KR20200055518A - Composition containing microalgae extracts and preparation method of the same - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 옥세노클로렐라 프로토테코이드 균체의 추출물을 포함하는 우수한 기능성을 갖는 화장료 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것이다.The present invention relates to a cosmetic composition having excellent functionality comprising an extract of oxenochlorella protothecoid cells and a method for manufacturing the same.
피부의 미용과 건강에 관한 관심이 급증하는 가운데 피부의 주름 및 미백 개선 등을 위한 기능성 화장품이 다양하게 개발되어 왔다. 이들 중 대부분은 화학 제품이나 합성제품으로, 화장료 제형에 균일하게 분산되기 어렵거나 눈에 대한 자극성, 임산부 사용제한, 부스럼증, 가려움증(소양증) 등의 부작용이 있는 것으로 보고된다. 이에, 피부 주름 완화나 미백 등의 개선을 위한 기능성 물질로서 합성 제품보다는 천연 소재를 이용한 화장료 제품에 대한 선호도가 크게 증가하고 있다.With the increasing interest in beauty and health of skin, various functional cosmetics for improving wrinkles and whitening of the skin have been developed. Most of them are chemical products or synthetic products, which are difficult to be uniformly dispersed in cosmetic formulations or have side effects such as irritation to eyes, restrictions on use of pregnant women, swelling, and itching (pruritus). Accordingly, the preference for cosmetic products using natural materials rather than synthetic products as a functional material for improving skin wrinkles or whitening has increased significantly.
조류(algae)는 크기를 기준으로 김, 미역과 같은 수십 미터까지 성장하는 거대조류(macroalgae)와, 식물성 플랑크톤과 같은 수 마이크로미터 크기의 단세포 생물인 미세조류(microalgae)로 분류되고 있다. 식물성 플랑크톤 중 현미경으로 관찰할 수 있는 단세포성 조류를 미세조류(microalgae)라 한다.Algae are classified into macroalgae that grow up to several tens of meters, such as seaweed and seaweed, and microalgae, a single-celled organism that is several micrometers in size, such as phytoplankton. Of the phytoplankton, unicellular algae that can be observed with a microscope are called microalgae.
미세조류는 지구상에서 전체 광합성의 90%를 담당하는 것으로 추정되고 있으며, 지구 생태계의 1차 생산자로 매우 중요한 위치를 점하고 있다. 미세조류는 종류가 다양하고 증식 속도가 빠른 특징을 갖는다. 알려진 것만 4만 종 이상이며, 미등록된 것을 포함하면 30만 종 이상의 종류가 있다고 추정되고 있다. Microalgae are estimated to account for 90% of all photosynthesis on the planet, and are very important as primary producers of the global ecosystem. Microalgae are characterized by a variety of varieties and rapid growth. It is estimated that there are more than 40,000 known species, and that there are more than 300,000 types including unregistered ones.
미세조류는, 생육이 용이하고, 그로부터 단백질, 지질, 당질 및 색소와 같은 산업적으로 의미가 있는 생물 고분자 물질은 물론이고 특정의 생리 기능을 갖는 물질을 고농도로 생산할 수 있으므로, 중요한 생물 산업 소재로서 인식되고 있다. Microalgae are recognized as important bio-industry materials because they are easy to grow and can produce high-concentration substances with specific physiological functions as well as industrially meaningful bio-polymeric substances such as proteins, lipids, sugars and pigments. Is becoming.
옥세노클로렐라 프로토테코이드(Auxenochlorella protothecoides)는 미세조류로 분류되는 녹조류이다. 옥세노클로렐라 프로토테코이드를 산업 소재로서 이용하려는 시도는 있었으나, 화장품에 적용할 수 있을 정도의 품질 및 유효 성분 농도를 얻어내는데 어려움이 있어 실질적으로 화장품 원료로서 널리 사용되지 않는다. 따라서, 옥세노클로렐라 프로토테코이드에만 적합한 배양 방법이 지속적으로 요구되고 있다.Auxenochlorella protothecoides are green algae that are classified as microalgae. There have been attempts to use oxenochlorella protothecoide as an industrial material, but it is practically not widely used as a cosmetic raw material due to difficulty in obtaining a quality and active ingredient concentration that is applicable to cosmetics. Therefore, there is a continuous need for a culture method suitable only for oxenochlorella protothecoides.
일 양상은, 옥세노클로렐라 프로토테코이드 추출물을 유효성분으로 하는 화장료, 피부외용제 또는 의약외품제를 제조하는 방법을 제공한다.One aspect provides a method for preparing a cosmetic, an external preparation for skin, or a quasi-drug using an oxenochlorella protothecoide extract as an active ingredient.
다른 양상은, 상기 화장료, 피부외용제 또는 의약외품제의 제조 방법에 의해 제조된 조성물을 제공한다.Another aspect provides a composition prepared by the method for preparing a cosmetic, an external preparation for skin, or a quasi-drug.
이하, 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail.
본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 또한, 본 명세서에는 바람직한 방법이나 시료가 기재되나, 이와 유사하거나 동등한 것들도 본 발명의 범주에 포함된다. 또한, 본 명세서에 기재된 수치는 명시하지 않아도 "약"의 의미를 포함하는 것으로 간주한다. 본 명세서에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 전체가 본 명세서에 참고로 통합된다.All technical terms used in the present invention, unless defined otherwise, are used in a sense as commonly understood by those skilled in the art in the relevant field of the present invention. In addition, although a preferred method or sample is described herein, similar or equivalent ones are included in the scope of the present invention. In addition, the numerical values described in this specification are considered to include the meaning of “about” even if not specified. The contents of all publications described by reference herein are incorporated herein by reference in their entirety.
일 양상은, 옥세노클로렐라 프로토테코이드(Auxenochlorella protothecoides) 균주를 0.1 내지 60 μmol 광자/m2s의 광양자 밀도에서 배양하는 단계; 상기 배양물로부터 배양액을 제거하는 단계; 및 상기 배양액을 제거한 배양물을 이산화탄소 초임계추출하는 단계를 포함하는, 옥세노클로렐라 프로토테코이드 균주의 추출 방법을 제공한다.One aspect is the step of culturing an auxenochlorella protothecoide (Auxenochlorella protothecoides) strain at a photon density of 0.1 to 60 μmol photon / m 2 s; Removing the culture solution from the culture; And supercritical carbon dioxide extraction of the culture from which the culture solution is removed, to provide an extraction method of an oxenochlorella protothecoid strain.
일 구체예에서, 상기 균주는 상기 균주는 기탁번호 KCTC18635P인 균주일 수 있다. In one embodiment, the strain may be a strain having the accession number KCTC18635P.
