KR20200063567A - Gene implicated in salt stress tolerance and use thereof - Google Patents

Abstract

The present invention relates to a salt stress resistance-related gene and a transgenic plant with improved resistance. More specifically, the present invention relates to a transgenic plant having resistance to salt stress by transforming plant cells with a transformation vector containing a BrATL30 gene to express the BrATL30 gene. By using the transgenic plant of the present invention, it is possible to improve productivity and safely supply agricultural products.

Description

내염성 관련 유전자 및 이의 용도{Gene implicated in salt stress tolerance and use thereof}Gene implicated in salt stress tolerance and use thereof

본 발명은 내염성 관련 유전자 및 이의 용도에 관한 것이다.The present invention relates to flame retardant related genes and uses thereof.

농업은 타산업에서는 볼 수 없는 특유의 위험과 불안정성을 가지고 있다. 농업은 재해에 따르는 손실이 클 뿐만 아니라 농산물가격 변동이 크며, 생산자재의 구입가격에 비해 농산물가격은 상대적으로 저위에 있기 때문에 더욱 불확실하다. 농업은 자연적 위험으로 한발이나 홍수, 서리, 우박 등에 의해 다른 어느 산업보다 피해를 입기 쉽다. 이는 농업생산의 장과 생산물이 이동이 불가능한 토지에 밀접하게 연결되어 있어서 제약을 받기 때문이며, 또한 생산의 대상이 동식물이기 때문에 생명현상의 제약에 따라 자연적인 조건에 지배되는 측면이 크기 때문이다. Agriculture has unique risks and instabilities that are not found in other industries. Agriculture is more uncertain because not only is the loss caused by the disaster large, but the price of agricultural products is fluctuating, and the price of agricultural products is relatively low compared to the purchase price of production materials. Agriculture is a natural risk, and is more susceptible to damage than any other industry by a blow, flood, frost or hail. This is because the field of agricultural production and the products are restricted because they are closely connected to the land that cannot be moved, and because the object of production is animals and plants, the aspects governed by natural conditions due to the limitations of life are large.

작물의 염해는 염류토양과 나트륨성 토양에 작물을 재배할 때에 나타나며, 해수의 유입, 토양수분의 증발에 따른 염류의 농축, 한발로 하천수가 감소되어 해수가 역류된 염분함량이 높은 관개수의 관개, 조풍 또는 파랑에 의한 바닷물의 비말 등의 영향으로도 나타난다. 한국은 3면이 바다로 둘러져 있어 대부분은 해안으로 구성이 되어 염지(鹽海地)가 많다. 염지란 염수의 침입이나 토양수분의 증발로 염분의 농도가 짙어짐으로써 식물이 생육에 장애를 받는 땅으로 일부지역은 염전으로 활용되었으며, 1960년대 이후 상당부분이 간척지로 변모하였다. 그 중 많은 면적은 숙답(熟沓)되어 벼의 수확량을 올리고 있지만, 비교적 근래에 간척사업이 끝난 신개답지의 경우 염해의 피해를 받는 일이 많다.The salt damage of crops appears when cultivating crops in salt soils and sodium soil, irrigation of irrigated water with a high salt content due to seawater inflow, salt water concentration due to evaporation of soil water, and reduced river water in one shot. Also, it is caused by the influence of seawater splash or blue water splash. In Korea, three sides are surrounded by the sea, and most of them are composed of coasts, so there are many salt fields. Yeomji is a land where plants are disturbed by growth due to the concentration of salinity caused by invasion of salt water or evaporation of soil moisture. Some areas have been used as salt fields, and since 1960s, many have been converted into reclamation sites. Many of these areas are ripened to increase the yield of rice, but relatively new lands that have been reclaimed in recent years are often affected by salt damage.

식물형질전환 기술의 발달에 의해 유연관계가 먼 외래유전자의 발현이 가능해짐에 따라 불량환경에 견디는 유전자를 감수성 식물에 도입함으로써 내재해성 작물개발이 가능하게 되었다. 따라서 냉해와 한발 및 염에 견디는 유전자의 분리 및 개발은 이러한 작물 개발에 필수 불가결한 요건이다. 냉해와 한발 및 염은 수분스트레스에 의해 유발되고 상호관련 되어 있으며, 저온에 의하여 발현이 유도되는 유전자는 종종 삼투 및 염에 의해서도 그 발현이 야기되기도 한다.With the development of plant transgenic technology, the expression of foreign genes with a distant relationship becomes possible, and thus, by introducing genes that endure poor environments into susceptible plants, it is possible to develop endogenous crops. Therefore, the isolation and development of cold-tolerant, single- and salt-tolerant genes are indispensable requirements for the development of these crops. Cold sea, hair and salt are caused by water stress and are interrelated, and genes whose expression is induced by low temperature are often caused by osmosis and salt.

특히, 염은 작물의 삼투압에 의한 수분부족을 야기하여 식물은 형태적, 대사적 변화를 일으키며 이에 대한 자세한 기작은 아직 완전히 밝혀져 있지 않다. 이러한 물의 부족은 식물의 형태적 변화 뿐 아니라 기공 폐쇄, 광합성율과 광호흡율의 감소, 소분자들의 증가 및 식물호르몬의 변화 그리고 유전자발현의 변화 등도 야기한다.In particular, the salt causes water shortage due to the osmotic pressure of the crop, causing the plant to undergo morphological and metabolic changes, and the detailed mechanism for this is not yet fully understood. This water deficiency causes not only morphological changes in plants, but also pore closure, decreased photosynthesis and photorespiration rates, increased small molecules and changes in plant hormones, and changes in gene expression.

현재 인구 증가에 따라 식량증산은 계속 요구되고 있으나 농수 및 농지는 점점 줄어들고 있는 실정이다. 아울러, 작물은 고착생활을 하기 때문에 주위 환경이 변화하는 경우 생육기간 중 많은 스트레스를 받아 수확량에 큰 차이를 가져 오게 된다. 우리나라는 온대성 기후에 속하지만, 지구 기후변화로 예기치 못한 가뭄 및 고온 등 이상 기상 현상이 빈번히 발생하고 있으며 과거 10년간(‘95～’04)의 한해, 풍수해, 냉해 등으로 인한 기상재해면적이 연평균 162.8 천ha로, 우리나라 총경지면적 1,836 천ha의 8.87%에 해당된다. 이같이 자연재해에 의한 농업생산성 저하는 심각한 수준으로 이러한 불량환경에 잘 견디는 작물 개발이 식량증산에 절대적으로 요구되고 있다.Currently, as the population grows, food production continues to be demanded, but farming water and farmland are gradually decreasing. In addition, because the crops have a fixed life, when the surrounding environment changes, they are subjected to a lot of stress during the growing period, which causes a large difference in yield. Although Korea belongs to a temperate climate, abnormal weather events such as drought and high temperatures are frequently occurring due to global climate change, and the area of meteorological disasters caused by the cold, flood, and cold seas in the past 10 years ('95~'04) The annual average is 162.8 thousand ha, which is 8.87% of Korea's total land area of 1,836 thousand ha. As such, the decline in agricultural productivity due to natural disasters is at a serious level, and the development of crops that can withstand these poor environments is absolutely required for food production.

이에, 본 발명자들은 작물의 내염성 증진방법에 관해 연구를 하던 중, 배추 유래 한 유전자가 식물체의 내염성을 증진시킬 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.Thus, the present inventors completed the present invention while confirming that the gene derived from Chinese cabbage can enhance the flame resistance of plants while conducting research on a method for improving the flame resistance of crops.

한국특허공개공보 10-2013-0113035 A (2013.10.15)Korea Patent Publication No. 10-2013-0113035 A (2013.10.15)

본 발명의 목적은 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 염 스트레스 저항성 유전자 및 이를 포함하는 식물체의 염 스트레스 저항성 유도용 조성물을 제공하는 것이다.An object of the present invention is to provide a salt stress resistance gene consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 and a composition for inducing salt stress resistance of a plant containing the same.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 유전자에 의해 암호화되는 단백질 또는 서열번호 2로 표시되는 단백질을 포함하는 식물체의 염 스트레스 저항성 유도용 조성물을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a composition for inducing salt stress resistance of a plant comprising a protein encoded by the gene or a protein represented by SEQ ID NO: 2.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 유전자를 포함하는 벡터, 상기 벡터로 형질전환된 식물체를 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a vector containing the gene, a plant transformed with the vector.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 유전자를 포함하는 벡터를 제조하여 식물체에 도입하는 단계를 포함하는 염 스트레스 저항성 식물체의 제조방법 및 식물체의 염 스트레스 저항성을 증가시키는 방법을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a method for producing a salt stress-resistant plant comprising the step of preparing a vector containing the gene and introducing it into the plant, and a method for increasing the salt stress resistance of the plant.

본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 염 스트레스 저항성 유전자를 제공한다. 상기 유전자는 배추(Brassica rapa) 유래의 RING-H2 finger protein ATL30(BrATL30) 유전자를 의미할 수 있다.The present invention provides a salt stress resistance gene consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1. The gene may mean a RING-H2 finger protein ATL30 ( BrATL30 ) gene derived from Chinese cabbage ( Brassica rapa ).

상기 서열번호 1의 염기서열로 이루어지는 BrATL30 유전자는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어지는 BrATL30 단백질로 발현될 수 있다. BrATL30 consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 The gene can be expressed as a BrATL30 protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.

상기 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 유전자 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 단백질이 식물체 내에서 염 스트레스 저항성을 유도할 수 있음을 확인하였으며, 이에 따라, 본 발명은 상기 유전자 또는 상기 유전자로부터 발현된 단백질을 포함하는 식물체의 염 스트레스 저항성 유도용 조성물을 제공한다.It was confirmed that the gene consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or the protein represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 can induce salt stress resistance in plants, and accordingly, the present invention is expressed from the gene or the gene It provides a composition for inducing salt stress resistance of a plant containing the protein.

본 발명은 또한 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공하며, 구체적으로 식물체의 염 스트레스 저항성을 증진시키는, 서열번호 1의 염기서열로 이루어지는 BrATL30 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.The present invention also provides a recombinant vector comprising the gene consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, and specifically provides a recombinant vector comprising the BrATL30 gene consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, which enhances salt stress resistance of plants. do.

상기 재조합 벡터는 도 1의 개열지도를 갖는 것이 바람직하며, 이에 한정하지 않는다.The recombinant vector preferably has the cleavage map of FIG. 1, but is not limited thereto.

본 명세서에서 사용된 용어, "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호화된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로서 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.As used herein, the term “recombinant” refers to a cell in which a cell replicates a heterologous nucleic acid, expresses the nucleic acid, or expresses a peptide, a heterologous peptide, or a protein encoded by a heterologous nucleic acid. Recombinant cells can express genes or gene segments not found in the natural form of the cells, either in sense or antisense form. Recombinant cells can also express genes found in natural cells, but the genes have been modified and reintroduced into the cell by artificial means.

