KR20200057667A

KR20200057667A - 이온 교환 크로마토그래피를 사용한 1염기 치환 검출 방법

Info

Publication number: KR20200057667A
Application number: KR1020197009796A
Authority: KR
Inventors: 히로유키 에비누마; 가츠라 우치다; 유리코 츠카모토
Original assignee: 세키스이 메디칼 가부시키가이샤
Priority date: 2017-09-29
Filing date: 2017-09-29
Publication date: 2020-05-26
Also published as: WO2019064483A1; EP3690039A1; CN109863245A; JP6875411B2; JPWO2019064483A1; KR102389120B1; US10626452B2; EP3690039A4; US20190203284A1; EP3690039B1

Abstract

본 발명은, 다종류의 유전자 변이, 특히 1염기 치환 혹은 점 변이를, 정확하고 또한 정량적으로 분리 및 검출하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
유전자 변이, 특히 1염기 치환 혹은 점 변이를 해석하기 위한 대립 유전자 특이적 프라이머(ASP)에 있어서, 그 ASP 및 그것과 쌍을 이루는 프라이머의 적어도 하나의 5' 말단에, 비뉴클레오티드 성분을 부가하여 PCR에 의해 증폭하고, 그 증폭산물을 이온 교환 크로마토그래피에 의해 분리함으로써, 증폭산물의 길이가 동일해도, 분리 검출할 수 있다.

Description

이온 교환 크로마토그래피를 사용한 1염기 치환 검출 방법

본 발명은, 핵산 시료 중에 포함되는 1염기 치환 혹은 점 변이 등의 변이의 특이적인 검출 방법에 관한 것이다.

유전자 변이에는 유전적으로 계승되는 생식 세포 변이와 후천적으로 하나하나의 세포 내에서 야기되는 체세포 변이가 있지만, 생식 세포 변이 중에서 특정한 유전자의 1염기 다형(Single Nucleotide Polymorphism; SNP)의 특정한 유전자형이나 체세포 변이의 점 변이(1염기 치환), 삽입, 결실 등이, 각종 질병에 관련되어 있는 것이 보고되어 있고, 근년 그들의 염기 서열을 동정함으로써, 특정한 약제에 효과가 기대되는 환자의 선별에 이용되고 있다. 예를 들어, UGT1A1의 유전자 다형은, 항암제인 이리노테칸의 위독한 부작용의 발현 리스크를 판단하는 데 이용되고 있다. UGT1A1의 유전자 다형 검사에 있어서는, 2개의 염기 서열(*6, *28)을 대상으로, 각각 변이를 갖지 않는 야생형, 야생형과 변이형의 양쪽을 갖는 헤테로 접합체, 변이형만의 호모 접합체를 판별할 필요가 있다. 골수성 증식성 질환의 유전자 변이의 하나인 진성 적혈구 증가증의 진단에 사용되고 있는 JAK2 유전자 변이는, 기능 획득형의 후천적 체세포 변이이고, 엑손 14의 1849 G>T의 점 변이에 의해, 항상적인 수용체형 티로신키나아제의 활성화를 초래한다. 이 점 변이는, 검출될 뿐만 아니라, 양적 추이가 진료상 유용해지는 점에서, 대립 유전자 빈도를 산출하는 것이 요구된다. 즉, 유전자 다형 검출과 마찬가지로, 점 변이 검출에 있어서도 변이형 및 야생형의 양쪽을 정량적으로 검출할 필요가 있다. 또한, 원발성 골수 섬유증에서 WHO 분류의 진단 기준으로 설정되어 있는 MPL(Myeloproliferative leukemia virus) 유전자 변이는, 엑손 10, 코돈 515의 1543 내지 1544번째의 염기에 점 변이나 결실·삽입 변이가 생기는 점에서, 동일 위치에서 몇 가지의 변이 패턴이 있고, 그 패턴을 구별하여 검출하는 것이 바람직하다.

핵산을 단시간에 고정밀도로 분리 검출할 수 있는 방법으로서, 이온 교환 크로마토그래피가 이용되고 있다. 이 이온 교환 크로마토그래피를 핵산의 검출에 응용하는 이점으로서는, 핵산을 그의 쇄 길이에 따라 분리할 수 있는 점에서, 예를 들어 PCR(폴리메라아제 연쇄 반응, polymerase chain reaction)에 의한 증폭산물의 길이를 조절하면, 복수의 증폭산물을 한 번의 측정으로 분리 및 검출하는 것도 가능해지는 것이다. 이 원리는, 상기와 같은 복수 존재하는 유전자 변이의 검출로의 응용도 이론적으로는 가능하지만, 1염기 치환이나 점 변이와 같은 불과 1염기의 차이를 검출하기 위해서는, 고안이 필요하다. 1염기 치환 검출의 경우, 단순히 SNP 부위를 사이에 두도록 PCR용의 프라이머를 설계하여, 증폭산물을 얻었다고 해도, 1염기의 차이를 이온 교환 크로마토그래피로 분리하는 것은 곤란하다. 이에 대해, 특허문헌 1에는 대립 유전자 특이적 프라이머(Allele Specific Primer; ASP)의 5' 말단에 주형 DNA와 불완전 상보인 서열(태그 서열)을 부가시킴으로써, PCR에 의한 증폭산물의 길이를 인위적으로 변화시켜, 이온 교환 크로마토그래피로 SNP를 분리 검출하는 방법이 개시되어 있다. 그러나, 부가하는 염기 서열이 지나치게 길면 프라이머로서의 Tm값의 변화가 커져, 특이성을 유지할 수 없게 될 가능성이 있다. 반대로 지나치게 짧으면, 증폭산물 길이의 차가 작아짐으로써 이온 교환 크로마토그래피의 분리가 나빠지고, 1염기 다형을 정확하게 판정할 수 없게 되는 것이 염려된다.