옥세노클로렐라 프로토테코이드는 옥세노클로렐라 속의 하류단계 9 종 중 하나로, 클로렐라 프로토테코이드(Chlorella protothecoides) 또는 클로렐라 미누티시마(Chlorella minutissima)와 동일한 의미로 사용될 수 있다. 상기 균주는 국제기탁기관인 한국생명공학연구원 생물자원센터에 2017년 11월 24일에 균주특허 기탁하여 기탁번호 KCTC18635P를 부여 받았다.Oxenochlorella protothecoides are one of nine species downstream of the genus Oxenochlorella, and can be used in the same sense as Chlorella protothecoides or Chlorella minutissima. The strain was deposited as a strain patent on November 24, 2017 to the Korea Institute of Bioscience and Biotechnology Biological Resource Center, which was an international depository organization and was given a deposit number KCTC18635P.
상기 배양 단계에서 균주의 접종은 배양액 부피에 따라 접종 수는 상이할 수 있다.Inoculation of the strain in the culture step may be different in number of inoculations depending on the culture volume.
일 구체예에서, 상기 배양은 26 내지 30 ℃에서 90 시간 이상 100 시간 미만 동안 110 내지 120 rpm으로 진탕 배양하는 제1 배양 단계; 및 상기 제1 배양 단계에서의 배양물을 26 내지 30 ℃에서 100 시간 내지 140 시간 미만으로 110 내지 120 rpm으로 진탕 배양하는 제2 배양 단계를 포함하는 것일 수 있다.In one embodiment, the culture is a first culture step of shaking culture at 110 to 120 rpm for more than 90 hours and less than 100 hours at 26 to 30 ℃; And a second culture step of shaking the culture at the first culture step at 110 to 120 rpm at 26 to 30 ° C. for less than 100 hours to 140 hours.
상기 제1 및 제2 배양 단계에서의 진탕 속도는 110 rpm에서 120 rpm으로 5 rpm으로 상향하며 배양하는 것일 수 있다. 상기 진탕 속도는 30 내지 50 시간 마다 5 rpm으로 상향시키는 것일 수 있다. 상기 제1 배양 단계에서의 온도는 26 내지 30 ℃, 27 내지 29℃ 또는 27.5 내지 28.5 ℃일 수 있다. The shaking speed in the first and second culturing steps may be to cultivate while increasing from 110 rpm to 120 rpm to 5 rpm. The shaking speed may be increased to 5 rpm every 30 to 50 hours. The temperature in the first culture step may be 26 to 30 ° C, 27 to 29 ° C, or 27.5 to 28.5 ° C.
상기 균주를 제1 및 제2 배양 단계로 나누어 배양하지 않는 경우, 질적으로 및/또는 양적으로 추출에 적용하기에 적합한 수준의 균주를 얻기 어려울 수 있다. 제1 배양 단계에서의 온도 범위 및/또는 배양 시간 범위 밖으로 배양하는 경우 제2 배양 단계에 적용하기에 적절한 수의 균주를 얻지 못하거나, 추가로 장시간 배양하기에 적절한 상태의 균주를 얻기 어려울 수 있다. 제2 배양 단계에서 온도 범위 및/또는 배양 시간 범위 미만으로 배양하는 경우, 추출하기에 적절한 수의 균주를 얻지 못할 수 있고, 상기 범위를 초과하여 배양하는 경우, 균주의 기능성 성분이 변경될 수 있어 제품화하기에 적합하지 않을 수 있다.If the strain is not cultured by dividing it into the first and second culturing steps, it may be difficult to obtain a strain suitable for qualitative and / or quantitative extraction. When culturing outside the temperature range and / or the cultivation time range in the first cultivation step, it may not be possible to obtain a suitable number of strains to be applied to the second cultivation step, or it may be difficult to obtain a strain in an appropriate state for further long-term cultivation. . When culturing below the temperature range and / or the cultivation time range in the second cultivation step, it may not be possible to obtain an appropriate number of strains for extraction, and when cultivation is exceeded, the functional component of the strain may be changed It may not be suitable for commercialization.
일 구체예에서, 제1 배양 단계에서는 0.1 내지 1 μmol 광자/m2s의 광양자 밀도에서 배양하고, 제2 배양 단계에서는 30 내지 60 μmol 광자/m2s의 광양자 밀도에서 배양하는 것일 수 있다.In one embodiment, the first culture step may be cultured at a photon density of 0.1 to 1 μmol photon / m 2 s, and the second culture step may be cultured at a photon density of 30 to 60 μmol photon / m 2 s.
상기 제1 배양 단계에서 광양자 밀도는 0.1 내지 1 μmol 광자/m2s, 0.3 내지 0.8 μmol 광자/m2s, 또는 0.5 내지 0.6 μmol 광자/m2s일 수 있다. 제1 배양 단계에서 0.1 내지 1 μmol 광자/m2s, 바람직하게는 약 0.5 내지 약 0.6 μmol 광자/m2s 수준으로 광양자 밀도를 조절하지 않으면, 제2 배양 단계에서 광양자 밀도를 조절하여도 기능성 성분의 증가 효과를 달성할 수 없었다. 따라서, 제1 배양 단계에서의 광양자 밀도의 조절은, 궁극적으로 제2 배양 단계에서의 광양자 밀도 조절에 의한 기능성 성분 증가 효과를 달성하기 위해 필수적일 수 있다.In the first culture step, the photon density may be 0.1 to 1 μmol photon / m 2 s, 0.3 to 0.8 μmol photon / m 2 s, or 0.5 to 0.6 μmol photon / m 2 s. If the photon density is not adjusted to the level of 0.1 to 1 μmol photon / m 2 s in the first culturing step, preferably about 0.5 to about 0.6 μmol photon / m 2 s, it is functional even if the photon density is adjusted in the second culturing step The increasing effect of the ingredients could not be achieved. Therefore, control of the photon density in the first culture step may be necessary to ultimately achieve the effect of increasing the functional component by controlling the photon density in the second culture step.
상기 제2 배양 단계에서 광양자 밀도는 30 내지 60 μmol 광자/m2s, 35 내지 55 μmol 광자/m2s 또는 40 내지 50 μmol 광자/m2s일 수 있다. 제2 배양 단계에서 약 40 내지 약 50 μmol 광자/m2s 수준의 광양자 밀도가 만족되어야, 기능성 성분이 충분히 생산될 수 있다.In the second culture step, the photon density may be 30 to 60 μmol photon / m 2 s, 35 to 55 μmol photon / m 2 s, or 40 to 50 μmol photon / m 2 s. In the second culture step, a photon density of about 40 to about 50 μmol photon / m 2 s level must be satisfied, so that the functional component can be sufficiently produced.
일 구체예에서, 상기 방법은 초임계추출 전 상기 배양물을 동결건조하는 단계를 더 포함할 수 있다.In one embodiment, the method may further include lyophilizing the culture prior to supercritical extraction.
상기 배양물을 동결건조할 때, 배양액을 제거한 배양물을 동결건조하는 것이 바람직할 수 있다. 초임계추출 전 배양물을 동결건조함으로써 추출 효율을 높일 수 있다. 동결건조는 -20 ℃ 내지 -80 ℃의 온도에서 이루어질 수 있다.When freeze-drying the culture, it may be desirable to freeze-dry the culture from which the culture medium is removed. Freeze-drying of the culture prior to supercritical extraction can improve extraction efficiency. Lyophilization may be performed at a temperature of -20 ° C to -80 ° C.
