KR20200074954A - 형질전환된 인간세포 및 이의 용도 - Google Patents

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KR20200074954A
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김문경
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이지원
양우석
김유영
권영은
최승현
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재단법인 목암생명과학연구소
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Abstract

본 발명은 형질전환된 인간세포 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 구체적으로 가이드 RNA를 이용한 유전자 발현 억제용 시스템을 이용한 MHC I 세포막 수용체 및 MHC II 세포막 수용체를 코딩하는 유전자가 변형된 세포 및 이의 용도에 관한 것이다. 상기와 같은 형질전환 세포는 생체 내에서도 세포의 치료 효능을 효과적으로 발휘할 수 있으며, 생체 내 면역반응에 의해 제거되지 않는다. 따라서, 상기 면역세포를 유효성분으로 포함하는 조성물은 암, 감염성 질환, 퇴행성 질환 또는 면역 질환 치료에 유용하게 활용될 수 있을 것으로 기대된다.

Description

형질전환된 인간세포 및 이의 용도
본 발명은 형질전환된 인간세포 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 가이드 RNA를 통해 형질전환된 인간세포 및 이의 용도에 관한 것이다.
암 또는 감염성 질환의 치료를 위한 방법으로서 환자의 면역기능을 이용한 면역치료법이 관심을 받고 있다. 면역치료법이란 NK 세포, T 세포, 수지상세포 등과 같은 면역세포들의 상호작용을 통해 질환을 치료하는 치료법을 의미한다. 이중, 항원에 특정한 키메릭 항원 수용체를 발현하는 유전자 변형 T 세포를 이용한 면역치료법이 대두되고 있다. 또한, 체외에서 NK 세포의 활성화를 통해 높은 세포독성을 갖는 NK 세포는 백혈병과 같은 혈액암에 대해 우수한 치료 효과를 갖는다고 보고되었다(Blood Cells Molecules & Disease, 33: p261-266, 2004).
한편, 상기와 같은 면역세포의 암 또는 감염성 질환에 대한 치료제로서의 가능성에도 불구하고, 환자의 생체 내에 존재하는 면역세포는 건강한 개체의 면역세포에 비해 그 기능 및 개수가 현저히 떨어진다. 따라서, 자가 면역세포를 이용하는 것보다 동종이계(allogenic) 면역세포의 이식을 활용하는 것이 보다 효과적이다. 그러나, 동종이계 면역세포를 이식할 경우, 이식거부 반응이 일어나거나 생체 내에서 비자기(non-self) 인식을 통한 면역학적 제거 반응이 일어나는 등 여러 문제점을 야기할 수 있다. 이에 따라, 이러한 단점을 극복하기 위해 동종이계 면역세포를 자기(self)로 인식할 수 있도록 세포주화하는 대안이 필요하다.
이와 같은 문제점을 해결하기 위해, 본 발명자들은 세포의 MHC I 세포막 수용체 및 MHC II 세포막 수용체를 코딩하는 유전자를 표적으로 하는 가이드 RNA를 합성하였다. 또한, 상기 가이드 RNA 및 RNA-유도 엔도뉴클레아제를 유효성분으로 포함하는 유전자 발현 억제용 조성물을 이용하여 MHC I 세포막 수용체 및 MHC II 세포막 수용체의 발현이 억제된 세포를 제조하였고, 상기 세포에 대한 생체 내 면역학적 제거 반응을 방지할 수 있도록 HLA-E를 도입시킬 수 있다.
따라서, 본 발명은 MHC I 세포막 수용체 및 MHC II 세포막 수용체를 코딩하는 유전자를 표적으로 하는 가이드 RNA를 제공하고, 상기 가이드 RNA를 이용하여 형질전환된 세포를 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 β2-마이크로글로불린(B2M)을 코딩하는 핵산 서열에 상보적으로 결합하는 가이드 RNA로서, 상기 가이드 RNA는 서열번호 1, 서열번호 6, 서열번호 17 및 서열번호 26으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 핵산 서열을 포함하는 것인 가이드 RNA를 제공하고; HLA-DQ를 코딩하는 핵산 서열에 상보적으로 결합하는 가이드 RNA로서, 상기 가이드 RNA는 서열번호 64, 서열번호 65, 서열번호 87 및 서열번호 90으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 핵산 서열을 포함하는 것인 가이드 RNA를 제공하고; HLA-DP를 코딩하는 핵산 서열에 상보적으로 결합하는 가이드 RNA로서, 상기 가이드 RNA는 서열번호 123 또는 서열번호 129의 핵산 서열을 포함하는 것인 가이드 RNA를 제공하며; HLA-DR을 코딩하는 핵산 서열에 상보적으로 결합하는 가이드 RNA로서, 상기 가이드 RNA는 서열번호 186, 서열번호 188 및 서열번호 225로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 핵산 서열을 포함하는 것인 가이드 RNA를 제공한다.
또한, 본 발명은 가이드 RNA 또는 가이드 RNA 인코딩 뉴클레오타이드 및 RNA-유도 엔도뉴클레아제 또는 RNA-유도 엔도뉴클레아제 인코딩 뉴클레오타이드를 유효성분으로 포함하는 유전자 발현 억제용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 MHC I 세포막 수용체 및 MHC II 세포막 수용체의 발현이 억제된 형질전환된 세포를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 형질전환된 세포를 유효성분으로 포함하는 암, 감염성 질환, 퇴행성 질환, 유전성 질환 또는 면역 질환 치료용 약학 조성물 및 상기 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암, 감염성 질환, 퇴행성 질환, 유전성 질환 또는 면역 질환을 치료하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 MHC I 세포막 수용체 및 MHC II 세포막 수용체의 발현이 억제되고, 변형된 MHC I 세포막 수용체에 결합된 펩타이드 항원, 예를 들어 G-펩타이드를 세포막 표면에 발현하는 것인 형질전환된 세포의 암, 감염성 질환, 퇴행성 질환, 유전성 질환 또는 면역 질환 치료 용도를 제공한다.
본 발명에 따른 가이드 RNA를 이용한 유전자 발현 억제용 시스템을 이용한 MHC I 세포막 수용체 및 MHC II 세포막 수용체를 코딩하는 유전자가 변형된 세포를 제조할 수 있다. 또한, 상기 세포에 추가적으로 펩타이드 항원, 예를 들어 G-펩타이드가 결합된 HLA-E를 도입시킬 수 있다. 상기와 같은 형질전환된 세포는 생체 내에서도 세포의 치료 효능을 효과적으로 발휘할 수 있으며, 생체 내 면역반응에 의해 제거되지 않는다. 따라서, 상기 세포를 유효성분으로 포함하는 조성물은 암, 감염성 질환, 퇴행성 질환, 유전성 질환 또는 면역 질환 치료에 유용하게 활용될 수 있을 것으로 기대된다.
도 1은 B2M 표적 gRNA를 이용해 제조한 세포에서 HLA-ABC 음성 세포를 유세포 분석기로 분석한 결과이다.
도 2는 HLA-DRA 표적 gRNA를 이용해 제조한 세포에서 HLA-DR 음성 세포를 유세포 분석기로 분석한 결과이다.
도 3은 HLA-DQA 표적 gRNA를 이용해 제조한 세포에서 HLA-DQ 음성 세포를 유세포 분석기로 분석한 결과이다.
도 4는 HLA-DPA 표적 gRNA를 이용해 제조한 세포에서 HLA-DP 음성 세포를 유세포 분석기로 분석한 결과이다.
도 5는 B2M 표적 gRNA에 따른 HLA-ABC 음성 세포주의 생성 비율을 나타낸 것이다.
도 6은 DRA 표적 gRNA에 따른 HLA-DR 음성 세포주의 생성 비율을 나타낸 것이다.
도 7은 DQA 표적 gRNA에 따른 HLA-DQ 음성 세포주의 생성 비율을 나타낸 것이다.
도 8은 DPA 표적 gRNA에 따른 HLA-DP 음성 세포주의 생성 비율을 나타낸 것이다.
도 9는 B2M 표적 gRNA로 제조한 세포주에서 B2M을 코딩하는 핵산의 변이를 확인한 것이다.
도 10은 HLA-DRA 표적 gRNA로 제조한 세포주에서 HLA-DRA를 코딩하는 핵산의 변이를 확인한 것이다.
도 11은 HLA-DQA 표적 gRNA로 제조한 세포주에서 HLA-DQA를 코딩하는 핵산의 변이를 확인한 것이다.
도 12는 HLA-DPA 표적 gRNA로 제조한 세포주에서 HLA-DPA를 코딩하는 핵산의 변이를 확인한 것이다.
도 13은 세포분리 후 HLA-I 양성 NK-92MI 세포주 및 HLA-I 음성 NK-92MI 세포주를 나타낸 것이다.
도 14는 HLA-I 양성 NK-92MI 세포주 및 HLA-I 음성 NK-92MI 세포주의 세포살해능을 평가한 결과를 나타낸 것이다.
도 15는 gRNA를 이용해 CD4 T 세포, CD8 T 세포 및 NK 세포를 형질전환시킨 후, 유세포 분석기로 분석한 결과이다.
도 16은 단일 gRNA로 형질전환시킨 세포와 복합 gRNA로 형질전환시킨 세포에서 표적에 대한 결실 효율을 나타낸 것이다.
도 17은 단일 gRNA로 형질전환시킨 세포, 복합 gRNA로 형질전환시킨 세포 및 대조군 세포의 세포 성장 속도를 비교한 것이다.
도 18은 HLA-I 양성 T 세포 및 HLA-I 음성 T 세포의 사이토카인 생성능을 비교한 결과이다.
도 19는 HLA-I 양성 NK 세포 및 HLA-I 음성 NK 세포의 사이토카인 생성능을 비교한 결과이다.
도 20은 HLA-I 양성 Raji 세포주 및 HLA-I 음성 Raji 세포주에 대한 NK 세포의 세포살해능을 평가한 결과이다.
도 21은 G-펩타이드가 적재된 HLA-E 모식도 및 이를 발현시키기 위한 단백질의 구조를 나타낸 것이다.
도 22는 형질도입을 통해 K562 세포주에 발현된 HLA-E를 분석한 결과이다.
도 23은 HLA-E를 발현시킨 K562 세포주(K562 G-B2M-HLA-E) 및 대조군 K562 세포주(K562)에 대한 NK 세포의 세포살해능을 평가한 결과이다.
