KR20120124029A

KR20120124029A - 다형 검출용 프로브, 다형 검출 방법, 약효 판정 방법 및 다형 검출용 시약 키트

Info

Publication number: KR20120124029A
Application number: KR1020120044372A
Authority: KR
Inventors: 아키 이구치
Original assignee: 아크레이 가부시키가이샤
Priority date: 2011-05-02
Filing date: 2012-04-27
Publication date: 2012-11-12
Also published as: CN102766682B; EP2520665A1; JP2012244991A; US8624018B2; JP5757909B2; CN102766682A; US20120282608A1; EP2520665B1; KR101581388B1

Abstract

[과제] ABCC2 유전자의 다형을, 높은 감도로, 간편하게 검출할 수 있는 다형 검출용 프로브를 제공한다.
[해결 수단] (P1) 서열 번호1에 나타내는 서열 중 207번째?217번째의 염기를 포함하는 염기길이 11?60의 서열이며, 서열 번호1에 있어서의 217번째의 염기에 대응하는 염기가 C인 것 이외는 서열 번호1과 동일한 염기를 갖는 염기 서열에 대하여 적어도 80% 이상의 동일성을 가지고, 서열 번호1에 나타내는 서열 중 217번째의 염기에 대응하는 염기가 형광 색소로 표지되어 있는 형광 표지 올리고뉴클레오티드, 또는 (P1') 상기 서열 번호1과 동일한 염기를 갖는 염기 서열의 상보쇄에 대하여 스트린젠트한 조건 하에서 하이브리다이즈하고, 서열 번호1에 나타내는 서열 중 217번째의 염기에 대응하는 염기가 형광 색소로 표지되어 있는 형광 표지 올리고뉴클레오티드인 ABCC2 유전자의 다형을 검출하기 위한 다형 검출용 프로브.

Description

다형 검출용 프로브, 다형 검출 방법, 약효 판정 방법 및 다형 검출용 시약 키트{PROBE FOR DETECTING POLYMORPHISM, METHOD OF DETECTING POLYMORPHISM, METHOD OF EVALUATING DRUG EFFICACY AND REAGENT KIT FOR DETECTING POLYMORPHISM}

본 발명은, 다형 검출용 프로브, 다형 검출 방법, 약효 판정 방법 및 다형 검출용 시약 키트에 관한 것이다.

ABCC2 유전자는, 간세포의 담관(膽管)에 국재(局在)하여, 글루타티온, 글루쿠론산, 황산 포합체(抱合體)를 담관으로부터 담관에 수송하는 트랜스 포터를 코드하고 있어, 다양한 약제의 대사에 관여하고 있다고 생각되고 있다.

또한, 최근, 일본인에게 있어서의 ABCC2 유전자의 1염기 다형(SNPs)을 해석한 바, 다양한 유전자 다형을 알아냈다. 또한, ABCC2 유전자의 5' 말단으로부터 24염기 근방의 시토신(C)이, 티민(T)으로 변이하고 있는 C-24T를 측정하는 것에 의해, 약제내성(藥劑耐性)을 예측할 수 있는 가능성이 시사되었다(Drug Metabolism and Disposition, 2002년, Vol.30, No.4, p.363-364 참조). 그 때문에, ABCC2 유전자의 다형을 정확하게 또한 단시간, 저비용으로 간편하게 측정하는 방법이 요망되고 있다.

또한, 약제의 감수성에 관련하는 변이로서는, 예를 들면, C-24T 변이의 외에도, MDR1 유전자의 26에 있어서의 3435번째의 시토신(C)이, 티민(T)으로 변이하고 있는 C3435T 변이 등의 다수의 변이가 알려져 있다(특허 제4454366호 공보 참조). 그 때문에, ABCC2 유전자의 다형뿐만 아니라, 기타의 약제 감수성에 관한 변이체를 C-24T 변이와 합하여 검출하는 것에 의해, 약제내성을 보다 고감도로 예측할 수 있는 가능성이 있다고 생각되고 있다.

현재, 유전자의 다형을 측정하는 방법으로서는, 측정하고 싶은 염기를 포함하는 부분을 증폭하도록 설계된 프라이머를 사용하여 PCR을 행하고, 당해 특정 염기에 있어서의 변이의 유무로 절단의 유무가 나눠지는 제한 효소로 절단하고, 그 후 전기 영동으로 절단됐는가 아닌가를 검출한다고 하는 방법(PCR-RFLP법)이 알려져 있다(Genet. Mol. Res., 2010년, 제9권, 제1호, p.34-40 참조).

또한, 변이를 포함하는 영역을 PCR법으로 증폭한 후, 형광 색소로 표지된 핵산 프로브를 사용하여 융해 곡선 분석을 행하고, 융해 곡선 분석의 결과에 의거하여 염기 서열의 변이를 해석하는 방법도 알려져 있다(일본 특개2002-119291호 공보 참조).

그러나, ABCC2 유전자의 변이에는, 상술과 같이 각종 변이가 존재하고 있다. 이 때문에, PCR-RFLP법에서는, PCR 반응 후에 증폭 산물을 취출(取出)하여 제한 효소 처리를 행할 필요가 있다. 그 때문에, 증폭 산물이 다음의 반응계에 혼입할 우려가 있어, 이에 기인하여 위(僞)양성, 위음성의 결과를 얻게 되버릴 경우가 있다. 또한, PCR 종료 후, 제한 효소로 처리를 행하고, 그 후 전기 영동을 행하기 때문에, 검출까지 필요한 시간도 매우 길어져 버릴 경우가 있다. 또한, 조작이 복잡하기 때문에, 자동화가 곤란하다.

이들의 현상을 고려하여, ABCC2 유전자 다형 검출을 위한 새로운 기술 개발이 요망되고 있었다.

본 발명은, ABCC2 유전자의 다형을, 높은 감도로, 간편하게 검출하는 것을 가능하게 하는 다형 검출용 프로브, 이를 사용하는 다형 검출 방법을 제공하는 것을 과제로 한다. 또한, 본 발명은, 당해 다형 검출 방법을 사용한 약효 판정 방법을 제공하는 것을 과제로 한다. 또한 본 발명은, 당해 다형 검출용 프로브를 사용한 다형 검출용 시약 키트를 제공하는 것을 과제로 한다.

본 발명은 이하와 같다.

<1> 하기 P1 및 P1'로 이루어지는 군에서 선택되는 일종의 형광 표지 올리고뉴클레오티드인 ABCC2 유전자의 다형을 검출하기 위한 다형 검출용 프로브;

(P1) 서열 번호1에 나타내는 서열 중 207번째?217번째의 염기를 포함하는 염기길이 11?60의 서열이며, 서열 번호1에 있어서의 217번째의 염기에 대응하는 염기가 시토신인 것 이외는 서열 번호1과 동일한 염기를 갖는 염기 서열에 대하여 적어도 80% 이상의 동일성을 가지고, 서열 번호1에 나타내는 서열 중 217번째의 염기에 대응하는 염기가 형광 색소로 표지되어 있는 형광 표지 올리고뉴클레오티드, 및

(P1') 서열 번호1에 나타내는 서열 중 207번째?217번째의 염기를 포함하는 염기길이 11?60의 서열이며, 서열 번호1에 있어서의 217번째의 염기에 대응하는 염기가 시토신인 것 이외는 서열 번호1과 동일한 염기를 갖는 염기 서열의 상보쇄에 대하여 스트린젠트한 조건 하에서 하이브리다이즈하고, 서열 번호1에 나타내는 서열 중 217번째의 염기에 대응하는 염기가 형광 색소로 표지되어 있는 형광 표지 올리고뉴클레오티드.

<2> 하기 P1 또는 하기 P1'의 상기 형광 표지 뉴클레오티드인 <1>에 기재된 다형 검출용 프로브;

(P1-1) 서열 번호1에 나타내는 서열 중 207번째?217번째의 염기를 포함하는 염기길이 11?60의 서열이며, 서열 번호1에 있어서의 217번째의 염기에 대응하는 염기가 시토신인 것 이외는 서열 번호1과 동일한 염기를 갖는 염기 서열에 대하여 적어도 80% 이상의 동일성을 가지고, 서열 번호1에 나타내는 서열 중 217번째의 염기에 대응하는 염기가 형광 색소로 표지되어 있으며, 또한 서열 번호1에 있어서의 207번째의 염기의 다형을 인식하는 형광 표지 올리고뉴클레오티드, 또는

(P1'-1) 서열 번호1에 나타내는 서열 중 207번째?217번째의 염기를 포함하는 염기길이 11?60의 서열이며, 서열 번호1에 있어서의 217번째의 염기에 대응하는 염기가 시토신인 것 이외는 서열 번호1과 동일한 염기를 갖는 염기 서열의 상보쇄에 대하여 스트린젠트한 조건 하에서 하이브리다이즈하고, 서열 번호1에 나타내는 서열 중 217번째의 염기에 대응하는 염기가 형광 색소로 표지되어 있으며, 또한 서열 번호1에 있어서의 207번째의 염기의 다형을 인식하는 형광 표지 올리고뉴클레오티드.

<3> 상기 형광 표지 올리고뉴클레오티드가, 형광 색소로 표지된 217번째의 염기를 3' 말단으로부터 세어 1?3번째에 갖는 <1> 또는 <2>에 기재된 다형 검출용 프로브.

<4> 상기 형광 표지 올리고뉴클레오티드가, 형광 색소로 표지된 217번째의 염기를 3' 말단에 갖는 <1>?<3>의 어느 한 항에 기재된 다형 검출용 프로브.

<5> 상기 형광 표지 올리고뉴클레오티드가, 표적 서열에 하이브리다이즈하지 않을 때에 형광을 발하고, 또한, 당해 표적 서열에 하이브리다이즈했을 때에 형광 강도가 감소하거나 또는 증가하는 <1>?<4>의 어느 한 항에 기재된 다형 검출용 프로브.

<6> 상기 형광 표지 올리고뉴클레오티드가, 표적 서열에 하이브리다이즈하지 않을 때에 형광을 발하고, 당해 표적 서열에 하이브리다이즈했을 때에 형광 강도가 감소하는 <1>?<5>의 어느 한 항에 기재된 다형 검출용 프로브.

<7> 상기 형광 표지 올리고뉴클레오티드의 염기길이가 12?55인 <1>?<6>의 어느 한 항에 기재된 다형 검출용 프로브.

<8> 상기 형광 표지 올리고뉴클레오티드의 염기길이가 15?45인 <1>?<7>의 어느 한 항에 기재된 다형 검출용 프로브.

<9> 상기 형광 표지 올리고뉴클레오티드의 염기길이가 18?35인 <1>?<8>의 어느 한 항에 기재된 다형 검출용 프로브.

<10> 상기 다형 검출용 프로브가, 융해 곡선 분석용의 프로브인, <1>?<9>의 어느 한 항에 기재된 다형 검출용 프로브.

<11> 상기 다형 검출용 프로브가, 서열 번호4, 서열 번호5, 서열 번호6, 서열 번호7, 서열 번호8, 서열 번호9, 서열 번호10, 서열 번호11, 서열 번호12, 서열 번호13, 서열 번호14, 서열 번호15 또는 서열 번호16에 나타내는 염기 서열을 갖는 <1>?<10>의 어느 한 항에 기재된 다형 검출용 프로브.