일 구체예에서, 상기 초임계추출은 40 내지 70 ℃의 추출온도에서 80 내지 700 bar로 이루어지는 것일 수 있다.In one embodiment, the supercritical extraction may be made of 80 to 700 bar at an extraction temperature of 40 to 70 ℃.
상기 추출 온도는 40 내지 70 ℃, 40 내지 60 ℃, 45 내지 55 ℃ 또는 48 내지 52 ℃일 수 있다. 상기 추출 압력은 80 내지 700 bar, 100 내지 500 bar, 200 내지 400 bar, 250 내지 350 bar, 또는 280 내지 320 bar일 수 있다. 상기 추출은 약 50 ℃ 및 약 300 bar의 조건에서 이루어져야 하고, 온도 및 압력이 상기 범위 보다 현저히 높은 경우 성분이 파괴되거나 잡내가 발생하여 품질이 저하될 수 있다. 또한, 온도 및 압력이 상기 범위 보다 현저히 낮은 경우, 추출물의 기능성 성분이 충분히 추출되지 않고, 생산량이 현저히 감소할 수 있다. 상기 추출은 6 시간 이상 이루어질 수 있다. 상기 추출 시간은 6 시간 내지 20 시간, 6 시간 내지 15 시간, 6 시간 내지 10시간, 또는 6 시간 내지 8시간일 수 있다. 추출 시간이 상기 범위 보다 현저히 높거나 낮은 경우, 품질이 저하되거나 생산량이 현저히 감소될 수 있다. 상기 추출은 추출물 회수량이 시간당 100 g 이하로 수득되는 경우 추출을 종료하는 것이 바람직할 수 있다. 회수량이 시간당 100 g 이하임에도 추출을 계속 하는 경우, 잡내가 발생하고, 산폐된 지방산 함량이 증가하여 제품의 품질이 저하될 수 있다.The extraction temperature may be 40 to 70 ℃, 40 to 60 ℃, 45 to 55 ℃ or 48 to 52 ℃. The extraction pressure may be 80 to 700 bar, 100 to 500 bar, 200 to 400 bar, 250 to 350 bar, or 280 to 320 bar. The extraction should be performed at a condition of about 50 ° C. and about 300 bar, and when the temperature and pressure are significantly higher than the above range, the quality of the component may be destroyed or deterioration may occur, resulting in deterioration of quality. In addition, when the temperature and pressure are significantly lower than the above range, the functional component of the extract is not sufficiently extracted, and the production amount may be significantly reduced. The extraction may be performed for 6 hours or more. The extraction time may be 6 hours to 20 hours, 6 hours to 15 hours, 6 hours to 10 hours, or 6 hours to 8 hours. If the extraction time is significantly higher or lower than the above range, the quality may be lowered or the production amount may be significantly reduced. In the extraction, it may be desirable to terminate the extraction when the recovery amount of the extract is obtained at 100 g or less per hour. If the extraction is continued even though the recovery amount is 100 g or less per hour, odor is generated, and the quality of the product may deteriorate due to an increase in the amount of acidic fatty acids.
일 구체예에서, 상기 방법은 상기 초임계추출물을 정제하는 단계를 더 포함할 수 있다.In one embodiment, the method may further include purifying the supercritical extract.
균체가 배양되는 동안, 냄새의 원인이 되는 물질이 배양물에 혼합되어 최종 산물의 품질을 저하시킬 수 있으므로, 상기 방법은 배양물을 동결건조하기 전에 식염수로 수회 세척하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 세척은 원심분리된 배양물을 식염수에 현탁시키고 다시 원심분리를 가하는 방법으로 수행될 수 있다.During the cultivation of the cells, since the substance causing the odor may be mixed with the culture and degrade the quality of the final product, the method may further include washing the culture with a saline solution several times before lyophilizing the culture. . The washing may be performed by suspending the centrifuged culture in saline and adding centrifugation again.
상기 정제하는 단계는 산폐된 지방산을 제거하거나 및/또는 냄새 성분을 제거하는 탈취 공정을 포함할 수 있다. 탈취 공정은 스팀스트리핑을 이용해 수행될 수 있다. 구체적으로, 탈취 공정은 2 torr 이하, 0.5 내지 2 torr 또는 1 내지 2 torr의 감압 환경에서 60 내지 80 ℃의 탈취 온도를 적용하며 스팀을 적용하는 방식으로 진행될 수 있다. 탈취 공정은 탈취가 성공적으로 달성될 때까지 1 회 이상 반복될 수 있으나, 횟수가 증가하는 경우 추출물 내 기능성 성분이 변질될 수 있으므로 이를 최소화 하는 것이 바람직할 수 있다.The refining may include a deodorizing process to remove acidic fatty acids and / or remove odor components. The deodorization process can be performed using steam stripping. Specifically, the deodorization process may be carried out in a manner of applying steam and applying a deodorization temperature of 60 to 80 ° C in a reduced pressure environment of 2 torr or less, 0.5 to 2 torr or 1 to 2 torr. The deodorization process may be repeated one or more times until deodorization is successfully achieved, but it may be desirable to minimize this as the functional component in the extract may deteriorate as the number of times increases.
정제하는 과정에서, 산폐된 지방산을 제거할 수 있다. 제2 배양 단계에서 광양자 밀도를 조절한 조건 하에 배양된 균체로부터 수득된 추출물은, 제1 및 제2 배양 단계 모두에서 300 내지 370 μmol 광자/m2s의 광양자 밀도 조건하에 배양된 균체로부터 수득된 추출물에 비해 산폐된 지방산이 적었다. 또한, 제1 및 제2 배양 단계 모두에서 300 내지 370 μmol 광자/m2s의 광양자 밀도 조건하에 배양된 균체로부터 수득된 추출물은 탈취 공정을 거쳐도 균체의 특유의 냄새가 여전히 강하게 남아 있음을 관찰하였다. 따라서, 일 구체예에 따른 본 발명의 방법이 종래의 광합성 조건과 유사한 배양 방법에 비해 우수한 품질의 옥세노클로렐라 프로토테코이드 균주의 추출물을 획득하는데 유리할 수 있다.In the course of purification, acidic fatty acids can be removed. The extract obtained from the cells cultured under conditions in which the photon density was adjusted in the second culture step, the extract obtained from the cells cultured under the photon density conditions of 300 to 370 μmol photons / m2s in both the first and second culture steps Compared, there were fewer acid fatty acids. In addition, it was observed that the extracts obtained from cells cultured under conditions of photon density of 300 to 370 μmol photons / m2s in both the first and second culturing stages still have a strong characteristic odor of the cells even after deodorization. Therefore, the method of the present invention according to one embodiment may be advantageous in obtaining an extract of a superior quality oxenochlorella protothecoid strain compared to a culture method similar to conventional photosynthetic conditions.