발명의 실시를 위한 최선의 형태
본 발명의 일 측면은 β2-마이크로글로불린(B2M)을 코딩하는 핵산 서열에 상보적으로 결합하는 가이드 RNA로서, 상기 가이드 RNA는 서열번호 1, 서열번호 6, 서열번호 17 및 서열번호 26으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 핵산 서열을 포함하는 것인 가이드 RNA를 제공한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "B2M"이란, MHC I의 구성성분인 β2-마이크로글로불린 단백질을 의미한다. 상기 B2M은 MHC I 세포막 수용체가 세포 표면에 발현하는데 필수적이며, B2M이 제거되거나 변형된 경우에는 세포 표면 상에 MHC I 세포막 수용체가 발현되기 어렵다. 따라서, 상기 B2M 유전자를 변형시킴으로써 MHC I 세포막 수용체의 기능을 제거할 수 있다.
상기 B2M을 코딩하는 핵산 서열에 상보적으로 결합하는 가이드 RNA는 서열번호 1 내지 58로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있으며, 구체적으로는 서열번호 1, 서열번호 6, 서열번호 17 및 서열번호 26으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.
또한, 본 발명의 일 측면은 HLA-DQ를 코딩하는 핵산 서열에 상보적으로 결합하는 가이드 RNA로서, 상기 가이드 RNA는 서열번호 64, 서열번호 65, 서열번호 87 및 서열번호 90으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 핵산 서열을 포함하는 것인 가이드 RNA를 제공한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "HLA"란, MHC 유전자의 산물인 인간백혈구항원을 의미한다. 상기 HLA는 HLA I 및 HLA II로 구성되며, 상기 HLA I은 HLA-A, HLA-B, HLA-C를 포함하고, 상기 HLA II는 HLA-DQ, HLA-DP 및 HLA-DR을 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "HLA-DQ"란, MHC II를 구성하는 αβ 헤테로다이머를 지칭한다. 상기 DQ는 HLA-DQA1 및 HLA-DQB1로 구성되고, 상기 α 서브유닛은 HLA-DQA1 유전자에 의해 코딩되며, 상기 β 서브유닛은 HLA-DQB1 유전자에 의해 코딩된다. 상기 DQ 유전자를 변형시킴으로써 MHC II 세포막 수용체의 발현을 저해시킬 수 있다.
상기 DQ를 코딩하는 핵산 서열에 상보적으로 결합하는 가이드 RNA는 서열번호 59 내지 116으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있으며, 구체적으로는 서열번호 64, 서열번호 65, 서열번호 87 및 서열번호 90으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.
본 발명의 다른 측면은 HLA-DP를 코딩하는 핵산 서열에 상보적으로 결합하는 가이드 RNA로서, 상기 가이드 RNA는 서열번호 123 또는 서열번호 129의 핵산 서열을 포함하는 것인 가이드 RNA를 제공한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "HLA-DP"란, 코딩되는 MHC II 세포 표면 수용체로서, DPα 서브유닛 및 DPβ 서브유닛으로 구성된다. 상기 DPα는 HLA-DPA1에 의해 코딩되며, 상기 DPβ는 HLA-DPB1에 의해 코딩된다. 상기 DP 유전자를 변형시킴으로써 MHC II 세포막 수용체의 발현을 저해시킬 수 있다.
상기 DP를 코딩하는 핵산 서열에 상보적으로 결합하는 가이드 RNA는 서열번호 117 내지 175로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있으며, 구체적으로는 서열번호 123 또는 서열번호 129일 수 있다.
또한, 본 발명의 다른 측면은 HLA-DR을 코딩하는 핵산 서열에 상보적으로 결합하는 가이드 RNA로서, 상기 가이드 RNA는 서열번호 186, 서열번호 188 및 서열번호 225로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 핵산 서열을 포함하는 것인 가이드 RNA를 제공한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "HLA-DR"이란, MHC II 세포 표면 수용체로서 이를 구성하는 αβ 헤테로다이머를 지칭한다. HLA-DR의 각각의 서브 유닛은 두 개의 세포외 도메인으로서 막-스패닝 도메인(membrane-spanning domain) 및 세포질내 미부(cytoplasmic tail)를 포함한다. 상기 DR 유전자를 변형시킴으로써 MHC II 세포막 수용체의 발현을 저해시킬 수 있다.
상기 DR을 코딩하는 핵산 서열에 상보적으로 결합하는 가이드 RNA는 서열번호 176 내지 234로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있으며, 바람직하게는 서열번호 186, 서열번호 188 및 서열번호 225로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "가이드 RNA(gRNA)"란 표적 DNA를 특이적으로 인식하여 뉴클레아제와 복합체를 형성함으로써 뉴클레아제를 표적 DNA로 유도(guiding)하는 RNA 분자를 의미한다.
상기 가이드 RNA는 원핵생물의 크리스퍼(CRISPR, clustered regularly interspaced short palindromic repeats) 시스템에서 유래한 가이드 RNA일 수 있다.
상기 가이드 RNA는 자연 발생적이지 않은 키메라 crRNA 서열을 포함할 수 있으며, 상기 crRNA는 표적 서열에 혼성화될 수 있는 가변 표적화 도메인을 포함할 수 있다.
또한, 상기 가이드 RNA는 B2M, HLA-DQ, HLA-DP 및 HLA-DR 유전자에 대한 상보적인 서열을 포함하고 있다. 이는 세포 내로 전달된 후 상기 표적 서열을 인식하고 RNA-유도 엔도뉴클레아제와 복합체를 형성할 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은 상기 가이드 RNA 또는 가이드 RNA 인코딩 뉴클레오타이드 및 RNA-유도 엔도뉴클레아제 또는 RNA-유도 엔도뉴클레아제 인코딩 뉴클레오타이드를 유효성분으로 포함하는 유전자 발현 억제용 조성물을 제공한다.
상기 RNA-유도 엔도뉴클레아제는 mRNA 형태 또는 단백질 형태로 전달될 수도 있고, 이를 코딩하는 DNA가 탑재된 벡터로 형질전환함으로써 목적 세포에 전달될 수도 있다. 단백질 형태의 엔도뉴클레아제가 이용될 경우, 가이드 RNA와 복합체를 이루는 RNP 복합체로서 기능할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "RNP 복합체"란, 상기 가이드 RNA 및 RNA-유도 엔도뉴클레아제를 유효성분으로 포함하는 것으로, 상기 복합체는 표적 서열을 인식하여 결합하고, 이를 선택적으로 니킹(nicking) 또는 절단할 수 있다. 상기 RNA 복합체는 예를 들어, Cas9-gRNA 복합체일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 RNA-유도 엔도뉴클레아제는 Cas1, Cas1B, Cas2, Cas3, Cas4, Cas5, Cas6, Cas7, Cas8, Cas9, Cas10, Cas12a, Cas12b, Cas12c, Cas12d, Cas12e, Cas 13a, Cas 13b, Cas 13c, Cas 13d, Cpf1, Csy1, Csy2, Csy3, Cse1, Cse2, Csc1, Csc2, Csa5, Csn2, Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Csm6, Cmr1, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, Csb1, Csb2, Csb3, Csx17, Csx14, Csx10, Csx16, CsaX, Csx3, Csx1, Csx15, Csf1, Csf2, Csf3 및 Csf4로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있으며, 구체적으로 Cas9일 수 있다.
본 발명의 일 측면은 MHC I 세포막 수용체 및 MHC II 세포막 수용체의 발현이 억제된 형질전환된 세포를 제공한다.
본 명세서에서 용어 "발현 억제"란 표적 유전자의 기능 저하를 야기하는 뉴클레오타이드 서열상의 변형을 의미하며, 바람직하게는 이에 의해 표적 유전자 발현이 탐지 불가능해지거나 무의미한 수준으로 존재하게 되는 것을 의미한다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 형질전환된 세포는 펩타이드 항원을 세포막 표면에 발현할 수 있다. 상기 펩타이드 항원은 예를 들어 HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-G의 시그널 펩타이드를 포함하나 이에 제한되는 것은 아니며, 구체적으로는 HLA-G의 시그널 펩타이드(G-펩타이드)이다. 상기 펩타이드 항원은 변형된 MHC I 세포막 수용체에 결합될 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 변형된 MHC I 세포막 수용체는 HLA-E와 B2M이 연결된 구조를 갖는 것이며, 구체적으로 상기 변형된 MHC I 세포막 수용체는 상기 HLA-E의 α1의 N 말단에 B2M의 C 말단이 제1 링커를 통해 연결되고, 상기 B2M의 N 말단에 상기 G-펩타이드의 C 말단이 제2 링커를 통해 연결될 수 있다. 상기 변형된 MHC I 세포막 수용체는 HLA-G와 B2M이 연결된 구조를 갖는 것일 수도 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 G-펩타이드는 서열번호 236의 서열을 가질 수 있고, 상기 HLA-E는 서열번호 240의 서열을 가질 수 있으며, 상기 B2M은 서열번호 237의 서열을 가질 수 있고, 상기 제1 링커는 (G4S)n(n은 1 내지 5의 정수)일 수 있으며, 일 실시예로 서열번호 238의 서열을 가질 수 있다. 상기 제2 링커는 (G4S)n(n은 2 내지 6의 정수)일 수 있으며, 서열번호 241의 서열을 가질 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 MHC I 세포막 수용체를 코딩하는 유전자의 변형은 상기 B2M을 코딩하는 핵산 서열에 상보적으로 결합하는 가이드 RNA(예를 들어, 서열번호 1, 서열번호 6, 서열번호 17 또는 서열번호 26)를 이용해 수행될 수 있다. 구체적으로, 상기 MHC I의 변형은 단일 가이드 RNA를 이용한 단일결실에 의해 수행될 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 MHC II 세포막 수용체를 코딩하는 DQ, DP 및 DR 유전자의 변형은 상기 DQ를 코딩하는 핵산 서열에 상보적으로 결합하는 가이드 RNA(예를 들어, 서열번호 64, 서열번호 65, 서열번호 87 또는 서열번호 90), 상기 DP를 코딩하는 핵산 서열에 상보적으로 결합하는 가이드 RNA(예를 들어, 서열번호 123 또는 서열번호 129) 및 상기 DR를 코딩하는 핵산 서열에 상보적으로 결합하는 가이드 RNA(예를 들어, 서열번호 186, 서열번호 188 또는 서열번호 225)를 이용해 수행될 수 있다. 상기 MHC II의 변형은 MHC I의 변형과 함께 수행되며, 이는 복합 가이드 RNA(예를 들어, 서열번호 1, 서열번호 64, 서열번호 129 및 서열번호 188을 모두 포함)를 이용한 복합결실에 의해 수행될 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 형질전환된 세포는 치료용 동종세포(allogeneic cell)일 수 있다. 본 명세서에서 사용된 용어 "치료용 동종세포"란, 질환의 진행 억제, 치료, 증상의 경감을 목적으로 대상체에 주입되는 비자가 동종세포를 의미하며, 예를 들어 면역세포 및 줄기세포를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서 사용된 용어 "면역세포"란, 인체의 면역반응에 관여하는 세포를 의미하며, NK 세포, T 세포, B 세포, 수지상세포, 대식세포를 포함한다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 면역세포는 NK 세포 또는 T 세포일 수 있다
본 명세서에서 사용된 용어 "줄기세포(stem cell)"란, 다양한 세포로 분화가 가능한 전분화능을 갖는 세포를 의미한다. 상기 줄기세포는 인간배아줄기세포, 골수줄기세포, 중간엽줄기세포, 인간신경줄기세포, 경구막점막세포 등을 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 줄기세포는 중간엽줄기세포일 수 있다.
