KR20200054178A - 유전자 조작된 세포 조성물 및 관련 조성물의 제조 방법 - Google Patents
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Abstract
본 명세서에는 조작된 세포, 예컨대 재조합 수용체를 발현하는 세포를 생성하는 방법 및 조성물에 관한 것이며, 나이브-유사 CD4+ T 세포 대 나이브-유사 CD8+ T 세포의 정의된 비율을 가지는 투입 조성물의 자극 및/또는 조작을 수반하는 방법이 제공된다. 특히, 상기 방법은 유전자 조작된 수용체, 예컨대 유전자 조작된 항원 수용체 예컨대 조작된 (재조합) TCR 및 키메라 항원 수용체 (CAR), 또는 다른 재조합 키메라 수용체를 가지는 T 세포를 조작하기 위해 사용될 수 있다. 상기 방법의 특징으로는, 다른 방법과 비교하여, 보다 일관되고 및/또는 예측 가능한 T 세포 생성물 및/또는 낮은 독성이 낮은 생성물을 생성하는 것을 포함한다.
Description
관련 출원의 상호 참조
본 출원은 2017년 8월 9일자, 발명의 명칭이 “METHODS FOR PRODUCING GENETICALLY ENGINEERED CELL COMPOSITIONS AND RELATED COMPOSITIONS”인 미국 가특허 출원 제62/543,363호, 및 2017년 12월 8월자, 발명의 명칭이 “METHODS FOR PRODUCING GENETICALLY ENGINEERED CELL COMPOSITIONS AND RELATED COMPOSITIONS”인 미국 가특허 출원 제62/596,770호의 우선권을 주장하며, 상기 특허는 그 전체가 본 명세서에 참조 문헌으로 포함된다.
서열 목록의 참조에 의한 포함
본 출원은 전자 형식의 서열 목록과 함께 출원된다. 서열 목록은 2018년 8월 9일에 생성된, 35,001 Kb 크기의 파일명 735042013140SEQLIST.txt으로 제공된다. 전자 형식의 서열 목록에 있는 정보는 본 출원에 그 전체가 참조로 포함된다.
기술분야
본 발명은 조작된 세포, 예컨대 재조합 수용체를 발현하는 세포를 생성하는 방법 및 조성물에 관한 것이며, 나이브-유사 CD4+ T 세포 대 나이브-유사 CD8+ T 세포의 정의된 비율을 가지는 투입 조성물의 자극 및/또는 조작을 수반하는 방법을 포함한다. 특히, 상기 방법은 유전자 조작된 수용체, 예컨대 유전자 조작된 항원 수용체 예컨대 조작된 (재조합) TCR 및 키메라 항원 수용체 (CAR), 또는 다른 재조합 키메라 수용체를 가지는 T 세포를 조작하기 위해 사용될 수 있다. 상기 방법의 특징으로는, 다른 방법과 비교하여, 보다 일관되고 및/또는 예측 가능한 T 세포 생성물 및/또는 낮은 독성이 낮은 생성물을 생성하는 것을 포함한다.
치료적 용도를 위한 세포를 제조하고 세포를 투여하기 위한 다양한 방법이 이용 가능하다. 예를 들어, 상기 방법은 T 세포를 포함한 세포의 제조, 조작 및 세포 요법에 이용 가능하며, 상기 방법은 특정 서브-집단의 고갈 또는 농축을 포함하는 방법을 포함한다. 개선된 방법, 예를 들어, 특정 입양 세포 요법 투여와 관련된 독성을 감소하고, 제조 공정을 개선하고, 개선된 투여를 가능하게 하고, 및/또는 비용 또는 다른 자원을 감소하는 방법이 요구된다. 이러한 요구를 충족하는 방법, 세포, 조성물, 키트, 및 시스템이 제공된다.
본 명세서에는 세포 조성물을 생성하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 나이브-유사 CD4+ T 세포를 포함하는 제1 세포 조성물과 나이브-유사 CD8+ T 세포를 포함하는 제2 세포 조성물을 조합하여 투입 세포 조성물을 제조하는 단계를 포함하고, 이러한 나이브-유사 CD4+ T 세포 대 나이브-유사 CD8+ T 세포의 비율은 (약) 0.8:1 내지 2.2:1이다. 일부 구현예에서, 제1 세포 조성물은 대상체로부터 수득한 생물학적 샘플로부터 CD4+ T 세포를 단리함으로써 제조되고 및/또는 제2 세포 조성물은 대상체로부터 수득한 생물학적 샘플로부터 CD8+ T 세포를 단리함으로써 제조된다.
일부 구현예에서, 조합 이전에, 상기 방법은 제1 세포 조성물 내 나이브-유사 CD4+ T 세포의 개수, 부피 당 개수, 중량 당 개수 및/또는 백분율, 및/또는 제2 조성물 내 나이브-유사 CD8+ T 세포의 개수, 부피 당 개수, 중량 당 개수 및/또는 백분율을 결정하는 단계를 포함한다. 일부 경우에, 조합 이전에, 상기 방법은 대상체로부터의 생물학적 샘플 내 나이브-유사 CD4+ T 세포의 개수, 부피 당 개수, 중량 당 개수 및/또는 백분율, 및/또는 나이브-유사 CD8+ T 세포의 개수, 부피 당 개수, 중량 당 개수 및/또는 백분율을 결정하는 단계를 포함한다. 임의의 이러한 일부 구현예에서, 투입 조성물 내 나이브-유사 CD4+ T 세포 대 나이브-유사 CD8+ T 세포의 비율은 대상체로부터의 생물학적 샘플 내 나이브-유사 CD4+ T 세포 대 나이브-유사 CD8+ T 세포의 비율과 비교하여 조정 또는 변경된다.
본 명세서에는 세포 조성물을 생성하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 대상체로부터 수득한 생물학적 샘플 또는 그로부터 유래된 하나 이상의 샘플 내 나이브-유사 CD4+ T 세포 및 나이브-유사 CD8+ T 세포의 개수, 부피 당 개수, 중량 당 개수 및/또는 백분율을 결정하는 단계; 및 CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포를 포함하는 투입 조성물을 생성하는 단계를 포함하며, 여기서 나이브-유사 CD4+ T 세포 대 나이브-유사 CD8+ T 세포의 비율은 (약) 2.2:1 내지 0.8:1이고, 상기 투입 조성물 내 비율은 대상체로부터의 생물학적 샘플 내 나이브-유사 CD4+ T 세포 대 나이브-유사 CD8+ T 세포의 비율과 비교하여 조정 또는 변경된다.
일부 구현예에서, 상기 방법은 투입 조성물을, 재조합 수용체를 인코딩하는 핵산을 투입 조성물 내 세포 내로 도입하는 조건하에서, 재조합 수용체를 인코딩하는 핵산 분자를 포함하는 시제와 접촉시키는 단계를 추가로 포함한다.
본 명세서에는 세포 조성물을 생성하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 대상체로부터 유래한 생물학적 샘플로부터의 나이브-유사 CD4+ T 세포 및 나이브-유사 CD8+ T 세포를 포함하는 투입 조성물을 재조합 수용체를 인코딩하는 핵산을 이러한 조성물 내 세포 내로 도입하는 조건하에서 재조합 수용체를 인코딩하는 핵산 분자를 포함하는 시제와 접촉시키는 단계를 포함하며, 여기서 투입 조성물 내 존재하는 나이브-유사 CD4+ T 세포 대 나이브-유사 CD8+ T 세포의 비율은 (약) 0.8:1 내지 2.2:1이다.
일부 구현예에서, 상기 방법은 상기 접촉 단계 이전, 동안 및/또는 이후에 세포를 자극하는 단계를 추가로 포함하며, 이러한 자극 단계는 하나 이상의 자극 시제의 존재하에 세포의 인큐베이션을 포함하고, 자극은 세포의 활성화 및/또는 증식을 초래한다.
본 명세서에는 세포 조성물을 생성하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 나이브-유사 CD4+ T 세포를 포함하는 제1 세포 조성물과 나이브-유사 CD8+ T 세포를 포함하는 제2 세포 조성물을 조합하여 투입 세포 조성물을 제조하는 단계로서, 여기서 나이브-유사 CD4+ T 세포 대 나이브-유사 CD8+ T 세포의 비율은 (약) 0.8:1 내지 2.2:1인 단계; 투입 조성물을, 재조합 수용체를 인코딩하는 핵산을 이러한 조성물 내 세포 내로 도입하는 조건하에서, 재조합 수용체를 인코딩하는 핵산 분자를 포함하는 시제와 접촉시키는 단계; 상기 접촉 단계 이전, 동안 및/또는 이후에 세포를 자극하는 단계를 포함하며, 여기서 자극은 하나 이상의 자극 시제의 존재하에 세포의 인큐베이션을 포함하고 이러한 자극은 세포의 활성화 및/또는 증식을 초래한다.
임의의 이러한 일부 구현예에서, 나이브-유사 CD4+ 및/또는 나이브-유사 CD8+ T 세포는 CD45RA, CD27, CD28, CD62L 및 CCR7으로 구성된 군으로부터 선택된 T 세포 활성화 마커에 대해 표면 양성이고; 및/또는 CD25, CD45RO, CD56, KLRG1으로 구성된 군으로부터 선택된 마커에 대해 표면 음성이고; 및/또는 CD95의 낮은 발현을 가지고; 및/또는 IL-2, IFN-γ, IL-4, IL-10으로 구성된 군으로부터 선택된 사이토카인의 세포 내 발현에 대해 음성이다. 일부 구현예에서, 나이브-유사 CD4+ 및/또는 나이브-유사 CD8+ 세포는 CD45RA, CD27, CD28, 및 CCR7으로 구성된 군으로부터 선택된 T 세포 활성화 마커에 대해 표면 양성이고; 및/또는 CD45RO, CD56, KLRG1으로 구성된 군으로부터 선택된 마커에 대해 표면 음성이고; 및/또는 CD95의 낮은 발현을 가진다. 일부 양태에서, 나이브-유사 CD4+ 및/또는 나이브-유사 CD8+ 세포는 CD45RA 및 CCR7에 대하여 표면 양성이다. 일부 구현예에서, 나이브-유사 CD4+ 및 나이브-유사 CD8+ 세포는 CD45RA, CD27 및 CCR7에 대하여 표면 양성이고, CD45RO에 대하여 표면 음성이다.
임의의 이러한 일부 구현예에서, 나이브-유사 CD4+ T 세포의 개수, 부피 당 개수, 중량 당 개수 및/또는 백분율, 및/또는 나이브-유사 CD8+ T 세포의 개수, 부피 당 개수, 중량 당 개수 및/또는 백분율은 유세포 분석에 의해 결정된다. 일부 양태에서, 나이브-유사 CD4+ T 세포 대 나이브-유사 CD8+ T 세포의 비율은, 대상체로부터의 생물학적 샘플 내 나이브-유사 CD4+ T 세포 대 나이브-유사 CD8+ T 세포의 비율과 비교하여 조절되었다.
일부 구현예에서, 생물학적 샘플은 혈액, 혈장 또는 혈청 샘플이거나, 이로부터 수득된다. 일부 양태에서, 생물학적 샘플은 전혈 샘플, 버피 코트 샘플, 말초 혈액 단핵구 세포 (PBMC) 샘플, 분별되지 않은 T 세포 샘플, 림프구 샘플, 백혈구 샘플, 성분채집 생성물, 또는 백혈구성분채집 생성물이거나, 또는 이를 포함한다. 일부 경우에, 생물학적 샘플은 성분채집술 또는 백혈구성분채집술 샘플이거나, 또는 이로부터 수득된다. 일부 구현예에서, 대상체는 인간 대상체이다.
임의의 이러한 일부 구현예에서, 투입 조성물은 나이브-유사 CD4+ 세포 대 나이브-유사 CD8+ 세포의 비율이 (약) 0.8:1 내지 2.0:1, 0.8:1 내지 1.6:1, 0.8:1 내지 1.4:1, 0.8:1 내지 1.2:1 또는 1.0:1 내지 1.2:1이다. 일부 구현예에서, 투입 조성물은은 나이브-유사 CD4+ 세포 대 나이브-유사 CD8+ 세포의 비율이 (약) 1.5:1, 1.4:1, 1.3:1, 1.2:1, 1.1:1, 또는 1.0:1이다. 일부 구현예에서, 투입 조성물은 나이브-유사 CD4+ 세포 대 나이브-유사 CD8+ 세포의 비율이 (약) 1.1:1이다.
이러한 임의의 일부 구현예에서, 투입 조성물은 (약) 1 x 107 내지 5 x 109 개의 전체 세포 또는 전체 T 세포, (약) 5 x 107 내지 1 x 109 개의 전체 세포 또는 전체 T 세포, (약) 1 x 108 내지 5 x 108 개의 전체 세포 또는 전체 T 세포, 또는 (약) 2 x 108 내지 5 x 108 개의 전체 세포 또는 전체 T 세포, 또는 전술한 임의의 범위의 생존 집단을 포함한다. 일부 경우에, 투입 조성물은 적어도 (약) 1 x 108, 2 x 108, 3 x 108, 4 x 108, 또는 5 x 108 개의 전체 세포 또는 전체 T 세포 또는 전술한 임의의 범위의 생존 집단을 포함한다.
이러한 임의의 일부 구현예에서, 하나 이상의 자극 시제는 T 세포, CD4+ T 세포 및/또는 CD8+ T 세포를 활성화시킬 수 있고; TCR 복합체를 통해 신호를 유도할 수 있고; 및/또는 세포, CD4+ T 세포 및/또는 CD8+ T 세포의 증식을 유도할 수 있다. 일부 양태에서, 하나 이상의 자극 시제로는 TCR 복합체의 구성원에 결합하는, 선택적으로 CD3에 특이적으로 결합하는 1차 시제를 포함한다. 일부 경우에, 하나 이상의 자극 시제는 T 세포 공동자극 분자에 특이적으로 결합하는 2차 시제를 추가로 포함한다. 일부 실시예에서, 공동자극 분자는 CD28, CD137 (4-1-BB), OX40, 또는 ICOS로 구성된 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 1차 및 2차 시제로는 항체를 포함하며, 선택적으로 하나 이상의 자극제는 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체와의 인큐베이션을 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 자극 시제는 고체 지지체, 선택적으로 비드의 표면상에 존재한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 자극 시제는 비드의 표면상에 존재하며 상기 비드는 상자성 비드이다. 일부 양태에서, 하나 이상의 자극 시제는 CD3-결합 분자; CD28-결합 분자; 재조합 IL-2; 재조합 IL-15; 및 재조합 IL-7, 항원 수용체에 의해 특이적으로 인식되는 항원을 포함하는 백신, 및 항원 수용체 또는 이의 조합에 특이적으로 결합하는 항-이디오타입 항체로 구성된 군으로부터 선택된다.
임의의 이러한 일부 구현예에서, 인큐베이션은 2 내지 15 일, 2 내지 12 일, 2 내지 12 일, 2 내지 8 일, 2 내지 6 일, 2 내지 4 일, 4 내지 12 일, 4 내지 10 일, 4 내지 8 일, 4 내지 6 일, 6 내지 12 일, 6 내지 10 일, 6 내지 8 일, 8 내지 12 일, 8 내지 10 일, 또는 10 내지 12 일 동안 수행된다. 일부 경우에, 인큐베이션은 적어도 (약) 4 일, 6 일, 8 일, 10 일 또는 12 일 동안 수행된다.
임의의 이러한 일부 구현예에서, 핵산 분자를 포함하는 시제는 바이러스 벡터이거나, 또는 트랜스포존이다. 일부 경우에, 핵산 분자를 포함하는 시제는 바이러스 벡터이고, 바이러스 벡터는 레트로바이러스 벡터이다. 일부 예시에서, 바이러스 벡터는 렌티바이러스 벡터 또는 감마레트로바이러스 벡터이다.
일부 구현예에서, 재조합 수용체는 질병, 장애 또는 병태의 세포 또는 조직과 관련된, 이에 특이적인, 및/또는 이에 발현되는 표적 항원에 결합할 수 있다. 일부 경우에, 질병, 장애 또는 병태는 감염성 질병 또는 장애, 자가면역 질병, 염증성 질병, 또는 종양 또는 암이다. 일부 예시에서, 표적 항원은 종양 항원이다. 일부 구현예에서,표적 항원은 다음으로부터 선택된다: ROR1, B 세포 성숙화 항원 (BCMA), 탄산 무수화효소 9 (CAIX), tEGFR, Her2/neu (수용체 타이로신 키나제 erbB2), CD19, CD20, CD22, 메소텔린, CEA, 및 간염 B 표면 항원, 항-엽산 수용체, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44, EGFR, 상피 당단백 2 (EPG-2), 상피 당단백 40 (EPG-40), EPHa2, erb-B2, erb-B3, erb-B4, erbB 이합체, EGFR vIII, 엽산 결합 단백질 (FBP), FCRL5, FCRH5, 태아 아세틸콜린 수용체, GD2, GD3, G 단백질 연결 수용체 5D (GPCR5D), HMW-MAA, IL-22R-알파, IL-13R-알파2, 키나제 삽입 도메인 수용체 (kdr), 카파 경쇄, Lewis Y, L1-세포 접합 분자, (L1-CAM), 흑색종-관련 항원 (MAGE)-A1, MAGE-A3, MAGE-A6, 우선적으로 발현되는 흑색종 항원 (PRAME), 서바이빈, TAG72, B7-H6, IL-13 수용체 알파 2 (IL-13Ra2), CA9, GD3, HMW-MAA, CD171, G250/CAIX, PSCA, 엽산 수용체-a, CD44v6, CD44v7/8, avb6 인테그린, 8H9, NCAM, VEGF 수용체, 5T4, 태아 AchR, NKG2D 리간드, CD44v6, 이중 항원, 암-고환 항원, 메소텔린, 쥐과 CMV, 뮤신 1 (MUC1), MUC16, PSCA, NKG2D, NY-ESO-1, MART-1, gp100, 종양태아성 항원, ROR1, TAG72, VEGF-R2, 암배아 항원 (CEA), Her2/neu, 에스트로겐 수용체, 프로게스테론 수용체, 에프린B2, CD123, c-Met, GD-2, O-아세틸화 GD2 (OGD2), CE7, Wilms 종양 1 (WT-1), 사이클린, 사이클린 A2, CCL-1, CD138, 및 병원체-특이적 항원 및 보편적인 표지와 관련된 항원.
일부 실시예에서, 표적 항원은 다음으로부터 선택된다: 수용체 타이로신 키네이스 유사 고아 수용체 1 (ROR1), B 세포 성숙화 항원 (BCMA), 탄산 무수화효소 9 (CA9, 또한 CAIX 또는 G250로도 알려짐), Her2/neu (수용체 타이로신 키네이스 erbB2), CD19, CD20, CD22, 메소텔린 (MSLN), 암배아 항원 (CEA), 및 B형 간염 표면 항원, 항-엽산 수용체, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44, 콘드로이틴 설페이트 프로테오글리칸 4 (CSPG4), EGFR, 상피 당단백 2 (EPG-2), 상피 당단백 40 (EPG-40), 에프린 수용체 A2 (EPHa2), Her3 (erb-B3), Her4 (erb-B4), erbB 이합체, III형 표피 성장 인자 수용체 돌연변이 (EGFR vIII), 엽산 결합 단백질 (FBP), Fc 수용체 유사 5 (FCRL5, 또한 Fc 수용체 동족체 5 또는 FCRH5로도 알려짐), 태아 아세틸콜린 수용체(태아 AchR), 강글리오사이드 GD2, 강글리오사이드 GD3, 인간 백혈구 항원 A1 (HLA-A1), 인간 백혈구 항원 A2 (HLA-A2), IL-22 수용체 알파 (IL-22Rα), 키네이스 삽입 도메인 수용체 (kdr), 카파 경쇄, 류신 풍부 반복 함유 8 패밀리 구성원 A (LRRC8A), Lewis Y, L1-세포 점착 분자 (L1-CAM), 흑색종-연관 항원 (MAGE)-A1, MAGE-A3, MAGE-A6, MAGE-A10, 우선적으로 발현되는 흑색종 항원 (PRAME), 서바이빈, 종양-연관 당단백 72 (TAG72), B7-H3, B7-H6, IL-13 수용체 알파 2 (IL-13Rα2), 인간 고분자량-흑색종-연관 항원 (HMW-MAA), CD171, 엽산 수용체-알파, CD44v7/8, αvβ6 인테그린 (avb6 인테그린), 8H9, 신경 세포 점착 분자 (NCAM), 혈관 내피 성장 인자 수용체 (VEGF 수용체 또는 VEGFR), 영양막 당단백 (TPBG 또한 5T4로도 알려짐), NKG2D 리간드, CD44v6, 이중 항원, 암-고환 항원, 쥐과 거대세포바이러스 (CMV), 뮤신 1 (MUC1), MUC16, 전립선 줄기 세포 항원 (PSCA), 전립선 특이적 멤브레인 항원 (PSMA), 자연 살해 그룹 2 구성원 D (NKG2D) 리간드, 암/고환 항원 1B (CTAG, 또한 NY-ESO-1 및 LAGE-2으로도 알려짐), 멜란 A (MART-1), 당단백 100 (gp100), 글리피칸-3 (GPC3), G 단백질 연결 수용체 5D (GPRC5D), 종양태아성 항원, TAG72, 타이로시나제 관련 단백질 1 (TRP1, 또한 TYRP1 또는 gp75로도 알려짐), 타이로시나제 관련 단백질 2 (TRP2, 또한 도파크롬 토토머라제, 도파크롬 델타-아이소머라제 또는 DCT로도 알려짐), 혈관 내피 성장 인자 수용체 2 (VEGF-R2), 암배아 항원 (CEA), 에스트로겐 수용체, 프로게스테론 수용체, 전립선 특이적 항원, 에프린B2, CD123, CD133, c-Met, O-아세틸화된 GD2 (OGD2), L1-CAM의 CE7 에피토프, Wilms 종양 1 (WT-1), 사이클린, 사이클린 A2, C-C 모티프 케모카인 리간드 1 (CCL-1), CD138, 병원체-특이적 항원 또는 병원체-발현 항원, 및 보편적인 표지와 관련된 항원, 및/또는 비오틴화된 분자, 및/또는 HIV, HCV, HBV 또는 다른 병원체에 의해 발현되는 분자.
일부 구현예에서, 수용체에 의해 표적화된 항원은 B 세포 악성종양과 관련된 항원을 포함하는데, 예컨대 다수의 공지된 B 세포 마커 중 어느 하나이다. 일부 구현예에서, 항원은 CD20, CD19, CD22, ROR1, CD45, CD21, CD5, CD33, Ig카파, Ig람다, CD79a, CD79b 또는 CD30이거나, 또는 이를 포함한다.
일부 구현예에서, 항원은 병원체-특이적 또는 병원체-발현된 항원이거나, 또는 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 항원은 바이러스 항원 (예컨대, HIV, HCV, HBV 등으로부터의 바이러스 항원), 박테리아 항원 및/또는 기생충 항원이다.
일부 구현예에서, 재조합 수용체는 기능적 비-TCR 항원 수용체 또는 TCR 또는 이의 항원-결합 단편이거나, 또는 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 재조합 수용체는 키메라 항원 수용체 (CAR)이다. 일부 경우에, 키메라 항원 수용체는 항원-결합 도메인을 포함하는 세포 외 도메인을 포함한다. 일부 예시에서, 항원-결합 도메인은 항체 또는 이의 항체 단편이거나, 또는 이를 포함하고, 상기 단편은 선택적으로 단일 사슬 단편이다. 일부 구현예에서, 단편은 유연한 링커에 의해 연결된 항체 가변 영역을 포함한다. 일부 양태에서, 단편은 scFv를 포함한다.
일부 구현예에서, 키메라 항원 수용체는 스페이서 및/또는 힌지 영역을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 키메라 항원 수용체는 공동자극 신호전달 영역을 포함한다. 일부 경우에, 세포 내 신호전달 영역은 세포 내 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포 내 신호전달 영역은 1차 신호전달 도메인, T 세포에서 1차 활성화 신호를 유도할 수 있는 신호전달 도메인, T 세포 수용체 (TCR) 요소의 신호전달 도메인 및/또는 면역수용체 타이로신-계 활성화 모티프 (ITAM)를 포함하는 신호전달 도메인이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포 내 신호전달 도메인은 CD3 사슬, 선택적으로 CD3-제타 (CD3ζ) 사슬의 세포 내 신호전달 도메인, 또는 이의 신호전달 부분이거나, 또는 이를 포함한다.
일부 구현예에서, CAR은 항원에 특이적인 scFv, 막횡단 도메인, 공동자극 분자로부터 유도된 세포질 신호전달 도메인 (선택적으로 4-1BB이거나 이를 포함), 및 1차 신호전달 ITAM-함유 분자로부터 유도된 세포질 신호전달 도메인 (선택적으로 CD3제타 신호전달 도메인이거나 이를 포함)을 포함하며, 선택적으로 막횡단 도메인과scFv 사이에 스페이서를 추가로 포함하거나; CAR은, 순서대로, 항원에 특이적인 scFv, 막횡단 도메인, 공동자극 분자로부터 유도된 세포질 신호전달 도메인 (선택적으로 4-1BB 신호전달 도메인이거나 이를 포함), 및 1차 신호전달 ITAM-함유 분자로부터 유도된 세포질 신호전달 도메인 (선택적으로 CD3제타 신호전달 도메인)을 포함하거나; 또는 CAR은, 순서대로, 항원에 특이적인 scFv, 스페이서, 막횡단 도메인, 공동자극 분자로부터 유도된 세포질 신호전달 도메인 (선택적으로 4-1BB), 및 1차 신호전달 ITAM-함유 분자로부터 유도된 세포질 신호전달 도메인 (선택적으로 CD3제타 신호전달 도메인이거나 이를 포함)을 포함한다.
일부 구현예에서, 키메라 항원 수용체는 세포 외 도메인과 세포 내 신호전달 영역 사이에 배치된 막횡단 도메인을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 세포 내 신호전달 영역은 공동자극 신호전달 영역을 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 공동자극 신호전달 영역은 T 세포 공동자극 분자의 세포 내 신호전달 도메인 또는 이의 신호전달 부분을 포함한다. 일부 예시에서, 공동자극 신호전달 영역은 CD28, 4-1BB 또는 ICOS의 세포 내 신호전달 도메인 또는 이의 신호전달 부분을 포함한다. 일부 구현예에서, 공동자극 신호전달 영역은 막횡단 도메인과 세포 내 신호전달 영역 사이에 있다.
임의의 이러한 일부 구현예에서, 대상체는 질병 또는 병태를 가지며, 선택적으로 재조합 수용체는 질병 또는 병태의 세포와 연관된, 또는 발현된, 또는 세포 상에 존재하는 항원을 특이적으로 인식하거나, 또는 특이적으로 이에 결합한다.
일부 구현예에서, 상기 방법은 재조합 수용체-발현 CD4+ T 세포 대 재조합 수용체-발현 CD8+ T 세포의 비율, 선택적으로 이의 생존 세포의 비율이, 상기 방법에 의해 제조된 복수의 T 세포 조성물 내 상기 비율의 평균으로부터 20% 미만 또는 10% 미만 또는 5% 미만으로 변하고 및/또는 이러한 평균으로부터 하나의 표준 편차 이하만큼 변하는 산츨 조성물을 제조한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 재조합 수용체-발현 CD4+ T 세포 대 재조합 수용체-발현 CD8+ T 세포의 비율, 선택적으로 이의 생존 세포의 비율이, (약) 0.5:1 내지 2:1 또는 0.8:1 내지 1.6:1 또는 1:1 내지 1.5:1인 산출 조성물을 제조한다. 일부 실시예에서, 산출 조성물 내 재조합 수용체-발현 CD4+ T 세포 대 재조합 수용체-발현 CD8+ T 세포의 비율, 선택적으로 이의 생존 세포의 비율은 (약) 1.2:1, 1.1:1, 1:1, 0.9:1, 또는 0.8:1이다. 일부 경우에, 산출 조성물 내 재조합 수용체-발현 CD4+ T 세포 대 재조합 수용체-발현 CD8+ T 세포의 비율, 선택적으로 이의 생존 세포의 비율은 (약) 1:1이다.
일부 구현예에서, 생존 세포는 세포사멸 마커 음성 (-)인 세포를 포함하며, 선택적으로 이러한 세포사멸 마커는 아넥신 V 또는 활성 카스파제 3이다.
이러한 일부 구현예에서, 상기 방법은 시험관 내 또는 생체 외에서 수행된다.
본 명세서에 제공된 임의의 방법에 의해 제조된 산출 조성물이 제공된다. 또한 기재된 산출 조성물을 포함하는 약제학적 조성물이 제공된다. 일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 약제학적 담체를 추가로 포함한다.
기재된 임의의 방법에 의해 생성된 산출 조성물 또는 기재된 임의의 약제학적 조성물을 포유동물 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 치료 방법이 본 명세서에 제공된다 일부 구현예에서, 세포는 세포가 투여되는 대상체로부터 유래된다.
제공된 방법의 특정 구현예에서, 나이브-유사 CD4+ 및/또는 나이브-유사 CD8+ 세포는 CD45RA 및 CCR7에 대하여 표면 양성이다. 제공된 방법의 일부 구현예에서, 나이브-유사 CD4+ 및/또는 나이브-유사 CD8+ 세포는 CD27 및 CCR7에 대하여 표면 양성이다. 제공된 방법의 구체적인 구현예에서, 나이브-유사 CD4+ 및 나이브-유사 CD8+ 세포는 CD45RA, CD27 및 CCR7에 대하여 표면 양성ㅇ고, CD45RO에 대하여 표면 음성이다.
제공된 방법의 특정 구현예에서, 나이브-유사 CD4+ 및/또는 나이브-유사 CD8+ 세포는 CCR7에 대하여 표면 양성이고, CD62L에 대하여 표면 음성이다.제시된 방법의 일부 구현예에서, 투입 조성물은 CD45RA 및 CCR7에 대하여 표면 양성인 나이브-유사 CD4+ 세포 대 나이브-유사 CD8+ 세포의 비율이 (약) 1.1:1이다. 제공된 방법의 구체적인 구현예에서, 투입 조성물은 CD45RA 및 CD27에 대하여 표면 양성인 나이브-유사 CD4+ 세포 대 나이브-유사 CD8+ 세포의 비율이 (약) 1.69:1이다. 일부 구현예에서, 투입 세포 조성물은 CD27 및 CCR7에 대하여 표면 양성인 나이브-유사 CD4+ 세포 대 나이브-유사 CD8+ 세포의 비율이 (약) 1.69:1이다.
특정 구현예에서, 본 명세서는 세포 조성물을 생성하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 다음의 단계를 포함한다:
CCR7+CD45RA+CD4+ T 세포를 포함하는 제1 세포 조성물과 CCR7+CD45RA+CD8+ T 세포를 포함하는 제2 세포 조성물을 조합하여, 투입 세포 조성물을 제조하는 단계로서, 여기서 CCR7+CD45RA+CD4+ T 세포 대 CCR7+CD45RA+CD8+ T 세포의 비율은 (약) 0.8:1 내지 2.2:1이다. 제공된 방법의 일부 구현예에서, 제1 세포 조성물은 대상체로부터 수득한 생물학적 샘플로부터 CD4+ T 세포를 단리함으로써 제조되고 및/또는 제2 세포 조성물은 대상체로부터 수득한 생물학적 샘플로부터 CD8+ T 세포를 단리함으로써 제조된다.
제공된 방법의 구체적인 구현예에서, 조합 이전에, 상기 방법은 제1 세포 조성물 내 CCR7+CD45RA+CD4+ T 세포의 개수, 부피 당 개수, 중량 당 개수 및/또는 백분율, 및/또는 제2 조성물 내 CCR7+CD45RA+CD8+ T 세포의 개수, 부피 당 개수, 중량 당 개수 및/또는 백분율을 결정하는 단계를 포함한다. 제공된 방법의 특정 구현예에서, 조합 이전에, 상기 방법은 대상체로부터의 생물학적 샘플 내 CCR7+CD45RA+CD4+ T 세포의 개수, 부피 당 개수, 중량 당 개수 및/또는 백분율, 및/또는 CCR7+CD45RA+CD8+ T 세포의 개수, 부피 당 개수, 중량 당 개수 및/또는 백분율을 결정하는 단계를 포함한다. 제공된 방법의 일부 구현예에서, 투입 조성물 내 CCR7+CD45RA+CD4+ T 세포 대 CCR7+CD45RA+CD8+ T 세포의 비율은 대상체로부터의 생물학적 샘플 내 CCR7+CD45RA+CD4+ T 세포 대 CCR7+CD45RA+CD8+ T 세포의 비율과 비교하여 조정 또는 변경된다.
구체적인 구현예에서, 본 명세서에는 세포 조성물을 생성하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 다음의 단계를 포함한다: 대상체로부터 수득한 생물학적 샘플 또는 그로부터 유래된 하나 이상의 샘플 내 CCR7+CD45RA+CD4+ T 세포 및 CCR7+CD45RA+CD8+ T 세포의 개수, 부피 당 개수, 중량 당 개수 및/또는 백분율을 결정하는 단계; 및 CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포를 포함하는 투입 조성물을 제조하는 단계, 여기서 CCR7+CD45RA+CD4+ T 세포 대 나이브-유사 CD8+ T 세포의 비율은 (약) 2.2:1 내지 0.8:1이며, 상기 투입 조성물 내 비율은 대상체로부터의 생물학적 샘플 내 CCR7+CD45RA+CD4+ T 세포 대 나이브-유사 CD8+ T 세포의 비율과 비교하여 조정 또는 변경된다.
제공된 방법의 특정 구현예에서, 상기 방법은 투입 조성물을, 재조합 수용체를 인코딩하는 핵산을 투입 조성물 내 세포 내로 도입하는 조건하에서, 재조합 수용체를 인코딩하는 핵산 분자를 포함하는 시제와 접촉시키는 단계를 추가로 포함한다.
본 명세서에는 세포 조성물을 생성하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 다음의 단계를 포함한다:
대상체로부터 유래한 생물학적 샘플로부터의 CCR7+CD45RA+CD4+ T 세포 및 CCR7+CD45RA+CD8+ T 세포를 포함하는 투입 조성물을, 재조합 수용체를 인코딩하는 핵산을 이러한 조성물 내 세포 내로 도입하는 조건하에서, 재조합 수용체를 인코딩하는 핵산 분자를 포함하는 시제와 접촉시키는 단계, 여기서 투입 조성물 내 존재하는 CCR7+CD45RA+CD4+ T 세포 대 CCR7+CD45RA+CD8+ T 세포의 비율은 (약) 0.8:1 내지 2.2:1이다. 제공된 방법의 일부 구현예에서, 상기 방법은 상기 접촉 단계 이전, 동안 및/또는 이후에 세포를 자극하는 단계를 추가로 포함하며, 이러한 자극 단계는 하나 이상의 자극 시제의 존재하에 세포의 인큐베이션을 포함하고, 자극은 세포의 활성화 및/또는 증식을 초래한다.
구체적인 구현예에서, 본 명세서에는 세포 조성물을 생성하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 다음의 단계를 포함한다: CCR7+CD45RA+CD4+ T 세포를 포함하는 제1 세포 조성물과 CCR7+CD45RA+CD8+ T 세포를 포함하는 제2 세포 조성물을 조합하여, 투입 세포 조성물을 제조하는 단계로서, 여기서 CCR7+CD45RA+CD4+ T 세포 대 CCR7+CD45RA+CD8+ T 세포의 비율은 (약) 0.8:1 내지 2.2:1인 단계; 투입 조성물을, 재조합 수용체를 인코딩하는 핵산을 이러한 조성물 내 세포 내로 도입하는 조건하에서, 재조합 수용체를 인코딩하는 핵산 분자를 포함하는 시제와 접촉시키는 단계; 상기 접촉 단계 이전, 동안 및/또는 이후에 세포를 자극하는 단계, 여기서 자극은 하나 이상의 자극 시제의 존재하에 세포의 인큐베이션을 포함하고, 자극은 세포의 활성화 및/또는 증식을 초래한다.
제공된 방법의 특정 구현예에서, CCR7+CD45RA+CD4+ T 세포의 개수, 부피 당 개수, 중량 당 개수 및/또는 백분율, 및/또는 CCR7+CD45RA+CD8+ T 세포의 개수, 부피 당 개수, 중량 당 개수 및/또는 백분율은 유세포 분석에 의해 결정된다. 제공된 방법의 일부 구현예에서, CCR7+CD45RA+CD4+ T 세포 대 CCR7+CD45RA+CD8+ T 세포의 비율은 대상체로부터의 생물학적 샘플 내 CCR7+CD45RA+CD4+ T 세포 대 CCR7+CD45RA+CD8+ T 세포의 비율과 비교하여 조정되었다. 제공된 방법의 구체적인 구현예에서, 투입 조성물은 CCR7+CD45RA+CD4+ 세포 대 CCR7+CD45RA+CD8+ 세포의 비율이 (약) 0.8:1 내지 2.0:1, 0.8:1 내지 1.6:1, 0.8:1 내지 1.4:1, 0.8:1 내지 1.2:1, 또는 1.0:1 내지 1.2:1이다. 제공된 방법의 특정 구현예에서, 투입 조성물은 CCR7+CD45RA+CD4+ 세포 대 CCR7+CD45RA+CD8+ 세포의 비율이 (약) 1.5:1, 1.4:1, 1.3:1, 1.2:1, 1.1:1, 또는 1.0:1이다.
제공된 방법의 일부 구현예에서, 투입 조성물은 CCR7+CD45RA+CD4+ 세포 대 CCR7+CD45RA+CD8+ 세포의 비율이 (약) 1.1:1이다. 구체적인 구현예에서, 본 명세서에는 세포 조성물을 생성하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 다음의 단계를 포함한다:
CD27+CCR7+CD4+ T 세포를 포함하는 제1 세포 조성물과 CD27+CCR7+CD8+ T 세포를 포함하는 제2 세포 조성물을 조합하여, 투입 세포 조성물을 제조하는 단계로서, 여기서 CD27+CCR7+CD4+ T 세포 대 CD27+CCR7+CD8+ T 세포의 비율은 (약) 1.2:1 내지 2.4:1인 단계.
제공된 방법의 특정 구현예에서, 제1 세포 조성물은 대상체로부터 수득한 생물학적 샘플로부터 CD4+ T 세포를 단리함으로써 제조되고 및/또는 제2 세포 조성물은 대상체로부터 수득한 생물학적 샘플로부터 CD8+ T 세포를 단리함으로써 제조된다. 제공된 방법의 구체적인 구현예에서, 조합 이전에, 상기 방법은 제1 세포 조성물 내 CD27+CCR7+CD4+ T 세포의 개수, 부피 당 개수, 중량 당 개수 및/또는 백분율, 및/또는 제2 조성물 내 CD27+CCR7+CD8+ T 세포의 개수, 부피 당 개수, 중량 당 개수 및/또는 백분율을 결정하는 단계를 포함한다. 제공된 방법의 구체적인 구현예에서, 조합 이전에, 상기 방법은 대상체로부터의 생물학적 샘플 내 CD27+CCR7+CD4+ T 세포의 개수, 부피 당 개수, 중량 당 개수 및/또는 백분율, 및/또는 CD27+CCR7+CD8+ T 세포의 개수, 부피 당 개수, 중량 당 개수 및/또는 백분율을 결정하는 단계를 포함한다.
제공된 방법의 특정 구현예에서, 투입 조성물 내 CD27+CCR7+CD4+ T 세포 대 CD27+CCR7+CD8+ T 세포의 비율은 대상체로부터의 생물학적 샘플 내 CD27+CCR7+CD4+ T 세포 대 CD27+CCR7+CD8+ T 세포의 비율과 비교하여 조정 또는 변경된다. 특정 구현예에서, 본 명세서에는 세포 조성물을 생성하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 다음의 단계를 포함한다: 대상체로부터 수득한 생물학적 샘플 또는 그로부터 유래된 하나 이상의 샘플 내 CD27+CCR7+CD4+ T 세포 및 CD27+CCR7+CD8+ T 세포의 개수, 부피 당 개수, 중량 당 개수 및/또는 백분율을 결정하는 단계; 및 CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포를 포함하는 투입 조성물을 제조하는 단계, 여기서 CD27+CCR7+CD4+ T 세포 대 나이브-유사 CD8+ T 세포의 비율은 (약) 2.2:1 내지 0.8:1이며, 상기 투입 조성물 내 비율은 대상체로부터의 생물학적 샘플 내 CD27+CCR7+CD4+ T 세포 대 나이브-유사 CD8+ T 세포의 비율과 비교하여 조정 또는 변경된다.
일부 구현예에서, 상기 방법은 투입 조성물을, 재조합 수용체를 인코딩하는 핵산을 투입 조성물 내 세포 내로 도입하는 조건하에서, 재조합 수용체를 인코딩하는 핵산 분자를 포함하는 시제와 접촉시키는 단계를 추가로 포함한다.
구체적인 구현예에서, 본 명세서에는 세포 조성물을 생성하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 다음의 단계를 포함한다: 대상체로부터 유래한 생물학적 샘플로부터의 CD27+CCR7+CD4+ T 세포 및 CD27+CCR7+CD8+ T 세포를 포함하는 투입 조성물을, 재조합 수용체를 인코딩하는 핵산을 이러한 조성물 내 세포 내로 도입하는 조건하에서, 재조합 수용체를 인코딩하는 핵산 분자를 포함하는 시제와 접촉시키는 단계, 여기서 투입 조성물 내 존재하는 CD27+CCR7+CD4+ T 세포 대 CD27+CCR7+CD8+ T 세포의 비율은 (약) 0.8:1 내지 2.2:1이다. 제공된 방법의 특정 구현예에서, 상기 방법은 상기 접촉 단계 이전, 동안 및/또는 이후에 세포를 자극하는 단계를 추가로 포함하며, 이러한 자극 단계는 하나 이상의 자극 시제의 존재하에 세포의 인큐베이션을 포함하고, 자극은 세포의 활성화 및/또는 증식을 초래한다.
구체적인 구현예에서, 본 명세서에는 세포 조성물을 생성하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 다음의 단계를 포함한다: CD27+CCR7+CD4+ T 세포를 포함하는 제1 세포 조성물과 CD27+CCR7+CD8+ T 세포를 포함하는 제2 세포 조성물을 조합하여, 투입 세포 조성물을 제조하는 단계로서, 여기서 CD27+CCR7+CD4+ T 세포 대 CD27+CCR7+CD8+ T 세포의 비율은 (약) 0.8:1 내지 2.2:1인 단계; 투입 조성물을, 재조합 수용체를 인코딩하는 핵산을 이러한 조성물 내 세포 내로 도입하는 조건하에서, 재조합 수용체를 인코딩하는 핵산 분자를 포함하는 시제와 접촉시키는 단계; 상기 접촉 단계 이전, 동안 및/또는 이후에 세포를 자극하는 단계, 여기서 자극은 하나 이상의 자극 시제의 존재하에 세포의 인큐베이션을 포함하고, 자극은 세포의 활성화 및/또는 증식을 초래한다.
제공된 방법의 구체적인 구현예에서, CD27+CCR7+CD4+ T 세포의 개수, 부피 당 개수, 중량 당 개수 및/또는 백분율, 및/또는 CD27+CCR7+CD8+ T 세포의 개수, 부피 당 개수, 중량 당 개수 및/또는 백분율은 유세포 분석에 의해 결정된다. 제공된 방법의 특정 구현예에서, CD27+CCR7+CD4+ T 세포 대 CD27+CCR7+CD8+ T 세포의 비율은 대상체로부터의 생물학적 샘플 내 CD27+CCR7+CD4+ T 세포 대 CD27+CCR7+CD8+ T 세포의 비율과 비교하여 조정되었다.
제공된 방법의 일부 구현예에서, 투입 조성물은 CD27+CCR7+CD4+ 세포 대 CD27+CCR7+CD8+ 세포의 비율이 (약) 0.8:1 내지 2.0:1, 0.8:1 내지 1.6:1, 0.8:1 내지 1.4:1, 0.8:1 내지 1.2:1, 또는 1.0:1 내지 1.2:1이다. 제공된 방법의 구체적인 구현예에서, 투입 조성물은 CD27+CCR7+CD4+ 세포 대 CD27+CCR7+CD8+ 세포의 비율이 (약) 1.5:1, 1.4:1, 1.3:1, 1.2:1, 1.1:1, 또는 1.0:1이다. 제공된 방법의 특정 구현예에서, 투입 조성물은 CD27+CCR7+CD4+ 세포 대 CD27+CCR7+CD8+ 세포의 비율이 (약) 1.1:1이다. 일부 구현예에서, 투입 세포 조성물은 CD27+CCR7+CD4+ 세포 대 CD27+CCR7+CD8+ 세포의 비율이 (약) 1.69:1이다.
일부 구현예에서, 본 명세서에는 세포 조성물을 생성하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 다음의 단계를 포함한다: CD62L-CCR7+CD4+ T 세포를 포함하는 제1 세포 조성물과 CD62L-CCR7+CD8+ T 세포를 포함하는 제2 세포 조성물을 조합하여, 투입 세포 조성물을 제조하는 단계로서, 여기서 CD62L-CCR7+CD4+ T 세포 대 CD62L-CCR7+CD8+ T 세포의 비율은 (약) 0.5:1 내지 2:1인 단계.
구체적인 구현예에서, 본 명세서에는 세포 조성물을 생성하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 다음의 단계를 포함한다: 대상체로부터 수득한 생물학적 샘플 또는 그로부터 유래된 하나 이상의 샘플 내 CD62L-CCR7+CD4+ T 세포 및 CD62L-CCR7+CD8+ T 세포의 개수, 부피 당 개수, 중량 당 개수 및/또는 백분율을 결정하는 단계; 및 CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포를 포함하는 투입 조성물을 제조하는 단계, 여기서 CD62L-CCR7+CD4+ T 세포 대 나이브-유사 CD8+ T 세포의 비율은 (약) 0.5:1 내지 2:1이며, 상기 투입 조성물 내 비율은 대상체로부터의 생물학적 샘플 내 CD62L-CCR7+CD4+ T 세포 대 나이브-유사 CD8+ T 세포의 비율과 비교하여 조정 또는 변경된다.
제공된 방법의 특정 구현예에서, 상기 방법은 투입 조성물을, 재조합 수용체를 인코딩하는 핵산을 투입 조성물 내 세포 내로 도입하는 조건하에서, 재조합 수용체를 인코딩하는 핵산 분자를 포함하는 시제와 접촉시키는 단계를 추가로 포함한다. 구체적인 구현예에서, 본 명세서에는 세포 조성물을 생성하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 다음의 단계를 포함한다: CD62L-CCR7+CD4+T 세포를 포함하는 제1 세포 조성물과 CD62L-CCR7+CD8+ T 세포를 포함하는 제2 세포 조성물을 조합하여, 투입 세포 조성물을 제조하는 단계로서, 여기서 CD62L-CCR7+CD4+ T 세포 대 CD62L-CCR7+CD8+ T 세포의 비율은 (약) 0.5:1 내지 2:1인 단계; 투입 조성물을, 재조합 수용체를 인코딩하는 핵산을 이러한 조성물 내 세포 내로 도입하는 조건하에서, 재조합 수용체를 인코딩하는 핵산 분자를 포함하는 시제와 접촉시키는 단계; 상기 접촉 단계 이전, 동안 및/또는 이후에 세포를 자극하는 단계, 여기서 자극은 하나 이상의 자극 시제의 존재하에 세포의 인큐베이션을 포함하고, 자극은 세포의 활성화 및/또는 증식을 초래한다.
제공된 방법의 구체적인 구현예에서, CD62L-CCR7+CD4+ T 세포의 개수, 부피 당 개수, 중량 당 개수 및/또는 백분율, 및/또는 CD62L-CCR7+CD8+ T 세포의 개수, 부피 당 개수, 중량 당 개수 및/또는 백분율은 유세포 분석에 의해 결정된다. 제공된 방법의 특정 구현예에서, CD62L-CCR7+CD4+ T 세포 대 CD62L-CCR7+CD8+ T 세포의 비율은 대상체로부터의 생물학적 샘플 내 CD62L-CCR7+CD4+ T 세포 대 CD62L-CCR7+CD8+ T 세포의 비율과 비교하여 조정되었다. 제공된 방법의 일부 구현예에서, 투입 조성물은 CD62L-CCR7+CD4+ 세포 대 CD62L-CCR7+CD8+ 세포의 비율이 (약) 0.5:1 내지 1.5:1, 1:1 내지 2:1, 0.75:1 내지 1.5:1, 또는 0.8:1 내지 1.2:1이다. 제공된 방법의 구체적인 구현예에서, 투입 조성물은 CD62L-CCR7+CD4+ 세포 대 CD62L-CCR7+CD8+ 세포의 비율이 (약) 1.2:1, 1.1:1, 1.0:1, 0.9:1, 또는 0.8:1이다.
제공된 방법의 특정 구현예에서, 생물학적 샘플은 혈액, 혈장 또는 혈청 샘플이거나 이로부터 수득된다. 제공된 방법의 일부 구현예에서, 생물학적 샘플은 전혈 샘플, 버피 코트 샘플, 말초 혈액 단핵구 세포 (PBMC) 샘플, 분별되지 않은 T 세포 샘플, 림프구 샘플, 백혈구 샘플, 성분채집 생성물, 또는 백혈구성분채집 생성물이거나, 또는 이를 포함한다. 제공된 방법의 구체적인 구현예에서, 생물학적 샘플은 성분채집술 또는 백혈구성분채집술 샘플이거나, 또는 이로부터 수득된다.
도 1A는 T 세포 활성화, 키메라 항원 수용체 (CAR) 작제물로의 형질도입 및 팽창 이후 T 세포 조성물 내 CAR+CD4+ T 세포 대 CAR+CD8+ T 세포의 비율 (CAR+ CD4+/CD8+ 비율)과 비교하여, 성분채집술 샘플 내 생존 CD4+ 세포 대 생존 CD8+ 세포의 비율(생존 CD4+/CD8+ 비율)의 이변량 피트 분석의 플롯을 도시한다. 곡선은 p=0.990에서의 이변량 정규 타원의 경계를 나타낸다. 데이터 포인트는 건강한 대상 (원) 및 골수종이 있는 대상체 (더하기 부호)을 포함하여 각 대상으로부터 4 개의 샘플의 평균 비율을 나타낸다.
도 1B는 T 세포 활성화, 키메라 항원 수용체 (CAR) 작제물로의 형질도입 및 팽창 이후 T 세포 조성물 내 CAR+ CD4+/CD8+ 비율과 비교하여 선별된 CD4 및 CD8 세포의 출발 혼합물 내 CD45RA+/CCR7+ CD4/CD8 비율의 이변량 피트 분석의 플롯을 도시한다. 곡선은 p=0.990에서의 이변량 정규 타원의 경계를 나타낸다. 데이터 포인트는 건강한 대상체 (원) 및 골수종이 있는 대상체 (더하기 부호)을 포함하여 각 대상체로부터 4 개의 샘플의 평균 비율을 나타낸다.
도 2A-2C는 조작된 CAR+ T 세포 조성물 내 CAR+ CD4+/CD8+ 비율과 비교하여 선별된 CD4 및 CD8 세포의 출발 혼합물 내 상이한 표현형 세포의 비율의 이변량 피트 분석의 플롯을 도시한다. 도 2A는 조작된 CAR+ T 세포 조성물 내 CAR+ CD4+/CD8+ 비율과 비교하여 선별된 CD4 및 CD8 세포의 출발 혼합물 내 CD45RA+/CCR7+/CD4+ 대 CD45RA+/CCR7+/CD8+ 세포 비율의 이변량 피트 분석의 플롯을 도시한다. 도 2B는 조작된 CAR+ T 세포 조성물 내 CAR+ CD4+/CD8+ 비율과 비교하여 선별된 CD4 및 CD8 세포의 출발 혼합물 내 CD62L-/CCR7+/CD4+ T 세포 대 CD62L-/CCR7+/CD8+ T 세포의 비율의 이변량 피트 분석의 플롯을 도시한다. 도 2C는 조작된 CAR+ T 세포 조성물 내 CAR+ CD4+/CD8+ 비율과 비교하여 선별된 CD4 및 CD8 세포의 출발 혼합물 내 CD27+/CCR7+/CD4+ T 세포 대 CD27+/CCR7+/CD8+ T 세포의 비율의 이변량 피트 분석의 플롯을 도시한다. 곡선은 p=0.950에서의 이변량 정규 타원의 경계를 나타낸다. 데이터 포인트는 건강한 공여자 (원) 및 다발성 골수종이 있는 환자 (더하기 부호)을 포함하여 각 대상체로부터 다중 샘플의 평균 비율을 나타낸다.
도 3A-3C는 생성된 조작된 CAR+ T 세포 조성물 내 CAR+ CD4+/CD8+ 비율과 비교하여, 다발성 골수종을 가지는 7명의 공여자로부터의 선별된 CD4 및 CD8 세포의 출발 혼합물 내 상이한 표현형 세포의 비율의 이변량 피트 분석의 플롯을 도시한다. 도 3A는 조작된 CAR+ T 세포 조성물 내 CAR+ CD4+/CD8+ 비율과 비교하여 선별된 CD4 및 CD8 세포의 출발 혼합물 내 CD27+/CCR7+/CD4+ 대 CD27+/CCR7+/CD8+ 세포 비율의 이변량 피트 분석의 플롯을 도시한다. 도 3B는 조작된 CAR+ T 세포 조성물 내 CAR+ CD4+/CD8+ 비율과 비교하여 선별된 CD4 및 CD8 세포의 출발 혼합물 내 CD27+/CCR7+/CD4+ T 세포 대 CD27+/CCR7+/CD8+ T 세포의 비율의 이변량 피트 분석의 플롯을 도시한다. 도 3C는 조작된 CAR+ T 세포 조성물 내 CAR+ CD4+/CD8+ 비율과 비교하여 선별된 CD4 및 CD8 세포의 출발 혼합물 내 CD62L-/CCR7+/CD4+ T 세포 대 CD62L-/CCR7+/CD8+ T 세포의 비율의 이변량 피트 분석의 플롯을 도시한다. 곡선은 p=0.950에서의 이변량 정규 타원의 경계를 나타낸다.
도 1B는 T 세포 활성화, 키메라 항원 수용체 (CAR) 작제물로의 형질도입 및 팽창 이후 T 세포 조성물 내 CAR+ CD4+/CD8+ 비율과 비교하여 선별된 CD4 및 CD8 세포의 출발 혼합물 내 CD45RA+/CCR7+ CD4/CD8 비율의 이변량 피트 분석의 플롯을 도시한다. 곡선은 p=0.990에서의 이변량 정규 타원의 경계를 나타낸다. 데이터 포인트는 건강한 대상체 (원) 및 골수종이 있는 대상체 (더하기 부호)을 포함하여 각 대상체로부터 4 개의 샘플의 평균 비율을 나타낸다.
도 2A-2C는 조작된 CAR+ T 세포 조성물 내 CAR+ CD4+/CD8+ 비율과 비교하여 선별된 CD4 및 CD8 세포의 출발 혼합물 내 상이한 표현형 세포의 비율의 이변량 피트 분석의 플롯을 도시한다. 도 2A는 조작된 CAR+ T 세포 조성물 내 CAR+ CD4+/CD8+ 비율과 비교하여 선별된 CD4 및 CD8 세포의 출발 혼합물 내 CD45RA+/CCR7+/CD4+ 대 CD45RA+/CCR7+/CD8+ 세포 비율의 이변량 피트 분석의 플롯을 도시한다. 도 2B는 조작된 CAR+ T 세포 조성물 내 CAR+ CD4+/CD8+ 비율과 비교하여 선별된 CD4 및 CD8 세포의 출발 혼합물 내 CD62L-/CCR7+/CD4+ T 세포 대 CD62L-/CCR7+/CD8+ T 세포의 비율의 이변량 피트 분석의 플롯을 도시한다. 도 2C는 조작된 CAR+ T 세포 조성물 내 CAR+ CD4+/CD8+ 비율과 비교하여 선별된 CD4 및 CD8 세포의 출발 혼합물 내 CD27+/CCR7+/CD4+ T 세포 대 CD27+/CCR7+/CD8+ T 세포의 비율의 이변량 피트 분석의 플롯을 도시한다. 곡선은 p=0.950에서의 이변량 정규 타원의 경계를 나타낸다. 데이터 포인트는 건강한 공여자 (원) 및 다발성 골수종이 있는 환자 (더하기 부호)을 포함하여 각 대상체로부터 다중 샘플의 평균 비율을 나타낸다.
도 3A-3C는 생성된 조작된 CAR+ T 세포 조성물 내 CAR+ CD4+/CD8+ 비율과 비교하여, 다발성 골수종을 가지는 7명의 공여자로부터의 선별된 CD4 및 CD8 세포의 출발 혼합물 내 상이한 표현형 세포의 비율의 이변량 피트 분석의 플롯을 도시한다. 도 3A는 조작된 CAR+ T 세포 조성물 내 CAR+ CD4+/CD8+ 비율과 비교하여 선별된 CD4 및 CD8 세포의 출발 혼합물 내 CD27+/CCR7+/CD4+ 대 CD27+/CCR7+/CD8+ 세포 비율의 이변량 피트 분석의 플롯을 도시한다. 도 3B는 조작된 CAR+ T 세포 조성물 내 CAR+ CD4+/CD8+ 비율과 비교하여 선별된 CD4 및 CD8 세포의 출발 혼합물 내 CD27+/CCR7+/CD4+ T 세포 대 CD27+/CCR7+/CD8+ T 세포의 비율의 이변량 피트 분석의 플롯을 도시한다. 도 3C는 조작된 CAR+ T 세포 조성물 내 CAR+ CD4+/CD8+ 비율과 비교하여 선별된 CD4 및 CD8 세포의 출발 혼합물 내 CD62L-/CCR7+/CD4+ T 세포 대 CD62L-/CCR7+/CD8+ T 세포의 비율의 이변량 피트 분석의 플롯을 도시한다. 곡선은 p=0.950에서의 이변량 정규 타원의 경계를 나타낸다.
본 명세서에는 재조합 수용체를 발현하기 위해 세포를 유전자 조작 세포에서 사용하기 위한 세포 조성물, 예를 들어 투입 세포 조성물의 제조 방법이 제공된다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 나이브-유사 CD4+ T 세포 대 나이브-유사 CD8+ T 세포를, 정의된, 제어된, 또는 원하는 비율로 포함하는 투입 세포 조성물을 제조하는 하나 이상의 단계를 포함한다. 일부 경우에, 제공된 투입 조성물은 예컨대, 선택된 또는 원하는 비율을 달성하기 위해, 공지된 또는 결정된 개수 또는 백분율의 나이브-유사 CD4+ T 세포를 가지는 CD4+ T 세포를 포함하는 세포 조성물과, 공지된 또는 결정된 개수 또는 백분율의 나이브-유사 CD8+ T 세포를 가지는 CD8+ T 세포를 포함하는 세포 조성물을 혼합 또는 조합함으로써 제조될 수 있다. 또한, 투입 조성물 내 세포의 자극, 팽창 및/또는 증식 유도를 위한 방법이 제공된다. 제공된 방법은 또한 세포의 유전자 조작과 관련된 방법, 예컨대 형질도입 방법을 비롯하여, 입양 세포 요법과 관련하여 사용하기 위해 재조합 수용체, 예를 들어, 키메라 항원 수용체를, 이러한 세포 내로 도입하는 방법을 포함할 수 있다.
하나의 구현예에서, 생성된 투입 조성물의 가공은, 예를 들어 일부 양태에서, 조작 또는 형질도입을 위해, 또는 세포 팽창을 위해 세포를 활성화 시키기 위해, 자극 조건하에서 세포를 인큐베이션하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은, 복수의 세포 유형, 예컨대 CD4+ 세포 및 CD8+ 세포, 예컨대 투입 조성물 내 단리 및 존재하는 세포를 조작하는 단계를 포함한다. 일부 양태에서, 조작 단계는 세포 내로 유전자 조작된 항원 수용체, 예컨대 TCR, 예를 들어, 높은-친화성의 TCR, 또는 기능성 비-TCR 항원 수용체, 예컨대 키메라 항원 수용체 (CAR)를 도입하기 위해 수행된다. 일부 양태에서, 상기 방법은, 예를 들어 (약) 37º C ± 2º C에서 추가의 인큐베이션과 같은 가공, 및/또는 세포 및 이를 함유하는 조성물의 제제화 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 이러한 가공으로, 예컨대 조작된 CD4+ 및 CD8+ 세포가 원하는 비율로 존재하는 세포를 비롯하여, 유전자 조작된 CD4+ 세포 및 CD8+ 세포와 같은 유전자 조작된 세포를 포함하는 산출 조성물이 생성된다 일부 구현예에서, 결과의 가공된 산출 조성물은 예를 들어, 입양 세포 요법과 관련하여, 상기 방법에 의해 제조된 세포 및 조성물을 환자에게 투여하는 방법에 사용될 수 있다.
일부 양태에서, 조작된 CD4+ 세포 및 CD8+ 세포가 원하는 비율로, 또는 원하는 비율의 어느 정도의 허용 오차 이내로 존재하는 조작된 세포, 예를 들어, CAR+ T 세포를 포함하는 산출 조성물이 유리하다. 예를 들어, 복수의 상이한 세포 집단 또는 유형의 세포, 예컨대 단리된 CD4+ 및 CD8+ T 세포 집단 및 서브집단에 대해 농축된 세포를 조작하면, 효능을 개선하거나, 또는 원하지 않는 효과를 감소 또는 예방할 수 있다. 일부 경우에, 이러한 비율은 치료 용도에 최적인 것으로 여겨지는 비율, 예를 들어, 입양 세포 요법과 관련하여 환자에게 투여하기에 적절하거나 최적인 것으로 여겨지는 산출 비율을 포함한다. 일부 구현예에서, 예컨대 입양 세포 요법과 관련하여 대상체에게 투여하기 위한 산출 조성물 내 CD4+ 대 CD8+ T 세포의 원하는 비율은 (약) 2:1 내지 0.5:1, 예를 들어 (약) 1:1이다. 일부 양태에서, 단리된 CD8+ 및 CD4+ T 세포를 포함하는, 예컨대 이러한 세포의 특정 원하는 비율을 포함하는 조성물은, 생체 내에서 또는 대상체에게 투여 시, 최종적으로 대상체에게 투여되는 세포의 지속, 팽창, 활성화, 및/또는 생착 능력을 증가시킨다. 일부 양태에서, 이는 하나 이상의 이펙터 기능 또는 활성화 표현형을 개선 또는 증가시킨다. 예를 들어, 이러한 이점은 일부 양태에서 CD8+ 집단 단독으로와 비교하여 CD4+ 및 CD8+ 집단을 투여함으로써 달성될 수 있다.
일부 구현예에서, 상기 방법은 다른 제조, 단리, 인큐베이션, 및 조작 방법과 비교하여, 비용, 시간, 및/또는 공급원 절약과 같은 하나 이상의 이점을 제공한다. 이러한 이점은, 다른 방법과 비교하여 증가된 효율 및/또는 감소된 복잡성, 시간, 비용, 및/또는 공급원의 사용으로, (거의) 원하는 비율로 존재하는 복수의 세포 집단을 단리, 가공, 예를 들어, 인큐베이션, 및/또는 조작하는 능력을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 제공된 방법은, 세포를 조작하기 위한 특정 세포 제조 공정에서, CD4+ 대 CD8+ 세포의 투입 비율, 또는 이의 생존 세포의 비율이 조작된 CD4+ 대 CD8+ 세포의 산출 비율, 또는 이의 생존 세포의 비율과 상관관계가 없다는 관찰에 근거한다. 본 명세서에 나타난 바와 같이, 산출 조성물 내 조작된 CD4+ 대 CD8+ T 세포의 원하는 비율 (예를 들어, CAR+ CD4 대 CAR+ CD8+ T 세포의 비율 또는 이의 생존 세포의 비율)은 산출 조성물을 제조하기 위해, 예를 들어, 세포의 자극, 활성화, 팽창, 증식 및/또는 형질도입 중 하나 이상의 단계를 수반하는, 세포에 대한 제조 공정을 수행하기 이전에, 투입 조성물 내에 존재하는 나이브-유사 CD4+ T 세포 대 나이브-유사 CD8+ T 세포의 비율, 또는 이의 생존 세포의 비율과 상관관계가 있거나, 또는 연관이 있는 것으로 밝혀졌다. 이러한 예시적인 나이브-유사 세포는 CD45RA+ 및 CCR7+, CD62L-/CCR7+ 또는 CD27+/CCR7+인, CD4+ 대 CD8+ 세포의 비율이다. 일부 양태에서, 투입 조성물 내 나이브-유사 CD4/CD8 세포 대 산출 조성물 내 조작된 CD4+ 대 CD8+ 세포 (예를 들어, CAR+ CD4 대 CAR+ CD8+ T 세포 또는 이의 생존 세포의 비율) 비율 사이의 이러한 상관관계는 산출 조성물을 생성 또는 제조하기 위해 사용되는 공정의 변화에도 불구하고 존재하는 것으로 관찰된다. 이러한 변화에 대한 공급원으로는, 하나의 세포 조성물로부터 다음 조성물로 변이를 도입할 수 있는 공정의 특정 단계 또는 조건을 비롯한 다수의 상이한 요인을 포함할 수 있거나, 또는 조작된 세포가 단리, 선별, 유도, 또는 획득된 개체 또는 샘플에서의 차이로부터 기인할 수 있다.
특정 구현예에서, 제공된 방법은 산출 조성물 내 조작된 CD4+ 대 CD8+ T 세포의 원하는 비율 (예를 들어, CAR+ CD4 대 CAR+ CD8+ T 세포 또는 이의 생존 세포의 비율)은 산출 조성물을 제조하기 위해, 예를 들어, 세포의 자극, 활성화, 팽창, 증식 및/또는 형질도입 중 하나 이상의 단계를 수반하는, 세포에 대한 제조 공정을 수행하기 이전에, 투입 조성물 내에 존재하는 CD45RA+/CCR7+CD4+ T 세포 대 CD45RA+/CCR7+CD8+ T 세포의 비율, 또는 이의 생존 세포의 비율과 상관관계가 있거나, 또는 연관이 있다는 관찰에 근거한다. 특정 양태에서, 투입 조성물 내 CD45RA+/CCR7+CD4+ 대 CD45RA+/CCR7+/CD8+ 세포의 비율과 산출 조성물의 조작된 CD4+ 대 CD8+ 세포 (예를 들어, CAR+ CD4 대 CAR+ CD8+ T 세포 또는 이의 생존 세포의 비율) 사이의 이러한 상관관계는 산출 조성물을 생성 또는 제조하기 위해 사용되는 공여자 및/또는 공정의 변화에도 불구하고 존재하는 것으로 관찰된다.
구체적인 구현예에서, 제공된 방법은 산출 조성물 내 조작된 CD4+ 대 CD8+ T 세포의 원하는 비율 (예를 들어, CAR+ CD4 대 CAR+ CD8+ T 세포 또는 이의 생존 세포의 비율)은 산출 조성물을 제조하기 위해, 예를 들어, 세포의 자극, 활성화, 팽창, 증식 및/또는 형질도입 중 하나 이상의 단계를 수반하는, 세포에 대한 제조 공정을 수행하기 이전에, 투입 조성물 내에 존재하는 CD62L-/CCR7+CD4+ T 세포 대 CD62L-/CCR7+CD8+ T 세포의 비율, 또는 이의 생존 세포의 비율과 상관관계가 있거나, 또는 연관이 있다는 관찰에 근거한다. 특정 양태에서, 투입 조성물 내 CD62L-/CCR7+CD4+ 대 CD62L-/CCR7+/CD8+ 세포의 비율과 산출 조성물의 조작된 CD4+ 대 CD8+ 세포 (예를 들어, CAR+ CD4 대 CAR+ CD8+ T 세포 또는 이의 생존 세포의 비율) 사이의 이러한 상관관계는 산출 조성물을 생성 또는 제조하기 위해 사용되는 공여자 및/또는 공정의 변화에도 불구하고 존재하는 것으로 관찰된다.