일 구체예에서, 상기 방법은 상기 균주 추출물 중 루테인 함량을 두 배 이상 증가시키기 위한 것일 수 있다.In one embodiment, the method may be to increase the lutein content in the strain extract more than twice.
상기 루테인 함량은 정제된 초임계 추출물의 중량비를 기준으로 산정된 것일 수 있다.The lutein content may be calculated based on the weight ratio of the purified supercritical extract.
본 발명의 일 구체예에 따라 제조된 균주 추출물은 루테인 함량이 200 ppm 이상이다.The strain extract prepared according to one embodiment of the present invention has a lutein content of 200 ppm or more.
일 구체예에서, 상기 방법은 피부개선기능이 향상된 균주 추출물을 획득하기 위한 것일 수 있다.In one embodiment, the method may be for obtaining a strain extract with improved skin improvement function.
하기의 시험예 1에서, 본 발명의 일 구체예에 따른 추출물은 다른 방법에 따라 추출된 것과 비교하여, 시험된 모든 농도에서 현저하게 우수한 티로시나아제 저해 활성을 가짐이 입증되었다. 따라서, 상기 피부 개선은 미백을 의미하는 것일 수 있다.In the following Test Example 1, the extract according to one embodiment of the present invention was proved to have a remarkably excellent tyrosinase inhibitory activity at all concentrations tested, compared to that extracted according to another method. Therefore, the skin improvement may mean whitening.
또한, 하기의 시험예 2 및 3에서, 본 발명의 일 구체예에 따른 추출물은 다른 방법에 따라 추출된 것과 비교하여 콜라게나아제 및 엘라스타아제 억제 효능이 현저하게 높은 것을 확인하였다. 따라서, 본 발명의 일 구체예에 따라 추출된 옥세노클로렐라 프로토테코이드 균주의 초임계추출물은 콜라게나아제 및 엘라스타아제 억제 효능을 발휘할 수 있는 유효 성분을 다량 함유하는 것일 수 있다. 따라서, 상기 피부 개선은 피부탄력회복, 노화방지 또는 주름개선을 의미하는 것일 수 있다.In addition, in the following Test Examples 2 and 3, it was confirmed that the extracts according to one embodiment of the present invention have significantly higher inhibitory effects on collagenase and elastase compared to those extracted according to other methods. Therefore, the supercritical extract of the oxenochlorella protothecoide strain extracted according to one embodiment of the present invention may contain a large amount of active ingredients capable of exerting collagenase and elastase inhibitory efficacy. Accordingly, the skin improvement may mean skin elasticity recovery, anti-aging or wrinkle improvement.
또한, 하기의 시험예 4에서, 본 발명의 일 구체예에 따른 추출물은 다른 방법에 따라 추출된 것과 비교하여, iNOS 억제 효과가 우수하고, 이는 대조군과 비교시 무려 약 3 배 정도 우수한 iNOS 억제 효과를 갖는 것으로 관찰되었다. 따라서, 상기 피부 개선은 항염증, 구체적으로 피부 염증 반응 감소를 의미하는 것일 수 있다.In addition, in the following Test Example 4, the extract according to one embodiment of the present invention has superior iNOS inhibitory effect compared to that extracted according to another method, which is about 3 times better than the control group. It was observed to have. Therefore, the skin improvement may mean anti-inflammatory, specifically, a reduction in skin inflammatory response.
다른 양상은, 본 발명의 일 구체예에 따른 제조방법에 의하여 제조된 피부개선용 조성물을 제공한다.Another aspect provides a composition for improving skin produced by a manufacturing method according to an embodiment of the present invention.
일 구체예에서, 상기 조성물은 화장료, 피부외용제 또는 의약외품제 원료로 사용될 수 있다.In one embodiment, the composition may be used as a raw material for cosmetic, external skin or quasi-drugs.
일 구체예에서, 상기 피부개선은 미백, 피부탄력회복, 노화방지, 주름개선, 항염증 또는 이들의 조합일 수 있다.In one embodiment, the skin improvement may be whitening, skin elasticity recovery, anti-aging, wrinkle improvement, anti-inflammatory or a combination thereof.
피부개선용 조성물은 제형화하기 위해 "약학적으로 허용가능한 담체"를 더 포함할 수 있다. 상기 조성물은 외용제로 사용될 수 있다. 외용제는 패취, 밴드, 유액, 연고, 팩, 젤, 크림, 로션, 액제 또는 분말제의 형태로 적용될 수 있고, 화장품으로서 유연화장수, 영양화장수, 마사지 크림, 영양크림, 보습크림, 기능성 로션, 미스트, 팩, 젤 또는 피부 점착타입 제형으로서 적용될 수 있다. 따라서 상기 외용제로 사용되기 위하여 통상 화장품이나 의약품 등의 외용제에 사용되는 성분, 예컨대 수성성분, 유성성분, 분말성분, 알코올류, 보습제, 증점제, 자외선흡수제, 미백제, 방부제, 산화방지제, 계면활성제, 향료, 색제, 각종 피부 영양제등이 조성물에 필요에 따라서 적절하게 배합될 수 있다. 상기 외용제는, 에데트산이나트륨, 에데트산삼나트륨, 시트르산나트륨, 폴리인산나트륨, 메타인산나트륨, 글루콘산 등의 금속봉쇄제, 카페인, 탄닌, 벨라파밀, 감초추출물, 글라블리딘, 칼린의 과실의 열수추출물, 각종생약, 아세트산토코페롤, 글리틸리틴산, 트라넥삼산 및 그 유도체 또는 그 염등의 약제, 비타민 C, 아스코르브산인산마그네슘, 아스코르브산글루코시드, 알부틴, 코지산, 글루코스, 프룩토스, 트레할로스 등의 당류등도 적절하게 배합할 수 있다.The composition for skin improvement may further include a "pharmaceutically acceptable carrier" for formulation. The composition can be used as an external preparation. External preparations can be applied in the form of patches, bands, emulsions, ointments, packs, gels, creams, lotions, liquids or powders, and as cosmetics are softening lotions, nourishing lotions, massage creams, nourishing creams, moisturizing creams, functional lotions, mists , Pack, gel or skin adhesive type formulations. Therefore, in order to be used as the external preparation, ingredients commonly used in external preparations such as cosmetics and pharmaceuticals, such as aqueous ingredients, oily ingredients, powder ingredients, alcohols, moisturizers, thickeners, ultraviolet absorbers, whitening agents, preservatives, antioxidants, surfactants, fragrances , Colorants, various skin nutrients, etc. may be appropriately formulated in the composition as needed. The external preparation is a fruit of metal blockades such as disodium edetate, trisodium edetate, sodium citrate, sodium polyphosphate, sodium metaphosphate, gluconic acid, caffeine, tannins, velapamil, licorice extract, glabridine, and fruit of kaline Pharmaceuticals such as hot water extracts, various herbal medicines, tocopherol acetate, glytilitic acid, tranexamic acid and its derivatives or salts thereof, vitamin C, magnesium ascorbate phosphate, ascorbic acid glucoside, arbutin, kojic acid, glucose, fructose, trehalose Sugars, such as, etc. can also be mix | blended suitably.