또한, 본 발명의 일 측면은 상기 형질전환된 세포를 유효성분으로 포함하는 암, 감염성 질환, 퇴행성 질환, 유전성 질환 또는 면역 질환의 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 암은 만성 림프구성 백혈병(CLL), B 세포 급성 림프구성 백혈병(B-ALL), 급성 림프아구성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 림프종, 비호지킨 림프종(NHL), 다발성 골수종, 혈액암, 위암, 간암, 췌장암, 대장암, 폐암, 유방암, 난소암, 피부암, 흑색종, 육종, 전립선암, 식도암, 간세포 암종, 성상세포종, 중피종, 두경부암 및 수아세포종으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 감염성 질환은 B형 간염, C형 간염, 인간 파필로마 바이러스(HPV) 감염, 사이토메갈로바이러스(Cytomegalovirus) 감염, 엡스타인바 바이러스(EBV)감염, 바이러스성 호흡기 질환 및 인플루엔자로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "퇴행성 질환"이란, 조직의 비가역적인 양적 소실로 인하여 해당 조직이 원래의 기능을 상실하는 병적 상태를 의미한다. 상기 퇴행성 질환은 뇌신경질환, 허혈성 질환, 피부손상, 골질환, 퇴행성 관절염 등을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서 사용된 용어 "유전성 질환"이란, 유전자나 염색체에 해로운 변이로 인해 발생하는 병적 상태를 의미한다. 상기 유전성 질환은 예를 들어 혈우병, 백색증, 파브리병(fabry disease), 헌터증후군(Hunter syndrome), 글리코겐　축적　이상증(glycogen storage disorder)을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서 사용된 용어 "면역 질환"은 과도하거나(excessive), 원치않는(undesired) 면역반응을 원인으로 조직이 손상되는 모든 병적 상태를 의미한다. 따라서, 상기 용어 "면역 질환"은 "면역과다 질환"과 동일한 의미를 가지며, "면역 질환의 예방 또는 치료용 조성물"은 "면역 억제제"와 동일한 의미를 가진다.
상기 면역 질환은 이식편대 숙주질환, 이식편 거부반응, 만성 염증성 질환, 염증성 통증, 신경병성 통증, 만성 폐색성 호흡기 질환(chronic obstructive pulmonary disease, COPD) 및 자가면역 질환을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 용어 "자가면역 질환"은 면역 세포가 자신과 외부물질을 구별하지 못하고 자신을 공격하여 발생하는 병적 상태를 의미한다. 상기 자가면역 질환은 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis), 전신성홍반성낭창(systemic lupus erythematosis), 하시모토씨 갑상선염(Hashimoto's thyroiditis), 그레브스 병(Grave's disease), 다발성경화증(multiple sclerosis), 경피증(Scleroderma), 중증근무력증(myasthenia gravis), 제1형 당뇨(type I diabetes), 알레르기성 뇌척수염(allergic encephalomyelitis), 사구체신염(glomerulonephritis), 백반증(vitilligo), 베제트병(Becet's disease), 크론병(Crohn's disease), 강직성 척추염(ankylosing spondylitis), 혈소판 감소성 자반증(thrombocytopenic purpura), 심상성 천포창(pemphigus vulgaris), 자가면역성 용혈성 빈혈(autoimmune anemia), 부신백질이영양증(adrenoleukodystrophy, ALD) 및 전신성 홍반성 낭창(systemic lupus erythematosus, SLE)을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 측면은 상기 약학 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암, 감염성 질환, 퇴행성 질환, 유전성 질환 또는 면역 질환을 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 투여 경로는 정맥내, 근육내, 피내, 피하, 복강내, 소동맥내, 심실내, 병변내, 척추강내, 국소 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.
본 발명의 다른 측면은 MHC I 세포막 수용체 및 MHC II 세포막 수용체의 발현이 억제되고, 변형된 MHC I 세포막 수용체에 결합된 G-펩타이드를 세포막 표면에 발현하는 형질전환된 세포의 암, 감염성 질환, 퇴행성 질환, 유전성 질환 또는 면역 질환의 치료 용도를 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은 상기 가이드 RNA 또는 가이드 RNA 인코딩 뉴클레오타이드 및 RNA-유도 엔도뉴클레아제 또는 RNA-유도 엔도뉴클레아제 인코딩 뉴클레오타이드를 포함하는 MHC I 세포막 수용체 및 MHC II 세포막 수용체의 유전자 변형을 위한 키트를 제공한다.
발명의 실시를 위한 형태
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. HLA를 표적으로 하는 gRNA의 합성 및 선별
실시예 1.1. gRNA 서열 탐색 및 합성
gRNA 서열을 탐색하기 위해 NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)에서 제공하는 유전자의 완전 뉴클레오티드 서열(complete nucleotide sequence)을 사용하였다. gRNA 디자인 도구로 웹 기반 시스템인 CHOPCHOP(http://chopchop.cbu.uib.no/), E-CRISP(http://www.e-crisp.org/E-CRISP/designcrispr.html), CRISPR-ERA(http://crispr-era.stanford.edu/), RGEN tool(http://www.rgenome.net/cas-designer/)을 사용하였다. 디자인된 gRNA 중 유전자 녹-아웃에 가장 적합한 gRNA를 목적하는 표적 당 약 60종씩 도출하고, 이 서열을 바탕으로 GeneArt Precision gRNA Synthesis Kit(Thermo Fisher Scientific, A29377)를 이용해 제조업자의 지시에 따라 gRNA를 합성하였다.
즉, gRNA를 코딩하는 DNA 템플릿을 합성하기 위해 필요한 정방향 및 역방향의 올리고 뉴클레오티드 프라이머를 합성한 후, 합성한 프라이머와 GeneArt Precision gRNA Synthesis Kit(Thermo Fisher Scientific, A29377)에 포함된 Tracr Fragment + T7 Primer Mix를 사용하여 PCR thermal cycler(FlexCycler2, Analytik Jena)로 PCR 반응을 수행하였다. PCR 반응은 98℃에서 10초간 전-변성(pre-denaturation)을 수행한 후, 98℃에서 5초 및 55℃에서 15초 조건으로 32 사이클을 반복하여 변성과 결합(annealing)을 진행하고, 72℃에서 1분간 최종 신장(final extension)을 수행하였다. 수득한 PCR 생성물을 템플릿으로 하여 시험관내 전사 반응을 37℃에서 4시간 동안 수행한 후 정제 과정을 거쳐 gRNA를 수득하였다.
수득한 gRNA를 하기 표 1 내지 4에 나타내었다. 구체적으로, HLA-ABC(B2M)에 대한 gRNA 서열을 하기 표 1에 나타내었고, HLA-DQ에 대한 gRNA 서열을 하기 표 2에 나타내었으며, HLA-DP에 대한 gRNA 서열을 하기 표 3에 나타내었고, HLA-DR에 대한 gRNA 서열을 하기 표 4에 나타내었다.