일부 구현예에서, 제공된 방법은 산출 조성물 내 조작된 CD4+ 대 CD8+ T 세포의 원하는 비율 (예를 들어, CAR+ CD4 대 CAR+ CD8+ T 세포 또는 이의 생존 세포의 비율)은 산출 조성물을 제조하기 위해, 예를 들어, 세포의 자극, 활성화, 팽창, 증식 및/또는 형질도입 중 하나 이상의 단계를 수반하는, 세포에 대한 제조 공정을 수행하기 이전에, 투입 조성물 내에 존재하는 CD27+/CCR7+CD4+ T 세포 대 CD27+/CCR7+CD8+ T 세포의 비율, 또는 이의 생존 세포의 비율과 상관관계가 있거나, 또는 연관이 있다는 관찰에 근거한다. 특정 양태에서, 투입 조성물 내 CD27+/CCR7+CD4+ 대 CD27+/CCR7+/CD8+ 세포의 비율과 산출 조성물의 조작된 CD4+ 대 CD8+ 세포 (예를 들어, CAR+ CD4 대 CAR+ CD8+ T 세포 또는 이의 생존 세포의 비율) 사이의 이러한 상관관계는 산출 조성물을 생성 또는 제조하기 위해 사용되는 공여자 및/또는 공정의 변화에도 불구하고 존재하는 것으로 관찰된다.
일부 양태에서, 제공된 방법은 세포 제조 공정에 의해 생성된 유전자 조작된 세포, 예를 들어, CAR+ T 세포의 산출 조성물이 비교적 일관된 및/또는 제어된, 조작된 CD4+ 대 CD8+ T 세포의 원하는 비율, 또는 이의 생존 세포의 비율을 달성하고, 이는 상이한 연령, 수 및/또는 이전 요법, 및 징후의 유형 및 이의 서브유형 또는 중증도 또는 등급과 같은, 상이한 특성을 가지는, 다수의 상이한 대상체로부터 유래한 샘플로부터의 조성물을 비롯하여, 상기 공정에 의해 제조된 조성물 중에서 이러한 비율의 변동이 낮거나 또는 허용 가능한 또는 임계의 변동 이하를 나타낸다는 것을 보장한다. 일부 양태에서, 이러한 공정으로 생성된, 조작된 CD4+ 대 CD8+의 비율 (예를 들어, CAR+ CD4 대 CAR+ CD8+ T 세포 또는 이의 생존 세포의 비율)은, 상기 방법에 의해 제조된 복수의 T 세포 조성물 내 상기 비율의 평균으로부터 20% 미만 또는 10% 미만 또는 5% 미만으로 변하고 및/또는 이러한 다양한 샘플 및 환자 중에서 상기 공정에 의해 제조된 복수의 T 세포 조성물 중에서 이러한 평균으로부터 하나의 표준편차 이하로 변하거나, 또는 20% 미만 또는 10% 미만 또는 5% 미만으로 변한다.
일부 구현예에서, 세포 제조 공정 중에서, 예컨대 조작된 CD4 대 CD8 T 세포 비율에 대하여 생성된 산출 조성물 중에서 더 큰 일관성을 생성하는 공정을 사용하면 대상체의 투약에서 일관성을 보장하기 위해 유리할 수 있으며, 이는 일부 양태에서, 치료되는 대상체 중에 투여되는 조성물의 효능, 잠재력 및/또는 안전성을 최적화할 수 있다. 일부 양태에서, 조작된 산출 조성물에서 원하는 산출 비율로 CD4+ 및 CD8+ T 세포 집단이 농축된 세포를 조작하면, 효능을 개선하거나, 또는 원하지 않는 효과를 감소 또는 예방할 수 있다. 일부 양태에서, 단리 또는 농축은 생체 내에서 또는 대상체에게 투여 시, 최종적으로 대상체에게 투여되는 세포의 지속, 팽창, 활성화, 및/또는 생착 능력을 증가시킨다. 일부 양태에서, 이는 하나 이상의 이펙터 기능 또는 활성화 표현형을 개선 또는 증가시킨다. 이러한 결과는 세포 조작을 위한 출발 세포 샘플 중에서 공여자 가변성이 있는 경우에도 달성될 수 있다.
일부 구현예에서, 본 명세서에 제공된 방법은 조작된 CD4+ 및 CD8+ T 세포가 개별적으로 가공 및/또는 투여될 필요 없이, 산출 조성물 내 원하는 산출 비율을 가지는 조작된 세포의 치료적 세포 조성물을 제조할수 있도록 한다. 이에 따라, 제공된 방법은 조작된 CD4+ T 세포 집단 및 CD8+ T 세포 집단의 (거의) 원하는 산출 비율을 가지는 조성물을 제조하기 위한 보다 능률적이고 및/또는 제어된 방법을 제공한다. 특히 양태, 기재된 바와 같이 나이브-유사 CD4 및 CD8 세포를 원하는 비율로 포함하는 투입 조성물을 제조한 이후, 제공된 방법은 단일 스트림 공정에서 함께 CD4+ 및 CD8+ T 세포가 가공, 예를 들어, 활성화, 자극, 팽창 및/또는 형질도입되는 세포 제조 공정에서 사용될 수 있다. 이에 따라, 일부 양태에서, 상기 방법은 입양 세포 요법에 사용하기 위한 유전자 조작된 항원 수용체의 도입을 허용하여, 세포 집단이 조합되어 단리, 인큐베이션, 및/또는 조작되고, 상기 방법은, 집단이 개별적으로 단리, 인큐베이션, 및/또는 조작되는 방법과 비교하여, 증가된 효율 및/또는 감소된 복잡성, 시간, 비용, 및/또는 공급원의 사용과 연관이 있다.
또한 상기 방법에 의해 제조된 세포 및 조성물, 뿐만 아니라 상기 방법을 수행하기 위한 약제학적 조성물 및 제제, 및 키트, 시스템, 및 장치가 제공된다. 또한 입양 세포 요법을 위한 방법과 같은 치료적 방법을 비롯하여, 상기 방법에 의해 제조된 세포 및 조성물의 사용 방법, 및 대상체에게 투여하기 위한 약제학적 조성물이 제공된다.
본 명세서에 언급된 모든 간행물, 예를 들어 특허 문서, 과학 논문 및 데이터베이스는 각각의 개별 간행물이 개별적으로 참조 문헌으로서 포함된 것과 마찬가지로, 동일하게 그 전체가 모든 목적을 위해 참조로 포함된다. 본 명세서에 기재된 정의가 본 명세서에 참조 문헌으로 포함된 특허, 출원, 공개된 출원 및 다른 출원에 기재된 정의와 상반되거나 일치하지 않는 경우, 본 명세서에 기재된 정의는 본 명세서에 참조 문헌으로 포함된 정의보다 우선한다.
본 출원에서 사용되는 구획 제목은 단지 구조화를 위한 것이며 기재된 주제를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.
I. CD4+ 대 CD8+ T 세포 또는 이의 특정 서브유형의 제어된 비율을 가지는 조작된 세포의 생성 방법
본 명세서에는 재조합 수용체를 발현하기 위해 세포를 유전자 조작 세포에서 사용하기 위한 세포 조성물, 예를 들어 투입 세포 조성물의 생성 방법이 제공된다. 일부 구현예에서, 투입 세포 조성물은 CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포를 포함한다. 특정 구현예에서, 투입 세포 조성물은 CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포의 하나 이상의 서브유형 또는 집단을 포함한다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 서브유형 또는 집단은 나이브 및/또는 나이브-유사 세포이다. 구체적인 구현예에서, 투입 세포 조성물은 CD4+ T 세포를 포함하며, CD4+ T 세포의 적어도 일부는 나이브-유사 CD4 세포이다. 일부 구현예에서, 투입 세포 조성물은 CD8+ T 세포를 포함하며, CD8+ T 세포의 적어도 일부는 나이브 세포이다. 구체적인 구현예에서, 투입 세포 조성물은 고정된, 바람직한, 표적의, 정의된, 및/또는 제어된 나이브-유사 CD4+ T 세포 대 나이브-유사 CD8+ T 세포의 비율을 포함 및/또는 가진다.
특정 구현예에서, 상기 방법은 투입 세포 조성물을 생성 또는 제조하기 위해 세포 또는 조성물을 혼합 또는 조합하는 하나 이상의 단계를 포함한다. 특정 구현예에서, 세포 또는 세포 조성물은 샘플로부터 선별 및/또는 단리되었다. 일부 구현예에서, 투입 세포 조성물의 세포는 샘플로부터 선별 및/또는 단리되었다. 일부 구현예에서, CD4+ T 세포 및/또는 CD4+ T 세포의 조성물은 샘플로부터 선별 또는 단리된다. 일부 구현예에서, 샘플은 생물학적 샘플, 예컨대 혈액 샘플, 성분채집술 샘플, 및/또는 백혈구성분채집술 샘플이다. 특정 구현예에서, 샘플은 대상체, 예를 들어, 인간 대상체로부터 유래한다. 구체적인 구현예에서, CD4+ T 세포의 조성물 및 CD8+ T 세포의 조성물은 동일한 샘플로부터 단리된 및/또는 선별된다. 구체적인 구현예에서, CD4+ T 세포의 조성물 및 CD8+ T 세포의 조성물은 동일한 대상체로부터 수득 또는 획득된 샘플로부터 단리된 및/또는 선별된다.
일부 구현예에서, 투입 세포 조성물의 생성 또는 제조는 세포를 평가, 특성화, 및/또는 식별하는 하나 이상의 단계를 포함한다. 구체적인 구현예에서, 세포는 CD4+ T 세포의 조성물에서 평가, 특성화, 및/또는 식별된다. 일부 구현예에서, 세포는 CD8+ T 세포의 조성물에서 평가, 특성화, 및/또는 식별된다. 일부 구현예에서, 세포는 T 세포에서 나이브-유사 상태를 나타내는 및/또는 이와 연관된 마커에 대해 양성인 세포에 대해 평가된다. 특정 구현예에서, 세포는 T 세포에서 비-나이브-유사 상태를 나타내는 및/또는 이와 연관된 마커에 대해 음성인 세포에 대해 평가된다. 구체적인 구현예에서, 대상체로부터 유래한 생물학적 샘플로부터 단리된 세포 조성물과 같이, CD4+ 및 CD8+ T 세포 조성물의 세포는, 나이브-유사 상태와 연관된 하나 이상의 마커에 대해 양성인 및/또는 비-나이브-유사 상태와 연관된 하나 이상의 마커에 대해 음성인 세포의 양, 수준, 부분, 및/또는 백분율을 결정하기 위해 평가, 특성화, 및/또는 식별된다. 특정 구현예에서, 대상체로부터 유래한 생물학적 샘플로부터 단리된 세포 조성물과 같이, CD4+ 및 CD8+ T 세포 조성물의 세포는, 나이브-유사 세포인 세포의 양, 수준, 부분, 및/또는 백분율을 결정하기 위해 평가, 특성화, 및/또는 식별된다.
일부 구현예에서, 상기 방법은 CD4+ T 세포를 함유하는 세포 조성물과 CD8+ T 세포를 함유하는 세포 조성물을 혼합 또는 조합하여, 나이브-유사 CD4+ T 세포 대 나이브-유사 CD8+ T 세포의 정의된 비율을 가지는, 세포 조성물, 예를 들어, 투입 세포 조성물을 생성 또는 제조하는 하나 이상의 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 투입 세포 조성물의 생성 또는 제조는 다음 중 하나 이상의 단계를 포함한다: (i) 샘플, 예를 들어, 생물학적 샘플로부터 CD4+ T 세포 조성물 및/또는 CD8+ T 세포 조성물을 단리 또는 선별하는 단계; (ii) CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포의 조성물에서 나이브-유사 상태와 연관된 하나 이상의 마커에 양성인 및/또는 비-나이브-유사 상태와 관련된 하나 이상의 마커에 음성인 세포의 양, 수준, 부분, 및/또는 백분율을 평가, 특성화, 및/또는 식별하는 단계; 및/또는 (iii) CD4+ T 세포 조성물의 세포와 CD8+ T 세포 조성물의 세포를, 나이브-유사 CD4+ T 세포 대 나이브-유사 CD8+ T 세포의 정의된, 고정된, 및/또는 바람직한 비율로 혼합 또는 조합하는 단계. 구체적인 구현예에서, 투입 세포 조성물 내 나이브-유사 CD4+ T 세포 대 나이브-유사 CD8+ T 세포의 비율은 샘플 내 존재하는 비율과 상이하다.
구체적인 구현예에서, 투입 세포 조성물의 내용물, 성분, 및/또는 구성은 산출 세포 조성물의 내용물, 성분, 및/또는 구성과 상관관계가 있고, 이를 제어하고, 이에 상응하고, 및/또는 이와 연관이 있다. 특정 구현예에서, 투입 세포 조성물 내 나이브 및/또는 나이브-유사 세포, 예를 들어, 나이브-유사 T 세포의 양, 부분, 백분율, 개수, 부피 당 개수, 중량 당 개수 및/또는 비율은, 산출 세포 조성물의 내용물, 성분, 및/또는 구성과 상관관계가 있고, 이를 제어하고, 이에 상응하고, 및/또는 이와 연관이 있다. 구체적인 구현예에서, 투입 세포 조성물 내 나이브-유사 CD4+ T 세포 및/또는 나이브-유사 CD8+ T 세포의 양, 부분, 백분율, 개수, 부피 당 개수, 중량 당 개수 및/또는 비율은, 산출 세포 조성물의 내용물, 성분, 및/또는 구성과 상관관계가 있고, 이를 제어하고, 이에 상응하고, 및/또는 이와 연관이 있다.
일부 구현예에서, 상기 방법은 투입 조성물의 세포를 유전자 조작하는 하나 이상의 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 유전자 조작은 세포를 활성화 및/또는 자극하는 조건하에서 투입 세포 조성물의 세포를 인큐베이션하는 단계, 유전자, 예를 들어, 재조합 및/또는 이종성 유전자를 세포에 전달하는 단계, 활성화 또는 자극 조건하에서 세포를 인큐베이션함으로써 세포를 팽창하는 단계, 세포를 수확하는 단계, 및/또는 동결, 예를 들어, 동결보존에 의해 세포를 저장하는 단계 중하나 이상의 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 유전자 조작 단계는 조작된 세포를 함유하는 산출 세포 조성물를 제조한다. 특정 구현예에서, 산출 조성물의 조작된 세포는 CD4+ 대 CD8+ 세포의 고정된, 정의된, 및/또는 표적 비율을 가진다.
일부 구현예에서, 본 명세서에 제공되는 방법은 정의된 비율의 CD4+ 대 CD8+ T 세포를 가지는 조작된 세포, 재조합 수용체를 발현하는 세포를 생성하는 하나 이상의 단계를 포함한다. 특정 구현예에서, 본 명세서에 제공되는 방법은 정의된 비율의 유전자 조작된 CD4+ 대 CD8+ T 세포를 가지는 생성된 및/또는 산출 세포 조성물을 생성하기 위해 출발 및/또는 투입 세포 조성물로부터 세포를 유전자 조작하는 하나 이상의 단계를 포함한다. 구체적인 구현예에서, 유전자 조작은 투입 세포 조성물로부터 세포를 형질주입 또는 형질도입하여, 핵산을 포함하는 시제를 투입 세포 조성물의 세포 내로 도입하는 것이거나, 또는 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 핵산은 재조합 수용체, 예를 들어, 키메라 항원 수용체 (CAR)를 인코딩한다. 일부 구현예에서, 산출 세포 조성물의 생성은 투입 세포 조성물의 세포를 활성화 또는 자극하는 단계; 투입 세포 조성물로부터의 세포를 유전자 조작, 형질도입 또는 형질주입하는 단계; 및/또는 형질주입된 세포를 팽창시키는 단계; 이에 따라 정의된 비율의, 예컨대 1:1 비율의 유전자 조작된 CD4+ 대 CD8+ T 세포를 가지는 산출 세포 조성물을 생성하는 단계를 중 하나 이상의 단계를 포함한다.
A. 투입 세포 조성물의 세포 및 제조
일부 구현예에서, 본 명세서에 제공된 방법은 유전자 조작을 위한 세포를 제조하기 위한 하나 이상의 단계를 포함한다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 단계는 유전자 조작될 세포의 조성물, 예를 들어, 투입 세포 조성물을 제조하기 위해 생물학적 샘플로부터 세포의 단기를 포함한다. 일부 구현예에서, 투입 세포 조성물의 제조는 둘 이상의 세포 유형 및/또는 특정 세포 유형 또는 세포 서브유형의 조성물을 단리하는 단계, 및 상기 세포 유형 및/또는 특정 세포 유형의 세포 조성물을 단일 투입 세포 조성물로 혼합 또는 조합하는 단계 중 한 이상의 단계를 포함한다. 구체적인 구현예에서, 구체적인 세포 유형의 세포 조성물은 조성물 내 추가적인 서브유형의 존재, 양, 및/또는 비율을 결정하기 위해 평가된다. 특정 구현예에서, 구체적인 세포 유형의 세포 조성물은 혼합 또는 조합되어, 고정된 또는 결정된 비율의 세포 유형 또는 서브유형의 투입 세포 조성물을 달성한다. 일부 구현예에서, 세포 유형 및/또는 세포 서브유형은 산출 세포 조성물의 내용물, 성분, 및/또는 구성과 상관관계가 있고, 이를 제어하고, 이에 상응하고, 및/또는 이와 연관이 있다.
특정 구현예에서, 투입 세포 조성물의 제조는 CD4+ T 세포의 또는 이를 포함하는 조성물을 단리하는 단계, CD8+ T 세포의 또는 이를 포함하는 조성물을 단리하는 단계, 및 구체적인 세포 유형의 CD4+ 및 CD8+ T 세포 조성물을 단일 투입 세포 조성물로 혼합 또는 조합하는 단계 중 하나 이상의 단계를 포함한다. 특정 구현예에서, 투입 세포 조성물의 제조는 세포 조성물 중 CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포의 서브유형의 부분 또는 양을 평가, 결정, 및/또는 정량하는 단계 중 하나 이상의 단계를 포함한다. 구체적인 구현예에서, CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포의 서브유형은 나이브 및/또는 나이브-유사 CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포이거나, 또는 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 투입 세포 조성물 내 나이브-유사 세포의 부분 또는 양은 산출 세포 조성물의 내용물, 성분, 및/또는 구성과 상관관계가 있고, 이를 제어하고, 이에 상응하고, 및/또는 이와 연관이 있다.
일부 구현예에서, 샘플로부터 단리된 세포, 예를 들어, CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포는 포유동물 세포와 같은 진핵 세포이며, 일부 구현예에서 인간 세포이다. 일부 구현예에서, 세포는 대상체의 혈액, 골수, 림프 또는 림프 기관으로부터 유래되고, 및/또는 면역계의 세포, 예컨대 선천성 또는 적응 면역 세포이다. 일부 구현예에서, 세포는 림프구이다. 특정 구현예에서, 림프구는 T 림프구 또는 T 세포이다. 일부 구현예에서, 세포는 CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포를 포함한다.
특정 구현예에서, T 세포 조성물, 예를 들어, CD4+ T 세포 조성물 및/또는 CD8+ T 세포 조성물은 기능, 활성화 상태, 성숙도, 분화 가능성, 팽창, 마커 또는 사이토카인 분비 프로파일, 및/또는 분화 정도에 의해 추가적으로 분류되는 세포의 서브유형을 포함한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 세포는 나이브 및/또는 나이브-유사 CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포이거나, 이를 포함한다. 치료되는 대상체와 관련하여, 세포는 동종이계 및/또는 자가일 수 있다. 상기 방법들 중에는 기성 방법이 포함된다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 동결 보존 이전 또는 이후, 대상체로부터 세포의 단리, 세포의 제조, 가공, 배양, 및/또는 조작, 및 상기 동일한 대상체에게 세포의 재도입을 포함한다.
일부 구현예에서, 조작된 세포의 제조는 하나 이상의 배양 단계 및/또는 제조 단계를 포함한다. 예를 들어, CAR와 같은 재조합 수용체를 발현하기 위해서 투입 세포 조성물, 예를 들어, 유전자 조작될 세포의 조성물에 사용하기 위한 세포는 생물학적 샘플과 같은 샘플로부터 단리된 세포, 예를 들어, 대상체로부터 획득된 또는 유래된 세포를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 세포가 단리된 대상체는 세포 요법을 필요로 하는 질병 또는 질병 상태를 지니거나 또는 세포 요법이 가해질 대상체이다. 일부 구현예에서, 대상체는 특정 치료적 개입, 예컨대 세포가 단리, 가공 및/또는 조작되는 입양 세포 요법을 필요로 하는 인간이다.
일부 양태에서, 세포가 유래되거나 단리되는 샘플, 예를 들어 생물학적 샘플은 혈액 또는 혈액 유래 샘플, 또는 성분채집술 (apheresis) 또는 백혈구성분채집술 (leukapheresis) 산물이거나 이로부터 유래된다. 예시적인 샘플은 전혈, 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC), 백혈구, 골수, 흉선, 및/또는 이로부터 유래된 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 샘플 또는 생물학적 샘플로부터 유래, 단리, 및/또는 선별된 세포는 전혈 샘플, 버피 코트 샘플, 말초 혈액 단핵구 세포 (PBMC) 샘플, 분별되지 않은 T 세포 샘플, 림프구 샘플, 백혈구 샘플, 성분채집 생성물, 또는 백혈구성분채집 생성물이거나, 또는 이를 포함할 수 있다. 샘플은 세포 요법, 예컨대, 입양 세포 요법의 맥락에서, 자가 및 동종이계 공급원으로부터 유래된 샘플을 포함한다.
일부 구현예에서, 세포는 세포주 (예컨대, T 세포주)로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 세포는 이종 공급원, 예컨대 마우스, 래트, 비인간 영장류 및 돼지로부터 수득된다.
일부 구현예에서, 세포 또는 세포 조성물, 예를 들어, T 림프구 또는 CD4+ T 세포 조성물 및/또는 CD8+ T 세포 조성물의 단리는 하나 이상의 제조 및/또는 비-친화성 기반의 세포 분리 단계를 포함한다. 일부 예시에서, 세포는 세척되고, 원심 분리되며 및/또는 하나 이상의 시약 존재하에서, 예컨대 원치 않는 성분을 제거하고 원하는 성분을 풍부하게 하고, 특정 시약에 민감한 세포를 용해 또는 제거하기 위하여 인큐베이션된다. 일부 예시에서, 세포는 하나 이상의 성질, 예컨대 밀도, 부착 성질, 크기, 민감성 및/또는 특정 성분에 대한 내성에 기초하여 분리된다.
일부 예시에서, 환자의 순환 혈액의 세포는, 예컨대 성분채집술 또는 백혈구성분채집술에 의해 수득된다. 일부 양태에서, 샘플은 T 세포, 단핵구, 과립구, B 세포, 기타 유핵 백혈구, 적혈구 및/또는 혈소판을 비롯한 림프구를 포함하고, 일부 양태에서 적혈구 및 혈소판 이외의 세포를 함유한다.
일부 구현예에서, 상기 대상체로부터 채취된 혈액 세포는, 예컨대 혈장 부분을 제거하고 세포를 후속 공정 단계를 위해 적절한 완충액 또는 배지에 위치시키기 위하여 세척된다. 일부 구현예에서, 세포는 인산 완충 식염수 (PBS)로 세척된다. 일부 구현예에서, 상기 세척 용액은 칼슘 및/또는 마그네슘 및/또는 다수의 또는 모든 2가 양이온을 가지지 않는다. 일부 양태에서, 세척 단계는 반-자동 "플로우-스루" 원심 분리기 (예컨대, Cobe 2991 세포 프로세서, Baxter)를 제조사의 지침에 따라 수행된다. 일부 양태에서, 세척 단계는 상기 제조사의 지침에 따른 접선 유동 여과 (tangential flow filtration; TFF)에 의해 수행된다. 일부 구현예에서, 세포는 세척 후 다양한 생체 적합성 완충액, 예를 들어 Ca++/Mg++ 없는 PBS에 재현탁된다. 특정 구현예에서, 혈액 세포 샘플의 성분은 제거되고 세포는 배양 배지에 직접 재현탁된다.
일부 구현예에서, 상기 방법은 적혈구를 용해시켜 퍼콜 (Percoll) 또는 피콜 (Ficoll) 구배를 통해 원심 분리하여 말초 혈액으로부터 백혈구를 제조하는 것과 같은 밀도-기반 세포 분리 방법을 포함한다.
일부 구현예에서, 단리 방법은 표면 마커, 예컨대 표면 단백질, 세포 내 마커 또는 핵산과 같은 하나 이상의 특정 분자의 세포에서의 발현 또는 존재에 기초한 상이한 세포 유형의 분리를 포함한다. 일부 구현예에서, 이러한 마커에 기초한 임의의 공지된 분리 방법이 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 분리는 친화성- 또는 면역친화성- 기반 분리이다. 예를 들어, 일부 양태에서, 상기 단리는 세포의 발현 또는 하나 이상의 마커, 전형적으로 세포 표면 마커의 발현 수준에 기초한 세포 및 세포 집단의 분리를 포함하며, 예컨대 상기 분리는 이러한 마커에 특이적으로 결합하는 항체 또는 결합 파트너와의 배양에 의해 이루어지고, 뒤이어 일반적으로 세척 단계 및 상기 항체 또는 결합 파트너에 결합된 세포를 상기 항체 또는 결합 파트너에 결합되지 않은 세포로부터 분리하는 단계를 거친다.
이러한 분리 단계는 시약에 결합된 세포가 추가적인 사용을 위해 유지된 양성 선별, 및/또는 항체 또는 결합 파트너에 결합되지 않은 세포가 유지된 음성 선별에 기초할 수 있다. 일부 예시에서, 두 분획은 모두 추가적인 사용을 위해 유지된다. 일부 양태에서, 음성 선택은 이종 집단에서 세포 유형을 특이적으로 식별하는 이용 가능한 항체가 없는 경우에 특히 유용하여, 분리는 원하는 집단 이외의 세포에 의해 발현되는 마커에 기초하여 수행되는 것이 가장 바람직하다.
분리는 특정 마커를 발현하는 특정 세포 집단 또는 세포의 100% 농축 또는 제거를 초래할 필요는 없다. 예를 들어, 마커를 발현하는 세포와 같은 특정 유형의 세포에 대한 양성 선별 또는 농축은, 이러한 세포의 수 또는 퍼센트를 증가시키는 것을 의미하지만, 마커를 발현하지 않는 세포의 완전한 부재를 초래할 필요는 없다. 마찬가지로, 마커를 발현하는 세포와 같은 특정 유형의 세포의 음성 선별, 제거 또는 고갈은, 이러한 세포의 수 또는 퍼센트를 감소시키는 것을 의미하지만, 이러한 모든 세포의 완전한 제거를 초래할 필요는 없다.
일부 예시에서, 하나의 단계로부터 양성 또는 음성으로 선택된 분획이 연속된 양성 선별 또는 음성선택과 같은 또 다른 분리 단계를 거치는 분리 단계의 다중 라운드가 수행된다. 일부 예시에서, 단일 분리 단계는 예컨대 세포를 다수의 항체 또는 결합 파트너와 함께 배양함으로써 다중 마커를 동시에 발현하는 세포를 고갈시킬 수 있으며, 각각은 음성선택에 대해 표적화된 마커에 특이적이다. 마찬가지로, 여러 세포 유형은, 세포를 다양한 세포 유형에서 발현되는 다수의 항체 또는 결합 파트너와 함께 배양함으로써 동시에 양성 선택될 수 있다.
예를 들어, 일부 양태에서, T 세포의 특정 서브집단 또는 서브유형, 예컨대 CD4+ T 세포 및/또는 CD8+ T 세포는 양성 또는 음성 선별 기법에 의해 단리된다. 특정 구현예에서, CD4+ T 세포 및/또는 CD4+ T 세포의 또는 이를 포함하는 세포 조성물은 양성 또는 음성 선별 기법에 의해 단리된다. 구체적인 구현예에서, CD8+ T 세포 및/또는 CD8+ T 세포의 또는 이를 포함하는 세포 조성물은 양성 또는 음성 선별 기법에 의해 단리된다. 구체적인 구현예에서, CD4+ T 세포의 조성물 및/또는 CD8+ T 세포의 조성물은 양성 또는 음성 선별 기법에 의해 단리된다.
일부 구현예에서, 단리는 양성 선별에 의한 특정 세포 집단의 농축, 또는 음성선택에 의한 특정 세포 집단의 고갈에 의해 수행된다. 일부 구현예에서, 양성 또는 음성 선별은, 세포를 각각 양성 또는 음성으로 선택된 세포 상에 발현된 (marker+ 또는 marker+) 또는 상대적으로 높은 수준으로 발현된 (markerhigh) 하나 이상의 표면 마커와 특이적으로 결합하는 하나 이상의 항체 또는 기타 결합제와 함께 인큐베이션함으로써 수행된다.
일부 구현예에서, T 세포는 비-T 세포, 예컨대 B 세포, 단핵구 또는 CD14 등의 기타 백혈구에서 발현된 마커의 음성선택에 의해 PBMC 샘플로부터 분리된다. 일부 양태에서, CD4+ 또는 CD8+ 선별 단계는 CD4+ 헬퍼 및 CD8+ 세포독성 T 세포를 분리하도록 사용된다. 이러한 CD4+ 및 CD8+ 조성물은 마커의 양성 또는 음성 발현 및/또는 마커의 상대적인 발현 수준에 기초하여 추가적으로 분류 또는 구분될 수 있는 세포를 포함할 수 있다. 이러한 서브유형은 나이브, 나이브-유사, 및/또는 비-나이브 서브유형 또는 서브집단을 포함할 수 있다.
특정 구현예에서, CD4+ T 세포, 예를 들어, CD4+ T 보조 세포는 세포 표면 항원을 가지는 세포 집단을 식별함으로써 나이브 및/또는 나이브-유사, 및 비-나이브 및/또는 비-나이브-유사 세포로 분류될 수 있다. 구체적인 구현예에서, CD8+ T 세포, 예를 들어, CD8+ T 보조 세포는 세포 표면 항원을 가지는 세포 집단을 식별함으로써 나이브 및/또는 나이브-유사, 및 비-나이브 및/또는 비-나이브-유사 세포로 분류될 수 있다.
특정 구현예에서, T 림프구는 면역자기성 (또는 친화성자기성) 분리 기법을 사용하여 분리 또는 단리된다. 구체적인 구현예에서, CD4+ T 세포 및/또는 CD4+ T 세포의 조성물은 면역자기성 분리 기법을 사용하여 분리 또는 단리된다. 일부 구현예에서, CD8+ T 세포 및/또는 CD8+ T 세포의 조성물은 면역자기성 분리 기법을 사용하여 분리 또는 단리된다. 면역 자기성 (또는 친화성 자기성) 분리 기법을 사용한 분리 및 단리는 [Molecular Medicine, vol. 58: Metastasis Research Protocols, Vol. 2: Cell Behavior In Vitro and In Vivo, p 17-25 Edited by: S. A. Brooks and U. Schumacher ⓒ Humana Press Inc., Totowa, NJ]에서 검토된다.
일부 양태에서, 분리될 세포의 샘플 또는 조성물은 상자성 비드 (예컨대, Dynalbeads 또는 MACS 비드)와 같은 자기적 반응 입자 또는 미세 입자 등의 작고 자화가능하거나 자기적 반응 물질과 함께 배양된다. 자기적 반응 물질, 예컨대 입자는 일반적으로 세포, 세포들 또는 세포 집단상에 존재하는 분자, 예컨대 표면 마커에 특이적으로 결합하는 결합 파트너, 예컨대 항체에 직접적으로 또는 간접적으로 부착되고, 이는 분리, 예컨대 음성적으로 또는 양성적으로 선택하는 것이 바람직하다.
일부 구현예에서, 자성 입자 또는 비드는 특이적 결합 구성원, 예컨대 항체 또는 기타 결합 파트너에 결합된 자기적 반응 물질을 포함한다. 자성 분리 방법에서 사용되는 공지된 자기적 반응 물질들이 많이 있다. 적합한 자성 입자는 Molday의 미국 특허 4,452,773, 및 유럽 특허 EP 452342B에 기술된 입자를 포함하며, 상기 특허는 본 명세서에 참조로 포함된다. Owen의 미국 특허 4,795,698 및 Liberti et al.의 미국 특허 5,200,084에 기술된 입자와 같은 콜로이드 크기의 입자가 기타 예시이다.
인큐베이션 단계는 일반적으로, 항체 또는 결합 파트너, 또는 자성 입자 또는 비드에 부착된 그러한 항체 또는 결합 파트너에 특이적으로 결합하는 2차 항체 또는 기타 시약 등의 분자가, 샘플 내 세포에 존재한다면 세포 표면 분자에 특이적으로 결합하는 조건하에서 수행된다.
일부 양태에서, 샘플은 자기장 내에 배치되고, 자기적 반응 또는 자화 가능 입자들이 부착된 세포는 자석에 끌려서 표지되지 않은 세포들부터 분리될 것이다. 양성 선별의 경우, 자석에 끌리는 세포들이 유지되고; 음성 선별의 경우, 끌리지 않는 세포들 (표지되지 않은 세포)이 유지된다. 일부 양태에서, 양성 선별 및 음성 선별의 조합은 양성 및 음성 분획이 유지되고 추가로 가공되거나 추가적인 분리 단계에 종속되는 동일한 선택 단계 중에 수행된다.
특정 구현예에서, 자기적 반응 입자들은 1차 항체 또는 기타 결합 파트너, 2차 항체, 렉틴, 효소 또는 스트렙타비딘에서 코팅된다. 특정 구현예에서, 자성 입자들은 하나 이상의 마커에 특이적인 1차 항체의 코팅을 통해 세포들에 부착된다. 특정 구현예에서, 비드보다는 세포가 1차 항체 또는 결합 파트너로 표지되고, 이어서 세포-유형 특이적 2차 항체- 또는 기타 결합 파트너 (예컨대, 스트렙타비딘)-코팅된 자성 입자가 첨가된다. 특정 구현예에서, 스트렙타비딘-코팅된 자성 입자는 비오틴화된 1차 또는 2차 항체와 함께 사용된다.
일부 구현예에서, 자기적 반응 입자들은 후속적으로 배양 및/또는 조작되는 세포들에 부착된 채로 남고; 일부 양태에서, 입자들은 환자에게 투여되기 위해 세포에 부착된 채로 남는다. 일부 구현예에서, 자화 가능 또는 자기적 반응 입자들은 세포들로부터 제거된다. 세포로부터 자화 가능한 입자들을 제거하는 방법은 공지되어 있으며, 예컨대 경쟁적 비표지된 항체, 및 자화 가능한 입자 또는 절단 가능한 링커에 컨쥬게이션된 항체를 포함한다. 일부 구현예에서, 일부 구현예에서, 자화 가능한 입자들은 생분해성이다.
일부 구현예에서, 친화성-기반의 선별은 자성-활성화된 세포 분류 (MACS) (Miltenyi Biotec, Auburn, CA)를 통해 이루어진다. Magnetic Activated Cell Sorting (MACS) 시스템은 자성 입자가 부착된 세포들을 고순도로 선별할 수 있다. 특정 구현예에서, MACS는 비-표적 종 및 표적 종이 외부 자기장의 적용 이후 순차적으로 용출되는 모드로 작동한다. 즉, 자화된 입자들에 부착된 세포들은 부착되지 않은 종들이 용출되는 동안 제 위치에 유지된다. 이어서, 이 제1 용출 단계가 완료된 이후, 자기장에 포획되어 용출되는 것이 방지된 종은 용출 및 회수할 수 있는 어떤 방법으로 유리된다. 특정 구현예에서, 비-표적 세포는 표지되고 세포의 이종 집단으로부터 고갈된다.
특정 구현예에서, 단리 또는 분리는 단리, 세포 제조, 분리, 가공, 인큐베이션, 배양 및/또는 제형 단계 중 하나 이상을 수행하는 시스템, 기구 또는 장치를 사용하여 수행된다. 일부 양태에서, 시스템은 밀폐되거나 멸균 환경에서 이러한 각 단계를 수행하기 위해, 예컨대 에러, 사용자 처리 및/또는 오염을 최소화하기 위해 사용된다. 한 예시에서, 한 예에서, 시스템은 국제 특허 출원 WO2009/072003 또는 US 20110003380 A1에 기술된 시스템이다.
일부 구현예에서, 시스템 또는 장치는 통합 또는 자체 내장 시스템에서, 및/또는 자동화되거나 프로그램 가능한 방식으로, 예컨대 모든 분리, 가공, 조작 및 제형 단계 중 하나 이상을 수행한다. 일부 양태에서, 시스템 또는 장치는 사용자가 가공, 단리, 조작 및 제제화 단계의 결과를 프로그램, 제어, 평가하고, 및/또는 다양한 양상들을 조정할 수 있도록 하는 시스템 또는 장치와 통신하는 컴퓨터 및/또는 컴퓨터 프로그램을 포함한다.
일부 양태에서, 분리 및/또는 기타 단계는 CliniMACS 시스템 (Miltenyi Biotec)을 사용하여 수행되고, 예컨대 닫힌 무균 시스템에서 임상 규모 수준의 세포의 자동 분리를 위해 수행된다. 구성 요소들은 통합 마이크로컴퓨터, 자기 분리 유닛, 연동 펌프 및 다양한 핀치 밸브을 포함할 수 있다. 통합 컴퓨터는 일부 양태에서 기구의 모든 구성 요소를 제어하고, 표준화된 순서로 반복적인 절차를 수행하도록 시스템에 지시하다. 자기 분리 유닛은 일부 양태에서 이동 가능한 영구 자석 및 선택 칼럼을 위한 홀더를 포함한다. 연동 펌프는 튜빙 세트 전체의 유속을 제어하며, 핀치 밸브와 함께 시스템을 통한 완충액의 제어된 흐름 및 세포의 지속적인 서스펜션을 보장한다.
CliniMACS 시스템은 일부 양태에서 멸균된 비-발열성 용액으로 공급되는 항체 결합 자화 가능 입자를 사용한다. 일부 구현예에서, 자성 입자로 세포를 표지한 이후 세포를 세척하여 과량의 입자를 제거한다. 세포 제조 백은 이후 튜빙 세트에 연결되고, 완충액과 세포 채취 백에 차례로 연결된다. 튜빙 세트는 예비-칼럼과 분리 칼럼을 포함하여 미리 조립된 무균 튜빙으로 구성되어 있으며 일회용으로만 사용된다. 분리 프로그램의 개시 후, 시스템은 자동으로 세포 샘플을 분리 칼럼에 도포시킨다. 표지된 세포들은 칼럼 내에 유지되는 반면, 표지되지 않은 세포들은 일련의 세척 단계에 의해 제거된다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 방법과 함께 사용하기 위한 세포 집단은 표지되지 않고 칼럼에 유지되지 않는다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 방법과 함께 사용하기 위한 세포 집단은 표지되고 칼럼에 유지된다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 방법과 함께 사용하기 위한 세포 집단은 자기장의 제거 이후 칼럼으로부터 용출되어 세포 채취 백 내에 수집된다.
특정 구현예에서, 분리 및/또는 기타 단계는 CliniMACS Prodigy 시스템 (Miltenyi Biotec)을 사용하여 수행된다. CliniMACS Prodigy 시스템은 일부 양태에서 원심 분리에 의한 세포의 자동화된 세척 및 분류를 가능하게 하는 세포 처리 일체로 장착되어 있다. CliniMACS Prodigy 시스템은 또한 공급원 세포 생성물의 육안으로 보이는 층을 식별함으로써 최적의 세포 분획 종점을 결정하는 내장 카메라 및 이미지 인식 소프트웨어를 포함할 수 있다. 예를 들어, 말초 혈액은 적혈구, 백혈구 및 혈장 층으로 자동 분리된다. CliniMACS Prodigy 시스템은 또한, 예컨대 세포 분화 및 팽창, 항원 로딩 및 수명이 긴 세포 배양 등의 세포 배양 프로토콜을 수행하는 통합 세포 배양 챔버를 포함할 수 있다. 입력 포트는 멸균 제거 및 배지의 보충을 허용할 수 있으며 통합 현미경을 사용하여 세포를 모니터할 수 있다. 예를 들어, Klebanoff et al. (2012) J Immunother. 35(9): 651-660, Terakura et al. (2012) Blood.1:72-82, and Wang et al. (2012) J Immunother. 35(9):689-701를 참조한다.
일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 세포 집단은 유동 세포 분석법을 통해 채취 및 농축 (또는 고갈)되고, 여기서 여러 세포 표면 마커에 대해 염색된 세포는 유체 줄기로 운반된다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 세포 집단은 예비 크기 (FACS) 분리를 통해 채취 및 농축 (또는 고갈)된다. 특정 구현예에서, 본 명세서에 기재된 세포 집단은 FACS-기반 검출 시스템과 함께 마이크로 전기 기계 시스템 (MEMS) 칩의 사용에 의해 채취 및 농축 (또는 고갈)된다 (예컨대, 문헌 WO 2010/033140, Cho et al. (2010) Lab Chip 10, 1567-1573; 및 Godin et al. (2008) J Biophoton. 1(5):355-376 참조). 두 경우 모두 세포를 여러 마커로 표지할 수 있어 명확한 T 세포는 고순도로 단리된다.
일부 구현예에서, 항체 또는 결합 파트너는 하나 이상의 검출 가능한 마커로 표지되어, 양성 및/또는 음성 선별을 위한 분리를 용이하게 한다. 예를 들어, 분리는 형광 표지된 항체와의 결합에 기초할 수 있다. 일부 예시에서, 하나 이상의 세포 표면 마커에 특이적인 항체 또는 기타 결합 파트너의 결합에 기초한 세포의 분리는 유체 줄기에서, 예컨대 예비 크기 (FACS) 및/또는 마이크로 전기 기계 시스템 (MEMS) 칩을 포함하는 형광 활성화 세포 분류 (FACS)를, 유동 세포 검출 시스템과 함께 조합하여 수행될 수 있다. 이러한 방법은 동시에 여러 마커에 기초한 양성 선별 및 음성 선별을 허용한다.
투입 세포 조성물
특정 구현예에서, 투입 세포 조성물을 제조 및/또는 생산하는 방법이 본 명세서에 제공된다. 특정 구현예에서, 투입 세포 조성물은 유전자 조작에 사용하기 위한 세포, 예를 들어, 재조합 단백질, 예컨대 재조합 수용체, 예를 들어, CAR을 인코딩하는 핵산으로 유전자 조작될 및/또는 재조합 단백질, 예컨대 재조합 수용체, 예를 들어, CAR을 발현하는 유전자 조작된 세포를 제조하는 공정을 거칠 세포의 조성물이다. 특정 구현예에서, 투입 조성물의 세포는 재조합 수용체을 인코딩하는 핵산으로 처리, 이와 접촉, 및/또는 이와 인큐베이션될 것이다. 특정 구현예에서, 투입 세포 조성물은 CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포를 포함한다. 구체적인 구현예에서, 투입 세포 조성물은 나이브 및/또는 나이브-유사 T 세포인 CD4+ 대 CD8+ T 세포의 특정 원하는, 고정된 및/또는 제어된 비율을 포함하는 CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포를 함유한다.
일부 구현예에서, 나이브 및/또는 나이브-유사 T 세포인 CD4+ 대 CD8+ T 세포의 원하는, 고정된, 및/또는 제어된 비율은 인큐베이션 및/또는 조작 단계 또는 다른 가공 단계의 완료 시 및/또는 해동 시 및/또는 대상체에게 투여하기 직전에, 두 가지 유형의 세포 또는 단리된 세포 집단이 투입 세포 조성물에 포함되며, 원하는, 정의된, 및/또는 제어된 비율, 또는 이의 허용되는 오차 비율 또는 차이 이내의, 조작된 CD4+ 대 CD8+ T 세포를 가지는 산출 세포 조성물을 생성하도록 설계될 때, 세포의 비율 또는 개수이다.
특정 구현예에서, 투입 세포 조성물은 비율, 예를 들어, 정의된, 제어된, 및/또는 고정된 비율의, CD4+ 나이브-유사 T 세포 대 CD8+ 나이브-유사 T 세포를 함유한다. 구체적인 구현예에서, CD4+ 나이브-유사 T 세포 대 CD8+ 나이브-유사 T 세포의 비율은 10:1 내지 0.05:1, 8:1 내지 0.1:1, 5:1 내지 0.2:1, 2.5:1 내지 0.25:1, 2.2:1 내지 0.8:1, 2:1 내지 0.5:1, 또는 1.5:1 내지 1:1이다. 구체적인 구현예에서, CD4+ 나이브-유사 T 세포 대 CD8+ 나이브-유사 T 세포의 비율은 2:1 내지 0.8:1, 1.6:1 내지 0.8:1, 1.4:1 내지 0.8:1, 1.2:1 내지 0.8:1, 또는 1.2:1 내지 0.8:1이다. 일부 구현예에서, 비율은 2.2:1 내지 0.8:1이다. 특정 구현예에서, CD4+ 나이브-유사 T 세포 대 CD8+ 나이브-유사 T 세포의 비율은 (약) 2.2:1, 2.1:1, 2.0:1, 1.9:1, 1.8:1, 1.7:1, 1.6:1, 1.5:1, 1.4:1, 1.3:1, 1.2:1, 1.1:1, 1.0:1, 0.9:1, 또는 0.8:1이다. 특정 구현예에서, 비율은 (약) 1.1:1이다.
구체적인 구현예에서, 투입 세포 조성물은 (약) 1 x 106, 5 x 106, 1 x 107, 5 x 107, 1.0 x 108, 1.1 x 108, 1.2 x 108, 1.3 x 108, 1.4 x 108, 1.5 x 108, 1.6 x 108, 1.7 x 108, 1.8 x 108, 1.9 x 108, 2.0 x 108, 2.1 x 108, 2.2 x 108, 2.3 x 108, 2.4 x 108, 2.5 x 108, 2.6 x 108, 2.7 x 108, 2.8 x 108, 2.9 x 108, 3.0 x 108, 3.5 x 108, 4.0 x 108, 4.5 x 108, 5 x 108, 5 x 108, 또는 1 x 109 개의 전체 세포 또는 전체 생존 세포의 양을 가진다. 특정 구현예에서, 투입 세포 조성물은 CD4 또는 CD8을 발현하는 (약) 1 x 106, 5 x 106, 1 x 107, 5 x 107, 1.0 x 108, 1.1 x 108, 1.2 x 108, 1.3 x 108, 1.4 x 108, 1.5 x 108, 1.6 x 108, 1.7 x 108, 1.8 x 108, 1.9 x 108, 2.0 x 108, 2.1 x 108, 2.2 x 108, 2.3 x 108, 2.4 x 108, 2.5 x 108, 2.6 x 108, 2.7 x 108, 2.8 x 108, 2.9 x 108, 3.0 x 108, 3.5 x 108, 4.0 x 108, 4.5 x 108, 5 x 108, 5 x 108, or 1 x 109 개 세포의 양을 가진다. 일부 구현예에서, 투입 세포 조성물은 (약) 1 x 106, 5 x 106, 1 x 107, 5 x 107, 1.0 x 108, 1.1 x 108, 1.2 x 108, 1.3 x 108, 1.4 x 108, 1.5 x 108, 1.6 x 108, 1.7 x 108, 1.8 x 108, 1.9 x 108, 2.0 x 108, 2.1 x 108, 2.2 x 108, 2.3 x 108, 2.4 x 108, 2.5 x 108, 2.6 x 108, 2.7 x 108, 2.8 x 108, 2.9 x 108, 3.0 x 108, 3.5 x 108, 4.0 x 108, 4.5 x 108, 5 x 108, 5 x 108, or 1 x 109 개의 나이브-유사 CD4+ 및 나이브-유사 CD8+ T 세포의 양을 가진다.
구체적인 구현예에서, 투입 세포 조성물은 1 x 106 내지 1 x 1010, 1 x 107 내지 1 x 109, 5 x 107 내지 5 x 108, 또는 1 x 108 내지 3 x 108 개의 전체 세포 또는 전체 생존 세포를 가진다. 특정 구현예에서, 투입 세포 조성물은 CD4 또는 CD8을 발현하는 (약) 1 x 106 내지 1 x 1010, 1 x 107 내지 1 x 109, 5 x 107 내지 5 x 108, 또는 1 x 108 내지 3 x 108 개의 세포의 양을 가진다. 일부 구현예에서, 투입 세포 조성물은 (약) 1 x 106 내지 1 x 1010, 1 x 107 내지 1 x 109, 5 x 107 내지 5 x 108, 또는 1 x 108 내지 3 x 108 개의 나이브-유사 CD4+ 및 나이브-유사 CD8+ T 세포의 양을 가진다.
일부 구현예에서, 투입 세포 조성물은 적어도 1%, 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70% , 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.9%, 또는 100% 또는 약 100%의 나이브-유사 세포를 가지거나, 또는 이를 포함한다. 구체적인 구현예에서, 투입 세포 조성물은 100% 미만, 99% 미만, 98% 미만, 97% 미만, 96% 미만, 95% 미만, 90%, 또는 85% 미만의 나이브-유사 세포를 함유하거나 또는 포함한다.
구체적인 구현예에서, 본 명세서에 제공되는 방법은 투입 세포 조성물의 제조, 생성, 및/또는 생산 중 하나 이상의 단계를 포함한다. 특정 구현예에서, 투입 세포 조성물의 제조, 생성, 및/또는 생산은 CD4+ T 세포 조성물의 세포와 CD8+ T 세포 조성물의 세포를 혼합 또는 조합하는 하나 이상의 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 투입 조성물의 세포, 예를 들어, CD4+ T 세포 CD8+ T 세포는 샘플, 예를 들어, 생물학적 샘플로부터 단리 및/또는 선별되었다. 특정 구현예에서, 투입 조성물의 세포 공급원은 세포의 조성물, 예를 들어, 샘플로부터 단리 및/또는 선별된, 예컨대 개별적으로 단리 또는 선별된 CD4+ 조성물 및 CD8+ T 세포 조성물이다. 구체적인 구현예에서, CD4+ T 세포의 조성물 및 CD8+ T 세포의 조성물은 샘플, 예를 들어, 생물학적 샘플로부터 단리 및/또는 선별된, 예컨대 개별적으로 단리 및/또는 선별된다. 특정 구현예에서, CD4+ T 세포의 조성물 및 CD8+ T 세포의 조성물은 동일한 샘플로부터 단리된 및/또는 선별된다. 구체적인 구현예에서, CD4+ T 세포의 조성물 및 CD8+ T 세포의 조성물은 동일한 대상체로부터 수득 또는 획득된 샘플로부터 단리된 및/또는 선별된다.
구체적인 구현예에서, CD4+ T 세포의 조성물은 적어도 60%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.9%, 또는 100% 또는 약 100%의 CD4+ T 세포를 함유 또는 포함한다. 일부 구현예에서, CD4+ T 세포의 조성물은 100% 미만, 99% 미만, 98% 미만, 97% 미만, 96% 미만, 95% 미만, 90%, 또는 85% 미만의 CD4+ T 세포를 함유하거나 또는 포함한다.
특정 구현예에서, CD8+ T 세포의 조성물은 적어도 60%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.9%, 또는 100% 또는 약 100%의 CD8+ T 세포를 함유 또는 포함한다. 구체적인 구현예에서, CD8+ T 세포의 조성물은 100% 미만, 99% 미만, 98% 미만, 97% 미만, 96% 미만, 95% 미만, 90%, 또는 85% 미만의 CD8+ T 세포를 함유하거나 또는 포함한다.
특정 구현예에서, 투입 세포 조성물의 제조, 생성, 및/또는 생산은, 예를 들어, 세포 조성물의 세포를 조합 또는 혼합하기 전, CD4+ T 세포 조성물 및/또는 CD8+ T 세포 조성물에 존재하는 생존 CD4+ T 세포 및/또는 생존 CD8+ T 세포의 양, 부분, 개수, 부피 당 개수, 중량 당 개수 및/또는 백분율을 측정, 결정, 및/또는 정량화하는 단계 중 하나 이상의 단계를 포함한다. 구체적인 구현예에서, 투입 세포 조성물의 제조, 생성, 및/또는 생산은 CD4+ T 세포 조성물 및/또는 CD8+ T 세포 조성물에 존재하는 나이브-유사 CD4+ T 세포 및/또는 나이브-유사 CD8+ T 세포의 양, 부분, 개수, 부피 당 개수, 중량 당 개수 및/또는 백분율의 측정, 결정, 및/또는 정량화하는 단계 중 하나 이상의 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 나이브-유사 CD4+ 및/또는 나이브-유사 CD8+ T 세포는 생존 나이브-유사 세포이다.
특정 구현예에서, 투입 세포 조성물의 제조, 생성, 및/또는 생산은 샘플, 예를 들어, 생물학적 샘플 내 존재하는 생존 CD4+ T 세포 및/또는 생존 CD8+ T 세포의 양, 부분, 개수, 부피 당 개수, 중량 당 개수 및/또는 백분율을 측정, 결정, 및/또는 정량화하는 단계 중 하나 이상의 단계를 포함한다 구체적인 구현예에서, 투입 세포 조성물의 제조, 생성, 및/또는 생산은 샘플 내 존재하는 나이브-유사 CD4+ T 세포 및/또는 나이브-유사 CD8+ T 세포의 양, 부분, 개수, 부피 당 개수, 중량 당 개수 및/또는 백분율을 측정, 결정, 및/또는 정량화하는 단계 중 하나 이상의 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 나이브-유사 CD4+ 및/또는 나이브-유사 CD8+ T 세포는 생존 나이브-유사 세포이다.
일부 구현예에서, 투입 조성물의 세포는 샘플, 예를 들어, 생물학적 샘플로부터 단리 및/또는 선별된다. 구체적인 구현예에서, 샘플 내 나이브-유사 세포 부분, 예를 들어, 나이브-유사 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 부분은 공지되어 있거나, 또는 결정, 측정, 또는 평가되었다. 일부 구현예에서, 샘플로부터 유래한 세포는 정의된, 고정된, 또는 제어된 나이브-유사 CD4+ T 세포 대 나이브-유사 CD8+ T 세포의 비율을 가지는 세포 조성물, 예를 들어, 투입 세포 조성물을 직접적으로 제조하기 위해 단리 및/또는 선별된다. 특정 구현예에서, 세포는 면역친화성 비드 선별로 단리 및/또는 선별된다. 일부 구현예에서, 세포는 친화도 컬럼으로 단리 및/또는 선별된다. 구체적인 구현예에서, 샘플로부터 유래한 세포는 정의된, 제어된, 및/또는 고정된 나이브-유사 CD4+ 세포 대 나이브-유사 CD8+ 세포의 비율을 가지는 세포 조성물을 제조하기 위해 WO 2015/164675에 기재된 임의의 방법에 따라 단리 또는 선별된다.
특정 구현예에서, 투입 세포 조성물은 제1 및 제2 단리 또는 선별에 의해 샘플로부터 직접적으로 단리 및/또는 선별된 세포를 함유한다. 특정 구현예에서, 투입 조성물은 정의된, 고정된, 및/또는 제어된 나이브-유사 CD4+ 대 나이브-유사 CD8+ T 세포의 비율을 제조하기에 충분한 양, 개수 또는 농도의 CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포를 단리하기 위해 제1 및 제2 선별을 수행함으로써 제조된다.
일부 구현예에서, 샘플로부터 유래한 세포는 CD4+ 세포 및 CD8+ 세포에 대해 농축된 투입 세포 조성물을 제조하기 위해 직접적으로 단리, 선별, 및/또는 농축된다. 일부 구현예에서, 나이브-유사 CD4+ 및 나이브-유사 CD8+ 세포의 양, 개수, 백분율, 부피 당 개수 및/또는 중량 당 개수는 have 샘플에서 측정, 평가, 및/또는 결정되었으며, CD4+ 및 CD8+ 세포는 정의된, 고정된, 또는 제어된 나이브-유사 CD4+ 대 나이브-유사 CD8+ T 세포 비율 을 가지는 투입 세포 조성물을 달성하기에 충분한 양으로 단리, 선별, 및/또는 농축된다. 일부 구현예에서, 샘플로부터 직접적으로 단리, 선별, 및/또는 농축된 세포는 투입 세포 조성물이며, 후속의 가공 단계, 예컨대 농축된 세포의 인큐베이션, 자극, 활성화, 조작 및/또는 제제화를 수반하는 후속 가공 단계에서 사용된다.
일부 구현예에서, 세포로부터 단리, 선별, 및/또는 농축된 세포, 예컨대 투입 세포 조성물은, 정의된, 고정된, 또는 제어된 나이브-유사 CD4+ 세포 대 나이브-유사 CD8+ 세포의 비율로 CD4+ 세포 대 CD8+ 세포의 비율을 포함한다. 본 명세서에 제공되는 방법의 구현예에서, 샘플의 제1 및/또는 제2 선별, 또는 이의 서브집단의 선별은 원하는 나이브-유사 CD4+ T 세포 대 나이브-유사 CD8+ 세포의 비율을 가지는 투입 세포 조성물을 생성하는 방식으로 수행될 수 있다.
일부 구현예에서, 샘플로부터 제1 및/또는 제2 선별을 수행하기 전, 샘플, 예를 들어, 생물학적 샘플 내 CD4+ 대 CD8+ T 세포의 비율이 결정된다. 특정 구현예에서, 제1 및/또는 제2 선별을 수행하기 전, 샘플 내 나이브-유사 CD4+ 대 나이브-유사 CD8+ T 세포의 비율이 결정된다. 샘플에 따라 달라질 수 있는, 샘플 내 CD4+ 대 CD8+ T 세포 및/또는 나이브-유사 CD4+ 대 CD8+ T 세포의 구체적인 비율에 기초하여, 특정 선별 모드는 예를 들어 크로마토그래피 컬럼의 크기, 또는 면역친화성 시약의 양 또는 농도의 선별에 따라 샘플에 대해 개별화되어, 원하는, 고정된, 또는 제어된 비율을 달성할 수 있다. 대상체 내 다양한 세포 집단의 상대적인 수준 및 빈도는 이러한 집단 또는 서브집단에 존재하는 마커 또는 마커들의 표면 발현에 대한 평가에 기초하여 결정될 수 있다. 표면 마커 또는 단백질의 발현 수준을 평가하는 다수의 공지된 방법, 예컨대 친화도-기반의 방법, 예를 들어, 면역친화성-기반의 방법, 예를 들어, 세포 표면 단백질의 맥락에서, 예컨대 유세포 분석에 의한 검출이 사용될 수 있다.
일부 맥락에서, 적절한 나이브-유사 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 비율은 상황에 따라 달라질 수 있는데, 예를 들어, 특정 질병, 병태, 또는 세포가 유도되는 대상체의 사전 치료, 및/또는 세포의 특정 항원-특이성, 특정 유형의 (예를 들어, CD4+ 세포)의 다양한 서브집단의 세포 사이의 상대적인 표현, 예를 들어, 이펙터 대 기억 대 나이브 세포, 및/또는 세포가 인큐베이션될 하나 이상의 조건, 예컨대 배지, 자극 시제, 배양 시간, 완충액, 산소 함량 이산화탄소 함량, 항원, 사이토카인, 항체, 및 다른 성분에 따라 달라질 수 있다. 이에 따라, 전형적으로 또는 일반적으로 다른 유형보다 더욱 빠르게 증식 또는 팽창하는 것으로 알려진 세포 유형이 모든 상황에서 항상 이러한 특성을 갖는 것은 아닐 수 있다. 이에 따라, 일부 양태에서, 나이브-유사 CD4+ T 세포 및 나이브-유사 CD8+ T 세포의 비율은 세포 또는 세포가 유래되는 대상체의 표현형 또는 상태에 대한 평가, 및/또는 경험적 증거와 함께, 일반적인 또는 전형적인 상황에서 세포 유형의 공지된 용량에 기초하여 결정된다.
일부 구현예에서, 분리 및/또는 단계는 면역자기성 비드를 사용하여 수행된다. 일부 구현예에서, CD4+ 및 CD8+ 세포를 함유하는 세포 샘플은 CD4 또는 CD8에 결합하는 제1 면역친화성 시약을 함유하는 자기성 비드 및 다른 CD4 또는 CD8에 결합하는 제2 면역친화성 시약을 함유하는 자기성 비드와 접촉된다. 분리 및/또는 단계는 동시에 및/또는 순차적으로 일어날 수 있다.
일부 구현예에서, 제1 및/또는 제2 면역친화성 시약은 준최적의 산출 농도로 인큐베이션 조성물 내에 존재하며, 이에 의해 농축된 조성물은 contains 인큐베이션 조성물 내 전체보다 작은, 예를 들어, 70%의 전체 CD4+ 세포 및/또는 인큐베이션 조성물 내 전체보다 작은, 예를 들어, 70%의 CD8+ 세포를 함유하여, CD4+ 및 CD8+ T 세포에 대해 농축된 조성물을 제조한다.
일부 구현예에서, 친화성 시약의 준최적의 산출 농도는 상기 시약으로의 세포를 인큐베이션하고 이러한 시약에 결합된 세포를 회수 또는 분리하는 단계를 수반하는, 주어진 선별 또는 농축에서 결합된 세포의 최적의 또는 최대의 수율을 달성하기 위해 사용되는 또는 요구되는 농도 미만의 농도이다 (“산출”은, 예를 들어, 인큐베이션에서의 페소의 전체 수와 비교하여, 시약에 의해 표적화되는 또는 시약에 대해 특이적인 또는 시약이 특이적이며 결합할 수 있는 마커커를 가지는, 이와같이 회수 또는 선별된 세포의 수). 준최적의 산출 농도는 일반적으로 이러한 공정 또는 단계가, 시약에 결합된 세포의 회수 시에 결합된 세포, 예를 들어, CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포의 전체보다 작은, 예를 들어 70% 미만의 산출을 달성하는 시약의 농도 또는 양이다. 일부 구현예에서, (약) 50 %, 45 %, 40 %, 30 %, 또는 25 % 미만의 산출은 친화성 시약의 준최적 농도에 의해 달성된다. 농도는 세포 당 입자 또는 표면의 수 또는 다수(mass) 및/또는 세포 당 시제 (예를 들어, 항체, 예컨대 항체 단편)의 다수 또는 분자의 수의 관점으로 표현될 수 있다. 구체적인 구현예에서, 준최적의 산출 농도는 고정된, 제어된, 및/또는 나이브-유사 CD4+ T 세포 대 나이브-유사 CD8+ T 세포의 정의된 비율을 유도 또는 달성하기에 충분하다.
일부 구현예에서, 예를 들어, CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포에 대한 친화성을 가지는 둘 이상 선별 시약 각각, 또는 하나 이상에 대해 준최적의 산출 농도로 작업하는 경우, 이러한 시약 중 하나 이상은, 다른 시약(들)에 의해 인식되는 세포 유형(들)과 비교하여 이러한 시약에 의해 인식되는 세포 유형의 비율을 편향시키기 위해 이러한 다른 시약(들) 중 하나 이상보다 더 높은 농도로 사용된다. 예를 들어, 비율을 편향시키기 위해 바람직한 마커에 대해 특이적으로 결합하는 시약은 다른 시약(들)과 비교하여, 비율을 증가시키는 것이 얼마나 필요한지에 따라 절반, 1 배, 2 배, 3 배, 4 배, 5 배, 10 배 이상으로 증가된 농도 (예를 들어, 세포 당 시제 또는 다수)로 포함될 수 있다.
일부 구현예에서, 준최적 범위에서 및/또는 시약 포화를 달성하기에 충분한 세포로 작업하는 경우, 면역친화성 시약의 양은 농축된 세포의 대략적인 산출량에 비례한다. 특정 구현예에서, 농축된 또는 선별된 CD4+ 및 CD8+ T 세포를 함유하는 생성된 조성물의 원하는 비율에 의존하는 면역친화성 시약의 적절한 양 또는 농도는 일상적으로 결정될 수 있다.
일부 구현예에서, 분리 및/또는 단리 단계는 면역친화성 시약이, 예컨대 WO 2015/164675에 기재된 바와 같이 스트렙타비딘 뮤테인과의 펩타이드 리간드 상호 작용을 통해 가역적으로 결합되는 자기 비드를 사용하여 수행된다. 예시적인 자기 비드는 Streptamers®이다. 일부 구현예에서, 분리 및/또는 단계는 자기 비드, 예컨대 Miltenyi Biotec으로부터 상업적으로 입수 가능한 자기 비드를 사용하여 수행된다.
일부 구현예에서, 샘플로부터 CD4+ 및 CD8+ 세포의 제1 선별 또는 농축은 면역친화성-기반의 시약을 사용하여 수행되며, 이러한 시약은 적어도 각각, 항체가 고정된 제1 및 제2 친화성 크로마토그래피 매트릭스를 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 및/또는 제2 선별 중 하나 또는 둘 모두는 복수의 친화성 크로마토그래피 매트릭스 및/또는 항체를 사용할 수 있으며, 이에 따라 동일한 선별, 즉, 제1 선별 또는 제2 선별에 사용되는 복수의 매트릭스 및/또는 항체는 직렬로 연결된다. 일부 구체예에서, 제1 및/또는 제2 선별에 사용되는 친화성 크로마토그래피 매트릭스 또는 매트릭스들은 적어도 약 50 x 106 세포/mL, 100 x 106 세포/mL, 200 x 106 세포/mL 또는 400 x 106 세포/mL를 흡착하거나, 또는 이를 선별 또는 농축할 수 있다. 일부 구현예에서, 흡착 용량은 컬럼의 직경 및/또는 길이에 기초하여 조정될 수 있다. 일부 구현예에서, 선별된 또는 농축된 조성물의 배양-개시 비율은 예를 들어, 세포를 선별하기 위한 컬럼 또는 컬럼들의 흡착 용량에 기초하여 가정할 때 배양-개시 비율을 달성하기에 충분한 양의 매트릭스 및/또는 충분한 상대량을 선택함으로써 달성된다.
하나의 예시적인 구현예에서, CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포는 나이브-유사 세포와 동일한 또는 유사한 부분을 가지며, 매트릭스 또는 매트릭스들의 흡착 용량은 제1 및 제2 선별에서 동일하여, 예를 들어 두 선별 모두에 대해 (약) 1 x 108 세포/mL이고, 이에 의해 제1 선별 및 제2 선별에서 세포의 농축 또는 선별은 나이브-유사 CD4+ 대 CD8+ T 세포의 비율이 (약) 1:1인 CD4+ 세포 대 CD8+ 세포를 함유하는 조성물을 생성한다. 구체적인 구현예에서, 나이브-유사 세포의 부분 및 생성된 투입 세포 조성물의 원하는 비율에 따라, 제1 및/또는 제2 선별에 대한 친화성 매트릭스 크로마토그래피 컬럼의 적절한 부피, 직경 또는 개수는 일상적으로 선택 또는 결정될 수 있다.
일부 구현예에서, 컬럼 매트릭스 또는 매트릭스들의 흡착 용량은 대상체로부터의 출발 샘플 내 각각의 CD4+ 또는 CD8+ 모체 집단의 세포의 빈도와 비교하여. 나이브-유사 세포, 예를 들어, 나이브 유사 CD4+ 또는 CD8+ 세포의 빈도의 차이를 설명하기 위해 조정된다. 대상체 내 다양한 세포 집단의 상대적인 수준 및 빈도는 이러한 집단 또는 서브집단에 존재하는 마커 또는 마커들의 표면 발현에 대한 평가에 기초하여 결정될 수 있다. 표면 마커 또는 단백질의 발현 수준을 평가하는 다수의 공지된 방법, 예컨대 친화도-기반의 방법, 예를 들어, 면역친화성-기반의 방법, 예를 들어, 세포 표면 단백질의 맥락에서, 예컨대 유세포 분석에 의한 검출이 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 나이브-유사 세포, 예를 들어, 나이브-유사 CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포는 세포 조성물, 예를 들어, CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포 조성물에서, 또는 샘플, 예를 들어, 생물학적 샘플에서 평가, 측정, 및/또는 검출된다. 일부 구현예에서, 나이브-유사 T 세포는 세포가 나이브 및/또는 나이브-유사 세포임을 나타내는 하나 이상의 마커의 발현에 대해 양성인 T 세포이다. 특정 구현예에서, 나이브-유사 T 세포는 T 세포에서 나이브 또는 나이브-유사 상태와 연관이 있는 마커의 발현에 대해 양성인 세포이다. 구체적인 구현예에서, 나이브-유사 T 세포는 세포가 나이브가 아님 및/또는 나이브-유사 세포가 아님을 나타내는 하나 이상의 마커의 발현에 대해 음성인 T 세포이다. 특정 구현예에서, 나이브-유사 T 세포는 T 세포에서 비-나이브 또는 비-나이브-유사 상태와 연관된 마커의 발현에 대해 음성인 세포이다. 특정 구현예에서, T 세포 내 비-나이브 또는 비-나이브-유사 상태로는, 예를 들어, 이펙터 T (TEFF) 세포, 기억 T 세포, 중추 기억 T 세포 (TCM), 이펙터 기억 T (TEM) 세포, 및 이의 조합을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
일부 구현예에서, 나이브-유사 T 세포는 세포가 나이브 및/또는 나이브-유사 세포이고, 및/또는 T 세포에서 나이브 또는 나이브-유사 상태와 연관이 있음을 나타내는 마커의 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 또는 10개 이상의 발현에 대해 양성이다. 일부 구현예에서, 마커는 세포 표면 상에서 발현된다. 특정 구현예에서, 나이브-유사 T 세포는 세포가 비-나이브 및/또는 비-나이브-유사 세포이고, 및/또는 T 세포에서 비-나이브 또는 비-나이브-유사 상태와 연관이 있음을 나타내는 마커의 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 또는 10개 이상의 발현에 대해 음성이다.
