KR100712256B1 - 가용성 단일쇄 ｔ-세포 수용체 단백질 - Google Patents

Abstract

본 발명은 완전히 가용성이고 기능성인 단일쇄 T-세포 수용체 단백질을 특징으로 한다. 한 측면에서, 본 발명은 단일쇄 T세포 수용체에 공유결합된 면역글로불린 경쇄 불변 영역 또는 그의 단편을 포함하고, 여기에서 단일쇄 T-세포 수용체는 펩타이드 결합 서열에 의해 V-β서열에 공유결합된 V-α쇄를 가용성 융합 단백질을 특징으로 한다. 단일쇄 T-세포 수용체는 원하는 MHC-펩타이드 복합체를 발현하는 세포를 검출하는 스크린에서의 용도를 포함하는 다양한 용도를 갖는다.

Description

가용성 단일쇄 Ｔ-세포 수용체 단백질{Soluble single-chain T-cell receptor proteins}

본 발명은 가용성 단일쇄 T-세포 수용체 단백질, 및 그러한 단백질을 제조 및 사용하는 방법에 관한 것이다. 단백질은 원하는 펩타이드-MHC 복합체를 발현하는 세포를 검출하기 위한 시험관내 스크린을 포함하는 다양한 적용에 유용하다.

T-세포 반응은 T-세포 수용체(TCR)에 결합하는 항원에 의해 조절된다. TCR의 한 유형은 면역글로불린 가변 영역(V) 및 불변 영역(C)을 닮은 α 쇄 및 β쇄로 구성되는 막에 결합된 헤테로다이머(heterodimer)이다. TCR α쇄는 공유결합된 V-α 및 C-α쇄를 포함하고, 반면에 β쇄는 C-β쇄에 공유결합된 V-β쇄를 포함한다. V-α 및 V-β쇄는 주요 조직 적합성 복합체(MHC)(인간에서 HLA 복합체라 알려진)에 관련한 초항원 또는 항원과 결합할 수 있는 포켓(pocket) 또는 갈라진 틈(cleft)을 형성한다(참조, 일반적으로 문헌[Davis Ann. Rev. of Immunology 3: 537(1985)]; 문헌[Fundamental Immunology 3rd. Ed., W. Paul Ed. Rsen Press LTD, New York(1993)]).

TCR은 면역 시스템의 발달 및 기능에 있어서 중요한 역할을 하는 것으로 믿어진다. 예를들어, TCR은 세포 사멸을 중재하고, B 세포 증식을 증가시키며, 암, 알레르기, 바이러스 감염 및 자가면역 질환을 포함하는 다양한 질환의 발달 및 심각성에 영향을 주는 것으로 보고되었다. 따라서, 상업적, 연구 및 의약 세팅에서 TCR을 수득하는 방법을 개발하는 것이 지대한 관심이었다.

일반적으로 말하자면, TCR은 상당한 양을 단리하기 어려웠다. 예를들어, 주된 장애 중 하나는 TCR 전달막 영역의 부재하에서 가용성 TCR을 생성하는 것이다. 보다 구체적으로, TCR α및 β쇄가 γ, δ, ε및 ζ쇄를 포함하는 CD3 복합체에 회합되지(assemble) 않으면, 단백질은 전형적으로 분해된다(참조, 예로 Shin et al.(1993) Science 259:1901).

막내외(transmembrane) 영역없이 가용성 TCR을 생산하려는 시도가 박테리아에서 종종 시도되어 왔다. 그러나, 박테리아 TCR 발현은 전형적으로 불용성이고 부적절하게 폴딩된 분자를 예시하는 봉입체(inclusion bodies)를 형성한다. 많은 경우에, TCR은 어려운 단백질 가용화 및 재-폴딩 단계후 이들 방법에 의해 수득될 수 있다. 이들 단계는 TCR 수율을 실질적으로 감소시키고 TCR 안정성 및 기능성에 부정적으로 영향을 끼친다.

가용성 TCR을 수득하기 위한 추가의 시도는 보다 가용성인 TCR 분자를 설계하는데에 촛점을 맞추었다. 예를들어, TCR을 포스파티딜리노시톨 연결 서열 및 CD3 쇄와 같은 다양한 단백질 및 폴리펩타이드 서열과 융합시켰다. 종종, 목표는 단백질 폴딩을 돕는 특정한 세포 구획에서 TCR을 발현시키는 것이었다. 세포 표면에서 발현되는 TCR 융합 단백질은 가용성 TCR을 얻으려는 시도에서 보통 통상적인 방법에 의해 절단된다. 그러나, 완전한 가용성과 기능성의 TCR은 보통 소량만이 생산된다(참조, Matsui, K.등의 문헌[(1991) Science 254, 1788(1991)]; Engel, I.등의 문헌[(1992) Science 256, 1318]; Lin, A.Y. 등의 문헌[(1990) Science 249, 677]).

가용성 TCR을 생산하려는 다른 시도에는 면역글로불린 불변 영역에 공유결합된 TCR V 쇄를 포함하는 헤테로다이머 TCR 분자의 합성이 있다. 예를들어, Gregoire, C.등은 문헌[(1991) PANS, 88, 8077]에서 카파 경쇄(C_k)의 C 영역에 연결된 C_α, V_α 서열을 포함하는 헤테로다이머 αβTCR 쇄의 분비를 보고했다. 이 문헌에는 또한 VβCβC_k 서열이 개시되어 있다(참조, Weber, S등의 문헌[1992) Nature, 356:793]).

헤테로다이머 TCR의 합성이 일부 경우에 가용성 발현을 향상시키는 것으로 보고되었지만, 이 방법은 실질적인 결점을 갖는다. 예를들어, 합성은 다중 단백질쇄를 올바르게 어셈블링해야 하는 특정화된 세포에 DNA의 공형질 감염을 종종 요구하였다. 이들 방법은 기능성 헤테로다이머 αβ TCR의 수율을 종종 실질적으로 감소시킨다.

중요하게는, C_k 쇄는 TCR 헤테로다이머 발현에 부정적으로 영향을 끼치는 것으로 보고되어 있다. 예를들어, C_k 쇄를 대체하는 것이 일부 경우에 TCR 헤테로다이머 결합가(valency)를 개선시킬 수 있다는 것이 제안되었다. 또한, C_k 영역을 포함하는 키메라 Vβ쇄를 처리하고, 분비하고/하거나 접는데에 특히 어려운 것으로 개시되었다(참조, 상기 Gregoire 등; Mariuzza, R.A. 및 Winter, G., (1989) 264:7310; Gascoigne, N.R.J. 등, PANS(USA)(1987), 84:2986).

완전한 가용성과 기능성의 TCR을 생산하려는 또다른 시도에는 TCR V 영역(즉, sc-TCRs)을 포함하는 단일쇄 단백질의 작제이다. 일반적으로 말하자면, sc-TCR이 융합된 V-α및 V-β쇄를 포함한다(참조, Novotny, J. et al. PNAS(USA)88, 8646(1991); Soo Hoo, W.F. et al. PNAS(USA)89, 4759(1992); Wulfing, C. and Plueckthun, A., J. Mol. Biol. 242, 655(1994); Kurucz, I. et al. PANS(USA) 90 3830(1993); PCT WO 96/13593; Ward, E.S. et al., J.Mol. Biol. 224, 885,(1992); and Schlueter, C.J. et al. J. Mol. Biol 256, 859(1996)).

그러나, sc-TCR을 생산하는 선행 방법은 종종 불용성이고 부적절하게 폴딩된 분자를 생성시킨다. 예를들어, 공개된 PCT 출원 WO 96/18105에는 일반적으로 불편한 단백질 재-폴딩 및 가용화 단계를 요구하는 sc-TCR을 발현하는 방법이 개시되어 있다. 이 방법은 전형적으로 허용될 수 없는 낮은 양의 sc-TCR을 생산한다(참조, 상기 Ward, E.S. 및 상기 Schluter).

sc-TCR을 개선시키기 위한 시도로 수개의 전략이 개발되었다. 이 전략은 세포 표면에서의 단백질 발현의 표적화 및 가용화 담체 단백질의 사용을 포함한다(참조, 공개된 PCT 출원 WO 96/18105 및 WO 96/13593). 그러나, 이들 방법에 의해 생상된 sc-TCR은 심지어 알맞은(modest) 양의 단백질을 얻는데 시간이 소모적인 조작을 필요로 한다.

시험관내 및 생체내에서 면역 시스템 분자들의 상호작용을 연구하는 것이 크 게 중요하였다. 그러므로, 상당한 양으로 쉽게 생산되는 가용성이 있고 완전한 기능성의 TCR 분자가 크게 요구되고 있다. 예를들어, TCR V 영역은 TCR 기능을 잠재적으로 조절할 수 있는 작은 분자(예, TCR 길항제 또는 작용제)를 위한 매력적인 표적을 제공한다. 따라서, 가용성이 있고 완전한 기능성의 sc-TCR 융합 단백질을 상당한 양으로 생산하는 편리한 방법이 요망되고 있다.

[발명의 요약]

본 발명은 가용성 단일쇄 T-세포 수용체 단백질, 예를들어 면역글로불린 경쇄 불변 영역에 공유결합하는 단일쇄 T-세포 수용체를 포함하는 융합 단백질에 관한 것이다. 단일쇄 T-세포 수용체에 면역글로불린 경쇄 불변 영역을 융합시키는 것은 예기치않게 가용성 발현을 용이하게 한다는 것이 밝혀졌다. 단일쇄 T-세포 수용체 단백질은 어려운 가용화, 절단 또는 재폴딩 단계를 수행함이 없이 상당한 양으로 분리될 수 있다.

본 발명의 단일쇄 T-세포 수용체(즉, sc-TCR) 단백질은 완전한 기능성과 가용성이 있다. 한 측면에서, sc-TCR 단백질은 면역글로불린 경쇄 불변 영역(즉, I_g-C_L)또는 적절한 I_g-C_L 단편에 융합된 공유결합된 TCR Vα 및 Vβ 쇄를 포함한다. 또다른 측면에서, sc-TCR이 융합된 I_g-C_L 쇄 또는 단편없이 제공된다. 본 발명의 sc-TCR 융합 단백질은 본 명세서에서 때로 "sc-TCR 융합 단백질", "가용성 융합 단백질" 또는 유사한 구(phrase)로 언급된다. 가용성 sc-TCR 단백질의 발현은 숙주 세포에서 불용성체(insoluble bodies)의 형성을 감소시켜, 단백질의 안정성 및 수율 을 상당히 증가시키고 정제의 용이를 향상시킨다.

sc-TCR 융합 단백질은 일반적으로 단일쇄인 V쇄에 공유결합된 I_g-C_L 쇄 또는 적절한 단편을 포함한다. V쇄는 V-α쇄가 일반적으로 펩타이드 결합(링커(linker)) 서열을 통해 V-β쇄에 연결된 Vα, β서열을 포함한다. 융합 생성물은 추가로 V-α 또는 V-β쇄를 통해 I_g-C_L 쇄 또는 적절한 I_g-C_L 단편에 공유결합된다. 그의 I_g-C_L 쇄 또는 단편은, 예를들어 본 명세서에서 제공된 것과 같은 펩타이드 결합 서열에 의해 단일쇄 V-서열로부터 이격될 수 있다.

일반적으로, I_g-C_L 쇄는 공지된 κ- 또는 λ-형 면역글로불린 경쇄 불변 영역이다. κ형 면역글로불린 경쇄 불변 영역은 종종 본 명세서에서 "C_κ 쇄"라고 언급되며, 반면에 λ-형 면역글로불린 불변쇄 경쇄 영역은 종종 "C_λ 쇄"라고 언급된다. 예를들어, 하기에 기술된 바와 같은 I_g-C_L 쇄는 C_κ 쇄 또는 그의 적절한 단편일 수 있다. 본 발명은 완전한 가용성과 기능성의 융합 단백질 및 상당한 양으로 sc-TCR 융합 단백질 또는 다양한 유용한 적용을 위해 그로부터 유도된 sc-TCR을 수득하는 방법을 제공한다.

일부 경우에, sc-TCR 분자는 I_g-C_L 쇄 또는 그의 단편에 융합됨이 없이 완전한 기능성과 가용성이 있다. 특히, 본 발명자들은 많은 sc-TCR 분자가 I_g-C_L 쇄 또는 그의 단편에 융합됨이 없이 발현될 수 있다는 것을 예기치않게 밝혀냈다. 본 발명은 따라서 I_g-C_L 쇄 또는 그의 단편에 융합되지 않은 sc-TCR 분자 및 상기 sc-TCR 분자를 제조하는 방법을 제공한다.

