 쉬워지고, 세포사가 일어나기 어렵고, 응집체의 내부가 조밀한 미분화성을 유지한 세포 응집체를 고효율로 제조할 수 있다.
공정 (a) 는 피더 세포의 비존재 하에 실시하는 것이 바람직하다.
본 발명의 피더 세포의 비존재 하 (피더-프리) 는 피더 세포를 실질적으로 포함하지 않는 (예를 들어, 전체 세포수에 대한 피더 세포수의 비율이 3% 이하) 조건을 의미한다.
공정 (a) 에서 사용되는 배지는 피더-프리 조건 하에 다능성 줄기 세포의 미분화 유지 배양을 가능하게 하는 배지 (피더-프리 배지) 이면 특별히 한정되지 않는다. 예를 들어, 미분화 상태 유지 인자를 포함하고 TGFβ 패밀리 신호 전달 경로 저해 물질 및/또는 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질을 포함하는 배지를 들 수 있다.
공정 (a) 에서 사용되는 배지는 미분화 유지 배양을 가능하게 하는 미분화 상태 유지 인자를 포함한다. 미분화 상태 유지 인자는 다능성 줄기 세포의 분화를 억제하는 작용을 갖는 물질이라면 특별히 제한은 없다. 당업자에 범용되는 미분화 상태 유지 인자로는 프라임드 다능성 줄기 세포 (primed pluripotent stem cells) (예를 들어, 인간 ES 세포, 인간 iPS 세포) 의 경우, FGF 신호 전달 경로 활성화 물질, TGFβ 패밀리 신호 경로 활성화 물질, 인슐린 등을 들 수 있다. FGF 신호 전달 경로 활성화 물질로서 구체적으로는 섬유아세포 증식 인자 (예를 들어, bFGF, FGF4 및 FGF8) 를 들 수 있다. 또한 TGFβ 패밀리 신호 전달 경로 활성화 물질로는 TGFβ 신호 전달 경로 활성화 물질, 노달 (Nodal)/액티빈 (Activin) 신호 전달 경로 활성화 물질이 있다. TGFβ 신호 전달 경로 활성화 물질로서, 예를 들어 TGFβ1, TGFβ2 를 들 수 있다. 노달/액티빈 신호 전달 경로 활성화 물질로서, 예를 들어 노달, 액티빈A, 액티빈B 를 들 수 있다. 인간 다능성 줄기 세포 (인간 ES 세포, 인간 iPS 세포) 를 배양할 경우, 공정 (a) 에서 배지는 바람직하게는 미분화 상태 유지 인자로서 bFGF 를 포함한다.
본 발명에 사용 미분화 상태 유지 인자는 일반적으로 포유 동물의 미분화 상태 유지 인자이다. 포유 동물로는 상기의 것을 들 수 있다. 미분화 상태 유지 인자는 포유 동물 종 사이에서 교차 반응성을 가질 수 있기 때문에 배양되는 다능성 줄기 세포의 미분화 상태를 유지할 수 있는 한 임의의 포유 동물의 미분화 상태 유지 인자를 사용할 수 있다. 바람직하게는, 배양되는 세포와 같은 종류의 포유 동물의 미분화 상태 유지 인자가 사용된다. 예를 들어, 인간 다능성 줄기 세포의 배양에는 인간 미분화 상태 유지 인자 (예를 들어, bFGF, FGF4, FGF8, EGF, 노달, 액티빈A, 액티빈B, TGFβ1, TGFβ2 등) 가 사용된다. 여기에서 "인간 단백질 X" 는 단백질 X (미분화 상태 유지 인자 등) 가 인간 생체 내에서 자연적으로 발현하는 단백질 X 의 아미노산 서열을 갖는 것을 의미한다.
본 발명에서 사용되는 미분화 상태 유지 인자는 바람직하게는 단리되어 있다.
"단리된" 은 목적으로 하는 성분 또는 세포 이외의 인자를 제거하는 조작이 이루어져, 성분 또는 세포가 더이상 자연적으로 존재하는 상태에 있지 않음을 의미한다. 따라서, "단리된 단백질 X" 에는 배양되는 세포 또는 조직에서 생산된 세포와 조직 및 배지에 포함되어 있는 내재성 단백질 X 는 포함되지 않는다. "단리된 단백질 X" 의 순도 (총 단백질 중량에서 차지하는 단백질 X 의 중량의 백분율) 는 일반적으로 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 99% 이상, 가장 바람직하게는 100% 이다.
본 발명은 일 태양에서 단리된 미분화 상태 유지 인자를 제공하는 단계를 포함한다. 또한 한 양태에서, 공정 (a) 에 이용하는 배지에, 단리된 미분화 상태 유지 인자를 외래적 (또는 외인적) 으로 첨가하는 공정을 포함한다. 또는 공정 (a) 에 이용하는 배지에 미리 미분화 상태 유지 인자가 첨가되어 있어도 좋다.
공정 (a) 에서 사용되는 배지의 미분화 상태 유지 인자 농도는 배양하는 다능성 줄기 세포의 미분화 상태를 유지할 수 있는 농도이며, 당업자라면 적절히 설정할 수 있다. 예를 들어, 미분화 상태 유지 인자로서 피더 세포의 비존재 하에서 bFGF 를 사용하는 경우, 그 농도는 통상 약 4 ng/㎖ - 약 500 ng/㎖, 바람직하게는 약 10 ng/㎖ - 약 200 ng/㎖, 보다 바람직하게는 약 30 ng/㎖ - 약 150 ng/㎖ 이다.
피더-프리 배지로 많은 합성 배지가 개발되어 시판되고 있으며, 예를 들어 Essential 8 배지를 들 수 있다. Essential 8 배지는 첨가제로 L-아스코르브산-2-포스페이트 마그네슘 (64 ㎎/ℓ), 소듐 셀레늄 (14 ㎎/ℓ), 인슐린 (19.4 ㎎/ℓ), NaHCO3 (543 ㎎/ℓ), 트랜스페린 (10.7 ㎎/ℓ), bFGF (100 ng/㎖) 및, TGFβ 패밀리 신호 전달 경로 활성화 물질 (TGFβ1 (2 ng/㎖) 또는 노달 (100 ng/㎖)) 을 포함하는 DMEM/F12 배지이다 (Nature Methods, 8, 424-429 (2011)). 시판의 피더-프리 배지로는, 예를 들어 Essential 8 (Life Technologies 사제), S-medium (DS 파마 바이오 메디칼 사제), StemPro (Life Technologies 사제), hESF9, mTeSR1 (STEMCELL Technologies 사제), mTeSR2 (STEMCELL Technologies 사제), TeSR-E8 (STEMCELL Technologies 사제) 을 들 수 있다. 또한 이 밖에, 피더-프리 배지로는, StemFit (Ajinomoto Co., Inc. 사제) 을 들 수 있다. 상기 공정 (a) 는 이들을 이용하여 간편하게 본 발명을 실시할 수 있다. StemFit 배지는 Scientific Reports, 4, 3594 에 명시된 바와 같이 미분화 상태 유지 성분으로 bFGF 를 함유한다.
공정 (a) 에서 사용되는 배지는 혈청 배지도 무혈청 배지도 좋지만, 화학적으로 미결정된 성분의 혼입을 회피하는 관점에서, 바람직하게는 무혈청 배지이다.
공정 (a) 에서 사용되는 배지는 화학적으로 미결정된 성분의 혼입을 회피하는 관점에서, 바람직하게는 함유 성분이 화학적으로 결정된 배지이다.
공정 (a) 에서 다능성 줄기 세포의 배양은 부유 배양 및 접착 배양 중의 조건 하에 수행될 수 있으나, 바람직하게는 접착 배양에 의해 이루어진다.
공정 (a) 의 피더-프리 조건 하에서의 다능성 줄기 세포의 배양에서는 배지로 상기 피더-프리 배지를 이용하면 된다.
공정 (a) 의 피더-프리 조건 하에서의 다능성 줄기 세포의 배양에 있어서는, 피더 세포를 대체하는 스카폴드를 다능성 줄기 세포에 제공하기 위해 적절한 매트릭스를 스카폴드로 사용할 수 있다. 스카폴드인 매트릭스에 의해 표면을 코팅한 세포 용기에서 다능성 줄기 세포를 접착 배양한다.
스카폴드로 사용될 수 있는 매트릭스로는 라미닌 (Nat Biotechnol 28, 611-615 (2010)), 라미닌 단편 (Nat Commun 3, 1236 (2012)), 기저막 표품 (Nat Biotechnol 19, 971-974 (2001)), 젤라틴, 콜라겐, 헤파란 황산 프로테오글리칸, 엔탁틴, 비트로넥틴 (vitronectin) 등을 들 수 있다.
"라미닌" 은 α, β, γ 사슬로 이루어진 이종삼량체 분자이며, 서브유닛 사슬의 조성이 다른 아이소폼이 존재하는 세포외 기질 단백질이다. 구체적으로는 라미닌은 5 종의 α 사슬, 4 종의 β 사슬 및 3 종의 γ 사슬 이종삼량체의 조합으로 약 15 종류의 아이소폼이 있다. α 사슬 (α1 - α5), β 사슬 (β1 - β4) 및 γ 사슬 (γ1 - γ4) 의 각 숫자를 조합하여 라미닌의 명칭이 정해져 있다. 예를 들어 α5 사슬, β1 사슬, γ1 사슬의 조합에 의한 라미닌을 라미닌 511 로 명명한다. 본 발명은 바람직하게는 라미닌 511 이 사용된다 (Nat Biotechnol 28, 611-615 (2010)).
본 발명에서 사용되는 라미닌 단편은 다능성 줄기 세포에 접착성을 가지고 있으며, 피더-프리 조건 하에서의 다능성 줄기 세포의 유지 배양을 가능하게 하는 것이면 특별히 한정되지 않지만, 바람직하게는, E8 단편이다. 라미닌 E8 단편은 라미닌 511 을 엘라스타아제로 소화시켜 얻은 단편에서 강한 세포 접착 활성을 가진 단편으로 확인된 것이다 (EMBO J. 3:1463-1468, 1984, J. Cell Biol., 105:589-598, 1987). 본 발명에서는 바람직하게는 라미닌 511 의 E8 단편이 사용된다 (Nat Commun 3, 1236 (2012), Scientific Reports 4, 3549 (2014)). 본 발명에 사용되는 라미닌 E8 단편은 라미닌의 엘라스타아제 소화 산물임을 요하는 것은 아니고, 재조합체이어도 좋다. 또는 유전자 재조합 동물 (누에 등) 에 의해 생산된 것이어도 좋다. 화학적으로 미결정된 성분의 혼입을 회피하는 관점에서, 본 발명에서는 바람직하게는 재조합체의 라미닌 단편이 사용된다. 라미닌 511 의 E8 단편은 시판되고 있으며, 예를 들어 Nippi, Inc. 등으로부터 구입가능하다.
화학적으로 미결정된 성분의 혼입을 회피하는 관점에서, 본 발명에서 이용되는 라미닌 또는 라미닌 단편은 바람직하게는 단리되어 있다.
바람직하게는 공정 (a) 의 피더-프리 조건 하에서의 다능성 줄기 세포의 배양에서는 단리된 라미닌 511 또는 라미닌 511 의 E8 단편 (가장 바람직하게는, 라미닌 511 의 E8 단편) 으로 표면을 코팅한 세포 용기에 인간 다능성 줄기 세포를 접착 상태로 배양한다.
공정 (a) 에서 다능성 줄기 세포의 배양 시간은 후속 공정 (1) 에서 형성되는 응집체의 질을 향상시키는 효과가 달성가능한 범위에서 특별히 한정되지 않지만, 통상 0.5 - 144 시간, 바람직하게는 2 - 96 시간, 보다 바람직하게는 6 - 48 시간, 더욱 바람직하게는 12 - 48 시간, 더 더욱 바람직하게는 18 - 28 시간 (예를 들어, 24 시간) 이다. 즉, 공정 (1) 개시의 0.5 - 144 시간 (바람직하게는 18 - 28 시간) 전에 공정 (a) 를 개시하고, 공정 (a) 를 완료한 후 후속 공정 (1) 이 수행된다.
공정 (a) 에서 배양 온도, CO2 농도 등의 배양 조건은 적절히 설정할 수 있다. 배양 온도는, 예를 들어 약 30℃ 내지 약 40℃, 바람직하게는 약 37℃ 이다. 또한 CO2 농도는 예를 들어 약 1% 내지 약 10%, 바람직하게는 약 5% 이다.
바람직한 양태에서, 인간 다능성 줄기 세포 (예를 들어, 인간 iPS 세포) 를 피더 세포의 비존재 하에서 bFGF 를 함유하는 무혈청 배지에서 접착 배양한다. 해당 접착 배양은 바람직하게는 라미닌 511, 라미닌 511 의 E8 단편 또는 비트로넥틴으로 표면을 코팅한 세포 용기에서 실시된다. 해당 접착 배양은 바람직하게는 피더-프리 배지로 StemFit 을 이용하여 실시된다.
바람직한 양태에서, 인간 다능성 줄기 세포 (예를 들어, 인간 iPS 세포) 를 피더 세포의 비존재 하에서 bFGF 를 함유하는 무혈청 배지에서 부유 배양한다. 해당 부유 배양에서는 인간 다능성 줄기 세포는 인간 다능성 줄기 세포의 응집체를 형성하고 있다.
소닉 헤지호그 (Shh) 신호 전달 경로 활성화 물질은 Shh 에 의해 매개되는 신호 전달을 증강할 수 있는 물질이다. Shh 신호 전달 경로 활성화 물질로는 예를 들어, Hedgehog 패밀리에 속하는 단백질 (예를 들어, Shh 및 Ihh), Shh 수용체, Shh 수용체 아고니스트, Smo 아고니스트, 퍼모파민, GSA-10, Hh-Ag1.5, 및 20 (S)-히드록시콜레스테롤 또는 SAG (Smoothened Agonist; N-메틸-N'-(3-피리디닐벤질)-N'-(3-클로로벤조[b]티오펜-2-카르보닐)-1,4-디아미노시클로헥산) 등을 들 수 있다. Shh 신호 전달 경로 활성화 물질은 바람직하게는 SAG 이다. 배지 중의 Shh 신호 전달 경로 활성화 물질의 농도는 상기의 효과를 달성가능한 범위에서 적절히 설정하는 것이 가능하다. SAG 는 공정 (a) 에서는 일반적으로 약 1 nM - 약 2000 nM, 바람직하게는 약 10 nM - 약 1000 nM, 특히 바람직하게는 약 10 nM - 약 700 nM, 보다 바람직하게는 약 100 nM - 약 600 nM, 더욱 바람직하게는 약 100 nM - 약 500 nM 의 농도로 사용된다. 또한 SAG 이외의 Shh 신호 전달 경로 활성화 물질을 사용하는 경우, 상기 농도의 SAG 와 동등한 Shh 신호 전달 촉진 활성을 나타내는 농도로 사용되는 것이 바람직하다. SAG 등의 Shh 신호 전달 촉진 활성은 당업자에게 잘 알려진 방법, 예를 들어 Gli1 유전자의 발현에 주목한 리포터 유전자 어세이에 의해 결정될 수 있다 (Oncogene (2007) 26, 5163-5168). 예를 들어, 10 nM 내지 약 700 nM 의 SAG 에 상당하는 Shh 신호 전달 촉진 활성을 갖는 Shh 신호 전달 경로 활성화 물질로는 20 nM 내지 2 μM 의 퍼모파민, 20 nM 내지 3 μM 의 GSA-10, 10 nM 내지 1 μM 의 Hh-Ag1 등을 들 수 있다.
TGFβ 패밀리 신호 전달 경로 (즉 TGFβ 슈퍼 패밀리 신호 전달 경로) 는 TGFβ, 노달/액티빈 또는 BMP 를 리간드로 세포 내에서 Smad 패밀리에 의해 전달되는 신호 전달 경로이다.
TGFβ 패밀리 신호 전달 경로 저해 물질은 TGFβ 패밀리 신호 전달 경로, 즉 Smad 패밀리에 의해 전달되는 신호 전달 경로를 저해하는 물질을 나타내며, 구체적으로는 TGFβ 신호 전달 경로 저해 물질, 노달/액티빈 신호 전달 경로 저해 물질 및 BMP 신호 전달 경로 저해 물질을 들 수 있다. TGFβ 패밀리 신호 전달 경로 저해 물질로는 TGFβ 신호 전달 경로 저해 물질이 바람직하다.
TGFβ 신호 전달 경로 저해 물질로는 TGFβ 에 기인하는 신호 전달 경로를 저해하는 물질이라면 특별히 제한은 없고, 핵산, 단백질, 저분자 유기 화합물 중 어느 것이라도 좋다. 해당 물질로 예를 들어, TGFβ 에 직접 작용하는 물질 (예를 들어, 단백질, 항체, 압타머 등), TGFβ 를 코딩하는 유전자의 발현을 억제하는 물질 (예를 들어, 안티센스 올리고뉴클레오티드, siRNA 등), TGFβ 수용체와 TGFβ 의 결합을 저해하는 물질, TGFβ 수용체에 의한 신호 전달에 기인하는 생리 활성을 저해하는 물질 (예를 들어, TGFβ 수용체 저해 물질, Smad 저해 물질 등) 을 들 수 있다. TGFβ 신호 전달 경로 저해 물질로 알려진 단백질로 Lefty 등을 들 수 있다.
TGFβ 신호 전달 경로 저해 물질로 당업자에게 알려진 화합물을 사용할 수 있다. 구체적으로는, SB431542 (본 명세서 중, SB431 로 약기할 수 있다), SB505124, SB525334, LY2157299, LY2109761, GW788388, LY364947, SD-208, EW-7197, A 83-01, RepSox 등의 Alk5/TGFβR1 저해제, 및 SIS3 등의 SMAD3 저해제를 들 수 있다. 여기서 SB431542 (4-(5-벤졸[1,3]디옥솔-5-일-4-피리딘-2-일-1H-이미다졸-2-일)-벤즈아미드) 및 A-83-01 (3-(6-메틸-2-피리디닐)-N-페닐-4-(4-퀴놀리닐)-1H-피라졸-1-카르보티오아미드) 는 TGFβ 수용체 (ALK5) 및 액티빈 수용체 (ALK4/7) 의 저해제 (즉 TGFβR 저해제) 로 공지된 화합물이다. SIS3 은 TGFβ 수용체의 제어 하에 있는 세포내 신호 전달 인자인 SMAD3 의 인산화를 저해하는 TGFβ 신호 전달 경로 저해 물질이다. 본 발명에서 사용되는 TGFβ 신호 전달 경로 저해 물질은 바람직하게는 SB431542 또는 A-83-01 이다.
배지 중의 TGFβ 신호 전달 경로 저해 물질의 농도는 상기의 효과를 달성가능한 범위에서 적절히 설정하는 것이 가능하다. 공정 (a) 에서 TGFβ 신호 전달 경로 저해 물질로 SB431542 을 사용하는 경우는, 통상 약 1 nM - 약 100 μM, 바람직하게는 약 10 nM - 약 50 μM, 보다 바람직하게는 약 100 nM - 약 50 μM, 더욱 바람직하게는 약 1 μM - 약 10 μM 의 농도로 사용된다. 또한 SB431542 이외의 TGFβ 신호 전달 경로 저해 물질을 사용하는 경우, 상기 농도의 SB431542 와 동등한 TGFβ 신호 전달 경로 억제 활성을 나타내는 농도로 사용되는 것이 바람직하다.
<공정 (1)>
미분화 조건 하에 유지된 다능성 줄기 세포, 바람직하게는 공정 (a) 에서 얻어진 다능성 줄기 세포를 Wnt 신호 전달 경로 저해 물질의 존재 하에 부유 배양하여 세포 응집체를 형성시키는 제 1 공정에 대해 설명한다.
Wnt 신호 전달 경로는 Wnt 패밀리 단백질을 리간드로 사용하고 주로 프리즐드 (Frizzled) 를 수용체로 사용하는 신호 전달 경로이다. 해당 신호 경로로는 β-카테닌에 의해 전달되는 고전적 Wnt 경로 (Canonical Wnt pathway) 이외에, β-카테닌 독립성 비고전적 Wnt 경로 (Non-Canonical Wnt pathway) 등을 들 수 있다. 비고전적 Wnt 경로로는 평면 세포 극성 (Planar Cell Polarity) (PCP) 경로, Wnt/칼슘 경로, Wnt-RAP1 경로, Wnt-Ror2 경로, Wnt-PKA 경로, Wnt-GSK3MT 경로, Wnt-aPKC 경로, Wnt-RYK 경로, Wnt-mTOR 경로 등을 들 수 있다. 비고전적 Wnt 경로에는 Wnt 이외의 다른 신호 전달 경로에서 활성화되는 공통의 신호 전달 인자가 존재한다. 본 발명에서는, 그 인자도 Wnt 신호 전달 경로의 구성 요소로 여겨지고, 그 인자에 대한 저해 물질도 Wnt 신호 전달 경로 저해 물질에 포함된다.