한편, ASP의 설계를, 이중쇄의 포워드측 및 리버스측에 설계하고, 그의 쌍이 되는 프라이머를, 변이 부위 이외의 적당한 장소에 설계함으로써, 2종류의 크기가 상이한 증폭산물을 얻음으로써, 캐필러리 전기 영동을 사용하여 분리할 수 있는 것이 보고되어 있다(비특허문헌 1). 그러나, 이 방법으로는 변이와 관계없는 프라이머끼리가 쌍이 된 증폭이 진행되어 버리는 점에서, 증폭에 필요한 성분이 소비되어, 특이 반응에 영향을 미칠 가능성이 있다. 또한, 2조의 쌍이 되는 프라이머를 사용하고 있는 점에서, 하이브리다이제이션 및 증폭의 효율에 차가 발생하기 쉽고, JAK2 유전자 변이 등의 유전자 변이를 검출할 때에, 대립 유전자 빈도를 정확하게 산출하는 것은 곤란했다. 이에 더하여, 이 방법으로는, 2종류까지의 변이 검출이 한계이고, MPL의 코돈 515 주변의 복수 변이나, KRAS나 NRAS 등의 코돈 12나 코돈 13의 점 변이와 같이, 많은 종류의 변이에는 적용할 수 없다.

WO2012/133834

Takei H, Morishita S, Araki M, Edahiro Y, Sunami Y, Hironaka Y, Noda N, Sekiguchi Y, Tsuneda S, Ohsaka A, Komatsu N. Detection of MPLW515L/K mutations and determination of allele frequencies with a single-tube PCR assay. PLoS One. 2014 Aug 21; 9(8):e104958.

본 발명은 상기와 같은 종래의 과제를 감안하여, 다종류의 유전자 변이, 특히 1염기 치환 혹은 점 변이를, 정확하고 또한 정량적으로 분리 및 검출하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기 과제를 해결하기 위한 수단으로서, 유전자 변이, 특히 1염기 치환 혹은 점 변이를 해석하기 위한 ASP에 있어서, 그 ASP 및 그것과 쌍을 이루는 프라이머의 적어도 하나의 5' 말단에, 비뉴클레오티드 성분을 부가하여 PCR에 의해 증폭하고, 그 증폭산물을 이온 교환 크로마토그래피에 의해 분리함으로써, 증폭산물의 길이가 동일해도, 분리 검출할 수 있는 것을 발견하고, 본 발명을 완성시키는 데 이르렀다. 즉, 본 발명은 이하의 〔1〕 내지 〔8〕의 구성을 포함한다.

〔1〕

2종류 이상의 대립 유전자 특이적 프라이머를 사용하여 증폭된 2종류 이상의 유전자 증폭산물을, 이온 교환 크로마토그래피를 사용하여 판별하는 방법으로서, 상기 2종류 이상의 대립 유전자 특이적 프라이머의 적어도 하나의 5' 말단이, 비뉴클레오티드 성분이 부가되어 있는 것을 특징으로 하는, 유전자 변이를 검출하는 방법: 여기서, 당해 비뉴클레오티드 성분은, 바람직하게는 히드록시기, 알데히드기, 카르복시기, 아미노기, 니트로기, 니트로소기, 티올기, 술폰산기, 플루오로기, 클로로기, 브로모기 및 요오드기로 이루어지는 군에서 선택되는 이온성 관능기, 또는 당해 이온성 관능기를 적어도 하나 이상 포함하는 분자이고, 더욱 바람직하게는 표 1에 나타나는 형광 물질이고, 또한 당해 유전자 증폭산물의 크기의 차는, 바람직하게는 0염기쌍, 1염기쌍, 2염기쌍, 3염기쌍, 4염기쌍, 5염기쌍, 6염기쌍, 7염기쌍, 8염기쌍, 9염기쌍 또는 10염기쌍이고, 보다 바람직하게는 0염기쌍, 1염기쌍 또는 2염기쌍이고, 더욱 바람직하게는 0염기쌍이다.

〔2〕

이온 교환 크로마토그래피가 음이온 교환 크로마토그래피인 상기 〔1〕에 기재된 검출 방법.

〔3〕

비뉴클레오티드 성분이, 프라이머의 5' 말단의 전하에 변화를 일으키게 하는 물질인 상기 〔1〕 또는 〔2〕에 기재된 검출 방법.

〔4〕

이하의 공정을 포함하는, 시료 중의 이중쇄 데옥시리보핵산에 포함되는 다형 부위에 있어서의 적어도 하나의 대립 유전자의 존재를 검출하는 방법:

(a) 다형 부위를 포함하는 이중쇄 데옥시리보핵산을 포함하는 시료를 제공하는 공정;

(b) 제1 프라이머, 제2 프라이머 및 제3 프라이머를 제공하는 공정,

여기서, 제1 프라이머의 서열은, 당해 다형 부위에 있어서 제1 대립 유전자를 갖는 이중쇄 데옥시리보핵산의 제2 쇄에 상보적이고 또한 3' 말단의 3개의 염기 중 어느 1개 또는 2개 또는 3개의 염기 혹은 3' 말단의 2개의 염기 중 한쪽 또는 양쪽의 염기가 당해 다형 부위에 대응하고,

제2 프라이머의 서열은, 당해 다형 부위에 있어서 제2 대립 유전자를 갖는 이중쇄 데옥시리보핵산의 제2 쇄에 상보적이고 또한 3' 말단의 3개의 염기 중 어느 1개 또는 2개 또는 3개의 염기 혹은 3' 말단의 2개의 염기 중 한쪽 또는 양쪽의 염기가 당해 다형 부위에 대응하고,