T 세포가 나이브 및/또는 나이브-유사 T 세포이고, 및/또는 T 세포에서 나이브 또는 나이브-유사 상태와 연관이 있음을 나타내는 마커로는 CD27, CD28, CD45RA, CD62L, 및/또는 CCR7을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 나이브-유사 T 세포, 예를 들어, 나이브-유사 CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포는 CD27, CD28, CD45RA, 및/또는 CCR7의 발현에 대해 양성이다. 특정 구현예에서, 나이브-유사 T 세포는 CD27, CD28, CD45RA, 및/또는 CCR7 중 하나 이상의 표면 발현에 대해 양성이다. 일부 구현예에서, 나이브-유사 T 세포, 예를 들어, 나이브-유사 CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포는 CD62L의 발현에 대해 음성이다.
세포가 비-나이브 및/또는 비-나이브-유사 T 세포이고, 및/또는 T 세포에서 비-나이브 또는 비-나이브-유사 상태와 연관이 있음을 나타내는 마커로는, CD25, CD45RO, CD56, KLRG1, 및/또는 CD95를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 나이브-유사 T 세포, 예를 들어, 나이브-유사 CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포는 CD25, CD45RO, CD56, 및/또는 KLRG1의 발현에 대해 음성이다. 구체적인 구현예에서, 나이브-유사 T 세포, 예를 들어, 나이브-유사 CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포는 비-나이브 또는 비-나이브-유사 세포와 연관된 마커의 낮은 발현을 가진다. 구체적인 구현예에서, 나이브-유사 T 세포는 CD95의 낮은 발현을 가진다. 특정 구현예에서, 나이브-유사 T 세포는 CD25, CD45RO, CD56, 및/또는 KLRG1 중 하나 이상의 표면 발현에 대해 음성이다.
일부 구체예에서, 비-나이브 또는 비-나이브-유사 세포와 연관이 있는 마커의 낮은 발현은 비-나이브-유사 세포인 세포 내 발현, 및/또는 비-나이브 및/또는 비-나이브-유사 T 세포이고, 및/또는 T 세포에서 비-나이브 또는 비-나이브-유사 상태와 연관이 있음을 나타내는 하나 이상의 마커에 대해 양성인 세포 내 발현보다 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99% 더 적은 발현이거나, 또는 이를 포함한다. 특정 구현예에서, 비-나이브 또는 비-나이브-유사 세포와 연관이 있는 마커의 낮은 발현은 이펙터 T (TEFF) 세포, 기억 T 세포, 중추 기억 T 세포 (TCM), 및/또는 이펙터 기억 T (TEM) 세포 내 마커의 발현보다 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99% 더 적은 발현이거나, 또는 이를 포함한다.
일부 구현예에서, 세포가 비-나이브 및/또는 비-나이브-유사 T 세포이고, 및/또는 T 세포에서 비-나이브 또는 비-나이브-유사 상태와 연관이 있음을 나타내는 마커로는, 하나 이상의 사이토카인을 포함한다. 예를 들어, 특정 구현예에서, 비-나이브 또는 비-나이브-유사 T 세포는 IL-2, IFN-γ, IL-4, 및 IL-10 중 하나 이상의 발현 및/또는 제조에 대해 음성이다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 사이토카인이 분비된다. 구체적인 구현예에서, 하나 이상의 사이토카인은, 예를 들어, 분비를 예방, 억제, 또는 감소시키는 시제로 치료하는 동안 또는 이후에 비-나이브-유사 T 세포에 의해 내부적으로 발현된다.
특정 구현예에서, 나이브-유사 T 세포는 CD45RA 및 CCR7의 발현, 예를 들어, 표면 발현에 대해 양성이다. 구체적인 구현예에서, 나이브-유사 CD4+ T 세포는 CD45RA 및 CCR7의 발현, 예를 들어, 표면 발현에 대해 양성이다. 일부 구현예에서, 나이브-유사 CD8+ T 세포는 CD45RA 및 CCR7의 발현, 예를 들어, 표면 발현에 대해 양성이다. 구체적인 구현예에서, 나이브-유사 T 세포는 CD45RA, CD27, 및 CCR7의 발현, 예를 들어, 표면 발현에 대해 양성이고, CD45RO의 발현, 예를 들어, 표면 발현에 대해 음성이다. 구체적인 구현예에서, 나이브-유사 CD4+ T 세포는 CD45RA, CD27, 및 CCR7의 발현, 예를 들어, 표면 발현에 대해 양성이고, CD45RO의 발현, 예를 들어, 표면 발현에 대해 음성이다. 일부 구현예에서, 나이브-유사 CD8+ T 세포는 CD45RA, CD27, 및 CCR7의 발현, 예를 들어, 표면 발현에 대해 양성이고, CD45RO의 발현, 예를 들어, 표면 발현에 대해 음성이다.
특정 구현예에서, CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포는 생존 세포이다. 특정 구현예에서, CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포는 생존 나이브-유사 세포이다. 생존 세포는 세포가 정상적인 기능적 세포 과정을 거치고 및/또는 괴사 또는 프로그램된 세포 사망을 거치는 과정하에 있지 않았거나 또는 있지 않음을 나타내는 마커의 발현에 대해 양성이다. 일부 구현예에서, 생존력은 세포의 산화환원 전위, 세포 막의 완전성, 또는 미토콘드리아의 활성 또는 기능에 의해 평가될 수 있다. 일부 구현예에서, 생존력은 세포 사망과 연관이 있는 특정 분자의 부재, 분석에서 세포 사망의 징후의 부재이다.
특정 구현예에서, 세포 생존력은 분석법으로 평가되며, 이러한 분석법으로는, 염료 흡수 분석법 (예를 들어, 칼세인 AM 분석법), XTT 세포 생존력 분석법, 및 염료 배제 분석법 (예를 들어, 트리토판 블루, 에오신, 또는 프로피듐 염료 배제 분석법)을 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 구체적인 구현예에서, 생존 세포는 세포사멸 마커, 예를 들어, 아넥신 V 또는 활성 카스파제 3 중 하나 이상에 대해 음성 발현을 가진다. 일부 구체예에서, 생존 세포는 하나 이상의 세포사멸 마커의 발현 또는 활성화에 대해 음성이며, 이러한 마커로는 카스파제, 예를 들어, 카스파제 2, 카스파제 3, 카스파제 6, 카스파제 7, 카스파제 8, 카스파제 9, 및 카스파제 10, Bcl-2 패밀리 멤버, 예를 들어, Bax, Bad, 및 Bid, 아넥신 V, 및/또는 TUNEL 염색을 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.
일부 구현예에서, 발현은 마커의 양, 수준, 농도, 및/또는 존재이거나, 또는 이를 포함한다. 구체적인 구현예에서, 마커는 폴리펩타이드이다. 일부 구현예에서, 마커는 mRNA이다. 일부 구현예에서, 발현은 폴리펩타이드, 예를 들어, 마커 폴리펩타이드의 양, 수준, 농도, 및/또는 존재이거나, 또는 이를 포함한다. 특정 구현예에서, 마커를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 예를 들어, mRNA 또는 mRNA으로부터 유래된 cDNA의 양, 수준, 농도, 및/또는 존재이다. 특정 구현예에서, 발현은 세포 표면 상에 또는 세포 막 내부에 있는 또는 발현되는 마커의 양, 수준, 농도, 및/또는 존재이거나, 또는 이를 포함한다. 특정 구현예에서, 발현은 세포 표면 상에 또는 세포 막 내부에 있는 또는 발현되는 마커의 양, 수준, 농도, 및/또는 존재이거나, 또는 이를 포함한다. 구체적인 구현예에서, 발현은 내부 발현, 예를 들어, 세포 내에, 예컨대 세포액, 핵, 소포체, 및/또는 골지체 내에서의 마커의 양, 수준, 농도, 및/또는 존재이거나, 또는 이를 포함한다.
일부 구현예에서, 마커는 시험관 내 분석을 수행함으로써 측정, 평가, 및/또는 정량화된다. 일부 예시에서, 시험관 내 분석은 면역분석, 앱타머-기반 분석, 조직학적 또는 세포학적 분석, 또는 mRNA 발현 수준 분석이다. 일부 구현예에서, 시험관 내 분석은 효소-결합 면역흡착 분석 (ELISA), 면역 블로팅, 면역 침전법, 방사 면역 분석법 (RIA), 면역 염색법, 유동 세포 측정 분석법, 표면 플라즈몬 공명 (SPR), 화학발광 분석, 측면 흐름 면역분석, 억제 분석 또는 열성 분석일 수 있다. 일부 구현예에서, 마커의 발현은 RNA-seq에 의해 측정, 평가, 및/또는 정량화된다. 구체적인 구현예에서, 마커의 발현은 면역염색 기법에 의해 측정, 평가, 및/또는 정량화된다. 구체적인 구현예에서, 마커의 발현은 유세포 분석법에 의해 측정, 평가, 및/또는 정량화된다. 일부 구현예에서, 마커의 발현은 내부 사이토카인 염색법에 의해 측정, 평가, 및/또는 정량화된다.
일부 구현예에서, 마커는 CD4+ T 세포 조성물의 세포에서 측정, 평가, 및/또는 정량화된다. 구체적인 구현예에서, 적어도 1%, 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 95%,적어도 97%, 또는 적어도 99%의 CD4+ T 세포는 나이브-유사 CD4+ T 세포이다. 특정 구현예에서, 10% 내지 50%, 20% 내지 60%, 25% 내지 75%, 30% 내지 80%, 40% 내지 90%, 50% 내지 100%, 30% 내지 50%, 40% 내지 60%, 50% 내지 70%, 60% 내지 80%, 70% 내지 90%, 80% 내지 100%, 5% 내지 25%, 25% 내지 50%, 50% 내지 75%, 또는 75% 내지 99%의 CD4+ T 세포는 나이브-유사 CD4+ T 세포이다. 특정 구현예에서, 나이브-유사 CD4+ T 세포는 생존 나이브-유사 CD4+ T 세포이다.
특정 구현예에서, 마커는 CD8+ T 세포 조성물의 세포에서 측정, 평가, 및/또는 정량화된다. 구체적인 구현예에서, 적어도 1%, 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 95%,적어도 97%, 또는 적어도 99%의 CD8+ T 세포는 나이브-유사 CD8+ T 세포이다. 특정 구현예에서, 10% 내지 50%, 20% 내지 60%, 25% 내지 75%, 30% 내지 80%, 40% 내지 90%, 50% 내지 100%, 30% 내지 50%, 40% 내지 60%, 50% 내지 70%, 60% 내지 80%, 70% 내지 90%, 80% 내지 100%, 5% 내지 25%, 25% 내지 50%, 50% 내지 75%, 또는 75% 내지 99%의 CD8+ T 세포는 나이브-유사 CD4+ T 세포이다. 특정 구현예에서, 나이브-유사 CD8+ T 세포는 생존 나이브-유사 CD8+ T 세포이다.
일부 구체예에서, CD4+ T 세포 조성물로부터의 세포는 CD8+ T 세포 조성물의 세포와, CD4+ 나이브-유사 T 세포 대 CD8+ 나이브-유사 T 세포의 비율이 10:1 내지 0.05:1, 8:1 내지 0.1:1, 5:1 내지 0.2:1, 2.5:1 내지 0.25:1, 2.2:1 내지 0.8:1, 2:1 내지 0.5:1, 또는 1.5:1 내지 1:1인 투입 세포 조성물을 제조하기에 충분한 양 및/또는 비율로 혼합 또는 조합된다. 일부 구현예에서, 세포는 CD4+ 나이브-유사 T 세포 대 CD8+ 나이브-유사 T 세포의 비율이 2.2:1 내지 0.8:1이기에 충분한 양 및/또는 비율로 혼합된다. 특정 구현예에서, 세포는 CD4+ 나이브-유사 T 세포 대 CD8+ 나이브-유사 T 세포의 비율이 (약) 2.2:1, 2.1:1, 2.0:1, 1.9:1, 1.8:1, 1.7:1, 1.6:1, 1.5:1, 1.4:1, 1.3:1, 1.2:1, 1.1:1, 1.0:1, 0.9:1, 또는 0.8:1으로 혼합 또는 조합된다. 특정 구현예에서, 세포는 (약) 1.1:1의 비율로 혼합 또는 조합된다.
일부 구체예에서, (약) 5 x 105, 1 x 106, 5 x 106, 1 x 107, 5 x 107, 1.0 x 108, 1.1 x 108, 1.2 x 108, 1.3 x 108, 1.4 x 108, 1.5 x 108, 1.6 x 108, 1.7 x 108, 1.8 x 108, 1.9 x 108, 2.0 x 108, 2.1 x 108, 2.2 x 108, 2.3 x 108, 2.4 x 108, 2.5 x 108, 2.6 x 108, 2.7 x 108, 2.8 x 108, 2.9 x 108, 3.0 x 108, 3.5 x 108, 4.0 x 108, 4.5 x 108, 5 x 108, 5 x 108, 또는 1 x 109개 양의 전체 또는 전체 생존 CD4+ T 세포는 (약) 5 x 105, 1 x 106, 5 x 106, 1 x 107, 5 x 107, 1.0 x 108, 1.1 x 108, 1.2 x 108, 1.3 x 108, 1.4 x 108, 1.5 x 108, 1.6 x 108, 1.7 x 108, 1.8 x 108, 1.9 x 108, 2.0 x 108, 2.1 x 108, 2.2 x 108, 2.3 x 108, 2.4 x 108, 2.5 x 108, 2.6 x 108, 2.7 x 108, 2.8 x 108, 2.9 x 108, 3.0 x 108, 3.5 x 108, 4.0 x 108, 4.5 x 108, 5 x 108, 5.5 x 108, 또는 1 x 109개 양의 전체 또는 전체 생존 CD8+ T 세포와 혼합 또는 조합되어 정의된 CD4+ 나이브-유사 T 세포 대 CD8+ 나이브-유사 T 세포의 비율을 가지는 투입 세포 조성물을 제조한다. 특정 구현예에서, 1 x 106 내지 1 x 1010, 1 x 107 내지 1 x 109, 5 x 107 내지 5 x 108, 또는 1 x 108 내지 3 x 108 개의 전체 또는 전체 생존 CD4+ T 세포는 (약) 1 x 106 내지 1 x 1010, 1 x 107 내지 1 x 109, 5 x 107 내지 5 x 108, 또는 1 x 108 내지 3 x 108개 양의 전체 또는 전체 생존 CD8+ T 세포와 혼합 또는 조합되어, 정의된 CD4+ 나이브-유사 T 세포 대 CD8+ 나이브-유사 T 세포의 비율을 가지는 투입 세포 조성물을 제조한다.
일부 구체예에서, (약) 5 x 105, 1 x 106, 5 x 106, 1 x 107, 5 x 107, 1.0 x 108, 1.1 x 108, 1.2 x 108, 1.3 x 108, 1.4 x 108, 1.5 x 108, 1.6 x 108, 1.7 x 108, 1.8 x 108, 1.9 x 108, 2.0 x 108, 2.1 x 108, 2.2 x 108, 2.3 x 108, 2.4 x 108, 2.5 x 108, 2.6 x 108, 2.7 x 108, 2.8 x 108, 2.9 x 108, 3.0 x 108, 3.5 x 108, 4.0 x 108, 4.5 x 108, 5 x 108, 5 x 108, 또는 1 x 109개 양의 나이브-유사 CD4+ T 세포는 (약) 5 x 105, 1 x 106, 5 x 106, 1 x 107, 5 x 107, 1.0 x 108, 1.1 x 108, 1.2 x 108, 1.3 x 108, 1.4 x 108, 1.5 x 108, 1.6 x 108, 1.7 x 108, 1.8 x 108, 1.9 x 108, 2.0 x 108, 2.1 x 108, 2.2 x 108, 2.3 x 108, 2.4 x 108, 2.5 x 108, 2.6 x 108, 2.7 x 108, 2.8 x 108, 2.9 x 108, 3.0 x 108, 3.5 x 108, 4.0 x 108, 4.5 x 108, 5 x 108, 5.5 x 108, 또는 1 x 109개 양의 나이브-유사 CD8+ T 세포와 혼합 또는 조합되어 정의된 CD4+ 나이브-유사 T 세포 대 CD8+ 나이브-유사 T 세포의 비율을 가지는 투입 세포 조성물을 제조한다. 특정 구현예에서, 5 x 105 내지 1 x 1010, 1 x 106 내지 1 x 1010, 1 x 107 내지 1 x 109, 5 x 107 내지 5 x 108, 또는 1 x 108 내지 3 x 108 개의 나이브-유사 CD4+ T 세포는 (약) 5 x 105 내지 1 x 1010, 1 x 106 내지 1 x 1010, 1 x 107 내지 1 x 109, 5 x 107 내지 5 x 108, 또는 1 x 108 내지 3 x 108개 양의 나이브-유사 CD8+ T 세포와 혼합 또는 조합되어, 정의된 CD4+ 나이브-유사 T 세포 대 CD8+ 나이브-유사 T 세포의 비율을 가지는 투입 세포 조성물을 제조한다.
구체적인 구현예에서, 투입 세포 조성물의 나이브-유사 CD4+ T 세포 대 나이브-유사 CD8+ T 세포의 비율은 샘플, 예를 들어, 생물학적 샘플의 나이브-유사 CD4+ T 세포 대 나이브-유사 CD8+ T 세포의 비율과 비교하여 조정, 변화, 및/또는 변경되었다. 구체적인 구현예에서, 나이브-유사 CD4+ T 세포 대 나이브-유사 CD8+ T 세포의 비율은 생물학적 샘플으로부터 (약) 적어도 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 100%, 1 배, 1.5 배, 2 배, 2.5 배, 3 배, 4 배, 5 배, 10 배, 20 배, 50 배, 100 배로 조정, 변화, 또는 변경된다. 특정 구현예에서, 샘플은 투입 세포 조성물의 세포가 유래, 단리, 선별, 및/또는 획득된 샘플이다.
특정 구현예에서, 투입 세포 조성물은 비율, 예를 들어, 정의된, 제어된, 및/또는 고정된 비율의 CD45RA+/CCR7+/CD4+ T 세포 대 CD45RA+/CCR7+/CD8+ T 세포를 포함한다. 구체적인 구현예에서, CD45RA+/CCR7+/CD4+ T 세포 대 CD45RA+/CCR7+/CD8+ T 세포의 비율은 10:1 내지 0.05:1, 8:1 내지 0.1:1, 5:1 내지 0.2:1, 2.5:1 내지 0.25:1, 2.2:1 내지 0.8:1, 2:1 내지 0.5:1, 또는 1.5:1 내지 1:1이다. 구체적인 구현예에서, CD45RA+/CCR7+/CD4+ T 세포 대 CD45RA+/CCR7+/CD8+ T 세포의 비율은 2:1 내지 0.8:1, 1.6:1 내지 0.8:1, 1.4:1 내지 0.8:1, 1.2:1 내지 0.8:1, 또는 1.2:1 내지 0.8:1이다. 일부 구현예에서, 비율은 2.2:1 내지 0.8:1이다. 특정 구현예에서, CD45RA+/CCR7+/CD4+ T 세포 대 CD45RA+/CCR7+/CD8+ T 세포의 비율은 (약) 2.2:1, 2.1:1, 2.0:1, 1.9:1, 1.8:1, 1.7:1, 1.6:1, 1.5:1, 1.4:1, 1.3:1, 1.2:1, 1.1:1, 1.0:1, 0.9:1, 또는 0.8:1이다. 특정 구현예에서, 비율은 (약) 1.1:1이다.
구체적인 구현예에서, 투입 세포 조성물은 (약) 1 x 106, 5 x 106, 1 x 107, 5 x 107, 1.0 x 108, 1.1 x 108, 1.2 x 108, 1.3 x 108, 1.4 x 108, 1.5 x 108, 1.6 x 108, 1.7 x 108, 1.8 x 108, 1.9 x 108, 2.0 x 108, 2.1 x 108, 2.2 x 108, 2.3 x 108, 2.4 x 108, 2.5 x 108, 2.6 x 108, 2.7 x 108, 2.8 x 108, 2.9 x 108, 3.0 x 108, 3.5 x 108, 4.0 x 108, 4.5 x 108, 5 x 108, 5 x 108, 또는 1 x 109 개의 전체 세포 또는 전체 생존 세포의 양을 가진다. 특정 구현예에서, 투입 세포 조성물은 CD4 또는 CD8을 발현하는 (약) 5 x 105, 1 x 106, 5 x 106, 1 x 107, 5 x 107, 1.0 x 108, 1.1 x 108, 1.2 x 108, 1.3 x 108, 1.4 x 108, 1.5 x 108, 1.6 x 108, 1.7 x 108, 1.8 x 108, 1.9 x 108, 2.0 x 108, 2.1 x 108, 2.2 x 108, 2.3 x 108, 2.4 x 108, 2.5 x 108, 2.6 x 108, 2.7 x 108, 2.8 x 108, 2.9 x 108, 3.0 x 108, 3.5 x 108, 4.0 x 108, 4.5 x 108, 5 x 108, or 1 x 109 개 세포의 양을 가진다. 일부 구현예에서, 투입 세포 조성물은 (약) 5 x 105, 1 x 106, 5 x 106, 1 x 107, 5 x 107, 1.0 x 108, 1.1 x 108, 1.2 x 108, 1.3 x 108, 1.4 x 108, 1.5 x 108, 1.6 x 108, 1.7 x 108, 1.8 x 108, 1.9 x 108, 2.0 x 108, 2.1 x 108, 2.2 x 108, 2.3 x 108, 2.4 x 108, 2.5 x 108, 2.6 x 108, 2.7 x 108, 2.8 x 108, 2.9 x 108, 3.0 x 108, 3.5 x 108, 4.0 x 108, 4.5 x 108, 5 x 108, or 1 x 109 개의 CD45RA+/CCR7+/CD4+ 및 CD45RA+/CCR7+/CD8+ T 세포의 양을 가진다.
구체적인 구현예에서, 투입 세포 조성물은 1 x 106 내지 1 x 1010, 1 x 107 내지 1 x 109, 5 x 107 내지 5 x 108, 또는 1 x 108 내지 3 x 108 개의 전체 세포 또는 전체 생존 세포를 가진다. 특정 구현예에서, 투입 세포 조성물은 CD4 또는 CD8을 발현하는 (약) 5 x 105 내지 1 x 1010, 1 x 106 내지 1 x 1010, 1 x 107 내지 1 x 109, 5 x 107 내지 5 x 108, 또는 1 x 108 내지 3 x 108 개의 세포의 양을 가진다. 일부 구현예에서, 투입 세포 조성물은 (약) 5 x 105 내지 1 x 1010, 1 x 106 내지 1 x 1010, 1 x 107 내지 1 x 109, 5 x 107 내지 5 x 108, 또는 1 x 108 내지 3 x 108 개의 CD45RA+/CCR7+/CD4+ 및 CD45RA+/CCR7+/CD8+ T 세포의 양을 가진다.
일부 구현예에서, 투입 세포 조성물은 적어도 1%, 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70% , 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.9%, 또는 100% 또는 약 100% CD45RA+/CCR7+ 세포를 가지거나, 또는 이를 포함한다. 구체적인 구현예에서, 투입 세포 조성물은 100% 미만, 99% 미만, 98% 미만, 97% 미만, 96% 미만, 95% 미만, 90%, 또는 85% 미만의 CD45RA+/CCR7+ 세포를 함유하거나 또는 포함한다.
일부 구체예에서, (약) 5 x 105, 1 x 106, 5 x 106, 1 x 107, 5 x 107, 1.0 x 108, 1.1 x 108, 1.2 x 108, 1.3 x 108, 1.4 x 108, 1.5 x 108, 1.6 x 108, 1.7 x 108, 1.8 x 108, 1.9 x 108, 2.0 x 108, 2.1 x 108, 2.2 x 108, 2.3 x 108, 2.4 x 108, 2.5 x 108, 2.6 x 108, 2.7 x 108, 2.8 x 108, 2.9 x 108, 3.0 x 108, 3.5 x 108, 4.0 x 108, 4.5 x 108, 5 x 108, 5 x 108, 또는 1 x 109개 양의 전체 또는 전체 생존 CD4+ T 세포는 (약) 5 x 105, 1 x 106, 5 x 106, 1 x 107, 5 x 107, 1.0 x 108, 1.1 x 108, 1.2 x 108, 1.3 x 108, 1.4 x 108, 1.5 x 108, 1.6 x 108, 1.7 x 108, 1.8 x 108, 1.9 x 108, 2.0 x 108, 2.1 x 108, 2.2 x 108, 2.3 x 108, 2.4 x 108, 2.5 x 108, 2.6 x 108, 2.7 x 108, 2.8 x 108, 2.9 x 108, 3.0 x 108, 3.5 x 108, 4.0 x 108, 4.5 x 108, 5 x 108, 5.5 x 108, 또는 1 x 109개 양의 전체 또는 전체 생존 CD8+ T 세포와 혼합 또는 조합되어, 정의된 CD45RA+/CCR7+/CD4+ T 세포 대 CD45RA+/CCR7+/CD8+ T 세포의 비율을 가지는 투입 세포 조성물을 제조한다. 특정 구현예에서, 5 x 105 내지 1 x 1010, 1 x 106 내지 1 x 1010, 1 x 107 내지 1 x 109, 5 x 107 내지 5 x 108, 또는 1 x 108 내지 3 x 108 개의 전체 또는 전체 생존 CD4+ T 세포는 (약) 5 x 105 내지 1 x 1010, 1 x 106 내지 1 x 1010, 1 x 107 내지 1 x 109, 5 x 107 내지 5 x 108, 또는 1 x 108 내지 3 x 108개 양의 전체 또는 전체 생존 CD8+ T 세포와 혼합 또는 조합되어, 정의된 CD45RA+/CCR7+/CD4+ T 세포 대 CD45RA+/CCR7+/CD8+ T 세포의 비율을 가지는 투입 세포 조성물을 제조한다.
구체적인 구현예에서, 투입 세포 조성물의 CD45RA+/CCR7+/CD4+ T 세포 대 CD45RA+/CCR7+/CD8+ T 세포의 비율은 샘플, 예를 들어, 생물학적 샘플의 CD45RA+/CCR7+/CD4+ T 세포 대 CD45RA+/CCR7+/CD8+ T 세포의 비율과 비교하여 조정, 변화, 및/또는 변경되었다. 구체적인 구현예에서, CD45RA+/CCR7+/CD4+ T 세포 대 CD45RA+/CCR7+/CD8+ T 세포의 비율은 생물학적 샘플으로부터 (약) 적어도 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 100%, 1 배, 1.5 배, 2 배, 2.5 배, 3 배, 4 배, 5 배, 10 배, 20 배, 50 배, 100 배로 조정, 변화, 또는 변경된다. 특정 구현예에서, 샘플은 투입 세포 조성물의 세포가 유래, 단리, 선별, 및/또는 획득된 샘플이다.
특정 구현예에서, 투입 세포 조성물은 비율, 예를 들어, 정의된, 제어된, 및/또는 고정된 비율의 CD27+/CCR7+/CD4+ T 세포 대 CD27+/CCR7+/CD8+ T 세포를 포함한다. 구체적인 구현예에서, CD27+/CCR7+/CD4+ T 세포 대 CD27+/CCR7+/CD8+ T 세포의 비율은 10:1 내지 0.05:1, 8:1 내지 0.1:1, 5:1 내지 0.2:1, 2.5:1 내지 0.25:1, 2.2:1 내지 0.8:1, 2:1 내지 0.5:1, 또는 2:1 내지 1:1이다. 구체적인 구현예에서, CD27+/CCR7+/CD4+ T 세포 대 CD27+/CCR7+/CD8+ T 세포의 비율은 2:1 내지 0.8:1, 1.8:1 내지 1:1, 1.8:1 내지 1.2:1, 1.2:1 내지 1.4:1, 또는 1.8:1 내지 1.6:1이다. 일부 구현예에서, 비율은 1.8:1 내지 1.6:1이다. 특정 구현예에서, CD27+/CCR7+/CD4+ T 세포 대 CD27+/CCR7+/CD8+ T 세포의 비율은 (약) 2.2:1, 2.1:1, 2.0:1, 1.9:1, 1.8:1, 1.7:1, 1.69:1, 1.6:1, 1.5:1, 1.4:1, 또는 1.3:1이다. 특정 구현예에서, 비율 (약) 1.69:1이다.
구체적인 구현예에서, 투입 세포 조성물은 (약) 1 x 106, 5 x 106, 1 x 107, 5 x 107, 1.0 x 108, 1.1 x 108, 1.2 x 108, 1.3 x 108, 1.4 x 108, 1.5 x 108, 1.6 x 108, 1.7 x 108, 1.8 x 108, 1.9 x 108, 2.0 x 108, 2.1 x 108, 2.2 x 108, 2.3 x 108, 2.4 x 108, 2.5 x 108, 2.6 x 108, 2.7 x 108, 2.8 x 108, 2.9 x 108, 3.0 x 108, 3.5 x 108, 4.0 x 108, 4.5 x 108, 5 x 108, 5 x 108, 또는 1 x 109 개의 전체 세포 또는 전체 생존 세포의 양을 가진다. 특정 구현예에서, 투입 세포 조성물은 CD4 또는 CD8을 발현하는 (약) 5 x 105, 1 x 106, 5 x 106, 1 x 107, 5 x 107, 1.0 x 108, 1.1 x 108, 1.2 x 108, 1.3 x 108, 1.4 x 108, 1.5 x 108, 1.6 x 108, 1.7 x 108, 1.8 x 108, 1.9 x 108, 2.0 x 108, 2.1 x 108, 2.2 x 108, 2.3 x 108, 2.4 x 108, 2.5 x 108, 2.6 x 108, 2.7 x 108, 2.8 x 108, 2.9 x 108, 3.0 x 108, 3.5 x 108, 4.0 x 108, 4.5 x 108, 5 x 108, or 1 x 109 개 세포의 양을 가진다. 일부 구현예에서, 투입 세포 조성물은 (약) 5 x 105, 1 x 106, 5 x 106, 1 x 107, 5 x 107, 1.0 x 108, 1.1 x 108, 1.2 x 108, 1.3 x 108, 1.4 x 108, 1.5 x 108, 1.6 x 108, 1.7 x 108, 1.8 x 108, 1.9 x 108, 2.0 x 108, 2.1 x 108, 2.2 x 108, 2.3 x 108, 2.4 x 108, 2.5 x 108, 2.6 x 108, 2.7 x 108, 2.8 x 108, 2.9 x 108, 3.0 x 108, 3.5 x 108, 4.0 x 108, 4.5 x 108, 5 x 108, or 1 x 109 개의 CD27+/CCR7+/CD4+ 및 CD27+/CCR7+/CD8+ T 세포의 양을 가진다.
구체적인 구현예에서, 투입 세포 조성물은 1 x 106 내지 1 x 1010, 1 x 107 내지 1 x 109, 5 x 107 내지 5 x 108, 또는 1 x 108 내지 3 x 108 개의 전체 세포 또는 전체 생존 세포를 가진다. 특정 구현예에서, 투입 세포 조성물은 CD4 또는 CD8을 발현하는 (약) 5 x 105 내지 1 x 1010, 1 x 106 내지 1 x 1010, 1 x 107 내지 1 x 109, 5 x 107 내지 5 x 108, 또는 1 x 108 내지 3 x 108 개의 세포의 양을 가진다. 일부 구현예에서, 투입 세포 조성물은 (약) 5 x 105 내지 1 x 1010, 1 x 106 내지 1 x 1010, 1 x 107 내지 1 x 109, 5 x 107 내지 5 x 108, 또는 1 x 108 내지 3 x 108 개의 CD27+/CCR7+/CD4+ 및 CD27+/CCR7+/CD8+ T 세포의 양을 가진다.
일부 구현예에서, 투입 세포 조성물은 적어도 1%, 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70% , 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.9%, 또는 100% 또는 약 100%의 CD27+/CCR7+ 세포를 가지거나, 또는 이를 포함한다. 구체적인 구현예에서, 투입 세포 조성물은 100% 미만, 99% 미만, 98% 미만, 97% 미만, 96% 미만, 95% 미만, 90%, 또는 85% 미만의 CD27+/CCR7+ 세포를 함유하거나 또는 포함한다.
일부 구체예에서, (약) 5 x 105, 1 x 106, 5 x 106, 1 x 107, 5 x 107, 1.0 x 108, 1.1 x 108, 1.2 x 108, 1.3 x 108, 1.4 x 108, 1.5 x 108, 1.6 x 108, 1.7 x 108, 1.8 x 108, 1.9 x 108, 2.0 x 108, 2.1 x 108, 2.2 x 108, 2.3 x 108, 2.4 x 108, 2.5 x 108, 2.6 x 108, 2.7 x 108, 2.8 x 108, 2.9 x 108, 3.0 x 108, 3.5 x 108, 4.0 x 108, 4.5 x 108, 5 x 108, 5 x 108, 또는 1 x 109개 양의 전체 또는 전체 생존 CD4+ T 세포는 (약) 5 x 105, 1 x 106, 5 x 106, 1 x 107, 5 x 107, 1.0 x 108, 1.1 x 108, 1.2 x 108, 1.3 x 108, 1.4 x 108, 1.5 x 108, 1.6 x 108, 1.7 x 108, 1.8 x 108, 1.9 x 108, 2.0 x 108, 2.1 x 108, 2.2 x 108, 2.3 x 108, 2.4 x 108, 2.5 x 108, 2.6 x 108, 2.7 x 108, 2.8 x 108, 2.9 x 108, 3.0 x 108, 3.5 x 108, 4.0 x 108, 4.5 x 108, 5 x 108, 5.5 x 108, 또는 1 x 109개 양의 전체 또는 전체 생존 CD8+ T 세포와 혼합 또는 조합되어, 정의된 CD27+/CCR7+/CD4+ T 세포 대 CD27+/CCR7+/CD8+ T 세포의 비율을 가지는 투입 세포 조성물을 제조한다. 특정 구현예에서, 5 x 105 내지 1 x 1010, 1 x 106 내지 1 x 1010, 1 x 107 내지 1 x 109, 5 x 107 내지 5 x 108, 또는 1 x 108 내지 3 x 108 개의 전체 또는 전체 생존 CD4+ T 세포는 (약) 5 x 105 내지 1 x 1010, 1 x 106 내지 1 x 1010, 1 x 107 내지 1 x 109, 5 x 107 내지 5 x 108, 또는 1 x 108 내지 3 x 108개 양의 전체 또는 전체 생존 CD8+ T 세포와 혼합 또는 조합되어, 정의된 CD27+/CCR7+/CD4+ T 세포 대 CD27+/CCR7+/CD8+ T 세포의 비율을 가지는 투입 세포 조성물을 제조한다.
구체적인 구현예에서, 투입 세포 조성물의 CD27+/CCR7+/CD4+ T 세포 대 CD27+/CCR7+/CD8+ T 세포의 비율은 샘플, 예를 들어, 생물학적 샘플의 CD27+/CCR7+/CD4+ T 세포 대 CD27+/CCR7+/CD8+ T 세포의 비율과 비교하여 조정, 변화, 및/또는 변경되었다. 구체적인 구현예에서, CD27+/CCR7+/CD4+ T 세포 대 CD27+/CCR7+/CD8+ T 세포의 비율은 생물학적 샘플으로부터 (약) 적어도 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 100%, 1 배, 1.5 배, 2 배, 2.5 배, 3 배, 4 배, 5 배, 10 배, 20 배, 50 배, 100 배로 조정, 변화, 또는 변경된다. 특정 구현예에서, 샘플은 투입 세포 조성물의 세포가 유래, 단리, 선별, 및/또는 획득된 샘플이다.
특정 구현예에서, 투입 세포 조성물은 비율, 예를 들어, 정의된, 제어된, 및/또는 고정된 비율의 CD62L-/CCR7+/CD4+ T 세포 대 CD62L-/CCR7+/CD8+ T 세포를 포함한다. 구체적인 구현예에서, CD62L-/CCR7+/CD4+ T 세포 대 CD62L-/CCR7+/CD8+ T 세포의 비율은 10:1 내지 0.05:1, 8:1 내지 0.1:1, 5:1 내지 0.2:1, 2.5:1 내지 0.25:1, 2.2:1 내지 0.8:1, 2:1 내지 0.5:1, 또는 1.5:1 내지 1:1이다. 구체적인 구현예에서, CD62L-/CCR7+/CD4+ T 세포 대 CD62L-/CCR7+/CD8+ T 세포의 비율은 2:1 내지 0.8:1, 1.6:1 내지 0.8:1, 1.4:1 내지 0.8:1, 1.2:1 내지 0.8:1, 또는 1.2:1 내지 0.8:1이다. 일부 구현예에서, 비율은 2.2:1 내지 0.8:1이다. 특정 구현예에서, CD62L-/CCR7+/CD4+ T 세포 대 CD62L-/CCR7+/CD8+ T 세포의 비율은 (약) 2.2:1, 2.1:1, 2.0:1, 1.9:1, 1.8:1, 1.7:1, 1.6:1, 1.5:1, 1.4:1, 1.3:1, 1.2:1, 1.1:1, 1.0:1, 0.9:1, 또는 0.8:1이다. 특정 구현예에서, 비율은 (약) 1.1:1이다.
구체적인 구현예에서, 투입 세포 조성물은 1 x 106 내지 1 x 1010, 1 x 107 내지 1 x 109, 5 x 107 내지 5 x 108, 또는 1 x 108 내지 3 x 108 개의 전체 세포 또는 전체 생존 세포를 가진다. 특정 구현예에서, 투입 세포 조성물은 CD4 또는 CD8을 발현하는 (약) 1 x 106 내지 1 x 1010, 1 x 107 내지 1 x 109, 5 x 107 내지 5 x 108, 또는 1 x 108 내지 3 x 108 개의 세포의 양을 가진다. 일부 구현예에서, 투입 세포 조성물은 (약) 1 x 106 내지 1 x 1010, 1 x 107 내지 1 x 109, 5 x 107 내지 5 x 108, 또는 1 x 108 내지 3 x 108 개의 CD62L-/CCR7+/CD4+ 및 CD62L-/CCR7+/CD8+ T 세포의 양을 가진다.
일부 구현예에서, 투입 세포 조성물은 적어도 1%, 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70% , 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.9%, 또는 100% 또는 약 100%의 CD62L-/CCR7+ 세포를 가지거나, 또는 이를 포함한다. 구체적인 구현예에서, 투입 세포 조성물은 100% 미만, 99% 미만, 98% 미만, 97% 미만, 96% 미만, 95% 미만, 90%, 또는 85% 미만의 CD62L-/CCR7+ 세포를 함유하거나 또는 포함한다.
일부 구체예에서, (약) 1 x 106, 5 x 106, 1 x 107, 5 x 107, 1.0 x 108, 1.1 x 108, 1.2 x 108, 1.3 x 108, 1.4 x 108, 1.5 x 108, 1.6 x 108, 1.7 x 108, 1.8 x 108, 1.9 x 108, 2.0 x 108, 2.1 x 108, 2.2 x 108, 2.3 x 108, 2.4 x 108, 2.5 x 108, 2.6 x 108, 2.7 x 108, 2.8 x 108, 2.9 x 108, 3.0 x 108, 3.5 x 108, 4.0 x 108, 4.5 x 108, 5 x 108, 5 x 108, 5 x 108, 또는 1 x 109개 양의 전체 또는 전체 생존 CD4+ T 세포는 (약) 1 x 106, 5 x 106, 1 x 107, 5 x 107, 1.0 x 108, 1.1 x 108, 1.2 x 108, 1.3 x 108, 1.4 x 108, 1.5 x 108, 1.6 x 108, 1.7 x 108, 1.8 x 108, 1.9 x 108, 2.0 x 108, 2.1 x 108, 2.2 x 108, 2.3 x 108, 2.4 x 108, 2.5 x 108, 2.6 x 108, 2.7 x 108, 2.8 x 108, 2.9 x 108, 3.0 x 108, 3.5 x 108, 4.0 x 108, 4.5 x 108, 5 x 108, 5.5 x 108, 5.5 x 108, 또는 1 x 109개 양의 전체 또는 전체 생존 CD8+ T 세포와 혼합 또는 조합되어, 정의된 CD62L-/CCR7+/CD4+ T 세포 대 CD62L-/CCR7+/CD8+ T 세포의 비율을 가지는 투입 세포 조성물을 제조한다. 특정 구현예에서, 1 x 106 내지 1 x 1010, 1 x 107 내지 1 x 109, 5 x 107 내지 5 x 108, 또는 1 x 108 내지 3 x 108 개의 전체 또는 전체 생존 CD4+ T 세포는 (약) 1 x 106 내지 1 x 1010, 1 x 107 내지 1 x 109, 5 x 107 내지 5 x 108, 또는 1 x 108 내지 3 x 108개 양의 전체 또는 전체 생존 CD8+ T 세포와 혼합 또는 조합되어, 정의된 CD62L-/CCR7+/CD4+ T 세포 대 CD62L-/CCR7+/CD8+ T 세포의 비율을 가지는 투입 세포 조성물을 제조한다.
구체적인 구현예에서, 투입 세포 조성물의 CD62L-/CCR7+/CD4+ T 세포 대 CD62L-/CCR7+/CD8+ T 세포의 비율은 샘플, 예를 들어, 생물학적 샘플의 CD62L-/CCR7+/CD4+ T 세포 대 CD62L-/CCR7+/CD8+ T 세포의 비율과 비교하여 조정, 변화, 및/또는 변경되었다. 구체적인 구현예에서, CD62L-/CCR7+/CD4+ T 세포 대 CD62L-/CCR7+/CD8+ T 세포의 비율은 생물학적 샘플으로부터 (약) 적어도 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 100%, 1 배, 1.5 배, 2 배, 2.5 배, 3 배, 4 배, 5 배, 10 배, 20 배, 50 배, 100 배로 조정, 변화, 또는 변경된다. 특정 구현예에서, 샘플은 투입 세포 조성물의 세포가 유래, 단리, 선별, 및/또는 획득된 샘플이다.
일부 구현예에서, 투입 세포 조성물의 제조, 생성, 및/또는 생산은 2.2:1 내지 0.8:1의 CD45RA+/CCR7+/CD4+ T 세포 대 CD45RA+/CCR7+/CD8+ T 세포의 비율을 가지는 투입 세포 조성물을 제조하기 위해 CD4+ T 세포 조성물의 세포와 CD8+ T 세포 조성물의 세포를 혼합 또는 조합하는 하나 이상의 단계를 포함한다. 구체적인 구현예에서, CD45RA+/CCR7+ 세포의 개수, 부피 당 개수, 중량 당 개수 및/또는 양, 수준, 또는 백분율은 혼합 또는 조합 이전에 CD4+ T 세포 조성물 및 CD8+ T 세포 조성물에서 측정, 평가, 및/또는 정량화된다. 일부 구현예에서, CD45RA+/CCR7+ 세포의 양, 수준, 개수, 부피 당 개수, 중량 당 개수 및/또는 백분율은 CD45RA+/CR7+ T 세포의 검출에 의해 측정, 평가, 및/또는 정량화된다. 구체적인 구현예에서, 투입 세포 조성물은 2.2:1 내지 0.8:1의 CD45RA+/CCR7+/CD4+ T 세포 대 CD45RA+/CCR7+/CD8+ T 세포의 비율을 가진다. 일부 구현예에서, 투입 세포 조성물은 (약) 1.1:1의 CD45RA+/CCR7+/CD4+ T 세포 대 CD45RA+/CCR7+/CD8+ T 세포의 비율을 가진다.
일부 구현예에서, 투입 세포 조성물의 제조, 생성, 및/또는 생산은 2.4:1 내지 1:1의 CD27+/CCR7+/CD4+ T 세포 대 CD27+/CCR7+/CD8+ T 세포의 비율을 가지는 투입 세포 조성물을 제조하기 위해 CD4+ T 세포 조성물의 세포와 CD8+ T 세포 조성물의 세포를 혼합 또는 조합하는 하나 이상의 단계를 포함한다. 구체적인 구현예에서, CD27+/CCR7+ 세포의 개수, 부피 당 개수, 중량 당 개수 및/또는 양, 수준, 또는 백분율은 혼합 또는 조합 이전에 CD4+ T 세포 조성물 및 CD8+ T 세포 조성물에서 측정, 평가, 및/또는 정량화된다. 일부 구현예에서, CD27+/CCR7+ 세포의 양, 수준, 개수, 부피 당 개수, 중량 당 개수 및/또는 백분율은 CD45RA+;CCR7+ T 세포의 검출에 의해 측정, 평가, 및/또는 정량화된다. 구체적인 구현예에서, 투입 세포 조성물은 2.4:1 내지 1:1의 CD27+/CCR7+/CD4+ T 세포 대 CD27+/CCR7+/CD8+ T 세포의 비율을 가진다. 일부 구현예에서, 투입 세포 조성물은 (약) 1.69:1의 CD27+/CCR7+/CD4+ T 세포 대 CD27+/CCR7+/CD8+ T 세포의 비율을 가진다.
일부 구현예에서, 투입 세포 조성물의 제조, 생성, 및/또는 생산은 2.2:1 내지 0.8:1의 CD62L-/CCR7+/CD4+ T 세포 대 CD62L-/CCR7+/CD8+ T 세포의 비율을 가지는 투입 세포 조성물을 제조하기 위해 CD4+ T 세포 조성물의 세포와 CD8+ T 세포 조성물의 세포를 혼합 또는 조합하는 하나 이상의 단계를 포함한다. 구체적인 구현예에서, CD62L-/CCR7+ 세포의 개수, 부피 당 개수, 중량 당 개수 및/또는 양, 수준, 또는 백분율은 혼합 또는 조합 이전에 CD4+ T 세포 조성물 및 CD8+ T 세포 조성물에서 측정, 평가, 및/또는 정량화된다. 일부 구현예에서, CD62L-/CCR7+ 세포의 양, 수준, 개수, 부피 당 개수, 중량 당 개수 및/또는 백분율은 CD62L-/CCR7+ T 세포의 검출에 의해 측정, 평가, 및/또는 정량화된다. 구체적인 구현예에서, 투입 세포 조성물은 2.2:1 내지 0.8:1의 CD62L-/CCR7+/CD4+ T 세포 대 CD62L-/CCR7+/CD8+ T 세포의 비율을 가진다. 일부 구현예에서, 투입 세포 조성물은 (약) 1.1:1의 CD62L-/CCR7/CD4+ T 세포 대 CD62L-/CCR7/CD8+ T 세포의 비율을 가진다.
일부 구현예에서, 투입 세포 조성물의 제조, 생성, 및/또는 생산은 2.2:1 내지 0.8:1의 나이브-유사 CD4+ T 세포 대 나이브-유사 CD8+ T 세포의 비율을 가지는 투입 세포 조성물을 제조하기 위해 CD4+ T 세포 조성물의 세포와 CD8+ T 세포 조성물의 세포를 혼합 또는 조합하는 하나 이상의 단계를 포함한다. 구체적인 구현예에서, 나이브-유사 세포의 개수, 부피 당 개수, 중량 당 개수 및/또는 양, 수준, 또는 백분율은 혼합 또는 조합 이전에 CD4+ T 세포 조성물 및 CD8+ T 세포 조성물에서 측정, 평가, 및/또는 정량화된다. 일부 구현예에서, 나이브-유사 세포의 양, 수준, 개수, 부피 당 개수, 중량 당 개수 및/또는 백분율은 CD45RA+;CCR7+ T 세포의 검출에 의해 측정, 평가, 및/또는 정량화된다. 구체적인 구현예에서, 투입 세포 조성물은 2.2:1 내지 0.8:1의 CD45RA+/CCR7+/CD4+ T 세포 대 CD45RA+/CCR7+/CD8+ T 세포의 비율을 가진다. 일부 구현예에서, 투입 세포 조성물은 (약) 1.1:1의 CD45RA+/CCR7+/CD4+ T 세포 대 CD45RA+/CCR7+/CD8+ T 세포의 비율을 가진다.
B. 세포의 활성화 또는 자극
일부 구현예에서, 세포는 유전자 조작에 선행하여, 이와 관련하여, 및/또는 이에 후속하여 인큐베이션 및/또는 배양된다. 특정 구현예에서, 세포는 유전자 조작 프로토콜 또는 공정과 관련된 하나 이상의 단계 이전에, 동안, 또는 직후에 인큐베이션 및/또는 배양된다. 인큐베이션 단계는 배양, 구축, 자극, 활성화 및/또는 증식을 포함할 수 있다. 배양 및/또는 조작은, 배양물 또는 배양 세포용의 배양 용기, 예컨대 유닛, 챔버, 웰, 컬럼, 튜브, 튜브 세트, 밸브, 바이알, 배양 디쉬, 백 또는 기타 컨테이너에서 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, 조성물 또는 세포는 자극 조건 또는 자극제의 존재하에서 인큐베이션된다. 이러한 조건은 집단에서 세포의 증식, 팽창, 활성화 및/또는 생존을 유도하고, 항원 노출을 모방하며, 및/또는 재조합 항원 수용체의 도입과 같은 유전자 조작을 위해 세포를 준비하도록 고안된 것들을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 명세서에 제공된 방법은 자극 또는 활성화 조건하에서 세포를 인큐베이션하는 하나 이사의 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포는 (약) 15 분, 30 분, 45 분, 60 분, 90 분, 120 분, 2 시간, 3 시간, 4 시간, 6 시간, 8 시간, 12 시간, 16 시간, 18 시간, 24 시간, 36 시간, 1 일, 2 일, 3 일, 4 일, 5 일, 6 일, 7 일, 또는 7일 이상 동안 인큐베이션된다. 일부 구현예에서, 세포는 5 분 내지 90 분, 1 시간 내지 4 시간, 2 시간 내지 8 시간, 6 시간 내지 24 시간, 12 시간 내지 48 시간, 16 시간 내지 32 시간, 18 시간 내지 30 시간, 1 일 내지 4 일, 또는 2 일 내지 7 일 동안 인큐베이션된다. 일부 구현예에서, 세포는 2 내지 15 일, 2 내지 12 일, 2 내지 10 일, 2 내지 8 일, 2 내지 6 일, 2 내지 4 일, 4 내지 12 일, 4 내지 10 일, 4 내지 8 일, 4 내지 6 일, 6 내지 12 일, 6 내지 10 일, 6 내지 8 일, 8 내지 12 일, 8 내지 10 일, 또는 10 내지 12 일 동안 인큐베이션된다.일부 구현예에서, 세포는 적어도 2 일, 3 일, 4 일, 5 일, 6 일, 7 일, 8 일, 9 일, 10 일, 11 일, 12 일, 13 일, 14 일, 또는 14일 이상 동안 인큐베이션된다.
일부 구현예에서, 세포는 유전자 전달을 위한 하나 이상의 단계를 포함하는 방법 또는 공정에 의해 유전적으로 조작된다. 일부 구현예에서, 유전자 전달은 먼저 자극 조건하에서 세포를 인큐베이션하여, 예를 들어, 증식, 생존, 및/또는 활성화와 같은 반응을 유도하는 자극으로 세포를 인큐베이션하여 세포를 자극한 후, 유전자 전달에 의해 달성된다. 일부 구현예에서, 세포는 유전자 전달 전에 세포를 활성화시키기 위한 목적으로 자극 조건하에서 인큐베이션된다. 일부 구현예에서, 유전자 전달은 활성화된 세포의 형질 도입이거나, 또는 이를 포함한다. 구체적인 구현예에서, 자극 시제 또는 조건은 세포의 1차 신호 유도, 신호전달, 자극, 활성화 및/또는 팽창을 유도하고 및/또는 유도할 수 있다.
일부 구현예에서, 세포, 예를 들어, 투입 세포 조성물의 세포는 유전자 전달 전에 자극 또는 활성화 조건하에서 인큐베이션된다. 일부 구현예에서, 세포는 자극 또는 활성화 조건하에서 (약) 15 분, 30 분, 45 분, 60 분, 90 분, 120 분, 2 시간, 3 시간, 4 시간, 6 시간, 8 시간, 12 시간, 16 시간, 18 시간, 24 시간, 36 시간, 1 일, 2 일, 3 일, 4 일, 5 일, 6 일, 7 일, 또는 7일 이상 동안 인큐베이션된다. 일부 구현예에서, 투입 세포 조성물의 세포는 유전자 전달 전에 자극 또는 활성화 조건하에서 5 분 내지 90 분, 1 시간 내지 4 시간, 2 시간 내지 8 시간, 6 시간 내지 24 시간, 12 시간 내지 48 시간, 16 시간 내지 32 시간, 18 시간 내지 30 시간, 1 일 내지 4 일, 또는 2 일 내지 7 일 . 구체적인 구현예에서, 투입 세포 조성물의 세포는 자극 또는 활성화 조건하에서 2 내지 15 일, 2 내지 12 일, 2 내지 12 일, 2 내지 8 일, 2 내지 6 일, 2 내지 4 일, 4 내지 12 일, 4 내지 10 일, 4 내지 8 일, 4 내지 6 일, 6 내지 12 일, 6 내지 10 일, 6 내지 8 일, 8 내지 12 일, 8 내지 10 일, 또는 10 내지 12 일 동안 인큐베이션된다. 일부 구현예에서, 세포는 적어도 2 일, 3 일, 4 일, 5 일, 6 일, 7 일, 8 일, 9 일, 10 일, 11 일, 12 일, 13 일, 14 일 또는 14 일 이상 동안 인큐베이션된다.
일부 구현예에서, 세포는 유전자 전달의 일부 동안 또는 전달 내내 자극 또는 활성화 조건하에서 인큐베이션된다. 예를 들어, 특정 구현예에서, 세포는 이종성 핵산을 도입하기 위한 세포의 형질도입 또는 형질주입 내내 또는 일부 동안 자극 조건하에서 인큐베이션된다. 특정 구현예에서, 세포는 바이러스 벡터, 예를 들어, 레트로바이러스 벡터, 예컨대 감마레트로바이러스 벡터 또는 렌티바이러스 벡터의 존재하에 자극 또는 활성화 조건하에서 인큐베이션된다.
구체적인 구현예에서, 세포는 유전자 전달 이후, 예를 들어, 직후에 자극 또는 활성화 조건하에서 인큐베이션된다. 일부 구현예에서, 세포는 세포를 팽창시키기 위해, 예를 들어, 임상 적용에 충분한 개수로 세포를 팽창시키기 위해 유전자 전달 이후 자극 또는 활성화 조건하에서 인큐베이션된다. 일부 구현예에서, 세포는 유전자 전달 이후 자극 또는 활성화 조건하에서 (약) 15 분, 30 분, 45 분, 60 분, 90 분, 120 분, 2 시간, 3 시간, 4 시간, 6 시간, 8 시간, 12 시간, 16 시간, 18 시간, 24 시간, 36 시간, 1 일, 2 일, 3 일, 4 일, 5 일, 6 일, 7 일, 또는 7일 이상 동안 인큐베이션된다. 일부 구현예에서, 세포 조성물은 유전자 전달 이후 자극 또는 활성화 조건하에서 5 분 내지 90 분, 1 시간 내지 4 시간, 2 시간 내지 8 시간, 6 시간 내지 24 시간, 12 시간 내지 48 시간, 16 시간 내지 32 시간, 18 시간 내지 30 시간, 1 일 내지 4 일, 또는 2 일 내지 7 일 동안 유전자 전달 전에 인큐베이션된다. 일부 구현예에서, 조성물의 세포는 유전자 전달 이후 자극 또는 활성화 조건하에서 2 내지 15 일, 2 내지 12 일, 2 내지 12 일, 2 내지 8 일, 2 내지 6 일, 2 내지 4 일, 4 내지 12 일, 4 내지 10 일, 4 내지 8 일, 4 내지 6 일, 6 내지 12 일, 6 내지 10 일, 6 내지 8 일, 8 내지 12 일, 8 내지 10 일, 또는 10 내지 12 일 동안 인큐베이션된다.일부 구현예에서, 세포는 적어도 2 일, 3 일, 4 일, 5 일, 6 일, 7 일, 8 일, 9 일, 10 일, 11 일, 12 일, 13 일, 14 일, 또는 14일 이상 동안 인큐베이션된다. 일부 구현예에서, 세포는 임상 적용을 위한 적합한 개수를 생성하기에 충분한 시간 동안 팽창된다.
조건은 하나 이상의 특정 배지, 온도, 산소 함량, 이산화탄소 함량, 시간, 시제 (예컨대, 영양제, 아미노산, 항생제, 이온 및/또는 자극 인자 (예컨대, 사이토카인, 케모카인, 항원, 결합 파트너, 융합 단백질, 재조합 가용성 수용체 및 세포를 활성화하도록 고안된 임의의 기타 시제))를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 자극 조건 또는 시제는 세포의 1차 신호 유도, 신호전달, 자극, 활성화 및/또는 팽창을 유도하고 및/또는 유도할 수 있다.
일부 구현예에서, 자극 조건 또는 시제는 TCR 복합체의 세포 내 신호 전달 도메인을 활성화시킬 수 있는 하나 이상의 시제, 예컨대 리간드를 포함한다. 일부 양태에서, 시제는 T 세포에서 TCR/CD3 세포 내 신호 전달 캐스케이드를 작동시키거나 개시한다. 이러한 시제는 항체, 예컨대 TCR에 대하여 특이적인 항체, 예컨대, 항-CD3를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 자극 조건은 공동자극 수용체를 자극할 수 있는 하나 이상의 약제, 예를 들어 리간드를 포함하며, 예컨대 항-CD28이다. 일부 구현예에서, 이러한 제제 및/또는 리간드는 고체 지지체에 결합될 수 있는데, 예컨대 비드이고 및/또는 하나 이상의 사이토카인에 결합 될 수 있다. 필요에 따라, 상기 증식 방법은 항-CD3 및/또는 항CD28 항체를 배양 배지에 (예를 들어, 적어도 약 0.5 ng/ml의 농도로) 첨가하는 단계를 더 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 자극 시제는 IL-2, IL-15 및/또는 IL-7을 포함한다. 구체적인 구현예에서, 시제는 재조합 수용체에 특이적으로 결합하는 항체이다. 구체적인 구현예에서, 재조합 수용체는 항원 결합 수용체, 예를 들어, CAR이고, 시제는 항원 결합 수용체에 특이적으로 결합하는 항-이디오타입 항체이다.
일부 구현예에서, 시제 및/또는 리간드는 자기 비드, 예컨대 상자성 비드 (예를 들어, 예컨대 Dynalbeads 또는 MACS 비드)에 부착된다. 특정 구현예에서, 비드는 세포를 자기장에 위치시켜, 세포로부터 비드를 제거 및/또는 분리함으로써, 예를 들어, 세포를 탈비드화함으로써, 세포로부터 제거될 수 있다 특정 구현예에서, 비드는 세포를 활성화시키기 위한 인큐베이션 직후에 제거된다. 일부 구현예에서, 비드는 예를 들어 형질도입 또는 형질주입에 의해 유전자 전달 이전에 제거된다. 특정 구현예에서, 비드는 유전자 전달 동안 또는 직후에 제거된다. 구체적인 구현예에서, 비드는 세포를 팽창시키는 인큐베이션 이전 또는 동안 제거된다. 일부 구현예에서, 비드는 세포를 수확 및/또는 동결보호하기 이전에 제거된다.
일부 양태에서, 인큐베이션 단계는 Riddell et al의 미국 특허 6,040,177, Klebanoff et al.(2012) J Immunother. 35(9): 651-660, Terakura et al. (2012) Blood.1:72-82, 및/또는 Wang et al. (2012) J Immunother. 35(9):689-701에 기재된 기법에 따라 수행된다.
일부 구현예에서, T-세포는, 배양-개시 조성물에 피더 세포, 예컨대 비-분할 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 첨가하고 (예컨대 그로써 결과물인 세포 집단은 증식될 최초 집단에서의 각 T 림프구에 대하여 약 5, 10, 20, 또는 40 또는 그 이상의 PBMC 피더 세포를 함유한다); 배양물을 배양함으로써 (예컨대, T t세포의 수가 증식하기에 충분한 시간 동안) 증식된다. 일부 양태에서, 비-분할 피더 세포는 감마선 조사된 PBMC 피더 세포를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, PBMC는 세포 분열을 방지하기 위해 약 3000 내지 3600 rads 범위의 감마선으로 조사된다. 일부 양태에서, 피더 세포는 T 세포 집단의 첨가에 선행하여 배양 배지에 첨가된다.
일부 구현예에서, 자극 조건은 인간 T 림프구의 성장에 적합한 온도, 예컨대, 적어도 약 25 ℃, 일반적으로 약 30 ℃, 및 일반적으로 약 37 ℃를 포함한다. 선택적으로, 인큐베이션 단계는 피더 세포로서 비-분할 EBV-형질 전환 림프아구 세포 (LCL)를 첨가하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. LCL은 약 6000 내지 10,000 rads 범위의 감마선으로 조사될 수 있다. LCL 피더 세포는 일부 양태에서 임의의 적합한 양으로, 예컨대 초기 T 림프구에 대한 LCL 피더 세포의 비율이 적어도 약 10:1인 양으로 제공된다.
구현예에서, 항원 특이적 T 세포, 예컨대 CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포는 나이브 또는 항원 특이적 T 림프구를 항원으로 자극함으로써 수득된다. 예를 들어, 항원 특이적 T 세포주 또는 클론은 T 세포를 감염된 대상체로부터 단리하고 시험관 내에서 동일한 항원으로 세포를 자극함으로써, 사이토메갈로바이러스 항원에 생성될 수 있다.
C. 유전자 조작
일부 구현예에서, 제공된 방법은 조작된 세포의 조성물, 예를 들어, 재조합 항원 수용체를 발현하는 세포를 함유하는 세포 조성물을 생성 또는 제조하는 단계를 포함한다. 유전자 조작된 성분, 예컨대 재조합 수용체 (예컨대, CAR 또는 TCR)의 도입을 위한 다양한 방법이 공지되어 있으며, 제공된 방법 및 조성물과 함께 사용될 수 있다. 예시적 방법에는 바이러스, 예컨대 레트로바이러스 또는 렌티바이러스, 형질 도입, 트랜스포존 및 일렉트로포레이션 등을 통한 수용체를 코딩하는 핵산의 전달 방법들이 있다.
특정 구현예에서, 투입 세포 조성물의 세포는 핵산, 예를 들어 CAR와 같은 재조삽 수용체를 인코딩하는 핵산을 함유하는 하나 이상의 시제와 접촉 및/또는 인큐베이션된다. 일부 구현예에서, 이러한 시제는 벡터, 예를 들어, 바이러스 벡터, 플라스미드, 또는 트랜스포존이다. 일부 구현예에서, 세포는 CD4+ T 세포이다. 특정 구현예에서, 세포는 CD8+ T 세포이다. 구체적인 구현예에서, 핵산의 도입 및/또는 세포와 핵산의 접촉은 조작된 CD4+ T 세포 대 조작된 CD8+ T 세포를 정의된, 원하는, 또는 고정된 비율로 가지는 조작된 세포를 생성한다. 일부 구현예에서, 핵산은 이종성이며, 즉 통상적으로 세포 또는 세포로부터 수득한 샘플, 예컨대 조작된 세포 및/또는 그러한 세포가 유래된 유기체에서 일반적으로 발견되지 않는 기타 유기체 또는 세포로부터 수득한 샘플에 존재하지 않는다. 일부 구현예에서, 핵산은 자연적으로 발생하지 않으며, 예컨대 자연에서 발견되지 않는 핵산은 여러 상이한 세포 유형으로부터의 다양한 도메인을 코딩하는 핵산의 키메라 조합물을 포함한다.
일부 구현예에서, 제조 방법은 유전자 조작 단계 및/또는 유전자 조작된 세포를 함유하는 산출 세포 조성물의 제조 단계 중 임의의 단계 이전, 예컨대 직전, 동안, 또는 이후, 예컨대 직후에 세포의 동결, 예를 들어, 동결보존 단계를 포함한다. 특정 구현예에서, 세포는 세포의 단리 또는 선별 단계, 투입 세포 조성물 내로 세포의 혼합 또는 조합 단계, 인큐베이션, 활성화, 유전자 전달, 형질도입, 형질주입, 팽창, 및/또는 수확 단계 이전, 동안, 또는 이후에 즉시 동결된다. 일부 구현예에서, 전체 세포 또는 이의 일부는 동결을 위해 수집된다. 일부 구현예에서, 세포 일부는 이후 또는 후속 분석을 위해, 예를 들어, 조작된 세포의 조성물이 대상체에게 투여된 이후 분석을 위해 세포의 유전자 조작 공정의 단계 이전, 동안, 또는 이후에 수집한다.
일부 구현예에서, 동결 및 후속 해동 단계는 과립구 및 어느 정도는 세포 집단 내의 단핵구를 제거한다. 일부 구현예에서, 예컨대, 혈장 및 혈소판을 제거하기 위한 세척 단계 후에, 세포는 동결 용액에서 현탁된다. 임의의 다양한 공지된 동결 용액 및 파라미터가 경우에 따라 사용될 수 있다. 한 예시로는 20% DMSO 및 8% 인간 혈청 알부민 (HSA) 또는 기타 적합한 세포 동결 배지를 포함하는 PBS를 사용하는 것을 포함한다. 그런 다음 DMSO와 HSA의 최종 농도가 각각 10%와 4%가 되도록 배지와 1:1로 희석된다. 이어서, 세포는 일반적으로 분당 1°의 속도에서 -80 ℃로 동결되고 액체 질소 저장 탱크의 증기상에 저장된다.
1. 유전자 조작을 위한 벡터 및 방법
일부 구현예에서, 재조합 핵산은, 예를 들어 유인원 바이러스 40 (SV40), 아데노바이러스, 아데노-연관 바이러스 (AAV)로부터 유래한 벡터와 같은 재조합 감염성 바이러스 입자를 사용하여, 세포 내로 전달된다. 일부 구현예에서, 재조합 핵산은 재조합 렌티바이러스 벡터 또는 레트로바이러스 벡터, 예컨대 감마-레트로바이러스 벡터를 사용하여 T 세포로 전달된다 (예를 들어, Koste et al. (2014) Gene Therapy 2014 Apr 3. doi: 10.1038/gt.2014.25; Carlens et al. (2000) Exp Hematol 28(10): 1137-46; Alonso-Camino et al. (2013) Mol Ther Nucl Acids 2, e93; Park et al., Trends Biotechnol. 2011 November 29(11): 550-557 참조. 일부 구현예에서, 바이러스는 아데노-연관 바이러스 (AAV)이다.
일부 구현예에서, 레트로바이러스 벡터는 몰로니 쥐과 백혈병 바이러스 (MoMLV), 골수 증식 육종 바이러스 (MPSV), 쥐과 배아 줄기 세포 바이러스 (MESV), 쥐과 줄기 세포 바이러스 (MSCV), 비장 병소 형성 바이러스 (SFFV)로부터 유래된 레트로바이러스 벡터와 같은 긴 말단 반복 서열 (LTR)을 가진다. 대부분의 레트로바이러스 벡터는 쥐과의 레트로바이러스로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 레트로바이러스는 임의의 조류 또는 포유류 세포 공급원으로부터 유래한 것을 포함한다. 레트로바이러스는 전형적으로 양친매성이며, 이는 인간을 비롯한 여러 종의 숙주 세포를 감염시킬 수 있음을 의미한다. 한 구현예에서, 발현될 유전자는 레트로바이러스 gag, pol 및/또는 env 서열을 대체한다. 다수의 구체적인 레트로바이러스 시스템은 기술되어 있다 (예를 들어, 미국 특허 5,219,740; 6,207,453; 5,219,740; Miller and Rosman (1989) BioTechniques 7:980-990; Miller, A. D. (1990) Human Gene Therapy 1:5-14; Scarpa et al. (1991) Virology 180:849-852; Burns et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:8033-8037; 및 Boris-Lawrie and Temin (1993) Cur. Opin. Genet. Develop. 3:102-109 참조.
