KR102266998B1

KR102266998B1 - BrZHD10 gene with salt tolerance and use thereof

Info

Publication number: KR102266998B1
Application number: KR1020190066075A
Authority: KR
Inventors: 이연희; 서은정; 윤혜진; 홍준기
Original assignee: 대한민국
Priority date: 2019-06-04
Filing date: 2019-06-04
Publication date: 2021-06-21
Also published as: KR20200139872A

Abstract

본 발명은 내염성 BrZHD10 (zinc-finger homeodomain protein 10) 단백질, 내염성 BrZHD10 (zinc-finger homeodomain protein 10) 유전자, 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터로 형질전환된 식물체, 내염성이 증진된 형질전환 식물체의 제조방법 및 식물체의 내염성을 증진시키는 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, 배추로부터 분리된 zinc-finger homeodomain protein 10 (BrZHD10) 유전자는 내염성에 대한 저항 효과에 있어, 내염성이 필요한 환경에서 재배할 수 있는 식물 품종 개발에 이용이 가능하다. The present invention relates to a salt-resistant BrZHD10 (zinc-finger homeodomain protein 10) protein, a salt-resistant BrZHD10 (zinc-finger homeodomain protein 10) gene, a recombinant vector containing the gene, a plant transformed with the recombinant vector, and a transformation with improved salt resistance. It relates to a method for producing a plant and a method for enhancing the salt tolerance of a plant.
According to the present invention, the zinc-finger homeodomain protein 10 (BrZHD10) gene isolated from Chinese cabbage can be used for the development of plant varieties that can be cultivated in environments requiring salt resistance in terms of resistance to salt tolerance.

Description

내염성 BrZHD10 유전자 및 이의 용도{BrZHD10 gene with salt tolerance and use thereof}BrZHD10 gene with salt tolerance and use thereof

본 발명은 내염성 단백질, 이를 코딩하는 유전자, 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터, 상기 벡터로 형질전환된 식물체, 상기 형질전환 식물체의 제조방법 및 상기 유전자를 식물체에 도입하는 단계를 포함하는 식물체의 내염성을 증진시키는 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a salt resistance protein, a gene encoding the same, a recombinant vector comprising the gene, a plant transformed with the vector, a method for producing the transgenic plant, and a plant comprising the step of introducing the gene into the plant. It's about how to promote it.

인류의 식량 부족 문제는 늘어나는 인구에 의하여 야기되어지고 있으며 이를 극복하기 위하여 황무지의 개간과 간척지 사업을 통한 경작이 가능한 농경지를 늘리는 노력이 중요하게 되었다. 황무지와 간척지는 일반농지와 비교하여 비생물적 스트레스(abiotic stress)가 많이 존재하는데, 특히 토양 내 염류축적(salinization)이 심각하여 작물 생육에 악영향을 미친다. 높은 농도의 염류(salts)는 이온 스트레스(ion stress)와 삼투압 스트레스(osmotic stress)를 유발시키며, 이를 통하여 산화적인 스트레스(oxidative stress)와 영양장애 같은 2차 스트레스(secondary stress)를 초래한다고 알려져 있다.The human food shortage problem is caused by the increasing population, and in order to overcome this problem, it is important to make efforts to increase arable land that can be cultivated through reclaimed land and reclaimed land. Wasteland and reclaimed land have a lot of abiotic stress compared to general farmland. In particular, salinization in the soil is serious, which adversely affects crop growth. It is known that high concentrations of salts induce ion stress and osmotic stress, thereby causing secondary stress such as oxidative stress and malnutrition. .

이와 같이, 작물의 염해는 염류토양과 나트륨성 토양에 작물을 재배할 때에 나타나며, 해수의 유입, 토양수분의 증발에 따른 염류의 농축, 한발로 하천수가 감소되어 해수가 역류된 염분함량이 높은 관개수의 관개, 조풍 또는 파랑에 의한 바닷물의 비말 등의 영향으로도 나타난다. 한국은 3면이 바다로 둘러져 있어 대부분은 해안으로 구성이 되어 염해지(鹽海地)가 많다. 염해지란 염수의 침입이나 토양수분의 증발로 염분의 농도가 짙어짐으로써 식물이 생육에 장애를 받는 땅으로 일부 지역은 염전으로 활용되었으며, 1960년대 이후 상당부분이 간척지로 변모하였다. 그 중 많은 면적은 숙답(熟沓)되어 벼의 수확량을 올리고 있지만, 비교적 근래에 간척사업이 끝난 신개답지의 경우 염의 피해를 받는 일이 많다.As such, crop salt damage occurs when crops are grown in saline and sodium soils, and irrigation with high salt content in which seawater flows backward due to inflow of seawater, concentration of salts due to evaporation of soil moisture, and reduction of river water in one shot. It also appears under the influence of water irrigation, tidal winds, or splashes of seawater caused by waves. Korea is surrounded by the sea on three sides, and most of it is composed of coasts, so there are many salty sea areas. A salty sea is a land in which the growth of plants is impaired due to the increase in salinity due to the intrusion of salt water or evaporation of soil moisture. Some areas have been used as salt fields, and since the 1960s, much of it has been transformed into reclaimed land. Many of these areas have been fertilized to increase the yield of rice, but in the case of Shingae fields, which have recently been reclaimed, they are often damaged by salt.

이에 따라, 염류 농도가 높은 환경에 의한 농업생산성 저하는 심각한 수준으로 이러한 환경에 내성을 갖는 우량 품종의 개발이 식량자원의 안정적 확보에 매우 시급하게 필요한 실정이다.Accordingly, the decrease in agricultural productivity due to the high salt concentration environment is serious, and the development of high-quality varieties resistant to such environments is very urgently needed to secure food resources stably.

대한민국공개특허 제10-2001-0111723호Republic of Korea Patent Publication No. 10-2001-0111723

본 발명의 하나의 목적은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 내염성 BrZHD10 (zinc-finger homeodomain protein 10) 단백질을 제공하는 것이다. One object of the present invention is to provide a salt-resistant BrZHD10 (zinc-finger homeodomain protein 10) protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.

본 발명의 다른 목적은 상기 단백질을 코딩하는 유전자를 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a gene encoding the protein.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 유전자를 포함하는, 재조합 벡터를 제공하는 것이다. Another object of the present invention is to provide a recombinant vector comprising the gene.

본 발명의 또 다른 목적은, 상기 유전자 또는 재조합 벡터로 형질전환된 식물체를 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a plant transformed with the gene or recombinant vector.

본 발명의 또 다른 목적은, 상기 유전자 또는 서열번호 1의 염기서열로 이루어지는 내염성 BrZHD10 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제조하는 단계; 및 상기 벡터를 식물체에 형질전환시키는 단계를 포함하는, 내염성이 증진된 형질전환 식물체의 제조방법을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to prepare a recombinant vector comprising a salt-resistant BrZHD10 gene consisting of the nucleotide sequence of the gene or SEQ ID NO: 1; And to provide a method for producing a transgenic plant with improved salt tolerance, comprising the step of transforming the vector into the plant.

본 발명의 또 다른 목적은, 상기 유전자 또는 재조합 벡터를 식물체에 도입하는 단계를 포함하는, 식물체의 내염성을 증진시키는 방법을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a method for enhancing the salt tolerance of a plant, comprising the step of introducing the gene or recombinant vector into the plant.

상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 내염성 BrZHD10 (Brassica rapa zinc-finger homeodomain protein 10) 단백질을 제공한다.As one aspect for achieving the above object, the present invention provides a salt-resistant BrZHD10 ( Brassica rapa zinc-finger homeodomain protein 10) protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.

본 발명에서 용어 "내염성"은 식물이 염해에 견디는 성질로, 높은 염 농도에 대한 식물의 저항성을 의미한다. 간척지에서는 내염성이 강한 품종이 필요하며, 작물의 내염성은 생산성을 잃지 않으면서 작물이 견딜 수 있는 최대 소금 농도이며 소금의 농도가 높을수록 작물의 생산성에 부정적인 영향을 준다. 상기 소금 농도는 일반적으로 토양 염분 또는 관개 용수의 염분을 일컫는다.In the present invention, the term "salt tolerance" refers to the property of a plant to withstand salt damage, and refers to the plant's resistance to high salt concentration. Reclaimed land requires a variety with strong salt tolerance. The salt tolerance of crops is the maximum salt concentration that crops can withstand without losing productivity. The higher the salt concentration, the more negatively it affects crop productivity. The salt concentration generally refers to soil salinity or salinity of irrigation water.

본 발명에서 상기 단백질은 첨부한 서열목록에 기재된 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 단백질에 한정되지 않으며, 서열번호 2의 아미노산 서열을 가지는 내염성 단백질과 기능적 동등물일 수 있다. 상기 "기능적 동등물"이란, 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 60%, 구체적으로는 70%, 보다 구체적으로는 80% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로서 본 발명의 BrZHD10과 실질적으로 동질의 활성을 나타내는 단백질을 의미한다.In the present invention, the protein is not limited to the protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 described in the accompanying sequence list, and may be a functional equivalent to the salt-resistant protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2. As a result of the addition, substitution or deletion of amino acids, the "functional equivalent" has at least 60%, specifically 70%, more specifically 80% or more sequence homology with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 It refers to a protein that exhibits substantially the same activity as BrZHD10 of the present invention.

상기 기능적 동등물에는, 예를 들어, 서열번호 2의 아미노산 서열의 아미노산 중 일부가 치환되거나, 결실 또는 부가된 아미노산 서열 변형체가 포함된다. 아미노산의 치환은 바람직하게는 보존적 치환이다. 천연에 존재하는 아미노산의 보존적 치환의 예는 다음과 같다; 지방족 아미노산(Gly, Ala, Pro), 소수성 아미노산(Ile, Leu, Val), 방향족 아미노산(Phe, Tyr, Trp), 산성 아미노산(Asp, Glu), 염기성 아미노산(His, Lys, Arg, Gln, Asn) 및 황 함유 아미노산(Cys, Met). 아미노산의 결실은 바람직하게는 본 발명의 BrZHD10의 활성에 직접 관여하지 않는 부분에 위치한다. 또한 상기 기능적 동등물의 범위에는 BrZHD10의 기본 골격 및 이의 생리활성을 유지하면서 단백질의 일부 화학 구조가 변형된 단백질 유도체도 포함된다. 예를 들어, 본 발명의 단백질의 안정성, 저장성, 휘발성 또는 용해도 등을 변경시키기 위한 구조변경 및 생리활성을 유지하면서 GFP(Green Fluorescent Protein)와 같은 다른 단백질과 융합으로 만들어진 융합 단백질 등이 이에 포함된다.The functional equivalents include, for example, amino acid sequence variants in which some of the amino acids of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 are substituted, deleted or added. Substitutions of amino acids are preferably conservative substitutions. Examples of conservative substitutions for naturally occurring amino acids are; Aliphatic amino acids (Gly, Ala, Pro), hydrophobic amino acids (Ile, Leu, Val), aromatic amino acids (Phe, Tyr, Trp), acidic amino acids (Asp, Glu), basic amino acids (His, Lys, Arg, Gln, Asn) ) and sulfur-containing amino acids (Cys, Met). Deletion of amino acids is preferably located in a region not directly involved in the activity of BrZHD10 of the present invention. In addition, the scope of the functional equivalent includes protein derivatives in which some chemical structures of proteins are modified while maintaining the basic backbone of BrZHD10 and its physiological activity. For example, fusion proteins made by fusion with other proteins such as GFP (Green Fluorescent Protein) while maintaining physiological activity and structural changes to change the stability, storage, volatility or solubility of the protein of the present invention are included therein. .