제3 프라이머의 서열은, 당해 다형 부위를 포함하지 않고 또한 당해 이중쇄 데옥시리보핵산의 제1 쇄에 상보적이고,

제1 프라이머 및 제2 프라이머의 적어도 하나가, 비뉴클레오티드 성분이 부가되어 있다,

여기서, 당해 비뉴클레오티드 성분은, 바람직하게는 히드록시기, 알데히드기, 카르복시기, 아미노기, 니트로기, 니트로소기, 티올기, 술폰산기, 플루오로기, 클로로기, 브로모기 및 요오드기로 이루어지는 군에서 선택되는 이온성 관능기, 또는 당해 이온성 관능기를 적어도 하나 이상 포함하는 분자이고, 더욱 바람직하게는 표 1에 나타나는 형광 물질이다;

(c) 폴리메라아제 연쇄 반응을 행하는 공정,

여기서, 당해 폴리메라아제 연쇄 반응은, 제1 대립 유전자를 갖는 이중쇄 데옥시리보핵산의 제2 쇄에 하이브리다이즈한 제1 프라이머로부터의 폴리메라아제에 의한 쇄의 신장이, 제1 대립 유전자를 갖는 이중쇄 데옥시리보핵산의 제2 쇄에 하이브리다이즈한 제2 프라이머로부터의 폴리메라아제에 의한 쇄의 신장과 비교하여 우선적으로 발생하고, 또한 제2 대립 유전자를 갖는 이중쇄 데옥시리보핵산의 제2 쇄에 하이브리다이즈한 제2 프라이머로부터의 폴리메라아제에 의한 쇄의 신장이, 제2 대립 유전자를 갖는 이중쇄 데옥시리보핵산의 제2 쇄에 하이브리다이즈한 제1 프라이머로부터의 폴리메라아제에 의한 쇄의 신장과 비교하여 우선적으로 발생하는 조건에서 행해진다;

(d) 당해 폴리메라아제 연쇄 반응의 증폭산물을 이온 교환 크로마토그래피에 가하는 공정, 여기서, 바람직하게는 이온 교환 크로마토그래피는, 음이온 교환 크로마토그래피이다;

여기서, 제1 프라이머 및 제3 프라이머로부터의 폴리메라아제 연쇄 반응의 증폭산물과 제2 프라이머 및 제3 프라이머로부터의 폴리메라아제 연쇄 반응의 증폭산물의 크기의 차는, 0염기쌍, 1염기쌍, 2염기쌍, 3염기쌍, 4염기쌍, 5염기쌍, 6염기쌍, 7염기쌍, 8염기쌍, 9염기쌍 또는 10염기쌍이고, 보다 바람직하게는 0염기쌍, 1염기쌍 또는 2염기쌍이고, 더욱 바람직하게는 0염기쌍이다; 및

제1 및 제2 대립 유전자의 한쪽 또는 양쪽의 존재를 상기 증폭산물의 용출 위치 또는 용출 시간에 기초하여 검출하는 공정.

〔5〕

상기 (a)의 공정이, 인간 등의 포유류 체세포 검체로부터 게놈 DNA를 추출하는 공정인, 상기 〔4〕에 기재된 방법.

〔6〕

상기 다형 부위가, UGT1A1*28다형(rs8175347), UGT1A1*6다형(rs4148323), JAK2 1849G>T(V617F) 변이 부위(rs77375493), MPL 1589G>T(W515L) 변이 부위(rs121913615), 또는 MPL 1588:1599TG>AA(W515K) 변이 부위(rs121913616)인, 상기 〔4〕 또는 〔5〕에 기재된 방법.

〔7〕

상기 비뉴클레오티드 성분이, 프라이머의 5' 말단의 전하에 변화를 일으키게 하는 물질인, 상기 〔4〕 내지 〔6〕 중 어느 것에 기재된 방법.

〔8〕

제3 프라이머가 비뉴클레오티드 성분이 부가되어 있는, 상기 〔4〕 내지 〔7〕 중 어느 것에 기재된 방법:

여기서, 당해 비뉴클레오티드 성분은, 바람직하게는 히드록시기, 알데히드기, 카르복시기, 아미노기, 니트로기, 니트로소기, 티올기, 술폰산기, 플루오로기, 클로로기, 브로모기 및 요오드기로 이루어지는 군에서 선택되는 이온성 관능기, 또는 당해 이온성 관능기를 적어도 하나 이상 포함하는 분자이고, 더욱 바람직하게는 표 1에 나타나는 형광 물질이다.

1염기 치환 혹은 점 변이를 해석하기 위한 ASP에서는, 증폭산물의 길이가 동일하거나, 혹은 서열에 따라서는, 1 내지 2염기 정도 상이한 것은 있지만, 일반적으로 이온 교환 크로마토그래피에서의 분리 검출은 곤란하다.

이에 비해, ASP 및 그것과 쌍을 이루는 프라이머의 적어도 하나의 5' 말단에, 비뉴클레오티드 성분을 부가하고 PCR에 의해 증폭하면, 그 증폭산물에 1개 혹은 2개의 비뉴클레오티드 성분이 표지되어 있게 된다. 이 약간의 표지물의 물성 및 개수의 차이에 의해, 증폭산물의 이온 강도가 미묘하게 변화되고, 이온 교환 크로마토그래피에서의 용출 위치가 변화되며, 이 특성을 사용하여 증폭산물의 분리 검출하는 것이 가능해진다고 추측된다.