HLA-ABC gRNA 서열 서열번호
B2M-01 GAGUAGCGCGAGCACAGCUA 서열번호 1
B2M-03 CUCGCGCUACUCUCUCUUUC 서열번호 2
B2M-04 GCAUACUCAUCUUUUUCAGU 서열번호 3
B2M-05 GCUACUCUCUCUUUCUGGCC 서열번호 4
B2M-06 GGCAUACUCAUCUUUUUCAG 서열번호 5
B2M-07 GGCCACGGAGCGAGACAUCU 서열번호 6
B2M-08 GGCCGAGAUGUCUCGCUCCG 서열번호 7
B2M-09 UCACGUCAUCCAGCAGAGAA 서열번호 8
B2M-10 ACAAAGUCACAUGGUUCACA 서열번호 9
B2M-11 AGUCACAUGGUUCACACGGC 서열번호 10
B2M-12 AAGUCAACUUCAAUGUCGGA 서열번호 11
B2M-13 CAUACUCAUCUUUUUCAGUG 서열번호 12
B2M-14 UCCUGAAUUGCUAUGUGUCU 서열번호 13
B2M-15 CGUGAGUAAACCUGAAUCUU 서열번호 14
B2M-16 UUGGAGUACCUGAGGAAUAU 서열번호 15
B2M-17 AGGGUAGGAGAGACUCACGC 서열번호 16
B2M-18 ACAGCCCAAGAUAGUUAAGU 서열번호 17
B2M-19 AUACUCAUCUUUUUCAGUGG 서열번호 18
B2M-20 UGGAGUACCUGAGGAAUAUC 서열번호 19
B2M-21 AAGAAAAGGAAACUGAAAAC 서열번호 20
B2M-22 AAGAAGGCAUGCACUAGACU 서열번호 21
B2M-23 ACAUGUAAGCAGCAUCAUGG 서열번호 22
B2M-24 ACCCAGACACAUAGCAAUUC 서열번호 23
B2M-25 ACUUGUCUUUCAGCAAGGAC 서열번호 24
B2M-26 CAAGCCAGCGACGCAGUGCC 서열번호 25
B2M-27 CACAGCCCAAGAUAGUUAAG 서열번호 26
B2M-29 CAUCACGAGACUCUAAGAAA 서열번호 27
B2M-30 CGCAGUGCCAGGUUAGAGAG 서열번호 28
B2M-31 CUAACCUGGCACUGCGUCGC 서열번호 29
B2M-32 GAAAGUCCCUCUCUCUAACC 서열번호 30
B2M-33 GAGACAUGUAAGCAGCAUCA 서열번호 31
B2M-34 GAGUCUCGUGAUGUUUAAGA 서열번호 32
B2M-35 GCAGUGCCAGGUUAGAGAGA 서열번호 33
B2M-36 UAAGAAGGCAUGCACUAGAC 서열번호 34
B2M-37 UCGAUCUAUGAAAAAGACAG 서열번호 35
B2M-39 UUCAGACUUGUCUUUCAGCA 서열번호 36
B2M-40 UUCCUGAAUUGCUAUGUGUC 서열번호 37
B2M-41 UAAGAAAAGGAAACUGAAAA 서열번호 38
B2M-42 CUGGCACUGCGUCGCUGGCU 서열번호 39
B2M-43 UGCGUCGCUGGCUUGGAGAC 서열번호 40
B2M-44 GCUGGCUUGGAGACAGGUGA 서열번호 41
B2M-45 AGACAGGUGACGGUCCCUGC 서열번호 42
B2M-46 CAAUCAGGACAAGGCCCGCA 서열번호 43
B2M-47 CCUGCGGGCCUUGUCCUGAU 서열번호 44
B2M-48 CCAAUCAGGACAAGGCCCGC 서열번호 45
B2M-49 CGGGCCUUGUCCUGAUUGGC 서열번호 46
B2M-50 GGGCCUUGUCCUGAUUGGCU 서열번호 47
B2M-51 GUGCCCAGCCAAUCAGGACA 서열번호 48
B2M-52 AAACGCGUGCCCAGCCAAUC 서열번호 49
B2M-53 GGGCACGCGUUUAAUAUAAG 서열번호 50
B2M-54 CACGCGUUUAAUAUAAGUGG 서열번호 51
B2M-55 UAUAAGUGGAGGCGUCGCGC 서열번호 52
B2M-56 AAGUGGAGGCGUCGCGCUGG 서열번호 53
B2M-57 AGUGGAGGCGUCGCGCUGGC 서열번호 54
B2M-58 UUCCUGAAGCUGACAGCAUU 서열번호 55
B2M-59 UCCUGAAGCUGACAGCAUUC 서열번호 56
B2M-60 UGGGCUGUGACAAAGUCACA 서열번호 57
B2M-61 ACUCUCUCUUUCUGGCCUGG 서열번호 58
HLA-DQ gRNA 서열 서열번호
DQA-08 UUAGGAUCAUCCUCUUCCCA 서열번호 59
DQA-09 AACUCUACCGCUGCUACCAA 서열번호 60
DQA-10 ACAAUGUCUUCACCUCCACA 서열번호 61
DQA-11 ACCACCGUGAUGAGCCCCUG 서열번호 62
DQA-12 ACCCAGUGUCACGGGAGACU 서열번호 63
DQA-14 ACCUCCACAGGGGCUCAUCA 서열번호 64
DQA-15 CAAUGUCUUCACCUCCACAG 서열번호 65
DQA-16 CACAAUGUCUUCACCUCCAC 서열번호 66
DQA-17 CAGUACACCCAUGAAUUUGA 서열번호 67
DQA-18 CUCUGUGAGCUCUGACAUAG 서열번호 68
DQA-19 CUGUGGAGGUGAAGACAUUG 서열번호 69
DQA-20 GGCUGGAAUCUCAGGCUCUG 서열번호 70
DQA-21 GUUGGGCUGACCCAGUGUCA 서열번호 71
DQA-22 UCAUGGGUGUACUGGCCAGA 서열번호 72
DQA-23 UCCAAGUCUCCCGUGACACU 서열번호 73
DQA-24 UCCACAGGGGCUCAUCACGG 서열번호 74
DQA-25 UGUGGAGGUGAAGACAUUGU 서열번호 75
DQA-26 UUCCAAGUCUCCCGUGACAC 서열번호 76
DQA-27 UUGGGCUGACCCAGUGUCAC 서열번호 77
DQA-28 AACAUCACAUGGCUGAGCAA 서열번호 78
DQA-29 ACAUCACAUGGCUGAGCAAU 서열번호 79
DQA-30 AGCCAUGUGAUGUUGACCAC 서열번호 80
DQA-31 AGGAAUGAUCACUCUUGGAG 서열번호 81
DQA-32 AUCACUCUUGGAGAGGAAGC 서열번호 82
DQA-33 AUGACUGCAAGGUGGAGCAC 서열번호 83
DQA-34 CAAGGUGGAGCACUGGGGCC 서열번호 84
DQA-35 CAUCAAAUUCAUGGGUGUAC 서열번호 85
DQA-36 CAUGUGAUGUUGACCACAGG 서열번호 86
DQA-37 CCUCACCACAGAGGUUCCUG 서열번호 87
DQA-38 CUCAUCUCCAUCAAAUUCAU 서열번호 88
DQA-39 CUCCUGUGGUCAACAUCACA 서열번호 89
DQA-40 GAAGAAGGAAUGAUCACUCU 서열번호 90
DQA-41 GACUGCAAGGUGGAGCACUG 서열번호 91
DQA-42 GAGGUAACUGAUCUUGAAGA 서열번호 92
DQA-43 GGACAACAUCUUUCCUCCUG 서열번호 93
DQA-44 GUGCUGUUUCCUCACCACAG 서열번호 94
DQA-45 UCUUCUGAAACACUGGGGUA 서열번호 95
DQA-47 UUCAUGGGUGUACUGGCCAG 서열번호 96
DQA-48 AGAGACUGUGGUCUGCGCCC 서열번호 97
DQA-49 GACAUAGGGGCUGGAAUCUC 서열번호 98
DQA-50 GAGACUGUGGUCUGCGCCCU 서열번호 99
DQA-51 GGCCUCGUGGGCAUUGUGGU 서열번호 100
DQA-52 GGGCCUCGUGGGCAUUGUGG 서열번호 101
DQA-53 GUCAGAGCUCACAGAGACUG 서열번호 102
DQA-54 GUCUCUGUGAGCUCUGACAU 서열번호 103
DQA-55 GUGAGCUCUGACAUAGGGGC 서열번호 104
DQA-56 GUUGGUGCUUCCAGACACCA 서열번호 105
DQA-57 UCUCUGUGAGCUCUGACAUA 서열번호 106
DQA-58 UGACUGCAAGGUGGAGCACU 서열번호 107
DQA-59 UGCCCACCACAAUGCCCACG 서열번호 108
DQA-60 UGGAAGCACCAACUGAACGC 서열번호 109
DQA-61 UGUGGGCCUCGUGGGCAUUG 서열번호 110
DQA-62 UUACCCCAGUGUUUCAGAAG 서열번호 111
DQA-63 UUGGAAAACACUGUGACCUC 서열번호 112
DQA-64 UUGGUGCUUCCAGACACCAA 서열번호 113
DQA-65 AAACAAAGCUCUGCUGCUGG 서열번호 114
DQA-66 AAAUCUCAUCAGCAGAAGGG 서열번호 115
DQA-67 CUAAACAAAGCUCUGCUGCU 서열번호 116
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004
HLA-DR gRNA 서열 서열번호
DRA-08 AAGAAGAAAAUGGCCAUAAG 서열번호 176
DRA-09 AAUCAUGGGCUAUCAAAGGU 서열번호 177
DRA-10 AGCUGUGCUGAUGAGCGCUC 서열번호 178
DRA-11 AUAAGUGGAGUCCCUGUGCU 서열번호 179
DRA-12 ACUUAUGGCCAUUUUCUUCU 서열번호 180
DRA-13 AUGAUGAAAAAUCCUAGCAC 서열번호 181
DRA-14 CAGAGCGCCCAAGAAGAAAA 서열번호 182
DRA-15 CAGGAAUCAUGGGCUAUCAA 서열번호 183
DRA-16 CUUAUGGCCAUUUUCUUCUU 서열번호 184
DRA-17 GACUGUCUCUGACACUCCUG 서열번호 185
DRA-18 GAGCCUCUUCUCAAGCACUG 서열번호 186
DRA-19 GAUAGUGGAACUUGCGGAAA 서열번호 187
DRA-20 GAUGAGCGCUCAGGAAUCAU 서열번호 188
DRA-21 GCUAUCAAAGGUAGGUGCUG 서열번호 189
DRA-22 GUUACCUCUGGAGGUACUGG 서열번호 190
DRA-23 UAGCACAGGGACUCCACUUA 서열번호 191
DRA-24 UGAUGAAAAAUCCUAGCACA 서열번호 192
DRA-25 UGAUGAGCGCUCAGGAAUCA 서열번호 193
DRA-27 UUUGCCAGCUUUGAGGCUCA 서열번호 194
DRA-28 AACUAUACUCCGAUCACCAA 서열번호 195
DRA-29 AGAAGAACAUGUGAUCAUCC 서열번호 196
DRA-30 AGCAGAGAGGGAGGUACCAU 서열번호 197
DRA-31 AGCGCUUUGUCAUGAUUUCC 서열번호 198
DRA-32 AGCUGUGGACAAAGCCAACC 서열번호 199
DRA-33 AGGGAGGUACCAUUGGUGAU 서열번호 200
DRA-34 AUAAACUCGCCUGAUUGGUC 서열번호 201
DRA-35 AUUGGUGAUCGGAGUAUAGU 서열번호 202
DRA-36 CCAUGUGGAUAUGGCAAAGA 서열번호 203
DRA-37 CUUUGAGGCUCAAGGUGCAU 서열번호 204
DRA-38 CUUUGUCAUGAUUUCCAGGU 서열번호 205
DRA-39 GGAUAUGGCAAAGAAGGAGA 서열번호 206
DRA-40 UAUCUGAAUCCUGACCAAUC 서열번호 207
DRA-41 UGAGAUUUUCCAUGUGGAUA 서열번호 208
DRA-42 UGAUCACAUGUUCUUCUGAA 서열번호 209
DRA-43 UGCACCUUGAGCCUCAAAGC 서열번호 210
DRA-44 UGCAUUGGCCAACAUAGCUG 서열번호 211
DRA-45 UGGACGAUUUGCCAGCUUUG 서열번호 212
DRA-46 UGGCAAAGAAGGAGACGGUC 서열번호 213
DRA-47 UGGUGAUGAGAUUUUCCAUG 서열번호 214
DRA-48 AAUGUCACGUGGCUUCGAAA 서열번호 215
DRA-49 AGACAAGUUCACCCCACCAG 서열번호 216
DRA-50 CAAUCCCUUGAUGAUGAAGA 서열번호 217
DRA-51 GAACGCAGGGGGCCUCUGUA 서열번호 218
DRA-52 CUGAGGACGUUUACGACUGC 서열번호 219
DRA-53 GCGGAAAAGGUGGUCUUCCC 서열번호 220
DRA-54 GGACGUUUACGACUGCAGGG 서열번호 221
DRA-55 GUCGUAAACGUCCUCAGUUG 서열번호 222
DRA-56 GUGAGCACAGUUACCUCUGG 서열번호 223
DRA-57 GUGUCCCCCAGUACCUCCAG 서열번호 224
DRA-58 UGAGGACGUUUACGACUGCA 서열번호 225
DRA-59 AAUGGAAAACCUGUCACCAC 서열번호 226
DRA-60 AGUGGAACUUGCGGAAAAGG 서열번호 227
DRA-61 AUGAAACAGAUGAGGACGUU 서열번호 228
DRA-62 CAGAGACAGUCUUCCUGCCC 서열번호 229
DRA-63 CGUGACAUUGACCACUGGUG 서열번호 230
DRA-64 UAUGAAACAGAUGAGGACGU 서열번호 231
DRA-65 UCUGACACUCCUGUGGUGAC 서열번호 232
DRA-66 AAACGUCCUCAGUUGAGGGC 서열번호 233
DRA-67 UCGUAAACGUCCUCAGUUGA 서열번호 234
실시예 1.2. Raji 세포주에 형질감염을 통한 gRNA 선별
수득한 gRNA 7.5 ㎍을 65℃에서 10분간 배양하여 단일가닥으로 만든 후 7.5 ㎍ Cas9 단백질(Toolgen, TGEN_CP3 또는 Clontech, M0646T)을 첨가하고 25℃에서 10분간 배양하여 Cas9-gRNA 복합체(RNP 복합체)를 제조하였다. 상기 RNP 복합체를 4x105개의 Raji 세포주에 SG Cell Line 4D-Nucleofector® X Kit S(Lonza, V4XC-3032)를 사용하여 4D-Nucleofector™ X Unit(Lonza, AAF-1002X)으로 형질감염하였다. 형질감염된 세포를 7일간 배양한 후 세포 표면의 HLA 발현량 및 유전체(genomic) DNA 돌연변이의 여부를 확인하였다.