다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 단백질을 코딩하는 유전자를 제공한다.In another aspect, the present invention provides a gene encoding the protein.

본 발명에서 용어 “상기 단백질을 코딩하는 유전자”는 상기 단백질의 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열을 가진 유전자를 의미한다. 보다 상세하게, 상기 유전자는 서열번호 2의 아미노산 서열을 가지는 내염성 관련 단백질을 코딩하는 유전자로, 서열번호 1의 염기서열을 가지는 BrZHD10 (Brassica rapa zinc-finger homeodomain protein 10) 유전자이며, 배추(Brassica rapa)에서 유래되었다. 또한 식물체에 고염 스트레스를 가할 경우 BrZHD10 유전자의 발현이 증가하며, 상기 유전자의 발현을 증가시킬 경우 이러한 고염 스트레스들에 대한 내성이 증가함을 확인되어, 상기 유전자는 식물체의 내염성에 관여함을 확인하였다.As used herein, the term “gene encoding the protein” refers to a gene having a nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of the protein. More specifically, the gene is a gene encoding a salt resistance-related protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, a BrZHD10 ( Brassica rapa zinc-finger homeodomain protein 10) gene having the base sequence of SEQ ID NO: 1, and Chinese cabbage (Brassica rapa) ) is derived from In addition, when high salt stress was applied to the plant, the expression of the BrZHD10 gene increased, and when the expression of the gene was increased, it was confirmed that the tolerance to these high salt stresses was increased, and it was confirmed that the gene is involved in the salt tolerance of the plant. .

상기 BrZHD10 유전자는 서열번호 1의 염기서열에 한정되지 않으며, 기능적으로 균등한 코돈 또는 동일한 아미노산을 코딩하는 코돈, 또는 생물학적으로 균등한 아미노산을 코딩하는 코돈을 포함하는 염기서열을 포함한다. 생물학적으로 균등 활성을 갖는 변이를 고려한다면, 본 발명에서 이용되는 염기서열은 서열목록에 기재된 서열과 실질적인 동일성(substantial identity)을 나타내는 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기한 본 발명의 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 60%의 상동성, 보다 구체적으로는 70%의 상동성, 보다 더 구체적으로는 80%의 상동성, 가장 구체적으로는 90%의 상동성을 나타내는 서열을 의미한다.The BrZHD10 gene is not limited to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, and includes a functionally equivalent codon or a nucleotide sequence including a codon encoding the same amino acid, or a codon encoding a biologically equivalent amino acid. Considering mutations having biologically equivalent activity, the nucleotide sequence used in the present invention is interpreted to include a sequence showing substantial identity to the sequence described in the sequence listing. The substantial identity is at least 60% when the sequence of the present invention and any other sequences are aligned as much as possible, and the aligned sequence is analyzed using an algorithm commonly used in the art. It means a sequence that exhibits homology, more specifically 70% homology, even more specifically 80% homology, and most specifically 90% homology.

본 발명의 일실시예에 따르면, 먼저 배추 유래 신규 내염성 관련 유전자를 동정하기 위해 "Brassica rapa EST 정보"를 활용하여, cDNA 클론이 완전장 (full-ORF)을 포함하고 있으며 특이적 발현을 나타내고 애기장대 유전자들과 유사성이 낮은 약 300개의 배추 고유 유전자 중에서 BrZHD10을 선발하고, 염기서열 분석 결과 서열번호 1의 염기서열을 가지는 것을 확인하였다. 또한, 확인된 염기서열을 바탕으로 아미노산 서열을 분석한 결과 단백질 합성을 위한 ATG 시작 코돈부터 TAA 종결코돈까지 약 955개의 염기로부터 번역된 317개의 폴리펩티드(서열번호 2)를 가지고 있으며 ZF-HD dimerisation (ZF-HD dimer)과 Homeobox domain ZF-HD class (Homeo_ZF_HD)의 motif를 갖고 있는 Brassica rapa ZHD10 유전자 (Genebank ID XM_009141674.2)에 의해 코딩되는 단백질로 확인되어, 배추(Brassica rapa) 로부터 분리된 내염성 유전자 BrZHD10 (Brassica rapa zinc-finger homeodomain protein 10)로 명명하였다. According to one embodiment of the present invention, first, by utilizing "Brassica rapa EST information" to identify a novel inflammatory resistance-related gene derived from Chinese cabbage, the cDNA clone contains a full-ORF and exhibits specific expression. BrZHD10 was selected from about 300 Chinese cabbage-specific genes with low similarity to thaliana genes, and as a result of nucleotide sequence analysis, it was confirmed that it has the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1. In addition, as a result of analyzing the amino acid sequence based on the identified nucleotide sequence, it has 317 polypeptides (SEQ ID NO: 2) translated from about 955 bases from the ATG start codon to the TAA stop codon for protein synthesis, and ZF-HD dimerisation ( ZF-HD dimer) and the Brassica rapa ZHD10 gene (Genebank ID XM_009141674.2) having a motif of the Homeobox domain ZF-HD class (Homeo_ZF_HD) was identified as a protein encoded, and a tolerant gene isolated from Chinese cabbage ( Brassica rapa ) It was named BrZHD10 ( Brassica rapa zinc-finger homeodomain protein 10).

또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 내염성 BrZHD10 (Brassica rapa zinc-finger homeodomain protein 10) 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다. As another aspect, the present invention provides a recombinant vector comprising a salt-resistant BrZHD10 (Brassica rapa zinc-finger homeodomain protein 10) gene consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1.

본 발명에서 상기 재조합 벡터는 형질전환용 재조합 벡터를 포함한다. 또한, 본 발명의 상기 재조합 벡터는 내염성을 증진시키는 재조합 벡터일 수 있다.In the present invention, the recombinant vector includes a recombinant vector for transformation. In addition, the recombinant vector of the present invention may be a recombinant vector that enhances salt resistance.

본 발명에서 용어 “재조합”은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호화된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로서 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.As used herein, the term “recombinant” refers to a cell in which a cell replicates a heterologous nucleic acid, expresses the nucleic acid, or expresses a peptide, a heterologous peptide, or a protein encoded by the heterologous nucleic acid. Recombinant cells can express genes or gene segments not found in the native form of the cell, either in sense or antisense form. Recombinant cells can also express genes found in cells in a natural state, but the genes are modified and re-introduced into cells by artificial means.

본 발명에서 "형질전환용 재조합 벡터"란 유전자 삽입물이 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 제작물로, 플라스미드 벡터, 코스미드 벡터, 박테리오파지 벡터 및 바이러스 벡터 등을 포함한 통상의 모든 벡터를 포함한다.In the present invention, the term "recombinant vector for transformation" refers to a gene construct including essential regulatory elements operably linked to express a gene insert, and includes all common vectors including plasmid vectors, cosmid vectors, bacteriophage vectors, and viral vectors. include

본 발명의 "형질전환용 재조합 벡터"는 상기 BrZHD10 (Brassica rapa zinc-finger homeodomain protein 10) 유전자가 발현될 수 있도록, 발현조절 서열과 기능적으로 연결되어 있다. 예를 들어, 벡터는 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널, 인핸서 같은 발현 조절 요소 외에도 막 표적화 또는 분비를 위한 신호서열 또는 리더 서열을 포함하며 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다. 또한, 벡터는 선택성 마커를 포함할 수 있으며, 벡터는 자가 복제하거나 숙주 DNA에 통합될 수 있다. 본 발명의 벡터는 당해 기술 분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술 분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을 사용한다.The "recombinant vector for transformation" of the present invention is functionally linked to an expression control sequence so that the BrZHD10 (Brassica rapa zinc-finger homeodomain protein 10) gene can be expressed. For example, the vector includes a signal sequence or leader sequence for membrane targeting or secretion in addition to expression control elements such as a promoter, operator, initiation codon, stop codon, polyadenylation signal, and enhancer, and may be prepared in various ways depending on the purpose. . In addition, the vector may include a selectable marker, and the vector may be self-replicating or integrated into host DNA. The vector of the present invention can be prepared using a genetic recombination technique well known in the art, and site-specific DNA cleavage and ligation are performed using enzymes generally known in the art.

본 발명의 일 실시예에서는, p35 프로모터와 Bar 유전자를 포함하고 있는 pB2GW7 벡터에 BrZHD10 유전자를 삽입하여 재조합 벡터를 제조하였다. In an embodiment of the present invention, a recombinant vector was prepared by inserting the BrZHD10 gene into the pB2GW7 vector containing the p35 promoter and the Bar gene.

또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 유전자 또는 재조합 벡터로 형질전환된 식물체를 제공한다.As another aspect, the present invention provides a plant transformed with the gene or recombinant vector.

본 발명에서 용어 "형질전환"은, 유전물질인 DNA를 다른 계통의 살아 있는 세포에 주입했을 때, DNA가 그 세포에 들어가 유전형질(遺傳形質)을 변화시키는 현상으로, 형질변환, 형전환, 또는 형변환 이라고도 한다.As used herein, the term "transformation" refers to a phenomenon in which DNA enters the cell and changes the genetic trait when DNA, which is a genetic material, is injected into a living cell of another lineage. Also called conversion.