본 발명에서 사용되는 대립 유전자 특이적 프라이머는, 그 유전자 다형이나 유전자 변이의 염기 서열에 대하여 특이적으로 결합할 수 있는 프라이머이면 되고, 1염기 치환뿐만 아니라, 삽입이나 결실 변이를 포함하는 염기 서열 등에 특이적이고, 또한 본 발명에 의한 분리에 적용할 수 있는 것이라면 특별히 제한없이 이용 가능하다.

본 발명에 사용되는 비뉴클레오티드 성분으로서는, 프라이머의 5' 말단의 전하에 변화를 일으키게 하는 물질인 것이 적합하고, 그것이 부가된 대립 유전자 특이적 프라이머를 사용하여 증폭된 유전자 증폭산물을, 이온 교환 크로마토그래피를 사용하여 분석 또는 판별하는 경우에, 용출 패턴이 변화되는 것이라면 특별히 제한은 없다. 바람직한 비뉴클레오티드 성분으로서는, 예를 들어 이온성 관능기 그 자체, 혹은 이온성 관능기를 적어도 하나 이상 포함하는 분자를 들 수 있다. 이온성 관능기는 특별히 제한되지 않고, 히드록시기, 알데히드기, 카르복시기, 아미노기, 니트로기, 니트로소기, 티올기, 술폰산기, 플루오로기, 클로로기, 브로모기, 요오드기 등을 예시할 수 있다. 프라이머의 수식으로서 사용되는 형광 색소도 비뉴클레오티드 성분으로서 이용할 수 있고, 예를 들어 Alexa Fluor 시리즈, Cy 시리즈, ATTO 시리즈, DY 시리즈, DyLight 시리즈, FAM, TAMRA 등을 들 수 있다. 또한, 디곡신(DIG), 비오틴 등의 기능성 물질의 부가나 아미드기 수식 등도 제한 없이 이용 가능하다. 비뉴클레오티드 성분으로서 이용할 수 있는 형광 색소의 예를, 표 1에 나타낸다.

이들 수식 물질의 효과는, 대립 유전자 특이적 프라이머를 사용하여 증폭된 유전자 증폭산물의 길이를 최적화함으로써, 더욱 발휘된다. 즉, 동일한 수식 물질이라도, 유전자 증폭산물의 길이가 짧을수록 그 차이가 현저하게 나타난다. 따라서, 본 발명에서는, 5' 말단에 비뉴클레오티드 성분이 부가된 대립 유전자 특이적 프라이머를 사용하여 증폭된 유전자 증폭산물을, 이온 교환 크로마토그래피를 사용하여 분석 또는 판별할 때에, 비뉴클레오티드 성분의 종류뿐만 아니라, 유전자 증폭산물의 길이를 적절하게 조합함으로써, 본 발명의 효과를 최대한으로 발휘하는 것이 가능해진다.

[표 1-1]

[표 1-2]

[표 1-3]

[표 1-4]

[표 1-5]

[표 1-6]

[표 1-7]

[표 1-8]

[표 1-9]

본 발명의 방법에 있어서, 이온 교환 크로마토그래피로서, 양이온 교환 크로마토그래피 또는 음이온 교환 크로마토그래피를, 측정 대상 물질의 등전점, 용리액(이동상이라고도 함)의 pH나 염 농도 등을 고려하여 선택할 수 있다. 핵산 등, 부(-)의 전하를 띠고 있는 측정 대상 물질의 경우에는, 음이온 교환 크로마토그래피를 사용하는 것이 바람직하다.

본 명세서에 있어서, 「핵산」이란, 리보핵산(이하, ribonucleic acid, RNA라고도 함)과 데옥시리보핵산(이하, deoxyribonucleic acid, DNA라고도 함)의 총칭이고, 염기, 당 및 인산으로 이루어지는 뉴클레오티드가, 포스포디에스테르 결합으로 연결된 것을 의미한다. 본 발명에 있어서, 추출되는 핵산은 DNA 및 RNA 중 어느 것이어도 되고, 또한 단편화되어 있는 것이어도 되고, 되어 있지 않은 것이어도 대상이 된다. 해당 핵산의 유래는 동물, 식물, 미생물을 포함하는 모든 생물, 바이러스를 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다. 또한, 세포핵 내의 핵산이나, 미토콘드리아나 엽록체나 핵소체 등으로 대표되는 소기관이 유지하는 핵외 유래의 핵산이어도 된다. 또한, 인공적 합성된 핵산이나, 일반적으로 벡터로서 사용되는 플라스미드나 바이러스 벡터여도 된다. 본 발명의 방법에 바람직한 핵산으로서 이중쇄 데옥시리보핵산을 예시할 수 있고, 보다 바람직한 핵산으로서, 그의 염기 서열에 1염기 다형, 점 변이 및/또는 결실·삽입 변이가 생기는 염기 서열을 포함하는 이중쇄 데옥시리보핵산을 예시할 수 있다.