일 양상에 따른 옥세노클로렐라 프로토테코이드의 추출물을 함유하는 제제의 제조방법은, 옥세노클로렐라 프로토테코이드의 화장료, 피부외용제 또는 의약외품제로서 유용한 기능성 성분의 함량을 극대화시킬 수 있고, 냄새가 적고 독성이 낮아 우수한 품질의 제제를 생산할 수 있다.A method for preparing a formulation containing an extract of oxenochlorella protothecoides according to one aspect can maximize the content of functional ingredients useful as cosmetic, external skin or quasi-drugs of oxenochlorella protothecoides, and have less odor Due to its low toxicity, it is possible to produce excellent quality preparations.
다른 양상에 따른 화장료, 피부외용제 또는 의약외품제 조성물은 높은 함량의 기능성 성분을 포함하고, 우수한 품질을 갖는다.The cosmetic, external skin or quasi-drug composition according to another aspect includes a high content of functional ingredients and has excellent quality.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in detail by examples. However, the following examples are merely illustrative of the present invention, and the contents of the present invention are not limited by the following examples.
모든 데이터는 평균±표준 편차로 표현하였고, 반올림하여 나타내었다. 두 평균 사이의 차이는 t-테스트를 수행하였고, 세 개 이상의 평균 사이의 차이는 사후 검증 (Tukey's multiple range test) 변화량 분석을 수행하였으며, p-value< 0.05 또는 0.01 수준에서 유의차를 검정하였다.All data were expressed as mean ± standard deviation and rounded. The difference between the two means was performed by the t-test, and the difference between the three or more means was performed by a variation analysis of Tukey's multiple range test, and the significant difference was tested at the p-value <0.05 or 0.01 level.
이하에서는, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 본 발명을 용이하게 실시할 수 있도록, 본 발명의 바람직한 실시 예들에 관하여 첨부된 표 내지는 도면을 참조하여 상세히 설명하기로 하며, 아래 시험에서 특별한 설명 없이 기재된 %는 문맥상 다른 의미로 해석되지 않으면 중량%를 의미한다.Hereinafter, with reference to the accompanying tables or drawings, preferred embodiments of the present invention will be described in detail with reference to the accompanying drawings so that those skilled in the art to which the present invention pertains can easily implement the present invention. In the description, the percentages indicated without specific description mean the weight percentages unless the context interprets them differently.
제조예Manufacturing example 1: 균주배양 및 추출물 제조 1: Strain culture and extract preparation
1) One) 실시예Example 1의 균주 배양물의 제조 Preparation of 1 strain culture
옥세노클로렐라 프로토테코이드 균주는 UTEX (Culture Collection of Algae at The University of Texas at Austin)에서 분양받은 UTEX2341(Auxenochlorella protothecoides, Chlorella protothecoides, 2011년 7월)을 사용하였다. 상기 균주를 한국생명공학연구원 생물자원센터에 2017년 11월 24일에 균주특허 기탁하여 기탁번호 KCTC18635P를 부여받았다.As an oxenochlorella protothecoide strain, UTEX2341 (Auxenochlorella protothecoides, Chlorella protothecoides, July 2011), which was purchased from UTEX (Culture Collection of Algae at The University of Texas at Austin), was used. The strain was deposited as a strain patent on November 24, 2017 to the Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology Biological Resource Center, and was assigned a deposit number KCTC18635P.
상기 균주를 -80 ℃에 보관된 동결 시험관 균주를 준비한 후, 얼음 상에 천천히 해동하고, 소량의 배양액에 분주한 다음 제1 배양을 위해 배양액을 포함하는 플라스크에 접종하였다. 균주가 접종된 배양물을 약 28 ℃에서 90 시간 이상 100 시간 미만 동안 110 rp에서 120 rpm으로 균주의 상태를 지켜보면서 약 40 시간 마다 5 rpm씩 속도를 상향시키며 진탕 배양하였고, 광양자 밀도를 약 0.5 내지 약 0.6 μmol 광자/m2s로 유지하였다. 배양 배지는 K2HPO4, KH2PO4, NaCl, MgSO4 .7H2O, NaNO3, CaCl2.2H2O, HEPES, 효모 추출물, 및 비타민 복합체를 함유한 것을 사용하였고, 탄소원으로 글루코스를 첨가하였다.After preparing the strain for freezing test tubes stored at -80 ° C, the strain was slowly thawed on ice, dispensed in a small amount of culture medium, and inoculated into a flask containing the culture medium for the first culture. The cultures inoculated with the strain were shaken and cultured at a rate of 5 rpm every 40 hours, while maintaining the state of the strain at 110 rpm at 120 rpm for more than 90 hours and less than 100 hours at about 28 ° C, and the photon density was about 0.5. To about 0.6 μmol photon / m 2 s. The culture medium was K 2 HPO 4 , KH 2 PO 4 , NaCl, MgSO 4 . 7H 2 O, NaNO 3 , CaCl 2. 2H 2 O, HEPES, yeast extract, and one containing a vitamin complex were used, and glucose was added as a carbon source.
상기 제1 배양의 배양물을 제2 배양을 위해 새로운 배양액을 포함하는 플라스크에 접종하였다. 상기 제1 배양물이 접종된 플라스크를 약 28 ℃에서 100 시간 내지 140 시간 미만으로 진탕속도를 제1 배양 단계에서와 같은 조건으로 하여 진탕 배양하였고, 광양자 밀도는 약 40 내지 약 50 μmol 광자/m2s를 유지하였다. The culture of the first culture was inoculated into a flask containing a new culture medium for the second culture. The flask inoculated with the first culture was cultured with shaking at a rate of about 28 to 100 hours to less than 140 hours under the same conditions as in the first culture step, and the photon density was about 40 to about 50 μmol photon / m 2 s was maintained.
2) 2) 비교예Comparative example 1 및 2의 균주 배양물의 제조 Preparation of strain cultures 1 and 2
비교예 1 및 비교예 2의 균주 배양물을, 실시예 1의 제1 배양 단계 및 제2 배양 단계 중 광양자 밀도만을 다르게 하여 제조하였다.The strain cultures of Comparative Example 1 and Comparative Example 2 were prepared by varying only the photon density among the first culture step and the second culture step of Example 1.
(μmol광자/m2s)Photon density
(μmol photon / m 2 s)
→40-500.5-0.6
→ 40-50
비교예 2의 경우, 광합성 배양으로 분류될 수 있으므로 당 업계 일반적인 배양 조건에 따라 탄소원인 글루코스를 포함하지 않고 배양하였다. 비교예 1은 배양이 완료될 때까지 완전히 빛이 차단된 암실에서 배양하였다.In the case of Comparative Example 2, since it can be classified as photosynthetic culture, it was cultured without containing the carbon source glucose according to general culture conditions in the art. Comparative Example 1 was cultured in a dark room completely blocked with light until the culture was completed.