본 명세서에서 사용된 용어, "벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 지칭할 때 사용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 용어 "발현 벡터"는 흔히 "재조합 벡터"와 호환하여 사용된다. 용어 "재조합 벡터"는 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다. 진핵세포에서 이용 가능한 프로모터, 인핸서, 종결신호 및 폴리아데닐레이션 신호는 공지되어 있다.The term "vector," as used herein, is used to refer to a DNA fragment(s), nucleic acid molecules that are delivered into a cell. Vectors replicate DNA and can be reproduced independently in host cells. The term "expression vector" is often used interchangeably with "recombinant vector." The term "recombinant vector" refers to a recombinant DNA molecule comprising a desired coding sequence and a suitable nucleic acid sequence necessary to express a coding sequence operably linked in a particular host organism. Promoters, enhancers, termination signals and polyadenylation signals available in eukaryotic cells are known.

본 발명의 벡터는 전형적으로 클로닝 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 또한, 본 발명의 벡터는 원핵 세포 또는 진핵 세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 재조합 벡터가 발현 벡터이고, 원핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터 (예컨대, pLλ프로모터, trp 프로모터, lac 프로모터, T7 프로모터, tac 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 리보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다.Vectors of the invention can typically be constructed as vectors for cloning or expression. In addition, the vector of the present invention can be constructed using prokaryotic or eukaryotic cells as hosts. For example, when the recombinant vector of the present invention is an expression vector and a prokaryotic cell is a host, a strong promoter capable of progressing transcription (eg, pLλ promoter, trp promoter, lac promoter, T7 promoter, tac promoter, etc.) , It usually contains a ribosome binding site for initiation of translation and a transcription/detox termination sequence.

발현 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함할 것이다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 그 예로는 글리포세이트(glyphosate), 글루포시네이트암모늄(glufosinate ammonium) 또는 포스피노트리신(phosphinothricin)과 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신(kanamycin), G418, 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신(hygromycin), 클로람페니콜(chloramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.The expression vector will preferably include one or more selectable markers. The marker is a nucleic acid sequence having a property that can be selected by a chemical method, and all genes capable of distinguishing transformed cells from non-transformed cells correspond to this. Examples include herbicide resistance genes such as glyphosate, glufosinate ammonium, or phosphinothricin, kanamycin, G418, bleomycin, hygromycin ), antibiotic resistance genes such as chloramphenicol, but are not limited thereto.

본 발명의 재조합 벡터에서, 프로모터는 CaMV 35S, 액틴, 유비퀴틴, pEMU, MAS 또는 히스톤 프로모터일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. "프로모터"란 용어는 구조 유전자로부터의 DNA 업스트림의 영역을 의미하며 전사를 개시하기 위하여 RNA 폴리머라아제가 결합하는 DNA 분자를 말한다. "식물 프로모터"는 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터이다. "항시발현(constitutive) 프로모터"는 대부분의 환경 조건 및 발달 상태 또는 세포 분화 하에서 활성이 있는 프로모터이다. 형질전환체의 선택이 각종 단계에서 각종 조직에 의해서 이루어질 수 있기 때문에 항시발현 프로모터가 본 발명에서 바람직할 수 있다. 따라서, 항시발현 프로모터는 선택 가능성을 한정하지 않는다.In the recombinant vector of the present invention, the promoter may be a CaMV 35S, actin, ubiquitin, pEMU, MAS or histone promoter, but is not limited thereto. The term "promoter" refers to the region of the DNA upstream from the structural gene and refers to a DNA molecule to which RNA polymerase binds to initiate transcription. "Plant promoter" is a promoter capable of initiating transcription in plant cells. A "constitutive promoter" is a promoter that is active under most environmental conditions and developmental status or cell differentiation. Constitutive expression promoters may be preferred in the present invention because selection of transformants can be made by various tissues at various stages. Therefore, the always-expressing promoter does not limit the possibility of selection.

본 발명의 일 실시예에서는 CaMV 35S 프로모터가 포함된 벡터 pB2GW7에 BrATL30 유전자를 삽입하여 제조한 재조합 벡터을 예시하고 있으나, 본 발명은 이러한 특정 벡터에 한정되는 것은 아니다.In one embodiment of the present invention, a recombinant vector prepared by inserting the BrATL30 gene into the vector pB2GW7 containing the CaMV 35S promoter is illustrated, but the present invention is not limited to this specific vector.

또한, 본 발명은 본 발명에 따른 재조합 벡터로 형질전환된 염 스트레스 저항성이 증진된 형질전환 식물체를 제공한다.In addition, the present invention provides a transformed plant with improved salt stress resistance transformed with the recombinant vector according to the present invention.

본 발명에서 상기 "식물체"는 벼, 밀, 보리, 옥수수, 콩, 감자, 팥, 귀리, 수수를 포함하는 식량 작물류; 애기장대, 배추, 무, 고추, 딸기, 토마토, 수박, 오이, 양배추, 참외, 호박, 파, 양파, 당근을 포함하는 채소 작물류; 인삼, 담배, 목화, 참깨, 사탕수수, 사탕무우, 들깨, 땅콩, 유채를 포함하는 특용 작물류; 사과나무, 배나무, 대추나무, 복숭아, 양다래, 포도, 감귤, 감, 자두, 살구, 바나나를 포함하는 과수류; 장미, 글라디올러스, 거베라, 카네이션, 국화, 백합, 튤립을 포함하는 화훼류; 및 라이그라스, 레드클로버, 오차드그라스, 알팔파, 톨페스큐, 페레니얼라이그라스 등을 포함하는 사료 작물류로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.The "plant" in the present invention includes rice, wheat, barley, corn, soybeans, potatoes, red beans, oats, food crops including sorghum; Vegetable crops including Arabidopsis, Chinese cabbage, radish, pepper, strawberry, tomato, watermelon, cucumber, cabbage, melon, pumpkin, green onion, onion, and carrot; Special crops including ginseng, tobacco, cotton, sesame, sugar cane, beet, perilla, peanut, and rapeseed; Fruit trees including apple trees, pear trees, jujube trees, peaches, skeins, grapes, citrus fruits, persimmons, plums, apricots, and bananas; Flowers including roses, gladiolus, gerbera, carnation, chrysanthemum, lily, tulip; And it may be selected from the group consisting of feed crops, including ryegrass, red clover, orchardgrass, alfalfa, tol pesque, perennial lyegras, etc., but is not limited thereto.

식물의 형질전환은 DNA를 식물에 전이시키는 임의의 방법을 의미한다. 그러한 형질전환 방법은 반드시 재생 및 (또는) 조직 배양 기간을 가질 필요는 없다. 식물 종의 형질전환은 이제는 쌍자엽 식물뿐만 아니라 단자엽 식물 양자를 포함한 식물 종에 대해 일반적이다. 원칙적으로, 임의의 형질전환 방법은 본 발명에 따른 잡종 DNA를 적당한 선조 세포로 도입시키는데 이용될 수 있다. 방법은 원형질체에 대한 칼슘/폴리에틸렌 글리콜 방법(Krens, F.A. et al., 1982, Nature 296, 72-74; Negrutiu I. et al., June 1987, Plant Mol. Biol. 8, 363-373), 원형질체의 전기천공법(Shillito R.D. et al., 1985 Bio/Technol. 3, 1099-1102), 식물 요소로의 현미주사법(Crossway A. et al., 1986, Mol. Gen. Genet. 202, 179-185), 각종 식물 요소의 (DNA 또는 RNA-코팅된) 입자 충격법(Klein T.M. et al., 1987, Nature 327, 70), 식물의 침윤 또는 성숙 화분 또는 소포자의 형질전환에 의한 아그로박테리움 투머파시엔스 매개된 유전자 전이에서 (비완전성) 바이러스에 의한 감염(EP 0 301 316호) 등으로부터 적당하게 선택될 수 있다. 본 발명에 따른 바람직한 방법은 아그로박테리움 매개된 DNA 전달을 포함한다. 특히 바람직한 것은 EP A 120 516호 및 미국 특허 제4,940,838호에 기재된 바와 같은 소위 이원 벡터 기술을 이용하는 것이다.Plant transformation refers to any method of transferring DNA to a plant. Such transformation methods do not necessarily have periods of regeneration and/or tissue culture. Transformation of plant species is now common for plant species including both dicotyledonous plants as well as monocotyledonous plants. In principle, any transformation method can be used to introduce the hybrid DNA according to the invention into suitable progenitor cells. Calcium/polyethylene glycol method for protoplasts (Krens, FA et al., 1982, Nature 296, 72-74; Negrutiu I. et al., June 1987, Plant Mol. Biol. 8, 363-373), protoplasts By electroporation (Shillito RD et al., 1985 Bio/Technol. 3, 1099-1102), microscopic injection into plant elements (Crossway A. et al., 1986, Mol. Gen. Genet. 202, 179-185 ), (DNA or RNA-coated) particle impact method of various plant elements (Klein TM et al., 1987, Nature 327, 70), Agrobacterium tumerfassi by infiltration of plants or transformation of mature pollen or vesicles It may be appropriately selected from infection with (non-complete) virus (EP 0 301 316) and the like in ence mediated gene transfer. A preferred method according to the invention comprises Agrobacterium mediated DNA delivery. Particularly preferred is the use of so-called binary vector technology as described in EP A 120 516 and US Pat. No. 4,940,838.

본 발명의 벡터가 도입되는 식물 세포는 세포가 식물로 재생될 수 있는 한 특정한 형태로 특별히 제한되는 것은 아니다. 이들 세포는, 예를 들면, 배양된 세포 부유물, 원형질체(protoplast), 잎 절편(leaf section) 및 캘러스(callus)를 포함한다. 꽃에 직접 DNA을 포함하고 있는 아그로박테리움을 뿌림으로서 DNA를 식물에 전달할 수 있다. 또한, 본 발명은 상기 방법, 즉 식물 꽃을 이용한 방법에 따라 제조되거나 조직 배양을 통해 재분화시킨 염 스트레스 저항성 식물체를 제공한다.The plant cell into which the vector of the present invention is introduced is not particularly limited in a specific form as long as the cell can be regenerated into a plant. These cells include, for example, cultured cell suspensions, protoplasts, leaf sections and callus. DNA can be transferred to plants by spraying Agrobacterium, which contains DNA directly on the flowers. In addition, the present invention provides a salt stress-resistant plant prepared according to the above method, that is, using a plant flower or re-differentiated through tissue culture.