본 발명의 sc-TCR 단백질은 많은 중요한 잇점을 제공한다. 예를들어, 선행 실시는 일반적으로 상당량의 단백질이 수득되기 전에 TCR-관련된 단백질(예를들어, TCR 수용체, TCR 헤테로다이머, sc-TCR)을 예의 조작하는 것을 요구했다. 대조적으로, 본 발명의 sc-TCR 단백질은 상당한 양으로 수득될 수 있다. 예를들어, sc-TCR 융합 단백질은 sc-TCR 융합 단백질의 용해도, 수율 및 기능성에 긍정적으로 영향을 미치는 융합된 I_g-C_L 쇄 또는 적절한 I_g-C_L 단편을 포함한다. 따라서, TCR 및 sc-TCR과 예를들어 작은 분자(예, 합성 펩타이드, 약제등) 및 항원 제시 세포(APC)와의 상호작용의 분석은 본 명세서에서 제공된 가용성 융합 단백질의 사용에 의해 실행될 수 있다. 또한, 매우 다양한 sc-TCR 융합 단백질이 하기에서 보다 충분히 기술될 초항원 또는 APC와의 상호작용을 위해 제공될 수 있다.

또한, sc-TCR에 I_g-C_L 쇄 또는 적절한 I_g-C_L 단편의 융합은 하기 기술된 바와 같은 통상적인 면역학적 방법에 의해 융합 단백질의 검출 및 정제의 편리한 수단을 제공한다.

추가의 잇점이 sc-TCR 단백질을 코딩하는 하기 개시된 DNA 작제물에 의해 제공된다. 예를들어, 제공된 DNA 작제물의 일부는 원하는 sc-TCR을 코딩하는 또다른 세그먼트(segment)로 치환될 수 있는 카세트 포맷중의 sc-TCR을 코딩하는 DNA를 포함한다. DNA 작제물은 많은 TCR Vαβ서열과 충분히 조화되고 숙주세포에서 발현되어 상당한 양의 단백질을 제공하는 융합된 Ig-C_L 쇄 또는 Ig-C_L 단편을 코딩할 수 있다. 따라서, 본 발명은 연구, 의약 또는 상업적 용도로 완전한 가용성과 기능성의 sc-TCR를 실질적인 양으로 생산하는 방법을 제공한다.

본 발명의 sc-TCR 단백질은 시험관내 및 생체내에서 수많은 용도를 갖는다.

예를들어, sc-TCR 단백질은 TCR 리간드의 펩타이드 및 MHC/HLA 분자 성분과같은 리간드를 검출 및 분석하기 위하여 시험관내에서 사용될 수 있다. sc-TCR 단백질은 또한 병원성 성질을 갖는 T-세포의 검출과 같은 진단학적 목적으로 제공되어 사용될 수 있다. sc-TCR는 또한 기능성의 세포 및 분자 분석에서, 그리고 X-레이 결정학, 핵자기 공명 영상화, 컴퓨터 그래픽 디스플레이와 같은 컴퓨터 기법을 포함하는 구조 분석에서 이용될 수 있다. 특히 중요한 기술은 TCR과 MHC 복합체사이의 상호 작용을 조절하는 작은 분자의 동정에 쉽게 채택될 수 있는 공지된 기술이다. 관련된 기술은 TCR과 TCR 특이적 항체사이의 상호작용을 잠재적으로 차단하는 작은 분자의 스크리닝에 사용될 수 있다. 특히 시험관내에서 TCR 길항제를 검출하도록 설계된 스크린이 고려된다.

sc-TCR 단백질은 또한 생체내에서 중요한 용도를 갖는다. 예를들어, 이 단백질은 면역 관련된 질환 또는 질병에 관련되는 것과 같은 병원성 T-세포와 경쟁하기 위하여; 또는 T-세포의 표면상에 생기고 병원성 또는 다른 유해 기능을 수행하거나 다른 분자가 수행하는 것을 돕는 세포외 영역과 같은 TCR 구조에 대해 포유동물, 예를들어 인간을 면역화시키기 위하여 이용될 수 있다. 특히, sc-TCR 단백질은 하기 기술된 바와 같은 공지된 면역학적 방법에 따라 항체를 생성시키는데에 사용될 수 있다. 이 방법들에 의해 생성된 항체는 예를들어 원하는 항원을 인식하는 특이적 T-세포의 수를 억제하거나 감소시켜 생체내에서 면역 반응을 조절하도록 설계된 치료 전략에서 사용될 수 있다. 특이적으로 TCR 에피토프와 결합하는 모노클로날 항체는 병에 연관된 제한된 T-세포 서브셋 또는 개체군이 표적화되고 제거되거나 또는 실질적으로 수가 감소될 수 있도록 선택될 수 있다. 하기에서 보다 충분히 기술되는 바와 같이, sc-TCR 단백질 또는 그와 결합하는 항체가 비변형되거나, 원한다면 원하는 분자, 예를들어 약제, 독소, 효소 또는 방사성 물질에 때로 연결된 펩타이드 결합 서열을 통해 공유 결합될 수 있다.

또한, 본 발명의 sc-TCR 단백질은 시험관내에서 원하는 펩타이드-MHC 복합체를 발현시키는 APC를 스크린하는데에 사용될 수 있다. 보다 구체적으로는, 원하는 펩타이드-MHC 복합체를 포함하는 선택된 APC를 수득하고 확장시키는 수개의 세팅(settings)에서 유용하였다.

또한, sc-TCR 융합 단백질을 코딩하는 DNA 작제물을 1997년 3월 7일 출원된 계류중인 U.S. 출원 제 08/813,781호(이의 개시는 본 명세서에서 참고로 인용된다)에 기술된 방법에 따라 박테리오파지 디스플레이 라이브러리를 만드는데에 사용될 수 있다.

또한, sc-TCR 단백질은 잠재력 있는 초항원과 같은 펩타이드 결합 서열을 검출하기 위하여 시험관내에서 펩타이드 라이브러리를 스크린하는데에 사용될 수 있다.

본 발명은 또한 중요한 sc-TCR 단백질을 코딩하는 서열을 포함하는 핵산 세그먼트(RNA, mRNA, cDNA 또는 게놈 DNA)에 관한 것이다. 예를들어, 핵산 세그먼트 는 I_g-C_L 쇄 또는 적절한 I_g-C_L 단편에 공유결합된 원하는 sc-TCR을 코딩할 수 있다. sc-TCR을 코딩하는 핵산은 공개적으로 입수가능한 TCR 및 I_g-C_L 쇄 DNA 서열을 폴리머라제 연쇄 반응(PCR) 증폭을 포함하는 다양한 공급원으로부터 수득할 수 있다. 핵산 세그먼트는 적절한 진핵 또는 원핵 세포 발현 시스템에서 sc-TCR 단백질을 발현할 수 있는 DNA 벡터로서 제공될 수 있다. 세그먼트는 원하는 세포 발현 시스템에서 가용성 sc-TCR 단백질의 발현을 구동시키는(drive) 프로모터, 리더, 전사 개시 서열과 같은 작동가능하게(operably) 연결된 전사 요소를 포함할 수 있다. 별도로, DNA 벡터 자체가 조절 요소의 일부 또는 전부를 제공할 수 있다.

sc-TCR 단백질을 코딩하는 핵산 세그먼트는 종종 천연의 TCR 조절 요소가 제거되도록 작제될 수 있다. 그러나, 일부 경우에 본 분야에서 알려진 것과 같은 면역글로불린 프로모터 및/또는 인핸서로 TCR 단백질의 발현을 구동시키는 것이 바람직할 수 있다. 본 발명의 핵산 세그먼트에 의해 코딩되는 I_g-C_L 쇄 또는 적절한 I _g-C_L 단편은 종종 가용성 융합 단백질이, 전형적으로 포유동물 세포에서, RNA 스플라이싱(splicing)을 수행할 수 있는 세포형에서 발현되는 경우 인트론 및 엑손 서열을 포함한다. 원핵세포에서 sc-TCR 융합 단백질을 발현시키는 것을 원하는 경우, 인트론은 발현을 최대화시키기 위하여 제거되거나 크기가 실질적으로 감소될 수 있다. 하기에서 보다 충분히 기술되는 바와 같이, 다양한 I_g-C_L 쇄 또는 그의 적절한 단편은 원하는 바와 같이 sc-TCR 분자에 융합될 수 있으며, 단 발현된 sc-TCR 융합 단백질이 하기 기술된 분석에 의해 결정된 바와 같이 완전한 가용성과 기능성이 있 다.

특히 I_g-C_L 쇄 또는 그의 단편이 없이 sc-TCR 분자를 코딩하는 핵산 세그먼트 또는 그를 함유하는 벡터가 제공된다.

또한, 본 명세서에서 개시된 가용성 sc-TCR 단백질을 분리하는 방법이 제공된다. 이들 방법은 일반적으로 융합 단백질을 발현시킬 수 있는 세포로 원하는 핵산 세그먼트 또는 그를 함유하는 벡터를 도입시키는 것을 포함한다. 세그먼트 또는 벡터를 포함하는 숙주 세포를 세포 증식을 지지할 수 있는 배지에서 배양한다. 숙주 세포는 가용성 형태로 가용성 융합 단백질을 발현시킬 수 있는 진핵세포, 바람직하게는 포유동물 세포일 수 있다. 그러나, 일부 경우에 박테리아내에서 가용성 융합 단백질을 발현시키는 것이 바람직할 수 있다. 하기에서 보다 상세히 설명되는 바와 같이 가용성 sc-TCR을 발현하는 박테리아 세포는 느린 유도(induction) 조건하에서 배양될 수 있다. 느린 유도 조건은 일반적으로 필수 영양분이 배지로부터 수시간에 걸쳐 고갈되어 상당한 양으로 sc-TCR 단백질의 가용성 발현을 유도하는 세포 성장 조건을 언급한다. 따라서, 이러한 경우에 느린 유도 조건하에서 발현을 최대화하도록 박테리아 발현 벡터를 설계하는 것이 바람직하다. 진핵 또는 원핵 세포에서 발현되는 가용성 sc-TCR 단백질은 원하는 경우 실질적으로 순수한 sc-TCR 융합 단백질을 생산하기 위해 정제될 수 있다.

본 발명은 특히 융합된 I_g-C_L 쇄 또는 단편이 없이 sc-TCR 분자를 분리하는 방법을 제공한다. 이 방법은 일반적으로 포유동물 세포에 sc-TCR을 코딩하는 DNA 단편 또는 그를 포함하는 벡터를 도입시키고, 포유동물 세포를 sc-TCR의 발현을 허용하는 조건하에서 적절한 배지에서 배양시키며, sc-TCR을 포유동물 세포 또는 배지로부터 정제하여 sc-TCR 수용체를 단리하는 것을 포함한다.

본 발명은 또한 본 발명의 가용성 sc-TCR 단백질을 코딩하는 서열을 포함하는 벡터 또는 핵산 세그먼트를 분리하는 방법을 포함한다. 일반적으로, 이 방법은 벡터 또는 핵산 세그먼트를 숙주세포, 바람직하게는 포유동물 세포에 도입하고, 그세포를 배양하며, 숙주세포로부터 융합 단백질을 정제하여 실질적으로 순수한 융합 단백질을 수득하는 것을 포함한다. 벡터 또는 핵산 세그먼트는 이어서 표준 방법에 의해 실질적으로 순수한 형태로 단리된다. 전형적으로, 벡터 또는 세그먼트는 DNA이다.

일부 경우에, 가용성 sc-TCR 단백질은 하나이상의 융합된 주효인자 (effactor) 또는 태그(전형적으로 하나 또는 두개)를 포함한다. 예를들어, 일부 경우에 태그는 전형적으로 융합 단백질을 수반하는 천연 세포 성분으로부터 sc-TCR 단백질을 정제하는 것을 돕는데에 사용될 수 있다. 다른 경우에, 단백질 태그는 가용성 단백질에 미리-예정된 화학적 또는 단백질 절단 부위를 도입시키기 위하여 사용될 수 있다. 특히, 원한다면 태그를 코딩하는 세그먼트를 DNA 벡터에, 예를들어 가용성 융합 단백질을 코딩하는 서열과 I_g-C_L 쇄 또는 적절한 단편사이에 도입하여 sc-TCR 분자가 I_g-C_L 쇄 또는 단편으로부터 절단될수 있도록(즉, 분리) 하는 것이 고려된다.