PCR 증폭의 방법으로서는 특별히 제한은 없고, 증폭 대상의 핵산의 서열, 길이, 양 등에 따라 공지의 방법을 적절히 선택하여 사용할 수 있다. PCR 증폭산물의 쇄 길이는, PCR의 증폭 시간의 단축, 그리고 이온 교환 크로마토그래피에서의 분석 시간의 단축이나 분리 성능의 유지 등의 요소를 감안하여 적절히 선택할 수 있다. 예를 들어, PCR 증폭산물의 쇄 길이의 상한은, 1000bp 이하, 700bp 이하, 600bp 이하, 500bp 이하, 400bp 이하, 300bp 이하, 200bp 이하, 190bp 이하, 180bp 이하, 170bp 이하, 160bp 이하, 150bp 이하, 140bp 이하, 130bp 이하, 또는 120bp 이하이다. 다른 양태에 있어서는, PCR 증폭산물의 쇄 길이의 상한은, 110bp 이하, 100bp 이하, 90bp 이하, 80bp 이하, 70bp 이하, 60bp 이하, 또는 50bp 이하이다. 한편, PCR 증폭산물의 쇄 길이의 하한은, 30bp 이상, 또는 40bp 이상이다. 다른 양태에 있어서는, PCR 증폭산물의 쇄 길이의 하한은 40bp 이상, 50bp 이상, 60bp 이상, 70bp 이상, 80bp 이상, 90bp 이상, 100bp 이상, 또는 110bp 이상이다. 다른 바람직한 양태에 있어서는, PCR 증폭산물의 쇄 길이는 40bp 이상 120bp 이하이다.

본 발명의 방법으로 검출 가능한 1염기 다형, 점 변이 및/또는 결실·삽입 변이로서, UGT1A1*28다형(rs8175347), UGT1A1*6다형(rs4148323), JAK2 1849G>T(V617F) 변이 부위(rs77375493), MPL 1589G>T(W515L) 변이 부위(rs121913615), MPL 1588:1599TG>AA(W515K) 변이 부위(rs121913616)를 예시할 수 있다.

[도면의 간단한 설명]

도 1은 3개의 형광 표지 프라이머(서열 번호 3, 7 및 8)에 의한 증폭산물의 용출 피크를 겹쳐 쓴 결과를 나타낸다.

도 2는 비뉴클레오티드 성분 부가 ASP를 사용한 UGT1A1 유전자의 *6다형 부위로부터의 증폭산물의 분리 및 검출을 나타낸다.

도 3은 비뉴클레오티드 성분 부가 ASP를 사용한 MPL 유전자의 코돈 515 부위 주변으로부터의 증폭산물의 분리 및 검출을 나타낸다.

[실시예]

이하, 실시예에 의해 본 발명을 상세하게 설명하지만, 본 발명은 이하의 실시예에 한정되는 것은 아니다.

[실시예 1] 비뉴클레오티드 성분 부가 ASP를 사용한 UGT1A1 유전자의 *6다형 부위로부터의 증폭산물

인간 UGT1A1 유전자의 *6 대립 유전자(211G>A)이고, 미스매치 염기를 1개소만 넣은 당해 대립 유전자를 특이적으로 증폭할 수 있는 ASP(서열 번호 1) 및 그의 리버스 프라이머(서열 번호 12)를 준비하고(시그마 알드리치 가부시키가이샤에 위탁), ASP의 5' 말단에, 비뉴클레오티드 성분을 수식한 프라이머를 별도로 더 준비했다(서열 번호 2는 서모 피셔 가부시키가이샤에 위탁, 서열 번호 8은 유로핀 제노믹스 가부시키가이샤에 위탁, 서열 번호 4 및 6은 Integrated DNA Technologies MBL 가부시키가이샤에 위탁, 그 이외는 시그마 알드리치 가부시키가이샤에 위탁). 서열 번호, 프라이머 서열, 올리고뉴클레오티드의 길이(bp), 비뉴클레오티드 성분의 종류, 그리고 비뉴클레오티드 성분의 여기 파장 및 형광 파장(㎚)을 표 2에 나타낸다. 또한, 실시예 1 내지 3에 있어서, 「Alexa488」은 표 1의 「Alexa Fluor 488 메타-이성체」와 「Alexa Fluor 488 파라-이성체」의 혼합물을 나타내고, 「FAM」은 표 1의 「5-FAM」을 나타내고, 「ATTO488」은 표 1의 「ATTO488」을 나타내고, 「Cy3」은 표 1의 「Cy3」을 나타내고, 「Alexa546」은 표 1의 「Alexa Fluor 546」을 나타내고, 「TAMRA」는 표 1의 「TAMRA」를 나타내고, 「Cy3.5」는 표 1의 「Cy3.5」를 나타내고, 「Cy5」는 표 1의 「Cy5」를 나타내고, 「Cy5.5」는 표 1의 「Cy5.5」를 나타내고, 「DIG」는 표 1의 「Digoxigenin」을 나타낸다.

[표 2]

· 시약, 증폭 조건 및 이온 교환 크로마토그래피 조건

이하의 시약을 포함하는 25μL의 반응 용액을 제조하여, CFX96(바이오래드사)으로 2스텝의 대립 유전자 특이적 PCR에 의한 증폭을 행하였다. 이 검토에서는, UGT1A1 유전자*6의 대립 유전자가 호모 접합체의 사람들로부터 채취한 정제 DNA를 사용했다.

[표 3]

그 결과를 표 4에 나타낸다. 모든 증폭산물의 쇄 길이는 117bp가 되지만, 미표지 증폭산물과 비교하여, 각종 비뉴클레오티드 성분이 표지된 프라이머를 사용하여 증폭된 산물의 이온 교환 크로마토그래피에서의 용출 시간(유지 시간이라고도 함)은 빨라지거나 지연되거나 하여 다양한 패턴을 나타내는 흥미 깊은 지견이 얻어졌다. 그 중에서, 특히 용출 시간의 변화가 컸던 3개의 형광 표지 프라이머(서열 번호 3, 7 및 8)에 의한 증폭산물의 용출 피크를 겹쳐 쓴 결과를 도 1에 나타낸다. 이 결과는, 동일한 부위에 몇 가지 패턴이 있는 유전자 다형이나 유전자 변이를 특정하기 위한 특이적인 프라이머마다, 표지하는 비뉴클레오티드 성분을 변화시킴으로써, 가령 그 증폭산물의 쇄 길이가 동일해지는 경우에 있어서도, 1회의 이온 교환 크로마토그래피 분리에 있어서, 복수 변이의 멀티플렉스 해석이 가능한 것을 지지하는 것이다.