보다 구체적으로 본 발명에 따른 염 스트레스 저항성 식물체는 BrATL30 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물체를 형질전환한 다음 통상적인 방법에 따라 캘러스의 유도, 발근 및 토양 순화의 과정을 통해 수득할 수 있다. 즉, BrATL30 유전자가 포함된 재조합 발현벡터로 아그로박테리움에 도입시키고 상기 도입된 아그로박테리움을 이용하여 애기장대 꽃에 분사시켜 형질전환시켰다. 그 다음, 제초제에 살아남는 개체를 선발하여 염 스트레스 저항성 식물체를 수득할 수 있다.More specifically, the salt stress-resistant plant according to the present invention can be obtained by transforming the plant with a recombinant vector containing the BrATL30 gene and then inducing callus, rooting and purifying the soil according to conventional methods. That is, the recombinant expression vector containing the BrATL30 gene was introduced into Agrobacterium and transformed by spraying Arabidopsis thaliana flowers using the introduced Agrobacterium. Then, individuals that survive the herbicide can be selected to obtain salt stress resistant plants.

또한, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 이루어지는 유전자를 발현시켜 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어지는 BrATL30 단백질의 세포 내 수준(level)을 높이는 단계를 포함하는 식물체의 염 스트레스 저항성을 증진시키는 방법을 제공한다.In addition, the present invention is a method for enhancing salt stress resistance of a plant comprising the step of increasing the intracellular level of the BrATL30 protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 by expressing a gene consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1. to provide.

상기 유전자를 발현시키는 방법은 프로모터에 상기 유전자를 작동 가능하게 연결한 재조합 벡터로 식물 세포를 형질전환하는 단계를 포함하는 것이 바람직하나, 이에 한정하지 않는다.The method for expressing the gene preferably includes transforming plant cells with a recombinant vector operably linked to the promoter, but is not limited thereto.

상기 세포 내 수준이란 세포 내에 존재하는 양을 말하는 것으로, 이는 당업자에게 공지된 여러 방법으로 조절될 수 있다. 예를 들면, 세포 내 수준은 전사 단계에서의 조절 또는 전사 후 단계에서의 조절을 통해 조절될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 전사 단계에서의 조절은 당업자에게 공지된 유전자의 발현을 증진시키기 위한 방법, 예를 들면, 프로모터에 서열번호 1의 BrATL30 유전자 또는 이들에 대한 상동 유전자를 연결한 재조합 발현벡터를 제조하여 상기 유전자의 발현을 증진시키는 방법 또는 서열번호 1의 BrATL30 유전자 또는 이들에 대한 상동유전자의 주변에 상기 유전자의 발현이 증진되도록 하는 발현조절서열을 삽입하는 방법 등에 의해 수행될 수 있다. 전사 후 단계에서의 조절은 당업자에게 공지된 단백질 발현을 증진시키기 위한 방법, 예를 들면, 서열번호 1 또는 이의 기능적 동등물의 BrATL30 유전자를 주형으로 전사된 mRNA의 안정성을 증진하는 방법, 단백질 또는 단백질의 안정성을 증진하는 방법 또는 단백질 또는 단백질의 활성을 증진하는 방법에 의해 수행될 수 있다.The intracellular level refers to the amount present in the cell, which can be adjusted by various methods known to those skilled in the art. For example, the intracellular level may be regulated through regulation in a transcription step or regulation in a post transcription step, but is not limited thereto. Regulation at the transcription step is a method for enhancing the expression of genes known to those skilled in the art, for example, the expression of the gene by preparing a recombinant expression vector in which a BrATL30 gene of SEQ ID NO: 1 or a homologous gene for them is linked to a promoter. It can be carried out by a method for enhancing or the expression of the BrATL30 gene of SEQ ID NO: 1 or a homologous gene for the expression of the gene to enhance the expression of the gene control sequence. Modulation in the post-transcriptional step is a method for enhancing protein expression known to those skilled in the art, for example, a method for enhancing the stability of mRNA transcribed with the BrATL30 gene of SEQ ID NO: 1 or a functional equivalent thereof, or a protein or protein. It may be carried out by a method for enhancing stability or a method for enhancing protein or protein activity.

바람직하게는 본 발명에서 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질 또는 이와 동등물의 세포 내 수준을 증가시키는 것은 상기 단백질을 암호화하는 유전자를 발현시키는 방법에 의해 수행될 수 있다. 이러한 발현시키는 방법은 당업자에게 공지된 방법을 사용할 수 있으나, 예를 들면, 프로모터에 서열번호2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질, 이와 동등물을 암호화하는 유전자, 바람직하게 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 갖는 유전자를 작동 가능하게 연결한재조합 발현벡터를 제조하여 그 발현을 증진시킬 수 있다.Preferably, in the present invention, increasing the intracellular level of a protein having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or equivalent thereof may be performed by a method of expressing a gene encoding the protein. As such a method of expression, a method known to those skilled in the art can be used, for example, a protein having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 in a promoter, a gene encoding the equivalent thereof, preferably a base represented by SEQ ID NO: 1 A recombinant expression vector operably linked to a gene having a sequence can be prepared to enhance its expression.

상기 단백질 동등물에는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질과 상동성을 갖는 상동 단백질이 포함된다.The protein equivalent includes a homologous protein having homology to a protein having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.

상기 "상동 단백질"이란 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열과 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더욱더 바람직하게는, 95% 이상, 가장 바람직하게는 99% 이상의 서열 상동성을 갖는 단백질로서 본 발명의 BrATL30 유전자 단백질과 실질적으로 동질의 기능을 나타내는 단백질을 말한다.The "homologous protein" refers to the sequence homology of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, preferably 80% or more, more preferably 90% or more, even more preferably, 95% or more, and most preferably 99% or more. As a protein to have, it refers to a protein that exhibits substantially the same function as the BrATL30 gene protein of the present invention.

또한, 상기 유전자 동등물에는 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 갖는 유전자와 상동성을 갖는 상동 유전자를 포함한다.In addition, the gene equivalent includes a homologous gene having homology to a gene having a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1.

서열번호 1로 표시되는 염기서열을 갖는 BrATL30 유전자 또는 이의 상동 유전자는 단백질로 암호화된다. The BrATL30 gene or homologous gene having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 is encoded by a protein.

상기 "상동 유전자"란 서열번호 1의 염기서열과 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더욱더 바람직하게는, 95% 이상, 가장 바람직하게는 99% 이상의 서열 상동성을 갖는 유전자로서 본 발명의 BrATL30 유전자와 실질적으로 동질의 기능을 나타내는 유전자를 말한다. 서열 상동성은 당업계에 공지된 방법으로 분석될 수 있다.The "homologous gene" is a gene having a sequence homology to the base sequence of SEQ ID NO: 1, preferably 80% or more, more preferably 90% or more, even more preferably, 95% or more, and most preferably 99% or more Refers to a gene that exhibits substantially the same function as the BrATL30 gene of the present invention. Sequence homology can be analyzed by methods known in the art.

상기 "실질적으로 동질의 기능"이란 염 스트레스에 대한 저항성에 관여하는 것을 의미한다. 상기 기능적 동등물에는, 예를 들어, 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열의 아미노산 중 일부가 치환되거나, 결실 또는 부가된 아미노산 서열 변형체가 포함된다. 아미노산의 치환은 바람직하게는 보존적 치환이다. 천연에 존재하는 아미노산의 보존적 치환의 예는 다음과 같다; 지방족 아미노산(Gly, Ala, Pro), 소수성 아미노산(Ile, Leu, Val), 방향족 아미노산(Phe, Tyr, Trp), 산성 아미노산(Asp, Glu), 염기성 아미노산 (His, Lys, Arg, Gln, Asn) 및 황함유 아미노산(Cys, Met). 아미노산의 결실은 바람직하게는 본 발명의 BrATL30의 활성에 직접관여하지 않는 부분에 위치한다. 또한 상기 기능적 동등물의 범위에는 BrATL30의 기본 골격 및 이의 생리 활성을 유지하면서 단백질의 일부 화학 구조가 변형된 단백질 유도체도 포함된다. 예를 들어, 본 발명의 단백질의 안정성, 저장성, 휘발성 또는 용해도 등을 변경시키기 위한 구조변경 및 생리활성을 유지하면서 GFP와 같은 다른 단백질과의 융합으로 만들어진 융합단백질 등이 이에 포함된다.The term "substantially homogenous function" means to participate in resistance to salt stress. The functional equivalents include, for example, amino acid sequence variants in which some of the amino acids in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 are substituted, deleted or added. Substitution of amino acids is preferably conservative substitution. Examples of conservative substitutions of naturally occurring amino acids are; Aliphatic amino acids (Gly, Ala, Pro), hydrophobic amino acids (Ile, Leu, Val), aromatic amino acids (Phe, Tyr, Trp), acidic amino acids (Asp, Glu), basic amino acids (His, Lys, Arg, Gln, Asn ) And sulfur-containing amino acids (Cys, Met). The deletion of the amino acid is preferably located in a part that is not directly involved in the activity of BrATL30 of the present invention. In addition, the range of functional equivalents includes protein derivatives in which some chemical structures of proteins are modified while maintaining the basic framework of BrATL30 and its physiological activity. For example, fusion proteins made by fusion with other proteins such as GFP while maintaining structural changes and physiological activities to change the stability, storage, volatile or solubility of the protein of the present invention are included therein.

본 발명의 일 실시예에서는 서열번호 1의 염기서열로 이루어지는 BrATL30 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제조하여 식물 세포를 형질전환시킴으로써 배추 유래 BrATL30 단백질의 세포 내 발현 수준을 증가시켰다.In one embodiment of the present invention, a recombinant vector comprising a BrATL30 gene consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 was prepared to transform plant cells to increase the level of intracellular expression of Chinese cabbage-derived BrATL30 protein.

또한, 상기 본 발명에 따른 형질전환 유전자로는 서열번호 1의 염기서열을 가지는 유전자뿐만 아니라, 서열번호 1의 일부 염기가 치환, 결실 또는 부가된 변형서열로서, 본 발명의 서열번호 1의 염기서열로부터 발현되는 단백질의 활성, 즉, 염 스트레스에 대한 저항성과 동등한 정도의 활성을 나타내는 단백질을 코딩하는 염기서열이 사용될 수 있다.In addition, the transformed gene according to the present invention is not only a gene having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, but also a base sequence of SEQ ID NO: 1 of the present invention as a modified sequence in which some bases of SEQ ID NO: 1 are substituted, deleted or added. From the activity of the protein expressed from, that is, a base sequence encoding a protein exhibiting an activity equivalent to resistance to salt stress can be used.

본 발명에 따라 제조한 염 스트레스 저항성이 증진된 BrATL30 유전자 발현 형질전환 개체는 비형질전환체(야생형)와 비교하여 비정상적 성장 또는 발달이 관찰되지 않았으므로, 기타 형질에는 변화 없이 염 스트레스 저항성만이 증진된 식물체를 얻을 수 있어 유용하다.The transformed individuals expressing BrATL30 gene with improved salt stress resistance prepared according to the present invention showed no abnormal growth or development compared to non-transformants (wild type), so only salt stress resistance was improved without changes in other traits. It is useful because you can get the old plant.