<12> <1>?<11>의 어느 한 항에 기재된 다형 검출용 프로브를 사용하는 것에 의해, ABCC2 유전자의 다형을 검출하는 다형 검출 방법.

<13> (Ⅰ) <1>?<11>의 어느 한 항에 기재된 다형 검출용 프로브 및 시료 중의 1본쇄 핵산을 접촉시켜서, 상기 형광 표지 올리고뉴클레오티드 및 상기 1본쇄 핵산을 하이브리다이즈시켜서 하이브리드를 얻는 것과,

(Ⅱ) 상기 하이브리드를 포함하는 시료의 온도를 변화시킴으로써, 상기 하이브리드를 해리시켜, 상기 하이브리드의 해리에 의거하는 형광 시그널의 변동을 측정하는 것과,

(Ⅲ) 상기 형광 시그널의 변동에 의거하여 하이브리드의 해리 온도인 Tm값을 측정하는 것과,

(Ⅳ) 상기 Tm값에 의거하여, 상기 시료 중의 1본쇄 핵산에 있어서의, ABCC2 유전자의 다형의 존재를 검출하는 것

을 포함하는, <12>에 기재된 다형 검출 방법.

<14> 상기 (Ⅰ)의 전 또는 (Ⅰ)과 동시에 핵산을 증폭하는 것을 더 포함하는, <13>에 기재된 다형 검출 방법.

<15> MDR1 유전자의 다형 검출용 프로브 및 CYP3A5 유전자의 다형 검출용 프로브로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종의 프로브를 사용하여, MDR1 유전자 및 CYP3A5 유전자로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 한쪽의 다형을 검출하는 것을 더 포함하는 <12>?<14>의 어느 한 항에 기재된 다형 검출 방법.

<16> <12>?<15>의 어느 한 항에 기재된 다형 검출 방법에 의해, ABCC2 유전자의 다형을 검출하는 것과,

검출된 다형의 유무에 의거하여, 약제에 대한 내성 또는 약제의 약효를 판정하는 것을 포함하는, 약제의 약효 판정 방법.

<17> <1>?<11>의 어느 한 항에 기재된 다형 검출용 프로브를 포함하는, ABCC2 유전자의 다형을 검출하기 위한 다형 검출용 시약 키트.

<18> 상기 P1 형광 표지 올리고뉴클레오티드가 하이브리다이즈하는 서열을 포함하는 영역을 증폭 가능한 프라이머를 더 포함하는, <17>에 기재된 다형 검출용 시약 키트.

<19> MDR1 유전자의 다형을 검출하기 위한 프로브 및 CYP3A5 유전자의 다형을 검출하기 위한 프로브로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종 이상의 다형 검출용 프로브를 더 포함하는, <17> 또는 <18>에 기재된 다형 검출용 시약 키트.

본 발명에 의하면, ABCC2 유전자의 다형을, 높은 감도로, 간편하게 검출하는 것을 가능하게 하는 다형 검출용 프로브, 이를 사용하는 다형 검출 방법을 제공할 수 있다. 또한, 본 발명은, 당해 다형 검출 방법을 사용한 약효 판정 방법을 제공할 수 있다. 또한 본 발명은, 당해 다형 검출용 프로브를 사용한 다형 검출용 시약 키트를 제공할 수 있다.

[도 1] (A)는, 핵산 혼합물의 융해 곡선의 일례이며, (B)는 미분 융해 곡선의 일례.
[도 2] (A)?(F)는, 본 발명의 실시예1에 관한 시료의 미분 융해 곡선.
[도 3] (A)?(C)는, 본 발명의 실시예2에 관한 시료의 미분 융해 곡선.
[도 4] (A)?(C)는, 본 발명의 비교예1에 관한 시료의 미분 융해 곡선.

본 발명에 관한 ABCC2 유전자의 다형 검출용 프로브(이하, 단지 「다형 검출용 프로브」라고 하는 경우가 있다)는, 하기 P1 및 P1'로 이루어지는 군에서 선택되는 일종의 형광 표지 올리고뉴클레오티드인 ABCC2 유전자의 다형을 검출하기 위한 다형 검출용 프로브이다 :

본 발명에 관한 ABCC2 유전자 다형 검출 방법은, 상기 ABCC2 유전자의 다형을 검출하기 위한 다형 검출용 프로브를 적어도 1종 사용하여 ABCC2 유전자의 다형을 검출하는 것을 포함하는 방법이다.

본 발명에 관한 약제의 약효 판정 방법은, 상기 ABCC2 유전자 다형 검출 방법에 의해 ABCC2 유전자의 다형을 검출하는 것, 및 검출된 다형의 유무에 의거하여, 약제에 대한 내성 또는 약제의 약효를 판정하는 것을 포함하는 방법이다.

본 발명에 관한 다형 검출용 시약 키트는, ABCC2 유전자의 다형을 검출하기 위한 다형 검출용 프로브를 포함하는 것이다.

본 발명에 있어서의 「ABCC2 유전자」는, 이미 공지이며, 그 염기 서열은, NCBI의 액세션 No.NC_000010.10의 101542463?101611662의 서열을 의미한다. 서열 번호1의 염기 서열은, NCBI의 dbSNP의 액세션 No.rs717620의 1?611의 서열이며, ABCC2 유전자의 프로모터 영역에 있어서의 핵산의 염기 서열의 일부에 상당한다.

본 발명에 있어서, 검출 대상이 되는 시료 중의 시료 핵산, 다형 검출용 프로브 또는 프라이머의 개개의 서열에 관하여, 이들 서로의 상보적인 관계에 의거하여 기술된 사항은, 특별히 언급이 없는 한, 각각의 서열과, 각 서열에 대하여 상보적인 서열에 대해서도 적용된다. 각 서열에 대하여 상보적인 당해 서열에 대하여 본 발명의 사항을 적용할 때에는, 당해 상보적인 서열이 인식하는 서열은, 당업자에 있어서의 기술 상식의 범위 내에서, 대응하는 본 명세서에 기재된 서열에 상보적인 서열로, 명세서 전체를 바꿔 읽는 것으로 한다.

본 발명에 있어서, 「Tm값」이란, 2본쇄 핵산이 해리하는 온도(해리 온도 : Tm)로서, 일반적으로, 260㎚에 있어서의 흡광도가, 흡광도 전 상승분의 50%에 달했을 때의 온도로 정의된다. 즉, 2본쇄 핵산, 예를 들면, 2본쇄 DNA를 포함하는 용액을 가열해 가면, 260㎚에 있어서의 흡광도가 상승한다. 이는, 2본쇄 DNA에 있어서의 양쇄 간의 수소 결합이 가열에 의해 풀어지고, 1본쇄 DNA에 해리(DNA의 융해)하는 것이 원인이다. 그리고, 모든 2본쇄 DNA가 해리하여 1본쇄 DNA가 되면, 그 흡광도는 가열 개시시의 흡광도(2본쇄 DNA만의 흡광도)의 약 1.5배 정도를 나타내고, 이에 의해 융해가 완료했다고 판단할 수 있다. Tm값은, 이 현상에 의거해 설정된다. 본 발명에 있어서의 Tm값은, 특별히 언급이 없는 한, 흡광도가, 흡광도 전 상승분의 50%에 달했을 때의 온도를 말한다.

본 발명에 있어서, 올리고뉴클레오티드의 서열에 관하여 「3' 말단으로부터 세어 1?3번째」라고 하는 경우는, 올리고뉴클레오티드쇄의 3' 말단을 1번째로 센다.

본 명세서에 있어서 「공정」이라는 말은, 독립한 공정뿐만 아니라, 다른 공정과 명확하게 구별할 수 없는 경우에도 본 공정의 소기(所期)의 작용이 달성되면, 본 용어에 포함된다.

또한, 본 명세서에 있어서 「?」을 사용하여 나타낸 수치 범위는, 「?」의 전후에 기재되는 수치를 각각 최소값 및 최대값으로서 포함하는 범위를 나타낸다.

또한, 본 발명에 있어서, 조성물 중의 각 성분의 양은, 조성물 중에 각 성분에 해당하는 물질이 복수 존재할 경우에는, 특별히 언급이 없는 한, 조성물 중에 존재하는 당해 복수의 물질의 합계량을 의미한다.

이하, 본 발명에 대해 설명한다.

본 발명에 관한 ABCC2 유전자의 다형 검출용 프로브(이하, 단지 「다형 검출용 프로브」라 하기도 함)는, 하기 P1 및 P1'로 이루어지는 군에서 선택되는 일종의 형광 표지 올리고뉴클레오티드인 ABCC2 유전자의 다형을 검출하기 위한 다형 검출용 프로브이다 :

본 발명의 상기 P1 및 상기 P1'로 이루어지는 군에서 선택되는 일종의 형광 표지 올리고뉴클레오티드(이하, 「상기 P1 또는 상기 P1'의 형광 표지 올리고뉴클레오티드」라고도 한다)는, 서열 번호1에 나타내는 염기 서열의 207번째의 염기에 있어서의 다형을 검출할 수 있는 프로브이다.

또한, 본 발명의 상기 P1 및 P1'의 형광 표지 올리고뉴클레오티드는, 구체적으로는, 서열 번호1에 나타내는 서열 중 207번째?217번째의 염기를 포함하는 서열이다.

ABCC2 유전자의 야생형에서는, 서열 번호1에 나타내는 서열 중 207번째로 대응하는 염기는, C(시토신)이지만, 변이형에 있어서는 T(티민)로 변이하고 있고(이하, 「C-24T 변이」라고 칭한다), 당해 염기는, ABCC2 유전자의 -428번째?183번째의 염기 중, 207번째의 염기에 해당한다.

본 발명의 상기 P1의 형광 표지 올리고뉴클레오티드는, 서열 번호1에 있어서의 217번째의 염기에 대응하는 염기가 C(시토신)인 것 이외는 서열 번호1과 동일한 염기를 갖는 염기 서열에 대하여 상동성을 갖는 것을 요한다.

구체적으로는, 본 발명의 상기 P1의 형광 표지 올리고뉴클레오티드는, 서열 번호1에 있어서의 217번째의 염기에 대응하는 염기가 C(시토신)인 것 이외는 서열 번호1과 동일한 염기를 갖는 염기 서열에 대하여, 80% 이상의 동일성을 나타낸다.

또한, 검출 감도의 관점에서, 85% 이상의 동일성, 90% 이상의 동일성, 95% 이상의 동일성, 96% 이상의 동일성, 97% 이상의 동일성, 98% 이상의 동일성 또는 99% 이상의 동일성을 나타내도 된다.

본 발명의 상기 P1의 형광 표지 올리고뉴클레오티드와, 서열 번호1에 있어서의 217번째의 염기에 대응하는 염기가 C(시토신)인 것 이외는 서열 번호1과 동일한 염기를 갖는 염기 서열을 비교했을 때의 동일성이 80% 미만일 경우에는, 변이형의 ABCC2 유전자를 포함하는 시료 핵산에 대한 검출 감도가 낮아진다.