렌티바이러스 형질 도입 방법은 공지되어 있다. 예시적인 방법은, 예를 들어, Wang et al. (2012) J. Immunother. 35(9): 689-701; Cooper et al. (2003) Blood. 101:1637-1644; Verhoeyen et al. (2009) Methods Mol Biol. 506: 97-114; and Cavalieri et al. (2003) Blood. 102(2): 497-505에 기재되어 있다.
일부 구현예에서, 바이러스 벡터 입자는 레트로바이러스 게놈 기반의 벡터로부터 유래된 게놈, 예컨대 렌티바이러스 게놈 또는 감마레트로바이러스 기반의 벡터로부터 유래된 게놈을 함유한다. 제공된 바이러스 벡터의 일부 양태에서, 항원 수용체와 같은 재조합 수용체, 예컨대 CAR를 인코딩하는 이종성 핵산은 벡터 게놈의 5′ LTR 및 3′ LTR 서열에 포함 및/또는 위치된다.
일부 구현예에서, 바이러스 벡터 게놈은 렌티바이러스 게놈, 예컨대 HIV-1 게놈 또는 SIV 게놈이다. 예를 들어, 렌티바이러스 벡터는 유전자를 증식시켜 약독화함으로써 생성되었으며, 예를 들어, 유전자 env, vif, vpu 및 nef 결실되어, 치료적 목적을 위해 벡터를 더 안전하게 만들 수 있다. 렌티바이러스 벡터는 공지되어 있다. 문헌 [Naldini et al., (1996 and 1998); Zufferey et al., (1997); Dull et al., 1998], 미국 특허 6,013,516; 및 5,994,136을 참조한다. 일부 구현예에서, 상기 바이러스 벡터는 플라스미드-기반 또는 바이러스-기반이며, 외래 핵산을 통합하기 위한, 선별을 위한, 및 숙주 세포 내로 핵산을 전달하기 위한 필수 서열을 보유하도록 구성된다. 공지된 렌티바이러스는 American Type Culture Collection와 같은 기탁소 또는 수집물 (“ATCC”; 10801 University Blvd., Manassas, Va. 20110-2209)로부터 용이하게 수득될 수 있거나, 또는 일반적으로 이용가능한 기법을 사용하여 공지된 공급원으로부터 단리될 수 있다.
렌티바이러스 벡터의 비제한적인 예시로는 인간 면역결핍 바이러스 1 (HIV-1), HIV-2, 시미안 면역결핍 바이러스 (SIV), 인간 T-세포 백혈병 바이러스 1 (HTLV-1), HTLV-2 또는 말 전염성 빈혈 (E1AV)과 같은 렌티바이러스로부터 유래한 벡터를 포함한다. 예를 들어, 렌티바이러스 벡터는 HIV 독성 유전자를 증식시켜 약독화함으로써 생성되었으며, 예를 들어, 유전자 env, vif, vpu 및 nef 결실되어, 치료적 목적을 위해 벡터를 더 안전하게 만든다. 렌티바이러스 벡터는 기술 분야 내에 공지되어 있으며, 문헌 [Naldini et al., (1996 and 1998); Zufferey et al., (1997); Dull et al., 1998], 미국 특허 6,013,516; 및 5,994,136을 참조한다. 일부 구현예에서, 상기 바이러스 벡터는 플라스미드-기반 또는 바이러스-기반이며, 외래 핵산을 통합하기 위한, 선별을 위한, 및 숙주 세포 내로 핵산을 전달하기 위한 필수 서열을 보유하도록 구성된다. 공지된 렌티바이러스는 American Type Culture Collection와 같은 기탁소 또는 수집물 (“ATCC”; 10801 University Blvd., Manassas, Va. 20110-2209)로부터 용이하게 수득될 수 있거나, 또는 일반적으로 이용가능한 기법을 사용하여 공지된 공급원으로부터 단리될 수 있다.
일부 구현예에서, 바이러스 게놈 벡터는 렌티바이러스와 같은 레트로바이러스의 5′ 및 3′ LTR 서열을 함유할 수 있다. 일부 양태에서, 바이러스 게놈 작제물은 렌티바이러스의 5′ 및 3′ LTR으로부터의 서열을 함유할 수 있고, 특히 렌티바이러스의 5′ LTR으로부터의 R 및 U5 서열 및 렌티바이러스의 불활성화 또는 자가-불활성화 3′ LTR을 함유할 수 있다. LTR 서열은 임의의 종의 임의의 렌티바이러스로부터의 LTR 서열일 수 있다. 예를 들어, 이는 HIV, SIV, FIV 또는 BIV으로부터의 LTR 서열일 수 있다. 일반적으로, LTR 서열은 HIV LTR 서열이다.
일부 구현예에서, 바이러스 벡터, 예컨대 HIV 바이러스 벡터의 핵산은, 추가의 전사 단위를 가지지 않는다. 벡터 게놈은 불활성화된 또는 자가-불활성화 3′ LTR을 함유할 수 있다 (Zufferey et al. J Virol 72: 9873, 1998; Miyoshi et al., J Virol 72:8150, 1998). 예를 들어, 바이러스 벡터 RNA를 제조하기 위해 사용되는 핵산의 3′ LTR의 U3 영역의 결실은 자가-불활성화 (SIN) 벡터를 생성하는데 사용될 수 있다. 이러한 결실은 이후 역전사 동안 프로바이러스 DNA의 5′ LTR로 전달될 수 있다. 자가-불활성화 벡터는 일반적으로 3′ 긴 발단 반복 (LTR)으로부터 인핸서 및 프로모터 서열의 결실을 가지며, 이는 벡터의 통합 동안 5′ LTR 내로 복사된다. 일부 구현예에서,LTR의 전사 활성을 제거하기 위해 TATA 박스의 제거를 비롯하여 충분한 서열이 제거될 수 있다. 이것은 형질도입된 세포에서 전장 벡터 RNA의 제조를 방지할 수 있다. 일부 양태에서, 3′ LTR의 U3 요소는 이의 인핸서 서열, TATA 박스, Sp1, 및 NF-카파 B 부위의 결실을 함유한다. 자가-불활성화 3′ LTR의 결과로, 진입 및 역전사 이후 생성된 프로바이러스는 불활성화된 5′ LTR를 함유한다. 이것은 벡터 게놈의 동원 위험 및 근처의 세포 프로모터에 대한 LTR의 영향을 감소시킴으로써 안전성을 향상시킬 수 있다. 자가-불활성화 3′ LTR는 기술 분야 내 공지된 임의의 방법에 의해 작제될 수 있다. 일부 구현예에서, 이것은 벡터 역가, 또는 백터의 시험관 내 또는 생체 내 성질에 영향을 미치지 않는다.
선택적으로, 렌티바이러스 5′ LTR의 U3 서열은 바이러스 작제물 내 프로모터 서열, 예컨대 이종성 프로모터 서열으로 대체될 수 있다. 이는 패키징 세포주로부터 회수된 바이러스의 역가를 증가시킬 수 있다. 인핸서 서열이 또한 포함될 수 있다. 패키징 세포주에서 바이러스 RNA 게놈의 발현을 증가시키는 임의의 인핸서/프로모터 조합이 사용될 수 있다. 한 예에서, CMV 인핸서/프로모터 서열이 사용된다 (미국 특허 5,385,839 미국 특허 5,168,062).
특정 구현예에서, 삽입 돌연변이 유발의 위험은 렌티바이러스 벡터 게놈과 같은 레트로바이러스 벡터 게놈이 통합 결함이되도록 작제함으로써 최소화될 수있다. 비-통합 벡터 게놈을 생성하기 위해 다양한 접근법이 추구될 수 있다. 일부 구현예에서, 돌연변이(들)은 pol 유전자의 인테그라제 효소 성분으로 조작되어 불활성 인테그라제를 가지는 단백질을 인코딩할 수 있다. 일부 구현예에서, 벡터 게놈 자체는, 예를 들어, 하나 또는 두 개의 부착 부위를 돌연변이 또는 결실 시키거나, 또는 결실 또는 변형을 통해 3 'LTR-근위 폴리퓨린 트랙 (PPT)을 기능하지 않도록 함으로써 통합을 방지하도러록 변형될 수 있다. 일부 구현예에서, 비-유전적 접근법이 이용 가능하며; 하나 이상의 통합 기능을 억제하는 약리학적 시제를 포함한다. 이러한 접근법은 상호 배타적이지 않으며; 즉, 한 번에 둘 이상을 사용할 수 있습니다. 예를 들어, 인테그라제 및 부착 위치 둘 모두는 기능을 하지 않을 수 있거나, 또는 인테그라제 및 PPT 위치가 기능을 하지 않을 수 있거나, 또는 부착 위치 및 PPT 위치가 기능을 하지 않을 수 있거나, 또는 상기 모두가 기능을 하지 않을 수 있다. 이러한 방법 및 바이러스 벡터 게놈은 공지되어 있으며 입수 가능하다 (문헌 [Philpott and Thrasher, Human Gene Therapy 18:483, 2007; Engelman et al. J Virol 69:2729, 1995; Brown et al J Virol 73:9011 (1999)]; WO 2009/076524; [McWilliams et al., J Virol 77:11150, 2003; Powell and Levin J Virol 70:5288, 1996] 참조).
일부 구현예에서, 제공된 방법은 복수의 세포를 포함하는 세포 조성물을 바이러스 입자와 접촉, 예를 들어 인큐베이션함으로써, 세포를 형질도입하는 방법을 포함한다. 일부 구현예에서, 형질주입될 또는 형질도입될 세포는 대상체로부터 수득된 1차 세포, 예컨대 대상체로부터 농축된 및/또는 선별된 세포이거나, 또는 이를 포함한다.
일부 구현예에서, 투입 조성물 중 세포의 농도는 약 1.0 x 105 세포/mL 내지 1.0 x 108 세포/mL, 예컨대 적어도 약 1.0 x 105 세포/mL, 5 x 105 세포/mL, 1 x 106 세포/mL, 5 x 106 세포/mL, 1 x 107 세포/mL, 5 x 107 세포/mL 또는 1 x 108 세포/mL이다.
일부 구현예에서, 바이러스 입자는 형질도입될 전체 세포 수 당 (IU/세포) 바이러스 벡터 입자 또는 이의 감염 단위 (IU)의 특정 비율의 카피로 제공된다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 접촉 단계 동안 바이러스 입자는 세포 하나 당 적어도 약 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 또는 60 IU의 바이러스 벡터 입자로 존재한다.
일부 구현예에서, 바이러스 벡터 입자의 역가는 약 1 x 106 IU/mL 내지 1 x 108 IU/mL, 예컨대 약 5 x 10 6 IU/mL 내지 5 x 107 IU/mL, 예컨대 적어도 6 x 106 IU/mL, 7 x 106 IU/mL, 8 x 106 IU/mL, 9 x 106 IU/mL, 1 x 107 IU/mL, 2 x 107 IU/mL, 3 x 107 IU/mL, 4 x 107 IU/mL, 또는 5 x107 IU/mL이다.
일부 구현예에서, 형질도입은 100 미만의 다수의 감염 (MOI), 예컨대 일반적으로 60, 50, 40, 30, 20, 10, 5 이하의 감염으로 달성될 수 있다.
일부 구현예에서, 상기 방법은 세포를 바이러스 입자와 접촉 또는 인큐베이션하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 접촉 단계는 30 분 내지 72 시간, 예컨대 30 분 내지 48 시간, 30 분 내지 24 시간 또는 1 시간 내지 24 시간, 예컨대 약 적어도 30 분, 1 시간, 2 시간, 6 시간, 12 시간, 24 시간, 36 시간 이상이다.
일부 구현예에서, 접촉 단계는 원심분리로, 예컨대 회전접종 (예를 들어, 원심분리적 접종)으로 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, 세포, 바이러스 입자 및 시약을 포함하는 조성물은 일반적으로 비교적 낮은 힘 또는 속력으로, 예컨대 세포를 펠릿화하기 위해 사용되는 속도보다 낮은 속도, 예컨대 약 600 rpm 내지 1700 rpm (예를 들어 약 적어도 600 rpm, 1000 rpm, 또는 1500 rpm 또는 1700 rpm)로 회전될 수 있다. 일부 구현예에서, 회전은 예를 들어 챔버 또는 캐비티의 내벽 또는 외벽에서 측정된 약 100 g 내지 3200 g (예를 들어 적어도 약 100 g, 200 g, 300 g, 400 g, 500 g, 1000 g, 1500 g, 2000 g, 2500 g, 3000 g 또는 3200 g), 예를 들어, 상대적 원심력과 같은 힘으로 수행된다. "상대적 원심력" 또는 RCF라는 용어는 일반적으로 회전축과 비교하여 공간 내 특정 지점에서, 지구 중력에 상대적으로, 객체 또는 물질 (예컨대 회전되는 챔버 또는 기타 컨테이너 내의 세포, 샘플, 또는 펠렛 및/또는 지점)에 가해지는 유효력으로 이해된다. 이러한 값은 중력, 회전 속도 및 회전 반경 (RCR가 측정되는 위치의 객체, 물질 또는 입자와 회전축 간의 거리)을 고려하여 공지된 공식을 이용하여 결정될 수 있다.
특정 구현예에서, 투입 세포는 바이러스 DNA에 의해 인코딩되는 재조합 수용체에 결합 또는 인식하는 결합 분자를 포함하는 입자와 함께 처리, 인큐베이션, 또는 접촉된다.
일부 구현예에서, 재조합 핵산은 일렉트로포레이션을 통해 T 세포에 전달된다 (예를 들어, Chicaybam et al, (2013) PLoS ONE 8(3): e60298 및 Van Tedeloo et al. (2000) Gene Therapy 7(16): 1431-1437 참조). 일부 구현예에서, 재조합 핵산은 전위를 통해 T 세포에 전달된다 (예를 들어, Manuri et al. (2010) Hum Gene Ther 21(4): 427-437; Sharma et al. (2013) Molec Ther Nucl Acids 2, e74; 및 Huang et al. (2009) Methods Mol Biol 506: 115-126 참조). 면역 세포에서 유전 물질을 도입하고 발현시키는 기타 방법들은 칼슘 포스페이트 트랜스펙션 (예컨대, 문헌 Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York. N.Y.에 기재된 트렌스펙션), 원형질 융합, 양이온성 리포좀 매개 트랜스펙션; 텅스텐 입자-촉진 미세 입자 충격 (Johnston, Nature, 346: 776-777 (1990)); 및 스트론튬 포스페이트 DNA 공동 침전 (Brash et al., Mol. Cell Biol., 7: 2031-2034 (1987))을 포함한다.
재조합 산물을 코딩하는 핵산의 전달을 위한 기타 접근법 및 벡터는, 예를 들어, 국제 특허 출원 공보 WO2014055668, 및 미국 특허 7,446,190에 기재되어 있다.
일부 구현예에서, 재조합 핵산은 트랜스포존을 통해 T 세포 내로 전달된다. 포유동물 세포, 예를 들어, 인간 1차 백혈구와 함께 사용하기에 적합한 트랜스포존의 예로는, 슬리핑 뷰티(Sleeping Beauty) 및 피기백(Piggybac)을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 트랜스포존-기반의 형질주입은 트랜스포사제(transposase) 및 트랜스포존으로 구성된 2-성분 시스템이다. 일부 구현예에서, 이러한 시스템은 외래 DNA (본 명세서에서 카고 DNA로도 지칭), 예를 들어, 동반되는 트랜스포사제에 의해 인식되는 역반복/직접 반복 (IR/DR) 서열에 의해 측면에 위치되는 재조합 수용체를 인코딩하는 유전자를 포함하도록 조작된 트랜스포존을 포함한다. 일부 구현예에서, 비-바이러스 플라스미드는 프로모터의 제어하에 트랜스포사제를 인코딩한다. 일부 구현예에서, 숙주 세포 내로 플라스미드를 형질주입시켜, 게놈 DNA 내로 통합시키기에 충분한 수준으로 트랜스포사제를 일시적으로 발현시킨다.
슬리핑 뷰티 (SB)는 연어과 어종 게놈에 있는 휴면의 요소로부터 재구성된, 트랜스포존의 Tc/1-마리너(mariner)수퍼패밀리의 합성 일원이다. SB 트랜스포존-기반의 형질주입은 트랜스포사제 및 역반복/직접 반복(IR/DR) 서열을 포함하여 트랜스포존으로 구성된 2-성분 시스템이며, 이는 TA 다이뉴클레오타이드로 정확하게 통합된다. 트랜스포존은 IR/DR에 의해 측면에 위치된 관심의 발현 카세트로 설계된다. SB 트랜스포사제는 슬리핑 뷰티 트랜스포존의 IR에 위치된 특이적인 결합 부위에 결합한다. SB 트랜스포사제는 트랜스포존의 통합을 매개하는데, 이동 요소는 촉매 효소 (SB)의 결합 부위를 가지는 역전된 말단 반복에 의해 양쪽 측면에 위치된 카고 서열을 인코딩한다. 컷-앤-페이스트(cut-and-paste) 메커니즘을 통해 TA 표적 다이뉴클레오타이드에서 척추동물 염색체 내로 유전자 서열을 삽입할 때 안정한 발현이 일어난다. 이러한 시스템은 1차 인간 말초 혈액 백혈구를 비롯한, 다양한 척추동물 세포 유형을 조작하는데 사용되었다. 일부 구현예에서, 세포는 카고 유전자, 예를 들어 SB IR 서열에 의해 측면에 위치된 재조합 수용체 또는 CAR을 인코딩하는 유전자를 포함하는 SB 트랜스포존과 접촉, 인큐베이션, 및/또는 처리된다. 구체적인 구현예에서, 형질주입될 세포는 카고 유전자, 예를 들어 SB IR 서열에 의해 측면에 위치된 CAR을 인코딩하는 유전자를 포함하는 SB 트랜스포존을 포함하는 플라스미드와 접촉, 인큐베이션, 및/또는 처리된다. 특정 구현예에서, 플라스미드는 SB IR 서열에 의해 측면에 위치되지 않은 SB 트랜스포사제를 인코딩하는 유전자를 추가로 포함한다.
피기백 (PB)은 숙주의, 예를 들어, 인간의, 게놈 DNA 내로 카고 DNA를 통합하도록 사용될 수 있는 또 다른 트랜스포존 시스템이다. PB 트랜스포사제는 트랜스포존의 양 말단에 위치하는 PB 트랜스포존-특이적 역전된 말단 반복 서열 (ITR)을 인식하며, 원래의 위치로부터 효과적으로 내용물을 이동시키고 효율적으로 TTAA 염색체 부위 내로 통합시킨다. PB 트랜스포존 시스템은 PB 벡터 내 두 개의 ITR 사이에 있는 관심 유전자가 표적 게놈 내로 동원될 수 있도록 한다. PB 시스템은 1차 인간 세포를 비롯한 다양한 척추동물 세포 유형을 조작하는데 사용되었다. 일부 구현예에서, 형질주입될 세포는 카고 유전자, 예를 들어 PB IR 서열에 의해 측면에 위치된 CAR을 인코딩하는 유전자를 포함하는 PB 트랜스포존과 접촉, 인큐베이션, 및/또는 처리된다. 구체적인 구현예에서, 형질주입될 세포는 카고 유전자, 예를 들어 PB IR 서열에 의해 측면에 위치된 CAR을 인코딩하는 유전자를 포함하는 PB 트랜스포존을 포함하는 플라스미드와 접촉, 인큐베이션, 및/또는 처리된다. 특정 구현예에서, 플라스미드는 PB IR 서열에 의해 측면에 위치되지 않은 SB 트랜스포사제를 인코딩하는 유전자를 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 트랜스포존을 통한 형질도입은 트랜스포사제 유전자를 포함하고, 트랜스포사제에 의해 인식되는 역반복/직접 반복 (IR/DR) 서열에 의해 측면에 위치하는 카고 DNA 서열을 포함하는 트랜스 포존을 포함하는 플라스미드로 수행된다. 특정 구현예에서, 카고 DNA 서열은 이종성 단백질, 예를 들어, 재조합 T 세포 수용체 또는 CAR을 인코딩한다. 일부 구현예에서, 플라스미드는 트랜스포사제 및 트랜스포존을 포함한다. 일부 구현예에서, 트랜스포사제는 유비쿼터스 프로모터, 또는 표적 세포에서 트랜스포사제의 발현을 유도하기에 적합한 임의의 프로모터의 제어하에 있다. 유비쿼터스 프로모터는 EF1a, CMB, SV40, PGK1, Ubc, 인간 β-액틴, CAG, TRE, UAS, Ac5, CaMKIIa, 및 U6를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 카고 DNA는 세포를 선별하며 카고 DNA를 게놈 DNA 내로 안전하게 통합하게 하는 선별 카세트를 포함한다. 적합한 선별 카세트로는, 카나마이신 내성 유전자, 스펙티노마이신 내성 유전자, 스트렙토마이신 내성 유전자, 암피실린 내성 유전자, 카베니실린적합한내성 유전자, 하이그로마이신 내성 유전자, 블레오마이신 내성 유전자, 에리쓰로마이신 내성 유전자, 및 폴리마이신 B 내성 유전자를 인코딩하는 선별 카세트를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
일부 구현예에서, 트랜스포존을 통한 형질 도입을 위한 성분, 예를 들어, SB 트랜스포사제 및 SB 트랜스포존을 포함하는 플라스미드는 표적 세포 내로 도입된다. 임의의 편리한 프로토콜이 사용될 수 있으며, 이러한 프로토콜은 표적 세포의 위치에 따라 표적 세포 내로 시스템 성분의 시험관 내 또는 생체 내 도입을 제공할 수 있다. 예를 들어, 표적 세포가 단리된 세포 인 경우, 시스템은 예를 들어 표준 형질전환 기법을 사용하여 표적 세포의 생존성을 허용하는 세포 배양 조건하에서, 세포로 직접 도입될 수 있다. 이러한 기법으로는, 바이러스 감염, 형질전환, 컨쥬게이션, 원형질체 융합, 전기 천공, 입자 총 기술, 인산 칼슘 침전, 직접 미세 주사, 바이러스 벡터 전달 등을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 방법의 선택은 일반적으로 형질전환되는 세포의 유형 및 형질전환이 일어나는 환경 (즉, 시험관 내, 생체 외 또는 생체 내)에 의존한다. 이러한 방법에 대한 일반적인 논의는 문헌 [Ausubel, et al, Short Protocols in Molecular Biology, 3rd ed., Wiley & Sons,1995]에서 확인할 수 있다.
일부 구현예에서, SB 트랜스포존 및 SB 트랜스포사제 공급원은 트랜스포존을 보유한 벡터로부터 역반복 측면 위치의 핵산의 절제에 충분한 조건하에서 다형질 유기체, 예를 들어, 포유동물 또는 인간의 표적 세포 내로 도입되고, 이후 표적 세포의 게놈 내로 절제된 핵산이 통합된다. 일부 구현예는 필수 트랜스포사제 활성이, 도입된 트랜스포손과 함께 표적 세포에 존재함을 보장하는 단계를 추가로 포함한다. 트랜스포존 벡터 자체의 구조에 따라, 즉, 벡터가 트랜스포사제 활성을 가지는 생성물을 인코딩하는 영역을 포함하는지 여부에 따라, 상기 방법은 필수 트랜스포사제 활성을 인코딩하는 제2 벡터를 표적 세포 내로 도입하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 트랜스포존을 포함하는 벡터 핵산의 양 및 세포 내로 도입되는 트랜스포사제를 인코딩하는 벡터 핵산의 양은 트랜스포존 핵산의 원하는 절제 및 표적 세포 게놈 내로의 삽입을 제공하기에 충분하다. 이와 같이, 도입된 벡터 핵산의 양은 충분한 양의 트랜스포사제 활성 및 표적 세포 내로 삽입되고자 하는 원하는 충분한 양의 핵산을 제공해야 한다. 표적 세포 내로 도입되는 벡터 핵산의 양은 사용되는 특정 도입 프로토콜, 예를 들어, 사용되는 특정 생체 외 투여 프로토콜의 효율에 따라 달라진다.
벡터 DNA가 필수 트랜스포사제와 조합으로 표적 세포에 진입하면, 역반복에 의한 측면 위치의, 즉, 벡터 핵산 역반복에 의해 인식되는 슬리핑 뷰티 트랜스포사제에 위치한 벡터의 핵산 영역은 제공된 트랜스포사제를 통해 벡터로부터 절제되고 표적 세포의 게놈에 삽입된다. 이와 같이, 표적 세포 내로 벡터 DNA를 도입한 후, 백터에 의해 수반되는 외인성 핵산을 프랜스포사제 매개로 절제하고 표적 세포의 게놈 내로의 삽입한다. 구체적인 구현예에서, 벡터는 SB 트랜스포존 및/또는 SB 트랜스포사제로 형질주입된 세포의 적어도 1%, 적어도 2%, 적어도 3%, 적어도 4%, 적어도 5%, 적어도 6% 적어도 7% 적어도 8%, 적어도 9%, 적어도 10%, 적어도 15%, 또는 적어도 20%의 게놈 내로 통합된다. 일부 구현예에서, 핵산을 표적 세포 게놈 내로 통합하는 것은 안정하며, 즉, 벡터 핵산은 과도한 시간 이상 동안 표적 세포 게놈에 존재하며 염색체 유전 물질의 일부는 표적 세포의 자손으로 전달된다.
특정 구현예에서, 트랜스포존은 다양한 크기의 핵산, 즉, 폴리뉴클레오타이드를 표적 세포 게놈 내로 통합하는데 사용된다. 일부 구현예에서, 본 발명의 방법을 사용하여 표적 세포 게놈에 삽입되는 DNA의 크기는 약 0.1 kb 내지 200 kb, 약 0.5 kb 내지100 kb, 약 1.0 kb 내지 약 8.0 kb, 약 1.0 내지 약 200 kb, 약 1.0 내지 약 10 kb, 약 10 kb 내지 약 50 kb, 약 50 kb 내지 약 100 kb, 또는 약 100 kb 내지 약 200 kb 범위이다. 일부 구현예에서, 본 발명의 방법을 사용하여 표적 세포 게놈에 삽입되는 DNA의 크기는 약 1.0 kb 내지 약 8.0 kb 범위이다. 일부 구현예에서, 본 발명의 방법을 사용하여 표적 세포 게놈에 삽입되는 DNA의 크기는 약 1.0 내지 약 200 kb 범위이다. 구체적인 구현예에서, 본 발명의 방법을 사용하여 표적 세포 게놈에 삽입되는 DNA의 크기 약 1.0 kb 내지 약 8.0 kb 범위이다.
일부 구현예에서, 세포, 예컨대 T 세포는 팽창 도중 또는 팽창 후에 T 세포 수용체 (TCR) 또는 키메라 항원 수용체 (CAR)로 트랜스펙션될 수 있다. 원하는 수용체 유전자의 도입을 위한 이러한 트랜스펙션은, 예컨대 임의의 적합한 레트로바이러스 벡터로 수행될 수 있다. 유전자 조작된 세포 집단은 초기 자극 (예컨대, CD3/CD28 자극)으로부터 유리된 후, 이어서 제2 유형의 자극, 예컨대 새로 (de novo) 도입된 수용체를 통한 자극으로 자극될 수 있다. 이러한 제2 유형의 자극은 펩타이드/MHC 분자, 유전적으로 도입된 수용체의 동족 (교차 결합) 리간드 (예컨대, CAR의 천연 리간드) 또는 새로운 수용체의 골격 내에서 (예컨대, 수용체 내의 불변 영역을 인식함으로써) 직접 결합하는 임의의 리간드 (예컨대, 항체) 형태의 항원 자극을 포함할 수 있다. 예를 들어, “Chimeric antigen receptors for T-cell based therapy” Methods Mol Biol. 2012; 907:645-66 or Barrett et al., Chimeric Antigen Receptor Therapy for Cancer Annual Review of Medicine Vol. 65: 333-347 (2014)를 참조한다.
일부 경우에서, 세포, 예컨대 T 세포가 활성화될 것을 필요로 하지 않는 벡터가 사용될 수 있다. 이러한 일부 경우에서, 세포는 활성화 전에 선택 및/또는 형질 도입될 수 있다. 이에 따라, 세포는 본 명세서에 기술된 바와 같은 세포의 배양 단계에 선행하여, 또는 배양 단계 후에, 경우에 따라 배양 단계와 동시에 또는 배양 단계의 적어도 일부 기간 동안에 조작될 수 있다.
추가적인 핵산, 예컨대 도입 유전자 중에는 전달된 세포의 생존력 및/또는 기능을 촉진시킴으로써 치료의 효능을 개선시키는 것; 생체 내 생존 또는 국소화를 평가하는 것과 같은 세포의 선택 및/또는 평가를 위한 유전자 마커를 제공하는 유전자; 문헌 Lupton S. D. et al., Mol. and Cell Biol., 11:6 (1991); 및 Riddell et al., Human Gene Therapy 3:319-338 (1992)에 기재된 바와 같이 세포가 생체 내 음성 선별에 민감성을 갖도록 함으로써 안정성을 개선시키는 유전자가 있으며, 예컨대 우성 양성 선택 마커와 음성 선별 마커를 융합시킴으로써 유래된 이작용성 선택 융합 유전자의 용도를 기술하고 있는 Lupton 등의 공보 PCT/US91/08442 및 PCT/US94/05601도 참조한다. 예를 들어, Riddell et al의 미국 특허 6,040,177의 14-17 열을 참조한다.
2. 재조합 수용체
일부 구현예에서, 제공된 방법과 관련된 사용을 위한 또는 이와 관련하여 투여되는 세포는 조작된 수용체, 예를 들어, 조작된 항원 수용체, 예컨대 키메라 항원 수용체 (CAR), 또는 T 세포 수용체 (TCR)를 포함하거나, 이를 포함하도록 조작된다. 또한 이러한 세포의 집단, 이러한 세포를 포함 및/또는 이러한 세포가 풍부한 조성물, 예컨대 T 세포, 또는 CD8+ 또는 CD4+ T 세포와 같은 특정 유형의 세포가 농축 또는 선택된 조성물이 제공된다. 조성물 중에는 입양 세포 요법과 같은 투여용 약제학적 조성물 및 제형이 있다. 또한, 대상체, 예컨대 환자에게 제공된 방법에 따라, 및/또는 제공된 제조 물품 또는 조성물에 따라 세포 및 조성물을 투여하는 방법이 제공된다.
일부 구현예에서, 세포는 유전 공학을 통해 도입되는 하나 이상의 핵산을 포함하고, 이에 의해 그러한 핵산의 재조합 또는 유전적으로 조작된 생성물을 발현한다. 일부 구현예에서, 유전자 전달은 우선 세포를 자극시킴으로써, 예컨대, 사이토카인 또는 활성화 마커의 발현에 의해 측정되는 바 증식, 생존 및/또는 활성화와 같은 반응을 유도하는 자극과 세포를 조합시킨 후, 활성화된 세포를 형질도입시키고, 임상 적용에 충분한 수로 배양 증식시킴으로써 달성된다.
세포는 일반적으로 재조합 수용체, 예컨대 항원 수용체, 예컨대 기능적 비-TCR 항원 수용체, 예컨대 키메라 항원 수용체 (CAR) 및 다른 항원-결합 수용체, 예컨대 트랜스제닉 T 세포 수용체 (TCR)를 발현한다. 수용체 중에는 또한 기타 키메라 수용체도 있다.
a. 키메라 항원 수용체 (CAR)
제공된 방법 및 용도의 일부 구현예에서, 키메라 수용체, 예컨대 키메라 항원 수용체는, 바람직한 항원 (예를 들어, 종양 항원)에 특이성을 제공하는 리간드-결합 도메인 (예를 들어 항체 또는 항체 단편)과 세포 내 신호전달 도메인을 조합한 하나 이상의 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포 내 신호전달 도메인은 1차 활성화 신호를 제공하는, 활성화 세포 내 도메인 부분, 예컨대 T 세포 활성화 도메인이다. 일부 구현예에서, 세포 내 신호전달 도메인은 이펙터 기능을 용이하게 하기 위해 공동자극 신호전달 도메인을 포함하거나 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 키메라 수용체는 면역 세포로 유전적으로 조작될 때 T 세포 활성을 조절할 수 있고, 일부 경우에, T 세포 분화 또는 항상성을 조절할 수 있어, 예컨대 입양 세포 요법 방법에 사용하기 위해, 생체 내 수명, 생존 및/또는 지속성이 개선된 유전자 조작 세포를 생성할 수 있다.
일부 구현예에서, 특정 항원 (또는 마커 또는 리간드), 예컨대 특정 세포 유형의 표면에서 발현되는 항원에 대해 특이성을 가지는 CAR를 발현하는 조작된 세포, 예컨대 T 세포가 제공된다. 일부 구현예에서, 항원은 폴리펩타이드이다. 일부 구현예에서, 탄수화물 또는 다른 분자이다. 일부 구현예에서, 항원은 정상 세포 또는 비-표적화된 세포 또는 조직과 비교하여, 질환 또는 증상 세포, 예컨대 종양 또는 병원성 세포에서 선택적으로 발현되거나 과발현된다. 다른 구현예에서, 항원은 정상 세포상에서 발현되고 및/또는 조작된 세포상에서 발현된다.
구체적인 구현예에서, 재조합 수용체, 예컨대 키메라 수용체는 세포 내 신호전달 영역을 포함하며, 이러한 신호전달 영역은 세포질 신호전달 도메인 (세포 내 신호전달 도메인로도 불림), 예컨대 T 세포에서 1차 활성화 신호를 유도할 수 있는 세포질 (세포 내) 영역, 예를 들어, T 세포 수용체 (TCR) 성분의 세포질 신호전달 도메인 (예컨대 CD3-제타 (CD3ζ) 사슬 또는 기능적 변형체의 세포질 신호전달 도메인 또는 이의 신호전달 부분)을 포함하고 및/또는 면역수용체 타이로신계 활성화 모티프 (ITAM)를 포함한다.
일부 구현예에서, 키메라 수용체는 리간드 (예컨대 항원) 항원에 특이적으로 결합하는 세포 외 리간드-결합 도메인을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 키메라 수용체는 항원에 특이적으로 결합하는 세포 외 항원-인식 도메인을 포함하는 CAR이다. 일부 구현예에서, 항원와 같은 리간드는 세포 표면에서 발현되는 단백질이다. 일부 구현예에서, CAR는 TCR-유사 CAR이고, 항원은 펩타이드 항원, 예컨대 세포 내 단백질의 펩타이드 항원으로 가공되며, 이는 TCR와 같이, 주조직 적합성 복합체 (MHC) 분자의 맥락에서 세포 표면에서 인식된다.
CAR을 비롯한 예시적 항원 수용체, 및 이러한 수용체를 조작하고 세포 내로 도입시키는 방법으로는, 예를 들어, 국제 특허 출원 공보 WO200014257, WO2013126726, WO2012/129514, WO2014031687, WO2013/166321, WO2013/071154, WO2013/123061 미국 특허 출원 US2002131960, US2013287748, US20130149337, 미국 특허 6,451,995, 7,446,190, 8,252,592, , 8,339,645, 8,398,282, 7,446,179, 6,410,319, 7,070,995, 7,265,209, 7,354,762, 7,446,191, 8,324,353, 및 8,479,118, 및 유럽 특허 출원 EP2537416에 기재된 수용체 및 방법, 및/또는 Sadelain et al., Cancer Discov. 2013 April; 3(4): 388-398; Davila et al. (2013) PLoS ONE 8(4): e61338; Turtle et al., Curr. Opin. Immunol., 2012 October; 24(5): 633-39; Wu et al., Cancer, 2012 March 18(2): 160-75에 개시된 항원 수용체 및 방법을 포함한다. 일부 양태에서, 항원 수용체로는 미국 특허 7,446,190에 개시된 CAR, 및 국제 특허 출원 공보 WO/2014055668 A1에 개시된 수용체를 포함한다. CAR의 예로는 전술한 공보, 예컨대 WO2014031687, US 8,339,645, US 7,446,179, US 2013/0149337, 미국 특허 7,446,190, 미국 특허 8,389,282, Kochenderfer et al., 2013, Nature Reviews Clinical Oncology, 10, 267-276 (2013); Wang et al. (2012) J. Immunother. 35(9): 689-701; and Brentjens et al., Sci Transl Med. 2013 5(177) 중 어느 하나에 개시된 CAR를 포함한다. 또한 WO2014031687, US 8,339,645, US 7,446,179, US 2013/0149337, 미국 특허 7,446,190, 및 미국 특허 8,389,282를 참조한다.
일부 구현예에서, CAR은 특정 항원 (또는 마커 또는 리간드), 예컨대 입양 요법에 의해 표적화되는 특정 세포 유형에서 발현되는 항원, 예컨대, 암 마커, 및/또는 완충 반응을 유도하기 위한 항원, 예컨대 정상 또는 비-병증 세포 유형에서 발현된 항원에 대한 특이성으로 구성된다. 이에 따라, CAR은 일반적으로 세포 외 부분에, 하나 이상의 항원 결합 분자, 예컨대 하나 이상의 항원-결합 단편, 도메인, 또는 부분, 또는 하나 이상의 항체 가변 도메인, 및/또는 항체 분자를 포함한다. 일부 구현예에서, CAR은 항원-결합 부분 또는 항체 분자의 부분, 예컨대 단클론성 항체 (mAb)의 가변 중쇄 (VH) 및 가변 경쇄 (VL)로부터 유도된 단일-사슬 항체 단편 (scFv)을 포함한다.
일부 구현예에서, 항체 또는 이의 항원-결합 부분은 재조합 수용체, 예컨대 항원 수용체의 일부로서 세포에서 발현된다. 항원 수용체 가운데 기능적 비-TCR 항원 수용체, 예컨대 키메라 항원 수용체 (CAR)가 존재한다. 일반적으로, 펩타이드-MHC 복합체에 대한 TCR-유사 특이성을 나타내는 항체 또는 항원-결합 단편을 포함하는 CAR이 또한 TCR-유사 CAR로 지칭될 수 있다. 일부 구현예에서, TCR-유사 CAR의 MHC-펩타이드 복합체에 대해 특이적인 세포 외 항원 결합 도메인은 하나 이상의 세포 내 신호전달 성분에 연결되며, 일부 양태에서 링커 및/또는 막횡단 도메인(들)을 통해 연결된다. 일부 구현예에서, 이러한 분자는 일반적으로 TCR와 같은 천연 항원 수용체를 통한 신호, 및, 선택적으로, 공동자극 수용체와의 조합된 이러한 수용체를 통한 신호를 모방하거나 유사하게 할 수 있다.
일부 구현예에서, 키메라 수용체 (예컨대 CAR)와 같은 재조합 수용체는 항원 (또는 리간드)에 대해 결합, 예컨대 특이적으로 결합하는 리간드-결합 도메인을 포함한다. 키메라 수용체에 의해 표적화되는 항원 가운데 입양 세포 요법을 통해 표적화되는 질병, 조건, 또는 세포 유형의 맥락에서 발현되는 항원이 존재한다. 질병 및 병태 중에는 암과 종양을 비롯한 증식성, 신생물성, 및 악성 질병 및 장애가 있으며, 혈액암, 면역계 암, 예컨대 림프종, 백혈병, 및/또는 골수종, 예컨대 B, T, 및 골수성 백혈병, 림프종, 및 다발성 골수종을 포함한다.
일부 구현예에서, 항원 (또는 리간드)은 폴리펩타이드이다. 일부 구현예에서, 탄수화물 또는 다른 분자이다. 일부 구현예에서, 항원 (또는 리간드)는 정상 세포 또는 비-표적화된 세포 또는 조직과 비교하여, 질환 또는 증상 세포, 예컨대 종양 또는 병원성 세포에서 선택적으로 발현되거나 과발현된다. 다른 구현예에서, 항원은 정상 세포상에서 발현되고 및/또는 조작된 세포상에서 발현된다.
일부 구현예에서, CAR은 항원, 예컨대 세포 표면에서 발현된 손상되지 않은 항원을 특이적으로 인식하는 항체 또는 항원-결합 단편 (예컨대 scFv)을 포함한다.
일부 구현예에서, 항원 (또는 리간드)는 종양 항원 또는 암 마커이다. 일부 구현예에서, 항원 (또는 리간드)는 다음 중 하나이거나, 또는 이를 포함한다: 고아 타이로신 키네이스 수용체 (ROR1), B 세포 성숙화 항원 (BCMA), 탄산 무수화효소 9 (CA9, 또한 CAIX 또는 G250로도 알려짐), Her2/neu (수용체 타이로신 키네이스 erbB2), CD19, CD20, CD22, 메소텔린 (MSLN), 암배아 항원 (CEA), 및 B형 간염 표면 항원, 항-엽산 수용체, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44, 콘드로이틴 설페이트 프로테오글리칸 4 (CSPG4), EGFR, 상피 당단백 2 (EPG-2), 상피 당단백 40 (EPG-40), 에프린 수용체 A2 (EPHa2), Her3 (erb-B3), Her4 (erb-B4), erbB 이합체, III형 표피 성장 인자 수용체 돌연변이 (EGFR vIII), 엽산 결합 단백질 (FBP), Fc 수용체 유사 5 (FCRL5, 또한 Fc 수용체 동족체 5 또는 FCRH5로도 알려짐), 태아 아세틸콜린 수용체(태아 AchR), 강글리오사이드 GD2, 강글리오사이드 GD3, 인간 백혈구 항원 A1 (HLA-A1), 인간 백혈구 항원 A2 (HLA-A2), IL-22 수용체 알파 (IL-22Rα), 키네이스 삽입 도메인 수용체 (kdr), 카파 경쇄, 류신 풍부 반복 함유 8 패밀리 구성원 A (LRRC8A), Lewis Y, L1-세포 점착 분자 (L1-CAM), 흑색종-연관 항원 (MAGE)-A1, MAGE-A3, MAGE-A6, MAGE-A10, 우선적으로 발현되는 흑색종 항원 (PRAME), 서바이빈, 종양-연관 당단백 72 (TAG72), B7-H3, B7-H6, IL-13 수용체 알파 2 (IL-13Rα2), 인간 고분자량-흑색종-연관 항원 (HMW-MAA), CD171, 엽산 수용체-알파, CD44v7/8, αvβ6 인테그린 (avb6 인테그린), 8H9, 신경 세포 점착 분자 (NCAM), 혈관 내피 성장 인자 수용체 (VEGF 수용체 또는 VEGFR), 영양막 당단백 (TPBG 또한 5T4로도 알려짐), NKG2D 리간드, CD44v6, 이중 항원, 암-고환 항원, 쥐과 거대세포바이러스 (CMV), 뮤신 1 (MUC1), MUC16, 전립선 줄기 세포 항원 (PSCA), 전립선 특이적 멤브레인 항원 (PSMA), 자연 살해 그룹 2 구성원 D (NKG2D) 리간드, 암/고환 항원 1B (CTAG, 또한 NY-ESO-1 및 LAGE-2으로도 알려짐), 멜란 A (MART-1), 당단백 100 (gp100), 글리피칸-3 (GPC3), G 단백질 연결 수용체 5D (GPRC5D), 종양태아성 항원, TAG72, 타이로시나제 관련 단백질 1 (TRP1, 또한 TYRP1 또는 gp75로도 알려짐), 타이로시나제 관련 단백질 2 (TRP2, 또한 도파크롬 토토머라제, 도파크롬 델타-아이소머라제 또는 DCT로도 알려짐), 혈관 내피 성장 인자 수용체 2 (VEGF-R2), 암배아 항원 (CEA), 에스트로겐 수용체, 프로게스테론 수용체, 전립선 특이적 항원, 에프린B2, CD123, CD133, c-Met, O-아세틸화된 GD2 (OGD2), L1-CAM의 CE7 에피토프, Wilms 종양 1 (WT-1), 사이클린, 사이클린 A2, C-C 모티프 케모카인 리간드 1 (CCL-1), CD138, 병원체-특이적 항원 또는 병원체-발현 항원, 및 보편적인 표지와 관련된 항원, 및/또는 비오틴화된 분자, 및/또는 HIV, HCV, HBV 또는 다른 병원체에 의해 발현되는 분자. 일부 구현예에서, 수용체에 의해 표적화된 항원은 B 세포 악성종양과 관련된 항원을 포함하는데, 예컨대 다수의 공지된 B 세포 마커 중 어느 하나이다. 일부 구현예에서, 수용체에 의해 표적화되는 항원은 CD20, CD19, CD22, ROR1, CD45, CD21, CD5, CD33, Ig카파, Ig람다, CD79a, CD79b 또는 CD30이다.
일부 구현예에서, 항원은 병원체-특이적 항원이다. 일부 구현예에서, 상기 항원은 바이러스 항원 (예컨대, HIV, HCV, HBV 등으로부터의 바이러스 항원), 박테리아 항원 및/또는 기생충 항원이다.
일부 구현예에서, 항원 또는 항원 결합 도메인은 CD19이다. 일부 구현예에서, scFv는 CD19에 특이적인 항체 또는 항체 단편으로부터 유도된 VH 및 VL을 포함한다. 일부 구현예에서, CD19에 결합하는 항체 또는 항체 단편은 마우스 유래 항체 예컨대 FMC63 및 SJ25C1이다. 일부 구현예에서, 항체 또는 항체 단편은 인간 항체, 예컨대, US 2016/0152723에 기재된 항체이다.
일부 구현예에서, scFv는 FMC63으로부터 유래한다. FMC63은 일반적으로 인간 기원의 CD19를 발현하는 Nalm-1 및 -16 세포에 대하여 만들어진 마우스 단일클론 IgG1 항체를 지칭한다 (Ling, N. R., et al. (1987). Leucocyte typing III. 302). FMC63 항체는 comprises 각각, 서열 번호 38, 39로 제시된 CDRH1 및 H2 및 서열 번호 40 또는 54로 제시된 CDRH3 및 서열 번호 35로 제시된 CDRL1 및 36 또는 55로 제시된 CDR L2 및 서열 37 또는 34로 제시된 CDR L3을 포함한다. FMC63 항체는 서열 번호 41의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH) 및 서열 번호 42의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함한다. 일부 구현예에서, svFv는 서열 번호 35의 CDRL1 서열, 서열 번호 36의 CDRL2 서열, 및 서열 번호 37의 CDRL3 서열을 포함하는 가변 경쇄 및/또는 서열 번호 38의 CDRH1 서열, 서열 번호 39의 CDRH2 서열 및 서열 번호 40의 CDRH3 서열을 포함하는 가변 중쇄를 포함한다. 일부 구현예에서, scFv는 서열 번호 41에 기재된 FMC63의 가변 중쇄 영역 및 서열 번호 42에 기재된 FMC63의 가변 경쇄 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 가변 중쇄 및 가변 경쇄는 링커에 의해 연결된다. 일부 구현예에서, 링커는 서열 번호 56에 기재된다. 일부 구현예에서, scFv는, 순서대로, VH, 링커, 및 VL를 포함한다. 일부 구현예에서, scFv는, 순서대로, VL, 링커, 및 VH를 포함한다. 일부 구현예에서, svFc는 서열 번호 57에 기재된 뉴클레오타이드 서열 또는 서열 번호 57와 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 나타내는 서열에 의해 코딩된다. 일부 구현예에서, scFv는 서열 번호 43에 기재된 아미노산 서열 또는 서열 번호 43와 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 나타내는 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, scFv는 SJ25C1로부터 유래한다. SJ25C1은 인간 기원의 CD19를 발현하는 Nalm-1 및 -16 세포에 대하여 만들어진 마우스 단일클론 IgG1 항체이다 (Ling, N. R., et al. (1987). Leucocyte typing III. 302). SJ25C1 항체는 서열 번호 47-49로 각각 제시되는 CDRH1, H2 및 H3, 서열 번호 44-46으로 각각 제시되는 CDRL1, L2 및 L3를 포함한다. SJ25C1 항체는 서열 번호 50의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH) 및 서열 번호 51의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함한다. 일부 구현예에서, svFv는 서열 번호 44의 CDRL1 서열, 서열 번호 45의 CDRL2 서열, 및 서열 번호 46의 CDRL3 서열을 포함하는 가변 경쇄 및/또는 서열 번호 47의 CDRH1 서열, 서열 번호 48의 CDRH2 서열 및 서열 번호 49의 CDRH3 서열을 포함하는 가변 중쇄를 포함한다. 일부 구현예에서, scFv는 서열 번호 50에 기재된 SJ25C1의 가변 중쇄 영역 및 서열 번호 51에 기재된 SJ25C1의 가변 경쇄 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 가변 중쇄 및 가변 경쇄는 링커에 의해 연결된다. 일부 구현예에서, 링커는 서열 번호 52에 기재된다. 일부 구현예에서, scFv는, 순서대로, VH, 링커, 및 VL를 포함한다. 일부 구현예에서, scFv는, 순서대로, VL, 링커, 및 VH를 포함한다. 일부 구현예에서, scFv는 서열 번호 53에 기재된 아미노산 서열 또는 서열 번호 53와 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 나타내는 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 항원 또는 항원 결합 도메인은 BCMA이다. 일부 구현예에서, scFv는 BCMA에 특이적인 항체 또는 항체 단편으로부터 유도된 VH 및 VL을 포함한다. 일부 구현예에서, BCMA에 결합하는 항체 또는 항체 단편은 국제 출원 공개 번호 WO 2016/090327 및 WO 2016/090320에 기재된 항체 또는 항체 단편으로부터의 VH 및 VL이거나, 또는 이를 포함한다.
일부 구현예에서, 항원 또는 항원 결합 도메인은 GPRC5D이다. 일부 구현예에서, scFv는 GPRC5D에 특이적인 항체 또는 항체 단편으로부터 유도된 VH 및 VL을 포함한다. 일부 구현예에서, GPRC5D에 결합하는 항체 또는 항체 단편은 국제 출원 공개 번호 WO 2016/090329 및 WO 2016/090312에 기재된 항체 또는 항체 단편으로부터의 VH 및 VL이거나, 또는 이를 포함한다.
일부 구현예에서, CAR은 MHC-펩타이드 복합체로서 세포 표면에 제시되는 종양-관련 항원과 같은 세포 내 항원을 특이적으로 인식하는 TCR-유사 항체, 예컨대 항체 또는 항원-결합 단편 (예컨대 scFv)을 포함한다. 일부 구현예에서, MHC-펩타이드 복합체를 인식하는 항체 또는 이의 항원-결합 부분은 재조합 수용체, 예컨대 항원 수용체의 일부로서 세포에서 발현될 수 있다. 항원 수용체 가운데 기능적 비-TCR 항원 수용체, 예컨대 키메라 항원 수용체 (CAR)가 존재한다. 일반적으로, 펩타이드-MHC 복합체에 대한 TCR-유사 특이성을 나타내는 항체 또는 항원-결합 단편을 포함하는 CAR이 또한 TCR-유사 CAR로 지칭될 수 있다.
“주조직 적합성 복합체” (MHC)는 다형성 펩타이드 결합 부위 또는 결합 그루브를 포함하는 단백질, 일반적으로 당단백질을 지칭하며, 이는 일부 경우에, 폴리펩타이드의 세포 기구에 의해 처리된 펩타이드 항원을 포함하여 폴리펩타이드의 펩타이드 항원과 복합체를 형성할 수 있다. 일부 경우에, MHC 분자는, TCR 또는 TCR-유사 항체와 같은 T 세포 상의 항원 수용체에 의해 인식될 수 있는 입체 구조로 항원을 제시하기 위해 펩타이드와의 복합체를 비롯하여, 즉 MHC-펩타이드 복합체로서, 세포 표면상에 표시 또는 발현될 수 있다. 일반적으로, MHC 클래스 I 분자는, 일부 경우에는 3개의 α 도메인과 함께, 막 관통 α 사슬, 및 비-공유 연결된 β2 마이크로글로불린을 가지는 이종이합체(heterodimer)이다. 일반적으로, MHC 클래스 II 분자는 2가지 막횡단 당단백질, α 및 β로 구성되며, 둘 모두는 일반적으로 막에 걸쳐있다. MHC 분자는 항원 결합 부위 또는 펩타이드에 결합하기 위한 부위를 포함하는 효과적인 MHC 부분 및 적절한 항원 수용체에 의한 인식에 필요한 서열을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, MHC 클래스 I 분자는 세포기질로부터 유래하는 펩타이드를 세포 표면으로 전달하며, MHC-펩타이드 복합체는 일반적으로 CD8+ T 세포이지만, 일부 경우에 CD4+ T 세포와 같은 T 세포에 의해 인식된다. 일부 구현예에서, MHC 클래스 II 분자는 소포 시스템에서 유래하는 펩타이드를 세포 표면으로 전달하며, 일반적으로 CD4+ T 세포에 의해 인식된다. 일반적으로, MHC 분자는 마우스에서의 H-2 및 인간에서 인간 백혈구 항원 (HLA)으로 총칭되는, 연결된 유전자좌 그룹에 의해 인코딩된다. 그러므로, 일반적으로 인간 MHC는 또한 인간 백혈구 항원 (HLA)으로서 지칭될 수 있다.
용어 “MHC-펩타이드 복합체” 또는 “펩타이드-MHC 복합체” 또는 이의 변형체는 일반적으로, MHC 분자의 결합 그루브 또는 틈에서 펩타이드의 비공유 상호작용에 의한 펩타이드 항원 및 MHC 분자의 복합체 또는 회합을 지칭한다. 일부 구현예에서, MHC-펩타이드 복합체는 세포의 표면에 존재하거나 또는 표시된다. 일부 구현예에서, MHC-펩타이드 복합체는 항원 수용체, 예컨대 TCR, TCR-유하 CAR 또는 이의 항원-결합 부분에 의해 특이적으로 인식될 수 있다.
일부 구현예에서, 폴리펩타이드의 펩타이드, 예컨대 펩타이드 항원 또는 에피토프는 예컨대 항원 수용체에 의한 인식을 위해 MHC 분자와 회합할 수 있다. 일반적으로, 펩타이드는 더 긴 생물학적 분자의 단편, 예컨대 폴리펩타이드 또는 단백질로부터 유래하거나, 또는 이를 기초로 한다. 일부 구현예에서, 펩타이드는 길이가 일반적으로 약 8 내지 약 24 개의 아미노산이다. 일부 구현예에서, 펩타이드는 MHC 클래스 II 복합체에서 인식하기 위해 길이가 (약) 9 내지 22 개의 아미노산이다. 일부 구현예에서, 펩타이드는 MHC 클래스 I 복합체에서 인식하기 위해 길이가 (약) 8 내지 13 개의 아미노산이다. 일부 구현예에서, MHC-펩타이드 복합체와 같은 MHC 분자의 맥락에서, 펩타이드의 인식 시, TCR 또는 TCR-유사 CAR와 같은 항원 수용체는 T 세포 반응, 예컨대 T 세포 증식, 사이토카인 제조, 세포독성 T 세포 반응 또는 다른 반응을 유도하는, T 세포에 대한 활성화 신호를 제조 또는 유발한다.
일부 구현예에서, TCR-유사 항체 또는 항원-결합 부분이 공지되어 있거나, 공지된 방법에 의해 제조될 수 있다 (예를 들어, 공개된 미국 특허 출원 US 2002/0150914; US 2003/0223994; US 2004/0191260; US 2006/0034850; US 2007/00992530; US20090226474; US20090304679; 및 국제 PCT 공개 출원 WO 03/068201을 참조한다).
일부 구현예에서, 펩타이드 복합체에 대해 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 부분은 특이적 MHC-펩타이드 복합체를 함유하는 면역원의 유효량으로 숙주를 면역화함으로써 제조될 수 있다. 일부 경우에, MHC-펩타이드 복합체의 펩타이드는 MHC에 결합할 수 있는 항원의 에피토프, 예컨대 종양 항원, 예를 들어 보편적인 종양 항원, 골수종 항원 또는 하기 기재되는 다른 항원의 에피토프이다. 일부 구현예에서, 면역원의 유효량이 이후 면역 반응을 유발하기 위해 숙주에 투여되며, 여기서 면역원은 MHC 분자의 결합 그루브에서 펩타이드의 3차원 존재에 대하여 면역 반응을 일으키기에 충분한 일정 기간 동안 이의 3차원 형태를 유지한다. 이어서, 숙주로부터 수집된 혈청을 분석하여 MHC 분자의 결합 그루브에서 펩타이드의 3차원 존재를 인식하는 원하는 항체가 제조되는지를 결정한다. 일부 구현예에서, 제조된 항체는 이러한 항체가 MHC-펩타이드 복합체를 MHC 분자 단독, 관심 펩타이드 단독, 및 MHC 및 관련이 없는 펩타이드의 복합체와 구별할 수 있음을 확인하기 위해 평가될 수 있다. 원하는 항체는 이후 단리될 수 있다.
일부 구현예에서, MHC-펩타이드 복합체에 대해 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 부분은 항체 라이브러리 디스플레이 방법, 에컨대 파지 항체 라이브러리를 사용하여 제조될 수 있다. 일부 구현예에서, 돌연변이 Fab, scFv 또는 다른 항체 형태의 파지 디스플레이 라이브러리가 생성될 수 있으며, 예를 들어, 라이브러리의 일원은 CDR 또는 CDRs의 하나 이상의 잔기에서 돌연변이된다. 예를 들어, 미국 공개 특허출원 US20020150914, US2014/0294841; 및 문헌 [Cohen CJ. et al. (2003) J Mol. Recogn. 16:324-332]을 참조한다.
본 명세서에서 용어 “항체”는 가장 넓은 의미로 사용되며 다클론성 및 단클론성 항체를 비롯한, 온전한 항체 및 기능성 (항원-결합) 항체 단편을 를 포함하고, 단편 항원 결합 (Fab) 단편, F(ab')2 단편, Fab' 단편, Fv 단편, 재조합 IgG (rIgG) 단편, 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 가변 중쇄 (VH) 영역, 단일 사슬 항체 단편을 비롯한, 단일 사슬 가변 단편 (scFv), 및 단일 도메인 항체 (예를 들어, sdAb, sdFv, 나노바디) 단편을 포함한다. 이러한 용어는 면역글로불린의 유전자 조작된 및/또는 개질된 형태, 예컨대 인트라바디, 펩티바디, 키메라 항체, 전장 인간 항체, 인간화 항체, 및 이종컨쥬게이트 항체, 아중특이성, 예를 들어, 이중특이성, 항체, 다이아바디, 트라이아바디, 및 테트라바디, 탠덤 다이-scFv, 탠덤 tri-scFv를 포함한다. 달리 언급되지 않는 한, 용어 “항체”는 이의 기능적 항체 단편을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 상기 용어는 또한 온전한 또는 전장의 항체를 비롯한, 임의의 클래스 또는 하위클래스의 항체를 포함하며, IgG 및 이의 하위클래스, IgM, IgE, IgA, 및 IgD를 포함한다.
일부 구현예에서, 항원-결합 단백질, 항체 및 이의 항원 결합 단편은 전장 항체의 항원을 특이적으로 인식한다. 일부 구현예에서, 항체의 중쇄 및 경쇄는 전장일 수 있거나, 또는 항원-결합 부분 (Fab, F(ab')2, Fv 또는 단일 사슬 Fv 단편 (scFv))일 수 있다. 다른 구현예에서, 항체 중쇄 불변 영역은, 예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA1, IgA2, IgD, 및 IgE으로부터 선택되며, 구체적으로는, 예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, 및 IgG4으로부터, 더욱 구체적으로, IgG1 (예를 들어, 인간 IgG1)으로부터 선택된다. 또 다른 구현예에서, 항체 경쇄 불변 영역은, 예를 들어, 카파 또는 람다, 구체적으로 카파로부터 선택된다.
제공된 항체 중에는 항체 단편이 있다. "항체 단편(antibody fragment)"은 손상되지 않은(intact) 항체가 결합하는 항원에 결합하는 손상되지 않은 항체의 부분을 포함하는 손상되지 않은 항체 이외의 분자를 지칭한다. 항체 단편의 예로는 Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2; 다이아바디; 선형 항체; 가변 중쇄 (VH) 영역, 단일-사슬 항체 분자 예컨대 scFv 및 단일-도메인 VH 단일 항체; 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 구체적인 구현예에서, 항체는 가변 중쇄 영역 및/또는 가변 경쇄 영역을 포함하는, 예컨대 scFv와 같은 단일-사슬 항체 단편이다.
용어 “가변 영역(variable region)” 또는 “가변 도메인(variable domain)”은 항체가 항원에 결합하는데 관여하는 항체 중쇄 또는 경쇄 도메인을 말한다. 고유 항체의 중쇄와 경쇄 (차례로 VH 및 VL)의 가변 도메인은 일반적으로 유사한 구조를 가지며, 각 도메인은 4개의 보존된 프레임워크 영역 (FRs)과 3개의 CDR을 포함한다. (예를 들어, Kindt et al. Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., page 91 (2007). 참조) 단일 VH 또는 VL 도메인은 항원-결합 특이성을 부여하기에 충분할 수 있다. 더욱이, 특정 항원에 결합하는 항체는 상보성 VL 또는 VH 도메인의 라이브러리를 스크린하기 위하여 항원에 결합하는 항체의 VH 또는 VL 도메인을 이용하여 단리될 수 있다. 예로써, Portolano et al., J. Immunol. 150:880-887 (1993); Clarkson et al., Nature 352:624-628 (1991)를 참조한다.
단일-도메인 항체는 이 항체의 중쇄 가변 도메인의 전부 또는 일부분 또는 경쇄 가변 도메인의 전부 또는 일부분이 포함된 항체 분절들이다. 특정 구현예에서, 단일-도메인 항체는 인간 단일-도메인 항체이다. 일부 구현예에서, CAR은 항원, 예컨대 암 마커 또는 종양 세포 또는 암 세포와 같은 표적화된 세포 또는 질병의 세포 표면 항원, 예컨대 본 명세서에 기재된 또는 기술 분야 내 공지되어 있는 임의의 표적 항원에 특이적으로 결합하는 항체 중쇄 도메인을 포함한다.
항체 단편은 다양한 기법에 의해 제조될 수 있으며, 이러한 기법으로는 온전한 항체의 단백질분해 소화, 뿐만 아니라 재조합 숙주 세포에 의한 제조를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 항체는 재조합으로 제조된 단편, 예컨대 자연적으로 발생하지 않는 배열, 예컨대 합성 링커, 예를 들어, 펩타이드 링커에 의해 연결된 둘 이상의 이상 항체 영역 또는 사슬을 가지는 배열을 포함하는 단편, 및/또는 자연적으로 발생하는 온전한 항체의 효소 소화에 의해 제조될 수 없는 단편이다. 일부 구현예에서, 항체 단편은 scFv이다.
“인간화” 항체는 모든 또는 실질적으로 모든 CDR 아미노산 잔기가 비-인간 CDR으로부터 유래하고, 모든 또는 실질적으로 모든 FR 아미노산 잔기가 인간 FR으로부터 유래한 항체이다. 인간화 항체는 선택적으로 인간 항체로부터 유래한 항체 불변 영역의 적어도 일부를 포함할 수 있다. 비-인간 항체의 “인간화 형태”는, 일반적으로 모체의 비-인간 항체의 특이성 및 친화성을 유지하면서 인간에 대한 면역원성을 감소시키기 위해 인간화를 거치는, 비-인간 항체의 변이체를 지칭한다. 일부 구현예에서, 인간화 항체 내 일부 FR은 비-인간 항체(예를 들어, CDR 잔기가 유래하는 항체)로부터의 상응하는 잔기로 치환되어, 예를 들어, 항체 특이성 또는 친화성을 회복 또는 개선한다.
이에 따라, 일부 구현예에서, TCR-유사 CAR를 비롯한 키메라 항원 수용체는 항체 또는 항체 단편을 포함하는 세포 외 부분을 포함한다. 일부 구현예에서, 항체 또는 단편은 scFv를 포함한다. 일부 양태에서, 키메라 항원 수용체는 항체 또는 단편 및 세포 내 신호 전달 영역을 포함하는 세포 외 부분을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포 내 신호전달 영역은 세포 내 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포 내 신호전달 영역은 1차 신호전달 도메인, T 세포에서 1차 활성화 신호를 유도할 수 있는 신호전달 도메인, T 세포 수용체 (TCR) 요소의 신호전달 도메인 및/또는 면역수용체 타이로신-계 활성화 모티프 (ITAM)를 포함하는 신호전달 도메인이거나 이를 포함한다.
일부 구현예에서, CAR와 같은 재조합 수용체, 예컨대 이의 항체 일부는 스페이서를 추가로 포함할 수 있으며, 이러한 스페이서는 면역글로불린 불변 영역 또는 변형체 또는 이의 개질된 버전의 적어도 일부, 예컨대 힌지 영역, 예컨대, IgG4 힌지 영역, 및/또는 CH1/CL 및/또는 Fc 영역일 수 있거나, 또는 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 재조합 수용체는 스페이서 및/또는 힌지 영역을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 불변 영역 또는 일부분은, 인간 IgG, 예컨대 IgG4 또는 IgG1이다. 일부 양태에서, 불변 영역의 일부는 항원-인식 성분, 예컨대 scFv와 막횡단 도메인 사이의 스페이서 영역으로서 작용한다. 스페이서는 스페이서가 없는 경우와 비교하여, 항원 결합 후 세포의 증가된 반응성을 제공하는 길이의 것일 수 있다. 일부 예시에서, 스페이서는 길이가 약 12개의 아미노산이거나 그 이하이다. 예시적 스페이서는 적어도 약 10 내지 229개의 아미노산, 약 10 내지 200개의 아미노산, 약 10 내지 175개의 아미노산, 약 10내지 150개의 아미노산, 약 10 내지 125개의 아미노산, 약 10 내지 100개의 아미노산, 약 10 내지 75개의 아미노산, 약 10 내지 50개의 아미노산, 약 10 내지 40개의 아미노산, 약 10 내지 30개의 아미노산, 약 10 내지 20개의 아미노산 또는 약 10 내지 15개의 아미노산을 가지는 것들, 및 나열된 범위 중 임의의 종점들 사이의 임의의 정수를 포함하는 것들을 포함한다. 일부 구현예에서, 스페이서 영역은 약 12 개 또는 그 이하의 아미노산, 약 119개 또는 그 이하의 아미노산, 또는 약 229개 또는 그 이하의 아미노산을 가진다. 예시적 스페이서는 IgG4 힌지 단독, CH2 및 CH3 도메인에 연결된 IgG4 힌지, 또는 CH3 도메인에 연결된 IgG4 힌지를 포함한다. 예시적인 스페이서로는, 문헌 Hudecek et al. (2013) Clin. Cancer Res., 19:3153, 또는 국제 특허 출원 공보 WO2014031687에 기재된 스페이서를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 스페이서는 서열 번호 1에 기재된 서열을 가지며, 서열 번호 2에 기재된 서열에 의해 인코딩된다. 일부 구현예에서, 스페이서는 서열 번호 3에 기재된 서열을 갖는다. 일부 구현예에서, 스페이서는 서열 번호 4에 기재된 서열을 갖는다.
일부 구현예에서, 불변 영역 또는 일부분은 IgD의 것이다. 일부 구현예에서, 스페이서는 서열 번호 5에 기재된 서열을 갖는다. 일부 구현예에서, 스페이서는 서열 번호 1, 3, 4 및 5 중 임의의 서열에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 가진다. 일부 구현예에서, 스페이서는 서열 번호 26-31에 기재된 서열을 갖는다. 일부 구현예에서, 스페이서는 서열 번호 23-31 중 임의의 서열에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 가진다.
일부 구현예에서, 항원 수용체는 세포 외 도메인에 직접적으로 또는 간접적으로 연결된 세포 내 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 키메라 항원 수용체는 세포 외 도메인과 세포 내 신호전달 도메인을 연결하는 막횡단 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포 내 신호전달 도메인은 ITAM을 포함한다. 예를 들어, 일부 양태에서, 항원 인식 도메인 (예를 들어 세포 외 도메인) 항원 인식 도메인은 하나 이상의 세포 내 신호 전달 성분, 예컨대 CAR의 경우 TCR 복합체 등의 항원 수용체 복합체 및/또는 다른 세포 표면 수용체 도메인을 통한 신호를 통한 활성화를 모방하는 신호 전달 성분에 연결된다. 일부 구현예에서, 키메라 수용체는 세포 외 도메인 (예를 들어 scFv)과 세포 내 신호전달 도메인 사이에 연결 또는 접합된 막횡단 도메인을 포함한다. 이에 따라, 일부 구현예에서, 항원-결합 성분 (예컨대, 항체)은 하나 이상의 막횡단 도메인 및 세포 내 신호 전달 영역에 연결된다. 일부 구현예에서, 막횡단 도메인은 세포 외 도메인에 융합된다. 한 구현예에서, 수용체 (예컨대, CAR)의 도메인 중 하나에 자연적으로 결합된 막횡단 도메인이 사용된다. 일부 경우에서, 막횡단 도메인은 동일하거나 상이한 표면 막 단백질들의 막경유 도메인들에 이들 도메인들이 결합하지 않도록 하여, 해당 수용체 복합체의 다른 구성원과의 상호작용을 최소화하기 위해 선택되거나 아미노산 치환하여 변형된다.