본 발명에서 상기 벡터로 식물체를 "형질전환"하는 것은 당업자에게 공지된 형질전환기술에 의해 수행될 수 있다. 구체적으로는, 아그로박테리움을 이용한 형질전환방법, 미세사출법(microprojectile bombardment), 일렉트로포레이션(electroporation), PEG-매개 융합법(PEG-mediated fusion), 미세주입법(microinjection), 리포좀 매개법(liposome-mediated method), 인-플란타 형질전환법(In planta transformation), 진공 침윤법(Vacuum infiltration method), 화아침지법(floral meristem dipping method), 및 아그로박테리아 분사법(Agrobacterium spraying method)을 이용할 수 있으며, 더 구체적으로는 아그로박테리움을 이용한 형질전환방법 또는 아그로박테리아 분사법(Agrobacterium spraying method)을 이용할 수 있다.In the present invention, "transformation" of a plant with the vector can be performed by transformation techniques known to those skilled in the art. Specifically, transformation method using Agrobacterium, microprojectile bombardment, electroporation, PEG-mediated fusion, microinjection, liposome-mediated method ( liposome-mediated method, In planta transformation, Vacuum infiltration method, floral meristem dipping method, and Agrobacterium spraying method. Can be, and more specifically, a transformation method using Agrobacterium or Agrobacterium spraying method may be used.

본 발명에서 용어 "식물체"는, 성숙한 식물체뿐만 아니라 성숙한 식물로 발육할 있는 식물 세포, 식물 조직 및 식물의 종자 등을 모두 포함하는 의미이다. In the present invention, the term "plant" is meant to include not only mature plants, but also plant cells, plant tissues, and seeds of plants that can develop into mature plants.

본 발명에서 상기 식물체는 특별히 제한되지 않으며, 일례로서 벼, 밀, 보리, 옥수수, 콩, 감자, 밀, 팥, 귀리 또는 수수를 포함하는 식량 작물류; 애기장대, 배추, 무, 고추, 딸기, 토마토, 수박, 오이, 양배추, 참외, 호박, 파, 양파 또는 당근을 포함하는 채소 작물류; 인삼, 담배, 목화, 참깨, 사탕수수, 사탕무우, 들깨, 땅콩 또는 유채를 포함하는 특용작물류; 사과나무, 배나무, 대추나무, 복숭아, 양다래, 포도, 감귤, 감, 자두, 살구 또는 바나나를 포함하는 과수류; 장미, 글라디올러스, 거베라, 카네이션, 국화, 백합 또는 튤립을 포함하는 화훼류; 및 라이그라스, 레드클로버, 오차드그라스, 알파알파, 톨페스큐 또는 페레니얼라이그라스를 포함하는 사료작물류로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나이며, 구체적으로는 애기장대, 배추, 무, 고추, 딸기, 토마토, 수박, 오이, 양배추, 참외, 호박, 파, 양파 또는 당근을 포함하는 채소 작물류이며, 더욱 구체적으로는 애기장대이나, 이에 제한되지 않는다.In the present invention, the plant is not particularly limited, and as an example, food crops including rice, wheat, barley, corn, soybean, potato, wheat, red bean, oat or sorghum; vegetable crops including Arabidopsis thaliana, Chinese cabbage, radish, red pepper, strawberry, tomato, watermelon, cucumber, cabbage, melon, pumpkin, green onion, onion or carrot; special crops including ginseng, tobacco, cotton, sesame, sugar cane, sugar beet, perilla, peanut or rapeseed; fruit trees, including apple trees, pear trees, jujube trees, peaches, poplars, grapes, tangerines, persimmons, plums, apricots or bananas; flowers including roses, gladiolus, gerberas, carnations, chrysanthemums, lilies or tulips; And ryegrass, red clover, orchard grass, alpha alpha, tall fescue or any one selected from the group consisting of forage crops including perennial ryegrass, specifically Arabidopsis thaliana, Chinese cabbage, radish, red pepper, strawberry, tomato, watermelon , cucumber, cabbage, melon, pumpkin, green onion, onion or carrot, and more specifically Arabidopsis thaliana, but is not limited thereto.

본 발명에서 상기 식물체는 BrZHD10 유전자 또는 이의 단백질을 발현하므로, 상기 BrZHD10 유전자를 도입함으로써 식물체에 존재하는 BrZHD10의 발현을 증진시킬 수 있다.In the present invention, since the plant expresses the BrZHD10 gene or a protein thereof, the expression of BrZHD10 present in the plant can be enhanced by introducing the BrZHD10 gene.

본 발명의 일실험예에 따르면, 배추 유래의 BrZHD10 유전자가 과발현된 애기장대의 형질전환체를 제작하기 위하여 아그로박테리움 투마파시엔(Agrobacterium tumefaciens)을 사용하여, 애기장대의 형질전환체를 제작하였다. 애기장대 형질전환체를 T3 세대까지 진전시켜 호모계통을 육성하여 125 mM NaCl이 들어있는 1/2 MS 배지에서 종자를 발아시켜 내염성 정도를 백화현상과 생존율로 조사한 결과 형질전환체에서 백화 현상이 감소하였으며, 생존율이 증가된 것을 확인하였다(도 6).According to an experimental example of the present invention, Agrobacterium tumefaciens was used to prepare a transformant of Arabidopsis in which the BrZHD10 gene derived from Chinese cabbage was overexpressed, to prepare a transformant of Arabidopsis. . By advancing Arabidopsis transformants to the T3 generation, cultivating homo lines, germinating seeds in 1/2 MS medium containing 125 mM NaCl, and investigating the degree of salt tolerance by efflorescence and viability. As a result, efflorescence was reduced in transformants. and it was confirmed that the survival rate was increased (FIG. 6).

또한, 내염성 배지에서 뿌리 길이 생장을 유묘 생장 12일 동안 측정한 결과, 비형질전환체와 달리, 형질전환체 뿌리가 정상적으로 생장하는 것을 확인하였으며, 형질전환체의 주근은 정상적으로 생장하였으며, 주근으로부터 발생된 측근의 수는 5-6개로 정상적으로 발생하는 것을 확인하여, 고염 조건의 배지에서 성장한 형질전환된 애기장대는 BrZHD10 유전자 도입에 의해 내염성이 증가하는 것을 확인하였다(도 7). In addition, as a result of measuring the root length growth in the salt-resistant medium for 12 days of seedling growth, it was confirmed that the transformant roots grew normally, unlike the non-transformants. It was confirmed that the number of entourage was normally 5-6, and it was confirmed that the transformed Arabidopsis thaliana grown in a medium under high salt conditions had increased salt resistance by introduction of the BrZHD10 gene (FIG. 7).

또한, 고염 농도의 토양에서 형질전환 애기장대의 내염성을 분석한 결과, 형질전환체의 생존률이 약 89%로 비형질전환체보다 높은 것을 확인하였다(도 8). In addition, as a result of analyzing the tolerance of transgenic Arabidopsis in soil with a high salt concentration, it was confirmed that the survival rate of the transformants was about 89%, which was higher than that of the non-transformants ( FIG. 8 ).

상기의 결과를 통해, 본 발명의 형질전환된 식물체는 내염성 유전자인 BrZHD10 유전자의 세포 내 발현 수준을 증가시켜, 염류 농도가 높은 환경에서 염 스트레스에 대한 내성이 탁월하여 고염 조건에 적응성이 뛰어난 신기능 작물로 유용하게 이용될 수 있음을 확인하였다.Through the above results, the transformed plant of the present invention increases the intracellular expression level of the BrZHD10 gene, which is a salt tolerance gene, and has excellent resistance to salt stress in an environment with high salt concentration. It was confirmed that it can be usefully used as

또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 내염성 BrZHD10 단백질을 코딩하는 유전자 또는 서열번호 1의 염기서열로 이루어지는 내염성 BrZHD10 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제조하는 단계; 및 상기 벡터를 식물체에 형질전환시키는 단계를 포함하는, 내염성이 증진된 형질전환 식물체의 제조방법을 제공한다. As another aspect, the present invention provides a method for preparing a recombinant vector comprising a gene encoding the flame-resistant BrZHD10 protein or a flame-resistant BrZHD10 gene comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1; And it provides a method for producing a transgenic plant with enhanced salt tolerance, comprising the step of transforming the vector into the plant.

본 발명에서, 상기 "BrZHD10 유전자", "재조합 벡터", "식물체", "내염성"에 대한 설명은 전술한 바와 같다.In the present invention, the descriptions of the "BrZHD10 gene", "recombinant vector", "plant", and "salt resistance" are the same as described above.

본 발명은 상기 BrZHD10 단백질을 코딩하는 유전자 또는 서열번호 1의 염기서열로 이루어지는 내염성 BrZHD10 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제조하고, 이를 식물체에 형질전환시켜, 내염성이 증진된 형질전환 식물체의 제조가 가능하다. The present invention prepares a recombinant vector containing the salt-tolerant BrZHD10 gene consisting of the gene encoding the BrZHD10 protein or the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, and transforms the plant, so that it is possible to produce a transgenic plant with improved salt resistance. .

또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 BrZHD10 단백질을 코딩하는 유전자 또는 재조합 벡터를 식물체에 도입하는 단계를 포함하는, 식물체의 내염성을 증진시키는 방법을 제공한다. As another aspect, the present invention provides a method for enhancing the salt tolerance of a plant, comprising introducing a gene or a recombinant vector encoding the BrZHD10 protein into the plant.

본 발명에서 용어 "BrZHD10 유전자", "재조합 벡터", "식물체", "내염성"에 대한 설명은 전술한 바와 같다.In the present invention, the terms "BrZHD10 gene", "recombinant vector", "plant", and "salt resistance" are the same as described above.

본 발명에서 용어 "유전자를 식물체에 도입하는 단계"는 특정 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터를 제작하고, 그 재조합 벡터를 식물체에 형질전환시키는 단계를 의미한다. In the present invention, the term "introducing a gene into a plant" refers to a step of preparing a recombinant vector including a polynucleotide having a specific nucleotide sequence and transforming the recombinant vector into a plant.

구체적으로 본 발명에서는, BrZHD10 유전자를 삽입하여 형질전환용 재조합 벡터 pB2GW7/BrZHD10를 제작하고, 아그로박테리움 투마파시엔(Agrobacterium tumefaciens)을 사용하여, 애기장대의 형질전환체를 제작하였으며, 상기 BrZHD10 유전자 도입에 의해 식물체의 내염성이 증진되는 것을 확인하였다.Specifically, in the present invention, a recombinant vector pB2GW7/BrZHD10 for transformation was prepared by inserting the BrZHD10 gene, and using Agrobacterium tumefaciens, a transformant of Arabidopsis was prepared, and the BrZHD10 gene It was confirmed that the salt resistance of the plant was improved by the introduction.