또한, 본 발명에 관한 상기 P1의 형광 표지 올리고뉴클레오티드로서는, 서열 번호1에 나타내는 서열 중 207번째?217번째의 염기를 포함하는 염기길이 11?60의 서열이며, 서열 번호1에 있어서의 217번째의 염기에 대응하는 염기가 시토신인 것 이외는 서열 번호1과 동일한 염기를 갖는 염기 서열에 대하여 적어도 80% 이상의 동일성을 가지고, 서열 번호1에 나타내는 서열 중 217번째의 염기에 대응하는 염기가 형광 색소로 표지되어 있으며, 또한 서열 번호1에 있어서의 207번째의 염기의 다형을 인식하는 형광 표지 올리고뉴클레오티드(P1-1)여도 된다.

당해 형광 표지 올리고뉴클레오티드는, 변이형의 ABCC2 유전자를 포함하는 시료 핵산에 대한 검출 감도가 높아지는 경향이 있다.

본 발명에 있어서의 상기 P1'의 형광 표지 올리고뉴클레오티드는, 서열 번호1에 있어서의 217번째의 염기에 대응하는 염기가 C(시토신)인 것 이외는 서열 번호1과 동일한 염기를 갖는 염기 서열의 상보쇄에 대하여 스트린젠트한 조건 하에서 하이브리다이즈하는 것을 요한다.

하이브리다이제이션은, 공지의 방법 혹은 그에 준하는 방법, 예를 들면, Molecular Cloning 3rd(J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 2001)에 기재된 방법 등을 따라서 행할 수 있다. 이 문헌은, 참조에 의해 본 명세서에 편입되는 것으로 한다.

스트린젠트한 조건이란, 특이적인 하이브리드가 형성되어, 비특이적인 하이브리드가 형성되지 않는 조건을 말한다. 전형적인 스트린젠트한 조건이란, 예를 들면, 칼륨 농도는 약 25mM?약 50mM, 및 마그네슘 농도는 약 1.0mM?약 5.0mM 중에 있어서, 하이브리다이제이션을 행하는 조건을 들 수 있다. 본 발명의 조건의 일례로서 Tris-HCl(pH8.6), 25mM의 KCl, 및 1.5mM의 MgCl₂ 중에 있어서 하이브리다이제이션을 행하는 조건을, 들 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 기타, 스트린젠트한 조건으로서는, Molecular Cloning 3rd(J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 2001)에 기재되어 있다. 이 문헌은, 참조에 의해 본 명세서에 편입되는 것으로 한다. 당업자는, 하이브리다이제이션 반응이나, 하이브리다이제이션 반응액의 염농도 등을 변화시키는 것에 의해, 이러한 조건을 용이하게 선택할 수 있다.

또한, 본 발명에 관한 상기 P1'의 형광 표지 올리고뉴클레오티드로서는, 서열 번호1에 나타내는 서열 중 207번째?217번째의 염기를 포함하는 염기길이 11?60의 서열이며, 서열 번호1에 있어서의 217번째의 염기에 대응하는 염기가 시토신인 것 이외는 서열 번호1과 동일한 염기를 갖는 염기 서열의 상보쇄에 대하여 스트린젠트한 조건에서 하이브리다이즈하고, 서열 번호1에 나타내는 서열 중 217번째의 염기에 대응하는 염기가 형광 색소로 표지되어 있으며, 또한 서열 번호1에 있어서의 207번째의 염기의 다형을 인식하는 형광 표지 올리고뉴클레오티드(P1'-1)여도 된다.

당해 형광 표지 올리고뉴클레오티드는, 특정한 염기 서열을 갖는 것에 더해, 서열 번호1에 있어서의 207번째의 염기의 다형을 인식한다고 하는 기능을 갖기 위해, 변이형의 ABCC2 유전자를 포함하는 시료 핵산에 대한 검출 감도가 높아지는 경향이 있다.

또한, 본 발명에 있어서의 상기 P1 또는 상기 P1'의 형광 표지 올리고뉴클레오티드에는, 상기 P1 또는 상기 P1'의 형광 표지 올리고뉴클레오티드에 염기가 삽입, 결실(缺失) 또는 치환한 형광 표지 올리고뉴클레오티드도 포함된다.

당해 염기가 삽입, 결실 또는 치환한 형광 표지 올리고뉴클레오티드는, 상기 P1 또는 상기 P1'의 형광 표지 올리고뉴클레오티드와 동등 정도의 작용을 나타내면 되며, 염기가 삽입, 결실 또는 치환되어 있을 경우, 그 삽입, 결실 또는 치환의 위치는, 특별히 한정되지 않는다. 삽입, 결실 또는 치환한 염기의 수로서는 1염기 또는 2염기 이상을 들 수 있고, 형광 표지 올리고뉴클레오티드 전체의 길이에 따라 다르지만, 예를 들면 1염기?10염기 또는 1염기?5염기를 들 수 있다.

삽입, 결실 또는 치환 그 중에서도, 본 발명에 있어서의 상기 P1 또는 상기 P1'의 형광 표지 올리고뉴클레오티드로서, 상기 P1 또는 상기 P1'의 형광 표지 올리고뉴클레오티드의 염기가 치환한 형광 표지 올리고뉴클레오티드를 들 수 있다.

치환의 위치는, 특별히 한정되지 않는다. 예를 들면, 검출 감도의 관점에서, 서열 번호1에 나타내는 서열 중 207번째?217번째의 염기 이외에 위치하는 염기가 치환되는 것을 들 수 있다. 치환되는 염기의 수로서는 1염기 또는 2염기 이상을 들 수 있다. 치환되는 염기의 수는, 형광 표지 올리고뉴클레오티드 전체의 길이에 따라 다르지만, 예를 들면 1염기?5염기, 또는 1염기?3염기를 들 수 있다.

본 발명의 상기 P1 또는 상기 P1'의 형광 표지 올리고뉴클레오티드의 길이로서는, 11mer?60mer인 것을 요한다. 상기 P1 또는 상기 P1'의 형광 표지 올리고뉴클레오티드의 길이가 10mer 이하나, 61mer 이상일 경우에는, ABCC2 유전자 다형의 검출 감도가 저하한다.

또한, 본 발명의 상기 P1 또는 상기 P1'의 형광 표지 올리고뉴클레오티드의 길이로서는, 12mer?55mer, 15mer?45mer, 또는 18mer?35mer로 할 수 있다. 12mer?55mer라는 범위로 하는 것에 의해, 예를 들면 검출 감도가 높아지는 등의 경향이 있다.

또한 상기 P1 또는 상기 P1'의 형광 표지 올리고뉴클레오티드의 염기길이를 변화시킴으로써, 예를 들면 P1 또는 상기 P1'의 형광 표지 올리고뉴클레오티드가 그 상보쇄(표적 서열)와 형성하는 하이브리드의 해리 온도인 Tm값을, 원하는 값으로 조정할 수 있다.

이하에 본 발명에 있어서의 상기 P1 또는 상기 P1'의 형광 표지 올리고뉴클레오티드에 있어서의 염기 서열의 일례를 표 1에 나타내지만, 본 발명은 이들에 한정되지 않는다.

또, 표 1에서는, 서열 번호1의 207번째의 염기에 대응하는 염기를 소문자로 표기하고, 당해 서열 번호1의 207번째로 대응하는 염기가 A, G, T 및 C의 경우인 올리고뉴클레오티드와, 각각의 형광 표지 올리고뉴클레오티드와의 하이브리드의 Tm값을 합하여 나타냈다. 또한, 서열 번호1에 나타내는 서열에 대하여 변이를 가한 것은, 밑줄을 쳤다.

여기에서 Tm값은, Meltcalc 99 free(http://www.meltcalc.com/)를 사용하고, 설정 조건 : Oligoconc[μM]0.2, Naeq.[mM]50의 조건으로 산출했다.

[표 1]

본 발명에 있어서, 상기 P1 또는 상기 P1'의 형광 표지 올리고뉴클레오티드가 상보적인 염기 서열을 갖는 DNA와 하이브리다이즈했을 경우의 Tm값(표 1에 있어서의 Tm(mt))과, 서열 번호1의 207번째의 염기에 대응하는 염기만이 비상보적인 올리고뉴클레오티드와 하이브리다이즈했을 경우의 Tm값(표 1에 있어서의 Tm(WT))과의 차는, 예를 들면 2.0℃ 이상, 3.0℃ 이상, 5.0℃ 이상, 또는 7.0℃ 이상 등을 들 수 있다. 상기 Tm값의 차가 2.0℃ 이상인 것으로써, 예를 들면, 서열 번호1에 있어서의 207번째의 염기의 변이를 보다 고감도로 검출할 수 있다.

또한, 본 발명의 상기 P1 또는 상기 P1'의 형광 표지 올리고뉴클레오티드는, 217번째의 염기가 형광 색소로 표지되어 있는 것을 요한다.

상기 P1 또는 상기 P1'의 형광 표지 올리고뉴클레오티드에 있어서는, 이 형광 표지된 217번째의 염기가, 3' 말단으로부터 세어 1?3번째의 어느 하나의 위치에 존재할 수 있다. 또한, 3' 말단에 존재할 수 있다. 이에 따라, 예를 들면, 다형 검출 감도가 보다 향상한다. 또한, P1 또는 상기 P1'의 형광 표지 올리고뉴클레오티드를 생산성 좋게 얻을 수 있다.

본 발명의 상기 형광 표지 올리고뉴클레오티드는, 표적 서열에 하이브리다이즈하고 있지 않을 때의 형광 강도에 비하여, 표적 서열에 하이브리다이즈하고 있을 때의 형광 강도가 감소(소광)하거나 또는 증가하는 형광 표지 올리고뉴클레오티드로 할 수 있다. 그 중에서도 표적 서열에 하이브리다이즈하고 있지 않을 때의 형광 강도에 비하여, 표적 서열에 하이브리다이즈하고 있을 때의 형광 강도가 감소하는 형광 표지 올리고뉴클레오티드로 할 수 있다.

이러한 형광 소광 현상(Quenching phenomenon)을 이용한 프로브는, 일반적으로, 구아닌 소광 프로브라고 불리고 있으며, 소위 Q Probe(등록상표)로서 알려져 있다. 그 중에서도, 3' 말단 혹은 5' 말단이 시토신(C)이 되도록 설계되어, 그 말단의 C가 구아닌(G)에 가까워지면 발광이 약해지도록 형광 색소로 표지화된 올리고뉴클레오티드인 것을 들 수 있다. 이러한 프로브를 사용하면, 시그널의 변동에 의해, 하이브리다이즈와 해리를 용이하게 확인할 수 있다.

또, Q Probe를 사용한 검출 방법 이외에도, 공지의 검출 양식을 적용해도 된다. 이러한 검출 양식으로서는, Taq-man Probe법, Hybridization Probe법, Moleculer Beacon법 또는 MGB Probe법 등을 들 수 있다.

상기 형광 색소로서는, 특별히 제한되지 않지만, 예를 들면, 플루오레세인, 인광체, 로다민, 폴리메틴 색소 유도체 등을 들 수 있다. 이들 형광 색소의 시판품으로서는, 예를 들면, Pacific Blue, BODIPY FL, Fluore Prime, Fluoredite, FAM, Cy3 및 Cy5, TAMRA 등을 들 수 있다.