특히, 진단 또는 영상화 연구에 적절한 세포 독소 또는 검출가능하게-표지된 원자 또는 화합물인 주요 인자를 포함하는, 융합된 I_g-C_L 쇄 또는 단편이 없는 가용성 sc-TCR 융합 단백질 및 sc-TCR 분자가 제공된다. sc-TCR 융합 단백질 및 sc-TCR 분자는 생체내에서 세포 또는 조직을 검출 및/또는 영상화하는 것 및 시험관내 및 생체내에서 세포에 손상을 일으키거나 사멸시키는 것을 포함하는 다양한 적용에서 사용될 수 있다. 일반적으로, 표적화 세포 또는 조직은 sc-TCR과 선택적으로 결합할 수 있는 하나이상의 리간드를 포함한다. 예시적인 세포에는 흑색종과 같은 종양 세포 및 바이러스-감염된 세포(예, 시토메갈로바이러스 또는 AIDS 바이러스와 같은 영장류(primate) DNA 또는 RNA 바이러스로 각각 감염된 세포)가 있다.

포유동물과 같은 동물에서 바람직하지 않은 면역 반응은 하나 또는 조합된 별도 전략에 따라 바람직하지 않은 면역 반응이 감소되거나 제거될 수 있다. 일반적으로, 본 발명은 약제학적으로 허용되는 제제중의 유효량의 sc-TCR 단백질을 제공하여 포유동물에서 면역 반응을 감소시키거나 제거하는 치료 방법을 제공한다. 별도로, 가용성 융합 단백질의 sc-TCR 부분이 치료 방법에서 사용될 수 있다. 일반적으로, sc-TCR 융합 단백질 또는 sc-TCR은 리간드(예, 항원)에 대해 하나이상의 TCR, 특히 병원성 T-세포와 결합된 TCR과 경쟁할 수 있는 것이다.

본 발명은 또한 여기에서 제공된 sc-TCR 단백질의 특이적 결합 친화성을 증가시키기 위한 방법을 제공한다. 예를들어, 계류중인 U.S. 출원 제 08/813,781 호에는 상응하는 TCR(즉, sc-TCR 융합 단백질의 Vαβ 쇄를 천연적으로 포함하는 TCR)보다 항원에 비해 약 2 내지 10배 큰 특이적 결합 친화성을 나타내는 sc-TCR" 뮤테인(muteins)을 만드는 방법이 개시되어 있다. 이 방법은 일반적으로 하나이상의 미리-예정된 아미노산 돌연변이가 분자내에 도입되어 특이적 결합을 개선하도록 sc-TCR 분자의 표준 올리고뉴클레오타이드-지시된(directed) 프라이머 돌연변이 유발을 사용하는 것을 포함한다. 개시된 sc-TCR 뮤테인은 시험관내 및 생체내에서 즉, 원하지 않는 면역 반응에 관련된 T-세포의 억제 또는 제거에서 특히 유용하다. 상기 계류중인 U.S. 출원에서 개시된 방법은 원하는 대로 본 발명의 sc-TCR 융합 단백질 및 sc-TCR 분자의 특이적 결합을 개선시키는데에 쉽게 채택될 수 있다.

또한 본 발명은 TCR에 특이적으로 결합하는 항체(폴리클로날, 모노클로날 또는 키메라)를 만드는 방법을 특징으로 한다. 이 방법은 일반적으로 면역원으로서 sc-TCR 단백질의 실질적으로 정제된 샘플을 사용하는 것을 포함한다. 일부 경우에, 예를들어 면역학적으로 반응성인 I_g-C_L 쇄 또는 단편에 대해 면역학적 거부를 최소화시키기 위하여, 면역원으로서 sc-TCR 분자를 사용하는 것이 바람직할 것이다. 예시적인 항체는 통상적인 하이브리도마 조작에 의해 수득되는 모노클로날 항체이다. 항체는 또한 sc-TCR의 하나이상의 에피토프를 포함하는 면역원성 펩타이드로부터 생성될 수 있다. 이러한 항체는 혈액, 혈청 또는 조직 종(specimen)과 같은 생물학적 샘플에서 병원성 T-세포를 검출하는 것을 포함하는 다양한 적용에서 유용하다. 앞서 언급된 바와 같이, 항체는 특히 표적화된 T-세포와 항원 또는 MHC/HLA 펩타이드 복합체사이의 상호작용을 감소시켜 생체내 및 시험관내에서 표적화된 T-세포의 활성을 고갈시키거나 억제하는데에 사용될 수 있다. 일부 세팅에서는 적절한 세포독성, 항대사, 또는 검출가능한 표지를 본 분야에 공지된 방법으로 항체에 공유적으로 부착시키는 것이 유용할 수 있다.

본 발명은 또한 sc-TCR 융합 단백질로부터 제조된 sc-TCR을 포함하여 유효량의 sc-TCR 단백질 또는 sc-TCR 분자를 포유동물에 투여하여 포유동물, 특히 인간과 같은 영장류에서 면역 반응을 유도하는 방법에 관한 것이다. sc-TCR 융합 단백질을 면역 반응을 유도하기 위하여 사용되는 경우, I_g-C_L 쇄 또는 단편 하플로타입 (haplotype)이 사용된 숙주와 조화될 수 있는 것이 바람직하다. 이들 면역원으로 T-세포(즉, 표적화된 T-세포)의 표면에 생성되고, 병원성 또는 달리 바람직하지 않은 면역 반응에 관련되는 TCR 항원 구조에 대해 포유동물을 면역화시키는 것이 가능하다. 이러한 T-세포는 통상적인 방법에 의해 동정될 수 있고, 원한다면 정제화되어 증식을 겪는 능력에 대해 분석될 수 있다. T-세포를 동정하고, 정제하며, 분석하는 방법이 하기 기술된다.

원하는 증식 반응을 나타내는 T-세포는 핵산이 단리되어 sc-TCR 융합 단백질을 생산하기 위하여 사용될 수 있는 배양된 세포주로 설정될 수 있다. 중요한 표적 TCR 항원 구조는 전형적으로 클로노타입 에피토프, V-α또는 V-β계(family)-특이적 에피토프, 배좌 에피투프, 및 선형 에피토프이다. TCR 항원 구조에 대한 면역화는 일반적으로 T-세포 활성을 억제하여, T-세포의 병원성 또는 바람직하지 않은 효과를 감소시키거나 제거한다. 포유동물은 전형적으로 면역학적 유효량이고(즉, 상당한 항체 역가(titre)를 생성할 수 있는) 약제학적으로 허용되는 혼합물인 sc-TCR 또는 sc-TCR 융합 단백질을 투여하여 표적화된 T-세포가 숙주 면역시스템으로부터 고갈되거나 제거된다.

또한, TCR을 특이적으로 결합시킬 수 있는 작은 분자를 검출하기 위한 분석이 고려된다. 일반적으로, 분석은 본 발명의 sc-TCR 단백질이 고체 지지체(예, 미세 적정 플레이트)에 결합되고 sc-TCR과 작은 분자사이의 특이적 결합에 유리한 조건하에서 중요한 작은 분자와 함께 배양되는 시험관 스크린이다. 예를들어, 중요한 sc-TCR 또는 sc-TCR 융합 단백질은 TCR V 영역을 특이적으로 결합시키는 작은 분자를 검출하고 분리하는 잘 알려진 패닝형(panning-type) 스크린에서 사용될 수 있다. 일부 경우에 I_g-C_L 또는 적절한 I_g-C_L 또는 단편이 고체 지지체에 결합되어 지지체와 sc-TCR V 영역사이의 방해를 최소화시키도록 sc-TCR 융합 분자를 사용하는 것이 바람직하다.

특히 초항원 또는 펩타이드 복합체와 TCR사이의 특이적 결합을 억제할 수 있는 작은 분자를 검출하는 스크린이 고려된다. 대체로 말해서, 스크린은 가용성 융합 단백질이 특이적 결합 복합체를 형성하도록 허용하는 조건하에서 본 발명의 sc-TCR 단백질이 작은 분자 및 초항원 또는 펩타이드-MHC 복합체와 함께 배양되는 시험관내 분석을 포함한다. 별개의 대조군 반응에서, 가용성 융합 단백질은 같은 배양 조건하에서 초항원 또는 펩타이드-MHC 복합체와 함께 배양된다. 이어서 초항원 또는 펩타이드-MHC 복합체와 sc-TCR사이의 특이적 결합을 억제할 수 있는 리간드가 통상적인 단백질 결합 분석 기술에 따라 선택된다.

또한, 조합형 화학에 의해 생성된 리간드를 검출하는 스크린이 고려된다. 예를들어, 한 분석에서, 중요한 sc-TCR 분자가 고체 지지체에 결합되어 제 1 의 공지된 리간드, 예를들어 초항원, 및 표준 조합 화학에 의해 생성된 제 2 리간드 계 열과 함께 혼합된다. 예시적인 제 2 리간드 계열은 전형적으로 하나의 미리 결정된 아미노산에서 다른 펩타이드의 풀(pool)이다. 이어서 배양 조건은 제 1 리간드와 sc-PCR 단백질사이의 특이적 결합에 유리한 조건하에서 수행된다. sc-TCR 단백질과 제 1 리간드사이의 상호작용을 효과적으로 차단하는 제 2 리간드 계열의 펩타이드가 표준방법에 따라 검출되고 분리될 수 있다. 이러한 스크린에 의해 검출된 리간드는 치료조성물 및 시험관내 및 생체내에서 APC 검출에서의 사용을 포함하는 다양한 용도를 갖는다.

본 명세서에서 언급된 모든 문헌은 전체로 본 명세서에서 참고로 인용된다. 하기 비제한적 실시예는 본 발명을 예시한다.

도 1A 및 도 1B는 pJRS149(1A) 및 pKC12.2(1B) 벡터를 나타내는 도면이고,

도 2는 다양한 DNA 벡터 구조의 개요를 도시한 플로우 차트이며,

도 3은 pKC12.2로부터 pKC45, pKC46(pSUN18) 및 pKC51 DNA 벡터 작제의 개요를 도시한 플로우 차트이고,

도 4는 PEN2 DNA 벡터를 도시하는 도면이며,

도 5는 pKC60 및 pKC67 DNA 벡터의 삽입물을 보여주는 도면이고,

도 6(6A-6G)은 하기 기술된 DNA 벡터를 작제하는데에 사용되는 DNA 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 보여주는 표이며; 도 6A(SEQ ID NOs.: 1-16), 도 6B(SEQ ID NOs: 17-30), 도 6C(SEQ ID NOs:31-45), 도 6D(SEQ ID NOs. 46-63), 도 6E(SEQ ID NOs: 64-79), Fig.6F(SEQ ID NOs: 80-95), Fig 6G(SEQ Id NOs:96-100),

도 7은 sc-TCR 융합 단백질의 V-β쇄를 작제하는데에 사용되는 DNA 올리고뉴클레오타이드 프라이머(SEQ ID NOs.: 101-115)를 보여주는 표이고,

도 8은 sc-TCR 융합 단백질의 V-β 쇄를 작제하는데에 사용되는 DNA 올리고 뉴클레오타이드 프라이머를 보여주는 표이며,

도 9A 및 9B는 (9A)pKC60-m, pKC67-m, pKC73-m, pKC74-m, pKC75-m, 및 (9B)pNAG1-m 및 pNAG3-m의 삽입물을 보여주는 도면이고,

도 10은 sc-TCR 융합 단백질을 포함하는 포유동물 DNA 발현 벡터를 보여주는 도면이며, sc-TCR을 코딩하는 DNA 삽입물("sc-TCR 변형체")은 마우스카파 인트론 및 아우스 카파 엑손에 융합되어 있고,

도 11(도 11a 및 11b를 포함)은 sc-TCR 융합 단백질을 작제하는데에 사용되는 DNA 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 보여주는 표(SEQ.ID NOs. 7, 10, 60, 75, 131-145)이며,

도 12는 중국산 햄스터 난소(CHO) 세포에서 생성된 sc-TCR(D011.10)을 보여주는 웨스턴 블로트이고,

도 13은 정제된 sc-TCR(D011.10) 카파 융합 단백질의 웨스턴 블로트이며,

도 14는 정제된 sc-TCR 카파 융합 단백질의 염색을 예시하는 쿠마시 브릴리언 블루(Commassie Brillian Blue)로 염색된 SDS-PAGE 겔이고,

도 15는 세개-도메인 sc-TCR-카파 융합 단백질 및 네개-도메인 sc-TCR 카파 융합 단백질의 전이적 발현을 보여주는 웨스턴 블로트이며,

도 16은 sc-TCR(D011.10) 카파 융합 단백질 변형체의 전이적 발현을 보여주 는 ELISA 분석의 그래프이고,

도 17은 scTCR(p-149) 카파 융합 단백질의 포유동물 세포 발현을 묘사하는 샌드위치 ELISA 분석의 그래프이며,

도 18은 p149 sc-TCR 및 p149 sc-TCR 카파 융합 단백질의 전이적인 포유동물 세포 발현의 그패프이다.