본 발명에서 용어 "내염성 증진"은 본 발명에서 대조군 식물과 비교하여 적어도 5% 또는 10%, 구체적으로는 적어도 20% 또는 40%, 더욱 바람직하게는 50%, 60%, 70% 또는 80% 이상의 내염성을 의미하며, 식물이 원래 가지고 있는 내염성 활성에 비해 상기 유전자의 발현을 증진하여 내염성이 증가되는 것을 의미한다.The term "increased salt tolerance" in the present invention refers to at least 5% or 10%, specifically at least 20% or 40%, more preferably 50%, 60%, 70% or 80% or more compared to the control plant in the present invention. It means salt resistance, and it means that salt resistance is increased by enhancing the expression of the gene compared to the original salt resistance activity of plants.

본 발명에 의하면, 상기 BrZHD10 유전자의 발현이 증진되는 경우, 식물체의 내염성이 증진되므로, 식물체의 내염성을 증진시키기 위하여, 전술한 바와 같이 BrZHD10 유전자의 발현을 증진하는 형질전환용 벡터를 이용하여, 식물체를 형질전환하거나 또는 다른 인위적인 물질의 처리에 의해 상기 유전자의 발현을 증진시켜 식물체의 내염성을 증진시키는 것도 가능하며, 이에 제한되지 않는다.According to the present invention, when the expression of the BrZHD10 gene is enhanced, since the salt tolerance of the plant is enhanced, in order to enhance the salt tolerance of the plant, a transformation vector that promotes the expression of the BrZHD10 gene as described above is used. It is also possible to enhance the salt tolerance of plants by transforming or enhancing the expression of the gene by treatment with other artificial substances, but is not limited thereto.

본 발명은 내염성 BrZHD10 (zinc-finger homeodomain protein 10) 단백질, 내염성 BrZHD10 (zinc-finger homeodomain protein 10) 유전자, 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터로 형질전환된 식물체, 내염성이 증진된 형질전환 식물체의 제조방법 및 식물체의 내염성을 증진시키는 방법에 관한 것이다. The present invention relates to a salt-resistant BrZHD10 (zinc-finger homeodomain protein 10) protein, a salt-resistant BrZHD10 (zinc-finger homeodomain protein 10) gene, a recombinant vector including the gene, a plant transformed with the recombinant vector, and a transformation with improved salt resistance It relates to a method for producing a plant and a method for enhancing the salt tolerance of a plant.

본 발명에 따르면, 배추로부터 분리된 zinc-finger homeodomain protein 10 (BrZHD10) 유전자는 내염성에 대한 저항 효과에 있어, 염류 농도가 높은 환경에서 염 스트레스에 대한 내성이 탁월하여 고염 조건에 적응성이 뛰어난 신기능 작물로 유용하게 이용될 수 있다.According to the present invention, the zinc-finger homeodomain protein 10 (BrZHD10) gene isolated from Chinese cabbage has excellent resistance to salt stress in an environment with high salt concentration in terms of resistance to salt tolerance, so it is a new functional crop with excellent adaptability to high salt conditions. can be usefully used as

도 1은 배추 BrZHD10 유전자를 포함하고 있는 식물 형질전환 벡터를 나타낸다. 35SP: CaMV 35S 프로모터, B288: BrZHD10, T35S: CaMV 35S 터미네이터, Bar: 제초제 저항성 유전자.
도 2는 배추 BrZHD10 유전자 염기서열(서열번호 1)과 이에 의해 코딩되는 아미노산 서열(서열번호 2)을 나타낸다.
도 3은 배추 BrZHD10과 ZHD10을 포함하는 작물 6종 아미노산 서열의 상동성 분석을 나타낸다. B288: B. rapa ZHD10 (XM_009141674.2), BnZHD10: B. napus ZHD10 (XP_022573783.1), BoZHD10: B. oleracea ZHD10 (XP_013631916.1), RsZHD10: R. sativus ZHD10 (XP_018478475.1), EsZHD10: E. salsugineum ZHD10 (XP_006405598.1), AlZHD10: A. lyrata ZHD10 (XP_020872961.1), AtZHD10: A. thaliana ZHD10 (OAO93865.1).
도 4는 환경스트레스 조건, 150 mM NaCl (고염), 2.5% PEG (건조), 37℃ (고온), 4℃ (저온)에 대한 BrZDH10 유전자 발현 분석을 나타낸다.
도 5는 형질전환체에서 Genomic DNA PCR로 유전자 도입을 확인한 결과이다. M: 마커, Wt: 비형질전환체, #1, #2, #3: 형질전환체.
도 6은 BrZHD10 형질전환 애기장대 내염성 검정 결과이다. A, 125 mM NaCl에서 BrZHD10 형질전환체 내염성 반응, Wt: 비형질전환체, #1-2-1, #3-3-3, #4-8-1: 형질전환체. B, 125 mM NaCl에서 형질전환체 백화현상 정도. C, 125 mM NaCl에서 식물체 생존율. Wt: 비형질전환체, #1, #2, #3: 형질전환체.
도 7은 내염성 배지에서 BrZHD10 형질전환 애기장대의 뿌리 생장을 나타낸다. A, 125 mM NaCl이 첨가된 배지에서 형질전환체 뿌리 생장 반응. B, 125 mM NaCl 배지에서 12일 유묘 생장 동안 형질전환체 주근의 길이 비교. C, 125 mM NaCl 배지에서 형질전환체 발생 측근수 비교. Wt: 비형질전환체, #1, #2, #3: 형질전환체.
도 8은 염처리 토양에서 형질전환체의 내염성 검정 결과이다. Wt: 비형질전환체, #1-2-1, #3-3-3, #4-8-1: 형질전환체.
도 9는 내염성을 나타내는 형질전환체에서 내염성 관련 유전자 발현을 확인한 결과이다. B288: BrZHD10, SOS1: salt overly sensitive1, HKT1: High-affinity K+ transporter 1, ABA1: ABA deficient 1, ABI1: ABA-insensitive1, FRY1: Fiery1, HOS1: High expression of osmotically responsive gene 1, SAD1: supersensitive to abscisic acid and drought 1. DREB2A: dehydration-responsive element-binding protein 2A, AtActin, Arabidopsis actin. Wt: 비형질전환체, #1, #2, #3: 형질전환체.1 shows a plant transformation vector containing a Chinese cabbage BrZHD10 gene. 35SP: CaMV 35S promoter, B288: BrZHD10, T35S: CaMV 35S terminator, Bar: herbicide resistance gene.
Figure 2 shows the Chinese cabbage BrZHD10 gene base sequence (SEQ ID NO: 1) and the amino acid sequence (SEQ ID NO: 2) encoded thereby.
3 shows the homology analysis of amino acid sequences of 6 crops including Chinese cabbage BrZHD10 and ZHD10. B288: B. rapa ZHD10 (XM_009141674.2), BnZHD10: B. napus ZHD10 (XP_022573783.1), BoZHD10: B. oleracea ZHD10 (XP_013631916.1), RsZHD10: R. sativus ZHD10 (XP_018478475.1), EsZHD10: E. salsugineum ZHD10 (XP_006405598.1), AlZHD10: A. lyrata ZHD10 (XP_020872961.1), AtZHD10: A. thaliana ZHD10 (OAO93865.1).
4 shows the analysis of BrZDH10 gene expression for environmental stress conditions, 150 mM NaCl (high salt), 2.5% PEG (dry), 37°C (high temperature), and 4°C (low temperature).
5 is a result confirming the gene introduction by genomic DNA PCR in the transformant. M: marker, Wt: non-transformant, #1, #2, #3: transformant.
6 is a result of BrZHD10 transgenic Arabidopsis tolerance assay. A, Salt tolerance reaction of BrZHD10 transformants in 125 mM NaCl, Wt: non-transformants, #1-2-1, #3-3-3, #4-8-1: transformants. B, Degree of whitening of transformants in 125 mM NaCl. C, Plant viability in 125 mM NaCl. Wt: non-transformants, #1, #2, #3: transformants.
7 shows the root growth of BrZHD10 transformed Arabidopsis thaliana in a salt-resistant medium. A, Transformant root growth reaction in a medium supplemented with 125 mM NaCl. B, Comparison of the length of the transformant main root during 12 days of seedling growth in 125 mM NaCl medium. C, Comparison of the number of lateral roots of transformants in 125 mM NaCl medium. Wt: non-transformants, #1, #2, #3: transformants.
8 is a result of a salt tolerance test of transformants in salt-treated soil. Wt: non-transformants, #1-2-1, #3-3-3, #4-8-1: transformants.
9 is a result of confirming the expression of the genes related to the flame resistance in the transformant showing the resistance. B288: BrZHD10, SOS1: salt overly sensitive1, HKT1: High-affinity K+ transporter 1, ABA1: ABA deficient 1, ABI1: ABA-insensitive1, FRY1: Fiery1, HOS1: High expression of osmotically responsive gene 1, SAD1: supersensitive to abscisic acid and drought 1. DREB2A: dehydration-responsive element-binding protein 2A, AtActin, Arabidopsis actin. Wt: non-transformants, #1, #2, #3: transformants.

이하, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본 발명의 실시예에 대하여 첨부한 도면을 참고로 하여 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다. Hereinafter, embodiments of the present invention will be described in detail with reference to the accompanying drawings so that those of ordinary skill in the art can easily carry out the present invention. However, the present invention may be embodied in many different forms and is not limited to the embodiments described herein.

<실시예 1> 배추로부터 zinc-finger homeodomain protein 10 (BrZHD10) 유전자 분리<Example 1> Zinc-finger homeodomain protein 10 (BrZHD10) gene isolation from Chinese cabbage

배추 생장발달 및 환경, 스트레스 처리 후에 유전자 은행을 제작하였다. 이로부터 구축된 EST 정보로부터 cDNA 클론이 완전장 (full-ORF)을 포함하고 있으며, 특이적 발현을 나타내고, 애기장대 유전자들과 유사성이 낮은 약 300개의 배추 고유 유전자 중에서 BrZHD10을 선발하였다. After the growth and development of Chinese cabbage, the environment and stress treatment, a gene bank was prepared. From the EST information constructed therefrom, the cDNA clone contains full-ORF, shows specific expression, and BrZHD10 was selected from about 300 Chinese cabbage native genes with low similarity to Arabidopsis genes.