본 발명에서는, Wnt 신호 전달 경로 저해 물질은 Wnt 패밀리 단백질에 의해 야기되는 신호 전달을 억제할 수 있는 것인 한 한정되지 않는다. 핵산, 단백질, 저분자 유기 화합물 중 어느 것이라도 좋다. 해당 물질로 예를 들어, Wnt 프로세싱과 세포 외로의 분비를 저해하는 물질, Wnt 에 직접 작용하는 물질 (예를 들어, 단백질, 항체, 압타머 등), Wnt 를 코드하는 유전자의 발현을 억제하는 물질 (예를 들어, 안티센스 올리고뉴클레오티드, siRNA 등), Wnt 수용체와 Wnt 의 결합을 저해하는 물질, Wnt 수용체에 의한 신호 전달에 기인하는 생리 활성을 저해하는 물질을 들 수 있다. Wnt 신호 전달 경로 저해 물질로 알려진 단백질로서, 분비된 프리즐드 관련 단백질 (secreted Frizzled Related Protein) (sFRP) 클래스에 속하는 단백질 (sFRP1 내지 5, Wnt 저해 인자-1 (WIF-1), Cerberus), Dickkopf (Dkk) 클래스 속하는 단백질 (Dkk1 내지 4, Kremen) 등을 들 수 있다.
Wnt 신호 전달 경로 저해 물질로서, 당업자에게 알려진 화합물을 사용할 수 있다. Wnt 신호 전달 경로 저해 물질로서 예를 들어, 포르쿠핀 (Porcupine) 저해제 (PORCN 저해제라고도 함), DKK 저해제, 프리즐드 저해제, Dvl 저해제, 탄키라아제 (Tankyrase) 저해제 (TANK 저해제라고도 함), 카제인 키나아제 1 저해제, 카테닌 응답성 전사 저해제, p300 저해제, CBP 저해제, BCL-9 저해제 (Am J Cancer Res. 2015; 5(8): 2344-2360) 등을 들 수 있다. 또한 작용 기전은 보고되고 있지 않지만, Wnt 신호 전달 경로 저해 물질로서 KY-02111, KY-03-I 을 들 수 있다. PORCN 저해제로서 예를 들어, IWP-2, IWP-3, IWP-4, IWP-L6, IWP-12, LGK-974, ETC-159, GNF-6231, Wnt-C59 등을 들 수 있다. TANK 저해제로서 예를 들어, IWR1-endo, XAV939, MN-64, WIKI4, TC-E 5001, JW 55 AZ6102 등을 들 수 있다. 본 발명에서 사용되는 Wnt 신호 전달 경로 저해 물질은 바람직하게는 PORCN 저해제, TANK 저해제 또는 KY-02111 이며, 보다 바람직하게는 PORCN 저해제이다. 본 발명에서 사용되는 PORCN 저해제는 바람직하게는 IWP-2 또는 Wnt-C59 이다. 본 발명에서 사용되는 TANK 저해제는 바람직하게는 XAV939 이다.
본 발명에서 사용되는 Wnt 신호 전달 경로 저해 물질은 비고전적 Wnt 경로 (Non-Canonical Wnt pathway) 에 대한 저해 활성을 갖는 것도 바람직하다. 비고전적 Wnt 경로에 대한 저해 활성을 갖는 Wnt 신호 전달 경로 저해 물질로는 예를 들어 PORCN 저해제, 항-프리즐드 항체, Box5 펩타이드 등을 들 수 있다. 포르쿠핀 은 고전적 Wnt 경로의 리간드인 Wnt1 과 Wnt3a 등 외에도 비고전적 Wnt 경로의 리간드인 Wnt5a, Wnt5b, 및 Wnt11 의 지질 수식에 관여하는 것으로 알려져 있고 (Dev Biol. 2012 Jan 15 ; 361 (2):392-402., Biochem J. 2007 Mar 15; 402 (Pt 3):515-523.), PORCN 저해제는 고전적 Wnt 경로 및 비고전적 Wnt 경로의 양쪽을 저해한다.
배지 중의 Wnt 신호 전달 경로 저해 물질의 농도는 상기의 효과를 달성가능한 범위에서 적절히 설정하는 것이 가능하다. 예를 들어 Wnt 신호 전달 경로 저해 물질로 PORCN 저해제의 일종인 IWP-2 를 사용하는 경우에는, 그 농도는 통상 약 0.01 μM - 약 30 μM, 바람직하게는 약 0.1 μM - 약 30 μM, 보다 바람직하게는 약 2 μM 이다. PORCN 저해제의 일종인 Wnt-C59 를 사용하는 경우에는, 그 농도는 통상 약 1 pM - 약 30 μM, 바람직하게는 약 100 pM - 약 30 μM, 보다 바람직하게는 약 1 nM - 약 1 μM 이다. TANK 저해제의 일종인 XAV939 를 사용하는 경우에는, 그 농도는 통상 약 0.01 μM - 약 30 μM, 바람직하게는 약 0.1 μM - 약 30 μM, 보다 바람직하게는 약 1 μM 이다. KY-02111 을 이용하는 경우에는, 그 농도는 통상 약 0.01 μM - 약 30 μM, 바람직하게는 약 0.1 μM - 약 30 μM, 보다 바람직하게는 약 5 μM 이다.
공정 (1) 에서, Wnt 신호 전달 경로 저해 물질 및 TGFβ 신호 전달 경로 저해 물질의 존재 하에 부유 배양하는 것이 간엽계 세포를 형성시키는 관점에서, 바람직하다.
공정 (1) 에서 사용되는 TGFβ 신호 전달 경로 저해 물질로는 공정 (a) 에서 예시한 것과 같은 것이 사용된다. 공정 (a) 및 공정 (1) 의 TGFβ 신호 전달 경로 저해 물질은 동일해도 상이해도 좋지만, 바람직하게는 동일하다.
배지 중의 TGFβ 신호 전달 경로 저해 물질의 농도는 상기의 효과를 달성가능한 범위에서 적절히 설정하는 것이 가능하다. 공정 (1) 에서 TGFβ 신호 전달 경로 저해 물질로 SB431542 을 사용하는 경우는, 통상 약 1 nM - 약 100 μM, 바람직하게는 약 10 nM - 약 50 μM, 보다 바람직하게는 약 100 nM - 약 50 μM, 더욱 바람직하게는 약 500 nM - 약 10 μM 의 농도로 사용된다. 또한 SB431542 이외의 TGFβ 신호 전달 경로 저해 물질을 사용하는 경우, 상기 농도의 SB431542 와 동등한 TGFβ 신호 전달 경로 억제 활성을 나타내는 농도로 사용되는 것이 바람직하다.
공정 (1) 에서 사용되는 배지는 상기 정의에 기재된 것과 같은 것인 한 특별히 한정되지 않는다. 공정 (1) 에서 사용되는 배지는 혈청 함유 배지 또는 무혈청 배지일 수 있다. 화학적으로 미결정된 성분의 혼입을 회피하는 관점에서, 본 발명에서는 무혈청 배지가 적합하게 사용된다. 조제의 번거로움을 회피하기 위해, 예를 들어, 시판의 KSR 등의 혈청 대체물을 적량 첨가한 무혈청 배지 (예를 들어, IMDM 와 F-12 의 1:1 혼합액에 5% KSR, 450 μM 1-모노티오글리세롤 및 1× 화학적으로 결정된 지질 농축물이 첨가된 배지 또는 5% - 20% KSR, NEAA, 피루브산, 2-메르캅토에탄올이 첨가된 GMEM 배지) 를 사용하는 것이 바람직하다. 무혈청 배지에의 KSR 의 첨가량으로는, 예를 들어 인간 ES 세포의 경우는, 통상 약 1% 내지 약 30% 이며, 바람직하게는 약 2% 내지 약 20% 이다.
공정 (1) 의 응집체의 형성시에는 먼저 공정 (a) 에서 얻어진 다능성 줄기 세포의 분산 조작을 하는 것이 바람직하다. 분산 조작에 의해 얻어진 "분산된 세포" 는 예를 들어 70% 이상이 단일 세포이고 2 - 50 세포의 괴가 세포의 30% 이하 존재하는 상태를 들 수 있다.
분산된 세포로, 바람직하게는 80% 이상이 단일 세포이며, 2 - 50 세포의 괴가 세포의 2% 이하 존재하는 상태를 들 수 있다. 분산된 세포는 세포의 상호 접착 (예를 들어 면접착) 이 거의 없어진 상태를 들 수 있다. 일부 양태에서, 분산된 세포는 세포 - 세포 간 결합 (예를 들어, 접착 결합) 이 거의 없어진 상태를 들 수 있다.
공정 (a) 에서 얻어진 다능성 줄기 세포의 분산 조작은 전술한 기계적 분산 처리, 세포 분산액 처리, 세포 보호제 첨가 처리를 포함할 수 있다. 이러한 처리를 조합하여 수행할 수 있다. 바람직하게는 세포 보호제 첨가 처리와 동시에 세포 분산액 처리하고,이어서 기계적 분산 처리를 하면 좋다.
세포 보호제 첨가 처리에 사용되는 세포 보호제로서, FGF 신호 전달 경로 활성화 물질, 헤파린, ROCK 저해 물질, 미오신 저해 물질, 혈청 또는 혈청 대체물을 들 수 있다. 바람직한 세포 보호제로는 ROCK 저해 물질을 들 수 있다. 분산에 의해 유도된 다능성 줄기 세포 (특히 인간 다능성 줄기 세포) 의 세포사를 억제하기 위해 Rho-관련 코일드 코일 키나아제 (Rho-associated coiled-coil kinase) (ROCK) 의 저해 물질을 제 1 공정 배양 개시시부터 첨가할 수 있다. ROCK 저해 물질로는 Y-27632, Fasudil (HA1077), H-1152 HA-100 등을 들 수 있다. 또는 조제를 위한 세포 보호제를 사용할 수도 있다. 조제를 위한 세포 보호제로서, 예를 들어 RevitaCell 보충제 (Thermo Fisher Scientific 사제), CloneR (Stemcell Technologies 사제) 를 들 수 있다.
세포 분산액 처리에 사용되는 세포 분산액으로는 트립신, 콜라게나아제, 히알루로니다아제, 엘라스타아제, 프로나아제, DNase 또는 파파인 등의 효소류 및 에틸렌디아민테트라아세트산 등의 킬레이트제 중 하나를 포함하는 용액을 들 수 있다. 시판의 세포 분산액 예를 들어, TrypLE Select (Thermo Fisher Scientific 사제) 와 TrypLE Express (Thermo Fisher Scientific 사제), Accumax (Innovative Cell Technologies 사제) 를 이용할 수도 있다.
기계적 분산 처리 방법으로는 피펫 처리 또는 스크레이퍼로 긁어내는 작업을 들 수 있다.
분산된 세포는 상기 배지에 현탁된다.
그 후, 분산된 다능성 줄기 세포의 현탁액을 상기 배양기에 파종하고, 분산된 다능성 줄기 세포를 배양기에 대해 비접착성 조건 하에 배양하여 복수의 세포를 집합시켜 응집체를 형성한다.
이 경우에, 분산된 다능성 줄기 세포를 10 ㎝ 디쉬 같은 비교적 큰 배양기에 파종하여 하나의 배양기에서 복수의 세포의 응집체를 동시에 형성시켜도 좋다. 응집체 각각의 크기의 차이를 생기기 어렵게 하는 관점에서, 예를 들어, 96 웰 마이크로플레이트와 같은 멀티웰 플레이트 (U 바닥, V 바닥) 의 각 웰에 일정 수의 분산된 다능성 줄기 세포를 넣어, 이를 정치 배양하면 세포가 빠르게 응집하여 각 웰에 1 개의 응집체를 형성시키는 것이 바람직하다. 이 응집체를 복수의 웰에서 회수함으로써 균일한 응집체의 집단을 얻을 수 있다.
공정 (1) 에서는 응집체의 조제의 복잡성을 회피하는 관점에서, 각 웰 내에 응집체가 들어간 상태에서 플레이트 전체의 배지를 한 번에 교환할 수 있는 삼차원 세포 배양 용기를 사용해도 좋다. 삼차원 세포 배양 용기로는, 예를 들어 PrimeSurface96 슬릿 웰 플레이트 (SUMITOMO BAKELITE CO., LTD. 사제) 등을 들 수 있다.
공정 (1) 에서 다능성 줄기 세포의 농도는 세포의 응집체를 보다 균일하고 효율적으로 형성시키도록 적절하게 설정할 수 있다. 예를 들어 96 웰 마이크로 웰 플레이트를 사용하여 인간 다능성 줄기 세포 (예를 들어, 공정 (a) 에서 얻어진 인간 iPS 세포) 를 부유 배양할 경우, 1 웰 당 일반적으로 약 1 × 103 내지 약 1 × 105 세포, 바람직하게는 약 3 × 103 내지 약 5 × 104 세포, 보다 바람직하게는 약 4 × 103 내지 약 2 × 104 세포, 더욱 바람직하게는 약 4 × 103 내지 약 1.6 × 104 세포, 특히 바람직하게는 약 8 × 103 내지 약 1.2 × 104 세포가 되도록 조제한 액을 웰에 첨가하고, 플레이트를 정치하여 응집체를 형성시킨다.
공정 (1) 에서 배양 온도, CO2 농도 등의 배양 조건은 적절히 설정할 수 있다. 배양 온도는, 예를 들어 약 30℃ 내지 약 40℃, 바람직하게는 약 37℃ 이다. CO2 농도는 예를 들어 약 1% 내지 약 10%, 바람직하게는 약 5% 이다.
공정 (1) 에서 배지 교환 조작을 할 경우, 예를 들어, 원래 있는 배지를 버리지 않고 새로운 배지를 추가 조작 (배지 첨가 조작), 원래 있는 배지를 반량 정도 (원래 있는 배지의 체적량의 30 - 90% 정도, 예를 들어 40 - 60% 정도) 버리고 새로운 배지를 반량 정도 (원래 있는 배지의 체적량의 30 - 90%, 예를 들어 40 - 60% 정도) 추가하는 조작 (반량 배지 교환 조작), 원래 있는 배지를 전량 정도 (원래 있는 배지의 체적량의 90% 이상) 버리고 새로운 배지를 전량 정도 (원래 있는 배지의 체적량의 90% 이상) 추가하는 조작 (전량 배지 교환 조작) 을 들 수 있다.
어떤 시점에서 특정 성분 (예를 들어, 분화 유도 인자) 을 첨가하는 경우, 예를 들어, 최종 농도를 계산한 후 원래의 배지를 반량 정도 버리고 특정 성분을 최종 농도보다 높은 농도로 포함하는 새로운 배지를 반량 정도 추가하는 조작 (반량 배지 교환 조작) 을 수행할 수 있다.
어떤 시점에서, 원래 배지에 포함된 성분을 희석하여 농도를 낮추는 경우, 예를 들어, 배지 교환 조작을 하루에 복수회, 바람직하게는 1 시간 내에 복수회 (예컨대 2 - 3 회) 실시할 수 있다. 또한 어떤 시점에서 원래 배지에 포함된 성분을 희석하여 농도를 낮추는 경우, 세포 또는 응집체를 다른 배양 용기에 옮겨도 된다.
배지 교환 조작에 사용하는 도구는 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어, 피펫, 피펫맨, 멀티채널 피펫맨, 연속 분주기 등을 들 수 있다. 예를 들어, 배양 용기로 96 웰 플레이트를 사용하는 경우, 멀티채널 피펫맨을 사용해도 좋다.
세포의 응집체를 형성하기 위해 필요한 부유 배양 시간은 세포를 균일하게 응집시킬 수 있도록, 사용하는 다능성 줄기 세포에 의해 적절하게 결정 가능하지만 균일한 세포의 응집체를 형성하기 위해 가능한 한 단시간인 것이 바람직하다. 분산된 세포가 세포 응집체가 형성되기에 이르기까지의 과정은 세포가 집합하는 공정 및 집합한 세포가 세포 응집체를 형성하는 공정으로 나누어진다. 분산된 세포를 파종하는 시점 (즉 부유 배양 개시시) 에서 세포가 집합할 때까지는, 예를 들어, 인간 다능성 줄기 세포 (예를 들어, 인간 iPS 세포) 의 경우, 바람직하게는 약 24 시간 이내, 더 바람직하게는 약 12 시간 이내에 집합한 세포를 형성시킨다. 분산된 세포를 파종하는 시점 (즉 부유 배양 개시시) 에서 세포 응집체가 형성될 때까지의 공정에서는, 예를 들어 인간 다능성 줄기 세포 (예를 들어, iPS 세포) 의 경우, 바람직하게는 약 72 시간 이내, 보다 바람직하게는 약 48 시간 이내에 응집체가 형성된다. 이 응집체 형성까지의 시간은 세포를 응집시키는 용구나 원심 조건 등을 조정하여 적절히 조절하는 것이 가능하다.
세포의 응집체가 형성된 것은 응집체의 크기 및 세포수, 거시적 형태, 조직 염색 분석에 의한 미시적 형태 및 균일성, 분화 및 미분화 마커의 발현 및 그의 균일성, 분화 마커의 발현 제어 및 그의 동기성, 분화 효율의 응집체 간의 재현성 등에 따라 판단하는 것이 가능하다.
응집체가 형성된 후 그대로 응집체의 배양을 계속해도 된다. 공정 (1) 에서 부유 배양 시간은 통상 8 시간 - 6 일 정도, 바람직하게는 12 시간 - 48 시간 정도이다.
<공정 (2)> 및 <공정 (2-1)>
공정 (1) 에서 얻어진 세포 응집체를 BMP 신호 전달 경로 활성화 물질 및 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질의 존재 하에 부유 배양하고, 뇌하수체 조직을 포함하는 세포괴를 얻는 제 2 공정 또는 공정 (1) 에서 얻어진 세포 응집체를 BMP 신호 전달 경로 활성화 물질 및 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질의 존재 하에 부유 배양하는 제 2 공정 (1) 에 대해 설명한다.
BMP 신호 전달 경로 활성화 물질은 BMP 에 의해 매개되는 신호 전달 경로를 증강시킬 수 있는 물질이다. BMP 신호 전달 경로 활성화 물질로서, 예를 들어 BMP2, BMP4 또는 BMP7 등의 BMP 단백질, GDF7 등의 GDF 단백질, 항-BMP 수용체 항체 또는, BMP 부분 펩티드 등을 들 수 있다. BMP2 단백질 및 BMP4 단백질은 예를 들어 R&D Systems 에서, BMP7 단백질은 Biolegend 사에서, GDF7 단백질은 예를 들어 Wako Pure Chemical Industries, Ltd. 에서 입수가능하다. BMP 신호 전달 경로 활성화 물질은 바람직하게는 BMP4 이다.
배지 중의 BMP 신호 전달 경로 활성화 물질의 농도는 상기의 효과를 달성가능한 범위에서 적절히 설정하는 것이 가능하다. BMP 신호 전달 경로 활성화 물질로 BMP4 를 이용하는 경우는, 통상 약 1pM - 약 100 nM, 바람직하게는 약 10 pM - 약 50 nM, 보다 바람직하게는 약 10 pM - 약 25 nM, 더욱 바람직하게는 약 10 pM - 약 5 nM 의 농도로 사용된다. 또한 BMP4 이외의 BMP 신호 전달 경로 활성화 물질을 사용하는 경우, 상기 농도의 BMP4 와 동등한 BMP 신호 전달 경로 촉진 활성을 나타내는 농도로 사용되는 것이 바람직하다.
공정 (2) 또는 공정 (2-1) 에서 사용되는 Shh 신호 전달 경로 활성화 물질로는 공정 (a) 에서 예시한 것과 같은 것이 사용된다. 공정 (a) 및 공정 (2) 또는 공정 (2-1) 의 Shh 신호 전달 경로 활성화 물질은 동일해도 상이해도 좋지만, 바람직하게는 동일하다.