상기 요약된 바와같이, 본 발명자들은 완전한 가용성과 기능성의 sc-TCR 단백질을 만들어 사용하는 것이 가능하다는 것을 밝혀냈다. 예를들어 I_g-C_L 쇄 또는 적절한 I_g-C_L 단편을 sc-TCR 분자에 공유결합시켜 sc-TCR 분자의 가용성 발현을 실행하는 것이 가능하다. 일반적으로 말해서, sc-TCR 단백질은 단일쇄 펩타이드 결합 서열에 의해 V-β쇄에 공유결합된 V-α쇄를 포함한다. sc-PCR 단백질은 V-α 또는 V-β쇄에 융합된 I_g-C_L 쇄 또는 적절한 쇄 단편을 포함한다. I_g-C_L 쇄 또는 단편의 융합은 다양한 세포에서 완전한 기능성 sc-TCR의 가용성 발현을 향상시킨다.

일반적으로, 본 sc-TCR 단백질의 제조는 본 명세서에 개시된 과정 및 인지된 재조합 DNA 기술에 의해 달성될 수 있다. 예를들어, 플라스미드 DNA의 제조, 제한 효소에 의한 DNA 절단, DNA의 연결, 세포로 DNA의 도입, 세포배양, 및 발현된 단백질의 단리 및 정제가 공지된 기술이다(참조, Sambrook et al. in Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed. 1989); and Ausubel et al. (1989), Current Protocols in molecular Biology, John Wiley & Sons, New York).

sc-RCR 분자의 일반적인 구조 및 그의 제조 및 사용 방법은 계류중인 U.S. 출원 제 08/813,781 호에 개시되어 있다.

간략히 말해서, sc-TCR 분자는 적절한 펩타이드 결합 서열을 통해 공유결합된 V-α및 V-β쇄를 포함한다. 예를들어, V-α쇄는 V-β쇄에 V-α쇄의 C-말단 및 V-β쇄의 N-말단에 융합된 적절한 펩타이드 결합 서열을 통해 공유결합될 수 있다. sc-TCR 융합 단백질의 V-α및 V-β쇄는 일반적으로 길이가 약 200 내지 400개의 아미노산, 바람직하게는 길이가 약 300 내지 350개의 아미노산이고, 천연 TCR의 V-α 및 V-β쇄에 적어도 90%, 바람직하게는 100% 동일하다. 용어 "동일"은 V-α또는 V-β의 아미노산이 상응하는 천연적인 TCR V-β또는 V-α쇄에 100% 동종성인 것을 의미한다.

sc-TCR 분자의 V-α쇄는 또한 V-β쇄의 C-말단에 융합된 C-β쇄 또는 그의 단편을 포함할 수 있다. 또한, V-α쇄는 V-α쇄의 C-말단 및 펩타이드 결합 서열의 N-말단에 융합된 C-α 쇄 또는 그의 단편을 포함할 수 있다. 일반적으로, C-β쇄 단편을 포함하는 융합 단백질에서, 단편은 대략 50 내지 126개 아미노산의 길이를 갖고 127위치에 있는 마지막 시스테인 잔기를 보통 포함하지 않는다. C-α쇄를 포함하는 융합 단백질 경우, 길이는 대략 1 내지 90개의 아미노산(즉, 마지막 시스테인까지이나, 이를 포함하지 않는 C-α쇄)으로 달라질 수 있다. 예를들어, 한 구체예에서, 융합 단백질은 아미노산 1로부터 출발하여 72까지의 약 1 내지 72개사이의 C-α쇄 단편을 포함한다. 또다른 구체예에서, C-α쇄 단편은 제 1 아미노산으로부터 22(류신)까지의 약 1 내지 22 아미노산사이이다. C-α쇄 단편은 전형적으로 두개의 시스(cys) 잔기를 포함하는 C_κ90 변형체외에는 어느 시스테인 잔기도 포함하지 않는다. 완전 가용성 및 기능성의 단백질의 발현을 실행하기 위하여, I_g-C_L 쇄 또는 적절한 I_g-C_L 단편은 sc-TCR 분자, 예를들어 V-β 쇄 또는 C-β 단편의 C-말단에 공유결합된다. 전형적으로 바람직한 것은 아니지만, I_g-C_L 또는 그의 단편을 V-α쇄의 N-말단에 공유결합시키는 것이 가능하다. 대부분의 경우에, Cα 및 Cβ 쇄 길이의 선택은 선택된 특정 V 쇄 및 가용성 융합 분자의 사용목적을 포함하는 수개의 파라미터에 좌우된다.

본 발명의 추가의 sc-TCR 단백질은 예를들어 두개의 펩타이드 결합 서열을 포함하고, 여기에서 첫번째 펩타이드 결합 서열이 V-α쇄의 C-말단과 V-β쇄의 N-말단사이에 융합된다. V-β쇄의 C-말단은 C-β쇄 단편의 N-말단에 융합될 수 있다. 이어서 두번째 펩타이드 결합는 V-β쇄 또는 C-β쇄 단편의 C-말단 및 예를들어 I_g-C_L 쇄 또는 I_g-C_L 쇄 단편 또는 주효인자 또는 태그 분자의 N-말단에 융합된다.

다른 예시적 구체예에서, sc-PCR 단백질은 적절한 펩타이드 결합를 통하여 V-β쇄 또는 그의 C-β쇄 단편의 C-말단 및 V-α쇄의 N-말단이 공유결합되는 V-α쇄에 V-β쇄를 융합시켜 만들어질 수 있다. I_g-C_L 쇄 또는 단편이,일반적으로 C-말단에서의 결합이 바람직하지만, 원하는대로 분자의 C- 또는 N-말단에 공유결합될 수 있다.

본 발명에 따른 scTCR 단백질은 하나이상의 융합된 단백질 태그를 포함할 수 있다. 예를들어, 가용성 융합 단백질에 관련해서, 단백질 태그는 sc-TCR V-β쇄(또는 C-β쇄 단편)의 C-말단 및 I_g-C_L 쇄 및 I_g-C_L 쇄 단편의 N-말단에 융합될 수 있다. sc-TCR 융합 단백질은 예를들어 두개의 단백질 태그를 포함할 수 있고, 여기에서, 첫번째 태그는 V-β쇄(또는 C-β쇄 단편)의 C-말단 및 I_g-C_L 쇄 또는 단편의 N-말단에 융합되고, 두번째 단백질 태그(같거나 다르다)는 I_g-C_L 쇄 또는 단편의 C-말단에 융합된다. 별도로, 단일 단백질 태그는 I_g-C_L 쇄 또는 단편의 C-말단에 융합될 수 있다.

V-α쇄의 N-말단에 융합된 하나이상의 단백질 태그를 포함하는 융합과 같은 다른 sc-TCR 융합 단백질이 고려된다.

sc-TCR 단백질의 펩타이드 결합 서열은 전형적으로 sc-TCR 분자가 천연적인 TCR V-α및 V-β쇄의 것과 닮은 결합부위를 형성하도록 선택된다. 대부분의 경우에 V 쇄는 병리학, 예를들어 면역 관련된 질환 또는 질병과 관련된 것이지만 비유도된 T-세포로부터 유래될 수 있다.

보다 구체적으로, Vα,β쇄를 분리하는 펩타이드 결합 서열은 V-쇄를 원하는 항원과 같은 리간드와 특이적으로 결합할 수 있는 포켓에 융통성 있게 위치시킨다. 예를들어, sc-TCR 융합 단백질에 결합하는 리간드는 하기 기술된 분석에서 측정된 바와 같이 T-세포 활성을 조절하는데에 사용될 수 있다. 이러한 분석의 예는 TCR을 발현하는 T-세포를 배양하고, TCR과 리간드사이에 결합을 가능하게 하는 조건하에서 T-세포와 sc-TCR 단백질(또는 그로부터 수득된 sc-TCR)을 접촉시키며, 이어서 가용성 융합 단백질이 T-세포의 활성을 조절할 수 있는 가를 평가하는 연속적 단계들을 포함하는 시험관내 분석을 포함한다. sc-TCR 분자에의 I_g-C_L 쇄 또는 I_g-C_L쇄 단편의 융합은 sc-TCR의 가용성 발현을 실행하고 세포 배지와 같은 수성 용액에서 sc-TCR 완전성을 유지하여 일부 세팅에서 분석 성능을 증가시킬 수 있다.

상기 언급된 바와 같이, 본 발명의 sc-TCR 융합 단백질은 예를들어 sc-TCR 분자의 C-말단에 결합된, 공유 결합된 I_g-C_L 쇄 또는 적절한 I_g-C_L 쇄 단편을 포함한다. 한 구체예에서, sc-TCR 융합 단백질은 융합된 포유동물 I_g-C_L 쇄, 바람직하게는 Cκ쇄와 같은 완전길이의 쥐 또는 인간 I_g-C_L 쇄를 포함한다. 수개 I_g-C _L 쇄의 핵산 및 단백질 서열이 개시되었다(참조, 예를들어, Fundamental Immunology, (1993) 3rd Edi, W. Paul. Ed. Rsen Press Ltd. New York, and Kabat, E.A., et al., (1991) Sequence of Proteins of Immunological Interest(5th Ed.) Public Health Services, National Institutes of Health).

용어 I_g-C_L 쇄는 또한 개시된 완전 길이의 서열로부터 하나이상의 아미노산 치환 또는 부가에 의해 변한 면역글로불린 경쇄 불변 영역을 포함한다. 예를들어, 아미노산이 예를들어 통상적인 재조합 방법에 의해 쇄의 한쪽 말단 또는 양쪽 말단에서 개시된 I_g-C_L 쇄 서열에 첨가될 수 있다. 또한, 재조합 방법은 원한다면 쇄중의 소정의 아미노산을 치환하는데에 사용될 수 있다. 일반적으로, 아미노산 부가 는 약 1 내지 30개사이의 중성 또는 친수성 아미노산, 바람직하게는 약 1 내지 10개사이의 아미노산을 포함한다. I_g-C_L 쇄에서 또다른 아미노산을 치환한 아미노산은 보존적(conservative) 또는 비보존적 아미노산 대체이다. 따라서, I_g-C_L 쇄 서열에서 페닐알라닌으로 치환된 티로신 아미노산은 보존적 아미노산 치환의 예이고, 반면에 알라닌으로 치환된 아르기닌은 비-보존적 아미노산 치환을 나타낸다. I_g-C_L 쇄 단편에 대해 하기 지적된 바와 같이, 융합된 I_g-C_L 쇄를 포함하는 sc-TCR 융합 단백질은 완전한 가용성과 기능성이 있다.

또한, 하기에 특정하게 개시된 바람직한 I_g-C_L 쇄에 대한 아미노산 치환 또는 부가는 본 발명의 범위안에 든다.

일부 경우에, 쥐 또는 인간 C_κ쇄 단편을 사용하는 것이 유용하다. 예를들어, 적절한 I_g-C_L 쇄 단편을 융합 단백질의 분자량을 최소화시키는 것이 바람직할 때 sc-TCR 분자에 융합시킬 수 있다. "적절한 I_g-C_L 쇄 단편"이란 구 또는 관련 용어는 원하는 sc-TCR 분자에 융합되었을 때, 하기 정의된 바와같이 완전한 가용성과 기능성의 sc-TCR 융합 단백질을 형성하는 I_g-C_L 단편을 의미한다. 원하는 I_g-C_L 쇄 단편(모두 C_κ 및 C_λ형)을 표준 재조합 방법, 예를들어 쥐 또는 인간 C_κ 또는 C_λ 쇄 단편의 PCR 증폭 및 이어서 PCR 생성물을 원하는 sc-TCR 분자를 코딩하는 DNA 세그먼트 또는 벡터에 결합시켜 만들 수 있다. 하기에 언급된 바와 같이 PCR 생성 물은 클로닝을 실행하기 위하여 제한효소 절단 부위를 포함하도록 조작될 수 있다. 일반적으로, 적절한 쥐 또는 인간 C_κ 쇄 DNA 단편은 길이가 약 70 내지 150, 바람직하게는 약 90 내지 120, 보다 바람직하게는 약 100 내지 110개의 아미노산이다. 적절한 쥐 또는 인간 C_κ 쇄 DNA 서열이 하기 개시된다. 하기 실시예 5, 6 및 7을 참고한다.