[표 4]

[실시예 2] 비뉴클레오티드 성분 부가 ASP를 사용한 UGT1A1 유전자의 *6다형 부위로부터의 증폭산물의 분리 및 검출

*6 대립 유전자 검출용의 프라이머는, 실시예 1에 기재된 서열 번호 3을 사용했다. 한편, *6다형 부위에 있어서의 야생형 검출용의 프라이머는, 실시예 1에 기재된 서열 번호 1과 마찬가지로, 비표지에서 미스매치 염기를 1개소에 도입하여 야생형을 특이적으로 증폭할 수 있는 ASP(서열 번호 13)를 별도로 준비했다. 이 검토에서는, UGT1A1 유전자 *6의 유전자 다형 부위가, 야생형, *6 대립 유전자의 헤테로 접합체 및 호모 접합체의 사람들로부터 채취한 정제 DNA를 사용했다.

서열 번호 13

5'-GTTGTACATCAGAGACGAA-3'

· 시약, 증폭 조건 및 이온 교환 크로마토그래피 조건

이하의 시약을 포함하는 25μL의 반응 용액을 제조하여, CFX96(바이오래드사)으로 2스텝의 대립 유전자 특이적 PCR에 의한 증폭을 행하였다. 이온 교환 크로마토그래피의 측정은, 실시예 1과 동일한 조건을 사용하여 실시했다.

[표 5]

그 결과를 도 2에 나타낸다. *6 대립 유전자의 헤테로 접합체인 검체 1에서는, 미표지 증폭산물의 용출 위치(용출 시간 8.6분 부근)와 FAM 표지 증폭산물의 용출 위치(용출 시간 9.2분)에 2개의 용출 피크를 인정하고, *6 대립 유전자의 호모 접합체인 검체 2에서는, FAM 표지 증폭산물의 용출 위치에만 용출 피크를 인정하고, 야생형인 검체 3에서는, 미표지 증폭산물의 용출 위치만 용출 피크를 인정한 점에서, UGT1A1 유전자의 *6다형 부위의 유전자형을 용이하고 또한 정확하게 판별하는 것이 가능한 것을 알 수 있었다.

실시예 3 비뉴클레오티드 성분 부가 ASP를 사용한 MPL 유전자 변이(코돈 515)의 분리 검출

MPL 유전자의 코돈 515에는, W515L, W515K, W515A의 3개의 변이 패턴이 있고, 각각 1543-1544번째의 2염기의 서열이 상이하다. 포워드 프라이머로서, 각각의 변이형 검출용의 미표지 ASP(서열 번호 14 내지 16)를 준비하고, 그것과 쌍이 되는 리버스 프라이머(서열 번호 17)를 준비했다. 별도로, W515K용의 비뉴클레오티드 성분을 부가한 ASP(서열 번호 18, 19, 20)도 준비했다. 또한, 각각의 유전자 변이 서열(서열 번호 21 내지 23)을 삽입한 플라스미드 DNA를, 검체용으로서 준비(유로핀 제노믹스 가부시키가이샤에 위탁)했다.

서열 번호 14(W515L용 ASP)

5'-CTGCTGCTGCTGAGGTTTC-3'

서열 번호 15(W515K용 ASP)

5'-CTGCTGCTGCTGAGGAA-3'

서열 번호 16(W515A용 ASP)

5'-TGCTGCTGCTGAGCGC-3'

서열 번호 17(공통 리버스 프라이머)

5'-GGCGGTACCTGTAGTGTGC-3'

서열 번호 18(비오틴 표지 W515K용 ASP)

5'-Biotin-CTGCTGCTGCTGAGGAA-3'

서열 번호 19(아미노기 표지 W515K용 ASP)

5'-NH2-CTGCTGCTGCTGAGGAA-3'

서열 번호 20(Cy3.5 형광 색소 표지 W515K용 ASP)

5'-Cy3.5-CTGCTGCTGCTGAGGAA-3'

서열 번호 21(W515L 유전자 변이 서열)

서열 번호 22(W515K 유전자 변이 서열)

서열 번호 23(W515A 유전자 변이 서열)

· 시약, 증폭 조건 및 이온 교환 크로마토그래피 조건

이하의 시약을 포함하는 25μL의 반응 용액을 제조하여, CFX96(바이오래드사)으로 2스텝의 대립 유전자 특이적 PCR에 의한 증폭을 행하였다.

[표 6]

도 3에, 비뉴클레오티드 성분 부가 ASP를 사용한 MPL 유전자의 코돈 515 부위 주변으로부터의 증폭산물의 이온 교환 크로마토그래피 분리 및 검출 결과를 나타낸다. 우선, 미표지 ASP를 사용한 경우의 이온 교환 크로마토그래피 분리 결과에 대하여, W515A의 증폭산물(45bp)의 용출 위치(용출 시간 3.82분)는 W515L 및 W515K의 증폭산물(각각 46bp)의 용출 위치와 상이한 점에서 판별 가능하지만, W515L과 W515K의 증폭산물은, 거의 동일한 용출 위치(용출 시간 4.42분과 4.35분)가 되고, 변이의 유무는 확인되지만, 그의 패턴의 동정은 할 수 없는 것이 판명되었다. 그것에 비해, W515K용의 비뉴클레오티드 성분을 부가한 ASP(서열 번호 18, 19, 20)를 사용한 증폭산물의 용출 위치는 각각, 4.16분, 3.91분, 4.97분이 되고, W515L의 용출 위치와 겹치지 않는 것에 더하여, W515A의 증폭산물의 용출 위치에도 겹치지 않는 것도 확인되었다.