실시예 1.3. 유세포 분석기를 이용한 HLA의 발현량 확인
RNP 복합체를 형질감염한 Raji 세포주 및 대조군 Raji 세포주 2x105개를 100 μL의 FACS 버퍼(1% FBS/sheath buffer)에 현탁하여 5 mL 튜브에 준비하였다. 여기에 항체를 처리한 후, 30분간 빛을 차단하고 4℃에서 배양하였다. 항체로는 PE anti-HLA-ABC(Miltenyi Biotec, 130-101-448), PE anti HLA-DR(Biolegend, 361605), PE anti-HLA-DQ(Biolegend, 318106) 및 PE anti-HLA-DP(Leinco Technologies, H130)를 사용하였다. 이후에, 3 mL FACS 버퍼를 넣어주고 4℃에서 2,000 rpm으로 3분간 원심분리한 다음 상층액을 제거하고 시료를 수득하여 LSR Fortessa로 분석하였다. 총 60종의 gRNA를 3번에 나누어 20종씩 테스트하였고 각 gRNA의 '% HLA 음성' 값에서 대조군의 '% HLA 음성' 값을 뺀 수치(정규화 % HLA 음성)를 계산한 결과를 도 1 내지 도 4에 나타내었다. 또한, 그 수치가 10 이상인 gRNA(단, B2M 표적 gRNA의 경우 수치가 1 이상인 gRNA)를 대상으로 한꺼번에 재실험을 수행한 결과를 도 5 내지 도 8에 나타내었다.
도 5 내지 도 8의 결과에서 각 HLA의 발현을 효율적으로 감소시킬 수 있는 gRNA를 표적(HLA-ABC, HLA-DQ, HLA-DP 및 HLA-DR)당 2 내지 4종씩 총 13종의 gRNA를 선별하였다. 구체적으로, HLA-ABC의 경우 B2M-01, B2M-07, B2M-18 및 B2M-27 gRNA, HLA-DQ의 경우 DQA-14, DQA-15, DQA-37 및 DQA-40, HLA-DP의 경우 DPA-07 및 DPA-13, HLA-DR의 경우 DRA-18, DRA-20 및 DRA-58을 선별하였다.
실시예 1.4. 표적 유전자의 유전체 DNA 돌연변이 확인
유세포 분석기를 이용해 선별한 HLA 표적 gRNA가 유전체 DNA에 돌연변이를 일으키는지 확인하기 위해 Guide-it mutation detection kit(Clontech, 631443)를 사용하여 제조업자의 지시에 따라 유전체 DNA를 분석하였다.
즉, RNP 복합체를 형질감염한 Raji 세포주 및 대조군 Raji 세포주 5x105개를 1,200 rpm으로 5분간 원심분리한 후 상층액을 제거하였다. 그 다음 Guide-it mutation detection kit(Clontech, 631443)에 포함된 추출버퍼 1을 90 μL 넣고 95℃에서 10분간 배양한 후, Guide-it mutation detection kit(Clontech, 631443)에 포함된 추출버퍼 2를 10 μL 넣고 파이펫팅(pipetting)하여 얻은 DNA 용해물을 PCR용 순수에 1 : 8의 비율로 희석하였다. 희석한 DNA 용해물과 하기 표 5에 나타낸 선별된 gRNA 및 표적 유전체 DNA에 대한 분석용 PCR 프라이머를 사용하여 PCR thermal cycler(FlexCycler2, Analytik Jena)로 PCR 반응을 수행하였다.
PCR 반응은 98℃에서 2분간 전-변성을 수행한 후, 98℃에서 10초, 60℃에서 15초 및 68℃에서 1분 조건으로 35 사이클을 반복하여 변성과 결합을 진행하고, 68℃에서 5분간 신장시키는 과정을 통해 PCR 생성물을 생산하였다. 수득한 PCR 생성물을 변성 및 재혼성화하기 위해 PCR 생성물 10 μL에 PCR용 순수 5 μL를 첨가하였다. 이어서, 95℃에서 5분 배양한 후, 95℃에서 85℃까지 초당 2℃씩 감소하고, 85℃에서 25℃까지 초당 0.1℃씩 감소하는 조건으로 온도 변화를 주었다. 마지막으로 Guide-it Resolvase 1 μL 넣고 37℃에서 30분간 배양시킨 뒤 1.5% 아가로스 겔에 전기영동한 결과를 도 9 내지 도 12에 나타내었다.
HLA 표적 gRNA를 형질감염한 세포의 PCR 생성물에서 Guide-it resolvase에 의해 절단된 DNA 조각을 전기영동 결과에서 확인하였다. 이 결과를 통해 상기 선별한 13종의 HLA 표적 gRNA가 표적 유전체 DNA에 대해 돌연변이를 유도한다는 사실을 확인하였다.
Figure pct00005
이와 같이, Raji 세포에서의 형질감염을 통해 각 HLA의 발현을 효율적으로 감소시킬 수 있는 gRNA를 선별하였다. 하기 실시예 2 및 3에서는 상기 선별된 gRNA를 이용하여 형질전환된 NK 세포를 제조한 후 효능을 확인하였다.
실시예 2. HLA-I이 결실된 세포의 제조 및 확인
실시예 2.1. NK-92MI 세포주의 HLA-I 결실
B2M-01 gRNA 37.5 ㎍을 65℃에서 10분간 배양하여 단일가닥으로 만든 후 37.5 ㎍ Cas9 단백질(Toolgen, TGEN_CP3)을 첨가하고 25℃에서 10분간 배양하여 Cas9-gRNA 복합체(RNP 복합체)를 제조하였다. 상기 RNP 복합체를 2x106개의 NK-92MI 세포주에 Cell Line nucleofector Kit R(Lonza, VCA-1001)을 사용하여 Nucleofector™ 2b(Lonza, AAB-1001)로 형질감염하였다. 형질감염된 세포를 3일간 배양한 후 세포분리기를 사용하여 세포분리를 수행하였다.
실시예 2.2. HLA I 음성 세포의 분리
B2M-01 RNP 복합체를 형질감염한 NK-92MI 세포주를 5 mL 튜브로 옮긴 후, PE anti-HLA-ABC(Miltenyi biotec, 130-101-448) 및 7-AAD(Beckman Coulter, A07704)를 처리한 후, 30분간 빛을 차단하고 4℃에서 배양하였다. 염색된 세포를 filter top FACS tube(Falcon, 352235)를 이용해 거른 후 FACS Aria II(BD)를 이용하여 HLA-I 양성 세포와 HLA-I 음성 세포를 분리한 결과를 도 13에 나타내었다. HLA-I 음성 세포의 순도는 95.9% 및 HLA-I 양성 세포의 순도는 97.2%로 확인하였다.
실시예 2.3. HLA-I 결실 NK-92MI 세포주의 세포살해능 평가
세포를 분리한 후 4일간 배양한 HLA-I 양성 세포 및 HLA-I 음성 세포를 이용하여 K562 세포주에 대한 세포살해능을 비교하였다. K562 세포주를 제조업자의 지시에 따라 30 μM Calcein-AM(Invitrogen, C3099)으로 염색한 후 NK-92MI 세포주와 함께 E : T의 비율을 10 : 1, 3 : 1, 1 : 1 및 0.3 : 1로 U-bottom 플레이트에 배양하였다. 4시간 후 배양액을 100 μL씩 덜어내어 세포사멸에 의해 분비된 Calcein-AM 양을 형광측정기(VictorTMX3, PerkinElmer)로 측정하였다. 그 결과, 도 14와 같이 HLA-I 양성 세포와 HLA-I 음성 세포의 K562 세포주에 대한 세포살해능이 동등한 것을 확인하였다. 이를 통해, HLA-I의 결실은 세포살해능에 영향을 미치지 않는다는 것을 확인하였다.