본 발명의 sc-TCR 단백질은 완전한 기능성과 가용성이 있다. 용어 "완전한 기능성" 또는 유사한 용어는 융합 단백질이 특이적으로 리간드와 결합하는 것을 의미한다. 이러한 특이적 결합을 검출하기 위한 분석이 본 명세서에 개시되어 있고, 웨스턴 블로팅과 같은 표준 면역블랏 기술을 포함한다.

용어 "완전한 가용성"이란 융합 단백질이 수성 버퍼, 예를들어 세포 배지로부터 낮은 G-력 원심분리하에서 쉽게 침전되지 않음을 의미한다. 또한, sc-TCR은 음이온 또는 비이온성 세제의 낮은 농도 또는 제로 농도에서 약 5-37℃ 초과 온도 및 중성 또는 그 근처의 pH에서 융합 단백질이 수용액으로 잔류한다면 가용성이다. 이들 조건하에서, 가용성 단백질은 종종 약 10 내지 50 스베드베르그(svedberg) 단위 미만의 침강 값을 갖는다. 본 명세서에서 언급된 수용액은 pH, 전형적으로 약 5-9의 pH 범위, 및 약 2 mM 내지 500 mM범위의 이온 세기 범위를 설정하는 버퍼링 화합물을 갖는다. 때로, 프로테아제 억제제 또는 온화한 비이온성 세제가 첨가되고 원한다면 소혈청 알부민(BSA)과 같은 담체 단백질이 1 ml당 수 mg으로 첨가될 수 있다. 예시적인 수성 버퍼에는 표준 포스페이트 버퍼된 염수, 트리스 버퍼된 염수, 또는 다른 공지된 버퍼 및 세포 배지 제제가 있다.

상기에서 언급된 바와 같이, 많은 sc-TCR 분자가 융합된 I_g-C_L 쇄 또는 그의 단편없이 포유동물 세포에서 발현됐을 때 완전한 기능성과 가용성이 있다. 예를들어, 하기 도 9B에서 예시된 pNAG3-m 및 p149-m 벡터는 하기 특정된 포유동물 세포에서 발현될 때 완전한 기능성과 가용성의 sc-TCR 분자를 코딩한다. pNAG3-m 벡터에 의해 코딩되는 sc-TCR 분자는 공유 결합된 순서로 Vα 쇄_, Cα쇄, 펩타이드 결합 서열, Vβ 쇄 및 Cβ쇄를 포함한다. 또한, 전 길이의 Cα쇄 까지도 Cα쇄에서 아미노산을 결여하는 sc-TCR 분자가 개시되어 있다(하기 도9A 및 9B 및 도5에 예시된 pKC60 벡터를 참조). 또한, 계류중인 U.S. 출원 제 08/813,781 호에는 공유 결합된 순서로 Vα 쇄_, Cα 쇄 단편, 펩타이드 결합 서열, Vβ 쇄 및 Cβ쇄를 포함하는 sc-TCR 분자를 제조하는 방법이 개시되어 있다. 따라서, 분자에 I_g-C_L 쇄 또는 적절한 단편을 융합함이 없이 변형된(또는 결여된) Cα 및 Cβ 쇄를 포함하는 다양한 sc-TCR 분자를 제조하는 것이 가능하다. sc-TCR 분자는 특정 포유동물 세포에서 가용성 발현에 대해 본 명세서에서 개시된 방법에 따라 시험 될 수 있다.

본 발명의 sc-TCR 단백질은 보통 RNA, mRNA, cDNA 또는 게놈DNA일 수 있는 핵산 세그먼트에 의해 코딩된다. 전형적으로, 핵산 세그먼트는 DNA 세그먼트이다. 예를들어, 본 발명에 따른 DNA 세그먼트는 전형적으로 적절한 세포 처리 시그널을 제공하는 작동가능하게 연결된 리더 서열을 포함한다. 일반적으로, 리더 서열은 sc-TCR 분자를 코딩하는 DNA 서열의 5' 말단에 융합된다. 예를들어 리더는 V-α 쇄, 또는 일부 구체예에서는 V-β쇄를 코딩하는 DNA 서열의 5' 말단에 공유결합될 수 있다. 그러나, 특정 리더 서열이 특정 α쇄 또는 β쇄에 결합될 수 있지만, 리더 서열은 종종 융합 단백질의 처리에 유해 작용 없이 재조합 기술을 사용하여 교환될 수 있다. 따라서, 한 구체예에서, V-α 쇄의 5' 말단은 적절한 리더 서열의 3' 말단에 공유결합된다. 리더 서열은 종종 길이가 대략 12 내지 26개 아미노산 잔기이다. 박테리아 발현 벡터에 삽입하도록 설계된 DNA 세그먼트는 Pel B 서열을 포함할 수 있고, 반면에 포유동물 세포에서 발현되도록 설계된 벡터에의 삽입을 위한 DNA 세그먼트는 포유동물 C_κ 리더 서열과 같은 I_g-C_L 리더를 포함한다. 예시적인 C_κ 리더가 하기에 제공된다.

용어 "작동가능하게 결합된"이란 소정의 세그먼트 또는 서열로부터 상향(5') 또는 하향(3')으로 핵산 세그먼트, 또는 서열에 작동가능하게(즉, 기능적으로) 결합된 유전학적인 서열을 의미한다. 가까이 있는 서열들은 종종 원하는 세포형에서 핵산 세그먼트 또는 서열의 처리 및/또는 발현에 긍정적으로 영향을 끼친다.

박테리아 발현용으로 사용되는 본 발명에 따른 DNA 벡터는 trp 오페론 프로모터, lac 프로모터, trp-lac 프로모터, lac^uve 또는 phoA 프로모터와 같은 프로모터를 포함할 수 있다. 예시적인 프로모터는 약 수시간동안(예, 2 내지 10시간) 지속되는 느린 유도 조건동안 강하고, 조절된 발현을 제공하는 phoA와 같은 것이다. 적절한 배양 조건하에서, 가장 강한 프로모터는 총 숙주 세포 단백질의 대략 10%까지 및 그를 능가하는 수준으로 가용성 융합 단백질을 제공할 수 있다.

가용성 융합 단백질의 단일쇄 V 영역이 어떤 TCR V 영역으로부터도 유도될 수 있다. 일반적으로, 적절한 Vα,β쇄는 면역학적 유도에 따라 유전자 발현에서 증가가 있는 것이다. TCR V 쇄 발현에서의 증가를 분석하는 방법은 공지되어 있다9참조, Hafler, D.A. et al. J. Exp. Med. 167:1313(1988); Mantgazza R., et al. Autoimmunity 3, 431(1990)).

sc-TCR 융합 단백질은 실질적으로 완전한 길이의 코딩 서열이 쉽게 이용될 수 있는 Vα,β쇄를 포함할 수 있다. 세포 공급원으로부터 완전한 길이의 TCR V쇄 서열을 수득하는 방법은 잘 알려져 있다. 별도로, Vα,β쇄 영역은 적어도 일부분의 서열이 알려진 공중이 이용할 수 있는 Vα, β쇄의 PCR 증폭에 의해 수득될 수 있다. 예시적인 Vβ유전자 서열에는 Vβ8.1, Vβ6.1, Vβ5.1, Vβ5.2, Vβ5.3, Vβ2.1 및 Vβ2.3 유전자 서열을 포함한다(참조, Abe et al. (1992) PNAS(USA) 89: 4066; Wang, et al., 1993); PNAS(USA) 90: 188; Lahesma et al. (1993) J. Immunol 150; 4125; Kozin, et al., (1991) PNAS(USA) 88: 9161; Uematsu, et al. (1991) PNAS(USA) 88:8534, 또한 추가의 TCR V 쇄 서열에 대해 참조, Kabat, E.A., et al. supra and Chotia, C. et al., (1988) EMBO J. 7:3745).

또한, 하기 실시예 3은 다양한 V-α 및 V-β쇄를 증식하는 PCR에 대한 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 제공한다. 또한 적절한 올리고뉴클레오타이드 프라이머의 추가의 예에 대해서는 도 7 및 8을 참조.

생물학적 공급원으로부터 TCR V 쇄를 얻는 것을 원하는 경우, 원하는 TCR은 TCR V 영역의 에피토프에 대해 주로 결합하고 바람직하게는 그에 특이적인 TCR-특 이적 항체를 사용하는 것을 포함하는 통상적인 면역학적 방법에 의해 동정될 수 있다. 전형적으로는, 표면 발현이 형광 현미경, 플로 사이토메트리 (flow cytometry), 또는 면역화학과 같은 공지된 기술을 사용하여 검출될 수 있다. TCR 가변 영역에 특이적으로 결합하는 많은 항체가 공지되어 있다. 예를들어 PCT 출원 WO 90/06758 참조.

검출된 TCR의 DNA 또는 RNA는 바람직하게는 PCR 증폭후 본 분야에 잘 알려진 하이브리다이제이션 방법을 사용하여 다양한 TCR 유전자 계에 대한 올리고뉴클레오타이드 프로브와의 특이적 하이브리다이제이션에 의해 직접적으로 또는 바람직하게는 PCR 증폭후 프로빙(probe) 될 수 있다. 일반적으로 고 엄중(stringency) 핵산 하이브리다이제이션 조건이 수행된다. 본 명세서에서 사용된 바, 용어 "고 엄중 하이브리다이제이션"은 0.1 x SSC에서 대략 65℃의 핵산 배양 조건을 의미한다. 상기 Sambrook, et al. 참조. TCR DNA 서열 또는 원하는 그의 부분은 증폭된 DNA 또는 RNA로부터 직접적으로 수득될 수 있거나 원하는대로 적절한 벡터에로 서브클로닝될 수 있다.

TCR V 영역 DNA를 수득하기 위한 다른 방법이 공지되어 있다. 예를들어, V 영역 유전자를 포함하는 원하는 TCR은 TCR 또는 바람직하게는 V 영역에 상응하는 그의 일부분을 서열화하여 동정될 수 있다. DNA 서열은 예를들어 본 분야에 공지된 대로 적절한 서열화 벡터에 DNA를 클로닝한후 또는 먼저 TCR의 적어도 일부분의 단백질 서열을 결정한후, DNA 서열을 결정하여 결정될 수 있다. 상기 언급된 조작 및 숙련된자에 알려진 다른 조작이 단일쇄 Vαβ 작제물이 원하는 원하는 I_g-C_L 단편 또는 적절한 I_g-C_L 단편에의 융합을 위해 만들어지도록 TCR로부터 원하는 TCR을 성공적으로 동정하고, TCR로부터 V 영역 유전자를 수득하기위해 이용될 수 있다는 것이 본 분야에 숙련된자에게는 쉽게 명백할 것이다.

보다 구체적으로, 생물학적 공급원으로부터 TCR V 영역 DNA를 얻으려할 때, 원하는 V-α 및 V-β쇄를 코딩하는 DNA 세그먼트를 T-세포 하이브리도마 또는 세포독성 T-세포(CTLs)와 같은 세포로부터 수득될 수 있다. T-세포(예, Ts, Tc 또는 T_H 세포)는 생체내에서 수득될 수 있거나, T-세포가 배양된 T-세포 하이브리도마(예, D10 또는 B12 세포주)일 수 있다. 하기 실시예 1 참조. CTL은 비유도될 수 있거나 설치류(예, 마우스, 래트, 토끼) 또는 영장류(예, 인간 또는 침팬지)에서 독성 면역 시스템 반응과 결합될 수 있다. 예를들어, CTL 또는 다른 T-세포는 라임병, 가와사키 질병, 나병, 암(CEA와 같은 항원과 관련된 종양에 대한 면역 반응), 또는 자가면역 질환, 특히 이식 거부, 다발성 경화증, 인슐린 의존성 당뇨병, 류마티스성 관절염, 및 알레르기와 관련된 질환; 감염성 질병, 특히 RNA 또는 DNA 바이러스를 포함하는 감염 질병을 앓거나 갖는 것으로 의심되는 환자에게서 유래될 수 있다. 특히, 중요한 바이러스는 인간 면역결핍 바이러스(HIV), 시토메갈로바이러스 (CMV), 인플루엔자, 헤파티티스, 폭스 바이러스, 엡스타인 바이로스, 아데노 바이러스 또는 폴리오마 바이러스이다. CTL의 예시적 공급원은 암종 및 흑색종이 발병된 환자에게서 단리된 항원-특이 CTL 및 TIL이다(참조, Cox A et al. Science(1994)264:716; Rosenberg, S.A et al. N.Eng.J.Med(1988) 319:1676; Kawasaki, Y. et al., J. Exp. Med.(1994) 180:347); Kawakami, Y. et al. PANS(1994) 91:6458).