본 발명의 일 실시예에서, 본 발명에 따라 제조한 BrATL30 발현 애기장대 식물체에 대하여 염 스트레스 조건에서의 생존률을 측정하였다. 검정 결과, BrATL30 발현 애기장대에서 대조군과 비교하여 생존률이 증가한 것으로 보아, BrATL30 유전자는 염에 대한 저항성에 중요한 역할을 하는 것을 알 수 있었다.In one embodiment of the present invention, the survival rate under salt stress conditions was measured for Arabidopsis thaliana plants expressing BrATL30 prepared according to the present invention. As a result of the assay, it was found that the survival rate of BrATL30- expressing Arabidopsis was increased compared to that of the control group, and that the BrATL30 gene plays an important role in salt resistance.

본 발명의 일 실시예에서, 식물체 방어 시스템에서 BrATL30 의 기능을 실험하기 위하여, BrATL30 발현 애기장대 식물체에 RT-PCR을 수행하고, 식물체 저항성 관련 유전자의 발현 패턴에 대한 BrATL30 발현의 효과를 검정하였다. 그 결과, BrATL30 발현 개체에서 스트레스-반응성 유전자들의 발현이 강력하게 유도되었으므로, BrATL30 은 스트레스 저항성 마커 유전자의 발현과 관련이 있음을 확인하였다.In one embodiment of the present invention, in order to test the function of BrATL30 in the plant defense system, RT-PCR was performed on BrATL30 expressing Arabidopsis thaliana and the effect of BrATL30 expression on the expression pattern of plant resistance-related gene was assayed. As a result, since the expression of stress-responsive genes was strongly induced in BrATL30 expressing individuals, it was confirmed that BrATL30 was related to the expression of the stress resistance marker gene.

본 발명은 식물체에서 염 스트레스 저항성을 증진시키는 방법을 제공할 수 있으며, 종국에는 염 스트레스 저항성이 증진된 형질전환 식물체를 제공할 수 있다. 이러한 형질전환 식물체를 공급함으로써 염분이 있는 토양에서 재배가 가능하고 그로 인해 생산성 향상 및 안전한 농산물 공급이 가능하게 될 것이다.The present invention can provide a method for enhancing salt stress resistance in a plant, and finally, a transformed plant with improved salt stress resistance can be provided. By supplying such transgenic plants, cultivation in salty soil is possible, thereby improving productivity and providing safe agricultural products.

도 1은 BrATL30 유전자의 염기서열 및 아미노산 서열을 나타낸 도이다.
도 2는 배추 BrATL30과 RING-H2 like finger (C3H2C3 type)의 motif를 포함하는 다른 작물의 아미노산 서열의 상동성 분석 결과이다. B. rapa ATL30: XP_009101501.1, B. napus: XP_013695969.1, CDX77681.1, XP_013705849.1, B. oleracea: XP_013596672.1, R. sativus: XP_018466934.1, A. thaliana: OAO91314.1와 NP_199477.1, E. salsugineum: XP_006398362.1, A. lyrata: XP_002865171.1.
도 3은 배추 BrATL30 유전자를 포함하고 있는 식물 형질전환 벡터의 모식도이다. 35SP: CaMV 35S 프로모터, B267: BrATL30, T35S: CaMV 35S 터미네이터, Bar: 제초제 저항성 유전자
도 4는 형질전환체에서 Genomic DNA PCR로 유전자 도입을 확인한 결과이다. M: 마커, Wt: 비형질전환체, #1, #2, #3: 형질전환체
도 5는 BrATL30 형질전환 애기장대 내염성을 검정한 결과이다. A: 125mM NaCl에서 BrATL30 형질전환체 내염성 반응, Wt: 비형질전환체, #5-5-1, #5-5-2, #5-5-3: 형질전환체. B: 125mM NaCl에서 형질전환체 백화현상 정도. C: 125mM NaCl에서 식물체 생존율. Wt: 비형질전환체, #1, #2, #3: 형질전환체.
도 6은 내염성 배지에서 BrATL30 형질전환 애기장대 뿌리 생장을 관찰한 결과이다. A: 125 mM NaCl이 첨가된 배지에서 형질전환체 뿌리 생장 반응. B: 125 mM NaCl 배지에서 12일 유묘 생장 동안 형질전환체 주근의 길이 비교. C: 125 mM NaCl 배지에서 형질전환체 발생 측근 수 비교. Wt: 비형질전환체, #1, #2, #3: 형질전환체
도 7은 염처리 토양에서 형질전환체의 내염성을 검정한 결과이다. Wt: 비형질전환체, #5-5-1, #5-5-2, #5-5-3: 형질전환체
도 8은 내염성을 나타내는 형질전환체에서 내염성 관련 유전자 발현을 확인한 결과이다. B267: BrATL30 유전자, SOS1: salt overly sensitive1, HKT1: High-affinity K+ transporter 1, ABA1: ABA deficient 1, ABI1: ABA-insensitive1, FRY1: Fiery1, HOS1: High expression of osmotically responsive gene 1, SAD1: supersensitive to abscisic acid and drought 1. DREB2A: dehydration-responsive element-binding protein 2A, AtActin, Arabidopsis actin. Wt: 비형질전환체, #1, #2, #3: 형질전환체1 is a diagram showing the nucleotide sequence and amino acid sequence of the BrATL30 gene.
2 is a result of homology analysis of amino acid sequences of different crops including motifs of Chinese cabbage BrATL30 and RING-H2 like finger (C3H2C3 type). B. rap a ATL30: XP_009101501.1, B. napus : XP_013695969.1, CDX77681.1, XP_013705849.1, B. oleracea : XP_013596672.1, R. sativus : XP_018466934.1, A. thaliana : OAO91314.1 NP_199477.1, E. salsugineum : XP_006398362.1, A. lyrata : XP_002865171.1.
3 is a schematic diagram of a plant transformation vector containing Chinese cabbage BrATL30 gene. 35SP: CaMV 35S promoter, B267: BrATL30, T35S: CaMV 35S terminator, Bar: herbicide resistance gene
4 is a result of confirming the gene introduction by genomic DNA PCR in the transformant. M: marker, Wt: non-transformant, #1, #2, #3: transformant
Figure 5 is the result of assaying the BrATL30 transformed Arabidopsis salt resistance. A: BrATL30 transformant flame resistance reaction in 125 mM NaCl, Wt: non-transformant, #5-5-1, #5-5-2, #5-5-3: transformant. B: Degree of transformant whitening in 125 mM NaCl. C: Plant viability at 125 mM NaCl. Wt: non-transformant, #1, #2, #3: transformant.
6 is a result of observing the root growth of transformed Arabidopsis thaliana BrATL30 in a salt-resistant medium. A: Root growth reaction of transformants in medium with 125 mM NaCl. B: Comparison of lengths of transformant roots during 12-day seedling growth in 125 mM NaCl medium. C: Comparison of the number of transformant-generating aides in 125 mM NaCl medium. Wt: non-transformant, #1, #2, #3: transformant
7 is a result of assaying the salt resistance of transformants in salt-treated soil. Wt: non-transformant, #5-5-1, #5-5-2, #5-5-3: transformant
8 is a result of confirming the expression of the flame-resistant gene in a transformant showing flame resistance. B267: BrATL30 gene, SOS1: salt overly sensitive1, HKT1: High-affinity K+ transporter 1, ABA1: ABA deficient 1, ABI1: ABA-insensitive1, FRY1: Fiery1, HOS1: High expression of osmotically responsive gene 1, SAD1: supersensitive to abscisic acid and drought 1. DREB2A: dehydration-responsive element-binding protein 2A, AtActin, Arabidopsis actin. Wt: non-transformant, #1, #2, #3: transformant

이하, 본 발명을 하기 실시예에서 보다 상세하게 기술한다. 다만, 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 권리범위를 제한하거나 한정하는 것이 아니다. 본 발명의 상세한 설명 및 실시예로부터 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 기술자가 용이하게 유추할 수 있는 것은 본 발명의 권리범위에 속하는 것으로 해석된다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail in the following examples. However, the following examples are merely illustrative of the contents of the present invention and are not intended to limit or limit the scope of the present invention. From the detailed description and examples of the present invention, what can be easily inferred by those skilled in the art to which the present invention pertains is interpreted as belonging to the scope of the present invention.

<실시예 1> 배추 유래 <Example 1> Chinese cabbage origin BrATL30BrATL30 유전자 분리 및 발현 벡터의 제작 Gene isolation and construction of expression vectors

<1-1> 배추 유래 <1-1> Chinese cabbage origin BrATL30BrATL30 유전자 분리 Gene isolation

배추 생장발달 및 환경, 스트레스 처리 후에 유전자 은행을 제작하였다. 이로부터 구축된 EST 정보로부터 cDNA 클론이 완전장 (full-ORF)을 포함하고 있으며 특이적 발현을 나타내고 애기장대 유전자들과 유사성이 낮은 약 300개의 배추 고유 유전자 중에서 BrALT30을 선발하였다. Genetic banks were produced after cabbage growth, environment, and stress treatment. From the EST information constructed therefrom, the cDNA clone contained full-ORF, and specific expression and BrALT30 were selected from among approximately 300 cabbage native genes having low similarity to Arabidopsis genes.

선발된 배추 유전자의 아미노산 서열을 분석하여 본 결과 단백질 합성을 위한 ATG 시작 코돈부터 TAA 종결 코돈까지 약 864개의 염기로부터 번역된 287개의 폴리펩티드로 구성된 구조를 가지고 있으며 RING-H2 like finger (C3H2C3 type)의 motif를 갖고 있는 ATL30 (Genebank ID XM_009103253.2)으로 확인되었다(도 1). 11종의 다른 식물의 ATL30 아미노산 서열들을 비교 분석한 결과 80.5-99.7%의 높은 상동성을 나타내고 있으며 RING-H2 like finger (C3H2C3 type)의 motif가 잘 보존되어 있었다(도 2). As a result of analyzing the amino acid sequence of the selected Chinese cabbage gene, it has a structure composed of 287 polypeptides translated from about 864 bases from the ATG start codon to the TAA end codon for protein synthesis, and has a RING-H2 like finger (C3H2C3 type). It was identified as ATL30 (Genebank ID XM_009103253.2) with motif (FIG. 1). As a result of comparing and analyzing ATL30 amino acid sequences of 11 different plants, 80.5-99.7% showed high homology and the motif of RING-H2 like finger (C3H2C3 type) was well preserved (Fig. 2).