형광 표지 올리고뉴클레오티드의 검출 조건은 특별히 제한되지 않고, 사용하는 형광 색소에 따라 적절히 결정할 수 있다. 예를 들면, Pacific Blue는, 검출 파장 445㎚?480㎚, TAMRA는, 검출 파장 585㎚?700㎚, BODIPY FL은, 검출 파장 520㎚?555㎚로 검출할 수 있다.

이러한 형광 색소를 갖는 프로브를 사용하면, 각각의 형광 시그널의 변동에 의해, 하이브리다이즈와 해리를 용이하게 확인할 수 있다. 형광 색소의 올리고뉴클레오티드에의 결합은, 통상의 방법, 예를 들면 일본 특개2002-119291호 공보 등에 기재된 방법에 따라 행할 수 있다.

또한 상기 형광 표지 올리고뉴클레오티드는, 예를 들면, 3' 말단에 인산기가 부가되어도 된다. 이는, 형광 표지 올리고뉴클레오티드의 3' 말단에 인산기를 부가시켜 두는 것에 의해, 프로브 자체가 유전자 증폭 반응에 의해 신장(伸長)하는 것을 충분히 억제할 수 있다. 후술하는 바와 같이, 변이의 유무를 검출하는 DNA(표적 DNA)는, PCR 등의 유전자 증폭법에 의해 조제할 수 있다. 그 때, 3' 말단에 인산기가 부가된 형광 표지 올리고뉴클레오티드를 사용함으로써, 이를 증폭 반응의 반응액 중에 공존시킬 수 있다.

또한, 3' 말단에 상술과 같이 표지화 물질(형광 색소)을 부가하는 것에 의해서도, 같은 효과를 얻을 수 있다.

상기 염기 서열을 가지고, 3' 말단의 C가 형광 색소로 표지된 올리고뉴클레오티드의 구체예를 이하에 나타낸다(대문자의 염기는 변이점을 나타내고, (TAMRA)는, 상기 형광 색소에 해당한다). 단, 본 발명에 있어서의 형광 표지 올리고뉴클레오티드는 이하의 것에 한정되지 않는다.

[표 2]

상기 P1 또는 상기 P1'의 형광 표지 올리고뉴클레오티드는 ABCC2 유전자에 있어서의 다형, 특히 C-24T 변이를 검출하는 ABCC2 유전자 다형 검출용 프로브로서 사용할 수 있다.

또한, ABCC2 유전자 다형 검출용 프로브는, 융해 곡선 분석용의 프로브로서 사용할 수 있다.

또, 본 발명에 관한 상기 P1 또는 상기 P1'의 형광 표지 올리고뉴클레오티드는, 서열 번호1에 나타내는 염기 서열에 있어서, 217번째의 염기에 대응하는 염기가 시토신이며, 217번째의 염기에 대응하는 염기가 형광 색소로 표지된 염기를 사용하는 것 이외는, 올리고뉴클레오티드의 합성 방법으로서 알려져 있는 공지의 방법, 예를 들면 일본 특개2002-119291호 공보 등에 기재된 방법에 따라 제작할 수 있다.

<프라이머>

후술하는 ABCC2 유전자 다형 검출 방법에서는, 검출 대상이 되는 ABCC2 유전자 다형을 포함하는 서열을 PCR법에 의해 증폭하는 경우에는, 프라이머를 사용할 수 있다.

본 발명에 있어서 사용할 수 있는 프라이머는, 목적으로 하는 검출 대상이 되는 ABCC2 유전자의 다형의 부위인, 서열 번호1에 나타내는 서열 중 207번째의 염기에 대응하는 염기를 포함하는 핵산을 증폭 가능하면 특별히 제한되지 않는다.

PCR법에 적용하는 프라이머는, 본 발명의 다형 검출용 프로브가 하이브리다이제이션할 수 있는 영역을 증폭할 수 있는 것이면 특별히 제한되지 않고, 서열 번호1에 나타내는 염기 서열로부터, 당업자라면 적절히 설계할 수 있다. 프라이머의 길이 및 Tm값은, 12mer?40mer 및 40℃?70℃, 또는 16mer?30mer 및 55℃?60℃로 할 수 있다.

또한, 프라이머 세트의 각 프라이머의 길이는 동일하지 않아도 되지만, 양(兩)프라이머의 Tm값은 거의 동일(또는, Tm값의 양프라이머에서의 차가 5℃ 이내)하게 할 수 있다.

이하에 본 발명의 다형 검출 방법에 있어서, 본 발명의 다형 검출용 프로브가 하이브리다이즈하는 영역을 포함하는 염기 서열의 증폭에 사용할 수 있는 프라이머의 예를 나타낸다. 또, 이들은 예시로서, 본 발명을 제한하는 것은 아니다.

상기 서열 번호1에 나타내는 서열 중 207번째의 염기에 있어서의 다형을 검출하기 위한 프라이머로서는, 하기 P2, P2', P3 및 P3'로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종의 올리고뉴클레오티드이면 된다.

(P2) 서열 번호1에 나타내는 염기 서열 중 172번째?194번째의 염기를 포함하는 염기길이 23?60의 염기 서열에 대하여 적어도 80% 이상의 동일성을 갖는 올리고뉴클레오티드, (P2') 서열 번호1에 나타내는 염기 서열에 있어서 172번째?194번째의 염기를 포함하는 염기길이 23?60의 염기 서열의 상보쇄에 대하여 스트린젠트한 조건 하에서 하이브리다이즈하는 올리고뉴클레오티드, (P3) 서열 번호1에 나타내는 염기 서열 중 265번째?294번째의 염기를 포함하는 염기길이 30?60의 염기 서열의 상보쇄에 대하여 적어도 80% 이상의 동일성을 갖는 올리고뉴클레오티드, 및 (P3') 서열 번호1에 나타내는 염기 서열에 있어서 265번째?294번째의 염기를 포함하는 염기길이 30?60의 염기 서열에 대하여 스트린젠트한 조건에서 하이브리다이즈하는 올리고뉴클레오티드.

상기 P2의 올리고뉴클레오티드로서는, 서열 번호1에 나타내는 염기 서열에 있어서 172번째?194번째의 염기를 포함하는 염기길이 23?60의 염기 서열에 대하여 적어도 80% 이상의 동일성을 갖는 올리고뉴클레오티드이며, 또한 서열 번호1에 있어서의 207번째의 염기를 포함하는 영역을 증폭하는 올리고뉴클레오티드여도 된다. 또한, 상기 P2'의 올리고뉴클레오티드로서는, 서열 번호1에 나타내는 염기 서열에 있어서 172번째?194번째의 염기를 포함하는 염기길이 23?60의 염기 서열의 상보쇄에 대하여 스트린젠트한 조건 하에서 하이브리다이즈하는 올리고뉴클레오티드이며, 또한 서열 번호1에 있어서의 207번째의 염기를 포함하는 영역을 증폭하는 올리고뉴클레오티드여도 된다. 또한, 상기 P2 또는 P2'의 올리고뉴클레오티드로서는, 상기 P2 또는 P2'의 올리고뉴클레오티드의 염기가 삽입, 결실 또는 치환한 올리고뉴클레오티드여도 된다.

상기 P3의 올리고뉴클레오티드로서는, 서열 번호1에 나타내는 염기 서열에 있어서 265번째?294번째의 염기를 포함하는 염기길이 30?60의 염기 서열의 상보쇄에 대하여 적어도 80% 이상의 동일성을 갖는 올리고뉴클레오티드이며, 또한 서열 번호1에 있어서의 207번째의 염기를 포함하는 영역을 증폭하는 올리고뉴클레오티드여도 된다. 또한, 상기 P3'의 올리고뉴클레오티드로서는, 서열 번호1에 나타내는 염기 서열에 있어서 265번째?294번째의 염기를 포함하는 염기길이 30?60의 염기 서열에 대하여 스트린젠트한 조건에서 하이브리다이즈하는 올리고뉴클레오티드이며, 또한 서열 번호1에 있어서의 207번째의 염기를 포함하는 영역을 증폭하는 올리고뉴클레오티드여도 된다. 또한, 상기 P3 또는 P3'의 올리고뉴클레오티드로서는, 상기 P3 또는 P3'의 올리고뉴클레오티드의 염기가 삽입, 결실 또는 치환한 올리고뉴클레오티드여도 된다.

또, 하이브리다이제이션을 행하는 방법에 대해서는 프로브의 항에 기재한 방법에 따르면 되며, 스트린젠트한 조건에 대해서는 프로브의 항에 기재한 조건과 같은 조건을 적용할 수 있다. 또한, 동일성이나, 삽입, 결실 또는 치환의 범위에 대해서도, 프로브의 항에 기재한 것과 같은 범위를 적용할 수 있다.

이하에, 본 발명의 다형 검출 방법에 있어서의 상기 서열 번호1에 있어서의 207번째의 염기를 포함하는 영역의 증폭에 사용할 수 있는 프라이머의 일례를 나타낸다.

[표 3]

또한, 상기 서열 번호1에 있어서의 207번째의 염기에 있어서의 다형을 검출하기 위해서는, 상기 P2 및 P3, 또는 P2' 및 P3'로 나타내는 각 올리고뉴클레오티드를, 한 쌍의 프라이머 세트로서 사용할 수 있다.

다형의 검출 방법은 상기 형광 표지 뉴클레오티드를 프로브로서 이용하는 방법이면, 특별히 제한되지 않는다. 상기 형광 표지 뉴클레오티드를 프로브로서 사용하는 다형 검출 방법의 일례로서, Tm 해석을 이용한 다형 검출 방법에 대하여, 이하에 설명한다.

<다형 검출 방법>

본 발명에 관한 ABCC2 유전자 다형 검출 방법은, 상기 ABCC2 유전자 다형 검출용 프로브를 적어도 1종 사용하여 ABCC2 유전자의 다형을 검출하는 것을 포함하는 ABCC2 유전자 다형 검출 방법이다.

본 발명에 관한 다형 검출 방법에 의하면, 상기 다형 검출용 프로브를 적어도 1종 포함하는 것에 의해, ABCC2 유전자의 다형을 간편하게, 감도 좋게 검출 가능하게 한다.

또한, 본 발명의 다형 검출 방법은, ABCC2 유전자에 있어서의 다형의 검출 방법으로서, 하기 공정(Ⅰ)?(Ⅳ)을 포함할 수 있고, 하기 공정(Ⅴ)을 포함하고 있어도 된다. 또, 본 발명의 다형 검출 방법은, 상기 다형 검출용 프로브를 사용하는 것이 특징으로서, 기타의 구성이나 조건 등은, 이하의 기재에 제한되지 않는다.

(Ⅰ) 상기 다형 검출용 프로브 및 시료 중의 1본쇄 핵산을 접촉시켜서, 상기 형광 표지 올리고뉴클레오티드 및 상기 1본쇄 핵산을 하이브리다이즈하여 하이브리드를 얻는 것.

(Ⅱ) 상기 하이브리드를 포함하는 시료의 온도를 변화시키는 것에 의해, 상기 하이브리드를 해리시켜, 상기 하이브리드의 해리에 의거하는 형광 시그널의 변동을 측정하는 것.

(Ⅲ) 상기 형광 시그널의 변동에 의거하여 하이브리드의 해리 온도인 Tm값을 측정하는 것.

(Ⅳ) 상기 Tm값에 의거하여, 상기 시료 중의 1본쇄 핵산에 있어서의, ABCC2 유전자에 있어서의 다형의 존재를 검출하는 것.