세포 공급원으로부터 V-α 및 V-β쇄를 수득하는 것과 관련하여 앞서 언급된 바와 같이, 그로부터 단리된 핵산을 제조하기 위하여 수개의 별도 과정이 사용될 수 있다. 보다 구체적으로, V-α및 V-β쇄 DNA를 제조하기 위하여, mRNA를 원하는 TCR 결합 특이성을 나타내는 세포로부터 단리한다. 이러한 방법은 mRNA로부터 만들어진 제 1 가닥 cDNA 주형(template)을 사용하는 적절한 PCR 프로토콜을 사용하는 것을 일반적으로 포함한다. 이어서 원하는 α및 β쇄를 만들기 위하여 표준 재조합 기술이 이용될 수 있다. 이어서 원하는 V-α 및 V-β 쇄를 코딩하는 DNA 세그먼트를 원한다면 적절한 펩타이드 결합 서열 및 단백질 태그(들)를 포함하도록 변형시킨다.

일반적으로, PCR 방법에서 사용하기 위한 DNA 올리고뉴클레오타이드 프라이머는 길이가 대략 12 내지 50, 바람직하게는 20 내지 25 뉴클레오타이드이다. PCR 올리고뉴클레오타이드 프라이머는 적절하게는 예를들어 결찰(ligation) 부위를 도입하기 위하여 필요한대로 PCR 생성물에 특정 제한 효소 절단 부위를 첨가하기 위하여 제한부위를 포함한다. 예시적인 프라이머가 하기의 실시예 및 도면에서 제공된다. 생성된 PCR 생성물은 증폭된 V-α 및 V-β쇄 서열을 포함하고, 원하는 바 대로 융합 단백질의 최적 발현을 위해 리보좀 결합, 리더 및 프로모터 서열을 포함하도록 변형될 수 있다.

원하는 sc-TCR 분자를 코딩하는 DNA 세그먼트를 하기 기술된 방법에 따라 상 당한 양으로(세포 1 그램당 밀리그램 양으로) 만들어질 수 있다.

하기 제공된 가용성 융합 단백질을 만드는데 사용되는 특정 sc-TCR은 포유동물로부터 유래된 V-α및 V-β쇄를 갖는 sc-TCR을 포함한다. 예에는 영장류, 특히 인간 및 침팬지; 설치류, 예를들어 누드 마우스와 같은 면역학적으로 순수한 (naive) 마우스 또는 HLA-A2 항원 복합체를 발현할 수 있는 트랜스진(transgene)을 포함하는 마우스이다. 특히 중요한 인간은 자가 면역 질환과 같은 앞서 언급된 병에 걸린 인간이다. 상이한 포유동물로부터 유래된 V-α 및 V-β DNA 서열을 포함하는 키메라 작제물은 공지된 방법에 따라 작제될 수 있고 또한 본 발명의 범위에 든다.

상기 언급된 바와 같이, 펩타이드 결합 서열은 리간드 결합 포켓(pocket)을 형성하도록 융합 단백질의 V-α 및 V-β 쇄를 효과적으로 위치시킨다. 따라서, 가용성 융합 단백질은 초항원, 또는 MHC/HLA 펩타이드 복합체와 관련하여 펩타이드 항원, 또는 작은 분자와 같은 리간드와 특이적으로 결합할 수 있다. 특히, 본 발명의 목적은 T-세포의 표면에 천연 TCR과 경쟁할 수 있는 가용성이고 완전한 기능성의 sc-TCR 융합 분자를 제공하는 것이다. "경쟁"이란 단어는 가용성 융합 단백질이 동일한 리간드에 대해 TCR의 특이적 결합 친화성과 동일하거나, 일부 경우에는 그를 능가하는 수준으로 리간드와 결합할 수 있는 것을 의미한다. 예를들어, 하기 기술된 방법에 따라, sc-TCR 융합 단백질(또는 그로부터 유래된 sc-TCR 분자)은 천연 TCR과 대략 동등하거나 그보다 대략 2 내지 10배 까지로 높은 결합 친화성을 나타낼 수 있다.

전형적으로, 원하는 I_g-C_L 쇄와 적절한 I_g-C_L 쇄 단편의 융합은 융합된 I_g-C_L 쇄 또는 그의 단편을 결여하는 sc-TCR 분자와 비교할 때 sc-TCR 융합 단백질의 특이적 결합을 30% 미만, 바람직하게는 10% 미만 및 보다 바람직하게는 5% 또는 그 이하로 감소시킬 것이다. 예시적인 결합 분석이 본 명세서에 개시되어 있고, 하기 기술된 표준 웨스턴 블로팅 분석 및 표면 플라스몬 공명 분석을 포함한다.

본 발명의 예시적 구체예에서, 폴리펩타이드 결합 서열은 약 7 내지 20개 아미노산 , 보다 바람직하게는 약 10 내지 20개의 아미노산, 보다 더 바람직하게는 약 12 내지 20개의 아미노산을 포함한다. 결합 서열은 전형적으로 펩타이드 항원과 같은 원하는 리간드의 특이적 결합을 제공하는 배위로 V-α 및 V-β쇄를 위치시키도록 융합 단백질에 유연성 있게 배치된다. 결합은 바람직하게는 주로 최적의 유연성(flexibility)을 제공하기 위하여 글라이신, 알라닌 및 세린과 같은 작은 측쇄를 갖는 아미노산을 포함한다. 바람직하게는, 결합 서열의 약 80 또는 90 퍼센트 또는 그이상이 글라이신, 알라닌 또는 세린, 특히 글라이신 및 세린 잔기이다. 바람직하게는, 결합 서열은 유연성을 저해할 수 있는 어떤 프롤린 잔기도 함유하지 않는다. 결합 서열은 융합 단백질의 V-α쇄의 C-말단 및 V-β쇄의 N-말단에 적절하게 부착된다. 하기 실시예 1 및 2를 참조.

보다 구체적으로는, 적절한 결합 서열은 (GGGGS)4 서열(즉, (Gly Gly Gly Gly Ser)4를 포함하고, JA302(SEQ ID NO:96) 및 JA301(SEQ Id NO:95)이다. 바람직하게는, 선택된 결합 서열은 sc-TCR의 V-α쇄의 C-말단 잔기와 V-β쇄의 첫 아미노산사이에 공유결합된다. 그러나, 앞서 언급된 바와같이, 다른 펩타이드 결합 서열 배위가 가능하고, 이의 일부는 C_κ쇄 단편과 같은 I_g-C_L 쇄 또는 적절한 I_g-C_L 쇄 단편에의 융합을 포함한다. 수개의 폴리펩타이드 결합 서열이 항체 가변 영역을 결합시키는데에 사용하기에 허용가능한 것으로 개시되어 있다(참조, M.Whitlow et al., Methods: A Composition to Methods in Enzymology, 2:97-105(1991)). 별도로, 다른 적절한 결합 서열이 경험적으로 쉽게 동정될 수 있다. 예를들어, 결합 서열을 포함하는 융합 단백질을 코딩하는 DNA 세그먼트를 포함하는 DNA 벡터가 클로닝되어 발현되고, 융합 분자가 항체와 결합할 수 있는지를 결정하기 위하여 융합 분자를 시험한다. 예시적인 분석은 상기 Harlow 및 Lane에 개시된 것과 같은 통상적인 항체 결합 분석이다. 별도로, 결합 서열을 함유하는 발현된 융합 단백질이 본 명세서에서 참고된 분석에 의해 결정되는 바와 같이 T-세포의 활성을 조절할 수 있는 능력에 대해 시험될 수 있다. 하기 실시예 8, 10 및 11을 참조, 결합 서열의 적절한 크기 및 서열이 융합 단백질의 예견된 크기 및 모양에 기초한 통상적인 콤퓨터 모델링 기술에 의해 결정될 수 있다. 예시적인 펩타이드 결합 서열은 Vα쇄와 V-β쇄사이의 폴리펩타이드 결합 서열의 말단에 적절한 제한 부위(예, XhoI 및 SpeI)를 포함하는 서열이다.

대부분의 경우에, 중요한 sc-TCR 분자를 코딩하는 DNA 세그먼트를 적절한 DNA 벡터에 재조합으로 설계한다. 예를들어, 원하는 V 쇄가 PCR-증폭되는 구체예에서, 올리고뉴클레오타이드 프라이머는 보통 DNA 세그먼트가 원하는 또다른 세그먼트로 대체될 수 있도록 프라이머의 양 말단에 원하는 제한부위가 있게 구성된다. 따라서, 본 발명의 적절한 DNA 벡터는 원하는 sc-TCR 분자가 벡터내에 쉽게 삽입될 수 있는 벡터이다. 때로, 가용성 융합 분자를 만들려고 할 때, I_g-C_L 쇄 또는 적절한 I_g-C_L 단편을 벡터에 의해 코딩시키고 DNA 세그먼트에 결찰(ligation)에 의해 융합된다. 다른 경우에, I_g-C_L 쇄 또는 단편은 벡터에 결찰시키기전 DNA 세그먼트에 융합시킬 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어 "벡터"는 숙주 세포에 혼입될 수 있어, 상기 기술된 sc-TCR 융합 단백질을 코딩하는 세그먼트 또는 서열과 같은 중요한 핵산 세그먼트를 발현시키는 중요한 핵산 서열을 의미한다. 벡터는 예를들어 선형 핵산 세그먼트 또는 서열, 플라스미드, 코스미드, 파그미드(phagmids) 및 외부 크로모좀 DNA를 포함할 수 있다. 특히, 벡터는 재조합 DNA일 수 있다. 또한 본 발명에서 사용된 용어 "발현" 또는 "유전자 발현"은 DNA의 전사 및 RNA 전사의 번역을 포함하는 중요한 핵산 서열의 단백질 생성물의 생성을 의미한다. 전형적으로 본 발명의 sc-TCR 융합 단백질을 코딩하는 DNA 세그먼트는 벡터, 바람직하게는 DNA 벡터에 삽입되어 적절한 숙주 세포에서 DNA 세그먼트를 복제한다.

원하는 세포에서 본 발명의 sc-TCR 단백질을 발현시키기 위해서 많은 전략이 이용될 수 있다. 예를들어, sc-TCR 단백질을 코딩하는 DNA 서열이 미리 예정된 부위에서 벡터를 제한하는 효소를 사용하고, DNA를 벡터에 결찰시키는 등에 의한 공지된 방법에 의해서 DNA 벡터에 혼입될 수 있다. 이어서 DNA 서열을 함유하는 벡터가 sc-TCR 단백질의 가용성 발현을 위한 적절한 숙주에 도입된다. 적절한 벡터의 선택은 경험적으로 클로닝 프로토콜에 관련되는 인자들에 기초될 수 있다. 예 를들어, 벡터는 이용되는 숙주 세포와 조화되어야 하고 숙주 세포용의 적절한 레플리콘을 가져야 한다. 또한 벡터는 발현되려는 단백질을 코딩하는 DNA 서열을 조절할 수 있어야 한다. 바람직한 벡터는 포유동물 세포에서 가용성 단백질을 발현시킬 수 있는 것, 예를들어 인비트로겐(inVitrogen)사로부터 입수가능한 pCDNA3이다. 포유동물 세포에서 사용하기 위한 다른 적절한 벡터에 대해서는 상기 Sambrook et al., 및 Ausubel 참조. 전형적으로, 박테리아에서 발현하고 가용성 융합 단백질을 코딩하게 설계된 DNA 벡터는, 완전한 길이의 C_λ 또는 C_κ 인트론이 RNA 스플라이싱(splicing)을 할 수 있는 포유동물 세포에서 발현하도록 설계된 벡터에는 포함되지만, 이들 서열을 포함하지 않는다.