<1-2> 배추 <1-2> Chinese cabbage BrATL30 BrATL30 유전자의 발현 벡터의 제작Construction of gene expression vector

게이트웨이 시스템을 이용해서 선발된 BrATL30 유전자를 포함하고 있는 식물 형질전환용 벡터를 제작하였다. 최종운반체 (pB2GW7)에 삽입하기 위해 필요한 특정 서열(attB sequence)은 PCR을 통해서 얻었다. 위치 특이 재조합(site-specific recombination)을 위해 유전자에 부가적으로 삽입되어야 할 서열의 길이는 29bp로 PCR의 효율을 높이기 위하여 이 서열의 일부(12bp)만을 gene specific sequence (GSP)에 overhang으로 달아 첫 번째 PCR을 시행하였다. 첫 번째 PCR은 B267B1 프라이머(5‘-AAAAAGCAGGCTAAAACAAAAACCAAAAACAA-3’; 서열번호 3) 및 B267B2 프라이머 (5‘-AGAAAGCTGGGTTGAATCTAAGCGTGTTTC-3’; 서열번호 4)를 이용하여 95℃ 2분; 94℃ 30초, 60℃ 30초, 68℃ 1분의 10회; 및 68℃ 10분의 조건으로 수행하였다. 이 PCR 반응액의 1/10을 취해 다시 전체 재조합 서열을 갖는 attB1(5‘-ACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT-3’; 서열번호 5) 과 attB2(5‘-ACCCAGCTTTCTTGTACAAAGTGGT-3’; 서열번호 6)를 프라이머로 이용하여 95℃ 2분; 94℃ 30초, 45℃ 30초, 68℃ 1분의 5회; 94℃ 30초, 55℃ 30초, 68℃ 1분의 25회; 및 68℃ 10분의 조건으로 두 번째 PCR을 하였다. 증폭된 PCR 산물은 정제하여 사용하였다. 따라서 이 PCR 산물은 attB 서열을 모두 갖게 되어 이것을 형질전환용 벡터 제작에 사용했다. 게이트웨이 시스템은 크게 BP 반응과 LR 반응으로 나눌 수 있는데, attB 서열을 가지고 있는 BrALT30 유전자의 PCR 산물을 pDNOR 벡터(invitrogen)와 먼저 BP 반응을 시켜 중간 벡터를 만들었고, 이 산물을 최종 운반체와 LR 반응을 하여 원하는 최종 형질전환용 벡터를 얻었다(도 3).A plant transformation vector containing the selected BrATL30 gene was constructed using a gateway system. The specific sequence (attB sequence) required for insertion into the final carrier (pB2GW7) was obtained through PCR. For site-specific recombination, the length of the sequence to be additionally inserted into the gene is 29 bp. To increase PCR efficiency, only a portion (12 bp) of this sequence is overhanged to the gene specific sequence (GSP) for the first time. PCR was performed. The first PCR was 95°C 2 min using B267B1 primer (5'-AAAAAGCAGGCTAAAACAAAAACCAAAAACAA-3'; SEQ ID NO: 3) and B267B2 primer (5'-AGAAAGCTGGGTTGAATCTAAGCGTGTTTC-3'; SEQ ID NO: 4); 94°C 30 seconds, 60°C 30 seconds, 68°C ten times; And 68°C for 10 minutes. Take 1/10 of this PCR reaction solution and again use attB1 (5'-ACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT-3'; SEQ ID NO: 5) and attB2 (5'-ACCCAGCTTTCTTGTACAAAGTGGT-3'; SEQ ID NO: 6) with the entire recombinant sequence as primers. 95° C. 2 minutes; 94°C 30 seconds, 45°C 30 seconds, 68°C 5 times a minute; 94°C 30 seconds, 55°C 30 seconds, 68°C 25 times a minute; And 68°C for 10 minutes to perform a second PCR. The amplified PCR product was used after purification. Therefore, this PCR product had all of the attB sequences, which were used to construct a vector for transformation. The gateway system can be largely divided into a BP reaction and an LR reaction. The PCR product of the BrALT30 gene having the attB sequence is firstly BP-reacted with the pDNOR vector (invitrogen) to make an intermediate vector, and the product is subjected to LR reaction with the final carrier. To obtain the desired final transformation vector (FIG. 3).

<실시예 2> 배추 <Example 2> Chinese cabbage BrATL30 BrATL30 유전자 발현 형질전환체 제작 및 발현 검정Gene expression transformant production and expression assay

본 발명자들은 실시예 1-2에서 제작한 벡터의 식물에서의 발현을 확인하기 위하여 애기장대에 형질전환하였다.The present inventors were transformed into Arabidopsis thaliana in order to confirm expression of the vector produced in Example 1-2 in plants.

구체적으로, 제작된 벡터를 애기장대에 도입하기 위하여 아그로박테리움 투메파시엔스 GV3101(Agrobacterium tumefaciens GV3101)에 냉동/해동을 2-3번 반복한 후, 37℃의 열 쇼크(heat shock) 방법에 의해 형질전환한 후 스펙티노마이신(spectinomycin) 50 ㎎/ℓ, 리팜피신(rifampicin) 50 ㎎/ℓ, 젠타마이신(gentamycin) 25 ㎎/ℓ가 함유된 LB 배지에 접종하여 28 ℃에서 3-4일 정도 배양하였다. 형성된 콜로니 중 형질전환된 콜로니를 애기장대 형질전환에 사용하였다. 상기에서 형질전환된 아그로박테리움 투메파시엔스 GV3101를 아그로박테리움 GV3101:pB267로 명명하였다.Specifically, freezing/thawing was repeated 2-3 times in Agrobacterium tumefaciens GV3101 in order to introduce the prepared vector into Arabidopsis thaliana, followed by a heat shock method at 37°C. After transformation, inoculated in LB medium containing 50 mg/l of spectinomycin, 50 mg/l of rifampicin, and 25 mg/l of gentamicin, and cultured at 28°C for 3-4 days. Did. Among the colonies formed, the transformed colonies were used for Arabidopsis thaliana transformation. The transformed Agrobacterium tumefaciens GV3101 was named Agrobacterium GV3101:pB267.

제조한 pB267 재조합 발현벡터를 포함한 아그로박테리움 GV3101 균주를 이용하여 야생형 애기장대 Col-0 (Arabidopsis thaliana ecotype Col-0)를 형질전환하기 위해 먼저 애기장대를 파종 후 23℃ 생장상 (16시간 낮/8시간 밤)에서 약 4주간 생육시킨다. 4주된 애기장대 식물체의 일차 추대를 제거한 후 최소한 10 cm의 3-4개의 이차 추대를 유도한다. pB267 벡터로 형질전환된 아그로박테리움 튜메파시엔스 GV3101 균주를 항생제가 포함된 5㎖의 LB배지에서 48시간 동안 배양한 후 5% sucrose와 0.05% silwet L-77이 함유된 용액에 O.D 0.8 정도로 희석하여 현탁액을 제조한다. 제조한 현탁액을 애기장대 꽃봉오리에 분사한 후 충분한 습도와 암 조건을 유지한 상태로 24시간 배양한 다음 23℃, 16시간 낮 및 8시간 밤 조건의 생장상에서 3-4일 더 배양시키고 동일한 방법으로 2회 형질전환을 반복한다. 이 후, 23℃, 16시간 낮 및 8시간 밤 조건의 생장상에서 꼬투리 (silique)가 갈색으로 완전히 성숙할 때까지 약 4-6주간 생육시킨 후 종자를 수확하였다. 수확된 종자를 파종하여 생육 2주째 1차, 4주째 2차로 0.3% 바스타를 살포하여 형질전환체를 선발하여 같은 조건으로 생육시킨 후 후대종자를 확보하였다. 수확한 형질전환 애기장대 종자를 25㎍/㎖ 포스피노트리신 (DL-phophinothricin)이 포함된 MS배지에 파종하여 멘델의 유전법칙에 의한 잡종 제 2대의 분리비가 약 3 (항생제 저항): 1 (항생제 민감)로 나타나는 형질전환체를 선발하여 다음의 실험에 사용하였다. To transform wild type Arabidopsis Col-0 (Arabidopsis thaliana ecotype Col-0) using the Agrobacterium GV3101 strain containing the prepared pB267 recombinant expression vector, the Arabidopsis thaliana was first seeded and then grown at 23° C. (16 hours day/ 8 hours night) for about 4 weeks. After removing the primary pendulum of the 4-week-old Arabidopsis thaliana, 3-4 secondary pendulums of at least 10 cm are induced. Agrobacterium tumefaciens GV3101 strain transformed with pB267 vector was incubated in 5 ml LB medium containing antibiotics for 48 hours, and then diluted to a solution containing 5% sucrose and 0.05% silwet L-77 to an OD of 0.8. To prepare a suspension. After spraying the prepared suspension on Arabidopsis thaliana buds, the cells are cultured for 24 hours while maintaining sufficient humidity and dark conditions, followed by further cultivation for 3-4 days on growth at 23°C, 16 hours day and 8 hours night. The transformation is repeated twice. Thereafter, the seeds were harvested after growing for about 4-6 weeks at 23° C. for 16 hours during the day and 8 hours at night until the silique completely matured to brown. By harvesting the harvested seeds, 0.3% basta was sprayed on the first and second weeks of growth for 2 weeks to select transformants, and then grown under the same conditions to secure future seeds. The harvested transgenic Arabidopsis seeds were sown in MS medium containing 25 µg/ml phosphinothricin (DL-phophinothricin), and the separation ratio of the two hybrids according to Mendel's genetic law was about 3 (antibiotic resistance): 1 ( A transformant expressed as antibiotic-sensitive) was selected and used in the following experiment.

Genomic DNA PCR과 RT-PCR을 통해 BrALT30 유전자 삽입 유무와 발현을 각각 확인하였다. 형질전환 애기장대 식물체 잎으로부터 genomic DNA를 분리하였다(DNeasy Plant Kit, Qiagene). 분리된 genomic DNA 100 ng을 사용하여 유전자 특이 프라이머(B267F: 5'-ATGCCGATAACGAAACCGCTCGGATC-3 ; 서열번호 7, B267R: 5'- TTAACTTTGGGATTCCGGTACAAGTG-3' ; 서열번호 8)을 이용하여 PCR(95℃에서 3분 1 사이클, 95℃에서 30초, 55℃에서 30초, 72℃에서 45초, 35 사이클, 72℃ 10분 1 사이클 조건)로 식물체내 유전자 도입을 확인하였다. The presence or absence of BrALT30 gene insertion and expression were confirmed by genomic DNA PCR and RT-PCR, respectively. Genomic DNA was isolated from the transformed Arabidopsis thaliana plant leaf (DNeasy Plant Kit, Qiagene). PCR using a gene-specific primer (B267F: 5'-ATGCCGATAACGAAACCGCTCGGATC-3; SEQ ID NO: 7, B267R: 5'- TTAACTTTGGGATTCCGGTACAAGTG-3'; SEQ ID NO: 8) using 100 ng of isolated genomic DNA for 3 minutes at 95°C 1 cycle, 30 seconds at 95 ℃, 30 seconds at 55 ℃, 45 seconds at 72 ℃, 35 cycles, 72 ℃ 10 minutes 1 cycle conditions) was introduced into the plant gene.