(Ⅴ) 상기 다형의 존재에 의거하여, 상기 시료 중의 1본쇄 핵산에 있어서의, 다형을 갖는 1본쇄 핵산의 존재비를 검출하는 것.

또한, 본 발명에 있어서는, 상기 공정(Ⅰ)?(Ⅳ) 또는 상기 공정(Ⅰ)?(Ⅴ)에 더하여, 공정(Ⅰ) 하이브리다이즈 전 또는 공정(Ⅰ)의 하이브리다이즈하는 것과 동시에, 핵산을 증폭하는 것을 더 포함하고 있어도 된다.

또, (Ⅲ)에서 Tm값을 측정하는 것에는, 하이브리드의 해리 온도를 측정하는 것뿐만 아니라, 하이브리드의 융해시에 온도에 따라 변동하는 형광 시그널의 미분값의 크기를 측정하는 것을 포함해도 된다.

본 발명에 있어서, 시료 중의 핵산은, 1본쇄 핵산이어도 되고 2본쇄 핵산이어도 된다. 상기 핵산이 2본쇄 핵산의 경우는, 예를 들면, 상기 형광 표지 올리고뉴클레오티드와 하이브리다이즈하는 것에 앞서, 가열에 의해 상기 시료 중의 2본쇄 핵산을 융해(해리)시켜서 1본쇄 핵산으로 할 수 있다. 2본쇄 핵산을 1본쇄 핵산으로 해리하는 것에 의해, 상기 형광 표지 올리고뉴클레오티드와의 하이브리다이즈가 가능하게 된다.

본 발명에 있어서, 검출 대상인 시료에 포함되는 핵산은, 예를 들면, 생체 시료에 원래 포함되는 핵산이어도 되지만, 검출 정밀도를 향상할 수 있는 것에서, 생체 시료에 원래 포함되어 있는 핵산을 주형(鑄型)으로서 PCR 등에 의해 ABCC2 유전자의 변이한 부위를 포함하는 영역을 증폭시킨 증폭 산물인 것을 들 수 있다. 증폭 산물의 길이는, 특별히 제한되지 않지만, 예를 들면, 50mer?1000mer, 또는 80mer?200mer로 할 수 있다. 또한, 시료 중의 핵산은, 예를 들면, 생체 시료 유래의 RNA(토탈 RNA, mRNA 등)로부터 RT-PCR(Reverse Transcription PCR)에 의해 합성한 cDNA여도 된다.

본 발명에 있어서, 상기 시료 중의 핵산에 대한, 본 발명의 다형 검출용 프로브의 첨가 비율(몰비)은 특별히 제한되지 않는다. 시료 중의 DNA에 대하여 예를 들면 1배 이하를 들 수 있다. 또한, 충분한 검출 시그널 확보의 관점에서, 상기 시료 중의 핵산에 대한, 본 발명의 다형 검출용 프로브의 첨가 비율(몰비)은, 0.1배 이하로 할 수 있다.

여기에서, 시료 중의 핵산이란, 예를 들면, 검출 목적의 다형이 발생하여 있는 검출 대상 핵산과 상기 다형이 발생하여 있지 않는 비검출 대상 핵산과의 합계여도 되고, 검출 목적의 다형이 발생하여 있는 검출 대상 서열을 포함하는 증폭 산물과 상기 다형이 발생하여 있지 않는 비검출 대상 서열을 포함하는 증폭 산물의 합계여도 된다. 또, 시료 중의 핵산에 있어서의 상기 검출 대상 핵산의 비율은, 통상, 불분명하지만, 결과적으로, 상기 다형 검출용 프로브의 첨가 비율(몰비)은, 검출 대상 핵산(검출 대상 서열을 포함하는 증폭 산물)에 대하여 10배 이하로 할 수 있다. 또한, 상기 다형 검출용 프로브의 첨가 비율(몰비)은, 검출 대상 핵산(검출 대상 서열을 포함하는 증폭 산물)에 대하여, 5배 이하, 또는 3배 이하로 할 수 있다. 또한, 그 하한은 특별히 제한되지 않지만, 예를 들면 0.001배 이상, 0.01배 이상, 또는 0.1배 이상으로 할 수 있다.

상기 DNA에 대한 본 발명의 다형 검출용 프로브의 첨가 비율은, 예를 들면, 2본쇄 핵산에 대한 몰비여도 되고, 1본쇄 핵산에 대한 몰비여도 된다.

본 발명에 있어서, Tm값을 결정하기 위한 온도 변화에 수반하는 시그널 변동의 측정은, 상술한 바와 같은 원리로부터 260㎚의 흡광도 측정에 의해 행할 수도 있지만, 상기 다형 검출용 프로브에 부가한 표지의 시그널에 의거하는 시그널로서, 1본쇄 DNA와 상기 다형 검출용 프로브와의 하이브리드 형성의 상태에 따라 변동하는 시그널을 측정할 수 있다. 이 때문에, 상기 다형 검출용 프로브로서, 상술한 형광 표지 올리고뉴클레오티드를 사용할 수 있다. 상기 형광 표지 올리고뉴클레오티드로서는, 예를 들면, 상보 서열에 하이브리다이즈하고 있지 않을 때의 형광 강도에 비하여, 상보 서열에 하이브리다이즈하고 있을 때의 형광 강도가 감소(소광)하는 형광 표지 올리고뉴클레오티드, 또는 상보 서열에 하이브리다이즈하고 있지 않을 때의 형광 강도에 비하여, 표적 서열에 하이브리다이즈하고 있을 때의 형광 강도가 증가하는 형광 표지 올리고뉴클레오티드를 들 수 있다.

전자와 같은 프로브이면, 검출 대상 서열과 하이브리드(2본쇄 DNA)를 형성하고 있을 때는 형광 시그널을 나타내지 않거나, 형광 시그널이 약하지만, 가열에 의해 프로브가 해리하면 형광 시그널을 나타내도록 되거나, 형광 시그널이 증가한다.

또한, 후자의 프로브이면, 검출 대상 서열과 하이브리드(2본쇄 DNA)를 형성하는 것에 의해 형광 시그널을 나타내고, 가열에 의해 프로브가 해리하면 형광 시그널이 감소(소실)한다. 따라서, 이 형광 표지에 의거하는 형광 시그널의 변화를 형광 표지 특유의 조건(형광 파장 등)에서 검출하는 것에 의해, 상기 260㎚의 흡광도 측정과 마찬가지로, 융해의 진행 및 Tm값의 결정을 행할 수 있다.

다음으로, 본 발명의 다형 검출 방법에 대하여, 형광 색소에 의거하는 시그널의 변화를 검출하는 방법에 대하여 구체적 예를 들어서 설명한다. 또, 본 발명의 다형 검출 방법은, 상기 다형 검출용 프로브를 사용하는 것 자체가 특징이며, 기타의 공정이나 조건에 대해서는 조금도 제한되지 않는다.

핵산 증폭을 행할 때의 주형이 되는 핵산을 포함하는 시료로서는, 핵산, 특히 ABCC2 유전자를 포함하고 있으면 되며, 특별히 제한되지 않는다. 예를 들면, 대장이나 폐 등의 조직, 백혈구 세포 등의 혈구, 전혈, 혈장, 객담(喀痰), 구강 점막 현탁액, 손톱이나 모발 등의 체세포, 생식 세포, 젖, 복수액, 파라핀 포매 조직, 위액, 위세정액, 요(尿), 복막액, 양수, 세포 배양 등의 임의의 생물학적 기원에 유래하는 또는 유래할 수 있는 것을 들 수 있다. 또, 시료의 채취 방법, 핵산을 포함하는 시료의 조제 방법 등은, 제한되지 않고, 어느 것이나 종래 공지의 방법을 사용할 수 있다. 또한, 주형이 되는 핵산은, 당해 기원으로부터 얻어진 채로 직접적으로, 혹은 당해 샘플의 특성을 개변하기 위해 전처리한 후에 사용할 수 있다.

예를 들면, 전혈을 시료로 하는 경우, 전혈로부터의 게놈 DNA의 단리(單離)는, 종래 공지의 방법에 의해 행할 수 있다. 예를 들면, 시판의 게놈 DNA 단리 키트(상품명 GFX Genomic Blood DNA Purification kit; GE헬스케어바이오사이엔스사제) 등을 사용할 수 있다.

다음으로, 단리한 게놈 DNA를 포함하는 시료에, 상기 형광 표지 올리고뉴클레오티드를 포함하는 다형 검출용 프로브를 첨가한다.

상기 다형 검출용 프로브는, 단리한 게놈 DNA를 포함하는 액체 시료에 첨가해도 되고, 적당한 용매 중에서 게놈 DNA와 혼합해도 된다. 상기 용매로서는, 특별히 제한되지 않고, 예를 들면, Tris-HCl 등의 완충액, KCl, MgCl₂, MgSO₄, 글리세롤 등을 포함하는 용매, PCR 반응액 등, 종래 공지의 것을 들 수 있다.

상기 다형 검출용 프로브의 첨가의 타이밍은, 특별히 제한되지 않고, 예를 들면, 후술하는 PCR 등의 증폭 처리를 행하는 경우, 증폭 처리의 후에, PCR 증폭 산물에 대하여 첨가해도 되고, 증폭 처리 전에 첨가해도 된다.

이와 같이 PCR 등에 의한 증폭 처리 전에 상기 검출용 프로브를 첨가하는 경우는, 예를 들면, 상술와 같이, 그 3' 말단에, 형광 색소를 부가하거나, 인산기를 부가하거나 할 수 있다.

핵산 증폭의 방법으로서는, 예를 들면 폴리머라제를 사용하는 방법 등을 들 수 있다. 그 예로서는, PCR법, ICAN법, LAMP법, NASBA법 등을 들 수 있다. 폴리머라제를 사용하는 방법에 의해 증폭하는 경우는, 본 발명 프로브의 존재 하에서 증폭을 행할 수 있다. 사용하는 프로브 및 폴리머라제에 따라, 증폭의 반응 조건 등을 조정하는 것은 당업자라면 용이하다. 이에 따라, 핵산의 증폭 후에 프로브의 Tm값을 해석하는 것만으로 다형을 검출할 수 있으므로, 반응 종료 후 증폭 산물을 취급할 필요가 없다. 따라서, 증폭 산물에 의한 오염의 걱정이 없다. 또한, 증폭에 필요한 기기와 같은 기기로 검출하는 것이 가능하므로, 용기를 이동할 필요가 없고, 자동화도 용이하다.

또한, PCR법에 사용하는 DNA 폴리머라제로서는, 통상 사용할 수 있는 DNA 폴리머라제를 특별히 제한 없이 사용할 수 있다. 예를 들면, GeneTaq(니뽄진사제), PrimeSTAR Max DNA Polymerase(다카라바이오사제), Taq 폴리머라제 등을 들 수 있다.

폴리머라제의 사용량으로서는, 통상 사용되고 있는 농도이면 특별히 제한은 없다. 예를 들면, Taq 폴리머라제를 사용하는 경우, 예를 들면, 반응 용액량 50㎕에 대하여 0.01U?100U의 농도로 할 수 있다. 이에 의해, ABCC2 유전자 다형의 검출 감도가 높아지는 등의 경향이 있다.