실시예 3. HLA-I 및 HLA-II 결실 세포의 제조 및 확인
실시예 3.1. NK 세포의 준비 및 배양
냉동보존된(Cryopreserved) 말초혈액단핵세포(PBMC, peripheral blood mononuclear cell)를 37℃ 수조에서 신속하게 녹인 후, 50 mL 코니컬 튜브(conical tube)로 옮겼다. 상기 튜브를 흔들어주면서 해동 배지(thawing media)(RPMI, 11875-093 + 10% FBS + 55 μM β-ME)를 한 방울씩 점적하여 혼합하였다. 이어서, 1,200 rpm으로 4℃에서 10분간 원심분리하여 상층액을 제거하고 10 mL의 CellGro SCGM(CELLGENIX, 2001) 배지에 재현탁시킨 후 세포수를 정량하였다. 세포를 1x106 cells/mL의 농도로 배양용 배지(CellGro SCGM + 10 ng/mL OKT3 + 500 IU/mL IL-2 + 5% Human plasma)에 재현탁시킨 후, Culture Bag(NIPRO, 87-352)에 넣고 37℃의 CO2 인큐베이터에서 24시간 배양한 후 형질감염을 수행하였다.
실시예 3.2. T 세포의 준비 및 배양 방법
냉동보존된(Cryopreserved) 말초혈액단핵세포(PBMC)를 37℃ 수조에서 신속하게 녹인 후, 50 mL 코니컬 튜브(conical tube)로 옮겼다. 상기 튜브를 흔들어주면서 해동 배지(thawing media)(RPMI, 11875-093 + 10% FBS + 55 μM β-ME)를 한 방울씩 점적하여 혼합하였다. 이어서, 1,200 rpm으로 4℃에서 10분간 원심분리하여 상층액을 제거하고 40 mL의 MACS 버퍼(PBS + 0.5% FBS + 2mM EDTA)에 재현탁시킨 후 세포수를 정량하였다. 세포 107개 당 20 μL의 CD3 microbeads(Miltenyi Biotec, 130-050-101)를 처리한 후, 15분간 빛을 차단하고 4℃에서 배양하였다. 이어서, 1,350 rpm으로 4℃에서 8분간 원심분리하여 상층액을 제거하고 500 μL의 MACS 버퍼에 재현탁시킨 후, QuadroMACS separator(Miltenyi Biotec, 130-090-976)에 장착된 LS 컬럼(Miltenyi Biotec, 130-042-401)에 로딩하였다. LS 컬럼을 MACS 버퍼로 3회 세척하고 QuadroMACS 분리기에서 제거한 후 플런저(plunger)로 눌러 CD3 양성 세포를 수득하였다. 세포를 1x106 cells/mL의 농도로 T 세포 배양용 배지(X-VIVO15(Lonza, BE02-060Q) + 40 μL/mL Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28(gibco, 111.31D) + 200 IU/mL IL-2 + 5% Human plasma)에 재현탁시킨 후, Culture Bag(NIPRO, 87-352)에 넣고 37℃의 CO2 인큐베이터에서 24시간 배양한 후 형질감염을 수행하였다.
실시예 3.3. 선별한 gRNA를 이용한 HLA 결실 NK 세포 및 T 세포 제조
gRNA 37.5 ㎍을 65℃에서 10분간 배양하여 단일가닥으로 만든 후 37.5 ㎍ Cas9 단백질(Clontech, M0646T)을 첨가하고 25℃에서 10분간 배양하여 Cas9-gRNA 복합체(RNP 복합체)를 제조하였다. 복합결실(multiplex deletion)의 경우, 각 gRNA의 합이 37.5 ㎍이 되게 하였다. 상기 RNP 복합체를 2x106개의 세포에 P3 Primary Cell 4D-Nucleofector® X Kit L(Lonza, V4XP-3024)을 사용하여 4D-Nucleofector™ X Unit(Lonza, AAF-1002X)으로 형질감염하였다. 형질감염된 세포를 3일간 배양한 후 사이토카인의 생성을 관찰하였고, 14일간 배양한 후 HLA 발현 감소 여부를 유세포 분석기로 확인하였다.
실시예 3.4. 유세포 분석기를 이용한 HLA 발현 감소 확인
RNP 복합체를 형질감염한 세포 및 대조군 세포 2x105개를 100 μL의 FACS 버퍼(1% FBS/sheath buffer)에 현탁하여 5 mL 튜브에 준비하였다. 세포 염색을 3차에 걸쳐 진행하였으며, 1차 염색으로는 anti-HLA-DP(abcam, ab20897), 2차 염색으로는 PE Goat anti-mouse IgG(eBioscience, 12-4010-82) 및 3차 염색으로는 V450 anti-CD4(BD, 560345), APC-Cy7 anti-CD8(BD, 557834), BV510 anti-HLA-ABC(Biolegend, 311436), PE-Cy7 anti-HLA-DR(eBioscience, 25-9952-42), Alexa647 anti-HLA-DQ(BD, 564806)를 사용하였다. 한편, NK 세포의 경우 V450 anti-CD4 대신에 BV421 anti CD56(Biolegend, 318328)을 사용하였다. 매 차마다 항체를 처리한 다음 30분간 빛을 차단하고 4℃에서 배양하였다. 이후, 3 mL의 FACS 버퍼를 넣고 2,000 rpm으로 4℃에서 3분간 원심분리하여 상층액을 제거하였다. 모든 염색을 마친 시료를 수득한 후 LSR Fortessa로 분석한 결과를 도 15 내지 도 17에 나타내었다.
각각의 HLA를 결실시키기 위해 사용한 gRNA로는 B2M-01, DRA-20, DQA-14, DPA-13을 사용하였으며, 도 15의 결과에서 단일 gRNA 형질감염 시 최소 70%에서 최대 99%의 높은 효율로 표적 HLA를 결실시키는 것을 확인하였다. 도 16의 결과에서 단일결실의 효율과 비교하였을 때, 복합결실의 효율이 크게 감소하지 않는다는 것을 확인하였다. 단일결실에 대한 복합결실의 효율을 비교한 경우, 복합결실의 '% 음성' 값에서 단일결실의 '% 음성' 값을 나눈 수치에 100을 곱하여 표현하였다. 또한, 도 17의 결과에서 RNP 복합체를 형질감염한 세포에서의 14일 간 배양 속도가 대조군 세포와 비슷한 수준으로 나타났다. 특히, 단일 gRNA(DPA-13)가 형질감염된 세포와 복합 gRNA가 형질감염된 세포의 배양 속도에 차이가 없음을 확인하였다.
실시예 3.5. HLA 결실된 T 세포 및 NK 세포 활성 분석
RNP 복합체를 형질감염한 세포 및 대조군 세포 1x106개에 PMA, 이오노마이신(Cell Stimulation Cocktail, eBioscience, 00-4970-03) 및 APC anti-CD107α(BD, 560664)를 처리한 후 배양하거나, APC anti-CD107α 및 K562 세포 2x105개와 함께 배양하였다. 5시간 후 PerCP-Cy5.5 anti-CD3(Tonbo, 65-0038-T100), BV421 anti-CD56(Biolegend, 318328), FITC anti-B2M(Biolegend, 316304), APC-Cy7 anti-HLA-ABC(Biolegend, 311426) 및 PE anti-HLA-DR/DP/DQ(Miltenyi Biotec, 130-104-827)를 처리한 후, 30분간 빛을 차단하고 4℃에서 배양하여 표면 염색을 실시하였다.
이후, 3 mL의 FACS 버퍼를 넣고 2,000 rpm으로 4℃에서 3분간 원심분리하여 상층액을 제거한 후, BD Cytofix/Cytoperm™ 버퍼(BD, 554722)를 이용하여 고정 및 투과화를 30분 동안 진행하였다. 1X Perm/Wash 버퍼(BD, 554723)를 이용하여 2회 세척한 후, PE-Cy7 anti-TNF-α(eBioscience, 25-7349-82) 및 V500 anti-IFN-γ(BD, 554701)를 처리하였고, 30분간 빛을 차단하고 4℃에서 배양하여 세포내 염색을 수행하였다. 이어서, 3 mL의 FACS 버퍼를 넣고 2,000 rpm으로 4℃에서 3분간 원심분리하여 상층액을 제거한 후, 1X Perm/Wash 버퍼를 이용하여 2회 세척하고 유세포 분석기로 T 세포 및 NK 세포의 사이토카인의 생성을 분석한 결과를 도 18 및 도 19에 나타내었다.
도 18에서, T 세포가 활성화되었을 때 분비되는 TNF-α, IFN-γ, CD107α의 양이 HLA가 결실된 경우에도 HLA 양성 세포와 차이가 없음을 확인하였다. 도 19에서 또한, NK 세포가 활성화되었을 때 분비되는 TNF-α, IFN-γ, CD107α의 양이 HLA가 결실된 경우에도 HLA 양성 세포와 차이가 없음을 확인하였다. 이를 통해, HLA-I 및 HLA-II가 결실되어도 NK 세포의 활성이 유지된다는 것을 확인하였다.
실시예 4. HLA-E 발현 벡터의 합성 및 발현 확인
실시예 4.1. HLA-I이 결실된 Raji 세포주에 대한 NK 세포의 세포살해능 평가
NK 세포에 의한 세포살해능이 HLA-I이 결실된 세포에서 증가하는지 확인하기 위해, Raji 세포주에 B2M-01 RNP 복합체를 형질감염하고, 세포분리기를 사용하여 HLA-I 양성 세포 및 HLA-I 음성 세포를 분리하였다. 각 세포를 제조업자의 지시에 따라 Calcein-AM으로 염색한 후 1x104개의 세포를 NK-92MI 세포주와 함께 E : T의 비율을 10 : 1, 3 : 1, 1 : 1 및 0.3 : 1로 U-bottom 플레이트에 배양하였다. 5시간 후 세포사멸에 의해 분비된 Calcein-AM의 양을 형광측정기로 측정하였다. 도 20과 같이 HLA-I 양성 세포에 비하여 HLA-I 음성 세포에서 NK 세포에 의한 세포살해능이 증가한 것을 확인하였다.
실시예 4.2. HLA-E 벡터의 합성
상기 실시예 4.1.과 같이, 세포에 B2M RNP 복합체를 형질감염시켜 HLA-I을 결실시킨 후 발생하는 NK 세포살해 현상을 피하기 위해, 세포에 HLA-E를 도입시키기 위한 HLA-E 벡터를 합성하였다. 즉, B2M 신호 펩타이드(B2M SS; 서열번호 235)에 연결된 G-펩타이드(서열번호 236)에 B2M(서열번호 237)이 3개의 G4S 제1 링커(서열번호 238)로 연결되어 있고, B2M이 HA tag(서열번호 239)가 붙은 HLA-E(서열번호 240)에 4개의 G4S 제2 링커(서열번호 241)로 연결된 형질전환 HLA-E(G-B2M-HLA-E)를 합성하였다. 각각의 서열을 하기 표 6에 나타내었다. 합성된 형질전환 HLA-E를 pLVX-EF1α-IRES-Puro Vector(Clontech, 631988)에 삽입하여 클로닝하였으며 구조는 도 21과 같다.