형질전환체에 도입된 유전자 발현을 확인하기 위해 3 주간 재배한 형질전환 식물체의 잎을 채취한 후 즉시 액체질소에 얼려 막자사발로 마쇄하였다. 마쇄한 시료로부터 Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)을 이용해서 total RNA를 분리 하였다. Semi-quantitative RT-PCR 분석을 위해 역전사 효소(MMLV transcriptase RNase free, Toyobo)를 이용하여 total RNA 2 μg을 cDNA 라이브러리로 제작하고 3배 희석하여 2 μl를 PCR 증폭에 사용하였다. 유전자 특이 프라이머 B267F(서열번호 7)와 B267R(서열번호 8)를 이용하여 PCR (95℃에서 3분 1 사이클, 95℃에서 30초, 55℃에서 30초, 72℃에서 45초, 25 사이클, 72℃ 10분 1 사이클 조건)로 유전자 발현을 확인하였고 DNA 염기서열 분석을 통해 도입된 유전자의 발현을 최종 확인 하였다. Actin 유전자 발현 수준은 정량적 대조군으로 사용되었으며 모든 실험은 3반복으로 수행하였다.To confirm the expression of the gene introduced into the transformant, the leaves of the transformed plant grown for 3 weeks were harvested and immediately frozen in liquid nitrogen and ground in a mortar. Total RNA was isolated from the ground sample using Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). For semi-quantitative RT-PCR analysis, 2 μg of total RNA was prepared in a cDNA library using reverse transcriptase (MMLV transcriptase RNase free, Toyobo), and diluted 3 times to use 2 μl for PCR amplification. PCR using gene specific primers B267F (SEQ ID NO: 7) and B267R (SEQ ID NO: 8) (3 minutes 1 cycle at 95°C, 30 seconds at 95°C, 30 seconds at 55°C, 45 seconds at 72°C, 25 cycles, Gene expression was confirmed at 72°C for 10 minutes and 1 cycle condition), and finally the expression of the introduced gene was confirmed through DNA sequencing. Actin gene expression level was used as a quantitative control and all experiments were performed in 3 replicates.

그 결과, 비형질전환체에서는 BrATL30 이 발현되지 않는 반면에, 형질전환체에서는 BrATL30이 발현되었음을 확인할 수 있었다(도 4). As a result, BrATL30 in non-transformants While this was not expressed, it was confirmed that BrATL30 was expressed in the transformant (FIG. 4 ).

<실시예 3> <Example 3> BrATL30BrATL30 발현 형질전환체의 염 스트레스 저항성 검정 Salt stress resistance assay of expression transformants

본 발명자들은 실시예 2에서 제작한 BrATL30 유전자 발현 애기장대의 염 스트레스에 대한 저항성을 확인하였다.The present inventors confirmed the resistance to salt stress of Arabidopsis thaliana produced by BrATL30 gene prepared in Example 2.

구체적으로, Specifically,

가. 표면 살균한 형질전환 애기장대 종자를 125 mM NaCl이 포함된 1/2 MS 배지(MS salts, 1% Sucrose, 0.3% Gelrite)에 파종하여 2-4일간 4℃에서 휴면타파를 위해 저온처리 하였다. 저온처리 후 23℃, 16시간 낮 및 8시간 밤 조건의 생장상에서 배양하였다. 15-20일 후에 백화현상이 나타난 비율과 생존비율을 측정하였다. end. The surface-sterilized transformed Arabidopsis seeds were sown in 1/2 MS medium (MS salts, 1% Sucrose, 0.3% Gelrite) containing 125 mM NaCl and subjected to cold treatment for dormant breakdown at 4°C for 2-4 days. After the low temperature treatment, the cells were cultured on the growth conditions of 23° C., 16 hours day and 8 hours night. The rate of whitening after 15-20 days and the survival rate were measured.

그 결과 백화율은 비형질전환체가 90%이며 형질전환체가 26%로 나타났고(도 5B), 생존율은 비형질전환체가 10%이며 형질전환체가 74%로 나타났다(도 5C).As a result, the whitening rate was 90% for non-transformants and 26% for transformants (FIG. 5B), and the survival rate was 10% for non-transformants and 74% for transformants (FIG. 5C).

나. 고염도에서 형질전환 식물체의 뿌리 길이 생장을 측정하기 위해 Square-dish (1/2MS salts, 1% Sucrose, 125 mM NaCl, 0.8% Gelrite) 배지에 파종하여 2-4일간 4℃에서 휴면타파 후 23℃, 16시간 낮 및 8시간 밤 조건의 생장상에서 Square-dish를 세운 후 12일간 뿌리의 길이를 측정하였다. I. In order to measure the root length growth of transgenic plants at high salinity, seeding was performed in Square-dish (1/2MS salts, 1% Sucrose, 125 mM NaCl, 0.8% Gelrite) medium, and after 2-4 days of dormant break at 4°C, 23 The length of the roots was measured for 12 days after the square-dish was erected on the growth conditions of ℃, 16 hours daytime and 8 hours night.

그 결과, 내염성 배지에서 뿌리 길이 생장을 유묘 생장 12일 동안 측정한 결과 비형질전환체 비해서 형질전환체 뿌리가 거의 정상적으로 생장하였다(도 6A).As a result, the root length growth in the flame resistant medium was measured for 12 days of seedling growth. As a result, the transformant root grew almost normally compared to the non-transformant (FIG. 6A).

또한, 유묘 생장발달 동안 주근(Primary root)의 길이를 측정한 결과 비형질전환체에서는 주근 생장이 억제 받고 길이가 짧아졌으나 형질전환체 주근은 정상적으로 생장하였다(도 6B). 아울러 주근으로부터 발생된 측근의 수는 비형질전환체에서 1.2개로 급격하게 감소하였으나 형질전환체는 4-5개로 정상적으로 발생하였다(도 6C). 이 결과들로 부터 125 mM NaCl 배지에서 형질전환 애기장대는 BrATL30 유전자 도입에 의해 내염성이 증가한 것으로 예측되었다. In addition, as a result of measuring the length of the primary root during the growth and development of seedlings, the growth of the primary root was suppressed and shortened in the non-transformed transformant, but the transformant primary root grew normally (FIG. 6B). In addition, the number of lateral aides generated from the main roots decreased rapidly from non-transformants to 1.2, but 4-5 transformants were normal (Fig. 6C). From these results, the transformed Arabidopsis thaliana in 125 mM NaCl medium was predicted to have increased flame resistance by introducing the BrATL30 gene.

다. 원예용 상토에서 형질전환 애기장대 종자 50립을 파종 하여 23℃, 16시간 낮 및 8시간 밤 조건의 생장상에서 10일간 키운 후 대조군으로 NaCl이 포함되지 않은 일반물과 150 mM NaCl과 200 mM NaCl이 포함된 물 각각을 2일 간격으로 5번 공급한 후 10일 뒤 생존률을 측정하였다. All. 50 seeds of transformed Arabidopsis thaliana were sown in garden soil, grown for 10 days on growth at 23° C., 16 hours day and 8 hours night, and as a control, NaCl-free and 150 mM NaCl and 200 mM NaCl were added. Survival was measured after 10 days after supplying each of the included water 5 times at intervals of 2 days.

고염농도의 토양에서 형질전환 애기장대의 내염성 검정을 분석하기 위해 원예용 상토에서 10일 생장한 형질전환 애기장대에 염처리(일반물, 150 mM NaCl, 200 mM NaCl)를 2일 간격으로 5번 처리하여 10일 후 생존율을 조사한 결과, 200 mM NaCl에서는 비형질전환체와 큰 차이 없이 생존율이 낮았으며 150 mM NaCl에서는 생존율이 비형질전환체가 약 22%이며 형질전환체가 약 74%로 비형질전환체보다 형질전환체의 생존률이 52% 더 높게 나타났다(도 7). In order to analyze the salt tolerance assay of transformed Arabidopsis thaliana in high salt concentration, salt treatment (general material, 150 mM NaCl, 200 mM NaCl) was performed 5 times at 2 days intervals on the transformed Arabidopsis thaliana grown 10 days in the garden soil. As a result of examining the survival rate after 10 days by treatment, the survival rate was low without significant difference from the non-transformant at 200 mM NaCl, and the survival rate at 150 mM NaCl was about 22% for the non-transformer and about 74% for the transformant. The transformants showed a 52% higher survival rate than the sieve (Fig. 7).

따라서, 비형질전환체(NT)에서 보다 형질전환 애기장대에서 염 스트레스 저항성이 증진되었음을 알 수 있었다.Therefore, it was found that salt stress resistance was improved in transgenic Arabidopsis thaliana than in non-transformants (NT).

<실시예 4> BrATL30 유전자의 발현에 따른 형질전환체 내 내염성 관련 유전자의 발현 분석<Example 4> Analysis of the expression of the flame-resistance-related gene in the transformant according to the expression of the BrATL30 gene

21일 생장한 형질전환 애기장대 5번째 잎에서 total RNA분리 후 애기장대 내부 내염성 관련 유전자들의 발현양상을 RT-PCR로 분석 하였다. After total RNA isolation from the fifth leaf of transformed Arabidopsis thaliana grown on the 21st, expression patterns of the internal flame-resistant genes were analyzed by RT-PCR.

구체적으로, 형질전환 식물체에서 염 스트레스 관련 유전자들의 발현 수준을 확인하기 위하여 21일 자란 형질전환 식물체의 5번째 잎으로부터 Trizol을 사용하여 total RNA를 분리하였다. cDNA 라이브러리로 제작하고 (앞의 방법과 동일) 내염성 관련 유전자 특이 프라이머들(표 1)을 사용하여 semi-quantitative RT-PCR을 수행하였다. Semi-quantitative RT-PCR 결과로부터 Quantity One (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)과 GelQuant.NET (http://biochemlabsolutions.com/GelQuantNET.html)을 이용하여 상대적 발현 수준을 측정하였으며 모든 실험은 3반복으로 수행하였다.Specifically, in order to confirm the expression level of salt stress-related genes in the transgenic plant, total RNA was isolated using Trizol from the fifth leaf of the transgenic plant grown on the 21st. It was prepared with a cDNA library (same as the previous method) and semi-quantitative RT-PCR was performed using flame-resistant gene-specific primers (Table 1). From the semi-quantitative RT-PCR results, relative expression levels were measured using Quantity One (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) and GelQuant.NET (http://biochemlabsolutions.com/GelQuantNET.html). It was performed in 3 repetitions.