또한 PCR법은, 통상 사용되는 조건을 적절히 선택함으로써 행할 수 있다.

또, 증폭 시, 리얼타임 PCR에 의해 증폭을 모니터링하고, 시료에 포함되는 DNA(검출 대상 서열)의 카피수를 조사할 수도 있다. 즉, PCR에 의한 DNA(검출 대상 서열)의 증폭에 따라 하이브리드를 형성하는 프로브의 비율이 늘어나므로 형광 강도가 변동한다. 이를 모니터링함으로써, 시료에 포함되는 검출 대상 서열(정상 DNA 또는 변이 DNA)의 카피수나 존재비를 검출할 수 있다.

본 발명의 다형 검출 방법에 있어서는, 상기 형광 표지 올리고뉴클레오티드와, 시료 중의 1본쇄 핵산을 접촉시켜, 양자를 하이브리다이즈시킨다. 시료 중의 1본쇄 핵산은, 예를 들면, 상기와 같이 하여 얻어진 PCR 증폭 산물을 해리함으로써 조제할 수 있다.

상기 PCR 증폭 산물의 해리(해리 공정)에 있어서의 가열 온도는, 상기 증폭 산물을 해리할 수 있는 온도이면 특별히 제한되지 않는다. 예를 들면, 85℃?95℃이다. 가열 시간도 특별히 제한되지 않는다. 가열 시간은, 예를 들면 1초?10분, 또는 1초?5분으로 할 수 있다.

또한, 해리한 1본쇄 DNA와 상기 형광 표지 올리고뉴클레오티드와의 하이브리다이즈는, 예를 들면, 상기 해리 공정 후, 상기 해리 공정에 있어서의 가열 온도를 강하시키는 것에 의해 행할 수 있다. 온도 조건으로서는, 예를 들면 40℃?50℃이다.

하이브리다이즈 공정의 반응액에 있어서의 각 조성의 체적이나 농도는, 특별히 제한되지 않는다. 구체예로서는, 상기 반응액에 있어서의 DNA의 농도는, 예를 들면, 0.01μM?1μM, 또는 0.1μM?0.5μM으로 할 수 있다. 상기 형광 표지 올리고뉴클레오티드의 농도는, 예를 들면, 상기 DNA에 대한 첨가 비율을 만족하는 범위이며, 예를 들면, 0.001μM?10μM, 또는 0.001μM?1μM으로 할 수 있다.

그리고, 얻어진 상기 1본쇄 DNA와 상기 형광 표지 올리고뉴클레오티드와의 하이브리드를 서서히 가열하고, 온도 상승에 수반하는 형광 시그널의 변동을 측정한다. 예를 들면, Q Probe를 사용했을 경우, 1본쇄 DNA와 하이브리다이즈한 상태에서는, 해리한 상태에 비하여 형광 강도가 감소(또는 소광)한다. 따라서, 예를 들면, 형광이 감소(또는 소광)하고 있는 하이브리드를 서서히 가열하고, 온도 상승에 수반하는 형광 강도의 증가를 측정하면 된다.

형광 강도의 변동을 측정할 때의 온도 범위는, 특별히 제한되지 않지만, 예를 들면, 개시 온도가 실온?85℃, 또는 25℃?70℃로 할 수 있다. 종료 온도는, 예를 들면, 40℃?105℃로 할 수 있다. 또한, 온도의 상승 속도는, 특별히 제한되지 않지만, 예를 들면, 0.1℃/초?20℃/초, 또는 0.3℃/초?5℃/초로 할 수 있다.

다음으로, 상기 시그널의 변동을 해석하여 Tm값으로서 결정한다. 구체적으로는, 얻어진 형광 강도로부터 각 온도에 있어서의 미분값(-d형광 강도/dt)을 산출하고, 가장 낮은 값을 나타내는 온도를 Tm값으로서 결정할 수 있다. 또한, 단위 시간당의 형광 강도 증가량(형광 강도 증가량/t)이 가장 높은 점을 Tm값으로서 결정할 수도 있다. 또, 표지화 프로브로서, 소광 프로브가 아니고, 하이브리드 형성에 의해 시그널 강도가 증가하는 프로브를 사용했을 경우에는, 반대로, 형광 강도의 감소량을 측정하면 된다.

또한, 본 발명에 있어서는, 상술과 같이, 하이브리드를 가열하여, 온도 상승에 수반하는 형광 시그널 변동(바람직하게는 형광 강도의 증가)을 측정하지만, 이 방법 대신에, 예를 들면, 하이브리드 형성시에 있어서의 시그널 변동의 측정을 행해도 된다. 즉, 상기 프로브를 첨가한 시료의 온도를 강하시켜서 하이브리드를 형성할 때의 상기 온도 강하에 수반하는 형광 시그널 변동을 측정해도 된다.

구체예로서, Q Probe를 사용했을 경우, 상기 프로브를 시료에 첨가했을 때에는, 상기 프로브는 해리 상태에 있기 때문에 형광 강도가 크지만, 온도의 강하에 의해 하이브리드를 형성하면, 상기 형광이 감소(또는 소광)한다. 따라서, 예를 들면, 상기 가열한 시료의 온도를 서서히 강하하여, 온도 하강에 수반하는 형광 강도의 감소를 측정하면 된다.

한편, 하이브리드 형성에 의해 시그널이 증가하는 표지화 프로브를 사용했을 경우, 상기 프로브를 시료에 첨가했을 때에는, 상기 프로브는 해리 상태에 있기 때문에 형광 강도가 작지만(또는 소광), 온도의 강하에 의해 하이브리드를 형성하면, 형광 강도가 증가하게 된다. 따라서, 예를 들면, 상기 시료의 온도를 서서히 강하하여, 온도 하강에 수반하는 형광 강도의 증가를 측정하면 된다.

또, 본 발명의 다형 검출 방법에 있어서는, 또한, MDR1 유전자의 다형 검출용 프로브 및 CYP3A5 유전자의 다형 검출용 프로브로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종의 프로브를 사용하는 것에 의해, ABCC 유전자의 다형에 더하여, MDR1 유전자 및 CYP3A5 유전자로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 한쪽의 다형을 검출할 수 있다.

또한, ABCC2 유전자의 다형 검출용 프로브와, MDR1 유전자의 다형 검출용 프로브와, CYP3A5 유전자의 다형 검출용 프로브를 병용하는 것에 의해, 이들 3종의 유전자 다형을 하나의 계(系)에서 간편하게 검출할 수 있을 뿐만 아니라, 약제에 대한 내성 및 유효성을 보다 정확하게 예측할 수 있다.

복수의 유전자 다형을, 동일한 계로 검출하는 방법으로서는, 특별히 제한되는 것은 아니다. 예를 들면, 각 다형을 검출할 수 있는 각 프로브를 미리 혼합하고, 시료에 첨가해도 되며, 1본쇄 핵산을 포함하는 시료에 각 다형을 검출할 수 있는 각 프로브를 연속적으로 첨가해도 된다.

여기에서, 「계」란, 형광 표지 올리고뉴클레오티드 및 1본쇄 핵산이 하이브리다이즈한 하이브리드를 포함하는 시료로 형성되는 1개의 독립한 반응계를 의미한다.

본 발명에 있어서의 「MDR1 유전자」는, 이미 공지이며, 그 염기 서열의 일부는, NCBI의 dbSNP 액세션 No.rs1045642의 1?511의 서열에 해당한다.

또한, 본 발명에 있어서의 「CYP3A5 유전자」는, 이미 공지이며, 그 염기 서열의 일부는, NCBI의 dbSNP 액세션 No.rs776746의 1?801의 서열을 의미한다.

상기 MDR1 유전자의 다형 검출용 프로브로서는, MDR1 유전자의 다형을 검출할 수 있는 프로브이면 특별히 제한은 되지 않지만, MDR1 유전자의 엑손26에 있어서의 다형을 검출할 수 있는 프로브로 할 수 있고, MDR1 유전자의 3435번째의 염기에 있어서의 다형을 검출할 수 있는 프로브로 할 수도 있다.

이들 MDR1 유전자의 다형 검출용 프로브로서는, 예를 들면 일본 특개2005-287335호 공보에 기재된 프로브 등을 들 수 있다. 또한, 예를 들면 서열 번호19에 나타내는 염기 서열로 이루어지는 프로브 등도 들 수 있다.

상기 CYP3A5 유전자의 다형 검출용 프로브로서는, CYP3A5 유전자의 다형을 검출할 수 있는 프로브이면 특별히 제한은 되지 않지만, CYP3A5 유전자의 인트론3에 있어서의 다형을 검출할 수 있는 프로브로 할 수 있고, CYP3A5 유전자의 6986번째의 염기에 있어서의 다형을 검출할 수 있는 프로브로 할 수도 있다. 예를 들면, 서열 번호20에 나타내는 염기 서열로 이루어지는 프로브 등을 들 수 있다.

<약효 판정 방법>

본 발명의 약효 판정 방법은, 상술한 다형 검출 방법에 의해 ABCC2 유전자의 다형을 검출하는 것, 및, 상기 검출 결과에 의거하여 약제에 대한 내성 또는 약제의 약효를 판정하는 것을 포함한다.

상술한 다형 검출 방법에서는, 본 발명에 있어서의 다형 검출용 프로브를 사용하여, 감도 좋고 또한 간편하게 ABCC2 유전자의 다형을 검출하므로, ABCC2 유전자에 있어서의 이 다형에 의거하여 약제의 판정을 감도 좋고 또한 간편하게 행할 수 있다.

또한, 다형의 유무나 변이 서열과 정상 서열의 존재비에 의거하여 약제에 대한 내성이나 약제의 약효를 판정할 수 있다. 그리고, 본 발명의 약효 판정 방법은, 변이의 유무나 변이 서열의 존재비에 의거하여, 약제의 투여량의 증가, 다른 치료약으로의 변경 등으로의 교체 등의 질병의 치료 방침을 결정하는데 유용하다.

또한, 판정 대상이 되는 약제로서는, 구체적으로는, 면역 억제제, 분자 표적 치료약, 항우울약 등을 들 수 있고, 특별히 면역 억제제 및 분자 표적 치료약을 들 수 있다.

<다형 검출용 시약 키트>

본 발명의 ABCC2 유전자에 있어서의 다형을 검출하기 위한 ABCC2 유전자 다형 검출용 시약 키트는, 상기한 다형 검출용 프로브를 포함한다.

이 다형 검출용 시약 키트에는, ABCC2 유전자 중, 서열 번호1에 나타내는 서열 중 207번째의 염기에 있어서의 다형을 간편하게 또한 감도 좋게 검출하는 것이 가능한 기술한 다형 검출용 프로브의 적어도 1종을 포함하는 것에 의해, 예를 들면 ABCC2 유전자의 다형의 검출을 보다 간편하게 행할 수 있는 등의 경향이 있다.

또한, 본 발명에 있어서의 다형 검출용 시약 키트는, 상술의 검출 대상이 되는 ABCC2 유전자 다형을 포함하는 서열을 증폭 가능한 프라이머를 더 포함하고 있어도 된다. 이에 따라, 본 발명에 있어서의 다형 검출용 시약 키트는, 정밀도 좋게 ABCC2 유전자의 다형의 검출을 행할 수 있다.