3) 추출물의 제조3) Preparation of extract
진탕 배양을 종료하고, 배양액으로부터 균체만을 얻어내기 위해 원심분리하였다. 배양액을 완전히 제거하기 위해 식염수로 수회 세척하였다. 원심분리 후 수득된 고형분을 약 72 시간 동안 -40℃에서 동결 건조하여 건조 분말을 얻었다. 상기 건조 분말을 초임계 추출기에 넣고, 준연속식(Semi-continuous) 초임계 추출을 수행하였다. 구체적으로, 고압용 기체 펌프를 이용하여 추출조에 이산화탄소를 일시적으로 공급하여 300 바(bar)까지 승압하고, 추출조 외부 히터를 통해 내부의 추출 온도를 50 내지 70 ℃로 승온시켰다. 추출은 약 50 ℃의 온도에서 약 300 bar를 유지하여 6 시간 이상 수행하였다. 추출조의 출구에 부착된 압력조절기를 이용하여 압력을 조절하여 추출물의 양을 확인하였고, 추출물 회수량이 시간당 100 g 이하로 회수되면 추출을 종료하였다. 추출 작업이 완료된 후에는 추출조의 출구에 부착된 압력조절기를 통해서 이산화탄소는 대기로 방출하고, 포집기 내에 수득된 조추출물(crude oil)을 회수하였다.The shaking culture was terminated and centrifuged to obtain only cells from the culture medium. The culture was washed several times with saline to completely remove it. The solid obtained after centrifugation was freeze-dried at -40 ° C for about 72 hours to obtain a dry powder. The dry powder was placed in a supercritical extractor, and semi-continuous supercritical extraction was performed. Specifically, carbon dioxide was temporarily supplied to the extraction tank by using a high pressure gas pump, and the pressure was increased to 300 bar, and the internal extraction temperature was raised to 50 to 70 ° C through an external heater of the extraction tank. The extraction was carried out for 6 hours or more by maintaining about 300 bar at a temperature of about 50 ° C. The pressure was controlled using a pressure regulator attached to the outlet of the extraction tank to check the amount of the extract, and extraction was terminated when the amount of extract was recovered to 100 g or less per hour. After the extraction operation is completed, carbon dioxide is released into the atmosphere through a pressure regulator attached to the outlet of the extraction tank, and the crude oil obtained in the collector is recovered.
4) 추출물의 정제4) Purification of extract
초임계추출로 수득된 조추출물을 유리 반응기에 넣고, 교반하면서 약 75 ℃까지 승온하였다. 그 후 AV 분석 값을 바탕으로 NaOH 수용액을 적절한 pH에 도달할 때까지 교반하면서 적가하였다. 적가 후 교반을 멈추고 1 시간 정치시겼다. 그 후 상층액을 분리시켜 약 90 ℃의 물을 이용하여 세척하였다. 맑은 물이 나올 때까지 세척을 반복하였다. 그 후, 진공 상태를 유지하면서 교반하여 약 110 ℃까지 승온 하였다. 상기 과정에서 미량의 수분이 제거될 수 있다. 이후, 상기 조추출물에 미량으로 혼입된 이물질을 제거하기 위해 Mg-Si를 넣고 한 시간 반응시킨 후 60 ℃까지 냉각시켰다. 그 후, 진공감압플라스크를 이용하여 감압 필터하고, 1차 정제된 오일을 수득하였다. 상기 1차 정제 오일에 스팀스트리핑 방법에 의해 탈취 공정(Deodorization)을 수행하였다. 구체적으로, 2 torr 이하의 감압 환경에서 60 내지 80 ℃의 탈취 온도를 적용하며 상기 1차 정제 오일에 스팀을 적용하여 탈취 공정을 수행하였다. 탈취 공정 후, 실시예 1 및 비교예 1은 제품에 적합 수준으로 수득되었으나, 비교예 2는 탈취가 성공적으로 달성되지 않았다.The crude extract obtained by supercritical extraction was placed in a glass reactor and heated to about 75 ° C while stirring. Thereafter, NaOH aqueous solution was added dropwise with stirring until an appropriate pH was reached based on the AV analysis value. After dropping, stirring was stopped and allowed to stand for 1 hour. Thereafter, the supernatant was separated and washed with water at about 90 ° C. The washing was repeated until clear water came out. Thereafter, the mixture was stirred while maintaining a vacuum, and heated up to about 110 ° C. In the process, a small amount of moisture may be removed. Thereafter, Mg-Si was added to remove the foreign matter mixed in a very small amount to the crude extract, reacted for an hour, and then cooled to 60 ° C. Thereafter, the filter was vacuum-reduced using a vacuum reduced pressure flask to obtain a primary purified oil. Deodorization was performed by the steam stripping method on the primary refined oil. Specifically, a deodorization temperature of 60 to 80 ° C. was applied in a reduced pressure environment of 2 torr or less, and steam was applied to the primary refined oil to perform a deodorization process. After the deodorization process, Example 1 and Comparative Example 1 were obtained at a level suitable for the product, but Comparative Example 2 did not successfully achieve deodorization.
5) 추출물의 루테인 함량분석5) Lutein content analysis of extract
상기 추출된 샘플 중 실시예 1 및 비교예 1에서 루테인의 함량을 분석하였다. Among the extracted samples, the content of lutein in Example 1 and Comparative Example 1 was analyzed.
구체적으로, 시료 30 mg을 정밀하게 칭량하여 원심분리관으로 옮기고 증류수 15 mL를 첨가하였다. 30 분간 초음파 처리하여 시료를 완전히 분산시켰다. 30 mL 에틸아세테이트를 첨가하고, 상기 원심분리관에 염화나트륨 약 3 g을 넣고 마개를 한 후, 진탕하여 추출하고, 2,000 rpm으로 5 분간 원심분리하였다. 주황색의 상층액과 옅은 황색 또는 무색의 하층액으로 나뉠 때 까지 진탕 및 원심분리를 반복하였다. 상층액 1 mL를 취하여 25 mL 에탄올이 채워진 50 mL 플라스크에 넣고 희석하였다. 20 초간 진탕하여 혼합하고 에탄올을 대조군으로하여 446 nm에서 자외선분광광도계(UV/Visible Spectrophotometer)를 이용해 흡광도를 측정하였다.Specifically, 30 mg of the sample was precisely weighed, transferred to a centrifuge tube, and 15 mL of distilled water was added. The sample was completely dispersed by sonication for 30 minutes. 30 mL of ethyl acetate was added, about 3 g of sodium chloride was added to the centrifuge tube, and then the mixture was capped, shaken and extracted, and centrifuged at 2,000 rpm for 5 minutes. Agitation and centrifugation were repeated until the orange supernatant and the pale yellow or colorless lower supernatant were separated. 1 mL of supernatant was taken and placed in a 50 mL flask filled with 25 mL ethanol and diluted. The mixture was shaken for 20 seconds, ethanol was used as a control, and absorbance was measured using an ultraviolet spectrophotometer (UV / Visible Spectrophotometer) at 446 nm.