내염성 관련 유전자 특이 프라이머 서열 Flame-retardant gene-specific primer sequence 유전자 gene AGI No.AGI No. 프리이머 서열Primer sequence 예상 size (bp)Estimated size (bp) SOS1 SOS1 At2g01980At2g01980 5’-ATGACGACTGTAATCGACGCGACG-3’(서열번호 9) 정방향5'-ATGACGACTGTAATCGACGCGACG-3' (SEQ ID NO: 9) forward 727727 5’-ACGCCAGACCAATGCCTACAGCTCC-3’(서열번호 10) 역방향5'-ACGCCAGACCAATGCCTACAGCTCC-3' (SEQ ID NO: 10) reverse HKT1HKT1 At4g10310At4g10310 5’-CGCTGTGACGTTGAGACTGTTACTG-3’(서열번호 11) 정방향5'-CGCTGTGACGTTGAGACTGTTACTG-3' (SEQ ID NO: 11) forward 916916 5’-CCATATGCACTGATAACTTCGAGAG-3’(서열번호 12) 역방향5'-CCATATGCACTGATAACTTCGAGAG-3' (SEQ ID NO: 12) reverse ABA1 ABA1 At5g67030At5g67030 5’-TGACTCTGCAGCAGATTCTAGCACG-3’(서열번호 13) 정방향5'-TGACTCTGCAGCAGATTCTAGCACG-3' (SEQ ID NO: 13) Forward 892892 5’-ACCCAGTCAAGCATCGATGGCATAGC-3’(서열번호 14) 역방향5'-ACCCAGTCAAGCATCGATGGCATAGC-3' (SEQ ID NO: 14) reverse ABI1 ABI1 At4g26080At4g26080 5’-ATGGAGGAAGTATCTCCGGCGATCG-3’(서열번호 15) 정방향5'-ATGGAGGAAGTATCTCCGGCGATCG-3' (SEQ ID NO: 15) forward 951951 5’-ATCGCCAATGGATCTCGACATGGCG-3’(서열번호 16) 역방향5'-ATCGCCAATGGATCTCGACATGGCG-3' (SEQ ID NO: 16) reverse FRY FRY At5g63980At5g63980 5’-ATGGCTTACGAGAAAGAGCTTGATG-3’(서열번호 17) 정방향5'-ATGGCTTACGAGAAAGAGCTTGATG-3' (SEQ ID NO: 17) forward 884884 5’-ACTATAGCACCAGCGACATGGTCC-3’(서열번호 18) 역방향5'-ACTATAGCACCAGCGACATGGTCC-3' (SEQ ID NO: 18) reverse HOS1HOS1 At2g39810At2g39810 5’-TGAACTATGTGTTGAATCCATGTGG-3’(서열번호 19) 정방향5'-TGAACTATGTGTTGAATCCATGTGG-3' (SEQ ID NO: 19) forward 744744 5’-ACTGGTCTACAGCATCAGGCCATGC-3’(서열번호 20) 역방향5'-ACTGGTCTACAGCATCAGGCCATGC-3' (SEQ ID NO: 20) reverse SAD1 SAD1 At5g48870At5g48870 5’-ATGGCGAACAATCCTTCACAGCTTC-3’(서열번호 21) 정방향5'-ATGGCGAACAATCCTTCACAGCTTC-3' (SEQ ID NO: 21) forward 267267 5’-TCATTCTCCATCTTCGGGAGACCC-3’(서열번호 22) 역방향5'-TCATTCTCCATCTTCGGGAGACCC-3' (SEQ ID NO: 22) reverse DREB2ADREB2A At5g05410At5g05410 5’-ATGGCAGTTTATGATCAGAGTGGAG-3’(서열번호 23) 정방향5'-ATGGCAGTTTATGATCAGAGTGGAG-3' (SEQ ID NO: 23) forward 879879 5’-CCTGTATGAACCGTTGGCAACACTG-3’(서열번호 24) 역방향5'-CCTGTATGAACCGTTGGCAACACTG-3' (SEQ ID NO: 24) reverse

그 결과, 내염 저항 경로에서 이온 항상성(Ion homeostasis under salt stress)유지에 중요한 역할을 하는 Na+/H+ antiporter SOS1(salt overly sensitive1), Na+ transporter HKT1 (High-affinity K+ transporter 1) 유전자의 발현이 증가하였다. 또한, ABA 반응 경로에서 Type 2C protein phosphatase ABI1 (ABA-insensitive1) 유전자 발현이 증가되었다. 아울러, 환경 스트레스 반응 경로에서 inositol polyphosphate 1-phosphatase FRY1(Fiery1)과 ERF/AP2 전사조절인자 DREB2A (Dehydration-responsive element-binding protein 2A) 유전자 발현이 증가되었다(도 8). As a result, the expression of Na+/H+ antiporter SOS1 (salt overly sensitive1) and Na+ transporter HKT1 (High-affinity K+ transporter 1) genes, which play an important role in maintaining ion homeostasis under salt stress in the salt resistance pathway, increased. . In addition, the expression of the type 2C protein phosphatase ABI1 (ABA-insensitive1) gene was increased in the ABA reaction pathway. In addition, in the environmental stress response pathway, inositol polyphosphate 1-phosphatase FRY1 (Fiery1) and ERF/AP2 transcription regulators DREB2A (Dehydration-responsive element-binding protein 2A) gene expression was increased (Fig. 8).

따라서 애기장대 식물에 도입된 배추 BrATL30 유전자가 형질전환체에서 내염성 관련 유전자의 발현을 증가시킴으로써 식물체 내염성을 증가시키는 효과를 나타낸 것으로 예측되었다.Therefore, it was predicted that the cabbage BrATL30 gene introduced into Arabidopsis thaliana showed an effect of increasing plant flame resistance by increasing the expression of the flame resistance-related gene in the transformant.