또한, 본 발명에 있어서의 다형 검출용 시약 키트는, ABCC2 유전자의 다형 검출용 프로브에 더하여, 상술한 MDR1 유전자의 다형 검출용 프로브 및 CYP3A5 유전자의 다형 검출용 프로브로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종의 프로브를 더 포함하고 있어도 된다.

또, 다형 검출용 시약 키트에 포함될 수 있는 프로브 및 프라이머에 대하여는, 상술한 사항을 그대로 적용할 수 있다.

다형 검출용 프로브로서 2종 이상의 형광 표지 올리고뉴클레오티드를 포함하는 경우, 각각의 형광 표지 올리고뉴클레오티드는 혼합된 상태로 포함되어 있어도, 별개로 포함되어 있어도 된다.

2종 이상의 상기 형광 표지 올리고뉴클레오티드는 발광 파장이 서로 다른 형광 색소로 표지화되어 있어도 된다.

이와 같이 형광 색소의 종류를 바꿈으로써, 같은 반응계여도, 각각의 형광 표지 올리고뉴클레오티드에 대한 검출을 동시에 행하는 것도 가능하게 된다.

또한, 본 발명에 있어서의 검출용 시약 키트는, 상기 프로브 및 상기 프라이머 외에, 본 발명의 검출 방법에 있어서의 핵산 증폭을 행하는데 필요한 시약류를 더 포함하고 있어도 된다. 또한, 프로브, 프라이머 및 기타의 시약류는, 별개로 수용되어 있어도 되고, 그들의 일부가 혼합물로 되어 있어도 된다.

또한, 「별개로 수용」이란, 각 시약이 비접촉 상태를 유지할 수 있도록 구분된 것이면 되며, 반드시 독립하여 취급 가능한 개별의 용기에 수용될 필요는 없다.

다형 부위를 포함하는 서열(프로브가 하이브리다이즈하는 영역)을 증폭 가능한 프라이머 세트를 포함함으로써, 예를 들면, 보다 고감도로 다형을 검출할 수 있다.

또한 본 발명의 다형 검출용 시약 키트는, 상기 다형 검출용 프로브를 사용하여, 검출 대상인 핵산을 포함하는 시료에 대하여 미분 융해 곡선을 작성하고, 그 Tm값 해석을 행하여, ABCC2 유전자에 있어서의 다형을 검출하는 것이 기재된 취급 설명서, 또는 검출용 시약 키트에 포함되는 혹은 추가적으로 포함하는 것이 가능한 각종의 시약에 대하여 기재된 사용 설명서를 포함할 수 있다.

[실시예]

이하, 본 발명을 실시예로 상세하게 설명한다. 그러나, 본 발명은 그들에 조금도 한정되는 것은 아니다.

[실시예1]

전자동 SNPs 검사 장치(상품명 i-densy(상표), 아크레이사제)와, 하기 표 4에 기재한 처방의 검사용 시약을 사용하여, PCR 및 Tm 해석을 행했다. 또, 사용한 폴리머라제는, Taq 폴리머라제이다.

[표 4]

또, 상기 표 4에서 사용한 프로브와 프라이머의 상세를 이하의 표 5 및 표 6에 각각 나타낸다. 또, 프로브 중의 3' 말단의 괄호 내는 형광 색소의 종류를 나타낸다.

[표 5]

[표 6]

PCR은, 95℃로 60초 처리한 후, 95℃로 1초 및 61℃로 30초를 1사이클로 하여, 50사이클 반복했다.

또한 Tm 해석은, PCR 후, 95℃로 1초, 40℃로 60초 처리하고, 이어서 온도의 상승 속도 1℃/3초로, 40℃부터 75℃까지 온도를 상승시키고, 그 사이의 경시적(經時的)인 형광 강도의 변화를 측정했다.

또, 형광 색소 Pacific Blue의 여기 파장은 365㎚?415㎚이며, 검출 파장은 445㎚?480㎚이다. 형광 색소 BODIPY FL의 여기 파장은 420㎚?485㎚이며, 검출 파장은 520?555㎚이다. 형광 색소 TAMRA의 여기 파장은 520㎚?555㎚이며, 검출 파장은 585㎚?700㎚이다. 각각의 파장에 의해, 형광 표지 프로브에 유래하는 형광 강도의 변화를 각각 측정했다.

주형으로서는, 전혈과 정제 게놈(Roche사제)을 사용했다.

전혈은, 이하와 같이 조제했다.

전혈 10㎕를 80㎕의 희석액1에 가해, 잘 혼합한 후, 이 혼합액 10㎕를 80㎕의 희석액2에 가한다. 이 혼합액 17㎕를 95℃ 10분으로 가열하면 4㎕의 전처리된 전혈을 얻을 수 있다. 이를 1test당의 주형으로서 사용했다.

[표 7]

[표 8]

정제 게놈(Roche사제)은, 30카피/㎕를 1test당 4㎕ 사용했다.

Tm 해석에 의해, 프로브의 형광값의 변화량을 나타낸 도 2를 얻었다. 도면 중, 세로축은 단위 시간당의 형광 강도의 변화량(d형광 강도 증가량/t)을 표시하고, 가로축은 온도(℃)를 각각 표시한다.

도 2의 (A)는, 전혈을 주형으로서 사용했을 때의 MDR1 유전자에 있어서, 야생형의 피크 및 C3435T 변이형의 피크의 양쪽에 대하여, 명료한 피크를 얻는 것이 가능한 것을 나타내고 있다.

도 2의 (D)는, 인간 게놈을 주형으로서 사용했을 때의 MDR1 유전자에 있어서, 야생형의 피크 및 C3435T 변이형의 피크의 양쪽에 대하여, 명료한 피크를 얻는 것이 가능한 것을 나타내고 있다.

도 2의 (B)는, 전혈을 주형으로서 사용했을 때의 CYP3A5 유전자에 있어서, 야생형(*1)의 피크 및 변이형(*3)의 피크의 양쪽에 대하여, 명료한 피크를 얻는 것이 가능한 것을 나타내고 있다.

도 2의 (E)는, 인간 게놈을 주형으로서 사용했을 때의 CYP3A5 유전자에 있어서, 변이형(*3)의 피크에 대하여, 명료한 피크를 얻는 것이 가능한 것을 나타내고 있다.

도 2의 (C)는, 전혈을 주형으로서 사용했을 때의 ABCC2 유전자에 있어서, 야생형의 피크에 대하여, 명료한 피크를 얻는 것이 가능한 것을 나타내고 있다.

도 2의 (F)는, 인간 게놈을 주형으로서 사용했을 때의 ABCC2 유전자에 대하여, 야생형의 피크 및 C-24T 변이형의 피크의 양쪽에 대하여, 명료한 피크를 얻는 것이 가능한 것을 나타내고 있다.

[실시예2]

전자동 SNPs 검사 장치(상품명 i-densy(상표), 아크레이사제)와, 하기 표 9에 기재한 처방의 반응액을 사용하여 Tm 해석을 행했다.

[표 9]

Tm 해석은, PCR 후, 95℃로 1초, 40℃로 60초 처리하고, 이어서 온도의 상승 속도 1℃/3초로, 40℃로부터 75℃까지 온도를 상승시키고, 그 사이의 경시적인 형광 강도의 변화를 측정했다. 형광 색소로서 TAMRA를 사용했으므로, 여기 파장은 520㎚?555㎚이며, 검출 파장은 585㎚?700㎚이다. 각각의 파장에 의해, 형광 표지 프로브에 유래하는 형광 강도의 변화를 각각 측정했다.

다형 검출용 프로브에는, 서열 번호1에 나타내는 서열 중 207번째?217번째의 염기를 포함하는 염기길이 19의 서열이며, 217번째의 염기가 형광 색소(TAMRA)로 표지되어 있는 형광 표지 올리고뉴클레오티드(tctggaacAaagactcttc 서열 번호12)를 사용했다.

야생형의 주형으로서는, 1본쇄 핵산 ABCC2-C--24T-WT(atattaatagaagagtcttTgttccagacgcagtccagga 서열 번호25)를 사용하고, 변이형의 주형으로서는, 1본쇄 핵산 ABCC2-C--24T-mt(atattaatagaagagtcttCgttccagacgcagtccagga 서열 번호26)를 사용하고, 혼합형의 주형으로서는, 1본쇄 핵산 ABCC2-C--24T-WT와, 1본쇄 핵산 ABCC2-C--24T-mt를, 1:1의 비율로 혼합시킨 것을 사용했다.

Tm 해석에 의해, 프로브의 형광값의 변화량을 나타낸 도 3을 얻었다. 도 3의 (A)는 야생형의 결과를 나타내고, 도 3의 (B)는 변이형의 결과를 나타내고, 도 3(C)는 혼합형의 결과를 나타낸다. 도 중, 세로축은 단위 시간당의 형광 강도의 변화량(d형광 강도 증가량/t)을 표시하고, 가로축은 온도(℃)를 각각 나타낸다.

그 결과, 도 3(A)?(C)의 어느 경우에 있어서도, 야생형과 변이형을 식별할 수 있는 피크를 얻는 것이 명백하게 되었다.

[비교예1]

다형 검출용 프로브를, 서열 번호12에 기재된 염기 서열로 나타내는 3T-ABCC2-C--24T-mt-F2(tctggaacAaagactcttc-(TAMRA))부터, 서열 번호27에 기재된 염기 서열로 나타내는 3T-ABCC2-C--24T-mt-F1((TAMRA)-ctggaacAaagactcttctatt-(인산화))로 변경한 이외는, 실시예2와 같이 하여, Tm 해석을 행했다.

그 결과, 프로브의 형광값의 변화량을 나타낸 도 4를 얻었다. 도 4의 (A)는 야생형의 결과를 나타내고, 도 4의 (B)는 변이형의 결과를 나타내고, 도 4(C)는 혼합형의 결과를 나타낸다. 도 중, 세로축은 단위 시간당의 형광 강도의 변화량(d형광 강도 증가량/t)을 나타내고, 가로축은 온도(℃)를 각각 나타낸다.

Tm 해석에 있어서는, 온도가 상승하는 것에 의해, 프로브가 해리하고, 형광값이 상승하기 때문에, 피크가 볼록형이 되고 비로소 정상인 판정을 행하는 것이 가능하게 되는 것이다. 그러나, 도 4(A)?(C)에 나타내는 바와 같이, 3T-ABCC2-C--24T-mt-F1을 다형 검출용 프로브로서 사용했을 경우에는, 피크의 형상이 오목형이 되기 때문에, 정상인 판정을 행할 수 없는 것이 명백하게 되었다.

이상과 같으므로, 본 발명에 의하면, 높은 감도로, 간편하게 ABCC2 유전자에 있어서의 다형을 검출할 수 있는 것이 명백하게 되었다.

일본 출원 특원2011-102986(출원일 2011년 5월 2일)의 개시는, 그 전체가 참조에 의해 본 명세서에 편입된다.

본 명세서에 기재된 모든 문헌, 특허 출원 및 기술 규격은, 개개의 문헌, 특허 출원 및 기술 규격이 참조에 의해 포함되는 구체적 또한 개개에 기재된 경우와 동(同)정도로, 본 명세서 중에 참조에 의해 편입된다.