<실시예 2> 환경스트레스에 대한 발현 분석<Example 2> Expression analysis for environmental stress

BrZHD10 유전자의 고염, 건조, 고온, 저온 등의 환경스트레스에 대한 발현 분석을 연구하기 위해 표면 살균한 배추 종자를 MS 배지에 50 립을 파종하였다. 고염과 건조는 각각 3주 생장한 배추를 150 mM NaCl (고염 조건), 2.5% PEG(건조 조건)가 포함된 1/2 MS 액체 배지(1/2MS salts, 1% Sucrose)에 옮긴 후 30 분, 3시간, 6시간, 12시간, 24시간 간격으로 시료를 채취하였다. 또한, 고온과 저온 처리는 3주간 배양된 배추를 37℃와 4℃ 생장상에 옮겨 30분, 3시간, 6시간, 12시간, 24시간 간격으로 시료를 채취하여 발현분석에 사용하였다. In order to study the expression analysis of the BrZHD10 gene for environmental stress such as high salt, dryness, high temperature, and low temperature, 50 seeds of surface sterilized Chinese cabbage were sown in MS medium. For high salt and drying, transfer Chinese cabbage grown for 3 weeks to 150 mM NaCl (high salt condition) and 2.5% PEG (dry condition) in 1/2 MS liquid medium (1/2MS salts, 1% Sucrose) for 30 minutes , samples were collected at intervals of 3 hours, 6 hours, 12 hours, and 24 hours. In addition, high-temperature and low-temperature treatment was carried out by transferring the Chinese cabbage cultured for 3 weeks to 37°C and 4°C growth phase, collecting samples at intervals of 30 minutes, 3 hours, 6 hours, 12 hours, and 24 hours, and used for expression analysis.

유전자 발현을 확인하기 위해 액체질소에 얼린 시료를 막자사발로 마쇄하였다. 마쇄한 시료로부터 Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)을 이용해서 total RNA를 분리 하였다. Semi-quantitative RT-PCR 분석을 위해 역전사 효소(MMLV transcriptase RNase free, Toyobo)를 이용하여 total RNA 2 μg을 cDNA 라이브러리로 제작하고 3배 희석하여 2 μl를 PCR 증폭에 사용하였다. To check gene expression, samples frozen in liquid nitrogen were ground with a mortar. Total RNA was isolated from the ground sample using Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). For semi-quantitative RT-PCR analysis, 2 μg of total RNA was prepared as a cDNA library using reverse transcriptase (MMLV transcriptase RNase free, Toyobo), diluted 3-fold, and 2 μl was used for PCR amplification.

유전자 특이 프라이머(B288F: 5'-ATGGATATGGCGACTCATACAACAA-3, B288R: 5'- TCACGACGACGACGACCCGTTTACG-3')를 이용하여 PCR (95℃에서 3분 1 사이클, 95℃에서 30초, 55℃에서 30초, 72℃에서 45초, 25 사이클, 72℃ 10분 1 사이클 조건)로 식물체내에서 환경스트레스에 대한 BrZHD10 유전자 발현을 확인하였다. Semi-quantitative RT-PCR 결과로부터 Quantity One (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)과 GelQuant.NET (http://biochemlabsolutions.com/GelQuantNET.html)을 이용하여 상대적 발현 수준을 측정하였으며 모든 실험은 3회 반복으로 수행하였다.PCR using gene-specific primers (B288F: 5'-ATGGATATGGCGACTCATACAACAA-3, B288R: 5'-TCACGACGACGACGACCCGTTTACG-3') at 95°C for 3 minutes 1 cycle, at 95°C for 30 seconds, at 55°C for 30 seconds, 72°C BrZHD10 gene expression for environmental stress was confirmed in plants under 45 seconds, 25 cycles, and 72 ° C. for 10 minutes 1 cycle). From semi-quantitative RT-PCR results, relative expression levels were measured using Quantity One (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) and GelQuant.NET (http://biochemlabsolutions.com/GelQuantNET.html). All experiments were 3 repetitions were performed.

B288F 프라이머: 5'- ATGGATATGGCGACTCATACAACAA-3'(서열번호 3)B288F Primer: 5'-ATGGATATGGCGACTCATACAACAA-3' (SEQ ID NO: 3)

B288R 프라이머: 5'- TCACGACGACGACGACCCGTTTACG-3'(서열번호 4)B288R Primer: 5'-TCACGACGACGACGACCCGTTTACG-3' (SEQ ID NO: 4)

<실시예 3> BrZHD10 유전자 재조합 벡터 제조 및 아그로박테리움 형질전환<Example 3> BrZHD10 gene recombinant vector preparation and Agrobacterium transformation

3-1. 형질전환용 벡터 제작3-1. Transformation vector production

게이트웨이 시스템을 이용해서 선발된 BrZHD10 유전자를 포함한 식물 형질전환용 벡터를 제작하였다. 최종운반체(pB2GW7)에 삽입하기 위해 필요한 특정 서열(attB sequence)은 PCR을 통해서 얻었다. 위치 특이 재조합(site-specific recombination)을 위해 유전자에 부가적으로 삽입되어야 할 서열의 길이는 29bp로 PCR의 효율을 높이기 위하여 이 서열의 일부(12bp)만을 gene specific sequence (GSP)에 overhang으로 달아 첫 번째 PCR을 시행하였다. A vector for plant transformation including the BrZHD10 gene selected using the gateway system was constructed. The specific sequence (attB sequence) required for insertion into the final carrier (pB2GW7) was obtained through PCR. The length of the sequence to be additionally inserted into the gene for site-specific recombination is 29 bp. In order to increase the efficiency of PCR, only a part of this sequence (12 bp) is added as an overhang to the gene specific sequence (GSP). Second PCR was performed.

첫 번째 PCR은 B288B1 프라이머(5'-AAAAAGCAGGCTCCACGCGTTGGGAGCTCTCCC-3') 및 B288B2 프라이머 (5'-AGAAAGCTGGGTCATGGCGGCCGCGGGAATTC-3')를 이용하여 95℃ 2분; 94℃ 30초, 60℃ 30초, 68℃ 1분의 10회; 및 68℃ 10분의 조건으로 수행하였다. The first PCR was performed using primers B288B1 (5'-AAAAAGCAGGCTCCACGCGTTGGGAGCTCTCCC-3') and primer B288B2 (5'-AGAAAGCTGGGTCATGGCGGCCGCGGGAATTC-3') at 95°C for 2 minutes; 94°C for 30 seconds, 60°C for 30 seconds, 68°C 10 times per minute; and 68°C for 10 minutes.

B288B1프라이머: 5'-AAAAAGCAGGCTCCACGCGTTGGGAGCTCTCCC-3'(서열번호 5) B288B1 Primer: 5'-AAAAAGCAGGCTCCACGCGTTGGGAGCTCTCCC-3' (SEQ ID NO: 5)

B288B2 프라이머: 5'-AGAAAGCTGGGTCATGGCGGCCGCGGGAATTC-3'(서열번호 6)B288B2 Primer: 5'-AGAAAGCTGGGTCATGGCGGCCGCGGGAATTC-3' (SEQ ID NO: 6)

이 PCR 반응액의 1/10을 취해 다시 전체 재조합 서열을 갖는 attB1(5'-ACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT-3')과 attB2(5'-ACCCAGCTTTCTTGTACAAAGTGGT-3')를 프라이머로 이용하여 95℃ 2분;94℃ 30초, 45℃ 30초, 68℃ 1분의 5회; 94℃ 30초, 55℃ 30초, 68℃ 1분의 25회; 및 68℃ 10분의 조건으로 두 번째 PCR을 진행하였다. Take 1/10 of this PCR reaction solution and use attB1 (5'-ACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT-3') and attB2 (5'-ACCCAGCTTTCTTGTACAAAGTGGT-3') having the entire recombinant sequence as primers for 2 minutes at 95° C.; 94° C. 30 sec, 45°C 30 seconds, 68°C 5 times a minute; 94°C for 30 seconds, 55°C for 30 seconds, 68°C 25 times per minute; and a second PCR was performed under the conditions of 68° C. for 10 minutes.

attB1 프라이머: 5'-ACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT-3'(서열번호 7)attB1 primer: 5'-ACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT-3' (SEQ ID NO: 7)

attB2 프라이머: 5'-ACCCAGCTTTCTTGTACAAAGTGGT-3'(서열번호 8)attB2 primer: 5'-ACCCAGCTTTCTTGTACAAAGTGGT-3' (SEQ ID NO: 8)

증폭된 PCR 산물은 정제하여 사용하였다. 따라서 이 PCR 산물은 attB 서열을 모두 갖게 되므로, 형질전환용 벡터 제작에 사용하였다. 게이트웨이 시스템은 크게 BP 반응과 LR 반응으로 나눌 수 있는데, attB 서열을 가지고 있는 BrZHD10 유전자의 PCR 산물을 pDNOR 벡터(invitrogen)와 먼저 BP 반응을 시켜 중간 벡터를 만들었고, 이 산물을 최종 운반체와 LR 반응을 하여 원하는 최종 형질전환용 벡터 pB288를 얻었다(도 1).The amplified PCR product was purified and used. Therefore, since this PCR product has all attB sequences, it was used to construct a transformation vector. The gateway system can be largely divided into BP reaction and LR reaction. The PCR product of the BrZHD10 gene having attB sequence was first subjected to a BP reaction with a pDNOR vector (invitrogen) to make an intermediate vector, and this product was used for the final carrier and LR reaction. to obtain the desired final transformation vector pB288 (FIG. 1).

3-2. 아그로박테리움을 이용한 형질전환3-2. Transformation using Agrobacterium

상기 제조된 벡터를 애기장대에 도입하기 위하여 아그로박테리움 투메파시엔스 GV3101(Agrobacterium tumefaciens GV3101)에 냉동/해동을 2-3번 반복한 후, 37℃의 열 쇼크(heat shock) 방법에 의해 형질전환한 후 스펙티노마이신(spectinomycin) 50 ㎎/ℓ, 리팜피신(rifampicin) 50 ㎎/ℓ, 젠타마이신(gentamycin) 25 ㎎/ℓ가 함유된 LB 배지에 접종하여 28 ℃에서 3-4일 정도 배양하였다. 형성된 콜로니 중 형질전환된 콜로니를 다음 실험을 위한 애기장대 형질전환에 사용하였다. 상기에서 형질전환된 아그로박테리움 투메파시엔스 GV3101를 아그로박테리움 GV3101:pB288로 명명하였다.In order to introduce the prepared vector into Arabidopsis thaliana, freezing / thawing was repeated 2-3 times in Agrobacterium tumefaciens GV3101, and then transformed by a heat shock method at 37 ° C. Then, it was inoculated into LB medium containing 50 mg/L of spectinomycin, 50 mg/L of rifampicin, and 25 mg/L of gentamycin, and cultured at 28° C. for 3-4 days. Transformed colonies among the formed colonies were used for Arabidopsis transformation for the next experiment. The transformed Agrobacterium tumefaciens GV3101 was named Agrobacterium GV3101:pB288.