배지 중의 Shh 신호 전달 경로 활성화 물질의 농도는 상기의 효과를 달성가능한 범위에서 적절히 설정하는 것이 가능하다. 공정 (2) 또는 공정 (2-1) 에서 Shh 신호 전달 경로 활성화 물질로 SAG 를 이용하는 경우는, 통상 약 1 nM - 약 5 μM, 바람직하게는 약 10 nM - 약 4.5 μM, 보다 바람직하게는 약 50 nM - 약 4 μM 더욱 바람직하게는 약 100 nM - 약 3 μM 의 농도로 사용된다.
공정 (2) 또는 공정 (2-1) 에서 사용되는 배지는 BMP 신호 전달 경로 활성화 물질과 Shh 신호 전달 경로 활성화 물질을 포함하는 한 특별히 한정되지 않는다. 공정 (2) 또는 공정 (2-1) 에서 사용되는 배지는 혈청 함유 배지 또는 무혈청 배지일 수 있다. 화학적으로 미결정된 성분의 혼입을 회피하는 관점에서, 본 발명에서는 무혈청 배지가 적합하게 사용된다. 조제의 번거로움을 회피하기 위해, 예를 들어, 시판의 KSR 등의 혈청 대체물을 적량 첨가한 무혈청 배지 (예를 들어, IMDM 와 F-12 의 1:1 혼합액에 5% KSR, 450 μM 1-모노티오글리세롤 및 1× 화학적으로 결정된 지질 농축물이 첨가된 배지 또는 5% - 20% KSR, NEAA, 피루브산, 2-메르캅토에탄올이 첨가된 GMEM 배지) 를 사용하는 것이 바람직하다. 무혈청 배지에의 KSR 의 첨가량으로는, 예를 들어 인간 ES 세포의 경우는, 통상 약 1% 내지 약 30% 이며, 바람직하게는 약 2% 내지 약 20% 이다. 제 2 공정에서, 제 1 공정에서 얻어진 다능성 줄기 세포의 응집체를 BMP 신호 전달 경로 활성화 물질과 Shh 신호 전달 경로 활성화 물질을 포함하는 배지 (바람직하게는 무혈청 배지) 에서 부유 배양하여 세포괴를 형성시킴으로써, 세포괴의 질을 향상시키고 뇌하수체 조직을 포함하는 세포괴를 고효율로 만들 수 있다.
공정 (2) 또는 공정 (2-1) 에서 BMP 신호 전달 경로 활성화 물질과 Shh 신호 전달 경로 활성화 물질의 첨가 시기는 동일해도 좋고, 상이해도 좋다. 바람직하게는 동일하거나 또는 BMP 신호 전달 경로 활성화 물질을 첨가한 후, Shh 신호 전달 경로 활성화 물질을 첨가한다. Shh 신호 전달 경로 활성화 물질의 첨가 시기는 BMP 신호 전달 경로 활성화 물질의 첨가로부터 12 일 이내, 바람직하게는 10 일 이내, 보다 바람직하게는 6 일 이내이다. 공정 (2-1) 에 이어 공정 (2-2) 을 실시하는 태양의 경우에는, Shh 신호 전달 경로 활성화 물질의 첨가는 후술하는 공정 (2-2) 의 개시와 동시에 수행할 수 있다.
<공정 (2-2)>
공정 (2-1) 에서 얻어진 세포 응집체를 나아가 BMP 신호 전달 경로 저해 물질을 포함하는 배지에서 부유 배양하여 뇌하수체 조직을 포함하는 세포괴를 얻는 제 2 공정 (2) 에 대해 설명한다.
본 발명에서, BMP 신호 전달 경로 저해 물질은 BMP 패밀리 단백질에 의해 야기되는 신호 전달을 억제할 수 있는 것인 한 한정되지 않는다. 핵산, 단백질, 저분자 유기 화합물 중 어느 것이라도 좋다. 해당 물질로 예를 들어 BMP 프로세싱과 세포 외로의 분비를 억제하는 물질, BMP 에 직접 작용하는 물질 (예를 들어, 단백질, 항체, 압타머 등), BMP 를 코드하는 유전자의 발현을 억제하는 물질 (예를 들어, 안티센스 올리고뉴클레오티드, siRNA 등), BMP 수용체와 BMP 의 결합을 저해하는 물질, BMP 수용체에 의한 신호 전달에 기인하는 생리 활성을 저해하는 물질을 들 수 있다. BMP 수용체에는 I 형 BMP 수용체와 II 형 BMP 수용체가 존재하고, I 형 BMP 수용체로는 BMPR1A, BMPR1B, ACVR, II 형 BMP 수용체로는 TGF-beta R-II, ActR-II, ActR-IIB, BMPR2, MISR-II 가 알려져 있다.
BMP 신호 전달 경로 저해 물질로 알려진 단백질로서, 예를 들어 노긴 (Noggin), 코르딘 (Chordin), 폴리스타틴 (Follistatin), 그렘린 (Gremlin), 인히빈 (Inhibin), 트위스티드 가스트룰레이션 (Twisted Gastrulation), Coco, DAN 패밀리에 속하는 분비 단백질 등을 들 수 있다. 상기 공정 (2-1) 에서 배양액 중에 BMP 신호 전달 경로 활성화 물질을 첨가하고 있기 때문에, 이후의 BMP 신호 전달 경로를 보다 효과적으로 저해한다는 관점에서, 공정 (2-2) 에서 BMP 신호 전달 경로 저해 물질은 세포에의 BMP 의 분비보다 하류의 신호 전달 경로를 저해하는 물질, 예를 들어 BMP 수용체와 BMP 의 결합을 저해하는 물질, BMP 수용체에 의한 신호 전달로 인한 생리 활성을 저해하는 물질 등을 포함하는 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 I 형 BMP 수용체의 저해제를 포함한다.
BMP 신호 전달 경로 저해 물질로 당업자에게 알려진 화합물을 사용할 수도 있다. BMP 신호 전달 경로 저해 물질로는, 예를 들어 K02288 (3-[(6-아미노-5-(3,4,5-트리메톡시페닐)-3-피리디닐]페놀, 3-[6-아미노-5-(3,4,5-트리메톡시페닐)-3-피리디닐]-페놀), 도르소모르핀 (6-[4-[2-(1-피페리디닐)에톡시]페닐]-3-(4-피리디닐)피라졸로[1,5-a]피리미딘), LDN-193189 (4-[6-[4-(1-피페라지닐)페닐]피라졸로[1,5-a]피리미딘-3-일]퀴놀린 디하이드로클로라이드), LDN-212854 (5-[6-[4-(1-피페라지닐)페닐]피라졸로[1,5-a]피리미딘-3-일]퀴놀린), LDN-214117 (1-(4-(6-메틸-5-(3,4,5-트리메톡시페닐)피리딘-3-일)페닐)피페라진), ML347 (5-[6-(4-메톡시페닐)피라졸로[1,5-a]피리미딘-3-일]퀴놀린)), DMH1 (4-(6-(4-이소프로폭시페닐)피라졸로[1,5-a]피리미딘-3-일)퀴놀린), DMH2 (4-[6-[4-[2-(4-모르폴리닐)에톡시]페닐]피라졸로[1,5-a]피리미딘-3-일]-퀴놀린) 등을 들 수 있다. 이러한 물질은 단독으로 또는 조합하여 사용할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 BMP 신호 전달 경로 저해 물질은 바람직하게는 I 형 BMP 수용체 저해제이며, 보다 바람직하게는 K02288, 도르소모르핀, LDN-193189, LDN-212854, LDN-214117, ML347, DMH1 및 DMH2 에서 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나를 포함하고, 더욱 바람직하게는 K02288 을 포함한다.
배지 중의 BMP 신호 전달 경로 저해 물질의 농도는 상기의 효과를 달성가능한 범위에서 적절히 설정하는 것이 가능하다. 뇌하수체 조직의 형성 효율의 관점에서, 공정 (2-2) 에서 BMP 신호 전달 경로 저해 물질로 K02288 을 사용하는 경우는, 통상 약 1 nM - 약 100 μM, 바람직하게는 약 10 nM - 약 50 μM, 보다 바람직하게는 약 100 nM - 약 50 μM, 더욱 바람직하게는 약 500 nM - 약 25 μM 의 농도로 사용된다. BMP 신호 전달 경로 저해 물질로 LDN-193189 를 사용하는 경우는, 통상 약 1 nM - 약 100 μM, 바람직하게는 약 10 nM - 약 10 μM, 보다 바람직하게는 약 25 nM - 약 1 μM, 더욱 바람직하게는 약 100 nM - 약 500 nM 의 농도로 사용된다. BMP 신호 전달 경로 저해 물질로 LDN-212854 를 사용하는 경우는, 통상 약 1 nM - 약 100 μM, 바람직하게는 약 10 nM - 약 10 μM, 보다 바람직하게는 약 25 nM - 약 5 μM, 더욱 바람직하게는 약 250 nM - 약 3 μM 의 농도로 사용된다. BMP 신호 전달 경로 저해 물질로 ML-347을 사용하는 경우는, 통상 약 1 nM - 약 100 μM, 바람직하게는 약 10 nM - 약 50 μM, 보다 바람직하게는 약 100 nM - 약 50 μM, 더욱 바람직하게는 약 1 μM - 약 25 μM 의 농도로 사용된다. BMP 신호 전달 경로 저해 물질로 DMH2 를 이용하는 경우는, 통상 약 1 nM - 약 100 μM, 바람직하게는 약 10 nM - 약 10 μM, 보다 바람직하게는 약 25 nM - 약 5 μM, 더욱 바람직하게는 약 50 nM - 약 3 μM 의 농도로 사용된다. 또한 K02288 이외의 BMP 신호 전달 경로 저해 물질을 사용하는 경우, 상기 농도의 K02288 와 동등한 BMP 신호 전달 경로 억제 활성을 나타내는 농도로 사용되는 것이 바람직하다.
공정 (2-2) 에서 사용되는 배지는 BMP 신호 전달 경로 저해 물질을 포함하는 한 특별히 한정되지 않는다. 공정 (2-2) 에서 사용되는 배지는 공정 (1) 내지 공정 (2-1) 와 공통의 배지인 것도 바람직하다. 공정 (2-2) 에서 사용되는 배지는 혈청 함유 배지 또는 무혈청 배지일 수 있다. 화학적으로 미결정된 성분의 혼입을 회피하는 관점에서, 본 발명에서는 무혈청 배지가 적합하게 사용된다. 조제의 번거로움을 회피하기 위해, 예를 들어, 시판의 KSR 등의 혈청 대체물을 적량 첨가한 무혈청 배지 (예를 들어, IMDM 와 F-12 의 1:1 혼합액에 5% KSR, 450 μM 1-모노티오글리세롤 및 1× 화학적으로 결정된 지질 농축물이 첨가된 배지 또는, 5% - 20% KSR, NEAA, 피루브산, 2-메르캅토에탄올이 첨가된 GMEM 배지) 를 사용하는 것이 바람직하다. 무혈청 배지에의 KSR 의 첨가량으로는, 예를 들어 인간 ES 세포의 경우는, 통상 약 1% 내지 약 30% 이며, 바람직하게는 약 2% 내지 약 20% 이다.
공정 (2-2) 에서, 공정 (2-1) 에 이어 Shh 신호 전달 경로 활성화 물질을 배지에 첨가하는 것도 바람직하다. Shh 신호 전달 경로 활성화 물질로는 공정 (a) 에서 예시한 것과 같은 것이 사용된다. 공정 (a), (2-1) 및 (2-2) 의 Shh 신호 전달 경로 활성화 물질은 동일해도 상이해도 좋지만, 바람직하게는 동일하다.
배지 중의 Shh 신호 전달 경로 활성화 물질의 농도는 상기의 효과를 달성가능한 범위에서 적절히 설정하는 것이 가능하다. 공정 (2-2) 에서 Shh 신호 전달 경로 활성화 물질로 SAG 를 이용하는 경우는, 통상 약 1 nM - 약 5 μM, 바람직하게는 약 10 nM - 약 4.5 μM, 보다 바람직하게는 약 50 nM - 약 4 μM, 더욱 바람직하게는 약 100 nM - 약 3 μM 의 농도로 사용된다. 공정 (2-1) 에서 BMP 신호 전달 경로 활성화 물질을 첨가한 후에, Shh 신호 전달 경로 활성화 물질을 첨가하는 경우, Shh 신호 전달 경로 활성화 물질의 첨가와 공정 (2-2) 의 개시를 동시에 수행해도 좋다.
공정 (2), (2-1) 및 (2-2) 에서, 부유 배양이 나아가 TGFβ 신호 전달 경로 저해 물질의 존재 하에 수행되는 것이 바람직하다.
공정 (2), (2-1) 및 (2-2) 에서 사용되는 TGFβ 신호 전달 경로 저해 물질로는 공정 (a) 에서 예시한 것과 같은 것이 사용된다. 공정 (a), 공정 (1), (2), (2-1) 및 (2-2) 의 TGFβ 신호 전달 경로 저해 물질은 동일해도 상이해도 좋지만, 바람직하게는 동일하다.
배지 중의 TGFβ 신호 전달 경로 저해 물질의 농도는 상기의 효과를 달성가능한 범위에서 적절히 설정하는 것이 가능하다. 공정 (2), (2-1) 및 (2-2) 에서 TGFβ 신호 전달 경로 저해 물질로 SB431542 을 사용하는 경우는, 통상 약 1 nM - 약 100 μM, 바람직하게는 약 10 nM - 약 50 μM, 보다 바람직하게는 약 100 nM - 약 50 μM, 더욱 바람직하게는 약 500 nM - 약 10 μM 의 농도로 사용된다. 또한 SB431542 이외의 TGFβ 신호 전달 경로 저해 물질을 사용하는 경우, 상기 농도의 SB431542 와 동등한 TGFβ 신호 전달 경로 억제 활성을 나타내는 농도로 사용되는 것이 바람직하다.
본 발명에 있어서, 공정 (1), (2), (2-1) 및 (2-2) 중 하나 이상의 공정을 FGF 신호 전달 경로 활성화 물질의 존재 하에 수행하는 것이 바람직하다. FGF 신호 전달 경로 활성화 물질은 FGF (섬유아세포성장 인자) 에 의해 매개되는 신호 전달 경로를 증강시킬 수 있는 물질인 한 특별히 한정되지 않는다. FGF 신호 전달 경로 활성화 물질로서, 예를 들어 FGF1, FGF2 (bFGF라고 칭하는 경우도 있다), FGF8 등의 FGF 단백질, 항-FGF 수용체 항체, FGF 부분 펩티드 등을 들 수 있다. 이러한 물질은 단독으로 또는 조합하여 사용할 수 있다.
FGF2 단백질 및 FGF8 단백질은, 예를 들어 FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation 에서 입수가능하다. FGF 신호 전달 경로 활성화 물질은 바람직하게는 FGF2 및 FGF8, 및 이들의 변이체로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나를 포함하고, 보다 바람직하게는 FGF2 를 포함하고, 더욱 바람직하게는 재조합 인간 FGF2 를 포함한다.
배지 중의 FGF 신호 전달 경로 활성화 물질의 농도는 상기의 효과를 달성가능한 범위에서 적절히 설정하는 것이 가능하다. 신경 조직부의 상피 구조 형성, 플라코드로의 분화 및 세포의 생존과 증식 촉진의 관점에서, FGF 신호 전달 경로 활성화 물질로 FGF2 를 이용하는 경우는, 통상 약 1 pg/㎖ - 약 100 ㎍/㎖, 바람직하게는 약 10 pg/㎖ - 약 50 ㎍/㎖, 보다 바람직하게는 약 100 pg/㎖ - 약 10 ㎍/㎖, 더욱 바람직하게는 약 500 pg/㎖ - 약 1 ㎍/㎖, 가장 바람직하게는 약 1 ng/㎖ - 약 200 ng/㎖ 의 농도로 사용된다. 또한 FGF2 이외의 FGF 신호 전달 경로 활성화 물질을 사용하는 경우, 상기 농도의 FGF2 와 동등한 FGF 신호 전달 경로 촉진 활성을 나타내는 농도로 사용되는 것이 바람직하다.
배지에서 FGF 단백질의 활성을 유지하는 목적에서, FGF 단백질을 포함하는 배지에 헤파린, 헤파란 황산을 첨가하는 것도 바람직하다. 헤파린 소듐 염으로서 예를 들어 FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation 에서 입수가능하다. 배지의 헤파린 또는 헤파란 황산의 농도는 상기의 효과를 달성가능한 범위에서 적절히 설정하는 것이 가능하다. 배지의 헤파린 소듐의 농도는 일반적으로 약 1 ng/㎖ - 약 100 ㎎/㎖, 바람직하게는 약 10 ng/㎖ - 약 50 ㎎/㎖, 보다 바람직하게는 약 100 ng/㎖ - 약 10 ㎎/㎖, 더욱 바람직하게는 약 500 ng/㎖ - 약 1 ㎎/㎖, 가장 바람직하게는 약 1 ㎍/㎖ 내지 약 200 ㎍/㎖ 이다. 헤파란 황산을 사용하는 경우, 상기 농도의 헤파린과 같은 FGF 단백질 보호 활성을 갖는 농도인 것이 바람직하다. 37℃ 등의 세포 배양 환경에서 FGF 단백질의 활성을 유지하는 목적에서, 예를 들어 미국 특허 US8772460B2 호에 기재된 내열성 FGF2 등의 FGF 의 변이체 및 생분해성 폴리머에 FGF2 를 결합시킨 StemBeads FGF2 등의 FGF2 서방성 비즈를 이용하는 것도 바람직하다. 내열성 FGF2 는, 예를 들어 HumanZyme 에서 입수가능하다. StemBeads FGF2 는, 예를 들어 StemCulture 에서 입수가능하다.
본 발명에서 응집체 내부의 신경계 세포 또는 조직의 생존, 증식을 촉진하는 관점에서, 공정 (1), (2), (2-1) 및 (2-2) 중 하나 이상의 공정을 Wnt 신호 전달 경로 활성화 물질의 존재 하에 실시할 수도 있다. 전술한 바와 같이, Wnt 신호 전달 경로, 고전적 Wnt 경로 (Canonical Wnt pathway), 비고전적 Wnt 경로 (Non-Canonical Wnt pathway) 등을 들 수 있다. 비고전적 Wnt 경로로는 평면 세포 극성 (Planar Cell Polarity) (PCP) 경로, Wnt/칼슘 경로, Wnt-RAP1 경로, Wnt-Ror2 경로, Wnt-PKA 경로, Wnt-GSK3MT 경로, Wnt-aPKC 경로, Wnt-RYK 경로, Wnt-mTOR 경로 등을 들 수 있다.
본 발명에서 Wnt 신호 전달 경로 활성화 물질은 Wnt 패밀리 단백질에 의해 야기되는 신호 전달을 활성화시킬 수 있는 것인 한 한정되지 않는다. 핵산, 단백질, 저분자 유기 화합물 중 어느 것이라도 좋다. 해당 물질로 예를 들어, Wnt 자기 분비를 촉진하는 물질, Wnt 를 안정화시켜 분해를 억제하는 물질, Wnt 의 재조합 단백질, Wnt 부분 배열 펩타이드 및 그 파생물 및 유도체, Wnt 수용체에 작용하여 활성화시키는 물질, Wnt 의 세포내 신호 전달 기구를 활성화시키는 물질, Wnt 의 세포내 신호 전달 인자 및 그 변이체 (β-카테닌 S33Y 등), Wnt 응답 배열 하류의 유전자 발현을 활성화시키는 물질 등을 들 수 있다. Wnt 신호 전달 경로 활성화 물질로 알려진 단백질로서 Wnt, R-스폰딘 (Spondin) 등을 들 수 있다.
Wnt 신호 전달 경로 활성화 물질로 당업자에게 알려진 화합물을 사용할 수도 있다. Wnt 신호 전달 경로 활성화 물질로서 활성을 갖는 화합물로서 예를 들어 염화 리튬, AMBMP 하이드로클로라이드, SGC AAK1 1, Foxy 5, CHIR99021, CHIR98014, TWS119, SB216763, SB415286, BIO, AZD2858, AZD1080, AR-A014418, TDZD-8, LY2090314, IM-12, 인디루빈, 비키닌, A 1070722, 3F8, 켄파울론, 10Z-히메니알디신, 인디루빈-3'-옥심, NSC 693868, TC-G 24, TCS 2002, TCS 21311, CP21R7, BML-284, SKL2001, WAY 262611, IIIC3a, 메틸 바닐레이트, IQ-1 및 이들 화합물의 유도체 등을 들 수 있다.