SEQUENCE LISTING <110> ARKRAY, INC. <120> PROBE FOR DETECTING POLYMORPHISM, METHOD OF DETECTING POLYMORPHISM, METHOD OF EVALUATING DRUG EFFICACY AND REAGNET KIT FOR DETECTING POLYMORPHISM <130> P1410A <150> JP2011-102986 <151> 2011-05-02 <150> JP2012-082392 <151> 2012-03-30 <160> 27 <170> PatentIn version 3.4 <210> 1 <211> 611 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> variation <222> (207)..(207) <223> n is a, g, c or t. <220> <221> misc_feature <222> (207)..(207) <223> n is a, c, g, or t <400> 1 ttatgaatta tgctttctaa aaagcctgag ctttagacca attgcacatc taacatttct 60 ggttcttgtt ggtgaccacc ctaagttaac taactaccac ttgttctgag tctgagaaga 120 gtcaatatga agataaatgt aatttctcac ccaaaaagta gagttgcaga acttctccag 180 catgattcct ggactgcgtc tggaacnaag actcttctat taatatgatt gtgttgtttc 240 ttctttactt gtttcatcaa agaaagtgga acaggaatta tctaccattc tgatgttctc 300 cgtaaaggat gacctttcat cccaaccatt taatcgttaa ccttgcctag atgcatgtta 360 cattgaaaca gtggatggac atgtgactaa aaagccctag ggacagggag actcaccagt 420 tcccaaagta caagaggcct ctgtaggagt ggccatacat aaaaggaacc actgaaagat 480 gtcaacagag ctggccaaca aatcaagagt gcacagtctt tcattttcct aaggacatat 540 gacccacaaa gggcagcatc agtagagggg caggcacccc taaatgtgca gtttcgcttc 600 tgctgcaaga t 611 <210> 2 <211> 506 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> variation <222> (256)..(256) <223> n is a, g, c or t. <220> <221> misc_feature <222> (256)..(256) <223> n is a, c, g, or t <400> 2 ctcacagtaa cttggcagtt tcagtgtaag aaataatgat gttaattgtg ctacattcaa 60 agtgtgctgg tcctgaagtt gatctgtgaa ctcttgtttt cagctgcttg atggcaaaga 120 aataaagcga ctgaatgttc agtggctccg agcacacctg ggcatcgtgt cccaggagcc 180 catcctgttt gactgcagca ttgctgagaa cattgcctat ggagacaaca gccgggtggt 240 gtcacaggaa gagatngtga gggcagcaaa ggaggccaac atacatgcct tcatcgagtc 300 actgcctaat gtaagtctct cttcaaataa acagcctggg agcatgtggc agcctctctg 360 gcctatagtt tgatttataa ggggctggtt tcccagaagt gaagagaaat tagcaaccaa 420 atcacaccct tacctgtata caagcatctg gccacacttc ctgtttgggt tagttgttac 480 ctttacctga tcacctgacc ctcctt 506 <210> 3 <211> 801 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> variation <222> (401)..(401) <223> r is g or a. <400> 3 tttgttcact agaagcaagt gggagaaagc tttgcctctt tgtacttctt catcttctcc 60 cctcaagtcc tcagaatcca cagcgctgac tgtggagtgc tgtggagctg gcatggccca 120 tacaggcaac atgacttagt agacagatga cacagctcta gatgtccatg ggccccacac 180 caactgccct tgcagcattt agtccttgtg agcacttgat gatttacctg ccttcaattt 240 ttcactgacc taatattctt tttgataatg aagtatttta aacatataaa acattatgga 300 gagtggcata ggagataccc acgtatgtac cacccagctt aacgaatgct ctactgtcat 360 ttctaaccat aatctcttta aagagctctt ttgtctttca rtatctcttc cctgtttgga 420 ccacattacc cttcatcata tgaagccttg ggtggctcct gtgtgagact cttgctgtgt 480 gtcacaccct aatgaactag aacctaaggt tgctgtgtgt cgtacaacta ggggtatgga 540 ttacataaca taatgatcaa agtctggctt cctgggtgtg gctccagctg cagaatcggg 600 ctagtgaagt ttaatcagct ccgttgtccc cacacagaac gtatgaaggt caactccctg 660 tgctggccat cacagatccc gacgtgatca gaacagtgct agtgaaagaa tgttattctg 720 tcttcacaaa tcgaagggta agcatccatt ttttgaaatt 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Claims

하기 P1 및 P1'로 이루어지는 군에서 선택되는 일종의 형광 표지 올리고뉴클레오티드인 ABCC2 유전자의 다형을 검출하기 위한 다형 검출용 프로브;
(P1) 서열 번호1에 나타내는 서열 중 207번째?217번째의 염기를 포함하는 염기길이 11?60의 서열이며, 서열 번호1에 있어서의 217번째의 염기에 대응하는 염기가 시토신인 것 이외는 서열 번호1과 동일한 염기를 갖는 염기 서열에 대하여 적어도 80% 이상의 동일성을 가지고, 서열 번호1에 나타내는 서열 중 217번째의 염기에 대응하는 염기가 형광 색소로 표지되어 있는 형광 표지 올리고뉴클레오티드, 및
(P1') 서열 번호1에 나타내는 서열 중 207번째?217번째의 염기를 포함하는 염기길이 11?60의 서열이며, 서열 번호1에 있어서의 217번째의 염기에 대응하는 염기가 시토신인 것 이외는 서열 번호1과 동일한 염기를 갖는 염기 서열의 상보쇄에 대하여 스트린젠트한 조건 하에서 하이브리다이즈하고, 서열 번호1에 나타내는 서열 중 217번째의 염기에 대응하는 염기가 형광 색소로 표지되어 있는 형광 표지 올리고뉴클레오티드.
제1항에 있어서,
하기 P1 또는 하기 P1'의 상기 형광 표지 뉴클레오티드인 다형 검출용 프로브;
(P1-1) 서열 번호1에 나타내는 서열 중 207번째?217번째의 염기를 포함하는 염기길이 11?60의 서열이며, 서열 번호1에 있어서의 217번째의 염기에 대응하는 염기가 시토신인 것 이외는 서열 번호1과 동일한 염기를 갖는 염기 서열에 대하여 적어도 80% 이상의 동일성을 가지고, 서열 번호1에 나타내는 서열 중 217번째의 염기에 대응하는 염기가 형광 색소로 표지되어 있으며, 또한 서열 번호1에 있어서의 207번째의 염기의 다형을 인식하는 형광 표지 올리고뉴클레오티드, 또는
(P1'-1) 서열 번호1에 나타내는 서열 중 207번째?217번째의 염기를 포함하는 염기길이 11?60의 서열이며, 서열 번호1에 있어서의 217번째의 염기에 대응하는 염기가 시토신인 것 이외는 서열 번호1과 동일한 염기를 갖는 염기 서열의 상보쇄에 대하여 스트린젠트한 조건 하에서 하이브리다이즈하고, 서열 번호1에 나타내는 서열 중 217번째의 염기에 대응하는 염기가 형광 색소로 표지되어 있으며, 또한 서열 번호1에 있어서의 207번째의 염기의 다형을 인식하는 형광 표지 올리고뉴클레오티드.
제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 형광 표지 올리고뉴클레오티드가, 형광 색소로 표지된 217번째의 염기를 3' 말단으로부터 세어 1?3번째에 갖는 다형 검출용 프로브.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 형광 표지 올리고뉴클레오티드가, 형광 색소로 표지된 217번째의 염기를 3' 말단에 갖는 다형 검출용 프로브.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 형광 표지 올리고뉴클레오티드가, 표적 서열에 하이브리다이즈하지 않을 때에 형광을 발하고, 또한, 당해 표적 서열에 하이브리다이즈했을 때에 형광 강도가 감소하거나 또는 증가하는 다형 검출용 프로브.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 형광 표지 올리고뉴클레오티드가, 표적 서열에 하이브리다이즈하지 않을 때에 형광을 발하고, 당해 표적 서열에 하이브리다이즈했을 때에 형광 강도가 감소하는 다형 검출용 프로브.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 형광 표지 올리고뉴클레오티드의 염기길이가 12?55인 다형 검출용 프로브.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 형광 표지 올리고뉴클레오티드의 염기길이가 15?45인 다형 검출용 프로브.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 형광 표지 올리고뉴클레오티드의 염기길이가 18?35인 다형 검출용 프로브.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 다형 검출용 프로브가, 융해 곡선 분석용의 프로브인, 다형 검출용 프로브.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 다형 검출용 프로브가, 서열 번호4, 서열 번호5, 서열 번호6, 서열 번호7, 서열 번호8, 서열 번호9, 서열 번호10, 서열 번호11, 서열 번호12, 서열 번호13, 서열 번호14, 서열 번호15 또는 서열 번호16에 나타내는 염기 서열을 갖는 다형 검출용 프로브.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 기재된 다형 검출용 프로브를 사용하는 것에 의해, ABCC2 유전자의 다형을 검출하는 다형 검출 방법.
제12항에 있어서,
(Ⅰ) 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 기재된 다형 검출용 프로브 및 시료 중의 1본쇄 핵산을 접촉시켜서, 상기 형광 표지 올리고뉴클레오티드 및 상기 1본쇄 핵산을 하이브리다이즈시켜서 하이브리드를 얻는 것과,
(Ⅱ) 상기 하이브리드를 포함하는 시료의 온도를 변화시킴으로써, 상기 하이브리드를 해리시켜, 상기 하이브리드의 해리에 의거하는 형광 시그널의 변동을 측정하는 것과,
(Ⅲ) 상기 형광 시그널의 변동에 의거하여 하이브리드의 해리 온도인 Tm값을 측정하는 것과,
(Ⅳ) 상기 Tm값에 의거하여, 상기 시료 중의 1본쇄 핵산에 있어서의, ABCC2 유전자의 다형의 존재를 검출하는 것
을 포함하는, 다형 검출 방법.
제13항에 있어서,
상기(Ⅰ) 전 또는 (Ⅰ)과 동시에 핵산을 증폭하는 것을 더 포함하는, 다형 검출 방법.
제12항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,
MDR1 유전자의 다형 검출용 프로브 및 CYP3A5 유전자의 다형 검출용 프로브로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종의 프로브를 사용하여, MDR1 유전자 및 CYP3A5 유전자로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 한쪽의 다형을 검출하는 것을 더 포함하는 다형 검출 방법.
제12항 내지 제15항 중 어느 한 항에 기재된 다형 검출 방법에 의해, ABCC2 유전자의 다형을 검출하는 것과,
검출된 다형의 유무에 의거하여, 약제에 대한 내성 또는 약제의 약효를 판정하는 것을 포함하는, 약제의 약효 판정 방법.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 기재된 다형 검출용 프로브를 포함하는, ABCC2 유전자의 다형을 검출하기 위한 다형 검출용 시약 키트.
제17항에 있어서,
상기 P1 형광 표지 올리고뉴클레오티드가 하이브리다이즈하는 서열을 포함하는 영역을 증폭 가능한 프라이머를 더 포함하는, 다형 검출용 시약 키트.
제17항 또는 제18항에 있어서,
MDR1 유전자의 다형을 검출하기 위한 프로브 및 CYP3A5 유전자의 다형을 검출하기 위한 프로브로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종 이상의 다형 검출용 프로브를 더 포함하는, 다형 검출용 시약 키트.