또한 액체크로마토그래피 분석을 위해, 시료 30 ㎕를 갈색 HPLC 바이알에 옮겨 질소가스를 이용해 완전히 건조시킨 후 이동상 1 mL를 넣고 마개를 한 후 30 초간 초음파로 진탕하였다. 액체크로마토그래피 분석 조건은 하기와 같다.In addition, for liquid chromatography analysis, 30 µl of the sample was transferred to a brown HPLC vial, dried completely using nitrogen gas, 1 mL of the mobile phase was added, capped, and then shaken with ultrasonic waves for 30 seconds. Liquid chromatography analysis conditions are as follows.
<분석 방법><Analysis method>
주입량 10㎕, 온도 30 ℃, 이동상 헥산:에틸아세테이트 (70:30), 파장 446 nm, 유속 1.5 mL/min, 분석시간 25분Injection volume 10 μl, temperature 30 ° C., mobile phase hexane: ethyl acetate (70:30), wavelength 446 nm, flow rate 1.5 mL / min, analysis time 25 minutes
<결과 계산><Calculation of results>
총카로티노이드 함량(%)= (A × Vd × Ve × 100) / (α× Va × 1 × m)Total carotenoid content (%) = (A × V d × V e × 100) / (α × Va × 1 × m)
A : 446 nm에서 측정한 흡광도A : Absorbance measured at 446 nm
Vd : 희석용매의 부피(mL) ; 50 mLVd : Volume of diluted solvent (mL); 50 mL
Ve : 추출용매의 부피(mL) ; 30 mLVe: volume of the extraction solvent (mL); 30 mL
α : 흡광도 계수(255 mL/mg.m)α: absorbance coefficient (255 mL / mg.m)
※ 1% 루테인 에탄올 용액(10 mg/mL)의 흡광도 : 2550 ※ Absorbance of 1% Lutein ethanol solution (10 mg / mL): 2550
1 : Quartz cuvette의 규격(1 cm)One : Specification of Quartz cuvette (1 cm)
Va : 희석 시 사용한 추출용매의 부피(mL) ; 1 mLVa: volume of the extraction solvent used in dilution (mL); 1 mL
m : 검체량(mg)m: sample volume (mg)
루테인 함량(%) = 총 카로티노이드 함량(%)×(루테인 peak 면적(%)/100)Lutein content (%) = Total carotenoid content (%) × (Lutein peak area (%) / 100)
하기의 중량은, 최종 정제된 추출물 총 중량을 기준으로 계산하였다.The following weights were calculated based on the total weight of the final purified extract.
상기 표 2에서 알 수 있는 바와 같이, 실시예 1은 다른 조건에서 배양한 균주의 추출물과 유사한 수준의 조지방을 가지나, 루테인의 함량은 비교예 1에 비해 두 배 이상 얻을 수 있음을 알 수 있다.As can be seen from Table 2, Example 1 has a similar level of crude fat as the extract of the strain cultured under different conditions, but it can be seen that the content of lutein can be obtained more than twice as compared to Comparative Example 1.
제조예Manufacturing example 2: 세포 배양 2: cell culture
시험에 사용할 세포주들은 하기의 방법으로 배양하였다.Cell lines to be used for the test were cultured in the following manner.
사람의 정상섬유아세포 (HDF-A, Human dermal fibroblast)는 FGM-2 섬유아세포 성장 배지 키트 (Lonza, fibroblast growth media kit for fibroblast)을 이용하여 37℃, 5% 습윤 CO2 인큐베이터에서 배양하였다.Human normal fibroblasts (HDF-A, Human dermal fibroblast) were cultured in an incubator at 37 ° C., 5% wet CO 2 using a FGM-2 fibroblast growth media kit (Lonza, fibroblast growth media kit for fibroblast).
대식세포 (Raw 2647 cell)은 L-글루타민 (L-glutamine, 300 ㎎/L), 25 mM HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid) 및 25 mM NaHCO3, 10% FBS (heat inactivated fetal bovine serum) 등이 함유된 DMEM(Dulbecco’s modied Eagle's medium) 배지를 이용하여 37℃, 5% 습윤 CO2 인큐베이터에서 배양하였다.Macrophages (Raw 2647 cells) are L-glutamine (L-glutamine, 300 mg / L), 25 mM HEPES (4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazineethanesulfonic acid) and 25 mM NaHCO 3 , 10% FBS (heat The cells were cultured in a 37 ° C, 5% wet CO 2 incubator using DMEM (Dulbecco's modied Eagle's medium) medium containing inactivated fetal bovine serum.
시험예Test example 1: 티로시나아제 1: tyrosinase 억제능Restraint
티로시나아제 (Tyrosinase) 억제능을 확인하기 위해, pH 6.8의 67mM 인산염 버퍼 (sodium phosphate buffer)에 10 mM L-DOPA (L -3,4-dihydroxyphenylalanine)을 녹인 기질액과 각 샘플을 넣은 혼합액에, 110 Unit/ml 티로시나아제(mushroom tyrosinase)를 첨가하고, 25℃에서 2분간 반응을 진행시켰다. 반응액 중에 생성된 DOPA chrome의 양을 마이크로플레이트 리더를 이용하여 475 ㎚에서 흡광도를 측정하여 평가하였으며, 그 결과를 표 3에 나타냈다.In order to confirm the tyrosinase inhibitory ability, in a substrate solution in which 10 mM L-DOPA (L-3,4-dihydroxyphenylalanine) was dissolved in a 67 mM sodium phosphate buffer at pH 6.8 and a mixed solution containing each sample, 110 Unit / ml tyrosinase was added, and the reaction was allowed to proceed for 2 minutes at 25 ° C. The amount of DOPA chrome produced in the reaction solution was evaluated by measuring absorbance at 475 nm using a microplate reader, and the results are shown in Table 3.
위의 표에서 결과값은 Mean ± SD로 나타냈고, **은 대조군(무처리)을 나타낸다(p<0.01)In the above table, the result value is expressed as Mean ± SD, ** indicates the control (no treatment) (p <0.01).
상기 표 3에서 알 수 있는 바와 같이, 모든 농도에서 실시예 1이 가장 우수 티로시나아제 저해 활성을 나타냄을 확인하였다.As can be seen from Table 3, it was confirmed that Example 1 exhibited the best tyrosinase inhibitory activity at all concentrations.