본 발명에 있어서, 공정 (1) 에서 Wnt 신호 전달 경로 저해 물질을 첨가하고 있지만, 작용점이 다른 Wnt 신호 전달 경로 활성화 물질 및 Wnt 신호 전달 경로 저해 물질을 병용하는 것으로, 전술한 복수의 Wnt 신호 전달 경로 중 특정 경로만을 활성화 또는 저해할 수 있다. 본 발명에서 Wnt 신호 전달 경로 활성화 물질이 공정 (1) 에서 첨가하는 Wnt 신호 전달 경로 저해 물질의 하류의 인자에 작용하는 물질인 것이 바람직하다. 본 발명에서 첨가하는 Wnt 신호 전달 경로 활성화 물질이 고전적 Wnt 경로 (Canonical Wnt pathway) 를 활성화시키는 물질인 것도 바람직하고, 세포내의 Wnt 신호 전달 인자인 β-카테닌의 분해 저해, 안정화 작용에 의해 Wnt 신호 전달 경로를 활성화시키는 물질인 것이 더욱 바람직하다. β-카테닌의 분해 저해, 안정화 작용을 갖는 물질로서, 예를 들어 GSK3 저해제 및 BML-284, SKL2001 등을 들 수 있다. 첨가하는 Wnt 신호 전달 경로 활성화 물질이 β-카테닌 응답성 전사 (β-catenin responsive transcription: CRT) 를 촉진 및 활성화시키는 물질인 것도 바람직하다.
본 발명의 바람직한 Wnt 신호 전달 경로 활성화 물질 및 Wnt 신호 전달 경로 저해 물질의 조합으로 GSK3 저해제와 PORCN 저해제를 들 수 있다. GSK3 저해제와 PORCN 저해제를 병용한 경우, 고전적 Wnt 경로는 활성화되고, 비고전적 Wnt 경로는 저해된다. GSK3 저해제와 PORCN 저해제를 병용한 경우, 본 발명에서 바람직한 GSK3 저해제는 CHIR99021, CHIR98014, SB216763, SB415286, 및 BIO 로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나를 포함하고, 더욱 바람직하게는 CHIR99021 을 포함한다. GSK3 저해제와 PORCN 저해제를 병용한 경우, 본 발명에서 바람직한 PORCN 저해제는 IWP-2, IWP-3, IWP-4, IWP-L6, IWP-12, LGK-974, ETC-159, GNF-6231, 및 Wnt-C59 로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나를 포함하고, 더욱 바람직하게는 IWP-2 를 포함한다. 또한 GSK3 저해제와 KY02111 내지 그 유도체 등을 조합하여 사용해도 좋다. GSK3 저해제와는 작용 기전이 다른 β-카테닌의 분해 저해, 안정화 작용을 갖는 물질로는 예를 들어 BML-284, SKL2001 을 들 수 있으며, 이들 화합물 및 그 유도체도 PORCN 저해제, KY02111 내지 그 유도체 등과 조합하여 사용하여도 좋다.
배지 중의 Wnt 신호 전달 경로 활성화 물질의 농도는 상기의 효과를 달성가능한 범위에서 적절히 설정하는 것이 가능하다. 응집체 내부의 신경계 세포 또는 조직의 생존, 증식 촉진의 관점에서, Wnt 신호 전달 경로 활성화 물질로 CHIR99021 를 이용하는 경우는, 통상 약 10 pM - 약 10mM, 바람직하게는 약 100 pM - 약 1 mM, 보다 바람직하게는 약 1 nM - 약 100 μM, 더욱 바람직하게는 약 10 nM - 약 30 μM 가장 바람직하게는 약 100 nM - 약 3 μM 의 농도로 사용된다. 또한 CHIR99021 이외의 Wnt 신호 전달 경로 활성화 물질을 사용하는 경우, 상기 농도의 CHIR99021 와 동등한 Wnt 신호 전달 경로 촉진 활성을 나타내는 농도로 사용되는 것이 바람직하다.
본 발명에 있어서, 공정 (1), (2), (2-1) 및 (2-2) 중 하나 이상의 공정에서 세포사를 억제하고 세포의 증식을 촉진하는 관점에서, 배지 중에 추가로 성장 인자를 첨가하는 것도 바람직하다. 첨가되는 성장 인자의 종류는 상기 목적을 달성할 수 있는 한 특별히 한정되지 않는다. 이러한 목적으로 사용되는 성장 인자로는 상피 성장 인자 (Epidermal Growth Factor: EGF), 인슐린 유사 성장 인자 (Insulin-like growth factor: IGF), 신경 성장 인자 (Nerve growth factor: NGF), 뇌 유래 신경 영양 인자 (Brain-derived neurotrophic factor: BDNF), 뉴로트로핀 3, 뉴로트로핀 4/5, 모양체 신경 영양 인자 (Ciliary neurotrophic factor: CNTF), 혈관 내피 세포 성장 인자 (Vesicular endothelial growth factor: VEGF), 색소 상피 유래 인자 (Pigment epithelium-derived factor: PEDF), 간세포 증식 인자 (Hepatocyte growth factor: HGF) 등을 들 수 있다. 이러한 성장 인자는 상기 목적을 달성할 수 있는 농도로 첨가하면 된다.
본 발명의 공정 (1), (2), (2-1) 및 (2-2) 중 하나 이상의 공정에서 세포사를 억제하고 세포의 증식을 촉진하는 관점에서, 혈소판 유래 성장 인자 (Platelet-derived growth factor: PDGF) 등의 혈소판 유래 성장 인자 수용체 활성화 물질을 배지에 첨가하는 것도 바람직하다. PDGF 는 A, B, C, D 의 네 종류의 유전자가 존재 하고, AA, AB, BB, CC, DD 의 호모 또는 특정 조합의 이종 이합체를 형성하고, 리간드로서 기능한다. PDGF 수용체는 α 와 β 의 두 종류의 유전자가 존재하고, αα, αβ, ββ 조합의 호모 또는 헤테로 이합체를 형성하여 수용체로 기능한다. 이 가운데, 플라코드를 포함하는 비신경 외배엽에서 PDGFRβ 가 잘 발현하고 있으며, 본 발명에서 사용하는 혈소판 유래 성장 인자 수용체 활성화 물질은 바람직하게는 PDGFRββ 또는 PDGFRαβ 에 대한 작용을 가지고 있으며, 보다 바람직하게는 PDGF-AB, PDGF-BB, PDGF-CC, PDGF-DD 중 하나를 포함하고, 더욱 바람직하게는 PDGF-BB, PDGF-CC 중 하나를 포함한다. PDGF-AB, PDGF-BB, PDGF-CC, PDGF-DD 는 변형 단백질로 R & D systems 사 또는 GenScript 사 등으로부터 입수가능하다.
본 발명의 공정 (1), (2), (2-1) 및 (2-2) 중 하나 이상의 공정에서 뇌하수체 조직의 생산 효율을 향상시키는 관점에서, 플라코드 영역으로의 분화를 촉진하는 화합물을 첨가하는 것도 바람직하다. 위와 같은 작용을 갖는 화합물로서, 예를 들어 미국 특허 US20160326491A1 호에 기재된 BRL-54443, 페난트롤린, 파르테놀라이드 등을 들 수 있다. 플라코드 영역으로의 분화를 촉진하는 화합물로서 BRL-54443 을 사용하는 경우는, 통상 10 nM - 100 μM, 페난트롤린을 이용하는 경우는, 통상 10 nM - 100 μM, 파르테놀라이드를 이용하는 경우는, 통상 10 nM - 100 μM 의 농도로 사용된다.
본 발명의 공정 (2) 및 (2-2) 중 하나의 공정에서 제조된 세포괴를 장기 배양하여, 분화가 진행된 세포를 포함하는 보다 성숙한 세포괴를 얻을 수도 있다. 이러한 배양을 성숙 배양으로도 칭한다. 공정 (2) 및 (2-2) 의 성숙 배양 과정에서 화학적으로 미결정된 성분의 혼입을 회피하는 관점에서, 무혈청 배지가 적합하게 사용된다. 공정 (2) 및 (2-2) 의 성숙 배양에서 사용하는 배지는 공정 (2) 및 (2-2) 에서 사용한 것과 같은 것을 사용할 수도 있다. 또한, 신경 세포 등의 배양에 사용되는 기존의 배지, 예를 들어 DMEM/F-12 배지와 Neurobasal 배지의 1:1 혼합액에 0.5% N2 보충제와 1% B27 보충제가 첨가된 배지 (N2B27 배지), Knockout DMEM/F-12 배지에 StemPro NSC SFM 보충제가 첨가된 배지 (StemPro NSC SFM 배지) 등을 이용할 수도 있다. 성숙 배양을 실시하는 경우에, 부유 배양의 개시시에 이용한 배양 용기에서 배양을 계속할 수 있다. 또한 새로운 배양 용기, 예를 들어 부유 배양용 디쉬, 부유 배양용 플라스크 등에 세포괴를 옮겨 배양을 실시할 수 있다.
본 발명의 공정 (2), 공정 (2-1) 및 (2-2) 중 하나의 공정에서 세포사를 억제하고 세포의 증식을 촉진하는 관점에서, 높은 산소 분위기 하에서 배양 것도 바람직하다. 배양 과정에서 높은 산소 조건은, 예를 들어 세포를 배양하는 인큐베이터에 산소 실린더를 연결하여 인위적으로 산소를 공급함으로써 실현할 수 있다. 이러한 목적에서의 산소 농도는 통상 25% 내지 80% 이며, 보다 바람직하게는 30% 내지 60% 이다.
본 발명의 공정 (2), 공정 (2-1) 및 (2-2) 중 하나의 공정에서 세포괴를 배양하는 배지에의 산소 공급량을 증가시키는 관점에서, 가스 교환 효율 배양 장비를 사용할 수도 있다. 이러한 배양 기재의 예로는 세포 배양 디쉬, 디쉬의 바닥을 가스 투과성 필름으로 한 Lumox 디쉬 (Sarstedt K.K. 사제), VECELL 96 웰 플레이트 (Vessel CO. LTD. 사제) 등을 들 수 있다.
본 발명의 공정 (2), 공정 (2-1) 및 (2-2) 중 하나의 공정에서 배지에 부신피질 호르몬류를 첨가하여 세포괴를 부신피질 호르몬류에 의해 처리하는 것도 또한 바람직하다. 부신피질 호르몬류는 공정 (1) 에서 첨가할 수 있다. 부신피질 호르몬류 처리하여 뇌하수체 플라코드 및/또는 라트케낭에서 ACTH 생산 세포 이외의 뇌하수체 호르몬 생산 세포 (즉, GH 생산 세포, PRL 생산 세포, TSH 생산 세포, LH 생산 세포, FSH 생산 세포 등) 로의 분화가 촉진된다. 부신피질 호르몬류로는 하이드로코르티손, 아세테이트 코르티손, 아세테이트 플루드로코르티손 등의 천연 당질 코르티코이드; 덱사메타손, 베타메타손, 프레드니솔론, 메틸프레드니솔론, 트리암시놀론 등의 인공적으로 합성된 당질 코르티코이드 등을 들 수 있지만, 이에 한정되지 않는다.
배지 중의 부신피질 호르몬류의 농도는 뇌하수체 플라코드 및/또는 라트케낭에서 뇌하수체 호르몬 생산 세포 (단, ACTH 생산 세포를 제외) 로의 분화를 촉진할 수 있는 한 특별히 한정되지 않고, 또한 부신피질 호르몬류의 종류에 따라 적절히 설정할 수 있다. 예를 들어, 하이드로코르티손의 경우, 통상 100 ng/㎖ 이상, 바람직하게는 1 ㎍/㎖ 이상이다. 뇌하수체 호르몬 생산 세포 (단, ACTH 생산 세포를 제외) 의 분화에 영향이 없는 한 하이드로코르티손 농도의 상한치는 특별히 한정되지 않지만, 배양 비용의 관점에서, 일반적으로 1000 ㎍/㎖ 이하, 바람직하게는 100 ㎍/㎖ 이하이다. 한 양태에서, 배지 중의 하이드로코르티손 농도는 일반적으로 100 ng/㎖ - 1000 ㎍/㎖, 바람직하게는 1 - 100 ㎍/㎖ 이다. 부신피질 호르몬류로 덱사메타손을 사용하는 경우, 그 배지 중의 농도는 하이드로코르티손의 1/25 정도라고 할 수 있다.
본 발명의 공정 (2), (2-1) 및 (2-2) 에서 배지에 부신피질 호르몬류를 첨가하는 시기는 뇌하수체 플라코드 및/또는 라트케낭에서 뇌하수체 호르몬 생산 세포 (단, ACTH 생산 세포를 제외) 로의 분화를 촉진할 수 있는 한 특별히 한정되지 않으며, 본 발명의 공정 (2), (2-1) 및 (2-2) 의 배양 공정 개시시부터 배지에 부신 피질 호르몬류를 첨가해도 좋고, 배양 공정 개시 후 부신피질 호르몬류를 첨가하지 않은 배지에서 일정 기간 배양 후 배지에 부신피질 호르몬류를 첨가해도 좋다. 바람직하게는, 본 발명의 공정 (2), (2-1) 및 (2-2) 를 개시 후, 세포 응집괴 중에서 ACTH 생산 세포의 출현이 확인된 단계에서 배지에 부신피질 호르몬류를 첨가한다. 즉, 세포 응집괴 중에서 ACTH 생산 세포의 출현이 확인되기 전까지는 세포 응집괴를 부신피질 호르몬류를 첨가하지 않은 배지에서 배양하고, ACTH 생산 세포의 출현이 확인된 후에 부신피질 호르몬류를 포함하는 배지 중에서 제 3 의 배양 공정을 계속한다. ACTH 생산 세포의 출현은 ACTH 에 대한 항체를 이용하여 면역 조직학적 염색을 통해 확인할 수 있다. 인간 다능성 줄기 세포를 이용한 경우, 일반적으로, 본 발명의 공정 (2), (2-1) 및 (2-2) 의 배양 공정 개시에서 37 일 이상이면, ACTH 생산 세포의 출현이 기대될 수 있으므로, 한 양태에서, 본 발명의 공정 (2), (2-1) 및 (2-2) 의 배양 공정 개시부터 37 일 이후에 배지에 부신피질 호르몬류를 첨가한다.
세포 응집괴를 부신피질 호르몬류로 처리하는 기간은 뇌하수체 플라코드 및/또는 라트케낭에서 뇌하수체 호르몬 생산 세포 (단, ACTH 생산 세포를 제외) 로의 분화를 촉진할 수 있는 한 특별히 한정되지 않지만, 일반적으로 부신피질 호르몬류 비처리군과 비교하여 부신피질 호르몬류 처리군에서 뇌하수체 호르몬 생산 세포 (단, ACTH 생산 세포를 제외) 로의 분화의 촉진이 확인될 때까지 세포 응집괴를 부신피질 호르몬류로 처리한다. 처리 기간은 일반적으로 7 일 이상, 바람직하게는 12 일 이상이다. 처리 기간의 상한은 특별히 한정되지 않지만, 부신피질 호르몬류 비처리군과 비교하여 부신피질 호르몬류 처리군에서 뇌하수체 호르몬 생산 세포 (단, ACTH 생산 세포를 제외) 로의 분화 촉진이 확인된 단계에서 배지에서 부신피질 호르몬류를 제거할 수 있다.
또한, 배지에의 부신피질 호르몬류의 첨가는 ACTH 생산 세포의 분화 유도에 대해 피드백 저해로 인해 억제적으로 작용한다.
본 발명에서 Notch 신호 전달 경로는 세포막에 발현하는 수용체인 Notch 단백질과 인접한 세포막에 발현하는 Notch 리간드 (Delta와 Jagged 등) 와 직접 상호 작용에 의해 활성화되는 신호 전달 경로를 나타낸다. Notch 신호가 전달된 세포에서는 Notch 단백질이 단계적으로 프로세싱되고, 막에서 잘라진 세포내 도메인이 핵 내로 옮겨져 하류 유전자의 발현을 제어한다.
본 발명의 공정 (2), (2-1) 및 (2-2) 에서 이용하는 배지는 바람직하게는 Notch 신호 전달 경로 저해제 (Notch 신호 저해제) 를 포함한다. Notch 신호 저해제는 뇌하수체 플라코드 및/또는 라트케낭에서 뇌하수체 호르몬 생산 세포 (특히 ACTH 생산 세포) 로의 분화를 촉진한다. Notch 신호 저해제는 ACTH 생산의 상류 제어를 하는 전사 인자 Tbx19 의 발현이 증가한다.
Notch 신호 저해제는 공정 (1) 에서 이용하는 배지에 포함해도 좋다.
Notch 신호 저해제는 Notch 에 의해 매개되는 신호 전달을 억제할 수 있는 것인 한 특별히 한정되지 않는다. 핵산, 단백질, 저분자 유기 화합물 중 어느 것이라도 좋다. 해당 물질로 예를 들어, 기능 결실형 Notch 수용체와 리간드 Notch 프로세싱 (S1 절단) 을 저해하는 물질, Notch 및 Notch 리간드의 당쇄 수식을 저해하는 물질, 세포막 이동을 저해하는 물질, Notch 의 세포내 도메인 (NICD) 의 프로세싱 (S2 절단, S3 절단) 을 저해하는 물질 (γ 세크레타아제 저해제), NICD 을 분해하는 물질, NICD 의존적 전사를 저해하는 물질 등을 들 수 있다.
Notch 신호 저해제로 당업자에게 알려진 화합물을 사용할 수도 있다. Notch 신호 저해제로서의 활성을 갖는 화합물로서 예를 들어 DAPT (N-[N-(3,5-디플루오로펜아세틸)-l-알라닐]-S-페닐글라이신 t-부틸 에스테르), DBZ, MDL28170 등 또는 Onco Targets Ther 2013; 6:943-955 에 기재된 물질 등을 들 수 있다. 그 중에서도 DAPT 바람직하다.
배지 중의 Notch 신호 저해제의 농도는 뇌하수체 플라코드 및/또는 라트케낭에서 뇌하수체 호르몬 생산 세포 (특히 ACTH 생산 세포) 로의 분화를 촉진할 수 있는 농도인 한 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 DAPT 의 경우, 통상 0.1 μM 이상, 바람직하게는 1 μM 이상이다. 뇌하수체 호르몬 생산 세포로의 분화에 영향이 없는 한 DAPT 농도의 상한치는 특별히 한정되지 않지만, 배양 비용의 관점에서, 통상 1000 μM 이하, 바람직하게는 100 μM 이하이다. 한 양태에서, 배지의 DAPT 농도는 일반적으로 0.1 - 1000 μM, 바람직하게는 1 - 100 μM (예를 들어, 10 μM) 이다.
3. 뇌하수체 조직을 포함하는 세포괴
본 발명은 1) 신경계 세포 또는 신경 조직, 2) 뇌하수체 조직 및 3) 간엽계 세포를 포함하는 세포괴를 제공한다. 또한 또는 1) 신경계 세포 또는 신경 조직, 2) 뇌하수체 조직 및 4) 신경 능선 세포 또는 신경 능선 유래 세포를 포함하는 세포괴를 제공한다. 이하, 본 발명의 세포괴로도 칭한다. 본 발명의 세포괴는 바람직하게는 상기한 본 발명의 제조 방법에 의해 제조할 수 있다.
본 발명의 세포괴에서, 1) 신경계 세포 또는 신경 조직은 바람직하게는 중추 신경계의 세포 또는 조직, 또는 그 전구체 조직이며, 중추 신경계의 세포 또는 조직으로는 망막, 대뇌 피질, 간뇌 (예를 들어, 시상하부) 및 그 조직에서 유래하는 세포를 들 수 있으며, 보다 바람직하게는 간뇌 또는 그 전구체 조직이며, 더욱 바람직하게는 조직 중에 뇌실양의 구조를 가지고 있는 간뇌 또는 전구 조직이다. 1) 신경계 세포 또는 신경 조직은, 예를 들어 N-카드헤린 양성 신경 상피 조직이다.
본 발명의 세포괴에서 2) 뇌하수체 조직은 선호하지 않는 신경 상피 조직과 연속하여 형성된다. 비신경 상피 조직 및 뇌하수체 조직이 1) 신경계 세포 또는 신경 조직 및 3) 간엽계 세포 중 적어도 하나를 피복하고 있거나, 혹은 비신경 상피 조직 및 뇌하수체 조직이 1) 신경계 세포 또는 신경 조직 및 4) 신경 능선 세포 또는 신경 능선 유래 세포 중 적어도 하나를 피복하고 있는 것이 더 바람직하다.