일부 구현예에서 막횡단 도메인은 천연 또는 합성 공급원으로부터 유도될 수 있다. 천연 공급원인 경우, 도메인은 일부 양태에서 임의의 막-결합된 또는 막횡단 단백질로부터 유도될 수 있다. 막횡단 영역은 (즉, 적어도 막횡단 영역(들)을 포함하는) T-세포 수용체, CD28, CD3 엡실론, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD 16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD 134, CD137, CD154의 알파, 베타 또는 제타 사슬로부터 유도된 영역을 포함한다. 택일적으로 막횡단 도메인은 일부 구현예에서 합성이다. 일부 양태에서, 합성 막횡단 도메인은 주로 소수성 잔기, 예컨대 류신 및 발린을 포함한다. 일부 양태에서, 삼중의 페닐알라닌, 트립토판 및 발린은 합성 막횡단 도메인의 각 말단에서 발견될 것이다. 일부 구현예에서, 결합은 링커, 스페이서 및/또는 막횡단 도메인(들)에 의한다. 일부 양태에서, 막횡단 도메인은 CD28의 막횡단 부분을 포함한다.
일부 구현예에서, 세포 외 도메인과 막횡단 도메인은 직접적으로 또는 간접적으로 연결될 수 있다. 일부 구현예에서, 세포 외 도메인과 막횡단 도메인은 스페이서, 예컨대 본 명세서에 기재된 임의의 스페이서에 의해 연결된다. 일부 구현예에서, 수용체는 막횡단 도메인으로부터 유래하는 분자의 세포 외 부분, 예컨대 CD28 세포 외 부분을 포함한다.
세포 내 신호 전달 도메인 중에는 천연 항원 수용체를 통한 신호, 공동 자극 수용체와 조합하여 그러한 수용체를 통한 신호 및/또는 공동 자극 수용체만을 통한 신호를 모방하거나 이와 비슷한 것들이 있다. 일부 구현예에서, 짧은 올리고- 또는 폴리펩타이드 링커, 예컨대 글리신 및 세린 (예컨대, 이중 글리신-세린)을 포함하는 것과 같은 길이가 2 내지 10개 사이의 아미노산인 링커가 존재하며, 이는 막횡단 도메인과 CAR의 세포질 신호 전달 도메인 사이의 결합을 형성한다.
수용체, 예를 들어, CAR는 일반적으로 적어도 하나의 세포 내 신호 전달 성분 또는 성분들을 포함한다. 일부 구현예에서, 수용체는 TCR 복합체의 세포 내 성분, 예컨대 T 세포 활성화 및 세포 독성을 매개하는 TCR CD3 사슬, 예를 들어, CD3 제타 사슬을 포함한다. 이에 따라, 일부 양태에서, ROR1-결합 항체는 하나 이상의 세포 신호 전달 모듈에 연결된다. 일부 구현예에서, 세포 신호 전달 모듈은 CD3 막횡단 도메인, CD3 세포 내 신호 전달 도메인 및/또는 기타 CD 막횡단 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 수용체, 예를 들어, CAR는 Fc 수용체 γCD8, CD4, CD25 또는 CD16과 같은 하나 이상의 추가적인 분자의 일부를 추가로 포함한다. 예를 들어, 일부 양태에서, CAR은 CD3-제타 (CD3-ζ또는 Fc 수용체 γ및 CD8, CD4, CD25 또는 CD16 사이의 키메라 분자를 포함한다.
일부 구현예에서, CAR의 연결 시, 수용체의 세포질 도메인 또는 세포 내 신호 전달 도메인은 정상 이펙터 기능 또는 면역 세포, 예를 들어 CAR을 발현하도록 조작된 T 세포의 반응 중 적어도 하나를 활성화시킨다. 예를 들어, 일부 상황에서, CAR은 세포 용해 작용 또는 보조 T 작용, 예컨대 사이토카인 또는 기타 인자의 분비와 같은 T 세포의 기능을 유도한다. 일부 구현예에서, 항원 수용체 성분 또는 공동 자극 분자의 세포 내 신호 전달 영역의 절두된 부분은, 예컨대 이펙터 기능 신호를 전달하는 경우에 손상되지 않은 면역 자극 사슬 대신에 사용된다. 일부 구현예에서, 예를 들어, 세포 내 도메인 또는 도메인들은, T 세포 수용체 (TCR)의 세포질 서열, 일부 양태에서 또한 자연적인 상황에서 항원 수용체 결합 후 신호 형질전환을 개시하기 위해 이러한 수용체와 협력하여 작용하는 공동-수용체의 서열, 및/또는 이러한 분자의 임의의 유도체 또는 변형체, 및/또는 동일한 기능적 능력을 가지는 임의의 합성 서열을 을 포함한다.
천연 TCR의 맥락에서, 완전한 활성화는 일반적으로 TCR을 통한 신호 전달뿐만 아니라 공동 자극 신호도 필요로 한다. 이에 따라, 일부 구현예에서, 완전한 활성화를 촉진시키기 위하여, 2차 또는 공동 자극 신호를 발생시키는 성분이 또한 CAR에 포함된다. 다른 구현예에서, CAR은 공동 자극 신호를 생성하기 위한 성분을 포함하지 않는다. 일부 양태에서, 추가적인 CAR은 동일한 세포에서 발현되며, 2차 또는 공동 자극 신호를 생성하기 위한 성분을 제공한다.
T 세포 활성화는 일부 양태에서 다음의 두 종류의 세포질 신호 전달 서열에 의해 매개되는 것으로 설명된다: TCR을 통해 항원-의존적 1차 활성화를 개시하는 서열 (1차 세포질 신호 전달 서열), 및 2차 또는 공동 자극 신호를 제공하기 위해 항원-독립적인 방식으로 작용하는 서열 (2차 세포질 신호 전달 서열). 일부 양태에서, CAR은 이러한 신호 전달 성분들 중 하나 또는 둘 모두를 포함한다.
일부 양태에서, CAR은 TCR 복합체의 1차 활성화를 조절하는 1차 세포질 신호 전달 서열을 포함한다. 자극하는 방식으로 작용하는 1차 세포질 신호 전달 서열은 면역 수용체 타이로신-기반 활성 모티프 또는 ITAM으로 알려진 신호 전달 모티프를 포함할 수 있다. 1차 세포질 신호 전달 서열을 포함하는 ITAM의 예시로는 TCR 또는 CD3 제타, FcR 감마 또는 FcR 베타로부터 유래된 것들을 포함한다. 일부 구현예에서, CAR의 세포질 신호 전달 분자(들)은 세포질 신호 전달 도메인, 이의 일부분, 또는 CD3 제타로부터 유래된 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, CAR은 CD28, 4-1BB, OX40, DAP10 및 ICOS와 같은 공동자극 수용체의 신호 전달 영역 및/또는 막횡단 부분을 포함한다. 일부 양태에서, 동일한 CAR은 신호전달 영역 및 공동자극 성분을 모두 포함한다. 일부 구현예에서, 키메라 항원 수용체는, 예컨대 막횡단 도메인 및 세포 내 신호전달 도메인 사이에, T 세포 공동자극 분자로부터 유래되는 세포 내 도메인 또는 이의 기능적 변이체를 함유한다. 일부 양태에서, T 세포 공동자극 분자는 CD28 또는 41BB이다.
일부 구현예에서, 신호전달 영역 및/또는 활성화 도메인은 하나의 CAR 내에 포함되는 반면, 공동자극 성분은 또 다른 항원을 인식하는 또 다른 CAR에 의해 제공된다. 일부 구현예에서, CAR은 활성화 또는 자극 CAR, 및 공동자극 CAR을 포함하며, 모두 동일한 세포상에 발현된다 (WO2014/055668 참조). 일부 양태에서, 세포는 하나 이상의 자극 또는 활성화 CAR 및/또는 공동자극 CAR을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포는 억제 CAR (iCAR, 문헌 Fedorov et al., Sci. Transl. Medicine, 5(215) (December, 2013) 참조), 예컨대 질환-표적화 CAR을 통해 전달된 활성화 신호가 예컨대 오프-표적화 효과를 감소시키기 위해 억제 CAR이 이의 리간드에 결합함으로써 감소하거나 억제되는, 질환 또는 증상과 관련되고 및/또는 질환 또는 증상에 특이적 것 외의 항원을 인식하는 CAR을 추가로 포함한다.
특정 구현예에서, 세포 내 신호 전달 도메인은 CD3 (예컨대, CD3- 제타) 세포 내 도메인에 연결된 CD28 막횡단 도메인 및 신호 전달 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포 내 신호 전달 도메인은 CD3 제타 세포 내 도메인에 연결된, 키메라 CD28 및 CD137 (4-1BB, TNFRSF9) 공동자극 도메인을 포함한다.
일부 구현예에서, CAR은 하나 이상의, 예컨대 2개 이상의 공동자극 도메인 및 활성화 도메인, 예컨대 1차 활성화 도메인을 세포질 부분에 포함한다. 예시적인 CAR은 CD3-제타, CD28 및 4-1BB의 세포 내 성분을 포함한다.
일부 구현예에서, 항원 수용체는 CAR를 발현하는 마커 및/또는 세포를 추가로 포함하고 또는 다른 항원 수용체는 대리 마커, 예컨대 수용체를 발현하기 위한 세포의 형질도입 또는 조작을 확인하기 위해 사용될 수 있는 세포 표면 마커를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 마커는 CD34, NGFR, 또는 표피 성장 인자 수용체의 전제 또는 일부(예를 들어, 절단형), 예컨대 이러한 세포 표면 수용체의 절단형 (예를 들어, tEGFR)을 포함한다. 예시적인 대리 마커는 세포 표면 폴리펩타이드의 절두된 형태, 예컨대 비-기능적이며, 신호 또는 세포 표면 폴리펩타이드의 전장 형태에 의해 통상적으로 형질도입되는 신호를 형질전환하지 않거나 또는 형질전환할 수 없고, 및/또는 내재화하지 않거나 내재화가 불가능한 절두된 형태를 포함할 수 있다. 예시적인 절두된 세포 표면 폴리펩타이드로는 성장 인자 또는 다른 수용체의 절두된 형태, 예컨대 절두된 인간 상피 성장 인자 수용체 2 (tHER2), 절두된 상피 성장 인자 수용체 (tEGFR, 서열 번호 7 또는 16에 기재된 예시적인 tEGFR 서열) 또는 전립선-특이적 막항원 (PSMA) 또는 이의 개질된 형태를 포함한다. tEGFR은 항체 세툭시맙 (Erbitux®) 또는 다른 치료용 항-EGFL 항체 또는 결합 분자에 의해 인식되는 에피토프를 포함할 수 있는데, 이는 tEGFR 작제물 및 인코딩된 외인성 단백질, 예를 들어 키메라 항원 수용체 (CAR)로 조작된 세포를 동정하거나 선택, 및/또는 인코딩된 외인성 단백질을 발현하는 세포를 제거하거나 분리시키는데 사용될 수 있다. 미국 특허 8,802,374 및 [Liu et al., Nature Biotech. 2016 April; 34(4): 430-434]를 참조한다. 일부 양태에서, 마커, 예를 들어, 대리 마커는, CD34, NGFR, CD19의 전체 또는 일부 (예를 들어, 절두된 형태) 또는 절두된 CD19, 예를 들어, 절두된 비-인간 CD19, 또는 상피 성장 인자 수용체 (예를 들어, tEGFR)를 포함한다. 일부 구현예에서, 마커는 형광 단백질, 예컨대 녹색 형광 단백질 (GFP), 향상된 녹색 형광 단백질 (EGFP), 예컨대 슈퍼-폴드 GFP (sfGFP), 적색 형광 단백질 (RFP), 예컨대 tdTomato, mCherry, mStrawberry, AsRed2, DsRed 또는 DsRed2, 시안 형광 단백질 (CFP), 청록색 형광 단백질 (BFP), 강화된 청색 형광 단백질 (EBFP), 및 황색 형광 단백질 (YFP), 및 이의 변형체, 예를 들어 종 변형체, 단량체 변형체, 및 이러한 형광 단백질의 코돈-최적화 및/또는 향상된 변형체이거나, 또는 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 마커는 효소, 예컨대 루시퍼라제, E. coli의 lacZ 유전자, 알칼리성 포스파타제, 분비된 배아 알칼리성 포스파타제 (SEAP), 클로람페니콜 아세틸렌 트랜스퍼라제 (CAT)이거나, 또는 이를 포함한다. 예시적인 발광 리포터 유전자로는 루시퍼라제 (luc), β-갈락토시다제, 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라제 (CAT), β-글루쿠로니다제 (GUS) 또는 이의 변형체를 포함한다.
일부 구현예에서, 마커는 선별 마커이다. 일부 구현예에서, 선별 마커는 외인성 시제 또는 약물에 대한 내성을 부여하는 폴리펩타이드이거나, 또는 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 선별 마커는 항생제 내성 유전자이다. 일부 구현예에서, 선별 마커는 포유동물 세포에 대한 항생제 내성을 부여하는 항생제 내성 유전자이다. 일부 구현예에서, 선별 마커는 퓨로마이신 내성 유전자, 하이그로마이신 내성 유전자, 블라스티신 내성 유전자, 네오마이신 내성 유전자, 제네티신 내성 유전자 또는 지오신 내성 유전자 또는 이의 변형된 형태이거나, 또는 이를 포함한다.
일부 구현예에서, 마커를 인코딩하는 핵산은 절단 가능한 링커 서열, 예를 들어, T2A와 같은 링커 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하도록 연결된다. 예를 들어, 마커, 및 선택적으로 링커 서열은, 국제 공개 특허 WO2014031687에 기재된 임의의 마커일 수 있다. 예를 들어, 상기 마커는 필요에 따라 T2A 절단 가능 링커 서열과 같은 링커 서열에 연결된, 절단된 EGFR (tEGFR)일 수 있다. 절단형 EGFR (예를 들어 tEGFR)에 대한 예시적인 폴리펩타이드는 서열 번호 7 또는 16에 기재된 tEGFR 서열, 또는 서열 번호 7 또는 16과 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열 상동성을 나타내는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 마커를 인코딩하는 핵산은 절단 가능한 링커 서열, MMP 절단 가능한 링커 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하도록 연결된다. 예를 들어, 마커, 및 선택적으로 링커 서열은, 국제 공개 특허 WO2014031687에 기재된 임의의 마커일 수 있다. 예를 들어, 상기 마커는 필요에 따라 T2A 절단 가능 링커 서열과 같은 링커 서열에 연결된, 절단된 EGFR (tEGFR)일 수 있다.
일부 구현예에서, 마커는 T 세포상에서 자연적으로 발견되지 않거나 T 세포의 표면상에서 자연적으로 발견되지 않는 분자, 예컨대 세포 표면 단백질 또는 이의 일부이다. 일부 구현예에서, 분자는 비-자체 분자, 예컨대 비-자체 단백질이며, 즉 세포가 입양 전달될 숙주의 면역 시스템에 의해 "자체"로 인식되지 않는다.
일부 구현예에서, 마커는 치료 기능을 제공하지 않으며 및/또는 예컨대, 성공적으로 조작된 세포를 선택하기 위한 유전자 조작용 마커로서 사용되는 것 이외의 효과를 발생시키지 않는다. 기타 구현예에서, 마커는 치료용 분자, 또는 그렇지 않으면 입양 전달 및 리간드와의 접촉시 세포의 반응을 증강 및/또는 감쇠시키기 위한 공동자극 또는 면역 체크포인트 분자와 같은, 생체 내에서 접촉하게 될 세포에 대한 리간드 등의 원하는 효과를 발휘하는 분자일 수 있다.
일부 경우에서, CAR은 제1, 제2 및/또는 제3 세대 CAR로 지칭된다. 일부 양태에서, 제1 세대 CAR은 항원 결합시 단독으로 CD3-사슬 유도 신호를 제공하는 것이고; 일부 양태에서, 제2 세대 CAR은 CD28 또는 CD137 등의 공동자극 수용체로부터의 세포 내 신호 전달 도메인을 포함하는 것과 같은, 신호 및 공동자극 신호를 제공하는 것이며; 일부 양태에서, 제3 세대 CAR은 일부 양태에서 상이한 공동자극 수용체의 여러 공동자극 도메인을 포함하는 것이다.
일부 구현예에서, 키메라 항원 수용체는 본 명세서에 기재된 항체 또는 단편을 포함하는 세포 외 부분을 포함한다. 일부 양태에서, 키메라 항원 수용체는 명세서에 기재된 항체 또는 단편 및 세포 내 신호 전달 도메인을 포함하는 세포 외 부분을 포함한다. 일부 구현예에서, 항체 또는 단편은 scFv 또는 단일-도메인 VH 항체를 포함하고, 세포 내 도메인은 ITAM을 포함한다. 일부 양태에서, 세포 내 신호 전달 도메인은 CD3-제타 (CD3ζ) 사슬의 제타 사슬의 신호 전달 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 키메라 항원 수용체는 세포 외 도메인과 세포 내 신호전달 영역 사이에 배치된 막횡단 도메인을 포함한다.
일부 양태에서, 막횡단 도메인은 CD28의 막횡단 부분을 포함한다. 세포 외 도메인 및 막횡단 도메인은 직접적으로 또는 간접적으로 연결될 수 있다. 일부 구현예에서, 세포 외 도메인과 막횡단 도메인은 스페이서, 예컨대 본 명세서에 기재된 임의의 스페이서에 의해 연결된다. 일부 구현예에서, 키메라 항원 수용체는, 예컨대 막횡단 도메인 및 세포 내 신호전달 도메인 사이에, T 세포 공동자극 분자의 세포 내 도메인을 함유한다. 일부 양태에서, T 세포 공동자극 분자는 CD28 또는 4-1BB이다.
일부 구현예에서, CAR은 항체, 예를 들어, 항체 단편, CD28 또는 이의 기능적 변이체의 막횡단 부분이거나 이를 함유하는 막횡단 도메인, 및 CD28의 신호전달 부분 또는 이의 기능적 변이체 및 CD3 제타의 신호전달 부분 또는 이의 기능적 변이체를 함유하는 세포 내 신호전달 도메인을 함유한다. 일부 구현예에서, CAR은 항체, 예를 들어, 항체 단편, CD28 또는 이의 기능적 변이체의 막횡단 부분이거나 이를 함유하는 막횡단 도메인, 및 4-1BB의 신호전달 부분 또는 이의 기능적 변이체 및 CD3 제타의 신호전달 부분 또는 이의 기능적 변이체를 함유하는 세포 내 신호전달 도메인을 함유한다. 이러한 일부 구현예에서, 수용체는 인간 Ig 분자와 같은 Ig 분자의 일부분, 예를 들어 Ig 힌지, 예컨대 IgG4 힌지를 함유하는 스페이서를 더 포함하고, 예컨대 힌지-온리 (hinge-only) 스페이서이다.
일부 구현예에서, 재조합 수용체, 예를 들어, CAR의 막횡단 도메인은 인간 CD28 이의 변이체, 예를 들어, 인간 CD28의 27-아미노산 막횡단 도메인 (기탁 번호: P01747.1)이거나, 또는 서열 번호 8에 기재된 아미노산 서열 또는 서열 번호 8과 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 포함하는 막횡단 도메인이거나, 또는 이를 포함하고; 일부 구현예에서, 재조합 수용체의 일부를 포함하는 막횡단-도메인은 서열 번호 9에 기재된 아미노산 서열 또는 이와 적어도 (약) 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 키메라 항원 수용체는 T 세포 공동자극 분자의 세포 내 도메인을 포함한다. 일부 양태에서, T 세포 공동자극 분자는 CD28 또는 4-1BB이다.
일부 구현예에서, 세포 내 신호전달 영역은 인간 CD28의 세포 내 공동자극 신호전달 도메인 또는 이의 기능적 변이체 또는 일부, 예컨대 41 아미노산 도메인 이의 및/또는 천연 CD28 단백질의 186-187 위치에서 LL이 GG으로 치환된 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포 내 신호전달 도메인은 서열 번호 10 또는 11에 기재된 아미노산 서열, 또는 서열 번호 10 또는 11과 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열 상동성을 나타내는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포 내 영역은 4-1BB의 세포 내 공동자극 신호전달 도메인 또는 이의 기능적 변형체 또는 일부, 예컨대 인간 4-1BB (기탁 번호 Q07011.1)의 42-아미노산 세포질 도메인 또는 이의 기능적 변형체 또는 일부, 예컨대 서열 번호 12에 기재된 서열 또는 서열 번호 12와 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 서열 상동성을 나타내는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 세포 외 신호전달 영역은, 인간 CD3 사슬, 선택적으로 CD3 제타 자극 신호전달 도메인 또는 이의 기능적 변형체, 예컨대 인간 CD3ζ의 동형 3의 112 AA 세포질 도메인 (기탁 번호: P20963.2) 또는 미국 특허 7,446,190 또는 미국 특허 8,911,993에 기재된 CD3 제타 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포 내 신호전달 영역은 서열 번호 13, 14, 또는 15에 기재된 아미노산 서열, 또는 서열 번호 13, 14, 또는 15와 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열 상동성을 나타내는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 측면에서, 스페이서는 오로지 IgG의 힌지 영역만을 함유하는데, 예컨대 IgG4 또는 IgG1의 힌지 영역만, 예컨대 서열 번호 1에 기재된 힌지 온리 스페이서이다. 다른 구현예에서, 스페이서는 Ig 힌지, 예컨대, CH2 및/또는 CH3 도메인에 연결된 IgG4 힌지이다. 일부 구현예에서, 상기 스페이서는 Ig 힌지인데, 예컨대, 서열 번호 3에 기재된 것과 같은 CH2 및 CH3 도메인과 연결된 IgG4 힌지이다. 일부 구현예에서, 상기 스페이서는 Ig 힌지인데, 예컨대 서열 번호 4에 기재된 것과 같은 CH3 도메인과만 연결된 IgG4 힌지이다. 일부 구현예에서, 상기 스페이서는 글리신-세린 풍부 서열 또는 유연 링커로 알려진 것과 같은 기타 유연 링커이거나 이를 포함한다.
예를 들어, 일부 구현예에서, CAR은 항체, 예컨대 항체 단편, 예컨대 scFv, 스페이서, 예컨대 면역글로불린 분자의 일부분을 함유하는 스페이서, 예컨대 힌지 영역 및/또는 중쇄 분자의 하나 이상의 불변 영역, 예컨대 Ig-힌지 함유 스페이서, CD28-유래 막횡단 도메인의 전부 또는 일부분을 함유하는 막횡단 도메인, CD28-유래 세포 내 신호전달 도메인 및 CD3 제타 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, CAR은 항체 또는 단편, 예컨대 scFv, 스페이서, 예컨대 Ig-힌지 함유 스페이서 중 어느 하나, CD28-유래 막횡단 도메인, 4-1BB-유래 세포 내 신호전달 도메인, 및 CD3 제타-유래 신호전달 도메인을 포함한다.
일부 구현예에서, 그러한 CAR 컨스트럭트를 인코딩하는 핵산 분자는 T2A 리보좀 스킵 요소를 인코딩하는 서열 및/또는 tEGFR 서열, 예를 들어 CAR을 인코딩하는 서열의 하류 서열을 더 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 서열은 서열 번호 6 또는 17로 제시되는 T2A 리보좀 스킵 요소 또는 서열 번호 6 또는 17과 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열 상동성을 나타내는 아미노산 서열을 인코딩한다. 일부 구현예에서, 항원 수용체를 발현하는 T 세포 (예컨대, CAR)는 또한 비-면역원성 선별 에피토프로서 절단된 EGFR (EGFRt)를 발현하도록 생성될 수 있는데 (예를 들어, 동일한 컨스트럭트로부터 2 가지 단백질을 발현하기 위하여 T2A 리보좀 스위치에 의하여 분리되는 CAR 및 EGFRt를 인코딩하는 컨스트럭트를 도입함으로써), 이는 그 후 그러한 세포를 검출하는 마커로서 사용될 수 있다 (예를 들어, 미국 특허 8,802,374 참조). 일부 구현예에서, 상기 서열은 서열 번호 7 또는 16으로 제시되는 tEGFR 서열, 또는 서열 번호 7 또는 16과 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열 상동성을 나타내는 아미노산 서열을 인코딩한다. 일부 경우에, T2A와 같은 펩타이드는 리보좀으로 하여금 2A 요소의 C-말단에서 펩타이드 결합의 건너뛰기 (리보좀 스킵핑)를 일으켜, 2A 서열의 말단과 다음 펩타이드 하류 사이의 분리를 유도할 수 있다 (예를 들어, [de Felipe. Genetic Vaccines and Ther. 2:13 (2004)] 및 [de Felipe et al.Traffic 5:616-626 (2004)] 참조). 다수의 2A 요소가 알려져 있다. 본 발명에 개시되는 방법 및 핵산에 사용될 수 있는 2A 서열의 예시는, 제한없이, 미국 특허 공개 번호 20070116690에 기재된 것과 같은 구제역 바이러스 (F2A, 예를 들어, 서열 번호 22), 마(馬) 비염 A 바이러스 (equine rhinitis A virus)(E2A, 예컨대 서열 번호 21), 토시아 어시그나 바이러스 (Thosea asigna virus)(T2A, 예컨대 서열 번호 6 또는 17) 및 돼지 테스코 바이러스-1 (P2A, 예를 들어 서열 번호 19 또는 20) 이다.
대상체에 투여된 세포에 의해 발현되는 CAR과 같은 재조합 수용체는 일반적으로, 치료되는 질병 또는 질병 상태 또는 그의 세포에서 발현되고, 그와 관련되고, 및/또는 그에 특이적인 분자를 인식하거나 또는 그에 특이적으로 결합한다. 분자, 예를 들어 항원에 특이적으로 결합하면, 수용체는 일반적으로 ITAM-도입 신호와 같은 면역자극 신호를 세포 내로 전달하여, 그로 인하여 질병 또는 질병 상태를 표적하는 면역 반응을 촉진시킨다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 상기 세포는 질병 또는 질병 상태의, 또는 질병 또는 질병 상태와 관련된 세포 또는 조직에 의해 발현되는 항원에 특이적으로 결합하는 CAR을 발현한다.
b. 키메라 자가-항체 수용체 (CAAR)
일부 구현예에서, 조작된 세포에 의해 발현된 재조합 수용체 가운데 제공된 방법, 용도, 제조 물품 및 조성물와 관련하여 사용되는 수용체는 키메라 자가항체 수용체 (CAAR)이다. 일부 구현예에서, CAAR은 자가항체에 특이적이다. 일부 구현예에서, CAAR를 발현하는 세포, 예컨대 CARR을 발현하도록 조작된 T 세포는 자가항체-발현 세포에 특이적으로 결합하고 이를 죽이는데 사용될 수 있지만, 정상 항체 발현 세포에는 사용될 수 없다. 일부 구현예에서, CAAR-발현 세포는 자가면역 질병과 같은 자기-항원의 발현과 관련된 자가면역 질병을 치료하는데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, CAAR-발현 세포는 궁극적으로 자가항체를 생산하고 그의 세포 표면 상에 자가항체를 표시하는 B 세포를 표적화 할 수 있고, 이들 B 세포를 치료적 중재를 위한 질병-특이적 표적으로 표시할 수 있다. 일부 구현예에서, CAAR-발현 세포는 항원-특이적 키메라 자가항체 수용체를 사용하여 질병-유발 B 세포를 표적화함으로써 자가면역 질병에서 병원성 B 세포를 효율적으로 표적화하고 사멸시키는데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 재조합 수용체는 CAAR, 예컨대 미국 특허 출원 공보 2017/0051035에 개시된 임의의 수용체이다.
일부 구현예에서, CAAR은 자가항체 결합 도메인, 막횡단 도메인 및 세포 내 신호전달 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포 내 신호전달 영역은 세포 내 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포 내 신호전달 영역은 1차 신호전달 도메인, T 세포에서 1차 활성화 신호를 유도할 수 있는 신호전달 도메인, T 세포 수용체 (TCR) 요소의 신호전달 도메인 및/또는 면역수용체 타이로신-계 활성화 모티프 (ITAM)를 포함하는 신호전달 도메인이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포 내 신호전달 영역은 2차 또는 공동자극 신호전달 영역 (2차 세포 내 신호전달 영역)을 포함한다.
일부 구현예에서, 자가항체 결합 도메인은 자가항원 또는 그의 단편을 포함한다. 자가항원의 선택은 표적화 될 자가항체의 유형에 달려 있다. 예를 들어, 자가항원은, 그것이 특정 질병 상태, 예컨대 자기면역 질병, 예컨대 자가항체-매개 자가면역 질병과 관련된, B 세포와 같은 표적 세포상의 자가항체를 인식하기 때문에 선택될 수 있다. 일부 구현예에서, 자가면역 질병은 심상성 천포창 (pemphigus vulgaris, PV)을 포함한다. 예시적인 자가항원은 데스모글레인 1 (Dsg1) 및 Dsg3을 포함한다.
c. 다중-표적화
일부 구현예에서, 제공된 방법, 용도, 제조 물품 및 조성물과 관련하여 사용되는 세포는 다중 표적화 전략을 포함한다. 일부 구현예에서, 이러한 세포는 세포 상에 다중-사슬 키메라 항원 수용체 (CAR)를 발현하거나 또는 2가지 이상의 유전자 조작된 수용체의 발현하며, 각각은 상이한 항원의 동일한 것을 인식하고 전형적으로 각각은 상이한 세포 내 신호 전달 성분을 포함한다. 이러한 다중 표적화 전략은 예컨대, 국제 특허 출원 공보 WO 2014055668 A1 (예컨대, 오프-표적 (예컨대, 정상 세포)상에 개별적으로 존재하지만 치료하고자 하는 질환 또는 증상 세포에서만 함께 존재하는, 2개의 상이한 항원을 표적으로 하는 활성화 및 공동자극 CAR의 조합을 기술함) 및 문헌 Fedorov et al., Sci. Transl. Medicine, 5(215) (2013) (활성화 및 억제 CAR을 발현하는 세포들, 예컨대 활성화 CAR은 정상 또는 비-질환성 세포 및 치료될 질환 또는 증상 세포 모두에서 발현되는 하나의 항원에 결합하고, 억제 CAR은 정상 세포 또는 치료를 원하지 않는 세포상에서만 발현되는 또 다른 항원에 결합하는 것인 세포들을 기술함)에 기술되어 있다.
예를 들어, 일부 구현예에서, 세포는 일반적으로 제1 수용체에 의해 인식되는 항원 (예컨대, 제1 항원)에 특이적으로 결합시, 세포에 활성화 또는 자극 신호를 유도할 수 있는 제1 유전자 조작된 항원 수용체 (예컨대, CAR 또는 TCR)를 발현하는 수용체를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포는 일반적으로 제2 수용체에 의하여 인식되는 제2 항원에 특이적 결합시, 면역 세포에 대한 공동자극 신호를 유도할 수 있는, 유전적으로 조작된 제2 항원 수용체 (예컨대 CAR 또는 TCR), 예컨대 키메라 공동자극 수용체를 더 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 항원 및 제2 항원은 동일하다 일부 구현예에서, 제1 항원 및 제2 항원은 상이하다.
일부 구현예에서, 제1 및/또는 제2 유전자 조작된 항원 수용체 (예컨대, CAR 또는 TCR)는 세포에 활성화 신호를 유도할 수 있다. 일부 구현예에서, 수용체는 ITAM 또는 ITAM-유사 모티프를 포함하는 세포 내 신호 전달 성분을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 수용체에 의해 유도된 활성화는 신호 전달 또는 세포에서 단백질 발현의 변화를 수반하는데, 그 결과 면역 반응의 개시, 예컨대 ITAM 인산화 및/또는 ITAM-매개 신호 전달 캐스케이드의 개시, 면역학적 시냅스의 형성 및/또는 결합된 수용체 근처에서 분자들의 클러스터링 (예컨대, CD4 또는 CD8 등), 하나 이상의 전사 인자의 활성화, 예컨대 NF-κB 및/또는 AP-1, 및/또는 예컨대 사이토카인과 같은 인자들의 유전자 발현, 증식, 및/또는 생존의 유도가 일어난다.
일부 구현예에서, 상기 제1 및/또는 제2 수용체는 CD28, CD137 (4-1BB), OX40 및/또는 ICOS와 같은 공동자극 수용체의 세포 내 신호전달 도메인 또는 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 제1 및 제2 수용체는 상이한 공동자극 수용체의 세포 내 신호전달 도메인을 포함한다. 하나의 구현예에 있어서, 상기 제1 수용체는 CD28 공동자극 신호전달 영역을 함유하고, 제2 수용체는 4-1BB 공-자극 신호전달 영역을 함유하며, 또는 그 역도 마찬가지이다.
일부 구현예에서, 제1 및/또는 제2 수용체는 ITAM 또는 ITAM-유사 모티프를 포함하는 세포 내 신호 전달 도메인 및 공동자극 수용체의 세포 내 신호 전달 도메인을 모두 포함한다.
일부 구현예에서, 제1 수용체는 ITAM 또는 ITAM-유사 모티프를 포함하는 세포 내 신호 전달 도메인을 포함하고, 제2 수용체는 공동자극 수용체의 세포 내 신호 전달 도메인을 포함한다. 동일한 세포에서 유도된 활성화 신호와 조합하여 공동자극 신호는 면역 반응, 예컨대 증가된 유전자 발현, 사이토카인 및 기타 인자들의 분비 및 세포 살해와 같은 T 세포 매개 이펙터 기능 등의 강력하고 지속적인 면역 반응을 야기하는 신호이다.
일부 구현예에서, 제1 수용체의 결찰 단독으로 또는 제2 수용체의 결찰 단독으로는 모두 강력한 면역 반응을 유도하지 않는다. 일부 양태에서, 오직 하나의 수용체만이 결찰된다면, 세포는 항원에 내성을 가지거나 무반응성이 되거나 억제되고, 및/또는 인자를 증식 또는 분비하거나 이펙터 기능을 수행하도록 유도되지 않는다. 그러나, 일부 그러한 구현예에서, 제1 및 제2 항원을 발현하는 세포의 만남과 같이 다수의 수용체가 결찰될 때, 예컨대 하나 이상의 사이토카인의 분비, 증식, 지속 및/또는 표적 세포의 세포 독성 살해와 같은 면역 이펙터 기능의 수행에 의해 지시되는 바와 같이, 완전 면역 활성화 또는 자극 등의 원하는 반응이 달성된다.
일부 구현예에서, 두 수용체는 각각 세포에 대한 활성화 및 억제 신호를 유도하여, 수용체 중 하나에 의한 이의 항원에 대한 결합은 세포를 활성화시키거나 반응을 유도하지만, 두 번째 억제 수용체에 의한 이의 항원에 대한 결합은 반응을 억제하거나 감쇠시키는 신호를 유도한다. 예시로는 활성화 CAR과 억제 CAR, 즉 iCAR의 조합이 있다. 이러한 전략은 예컨대, 활성화 CAR은 질환 또는 증상에서 발현되지만 정상 세포에서도 발현되는 항원과 결합하고, 억제 수용체는 정상 세포에서 발현되지만 질환 또는 증상의 세포에서는 발현되지 않는 별도의 항원과 결합하는데 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 다중 표적화 전략은 특정 질환 또는 증상과 관련된 항원이 비-질환 세포상에서 발현되는 경우 및/또는 일시적으로 (예컨대, 유전자 조작과 관련된 자극시) 또는 영구적으로 조작된 세포 자체에서 발현되는 경우 사용된다. 이러한 경우, 2개의 분리된 개별 항원 수용체의 결찰을 필요로 함으로써, 특이성, 선택성 및/또는 효능이 개선될 수 있다.
일부 구현예에서, 다수의 항원, 예컨대 제1 및 제2 항원은 세포, 조직, 또는 암세포와 같이 표적화되는 질병 또는 증상 세포상에서 발현된다. 일부 양태에서, 세포, 조직, 질병 또는 증상 세포는 다발성 골수종 또는 다발성 골수종 세포이다. 일부 구현예에서, 다수의 항원 중 하나 이상은 일반적으로 정상 또는 비-질환 세포 또는 조직, 및/또는 조작된 세포 자체와 같은 세포 요법으로 표적화하는 것이 바람직하지 않은 세포상에서 또한 발현된다. 이러한 구현예에서, 세포의 반응을 달성하기 위해 다수의 수용체의 결찰을 필요로 함으로써, 특이성 및/또는 효능이 달성된다.
d. T 세포 수용체 (TCR)
일부 구현예에서, 조작된 세포, 예컨대 T 세포는 표적 폴리펩타이드, 예컨대 종양, 바이러스 또는 자가면역 단백질의 항원의 펩타이드 에피토프 또는 T 세포 에피토프를 인식하는 T 세포 수용체 (TCR) 또는 이의 항원-결합 일부를 발현하는 세포가 제공된다.
일부 구현예에 있어서, "T 세포 수용체" 또는 "TCR"은 가변 α 및 β 쇄 (각각, TCRα 및 TCRβ로도 알려짐) 또는 가변 γ 및 δ 쇄 (또한, 각각 TCRα 및 TCRβ로도 알려짐), 또는 이의 항원-결합 부분을 포함하고, MHC 분자에 결합된 펩타이드에 특이적으로 결합할 수 있는 분자이다. 일부 구현예에서, TCR은 αβ 형태이다. 통상, αβ와 γδ 형태로 존재하는 TCR은 일반적으로 구조적으로 유사하지만, 이들을 발현하는 T 세포는 별개의 해부학적 위치 또는 기능을 가질 수 있다. TCR은 세포 표면상에서 또는 가용성 형태로 발견된다. 일반적으로, TCR은, 일반적으로 주조직 적합성 복합체 (MHC) 분자에 결합된 항원을 인식하는 역할을 하는 T 세포 (또는 T 림프구)의 표면에서 발견된다.
달리 언급하지 않는 한, 용어 "TCR"은 완전 TCR 뿐만 아니라 그의 항원-결합 부분 또는 항원-결합 단편을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 일부 구현예에서, TCR은 온전한 또는 전장 TCR이고, 예컨대 αβ 형태 또는 γδ 형태의 TCR이다. 일부 구현예에서, TCR은 전장 TCR 보다 짧지만 MHC 분자에서 결합된 특정 펩타이드에 결합하는 항원-결합 부분이고, 예컨대 MHC-펩타이드 복합체에 결합한다. 일부 경우, TCR의 항원-결합 부분 또는 단편은 전장 또는 온전한 TCR의 구조적 도메인의 일부분만을 함유하지만, 여전히 상기 전장 TCR이 결합하는 MHC-펩타이드 복합체와 같은 펩타이드 에피토프에 결합할 수 있다. 일부 경우, 항원-결합 부분은 특정 MHC-펩타이드 복합체에 결합하기 위한 결합 위치를 형성하기에 충분한, TCR의 가변 도메인, 예컨대 가변 α 사슬 및 가변 β 사슬를 포함한다. 일반적으로, TCR의 가변 사슬들은 펩타이드, MHC 및/또는 MHC-펩타이드 복합체의 인식에 관여하는 상보성 결정 영역을 포함한다.
일부 구현예에서, TCR의 가변 도메인은 초가변 루프 또는 상보성 결정 영역 (CDR)을 함유하는데, 이것이 일반적으로 항원 인식 및 결합 능력 및 특이성에 주로 기여한다. 일부 구현예에서, TCR의 CDR 또는 그들의 조합은 주어진 TCR 분자의 항원-결합 위치의 전부 또는 실질적으로 전부를 형성한다. TCR 사슬의 가변 영역 내 다양한 CDR은 일반적으로 구조 영역 (FR)에 의해 분리되는데, 이는 CDR과 비교하여 TCR 분자 중에서 일반적으로 가변성이 덜 나타난다 (예를 들어, [Jores et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. U.S.A. 87:9138, 1990]; [Chothia et al., EMBO J. 7:3745, 1988] 참조; 또한 [Lefranc et al., Dev. Comp. Immunol. 27:55, 2003] 참조). 일부 구현예에서, CDR3이 항원 결합 또는 특이성을 책임지는 주 CDR이거나, 또는 항원 인식을 위해 및/또는 펩타이드-MHC 복합체의 가공된 펩타이드 부분과 상호 작용하기 위하여 주어진 TCR 가변 영역상의 3 개의 CDR 중에서 가장 중요하다. 일부 상황에서, 알파 사슬의 CDR1은 특정 항원 펩타이드의 N-말단 부분과 상호 작용할 수 있다. 일부 상황에서, 베타 사슬의 CDR1은 펩타이드의 C-말단 부분과 상호 작용할 수 있다. 일부 상황에서, CDR2는 MHC-펩타이드 복합체의 MHC 부분과의 상호 작용 또는 그의 인식을 책임지는 주 CDR에 가장 크게 기여하거나 그러한 CDR이다. 일부 구현예에서, β-사슬의 가변 영역은 추가적인 초변이 영역을 함유할 수 있는데 (CDR4 또는 HVR4), 이는 일반적으로 항원 인식이 아닌 초항원 (superantigen) 결합과 관련된다 (Kotb (1995) Clinical Microbiology Reviews, 8:411-426).
일부 구현예에서, TCR은 또한 불변 도메인, 막횡단 도메인 및/또는 짧은 세포질 꼬리를 함유 할 수 있다 (예컨대, [Janeway et al., Immunobiology: The Immune System in Health and Disease, 3rd Ed., Current Biology Publications, p. 4:33, 1997] 참조). 일부 측면에서, TCR의 각 사슬은 하나의 N-말단 면역글로불린 가변 도메인, 하나의 면역글로불린 불변 도메인, 막횡단 영역 및 C-말단에서 짧은 세포질 꼬리를 가질 수 있다. 일부 구현예에서, TCR은 신호 전달을 매개하는 것과 관련된 CD3 복합체의 불변 단백질들과 관련된다.
일부 구현예에서, TCR 사슬은 하나 이상의 불변 도메인을 포함한다. 예를 들어, 주어진 TCR 사슬 (예컨대, α-사슬 또는 b-사슬)의 세포 외 부분은 세포 막에 인접하여 2 개의 면역글로불린-유사 도메인을 함유할 수 있는데, 예컨대 가변 도메인 (예컨대, Vα 또는 Vb; 통상 카밧 (Kabat) 번호매김에 기초하여 아미노산 1 내지 116, [Kabat et al., "Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services, Public Health Service National Institutes of Health, 1991, 5th ed.]) 및 불변 도메인 (예컨대, α-사슬 불변 도메인 또는 Cα, 통상 카밧 번호매김에 기초하여 사슬 중 117 내지 259 위치 또는 b 사슬 불변 도메인 또는 Cb, 통상 카밧에 기초하여 사슬 중 117 내지 295 위치)이다. 예를 들어, 일부 경우, 2 개의 사슬에 의해 형성된 TCR의 세포 외 부분은 2 개의 막-근위 불변 도메인 및 2 개의 막-말단 가변 도메인을 포함하는데, 가변 도메인 각각은 CDR을 포함한다. TCR의 불변 도메인은, 시스테인 잔기가 이황화 결합을 형성하여 이에 의해 TCR의 두 사슬를 연결하는 짧은 연결 서열을 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, TCR은 α 및 β 사슬 각각에 추가의 시스테인 잔기를 가질 수 있어서, TCR은 불변 도메인에서 2 개의 이황화 결합을 포함한다.
일부 구현예에서, TCR 사슬은 막횡단 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서 막횡단 도메인은 양전하를 띤다. 일부 경우에는, TCR 사슬은 세포질 꼬리를 포함한다. 일부 경우, 상기 구조는 TCR이 CD3 및 그의 서브 유닛과 같은 다른 분자와 결합하는 것을 허용한다. 예를 들어, 막횡단 영역을 갖는 불변 도메인을 함유하는 TCR은 세포막 내의 단백질을 고정시키고 CD3 신호전달 장치 또는 복합체의 불변 서브 유닛과 결합 할 수 있다. CD3 신호전달 서브 유닛 (예를 들어, CD3γ, CD3δ, CD3ε 및 CD3ζ 사슬)의 세포 내 꼬리는 TCR 복합체의 신호전달 능력에 관계된 하나 이상의 면역수용체 타이로신-계 활성화 모티프 또는 ITAM을 포함한다.
일부 구현예에서, TCR은 2 개의 사슬 α 및 β (또는 필요에 따라, γ 및 δ)의 이종이량체이거나 단일 사슬 TCR 컨스트럭트일 수 있다. 일부 구현예에서, TCR은 이황화 결합 또는 이황화 결합들에 의해 연결된 2 개의 분리 된 사슬 (α 및 β 사슬 또는 γ 및 δ 사슬)를 함유하는 이종이량체이다.
일부 구현예에서, TCR은 Vα, β 사슬의 서열과 같은 공지된 TCR 서열(들)로부터 생성될 수 있는데, 이들에 대하여 실질적으로 전장 코딩 서열이 용이하게 이용 가능하다. 세포 공급원으로부터 V 사슬 서열을 포함하는 전장 TCR 서열을 얻는 방법은 잘 알려져 있다. 일부 구현예에서, TCR을 인코딩하는 핵산은 다양한 원으로부터 얻어질 수 있는데, 예컨대 주어진 세포 또는 세포들 내에서 또는 그로부터 분리된 TCR-인코딩 핵산의 중합 효소 연사슬 반응 (PCR) 증폭에 의하여 또는 공개적으로 입수 가능한 TCR DAN 서열을 합성함에 의하여 얻어질 수 있다.
일부 구현예에서, TCR은 생물학적 원으로부터 얻어지는데, 예컨대 세포로부터, 예컨대 T 세포 (예를 들어, 세포 독성 T 세포), T 세포 하이브리도마 또는 다른 공개적으로 입수 가능한 원으로부터 얻어진다. 일부 구현예에서, T 세포는 생체 내 분리된 세포로부터 수득될 수 있다. 일부 구현예에서, TCR은 흉선학적으로 (thymically) 선택된 TCR이다. 일부 구현예에서, TCR은 신에피토프-제한 (neoepitope-restricted) TCR이다. 일부 구현예에서, T-세포는 배양된 T-세포 하이브리도마 또는 클론일 수 있다. 일부 구현예에서, TCR 또는 이의 항원-결합 부분 또는 이의 항원-결합 단편은 TCR의 서열의 지식으로부터 합성으로 생성될 수 있다.
일부 구현예에서, TCR은 표적 폴리펩타이드 항원 또는 그의 표적 T 세포 에피토프에 대한 후보 TCR 라이브러리의 스크리닝하는 것으로부터 선택되거나 또는 동정된 TCR로부터 생성된다. TCR 라이브러리는 PBMC, 비장 또는 다른 림프 기관에 존재하는 세포를 포함하여 대상체로부터 분리된 T 세포로부터 Vα 및 Vβ 레파토리를 증폭함으로써 생성될 수 있다. 일부 경우에, T 세포는 종양-침윤 림프구 (TIL)로부터 증폭될 수 있다. 일부 구현예에서, TCR 라이브러리는 CD4+ 또는 CD8+ 세포로부터 생성될 수 있다. 일부 구현예에서, TCR은 건강한 대상체의 정상 T 세포원, 즉 정상 TCR 라이브러리로부터 증폭될 수 있다. 일부 구현예에서, TCR은 질병이 있는 대상체의 T 세포원, 즉 질병이 있는 TCR 라이브러리로부터 증폭될 수 있다. 일부 구현예에서, 축퇴 (degenerate) 프라이머는 인간으로부터 수득된 T 세포와 같은 샘플에서 예컨대 RT-PCR에 의하여 Vα 및 Vβ의 유전자 레퍼토리를 증폭시키는데 사용된다. 일부 구현예에서, scTv 라이브러리는 증폭된 산물이 클로닝되거나 어셈블리 되어 링커에 의해 분리되는 나이브 Vα 및 Vβ 라이브러리로부터 어셈블리 될 수 있다. 대상체 및 세포의 공급원에 따라 라이브러리는 HLA 대립형질-특이적일 수 있다. 택일적으로, 일부 구현예에서, TCR 라이브러리는 모체 또는 스캐폴드 TCR 분자의 돌연변이화 또는 다양화에 의해 생성될 수 있다. 일부 양태에서, TCR은 예를 들어 α 또는 β 사슬의 돌연변이화에 의하여 설명된 진화 (directed evolution)의 대상이 된다. 일부 구현예에서, TCR의 CDR 내의 특정 잔기가 변경된다. 일부 구현예에서, 선택된 TCR은 친화적 성숙에 의해 변형될 수 있다. 일부 구현예에서, 항원 특이적 T 세포는, 예컨대 펩타이드에 대한 CTL 활성을 평가하기 위한 스크리닝에 의하여 선택될 수 있다. 일부 측면에서, TCR, 예를 들어 항원-특이적 T 세포 상에서 존재하는 TCR은, 예컨대 결합 활성에 의하여, 예컨대 상기 항원에 대한 특정 친화도 또는 결합력 (avidity)에 의하여 선택될 수 있다.
일부 구현예에서, TCR 또는 그의 항원-결합 부분은 변형되거나 조작된 것이다. 일부 구현예에서, 설명된 진화 방법이 이용되어, 특정 MHC-펩타이드 복합체에 대한 보다 높은 친화성을 갖는 것과 같은 변화된 특성을 갖는 TCR을 생성시킨다. 일부 구현예에서, 설명된 진화는 디스플레이 방법, 예컨대 비한정적인 예로서 효모 디스플레이 (Holler et al. (2003) Nat Immunol, 4, 55-62; Holler et al. (2000) Proc Natl Acad Sci U S A, 97, 5387-92), 파지 디스플레이 (Li et al. (2005) Nat Biotechnol, 23, 349-54) 또는 T 세포 디스플레이 (Chervin et al. (2008) J Immunol 방법, 339, 175-84)에 의하여 달성된다. 일부 구현예에서, 디스플레이 접근법은 공지된, 모체 또는 레퍼런스 TCR을 조작하는것 또는 변형하는 것을 포함한다. 예를 들어, 일부 경우에, 야생형 TCR은, 그 TCR에서 CDR의 하나 이상의 잔기가 돌연변이되는 돌연변이화된 TCR을 생성하기 위한 주형으로서 사용될 수 있고, 원하는 변경된 성질을 갖는 돌연변이체, 예를 들어 원하는 표적 항원에 대한 더 높은 친화도의 돌연변이체가 선택된다.
일부 구현예에서, 대상 TCR을 생산하거나 생성시키는 데 사용하기 위한 표적 폴리펩타이드의 펩타이드는 공지되어 있거나 당업자에 의하여 쉽게 확인될 수 있다. 일부 구현예에서, TCR 또는 항원-결합 부분을 생성시키는 데 사용하기에 적합한 펩타이드는 대상 표적 폴리펩타이드, 예를 들어 하기 기술되는 표적 폴리펩타이드에서 HLA-제한 모티프의 존재에 기초하여 결정될 수 있다. 일부 구현예에서, 펩타이드는 이용가능한 컴퓨터 예측 모델을 사용하여 식별된다. 일부 구현예에서, MHC 클래스 I 결합 위치를 예측하기 위한 모델로서, ProPred1 (Singh and Raghava (2001) Bioinformatics 17(12):1236-1237), 및 SYFPEITHI ([Schuler et al. (2007) Immunoinformatics Methods in Molecular Biology, 409(1): 75-93 2007] 참조)를 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 일부 구현예에서, MHC-제한된 에피토프는 HLA-A0201인데, 이는 전체 코카시언의 대략 39-46%에서 발현되며, 따라서 TCR 또는 기타 MHC-펩타이드 결합 분자를 제조하는데 사용하기 위한 MHC 항원의 적절한 선택을 대표한다.
컴퓨터 예측 모델을 이용하여 HLA-A0201-결합 모티프 및 프로테아좀 및 면역-프로테아좀의 절단 위치는 당업자에게 공지되어 있다. MHC 클래스 I 결합 위치를 예측하기 위한 그러한 모델은 ProPred1 ([Singh and Raghava, ProPred: prediction of HLA-DR binding sites. BIOINFORMATICS 17(12):1236-1237 2001]에 보다 자세히 기술됨), 및 SYFPEITHI ([Schuler et al. SYFPEITHI, Database for Searching and T-Cell Epitope Prediction. in Immunoinformatics Methods in Molecular Biology, vol 409(1): 75-93 2007] 참조)를 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
일부 구현예에서, TCR 또는 그의 항원 결합 부분은 결합 특성과 같은 하나 이상의 특성이 변경된, 재조합적으로 생산된 천연 단백질 또는 그들의 돌연변이된 형태일 수 있다. 일부 구현예에서, TCR은 인간, 마우스, 래트 또는 다른 포유 동물과 같은 다양한 동물 종 중 하나로부터 유래될 수 있다. TCR은 세포-결합된 것 또는 가용성 형태일 수 있다. 일부 구현예에서, 제공되는 방법의 목적상, TCR은 세포 표면 상에 발현된 세포-결합된 형태이다.
일부 구현예에서, TCR은 전장 TCR이다. 일부 구현예에서, TCR은 항원-결합 부분이다. 일부 구현예에서, TCR은 이량체 TCR (dTCR)이다. 일부 구현예에서, TCR은 단일-사슬 TCR (sc-TCR)이다. 일부 구현예에서, dTCR 또는 scTCR은 WO 03/020763, WO 04/033685, WO2011/044186에 기재된 바와 같은 구조를 갖는다.
일부 구현예에서, TCR은 막횡단 서열에 상응하는 서열을 함유한다. 일부 구현예에서, TCR은 세포질 서열에 상응하는 서열을 함유한다. 일부 구현예에서, TCR은 CD3과 함께 TCR 복합체를 형성할 수 있다. 일부 구현예에서, dTCR 또는 scTCR을 포함하는 임의의 TCR은 T 세포의 표면 상에 활성 TCR을 생성하는 신호전달 도메인에 연결될 수 있다. 일부 구현예에서, TCR은 세포 표면에서 발현된다.
일부 구현예에서, dTCR은, TCR α 사슬 가변 영역 서열에 상응하는 서열이 TCR α 사슬 불변 영역 세포 외 서열에 상응하는 서열의 N 말단에 융합된 제1 폴리펩타이드, 및 TCR β 사슬 가변 영역 서열에 상응하는 서열이 TCR β 사슬 분변 영역 세포 외 서열에 상응하는 서열의 N 말단에 융합된 제2 폴리펩타이드를 함유하는데, 상기 제1 및 제2 폴리펩타이드는 이황화 결합에 의해 연결된다. 일부 구현예에서, 상기 결합은 본래의 이량체 αβ TCR에 존재하는 본래의 내부-사슬 이황화 결합에 해당할 수 있다. 일부 구현예에서, 사슬간 이황화 결합은 천연 TCR에는 존재하지 않는다. 예를 들어, 일부 구현예에서, dTCR 폴리펩타이드 쌍의 불변 영역 세포 외 서열에 하나 이상의 시스테인이 혼입될 수 있다. 일부 경우에, 천연 및 비-천연 이황화 결합 양자 모두가 바람직할 수 있다. 일부 구현예에서, TCR은 막에 결착하기 위해 막횡단 서열을 함유한다.
일부 구현예에서, dTCR은, 가변 α 도메인, 불변 α 도메인 및 상기 불변 α 도메인의 C-말단에 부착된 제1 이합체화 모티프를 함유하는 TCR α 사슬, 및 가변 β 도메인, 불변 β 도메인 및 상기 불변 β 도메인의 C-말단에 부착된 제2 이합체화 모티프를 포함하는 TCR β 사슬를 함유하고, 상기 제1 및 제2 이합체화 모티프는 쉽게 상호 작용하여 상기 제1 이합체화 모티프의 아미노산과 상기 제2 이합체화 모티프의 아미노산 간 공유 결합을 형성하여, TCR α 사슬와 TCR β 사슬를 함께 연결한다.
일부 구현예에서, TCR은 scTCR이다. 통상, scTCR은 당업자에게 공지된 방법을 사용하여 생성될 수 있다 (예를 들어, [Soo Hoo, W. F. et al. PNAS (USA) 89, 4759 (1992)]; [Wulfing, C. and Pluckthun, A., J. Mol. Biol. 242, 655 (1994)]; [Kurucz, I. et al. PNAS (USA) 90 3830 (1993)]; 국제 공개 PCT WO 96/13593, WO 96/18105, WO99/60120, WO99/18129, WO 03/020763, WO2011/044186; 및 [Schlueter, C. J. et al. J. Mol. Biol. 256, 859 (1996)] 참조). 일부 구현예에서, scTCR은 도입된 비-천연 (비-나이브) 이황화 사슬간 결합을 함유하여 TCR 사슬들의 결합을 촉진시킨다 (예를 들어, 국제 공개 PCT WO 03/020763 참조). 일부 구현예에서, scTCR은, 그의 C-말단에 융합된 이종의 류신 지퍼가 사슬 결합을 용이하게 하는 비-이황화 결합된 절단된 TCR이다 (예를 들어, 국제 공개 PCT WO 99/60120 참조). 일부 구현예에서, scTCR은 펩타이드 링커를 통해 TCRβ 가변 도메인에 공유 결합된 TCRα 가변 도메인을 함유한다 (국제 공개 PCT No. WO99/18129 참조).
일부 구현예에서, scTCR은, TCR α 사슬 가변 영역에 상응하는 아미노산 서열로 구성되는 제1 분절, TCR β 사슬 불변 도메인 세포 외 서열에 상응하는 아미노산 서열의 N 말단에 융합된 TCR β 사슬 가변 영역 서열에 상응하는 아미노산 서열로 구성되는 제2 분절, 및 상기 제1 분절의 C 말단을 상기 제2 분절의 N 말단에 연결하는 링커 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, scTCR은, α 사슬 세포 외 불변 도메인 서열의 N 말단에 융합된 α 사슬 가변 영역 서열로 구성되는 제1 분절, 및 β 사슬 세포 외 불변 서열의 N 말단에 융합된 β 사슬 가변 영역 서열 및 막횡단 서열로 구성되는 제2 분절, 및, 필요에 따라 상기 제1 분절의 C 말단을 상기 제2 분절의 N 말단에 연결하는 링커 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, scTCR은, β 사슬 세포 외 불변 도메인 서열의 N 말단에 융합된 TCR β 사슬 가변 영역 서열로 구성되는 제1 분절, 및 α 사슬 세포 외 불변 서열의 N 말단에 융합된 α 사슬 가변 영역 서열 및 막횡단 서열로 구성되는 제2 분절, 및, 필요에 따라 상기 제1 분절의 C 말단을 상기 제2 분절의 N 말단에 연결하는 링커 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 제1 및 제2 TCR 분절을 연결시키는 scTCR의 링커는 TCR 결합 특이성을 유지하면서 단일 폴리펩타이드 가닥을 형성할 수 있는 임의의 링커일 수 있다. 일부 구현예에서, 링커 서열은 예를 들어 식 -P-AA-P-를 가질 수 있는데, 여기서 P는 프롤린이고 AA는 그 아미노산이 글리신 및 세린 인 아미노산 서열을 나타낸다. 일부 구현예에서, 상기 제1 및 제2 분절은 그들의 가변 영역 서열이 그러한 결합을 위해 배향되도록 쌍을 이룬다. 따라서 일부 경우에, 상기 링커는 상기 제1 분절의 C 말단과 상기 제2 분절의 N 말단 간의 거리를 아우르는 충분한 길이를 가지거나 그 역도 마찬가지이지만, scTCR의 그 표적 리간드로의 결합을 차단하거나 감소시킬 만큼 너무 길지는 않다. 일부 구현예에서,상기 링커는 10 내지 45 개 아미노산, 예컨대 10 내지 30 개 아미노산, 또는 26 내지 41 개 아미노산 잔기, 예컨대 29, 30, 31 또는 32 개의 아미노산, 또는 약 그 정도의 아미노산을 함유 할 수있다. 일부 구현예에서, 상기 링커는 식 -PGGG-(SGGGG)5-P-를 갖는데, 여기서 P는 프롤린, G는 글리신 및 S는 세린이다 (서열 번호 32). 일부 구현예에서, 상기 링커는 서열 GSADDAKKDAAKKDGKS (서열 번호 33)을 갖는다.
일부 구현예에서, scTCR은 α 사슬의 불변 도메인의 면역글로불린 영역의 잔기를, β 사슬의 불변 도메인의 면역글로불린 영역의 잔기에 연결하는 공유 이황화 결합을 포함한다. 일부 구현예에서, 천연 TCR에서 사슬간 (interchain) 이황화 결합은 존재하지 않는다. 예를 들어, 일부 구현예에서, scTCR 폴리펩타이드의 제1 및 제2 분절의 불변 영역 세포 외 서열 내로 하나 이상의 시스테인이 혼입될 수 있다. 일부 경우에, 천연 및 비-천연 이황화 결합 양자 모두가 바람직할 수 있다.
도입된 사슬간 이황화 결합을 함유하는 dTCR 또는 scTCR의 일부 구현예에서, 천연의 이황화 결합은 존재하지 않는다. 일부 구현예에서, 천연의 사슬간 이황화 결합을 형성하는 하나 이상의 천연 시스테인은 세린 또는 알라닌과 같은 다른 잔기로 치환된다. 일부 구현예에서, 도입된 이황화 결합은 상기 제1 및 제2 분절 상의 비-시스테인 잔기를 시스테인으로 돌연변이 시킴으로써 형성될 수 있다. TCR의 예시적인 비-천연 이황화 결합은 국제 공개 PCT 번호 WO2006/000830에 기술되어 있다.
일부 구현예에서, TCR 또는 이의 항원-결합 단편은, 10-5 내지 10-12 M과 그 안의 모든 개별 값 및 범위 또는 약 그 정도의 표적 항원에 대한 평형 결합 상수를 갖는 친화도를 나타낸다. 일부 구현예에서, 표적 항원은 MHC-펩타이드 복합체 또는 리간드이다.
일부 구현예에서, α 사슬 및 β 사슬와 같은 TCR을 인코딩하는 핵산 또는 핵산들은 PCR, 클로닝 또는 다른 적절한 수단에 의해 증폭될 수 있고, 적합한 발현 벡터 또는 벡터들 내에 클로닝 될 수 있다. 발현 벡터는 임의의 적합한 재조합 발현 벡터일 수 있으며, 임의의 적합한 숙주를 형질 전환 또는 형질 감염 시키는데 사용될 수 있다. 적합한 벡터는 전파 및 증식을 위해 또는 발현을 위해, 또는 양자 모두를 위해 설계된 것들을 포함하며, 예컨대 플라스미드 및 바이러스이다.
일부 구현예에서, 벡터는 pUC 시리즈 (Fermentas Life Sciences), pBluescript 시리즈 (Stratagene, 미국 캘리포니아주 라호야 소재), pET 시리즈 (Novagen, 미국 위스콘신주 매디슨 소재), pGEX 시리즈 (Pharmacia Biotech, 스웨덴 웁살라 소재), 또는 pEX 시리즈 (Clontech, 미국 캘리포니아주 팔로앨토 소재)의 벡터일 수 있다. 일부 경우에서, 박테리오파지 벡터, 예컨대 λG10, λGT11, λZapII (Stratagene), λEMBL4, 및 λNM1149가 또한 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 식물 발현 벡터가 사용될 수 있으며, 이는 pBI01, pBI101.2, pBI101.3, pBI121 및 pBIN19 (Clontech)를 포함한다. 일부 구현예에서, 동물 발현 벡터는 pEUK-Cl, pMAM 및 pMAMneo (Clontech)를 포함한다. 일부 구현예에서, 바이러스 벡터, 예컨대 레트로바이러스 벡터가 사용된다.
일부 구현예에서, 재조합 발현 벡터는 표준 재조합 DNA 기법을 사용하여 제조할 수 있다. 일부 구현예에서, 벡터는, 벡터가 DNA- 또는 RNA-기반인지를 고려하여, 적절한 경우, 벡터가 도입될 숙주의 유형 (예를 들어, 박테리아, 균류, 식물 또는 동물)에 특이적인 조절 서열, 예컨대 전사 및 번역 개시 및 종결 코돈을 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, 벡터는 TCR 또는 항원-결합 부분 (또는 기타 MHC-펩타이드 결합 분자)를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열에 작동 가능하게 연결된 비천연 프로모터를 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, 프로모터는 비-바이러스 프로모터 또는 바이러스 프로모터, 예컨대 사이토메갈로바이러스 (CMV) 프로모터, SV40 프로모터, RSV 프로모터, 및 뮤린 줄기세포 바이러스의 긴 말단 반복부에서 발견되는 프로모터일 수 있다. 다른 공지된 프로모터도 또한 고려된다.
일부 구현예에서, TCR을 인코딩하는 벡터를 생성하기 위해, 대상 TCR을 발현하는 T 세포 클론으로부터 단리된 전체 cDNA로부터 α 및 β 사슬를 PCR 증폭하고 발현 벡터에 클로닝한다. 일부 구현예에서, α 및 β 사슬은 동일한 벡터 내로 클로닝된다. 일부 구현예에서, α 및 β 사슬은 상이한 벡터로 클로닝된다. 일부 구현예에서, 생성된 α 및 β 사슬은 레트로바이러스 벡터, 예를 들어, 렌티바이러스 벡터 내로 혼입된다.
D. 산출 세포 조성물의 특징
구체적인 구현예에서, 본 명세서에 제공되는 방법은 유전자 조작된 세포를 함유하는 세포의 조성물, 예를 들어, 산출 세포 조성물을 제조 또는 생성한다. 특정 구체예에서, 산출 세포 조성물은 유전적 조작 세포를 위한 일부 또는 전체 단계로부터 생성된 세포 조성물이다. 특정 구현예에서, 산출 세포 조성물은 투입 세포 조성물의 세포를 유전자 조작하는 공정으로부터 생성된다. 특정 구현예에서, 공정은 세포, 예컨대 투입 세포 조성물로부터 획득된 세포를 활성화, 형질도입 또는 형질감염, 팽창, 및/또는 수확하는 하나 이상의 단계를 포함한다. 특정 구현예에서, 산출 세포 조성물은 유전자 조작된 세포를 함유한다. 구체적인 구현예에서, 산출 세포 조성물의 세포는 유전자 조작 공정의 모든 단계를 거친다.
일부 구현예에서, 산출 세포 조성물은, 유전자 조작을 통해 도입되는 하나 이상의 핵산을 포함하여 그러한 핵산의 재조합 또는 유전적으로 조작된 생성물을 발현하는 세포를 함유한다. 일부 구현예에서, 핵산은 이종성이며, 즉 통상적으로 세포 또는 세포로부터 수득한 샘플, 예컨대 조작된 세포 및/또는 그러한 세포가 유래된 유기체에서 일반적으로 발견되지 않는 기타 유기체 또는 세포로부터 수득한 샘플에 존재하지 않는다. 일부 구현예에서, 핵산은 자연적으로 발생하지 않으며, 예컨대 자연에서 발견되지 않는 핵산은 여러 상이한 세포 유형으로부터의 다양한 도메인을 코딩하는 핵산의 키메라 조합물을 포함한다.
일부 구현예에서, 산출 세포 조성물은 유전자 조작된 세포를 함유한다. 구체적인 구현예에서, 산출 세포 조성물은 조작된 T 세포를 함유한다. 일부 구현예에서, 조작된 T 세포는 조작된 CD4+ T 세포 및 조작된 CD8+ T 세포를 포함한다. 구체적인 구현예에서, 산출 세포 조성물은 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70% , 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.9%, 또는 100% 또는 약 100%의 조작된 T 세포를 함유 또는 포함한다. 특정 구현예에서, 조작된 세포는 재조합 수용체를 발현한다. 구체적인 구현예에서, 산출 세포 조성물은 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70% , 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.9%, 또는 100% 또는 약 100%의 재조합 수용체를 발현하는 T 세포를 함유 또는 포함한다. 일부 구현예에서, 재조합 수용체는 TCR 또는 CAR이다. 구체적인 구현예에서, 재조합 수용체는 CAR이다.