<실시예 4> 애기장대 형질전환<Example 4> Arabidopsis transformation

제조한 pB288 재조합 발현벡터를 포함한 형질전환된 아그로박테리움 GV3101:pB288 균주를 이용하여 야생형 애기장대 Col-0 (Arabidopsis thaliana ecotype Col-0)를 형질전환하기 위해 먼저 애기장대를 파종 후 23℃ 생장상 (16시간 낮/8시간 밤)에서 약 4주간 생육시켰다. 4주된 애기장대 식물체의 일차 추대를 제거한 후 최소한 10 cm의 3-4개의 이차 추대를 유도하였다. To transform wild-type Arabidopsis thaliana ecotype Col-0 using the transformed Agrobacterium GV3101:pB288 strain including the prepared pB288 recombinant expression vector, Arabidopsis thaliana ecotype Col-0 was first sown and then grown at 23°C. (16 hours day / 8 hours night) was grown for about 4 weeks. After removing the primary bolting of a 4-week-old Arabidopsis plant, 3-4 secondary bolting of at least 10 cm was induced.

pB288 벡터로 형질전환된 아그로박테리움 튜메파시엔스 GV3101:pB288 균주를 항생제가 포함된 5㎖의 LB배지에서 48시간 동안 배양한 후 5% sucrose와 0.05% silwet L-77이 함유된 용액에 O.D 0.8 정도로 희석하여 현탁액을 제조하였다. 제조한 현탁액을 애기장대 꽃봉오리에 분사한 후 충분한 습도와 암 조건을 유지한 상태로 24시간 배양한 다음 23℃, 16시간 낮 및 8시간 밤 조건의 생장상에서 3-4일 더 배양시키고 동일한 방법으로 2회 형질전환을 반복하였다. 이 후, 23℃, 16시간 낮 및 8시간 밤 조건의 생장상에서 꼬투리 (silique)가 갈색으로 완전히 성숙할 때까지 약 4-6주간 생육시킨 후 종자를 수확하였다. 수확된 종자를 파종하여 생육 2주째 1차, 4주째 2차로 0.3% 바스타를 살포하여 형질전환체를 선발하고 같은 조건으로 생육시킨 후 후대종자를 확보하였다. 수확한 형질전환 애기장대 종자를 25㎍/㎖ 포스피노트로신 (DL-phophinothricin)이 포함된 MS배지에 파종하여 멘델의 유전법칙에 의한 잡종 제 2대의 분리비가 약 3 (항생제 저항): 1 (항생제 민감)로 나타나는 형질전환체를 선발하여 다음의 실험에 사용하였다. After culturing the Agrobacterium tumefaciens GV3101:pB288 strain transformed with the pB288 vector in 5 ml of LB medium containing antibiotics for 48 hours, OD 0.8 in a solution containing 5% sucrose and 0.05% silwet L-77 A suspension was prepared by dilution. After spraying the prepared suspension on Arabidopsis thaliana buds, incubate for 24 hours while maintaining sufficient humidity and dark conditions, then incubate for another 3-4 days at 23°C, 16 hours daytime and 8 hours night conditions, and cultured for another 3-4 days. Transformation was repeated twice. Thereafter, the seeds were harvested after growing for about 4-6 weeks until the silique was completely browned and matured on a growth phase of 23° C., 16 hours day and 8 hours night. After sowing the harvested seeds, the transformants were selected by spraying 0.3% basta in the first two weeks of growth and the second in the fourth week of growth, and then grown under the same conditions, and progeny seeds were secured. The harvested transgenic Arabidopsis seeds were sown in MS medium containing 25 μg/ml phosphinothricin, and the separation ratio of the second hybrid according to Mendel's law of inheritance was about 3 (antibiotic resistance): 1 (Antibiotic-sensitive) transformants were selected and used in the following experiments.

<실시예 5> 애기장대 형질전환체 유전자 도입 및 발현 분석<Example 5> Arabidopsis transformant gene introduction and expression analysis

Genomic DNA PCR과 RT-PCR을 통해 BrZHD10 유전자 삽입 유무와 발현을 각각 확인하였다. Genomic DNA PCR and RT-PCR were used to confirm the presence and absence of BrZHD10 gene insertion and expression, respectively.

형질전환 애기장대 식물체 잎으로부터 genomic DNA를 분리하였다(DNeasy Plant Kit, Qiagene). 분리된 genomic DNA 100 ng을 사용하여 유전자 특이 프라이머 B288F와 B288R을 이용하여 PCR(95℃에서 3분 1 사이클, 95℃에서 30초, 55℃에서 30초, 72℃에서 45초, 35 사이클, 72℃ 10분 1 사이클 조건)로 식물체내 유전자 도입을 확인하였다. Genomic DNA was isolated from the leaves of the transformed Arabidopsis plant (DNeasy Plant Kit, Qiagene). Using 100 ng of isolated genomic DNA, PCR using gene-specific primers B288F and B288R (3 min 1 cycle at 95°C, 30 seconds at 95°C, 30 seconds at 55°C, 45 seconds at 72°C, 35 cycles, 72 ℃ 10 minutes 1 cycle condition) was confirmed to introduce the gene into the plant.

형질전환체에 도입된 유전자 발현을 확인하기 위해 3 주간 재배한 형질전환 애기장대 식물체의 잎을 채취한 후 즉시 액체질소에 얼려 막자사발로 마쇄하였다. 마쇄한 시료로부터 Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)을 이용해서 total RNA를 분리하였다. cDNA 라이브러리로 제작하고 내염성 관련 유전자 특이 프라이머를 이용하여 PCR (95℃에서 3분 1 사이클, 95℃에서 30초, 55℃에서 30초, 72℃에서 45초, 25 사이클, 72℃ 10분 1 사이클 조건)로 유전자 발현을 확인하였고 DNA 염기서열 분석을 통해 도입 유전자 발현을 최종 확인 하였다. Actin 유전자 발현 수준은 정량적 대조군으로 사용되었으며 모든 실험은 3반복으로 수행하였다. In order to check the expression of the gene introduced into the transformant, the leaves of the transgenic Arabidopsis plant grown for 3 weeks were collected and immediately frozen in liquid nitrogen and ground with a mortar. Total RNA was isolated from the ground sample using Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Produced as a cDNA library and PCR (3 min 1 cycle at 95 °C, 30 sec at 95 °C, 30 sec at 55 °C, 45 sec at 72 °C, 25 cycles, 1 cycle at 72 °C, 10 min 1 cycle using salt resistance-related gene-specific primers) condition), and finally confirmed the transgene expression through DNA sequencing. Actin gene expression level was used as a quantitative control, and all experiments were performed in triplicate.

<실시예 6> 애기장대 형질전환 식물체 내염성 분석<Example 6> Analysis of tolerance to Arabidopsis transgenic plants

(1) 표면 살균한 형질전환 애기장대 종자를 125 mM NaCl이 포함된 1/2 MS 배지(MS salts, 1% Sucrose, 0.3% Gelrite)에 파종하여 2-4일간 4℃에서 휴면타파를 위해 저온처리를 하였다. 저온처리 후 23℃, 16시간 낮 및 8시간 밤 조건의 생장상에서 배양하였다. 15-20일 후에 백화현상이 나타난 비율과 생존비율을 측정하였다. (1) Surface-sterilized transgenic Arabidopsis thaliana seeds were sown in 1/2 MS medium (MS salts, 1% Sucrose, 0.3% Gelrite) containing 125 mM NaCl at 4°C for 2-4 days at low temperature to break dormancy. processed. After low-temperature treatment, it was cultured on a growth phase at 23° C., 16 hours day and 8 hours night conditions. After 15-20 days, the rate of whitening and the survival rate were measured.

(2) 고염도에서 형질전환 식물체의 뿌리 길이 생장을 측정하기 위해 Square-dish (1/2MS salts, 1% Sucrose, 125 mM NaCl, 0.8% Gelrite) 배지에 파종하여 2-4일간 4℃에서 휴면타파 후 23℃, 16시간 낮 및 8시간 밤 조건의 생장상에서 Square-dish를 세운 후 12일간 뿌리 길이를 측정하였다. (2) In order to measure the root length growth of transgenic plants at high salinity, they were sown in Square-dish (1/2MS salts, 1% Sucrose, 125 mM NaCl, 0.8% Gelrite) medium and dormant at 4°C for 2-4 days. After breaking, the root length was measured for 12 days after setting up a square-dish on the growth conditions of 23° C., 16 hours day and 8 hours night.

(3) 원예용 상토에서 형질전환 애기장대 종자 50립을 파종하여 23℃, 16시간 낮 및 8시간 밤 조건의 생장상에서 10일간 키운 후 대조군으로 NaCl이 포함되지 않은 일반물과 150 mM NaCl과 200 mM NaCl이 포함된 물을 각각 2일 간격으로 5번 공급한 후 10일 뒤 생존률을 측정하였다. (3) 50 transgenic Arabidopsis thaliana seeds were sown in horticultural medium and grown for 10 days at 23° C., 16 hours day and 8 hours night conditions, and then as a control, general water without NaCl and 150 mM NaCl and 200 After each supply of water containing mM NaCl 5 times with an interval of 2 days, the survival rate was measured 10 days later.

<실시예 7> 내염성 관련 유전자 발현 분석<Example 7> Analysis of gene expression related to flame resistance

형질전환 식물체에서 염 스트레스 관련 유전자들의 발현 수준을 확인하기 위하여 21일 자란 형질전환 식물체의 5째 잎으로부터 Trizol을 사용하여 total RNA를 분리하였다. cDNA 라이브러리로 제작하고 내염성 관련 유전자 특이 프라이머(표 1)를 사용하여 semi-quantitative RT-PCR을 수행하였다.To determine the expression level of salt stress-related genes in the transgenic plants, total RNA was isolated from the fifth leaf of the transgenic plants grown on day 21 using Trizol. It was prepared as a cDNA library and semi-quantitative RT-PCR was performed using the gene-specific primers related to salt resistance (Table 1).