상기 비신경 상피 조직이 구강 상피 또는 그 전구 조직인 것도 바람직하다. 뇌하수체 조직은 뇌하수체 호르몬 생산 세포를 포함하는 것이 바람직하며, 뇌하수체 조직 줄기 세포를 포함하는 것이 바람직하고, 모공 성상 세포를 포함하는 것이 바람직하며, 뇌하수체 호르몬 생산 세포, 뇌하수체 조직 줄기 세포, 여포 성상 세포 모두를 포함하는 것이 더욱 바람직하다. 뇌하수체 호르몬 생산 세포로는, 예를 들어 성장 호르몬 (GH) 생산 세포, 프로락틴 (PRL) 생산 세포 및 부신피질 자극 호르몬 (ACTH) 생산 세포로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 1 종을 들 수 있다.
뇌하수체 조직 중에 뇌하수체 틈새가 형성되는 것도 바람직하고, 뇌하수체 틈새가 뇌하수체 전엽과 중엽 사이에 잔존하는 잔류 공동 주변의 MCL 틈새양의 구조인 것도 바람직하고, 뇌하수체 틈새가 실질층 틈새양의 구조인 것도 바람직하고, MCL 틈새양의 구조와 실질층 틈새양의 구조를 모두 포함하는 것이 더욱 바람직하다.
본 발명의 세포괴에서, 3) 간엽계 세포는 바람직하게는 두부 간엽계 세포이다.
3) 간엽계 세포는 세포괴의 표면을 피복하고 있는 비신경 상피 조직과 세포괴의 내부에 존재하는 1) 신경계 세포 또는 신경 조직 사이에 존재하는 것이 바람직하다.
본 발명의 세포괴에서, 4) 신경 능선 세포 또는 신경 능선 유래 세포는 바람직하게는 두부 신경 능선 세포 또는 두부 신경 능선 유래 세포이다.
4) 신경 능선 세포 또는 신경 능선 유래 세포는 세포괴의 표면을 피복하고 있는 비신경 상피 조직과 세포괴의 내측에 존재하는 1) 신경계 세포 또는 신경 조직 사이에 존재하는 것이 바람직하다. 4) 신경 능선 세포 또는 신경 능선 유래 세포는 3) 간엽계 세포인 것도 바람직하다.
본 발명의 세포괴는, 예를 들어 1) 신경 상피 조직의 내부에 뇌실양의 공포가 형성되고 당해 공포에 접하고 있는 1) 신경 상피 조직의 면이 aPKC-제타 양성 정단면이다.
본 발명의 세포괴에 포함된 3) 간엽계 세포는 예를 들어, 네스틴, 비멘틴, 카드헤린-11, 라미닌, CD44, CD90 및 CD105 로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 1 종의 간엽계 세포 마커를 발현한다.
본 발명의 세포괴에 포함된 3) 신경 능선 세포 또는 신경 능선 유래 세포는, 예를 들어 네스틴, Sox10, Slug, Snail, Pax3, Zic1, FoxD3, p75 NTR, HNK-1, CHD7, Numb, 및 Ascl1 로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 1 종의 신경 능선 세포 마커를 발현한다.
본 발명에 포함될 수 있는 비신경 상피 조직은, 예를 들어 사이토케라틴, E-카드헤린 및 EpCAM 로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 1 종의 비신경 상피 조직 마커를 발현한다.
본 발명의 세포괴에 포함될 수 있는 뇌하수체 조직 줄기 세포는, 예를 들어 Sox2, Sox9, E-카드헤린, 네스틴, S100β, GFRα2, Prop1, CD133, β-카테닌, Klf4, Oct4, Pax6, 콕사키바이러스 및 아데노바이러스 공통 수용체 (CXADR), PRRX1/2, 에프린-B2 및 ACE 로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 1 종의 뇌하수체 줄기 세포 마커를 발현한다.
4. 뇌하수체 조직의 제조 방법
본 발명은 뇌하수체 조직의 제조 방법을 제공하고, 상기 방법은 하기 공정 (1) - (3) 을 포함한다.
(1) 다능성 줄기 세포를 Wnt 신호 전달 경로 저해 물질의 존재 하에 부유 배양하여 세포 응집체를 형성시키는 제 1 공정,
(2) 제 1 공정에서 얻어진 응집체를 BMP 신호 전달 경로 활성화 물질 및 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질의 존재 하에 부유 배양하여 뇌하수체 조직을 포함하는 세포괴를 얻는 제 2 공정,
(3) 제 2 공정에서 얻어진 세포괴로부터 뇌하수체 조직을 회수하는 제 3 공정.
제 1 공정 및 제 2 공정은 상기 "2. 뇌하수체 조직을 포함하는 세포괴의 제조 방법" 의 제 1 공정 및 제 2 공정과 동일한 방법으로 실시할 수 있다. 또한 선택적으로 제 1 공정 전에 공정 a 를 실시하고 있다. 또는 선택적으로 제 2 공정 대신 제 2 공정 (1) 및 제 2 공정 (2) 를 실시하고 있다.
제 2 공정 또는 제 2 공정 (2) 에서 얻어진 세포괴로부터 뇌하수체 조직을 회수하는 제 3 공정은 일반적으로 현미경 관찰 하에서 핀셋 등을 이용하여 세포괴의 외측 (라트케낭 부분) 에 형성되는 뇌하수체 조직을 박리 및 회수함으로써 이루어진다. 뇌하수체 조직은, 예를 들어 Nature communications, 2016, 7. 에 기재된 바와 같이 얻어진 세포괴의 표면에 있는 반투명한 얇은 상피로 판별할 수 있다. 제 3 공정에서 뇌하수체 조직의 회수 방법으로, 동결 융해, 바람직하게는 완만 동결법을 이용할 수도 있다. 그 방법은 외측에 뇌하수체 조직 및 내측에 간엽계 신경과 신경 상피 조직을 갖는 세포괴를 동결 융해하여 물리적 처리를 실시하지 않고 외측의 뇌하수체 조직이 세포괴에서 박리된다는 것이다.
5. 독성 및 약효성 평가용 시약 및 독성 또는 약효 평가 방법
본 발명의 세포괴, 본 발명의 제조 방법에 의해 제조되는 세포괴 또는 상기 세포괴에서 회수되는 조직은 뇌하수체 조직일 수 있다. 따라서, 본 발명의 세포괴, 본 발명의 제조 방법에 의해 제조되는 세포괴 또는 상기 세포괴에서 회수되는 뇌하수체 조직을 함유하여 이루어지는 시험 물질의 독성 및 약효성 평가용 시약이 제공될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 세포괴 또는 상기 세포괴에서 회수되는 뇌하수체 조직을 이용하여 독성 또는 약효 평가 방법을 제공할 수 있다.
예를 들어, 세포괴 또는 상기 세포괴에서 회수되는 뇌하수체 조직과 시험 물질을 접촉시키는 공정과,
당해 시험 물질이 상기 세포괴 또는 뇌하수체 조직에 미치는 영향을 측정하는 단계를 포함하는 시험 물질의 독성 또는 약효 평가 방법을 들 수 있다.
6. 치료 및 질환의 치료 방법
본 발명의 세포괴, 본 발명의 제조 방법에 의해 제조되는 세포괴 또는 상기 세포괴에서 회수되는 뇌하수체 조직을 함유하여 이루어지는 뇌하수체의 장애로 인한 질환의 치료약이 제공될 수 있다.
뇌하수체의 장애로 인한 질환의 치료약으로는, 예를 들어 본 발명의 세포괴 또는 본 발명의 제조 방법에 의해 제조되는 세포괴를 포함하는 현탁액을 포함하는 이식편을 들 수 있다.
현탁액으로는, 예를 들어 세포괴를 인공 누액이나 식염수에 현탁한 액을 들 수 있다. 현탁액은 세포괴에서 단리된 비신경 상피 세포를 포함할 수도 있는데, 세포의 접착을 촉진하는 인자, 예를 들어 세포외 기질이나 히알루론산 등을 포함하고 있다.
세포괴 대신에 세포괴에서 회수한 뇌하수체 조직을 이용해도 좋다.
또한, 본 발명의 세포괴, 본 발명의 제조 방법에 의해 제조되는 세포괴에서, 뇌하수체 조직의 유효량을 이식을 필요로 하는 대상에게 이식하는 단계를 포함하는 뇌하수체의 장애로 인한 질환의 치료 방법이 제공될 수 있다.
상기 뇌하수체의 장애로 인한 질환은 뇌하수체의 장애로 인한 동물의 질환일 수 있고, 뇌하수체의 장애로 인한 비인간 동물의 질환일 수 있다. 뇌하수체의 장애로 인한 질환으로는 구체적으로는 범 뇌하수체 기능 저하증, 뇌하수체성 소인증, 부신피질 기능 저하증, 부분적 뇌하수체 기능 저하증, 뇌하수체 전엽 호르몬 단독 결핍증 등을 들 수 있다.
이하에 실시예를 참조하여 본 발명을 보다 상세하게 설명하지만, 이들은 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다. 또한 사용하는 시약 및 재료는 특별히 한정되지 않는 한 상업적으로 입수가능하다.
실시예
실시예 1: 인간 ES 세포로부터 제작된 뇌하수체 조직을 포함하는 세포괴
인간 ES 세포 (KhES-1 주, Kyoto University 에서 입수) 를 Scientific Reports, 4, 3594 (2014) 에 기재된 방법에 준하여 피더-프리 조건 하에 배양하였다. 피더-프리 배지로는 StemFit 배지를 사용했고, 피더-프리 스카폴드로는 라미닌 511-E8 을 사용하였다.
구체적인 유지 배양 조작으로, 먼저 서브컨플루언트 인간 ES 세포 (KhES-1 주) 를 PBS 로 세척 후, Accumax (Innovative Cell Technologies 사제) 를 이용하여 효소 처리한 후, StemFit 배지를 첨가하고, 셀 스크레이퍼를 이용하여 배양 디쉬 표면에서 세포를 떼어내고, 피펫팅하여 단일 세포로 분산했다. 그 후, 상기 단일 세포로 분산된 인간 ES 세포를 라미닌 511-E8 로 코팅한 플라스틱 배양 디쉬에 파종하고, Y27632 (ROCK 저해 물질, Wako Pure Chemical Industries, Ltd. 사제, 10 μM) 의 존재 하에 StemFit 배지에서 피더-프리 배양하였다. 상기 플라스틱 배양 디쉬로 6 웰 플레이트 (Corning 사제, 세포 배양용, 배양 면적 9.5 ㎠) 를 이용한 경우, 상기 단일 세포로 분산된 인간 ES 세포의 파종 세포수는 1.2 × 104 였다. 파종한 1 일 후, Y27632 를 포함하지 않는 StemFit 배지로 전량 배지 교환했다. 이후, 1 일 - 2 일에 한 번 Y27632 를 포함하지 않는 StemFit 배지로 전량 배지 교환했다. 그 후, 파종한 7 일 후, 서브컨플루언스 (배양 면적의 60% 가 세포로 덮히는 정도) 가 될 때까지 세포를 배양하였다. 배양한 세포를 분화 유도에 사용하는 경우에는, 파종한 6 일 후에 Stemfit 배지로의 배지 교환과 동시에 SB-431542 (TGFβ 신호 전달 경로 저해 물질, Wako Pure Chemical Industries, Ltd. 사제, 5 μM) 와 SAG (Shh 신호 전달 경로 활성화 물질, Enzo Life Sciences 사제, 300 nM) 을 첨가하였다.
이렇게 하여 조제한 서브컨플루언트 인간 ES 세포를 PBS 로 세척 후, Accumax 을 이용하여 효소 처리를 실시한 후, 분화 유도용 무혈청 배지를 첨가하고, 셀 스크레이퍼를 이용하여 배양 디쉬 표면에서 세포를 떼어내고, 피펫팅하여 단일 세포로 분산했다. 그 후, 상기 단일 세포로 분산된 인간 ES 세포를 세포 비접착성 96 웰 배양 플레이트 (PrimeSurface 96V-바닥 플레이트, SUMITOMO BAKELITE 사제) 의 1 웰 당 1 × 104 세포가 되도록 100 ㎕ 의 무혈청 배지에 부유시켜 37℃, 5% CO2 의 조건 하에 부유 배양하였다. 그 때의 무혈청 배지 (gfCDM + KSR) 로, F-12+Glutamax 배지 (Thermo Fisher Scientific 사제) 와 IMDM+Glutamax 배지 (Thermo Fisher Scientific 사제) 의 1:1 혼합액에 5% Knockout 혈청 대체물 (Thermo Fisher Scientific 사제), 450 μM 1-모노티오글리세롤 (Wako Pure Chemical Industries, Ltd. 사제), 1× 화학적으로 결정된 지질 농축물 (Thermo Fisher Scientific 사제), 50 unit/㎖ 페니실린-50 ㎍/㎖ 스트렙토마이신 (Nacalai Tesque 사제) 를 첨가한 무혈청 배지를 사용하였다. 부유 배양 개시시 (부유 배양 개시후 0 일째, 공정 1 의 개시) 에, 상기 무혈청 배지에 Y27632 (최종 농도 20 μM), IWP-2 (Wnt 신호 전달 경로 저해 물질, Tocris Bioscience 사제, 2 μM), 및 SB-431542 (TGFβ 신호 전달 경로 저해 물질, Wako Pure Chemical Industries, Ltd. 사제, 1 μM) 을 첨가하였다.
부유 배양 개시후 2 일째에, Y27632 을 포함하지 않고, IWP-2, SB-431542, BMP4 (BMP 신호 전달 경로 활성화 물질) 및 SAG 을 포함하는 무혈청 배지를 1 웰 당 100 ㎕ 첨가하였다. BMP4 는 첨가하는 배지에 3 nM 첨가하여 웰의 최종 농도를 1.5 nM 가 되도록 하고, SAG 는 첨가하는 배지에 4 μM 첨가하여 웰의 최종 농도를 2 μM 가 되도록 했다. 그 후, 부유 배양 개시후 6, 10, 13, 17, 21 및 24 일째에 Y27632 와 BMP4 를 포함하지 않고, IWP-2, SB-431542 및 SAG 을 포함하는 무혈청 배지를 이용하여 반량 배지 교환하였다.
부유 배양 개시후 28 일째에 세포괴를 디쉬에 회수하고, 도립 현미경 (KEYENCE CORPORATION 사제, BIOREVO) 을 이용하여 명시야 관찰을 실시했다 (도 1A-B). 도 1A 오른쪽 아래의 스케일 바는 1000 ㎛, 도 1B 오른쪽 아래의 스케일 바는 200 ㎛ 를 나타낸다. 그 결과, 상기 분화 유도 방법에 의해 인간 ES 세포로부터 부유 배양 28 일째까지 신경 조직 및 비신경 상피 조직을 포함하는 직경 약 1 ㎜ 의 세포괴가 형성되었다. 세포괴의 표면에 두께 30 ㎛ 전후의 상피 모양의 구조가 형성되어 있었다.
상기 부유 배양 개시후 28 일째의 세포괴를 각각 4% 파라포름알데하이드로 실온에서 15 분 고정한 후, 20% 수크로오스/PBS 로 4℃ 에서 하룻밤 침지하여 동결 보호 처리 후, 동결 절편을 만들었다. 이러한 동결 절편에 관하여 뇌하수체의 초기 마커인 항-Lhx3 항체 (Merck Millipore 사제, 토끼), 플라코드 마커인 항-Emx2 항체 (R&D Systems 사제, 양), 구강 상피 또는 뇌하수체 플라코드 마커인 Pitx1 항체 (Santa Cruz Biotechnology 사제, 염소), 복측 간뇌 마커인 항-Nkx2.1 항체 (Merck Millipore 사제, 마우스), 항-Tbx3 항체 (R&D Systems 사제, 염소), 항-Sox3 항체 (R&D Systems 사제, 염소), 비신경 상피 조직 마커인 항-CD326/EpCAM 항체 (Acris Antibodies 사제, 마우스), 항-범-사이토케라틴 항체 (Sigma Aldrich 사제, 마우스), 미분화 신경 및 신경 능선 또는 간엽계 세포 마커인 항-네스틴 항체 (Spring Bioscience 사제, 토끼), 기저막 마커인 항-라미닌 항체 (KYOWA PHARMA CHEMICAL CO.,LTD. 사제, 마우스), 정단면 마커인 항-aPKC 항체 (Santa Cruz Biotechnology 사제, 토끼), 및 신경 세포 마커인 항-βIII 튜불린 (Tuj1) 항체 (Sigma Aldrich 사제, 마우스) 를 이용하여 면역 형광 염색을 실시했다. 형광 표지 이차 항체로 Alexa488-표지 당나귀 항-토끼 항체 (Thermo Fisher Scientific 사제), CF555-표지 당나귀 항-마우스 항체 (Biotium 사제), CF555-표지 당나귀 항-염소 항체, CF543-표지 당나귀 항-양 항체, 및 Alexa647-표지 당나귀 항-마우스 항체를 사용하여 다중 염색을 수행했다. 핵의 대비 염색에는 Hoechst33342 (Sigma Aldrich 사제) 을 사용하였다. 도 1E 는 도 1C 및 D, 도 1H 는 도 1F 및 G, 도 1K 는 도 1I 및 J, 도 1N 은 도 1L 및 M, 도 1Q 는 도 1O 및 P, 도 1U 는 도 1S 및 T, 도 1X 는 도 1V 및 W 에 대한 핵의 대비 염색상이다. 염색한 절편의 관찰 및 이미지 수집에는 정립 형광 현미경 Axio Imager M2 (Carl Zeiss 사제) 및 부속 소프트웨어 Axio Vision 을 사용하였다. 도 1C - E, 도 1F 오른쪽 아래의 스케일 바는 200 ㎛, 도 1I, 도 1L, 도 1O, 도 1S 오른쪽 아래의 스케일 바는 100 ㎛, 도 1V 오른쪽 아래의 스케일 바는 50 ㎛ 를 나타낸다.
그 결과, 상기 분화 유도 방법으로 유도된 부유 배양 개시후 28 일째의 세포괴의 내부에는 Nkx2.1, Tbx3, Sox3, βIII 튜불린 양성의 복측 간뇌 또는 시상하부의 신경 상피 조직이 존재하고 (도 1D, G, L, O, P), 외부에는 EpCAM, 범-사이토케라틴 양성 비신경 상피 조직이 존재하는 것으로 나타났다 (도 1M, W). 내측의 신경 상피 조직의 더 안쪽은 aPKC-제타-양성 정단면이며, 세포가 존재하지 않는 공포인 뇌실양의 조직이 형성되어 있는 것으로 나타났다 (도 1I, * 부). 외측의 비신경 상피 조직의 내부에 라미닌 등으로부터 형성되는 기저막양의 구조가 형성되어 있었다 (도 1J). 또한 비신경 상피 조직의 일부는 Lhx3, Emx2, Pitx1 양성이며, 비신경 상피 조직이 함입하여 형성되는 라트케낭양의 구조와 뇌하수체 플라코드가 형성되어 있는 것으로 나타났다 (도 1C, F, S, V). 또한, 외측의 비신경 상피 조직과 내측의 신경 상피 조직 사이에 네스틴-양성, 범-사이토케라틴, 라미닌-약양성, βIII 튜불린-음성 두부 간엽계 세포가 존재하고 있었다. 위의 결과로부터, 본 발명의 제조 방법에 의해, 비신경 상피 및 신경 상피와 간엽계 세포를 포함하고, 외부가 비신경 상피로 덮히고, 내부에 뇌실양의 구조를 갖는 복측 간뇌 또는 시상하부양의 신경 상피 조직이 형성되고, 비신경 상피 및 신경 상피 사이에 두부 간엽계 세포가 존재하고, 외부의 비신경 상피의 일부가 뇌하수체 플라코드인 세포괴가 제조 가능하다는 것이 밝혀졌다. 부유 배양 개시후 28 일째의 세포괴의 모식도를 도 1Y 에 나타낸다.
실시예 2: 인간 ES 세포로부터 제작된 뇌하수체 조직을 포함하는 세포괴의 장기 배양에 의한 성숙
인간 ES 세포 (KhES-1 주, Kyoto University 에서 입수) 를 Scientific Reports, 4, 3594 (2014) 에 기재된 방법에 준하여 피더-프리 조건 하에 배양하였다. 피더-프리 배지로는 StemFit 배지를 사용했고, 피더-프리 스카폴드로는 라미닌 511-E8 을 사용하였다.
구체적인 유지 배양 조작으로는 실시예 1 과 동일하게 수행하였다.
그 후, 실시예 1 과 동일한 조건 하에 96 웰 플레이트에서 부유 배양을 실시했다.