특정 구현예에서, 산출 세포 조성물은 조작된 CD4+ T 세포 대 CD8+ T 세포의 비율이 5:1 내지 0.2:1, 4:1 내지 0.25:1, 3:1 내지 0.33:1, 2:1 내지 0.5:1, 1.5:1 내지 0.66:1, 또는 1.25:1 내지 0.8:1이다. 구체적인 구현예에서, 산출 세포 조성물은 조작된 CD4+ T 세포 대 CD8+ T 세포의 비율이 2:1 내지 0.5:1이다. 일부 구현예에서, 산출 세포 조성물은 조작된 CD4+ T 세포 대 CD8+ T 세포의 비율이 (약) 2.0:1, 1.9:1, 1.8:1, 1.7:1, 1.6:1, 1.5:1, 1.4:1, 1.3:1, 1.2:1, 1.1:1, 1.0:1, 0.9:1, 0.8:1, 0.7:1, 0.6:1, 또는 0.5:1이다. 구체적인 구현예에서, 산출 세포 조성물은 조작된 CD4+ T 세포 대 CD8+ T 세포의 비율이 (약) 1:1이다. 구체적인 구현예에서, 조작된 세포는 재조합 수용체를 발현한다. 구체적인 구현예에서, 산출 세포 조성물은 CD4+ T 세포를 발현하는 재조합 수용체 대 CD8+ T 세포를 발현하는 재조합 수용체의 비율이 (약) 2.0:1, 1.9:1, 1.8:1, 1.7:1, 1.6:1, 1.5:1, 1.4:1, 1.3:1, 1.2:1, 1.1:1, 1.0:1, 0.9:1, 0.8:1, 0.7:1, 0.6:1, 또는 0.5:1이다. 구체적인 구현예에서, 산출 세포 조성물은 CD4+ T 세포를 발현하는 대 CD8+ T 세포를 발현하는 재조합 수용체의 비유이 (약) 1:1이다. 일부 구현예에서, 재조합 수용체는 TCR 또는 CAR이다. 구체적인 구현예에서, 재조합 수용체는 CAR이다.
일부 구현예에서, 상기 방법은 조작된 CD4+ T 세포 대 조작된 CD8+ T 세포의 비율, 재조합 수용체를 발현하는 CD4+ T 세포 대 재조합 수용체를 발현하는 CD8+ T 세포의 비율, 및/또는 CAR을 발현하는 CD4+ T 세포 대 CAR을 발현하는 CD8+ T 세포의 비율을 가지는 산출 세포 조성물을 생성하며, 이러한 비율은 정의된, 원하는, 또는 고정된 비율의 오차의 특정한 허용되는 차이 또는 범위 이내이며, 및/또는 상기 방법이 수행되는 특정한 배수의 백분율, 예컨대 이러한 배수의 적어도 (약) 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 95% 이상인 비율을 초래한다. 일부 구현예에서, 허용되는 차이는 비율의 약 1%, 약 2%, 약 3%, 약 4% 약 5%, 약 10%, 약 15%, 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 또는 약 75% 이내이다. 일부 양태에서, 비율은 원하는 비율의 10%, 20%, 또는 30% 이내, 및/또는 상기 방법이 수행되는 배수의 적어도 70%, 80%, 또는 90%의 비율 이내이다. 특정 구현예에서, 비율은 상기 방법이 수행되는 배수의 적어도 90% 1:1 비율의 50% 이내이다.
일부 구현예에서, 조작된, 재조합 수용체를 발현하는, 및/또는 CAR를 발현하는 CD4+ 대 CD8+ T 세포의 허용되는 차이 및/또는 정의된 비율은 복수의 테스트 비율 또는 개수로 하나 이상의 대상체에게 상이한 세포 유형을 투여함으로써, 예컨대 CD4+ 및 CD8+ T 세포를 투여하고, 하나 이상의 파라미터를 평가함으로써 결정되거나, 또는 결정되었다. 일부 양태에서, 정의된 또는 고정된 비율 또는 허용되는 차이의 결정은 대상체에게 투여한 후 하나 이상의 결과를 평가하는 것을 포함한다. 일부 양태에서, 결과는 질병의 증상 개선 및 안전성 및/또는 독성의 유무를 나타내는 결과로부터 선택되는 것을 포함한다.
특정 구현예에서, 본 명세서에 제공되는 방법에 의해 제조된 산출 세포 조성물은 조작된 CD4+ T 세포 대 조작된 CD8+ T 세포의 비율이 2:1 내지 0.5:1이다. 특정 구현예에서, 산출 조성물은 조작된 CD4+ T 세포 대 조작된 CD8+ T 세포의 비율이 (약) 1:1이다. 일부 구현예에서, 산출 세포 조성물은 본 명세서에 기재된 투입 세포 조성물, 예를 들어, 섹션 I-A에 기재된 투입 세포 조성물로부터 제조되었으며, 조작된 CD4+ T 세포 대 조작된 CD8+ T 세포의 비율이 2:1 내지 0.5:1이다. 구체적인 구현예에서, 투입 세포 조성물로부터 제조된 산출 세포 조성물은 조작된 CD4+ T 세포 대 조작된 CD8+ T 세포의 비율이 1:1이며, 허용되는 차이는 50%, 25%, 10% 미만이다. 특정 구현예에서, 조작된 T 세포는 재조합 수용체를 발현한다. 특정 구현예에서, 조작된 T 세포는 CAR을 발현한다.
II. 조성물 및 제제
본 명세서에 기재된 인큐베이션 (예를 들어, 자극) 방법에 따라 제조된 세포를 함유하는 조성물 및 제제가 본 명세서에 제공된다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 조성물 및 방법은, 예컨대 치료적 세포 조성물로서 사용하기 위해 정의된 비율의 재조합 수용체를 발현하는 CD4+ 대 CD8+ T 세포를 가지는 세포의 산출 세포 조성물을 수득하기 위해 사용될 수 있다. 또한 본 명세서에 기재된 임의의 방법에 의해 제조된 산출 세포 조성물이 본 명세서에 제공된다.
일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 임의의 방법을 사용하여 제조된 세포, 예를 들어, 산출 세포 조성물의 세포는, 약제학적 조성물 및 제제를 비롯한 조성물로서 제공되며, 예컨대 주어진 투여량 또는 또는 분획으로 투여를 위한 세포의 개수를 포함하는 단위 투여 형태 조성물로서 제공된다. 구체적인 구현예에서, 산출 세포 조성물의 세포는 재조합 수용체 (예를 들어, CAR-T 세포)로 유전자 조작된다. 특정 구현예에서, 약제학적 조성물 및 제제는 일반적으로 하나 이상의 선택적인 약학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 적어도 하나의 추가적인 치료제를 포함한다.
일부 구현예에서, 세포의 조성물, 예를 들어, 산출 세포 조성물은 세포 요법의 목적을 위해 생성 또는 제품화된다. 일부 구현예에서, 세포 조성물은 약제학적 조성물 또는 제제이다. 이러한 조성물은 제공된 방법에 따라, 예를 들어, 질병, 병태, 및 장애의 예방 또는 치료에서, 또는 검출, 진단, 및 예후 방법에서 사용하기 위한 방출을 평가하도록 사용될 수 있다.
용어 “약제학적 제형(pharmaceutical formulation)”이란 이러한 조성물 안에 포함된 활성 성분의 생물학적 활성이 효과가 있도록 하기 위한 형태의 조제물을 지칭하며, 제형이 투여되는 대상에게 수용 불가능한 독성을 주는 추가 성분은 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 제공된 방법은 동일한 조작된 세포로 구성되지만, 상이한 약제학적 제제를 가지는 세포 조성물의 표면 글리칸 발현을 비교하기 위해 사용될 수 있다.
“약제학적으로 허용 가능한 담체(pharmaceutically acceptable carrier)”란, 대상에게 비독성이며, 활성 성분 이외의 약학 제제에 포함된 성분을 지칭한다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 완충액, 부형제, 안정화제, 또는 보존제를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 구체적인 구현예에서, 본 명세서에 제공된 방법은 동일한 조작된 세포로 구성되지만, 상이한 약제학적으로 허용되는 담체를 가지는 세포 조성물의 표면 글리칸 발현을 비교하기 위해 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, T 세포 요법, 예컨대 조작된 T 세포 (예를 들어, CAR T 세포)는 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 제제화된다. 일부 양태에서, 담체의 선택은 부분적으로 특정 세포 및/또는 투여 방법에 의해 결정된다. 따라서, 다양한 적합한 제형이 존재한다. 예를 들어, 약제학적 조성물은 보존제를 포함할 수 있다. 적합한 보존제로는, 예를 들어, 메틸파라벤, 프로필파라벤, 벤조산나트륨 및 벤즈알코늄 클로라이드를 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 둘 이상의 보존제의 혼합물이 사용된다. 보존제 또는 이의 혼합물은 전형적으로 총 조성물 중량의 약 0.0001% 내지 약 2%의 양으로 존재한다. 담체는 예를 들어, 문헌 Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)에 기재되어 있다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 일반적으로 사용된 복용량 및 농도에서 수용자에게 무독성이며, 다음을 포함하지만 이에 제한되지 않는다: 포스페이트, 시트르산 및 기타 유기산과 같은 완충제; 아스코르빈산 및 메티오닌을 비롯한 항산화제; 보존제 (예컨대, 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드, 벤제토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알콜, 메틸 또는 프로필 파라벤 등의 알킬 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 시클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레졸); 저 분자량의 (약 10개 잔기 미만) 폴리펩타이드; 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역 글로불린 등의 단백질; 폴리비닐피롤리돈 등의 친수성 폴리머; 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 리신 등의 아미노산; 단당류, 이당류 및 포도당, 만노오스 또는 덱스트린을 비롯한 기타 탄수화물; EDTA 등의 킬레이트화제; 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨 등의 슈가; 나트륨 등의 염-형성 반대 이온; 금속 복합체 (예컨대, Zn-단백질 복합체); 및/또는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 등의 비이온성 계면 활성제.
일부 양태에서 완충제가 조성물에 포함된다. 적합한 완충제로는 예를 들어, 시트르산, 시트르산 나트륨, 인산, 인산 칼륨 및 다양한 기타 산 및 염을 포함한다. 일부 양태에서, 둘 이상의 완충제의 혼합물이 사용된다. 완충제 또는 이의 혼합물은 전형적으로 총 조성물 중량의 약 0.001% 내지 약 4%의 양으로 존재한다. 투여 가능한 약제학적 조성물의 제조 방법은 공지되어 있다. 예시적인 방법은 예컨대, 문헌 Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott Williams & Wilkins; 21st ed. (May 1, 2005)에 더욱 상세히 기재되어 있다.
이러한 제제는 수용액을 포함할 수 있다. 제제 또는 조성물은 또한 세포로 예방 또는 치료되는 특정 징후, 질병, 또는 병태에 유용한 하나 이상의 활성 성분을 포함할 수 있으며, 여기서 활성은 세포에 상보적이고 및/또는 각각의 활성은 서로 악영향을 미치지 않는 하나 이상의 활성 성분을 포함한다. 이러한 활성 성분은 의도된 목적에 유효한 양으로 조합하여 적절하게 존재한다. 따라서, 일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 기타 약제학적으로 활성인 시제 또는 약물, 예컨대 화학요법 시제, 예컨대 아스파라기나제, 부술판, 카보플라틴, 시스플라틴, 다우노루비신, 독소루비신, 플루오로우라실, 겜시타빈, 히드록시유레아, 메토트렉세이트, 파클리탁셀, 리툭시맵, 빈블라스틴 등을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 질환 또는 증상을 치료 또는 예방하기에 효과적인 양의, 예컨대 치료적 유효량 또는 예방적 유효량의 세포, 예를 들어, 산출 세포 조성물의 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 치료적 또는 예방적 효능은 치료된 대상체의 주기적인 평가에 의해 모니터링된다. 조건에 따른 며칠 또는 며칠 이상에 걸친 반복된 투여의 경우, 치료는 질병 증상이 바람직하게 억제될 때까지 반복된다. 그러나, 기타 복용량 요법이 유용할 수 있으며 결정될 수 있다. 원하는 복용량은 조성물의 단일 볼루스 투여, 조성물의 다중 볼루스 투여 또는 조성물의 지속 주입 투여에 의해 전달될 수 있다.
세포, 예를 들어, 산출 세포 조성물의 세포는, 표준 투여 기법, 제제, 및/또는 장치를 사용하여 투여를 위해 제제화될 수 있다. 조성물의 저장 및 투여를 위한 주사기 및 바이알과 같은 제형 및 장치가 제공된다. 세포와 관련하여, 투여는 자가 또는 이종성일 수 있다. 예를 들어, 면역 반응 세포 또는 전구 세포는 한 대상체로부터 수득될 수 있으며, 동일한 대상체 또는 상이한, 호환이 되는 대상체에 투여될 수 있다. 말초 혈액 유래의 면역 반응 세포 또는 그 후대 (예컨대, 생체 내, 생체 외 또는 시험관 내에서 유래됨)은 카테터 투여, 전신 주사, 국소 주사, 정맥 내 주사 또는 비경구 투여를 비롯한 국소 주사를 통해 투여될 수 있다. 치료적 조성물 (예컨대, 유전자 조작된 면역 반응 세포를 포함하는 약제학적 조성물)을 투여하는 경우, 이는 일반적으로 단위 복용량 주사 가능한 형태 (용액, 현탁액, 에멀젼)로 제형화될 것이다.
제형은 경구, 정맥 내, 복강 내, 피하, 폐, 경피, 근육 내, 비강 내, 협측, 설하 또는 좌약 투여를 위한 것들을 포함한다. 일부 구현예에서, 시제 또는 세포 집단은 비경구적으로 투여된다. 용어 “비경구”는, 본 명세서에서 사용 시, 정맥 내, 근육 내, 피하, 직장, 질 및 복강 내 투여를 포함한다. 일부 구현예에서, 시제 또는 세포 집단은 정맥 내, 복강 내 또는 피하 주사에 의한 말초 전신 전달을 사용하여 대상체에게 투여된다.
일부 구현예에서 조성물은, 일부 양태에서 선택된 pH로 완충될 수 있는 멸균 액체 제조물, 예컨대 등장성 수용액, 현탁액, 에멀젼, 분산액 또는 점성 조성물로서 제공된다. 액체 제조물은 일반적으로 겔, 기타 점성 조성물 및 고체 조성물보다 제조하기 용이하다. 또한, 액체 제조물은 특히 주사에 의해 투여하기에 더욱 편리하다. 한편, 점성 조성물은 특정 조직과의 연장된 접촉 시간을 제공하기 위해 적합한 점도 범위 내에서 제형화될 수 있다. 액체 또는 점성 조성물은 예컨대 물, 식염수, 인산 완충 식염수, 폴리올 (예컨대, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 액체 폴리에틸렌 글리콜) 및 이의 적합한 혼합물을 포함하는 용매 또는 분산 매질일 수 있는 담체를 포함할 수 있다.
멸균 주사 가능한 용액은 세포를 적합한 담체, 희석제, 또는 멸균수, 생리식염수, 글루코스, 덱스트로스 등과 같은 부형제와 혼합한 것과 같은 용매에 포함시킴으로써 제조될 수 있다. 조성물은 또한 동결 건조될 수 있다. 조성물은 원하는 투여 및 제조 경로에 따라 습윤제, 분산제 또는 에멀젼화제 (예컨대, 메틸셀룰로오스), pH 완충제, 겔화 또는 점도 증강 첨가제, 보존제, 향료제, 착색제 등과 같은 보조 물질을 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 적합한 제조물을 제조하기 위하여 표준 텍스트를 참고할 수 있다.
항균 보존제, 항산화제, 킬레이트화제 및 완충제를 비롯하여, 조성물의 안정성 및 무균성을 향상시키는 다양한 첨가제가 첨가될 수 있다. 미생물 작용의 예방은 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산 등 다양한 항균제 및 항진균제에 의해 보장될 수 있다. 주사 가능한 제약 형태의 흡수는, 흡수를 지연시키는 시제, 예컨대 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴의 사용에 의해 연장될 수 있다.
생체내 투여에 사용되는 제제는 일반적으로 무균이다. 무균성은, 예컨대 무균성 여과막을 통한 여과에 의해 용이하게 달성될 수 있다.
질병의 예방 또는 치료를 위해, 적절한 투여량은 치료될 질병의 유형, 시제의 유형, 세포 또는 재조합 수용체의 유형, 질병의 중증도 및 경과, 세포가 예방적 또는 치료적 목적으로 투여되는지 여부, 이전의 치료, 대상체의 임상 기록 및 시제 또는 세포에 대한 반응, 주치의의 재량에 따라 달라질 수 있다. 일부 구현예에서, 조성물은 한 번에 또는 일련의 치료를 통해 적절하게 대상체에게 투여된다.
III. 투여 방법
또한 재조합 수용체 (예컨대 CAR)에 의해 인식되는 항원이 발현되는 질병, 조건, 및 장애의 치료에 본 명세서에 기재된 산출 조성물에 존재하는 것과 같은 세포 및 조성물의 사용 방법 및 용도가 제공된다. 또한 기재된 임의의 조작 방법에 의해 제조된 산출 세포 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 치료 방법이 본 명세서에 제공된다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 본 명세서에 기재된 임의의 방법을 사용하여 유전자 조작된 T 세포, 예컨대 산출 세포 조성물의 유전자 조작된 T 세포를 생성하는 단계, 및 본 명세서에 기재된 방법에 의해 제조된 유전자 조작된 T 세포를 투여하는 단계를 포함한다.
조작된 세포 및 조성물을 투여하는 방법, 및 암을 비롯한 질환, 병태 및 장애를 치료 또는 예방하기 위한 조작된 세포 및 조성물의 용도가 제공된다. 제공된 방법 및 용도는 입양 세포 요법을 위한 방법 및 용도를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 질환, 병태 또는 장애를 가지거나 가질 위험이 있거나, 또는 가지는 것으로 의심을 받는 대상체, 조직 또는 세포에, 조작된 세포, 또는 세포를 포함하는 조성물, 예컨대 기재된 바와 같이 산출 조성물로부터의 세포를 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포, 집단 및 조성물은 치료될 특정 질환 또는 병태를 가지는 대상체에게, 예컨대 입양 T 세포 요법과 같은 입양 세포 요법을 통해 투여된다. 일부 구현예에서, 세포 또는 조성물은 대상체, 예컨대 질환 또는 병태를 가지거나 가질 위험이 있는 대상체에게 투여되어, 예컨대 조작된 T 세포에 의해 인식되는 항원을 발현하는 암에서 종양 부담을 감소시킴으로써, 질환 또는 병태 중 하나 이상의 징후를 개선시킨다.
치료되는 질환 또는 병태는, 일부 양태에서, 항원의 발현이 질병, 장애 또는 병태의 세포 또는 조직에 특이적인, 및/또는 발현되고, 및/또는 질병의 병인에 관여하는, 예컨대 그러한 질환, 병태 또는 장애를 유발하거나, 악화시키거나 또는 그렇지 않으면 이에 관여하는 임의의 것일 수 있다. 예시적인 질환 및 병태는 세포의 악성 또는 형질 전환 (예컨대, 암), 자가 면역 또는 염증성 질환, 또는 예컨대 박테리아, 바이러스 또는 기타 병원체에 의해 야기된 감염성 질환과 관련된 질환 또는 병태를 포함할 수 있다. 치료될 수 있는 다양한 질환 및 병태와 관련된 항원을 비롯한 예시적 항원들은 전술하였다. 구체적인 구현예에서, 면역조절성 폴리펩타이드 및/또는 재조합 수용체, 예컨대, 키메라 항원 수용체 또는 TCR은 질병 또는 병태와 연관된 항원에 특이적으로 결합한다. 일부 구현예에서, 대상체는 질병, 장애 또는 병태, 선택적으로 암, 종양, 자가면역 질병, 장애 또는 병태, 또는 감염성 질병을 가진다.
일부 구현예에서, 질병, 장애 또는 병태는 다양한 암과 연관된 종양을 포함할 수 있다. 암은 일부 구현예에서 대상체의 신체에 위치하는 임의의 암, 예컨대, 두경부, 유방, 간, 결장, 난소, 전립선, 췌장, 뇌, 자궁경부, 뼈, 피부, 눈, 방광, 위, 식도, 복막, 또는 폐에 위치하는 암일 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 항암제는 결장암, 자궁경부암, 중추신경계 암, 유방암, 방광암, 항문 암종, 두경부암, 난소암, 자궁내막암, 소세포 폐암, 비-소세포 폐암종, 신경내분비암, 연부조직 암종, 음경암, 전립선암, 췌장암, 위암, 담낭암 또는 식도암의 치료에 사용될 수 있다. 일부 경우에, 암은 혈액암일 수 있다. 일부 구현예에서, 질병, 장애 또는 병태는 종양, 예컨대 고체 종양, 림프종, 백혈병, 혈액 종양, 전이성 종양, 또는 다른 암 또는 종양 유형이다. 일부 구현예에서, 질병, 장애 또는 병태는 결장, 폐, 간, 유방, 전립선, 난소, 피부, 흑색종, 뼈의 암, 뇌암, 난소암, 상피암, 신장 세포 암종, 췌장 선암종, 자궁경부 암종, 대장암, 교모세포종, 신경아세포종, 유잉(Ewing) 육종, 수모세포종, 골육종, 활막 육종, 및/또는 악성중피종으로부터 선택된다.
질병, 병태, 및 장애 중에는, 고형 종양, 혈액 악성 종양, 및 흑색종을 비롯한 종양, 및 국소적 및 전이성 종양을 비롯한 종양, 감염성 질병, 예컨대 바이러스 또는 다른 병원체에 의한 감염, 예를 들어, HIV, HCV, HBV, CMV, HPV, 및 기생충 질병, 및 자가면역 및 염증성 질병이 있다. 일부 구현예에서, 질병, 장애 또는 병태는 종양, 암, 악성종양, 신생종(neoplasm), 또는 다른 증식성 질병 또는 장애이다. 이러한 질병으로는 백혈병, 림프종, 예를 들어, 급성 골수 (또는 골수성) 백혈병 (AML), 만성 골수 (또는 골수성) 백혈병 (CML), 급성 림프구성 (또는 림프아구성) 백혈병 (ALL), 만성 림프구성 백혈병 (CLL), 모세포 백혈병 (HCL), 소림프구성 림프종 (SLL), 외투 세포 림프종 (MCL), 변연부 림프종, 버킷 림프종, 호지킨 림프종 (HL), 비-호지킨 림프종 (NHL), 역형성 거대 세포 림프종 (ALCL), 여포성 림프종, 불응성 여포성 림프종, 미만성 거대 B-세포 림프종 (DLBCL) 및 다중 골수종 (MM)을 포함하지만, 이에 제한되지 않으며, B 세포 악성 종양은 급성 림프구성 백혈병 (ALL), 성인 ALL, 만성 림프구성 백혈병 (CLL), 비-호지킨 림프종 (NHL), 및 미만성 거대 B-세포 림프종 (DLBCL)으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 질병 또는 질병 상태는 감염성 질병 또는 질병 상태, 예컨대, 바이러스, 레트로바이러스, 박테리아, 및 원충 감염, 면역결핍, 사이토메갈로바이러스 (CMV), 엡스타인-바르 바이러스 (Epstein-Barr virus)(EBV), 아데노바이러스, BK 폴리오마바이러스 (polyomavirus)이나, 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 질병 또는 질병 상태는 자가면역 또는 염증성 질병 또는 질병 상태, 예컨대 관절염, 예를 들어 류머티즘성 관절염 (RA), I형 당뇨병, 전신 홍반성 낭창 (SLE), 염증성 장 질병, 건선, 경피증, 자가면역 갑상선 질병, 그레이브스병 (Grave's disease), 크론병 (Crohn's disease) 다발성 경화증, 천식, 및/또는 이식 관련 질병 또는 질병 상태이다.
일부 구현예에서, 질병 또는 장애와 관련된 항원은 다음으로 구성된 군으로부터 선택된다: 고아 타이로신 키네이스 수용체 ROR1, B 세포 성?I과 항원 (BCMA), 탄산 무수화효소 9 (CAIX), tEGFR, Her2/neu (수용체 타이로신 키네이스 erbB2), L1-CAM, CD19, CD20, CD22, 메소텔린, CEA, B형 간염 표면 항원, 항-엽산 수용체, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44, EGFR, 상피 당단백 2 (EPG-2), 상피 당단백 40 (EPG-40), 에프린 수용체 A2 (EPHa2), Her2/neu (수용체 타이로신 키네이스 erb-B2), Her3 (erb-B3), Her4 (erb-B4), erbB 이합체, 유형 III 상피 성장 인자 수용체 돌연변이 (EGFR vIII), 엽산 결합 단백질 (FBP), FCRL5, Fc 수용체 유사 5 (FCRL5; 또한 Fc 수용체 동족체 5 또는 FCRH5로도 알려짐), 태아 아세틸콜린 수용체, 강글리오사이드 GD2, 강글리오사이드 GD3, G 단백질 연결 수용체 5D (GPCR5D), HMW-MAA, IL-22R-알파, IL-13R-알파2, 키네이스 삽입 도메인 수용체 (kdr), 카파 경쇄, 류신 풍부 반복 함유 8 패밀리 구성원 A (LRRC8A), Lewis Y, L1-cell 유착 분자, (L1-CAM), 흑색종-관련 항원 (MAGE)-A1, MAGE-A3, MAGE-A6, 우선적으로 발현되는 흑색종 항원 (PRAME), 서바이빈, TAG72, B7-H6, IL-13 수용체 알파 2 (IL-13Ra2), CA9, GD3, HMW-MAA, CD171, G250/CAIX, 인간 백혈구 항원 A1 (HLA-A1), MAGE A1, HLA-A2, NY-ESO-1, PSCA, 엽산 수용체-a, CD44v6, CD44v7/8, αvβ6 인테그린 (avb6 인테그린), 8H9, NCAM, VEGF 수용체, 5T4, 태아 AchR, 자연 살해 그룹 2 구성원 D (NKG2D) 리간드, CD44v6, 이중 항원, 암-정소 항원, 메소텔린, 뮤린 CMV, 뮤신 1 (MUC1), MUC16, 전립선 줄기 세포 항원 (PSCA), NKG2D, 암-고환 항원 암/고환 항원 1B (CTAG, 또한 NY-ESO-1 및 LAGE-2으로도 알려짐), MART-1, 당단백 100 (gp100), 태아 종양 항원, ROR1, 영양막 당단백 (TPBG, 또한 5T4로도 알려짐), TAG72, VEGF-R2, 암 배아 항원 (CEA), Her2/neu, 에스트로겐 수용체, 프로게스테론 수용체, 에프린 B2, CD123, c-Met, GD-2, O-아세틸화된 GD2 (OGD2), CE7, Wilms 종양 1 (WT-1), 사이클린, 사이클린 A2, C-C 모티프 케모카인 리간드 1 (CCL-1), CD138, 병원체-특이적 항원 및 보편적인 표지와 관련된 항원, 및/또는 비오틴화된 분자, 및/또는 HIV, HCV, HBV 또는 다른 병원체에 의해 발현되는 분자.
일부 구현예에서, 항원 (또는 리간드)는 종양 항원 또는 암 마커이다. 일부 구현예에서, 항원 또는 리간드는 다음 중 하나이거나, 또는 이를 포함한다: 고아 타이로신 키네이스 수용체 (ROR1), B 세포 성숙화 항원 (BCMA), 탄산 무수화효소 9 (CA9, 또한 CAIX 또는 G250로도 알려짐), Her2/neu (수용체 타이로신 키네이스 erbB2), CD19, CD20, CD22, 메소텔린 (MSLN), 암배아 항원 (CEA), 및 B형 간염 표면 항원, 항-엽산 수용체, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44, 콘드로이틴 설페이트 프로테오글리칸 4 (CSPG4), EGFR, 상피 당단백 2 (EPG-2), 상피 당단백 40 (EPG-40), 에프린 수용체 A2 (EPHa2), Her3 (erb-B3), Her4 (erb-B4), erbB 이합체, III형 표피 성장 인자 수용체 돌연변이 (EGFR vIII), 엽산 결합 단백질 (FBP), Fc 수용체 유사 5 (FCRL5, 또한 Fc 수용체 동족체 5 또는 FCRH5로도 알려짐), 태아 아세틸콜린 수용체(태아 AchR), 강글리오사이드 GD2, 강글리오사이드 GD3, 인간 백혈구 항원 A1 (HLA-A1), 인간 백혈구 항원 A2 (HLA-A2), IL-22 수용체 알파 (IL-22Rα), 키네이스 삽입 도메인 수용체 (kdr), 카파 경쇄, 류신 풍부 반복 함유 8 패밀리 구성원 A (LRRC8A), Lewis Y, L1-세포 점착 분자 (L1-CAM), 흑색종-연관 항원 (MAGE)-A1, MAGE-A3, MAGE-A6, MAGE-A10, 우선적으로 발현되는 흑색종 항원 (PRAME), 서바이빈, 종양-연관 당단백 72 (TAG72), B7-H3, B7-H6, IL-13 수용체 알파 2 (IL-13Rα2), 인간 고분자량-흑색종-연관 항원 (HMW-MAA), CD171, 엽산 수용체-알파, CD44v7/8, αvβ6 인테그린 (avb6 인테그린), 8H9, 신경 세포 점착 분자 (NCAM), 혈관 내피 성장 인자 수용체 (VEGF 수용체 또는 VEGFR), 영양막 당단백 (TPBG 또한 5T4로도 알려짐), NKG2D 리간드, CD44v6, 이중 항원, 암-고환 항원, 쥐과 거대세포바이러스 (CMV), 뮤신 1 (MUC1), MUC16, 전립선 줄기 세포 항원 (PSCA), 전립선 특이적 멤브레인 항원 (PSMA), 자연 살해 그룹 2 구성원 D (NKG2D) 리간드, 암/고환 항원 1B (CTAG, 또한 NY-ESO-1 및 LAGE-2으로도 알려짐), 멜란 A (MART-1), 당단백 100 (gp100), 글리피칸-3 (GPC3), G 단백질 연결 수용체 5D (GPRC5D), 종양태아성 항원, TAG72, 타이로시나제 관련 단백질 1 (TRP1, 또한 TYRP1 또는 gp75로도 알려짐), 타이로시나제 관련 단백질 2 (TRP2, 또한 도파크롬 토토머라제, 도파크롬 델타-아이소머라제 또는 DCT로도 알려짐), 혈관 내피 성장 인자 수용체 2 (VEGF-R2), 암배아 항원 (CEA), 에스트로겐 수용체, 프로게스테론 수용체, 전립선 특이적 항원, 에프린B2, CD123, CD133, c-Met, O-아세틸화된 GD2 (OGD2), L1-CAM의 CE7 에피토프, Wilms 종양 1 (WT-1), 사이클린, 사이클린 A2, C-C 모티프 케모카인 리간드 1 (CCL-1), CD138, 병원체-특이적 항원 또는 병원체-발현 항원, 및 보편적인 표지와 관련된 항원, 및/또는 비오틴화된 분자, 및/또는 HIV, HCV, HBV 또는 다른 병원체에 의해 발현되는 분자.
일부 구현예에서, 질병 또는 병태는 B 세포 악성 종양이다. 일부 구현예에서, B 세포 악성 종양은 백혈병 또는 림프종이다. 일부 양태에서, 질병 또는 병태는 급성 림프구성 백혈병 (ALL), 성인 ALL, 만성 림프구성 백혈병 (CLL), 비-호지킨 림프종 (NHL), 또는 미만성 거대 B-세포 림프종 (DLBCL)이다. 일부 경우에, 질병 또는 병태는 NHL, 예컨대 공격형 NHL인 NHL, 미만성 거대 B 세포 림프종 (DLBCL), NOS (신생 또는 무통성 림프종으로부터 형질전환), 원발 종격동성 거대 B 세포 림프종 (PMBCL), T 세포/조직구-풍부형 거대 B 세포 림프종 (TCHRBCL), 버킷 림프종, 외투 세포 림프종 (MCL), 및/또는 여포성 림프종 (FL), 선택적으로 여포성 림프종 등급 3B (FL3B)를 포함한다. 일부 양태에서, 재조합 수용체, 예컨대 CAR은 질병 또는 병태와 관련된, 또는 B 세포 악성 종양과 관련된 병변의 환경의 세포에서 발현되는 항원에 특이적으로 결합한다. 일부 구현예에서, 수용체에 의해 표적화된 항원은 B 세포 악성종양과 관련된 항원을 포함하는데, 예컨대 다수의 공지된 B 세포 마커 중 어느 하나이다. 일부 구현예에서, 수용체에 의해 표적화되는 항원은 CD20, CD19, CD22, ROR1, CD45, CD21, CD5, CD33, Ig카파, Ig람다, CD79a, CD79b 또는 CD30이다.
일부 구현예에서, 질병 또는 병태는 골수종, 예컨대 다발성 골수종이다. 일부 구현예에서, 재조합 수용체는 질병 또는 병태와 연관된 또는 다발성 골수종과 연관된 병변 환경의 세포에서 발현된 항원에 특이적으로 결합한다. 수용체에 의해 표적화된 항원은, 일부 구현예에서, 다발성 골수종, 예컨대 GPRC5D 또는 BCMA와 연관된 항원을 포함한다.
일부 구현예에서, 항원은 병원체-특이적 또는 병원체-발현 항원이다. 일부 구현예에서, 상기 항원은 바이러스 항원 (예컨대, HIV, HCV, HBV 등으로부터의 바이러스 항원), 박테리아 항원 및/또는 기생충 항원이다.
일부 구현예에서, 세포 기반의 요법은 종양 또는 암과 같은 병변이 표면에 발현되는 분자를 표적화하는 T 세포를 투여하는 것이거나, 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 면역 세포는 T 세포 수용체 (TCR) 또는 다른 항원-결합 수용체를 발현한다. 일부 구현예에서, 면역 세포는 재조합 수용체, 예컨대 형질전환 TCR 또는 키메라 항원 수용체 (CAR)를 발현한다. 일부 구현예에서, 세포는 대상체에 대해 자가조직이다. 일부 구현예에서, 세포는 대상체에 대해 동종이계이다.
입양 세포 요법를 위한 조작된 세포의 투여 방법은 공지되어 있으며, 제공된 방법 및 조성물과 관련되어 사용될 수 있다. 예를 들어, 입양 T 세포 요법은 예컨대, Gruenberg 등의 미국 특허 출원 공보 2003/0170238; Rosenberg의 미국 특허 4,690,915; 문헌 Rosenberg (2011) Nat Rev Clin Oncol. 8(10):577-85)에 기재되어 있다. 예를 들어, 문헌 Themeli et al. (2013) Nat Biotechnol. 31(10): 928-933; Tsukahara et al. (2013) Biochem Biophys Res Commun 438(1): 84-9; Davila et al. (2013) PLoS ONE 8(4): e61338를 참조한다.
일부 구현예에서, 세포 요법, 예컨대 입양 T 세포 요법은 자가 전달에 의해 수행되며, 여기서 세포는 세포 요법을 받을 대상체 또는 그러한 대상체로부터 유래된 샘플로부터 단리되고 및/또는 그렇지 않으면 이로부터 제조된다. 이에 따라, 일부 양태에서, 세포는 치료가 필요한 대상체, 예컨대 환자로부터 유래되고, 단리 및 가공 후의 세포는 동일한 대상체에게 투여된다.
일부 구현예에서, 세포 요법, 예컨대 입양 T 세포 요법은 동종이계 전달에 의해 수행되며, 여기서 세포는 세포 요법을 받거나 또는 궁극적으로 받는 대상체 이외의 대상체, 예컨대 제1 대상체로부터 단리되고 및/또는 그렇지 않으면 이로부터 제조된다. 이러한 구현예에서, 이후 세포는 동일한 종의 상이한 대상체, 예컨대 제2 대상체에게 투여된다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 대상체는 유전적으로 동일하다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 대상체는 유전적으로 유사하다. 일부 구현예에서, 제2 대상체는 제1 대상체와 동일한 HLA 클래스 또는 수퍼타입을 나타낸다. 세포는 임의의 적합한 수단에 의해 투여될 수 있다. 복용 및 투여는 부분적으로 투여가 짧은 또는 만성인지 여부에 따라 좌우된다. 다양한 복용 스케쥴은 다양한 시점, 볼루스 투여 및 맥박 주입에 대한 단일 또는 다중 투여를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
일부 구현예에서, 제공된 방법은 산출 세포 조성물의 세포, 예컨대 섹션 I에 기재된 세포의 조성물을 대상체에게 투여하는 하나 이상의 단계를 포함한다. 특정 구현예에서, 산출 세포 조성물의 조성물은 조작된 CD4+ T 세포 및 조작된 CD8+ T 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 조작된 CD4+ 및 CD8+ T 세포는 T 세포 수용체 (TCR) 또는 다른 항원-결합 수용체를 발현한다. 일부 구현예에서, 면역 세포는 재조합 수용체, 예컨대 형질전환 TCR 또는 키메라 항원 수용체 (CAR)를 발현한다. 일부 구현예에서, 산출 세포 조성물의 세포는 대상체에 대해 자가조직이다. 일부 구현예에서, 세포는 대상체에 대해 동종이계이다.
특정 구현예에서, 산출 세포 조성물의 CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포는 동일한 조성물, 용량, 또는 혼합물로 대상체에게 투여된다. 이에 따라, 일부 구현예에서, 재조합 수용체 발현 CD4+ T 세포 및 재조합 수용체 발현 CD8+ T 세포, 예를 들어, CAR+CD4+ 및 CAR+CD8+는 동일한 조성물, 용량, 또는 혼합물로 대상체에게 투여된다.
특정 구현예에서, 세포, 예를 들어 산출 세포 조성물, 또는 세포 서브 유형의 개별 집단은 대상체에게, 약 100만 내지 약 1000억개의 세포 범위 및/또는 체중 kg당 세포의 양으로, 예컨대 약 100만 내지 약 500억개의 세포 (예컨대, 약 500만개의 세포, 약 2500만 개의 세포, 약 5억 개의 세포, 약 10억 개의 세포, 약 50억 개의 세포, 약 200억 개의 세포, 약 300억 개의 세포, 약 400억 개의 세포 또는 값 중 임의의 두 값으로 한정된 범위), 예컨대 약 1000만 내지 약 1000억개의 세포 (예컨대, 약 2000만 개의 세포, 약 3000만 개의 세포, 약 4000만 개의 세포, 약 6000만 개의 세포, 약 7000만 개의 세포, 약 8000만 개의 세포, 약 9000만 개의 세포, 약 100억 개의 세포, 약 250억 개의 세포, 약 500억 개의 세포, 약 750억 개의 세포, 약 900억 개의 세포 또는 값 중 임의의 두 값으로 한정된 범위), 및 경우에 따라 약 1억 내지 약 500억 개의 세포 (예컨대, 약 1억 2000만 개의 세포, 약 2억 5000만 개의 세포, 약 3억 5000만 개의 세포, 약 4억 5000만 개의 세포, 약 6억 5000만 개의 세포, 약 8억개의 세포, 약 9억개의 세포, 약 30억 개의 세포, 약 300억 개의 세포, 약 450억 개의 세포) 또는 이러한 범위 사이의 임의의 값 및/또는 체중 kg당 값으로 투여된다. 투여량은 질병 또는 장애 및/또는 환자 및/또는 다른 치료에 대한 특정 속성에 따라 달라질 수 있다.
일부 구현예에서, 예를 들어,대상체가 인간인 경우, 복용량은 약 1 x 108 미만의 전체 재조합 수용체 (예를 들어, CAR)-발현 세포, T 세포, 또는 말초 혈액 단핵구 세포 (PBMC), 예를 들어, 약 1 x 106 내지 1 x 108개 범위의 이러한 세포, 예컨대 2 x 106, 5 x 106, 1 x 107, 5 x 107, 1 x 108개의 전체 이러한 세포, 또는 전술한 값 중 임의의 둘 사이의 범위를 포함한다.
일부 구현예에서, 유전자 조작 세포의 복용량은 (약) 1 x 105 내지 5 x 108 개의 전체 CAR-발현 T 세포, 1 x 105 내지 2.5 x 108 개의 전체 CAR-발현 T 세포, 1 x 105 내지 1 x 108 개의 전체 CAR-발현 T 세포, 1 x 105 내지 5 x 107 개의 전체 CAR-발현 T 세포, 1 x 105 내지 2.5 x 107 개의 전체 CAR-발현 T 세포, 1 x 105 내지 1 x 107 개의 전체 CAR-발현 T 세포, 1 x 105 내지 5 x 106 개의 전체 CAR-발현 T 세포, 1 x 105 내지 2.5 x 106 개의 전체 CAR-발현 T 세포, 1 x 105 내지 1 x 106 개의 전체 CAR-발현 T 세포, 1 x 106 내지 5 x 108 개의 전체 CAR-발현 T 세포, 1 x 106 내지 2.5 x 108 개의 전체 CAR-발현 T 세포, 1 x 106 내지 1 x 108 개의 전체 CAR-발현 T 세포, 1 x 106 내지 5 x 107 개의 전체 CAR-발현 T 세포, 1 x 106 내지 2.5 x 107 개의 전체 CAR-발현 T 세포, 1 x 106 내지 1 x 107 개의 전체 CAR-발현 T 세포, 1 x 106 내지 5 x 106 개의 전체 CAR-발현 T 세포, 1 x 106 내지 2.5 x 106 개의 전체 CAR-발현 T 세포, 2.5 x 106 내지 5 x 108 개의 전체 CAR-발현 T 세포, 2.5 x 106 내지 2.5 x 108 개의 전체 CAR-발현 T 세포, 2.5 x 106 내지 1 x 108 개의 전체 CAR-발현 T 세포, 2.5 x 106 내지 5 x 107 개의 전체 CAR-발현 T 세포, 2.5 x 106 내지 2.5 x 107 개의 전체 CAR-발현 T 세포, 2.5 x 106 내지 1 x 107 개의 전체 CAR-발현 T 세포, 2.5 x 106 내지 5 x 106 개의 전체 CAR-발현 T 세포, 5 x 106 내지 5 x 108 개의 전체 CAR-발현 T 세포, 5 x 106 내지 2.5 x 108 개의 전체 CAR-발현 T 세포, 5 x 106 내지 1 x 108 개의 전체 CAR-발현 T 세포, 5 x 106 내지 5 x 107 개의 전체 CAR-발현 T 세포, 5 x 106 내지 2.5 x 107 개의 전체 CAR-발현 T 세포, 5 x 106 내지 1 x 107 개의 전체 CAR-발현 T 세포, 1 x 107 내지 5 x 108 개의 전체 CAR-발현 T 세포, 1 x 107 내지 2.5 x 108 개의 전체 CAR-발현 T 세포, 1 x 107 내지 1 x 108 개의 전체 CAR-발현 T 세포, 1 x 107 내지 5 x 107 개의 전체 CAR-발현 T 세포, 1 x 107 내지 2.5 x 107 개의 전체 CAR-발현 T 세포, 2.5 x 107 내지 5 x 108 개의 전체 CAR-발현 T 세포, 2.5 x 107 내지 2.5 x 108 개의 전체 CAR-발현 T 세포, 2.5 x 107 내지 1 x 108 개의 전체 CAR-발현 T 세포, 2.5 x 107 내지 5 x 107 개의 전체 CAR-발현 T 세포, 5 x 107 내지 5 x 108 개의 전체 CAR-발현 T 세포, 5 x 107 내지 2.5 x 108 개의 전체 CAR-발현 T 세포, 5 x 107 내지 1 x 108 개의 전체 CAR-발현 T 세포, 1 x 108 내지 5 x 108 개의 전체 CAR-발현 T 세포, 1 x 108 내지 2.5 x 108 개의 전체 CAR-발현 T 세포, 또는 2.5 x 108 내지 5 x 108 개의 전체 CAR-발현 T 세포를 포함한다.
일부 구현예에서, 유전자 조작 세포의 복용량은 적어도 (약) 1 x 105 CAR-발현 세포, 적어도 (약) 2.5 x 105 개의 CAR-발현 세포, 적어도 (약) 5 x 105 개의 CAR-발현 세포, 적어도 (약) 1 x 106 개의 CAR-발현 세포, 적어도 (약) 2.5 x 106 개의 CAR-발현 세포, 적어도 (약) 5 x 106 개의 CAR-발현 세포, 적어도 (약) 1 x 107 개의 CAR-발현 세포, 적어도 (약) 2.5 x 107 개의 CAR-발현 세포, 적어도 (약) 5 x 107 개의 CAR-발현 세포, 적어도 (약) 1 x 108 개의 CAR-발현 세포, 적어도 (약) 2.5 x 108 개의 CAR-발현 세포, 또는 적어도 (약) 5 x 108 개의 CAR-발현 세포를 포함한다.
일부 구현예에서, 세포 요법은 (약) 1 x 105 내지 5 x 108 개의 전체 재조합 수용체-발현 세포, 전체 T 세포, 또는 전체 말초 혈액 단핵구 세포 (PBMC) 수, (약) 5 x 105 내지 1 x 107 개의 전체 재조합 수용체-발현 세포, 전체 T 세포, 또는 전체 말초 혈액 단핵구 세포 (PBMC) 수, 또는 (약) 1 x 106 내지 1 x 107 개의 전체 재조합 수용체-발현 세포, 전체 T 세포, 또는 전체 말초 혈액 단핵구 세포 (PBMC) 수를 포함하는 투여량의 투여를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 세포 요법은 적어도 (약) 1 x 105개의 전체 재조합 수용체-발현 세포, 전체 T 세포, 또는 전체 말초 혈액 단핵구 세포 (PBMC) 수를 포함하는 세포 투여량의 투여를 포함하는데, 예컨대 적어도 (약) 1 x 106 개, 적어도 (약) 1 x 107 개, 적어도 (약) 1 x 108 개의 그러한 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 수는 CD3+ 또는 CD8+의 전체 수에 관한 것이며, 일부 경우, 재조합 수용체-발현 (예컨대, CAR+) 세포에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 상기 세포 요법은 (약) 1 x 105 내지 5 x 108 개의 CD3+ 또는 CD8+ 전체 T 세포 또는 CD3+ 또는 CD8+ 재조합 수용체-발현 세포, (약) 5 x 105 내지 1 x 107 개의 CD3+ 또는 CD8+ 전체 T 세포 또는 CD3+ 또는 CD8+ 재조합 수용체-발현 세포, 또는 (약) 1 x 106 내지 1 x 107 개의 CD3+ 또는 CD8+ 전체 T 세포 또는 CD3+ 또는 CD8+ 재조합 수용체-발현 세포 수를 포함하는 투여량의 투여를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 세포 요법은, (약) 1 x 105 내지 5 x 108 개의 전체 CD3+/CAR+ 또는 CD8+/CAR+ 세포, (약) 5 x 105 내지 1 x 107 개의 전체 CD3+/CAR+ 또는 CD8+/CAR+ 세포, 또는 (약) 1 x 106 내지 1 x 107 개의 전체 CD3+/CAR+ 또는 CD8+/CAR+ 세포 수를 포함하는 투여량의 투여를 포함한다.
일부 구현예에서, 예를 들어, 대상체가 인간인 경우, CD4+ 및 CD8+ T 세포를 포함하는 복용량을 포함하는, 복용량의 CD8+ T 세포는, 약 1 x 106 내지 5 x 108 개의 전체 재조합 수용체 (예를 들어, CAR)-발현 CD8+세포, 예를 들어, 약 5 x 106 내지 1 x 108 개의 이러한 세포의 범위를 포함하고, 이러한 세포는 1 x 107, 2.5 x 107, 5 x 107, 7.5 x 107, 1 x 108, 또는 5 x 108 개의 전체 이러한 세포, 또는 전술한 값 중 임의의 둘 사이의 범위를 포함한다. 일부 구현예에서, 환자는 다회 투여량을 투여받고, 투여량 각각 또는 전체 투여량은 전술한 수치들 중 어느 하나 이내일 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 세포 투여량은 (약) 1 x 107 내지 0.75 x 108 개의 전체 재조합 수용체-발현 CD8+ T 세포, 1 x 107 내지 2.5 x 107 개의 전체 재조합 수용체-발현 CD8+ T 세포, (약) 1 x 107 내지 0.75 x 108 개의 전체 재조합 수용체-발현 CD8+ T 세포의 투여를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포의 복용량은 약 1 x 107, 2.5 x 107, 5 x 107 7.5 x 107, 1 x 108, 또는 5 x 108 개의 전체 재조합 수용체-발현 CD8+ T 세포의 투여를 포함한다.
일부 구현예에서, 세포, 예를 들어, 재조합 수용체-발현 T 세포의 복용량은, 단일 용량으로서 대상체에게 투여되거나, 또는 2 주, 1 개월, 3 개월, 6 개월, 1 년 이상의 기간 내에 한 번만 투여된다.
일부 양태에서, 약제학적 조성물 및 제제는 주어진 용량 또는 이의 분획으로 투여하기 위한 세포의 개수를 포함하는 단위 투여 형태 조성물로서 제공된다. 일부 구현예에서, 제공된 방법은 세포를 인큐베이션 (예를 들어, 자극)하는 다른 방법과 비교하여 투여에 대한 예측 가능한 타임라인으로 세포를 제조한다. 일부 경우에, 투여를 위한 세포의 용량은 투입 세포 조성물 내 나이브-유사 세포의 개수에 기초하여 결정된다.
일부 양태에서, 용량의 크기는 대상체의 질병 부담 또는 병태에 의해 결정된다. 예를 들어, 일부 양태에서, 용량으로 투여되는 세포의 개수는 세포의 용량 개시의 투여 직전에 대상체 내에 존재하는 종양 부담에 기초하여 결정된다. 일부 구현예에서, 제1 및/또는 후속 용량의 크기는 질병 부담과 반비례 관계에 있다. 일부 양태에서, 질병 부담이 큰 상황에서 대상체는 적은 수의 세포가 투여된다. 다른 구현예에서, 질병 부담이 낮은 상황에서, 대상체는 많은 수의 세포가 투여된다.
세포의 투여 이후, 일부 구현예에서, 조작된 세포 집단의 생물학적 활성은 예컨대 다수의 공지된 방법 중 임의의 방법에 의해 측정된다. 생체 내, 예컨대 이미징에 의해 또는 생체 외, 예컨대 ELISA 또는 유동 세포 측정 분석에 의해 평가할 파라미터는, 항원에 대한 조작된 T 세포 또는 천연 T 세포 또는 기타 면역 세포의 특이적 결합을 포함한다. 특정 구현예에서, 조작된 세포가 표적 세포를 붕괴시키는 능력은, 예를 들어 문헌 [Kochenderfer et al., J. Immunotherapy, 32(7): 689-702 (2009)], 및 [Herman et al. J. Immunological Methods, 285(1): 25-40 (2004)]에 기재된 세포독성 분석과 같이, 임의의 적절한 방법을 사용하여 측정할 수 있다. 특정 구현예에서, 세포의 생물학적 활성은 CD107a, IFNγIL-2 및 TNF와 같은 하나 이상의 사이토카인의 발현 및/또는 분비를 분석함으로써 측정된다. 특정 구현예에서, 조작된 세포는 그 치료적 또는 예방적 효능이 증가되도록 임의의 수의 방법으로 추가로 조작된다.
세포는 임의의 적합한 수단에 의해 투여될 수 있다. 세포는 투약 요법으로 투여되어, 종양 부담의 감소와 같은 치료적 효과를 달성한다. 투약 및 투여는 면역조절성 화합물의 투여 스케줄에 부분적으로 의존할 수 있고, 이는 T 세포 요법의 투여 개시 이전에, 이후에, 및/또는 동시에 투여될 수 있다. T 세포 요법의 다양한 투약 스케쥴은 다양한 시점, 볼루스 투여 및 맥박 주입에 대한 단일 또는 다중 투여를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 특정 구현예에서, 조작된 T 세포는 재조합 수용체를 발현한다. 특정 구현예에서, 조작된 T 세포는 CAR을 발현한다.
구체적인 구현예에서, 동일한 조성물, 용량, 또는 혼합물로 대상체에게 투여되는 CD4+ T 세포 대 CD8+ T 세포의 비율은 5:1 내지 0.2:1, 4:1 내지 0.25:1, 3:1 내지 0.33:1, 2:1 내지 0.5:1, 1.5:1 내지 0.66:1, 또는 1.25:1 내지 0.8:1이다. 일부 구현예에서, 동일한 조성물, 용량, 또는 혼합물로 대상체에게 투여되는 CD4+ T 세포 대 CD8+ T 세포의 비율은 (약) 2.0:1, 1.9:1, 1.8:1, 1.7:1, 1.6:1, 1.5:1, 1.4:1, 1.3:1, 1.2:1, 1.1:1, 1.0:1, 0.9:1, 0.8:1, 0.7:1, 0.6:1, 또는 0.5:1이다.
구체적인 구현예에서, 동일한 조성물, 용량, 또는 혼합물로 대상체에게 투여되는 CD4+ T 세포를 발현하는 재조합 수용체 대 CD8+ T 세포를 발현하는 재조합 수용체의 비율은 5:1 내지 0.2:1, 4:1 내지 0.25:1, 3:1 내지 0.33:1, 2:1 내지 0.5:1, 1.5:1 내지 0.66:1, 또는 1.25:1 내지 0.8:1이다. 특정 구현예에서, 동일한 조성물, 용량, 또는 혼합물로 대상체에게 투여되는 CD4+ T 세포를 발현하는 재조합 수용체 대 CD8+ T 세포를 발현하는 재조합 수용체의 비율은 (약) 2.0:1, 1.9:1, 1.8:1, 1.7:1, 1.6:1, 1.5:1, 1.4:1, 1.3:1, 1.2:1, 1.1:1, 1.0:1, 0.9:1, 0.8:1, 0.7:1, 0.6:1, 또는 0.5:1이다. 구체적인 구현예에서, 투여되는 CD4+ T 세포를 발현하는 재조합 수용체 대 CD8+ T 세포를 발현하는 재조합 수용체의 비율은 (약) 1:1이다. 일부 구현예에서, 재조합 수용체는 TCR 또는 CAR이다. 구체적인 구현예에서, 재조합 수용체는 CAR이다.
일부 구현예에서, 대상체에게 투여되는 용량, 조성물, 또는 혼합물의 조작된 CD4+ T 세포 대 조작된 CD8+ T 세포의 비율은 이러한 정의된, 원하는, 또는 고정된 비율의 오차의 특정한 허용되는 차이 또는 범위 내에 있다. 일부 구현예에서, 허용되는 차이는 표적의, 정의된, 바람직한, 및/또는 고정된 비율의 (약) 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 또는 50% 이내이다.
일부 구현예에서, 본 명세서에 제공되는 방법에 의해 제조된 세포의 조성물, 예를 들어, 조작된 CD4+ T 세포 대 조작된 CD8+ T 세포의 비율이 2:1 내지 0.5:1인 산출 조성물은 단일 조성물, 용량, 또는 혼합물로 대상체에게 투여된다. 특정 구현예에서, 조성물은 조작된 CD4+ T 세포 대 조작된 CD8+ T 세포의 비율이 (약) 1:1이다. 일부 구현예에서, 투입 세포 조성물, 예를 들어, 섹션 I-A1에 기재된 투입 세포 조성물로부터 제조된 세포 조성물은 조작된 CD4+ T 세포 대 조작된 CD8+ T 세포의 비율이 2:1 내지 0.5:1이며, 단일 조성물, 용량, 또는 혼합물로 대상체에게 투여된다. 구체적인 구현예에서, 투입 세포 조성물로부터 제조된 세포 조성물은 조작된 CD4+ T 세포 대 조작된 CD8+ T 세포의 비율이 1:1이며, 허용되는 차이는 50%, 25%, 10% 미만이다.
일부 구현예에서, 세포는 항체 또는 조작된 세포 또는 수용체 또는 시제 (예컨대, 세포 독성제 또는 치료제) 등의 또 다른 치료적 개입과 동시에 또는 임의의 순서로 순차적으로, 추가적인 병용 치료의 일부로서 투여된다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 항암제 또는 면역조절제는 재조합 수용체, 예를 들어, CAR을 발현하는 조작된 세포로의 입양 세포 요법과 함께 병용 요법으로 사용될 수 있다. 일부 상황에서, 세포 집단이 하나 이상의 추가적인 치료제의 효과를 증강시키도록 또는 그 반대의 경우를 위하여, 세포는 또 다른 요법과 시간적으로 충분히 가까이 병용 투여된다. 일부 구현예에서, 세포는 하나 이상의 추가적인 치료제에 선행하여 투여된다. 일부 구현예에서, 세포는 하나 이상의 추가적인 치료제 후에 투여된다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 추가적인 치료제는 예컨대 지속성을 증강시키기 위한, IL-2와 같은 사이토카인을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 화학 요법 시제의 투여를 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 추가적인 치료제는 조작된 세포의 투여 개시 이전에, 또는 동시에 하나 이상의 림프고갈 요법을 포함한다. 일부 구현예에서, 림프고갈 요법은 포스파미드, 예컨대 사이클로포스파미드의 투여를 포함한다. 일부 구현예에서, 림프고갈 요법은 플루다라빈의 투여를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 플루다라빈은 림프고갈 요법에서 배제된다. 일부 구현예에서, 림프고갈 요법은 투여되지 않는다.
일부 구현예에서, 상기 방법은 세포 요법의 개시 전에 대상체에게 전처치 시제를 투여하는 것을 포함하는데, 예컨대 림프고갈 또는 화학치료 시제, 예컨대 사이클로포스파마이드, 플루다라빈 또는 이의 조합이다. 예를 들어, 상기 대상체는 세포 요법의 개시보다 적어도 2 일 전에, 예를 들어 적어도 3, 4, 5, 6, 또는 7 일 이전에 전처치 제제를 투여받는다. 일부 구현예에서, 상기 대상체는 세포 요법의 개시보다 최대 7 일 전에, 예를 들어 최대 6, 5, 4, 3 또는 2 일 이전에 전처치 제제를 투여받는다.
일부 구현예에서, 대상체는 20 mg/kg 내지 100mg/kg 사이, 또는 40 mg/kg 내지 80 mg/kg 사이 또는 약 그 정도의 투여량으로 사이클로포스파마이드를 이용하여 전처치된다. 일부 측면에서, 상기 대상체는 60 mg/kg의 또는 약 그 정도의 사이클로포스파마이드로 전처치된다. 일부 구현예에서, 사이클로포스파마이드는 단일 투여로 투여되거나 또는 복수 회 투여로, 예컨대 매일, 격일로 또는 매 3일에 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 사이클로포스파마이드는 하루 또는 이틀간 1 일 1 회 투여된다. 일부 구현예에서, 림프구고갈 시제가 사이클로포스파마이드를 포함하는 경우, 대상체는 사이클로포스파마이드가 복용량 (약) 100 mg/m2 내지 500 mg/m2, 예컨대 (약) 200 mg/m2 내지 400 mg/m2, 또는 250 mg/m2 내지 350 mg/m2의 복용량으로 투여된다. 일부 예시에서, 대상체는 약 300 mg/m2의 사이클로포스파마이드가 투여된다. 일부 구현예에서, 사이클로포스파마이드는 단일 투여로 투여되거나 또는 복수 회 투여로, 예컨대 매일, 격일로 또는 매 3일에 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 사이클로포스파마이드는 예컨대 1-5 일간, 예컨대 3 내지 5 일간 매일 투여된다. 일부 예시에서, 대상체는 세포 요법의 개시 이전에, 3 일 간 매일, 약 300 mg/m2의 사이클로포스파마이드기 투여된다.
일부 구현예에서, 림프구고갈 시제가 플루다라빈을 포함하는 경우, 대상체는 플루다라빈이 (약) 1 mg/m2 내지 100 mg/m2, 예컨대 (약) 10 mg/m2 내지 75 mg/m2, 15 mg/m2 내지 50 mg/m2, 20 mg/m2 내지 40 mg/m2, 또는 24 mg/m2 내지 35 mg/m2의 복용량으로 투여된다. 일부 예시에서, 대상체는 약 30 mg/m2의 플루다라빈이 투여된다. 일부 구현예에서, 플루다라빈은 단일 투여로 투여되거나 또는 복수 회 투여로, 예컨대 매일, 격일로 또는 매 3일에 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 플루다라빈은 예컨대 1-5 일간, 예컨대 3 내지 5 일간 매일 투여된다. 일부 예시에서, 대상체는 세포 요법의 개시 이전에, 3 일 간 매일, 약 30 mg/m2의 플루다라빈이 투여된다.
일부 구현예에있서, 림프고갈 제제는 제제들의 조합, 예컨대 사이클로포스파마이드 및 플루다라빈의 조합을 포함한다. 따라서, 상기 제제의 조합물은 임의의 투여량 또는 투여 스케쥴로 사이클로포스파마이드를 포함할 수 있는데, 예컨대 전술한 바와 같고, 상기 조합물은 임의의 투여량 또는 투여 스케쥴로 플루다라빈을 포함할 수 있는데, 예컨대 전술한 바와 같다. 예를 들어, 일부 측면에서, 제1 투여 또는 후속 투여 전에 60 mg/kg (~ 2 g/m2)의 사이클로포스파마이드 및 3 내지 5 투여량의 25 mg/m2 플루다라빈을 투여받는다.
IV. 제조 물품 및 키트
또한 입양 세포 요법에 대해 제공된 방법에 따라 대상체에게 세포를 투여하기 위한, 및 기재된 바와 같은 투입 조성물 또는 산출 조성물과 같은 세포 및 조성물의 저장 및 투여를 위한 키트 및 장치와 같은 제조 물품이 제공된다.
제조 물품은 하나 이상의 용기, 일반적으로 복수의 용기, 패키징 재료, 및 용기 또는 용기 및/또는 패키징 상에 또는 이와 관련된 라벨 또는 패키지 삽입물을 포함하며, 일반적으로 대상체에게 세포를 투여하기 위한 설명서를 포함한다.
일부 구현예에서, 용기는 투여될 세포, 예컨대, 이의 하나 이상의 단위 복용량을 포함한다. 제조 물품은 일반적으로 복수의 용기를 포함하며, 각각은 세포의 단일 단위 복용량을 포함한다. 단위 복용량은 제1 복용량으로 대상체에게 투여될 세포의 양 또는 수, 또는 제1 또는 임의의 하나 이상의 연속 복용량(들)로 투여될 세포 수의 두 배 (이상)일 수 있다. 이는 투여 방법과 관련하여 대상체에게 투여될 세포의 최저 용량 또는 가능한 최저 용량일 수 있다. 일부 구현예에서, 단위 용량은 본 명세서의 방법에 따라 특정 질병 또는 병태를 가지는 임의의 대상체, 또는 임의의 대상체에게 단일 용량으로 투여될 표적 범위 내에서 최소 세포 수 또는 세포 수, 또는 기준 단위의 최소 수 또는 표적 기준 단위 또는 기준 단위이다.
적합한 용기로는, 예를 들어, 병, 바이알, 실린지, 및 유연한 백, 예컨대, 주입 백 등을 포함한다. 구체적인 구현예에서, 용기는 유연한 백(bag)과 같은 백, 예컨대 대상체에게 세포를 주입하기에 적합한 백, 예컨대, 유연한 플라스틱 또는 PVC 백, 및/또는 IV 솔루션 백이다. 일부 구현예에서 백은 멸균 용액을 제공하고 세포 및 조성물의 전달하도록 밀봉 가능하고 및/또는 멸균될 수 있다. 일부 구현예에서, 용기, 예컨대, 백은 적어도 (약) 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 또는 1000 mL의 용량, 예컨대 (약) 10 내지 (약) 100, 또는 (약) 10 내지 (약) 500 mL의 용량을 가진다. 일부 구현예에서, 용기, 예컨대, 백은, 하나 이상의 다양한 온도, 예컨대 차가운 온도, 예컨대 (약) -20 ℃, -80 ℃, -120 ℃, 135 ℃에서 및/또는 냉동보존에 적합한 온도, 및/또는 다른 온도, 예컨대 세포를 해동하기에 적합한 온도 및, 예를 들어, 치료 직전에 대상체의 위치 또는 치료 위치, 예컨대, 침대 옆에서, 해동을 허용하는 (약) 37 ℃과 같은 체온에서, 안정한 및/또는 안정한 저장 및/또는 세포 유지를 제공하는 물질이고 및/또는 이러한 물질로 이루어져있다.
용기는 다양한 재료, 예컨대 유리 또는 플라스틱으로 형성될 수 있다. 일부 구현예에서, 용기는 예를 들어, 하나 이상의 튜브에 튜빙 또는 캐뉼레이션하기 위한, 예를 들어, 정맥내 또는 다른 주입을 위해 및/또는 다른 용기, 예컨대 세포 배양물, 및/또는 저장 백 또는 다른 용기로 전달하기 위한 하나 이상의 포트, 예컨대, 멸균 접근 포트를 가진다. 예시적인 용기로는 주사용 바늘이 뚫을 수 있고 스탑퍼를 가지는 백을 포함하여, 주입 백, 정맥 내 수액 백, 바이알을 포함한다.
제조 물품은 하나 이상의 식별 정보 및/또는 사용 설명서가 있는 패키지 삽입물 또는 라벨을 추가로 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 정보 또는 설명서는 구체적인 병태 또는 질병을 치료하기 위해, 및/또는 이를 위한 설명서를 제공하는데 사용될 수 있거나 사용되어야 하는 것을 명시한다. 라벨 또는 패키지 삽입물은 제조 물품의 내용물이 질병 또는 병태를 치료하기 위해 사용된다는 것을 명시할 수 있다. 일부 구현예에서, 라벨 또는 패키지 삽입물은 예컨대, 제공된 방법 중 임의의 구현예에 따라, 제1 및 하나 이상의 연속 용량의 세포 투여를 포함하는 방법을 통해, 세포가 유래된 대상체와 같은 대상체를 치료하기 위한 설명서를 제공한다. 일부 구현예에서, 설명서는, 제1 용량으로, 하나의 단위 용량, 예컨대, 제조 물품 내의 단일 개별 용기의 내용물의 투여에 이어서, 지정된 시점에 또는 지정된 시간 윈도우 이내에 및/또는 대상체에서 하나 이상의 인자 또는 결과의 존재 또는 부재 또는 양 또는 정도의 검출 이후, 하나 이상의 연속 용량을 투여하는 것을 명시한다.
일부 구현예에서, 설명서는 대상체에게 하나 이상의 단위 용량을 투여하는 것을 명시한다.
일부 구현예에서, 라벨 또는 패키지 삽입물 또는 패키징은 세포가 유래된 및/또는 세포가 투여될 대상체의 특정 신원을 나타내는 식별자를 포함한다. 자가 전이의 경우, 세포가 유래된 대상체의 신원은 세포가 투여되는 대상체의 신원과 동일하다. 이에 따라, 식별 정보는 세포가 특정 환자, 예컨대 세포가 원래 유래된 환자에게 투여되도록 특정할 수 있다. 이러한 정보는 바코드 또는 다른 암호화된 식별자의 형태의 패키징 재료 및/또는 라벨로 존재할 수 있거나, 또는 대상체의 이름 및/또는 다른 식별 특성을 식별할 수 있다.
일부 구현예에서 제조 물품은 세포를 포함하는 조성물을 함유하는 하나 이상의, 일반적으로 복수의 용기, 예컨대, 이의 개별 단위 용량을 포함하며, 예를 들어, 임의의 순서로 동시에 또는 순차적으로, 세포와 조합되어 투여될 세포독성제, 그렇지 않으면 치료제와 같은 추가적인 시제를 포함하는 조성물이 함유된 하나 이상의 추가적인 용기를 추가로 포함한다. 택일적으로, 또는 추가적으로, 제조 물품은은 약제학적으로-허용되는 완충액을 포함하는 또 다른 또는 동일한 용기를 추가로 포함할 수 있다. 이는 다른 물질, 예컨대 다른 완충액, 희석제, 튜빙, 필터, 바늘, 및/또는 실린지를 추가로 포함할 수 있다.
용어 “패키지 삽입물(package insert)”은 이러한 치료요법적 산물의 사용과 관련된 지시, 용도, 투여량, 투여, 복합 요법, 금기 및/또는 경고에 대한 정보가 포함된 치료요법적 산물의 시판 포장에 관례적으로 포함되는 지침을 칭할 때 이용된다.
V. 정의
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술 용어, 표기법 및 기타 기술 및 과학 용어 또는 전문 용어는, 청구되는 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 바와 같은 동일한 의미를 가진다. 일부 경우에, 일반적으로 이해되는 의미를 가지는 용어는 명확성 및/또는 즉답형 참조를 위해 본 발명에 정의되며, 본 명세서에 이러한 정의를 포함한다고 해서 해당 기술 분야에서 일반적으로 이해되는 바와 실질적인 차이를 나타내는 것으로 해석되어서는 안된다.
본 명세서에서 사용 시, "대상체"는 인간 또는 기타 동물과 같은 포유류이며, 일반적으로는 인간이다. 일부 구현예에서, 면역조절성 폴리펩타이드, 조작된 세포 또는 조성물이 투여되는 대상체, 예컨대 환자는 포유류, 전형적으로는 인간과 같은 영장류이다. 일부 구현예에서, 영장류는 원숭이 또는 유인원이다. 대상체는 남성 또는 여성일 수 있으며, 유아, 어린이, 청소년, 성인 및 노인 대상체를 포함하여 임의의 적합한 연령일 수 있다. 일부 구현예에서, 대상체는 설치류와 같은 영장류가 아닌 포유류이다.