바람직한 DNA 벡터는 진핵 세포, 특히 포유동물 세포에서 가용성 sc-TCR을 발현하도록 설셰된다. DNA 벡터는 적절한 양의 DNA 벡터가 수득될 수 있도록 원한다면 박테리아 숙주에서 복제를 하도록 포맷될 수 있다. 예를들어, DNA 벡터는 일반적으로 (i) E. coli에서 기능성인 복제 오리진(origin), (ii) 선택가능한 항생제 내성 유전자, (iii) 시토메갈로바이러스(CMV)와 같은 강한 바이러스 프로모터 및 임의의 CMV 인핸서 요소, (iv) I_g-C_L 리더 서열, (v) 중요한 sc-TCR 분자, (vi) I_g-C_L 엑손에 결합된 완전 길이의 I_g-C_L 인트론, (vii) 성장 호르몬 폴리아데닐화 서열, 예를들어 소 성장 호르몬(bgh)폴리 A 서열 및 (Viii) 항생제 내성 유전자(예, 네오마이신)에 결합되고 바이러스 폴리아데닐화 서열(예, SV40 폴리A 서열)에 융합된 강한 바이러스 프로모터(예, 시미안 바이러스 40(SV 40) 프로모터)와 같은 선택가 능한 진핵 마커를 코딩하는 DNA를 포함한다. 별도로, DNA 벡터는 상기의 (i)-(v), 및 (vii)-(viii) 모두를 포함하며, (vi)의 I_g-C_L 엑손에 결합된 완전 길이의 I_g-C_L 인트론은 없을 수 있다. 예시적인 I_g-C_L 리더 서열은 마우스 카파 리더이다. 완전 길이의 I_g-C_L 인트론 및 엑손의 예는 완전 길이의 C_κ 유전자이다. 포유동물 세포 발현을 위한 적절한 DNA 벡터의 예가 도 10(pSUN27 벡터)에 예시되어 있다. 하기 실시예 5 참조.

원하는 포유동물 세포에서 사용하기 위한 본 발명의 DNA 벡터는 다른 포유동물에서의 가용성 발현을 최대로 활용하기 위하여 통상적인 기술에 따라 변형될 수 있다. 예를들어, 상기 기술된 네오마이신 내성 유전자를 코딩하는 진핵 마커를 TK-(TK 결여) 포유동물 세포에서의 sc-TCR 융합 단백질의 발현을 실행하기 위하여 티미딘 키나제(TK) 유전자를 코딩하는 DNA에 의해 대체될 수 있다. DNA 벡터는 본 분야에 잘 알려진 다른 방법으로 변형될 수 있다(예를들어, 프로모터, 항생제 내성 유전자를 바꾸고, 원하는 포유동물에서 sc-TCR 융합 단백질 발현을 최적화 하기 위하여 CMV 프로모터를 면역글로불린으로부터 수득된 프로모터, SV40, 아데노바이러스 또는 파필로마 바이러스 프로모터로 대체). 별도로, sc-TCR 단백질을 코딩하는 DNA 서열을 원하는대로 효모 또는 곤충 세포에서 발현하기에 적절한 잘 알려진 벡터에 삽입시킬 수 있다. 상기 Ausubel, et al., 및 상기 Summer and Smith 참조.

적절한 숙주 세포는 레트로바이러스 전달, 바이러스 또는 박테리오파지 감염, 칼슘-, 리포좀-, 또는 폴리브렌-매개된 형질감염, 바이오리스틱(biolistic) 전 달, 또는 본 분야에 알려진 다른 이러한 기술을 포함하는 다양한 방법에 의해 형질전환될 수 있다.

앞서 언급된 바와 같이, 일부 경우에 비-포유동물 세포에서 가용성 융합 단백질을 발현시키는 것이 바람직할 수 있다. 예를들어, 박테리아에서 융합 단백질을 발현시키기위한 적절한 숙주 세포는 쉽게 형질전환되어 배양 배지에서 빠른 성장을 나타낼 수 있는 세포를 포함한다. 특히 바람직한 숙주 세포는 E. coli, 바실러스 서브틸러스(Bacillus subtillus) 등이다. 다른 숙주 세포에는 효모, 예를들어, 에스. 세레비지에(S. cerevisiae) 및 곤충 세포가 있다. 곤충 세포 발현을 위한 예시적인 세포는 Sf9 세포와 같은 바큘로바이러스에 의해 감염될 수 있는 세포이다(또한 참조, Summer and Smith(1988) A Manual of Methods for Baclovirus Vectors and Insect Cell Culure Procedure, Texas Agricultural Experimental Station Bulletin No. 1555, College Station, Texas).

일반적으로, 안정하게 형질전환되거나 형질감염된 세포주가 예를들어 벡터에 적절한 세포 선택 마커(예를들어, 항생제 내성 유전자 또는 G418)를 벡터에 혼입시킴으로써 선택되는 세포 배양 조건이 이용된다. sc-TCR 융합 단백질을 발현하는 세포가 공지된 과정, 예를들어 V-α 또는 V-β 쇄와 특이적으로 결합하는 시판되는 모노클로날 항체를 사용하는 ELISA 분석에 의해 결정될 수 있다. 별도로, 가용성 융합 단백질의 C_κ 또는 C_λ 쇄(또는 단편)에 특이적으로 결합되는 모노클로날 항체가 선택될 수 있다. 모노클로날 항체 및 적절한 분석의 예가 하기 실시예에서 제공된다.

박테리아에서 원하는 가용성 융합 단백질의 복제 및 발현을 위해 설계된 벡터는 예를들어 (i) 예를들어 pBR322로부터, 바람직하게는 잘 알려진 pUC19 벡터로부터 유래된, E. coli에서 기능성인 복제 오리진; (ii) 선택가능한 항생제 내성 유전자, 예를들어 앰피실린 및/또는 네오마이신 내성 유전자; (iii) 전사 종결 영역, 예를들어 E. coli trp 오페론의 종결 영역; (iv) 전사 프로모터, 예를들어 phoA, tac, tac-lac, lacZ, lac^uvz, T7, 또는 T3 프로모터; (v) 리더 서열, 예를들어 pelB 또는 ompA 리더; (vi) 원하는 I_g-C_L 쇄 또는 적절한 I_g-C_L 쇄 단편에 융합된 sc-TCR을 코딩하는 DNA 세그먼트, 예를들어, 완전 길이의 쥐 또는 인간 C_κ 엑손; 및 (vii) 전사 종결자, 예를들어 E. coli의 리보좀 RNA 위치로부터 T1T2 서열을 포함한다. 별도로, 벡터는 sc-TCR이 융합된 I_g-C_L 쇄 또는 단편 없이 제공되는 것 이외에는 상기 (i)-(vii)를 포함할 수 있다.

박테리아 발현을 위해 설계된 DNA 벡터중에 특정 뉴클레오타이드 서열의 포함은 느린 유도 조건하에서 sc-TCR 융합 단백질의 가용성 발현을 도울 수 있다. 예를들어, 하기 기술된 phoA 프로모터 및 pelB 리더 서열이 느린 유도 조건하에서 sc-TCR 융합 단백질을 발현하는데에 사용될 수 있다. 하기 실시예 6 참조, 강한 번역 개시 서열이 또한 번역 효율을 향상시키기 위하여 제조물에 포함될 수 있다. 포유동물 세포 발현 경우, 바람직한 개시 서열은 Kozak 콘센서스(consensus) 서열(CCACCATG)(SEQ ID NO:97)이다.

DNA 벡터의 리더 서열은 적절하게는 숙주 세포 막으로의 또는 숙주 세포 배지에로 융합 단백질의 발현을 지시하고, 종종 예를들어 중요한 V-α쇄를 코딩하는 DNA가 작제물에 편리하게 결찰될 수 있도록 제한 부위를 포함한다. 적절하게는, 제한 부위는 리더 서열의 3'-말단에 혼입되고, 때로 접합(junction) 서열이라고 본 명세서에서 언급되며, 예를들어 길이가 약 2 내지 10개 코돈이고, V-α쇄가 전형적으로 V-α코딩 영역의 첫번째 아미노산이도록 V-α쇄에 결합된다. 예를들어, 다른 절단 부위가 V-α쇄를 벡터 제조물에 편리하게 삽입되는 것을 증대시키기 위하여 V-α 쇄 코딩 영역전에 혼입될 수 있지만 하나의 제한 부위는 Sfi I 부위이다. 상기 언급된 바와같이, 전형적으로 V-α 쇄의 시작 부분에 위치하는 제 2 제한 부위와 조합하여 이러한 제한 부위의 사용이 매우 다양한 V-α 쇄, 또는 V-α , C-α쇄를 코딩하는 서열의 빠르고 똑바른 삽입을 가능하게 한다. 바람직한 리더 서열은 강한 번역 개시 부위를 함유하고, 때로 그의 mRNA의 3'-말단에 캡(cap) 부위를 포함 할 수 있다. 상기 언급된 바와같이, 예시적인 리더 서열은 박테리아 발현을 위한 pelB, 및 OmpA 및 포유동물에서 발현하기 위한 C_κ 마우스 카파 쇄 리더 서열을 포함한다.

sc-TCR 단백질은 다양한 방법에 의해서 박테리아에서 발현될 수 있다. 예를들어, sc-TCR 융합 단백질을 코딩하는 DNA 벡터는 연장된 시간, 약 2 내지 8시간에 걸쳐 숙주 세포를 느리게 유도하여 박테리아에서 발현될 수 있다. 예를들어, 실시예 6에서 하기 기술된 바와 같이, sc-TCR 단백질을 코딩하는 서열에 작동가능하게(강한) 결합된 phoA 프로모터를 포함하는 DNA 벡터가 제조될 수 있다. 이어서 숙주 세포는 DNA 벡터로 형질전환될 수 있고 숙주 세포 배지중의 포스페이트는 수시간, 일반적으로 약 2 내지 10시간, 보다 바람직하게는 약 4 내지 6시간에 걸쳐 배지로부터 고갈될 수 있다.

본 명세서에서 제공되는 DNA 벡터에 의해 코딩되는 sc-TCR 단백질은 수개의 통상적인 기술에 의해 정제될 수 있다. 예를들어, 앞서 언급된 바와같이, 가용성 융합 단백질은 화학적 또는 프로테아제 절단 부위를 포함하는 태그를 포함하여 하나이상의 단백질 태그(동일하거나 상이함)를 포함할 수 있다. 특히, 단백질 태그는 예를들어 6xHIS와 같은 생리학적 pH에서 전하를 갖는 폴리펩타이드일 수 있다. 이 구체예에서, 적절한 합성 매트릭스가 융합 단백질을 정제하기 위하여 사용될 수 있다. 보다 구체적으로는, 합성 매트릭스는 시판되는 세파로즈 매트릭스, 예를들어 Ni-세파로즈 또는 약 pH 6-9에서 6XHIS 태그와 결합할 수 있는 다른 적절한 매트릭스일 수 있다. 다른 적절한 태그에는 시판되는 모노클로날 항체에 의해 특이적으로 결합된 EE 또는 myc 에피토프가 있다. 일반적으로, 항체, 예를들어 모노클로날 항체에 의해 특이적으로 결합할 수 있는 매우 다양한 에피토프는 단백질 태그로서 작용할 수 있다. 다른 적절한 합성 매트릭스는 본 sc-TCR 단백질과 특이적으로 결합할 수 있는 결합된 항체를 갖는 것을 포함한다. 예시적인 단백질 태그는 엔테로키나제, 인자 Xa, 뱀 독(snake venom) 또는 트롬빈 절단 부위를 갖는 것을 포함한다. 예를들어 공개된 PCT 출원 WO 96/13593을 참조.

발현된 sc-TCR 단백질은 면역친화성 크로마토그래피, 면역흡착, 면역침전등을 포함하는 공지된 방법에 의해 단리 및 정제될 수 있다. 중요하게는, 준비 과정은 보통 융합 단백질의 상당한 수율을 얻기 위하여 연장된 단리 단계를 요구하지는 않는다. 하기에서 충분히 기술되는 단백질 정제 과정에 따라, 대부분의 sc-TCR에 대한 수율은 대략 50 내지 100 그램의 숙주 세포 페이스트당 2 내지 20 밀리그램 범위이다.