부유 배양 개시후 28 일째에 세포괴를 10 ㎝ 부유 배양용 디쉬 (SUMITOMO BAKELITE CO., LTD. 사제) 로 디쉬 1 장당 48 개의 세포괴를 옮겨 무혈청 배지를 이용하여 배양 84 일째까지 부유 배양을 실시했다. 그 때의 무혈청 배지 (gfCDM + KSR) 로, F-12+Glutamax 배지 (Thermo Fisher Scientific 사제) 와 IMDM+Glutamax 배지 (Thermo Fisher Scientific 사제) 의 1:1 혼합액에 10% Knockout 혈청 대체물 (Thermo Fisher Scientific 사제), 450 μM 1-모노티오글리세롤 (Wako Pure Chemical Industries, Ltd. 사제), 1× 화학적으로 결정된 지질 농축물 (Thermo Fisher Scientific 사제), 50 unit/㎖ 페니실린-50 ㎍/㎖ 스트렙토마이신 (Nacalai Tesque 사제), 및 2 μM SAG 을 첨가한 무혈청 배지를 디쉬 1 장당 15 ㎖ 이용하고, 3 일 내지 4 일에 한 번 반량 배지를 교환했다.
상기 부유 배양 개시후 70 일째의 세포괴를 도립 현미경 (KEYENCE CORPORATION 사제, BIOREVO) 을 이용하여 명시야 관찰을 실시했다 (도 2A, B). 도 2A 오른쪽 아래의 스케일 바는 1000 ㎛, 도 2B 오른쪽 아래의 스케일 바는 200 ㎛ 를 나타낸다. 그 결과, 부유 배양 개시후 70 일째에는 두께 100 ㎛ 전후의 상피 조직으로 덮힌 세포괴가 형성되어 있는 것으로 나타났다. 상기 세포괴의 일부를 4% 파라포름알데하이드로 고정하고, 나머지 세포괴를 더 부유 배양하였다. 그 때의 배지로는, 상기 무혈청 배지에 추가로 10 μM 덱사메타손 (Sigma Aldrich 사제, 마우스) 을 첨가한 것을 이용했다. 부유 배양 개시후 84 일째까지 배양한 후 4% 파라포름알데하이드로 세포를 고정했다. 상기 배양 70 일째와 84 일째의 세포괴로부터 실시예 1 과 동일한 방법으로 동결 절편을 만들고, 뇌하수체의 호르몬 생산 세포 마커인 항-부신피질 자극 호르몬 (ACTH) 항체 (Lab Vision 사제, 마우스), 항-프로락틴 (PRL) 항체 (Cell Marque 사제, 토끼), 항-성장 호르몬 항체 (R&D Systems 사제, 염소) 와 비신경 상피 조직 마커인 항-범-사이토케라틴 항체를 사용하여 실시예 1 과 동일한 방법으로 면역 형광 염색 및 관찰을 실시했다. 도 2D 는 도 2C 의, 도 2G 는 도 2E 및 F 의, 도 2J 는 도 2H 및 I 의 세포 핵의 대비 염색상이다. 도 2C, 도 2E 오른쪽 아래의 스케일 바는 100 ㎛, 도 2H 오른쪽 아래의 스케일 바는 50 ㎛ 를 나타낸다.
그 결과, 부유 배양 개시후 70 일째의 세포괴에는 뇌하수체의 호르몬 생산 세포 마커인 ACTH 양성 세포가 존재하고 있었다 (도 2C).
또한 덱사메타손을 첨가하여 14 일간 배양한 부유 배양 개시후 84 일째의 세포괴에는 뇌하수체의 호르몬 생산 세포 마커인 PRL 양성 세포와 GH 양성 세포가 각각 존재하고 있었다 (도 2E, H). 이러한 결과로부터, 상기 분화 유도 방법에 의해 인간 다능성 줄기 세포로부터 뇌하수체의 호르몬 생산 세포가 분화 유도된 것으로 나타났다.
참고예 1: 인간 ES 세포로부터의 뇌하수체 조직을 포함하는 세포괴의 제조에 있어서 BMP4 첨가 시기의 검토 (1)
인간 ES 세포 (KhES-1 주, Kyoto University 에서 입수) 를 Scientific Reports, 4, 3594 (2014) 에 기재된 방법에 준하여 피더-프리 조건 하에 배양하였다. 피더-프리 배지로는 StemFit 배지를 사용했고, 피더-프리 스카폴드로는 라미닌 511-E8 을 사용하였다.
구체적인 유지 배양 조작은 실시예 1 과 동일하게 실시했다.
그 후, 실시예 1 과 동일한 조건 하에 96 웰 플레이트에서 부유 배양을 개시했다.
부유 배양 기간 동안 BMP 신호 전달 경로 활성화 물질을 첨가하지 않은 조건을 컨트롤로 했다 (-BMP4 조건, 도 3A). 그 후, 부유 배양 개시후 1, 2 또는 3 일째에 BMP 신호 전달 경로 활성화 물질을 첨가하는 조건 (Day1 - 3 + BMP4 조건, 도 3B - D) 에서는, Y27632 을 포함하지 않고, IWP-2, SB-431542 및 BMP4 를 포함하는 무혈청 배지를 1 웰 당 100 ㎕ 첨가하였다. BMP4 는 첨가하는 배지에 3 nM 첨가하여, 웰의 최종 농도가 1.5 nM 가 되도록 했다. 부유 배양 개시후 6 일째에 Y27632 와 BMP4 를 포함하지 않고, IWP-2 및 SB-431542 을 포함하는 무혈청 배지를 이용하여 반량 배지를 교환했다. 부유 배양 개시후 10 일째에 도립 현미경 (KEYENCE CORPORATION 사제, BIOREVO) 을 이용하여 명시야 관찰을 실시했다 (도 3A-D). 도 3A-D 오른쪽 아래의 스케일 바는 200 ㎛ 를 나타낸다.
그 결과, BMP4 를 첨가하지 않은 조건 하에서는, 표면이 부드러운 배양체가 형성되고, 배양체 표면에서 비신경 상피양의 구조는 확인할 수 없었다 (도 3A). 분화 유도 개시 1 일째와 2 일째에 BMP4 를 첨가한 조건 (Day1, 2 + BMP4) 에서는, 신경 상피양의 구조를 갖는 중심부를 비신경 상피양의 층이 덮고 있는 이층 구조를 갖는 신경 조직 및 비신경 상피 조직을 포함하는 세포괴가 형성되어 있었다 (도 3B, C). 두 가지 조건을 비교하면, 2 일째에 BMP4 를 첨가한 경우에, 1 일째에 BMP4 를 첨가한 조건 하에 얻어진 배양체 (도 3B) 보다 큰 배양체 (도 3C) 가 형성되었다. 분화 유도 개시 3 일째에 BMP4 를 첨가한 조건에서는, 외부의 비신경 상피양의 조직이 형성되지 않고, 표면이 매끄러운 신경 상피양의 조직으로만 구성되는 배양체가 형성되었다 (도 3D). 위의 결과로부터, 인간 다능성 줄기 세포로부터 미래의 뇌하수체 조직의 기반이 되는 비신경 상피 조직으로 코팅된 세포괴의 형성에는 BMP 신호 전달 경로 활성화 물질을 부유 배양 개시후 72 시간 이내에 첨가하는 것이 효과적임을 알 수 있었다.
실시예 3: 인간 ES 세포로부터의 뇌하수체 조직을 포함하는 세포괴의 제조에 있어서 BMP4 첨가 시기의 검토 (2)
인간 ES 세포 (KhES-1 주, Kyoto University 에서 입수) 를 Scientific Reports, 4, 3594 (2014) 에 기재된 방법에 준하여 피더-프리 조건 하에 배양하였다. 피더-프리 배지로는 StemFit 배지를 사용했고, 피더-프리 스카폴드로는 라미닌 511-E8 을 사용하였다.
구체적인 유지 배양 조작은 실시예 1 과 동일하게 실시했다.
그 후, 실시예 1 과 동일한 조건 하에 96 웰 플레이트에서 부유 배양을 개시했다.
배지를 첨가하지 않고 부유 배양 개시후 2 일째와 3 일째에 도립 현미경을 이용하여 응집체의 명시야 관찰을 실시했다. 도 4A 오른쪽 아래의 스케일 바는 200 ㎛ 를 나타낸다. 관찰 결과, BMP4 의 첨가가 바람직한 시기인 부유 배양 개시후 2 일째의 응집체는 표면에 요철이 보이고, 일그러진 형상이었다 (도 4A). 한편, 부유 배양 개시후 3 일째의 응집체는 2 일째 보다 요철이 감소하고, 구체에 가까운 형태를 띠고 있었다 (도 4B).
상기 부유 배양 개시후 2 일째와 3 일째의 응집체를 실시예 1 에 기재된 방법으로 고정하고 동결 절편을 제작하였다. 이러한 동결 절편에 관해 밀착 결합 마커인 항-ZO-1 항체 (Thermo Fisher Scientific 사제, 토끼) 와 신경 줄기 세포와 다능성 줄기 세포 마커인 항-Sox2 항체 (Santa Cruz Biotechnology 사제, 염소) 를 사용해 면역 형광 염색을 실시했다. 형광 표지 이차 항체 및 핵 대비 염색은 실시예 1 에 기재된 것을 사용했다. 도 4C 오른쪽 아래의 스케일 바는 100 ㎛ 를 나타낸다. 그 결과, 부유 배양 개시후 2 일째의 응집체에서는, 응집체의 가장 표층 세포의 일부가 ZO-1 양성이며, 밀착 결합을 형성했다 (도 4C). 한편, 부유 배양 개시후 3 일째의 응집체에서는, ZO-1 양성 세포가 응집체 내부에 함입되어 가장 표층에는 국재화가 보이지 않았다 (도 4F). 또한, 부유 배양 개시후 3 일째의 응집체에서는, 외층의 세포들이 더 밀착된 영역과, 응집체 내부의 세포가 듬성 듬성한 영역의 이층 구조가 보다 명확하게 확인할 수 있도록 되어 있었다 (도 4D, G). 위의 결과로부터, 신경 조직 및 비신경 상피 조직을 포함하는 세포괴의 제조 과정에서 BMP4 의 첨가 시기를 결정하기 위한 방법으로서 응집체의 가장 표층의 세포의 밀착 결합의 검출을 사용할 수 있다는 것이 밝혀졌다.
실시예 4: 인간 ES 세포로부터의 뇌하수체 조직을 포함하는 세포괴의 제조에 있어서 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질 첨가 조건의 검토
인간 ES 세포 (KhES-1 주, Kyoto University 에서 입수) 를 Scientific Reports 4, 3594 (2014) 에 기재된 방법에 준하여 피더-프리 조건 하에 배양하였다. 피더-프리 배지로는 StemFit 배지를 사용했고, 피더-프리 스카폴드로는 라미닌 511-E8 을 사용하였다.
구체적인 유지 배양 조작은 실시예 1 과 동일하게 실시했다.
그 후, 실시예 1 과 동일한 조건 하에 96 웰 플레이트에서 부유 배양을 개시했다.
부유 배양 개시후 2 일째에, Y27632 을 포함하지 않고, IWP-2, SB-431542, BMP4 및 SAG 을 포함하는 무혈청 배지를 1 웰 당 100 ㎕ 첨가하였다. BMP4 는 첨가하는 배지에 3 nM 첨가하여, 웰의 최종 농도가 1.5 nM 이 되도록 했다. 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질로서 SAG 를 최종 농도가 100, 300, 500, 700 nM, 2, 5 μM 이 되도록 첨가하였다. 부유 배양 기간 동안 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질을 첨가하지 않은 조건을 컨트롤로 했다 (-SAG 조건, 도 5A).
부유 배양 개시후 6, 10, 13, 17, 21, 24 일째에 Y27632 와 BMP4 를 포함하지 않고, IWP-2, SB-431542 와 각 농도의 SAG 을 포함하는 무혈청 배지를 이용하여 반량 배지 교환했다.
부유 배양 개시후 28 일째에 도립 현미경 (KEYENCE CORPORATION 사제, BIOREVO) 을 이용하여 명시야 관찰을 실시했다 (도 5A-H). 도 5A 오른쪽 아래의 스케일 바는 1000 ㎛ 를 나타낸다.
그 결과, 부유 배양 동안 SAG 를 첨가하지 않은 조건 하에서는, 세포괴의 표면에 비신경 상피양의 구조를 갖는 구체에 가까운 조직이 형성되어 있었다 (도 5A). 한편, 각 농도의 SAG 을 첨가한 조건 하에서는, SAG 을 첨가하지 않은 조건에 비해 더 크고, 표면의 비신경 상피 조직이 라트케낭에 함입하여 세포괴 내부에 신경 상피양의 조직과 간엽계 세포가 존재하는 세포괴가 형성되었다 (도 5B-H). 위의 결과로부터, 뇌하수체 조직을 갖는 세포괴의 제조에서는 부유 배양 동안 SAG 농도는 100 nM 내지 5 μM 가 적정인 것으로 나타났다. 특히 SAG 를 최종 농도가 100 nM, 300 nM, 500 nM, 700 nM, 1 μM 또는 2 μM 가 되도록 배양 2 일째에 첨가한 조건 (도 5B-G) 에서는 5 μM 첨가한 조건 (도 5H) 과 비교하여 세포괴의 크기가 크고, 세포괴의 표면에서의 뇌하수체 조직의 형성이 양호했다.
실시예 5: 인간 ES 세포로부터의 뇌하수체 조직을 포함하는 세포괴의 제조에 있어서의 분화 유도 전 화합물 처리의 효과
인간 ES 세포 (KhES-1 주) 를 Scientific Reports, 4, 3594 (2014) 에 기재된 방법에 준하여 피더-프리 조건 하에 배양하였다. 피더-프리 배지로는 StemFit 배지를 사용했고, 피더-프리 스카폴드로는 라미닌 511-E8 을 사용하였다. 구체적인 유지 배양 조작으로는 실시예 1 과 동일하게 수행하였다.
배양한 세포를 분화 유도하는 전처리로, 파종한 6 일 후에 Stemfit 배지로의 배지 교환과 동시에 아무것도 첨가하지 않은 조건 (컨트롤 (control)), 300 nM SAG 만을 첨가한 조건 (+300 nM SAG), 5 μM SB-431542 만을 첨가한 조건 (+5 μM SB431542), SAG 및 SB431542 을 동시에 첨가한 조건 (+SAG/SB) 의 4 조건의 세포를 유지 배양하였다.
상기 처리 다음날, 서브컨플루언스에 도달한 4 조건의 인간 ES 세포를 각각 실시예 1 에 기재된 방법으로 부유 배양에 의해 뇌하수체 조직을 포함하는 세포괴로의 분화 유도를 실시했다.
부유 배양 개시후 28 일째에, 도립 현미경을 사용하여 명시야 관찰을 실시했다 (도 6A-D). 도 6A 오른쪽 아래의 스케일 바는 1000 ㎛ 를 나타낸다. 그 결과, 부유 배양 전에 화합물 (SAG 및/또는 SB431542) 을 첨가하지 않은 조건 하에서는 형성된 세포괴가 작고, 외측의 비신경 상피 조직과 내측의 신경 상피 조직 사이에 간엽계 세포를 확인할 수 없었다 (도 6A). 300 nM SAG 만으로 처리한 조건 하에서는 무첨가 조건과 비교하여 세포괴가 커졌고, 간엽계 세포의 존재도 확인할 수 있었다 (도 6B). 5 μM SB431542 만을 첨가한 조건 및 SAG 및 SB431542 을 동시에 첨가한 조건 하에서, 더 뇌하수체 조직을 포함하는 더 큰 세포괴가 형성되었다 (도 6C, D).
위의 결과로부터, 부유 배양 개시 전에 화합물 처리를 실시함으로써 뇌하수체 조직을 포함하는 세포괴의 형성 효율이 향상되고, 그 조건으로 5 μM SB-431542 만을 첨가한 조건 (+5 μM SB-431542) 및 SAG 및 SB431542 을 동시에 첨가한 조건 (+SAG/SB) 이 바람직한 것으로 나타났다.
실시예 6: 인간 ES 세포로부터의 뇌하수체 조직을 포함하는 세포괴의 제조에서 Wnt 신호 전달 경로 저해 물질 첨가 조건의 검토
인간 ES 세포 (KhES-1 주) 를 Scientific Reports, 4, 3594 (2014) 에 기재된 방법에 준하여 피더-프리 조건 하에 배양하였다. 피더-프리 배지로는 StemFit 배지를 사용했고, 피더-프리 스카폴드로는 라미닌 511-E8 을 사용하였다.
구체적인 유지 배양 조작으로는 실시예 1 과 동일하게 수행하였다.
그 후, 부유 배양 개시시에 첨가하는 Wnt 신호 전달 경로 저해 물질의 종류 또는 존재 또는 비존재를 변경하는 것 이외에는 실시예 1 과 동일한 조건 하에 96 웰 플레이트에서 부유 배양을 실시했다. 그 때의 Wnt 신호 전달 경로 저해 물질로서, PORCN 저해제인 IWP-2, C-59 (Cayman Chemicals 사제, 500 nM), LGK974 (Cayman Chemicals 사제, 5 μM), TANK 저해제인 XAV939 (Cayman Chemicals 사제, 1 μM), IWR1-endo (Merck Millipore 사제, 1 μM) 및 작용 기전이 보고되지 않은 KY02111 (Cayman Chemicals 사제, 5 μM) 을 부유 배양 개시시에 첨가하고, Wnt 신호 전달 경로 저해 물질 무첨가의 컨트롤로서 DMSO 만을 첨가한 조건을 실시했다.
부유 배양 개시후 2 일째에, Y27632 을 포함하지 않고, 각 Wnt 신호 전달 경로 저해 물질, SB-431542, BMP4 및 SAG 을 포함하는 무혈청 배지를 1 웰 당 100 ㎕ 첨가하였다. BMP4 는 첨가하는 배지에 3 nM 첨가하여 웰의 최종 농도를 1.5 nM 가 되도록 하고, SAG 는 첨가하는 배지에 4 μM 첨가하여 웰의 최종 농도를 2 μM 가 되도록 했다.
부유 배양 개시후 6, 10, 13, 17, 21, 24 일째에 Y27632 와 BMP4 를 포함하지 않고, 각 Wnt 신호 전달 경로 저해 물질, SB-431542 및 SAG 을 포함하는 무혈청 배지를 이용하여 반량 배지를 교환했다. 위 조건 이외에, 부유 배양 동안 SB431542 와 Wnt 신호 전달 경로 저해 물질을 둘 다 첨가하지 않는 조건도 실시했다.
부유 배양 개시후 28 일째에 도립 현미경 (KEYENCE CORPORATION 사제, BIOREVO) 을 이용하여 명시야 관찰을 실시했다 (도 7A - H). 도 7A 오른쪽 아래의 스케일 바는 1000 ㎛ 를 나타낸다.
그 결과, SB431542 및 Wnt 신호 전달 경로 저해 물질을 둘 다 첨가하지 않는 조건 및 SB431542 을 첨가하고 Wnt 신호 전달 경로 저해 물질을 첨가하지 않은 조건 하에서는 세포괴의 표면에 비신경 상피 조직이 형성되지 않았다 (도 7A, B). 한편, Wnt 신호 전달 경로 저해 물질인 IWP-2, KY02111, C59, LGK974, XAV939 및 IWR1-endo 를 첨가한 조건 하에 표면에 비신경 상피 구조를 갖는 세포괴가 형성되었다 (도 7C-H). 특히, 2 μM IWP-2,5 μM KY02111, 1 μM XAV939 및 1 μM IWR1e 을 첨가했을 때 상태가 좋은 큰 세포괴가 형성되었다 (도 7C, D, G, H). 위의 결과로부터, PORCN 저해제, TANK 저해제 등을 이용하여 Wnt 신호 전달 경로를 저해함으로써 BMP 신호에 의한 뇌하수체 조직을 포함하는 세포괴의 표면에서의 비신경 상피 조직의 형성이 촉진되는 것으로 나타났다.
실시예 7: 인간 ES 세포로부터의 뇌하수체 조직을 포함하는 세포괴의 제조에 있어서 BMP4 첨가 농도의 검토
인간 ES 세포 (KhES-1 주, Kyoto University 에서 입수) 를 Scientific Reports, 4, 3594 (2014) 에 기재된 방법에 준하여 피더-프리 조건 하에 배양하였다. 피더-프리 배지로는 StemFit 배지를 사용했고, 피더-프리 스카폴드로는 라미닌 511-E8 을 사용하였다.