본 명세서에서 사용 시, 본 명세서에서 사용된 바와 같이, "치료" (및 "치료하다" 또는 "치료의"와 같은 문법적인 변형)는 질환 또는 병태 또는 장애, 또는 징후, 부작용 또는 결과, 또는 이러한과 관련된 표현형의 완전한 또는 부분적인 개선 또는 감소를 의미한다. 치료의 바람직한 효과에는 질환의 발생 또는 재발 방지, 증상의 완화, 상기 질환의 임의의 직접 또는 간접적인 병리학적 결과의 감소, 전이 방지, 질환 진행 속도 감소, 상기 질환 상태의 개선 또는 경감, 그리고 차도 또는 개선된 예후가 포함되나, 이에 제한되지 않는다. 용어는 질환의 완치, 또는 모든 징후나 결과에 대한 임의의 징후나 효과(들)의 완전한 제거를 의미하지는 않는다.
본 명세서에서 사용 시, "질환 발달 지연"은 질환 (예컨대, 암)의 발달을 연기, 저해, 둔화, 지체, 안정화, 억제 및/또는 미루는 것을 의미한다. 지연은 치료될 질환 및/또는 개인의 병력에 좌우하여 다양한 길이의 시간이 될 수 있다. 명백한 바와 같이, 충분한 또는 현저한 지연은 사실상 개인이 질환을 발달시키지 않는다는 점에서 예방을 포함할 수 있다. 예를 들어, 말기 암, 예컨대 전이의 발달은 지연될 수 있다.
본 명세서에서 사용 시, "예방"은 질환에 걸리기 쉽지만 아직 질환을 진단받지 않은 대상체에서, 질환의 발병 또는 재발과 관련된 예방을 제공하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 제공된 세포 및 조성물은 질환의 발달을 지연시키거나 질환의 진행을 둔화시키는데 사용된다.
본 명세서에서 사용 시, 기능 또는 활성을 "억제"하는 것은 관심있는 조건 또는 파라미터를 제외한 다른 동일한 조건과 비교하였을 때, 또는 또 다른 조건과 비교하여, 기능 또는 활성을 감소시키는 것이다. 예를 들어, 종양 성장을 억제하는 세포는, 세포가 없는 경우에서의 종양의 성장 속도와 비교하여 종양의 성장 속도를 감소시킨다.
투여의 맥락에서, 약학 제형, 세포 또는 조성물의 "유효량"은, 필요한 시간 동안 복용량/투여량으로 치료적 또는 예방적 결과 등의 원하는 결과를 효과적으로 달성하기 위한 양을 의미한다.
시제, 예를 들어 약제학적 제제 또는 조작된 세포의 "치료적 유효량"은, 필요한 시간 동안 복용량으로 원하는 치료적 결과, 예컨대 질환, 병태 또는 장애의 치료, 및/또는 치료의 약동학 또는 약역학 효과를 효과적으로 달성하기 위한 양을 의미한다. 치료적 유효량은 대상체의 질환 상태, 연령, 성별 및 체중과 투여되는 면역조절성 폴리펩타이드 또는 조작된 세포 등의 인자에 따라 달라질 수 있다. 일부 구현예에서, 제공된 방법은 면역조절성 폴리펩타이드 또는 조작된 세포, 또는 조성물을 유효량으로, 예컨대 치료적 유효량으로 투여하는 단계를 포함한다.
"예방적 유효량"은, 필요한 시간 동안 복용량으로 원하는 예방적 결과를 효과적으로 달성하기 위한 양을 의미한다. 그러나, 전형적으로 반드시 그런 것은 아니지만, 예방적 투여량(dose)은 질환 전 또는 초기 단계에 이용되기 때문에, 예방적 유효량은 치료적 유효량보다 적을 것이다.
용어 “약제학적 제형(pharmaceutical formulation)”이란 이러한 조성물 안에 포함된 활성 성분의 생물학적 활성이 효과가 있도록 하기 위한 형태의 조제물을 지칭하며, 제형이 투여되는 대상에게 수용 불가능한 독성을 주는 추가 성분은 포함하지 않는다.
“약제학적으로 허용 가능한 담체(pharmaceutically acceptable carrier)”란, 대상에게 비독성이며, 활성 성분 이외의 약학 제제에 포함된 성분을 지칭한다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 완충액, 부형제, 안정화제, 또는 보존제를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
본 명세서에서 사용 시, 뉴클레오타이드 또는 아미노산 위치가 서열 목록에 기재된 것과 같은 개시된 서열에서 뉴클레오타이드 또는 아미노산 위치에 "상응한다"는 설명은, 표준 정렬 알고리즘, 예컨대 GAP 알고리즘을 사용하여 동일성을 최대화하기 위해 개시된 서열과의 정렬 시에 식별되는 뉴클레오타이드 또는 아미노산 위치를 지칭한다. 서열을 정렬시킴으로써, 예를 들어, 보존된 동일한 아미노산 잔기를 가이드로서 사용하여 상응하는 잔기를 식별할 수 있다. 일반적으로, 상응하는 위치를 식별하기 위해, 아미노산 서열은 가장 높은 순서로 일치하게 되도록 정렬된다 (예컨대, 다음의 문헌을 참조한다: Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M., and Griffin, H.G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; and Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991; Carrillo et al. (1988) SIAM J Applied Math 48: 1073).
아미노산 치환은 폴리펩타이드 내 하나의 아미노산을 또 다른 아미노산으로 대체하는 것을 포함할 수 있다. 치환은 보존적 아미노산 치환 또는 비-보존적 아미노산 치환일 수 있다. 아미노산 치환은 관심의 결합 분자, 예를 들어, 항체 내로 도입될 수 있으며, 생성물은 원하는 활성, 예를 들어, 유지/개선된 항원 결합, 감소된 면역원성, 또는 개선된 ADCC 또는 CDC를 위해 스크리닝될 수 있다.
아미노산은 일반적으로 다음의 공통적인 곁사슬 성질에 따라 그룹화될 수 있다:
(1) 소수성: 노르류신, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
(2) 중성 친수성: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
(3) 산성: Asp, Glu;
(4) 염기성: His, Lys, Arg;
(5) 사슬 방향에 영향을 미치는 잔기: Gly, Pro;
(6) 방향족: Trp, Tyr, Phe.
일부 구현예에서, 보존적 치환은 이러한 클래스 중 하나의 클래스의 구성원을 동일한 클래스의 또 다른 구성원으로 교환하는 것을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 비-보존적 아미노산 치환은 이러한 클래스 중 하나의 클래스의 구성원을 또 다른 클래스로 교환하는 것을 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용 시, 단수 용어(“a”, “ an”, 및 “the”)는 문맥이 명백하게 지시하지 않는 한 복수의 지시 대상을 포함한다. 예를 들어, 단수 용어(“a” 또는 “an”)는 "적어도 하나" 또는 "하나 이상"을 의미한다. 본 명세서에 기술된 양태 및 변형은, 양태 및 변형으로 "구성하는" 및/또는 "본질적으로 구성된"을 포함하는 것으로 이해된다.
본 명세서 전반에 걸쳐, 청구되는 발명의 다양한 양태가 범위 포맷으로 제공될 수 있다. 범위 포맷의 설명은 단지 편의 및 간결화를 위한 것이며, 청구되는 발명의 범위에 대한 변경할 수 없는 제한으로 해석되어서는 안됨을 이해해야 한다. 따라서, 범위의 기재는 그러한 범위에 속하는 개별적인 수치, 뿐만 아니라 모든 가능한 하위범위가 명시적으로 개시된 것으로 고려되어야 한다. 예를 들어, 값의 범위가 제공되는 경우, 그 범위의 상한과 하한 사이의 각각의 개재된 값 및 언급된 범위 내의 임의의 기타 언급되거나 개재된 값이 청구된 발명 내에 포함되는 것으로 이해된다. 이러한 더 작은 범위의 상한 및 하한은 독립적으로 더 작은 범위 내에 포함될 수 있으며, 또한 언급된 범위에서 임의의 특별히 배제된 한계값에 따라 청구된 발명 범위에 포함될 수도 있다. 언급된 범위가 한계값의 하나 또는 둘 모두를 포함하는 경우, 포함된 하나 또는 두 한계값을 제외한 범위 또한 청구된 발명 범위에 포함된다. 이는 범위의 폭에 관계없이 적용된다.
본 명세서에 사용 된 용어 "약(about)"이란 이 기술 분야의 당업자에게 잘 공지된 바와 같이, 각각의 값에 대한 통상적인 오차 범위를 나타낸다. 본 명세서의 값 또는 매개변수에 대한 "약(about)"의 언급은 그 값 또는 매개변수 그 자체(per se)를 나타내는 구현예를 포함 (및 설명)한다. 예를 들어, "약 X"을 언급하는 설명은 "X"의 설명을 포함한다. 특정 구체예에서, 언급된 값의 “약”은 언급된 값의 ±25%, ±20%, ±10%, ±5%, ±1%, ±0.1%, 또는 ±0.01% 이내의 값을 지칭한다.
본 명세서에서 사용 시, 조성물은 세포를 포함하는 둘 이상의 산물, 물질 또는 화합물의 임의의 혼합물을 의미한다. 이는 용액, 현탁액, 액체, 분말, 페이스트, 수성, 비수성 또는 이러한의 임의의 조합일 수 있다.
본 명세서에 사용 시, 세포 또는 세포 집단이 특정 마커에 대해 "양성"이라는 설명은, 특정 마커, 전형적으로 표면 마커가 세포 상의 또는 세포 내의 검출 가능하도록 존재하는 것을 의미한다. 표면 마커를 지칭할 때, 용어는 예컨대, 마커에 특이적으로 결합하는 항체로 염색하고 항체를 검출함으로써, 유동 세포 측정 분석에 의해 검출된 표면 발현의 존재를 지칭하며, 여기서 염색은 동일한 조건하에서 이소타입-매치된 대조군을 사용한 동일한 절차를 수행하여 검출된 염색보다 실질적으로 높은 수준에서, 및/또는 마커에 대해 양성인 것으로 알려진 세포에 대한 것과 실질적으로 유사한 수준에서, 및/또는 마커에 대해 음성인 것으로 알려진 세포보다 실질적으로 높은 수준에서 유동 세포 측정 분석에 의해 검출 가능하다.
본 명세서에 사용 시, 세포 또는 세포 집단이 특정 마커에 대해 "음성"이라는 설명은, 특정 마커, 전형적으로 표면 마커의 세포 상의 또는 세포 내의 실질적으로 검출 가능한 존재가 없다는 것을 의미한다. 표면 마커를 지칭할 때, 용어는 예컨대, 마커에 특이적으로 결합하는 항체로 염색하고 항체를 검출함으로써, 유동 세포 측정 분석에 의해 검출되는 표면 발현이 없음을 의미하며, 여기서 염색은 동일한 조건하에서 이소타입-매치된 대조군을 사용한 동일한 절차를 수행하여 검출된 염색보다 실질적으로 높은 수준에서, 및/또는 마커에 대해 양성인 것으로 알려진 세포보다 현저히 낮은 수준에서, 및/또는 마커에 대해 음성인 것으로 알려진 세포에 대한 것과 실질적으로 유사한 수준에서 유동 세포 측정 분석에 의해 검출되지 않는다.
본 발명에 사용되는바, 용어 "벡터"는 그것이 연결된 다른 핵산을 전파시킬 수 있는 핵산 분자를 말한다. 상기 용어는 그것이 도입된 숙주 세포의 게놈에 혼입된 벡터뿐만 아니라 자기 복제 핵산 구조로서의 벡터를 포함한다. 특정 벡터는 그들이 작동적으로 연결된 핵산의 발현을 지시할 수 있다. 이러한 벡터를 본 명세서에서 “발현 벡터(expression vectors)”라고 한다.
용어 "숙주 세포(host cell)", "숙주 세포 계통(cell line)", 및 "숙주 세포 배양물(culture)"은 호환 이용되며, 외생 핵산이 도입된, 세포 및 이러한 세포들의 후대가 포함된 세포들을 지칭한다. 숙주 세포는 "형질변환체(transformants)"와 "형질변환된(transformed) 세포"이 포함되는데, 이들은 계대의 수와 무관하게, 1차 형질변환된 세포와 이로부터 유도된 후대를 포함한다. 후대는 핵산 함량에 있어서 부모계 세포와 완벽하게 동일하지는 않고, 돌연변이를 포함할 수 있다. 원래 형질변환된 세포에 대하여 선별된 또는 선택된 것과 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 보유한 돌연변이 후대가 본 명세서에 포함된다.
VI. 예시적인 구현예
제공되는 구현예는 다음과 같다:
1. 다음의 단계를 포함하는, 세포 조성물의 제조 방법:
나이브-유사 CD4+ T 세포를 포함하는 제1 세포 조성물과 나이브-유사 CD8+ T 세포를 포함하는 제2 세포 조성물을 조합하여 투입 세포 조성물을 제조하는 단계로서, 여기서 나이브-유사 CD4+ T 세포 대 나이브-유사 CD8+ T 세포의 비율은 (약) 0.8:1 내지 2.2:1인 방법.
2. 구현예 1에 있어서, 제1 세포 조성물은 대상체로부터 수득한 생물학적 샘플로부터 CD4+ T 세포를 단리함으로써 제조되고 및/또는 제2 세포 조성물은 대상체로부터 수득한 생물학적 샘플로부터 CD8+ T 세포를 단리함으로써 제조되는 것인 방법.
3. 구현예 1 또는 구현예 2에 있어서, 조합 이전에, 상기 방법은 제1 조성물 내 나이브-유사 CD4+ T 세포의 개수, 부피 당 개수, 중량 당 개수 및/또는 백분율, 및/또는 제2 조성물 내 나이브-유사 CD8+ T 세포의 개수, 부피 당 개수, 중량 당 개수 및/또는 백분율을 결정하는 단계를 포함하는 것인 방법.
4. 구현예 2에 있어서, 조합 이전에, 상기 방법은 대상체로부터의 생물학적 샘플 내 나이브-유사 CD4+ T 세포의 개수, 부피 당 개수, 중량 당 개수 및/또는 백분율, 및/또는 나이브-유사 CD8+ T 세포의 개수, 부피 당 개수, 중량 당 개수 및/또는 백분율을 결정하는 단계를 포함하는 것인 방법.
5. 구현예 1-4 중 어느 하나에 있어서, 투입 조성물 내 나이브-유사 CD4+ T 세포 대 나이브-유사 CD8+ T 세포의 비율은 대상체로부터의 생물학적 샘플 내 나이브-유사 CD4+ T 세포 대 나이브-유사 CD8+ T 세포의 비율과 비교하여 조정 또는 변경되는 것인 방법.
6. 다음의 단계를 포함하는, 세포 조성물의 제조 방법:
대상체로부터 수득한 생물학적 샘플 또는 그로부터 유래된 하나 이상의 샘플 내 나이브-유사 CD4+ T 세포 및 나이브-유사 CD8+ T 세포의 개수, 부피 당 개수, 중량 당 개수 및/또는 백분율을 결정하는 단계; 및
CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포를 포함하는 투입 조성물을 생성하는 단계로서, 여기서 나이브-유사 CD4+ T 세포 대 나이브-유사 CD8+ T 세포의 비율은 (약) 2.2:1 내지 0.8:1이고, 상기 투입 조성물 내 비율은 대상체로부터의 생물학적 샘플 내 나이브-유사 CD4+ T 세포 대 나이브-유사 CD8+ T 세포의 비율과 비교하여 조정 또는 변경되는 것인 방법.
7. 구현예 1-6 중 어느 하나에 있어서, 재조합 수용체를 인코딩하는 핵산을 투입 조성물 내 세포 내로 도입하는 조건하에서, 투입 조성물과, 재조합 수용체를 인코딩하는 핵산 분자를 포함하는 시제와 접촉시키는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
8. 다음의 단계를 포함하는, 세포 조성물의 제조 방법:
대상체로부터 유래한 생물학적 샘플로부터의 나이브-유사 CD4+ T 세포 및 나이브-유사 CD8+ T 세포를 포함하는 투입 조성물을, 재조합 수용체를 인코딩하는 핵산을 이러한 조성물 내 세포 내로 도입하는 조건하에서 재조합 수용체를 인코딩하는 핵산 분자를 포함하는 시제와 접촉시키는 단계,
여기서 투입 조성물 내 존재하는 나이브-유사 CD4+ T 세포 대 나이브-유사 CD8+ T 세포의 비율은 (약) 0.8:1 내지 2.2:1인 것인 방법.
9. 구현예 7 또는 구현예 8에 있어서, 상기 방법은 상기 접촉 단계 이전, 동안 및/또는 이후에 세포를 자극하는 단계를 추가로 포함하며, 이러한 자극 단계는 하나 이상의 자극 시제의 존재하에 세포의 인큐베이션을 포함하고, 자극 단계는 세포의 활성화 및/또는 증식을 초래하는 것인 방법.
10. 다음의 단계를 포함하는, 세포 조성물의 제조 방법:
나이브-유사 CD4+ T 세포를 포함하는 제1 세포 조성물과 나이브-유사 CD8+ T 세포를 포함하는 제2 세포 조성물을 조합하여 투입 세포 조성물을 제조하는 단계로서, 여기서 나이브-유사 CD4+ T 세포 대 나이브-유사 CD8+ T 세포의 비율은 (약) 0.8:1 내지 2.2:1인 단계;
재조합 수용체를 인코딩하는 핵산을 조성물 내 세포 내로 도입하는 조건하에서, 투입 조성물과, 재조합 수용체를 인코딩하는 핵산 분자를 포함하는 시제와 접촉시키는 단계; 및
상기 접촉 단계 이전, 동안 및/또는 이후에 세포를 자극하는 단계로서, 이러한 자극 단계는 하나 이상의 자극 시제의 존재하에 세포의 인큐베이션을 포함하고, 자극 단계는 세포의 활성화 및/또는 증식을 초래하는 단계.
11. 구현예 1-10 중 어느 하나에 있어서, 나이브-유사 CD4+ 및/또는 나이브-유사 CD8+ 세포는:
CD45RA, CD27, CD28, 및 CCR7으로 구성된 군으로부터 선택된 마커에 대해 표면 양성이고; 및/또는
CD25, CD45RO, CD56, CD62L, 및 KLRG1으로 구성된 군으로부터 선택된 마커에 대해 표면 음성이고; 및/또는
CD95의 발현이 낮고; 및/또는
IL-2, IFN-γ, IL-4, IL-10으로 구성된 군으로부터 선택된 사이토카인의 세포 내 발현에 대해 음성인 것인 방법.
12. 구현예 1-11 중 어느 하나에 있어서, 나이브-유사 CD4+ 및/또는 나이브-유사 CD8+ 세포는:
CD45RA, CD27, CD28, 및 CCR7으로 구성된 군으로부터 선택된 T 세포 활성화 마커에 대해 표면 양성이고; 및/또는
CD45RO, CD56, CD62L, 및 KLRG1으로 구성된 군으로부터 선택된 마커에 대해 표면 음성이고; 및/또는
CD95의 발현이 낮은 것인 방법.
13. 구현예 1-12 중 어느 하나에 있어서, 나이브-유사 CD4+ 및/또는 나이브-유사 CD8+ 세포는 CD45RA 및 CCR7에 대하여 표면 양성인 것인 방법.
14. 구현예 1-12 중 어느 하나에 있어서, 나이브-유사 CD4+ 및/또는 나이브-유사 CD8+ 세포는 CD27 및 CCR7에 대하여 표면 양성인 것인 방법.
15. 구현예 1-14 중 어느 하나에 있어서, 나이브-유사 CD4+ 및 나이브-유사 CD8+ 세포는 CD45RA, CD27 및 CCR7에 대하여 표면 양성이고 CD45RO에 대하여 표면 음성인 것인 방법.
16. 구현예 1-12 중 어느 하나에 있어서, 나이브-유사 CD4+ 및/또는 나이브-유사 CD8+ 세포는 CCR7에 대하여 표면 양성이고 CD62L에 대하여 표면 음성인 것인 방법.
17.
구현예 3-16 중 어느 하나에 있어서, 나이브-유사 CD4+ T 세포의 개수, 부피 당 개수, 중량 당 개수 및/또는 백분율, 및/또는 나이브-유사 CD8+ T 세포의 개수, 부피 당 개수, 중량 당 개수 및/또는 백분율은 유세포 분석에 의해 결정되는 것인 방법.
18. 구현예 8-17 중 어느 하나에 있어서, 나이브-유사 CD4+ T 세포 대 나이브-유사 CD8+ T 세포의 비율은, 대상체로부터의 생물학적 샘플 내 나이브-유사 CD4+ T 세포 대 나이브-유사 CD8+ T 세포의 비율과 비교하여 조절되는 것인 방법.
19. 구현예 1-18 중 어느 하나에 있어서, 투입 조성물은 나이브-유사 CD4+ 세포 대 나이브-유사 CD8+ 세포의 비율로 (약) 0.8:1 내지 2.0:1, 0.8:1 내지 1.6:1, 0.8:1 내지 1.4:1, 0.8:1 내지 1.2:1, 1.5:1 내지 2:1, 1.6:1 내지 1.8:1, 또는 1.0:1 내지 1.2:1을 포함하는 것인 방법.
20. 구현예 1-19 중 어느 하나에 있어서, 투입 조성물은 나이브-유사 CD4+ 세포 대 나이브-유사 CD8+ 세포의 비율로 (약) 2:1, 1.9:1, 1.8:1, 1.7:1, 1.69:1, 1.6:1, 1.5:1, 1.4:1, 1.3:1, 1.2:1, 1.1:1, 또는 1.0:1을 포함하는 것인 방법.
21. 구현예 1-20 중 어느 하나에 있어서, 투입 조성물은 나이브-유사 CD4+ 세포 대 나이브-유사 CD8+ 세포의 비율로 (약) 1.1:1을 포함하는 것인 방법.
22. 구현예 1-20 중 어느 하나에 있어서, 투입 조성물은 CD45RA 및 CCR7에 대하여 표면 양성인 나이브-유사 CD4+ 세포 대 나이브-유사 CD8+ 세포의 비율로 (약) 1.1:1을 포함하는 것인 방법.
23. 구현예 1-20 중 어느 하나에 있어서, 투입 조성물은 CD45RA 및 CD27에 대하여 표면 양성인 나이브-유사 CD4+ 세포 대 나이브-유사 CD8+ 세포의 비율로 (약) 1.69:1을 포함하는 것인 방법.
24. 다음의 단계를 포함하는, 세포 조성물의 제조 방법:
CCR7+CD45RA+CD4+ T 세포를 포함하는 제1 세포 조성물과 CCR7+CD45RA+CD8+ T 세포를 포함하는 제2 세포 조성물을 조합하여, 투입 세포 조성물을 제조하는 단계로서, 여기서 CCR7+CD45RA+CD4+ T 세포 대 CCR7+CD45RA+CD8+ T 세포의 비율은 (약) 0.8:1 내지 2.2:1인 방법.
25. 구현예 24에 있어서, 제1 세포 조성물은 대상체로부터 수득한 생물학적 샘플로부터 CD4+ T 세포를 단리함으로써 제조되고 및/또는 제2 세포 조성물은 대상체로부터 수득한 생물학적 샘플로부터 CD8+ T 세포를 단리함으로써 제조되는 것인 방법.
26. 구현예 24 또는 구현예 25에 있어서, 조합 이전에, 상기 방법은 제1 조성물 내 CCR7+CD45RA+CD4+ T 세포의 개수, 부피 당 개수, 중량 당 개수 및/또는 백분율, 및/또는 제2 조성물 내 CCR7+CD45RA+CD8+ T 세포의 개수, 부피 당 개수, 중량 당 개수 및/또는 백분율을 결정하는 단계를 포함하는 것인 방법.
27. 구현예 24-26 중 어느 하나에 있어서, 조합 이전에, 상기 방법은 대상체로부터의 생물학적 샘플 내 CCR7+CD45RA+CD4+ T 세포의 개수, 부피 당 개수, 중량 당 개수 및/또는 백분율, 및/또는 CCR7+CD45RA+CD8+ T 세포의 개수, 부피 당 개수, 중량 당 개수 및/또는 백분율을 결정하는 단계를 포함하는 것인 방법.
28. 구현예 24-27 중 어느 하나에 있어서, 투입 조성물 내 CCR7+CD45RA+CD4+ T 세포 대 CCR7+CD45RA+CD8+ T 세포의 비율은 대상체로부터의 생물학적 샘플 내 CCR7+CD45RA+CD4+ T 세포 대 CCR7+CD45RA+CD8+ T 세포의 비율과 비교하여 조정 또는 변경되는 것인 방법.
29. 다음의 단계를 포함하는, 세포 조성물의 제조 방법:
대상체로부터 수득한 생물학적 샘플 또는 그로부터 유래된 하나 이상의 샘플 내 CCR7+CD45RA+CD4+ T 세포 및 CCR7+CD45RA+CD8+ T 세포의 개수, 부피 당 개수, 중량 당 개수 및/또는 백분율을 결정하는 단계; 및
CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포를 포함하는 투입 조성물을 생성하는 단계로서, 여기서 CCR7+CD45RA+CD4+ T 세포 대 나이브-유사 CD8+ T 세포의 비율은 (약) 2.2:1 내지 0.8:1이고, 상기 투입 조성물 내 비율은 대상체로부터의 생물학적 샘플 내 CCR7+CD45RA+CD4+ T 세포 대 나이브-유사 CD8+ T 세포의 비율과 비교하여 조정 또는 변경되는 것인 방법.
30. 구현예 29 중 어느 하나에 있어서, 재조합 수용체를 인코딩하는 핵산을 투입 조성물 내 세포 내로 도입하는 조건하에서, 투입 조성물과, 재조합 수용체를 인코딩하는 핵산 분자를 포함하는 시제와 접촉시키는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
31. 다음의 단계를 포함하는, 세포 조성물의 제조 방법:
대상체로부터 유래한 생물학적 샘플로부터의 CCR7+CD45RA+CD4+ T 세포 및 CCR7+CD45RA+CD8+ T 세포를 포함하는 투입 조성물을, 재조합 수용체를 인코딩하는 핵산을 이러한 조성물 내 세포 내로 도입하는 조건하에서 재조합 수용체를 인코딩하는 핵산 분자를 포함하는 시제와 접촉시키는 단계,
여기서 투입 조성물 내 존재하는 CCR7+CD45RA+CD4+ T 세포 대 CCR7+CD45RA+CD8+ T 세포의 비율은 (약) 0.8:1 내지 2.2:1인 것인 방법.
32. 구현예 31에 있어서, 상기 방법은 상기 접촉 단계 이전, 동안 및/또는 이후에 세포를 자극하는 단계를 추가로 포함하며, 이러한 자극 단계는 하나 이상의 자극 시제의 존재하에 세포의 인큐베이션을 포함하고, 자극 단계는 세포의 활성화 및/또는 증식을 초래하는 것인 방법.
33. 다음의 단계를 포함하는, 세포 조성물의 제조 방법:
CCR7+CD45RA+CD4+ T 세포를 포함하는 제1 세포 조성물과 CCR7+CD45RA+CD8+ T 세포를 포함하는 제2 세포 조성물을 조합하여, 투입 세포 조성물을 제조하는 단계로서, 여기서 CCR7+CD45RA+CD4+ T 세포 대 CCR7+CD45RA+CD8+ T 세포의 비율은 (약) 0.8:1 내지 2.2:1인 방법.
재조합 수용체를 인코딩하는 핵산을 조성물 내 세포 내로 도입하는 조건하에서, 투입 조성물과, 재조합 수용체를 인코딩하는 핵산 분자를 포함하는 시제와 접촉시키는 단계; 및
상기 접촉 단계 이전, 동안 및/또는 이후에 세포를 자극하는 단계로서, 이러한 자극 단계는 하나 이상의 자극 시제의 존재하에 세포의 인큐베이션을 포함하고, 자극 단계는 세포의 활성화 및/또는 증식을 초래하는 단계.
34.
구현예 24-33 중 어느 하나에 있어서, 나이브-유사 CD4+ T 세포의 개수, 부피 당 개수, 중량 당 개수 및/또는 백분율, 및/또는 나이브-유사 CD8+ T 세포의 개수, 부피 당 개수, 중량 당 개수 및/또는 백분율은 유세포 분석에 의해 결정되는 것인 방법.
35. 구현예 31-34 중 어느 하나에 있어서, CCR7+CD45RA+CD4+ T 세포 대 CCR7+CD45RA+CD8+ T 세포의 비율은 대상체로부터의 생물학적 샘플 내 CCR7+CD45RA+CD4+ T 세포 대 CCR7+CD45RA+CD8+ T 세포의 비율과 비교하여 조정되는 것인 방법.
36. 구현예 24-35 중 어느 하나에 있어서, 투입 조성물은 CCR7+CD45RA+CD4+ 세포 대 CCR7+CD45RA+CD8+ 세포의 비율로 (약) 0.8:1 내지 2.0:1, 0.8:1 내지 1.6:1, 0.8:1 내지 1.4:1, 0.8:1 내지 1.2:1, 또는 1.0:1 내지 1.2:1를 포함하는 것인 방법.
37. 구현예 24-36 중 어느 하나에 있어서, 투입 조성물은 CCR7+CD45RA+CD4+ 세포 대 CCR7+CD45RA+CD8+ 세포의 비율로 (약) 1.5:1, 1.4:1, 1.3:1, 1.2:1, 1.1:1, 또는 1.0:1을 포함하는 것인 방법.
38. 구현예 24-37 중 어느 하나에 있어서, 투입 조성물은 CCR7+CD45RA+CD4+ 세포 대 CCR7+CD45RA+CD8+ 세포의 비율로 (약) 1.1:1을 포함하는 것인 방법.
39. 다음의 단계를 포함하는, 세포 조성물의 제조 방법:
CD27+CCR7+CD4+ T 세포를 포함하는 제1 세포 조성물과 CD27+CCR7+CD8+ T 세포를 포함하는 제2 세포 조성물을 조합하여, 투입 세포 조성물을 제조하는 단계로서, 여기서 CD27+CCR7+CD4+ T 세포 대 CD27+CCR7+CD8+ T 세포의 비율은 (약) 1.2:1 내지 2.4:1인 단계.
40. 구현예 39에 있어서, 제1 세포 조성물은 대상체로부터 수득한 생물학적 샘플로부터 CD4+ T 세포를 단리함으로써 제조되고 및/또는 제2 세포 조성물은 대상체로부터 수득한 생물학적 샘플로부터 CD8+ T 세포를 단리함으로써 제조되는 것인 방법.
41. 구현예 39 또는 구현예 40에 있어서, 조합 이전에, 상기 방법은 제1 조성물 내 CD27+CCR7+CD4+ T 세포의 개수, 부피 당 개수, 중량 당 개수 및/또는 백분율, 및/또는 제2 조성물 내 CD27+CCR7+CD8+ T 세포의 개수, 부피 당 개수, 중량 당 개수 및/또는 백분율을 결정하는 단계를 포함하는 것인 방법.
42. 구현예 39-41 중 어느 하나에 있어서, 조합 이전에, 상기 방법은 대상체로부터의 생물학적 샘플 내 CD27+CCR7+CD4+ T 세포의 개수, 부피 당 개수, 중량 당 개수 및/또는 백분율, 및/또는 CD27+CCR7+CD8+ T 세포의 개수, 부피 당 개수, 중량 당 개수 및/또는 백분율을 결정하는 단계를 포함하는 것인 방법.
43. 구현예 39-42 중 어느 하나에 있어서, 투입 조성물 내 CD27+CCR7+CD4+ T 세포 대 CD27+CCR7+CD8+ T 세포의 비율은 대상체로부터의 생물학적 샘플 내 CD27+CCR7+CD4+ T 세포 대 CD27+CCR7+CD8+ T 세포의 비율과 비교하여 조정 또는 변경되는 것인 방법.
44. 다음의 단계를 포함하는, 세포 조성물의 제조 방법:
대상체로부터 수득한 생물학적 샘플 또는 그로부터 유래된 하나 이상의 샘플 내 CD27+CCR7+CD4+ T 세포 및 CD27+CCR7+CD8+ T 세포의 개수, 부피 당 개수, 중량 당 개수 및/또는 백분율을 결정하는 단계; 및
CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포를 포함하는 투입 조성물을 생성하는 단계로서, 여기서 CD27+CCR7+CD4+ T 세포 대 나이브-유사 CD8+ T 세포의 비율은 (약) 2.2:1 내지 0.8:1이고, 상기 투입 조성물 내 비율은 대상체로부터의 생물학적 샘플 내 CD27+CCR7+CD4+ T 세포 대 나이브-유사 CD8+ T 세포의 비율과 비교하여 조정 또는 변경되는 것인 방법.
45. 구현예 39-44 중 어느 하나에 있어서, 재조합 수용체를 인코딩하는 핵산을 투입 조성물 내 세포 내로 도입하는 조건하에서, 투입 조성물과, 재조합 수용체를 인코딩하는 핵산 분자를 포함하는 시제와 접촉시키는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
46. 다음의 단계를 포함하는, 세포 조성물의 제조 방법:
대상체로부터 유래한 생물학적 샘플로부터의 CD27+CCR7+CD4+ T 세포 및 CD27+CCR7+CD8+ T 세포를 포함하는 투입 조성물을, 재조합 수용체를 인코딩하는 핵산을 이러한 조성물 내 세포 내로 도입하는 조건하에서 재조합 수용체를 인코딩하는 핵산 분자를 포함하는 시제와 접촉시키는 단계,
여기서 투입 조성물 내 존재하는 CD27+CCR7+CD4+ T 세포 대 CD27+CCR7+CD8+ T 세포의 비율은 (약) 0.8:1 내지 2.2:1인 것인 방법.
47. 구현예 46 또는 구현예 47에 있어서, 상기 방법은 상기 접촉 단계 이전, 동안 및/또는 이후에 세포를 자극하는 단계를 추가로 포함하며, 이러한 자극 단계는 하나 이상의 자극 시제의 존재하에 세포의 인큐베이션을 포함하고, 자극 단계는 세포의 활성화 및/또는 증식을 초래하는 것인 방법.
48. 다음의 단계를 포함하는, 세포 조성물의 제조 방법:
CD27+CCR7+CD4+ T 세포를 포함하는 제1 세포 조성물과 CD27+CCR7+CD8+ T 세포를 포함하는 제2 세포 조성물을 조합하여, 투입 세포 조성물을 제조하는 단계로서, 여기서 CD27+CCR7+CD4+ T 세포 대 CD27+CCR7+CD8+ T 세포의 비율은 (약) 0.8:1 내지 2.2:1인 단계.
재조합 수용체를 인코딩하는 핵산을 조성물 내 세포 내로 도입하는 조건하에서, 투입 조성물과, 재조합 수용체를 인코딩하는 핵산 분자를 포함하는 시제와 접촉시키는 단계; 및
상기 접촉 단계 이전, 동안 및/또는 이후에 세포를 자극하는 단계로서, 이러한 자극 단계는 하나 이상의 자극 시제의 존재하에 세포의 인큐베이션을 포함하고, 자극 단계는 세포의 활성화 및/또는 증식을 초래하는 단계.
49.
구현예 39-48 중 어느 하나에 있어서, CD27+CCR7+CD4+ T 세포의 개수, 부피 당 개수, 중량 당 개수 및/또는 백분율, 및/또는 CD27+CCR7+CD8+ T 세포의 개수, 부피 당 개수, 중량 당 개수 및/또는 백분율은 유세포 분석에 의해 결정되는 것인 방법.
50. 구현예 39-49 중 어느 하나에 있어서, CD27+CCR7+CD4+ T 세포 대 CD27+CCR7+CD8+ T 세포의 비율은 대상체로부터의 생물학적 샘플 내 CD27+CCR7+CD4+ T 세포 대 CD27+CCR7+CD8+ T 세포의 비율과 비교하여 조정되는 것인 방법.
51. 구현예 39-50 중 어느 하나에 있어서, 투입 조성물은 CD27+CCR7+CD4+ 세포 대 CD27+CCR7+CD8+ 세포의 비율로 (약) 0.8:1 내지 2.0:1, 0.8:1 내지 1.6:1, 0.8:1 내지 1.4:1, 0.8:1 내지 1.2:1, 또는 1.0:1 내지 1.2:1을 포함하는 것인 방법.
52. 구현예 39-51 중 어느 하나에 있어서, 투입 조성물은 CD27+CCR7+CD4+ 세포 대 CD27+CCR7+CD8+ 세포의 비율로 (약) 1.5:1, 1.4:1, 1.3:1, 1.2:1, 1.1:1, 또는 1.0:1을 포함하는 것인 방법.
53. 구현예 39-52 중 어느 하나에 있어서, 투입 조성물은 CD27+CCR7+CD4+ 세포 대 CD27+CCR7+CD8+ 세포의 비율로 (약) 1.1:1을 포함하는 것인 방법.
54. 다음의 단계를 포함하는, 세포 조성물의 제조 방법:
CD62L-CCR7+CD4+ T 세포를 포함하는 제1 세포 조성물과 CD62L-CCR7+CD8+ T 세포를 포함하는 제2 세포 조성물을 조합하여, 투입 세포 조성물을 제조하는 단계로서, 여기서 CD62L-CCR7+CD4+ T 세포 대 CD62L-CCR7+CD8+ T 세포의 비율은 (약) 0.5:1 내지 2:1인 단계.
55. 다음의 단계를 포함하는, 세포 조성물의 제조 방법:
대상체로부터 수득한 생물학적 샘플 또는 그로부터 유래된 하나 이상의 샘플 내 CD62L-CCR7+CD4+ T 세포 및 CD62L-CCR7+CD8+ T 세포의 개수, 부피 당 개수, 중량 당 개수 및/또는 백분율을 결정하는 단계; 및
CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포를 포함하는 투입 조성물을 생성하는 단계로서, 여기서 CD62L-CCR7+CD4+ T 세포 대 나이브-유사 CD8+ T 세포의 비율은 (약) 0.5:1 내지 2:1이고, 상기 투입 조성물 내 비율은 대상체로부터의 생물학적 샘플 내 CD62L-CCR7+CD4+ T 세포 대 나이브-유사 CD8+ T 세포의 비율과 비교하여 조정 또는 변경되는 것인 방법.
56. 구현예 54 또는 55에 있어서, 재조합 수용체를 인코딩하는 핵산을 투입 조성물 내 세포 내로 도입하는 조건하에서, 투입 조성물과, 재조합 수용체를 인코딩하는 핵산 분자를 포함하는 시제와 접촉시키는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
57. 다음의 단계를 포함하는, 세포 조성물의 제조 방법:
CD62L-CCR7+CD4+ T 세포를 포함하는 제1 세포 조성물과 CD62L-CCR7+CD8+ T 세포를 포함하는 제2 세포 조성물을 조합하여, 투입 세포 조성물을 제조하는 단계로서, 여기서 CD62L-CCR7+CD4+ T 세포 대 CD62L-CCR7+CD8+ T 세포의 비율은 (약) 0.5:1 내지 2:1인 단계.
재조합 수용체를 인코딩하는 핵산을 조성물 내 세포 내로 도입하는 조건하에서, 투입 조성물과, 재조합 수용체를 인코딩하는 핵산 분자를 포함하는 시제와 접촉시키는 단계; 및
상기 접촉 단계 이전, 동안 및/또는 이후에 세포를 자극하는 단계로서, 이러한 자극 단계는 하나 이상의 자극 시제의 존재하에 세포의 인큐베이션을 포함하고, 자극 단계는 세포의 활성화 및/또는 증식을 초래하는 단계.
58.
구현예 56 또는 57에 있어서, CD62L-CCR7+CD4+ T 세포의 개수, 부피 당 개수, 중량 당 개수 및/또는 백분율, 및/또는 CD62L-CCR7+CD8+ T 세포의 개수, 부피 당 개수, 중량 당 개수 및/또는 백분율은 유세포 분석에 의해 결정되는 것인 방법.
59. 구현예 55-58 중 어느 하나에 있어서, CD62L-CCR7+CD4+ T 세포 대 CD62L-CCR7+CD8+ T 세포의 비율은 대상체로부터의 생물학적 샘플 내 CD62L-CCR7+CD4+ T 세포 대 CD62L-CCR7+CD8+ T 세포의 비율과 비교하여 조정되는 것인 방법.
60. 구현예 55-59 중 어느 하나에 있어서, 투입 조성물은 CD62L-CCR7+CD4+ 세포 대 CD62L-CCR7+CD8+ 세포의 비율로 (약) 0.5:1 내지 1.5:1, 1:1 내지 2:1, 0.75:1 내지 1.5:1, 또는 0.8:1 내지 1.2:1을 포함하는 것인 방법.
61. 구현예 55-60 중 어느 하나에 있어서, 투입 조성물은 CD62L-CCR7+CD4+ 세포 대 CD62L-CCR7+CD8+ 세포의 비율로 (약) 1.2:1, 1.1:1, 1.0:1, 0.9:1, 또는 0.8:1을 포함하는 것인 방법.
62. 구현예 2-9, 18-23, 25-32, 34-38, 40-47, 50-53, 55-56, 또는 59-61 중 어느 하나에 있어서, 생물학적 샘플은 혈액, 혈장 또는 혈청 샘플이거나, 또는 이로부터 수득되는 것인 방법.
63.
구현예 2-9, 18-23, 25-32, 34-38, 40-47, 50-53, 55-56, 또는 59-62 중 어느 하나에 있어서, 생물학적 샘플은 전혈 샘플, 버피 코트 샘플, 말초 혈액 단핵구 세포 (PBMC) 샘플, 분별되지 않은 T 세포 샘플, 림프구 샘플, 백혈구 샘플, 성분채집 생성물, 또는 백혈구성분채집 생성물이거나, 또는 이를 포함하는 것인 방법.
64. 구현예 2-9, 18-23, 25-32, 34-38, 40-47, 50-53, 55-56, 또는 59-63 중 어느 하나에 있어서, 생물학적 샘플은 성분채집술 또는 백혈구성분채집술 샘플이거나, 또는 이로부터 수득되는 것인 방법.
65. 구현예 2-9, 18-23, 25-32, 34-38, 40-47, 50-53, 55-56, 또는 59-64 중 어느 하나에 있어서, 대상체는 인간 대상체인 것인 방법.
66. 구현예 1-65 중 어느 하나에 있어서, 투입 조성물은 (약) 1 x 107 내지 5 x 109 개의 전체 세포 또는 전체 T 세포, (약) 5 x 107 내지 1 x 109 개의 전체 세포 또는 전체 T 세포, (약) 1 x 108 내지 5 x 108 개의 전체 세포 또는 전체 T 세포, 또는 (약) 2 x 108 내지 5 x 108 개의 전체 세포 또는 전체 T 세포, 또는 전술한 임의의 범위의 생존 집단을 포함하는 것인 방법.
67. 구현예 1-66 중 어느 하나에 있어서, 투입 조성물은 적어도 (약) 1 x 108, 2 x 108, 3 x 108, 4 x 108, 또는 5 x 108 개의 전체 세포 또는 전체 T 세포 또는 전술한 임의의 범위의 생존 집단을 포함하는 것인 방법.
68. 구현예 9-23, 32-38, 47-53, 57-67 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 자극 시제는 T 세포, CD4+ T 세포 및/또는 CD8+ T 세포를 활성화시킬 수 있고; TCR 복합체를 통해 신호를 유도할 수 있고; 및/또는 세포, CD4+ T 세포 및/또는 CD8+ T 세포의 증식을 유도할 수 있는 것인 방법.
69. 구현예 9-23, 32-38, 47-53, 57-68 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 자극 시제는 TCR 복합체의 구성원에 결합하는, 선택적으로 CD3에 특이적으로 결합하는 1차 시제를 포함하는 것인 방ㅂ버.
70. 구현예 69에 있어서, 하나 이상의 자극 시제는 T 세포 공동자극 분자에 특이적으로 결합하는 2차 시제를 추가로 포함하는 것인 방법.
71. 구현예 70에 있어서, 공동자극 분자는 CD28, CD137 (4-1-BB), OX40, 또는 ICOS로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
72. 구현예 70 또는 구현예 71에 있어서, 1차 및 2차 시제로는 항체를 포함하며, 선택적으로 하나 이상의 자극제는 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체와의 인큐베이션을 포함하는 것인 방법.
73. 구현예 9-23, 32-38, 47-53, 57-72 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 자극 시제는 고체 지지체, 선택적으로 비드의 표면상에 존재하는 것인 방법.
74. 구현예 9-23, 32-38, 47-53, 57-73 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 자극 시제는 CD3-결합 분자; CD28-결합 분자; 재조합 IL-2; 재조합 IL-15; 및 재조합 IL-7, 항원 수용체에 의해 특이적으로 인식되는 항원을 포함하는 백신, 및 항원 수용체 또는 이의 조합에 특이적으로 결합하는 항-이디오타입 항체로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
75. 구현예 9-23, 32-38, 47-53, 57-74 중 어느 하나에 있어서, 인큐베이션은 2 내지 15 일, 2 내지 12 일, 2 내지 12 일, 2 내지 8 일, 2 내지 6 일, 2 내지 4 일, 4 내지 12 일, 4 내지 10 일, 4 내지 8 일, 4 내지 6 일, 6 내지 12 일, 6 내지 10 일, 6 내지 8 일, 8 내지 12 일, 8 내지 10 일, 또는 10 내지 12 일 동안 수행되는 것인 방법.
76. 구현예 9-23, 32-38, 47-53, 57-75 중 어느 하나에 있어서, 인큐베이션은 적어도 (약) 4 일, 6 일, 8 일, 10 일 또는 12 일 동안 수행되는 것인 방법.
77. 구현예 7-23, 30-39, 45-53, 또는 57-76 중 어느 하나에 있어서, 핵산 분자를 포함하는 시제는 바이러스 벡터이거나, 또는 트랜스포존인 것인 방법.
78. 구현예 77에 있어서, 시제는 핵산 분자를 포함하는 시제는 바이러스 벡터이고 이러한 바이러스 벡터는 레트로바이러스 벡터인 것인 방법.
79. 구현예 78에 있어서, 바이러스 벡터는 렌티바이러스 벡터 또는 감마레트로바이러스 벡터인 것인 방법.
80.
구현예 7-23, 30-38, 45-53, 또는 56-79 중 어느 하나에 있어서, 재조합 수용체는 질병, 장애 또는 병태의 세포 또는 조직과 관련된, 이에 특이적인, 및/또는 이에 발현되는 표적 항원에 결합할 수 있는 것인 방법.
81. 구현예 80에 있어서, 질병, 장애 또는 병태는 감염성 질병 또는 장애, 자가면역 질병, 염증성 질병, 또는 종양 또는 암인 것인 방법.
82. 구현예 80 또는 구현예 81에 있어서, 표적 항원은 종양 항원인 것인 방법.
83. 구현예 80-82 중 어느 하나에 있어서, 표적 항원은 다음으로부터 선택되는 것인 방법: 수용체 타이로신 키네이스 유사 고아 수용체 1 (ROR1), B 세포 성숙화 항원 (BCMA), 탄산 무수화효소 9 (CA9, 또한 CAIX 또는 G250로도 알려짐), Her2/neu (수용체 타이로신 키네이스 erbB2), CD19, CD20, CD22, 메소텔린 (MSLN), 암배아 항원 (CEA), 및 B형 간염 표면 항원, 항-엽산 수용체, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44, 콘드로이틴 설페이트 프로테오글리칸 4 (CSPG4), EGFR, 상피 당단백 2 (EPG-2), 상피 당단백 40 (EPG-40), 에프린 수용체 A2 (EPHa2), Her3 (erb-B3), Her4 (erb-B4), erbB 이합체, III형 표피 성장 인자 수용체 돌연변이 (EGFR vIII), 엽산 결합 단백질 (FBP), Fc 수용체 유사 5 (FCRL5, 또한 Fc 수용체 동족체 5 또는 FCRH5로도 알려짐), 태아 아세틸콜린 수용체(태아 AchR), 강글리오사이드 GD2, 강글리오사이드 GD3, 인간 백혈구 항원 A1 (HLA-A1), 인간 백혈구 항원 A2 (HLA-A2), IL-22 수용체 알파 (IL-22Rα), 키네이스 삽입 도메인 수용체 (kdr), 카파 경쇄, 류신 풍부 반복 함유 8 패밀리 구성원 A (LRRC8A), Lewis Y, L1-세포 점착 분자 (L1-CAM), 흑색종-연관 항원 (MAGE)-A1, MAGE-A3, MAGE-A6, MAGE-A10, 우선적으로 발현되는 흑색종 항원 (PRAME), 서바이빈, 종양-연관 당단백 72 (TAG72), B7-H3, B7-H6, IL-13 수용체 알파 2 (IL-13Rα2), 인간 고분자량-흑색종-연관 항원 (HMW-MAA), CD171, 엽산 수용체-알파, CD44v7/8, αvβ6 인테그린 (avb6 인테그린), 8H9, 신경 세포 점착 분자 (NCAM), 혈관 내피 성장 인자 수용체 (VEGF 수용체 또는 VEGFR), 영양막 당단백 (TPBG 또한 5T4로도 알려짐), NKG2D 리간드, CD44v6, 이중 항원, 암-고환 항원, 쥐과 거대세포바이러스 (CMV), 뮤신 1 (MUC1), MUC16, 전립선 줄기 세포 항원 (PSCA), 전립선 특이적 멤브레인 항원 (PSMA), 자연 살해 그룹 2 구성원 D (NKG2D) 리간드, 암/고환 항원 1B (CTAG, 또한 NY-ESO-1 및 LAGE-2으로도 알려짐), 멜란 A (MART-1), 당단백 100 (gp100), 글리피칸-3 (GPC3), G 단백질 연결 수용체 5D (GPRC5D), 종양태아성 항원, TAG72, 타이로시나제 관련 단백질 1 (TRP1, 또한 TYRP1 또는 gp75로도 알려짐), 타이로시나제 관련 단백질 2 (TRP2, 또한 도파크롬 토토머라제, 도파크롬 델타-아이소머라제 또는 DCT로도 알려짐), 혈관 내피 성장 인자 수용체 2 (VEGF-R2), 암배아 항원 (CEA), 에스트로겐 수용체, 프로게스테론 수용체, 전립선 특이적 항원, 에프린B2, CD123, CD133, c-Met, O-아세틸화된 GD2 (OGD2), L1-CAM의 CE7 에피토프, Wilms 종양 1 (WT-1), 사이클린, 사이클린 A2, C-C 모티프 케모카인 리간드 1 (CCL-1), CD138, 병원체-특이적 항원 또는 병원체-발현 항원, 및 보편적인 표지와 관련된 항원, 및/또는 비오틴화된 분자, 및/또는 HIV, HCV, HBV 또는 다른 병원체에 의해 발현되는 분자.
84. 구현예 7-23, 30-38, 45-53, 또는 56-83 중 어느 하나에 있어서, 재조합 수용체는 기능적 비-TCR 항원 수용체 또는 TCR 또는 이의 항원-결합 단편이거나, 또는 이를 포함하는 것인 방법.
85. 구현예 7-23, 30-38, 45-53, 또는 56-83 중 어느 하나에 있어서, 재조합 수용체는 키메라 항원 수용체 (CAR)인 것인 방법.
86. 구현예 85에 있어서, 키메라 항원 수용체는 항원-결합 도메인을 포함하는 세포 외 도메인을 포함하는 것인 방법.
87. 구현예 86에 있어서, 항원-결합 도메인은 항체 또는 이의 항체 단편이거나, 또는 이를 포함하며, 선택적으로 단일 사슬 단편인 것인 방법.
88. 구현예 87에 있어서, 단편은 유연한 링커에 의해 연결된 항체 가변 영역을 포함하는 것인 방법.
89. 구현예 87 또는 구현예 88에 있어서, 단편은 scFv를 포함하는 것인 방법.
90. 구현예 86-89 중 어느 하나에 있어서, 키메라 항원 수용체는 스페이서 및/또는 힌지 영역을 추가로 포함하는 것인 방법.
91. 구현예 86-90 중 어느 하나에 있어서, 키메라 항원 수용체는 세포 내 신호전달 영역을 포함하는 것인 방법.
92. 구현예 91에 있어서, 세포 내 신호전달 영역은 세포 내 신호전달 도메인을 포함하는 것인 방법.
93. 구현예 91에 있어서, 세포 내 신호전달 영역은 1차 신호전달 도메인, T 세포에서 1차 활성화 신호를 유도할 수 있는 신호전달 도메인, T 세포 수용체 (TCR) 요소의 신호전달 도메인 및/또는 면역수용체 타이로신-계 활성화 모티프 (ITAM)를 포함하는 신호전달 도메인이거나, 또는 이를 포함하는 것인 방법.
94. 구현예 93에 있어서, 세포 내 신호전달 도메인은 CD3 사슬, 선택적으로 CD3-제타 (CD3ζ) 사슬의 세포 내 신호전달 도메인, 또는 이의 신호전달 부분이거나, 또는 이를 포함하는 것인 방법.
95. 구현예 91-94 중 어느 하나에 있어서, 키메라 항원 수용체는 세포 외 도메인과 세포 내 신호전달 영역 사이에 배치된 막횡단 도메인을 추가로 포함하는 것인 방법.
96. 구현예 91-95 중 어느 하나에 있어서, 세포 내 신호전달 영역은 공동자극 신호전달 영역을 추가로 포함하는 것인 방법.
97. 구현예 96에 있어서, 공동자극 신호전달 영역은 T 세포 공동자극 분자의 세포 내 신호전달 도메인 또는 이의 신호전달 부분을 포함하는 것인 방법.
98. 구현예 96 또는 구현예 97에 있어서, 공동자극 신호전달 영역은 CD28, 4-1BB 또는 ICOS의 세포 내 신호전달 도메인 또는 이의 신호전달 부분을 포함하는 것인 방법.
99. 구현예 96-98 중 어느 하나에 있어서, 공동자극 신호전달 영역은 막횡단 도메인과 세포 내 신호전달 영역 사이에 있는 것인 방법.
100. 구현예 2-9, 11-23, 25-32, 34-38, 40-47, 50-53, 55-56, 또는 59-99 중 어느 하나에 있어서, 대상체는 질병 또는 병태를 가지며, 선택적으로 재조합 수용체는 질병 또는 병태의 세포와 연관된, 또는 발현된, 또는 세포 상에 존재하는 항원을 특이적으로 인식하거나, 또는 특이적으로 이에 결합하는 것인 방법.
101. 구현예 1-100 중 어느 하나에 있어서, 재조합 수용체-발현 CD4+ T 세포 대 재조합 수용체-발현 CD8+ T 세포의 비율, 선택적으로 이의 생존 세포의 비율이, 상기 방법에 의해 제조된 복수의 T 세포 조성물 내 상기 비율의 평균으로부터 20% 미만 또는 10% 미만 또는 5% 미만으로 변하고 및/또는 이러한 평균으로부터 하나의 표준 편차 이하만큼 변하는 산출 조성물을 제조하는 것인 방법.
102. 구현예 1-101 중 어느 하나에 있어서, 상기 방법은 재조합 수용체-발현 CD4+ T 세포 대 재조합 수용체-발현 CD8+ T 세포의 비율, 선택적으로 이의 생존 세포의 비율이, (약) 0.5:1 내지 2:1 또는 0.8:1 내지 1.6:1 또는 1:1 내지 1.5:1인 산출 조성물을 제조하는 것인 방법.
103. 구현예 101 또는 구현예 102 중 어느 하나에 있어서, 산출 조성물 내 재조합 수용체-발현 CD4+ T 세포 대 재조합 수용체-발현 CD8+ T 세포의 비율, 선택적으로 이의 생존 세포의 비율은 (약) 1.2:1, 1.1:1, 1:1, 0.9:1, 또는 0.8:1인 것인 방법.
104. 구현예 101-103 중 어느 하나에 있어서, 산출 조성물 내 재조합 수용체-발현 CD4+ T 세포 대 재조합 수용체-발현 CD8+ T 세포의 비율, 선택적으로 이의 생존 세포의 비율은 (약) 1:1인 것인 방법.
105. 구현예 66-104 중 어느 하나에 있어서, 생존 세포는 세포사멸 마커 음성 (-)인 세포를 포함하며, 선택적으로 이러한 세포사멸 마커는 아넥신 V 또는 활성 카스파제 3인 것인 방법.
106. 구현예 1-105 중 어느 하나에 있어서, 상기 방법은 시험관 내 또는 생체 외에서 수행되는 것인 방법.
107. 구현예 104 중 어느 하나에 따라 제조된 산출 조성물.
108. 구현예 107의 산출 조성물을 포함하는 것인 약제학적 조성물.
109. 구현예 108에 있어서, 약제학적 담체를 추가로 포함하는 것인 약제학적 조성물.
110. 치료 방법으로서, 포유동물 대상체에게, 구현예 105에 의해 제조된 산출 조성물 또는 구현예 108 또는 구현예 109의 약제학적 조성물을 투여하는 것을 포함하는 치료 방법.
111. 구현예 110에 있어서, 세포는 세포가 투여되는 대상체로부터 유래하는 것인 방법.
VII. 실시예
다음의 실시예는 오직 설명의 목적으로 제공되는 것이며 본 발명의 범위를 제한하고자 하는 것이 아니다.
실시예 1 : 출발 조성물의 표현형과 CAR+ T 세포 조성물 내 CD4+ 대 CD8+ CAR 발현 세포의 비율의 상관관계
키메라 항원 수용체 (CAR)를 발현하는 자가 T 세포를 함유하는 CAR+ T 세포 조성물을 11개의 개별 공여자로부터 수집된 성분채집술로부터 생성하고 4개의 테스트 샘플을 각 공여자 샘플로부터 개별적으로 처리하였다. 하나의 공여자는 골수종 환자이며 나머지 공여자는 건강한 대상체였다. 각 성분채집술 샘플을 세척한 후, 각 샘플을 유세포 분석에 의해 세포사멸 마커를 사용하여 세포 생존력 및 CD4 및 CD8의 표면 발현에 대해 평가하여, 각 성분채집술 샘플 실행에서 생존 CD4+ 대 CD8+ T 세포의 비율(CD4/CD8 비율)을 결정하였다.
CD4+ 및 CD8+ T 세포는 면역친화성-기반의 선별에 의해 성분채집술 샘플로부터 선별하였다. CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포는 생존 CD4+ 대 CD8+ 세포의 1:1 비율로 조합되었다. 조합된 세포의 샘플을 유세포 분석에 의해 세포사멸 특이적 마커를 사용하여 세포 생존력에 대해 및 CD4, CD8, CD45RA 및 CCR7이 포함된 마커의 표면 발현에 대해 평가하였다. 선별된 CD4 및 CD8 세포의 혼합물 내 생존 CD45RA+/CCR7+CD4+ 대 생존 CD45RA+/CCR7+CD8+의 비율 (CD45RA+/CCR7+ CD4/CD8 비율)을 결정하였다.
CAR+ T 세포 조성물을 생성하기 위해, 조합된 CD4+ 및 CD8+ T 세포를 사이토카인의 존재하에 항-CD3 및 항-CD28 항체-코팅된 비드와 함께 인큐베이션하여 활성화하고, 항-BCMA CAR를 인코딩하는 렌티바이러스 벡터로 형질도입하였다. CAR는 BCMA에 대해 특이적인 scFv 항원-결합 도메인, 스페이서, CD28 막횡단 영역, 4-1BB 공동자극 신호전달 영역, 및 세포 내 신호전달 도메인으로부터 유래된 CD3-제타를 포함하였다. 형질도입 이후, 세포를 팽창시킨 뒤 동결보존에 의해 동결시켰다. 동결된 조성물을 해동시키고 BCMA-Fc 시약을 사용하여 유세포 분석에 의해 생존력, CD4 및 CD8의 표면 발현, 및 CAR 발현을 평가하였다. CD4+인 생존 CAR+ 세포 대 CD8+인 생존 CAR+ 세포의 비율 (CAR+ CD4/CD8 비율)을 결정하였다.
성분채집술 샘플 내 CD4/CD8 비율, 또는 선별된 CD4 및 CD8 세포의 혼합물 내 CD45RA+/CCR7+ CD4/CD8 비율을, 사후, 조작된 CAR-T 세포 조성물 내 CAR+ CD4/CD8 비율에 대하여 비교하였다. 각 대상체로부터의 평균 비율의 상관관계 정도를 이변량 분석에 의해 평가하였고, 플로팅된 데이터에 대한 0.990 확률 영역을 난타내는 이변량 정규 타원이 각각 도 1A 및 1B에 도시된다. 표 1A 및 표 1B는 각각 도 1A 및 도 1B에 플로팅된 데이터에 대해 수행한 피어슨 상관 분석의 결과를 나타낸다.
도 1A 및 표 1A에 도시된 바와 같이, 상기 실험에서 성분채집술 샘플로부터의 CD4+ 및 CD8+ T 세포 중 생존 CD4/CD8 비율은 최종 조성물 내 CAR+ CD4/CD8 비율과 상관관계를 가지지 않았다. 이러한 결과는, 전체 생존 세포 기준으로 활성화 전의 정제된 CD4 및 CD8 T 세포를 1:1 비율로 혼합해도 산출 T 세포 조성물 내 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 1:1 비율과 반드시 상관관계를 가지지 않는다는 관찰과 일치한다.
도 1B 및 표 1B에 도시된 바와 같이, 상기 실험에서, 최종 T 세포 조성물 내 CAR+ CD4/CD8 비율은, CD4 및 CD8 세포의 혼합물 내 CD45RA+/CCR7+ CD4/CD8 비율에 의해 결정된 바와 같이, 출발 나이브-유사 세포 CD4/CD8 T 세포 비율과 양의 상관관계를 가진다. 특히, 도 1B의 결과는 피어슨 상관관계 계수 및 p 값 <0.0001에 기초하여 출발 샘플 내 CD45RA+/CCR7+/CD4+ 세포 대 CD45RA+/CCR7+/CD8+ 세포의 비율과 T 세포 조성물 내 CAR+ CD4/CD8 비율의 상관관계가 높음을 도시한다. 이러한 상관관계는 투입 조성물 및 공정 실행간의 차이에도 불구하고 유지되었다. 이러한 예시적인 샘플 설정로부터 상기 모델 핏에 기초하여, 약 1.1:1의 CD45RA+/CCR7+/CD4+ 대 CD45RA+/CCR7+/CD8+ 비율이 산출 T 세포 조성물에서 약 1:1의 CAR+ CD4/CD8 비율을 야기하는 것으로 결정되었다.
이러한 데이터는, CD45RA+ 및 CCR7+ 표면 발현에 의해 결정된 것과 같은 나이브-유사 CD4+ 서브세트 대 나이브-유사 CD8+ T 세포 대상체의 비율을 제어함으로써, 산출 T 세포 조성물 내 CD4+ 세포 및 CD8+ 세포의 비율 및/또는 조성물을 제어 및/또는 조정할 수 있다는 가설을 뒷받침한다.
실시예 2 : 출발 T 세포 집단의 표현형과 조작된 CAR+ T 세포 조성물 내 CAR+CD4+ 대 CAR+CD8+ T 세포의 비율의 상관관계
15명의 건강한 공여자 및 한 명의 1 명의 다발성 골수종 환자로부터 유래한 성분채집술 샘플로부터 전체 50개의 조작된 CAR+ T 세포 조성물을 생성하였다. CAR-T 조성물을 생성하기 위해, 생존 선별된 CD4+ 및 CD8+ T 세포를 1:1 비율로 출발 세포 조성물로 조합한 뒤, 실시예 1에 기재된 바와 같이 활성화, 형질도입, 및 팽창하였다. 조합된 생존 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 출발 조성물로부터의 샘플을 유세포 분석에 의해 생존력에 대해 및 CD4, CD8, CD27, CD45RA, CCR7, 및 CD62L이 포함된 마커의 표면 발현에 대해 평가하였다.
조작된 CAR+ T 세포 조성물의 샘플을 CAR 발현에 대해 및 CD4 및 CD8이 포함된 마커의 표면 발현에 대해 평가하였다. 동일한 공여자의 개별적인 CAR+ T 세포 조성물의 CD4+CAR+ T 세포 대 CD8+CAR+T 세포의 비율 (CAR+ CD4/CD8 비율)에 대해 계산된 평균이 실시예 1에 기재된 동일하지만, 특정한 공정 파라미터가 달라진 예시적인 공정을 사용하여 생성하였다. 평균 CAR+ CD4/CD8 비율을 조합된 생존 CD4+ 대 CD8+ 세포의 출발 조성물의 다양한 표현형과의 상관관계에 대해 분석하였다. 활성화 전에 선별된 CD4+ 및 CD8+ T-세포를 1:1 비율로 조합하는 것은 생성된 산출 세포 조성물 내 1:1의 CAR+ CD4/CD8 비율과 반드시 상관관계를 가지지않았다.
평균 CAR+ CD4/CD8 비율과 각 공여자로부터의 표현형의 상관관계의 정도를 이변량 분석에 의해 평가하였다. 0.950 확률을 나타내는 이변량 정규 타원이 다음이 비율에 대새 도시된다: CD45RA+/CCR7+/CD4+ T 세포 대 CD45RA+/CCR7+/CD8+에 대한 비율 (CD45RA+/CCR7+ CD4/CD8 비율; 도 2A); CD62L-/CCR7+/CD4+ 대 CD62L-/CCR7+/CD8+에 대한 비율 (CD62L-/CCR7+ CD4/CD8 비율; 도 2B); 및 CD27+/CCR7+/CD4+ 대 CD27+/CCR7+/CD8+ 비율 (CD27+/CCR7+ CD4/CD8 비율; 도 2C). 표 2는 도 2A-2C에 플로팅된 데이터에 대해 수행한 피어슨 상관 분석의 결과를 나타낸다.
상기 분석은, 실시예 1에 기재된 예시적인 프로토콜을 사용하여, CAR+ CD4/CD8 비율은 건강한 공여자에 대한 CD45RA+ /CCR7+ CD4/CD8 T-세포 비율과는 양의 상관관계가 있지만, 상기 실험에서, 1명의 환자 샘플에 대해서는 상관관계를 가지지 않음을 나타낸다. CAR+ CD4/CD8 비율은 건강한 공여자 및 환자 샘플 출발 세포 조성물 둘 모두에서 CD62L-/CCR7+ CD4/CD8 및 CD27+/CCR7+ CD4/CD8 비율과 양의 상관관계를 가지는 것으로 나타났다. 모델 핏에 기초하여, 계산 결과 1.69:1의 출발 CD27+/CCR7+ CD4/CD8 비율이 대략 1:1의 CAR+ CD4/CD8 비율을 가지는 산출 세포 조성물을 생성할 것으로 예측되었다. 이러한 결과는 조작된 세포 조성물의 생성된 CAR+ CD4/CD8 비율을 제어 및/또는 예측하기 위해 출발 세포 조성물에서 CD27+CCR7+ CD4/CD8 비율이 조정될 수 있다는 결과와 일치한다.
실시예 3 : 출발 조성물의 표현형에 기초한 CAR+ T 세포 조성물의 제조 공정
2명의 건강한 공여자 및 1 명의 다발성 골수종 환자를 포함하여, 3명의 개별 공여자로부터 수집된 성분채집술로 CAR을 발현하는 자가 T 세포를 함유하는 10 개의 CAR+ T 세포 조성물을 생성하였다. CD4+ 및 CD8+ T 세포는 실시예 1에 기재된 바와 같이 성분채집술 샘플로부터 선별하였다. 성분채집술 샘플 및 선별된 CD4+ 및 CD8+ T 세포를 유세포 분석에 의해 생존력, 및 CD27, CCR7, CD4, 및 CD8을 포함하는 표면 마커에 대하여 평가하였다. 선별된 CD4+ 및 CD8+ T 세포 가운데 CD27+/CCR7+ 세포의 빈도를 결정하였고, 각 공여자는 성분채집술 샘플 내 CD27+/CCR7+ CD4+ 세포 대 CD27+/CCR7+ CD8+ 세포의 상이한 비율을 나타냈다. 예를 들어, 환자 샘플은 CD27+/CCR7+ CD4+ 세포 대 CD27+/CCR7+ CD8+ 세포의 비율로 대략 12.2:1을 나타낸 반면, 2 명이 건강한 공여자 샘플은 CD27+/CCR7+ CD4+ 세포 대 CD27+/CCR7+ CD8+ 세포의 비율이 3.56:1 내지 2.15:1을 나타냈다. (1) 선별된 CD4+ 및 CD8+ 세포를 1:1 생존 CD4+ 대 CD8+ 비율 (생존 CD4/CD8)로 조합하거나 또는 (2) CD4+ 및 CD8+ 세포를 활성화 전에 CD27+/CCR7+CD4+ 세포 및 CD27+/CCR7+ CD8+ 세포 (CD27+/CCR7+ CD4/CD8)의 1.69:1 비율로 조합함으로써 투입 세포 조성물을 생성하였다. 투입 조성물로부터 총 300 x 106 세포 또는 100 x 106 세포를 실질적으로 실시예 1에 기재된 바와 같이 활성화, 형질도입, 및 팽창하여 산출 세포 조성물을 생성하였다.