내염성 관련 유전자 특이 프라이머 서열 Inflammability-related gene-specific primer sequences 유전자 gene AGI No.AGI No. 프리이머 서열primer sequence 예상 size (bp)Expected size (bp) SOS1 SOS1 At2g01980at2g01980 5’-ATGACGACTGTAATCGACGCGACG-3’5’-ATGACGACTGTAATCGACGCGACG-3’ 727727 5’-ACGCCAGACCAATGCCTACAGCTCC-3’5’-ACGCCAGACCAATGCCTACAGCTCC-3’ HKT1HKT1 At4g10310At4g10310 5’-CGCTGTGACGTTGAGACTGTTACTG-3’5’-CGCTGTGACGTTGAGACTGTTACTG-3’ 916916 5’-CCATATGCACTGATAACTTCGAGAG-3’5’-CCATATGCACTGATAACTTCGAGAG-3’ ABA1 ABA1 At5g67030At5g67030 5’-TGACTCTGCAGCAGATTCTAGCACG-3’5’-TGACTCTGCAGCAGATTCTAGCACG-3’ 892892 5’-ACCCAGTCAAGCATCGATGGCATAGC-3’5’-ACCCAGTCAAGCATCGATGGCATAGC-3’ ABI1 ABI1 At4g26080At4g26080 5’-ATGGAGGAAGTATCTCCGGCGATCG-3’5’-ATGGAGGAAGTATCTCCGGCGATCG-3’ 951951 5’-ATCGCCAATGGATCTCGACATGGCG-3’5’-ATCGCCAATGGATCTCGACATGGCG-3’ FRY FRY At5g63980At5g63980 5’-ATGGCTTACGAGAAAGAGCTTGATG-3’5’-ATGGCTTACGAGAAAGGCTTGATG-3’ 884884 5’-ACTATAGCACCAGCGACATGGTCC-3’5’-ACTATAGCACCAGCGACATGGTCC-3’ HOS1HOS1 At2g39810At2g39810 5’-TGAACTATGTGTTGAATCCATGTGG-3’5’-TGAACTATGTGTTGAATCCATGTGG-3’ 744744 5’-ACTGGTCTACAGCATCAGGCCATGC-3’5’-ACTGGTCTACAGCATCAGGCCATGC-3’ SAD1 SAD1 At5g48870At5g48870 5’-ATGGCGAACAATCCTTCACAGCTTC-3’5’-ATGGCGAACAATCCTTCACAGCTTC-3’ 267267 5’-TCATTCTCCATCTTCGGGAGACCC-3’5’-TCATTCTCCATCTTCGGGAGACCC-3’ DREB2ADREB2A At5g05410At5g05410 5’-ATGGCAGTTTATGATCAGAGTGGAG-3’5'-ATGGCAGTTTATGATCAGAGTGGAG-3' 879879 5’-CCTGTATGAACCGTTGGCAACACTG-3’5’-CCTGTATGAACCGTTGGCAACACTG-3’

<실험예 1> 배추로부터 zinc-finger homeodomain protein 10 (BrZHD10) 유전자 분리<Experimental Example 1> Zinc-finger homeodomain protein 10 (BrZHD10) gene isolation from Chinese cabbage

배추 생장발달 및 환경, 스트레스 처리 후에 제작된 유전자 은행으로부터 완전장 (full-ORF)을 포함하고 있으며 애기장대 유전자들과 유사성이 낮은 배추 고유 유전자를 분리하여 염기서열을 분석한 결과 도 2와 같으며, 서열번호 1의 염기서열을 가지는 것으로 확인되었다(도 2).The result of analyzing the nucleotide sequence by isolating a cabbage-specific gene containing full-ORF and having low similarity with Arabidopsis genes from the gene bank produced after growth development, environment, and stress treatment of Chinese cabbage is shown in FIG. , was confirmed to have the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 (FIG. 2).

선발된 배추 유전자의 아미노산 서열을 분석한 결과, 단백질 합성을 위한 ATG 시작 코돈부터 TAA 종결코돈까지 약 955개의 염기로부터 번역된 317개의 폴리펩티드로 이루어져 있으며, 서열번호 2의 아미노산 서열을 가지는 것으로 확인되었다(도 2). As a result of analyzing the amino acid sequence of the selected Chinese cabbage gene, it was confirmed that it consists of 317 polypeptides translated from about 955 bases from the ATG start codon to the TAA stop codon for protein synthesis, and has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 ( 2).

또한, 상기 BrZHD10 단백질은 ZF-HD dimerisation(ZF-HD dimer)과 Homeobox domain ZF-HD class(Homeo_ZF_HD)의 motif를 갖고 있는 ZHD10(zinc-finger homeodomain protein 10) 유전자 (Genebank ID XM_009141674.2)로 확인되었다(도 2). In addition, the BrZHD10 protein was identified as ZF-HD dimerisation (ZF-HD dimer) and ZHD10 (zinc-finger homeodomain protein 10) gene (Genebank ID XM_009141674.2) having a motif of the Homeobox domain ZF-HD class (Homeo_ZF_HD). became (Fig. 2).

다른 식물 6종의 ZHD10 아미노산 서열들을 비교 분석한 결과 82.1-97.8%의 높은 상동성을 나타내고 있으며 ZF-HD dimer와 Homeo_ZF_HD의 motif가 잘 보존되어 있었다(도 3).As a result of comparative analysis of the ZHD10 amino acid sequences of 6 other plants, it showed a high homology of 82.1-97.8%, and the motifs of ZF-HD dimer and Homeo_ZF_HD were well preserved (FIG. 3).

<실험예 2> 환경스트레스에 대한 발현 분석<Experimental Example 2> Expression analysis for environmental stress

환경스트레스인 고염, 건조, 고온, 저온에 대해 BrZHD10 유전자 발현을 분석한 결과 150 mM NaCl를 처리한 배추에서 유전자의 발현이 3시간부터 급격하게 증가한 후 6시간째 가장 높은 발현량을 보이다가 서서히 감소하는 것을 확인 할 수 있었다. 그러나 다른 스트레스에 대해서는 반응이 나타나지 않았다(도 4). 따라서 BrZDH10 유전자는 NaCl(고염 조건)에 특이하게 반응하는 유전자로 확인되었다.As a result of analyzing the BrZHD10 gene expression for environmental stresses such as high salt, dryness, high temperature and low temperature, the expression of the gene in the 150 mM NaCl-treated Chinese cabbage increased rapidly from 3 hours, then showed the highest expression level at 6 hours and then gradually decreased. could confirm that However, there was no response to other stresses (Fig. 4). Therefore, the BrZDH10 gene was identified as a gene that responds specifically to NaCl (high salt conditions).

<실험예 3> 애기장대 형질전환체 유전자 도입 및 발현 분석<Experimental Example 3> Arabidopsis transformant gene introduction and expression analysis

유전자 발현을 통한 기능연구를 위하여 식물 형질전환용 벡터를 제조한 후, 이를 이용하여 애기장대 형질전환체를 제조하였다. After preparing a vector for plant transformation for functional study through gene expression, Arabidopsis transformants were prepared using this vector.

상기 제조된 애기장대 형질전환체로부터 BrZHD10 유전자 특이 프라이머(B288F: 5'- ATGGATATGGCGACTCATACAACAA-3, B288R: 5'- TCACGACGACGACGACCCGTTTACG-3')를 이용하여 genomic DNA PCR을 통해 유전자 삽입을 확인하였다(도 5).Gene insertion was confirmed through genomic DNA PCR using BrZHD10 gene-specific primers (B288F: 5'-ATGGATATGGCGACTCATACAACAA-3, B288R: 5'-TCACGACGACGACGACCCGTTTACG-3') from the Arabidopsis transformant prepared above (Fig. 5). .

<실험예 4> 애기장대 형질전환 식물체 내염성 분석<Experimental Example 4> Analysis of tolerance to Arabidopsis transgenic plants

애기장대 형질전환체를 T3 세대까지 진전시켜 호모계통을 육성하여 125 mM NaCl이 들어있는 1/2 MS 배지에서 종자를 발아시켜 내염성 정도를 백화현상과 생존율로 조사하였다(도 6). 그 결과 백화율은 비형질전환체가 89.3%이며 형질전환체가 35%로 나타났고(도 6B), 생존율은 비형질전환체가 10.7%이며 형질전환체가 65%로 나타났다(도 6C). 따라서, 형질전환체에서 백화 현상이 감소하였으며, 생존율이 증가된 것을 확인하였다.Arabidopsis transformants were advanced to the T3 generation to cultivate homo lines, and seeds were germinated in 1/2 MS medium containing 125 mM NaCl, and the degree of salt tolerance was investigated as efflorescence and viability (FIG. 6). As a result, the whitening rate was 89.3% for the non-transformants and 35% for the transformants (FIG. 6B), and the viability was 10.7% for the non-transformants and 65% for the transformants (FIG. 6C). Therefore, it was confirmed that the whitening phenomenon was reduced in the transformant, and the survival rate was increased.

또한, 내염성 배지에서 뿌리 길이 생장을 유묘 생장 12일 동안 측정한 결과 비형질전환체 비해서 형질전환체 뿌리가 정상적으로 생장하는 것을 확인하였다(도 7A).In addition, as a result of measuring root length growth in the salt-resistant medium for 12 days of seedling growth, it was confirmed that the transformant roots grew normally compared to the non-transformants ( FIG. 7A ).

유묘 생장발달동안 주근(Primary root)의 길이를 측정한 결과 비형질전환체에서는 주근 생장이 억제되고, 길이가 짧아졌으나, 형질전환체의 주근은 정상적으로 생장하였다(도 7B). 또한 주근으로부터 발생된 측근의 수는 비형질전환체에서 1.2개로 급격하게 감소하였으나 형질전환체는 5-6개로 정상적으로 발생하였다(도 7C). 상기 결과들로부터 125 mM NaCl 고염 조건의 배지에서 성장한 형질전환 애기장대는 BrZHD10 유전자 도입에 의해 내염성이 증가하는 것을 알 수 있었다. As a result of measuring the length of the primary root during seedling growth and development, the growth of the primary root was inhibited in the non-transformants and the length was shortened, but the primary root of the transformant grew normally ( FIG. 7B ). In addition, the number of lateral roots generated from the main root decreased sharply to 1.2 in the non-transformants, but 5-6 were normally generated in the transformants (FIG. 7C). From the above results, it can be seen that the transgenic Arabidopsis thaliana grown in a medium under high salt conditions of 125 mM NaCl has increased salt resistance by the introduction of the BrZHD10 gene.