구체적인 유지 배양 조작으로는 실시예 1 과 동일하게 수행하였다.
그 후, 실시예 1 과 동일한 조건 하에 96 웰 플레이트에서 부유 배양을 개시했다.
부유 배양 개시후 2 일째에, Y27632 을 포함하지 않고, IWP-2, SB-431542, BMP4 및 SAG 을 포함하는 무혈청 배지를 1 웰 당 100 ㎕ 첨가하였다. 이 경우, BMP4 의 첨가량은 0.5 nM, 1.5 nM, 5 nM 및 무첨가 컨트롤의 4 조건으로 했다. BMP4 는 첨가하는 배지에 설정한 조건의 2 배의 농도로 첨가하여, 웰의 최종 농도가 설정한 조건이 되도록 했다. SAG 는 첨가하는 배지에 4 μM 첨가하여 웰의 최종 농도를 2 μM 가 되도록 했다.
부유 배양 개시후 6, 10, 13, 17, 21 및 24 일째에 Y27632 와 BMP4 를 포함하지 않고, IWP-2, SB-431542 및 SAG 을 포함하는 무혈청 배지를 이용하여 반량 배지 교환을 실시했다.
부유 배양 개시후 28 일째에, 도립 현미경을 사용하여 명시야 관찰을 실시했다 (도 8A - D). 도 8A 오른쪽 아래의 스케일 바는 1000 ㎛ 를 나타낸다.
그 결과, BMP4 를 첨가하지 않은 조건 하에서는 세포괴의 표면에 비신경 상피 구조가 형성되지 않았다 (도 8A). 한편, 0.5 nM, 1.5 nM, 5 nM 의 BMP4 를 첨가한 조건 하에서는, 모두 세포괴의 표면에 비신경 상피 구조가 형성되었다 (도 8B-D). 위의 결과로부터, 부유 배양 2 일째에 BMP4 을 단회 첨가함으로써 뇌하수체 조직을 포함하는 세포괴의 표면에 비신경 상피 조직이 형성되는 것으로 나타났다.
실시예 8: 인간 ES 세포로부터의 뇌하수체 조직을 포함하는 세포괴의 제조에 있어서 TGF β 신호 전달 경로 저해 조건의 검토
인간 ES 세포 (KhES-1 주) 를 Scientific Reports, 4, 3594 (2014) 에 기재된 방법에 준하여 피더-프리 조건 하에 배양하였다. 피더-프리 배지로는 StemFit 배지를 사용했고, 피더-프리 스카폴드로는 라미닌 511-E8 을 사용하였다.
구체적인 유지 배양 조작으로는 실시예 1 과 동일하게 수행하였다.
그 후, 부유 배양 개시시에 첨가하는 TGFβ 신호 전달 경로 저해 물질의 농도 및 종류를 변경하는 것 이외에는 실시예 1 과 동일한 조건 하에 96 웰 플레이트에서 부유 배양을 실시했다. 그 때의 TGFβ 신호 전달 경로 저해 물질로서, SB431542 (1 또는 10 μM), A 83-01 (Cayman Chemicals 사제, 1 또는 10 μM), 및 RepSox (Cayman Chemicals 사제, 1 μM) 을 각 농도 조건으로 첨가하였다.
그 후, 부유 배양 개시후 2 일째에, Y27632 을 포함하지 않고, IWP-2, 각 TGFβ 신호 전달 경로 저해 물질, BMP4 및 SAG 을 포함하는 무혈청 배지를 1 웰 당 100 ㎕ 첨가하였다. BMP4 는 첨가하는 배지에 3 nM 첨가하여 웰의 최종 농도를 1.5 nM 가 되도록 하고, SAG 는 첨가하는 배지에 4 μM 첨가하여 웰의 최종 농도를 2 μM 가 되도록 했다.
부유 배양 개시후 6, 10, 13, 17, 21, 24 일째에 Y27632 와 BMP4 를 포함하지 않고, IWP-2, 각 TGFβ 신호 전달 경로 저해 물질 및 SAG 을 포함하는 무혈청 배지를 이용하여 반량 배지를 교환했다. 위 조건 이외에 부유 배양 동안 TGFβ 신호 전달 경로 저해 물질과 IWP-2 를 둘 다 첨가하지 않는 조건 및 IWP-2 를 첨가하고 TGFβ 신호 전달 경로 저해 물질을 첨가하지 않는 조건도 실시했다.
그 결과, 공정 (1) 에서, TGFβ 신호 전달 경로 저해 물질과 IWP-2 를 둘 다 첨가하지 않는 조건 하에서는 부유 배양 개시후 28 일째의 세포괴의 표면에 비신경 상피 구조가 형성되지 않았다 (도 9A). IWP-2 를 첨가하고 TGFβ 신호 전달 경로 저해 물질을 첨가하지 않는 조건 하에서는, 세포괴의 표면에 비신경 상피 구조가 형성되었지만, 형성된 세포괴가 작고, 외측의 비신경 상피 조직과 내측의 신경 상피 조직 사이에 간엽계 세포가 확인되지 않았다 (도 9B). 각 TGFβ 신호 전달 경로 저해 물질을 첨가한 조건 하에서는, 외측의 비신경 상피 조직과 내측의 신경 상피 조직 사이에 간엽계 세포가 존재하는 뇌하수체 조직을 포함하는 큰 세포괴가 형성되었다 (도 9C-G). 위의 결과로부터, 부유 배양 동안 TGFβ 신호 전달 경로 저해 물질을 첨가함으로써 외측의 비신경 상피 조직과 내측의 신경 상피 조직 사이에 간엽계 세포가 존재하는 뇌하수체 조직을 포함하는 큰 세포괴를 제조할 수 있는 것으로 밝혀졌다.
실시예 9: 인간 iPS 세포로부터 제작된 신경 조직 및 비신경 상피 조직을 포함하는 세포괴
인간 iPS 세포 (201B7 주, iPS Academia Japan, Inc. 에서 입수) 를, Scientific Reports, 4, 3594 (2014) 에 기재된 방법에 준하여 피더-프리 조건 하에 배양하였다. 피더-프리 배지로는 StemFit 배지를 사용했고, 피더-프리 스카폴드로는 라미닌 511-E8 을 사용하였다.
구체적인 유지 배양 조작으로는 실시예 1 과 동일하게 실시했다.
그 후, 실시예 1 과 동일한 조건 하에 96 웰 플레이트에서 부유 배양을 실시했다.
부유 배양 개시후 2 일째에, Y27632 을 포함하지 않고, IWP-2, SB-431542, SAG 및 BMP4 를 포함하는 무혈청 배지를 1 웰 당 100 ㎕ 첨가하였다. BMP4 는 첨가하는 배지에 3 nM 첨가하여 웰의 최종 농도를 1.5 nM 가 되도록 하고, SAG 는 첨가하는 배지에 4 μM 첨가하여 웰의 최종 농도를 2 μM 가 되도록 했다.
부유 배양 개시후 6, 10, 13, 17, 21, 24 일째에 Y27632 와 BMP4 를 포함하지 않고, IWP-2, SB-431542 및 SAG 을 포함하는 무혈청 배지를 이용하여 반량 배지를 교환했다.
부유 배양 개시후 28 일째에, 도립 현미경을 사용하여 명시야 관찰을 실시했다 (도 10A, B). 도 10A 오른쪽 아래의 스케일 바는 1000 ㎛, 도 10B 오른쪽 아래의 스케일 바는 200 ㎛ 를 나타낸다. 그 결과, 실시예 1 에서 인간 ES 세포주 KhES-1 로부터 제작했을 때와 마찬가지로, 인간 iPS 세포주 201B7 로부터 중심부의 신경 조직을 비신경 상피 조직이 둘러싼 세포괴가 형성되어 있는 것이 나타났다.
상기 배양 28 일째의 세포괴를 실시예 1 과 동일한 방법으로 고정하고, 동결 절편을 만들었다. 이러한 동결 절편에 관하여, 뇌하수체의 초기 마커인 항-Lhx3 항체, 구강 상피 또는 뇌하수체 플라코드 마커인 항-Pitx2 항체 (R&D Systems 사제, 양), 비신경 상피 또는 플라코드 마커인 항-Six1 항체 (Atlas Antibodies 사제, 토끼), 복측 간뇌 마커인 항-Nkx2.1 항체, 미분화 신경 및 플라코드 마커인 Sox2 항체, 종뇌 및 플라코드 마커인 Bf1 항체 (Takara Bio Inc. 사제, 토끼), 비신경 상피 조직 마커인 항-CD326/EpCAM 항체 (R&D Systems 사제, 염소), 항-범-사이토케라틴 항체, 항-E-카드헤린 항체 (Santa Cruz Biotechnology 사제, 마우스), 미분화 신경 및 신경 능선 또는 간엽계 세포 마커인 항-네스틴 항체, 신경 세포 마커인 항-βIII 튜불린 (Tuj1) 항체, 및 간엽계 세포 마커인 항-비멘틴 항체 (R&D Systems 사제, 염소) 를 사용하여 형광 면역 염색을 실시했다. 형광 표지 이차 항체로서 실시예 1 에서 사용한 것 이외에 Alexa647-표지 당나귀 항-염소 항체 (Thermo Fisher Scientific 사제) 를 이용하여 다중 염색을 수행했다. 핵의 대비 염색에는 Hoechst33342 을 사용하였다. 도 10F 는 도 10C, D, E, 도 10J 는 도 10G, H, I, 도 10N 은 도 10K, L, M, 도 10R 은 도 10O, P, Q 에 대한 핵의 대비 염색상이다. 염색한 절편의 관찰 및 이미지 수집에는 정립 형광 현미경 Axio Imager M2 (Carl Zeiss 사제) 및 부속 소프트웨어 Axio Vision 을 사용하였다. 도 10C 오른쪽 아래의 스케일 바는 200 ㎛, 도 10O 오른쪽 아래의 스케일 바는 100 ㎛ 를 나타낸다.
그 결과, 인간 iPS 세포주 201B7 로부터 상기 분화 유도 방법으로 유도된 부유 배양 개시후 28 일째의 세포괴의 내부에는 Nkx2.1, Sox2, Bf1, βIII 튜불린 양성의 복측 간뇌 또는 시상하부의 신경 상피 조직이 존재하고, 외부에는 EpCAM, 범-사이토케라틴, E-카드헤린, Pitx2 양성 구강 비신경 상피 조직이 존재하는 것으로 나타났다. 또한 비신경 상피 조직의 일부는 Lhx3, Bf1, Sox2 양성이며, 비신경 상피 조직이 함입하여 형성되는 라트케낭양의 구조와 뇌하수체 플라코드가 형성되어 있는 것으로 나타났다. 또한, 외측의 비신경 상피 조직과 내측의 신경 상피 조직 사이에 네스틴, 비멘틴 양성, 범-사이토케라틴, 라미닌 약양성, βIII 튜불린-음성 두부 간엽계 세포가 존재하고 있었다. 위의 결과로부터, 인간 ES 세포와 마찬가지로 인간 iPS 세포로부터 본 발명의 제조 방법에 의해, 비신경 상피, 신경 상피 및 간엽계 세포를 포함하고, 외부가 비신경 상피로 덮히고 내부에 뇌실양의 구조를 갖는 복측 간뇌 또는 시상하부양의 신경 상피 조직이 형성되고, 비신경 상피 및 신경 상피 사이에 두부 간엽계 세포가 존재하고, 외부의 비신경 상피의 일부가 뇌하수체 플라코드인 세포괴가 제조 가능하다는 것이 밝혀졌다.
실시예 10: Wnt 신호 전달 경로 활성화 물질 및 저해 물질을 병용하여 인간 iPS 세포로부터 제작된 신경 조직 및 비신경 상피 조직을 포함하는 세포괴
인간 iPS 세포 (HC-6#10 주, RIKEN 로부터 입수) 를 Scientific Reports, 4, 3594 (2014) 에 기재된 방법에 준하여 피더-프리 조건 하에 배양하였다. 피더-프리 배지로는 StemFit 배지를 사용했고, 피더-프리 스카폴드로는 라미닌 511-E8 을 사용하였다.
구체적인 유지 배양 조작으로는 실시예 1 과 동일하게 실시했다.
이렇게 하여 조제한 서브컨플루언트 인간 iPS 세포를 PBS 로 세척 후, Accumax 을 이용하여 효소 처리를 실시한 후, 분화 유도용 무혈청 배지를 첨가하고, 셀 스크레이퍼를 이용하여 배양 디쉬 표면에서 세포를 떼어내고, 피펫팅하여 단일 세포로 분산했다. 그 후, 상기 단일 세포로 분산된 인간 ES 세포를 세포 비접착성 96 웰 배양 플레이트 (PrimeSurface 96V-바닥 플레이트, SUMITOMO BAKELITE 사제) 의 1 웰 당 9 × 103 세포가 되도록 100 ㎕ 의 무혈청 배지에 부유시키고, 37℃, 5% CO2 조건 하에 부유 배양하였다. 그 때의 무혈청 배지 (gfCDM + KSR) 로서, F-12+Glutamax 배지 (Thermo Fisher Scientific 사제) 와 IMDM+Glutamax 배지 (Thermo Fisher Scientific 사제) 의 1:1 혼합액에 5% Knockout 혈청 대체물 (Thermo Fisher Scientific 사제), 450 μM 1-모노티오글리세롤 (Wako Pure Chemical Industries, Ltd. 사제), 1× 화학적으로 결정된 지질 농축물 (Thermo Fisher Scientific 사제), 50 unit/㎖ 페니실린-50 ㎍/㎖ 스트렙토마이신 (Nacalai Tesque 사제) 을 첨가한 무혈청 배지를 사용하였다. 부유 배양 개시시 (부유 배양 개시후 0 일째, 공정 1 의 개시) 에, 상기 무혈청 배지에 Y27632 (최종 농도 20 μM), SB-431542 (TGFβ 신호 전달 경로 저해 물질, Wako Pure Chemical Industries, Ltd. 사제, 1 μM), 및 IWP-2 (Wnt 신호 전달 경로 저해 물질, Tocris Bioscience 사제, 2 μM) 을 첨가하였다. 또한, Wnt 신호 전달 경로 활성화 물질로서 CHIR99021 (Cayman Chemical 사제) 을 300 nM, 1 μM, 3 μM 첨가한 조건 및 무첨가 컨트롤로 DMSO 만을 첨가한 조건 등 총 4 조건을 설정했다. 또한, 본 실시예에서, CHIR99021 을 CHIR 라고 칭하는 경우도 있다.
부유 배양 개시후 2 일째에, Y27632 을 포함하지 않고, SB-431542, IWP-2, BMP4 (BMP 신호 전달 경로 활성화 물질) 및 각 설정 조건 하에 CHIR99021 을 포함하는 무혈청 배지를 1 웰 당 100 ㎕ 첨가하였다. BMP4 는 첨가하는 배지에 3 nM 첨가하여 웰의 최종 농도를 1.5 nM 가 되게 했다. 비신경 상피 및 플라코드를 포함하는 세포괴를 유도하기 위한 방법으로서, 부유 배양 개시후 3 일째에 Y27632 와 BMP4 를 포함하지 않고, IWP-2, SB-431542, K02288 (BMP 신호 전달 경로 저해 물질, AdooQ Bioscience 사제), FGF2-TS (FGF 신호 전달 경로 활성화 물질, HumanZyme 사제) 및 헤파린 소듐 (Heparin Sodium) (FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation 사제) 을 포함하는 무혈청 배지를 이용하여 반량 배지를 교환했다. K02288, FGF2 와 헤파린 소듐은 첨가하는 배지에 각각 2 μM, 40 ng/㎖, 20 ㎍/㎖ 첨가하여 웰의 최종 농도가 1 μM, 20 ng/㎖, 10 ㎍/㎖ 가 되도록 했다. 부유 배양 개시후 6 일째, 10 일째에 반량 배지를 교환했다.
부유 배양 개시후 13 일째에, 도립 현미경을 사용하여 명시야 관찰을 실시했다 (도 11A - D). 도 11A 오른쪽 아래의 스케일 바는 1000 ㎛ 를 나타낸다. 그 결과, 실시예 1 에서 인간 ES 세포주 KhES-1 로부터 제작했을 때와 마찬가지로, 인간 iPS 세포주 HC-6#10 주로부터 중심부의 신경 조직을 비신경 상피 조직이 둘러싼 세포괴가 형성되는 것으로 나타났다. 또한 부유 배양 개시후 3 일째에 BMP 신호 전달 경로 저해 물질과 FGF 신호 전달 경로 활성화 물질을 첨가해도 비신경 상피 조직이 표면에 형성되는 것으로 나타났다. 또한 Wnt 신호 전달 경로 저해 물질인 IWP-2 의 존재 하에서도, Wnt 신호 전달 경로 활성화 물질인 CHIR99021 이 작용하고, 농도 의존적으로 세포괴가 커질 것이며, 한편 3 μM CHIR99021 첨가 조건 하에서 세포괴의 표면에서 비신경 상피 조직의 형성이 억제되는 것으로 나타났다.
상기 배양 13 일째의 세포괴를 실시예 1 과 동일한 방법으로 고정하고 동결 절편을 만들었다. 이러한 동결 절편에 관하여 비신경 상피 또는 플라코드 마커인 항-Six1 항체, 중추 신경계 플라코드 마커인 항-Dlx5 항체 (Atlas Antibodies 사제, 토끼), 항-E-카드헤린 항체 (R&D Systems 사제, 염소), 및 항-N-카드헤린 항체 (BD Biosciences 사제, 마우스) 를 이용하여 면역 형광 염색을 실시하였다 (도 11E - P, 도 12Q - AB). 염색한 절편의 관찰 및 이미지 수집에는 정립 형광 현미경 Axio Imager M2 (Carl Zeiss 사제) 및 부속 소프트웨어 Axio Vision 을 사용하였다. 도 11E, H, K, N, 도 12Q, T, W, Z 오른쪽 아래의 스케일 바는 100 ㎛ 를 나타낸다.
그 결과, 인간 iPS 세포주 HC-6#10 로부터 상기 분화 유도 방법으로 유도된 부유 배양 개시후 13 일째의 세포괴는 CHIR 무첨가 조건 및 300 nM, 1 μM 의 CHIR 을 첨가한 조건 하에 Dlx5, Six1, E-카드헤린, N-카드헤린 양성 비신경 상피 또는 플라코드 전구 조직의 형성을 보였다 (도 11E - P, 도 12Q - V). 3 μM 의 CHIR 을 첨가한 조건 하에서는 비신경 상피의 형성이 관찰되지 않아서, 다른 조직으로의 분화가 발생하는 것이 시사되었다 (도 12W - AB). 또한 CHIR 무첨가 조건 및 300 nM, 1 μM 의 CHIR 을 첨가한 조건을 비교한 결과, CHIR 무첨가 조건보다 300 nM CHIR 을 첨가한 조건 하에서 더 큰 세포괴가 형성되고, 내부의 신경 조직의 생존 및 상피 형성이 촉진되어 있었다. 한편, 1 μM 의 CHIR 을 첨가한 조건 하에서는 외부의 비신경 상피의 비후화 및 플라코드의 형성이 억제되어 있었다. 위의 결과로부터, Wnt 신호 전달 경로 저해 물질인 IWP-2 존재 하에서 일정한 정도 (3 μM CHIR99021 이하 정도) 의 β-카테닌의존적인 고전적 Wnt 경로의 활성화는 세포괴 전체의 성장, 내부의 신경 조직의 생존 및 상피 형성의 촉진에 효과적인 것으로 밝혀졌다.
실시예 11: Wnt 신호 전달 경로 활성화 물질 및 저해 물질을 병용하여 인간 iPS 세포로부터 제작된 신경 조직 및 뇌하수체 조직을 포함하는 세포괴
인간 iPS 세포 (HC-6#10 주, RIKEN 로부터 입수) 를 Scientific Reports, 4, 3594 (2014) 에 기재된 방법에 준하여 피더-프리 조건 하에 배양하였다. 피더-프리 배지로는 StemFit 배지를 사용했고, 피더-프리 스카폴드로는 라미닌 511-E8 을 사용하였다.
구체적인 유지 배양 조작으로는 실시예 1 과 동일하게 실시했다.