활성화 단계에서 전체 세포 개수는 CAR+ CD4/CD8 비율에영향을 미치지 않는 것으로 관찰되었다. 환자 샘플을 비롯하여, 약 1.69:1 비율로 혼합된 CD27+/CCR7+ CD4/CD8 세포를 함유하는 출발 조성물로부터 생성된 산출 세포 조성물은, 원하는 표적 비율인 1:1에 근접한 CAR+CD4/CD8 비율 (예를 들어, 대략 1.86:1 내지 1:1.86)을 나타냈다. 1:1 비율로 혼합된 생존 CD4/CD8 세포를 함유하는 투입 조성물로부터 생성된 산출 세포 조성물은, CD4+ 및 CD8+ 세포를 CD27+/CCR7+ CD4+ 세포 및 CD27+/CCR7+ CD8+ 세포의 1.69:1 비율로 함유하는 투입 조성물로부터 생성된 조성물과 비교하여, CAR+ CD4/CAR+ CD8 비율에서 더 큰 차이를 나타냈다. 상기 실험에서, 예시적인 공정에서 환자 재료를 사용하여 생성된 산출 조성물은 각각 100x106 개의 세포 또는 300x106 개의 세포가 활성화될 때, 대략 7.6 및 8.6의 CAR+ CD4/CAR+ CD8 비율을 나타냈다. 유사한 공정에서 표현형에 기초하여 혼합될 때, 예를 들어 CD27+CCR7+ CD4+: CD27+CCR7+ CD8+ T 세포가 1.69:1의 비율로 혼합된 경우, 최종 CAR+ CD4/CAR+ CD8 비율은 각각100x106 개의 세포 또는 300x106 세포가 활성화 될 때 각각 1.6 및 1.3이었다. 이러한 결과는 특정 표현형, 예를 들어, CD27+/CCR7+ 세포가 건강한 공여자 및 환자 샘플 둘 모두로부터 생성된 산출 조성물 내 생성된 CAR+ CD4/CAR+ CD8 비율과 상관관계를 가질 수 있는 발견과 일치한다.
실시예 4 : 출발 조성물의 표현형과 CAR+ T 세포 조성물 내 CD4+ 대 CD8+ CAR 발현 세포의 비율의 상관관계에 대한 질병을 가지는 대상체로부터 샘플의 평가
키메라 항원 수용체 (CAR)를 발현하는 자가 T 세포를 함유하는 CAR+ T 세포 조성물을 다발성 골수종을 가지는 7개의 개별 공여자로부터 수집된 성분채집술로부터 생성하였다.
CD4+ 및 CD8+ T 세포는 면역친화성-기반의 선별에 의해 성분채집술 샘플로부터 선별하였다. CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포는 생존 CD4+ 대 CD8+ 세포의 1:1 비율로 조합되었다. 조합된 세포의 샘플을 CD4, CD8, CD27, CD45RA, CCR7 및 CD62L이 포함된 마커의 표면 발현에 대하여 평가하였다. 선별된 CD4 및 CD8 세포의 혼합물에서, 다음의 세포 표현형의 비율을 결정하였다: (1) CD27+/CCR7+ CD4+ 세포 대 CD27+/CCR7+ CD8+ 세포의 비율 (CD27+/CCR7+ CD4/CD8 비율), (2) CD45RA+/CCR7+ CD4+ 세포 대 CD45RA+/CCR7+ CD8+ 세포의 비율 (CD45RA+/CCR7+ CD4/CD8 비율), 및 (3) CD62L-/CCR7+ CD4+ 세포 대 CD62L-/CCR7+ CD8+ 세포의 비율 (CD62L-/CCR7+ CD4/CD8 비율).
항-BCMA CAR을 발현하는 CAR+ T 세포 조성물을 생성된 세포의 활성화, 형질도입, 팽창 및 동결보존을 포함하는, 실질적으로 실시예 1에 기재된 공정을 사용하여 생성하였다. 동결된 조성물을 해동시키고 BCMA-Fc 시약을 사용하여 유세포 분석에 의해 생존력, CD4 및 CD8의 표면 발현, 및 CAR 발현을 평가하였다. CD4+인 생존 CAR+ 세포 대 CD8+인 생존 CAR+ 세포의 비율 (CAR+ CD4/CD8 비율)을 결정하였다.
선별된 CD4 및 CD8 세포의 혼합물 내 CD27+/CCR7+ CD4/CD8 비율, CD45RA+/CCR7+ CD4/CD8 비율, 또는 CD62L-/CCR7+ CD4/CD8 비율을, 사후, 조작된 CAR-T 세포 조성물 내 CAR+ CD4/CD8 비율에 대하여 비교하였다. 각 대상체로부터의 평균 비율의 상관관계 정도를 이변량 분석에 의해 평가하였고, 플로팅된 데이터에 대한 0.950 확률 영역을 나타내는 이변량 정규 타원이 각각 도 3A-3C에 도시된다. 도시된 바와 같이, 피어슨 상관관계 분석에 기초하여 출발 샘플 내 CD27+/CCR7+ CD4/CD8 비율, CD45RA+/CCR7+ CD4/CD8 비율, 또는 CD62L-/CCR7+ CD4/CD8 비율과, T 세포 조성물 내 CAR+ CD4/CD8 비율은 상당한 상관관계를 가졌다. 표 3A-3C는 도 3A-3C에 플로팅된 데이터에 대해 수행한 상관 분석의 결과를 나타낸다. 유의성 <0.05은 *로 표시된다.
본 발명은 예를 들어 본 발명의 다양한 양태를 예시하기 위해 제공되는 특정 개시된 구현예로 범위가 제한되도록 의도된 것이 아니다. 기재된 조성물 및 방법에 대한 다양한 변형은 본 명세서의 설명 및 교시로부터 명백해질 것이다. 이러한 변형은 본 개시의 진정한 범위 및 사상을 벗어나지 않고 실시될 수 있으며 본 개시의 범위 내에 속하도록 의도된 것이다.
SEQUENCE LISTING
<110> JUNO THERAPEUTICS, INC.
MUJACIC, Mirna
RAHARDJO, Ayu
<120> METHODS FOR PRODUCING GENETICALLY
ENGINEERED CELL COMPOSITIONS AND RELATED COMPOSITIONS
<130> 735042013140
<140> Not Yet Assigned
<141> Concurrently Herewith
<150> US 62/543,363
<151> 2017-08-09
<150> US 62/596,770
<151> 2017-12-08
<160> 57
<170> FastSEQ for Windows Version 4.0
<210> 1
<211> 12
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> spacer (IgG4hinge)
<400> 1
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro
1 5 10
<210> 2
<211> 36
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> spacer (IgG4hinge)
<400> 2
gaatctaagt acggaccgcc ctgcccccct tgccct 36
<210> 3
<211> 119
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Hinge-CH3 spacer
<400> 3
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Gly Gln Pro Arg
1 5 10 15
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
20 25 30
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
35 40 45
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
50 55 60
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
65 70 75 80
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
85 90 95
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
100 105 110
Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
115
<210> 4
<211> 229
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Hinge-CH2-CH3 spacer
<400> 4
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe
1 5 10 15
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
20 25 30
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
35 40 45
Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
50 55 60
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser
65 70 75 80
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
85 90 95
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser
100 105 110
Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
115 120 125
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln
130 135 140
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
145 150 155 160
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
165 170 175
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu
180 185 190
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
195 200 205
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
210 215 220
Leu Ser Leu Gly Lys
225
<210> 5
<211> 282
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> IgD-hinge-Fc
<400> 5
Arg Trp Pro Glu Ser Pro Lys Ala Gln Ala Ser Ser Val Pro Thr Ala
1 5 10 15
Gln Pro Gln Ala Glu Gly Ser Leu Ala Lys Ala Thr Thr Ala Pro Ala
20 25 30
Thr Thr Arg Asn Thr Gly Arg Gly Gly Glu Glu Lys Lys Lys Glu Lys
35 40 45
Glu Lys Glu Glu Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys Pro
50 55 60
Ser His Thr Gln Pro Leu Gly Val Tyr Leu Leu Thr Pro Ala Val Gln
65 70 75 80
Asp Leu Trp Leu Arg Asp Lys Ala Thr Phe Thr Cys Phe Val Val Gly
85 90 95
Ser Asp Leu Lys Asp Ala His Leu Thr Trp Glu Val Ala Gly Lys Val
100 105 110
Pro Thr Gly Gly Val Glu Glu Gly Leu Leu Glu Arg His Ser Asn Gly
115 120 125
Ser Gln Ser Gln His Ser Arg Leu Thr Leu Pro Arg Ser Leu Trp Asn
130 135 140
Ala Gly Thr Ser Val Thr Cys Thr Leu Asn His Pro Ser Leu Pro Pro
145 150 155 160
Gln Arg Leu Met Ala Leu Arg Glu Pro Ala Ala Gln Ala Pro Val Lys
165 170 175
Leu Ser Leu Asn Leu Leu Ala Ser Ser Asp Pro Pro Glu Ala Ala Ser
180 185 190
Trp Leu Leu Cys Glu Val Ser Gly Phe Ser Pro Pro Asn Ile Leu Leu
195 200 205
Met Trp Leu Glu Asp Gln Arg Glu Val Asn Thr Ser Gly Phe Ala Pro
210 215 220
Ala Arg Pro Pro Pro Gln Pro Gly Ser Thr Thr Phe Trp Ala Trp Ser
225 230 235 240
Val Leu Arg Val Pro Ala Pro Pro Ser Pro Gln Pro Ala Thr Tyr Thr
245 250 255
Cys Val Val Ser His Glu Asp Ser Arg Thr Leu Leu Asn Ala Ser Arg
260 265 270
Ser Leu Glu Val Ser Tyr Val Thr Asp His
275 280
<210> 6
<211> 24
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> T2A
<400> 6
Leu Glu Gly Gly Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp
1 5 10 15
Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Arg
20
<210> 7
<211> 357
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> tEGFR
<400> 7
Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro
1 5 10 15
Ala Phe Leu Leu Ile Pro Arg Lys Val Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly
20 25 30
Glu Phe Lys Asp Ser Leu Ser Ile Asn Ala Thr Asn Ile Lys His Phe
35 40 45
Lys Asn Cys Thr Ser Ile Ser Gly Asp Leu His Ile Leu Pro Val Ala
50 55 60
Phe Arg Gly Asp Ser Phe Thr His Thr Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu
65 70 75 80
Leu Asp Ile Leu Lys Thr Val Lys Glu Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile
85 90 95
Gln Ala Trp Pro Glu Asn Arg Thr Asp Leu His Ala Phe Glu Asn Leu
100 105 110
Glu Ile Ile Arg Gly Arg Thr Lys Gln His Gly Gln Phe Ser Leu Ala
115 120 125
Val Val Ser Leu Asn Ile Thr Ser Leu Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu
130 135 140
Ile Ser Asp Gly Asp Val Ile Ile Ser Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr
145 150 155 160
Ala Asn Thr Ile Asn Trp Lys Lys Leu Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys
165 170 175
Thr Lys Ile Ile Ser Asn Arg Gly Glu Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly
180 185 190
Gln Val Cys His Ala Leu Cys Ser Pro Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu
195 200 205
Pro Arg Asp Cys Val Ser Cys Arg Asn Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys
210 215 220
Val Asp Lys Cys Asn Leu Leu Glu Gly Glu Pro Arg Glu Phe Val Glu
225 230 235 240
Asn Ser Glu Cys Ile Gln Cys His Pro Glu Cys Leu Pro Gln Ala Met
245 250 255
Asn Ile Thr Cys Thr Gly Arg Gly Pro Asp Asn Cys Ile Gln Cys Ala
260 265 270
His Tyr Ile Asp Gly Pro His Cys Val Lys Thr Cys Pro Ala Gly Val
275 280 285
Met Gly Glu Asn Asn Thr Leu Val Trp Lys Tyr Ala Asp Ala Gly His
290 295 300
Val Cys His Leu Cys His Pro Asn Cys Thr Tyr Gly Cys Thr Gly Pro
305 310 315 320
Gly Leu Glu Gly Cys Pro Thr Asn Gly Pro Lys Ile Pro Ser Ile Ala
325 330 335
Thr Gly Met Val Gly Ala Leu Leu Leu Leu Leu Val Val Ala Leu Gly
340 345 350
Ile Gly Leu Phe Met
355
<210> 8
<211> 27
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> CD28 (amino acids 153-179 of Accession No. P10747)
<300>
<308> UniProt P10747
<309> 1989-07-01
<400> 8
Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu
1 5 10 15
Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val
20 25
<210> 9
<211> 66
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> CD28 (amino acids 114-179 of Accession No. P10747)
<300>
<308> UniProt P10747
<309> 1989-07-01
<400> 9
Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn
1 5 10 15
Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu
20 25 30
Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly
35 40 45
Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe
50 55 60
Trp Val
65
<210> 10
<211> 41
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> CD28 (amino acids 180-220 of P10747)
<300>
<308> UniProt P10747
<309> 1989-07-01
<400> 10
Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr
1 5 10 15
Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro
20 25 30
Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser
35 40
<210> 11
<211> 41
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> CD28 (LL to GG)
<400> 11
Arg Ser Lys Arg Ser Arg Gly Gly His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr
1 5 10 15
Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro
20 25 30
Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser
35 40
<210> 12
<211> 42
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> 4-1BB (amino acids 214-255 of Q07011.1)
<300>
<308> UniProt Q07011.1
<309> 1995-02-01
<400> 12
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
1 5 10 15
Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe
20 25 30
Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
35 40
<210> 13
<211> 112
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> CD3 zeta
<400> 13
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
50 55 60
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
65 70 75 80
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
85 90 95
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
100 105 110
<210> 14
<211> 112
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> CD3 zeta
<400> 14
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Glu Pro Pro Ala Tyr Gln Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
50 55 60
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
65 70 75 80
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
85 90 95
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
100 105 110
<210> 15
<211> 112
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> CD3 zeta
<400> 15
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
50 55 60
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
65 70 75 80
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
85 90 95
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
100 105 110
<210> 16
<211> 335
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> tEGFR
<400> 16
Arg Lys Val Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly Glu Phe Lys Asp Ser Leu
1 5 10 15
Ser Ile Asn Ala Thr Asn Ile Lys His Phe Lys Asn Cys Thr Ser Ile
20 25 30
Ser Gly Asp Leu His Ile Leu Pro Val Ala Phe Arg Gly Asp Ser Phe
35 40 45
Thr His Thr Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu Leu Asp Ile Leu Lys Thr
50 55 60
Val Lys Glu Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile Gln Ala Trp Pro Glu Asn
65 70 75 80
Arg Thr Asp Leu His Ala Phe Glu Asn Leu Glu Ile Ile Arg Gly Arg
85 90 95
Thr Lys Gln His Gly Gln Phe Ser Leu Ala Val Val Ser Leu Asn Ile
100 105 110
Thr Ser Leu Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu Ile Ser Asp Gly Asp Val
115 120 125
Ile Ile Ser Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr Ala Asn Thr Ile Asn Trp
130 135 140
Lys Lys Leu Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys Thr Lys Ile Ile Ser Asn
145 150 155 160
Arg Gly Glu Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly Gln Val Cys His Ala Leu
165 170 175
Cys Ser Pro Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu Pro Arg Asp Cys Val Ser
180 185 190
Cys Arg Asn Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys Val Asp Lys Cys Asn Leu
195 200 205
Leu Glu Gly Glu Pro Arg Glu Phe Val Glu Asn Ser Glu Cys Ile Gln
210 215 220
Cys His Pro Glu Cys Leu Pro Gln Ala Met Asn Ile Thr Cys Thr Gly
225 230 235 240
Arg Gly Pro Asp Asn Cys Ile Gln Cys Ala His Tyr Ile Asp Gly Pro
245 250 255
His Cys Val Lys Thr Cys Pro Ala Gly Val Met Gly Glu Asn Asn Thr
260 265 270
Leu Val Trp Lys Tyr Ala Asp Ala Gly His Val Cys His Leu Cys His
275 280 285
Pro Asn Cys Thr Tyr Gly Cys Thr Gly Pro Gly Leu Glu Gly Cys Pro
290 295 300
Thr Asn Gly Pro Lys Ile Pro Ser Ile Ala Thr Gly Met Val Gly Ala
305 310 315 320
Leu Leu Leu Leu Leu Val Val Ala Leu Gly Ile Gly Leu Phe Met
325 330 335
<210> 17
<211> 18
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> T2A
<400> 17
Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro
1 5 10 15
Gly Pro
<210> 18
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MMP cleavable linker
<400> 18
Pro Leu Gly Leu Trp Ala
1 5
<210> 19
<211> 22
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> P2A
<400> 19
Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val
1 5 10 15
Glu Glu Asn Pro Gly Pro
20
<210> 20
<211> 19
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> P2A
<400> 20
Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn
1 5 10 15
Pro Gly Pro
<210> 21
<211> 20
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> E2A
<400> 21
Gln Cys Thr Asn Tyr Ala Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser
1 5 10 15
Asn Pro Gly Pro
20
<210> 22
<211> 22
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> F2A
<400> 22
Val Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val
1 5 10 15
Glu Ser Asn Pro Gly Pro
20
<210> 23
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Hinge
<220>
<221> VARIANT
<222> 1
<223> Xaa= Gly,Cys or Arg
<220>
<221> VARIANT
<222> 4
<223> Xaa=Cys or Thr
<400> 23
Xaa Pro Pro Xaa Pro
1 5
<210> 24
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Hinge
<400> 24
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
1 5 10 15
<210> 25
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Hinge
<400> 25
Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro
1 5 10
<210> 26
<211> 61
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Hinge
<400> 26
Glu Leu Lys Thr Pro Leu Gly Asp Thr His Thr Cys Pro Arg Cys Pro
1 5 10 15
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Glu
20 25 30
Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Glu Pro
35 40 45
Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro
50 55 60
<210> 27
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Hinge
<400> 27
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro
1 5 10
<210> 28
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Hinge
<400> 28
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro
1 5 10
<210> 29
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Hinge
<400> 29
Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro
1 5
<210> 30
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Hinge
<400> 30
Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro
1 5 10
<210> 31
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Hinge
<400> 31
Glu Val Val Val Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro
1 5 10
<210> 32
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Exemplary linker sequence
<220>
<221> REPEAT
<222> (5)...(9)
<223> SGGGG is repeated 5 times
<400> 32
Pro Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Pro
1 5 10
<210> 33
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Exemplary linker sequence
<400> 33
Gly Ser Ala Asp Asp Ala Lys Lys Asp Ala Ala Lys Lys Asp Gly Lys
1 5 10 15
Ser
<210> 34
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FMC63 LC-CDR3
<400> 34
Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr
1 5
<210> 35
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FMC63 CDR L1
<400> 35
Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr Leu Asn
1 5 10
<210> 36
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FMC63 CDR L2
<400> 36
Ser Arg Leu His Ser Gly Val
1 5
<210> 37
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FMC63 CDR L3
<400> 37
Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly
1 5
<210> 38
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FMC63 CDR H1
<400> 38
Asp Tyr Gly Val Ser
1 5
<210> 39
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FMC63 CDR H2
<400> 39
Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser
1 5 10 15
<210> 40
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FMC63 CDR H3
<400> 40
Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly
1 5
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<211> 120
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FMC63 VH
<400> 41
Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr
20 25 30
Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Leu Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu
65 70 75 80
Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 42
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FMC63 VL
<400> 42
Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr
100 105
<210> 43
<211> 245
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FMC63 scFv
<400> 43
Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr Gly Ser Thr Ser Gly
100 105 110
Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Glu Val Lys
115 120 125
Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser
130 135 140
Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser
145 150 155 160
Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile
165 170 175
Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Leu
180 185 190
Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys Met Asn
195 200 205
Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr
210 215 220
Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser
225 230 235 240
Val Thr Val Ser Ser
245
<210> 44
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SJ25C1 CDR L1
<400> 44
Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn Val Ala
1 5 10
<210> 45
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SJ25C1 CDR L2
<400> 45
Ser Ala Thr Tyr Arg Asn Ser
1 5
<210> 46
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SJ25C1 CDR L3
<400> 46
Gln Gln Tyr Asn Arg Tyr Pro Tyr Thr
1 5
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<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SJ25C1 CDR H1
<400> 47
Ser Tyr Trp Met Asn
1 5
<210> 48
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SJ25C1 CDR H2
<400> 48
Gln Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 49
<211> 13
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SJ25C1 CDR H3
<400> 49
Lys Thr Ile Ser Ser Val Val Asp Phe Tyr Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 50
<211> 122
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SJ25C1 VH
<400> 50
Glu Val Lys Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Gln Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Gln Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Gly Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Lys Thr Ile Ser Ser Val Val Asp Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 51
<211> 108
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SJ25C1 VL
<400> 51
Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ser Val Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Pro Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Thr Tyr Arg Asn Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Thr Asn Val Gln Ser
65 70 75 80
Lys Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Asn Arg Tyr Pro Tyr
85 90 95
Thr Ser Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 52
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Linker
<400> 52
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 53
<211> 245
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SJ25C1 scFv
<400> 53
Glu Val Lys Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Gln Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Gln Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Gly Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Lys Thr Ile Ser Ser Val Val Asp Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
115 120 125
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser
130 135 140
Pro Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly Asp Arg Val Ser Val Thr Cys
145 150 155 160
Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys
165 170 175
Pro Gly Gln Ser Pro Lys Pro Leu Ile Tyr Ser Ala Thr Tyr Arg Asn
180 185 190
Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe
195 200 205
Thr Leu Thr Ile Thr Asn Val Gln Ser Lys Asp Leu Ala Asp Tyr Phe
210 215 220
Cys Gln Gln Tyr Asn Arg Tyr Pro Tyr Thr Ser Gly Gly Gly Thr Lys
225 230 235 240
Leu Glu Ile Lys Arg
245
<210> 54
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FMC63 HC-CDR3
<400> 54
His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 55
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FMC63 LC-CDR2
<400> 55
His Thr Ser Arg Leu His Ser
1 5
<210> 56
<211> 18
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Linker
<400> 56
Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr
1 5 10 15
Lys Gly
<210> 57
<211> 735
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Sequence encoding scFv
<400> 57
gacatccaga tgacccagac cacctccagc ctgagcgcca gcctgggcga ccgggtgacc 60
atcagctgcc gggccagcca ggacatcagc aagtacctga actggtatca gcagaagccc 120
gacggcaccg tcaagctgct gatctaccac accagccggc tgcacagcgg cgtgcccagc 180
cggtttagcg gcagcggctc cggcaccgac tacagcctga ccatctccaa cctggaacag 240
gaagatatcg ccacctactt ttgccagcag ggcaacacac tgccctacac ctttggcggc 300
ggaacaaagc tggaaatcac cggcagcacc tccggcagcg gcaagcctgg cagcggcgag 360
ggcagcacca agggcgaggt gaagctgcag gaaagcggcc ctggcctggt ggcccccagc 420
cagagcctga gcgtgacctg caccgtgagc ggcgtgagcc tgcccgacta cggcgtgagc 480
tggatccggc agccccccag gaagggcctg gaatggctgg gcgtgatctg gggcagcgag 540
accacctact acaacagcgc cctgaagagc cggctgacca tcatcaagga caacagcaag 600
agccaggtgt tcctgaagat gaacagcctg cagaccgacg acaccgccat ctactactgc 660
gccaagcact actactacgg cggcagctac gccatggact actggggcca gggcaccagc 720
gtgaccgtga gcagc 735
Claims (105)
- 다음의 단계를 포함하는, 세포 조성물의 제조 방법:
나이브-유사 CD4+ T 세포를 포함하는 제1 세포 조성물과 나이브-유사 CD8+ T 세포를 포함하는 제2 세포 조성물을 조합하여 투입 세포 조성물을 제조하는 단계로서, 여기서 나이브-유사 CD4+ T 세포 대 나이브-유사 CD8+ T 세포의 비율은 (약) 0.8:1 내지 2.2:1인 단계. - 청구항 1에 있어서, 제1 세포 조성물은 대상체로부터 수득한 생물학적 샘플로부터 CD4+ T 세포를 단리함으로써 제조되고 및/또는 제2 세포 조성물은 대상체로부터 수득한 생물학적 샘플로부터 CD8+ T 세포를 단리함으로써 제조되는 것인 방법.
- 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서, 조합 이전에, 상기 방법은 제1 세포 조성물 내 나이브-유사 CD4+ T 세포의 개수, 부피 당 개수, 중량 당 개수 및/또는 백분율, 및/또는 제2 세포 조성물 내 나이브-유사 CD8+ T 세포의 개수, 부피 당 개수, 중량 당 개수 및/또는 백분율을 결정하는 단계를 포함하는 것인 방법.
- 청구항 2에 있어서, 조합 이전에, 상기 방법은 대상체로부터의 생물학적 샘플 내 나이브-유사 CD4+ T 세포의 개수, 부피 당 개수, 중량 당 개수 및/또는 백분율, 및/또는 나이브-유사 CD8+ T 세포의 개수, 부피 당 개수, 중량 당 개수 및/또는 백분율을 결정하는 단계를 포함하는 것인 방법.
- 청구항 1-4 중 어느 한 항에 있어서, 투입 세포 조성물 내 나이브-유사 CD4+ T 세포 대 나이브-유사 CD8+ T 세포의 비율은 대상체로부터의 생물학적 샘플 내 나이브-유사 CD4+ T 세포 대 나이브-유사 CD8+ T 세포의 비율과 비교하여 조정 또는 변경되는 것인 방법.
- 다음의 단계를 포함하는, 세포 조성물의 제조 방법:
대상체로부터 수득한 생물학적 샘플 또는 그로부터 유래된 하나 이상의 샘플 내 나이브-유사 CD4+ T 세포 및 나이브-유사 CD8+ T 세포의 개수, 부피 당 개수, 중량 당 개수 및/또는 백분율을 결정하는 단계; 및
CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포를 포함하는 투입 세포 조성물을 생성하는 단계로서, 여기서 나이브-유사 CD4+ T 세포 대 나이브-유사 CD8+ T 세포의 비율은 (약) 2.2:1 내지 0.8:1이고, 상기 투입 세포 조성물 내 비율은 대상체로부터의 생물학적 샘플 내 나이브-유사 CD4+ T 세포 대 나이브-유사 CD8+ T 세포의 비율과 비교하여 조정 또는 변경되는 단계. - 청구항 1-6 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 수용체를 인코딩하는 핵산을 투입 세포 조성물 내 세포 내로 도입하는 조건하에서, 투입 세포 조성물과, 재조합 수용체를 인코딩하는 핵산 분자를 포함하는 시제와 접촉시키는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
- 다음의 단계를 포함하는, 세포 조성물의 제조 방법:
대상체로부터 유래한 생물학적 샘플로부터의 나이브-유사 CD4+ T 세포 및 나이브-유사 CD8+ T 세포를 포함하는 투입 세포 조성물을, 재조합 수용체를 인코딩하는 핵산을 이러한 조성물 내 세포 내로 도입하는 조건하에서 재조합 수용체를 인코딩하는 핵산 분자를 포함하는 시제와 접촉시키는 단계로서,
여기서 투입 세포 조성물 내 존재하는 나이브-유사 CD4+ T 세포 대 나이브-유사 CD8+ T 세포의 비율은 (약) 0.8:1 내지 2.2:1인 단계. - 청구항 7 또는 청구항 8에 있어서, 상기 방법은 상기 접촉 단계 이전, 동안 및/또는 이후에 세포를 자극하는 단계를 추가로 포함하며, 이러한 자극 단계는 하나 이상의 자극 시제의 존재하에 세포의 인큐베이션을 포함하고, 자극 단계는 세포의 활성화 및/또는 증식을 초래하는 것인 방법.
- 다음의 단계를 포함하는, 세포 조성물의 제조 방법:
나이브-유사 CD4+ T 세포를 포함하는 제1 세포 조성물과 나이브-유사 CD8+ T 세포를 포함하는 제2 세포 조성물을 조합하여 투입 세포 조성물을 제조하는 단계로서, 여기서 나이브-유사 CD4+ T 세포 대 나이브-유사 CD8+ T 세포의 비율은 (약) 0.8:1 내지 2.2:1인 단계;
재조합 수용체를 인코딩하는 핵산을 조성물 내 세포 내로 도입하는 조건하에서, 투입 세포 조성물과, 재조합 수용체를 인코딩하는 핵산 분자를 포함하는 시제와 접촉시키는 단계; 및
상기 접촉 단계 이전, 동안 및/또는 이후에 세포를 자극하는 단계로서, 이러한 자극 단계는 하나 이상의 자극 시제의 존재하에 세포의 인큐베이션을 포함하고, 자극 단계는 세포의 활성화 및/또는 증식을 초래하는 단계. - 청구항 1-10 중 어느 한 항에 있어서, 나이브-유사 CD4+ 및/또는 나이브-유사 CD8+ 세포는:
CD45RA, CD27, CD28, 및 CCR7으로 구성된 군으로부터 선택된 마커에 대해 표면 양성이고; 및/또는
CD25, CD45RO, CD56, CD62L, 및 KLRG1으로 구성된 군으로부터 선택된 마커에 대해 표면 음성이고; 및/또는
CD95의 발현이 낮고; 및/또는
IL-2, IFN-γ, IL-4, IL-10으로 구성된 군으로부터 선택된 사이토카인의 세포 내 발현에 대해 음성인 것인 방법. - 청구항 1-11 중 어느 한 항에 있어서, 나이브-유사 CD4+ 및/또는 나이브-유사 CD8+ 세포는:
CD45RA, CD27, CD28, 및 CCR7으로 구성된 군으로부터 선택된 T 세포 활성화 마커에 대해 표면 양성이고; 및/또는
CD45RO, CD56, CD62L, 및 KLRG1으로 구성된 군으로부터 선택된 마커에 대해 표면 음성이고; 및/또는
CD95의 발현이 낮은 것인 방법. - 청구항 1-12 중 어느 한 항에 있어서, 나이브-유사 CD4+ 및/또는 나이브-유사 CD8+ 세포는 CD45RA 및 CCR7에 대하여 표면 양성인 것인 방법.
- 청구항 1-12 중 어느 한 항에 있어서, 나이브-유사 CD4+ 및/또는 나이브-유사 CD8+ 세포는 CD27 및 CCR7에 대하여 표면 양성인 것인 방법.
- 청구항 1-14 중 어느 한 항에 있어서, 나이브-유사 CD4+ 및 나이브-유사 CD8+ 세포는 CD45RA, CD27 및 CCR7에 대하여 표면 양성이고 CD45RO에 대하여 표면 음성인 것인 방법.
- 청구항 1-12 중 어느 한 항에 있어서, 나이브-유사 CD4+ 및/또는 나이브-유사 CD8+ 세포는 CCR7에 대하여 표면 양성이고 CD62L에 대하여 표면 음성인 것인 방법.
- 청구항 3-16 중 어느 한 항에 있어서, 나이브-유사 CD4+ T 세포의 개수, 부피 당 개수, 중량 당 개수 및/또는 백분율, 및/또는 나이브-유사 CD8+ T 세포의 개수, 부피 당 개수, 중량 당 개수 및/또는 백분율은 유세포 분석에 의해 결정되는 것인 방법.
- 청구항 8-17 중 어느 한 항에 있어서, 나이브-유사 CD4+ T 세포 대 나이브-유사 CD8+ T 세포의 비율은, 대상체로부터의 생물학적 샘플 내 나이브-유사 CD4+ T 세포 대 나이브-유사 CD8+ T 세포의 비율과 비교하여 조절되는 것인 방법.
- 청구항 1-18 중 어느 한 항에 있어서, 투입 세포 조성물은 나이브-유사 CD4+ 세포 대 나이브-유사 CD8+ 세포의 비율로 (약) 0.8:1 내지 2.0:1, 0.8:1 내지 1.6:1, 0.8:1 내지 1.4:1, 0.8:1 내지 1.2:1, 1.5:1 내지 2:1, 1.6:1 내지 1.8:1, 또는 1.0:1 내지 1.2:1을 포함하는 것인 방법.
- 청구항 1-19 중 어느 한 항에 있어서, 투입 세포 조성물은 나이브-유사 CD4+ 세포 대 나이브-유사 CD8+ 세포의 비율로 (약) 2:1, 1.9:1, 1.8:1, 1.7:1, 1.69:1, 1.6:1, 1.5:1, 1.4:1, 1.3:1, 1.2:1, 1.1:1, 또는 1.0:1을 포함하는 것인 방법.
- 청구항 1-20 중 어느 한 항에 있어서, 투입 세포 조성물은 나이브-유사 CD4+ 세포 대 나이브-유사 CD8+ 세포의 비율로 (약) 1.1:1을 포함하는 것인 방법.
- 청구항 1-20 중 어느 한 항에 있어서, 투입 세포 조성물은 CD45RA 및 CCR7에 대하여 표면 양성인 나이브-유사 CD4+ 세포 대 나이브-유사 CD8+ 세포의 비율로 (약) 1.1:1을 포함하는 것인 방법.
- 청구항 1-20 중 어느 한 항에 있어서, 투입 세포 조성물은 CD45RA 및 CD27에 대하여 표면 양성인 나이브-유사 CD4+ 세포 대 나이브-유사 CD8+ 세포의 비율로 (약) 1.69:1을 포함하는 것인 방법.
- 청구항 1-20 중 어느 한 항에 있어서, 투입 조성물은 CD27 및 CCR7에 대하여 표면 양성인 나이브-유사 CD4+ 세포 대 나이브-유사 CD8+ 세포의 비율로 (약) 1.69:1을 포함하는 것인 방법.
- 다음의 단계를 포함하는, 세포 조성물의 제조 방법:
CCR7+CD45RA+CD4+ T 세포를 포함하는 제1 세포 조성물과 CCR7+CD45RA+CD8+ T 세포를 포함하는 제2 세포 조성물을 조합하여, 투입 세포 조성물을 제조하는 단계로서, 여기서 CCR7+CD45RA+CD4+ T 세포 대 CCR7+CD45RA+CD8+ T 세포의 비율은 (약) 0.8:1 내지 2.2:1인 방법. - 청구항 1에 있어서, 제1 세포 조성물은 대상체로부터 수득한 생물학적 샘플로부터 CD4+ T 세포를 단리함으로써 제조되고 및/또는 제2 세포 조성물은 대상체로부터 수득한 생물학적 샘플로부터 CD8+ T 세포를 단리함으로써 제조되는 것인 방법.
- 청구항 25 또는 청구항 26에 있어서, 조합 이전에, 상기 방법은 제1 세포 조성물 내 CCR7+CD45RA+CD4+ T 세포의 개수, 부피 당 개수, 중량 당 개수 및/또는 백분율, 및/또는 제2 세포 조성물 내 CCR7+CD45RA+CD8+ T 세포의 개수, 부피 당 개수, 중량 당 개수 및/또는 백분율을 결정하는 단계를 포함하는 것인 방법.
- 청구항 25-27 중 어느 한 항에 있어서, 조합 이전에, 상기 방법은 대상체로부터의 생물학적 샘플 내 CCR7+CD45RA+CD4+ T 세포의 개수, 부피 당 개수, 중량 당 개수 및/또는 백분율, 및/또는 CCR7+CD45RA+CD8+ T 세포의 개수, 부피 당 개수, 중량 당 개수 및/또는 백분율을 결정하는 단계를 포함하는 것인 방법.
- 청구항 25-28 중 어느 한 항에 있어서, 투입 세포 조성물 내 CCR7+CD45RA+CD4+ T 세포 대 CCR7+CD45RA+CD8+ T 세포의 비율은 대상체로부터의 생물학적 샘플 내 CCR7+CD45RA+CD4+ T 세포 대 CCR7+CD45RA+CD8+ T 세포의 비율과 비교하여 조정 또는 변경되는 것인 방법.
- 다음의 단계를 포함하는, 세포 조성물의 제조 방법:
대상체로부터 수득한 생물학적 샘플 또는 그로부터 유래된 하나 이상의 샘플 내 CCR7+CD45RA+CD4+ T 세포 및 CCR7+CD45RA+CD8+ T 세포의 개수, 부피 당 개수, 중량 당 개수 및/또는 백분율을 결정하는 단계; 및
CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포를 포함하는 투입 세포 조성물을 생성하는 단계로서, 여기서 CCR7+CD45RA+CD4+ T 세포 대 나이브-유사 CD8+ T 세포의 비율은 (약) 2.2:1 내지 0.8:1이고, 상기 투입 세포 조성물 내 비율은 대상체로부터의 생물학적 샘플 내 CCR7+CD45RA+CD4+ T 세포 대 나이브-유사 CD8+ T 세포의 비율과 비교하여 조정 또는 변경되는 것인 단계. - 청구항 30 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 수용체를 인코딩하는 핵산을 투입 세포 조성물 내 세포 내로 도입하는 조건하에서, 투입 세포 조성물과, 재조합 수용체를 인코딩하는 핵산 분자를 포함하는 시제와 접촉시키는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
- 다음의 단계를 포함하는, 세포 조성물의 제조 방법:
대상체로부터 유래한 생물학적 샘플로부터의 CCR7+CD45RA+CD4+ T 세포 및 CCR7+CD45RA+CD8+ T 세포를 포함하는 투입 세포 조성물을, 재조합 수용체를 인코딩하는 핵산을 이러한 조성물 내 세포 내로 도입하는 조건하에서 재조합 수용체를 인코딩하는 핵산 분자를 포함하는 시제와 접촉시키는 단계로서,
여기서 투입 세포 조성물 내 존재하는 CCR7+CD45RA+CD4+ T 세포 대 CCR7+CD45RA+CD8+ T 세포의 비율은 (약) 0.8:1 내지 2.2:1인 단계. - 청구항 32에 있어서, 상기 방법은 상기 접촉 단계 이전, 동안 및/또는 이후에 세포를 자극하는 단계를 추가로 포함하며, 이러한 자극 단계는 하나 이상의 자극 시제의 존재하에 세포의 인큐베이션을 포함하고, 자극 단계는 세포의 활성화 및/또는 증식을 초래하는 것인 방법.
- 다음의 단계를 포함하는, 세포 조성물의 제조 방법:
CCR7+CD45RA+CD4+ T 세포를 포함하는 제1 세포 조성물과 CCR7+CD45RA+CD8+ T 세포를 포함하는 제2 세포 조성물을 조합하여, 투입 세포 조성물을 제조하는 단계로서, 여기서 CCR7+CD45RA+CD4+ T 세포 대 CCR7+CD45RA+CD8+ T 세포의 비율은 (약) 0.8:1 내지 2.2:1인 단계;
재조합 수용체를 인코딩하는 핵산을 조성물 내 세포 내로 도입하는 조건하에서, 투입 세포 조성물과, 재조합 수용체를 인코딩하는 핵산 분자를 포함하는 시제와 접촉시키는 단계; 및
상기 접촉 단계 이전, 동안 및/또는 이후에 세포를 자극하는 단계로서, 이러한 자극 단계는 하나 이상의 자극 시제의 존재하에 세포의 인큐베이션을 포함하고, 자극 단계는 세포의 활성화 및/또는 증식을 초래하는 단계. - 청구항 25-34 중 어느 한 항에 있어서, 나이브-유사 CD4+ T 세포의 개수, 부피 당 개수, 중량 당 개수 및/또는 백분율, 및/또는 나이브-유사 CD8+ T 세포의 개수, 부피 당 개수, 중량 당 개수 및/또는 백분율은 유세포 분석에 의해 결정되는 것인 방법.
- 청구항 32-35 중 어느 한 항에 있어서, CCR7+CD45RA+CD4+ T 세포 대 CCR7+CD45RA+CD8+ T 세포의 비율은 대상체로부터의 생물학적 샘플 내 CCR7+CD45RA+CD4+ T 세포 대 CCR7+CD45RA+CD8+ T 세포의 비율과 비교하여 조정되는 것인 방법.
- 청구항 24-35 중 어느 한 항에 있어서, 투입 세포 조성물은 CCR7+CD45RA+CD4+ 세포 대 CCR7+CD45RA+CD8+ 세포의 비율로 (약) 0.8:1 내지 2.0:1, 0.8:1 내지 1.6:1, 0.8:1 내지 1.4:1, 0.8:1 내지 1.2:1, 또는 1.0:1 내지 1.2:1를 포함하는 것인 방법.
- 청구항 25-37 중 어느 한 항에 있어서, 투입 세포 조성물은 CCR7+CD45RA+ CD4+ 세포 대 CCR7+CD45RA+ CD8+ 세포의 비율로 (약) 1.5:1, 1.4:1, 1.3:1, 1.2:1, 1.1:1, 또는 1.0:1을 포함하는 것인 방법.
- 청구항 25-38 중 어느 한 항에 있어서, 투입 세포 조성물은 CCR7+CD45RA+CD4+ 세포 대 CCR7+CD45RA+CD8+ 세포의 비율로 (약) 1.1:1을 포함하는 것인 방법.
- 다음의 단계를 포함하는, 세포 조성물의 제조 방법:
CD27+CCR7+CD4+ T 세포를 포함하는 제1 세포 조성물과 CD27+CCR7+CD8+ T 세포를 포함하는 제2 세포 조성물을 조합하여, 투입 세포 조성물을 제조하는 단계로서, 여기서 CD27+CCR7+CD4+ T 세포 대 CD27+CCR7+CD8+ T 세포의 비율은 (약) 1.2:1 내지 2.4:1인 단계. - 청구항 40에 있어서, 제1 세포 조성물은 대상체로부터 수득한 생물학적 샘플로부터 CD4+ T 세포를 단리함으로써 제조되고 및/또는 제2 세포 조성물은 대상체로부터 수득한 생물학적 샘플로부터 CD8+ T 세포를 단리함으로써 제조되는 것인 방법.
- 청구항 40 또는 청구항 41에 있어서, 조합 이전에, 상기 방법은 제1 세포 조성물 내 CD27+CCR7+CD4+ T 세포의 개수, 부피 당 개수, 중량 당 개수 및/또는 백분율, 및/또는 제2 세포 조성물 내 CD27+CCR7+CD8+ T 세포의 개수, 부피 당 개수, 중량 당 개수 및/또는 백분율을 결정하는 단계를 포함하는 것인 방법.
- 청구항 40-42 중 어느 한 항에 있어서, 조합 이전에, 상기 방법은 대상체로부터의 생물학적 샘플 내 CD27+CCR7+CD4+ T 세포의 개수, 부피 당 개수, 중량 당 개수 및/또는 백분율, 및/또는 CD27+CCR7+CD8+ T 세포의 개수, 부피 당 개수, 중량 당 개수 및/또는 백분율을 결정하는 단계를 포함하는 것인 방법.
- 청구항 40-43 중 어느 한 항에 있어서, 투입 조성물 내 CD27+CCR7+CD4+ T 세포 대 CD27+CCR7+CD8+ T 세포의 비율은 대상체로부터의 생물학적 샘플 내 CD27+CCR7+CD4+ T 세포 대 CD27+CCR7+CD8+ T 세포의 비율과 비교하여 조정 또는 변경되는 것인 방법.
- 다음의 단계를 포함하는, 세포 조성물의 제조 방법:
대상체로부터 수득한 생물학적 샘플 또는 그로부터 유래된 하나 이상의 샘플 내 CD27+CCR7+CD4+ T 세포 및 CD27+CCR7+CD8+ T 세포의 개수, 부피 당 개수, 중량 당 개수 및/또는 백분율을 결정하는 단계; 및
CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포를 포함하는 투입 세포 조성물을 생성하는 단계로서, 여기서 CD27+CCR7+CD4+ T 세포 대 나이브-유사 CD8+ T 세포의 비율은 (약) 2.2:1 내지 0.8:1이고, 상기 투입 세포 조성물 내 비율은 대상체로부터의 생물학적 샘플 내 CD27+CCR7+CD4+ T 세포 대 나이브-유사 CD8+ T 세포의 비율과 비교하여 조정 또는 변경되는 단계. - 청구항 40-45 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 수용체를 인코딩하는 핵산을 투입 세포 조성물 내 세포 내로 도입하는 조건하에서, 투입 세포 조성물과, 재조합 수용체를 인코딩하는 핵산 분자를 포함하는 시제와 접촉시키는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
- 다음의 단계를 포함하는, 세포 조성물의 제조 방법:
대상체로부터 유래한 생물학적 샘플로부터의 CD27+CCR7+CD4+ T 세포 및 CD27+CCR7+CD8+ T 세포를 포함하는 투입 세포 조성물을, 재조합 수용체를 인코딩하는 핵산을 이러한 조성물 내 세포 내로 도입하는 조건하에서 재조합 수용체를 인코딩하는 핵산 분자를 포함하는 시제와 접촉시키는 단계로서,
여기서 투입 세포 조성물 내 존재하는 CD27+CCR7+CD4+ T 세포 대 CD27+CCR7+CD8+ T 세포의 비율은 (약) 0.8:1 내지 2.2:1인 단계. - 청구항 47에 있어서, 상기 방법은 상기 접촉 단계 이전, 동안 및/또는 이후에 세포를 자극하는 단계를 추가로 포함하며, 이러한 자극 단계는 하나 이상의 자극 시제의 존재하에 세포의 인큐베이션을 포함하고, 자극 단계는 세포의 활성화 및/또는 증식을 초래하는 것인 방법.
- 다음의 단계를 포함하는, 세포 조성물의 제조 방법:
CD27+CCR7+ CD4+ T 세포를 포함하는 제1 세포 조성물과 CD27+CCR7+CD8+ T 세포를 포함하는 제2 세포 조성물을 조합하여 투입 세포 조성물을 제조하는 단계로서, 여기서 CD27+CCR7+CD4+ T 세포 대 CD27+CCR7+ CD8+ T 세포의 비율은 (약) 0.8:1 내지 2.2:1인 단계;
재조합 수용체를 인코딩하는 핵산을 조성물 내 세포 내로 도입하는 조건하에서, 투입 세포 조성물과, 재조합 수용체를 인코딩하는 핵산 분자를 포함하는 시제와 접촉시키는 단계; 및
상기 접촉 단계 이전, 동안 및/또는 이후에 세포를 자극하는 단계로서, 이러한 자극 단계는 하나 이상의 자극 시제의 존재하에 세포의 인큐베이션을 포함하고, 자극 단계는 세포의 활성화 및/또는 증식을 초래하는 단계. - 청구항 40-49 중 어느 한 항에 있어서, CD27+CCR7+CD4+ T 세포의 개수, 부피 당 개수, 중량 당 개수 및/또는 백분율, 및/또는 CD27+CCR7+CD8+ T 세포의 개수, 부피 당 개수, 중량 당 개수 및/또는 백분율은 유세포 분석에 의해 결정되는 것인 방법.
- 청구항 40-50 중 어느 한 항에 있어서, CD27+CCR7+CD4+ T 세포 대 CD27+CCR7+CD8+ T 세포의 비율은 대상체로부터의 생물학적 샘플 내 CD27+CCR7+CD4+ T 세포 대 CD27+CCR7+CD8+ T 세포의 비율과 비교하여 조정되는 것인 방법.
- 청구항 40-51 중 어느 한 항에 있어서, 투입 세포 조성물은 CD27+CCR7+CD4+ 세포 대 CD27+CCR7+CD8+ 세포의 비율로 (약) 0.8:1 내지 2.0:1, 0.8:1 내지 1.6:1, 0.8:1 내지 1.4:1, 0.8:1 내지 1.2:1, 또는 1.0:1 내지 1.2:1을 포함하는 것인 방법.
- 청구항 40-52 중 어느 한 항에 있어서, 투입 세포 조성물은 CD27+CCR7+CD4+ 세포 대 CD27+CCR7+CD8+ 세포의 비율로 (약) 1.5:1, 1.4:1, 1.3:1, 1.2:1, 1.1:1, 또는 1.0:1을 포함하는 것인 방법.
- 청구항 40-53 중 어느 한 항에 있어서, 투입 세포 조성물은 CD27+CCR7+CD4+ 세포 대 CD27+CCR7+CD8+ 세포의 비율로 (약) 1.1:1을 포함하는 것인 방법.
- 청구항 40-53 중 어느 한 항에 있어서, 투입 세포 조성물은 CD27+CCR7+CD4+ 세포 대 CD27+CCR7+CD8+ 세포의 비율로 (약) 1.1:1을 포함하는 것인 방법.
- 다음의 단계를 포함하는, 세포 조성물의 제조 방법:
CD62L-CCR7+CD4+ T 세포를 포함하는 제1 세포 조성물과 CD62L-CCR7+CD8+ T 세포를 포함하는 제2 세포 조성물을 조합하여, 투입 세포 조성물을 제조하는 단계로서, 여기서 CD62L-CCR7+CD4+ T 세포 대 CD62L-CCR7+CD8+ T 세포의 비율은 (약) 0.5:1 내지 2:1인 단계. - 다음의 단계를 포함하는, 세포 조성물의 제조 방법:
대상체로부터 수득한 생물학적 샘플 또는 그로부터 유래된 하나 이상의 샘플 내 CD62L-CCR7+CD4+ T 세포 및 CD62L-CCR7+CD8+ T 세포의 개수, 부피 당 개수, 중량 당 개수 및/또는 백분율을 결정하는 단계; 및
CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포를 포함하는 투입 세포 조성물을 생성하는 단계로서, 여기서 CD62L-CCR7+CD4+ T 세포 대 나이브-유사 CD8+ T 세포의 비율은 (약) 0.5:1 내지 2:1이고, 상기 투입 세포 조성물 내 비율은 대상체로부터의 생물학적 샘플 내 CD62L-CCR7+CD4+ T 세포 대 나이브-유사 CD8+ T 세포의 비율과 비교하여 조정 또는 변경되는 것인 방법. - 청구항 56 또는 57에 있어서, 재조합 수용체를 인코딩하는 핵산을 투입 세포 조성물 내 세포 내로 도입하는 조건하에서, 투입 세포 조성물과, 재조합 수용체를 인코딩하는 핵산 분자를 포함하는 시제와 접촉시키는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
- 다음의 단계를 포함하는, 세포 조성물의 제조 방법:
CD62L-CCR7+CD4+ T 세포를 포함하는 제1 세포 조성물과 CD62L-CCR7+CD8+ T 세포를 포함하는 제2 세포 조성물을 조합하여, 투입 세포 조성물을 제조하는 단계로서, 여기서 CD62L-CCR7+CD4+ T 세포 대 CD62L-CCR7+CD8+ T 세포의 비율은 (약) 0.5:1 내지 2:1인 단계.
재조합 수용체를 인코딩하는 핵산을 조성물 내 세포 내로 도입하는 조건하에서, 투입 세포 조성물과, 재조합 수용체를 인코딩하는 핵산 분자를 포함하는 시제와 접촉시키는 단계; 및
상기 접촉 단계 이전, 동안 및/또는 이후에 세포를 자극하는 단계로서, 이러한 자극 단계는 하나 이상의 자극 시제의 존재하에 세포의 인큐베이션을 포함하고, 자극 단계는 세포의 활성화 및/또는 증식을 초래하는 단계. - 청구항 58 또는 59에 있어서, CD62L-CCR7+CD4+ T 세포의 개수, 부피 당 개수, 중량 당 개수 및/또는 백분율, 및/또는 CD62L-CCR7+CD8+ T 세포의 개수, 부피 당 개수, 중량 당 개수 및/또는 백분율은 유세포 분석에 의해 결정되는 것인 방법.
- 청구항 57-60 중 어느 한 항에 있어서, CD62L-CCR7+CD4+ T 세포 대 CD62L-CCR7+CD8+ T 세포의 비율은 대상체로부터의 생물학적 샘플 내 CD62L-CCR7+CD4+ T 세포 대 CD62L-CCR7+CD8+ T 세포의 비율과 비교하여 조정되는 것인 방법.
- 청구항 57-61 중 어느 한 항에 있어서, 투입 세포 조성물은 CD62L-CCR7+CD4+ 세포 대 CD62L-CCR7+CD8+ 세포의 비율로 (약) 0.5:1 내지 1.5:1, 1:1 내지 2:1, 0.75:1 내지 1.5:1, 또는 0.8:1 내지 1.2:1을 포함하는 것인 방법.
- 청구항 57-62 중 어느 하나에 있어서, 투입 세포 조성물은 CD62L-CCR7+CD4+ 세포 대 CD62L-CCR7+CD8+ 세포의 비율로 (약) 1.2:1, 1.1:1, 1.0:1, 0.9:1, 또는 0.8:1을 포함하는 것인 방법.
- 청구항 2-9, 18-24, 26-33, 35-39, 41-48, 51-54, 57-58, 또는 61-63 중 어느 한 항에 있어서, 생물학적 샘플은 혈액, 혈장 또는 혈청 샘플이거나, 또는 이로부터 수득되는 것인 방법.
- 청구항 2-9, 18-24, 26-33, 35-39, 41-48, 51-54, 57-58, 또는 61-64 중 어느 한 항에 있어서, 생물학적 샘플은 전혈 샘플, 버피 코트 샘플, 말초 혈액 단핵구 세포 (PBMC) 샘플, 분별되지 않은 T 세포 샘플, 림프구 샘플, 백혈구 샘플, 성분채집 생성물, 또는 백혈구성분채집 생성물이거나, 또는 이를 포함하는 것인 방법.
- 청구항 2-9, 18-24, 26-33, 35-39, 41-48, 51-54, 57-58, 또는 61-65 중 어느 한 항에 있어서, 생물학적 샘플은 성분채집술 또는 백혈구성분채집술 샘플이거나, 또는 이로부터 수득되는 것인 방법.
- 청구항 2-9, 18-24, 26-33, 35-39, 41-48, 51-54, 57-58, 또는 61-66 중 어느 한 항에 있어서, 대상체는 인간 대상체인 것인 방법.
- 청구항 1-67 중 어느 한 항에 있어서, 투입 세포 조성물은 (약) 1 x 107 내지 5 x 109 개의 전체 세포 또는 전체 T 세포, (약) 5 x 107 내지 1 x 109 개의 전체 세포 또는 전체 T 세포, (약) 1 x 108 내지 5 x 108 개의 전체 세포 또는 전체 T 세포, 또는 (약) 2 x 108 내지 5 x 108 개의 전체 세포 또는 전체 T 세포, 또는 전술한 임의의 범위의 생존 집단을 포함하는 것인 방법.
- 청구항 1-68 중 어느 한 항에 있어서, 투입 세포 조성물은 적어도 (약) 1 x 108, 2 x 108, 3 x 108, 4 x 108, 또는 5 x 108 개의 전체 세포 또는 전체 T 세포 또는 전술한 임의의 범위의 생존 집단을 포함하는 것인 방법.
- 청구항 9-24, 33-39, 48-54, 59-69 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 자극 시제는 T 세포, CD4+ T 세포 및/또는 CD8+ T 세포를 활성화시킬 수 있고; TCR 복합체를 통해 신호를 유도할 수 있고; 및/또는 세포, CD4+ T 세포 및/또는 CD8+ T 세포의 증식을 유도할 수 있는 것인 방법.
- 청구항 9-24, 33-39, 48-54, 59-70 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 자극 시제는 TCR 복합체의 구성원에 결합하는, 선택적으로 CD3에 특이적으로 결합하는 1차 시제를 포함하는 것인 방법.
- 청구항 71에 있어서, 하나 이상의 자극 시제는 T 세포 공동자극 분자에 특이적으로 결합하는 2차 시제를 추가로 포함하는 것인 방법.
- 청구항 72에 있어서, 공동자극 분자는 CD28, CD137 (4-1-BB), OX40, 또는 ICOS로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
- 청구항 72 또는 청구항 73에 있어서, 1차 및 2차 시제로는 항체를 포함하며, 선택적으로 하나 이상의 자극제는 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체와의 인큐베이션을 포함하는 것인 방법.
- 청구항 9-24, 33-39, 48-54, 59-74 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 자극 시제는 고체 지지체, 선택적으로 비드의 표면상에 존재하는 것인 방법.
- 청구항 75에 있어서, 하나 이상의 자극 시제는 비드의 표면상에 존재하며 상기 비드는 상자성 비드인 것인 방법.
- 청구항 9-24, 33-39, 48-54, 59-76 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 자극 시제는 CD3-결합 분자; CD28-결합 분자; 재조합 IL-2; 재조합 IL-15; 및 재조합 IL-7, 항원 수용체에 의해 특이적으로 인식되는 항원을 포함하는 백신, 및 항원 수용체 또는 이의 조합에 특이적으로 결합하는 항-이디오타입 항체로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
- 청구항 9-24, 33-39, 48-54, 59-77 중 어느 한 항에 있어서, 인큐베이션은 2 내지 15 일, 2 내지 12 일, 2 내지 12 일, 2 내지 8 일, 2 내지 6 일, 2 내지 4 일, 4 내지 12 일, 4 내지 10 일, 4 내지 8 일, 4 내지 6 일, 6 내지 12 일, 6 내지 10 일, 6 내지 8 일, 8 내지 12 일, 8 내지 10 일, 또는 10 내지 12 일 동안 수행되는 것인 방법.
- 청구항 9-24, 33-39, 48-54, 59-78 중 어느 한 항에 있어서, 인큐베이션은 적어도 (약) 4 일, 6 일, 8 일, 10 일 또는 12 일 동안 수행되는 것인 방법.
- 청구항 7-24, 31-40, 46-55, 또는 59-79 중 어느 한 항에 있어서, 핵산 분자를 포함하는 시제는 바이러스 벡터이거나, 또는 트랜스포존인 것인 방법.
- 청구항 80에 있어서, 시제는 핵산 분자를 포함하는 시제는 바이러스 벡터이고 이러한 바이러스 벡터는 레트로바이러스 벡터인 것인 방법.
- 청구항 81에 있어서, 바이러스 벡터는 렌티바이러스 벡터 또는 감마레트로바이러스 벡터인 것인 방법.
- 청구항 7-24, 31-39, 46-54, 또는 58-82 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 수용체는 질병, 장애 또는 병태의 세포 또는 조직과 관련된, 이에 특이적인, 및/또는 이에 발현되는 표적 항원에 결합할 수 있는 것인 방법.
- 청구항 83에 있어서, 질병, 장애 또는 병태는 감염성 질병 또는 장애, 자가면역 질병, 염증성 질병, 또는 종양 또는 암인 것인 방법.
- 청구항 83 또는 청구항 84에 있어서, 표적 항원은 종양 항원인 것인 방법.
- 청구항 83-85 중 어느 한 항에 있어서, 표적 항원은 다음으로부터 선택되는 것인 방법: 수용체 타이로신 키네이스 유사 고아 수용체 1 (ROR1), B 세포 성숙화 항원 (BCMA), 탄산 무수화효소 9 (CA9, 또한 CAIX 또는 G250로도 알려짐), Her2/neu (수용체 타이로신 키네이스 erbB2), CD19, CD20, CD22, 메소텔린 (MSLN), 암배아 항원 (CEA), 및 B형 간염 표면 항원, 항-엽산 수용체, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44, 콘드로이틴 설페이트 프로테오글리칸 4 (CSPG4), EGFR, 상피 당단백 2 (EPG-2), 상피 당단백 40 (EPG-40), 에프린 수용체 A2 (EPHa2), Her3 (erb-B3), Her4 (erb-B4), erbB 이합체, III형 표피 성장 인자 수용체 돌연변이 (EGFR vIII), 엽산 결합 단백질 (FBP), Fc 수용체 유사 5 (FCRL5, 또한 Fc 수용체 동족체 5 또는 FCRH5로도 알려짐), 태아 아세틸콜린 수용체(태아 AchR), 강글리오사이드 GD2, 강글리오사이드 GD3, 인간 백혈구 항원 A1 (HLA-A1), 인간 백혈구 항원 A2 (HLA-A2), IL-22 수용체 알파 (IL-22Rα), 키네이스 삽입 도메인 수용체 (kdr), 카파 경쇄, 류신 풍부 반복 함유 8 패밀리 구성원 A (LRRC8A), Lewis Y, L1-세포 점착 분자 (L1-CAM), 흑색종-연관 항원 (MAGE)-A1, MAGE-A3, MAGE-A6, MAGE-A10, 우선적으로 발현되는 흑색종 항원 (PRAME), 서바이빈, 종양-연관 당단백 72 (TAG72), B7-H3, B7-H6, IL-13 수용체 알파 2 (IL-13Rα2), 인간 고분자량-흑색종-연관 항원 (HMW-MAA), CD171, 엽산 수용체-알파, CD44v7/8, αvβ6 인테그린 (avb6 인테그린), 8H9, 신경 세포 점착 분자 (NCAM), 혈관 내피 성장 인자 수용체 (VEGF 수용체 또는 VEGFR), 영양막 당단백 (TPBG 또한 5T4로도 알려짐), NKG2D 리간드, CD44v6, 이중 항원, 암-고환 항원, 쥐과 거대세포바이러스 (CMV), 뮤신 1 (MUC1), MUC16, 전립선 줄기 세포 항원 (PSCA), 전립선 특이적 멤브레인 항원 (PSMA), 자연 살해 그룹 2 구성원 D (NKG2D) 리간드, 암/고환 항원 1B (CTAG, 또한 NY-ESO-1 및 LAGE-2으로도 알려짐), 멜란 A (MART-1), 당단백 100 (gp100), 글리피칸-3 (GPC3), G 단백질 연결 수용체 5D (GPRC5D), 종양태아성 항원, TAG72, 타이로시나제 관련 단백질 1 (TRP1, 또한 TYRP1 또는 gp75로도 알려짐), 타이로시나제 관련 단백질 2 (TRP2, 또한 도파크롬 토토머라제, 도파크롬 델타-아이소머라제 또는 DCT로도 알려짐), 혈관 내피 성장 인자 수용체 2 (VEGF-R2), 암배아 항원 (CEA), 에스트로겐 수용체, 프로게스테론 수용체, 전립선 특이적 항원, 에프린B2, CD123, CD133, c-Met, O-아세틸화된 GD2 (OGD2), L1-CAM의 CE7 에피토프, Wilms 종양 1 (WT-1), 사이클린, 사이클린 A2, C-C 모티프 케모카인 리간드 1 (CCL-1), CD138, 병원체-특이적 항원 또는 병원체-발현 항원, 및 보편적인 표지와 관련된 항원, 및/또는 비오틴화된 분자, 및/또는 HIV, HCV, HBV 또는 다른 병원체에 의해 발현되는 분자.
- 청구항 7-24, 31-39, 46-55, 또는 58-86 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 수용체는 기능적 비-TCR 항원 수용체 또는 TCR 또는 이의 항원-결합 단편이거나, 또는 이를 포함하는 것인 방법.
- 청구항 7-24, 31-39, 46-55, 또는 58-86 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 수용체는 키메라 항원 수용체 (CAR)인 것인 방법.
- 청구항 88에 있어서, 키메라 항원 수용체는 항원에 특이적으로 결합하는 항원-결합 도메인을 포함하는 세포 외 도메인 및 ITAM을 포함하는 세포 간 신호전달 도메인을 포함하는 것인 방법.
- 청구항 89에 있어서, 항원-결합 도메인은 항체 또는 이의 항체 단편이거나, 또는 이를 포함하며, 선택적으로 단일 사슬 단편인 것인 방법.
- 청구항 89 또는 청구항 90에 있어서, 세포 내 신호전달 도메인은 CD3 사슬, 선택적으로 CD3-제타 (CD3ζ) 사슬의 세포 내 신호전달 도메인, 또는 이의 신호전달 부분이거나, 또는 이를 포함하는 것인 방법.
- 청구항 89, 90 및 91 중 어느 하나에 있어서, 세포 내 신호전달 영역은 공동자극 신호전달 영역을 추가로 포함하는 것인 방법.
- 청구항 92에 있어서, 공동자극 신호전달 영역은 T 세포 공동자극 분자의 세포 내 신호전달 도메인 또는 이의 신호전달 부분을 포함하는 것인 방법.
- 청구항 92 또는 청구항 93에 있어서, 공동자극 신호전달 영역은 CD28, 4-1BB 또는 ICOS의 세포 내 신호전달 도메인 또는 이의 신호전달 부분을 포함하는 것인 방법.
- 청구항 88-93 중 어느 한 항에 있어서,
CAR은, 순서대로, 항원에 특이적인 scFv, 막횡단 도메인, 공동자극 분자로부터 유도된 세포질 신호전달 도메인 (선택적으로 4-1BB이거나 이를 포함), 및 1차 신호전달 ITAM-함유 분자로부터 유도된 세포질 신호전달 도메인 (선택적으로 CD3제타 신호전달 도메인이거나, 이를 포함)을 포함하며, 선택적으로 막횡단 도메인과 scFv 사이의 스페이서를 추가로 포함하거나;
CAR은, 순서대로, 항원에 특이적인 scFv, 막횡단 도메인, 공동자극 분자로부터 유도된 세포질 신호전달 도메인 (선택적으로 4-1BB 신호전달 도메인이거나 이를 포함), 및 1차 신호전달 ITAM-함유 분자로부터 유도된 세포질 신호전달 도메인 (선택적으로 CD3제타 신호전달 도메인)을 포함하거나; 또는
CAR은, 순서대로, 항원에 특이적인 scFv, 스페이서, 막횡단 도메인, 공동자극 분자로부터 유도된 세포질 신호전달 도메인 (선택적으로 4-1BB 신호전달 도메인이거나 이를 포함), 및 1차 신호전달 ITAM-함유 분자로부터 유도된 세포질 신호전달 도메인 (선택적으로 CD3제타 신호전달 도메인이거나, 이를 포함)을 포함하는 것인 방법. - 청구항 2-9, 11-24, 26-33, 35-39, 41-48, 51-55, 57-58, 또는 61-95 중 어느 한 항에 있어서, 대상체는 질병 또는 병태를 가지며, 선택적으로 재조합 수용체는 질병 또는 병태의 세포와 연관된, 또는 발현된, 또는 세포 상에 존재하는 항원을 특이적으로 인식하거나, 또는 특이적으로 이에 결합하는 것인 방법.
- 청구항 1-96 중 어느 하나에 있어서, 재조합 수용체-발현 CD4+ T 세포 대 재조합 수용체-발현 CD8+ T 세포의 비율, 선택적으로 이의 생존 세포의 비율이, 상기 방법에 의해 제조된 복수의 T 세포 조성물 내 상기 비율의 평균으로부터 20% 미만 또는 10% 미만 또는 5% 미만으로 변하고 및/또는 이러한 평균으로부터 하나의 표준 편차 이하만큼 변하는 산출 조성물을 제조하는 것인 방법.
- 청구항 1-97 중 어느 하나에 있어서, 상기 방법은 재조합 수용체-발현 CD4+ T 세포 대 재조합 수용체-발현 CD8+ T 세포의 비율, 선택적으로 이의 생존 세포의 비율이, (약) 0.5:1 내지 2:1 또는 0.8:1 내지 1.6:1 또는 1:1 내지 1.5:1인 산출 조성물을 제조하는 것인 방법.
- 청구항 97 또는 청구항 98 중 어느 하나에 있어서, 산출 조성물 내 재조합 수용체-발현 CD4+ T 세포 대 재조합 수용체-발현 CD8+ T 세포의 비율, 선택적으로 이의 생존 세포의 비율은 (약) 1.2:1, 1.1:1, 1:1, 0.9:1, 또는 0.8:1인 것인 방법.
- 청구항 97-99 중 어느 하나에 있어서, 산출 조성물 내 재조합 수용체-발현 CD4+ T 세포 대 재조합 수용체-발현 CD8+ T 세포의 비율, 선택적으로 이의 생존 세포의 비율은 (약) 1:1인 것인 방법.
- 청구항 1-100 중 어느 한 항에 의해 제조된 산출 조성물.
- 청구항 101의 산출 조성물을 포함하는 것인 약제학적 조성물.
- 청구항 102에 있어서, 약제학적 담체를 추가로 포함하는 것인 약제학적 조성물.
- 포유동물 대상체에게, 청구항 1-100에 의해 제조된 산출 조성물 또는 청구항 102 또는 청구항 103의 약제학적 조성물을 투여하는 것을 포함하는 치료 방법.
- 청구항 104에 있어서, 세포는 세포가 투여되는 대상체로부터 유래하는 것인 방법.
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