<110> Republic of Korea <120> Gene implicated in salt stress tolerance and use thereof <130> P18R12C1137 <160> 24 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1058 <212> DNA <213> Brassica rapa <400> 1 aaaacaaaaa ccaaaaacaa aatataaatc aagaaaccaa aaagaaaaca ttccagttat 60 tgaatcggag ataagcaatc tccgacactc tttccttcaa tgccgataac gaaaccgctc 120 ggatcaaaca caactcttcg atctcagcca ccacaacagt acagtaaacc gccactcttt 180 gtaatcctaa ccgtgatcct cctcgtcgtc ttcttcatcg gtttctgcgc tctctatttc 240 tgcaagtgtt tcttccacac tgtctcacat gcctgggatc gccgttacgg caacagatca 300 cccggaaatc aaatccaatc acaacaagaa aacgccagcc aaccaccggt taaccccggt 360 ttagagccgc gtatcagcca gtccttccca ttgtttccat tctcctcggt gaaagatctt 420 agagaagaca accaaggact cgaatgcgcg atttgtcttc tcgagttcga agaagaacac 480 atcctcctac ggcttctaac aacatgctac catgtttttc atcaagaatg catcgacaga 540 tggcttgatt ccaacaaaac atgccctgtt tgtcgcagaa atttagatcc aaacgctcct 600 gaaaacatca aagagttgat cattgaagtc atacacgaaa acagcaacgg gaaccacgag 660 caaccttcaa catcaaacga ggtttcgttg tcgaggcaga gcagtagtag tggtatgacc 720 gagcctttac cggataagtt ttcgaggtcg aagacgacgg gtcattcgat tgtgaggaat 780 aagccggagg aagaagatcg gtatactttg agattaccgg atcatgttaa gataaaggtt 840 acgagaagac ataataataa ccaaaccgag agttgtattt cgtttggtga gcttatgaga 900 aacagacaag gccggtttgg tgaactctct ggtcaatcac ttgtaccgga atcccaaagt 960 taaaagaaga tttacaattt ttattgtatt ttgttagtag gatacaagat atctttgtct 1020 aatgatgatg actgaagaat gaaacacgct tagattca 1058 <210> 2 <211> 287 <212> PRT <213> Brassica rapa <400> 2 Met Pro Ile Thr Lys Pro Leu Gly Ser Asn Thr Thr Leu Arg Ser Gln 1 5 10 15 Pro Pro Gln Gln Tyr Ser Lys Pro Pro Leu Phe Val Ile Leu Thr Val 20 25 30 Ile Leu Leu Val Val Phe Phe Ile Gly Phe Cys Ala Leu Tyr Phe Cys 35 40 45 Lys Cys Phe Phe His Thr Val Ser His Ala Trp Asp Arg Arg Tyr Gly 50 55 60 Asn Arg Ser Pro Gly Asn Gln Ile Gln Ser Gln Gln Glu Asn Ala Ser 65 70 75 80 Gln Pro Pro Val Asn Pro Gly Leu Glu Pro Arg Ile Ser Gln Ser Phe 85 90 95 Pro Leu Phe Pro Phe Ser Ser Val Lys Asp Leu Arg Glu Asp Asn Gln 100 105 110 Gly Leu Glu Cys Ala Ile Cys Leu Leu Glu Phe Glu Glu Glu His Ile 115 120 125 Leu Leu Arg Leu Leu Thr Thr Cys Tyr His Val Phe His Gln Glu Cys 130 135 140 Ile Asp Arg Trp Leu Asp Ser Asn Lys Thr Cys Pro Val Cys Arg Arg 145 150 155 160 Asn Leu Asp Pro Asn Ala Pro Glu Asn Ile Lys Glu Leu Ile Ile Glu 165 170 175 Val Ile His Glu Asn Ser Asn Gly Asn His Glu Gln Pro Ser Thr Ser 180 185 190 Asn Glu Val Ser Leu Ser Arg Gln Ser Ser Ser Ser Gly Met Thr Glu 195 200 205 Pro Leu Pro Asp Lys Phe Ser Arg Ser Lys Thr Thr Gly His Ser Ile 210 215 220 Val Arg Asn Lys Pro Glu Glu Glu Asp Arg Tyr Thr Leu Arg Leu Pro 225 230 235 240 Asp His Val Lys Ile Lys Val Thr Arg Arg His Asn Asn Asn Gln Thr 245 250 255 Glu Ser Cys Ile Ser Phe Gly Glu Leu Met Arg Asn Arg Gln Gly Arg 260 265 270 Phe Gly Glu Leu Ser Gly Gln Ser Leu Val Pro Glu Ser Gln Ser 275 280 285 <210> 3 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> B267B1 primer <400> 3 aaaaagcagg ctaaaacaaa aaccaaaaac aa 32 <210> 4 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> B267B2 primer <400> 4 agaaagctgg gttgaatcta agcgtgtttc 30 <210> 5 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> attB1 <400> 5 acaagtttgt acaaaaaagc aggct 25 <210> 6 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> attB2 <400> 6 acccagcttt cttgtacaaa gtggt 25 <210> 7 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> B267F <400> 7 atgccgataa cgaaaccgct cggatc 26 <210> 8 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> B267R <400> 8 ttaactttgg gattccggta caagtg 26 <210> 9 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SOS1 F <400> 9 atgacgactg taatcgacgc gacg 24 <210> 10 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SOS1 R <400> 10 acgccagacc aatgcctaca gctcc 25 <210> 11 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HKT1 F <400> 11 cgctgtgacg ttgagactgt tactg 25 <210> 12 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HKT1 R <400> 12 ccatatgcac tgataacttc gagag 25 <210> 13 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ABA1 F <400> 13 tgactctgca gcagattcta gcacg 25 <210> 14 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ABA1 R <400> 14 acccagtcaa gcatcgatgg catagc 26 <210> 15 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ABI1 F <400> 15 atggaggaag tatctccggc gatcg 25 <210> 16 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ABI1 R <400> 16 atcgccaatg gatctcgaca tggcg 25 <210> 17 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FRY F <400> 17 atggcttacg agaaagagct tgatg 25 <210> 18 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FRY R <400> 18 actatagcac cagcgacatg gtcc 24 <210> 19 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HOS1 F <400> 19 tgaactatgt gttgaatcca tgtgg 25 <210> 20 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HOS1 R <400> 20 actggtctac agcatcaggc catgc 25 <210> 21 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SAD1 F <400> 21 atggcgaaca atccttcaca 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ttgtttccat tctcctcggt gaaagatctt 420 agagaagaca accaaggact cgaatgcgcg atttgtcttc tcgagttcga agaagaacac 480 atcctcctac ggcttctaac aacatgctac catgtttttc atcaagaatg catcgacaga 540 tggcttgatt ccaacaaaac atgccctgtt tgtcgcagaa atttagatcc aaacgctcct 600 gaaaacatca aagagttgat cattgaagtc atacacgaaa acagcaacgg gaaccacgag 660 caaccttcaa catcaaacga ggtttcgttg tcgaggcaga gcagtagtag tggtatgacc 720 gagcctttac cggataagtt ttcgaggtcg aagacgacgg gtcattcgat tgtgaggaat 780 aagccggagg aagaagatcg gtatactttg agattaccgg atcatgttaa gataaaggtt 840 acgagaagac ataataataa ccaaaccgag agttgtattt cgtttggtga gcttatgaga 900 aacagacaag gccggtttgg tgaactctct ggtcaatcac ttgtaccgga atcccaaagt 960 taaaagaaga tttacaattt ttattgtatt ttgttagtag gatacaagat atctttgtct 1020 aatgatgatg actgaagaat gaaacacgct tagattca 1058 <210> 2 <211> 287 <212> PRT <213> Brassica rapa <400> 2 Met Pro Ile Thr Lys Pro Leu Gly Ser Asn Thr Thr Leu Arg Ser Gln 1 5 10 15 Pro Pro Gln Gln Tyr Ser Lys Pro Pro Leu Phe Val Ile Leu Thr Val 20 25 30 Ile Leu Leu Val Val Phe Phe Ile Gly Phe Cys Ala Leu Tyr Phe Cys 35 40 45 Lys Cys Phe Phe His Thr Val Ser His Ala Trp Asp Arg Arg Tyr Gly 50 55 60 Asn Arg Ser Pro Gly Asn Gln Ile Gln Ser Gln Gln Glu Asn Ala Ser 65 70 75 80 Gln Pro Pro Val Asn Pro Gly Leu Glu Pro Arg Ile Ser Gln Ser Phe 85 90 95 Pro Leu Phe Pro Phe Ser Ser Val Lys Asp Leu Arg Glu Asp Asn Gln 100 105 110 Gly Leu Glu Cys Ala Ile Cys Leu Leu Glu Phe Glu Glu Glu His Ile 115 120 125 Leu Leu Arg Leu Leu Thr Thr Cys Tyr His Val Phe His Gln Glu Cys 130 135 140 Ile Asp Arg Trp Leu Asp Ser Asn Lys Thr Cys Pro Val Cys Arg Arg 145 150 155 160 Asn Leu Asp Pro Asn Ala Pro Glu Asn Ile Lys Glu Leu Ile Ile Glu 165 170 175 Val Ile His Glu Asn Ser Asn Gly Asn His Glu Gln Pro Ser Thr Ser 180 185 190 Asn Glu Val Ser Leu Ser Arg Gln Ser Ser Ser Ser Gly Met Thr Glu 195 200 205 Pro Leu Pro Asp Lys Phe Ser Arg Ser Lys Thr Thr Gly His Ser Ile 210 215 220 Val Arg Asn Lys Pro Glu Glu Glu Asp Arg Tyr Thr Leu Arg Leu Pro 225 230 235 240 Asp His Val Lys Ile Lys Val Thr Arg Arg His Asn Asn Asn Gln Thr 245 250 255 Glu Ser Cys Ile Ser Phe Gly Glu Leu Met Arg Asn Arg Gln Gly Arg 260 265 270 Phe Gly Glu Leu Ser Gly Gln Ser Leu Val Pro Glu Ser Gln Ser 275 280 285 <210> 3 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> B267B1 primer <400> 3 aaaaagcagg ctaaaacaaa aaccaaaaac aa 32 <210> 4 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> B267B2 primer <400> 4 agaaagctgg gttgaatcta agcgtgtttc 30 <210> 5 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> attB1 <400> 5 acaagtttgt acaaaaaagc aggct 25 <210> 6 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> attB2 <400> 6 acccagcttt cttgtacaaa gtggt 25 <210> 7 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> B267F <400> 7 atgccgataa cgaaaccgct cggatc 26 <210> 8 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> B267R <400> 8 ttaactttgg gattccggta caagtg 26 <210> 9 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SOS1 F <400> 9 atgacgactg taatcgacgc gacg 24 <210> 10 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SOS1 R <400> 10 acgccagacc aatgcctaca gctcc 25 <210> 11 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HKT1 F <400> 11 cgctgtgacg ttgagactgt tactg 25 <210> 12 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HKT1 R <400> 12 ccatatgcac tgataacttc gagag 25 <210> 13 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ABA1 F <400> 13 tgactctgca gcagattcta gcacg 25 <210> 14 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ABA1 R <400> 14 acccagtcaa gcatcgatgg catagc 26 <210> 15 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ABI1 F <400> 15 atggaggaag tatctccggc gatcg 25 <210> 16 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ABI1 R <400> 16 atcgccaatg gatctcgaca tggcg 25 <210> 17 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FRY F <400> 17 atggcttacg agaaagagct tgatg 25 <210> 18 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FRY R <400> 18 actatagcac cagcgacatg gtcc 24 <210> 19 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HOS1 F <400> 19 tgaactatgt gttgaatcca tgtgg 25 <210> 20 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HOS1 R <400> 20 actggtctac agcatcaggc catgc 25 <210> 21 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SAD1 F <400> 21 atggcgaaca atccttcaca gcttc 25 <210> 22 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SAD1 R <400> 22 tcattctcca tcttcgggag accc 24 <210> 23 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DREB2A F <400> 23 atggcagttt atgatcagag tggag 25 <210> 24 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DREB2A R <400> 24 cctgtatgaa ccgttggcaa cactg 25

Claims (8)

서열번호 1의 염기서열로 이루어진 유전자를 포함하는 식물체의 염 스트레스 저항성 유도용 조성물.
A composition for inducing salt stress resistance of a plant comprising a gene consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1.
서열번호 1의 염기서열로 이루어진 유전자에 의해 암호화되는 단백질을 포함하는 식물체의 염 스트레스 저항성 유도용 조성물.
A composition for inducing salt stress resistance of a plant comprising a protein encoded by a gene consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1.
제 2항에 있어서, 상기 단백질은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어지는 것인, 식물체의 염 스트레스 저항성 유도용 조성물.
According to claim 2, The protein is composed of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, the composition for inducing salt stress resistance of plants.
서열번호 1의 염기서열로 이루어진 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환되어 상기 유전자의 발현이 유도된, 염 스트레스 저항성 형질전환 식물체.
Salt stress-resistant transformed plant, which has been transformed with a recombinant vector containing a gene consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 to express the gene.
제 4항에 있어서, 상기 식물체는 벼, 밀, 보리, 옥수수, 콩, 감자, 팥, 귀리, 수수를 포함하는 식량 작물류; 애기장대, 배추, 무, 고추, 딸기, 토마토, 수박, 오이, 양배추, 참외, 호박, 파, 양파, 당근을 포함하는 채소작물류; 인삼, 담배, 목화, 참깨, 사탕수수, 사탕무우, 들깨, 땅콩, 유채를 포함하는 특용 작물류; 사과나무, 배나무, 대추나무, 복숭아, 양다래, 포도, 감귤, 감, 자두, 살구, 바나나를 포함하는 과수류; 장미, 글라디올러스, 거베라, 카네이션, 국화, 백합, 튤립을 포함하는 화훼류; 및 라이그라스, 레드클로버, 오차드그라스, 알팔파, 톨페스큐, 페레니얼라이그라스를 포함하는 사료 작물류로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 형질전환 식물체.
The method of claim 4, wherein the plant is rice, wheat, barley, corn, soybeans, potatoes, red beans, oats, food crops, including sorghum; Vegetable crops including Arabidopsis, Chinese cabbage, radish, pepper, strawberry, tomato, watermelon, cucumber, cabbage, melon, pumpkin, green onion, onion, and carrot; Special crops including ginseng, tobacco, cotton, sesame, sugar cane, beet, perilla, peanut, and rapeseed; Fruit trees including apple trees, pear trees, jujube trees, peaches, skeins, grapes, citrus fruits, persimmons, plums, apricots, and bananas; Flowers including roses, gladiolus, gerbera, carnation, chrysanthemum, lily, tulip; And lyegrass, red clover, orchardgrass, alfalfa, tolfescu, and perennial lysig.
1) 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 유전자를 포함하는 벡터를 제조하는 단계;
2) 상기 1) 단계에서 제조된 벡터로 형질전환된 식물 형질전환세포를 제조하는 단계; 및
3) 상기 2) 단계에서 제조된 식물 형질전환세포로 식물체를 제조하는 단계; 를 포함하는 염 스트레스 저항성 식물체의 제조방법.
1) preparing a vector comprising a gene consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1;
2) preparing a plant transformed cell transformed with the vector prepared in step 1); And
3) preparing a plant from the plant transformed cell prepared in step 2); Method for producing a salt stress-resistant plant comprising a.
서열번호 1의 염기서열로 이루어지는 유전자를 발현시켜 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어지는 단백질의 수준(level)을 높이는 단계를 포함하는 식물체의 염 스트레스 저항성을 증진시키는 방법.
A method of enhancing salt stress resistance of a plant comprising expressing a gene consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 to increase the level of a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.
제 7항에 있어서, 상기 유전자를 발현시키는 방법은 프로모터에 상기 유전자를 작동 가능하게 연결한 재조합 벡터로 식물 세포를 형질전환하는 단계를 포함하는 것인 식물체의 염 스트레스 저항성을 증진시키는 방법.
The method of claim 7, wherein the method of expressing the gene comprises transforming plant cells with a recombinant vector operably linked to the promoter.

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