이 결과는, ASP를 사용한 증폭산물의 길이가 유사하고, 이온 교환 크로마토그래피를 사용한 분리 검출에서 용출 위치에 의한 차가 인정되지 않는 경우에, ASP에 적당한 비뉴클레오티드 성분을 부가함으로써, 분리 검출이 가능해지는 것을 지지한다.

상기한 지견을 근거로 하면, 복수의 ASP에 이온 교환 크로마토그래피에 의한 용출 시간이 변화되는 복수의 비뉴클레오티드 성분을 부가하고, 그것과 쌍을 이루는 프라이머에도 비뉴클레오티드 성분을 더 부가함으로써, 다양한 용출 시간을 조정하는 것이 가능해진다. 또한, 비뉴클레오티드 성분에, 형광 색소를 사용함으로써, 형광 파장이 크로스 토크하지 않는 것을 선택함으로써, 용출 시간에 차가 없어도, 검출하는 파장으로 판별하는 것도 가능해진다.

증폭산물의 검출 방법으로서는, 증폭 반응한 시약을 그대로 이온 교환 크로마토그래피로 분리하는 방법 이외에, 복수의 증폭 시약을 따로따로 준비하고, 그 혼합액을 이온 교환 크로마토그래피로 분리하는 방법도 가능하다.

따라서, 본 발명에 따르면, 종래법에서는 곤란했던 복수의 유전자 다형의 유전자형이나 1염기 치환을, 용이하고 또한 정확하게 검출할 수 있고, 근년 수요가 높아지고 있는 유전자 검사의 멀티플렉스화에 대응 가능한 방법이 제공된다.

SEQUENCE LISTING <110> SEKISUI MEDICAL CO. LTD. <120> Sigle nucleotide substitution detection method using ion exchange chromatography <130> 17P01204 <160> 23 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 gttgtacatc agagacata 19 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> modified_base <222> (1)..(1) <223> labeled with Alexa488 <400> 2 gttgtacatc agagacata 19 <210> 3 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> modified_base <222> (1)..(1) <223> labeled with FAM <400> 3 gttgtacatc agagacata 19 <210> 4 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> modified_base <222> (1)..(1) <223> labeled with ATTO488 <400> 4 gttgtacatc agagacata 19 <210> 5 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> modified_base <222> (1)..(1) <223> labeled with Cy3 <400> 5 gttgtacatc agagacata 19 <210> 6 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> modified_base <222> (1)..(1) <223> labeled with Alexa546 <400> 6 gttgtacatc agagacata 19 <210> 7 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> modified_base <222> (1)..(1) <223> labeled with TAMRA <400> 7 gttgtacatc agagacata 19 <210> 8 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> modified_base <222> (1)..(1) <223> labeled with Cy3.5 <400> 8 gttgtacatc agagacata 19 <210> 9 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> modified_base <222> (1)..(1) <223> labeled with Cy5 <400> 9 gttgtacatc agagacata 19 <210> 10 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> modified_base <222> (1)..(1) <223> labeled with Cy5.5 <400> 10 gttgtacatc agagacata 19 <210> 11 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> modified_base <222> (1)..(1) <223> labeled with DIG <400> 11 gttgtacatc agagacata 19 <210> 12 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 12 gaatcattct caaaaacatt atgccc 26 <210> 13 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 13 gttgtacatc agagacgaa 19 <210> 14 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 14 ctgctgctgc tgaggtttc 19 <210> 15 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 15 ctgctgctgc tgaggaa 17 <210> 16 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 16 tgctgctgct gagcgc 16 <210> 17 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 17 ggcggtacct gtagtgtgc 19 <210> 18 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> Biotin <400> 18 ctgctgctgc tgaggaa 17 <210> 19 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> NH2 <400> 19 ctgctgctgc tgaggaa 17 <210> 20 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> Cy3.5 <400> 20 ctgctgctgc tgaggaa 17 <210> 21 <211> 316 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> plasmid <220> <221> allele <222> (151)..(151) <223> W515L <400> 21 cagagtaggg gctggctgga tgagggcggg gctccggccc gggtgggccg aagtctgacc 60 ctttttgtct cctagcctgg atctccttgg tgaccgctct gcatctagtg ctgggcctca 120 gcgccgtcct gggcctgctg ctgctgaggt tgcagtttcc tgcacactac aggtaccgcc 180 cccgccaggc aggagactgg cggtggacca ggtggagccg aaggcctgta aacaggcatt 240 cttggttcgc tctgtgaccc cagatctccg tccaccgccc gtgcgcacct acggcttcgc 300 cacttcctgc acgtca 316 <210> 22 <211> 316 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> plasmid <220> <221> allele <222> (150)..(151) <223> W515K <400> 22 cagagtaggg gctggctgga tgagggcggg gctccggccc gggtgggccg aagtctgacc 60 ctttttgtct cctagcctgg atctccttgg tgaccgctct gcatctagtg ctgggcctca 120 gcgccgtcct gggcctgctg ctgctgagga agcagtttcc tgcacactac aggtaccgcc 180 cccgccaggc aggagactgg cggtggacca ggtggagccg aaggcctgta aacaggcatt 240 cttggttcgc tctgtgaccc cagatctccg tccaccgccc gtgcgcacct acggcttcgc 300 cacttcctgc acgtca 316 <210> 23 <211> 316 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> allele <222> (150)..(151) <223> W515A <400> 23 cagagtaggg gctggctgga tgagggcggg gctccggccc gggtgggccg aagtctgacc 60 ctttttgtct cctagcctgg atctccttgg tgaccgctct gcatctagtg ctgggcctca 120 gcgccgtcct gggcctgctg ctgctgaggg cgcagtttcc tgcacactac aggtaccgcc 180 cccgccaggc aggagactgg cggtggacca ggtggagccg aaggcctgta aacaggcatt 240 cttggttcgc tctgtgaccc cagatctccg tccaccgccc gtgcgcacct acggcttcgc 300 cacttcctgc acgtca 316