이렇게 하여 조제한 서브컨플루언트 인간 iPS 세포를 PBS 로 세척 후, Accumax 을 이용하여 효소 처리를 실시한 후, 분화 유도용 무혈청 배지를 첨가하고, 셀 스크레이퍼를 이용하여 배양 디쉬의 표면에서 세포를 떼어내고, 피펫팅하여 단일 세포로 분산했다. 그 후, 상기 단일 세포로 분산된 인간 ES 세포를 세포 비접착성 96 웰 배양 플레이트 (PrimeSurface 96V-바닥 플레이트, SUMITOMO BAKELITE 사제) 의 1 웰 당 9 × 103 세포가 되도록 100 ㎕ 의 무혈청 배지에 부유시키고, 37℃, 5% CO2 조건 하에 부유 배양하였다. 그 때의 무혈청 배지 (gfCDM + KSR) 로서, F-12+Glutamax 배지 (Thermo Fisher Scientific 사제) 와 IMDM+Glutamax 배지 (Thermo Fisher Scientific 사제) 의 1:1 혼합액에 5% Knockout 혈청 대체물 (Thermo Fisher Scientific 사제), 450 μM 1-모노티오글리세롤 (Wako Pure Chemical Industries, Ltd. 사제), 1× 화학적으로 결정된 지질 농축물 (Thermo Fisher Scientific 사제), 50 unit/㎖ 페니실린-50 ㎍/㎖ 스트렙토마이신 (Nacalai Tesque 사제) 을 첨가한 무혈청 배지를 사용하였다. 부유 배양 개시시 (부유 배양 개시후 0 일째, 공정 1 의 개시) 에, 상기 무혈청 배지에 Y27632 (최종 농도 20 μM), SB-431542 (TGFβ 신호 전달 경로 저해 물질, Wako Pure Chemical Industries, Ltd. 사제, 1 μM), 및 IWP-2 (Wnt 신호 전달 경로 저해 물질, Tocris Bioscience 사제, 2 μM) 을 첨가하였다. 또한, Wnt 신호 전달 경로 활성화 물질로서 CHIR99021 (Cayman Chemical 사제) 을 300 nM 첨가하였다.
부유 배양 개시후 2 일째에, Y27632 을 포함하지 않고, SB-431542, IWP-2, CHIR99021, BMP4 (BMP 신호 전달 경로 활성화 물질) 및 SAG (Shh 신호 전달 경로 활성화 물질) 을 포함하는 무혈청 배지를 1 웰 당 100 ㎕ 첨가하였다. BMP4 는 첨가하는 배지에 3 nM 첨가하여 웰의 최종 농도를 1.5 nM 가 되도록 했다. SAG 는 첨가하는 배지에 1.4 μM 첨가하여 웰의 최종 농도를 700 nM 가 되도록 했다.
부유 배양 개시후 6, 10, 13 일째에 Y27632, BMP4 를 포함하고, SAG, SB-431542, IWP-2 및 CHIR99021 을 같은 농도로 포함하는 무혈청 배지로 반량 배지를 교환했다. 부유 배양 개시후 17, 21, 24 일째에 SAG, SB-431542, IWP-2, CHIR99021 이외에 형성된 플라코드 전구 조직을 더욱 성장시킬 목적으로 FGF2-TS (FGF 신호 전달 경로 활성화 물질, HumanZyme 사제, 20 ng/㎖), 헤파린 소듐 (FGF 안정화제, Fujifilm Corporation Wako Pure Chemical Industries, Ltd. 사제, 10 ㎍/㎖) 을 포함하는 무혈청 배지로 반량 배지를 교환했다.
부유 배양 개시후 28 일째에, 도립 현미경을 사용하여 명시야 관찰을 실시했다 (도 13A). 도 11A 오른쪽 아래의 스케일 바는 1000 ㎛ 를 나타낸다. 그 결과, 실시예 1 에서 인간 ES 세포주 KhES-1 로부터 제작했을 때와 마찬가지로, SAG 를 첨가한 조건 하에 인간 iPS 세포주 HC-6#10 주로부터 중심부의 신경 조직을 비신경 상피 조직이 둘러싼 세포괴가 형성되어 있는 것으로 나타났다.
상기 배양 28 일째의 세포괴를 실시예 1 과 동일한 방법으로 고정하고 동결 절편을 만들었다. 이러한 동결 절편에 관하여 Lhx3, Nkx2.1, E-카드헤린, 네스틴, Pitx2, Sox2, Six1, 비멘틴, Rx, N-카드헤린, Tbx3, 및 범-사이토케라틴에 대한 항체를 사용하여 실시예 1 과 동일한 방법으로 면역 형광 염색을 실시하였다 (도 13B - I, 도 14J - V). 도 13E, I, 도 14M, P, S, V 는 동행의 면역 염색상에 대한 세포 핵의 대비 염색상이다.
그 결과, 인간 iPS 세포주 HC-6#10 주로부터 상기 Wnt 신호 전달 경로 활성화 물질과 FGF 신호 전달 경로 활성화 물질을 첨가한 분화 유도 방법으로 유도된 부유 배양 개시후 28 일째의 세포괴의 내부에는 Nkx2.1, Sox2, Tbx3, Rx, N-카드헤린 양성 복측 간뇌 또는 시상하부의 신경 상피 조직이 존재하고, 외부에는 범-사이토케라틴, E-카드헤린, Pitx2 양성 구강 비신경 상피 조직이 존재하는 것으로 나타났다. 또한 비신경 상피 조직의 일부는 Lhx3, Six1, Sox2 양성이며, 비신경 상피 조직이 함입하여 형성되는 라트케낭양의 구조와 뇌하수체 플라코드가 형성되어 있는 것으로 나타났다. 또한, 외측의 비신경 상피 조직과 내측의 신경 상피 조직 사이에 네스틴, 비멘틴 양성, 범-사이토케라틴 약양성의 두부 간엽계 세포가 존재하고 있었다. 위의 결과로부터, 인간 iPS 세포로부터 Wnt 신호 전달 경로 활성화 물질과 FGF 신호 전달 경로 활성화 물질을 첨가한 분화 유도 조건에 의해, 비신경 상피 및 신경 상피와 간엽계 세포를 포함하고, 외부가 비신경 상피로 덮히고, 내부에 뇌실양의 구조를 갖는 복측 간뇌 또는 시상하부양의 신경 상피 조직이 형성되고, 비신경 상피 및 신경 상피 사이에 두부 간엽계 세포가 존재하고, 외부의 비신경 상피의 일부가 뇌하수체 플라코드인 세포괴가 제조 가능하다는 것을 보여 주었다.
실시예 12: BMP 신호 전달 경로 활성화 물질을 첨가하여 일정 기간 후에 BMP 신호 전달 경로 저해 물질을 사용하여 인간 iPS 세포로부터 제작된 신경 조직 및 비신경 상피 조직을 포함하는 세포괴
인간 iPS 세포 (HC- 6 # 10 주, RIKEN 에서 입수) 를 Scientific Reports, 4, 3594 (2014) 에 기재된 방법에 준하여 피더-프리 조건 하에 배양하였다. 피더-프리 배지로는 StemFit 배지를 사용했고, 피더-프리 스카폴드로는 라미닌 511-E8 을 사용하였다.
구체적인 유지 배양 조작으로는 실시예 1 과 동일하게 실시했다.
이렇게 하여 조제한 서브컨플루언트 인간 iPS 세포를 PBS 로 세척 후, Accumax 을 이용하여 효소 처리를 실시한 후, 분화 유도용 무혈청 배지를 첨가하고, 셀 스크레이퍼를 이용하여 배양 디쉬 표면에서 세포를 떼어내고, 피펫팅하여 단일 세포로 분산했다. 그 후, 상기 단일 세포로 분산된 인간 ES 세포를 세포 비접착성 96 웰 배양 플레이트 (PrimeSurface 96V-바닥 플레이트, SUMITOMO BAKELITE 사제) 의 1 웰 당 9 × 103 세포가 되도록 100 ㎕ 의 무혈청 배지에 부유시키고, 37℃, 5% CO2 조건 하에 부유 배양하였다. 그 때의 무혈청 배지 (gfCDM + KSR) 로서, F-12+Glutamax 배지 (Thermo Fisher Scientific 사제) 와 IMDM+Glutamax 배지 (Thermo Fisher Scientific 사제) 의 1:1 혼합액에 5% Knockout 혈청 대체물 (Thermo Fisher Scientific 사제), 450 μM 1-모노티오글리세롤 (Wako Pure Chemical Industries, Ltd. 사제), 1× 화학적으로 결정된 지질 농축물 (Thermo Fisher Scientific 사제), 50 unit/㎖ 페니실린-50 ㎍/㎖ 스트렙토마이신 (Nacalai Tesque 사제) 을 첨가한 무혈청 배지를 사용하였다. 부유 배양 개시시 (부유 배양 개시후 0 일째, 공정 1 의 개시) 에, 상기 무혈청 배지에 Y27632 (최종 농도 20 μM), SB-431542 (TGFβ 신호 전달 경로 저해 물질, Wako Pure Chemical Industries, Ltd. 사제, 1 μM), IWP-2 (Wnt 신호 전달 경로 저해 물질, Tocris Bioscience 사제, 2 μM), 및 CHIR99021 (Wnt 신호 전달 경로 활성화 물질, Cayman Chemical 사제, 300 nM) 을 첨가하였다.
부유 배양 개시후 2 일째에, Y27632 을 포함하지 않고, SB-431542, IWP-2, CHIR99021, BMP4 (BMP 신호 전달 경로 활성화 물질) 및 SAG (Shh 신호 전달 경로 활성화 물질) 을 포함하는 무혈청 배지를 1 웰 당 100 ㎕ 첨가하였다. BMP4 는 첨가하는 배지에 3 nM 첨가하여 웰의 최종 농도를 1.5 nM 가 되도록 했다. SAG 는 첨가하는 배지에 1.4 μM 첨가하여 웰의 최종 농도를 700 nM 가 되도록 했다. 부유 배양 개시후 3, 6, 10, 13 일째에 Y27632, BMP4 를 포함하지 않고, SAG, SB-431542, IWP-2, CHIR99021 을 포함하는 무혈청 배지로 반량 배지를 교환했다. 또한 그 때 부유 배양 개시후 3, 6, 10 일째의 어느 시점에서 K02288 (BMP 신호 전달 경로 저해 물질, Adooq BioScience 사제, 300 nM) 을 반량 배지 교환시 첨가하는 조건 및 컨트롤로서 용매의 DMSO 를 첨가하는 조건을 포함하여 4 조건을 설정했다. K02288 는 첨가하는 배지에 600 nM 첨가하여 웰의 최종 농도를 300 nM 가 되도록 했다. 부유 배양 개시후 17, 21, 24 일째에 SAG, SB-431542, IWP-2, CHIR99021, K02288 이외에 형성된 플라코드 전구 조직을 더욱 성장시킬 목적으로 최종 농도가 20 ng/㎖ FGF2-TS, 10 ㎍/㎖ 헤파린 소듐이 되도록 무혈청 배지로 반량 배지를 교환했다. 부유 배양 개시후 28 일째에, 도립 현미경을 사용하여 명시야 관찰을 실시했다 (도 15A - D). 도 15A 오른쪽 아래의 스케일 바는 1000 ㎛ 를 나타낸다. 그 결과, K02288 무첨가 컨트롤 뿐만 아니라, 부유 배양 개시후 3, 6, 10 일째의 어느 시점에서 K02288 을 첨가한 조건 하에도 중심부의 신경 조직을 비신경 상피 조직이 둘러싼 세포괴가 형성되어 있는 것으로 나타났다.
또한 부유 배양 개시후 6 일째에 K02288 을 첨가하여 분화 유도한 상기 배양 28 일째의 세포괴를 실시예 1 과 유사한 방법으로 고정하여 동결 절편을 만들었다. 이러한 동결 절편에 관하여 Lhx3, Nkx2.1, E-카드헤린, 네스틴, Pitx2, Sox2, Six1, 비멘틴, Rx, N-카드헤린, Tbx3, 범-사이토케라틴에 대한 항체를 사용하여 실시예 1 과 유사한 방법으로 면역 형광 염색을 실시하였다 (도 15E - L, 도 16M - Y). 도 15H, L, 도 16P, S, V, Y 는 동행의 면역 염색상에 대한 세포 핵의 대비 염색상이다.
그 결과, 인간 iPS 세포주 HC-6#10 주로부터 상기 BMP 신호 전달 경로 활성화 물질을 첨가하여 일정 기간 후에 BMP 신호 전달 경로 저해 물질을 첨가하는 분화 유도 방법으로 유도된 부유 배양 개시후 28 일째의 세포괴의 내부에는 Nkx2.1, Sox2, Tbx3, Rx, N-카드헤린 양성 복측 간뇌 또는 시상하부의 신경 상피 조직이 존재하고, 외부에는 범-사이토케라틴, E-카드헤린, Pitx2 양성 구강 비신경 상피 조직이 존재하는 것으로 나타났다. 또한 비신경 상피 조직의 일부는 Lhx3, Six1, Sox2 양성이며, 비신경 상피 조직이 함입하여 형성되는 라트케낭양의 구조와 뇌하수체 플라코드가 형성되어 있는 것으로 나타났다. 또한, 외측의 비신경 상피 조직과 내측의 신경 상피 조직 사이에 네스틴, 비멘틴 양성, 범-사이토케라틴 약양성의 두부 간엽계 세포가 존재하고 있었다. 또한, BMP 신호 전달 경로 저해 물질을 첨가하여 세포괴의 표면에서의 뇌하수체 플라코드 마커 Lhx3 양성 세포의 비율이 매우 높은 세포괴를 얻을 수 있었다.
위의 결과로부터 BMP 신호 전달 경로 활성화 물질을 첨가하고 일정 기간 후에 BMP 신호 전달 경로 저해 물질을 첨가하는 분화 유도 조건에 의해 비신경 상피의 일부에 형성되는 뇌하수체 플라코드의 비율을 높일 수 있는 것으로 나타났다.
본 발명에 의하면, 다능성 줄기 세포로부터 복측 간뇌 등의 중추 신경계 조직, 두부 간엽계 세포와 뇌하수체 조직을 모두 포함하는 세포괴를 저비용으로 효율적으로 제조하는 것이 가능하다.
본 출원은 일본에서 출원된 특허 출원 2017-226312 (출원일: 2017 년 11 월 24 일) 을 기초로 하고 있으며, 그 내용은 본 명세서에 모두 포함된다.

Claims (16)

  1. 하기 공정 (1) 및 (2) 를 포함하는, 뇌하수체 조직을 포함하는 세포괴의 제조 방법;
    (1) 다능성 줄기 세포를 Wnt 신호 전달 경로 저해 물질의 존재 하에 부유 배양하여 세포 응집체를 형성시키는 제 1 공정,
    (2) 제 1 공정에서 얻어진 응집체를 BMP 신호 전달 경로 활성화 물질 및 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질의 존재 하에 부유 배양하여 뇌하수체 조직을 포함하는 세포괴를 얻는 제 2 공정.
  2. 하기 공정 (a), (1) 및 (2) 를 포함하는, 뇌하수체 조직을 포함하는 세포괴의 제조 방법;
    (a) 다능성 줄기 세포를 피더 세포의 비존재 하에 1) TGFβ 패밀리 신호 전달 경로 저해 물질 및/또는 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질, 및 2) 미분화 상태 유지 인자를 포함하는 배지에서 배양하는 공정 a,
    (1) 공정 a 에서 배양된 다능성 줄기 세포를 Wnt 신호 전달 경로 저해 물질의 존재 하에 부유 배양하여 세포 응집체를 형성시키는 제 1 공정,
    (2) 제 1 공정에서 얻어진 응집체를 BMP 신호 전달 경로 활성화 물질 및 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질의 존재 하에 부유 배양하여 뇌하수체 조직을 함유하는 세포괴를 얻는 제 2 공정.
  3. 하기 공정 (1), (2-1) 및 (2-2) 를 포함하는, 뇌하수체 조직을 포함하는 세포괴의 제조 방법;
    (1) 다능성 줄기 세포를 Wnt 신호 전달 경로 저해 물질의 존재 하에 부유 배양하여 세포 응집체를 형성시키는 제 1 공정,
    (2-1) 제 1 공정에서 얻어진 응집체를 BMP 신호 전달 경로 활성화 물질 및 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질의 존재 하에 부유 배양하는 제 2 공정 (1),
    (2-2) 제 2 공정 (1) 에서 부유 배양된 응집체를 BMP 신호 전달 경로 저해 물질의 존재 하에 부유 배양하여 뇌하수체 조직을 포함하는 세포괴를 얻는 제 2 공정 (2).
  4. 하기 공정 (a), (1), (2-1) 및 (2-2) 를 포함하는, 뇌하수체 조직을 포함하는 세포괴의 제조 방법;
    (a) 다능성 줄기 세포를 피더 세포의 비존재 하에 1) TGFβ 패밀리 신호 전달 경로 저해 물질 및/또는 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질, 및 2) 미분화 상태 유지 인자를 포함하는 배지에서 배양하는 공정 a,
    (1) 공정 a 에서 배양된 다능성 줄기 세포를 Wnt 신호 전달 경로 저해 물질의 존재 하에 부유 배양하여 세포 응집체를 형성시키는 제 1 공정,
    (2-1) 제 1 공정에서 얻어진 응집체를 BMP 신호 전달 경로 활성화 물질 및 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질의 존재 하에 부유 배양하는 제 2 공정 (1),
    (2-2) 제 2 공정 (1) 에서 부유 배양된 응집체를 BMP 신호 전달 경로 저해 물질의 존재 하에 부유 배양하여 뇌하수체 조직을 포함하는 세포괴를 얻는 제 2 공정 (2).
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, Wnt 신호 전달 경로 저해 물질이 PORCN 저해제인 것을 특징으로 하는 제조 방법.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 공정 (1), (2), (2-1) 및 (2-2) 에서의 부유 배양이 TGFβ 신호 전달 경로 저해 물질의 추가의 존재 하에 수행되는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 공정 (1), (2), (2-1) 및 (2-2) 로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 공정이 FGF 신호 전달 경로 활성화 물질의 존재 하에 수행되는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
  8. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, 공정 (1), (2), (2-1) 및 (2-2) 로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 공정이 Wnt 신호 전달 경로 활성화 물질의 존재 하에 수행되는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
  9. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 공정 (1), (2), (2-1) 및 (2-2) 로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 공정에서의 부유 배양이 Notch 신호 저해제의 추가의 존재 하에 수행되는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
  10. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서, 공정 (1), (2), (2-1) 및 (2-2) 로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 공정에서의 부유 배양이 덱사메타손의 추가의 존재 하에 수행되는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
  11. 하기 공정 (1) - (3) 을 포함하는, 뇌하수체 조직의 제조 방법;
    (1) 다능성 줄기 세포를 Wnt 신호 전달 경로 저해 물질의 존재 하에 부유 배양하여 세포 응집체를 형성시키는 제 1 공정,
    (2) 제 1 공정에서 얻어진 응집체를 BMP 신호 전달 경로 활성화 물질 및 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질의 존재 하에 부유 배양하여 뇌하수체 조직을 포함하는 세포괴를 얻는 제 2 공정,
    (3) 제 2 공정에서 얻어진 세포괴로부터 뇌하수체 조직을 회수하는 제 3 공정.
  12. 하기 공정 (1), (2-1), (2-2) 및 (3) 을 포함하는, 뇌하수체 조직의 제조 방법;
    (1) 다능성 줄기 세포를 Wnt 신호 전달 경로 저해 물질의 존재 하에 부유 배양하여 세포 응집체를 형성시키는 제 1 공정,
    (2-1) 제 1 공정에서 얻어진 응집체를 BMP 신호 전달 경로 활성화 물질 및 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질의 존재 하에 부유 배양하는 제 2 공정 (1),
    (2-2) 제 2 공정 (1) 에서 부유 배양된 응집체를 BMP 신호 전달 경로 저해 물질의 존재 하에 부유 배양하여 뇌하수체 조직을 포함하는 세포괴를 얻는 제 2 공정 (2),
    (3) 제 2 공정 (2) 에서 얻어진 세포괴로부터 뇌하수체 조직을 회수하는 제 3 공정.
  13. 제 11 항 또는 제 12 항에 따른 제조 방법에 의해 얻어진 뇌하수체 조직.
  14. 1) 신경계 세포 또는 신경 조직, 2) 뇌하수체 조직 및 3) 간엽계 세포를 포함하는 세포괴.
  15. 1) 신경계 세포 또는 신경 조직, 2) 뇌하수체 조직 및 4) 신경 능선 세포 및 신경 능선 유래 세포를 포함하는 세포괴.
  16. 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 제조된 세포괴 또는 제 11 항 또는 제 12 항에 따른 방법에 의해 제조된 뇌하수체 조직을 포함하는, 뇌하수체의 장애로 인한 질환의 치료약.
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