형질전환 HLA-E 아미노산 서열
B2M SS MSRSVALAVLALLSLSGLEA(서열번호 235)
G-펩타이드 VMAPRTLFL(서열번호 236)
B2M IQRTPKIQVYSRHPAENGKSNFLNCYVSGFHPSDIEVDLLKNGERIEKVEHSDLSFSKDWSFYLLYYTEFTPTEKDEYACRVNHVTLSQPKIVKWDRDM(서열번호 237)
제1 링커(G4S 링커 1) GGGGSGGGGSGGGGS(서열번호 238)
HA tag YPYDVPDYA(서열번호 239)
HLA-E GSHSLKYFHTSVSRPGRGEPRFISVGYVDDTQFVRFDNDAASPRMVPRAPWMEQEGSEYWDRETRSARDTAQIFRVNLRTLRGYYNQSEAGSHTLQWMHGCELGPDGRFLRGYEQFAYDGKDYLTLNEDLRSWTAVDTAAQISEQKSNDASEAEHQRAYLEDTCVEWLHKYLEKGKETLLHLEPPKTHVTHHPISDHEATLRCWALGFYPAEITLTWQQDGEGHTQDTELVETRPAGDGTFQKWAAVVVPSGEEQRYTCHVQHEGLPEPVTLRWKPASQPTIPIVGIIAGLVLLGSVVSGAVVAAVIWRKKSSGGKGGSYSKAEWSDSAQGSESHSL(서열번호 240)
제2 링커(G4S 링커 2) GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(서열번호 241)
실시예 4.3. K562 세포주에 형질도입을 통한 HLA-E의 발현 및 확인
형질전환 HLA-E가 삽입된 pLVX-EF1α-IRES-Puro Vector를 lenti viral packaging vector와 함께 293T 세포주에 형질감염하고 3일 후 렌티바이러스 상층액을 0.45 μm 필터를 통하여 수득하였다. 렌티바이러스 상층액을 K562 세포주에 처리하고 32℃에서 3,000 rpm으로 1시간 동안 원심분리하였다. 3일 후 1x106개의 세포를 5 mL 튜브로 옮기고 PE-Cy7 anti-HLA-E(Biolegend, 342608) 및 APC anti-B2M(Biolegend, 316312)으로 세포 표면 염색을 30분 동안 진행하였다. FACS 버퍼로 세척한 후, 유세포 분석기를 이용하여 HLA-E 및 B2M의 발현을 확인하였다. 도 22와 같이 형질전환 HLA-E를 발현시킨 K562 세포주에서 HLA-E와 B2M이 높은 수준으로 발현하는 것을 확인하였다.
실시예 4.4. HLA-E 도입 세포의 세포살해능 평가
형질전환 HLA-E를 발현시킨 K562 세포주와 대조군 K562 세포주를 제조업자의 지시에 따라 Calcein-AM으로 염색한 후, 1x104개 세포를 NK 세포와 함께 E : T의 비율을 10 : 1, 3 : 1, 1 : 1 및 0.3 : 1로 U-bottom 플레이트에 배양하였다. 5시간 후 배양액을 100 μL씩 덜어내어 세포사멸에 의해 분비된 Calcein-AM 양을 형광측정기(VictorTMX3, PerkinElmer)로 측정하였다.
도 23과 같이 NK 세포에 의한 세포살해 현상이 형질전환 HLA-E를 발현시킨 K562 세포주(K562 G-B2M-HLA-E)의 경우 대조군 K562 세포주(K562)에 비하여 유의하게 감소하는 것을 확인하였다. 이를 통해, HLA-E의 발현이 NK 세포에 의한 세포사멸을 방지할 수 있다는 것을 확인하였다.
실시예 5. HLA-I 및 HLA-II가 결실된 NK 세포에 대한 HLA-E의 도입
상기 실시예 3에서 제조한 HLA-I 및 HLA-II가 결실된 NK 세포에 상기 실시예 4.2와 같이 제조한 HLA-E 벡터를 이용하여, 상기 세포에 G-펩타이드가 결합된 HLA-E가 도입된 형질전환 NK 세포를 제조하였다.
<110> MOGAM INSTITUTE FOR BIOMEDICAL RESEARCH <120> AN ENGINEERED IMMUNE CELL AND USE THEREOF <130> PCB711063MOG <150> US 62/587,068 <151> 2017-11-16 <160> 259 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gRNA of B2M-01 <400> 1 gaguagcgcg agcacagcua 20 <210> 2 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gRNA of B2M-03 <400> 2 cucgcgcuac ucucucuuuc 20 <210> 3 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gRNA of B2M-04 <400> 3 gcauacucau cuuuuucagu 20 <210> 4 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gRNA of B2M-05 <400> 4 gcuacucucu cuuucuggcc 20 <210> 5 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gRNA of B2M-06 <400> 5 ggcauacuca ucuuuuucag 20 <210> 6 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gRNA of B2M-07 <400> 6 ggccacggag cgagacaucu 20 <210> 7 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gRNA of B2M-08 <400> 7 ggccgagaug ucucgcuccg 20 <210> 8 <211> 20 <212> RNA 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of DRA-31 <400> 198 20 agcgcuuugucaugauuucc <210> 199 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gRNA of DRA-32 <400> 199 20 agcuguggacaaagccaacc <210> 200 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gRNA of DRA-33 <400> 200 20 agggagguaccauuggugau <210> 201 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gRNA of DRA-34 <400> 201 20 auaaacucgccugauugguc <210> 202 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gRNA of DRA-35 <400> 202 20 auuggugaucggaguauagu <210> 203 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gRNA of DRA-36 <400> 203 20 ccauguggauauggcaaaga <210> 204 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gRNA of DRA-37 <400> 204 20 cuuugaggcucaaggugcau <210> 205 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gRNA of DRA-38 <400> 205 20 cuuugucaugauuuccaggu <210> 206 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gRNA of DRA-39 <400> 206 20 ggauauggcaaagaaggaga <210> 207 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gRNA of DRA-40 <400> 207 20 uaucugaauccugaccaauc <210> 208 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gRNA of DRA-41 <400> 208 20 ugagauuuuccauguggaua <210> 209 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gRNA of DRA-42 <400> 209 20 ugaucacauguucuucugaa <210> 210 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gRNA of DRA-43 <400> 210 20 ugcaccuugagccucaaagc <210> 211 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gRNA of DRA-44 <400> 211 20 ugcauuggccaacauagcug <210> 212 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gRNA of DRA-45 <400> 212 20 uggacgauuugccagcuuug <210> 213 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gRNA of DRA-46 <400> 213 20 uggcaaagaaggagacgguc <210> 214 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gRNA of DRA-47 <400> 214 20 uggugaugagauuuuccaug <210> 215 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gRNA of DRA-48 <400> 215 20 aaugucacguggcuucgaaa <210> 216 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gRNA of DRA-49 <400> 216 20 agacaaguucaccccaccag <210> 217 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gRNA of DRA-50 <400> 217 20 agacaaguucaccccaccag <210> 218 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gRNA of DRA-51 <400> 218 20 gaacgcagggggccucugua <210> 219 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gRNA of DRA-52 <400> 219 20 cugaggacguuuacgacugc <210> 220 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gRNA of DRA-53 <400> 220 20 gcggaaaagguggucuuccc <210> 221 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gRNA of DRA-54 <400> 221 20 ggacguuuacgacugcaggg <210> 222 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gRNA of DRA-55 <400> 222 20 gucguaaacguccucaguug <210> 223 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gRNA of DRA-56 <400> 223 20 gugagcacaguuaccucugg <210> 224 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gRNA of DRA-57 <400> 224 20 gugucccccaguaccuccag <210> 225 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gRNA of DRA-58 <400> 225 20 ugaggacguuuacgacugca <210> 226 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gRNA of DRA-59 <400> 226 20 aauggaaaaccugucaccac <210> 227 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gRNA of DRA-60 <400> 227 20 aguggaacuugcggaaaagg <210> 228 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gRNA of DRA-61 <400> 228 20 augaaacagaugaggacguu <210> 229 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gRNA of DRA-62 <400> 229 20 cagagacagucuuccugccc <210> 230 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gRNA of DRA-63 <400> 230 20 cgugacauugaccacuggug <210> 231 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gRNA of DRA-64 <400> 231 20 uaugaaacagaugaggacgu <210> 232 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gRNA of DRA-65 <400> 232 20 ucugacacuccuguggugac <210> 233 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gRNA of DRA-66 <400> 233 20 aaacguccucaguugagggc <210> 234 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gRNA of DRA-67 <400> 234 20 ucguaaacguccucaguuga <210> 235 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> B2M signal peptide <400> 235 Met Ser Arg Ser Val Ala Leu Ala Val Leu Ala Leu Leu Ser Leu Ser 1 5 10 15 Gly Leu Glu Ala 20 <210> 236 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> G-peptide <400> 236 Val Met Ala Pro Arg Thr Leu Phe Leu 1 5 <210> 237 <211> 99 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> B2M <400> 237 Ile Gln Arg Thr Pro Lys Ile Gln Val Tyr Ser Arg His Pro Ala Glu 1 5 10 15 Asn Gly Lys Ser Asn Phe Leu Asn Cys Tyr Val Ser Gly Phe His Pro 20 25 30 Ser Asp Ile Glu Val Asp Leu Leu Lys Asn Gly Glu Arg Ile Glu Lys 35 40 45 Val Glu His Ser Asp Leu Ser Phe Ser Lys Asp Trp Ser Phe Tyr Leu 50 55 60 Leu Tyr Tyr Thr Glu Phe Thr Pro Thr Glu Lys Asp Glu Tyr Ala Cys 65 70 75 80 Arg Val Asn His Val Thr Leu