시험예Test example 2: 2: 콜라게나아제Collagenase 억제능Restraint
콜라게나아제(Collagenase) 억제능 확인을 위해, 0.1 M Tris-HCI 버퍼 (pH 7.5)에 4 mM CaCl2를 첨가하고, 4-페닐아조벤질 옥시카보닐-프로린-레우신-글라이신-프로린-아르지닌 (4-phenylazobenzyloxycarbonylPro-Leu-Gly-ProArg, 0.3㎎/㎖)를 녹인 기질액과 실시예 또는 비교예 각각을 넣은 혼합액에 콜라게나아제 (collagenase, 0.2 mg/ml)를 첨가하여 실온에서 20분간 반응시켰다. 6% 시트르산 (citric acid)를 넣어 반응을 정지시킨 후, 에틸아세테이트 (ethyl acetate)를 첨가하여 상등액을 취하여 320 nm에서 흡광도를 측정하는 방법으로 콜라게나아제 저해능을 확인했으며, 그 결과를 하기의 표 4에 나타냈다.To confirm the inhibitory effect of collagenase, 4 mM CaCl 2 was added to 0.1 M Tris-HCI buffer (pH 7.5), and 4-phenylazobenzyl oxycarbonyl-proline-leucine-glycine-proline-arginine (4-phenylazobenzyloxycarbonylPro-Leu-Gly-ProArg, 0.3mg / ml) was added to collagenase (collagenase, 0.2 mg / ml) to the mixed solution containing the substrate solution and each of the examples or comparative examples, and reacted at room temperature for 20 minutes. Ordered. After stopping the reaction by adding 6% citric acid, ethyl acetate was added and supernatant was taken to measure the absorbance at 320 nm. It is shown in 4.
위의 표에서 결과는 Mean ± SD로 나타냈고, *는 대조군과의 유의차가 p<0.05인 것을, **는 p<0.01인 것을 나타냈다.In the above table, the results are expressed as Mean ± SD, * indicates that the significant difference from the control group is p <0.05, ** indicates that p <0.01.
상기 표 4에서 알 수 있는 바와 같이, 실시예 1은 비교예 1 및 2에 비해서 시험된 모든 농도에서 콜라게나아제 활성을 현저하게 저해시킬 수 있음을 확인하였다.As can be seen from Table 4, it was confirmed that Example 1 can significantly inhibit collagenase activity at all concentrations tested compared to Comparative Examples 1 and 2.
시험예Test example 3: 엘라스타아제 3: Elastase 억제능Restraint
엘라스타아제 (Elastase) 억제능 확인을 위해, 0.2 M Tris-HCl 버퍼(pH 8.0) 200 ㎕에 실시예 및 비교예 각각을 20 ㎕를 최종 농도가 0.01 또는 0.1%가 되도록 넣은 후 기질 10 mM N-숙시닐-(알라닌)3-ρ-니트로아닐라이드 (Nsuccinyl-(Ala)3-ρ-nitroanilide) 20 ㎕를 넣고 실온에서 10분간 반응시켰다. 반응물에는 1 ㎎/㎖ 엘라스타아제를 20 ㎕씩 넣고 다시 실온에서 20분간 반응시킨 후, 405 ㎚에서 흡광도를 측정하여 엘라스타아제 억제능을 평가하여 그 결과를 표 5에 나타냈다.To confirm the elastase inhibitory capacity, 20 μl of each of the Examples and Comparative Examples was added to 200 μl of 0.2 M Tris-HCl buffer (pH 8.0) to a final concentration of 0.01 or 0.1%, and then the substrate 10 mM N- 20 µl of succinyl- (alanine) 3-ρ-nitroanilide was added and reacted at room temperature for 10 minutes. After adding 20 µl of 1 mg / ml elastase to the reactant for 20 minutes at room temperature, the absorbance was measured at 405 nm to evaluate the elastase inhibitory ability, and the results are shown in Table 5.
위의 표에서 결과는 Mean ± SD로 나타냈고, *는 대조군과의 유의차가 p<0.05인 것을, **는 p<0.01인 것을 나타냈다.In the above table, the results are expressed as Mean ± SD, * indicates that the significant difference from the control group is p <0.05, ** indicates that p <0.01.
상기 표 5에서 알 수 있는 바와 같이, 사용된 농도에서 실시예 1이 비교예 1 및 2에 비해 엘라스타아제 저해율이 현저하게 높은 것을 알 수 있다.As can be seen from Table 5, it can be seen that Example 1 in the used concentration has a significantly higher elastase inhibition rate than Comparative Examples 1 and 2.
시험예Test example 4: 항염증 반응에 대한 관련성 확인 4: Relevance to anti-inflammatory reactions
대식세포를 24 웰 플레이트에 2 x 106cells/㎖의 농도로 분주한 후 CO2 인큐베이터에서 18 시간 배양한 후 LPS (최종농도, 1 ㎍/㎖)와 실시예 및 비교예를 각각을 넣은 혼합액의 최종 농도가 각각 3 %가 되도록 같이 처리하였다. LPS와 시험물질을 처리한 후 24 시간 배양한 후 media를 수거하여 iNOS 측정에 사용하였으며, 모든 시험군은 3회 반복으로 실시하여 그 결과를 표 6에 나타냈다.After macrophages were dispensed at a concentration of 2 x 10 6 cells / ml in a 24-well plate, incubated for 18 hours in a CO 2 incubator, and mixed solution containing LPS (final concentration, 1 µg / ml) and Examples and Comparative Examples, respectively. The final concentrations of each were treated together to be 3%. After incubating for 24 hours after treating the LPS and the test substance, media was collected and used for iNOS measurement, and all the test groups were repeated three times and the results are shown in Table 6.
위의 표에서 결과는 Mean ± SD로 나타냈고, *는 대조군과의 유의차가 p<0.05인 것을, **는 p<0.01인 것을 나타냈다.In the above table, the results are expressed as Mean ± SD, * indicates that the significant difference from the control group is p <0.05, ** indicates that p <0.01.
상기 표 6에서 알 수 있는 바와 같이, 실시예 및 비교예 모두 대조군에 비해 iNOS를 감소시키는 것으로 관찰되었으나, 실시예 1이 가장 iNOS를 감소 효과가 뛰어난 것으로 관찰되었다. 더욱이, 실시예 1의 iNOS 감소 효과는 종래의 광합성 배양법과 유사한 비교예 2에 비해 현저히 우수한 것으로 확인되었다.As can be seen from Table 6, both the Examples and Comparative Examples were observed to reduce iNOS compared to the control group, but Example 1 was observed to have the most excellent effect of reducing iNOS. Moreover, the iNOS reduction effect of Example 1 was found to be significantly superior to Comparative Example 2, which is similar to the conventional photosynthetic culture method.
Claims (13)
상기 배양물로부터 배양액을 제거하는 단계; 및
상기 배양액을 제거한 배양물을 이산화탄소 초임계 추출하는 단계를 포함하는, 옥세노클로렐라 프로토테코이드 균주의 추출 방법.Culturing the auxenochlorella protothecoides strain at a photon density of 0.1 to 60 μmol photons / m 2 s;
Removing the culture solution from the culture; And
Comprising the step of supercritical carbon dioxide extraction of the culture from which the culture medium is removed, extracting method of oxenochlorella protothecoid strain.
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