Claims

2종류 이상의 대립 유전자 특이적 프라이머를 사용하여 증폭된 2종류 이상의 유전자 증폭산물을, 이온 교환 크로마토그래피를 사용하여 판별하는 방법으로서, 상기 2종류 이상의 대립 유전자 특이적 프라이머의 적어도 하나의 5' 말단이, 비뉴클레오티드 성분이 부가되어 있는 것을 특징으로 하는, 유전자 변이를 검출하는 방법.
제1항에 있어서, 이온 교환 크로마토그래피가 음이온 교환 크로마토그래피인 검출 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 비뉴클레오티드 성분이, 프라이머의 5' 말단의 전하에 변화를 일으키게 하는 물질인 검출 방법.
이하의 공정을 포함하는, 시료 중의 이중쇄 데옥시리보핵산에 포함되는 다형 부위에 있어서의 적어도 하나의 대립 유전자의 존재를 검출하는 방법:
(a) 다형 부위를 포함하는 이중쇄 데옥시리보핵산을 포함하는 시료를 제공하는 공정;
(b) 제1 프라이머, 제2 프라이머 및 제3 프라이머를 제공하는 공정,
여기서, 제1 프라이머의 서열은, 당해 다형 부위에 있어서 제1 대립 유전자를 갖는 이중쇄 데옥시리보핵산의 제2 쇄에 상보적이고 또한 3' 말단의 3개의 염기 중 어느 1개 또는 2개 또는 3개의 염기 혹은 3' 말단의 2개의 염기 중 한쪽 또는 양쪽의 염기가 당해 다형 부위에 대응하고,
제2 프라이머의 서열은, 당해 다형 부위에 있어서 제2 대립 유전자를 갖는 이중쇄 데옥시리보핵산의 제2 쇄에 상보적이고 또한 3' 말단의 3개의 염기 중 어느 1개 또는 2개 또는 3개의 염기 혹은 3' 말단의 2개의 염기 중 한쪽 또는 양쪽의 염기가 당해 다형 부위에 대응하고,
제3 프라이머의 서열은, 당해 다형 부위를 포함하지 않고 또한 당해 이중쇄 데옥시리보핵산의 제1 쇄에 상보적이고,
제1 프라이머 및 제2 프라이머의 적어도 하나가, 비뉴클레오티드 성분이 부가되어 있다;
(c) 폴리메라아제 연쇄 반응을 행하는 공정,
여기서, 당해 폴리메라아제 연쇄 반응은, 제1 대립 유전자를 갖는 이중쇄 데옥시리보핵산의 제2 쇄에 하이브리다이즈한 제1 프라이머로부터의 폴리메라아제에 의한 쇄의 신장이, 제1 대립 유전자를 갖는 이중쇄 데옥시리보핵산의 제2 쇄에 하이브리다이즈한 제2 프라이머로부터의 폴리메라아제에 의한 쇄의 신장과 비교하여 우선적으로 발생하고, 또한 제2 대립 유전자를 갖는 이중쇄 데옥시리보핵산의 제2 쇄에 하이브리다이즈한 제2 프라이머로부터의 폴리메라아제에 의한 쇄의 신장이, 제2 대립 유전자를 갖는 이중쇄 데옥시리보핵산의 제2 쇄에 하이브리다이즈한 제1 프라이머로부터의 폴리메라아제에 의한 쇄의 신장과 비교하여 우선적으로 발생하는 조건에서 행해진다;
(d) 당해 폴리메라아제 연쇄 반응의 증폭산물을 이온 교환 크로마토그래피에 가하는 공정;
여기서, 제1 프라이머 및 제3 프라이머로부터의 폴리메라아제 연쇄 반응의 증폭산물과 제2 프라이머 및 제3 프라이머로부터의 폴리메라아제 연쇄 반응의 증폭산물의 크기의 차는, 0염기쌍, 1염기쌍, 2염기쌍, 3염기쌍, 4염기쌍, 5염기쌍, 6염기쌍, 7염기쌍, 8염기쌍, 9염기쌍 또는 10염기쌍이다; 및
(e) 제1 및 제2 대립 유전자의 한쪽 또는 양쪽의 존재를 상기 증폭산물의 용출 위치 또는 용출 시간에 기초하여 검출하는 공정.
제4항에 있어서, 상기 (a)의 공정이, 인간 등의 포유류 체세포 검체로부터 게놈 DNA를 추출하는 공정인, 방법.
제4항 또는 제5항에 있어서, 상기 다형 부위가, UGT1A1*28다형(rs8175347), UGT1A1*6다형(rs4148323), JAK2 1849G>T(V617F) 변이 부위(rs77375493), MPL 1589G>T(W515L) 변이 부위(rs121913615), 또는 MPL 1588:1599TG>AA(W515K) 변이 부위(rs121913616)인, 방법.
제4항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 비뉴클레오티드 성분이, 프라이머의 5' 말단의 전하에 변화를 일으키게 하는 물질인, 방법.
제4항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 제3 프라이머가 비뉴클레오티드 성분이 부가되어 있는, 방법.