Ser Gln Pro Lys Ile Val Lys Trp Asp 85 90 95 Arg Asp Met <210> 238 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> G4S linker 1 <400> 238 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 <210> 239 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HA tag <400> 239 Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala 1 5 <210> 240 <211> 337 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HLA-E <400> 240 Gly Ser His Ser Leu Lys Tyr Phe His Thr Ser Val Ser Arg Pro Gly 1 5 10 15 Arg Gly Glu Pro Arg Phe Ile Ser Val Gly Tyr Val Asp Asp Thr Gln 20 25 30 Phe Val Arg Phe Asp Asn Asp Ala Ala Ser Pro Arg Met Val Pro Arg 35 40 45 Ala Pro Trp Met Glu Gln Glu Gly Ser Glu Tyr Trp Asp Arg Glu Thr 50 55 60 Arg Ser Ala Arg Asp Thr Ala Gln Ile Phe Arg Val Asn Leu Arg Thr 65 70 75 80 Leu Arg Gly Tyr Tyr Asn Gln Ser Glu Ala Gly Ser His Thr Leu Gln 85 90 95 Trp Met His Gly Cys Glu Leu Gly Pro Asp Gly Arg Phe Leu Arg Gly 100 105 110 Tyr Glu Gln Phe Ala Tyr Asp Gly Lys Asp Tyr Leu Thr Leu Asn Glu 115 120 125 Asp Leu Arg Ser Trp Thr Ala Val Asp Thr Ala Ala Gln Ile Ser Glu 130 135 140 Gln Lys Ser Asn Asp Ala Ser Glu Ala Glu His Gln Arg Ala Tyr Leu 145 150 155 160 Glu Asp Thr Cys Val Glu Trp Leu His Lys Tyr Leu Glu Lys Gly Lys 165 170 175 Glu Thr Leu Leu His Leu Glu Pro Pro Lys Thr His Val Thr His His 180 185 190 Pro Ile Ser Asp His Glu Ala Thr Leu Arg Cys Trp Ala Leu Gly Phe 195 200 205 Tyr Pro Ala Glu Ile Thr Leu Thr Trp Gln Gln Asp Gly Glu Gly His 210 215 220 Thr Gln Asp Thr Glu Leu Val Glu Thr Arg Pro Ala Gly Asp Gly Thr 225 230 235 240 Phe Gln Lys Trp Ala Ala Val Val Val Pro Ser Gly Glu Glu Gln Arg 245 250 255 Tyr Thr Cys His Val Gln His Glu Gly Leu Pro Glu Pro Val Thr Leu 260 265 270 Arg Trp Lys Pro Ala Ser Gln Pro Thr Ile Pro Ile Val Gly Ile Ile 275 280 285 Ala Gly Leu Val Leu Leu Gly Ser Val Val Ser Gly Ala Val Val Ala 290 295 300 Ala Val Ile Trp Arg Lys Lys Ser Ser Gly Gly Lys Gly Gly Ser Tyr 305 310 315 320 Ser Lys Ala Glu Trp Ser Asp Ser Ala Gln Gly Ser Glu Ser His Ser 325 330 335 Leu <210> 241 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> G4S linker 2 <400> 241 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser 20 <210> 242 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 242 ctggcttgga gacaggtgac 20 <210> 243 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 243 gacgcttatc gacgccctaa 20 <210> 244 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 244 cccaagtgaa ataccctggc a 21 <210> 245 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 245 agcccttcct actagcctca 20 <210> 246 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 246 aatttcttgg ggagggggtg 20 <210> 247 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 247 agctggatag taggagaaga cagt 24 <210> 248 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 248 gggttaaaga gtctgtccgt ga 22 <210> 249 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 249 tgtcgagacc acataatacc tgt 23 <210> 250 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 250 acctgacttg gcagggtttg 20 <210> 251 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 251 cccaagatct accaccggag a 21 <210> 252 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 252 tgctcccaag cagaaggtaa 20 <210> 253 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 253 aacccatgaa gtgtggaaaa caag 24 <210> 254 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 254 tccctccata ccagggttca 20 <210> 255 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 255 aactcatcct taccccagtg t 21 <210> 256 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 256 tgtgtcaact tatgccgcgt 20 <210> 257 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 257 ttgggaaaca cggtcacctc 20 <210> 258 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 258 tgtgaactgg agctctcttg a 21 <210> 259 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 259 tatgagggcc agagggaaca t 21

Claims (28)

  1. β2-마이크로글로불린(B2M)을 코딩하는 핵산 서열에 상보적으로 결합하는 가이드 RNA로서,
    상기 가이드 RNA는 서열번호 1, 서열번호 6, 서열번호 17 및 서열번호 26으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 핵산 서열을 포함하는 것인 가이드 RNA.
  2. HLA-DQ를 코딩하는 핵산 서열에 상보적으로 결합하는 가이드 RNA로서,
    상기 가이드 RNA는 서열번호 64, 서열번호 65, 서열번호 87 및 서열번호 90으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 핵산 서열을 포함하는 것인 가이드 RNA.
  3. HLA-DP를 코딩하는 핵산 서열에 상보적으로 결합하는 가이드 RNA로서,
    상기 가이드 RNA는 서열번호 123 또는 서열번호 129의 핵산 서열을 포함하는 것인 가이드 RNA.
  4. HLA-DR을 코딩하는 핵산 서열에 상보적으로 결합하는 가이드 RNA로서,
    상기 가이드 RNA는 서열번호 186, 서열번호 188 및 서열번호 225로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 핵산 서열을 포함하는 것인 가이드 RNA.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 가이드 RNA 또는 가이드 RNA 인코딩 뉴클레오타이드 및 RNA-유도 엔도뉴클레아제 또는 RNA-유도 엔도뉴클레아제 인코딩 뉴클레오타이드를 유효성분으로 포함하는 유전자 발현 억제용 조성물.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 RNA-유도 엔도뉴클레아제는 Cas1, Cas1B, Cas2, Cas3, Cas4, Cas5, Cas6, Cas7, Cas8, Cas9, Cas10, Cas12a, Cas12b, Cas12c, Cas12d, Cas12e, Cas 13a, Cas 13b, Cas 13c, Cas 13d, Cpf1, Csy1, Csy2, Csy3, Cse1, Cse2, Csc1, Csc2, Csa5, Csn2, Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Csm6, Cmr1, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, Csb1, Csb2, Csb3, Csx17, Csx14, Csx10, Csx16, CsaX, Csx3, Csx1, Csx15, Csf1, Csf2, Csf3 및 Csf4로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인, 유전자 발현 억제용 조성물.
  7. MHC I 세포막 수용체 및 MHC II 세포막 수용체의 발현이 억제된 형질전환된 세포.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 형질전환된 세포는 펩타이드 항원을 세포막 표면에 발현하는 것인, 형질전환된 세포.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 펩타이드 항원은 G-펩타이드인, 형질전환된 세포.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 G-펩타이드는 변형된 MHC I 세포막 수용체에 결합된 것인, 형질전환된 세포.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 변형된 MHC I 세포막 수용체는 HLA-E와 B2M이 연결된 구조를 갖는 것인, 형질전환된 세포.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 변형된 MHC I 세포막 수용체는 상기 HLA-E의 α1의 N 말단에 B2M의 C 말단이 제1 링커를 통해 연결되고,
    상기 B2M의 N 말단에 상기 G-펩타이드의 C 말단이 제2 링커를 통해 연결된 것인, 형질전환된 세포.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 G-펩타이드는 서열번호 236의 서열을 가지는 것인, 형질전환된 세포.
  14. 제12항에 있어서,
    상기 HLA-E는 서열번호 240의 서열을 가지는 것인, 형질전환된 세포.
  15. 제12항에 있어서,
    상기 B2M은 서열번호 237의 서열을 가지는 것인, 형질전환된 세포.
  16. 제12항에 있어서,
    상기 제1 링커는 서열번호 238의 서열을 가지는 것인, 형질전환된 세포.
  17. 제12항에 있어서,
    상기 제2 링커는 서열번호 241의 서열을 가지는 것인, 형질전환된 세포.
  18. 제7항에 있어서,
    MHC I 세포막 수용체를 코딩하는 유전자의 변형은 제1항의 가이드 RNA를 이용해 수행되는 것인, 형질전환된 세포.
  19. 제7항에 있어서,
    MHC II 세포막 수용체를 코딩하는 DQ, DP 및 DR 유전자의 변형은 각각 제2항, 제3항 및 제4항의 가이드 RNA를 이용해 수행되는 것인, 형질전환된 세포.
  20. 제7항에 있어서,
    상기 형질전환된 세포는 치료용 동종세포(allogeneic cell)인 것인, 형질전환된 세포.
  21. 제20항에 있어서,
    상기 치료용 동종세포는 면역세포 또는 줄기세포인, 형질전환된 세포.
  22. 제21항에 있어서,
    상기 면역세포는 NK 세포 또는 T 세포인 것인, 형질전환된 세포.
  23. 제7항에 따른 형질전환된 세포를 유효성분으로 포함하는 암, 감염성 질환, 퇴행성 질환, 유전성 질환 또는 면역 질환 치료용 약학 조성물.
  24. 제23항에 있어서,
    상기 암은 만성 림프구성 백혈병(CLL), B 세포 급성 림프구성 백혈병(B-ALL), 급성 림프아구성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 림프종, 비호지킨 림프종(NHL), 다발성 골수종, 혈액암, 위암, 간암, 췌장암, 대장암, 폐암, 유방암, 난소암, 피부암, 흑색종, 육종, 전립선암, 식도암, 간세포 암종, 성상세포종, 중피종, 두경부암 및 수아세포종으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인, 약학 조성물.
  25. 제23항에 있어서,
    상기 감염성 질환은 B형 간염, C형 간염, 인간 파필로마 바이러스(HPV) 감염, 사이토메갈로바이러스(Cytomegalovirus) 감염, 엡스타인바 바이러스(EBV)감염, 바이러스성 호흡기 질환 및 인플루엔자로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인, 약학 조성물.
  26. 제23항 내지 제25항 중 어느 한 항에 따른 약학 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암, 감염성 질환, 퇴행성 질환, 유전성 질환 또는 면역 질환을 치료하는 방법.
  27. 제26항에 있어서,
    상기 투여 경로는 정맥내, 근육내, 피내, 피하, 복강내, 소동맥내, 심실내, 병변내, 척추강내, 국소 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인, 방법.
  28. MHC I 세포막 수용체 및 MHC II 세포막 수용체의 발현이 억제되고,
    변형된 MHC I 세포막 수용체에 결합된 펩타이드 항원을 세포막 표면에 발현하는 형질전환된 세포의 암, 감염성 질환, 퇴행성 질환, 유전성 질환 또는 면역 질환 치료 용도.
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