또한, 토양에서 고염농도에서 형질전환 애기장대의 내염성 검정을 분석하기 위해, 원예용 상토에 10일 생장한 형질전환 애기장대에 염처리(일반물, 150 mM NaCl, 200 mM NaCl)를 2일 간격으로 5번 처리하여 10일 후 생존율을 조사한 결과 200 mM NaCl에서는 비형질전환체와 큰 차이 없이 생존율이 낮았다. 그러나, 150 mM NaCl에서는 비형질전환체의 생존율이 약 22%이며 형질전환체의 생존율이 약 89%로 비형질전환체보다 형질전환체의 생존률이 67% 더 높게 나타났다(도 8). In addition, in order to analyze the salt tolerance assay of transgenic Arabidopsis thaliana at high salt concentration in the soil, salt treatment (normal, 150 mM NaCl, 200 mM NaCl) was applied to transgenic Arabidopsis thaliana grown for 10 days in horticultural medium at 2-day intervals. As a result of investigating the survival rate after 10 days of treatment with 5 times, the survival rate was low in 200 mM NaCl without significant difference from that of the non-transformants. However, in 150 mM NaCl, the survival rate of the non-transformants was about 22% and the survival rate of the transformants was about 89%, indicating that the survival rate of the transformants was 67% higher than that of the non-transformants ( FIG. 8 ).

<실험예 5> 형질전환체 내염성 관련 유전자 발현 분석<Experimental Example 5> Transformant resistance-related gene expression analysis

21일 생장한 형질전환 애기장대 5번째 잎에서 total RNA 분리 후 애기장대 내부 내염성 관련 유전자들의 발현양상을 RT-PCR로 분석하였다. After total RNA isolation from the 5th leaf of transgenic Arabidopsis grown on the 21st, the expression patterns of Arabidopsis internal inflammation-related genes were analyzed by RT-PCR.

그 결과, 환경 스트레스 반응 경로에서 ERF/AP2 전사조절인자인 DREB2A(Dehydration-responsive element-binding protein 2A) 유전자의 발현이 증가되었다. 그러나 내염 저항 경로에서 이온 항상성(Ion homeostasis under salt stress) 유지에 중요한 역할을 하는 Na+ transporter HKT1 (High-affinity K+ transporter 1) 유전자의 발현은 감소하였다.As a result, the expression of DREB2A (dehydration-responsive element-binding protein 2A) gene, which is an ERF/AP2 transcriptional regulator, was increased in the environmental stress response pathway. However, the expression of the Na+ transporter HKT1 (High-affinity K+ transporter 1) gene, which plays an important role in maintaining ion homeostasis under salt stress in the flame resistance pathway, was decreased.

이러한 결과로부터 형질전환체에서 배추 BrZHD10 유전자는 환경 스트레스 관련 유전자의 발현을 증가시킴으로써 식물체 내염성을 증가시키는 효과를 나타내지만, 이온 항상성(Ion homeostasis under salt stress) 경로와는 다른 경로로 내염 효과를 나타내는 것으로 확인되었다. From these results, the BrZHD10 gene of Chinese cabbage in the transformant shows the effect of increasing the plant flame tolerance by increasing the expression of environmental stress-related genes, but it shows the flame resistance effect by a different route than the ion homeostasis under salt stress route. Confirmed.

결론적으로, 배추로부터 분리된 zinc-finger homeodomain protein 10 (BrZHD10) 유전자는 내염성을 증진시키는 효과가 있어, 내염성이 필요한 환경에서 재배할 수 있는 식물 품종 개발에 이용이 가능하다.In conclusion, the zinc-finger homeodomain protein 10 (BrZHD10) gene isolated from Chinese cabbage has the effect of enhancing salt tolerance, so it can be used for the development of plant varieties that can be grown in environments requiring salt tolerance.

<110> Republic of Korea <120> BrZHD10 gene with salt tolerance and use thereof <130> DP20190164 <160> 8 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 955 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BrZHD10 <400> 1 atggatatgg cgactcatac aacaataaca tctcctccta aatcacctga accagaaccc 60 gaaactccga accggatcca accggccaaa cccatttcct tcagcaacgg catcatcaaa 120 cgccaccacc atcctactct cctcttcact tacaaagaat gtctcaaaaa ccacgcggca 180 gctttaggta gccacgcgct agacggttgc ggcgaattca tgccgtctcc gtcgttagtc 240 tccaccgatc caacttctct caaatgcgca gcttgtggtt gccaccgtaa cttccaccgc 300 cgtgaaccag gcaacgactc ctcaatccgt ccacctcctt cctcagtcgc cgccacaatt 360 gagtatcagc ctcaccaccg tcaccatcca ccaccaccac cacaattacc tcctcctcgc 420 agccctaact cctcttctcc gccgccgatt tcctcgtctt acatgctctt atctctctcc 480 gggactaaca acaacaacaa cttagctttc tccggcaaca accaccacca ccaaaccgga 540 tctcgtaagc ggttccgaac gaagttcagc cagtttcaga aagagaagat gcacgagttc 600 gccgaccgag tcgggtggaa gatgcagaaa cgcgacgaag acgatgttcg agaattctgc 660 cggcagatcg gagttgacaa aagcgttctc aaagtctgga tgcacaacaa caaaaacaac 720 ttcaaccgcc gcgatatcca gttctccgtc gccgccgccg gagccaccga gatccacaaa 780 acagataacg gcggtggagg aatccacgct ccgattcccg ccggtgaaac taacaataac 840 ggatgcaacg agcttcacca cagtgttagt aacggcggag gagggtttga tagtgatagt 900 ggtggcggtg gaggagctca cggcggtgac gtaaacgggt cgtcgtcgtc gtgaa 955 <210> 2 <211> 317 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> BrZHD10 <400> 2 Met Asp Met Ala Thr His Thr Thr Ile Thr Ser Pro Pro Lys Ser Pro 1 5 10 15 Glu Pro Glu Pro Glu Thr Pro Asn Arg Ile Gln Pro Ala Lys Pro Ile 20 25 30 Ser Phe Ser Asn Gly Ile Ile Lys Arg His His His Pro Thr Leu Leu 35 40 45 Phe Thr Tyr Lys Glu Cys Leu Lys Asn His Ala Ala Ala Leu Gly Ser 50 55 60 His Ala Leu Asp Gly Cys Gly Glu Phe Met Pro Ser Pro Ser Leu Val 65 70 75 80 Ser Thr Asp Pro Thr Ser Leu Lys Cys Ala Ala Cys Gly Cys His Arg 85 90 95 Asn Phe His Arg Arg Glu Pro Gly Asn Asp Ser Ser Ile Arg Pro Pro 100 105 110 Pro Ser Ser Val Ala Ala Thr Ile Glu Tyr Gln Pro His His Arg His 115 120 125 His Pro Pro Pro Pro Pro Gln Leu Pro Pro Pro Arg Ser Pro Asn Ser 130 135 140 Ser Ser Pro Pro Pro Ile Ser Ser Ser Tyr Met Leu Leu Ser Leu Ser 145 150 155 160 Gly Thr Asn Asn Asn Asn Asn Leu Ala Phe Ser Gly Asn Asn His His 165 170 175 His Gln Thr Gly Ser Arg Lys Arg Phe Arg Thr Lys Phe Ser Gln Phe 180 185 190 Gln Lys Glu Lys Met His Glu Phe Ala Asp Arg Val Gly Trp Lys Met 195 200 205 Gln Lys Arg Asp Glu Asp Asp Val Arg Glu Phe Cys Arg Gln Ile Gly 210 215 220 Val Asp Lys Ser Val Leu Lys Val Trp Met His Asn Asn Lys Asn Asn 225 230 235 240 Phe Asn Arg Arg Asp Ile Gln Phe Ser Val Ala Ala Ala Gly Ala Thr 245 250 255 Glu Ile His Lys Thr Asp Asn Gly Gly Gly Gly Ile His Ala Pro Ile 260 265 270 Pro Ala Gly Glu Thr Asn Asn Asn Gly Cys Asn Glu Leu His His Ser 275 280 285 Val Ser Asn Gly Gly Gly Gly Phe Asp Ser Asp Ser Gly Gly Gly Gly 290 295 300 Gly Ala His Gly Gly Asp Val Asn Gly Ser Ser Ser Ser 305 310 315 <210> 3 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> B288F-primer <400> 3 atggatatgg cgactcatac aacaa 25 <210> 4 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> B288R-primer <400> 4 tcacgacgac gacgacccgt ttacg 25 <210> 5 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> B288B1-primer <400> 5 aaaaagcagg ctccacgcgt tgggagctct ccc 33 <210> 6 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> B288B2-primer <400> 6 agaaagctgg gtcatggcgg ccgcgggaat tc 32 <210> 7 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> attB1-primer <400> 7 acaagtttgt acaaaaaagc aggct 25 <210> 8 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> attB2-primer <400> 8 acccagcttt cttgtacaaa gtggt 25 <110> Republic of Korea <120> BrZHD10 gene with salt tolerance and use thereof <130> DP20190164 <160> 8 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 955 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BrZHD10 <400> 1 atggatatgg cgactcatac aacaataaca tctcctccta aatcacctga accagaaccc 60 gaaactccga accggatcca accggccaaa cccatttcct tcagcaacgg catcatcaaa 120 cgccaccacc 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Claims

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서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 BrZHD10 (Brassica rapa zinc-finger homeodomain protein 10) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 식물체의 내염성 증진용 재조합 벡터로 형질전환하여 내염성이 증진된 식물체.A plant having improved salt tolerance by transforming it with a recombinant vector for enhancing plant tolerance comprising a gene encoding a BrZHD10 (Brassica rapa zinc-finger homeodomain protein 10 ) protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.

서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 BrZHD10 (Brassica rapa zinc-finger homeodomain protein 10) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 식물체의 내염성 증진용 재조합 벡터를 제조하는 단계; 및
상기 재조합 벡터를 식물체에 형질전환시키는 단계를 포함하는,
내염성이 증진된 형질전환 식물체의 제조방법.Preparing a recombinant vector for promoting salt tolerance of a plant comprising a gene encoding a BrZHD10 (Brassica rapa zinc-finger homeodomain protein 10 ) protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2; and
Containing the step of transforming the recombinant vector into a plant,
A method for producing a transgenic plant with improved salt tolerance.

서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 BrZHD10 (Brassica rapa zinc-finger homeodomain protein 10) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 식물체의 내염성 증진용 재조합 벡터를 식물체에 도입하는 단계를 포함하는,
식물체의 내염성을 증진시키는 방법. BrZHD10 ( Brassica rapa zinc-finger homeodomain protein 10 ) consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 comprising the step of introducing into a plant a recombinant vector for promoting salt tolerance of a plant comprising a gene encoding a protein,
A method for enhancing the salt tolerance of plants.