일반적으로, 본 명세서에서 개시된 sc-TCR 단백질을 제조하기 위하여, 세포 추출물 또는 숙주 세포 배양 배지를 원심분리하고, 생성된 상등액은 발현된 sc-TCR 융합 분자와 특이적으로 결합하는 항체의 사용을 포함하는 친화성 또는 면역 친화성 크로마토그래피, 예를들어 단백질-A 또는 단백질-G-친화성 크로마토그래피 또는 면역친화성 프로토콜에 의해 정제한다. 이러한 항체의 예는 sc-TCR의 V-α 쇄 또는 V-β쇄와 특이적으로 결합할 수 있는 시판되는 모노클로날 항체이다. 이러한 항체의 예는 Pharmagen으로부터 입수가능한 H57, MR5-2, 및 F23.1이다. 별도로 sc-TCR 단백질중의 면역글로불린 쇄와 특이적으로 결합하는 시판되는 항-이디오타이프(anti-idiotype) 항체가 sc-TCR 융합 단백질을 정제하기 위하여 사용될 수 있다. 이러한 항체의 사용 예가 하기 실시예 5에 제공된다. 모노크로날 항체를 사용하는 단백질의 친화성 정제가 일반적으로 알려져 있고 개시되어 있다. 예를들어, Harlow and Lane in, Antibodies: A Laboratory manunal(1988) 참조.

상기 기술된 바와 같이, 본 발명의 sc-TCR 단백질은 가용성이 있고 완전히 기능성인 형태로 제공된다. 따라서, sc-TCR 단백질은 배양 배지로 안정하게 분비되고 펩타이드 항원 또는 합성의 작은 분자와 같은 중요한 리간드와 특이적으로 결합할 수 있다. 보다 구체적으로는, sc-TCR 단백질은 세제등과 같은 카오트로픽제 (chaotropic agent)의 실질적인 또는 완전한 부재하에서 생리학적 조건하에서 일반 적으로 안정하다. 따라서, 본 가용성 단백질은 TCR 막내외 영역에서 발견되는 아미노산과 같은 소수성 아미노산이 풍부한 영역을 포함한다. 그러나, 일부 경우에, sc-TCR 단백질이 완전한 가용성이 있다면 그의 적절한 일부분이 포함될 수 있다. 즉, 융합 단백질의 발현은 적절한 숙주 세포에서 상당량의 봉입체를 형성하지는 않는다. 봉입체는 현미경 또는 원심분리 침강과 같은 통상적인 생화학 기술에 의해 쉽게 검출가능하다.

본 발명의 sc-TCR 단백질은 하기 실시예 및 상기 언급된 바와 같이 제조할 수 있다. 일반적으로, 원하는 V-α또는 V-β쇄를 코딩하는 DNA는 T-세포, T-세포 하이브리도마주, 또는 앞서 기술된 바와 같이 공공적으로 입수가능한 V-α및 V-β쇄와 같은 적절한 공급원으로부터 입수할 수 있다. DNA는 PCR, 클로닝 또는 다른 적절한 수단에 의해 증폭될 수 있다. 예를들어, 원하는 V-α쇄를 코딩하는 DNA를 적절한 벡터에 클로닝시키고, 원하는 V-β쇄 및 적당한 단일 쇄 결합 서열을 코딩하는 DNA를 클로닝시켜 원하는 sc-TCR을 생산한다. 앞서 개시된 바와 같이, 일부 경우에 sc-TCR은 C-α 및/또는 C-β 쇄 단편을 포함한다. 가용성 sc-TCR 융합 단백질 경우, sc-TCR 분자 작제물은 I_g-C_L 쇄 또는 단편, 예를들어 쥐 또는 인간의 C_κ 쇄 또는 적절한 C_κ 쇄 단편에 추가로 융합된다. 앞서 언급된 바와 같이, C_κ 쇄를 코딩하는 DNA는 PCR 증폭되어 sc-TCR을 코딩하는 DNA에 결찰시킬 수 있다. 별도로, C_κ 쇄는 하기의 Near, et al.등에 의해 개시된 것과같은 DNA 벡터에 포함될 수 있다. 이어서, 융합 단백질을 코딩하는 DNA 세그먼트를 DNA 벡터에 도입시킨다. 이어서 DNA 벡터는 숙주 세포에서 발현되어 융합 단백질이 수확되고 원한다면 정제된다.

본 발명의 예시적인 sc-TCR 융합 단백질은 일반적으로 공유결합 순서로 프로모터/리더 서열/V-α쇄/ 단일쇄 결합 서열/V-β쇄/C_κ 쇄; 프로모터/리더 서열/V-α쇄/단일쇄 결합 서열/V-β쇄, C-β쇄 단편/C_κ 쇄; 프로모터/리더 서열/V-α쇄, C-α쇄/단일 쇄 결합 서열/V-β쇄/C_κ 쇄; 또는 프로모터/리더 서열/ V-α쇄, C-α쇄 단편/단일쇄 결합 서열/V-β쇄, C-β쇄 단편/C_κ 쇄를 포함하는 DNA 세그먼트에 의해 코딩된다. sc-TCR 분자의 일예는 C_κ 쇄가 DNA 세그먼트에 의해 코팅되지 않는다는 사실을 제외하고 상기에 기재되어 있다. sc-TCR 단백질을 코딩하는 DNA 벡터를 융합 단백질의 가용성 발현을 위하여 본 명세서에 개시된 특정의 발현 시스템을 포함하는 원하는 세포로 도입시킨다.

본 명세서에서 제공된 sc-TCR 단백질을 다양한 공유결합된 주효인자 또는 태그를 포함하는 표준 방법에 의해서 변형시킬 수 있다. 적절한 주효인자 또는 태그는 원하는 생물학적, 화학적 또는 물리적 성질을 주는 것을 포함한다. 보다 구체적으로, 주효인자는 디프테리아 독소(DT), 시가(shiga) 독소, 아브린, 콜레라 독소, 리신, 사포린, 슈도모나스 엑소톡신(PE), 아메리카자리공 항바이러스 단백질, 또는 겔로닌과 같은 식물 또는 박테리아 기원의 세포 독소일 수 있다. 이러한 독소의 생물학적으로 활성인 단편은 본 분야에 공지되어 있고, 예를들어 DT A 쇄 및 리신 A 쇄를 포함한다. 또한, 독소는 예를들어 포스포리파제 효소(예를들어 포스 포리파제 C)와 같은 세포 표면에서 활성인 시약일 수 있다. 또한, 주효인자 분자는 예를들어 빈데신, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 메토트렉세이트, 아드리아마이신, 블레오마이신 또는 시스플라틴과 같은 치료요법 약제일 수 있다. 또한, 주효인자 분자는 방사핵종, 예를들어 요오드-131, 이트륨-90, 레늄-188 또는 비스무트-212와 같은 진단 또는 영상화 연구에 적당한 검출가능하게 표지된 분자일 수 있다(주효인자 또는 태그를 포함하는 단백질을 만들거나 사용하는 것에 대한 개시에 대하여 Moskaug, et al. J.Biol. Chem. 264, 15709(1989); Pastan, I. et al. Cell 47, 641,1986; Pasten et al., Recombient Toxins as Novel Therapeutic Agents, Ann. Rev.Biochem. 61, 331, (1992); "Chimeric Toxins" Olsnes and Phil, Pharmac. Ther., 25, 355(1982); publishef PCT application No. WO 94/29350; published PCT application No. WO 94/04689; and U.S. Pat. 5,620,939 참조).

또한 본 명세서에 개시된 sc-TCR 융합 분자 및 융합된 I_g-C_L 쇄(또는 단편)이 없는 sc-TCR 분자를 사용한 진단 및 영상화 연구를 수행하기 위한 추가의 방법 및 물질에 대한 개시에 대해서 하기 A.K. Abbas 및 하기 언급을 참조하시오.

공유결합된 주효인자 분자를 포함하는 가용성 sc-TCR 단백질은 수개의 중요한 용도를 갖는다. 예를들어, sc-TCR 단백질은 sc-TCR과 특이적으로 결합할 수 있는 특정 세포에 주효인자 분자를 전달하는데에 이용될 수 있다. 따라서, sc-TCR 단백질은 리간드를 포함하는 세포를 선택적으로 손상을 입히거나 사멸시키는 수단을 제공한다. sc-TCR 단백질에 의해 손상되거나 사멸될 수있는 세포 또는 조직의 예는 sc-TCR에 의해 특이적으로 결합될 수 있는 하나이상의 리간드를 발현하는 종 양 및 바이러스 감염된 세포를 포함한다. 손상되거나 사멸되기 쉬운 세포 또는 조직은 본 명세서에 개시된 방법에 의해 쉽게 분석될 수 있다.

주효인자 분자에 융합된 sc-TCR 단백질의 구체적인 예는 다음과 같다: 하기 실시예 6 및 7에 개시된 p149 sc-TCR과 같은 sc-TCR은 도9B에 도시된 pNAG1 또는 pNAG3 벡터로 포유동물 세포를 형질감염시켜 제조할 수 있다. sc-TCR p149 단백질은 인간 HLA 항원(HLA-2.1)과 관련하여 제시된 야생형 p53 종양 서프레서 단백질로부터 처리된 펩타이드 단편을 인식한다. sc-TCR p149 및 그의 펩타이드 리간드가 문헌[Theobald, M.J., et al., PNAS(USA)(1995), 92:11993]에 기술되어 있다. 펩타이드 서열은 STPPPGTRV(SEQ Id NO. 146)이다. 종양 서프레서 단백질 p53의 발현은 악성 세포상에서 조절된다. 모든 종양의 50%가 표면상에서 p53의 증가된 수준을 나타냈다. (Holliston, M.D., et al., Science(1991), 253:49). 그러므로, 이 에피토프에 특이적인 sc-TCR 분자는 p53 펩타이드 단편 HLA-2.1 리간드를 발현하는 악성 세포에 전달될 수있는 독소로 표지될 수있다. 이 표적 특이적 면역치료는 오직 악성 세포만을 사멸시키는데에 효과적일 수 있다. 시험관내의 세포독성을 측정하기 위한 방법은 잘 알려져 있고 하기 기술된 바와 같은 통상적인 생존성 분석을 포함한다. 주효인자에 결합된 p149 sc-TCR을 포함하는 sc-TCR 분자는 다른 중요한 용도를 갖는다. 예를들어, sc-TCR 분자는 인간 흉부암 세포 발현 p149 펩타이드를 선택적으로 사멸시키는데에 사용된다. 흉부 암 세포를 사멸시키는 독소 표지된 p149 분자를 Eu³⁺ 방출 세포독성 분석을 사용하는 비-방사성 세포 세포독성 분석을 사용하여 평가하는 시험관내 연구가 수행될 수 있다(Bouma, G.J., et al., (1992) Hum. Immunol. 35:85). 융합된 유효인자 분자를 포함하는 sc-TCR 분자는 생체내에서 쉽게 시험될 수 있다. 예를들어, 시험관내 연구는 p149/HLA.A21 발현 흉부 암세포를 HLA/A2 트랜스지닉 마우스에 이식시켜 수행할 수 있다(Theobald, et al., (1995) supra). 톡신 표지된 sc-TCR p149 분자를 미리 예정된 투여량으로 마우스에 주입시키고 종양 크기에 대한 효과를 sc-TCR 분자의 효능을 나타내기 위하여 측정할 수 있다. 또한, 생명의 연장을 신규한 항-종양 치료의 효능을 평가하는 제 2 기준으로 사용할 수 있다.

다른 적절한 주효인자 또는 태그 분자가 공지되어 있다. 예를들어 하나의 태그가 예로 6xHIS와 같은 생리적 pH에서 전하를 갖는 폴리펩타이드이다. 이 경우에, sc-TCR 분자 또는 가용성 sc-TCR 융합 단백질이 약 pH 6-9에서 6xHIs 태그와 특이적으로 결합할 수 있는 Ni-세파로즈와 같은 시판되는 메탈로-세파로즈 매트릭스에 의해 정제될 수 있다. EE 에피토프 및 myc 에피토프가 적절한 단백질 태그의 추가의 예이고, 이 에피토프는 하나이상의 시판되는 모노클로날 항체에 의해 특이적으로 결합될 수 있다.

본 발명의 sc-TCR 융합 단백질의 분자량은 완전 길이의 C_κ 또는 C_λ 쇄 또는 그의 적절한 단편이 선택되는가, 또는 하나이상의 단백질 태그가 이용되는가를 포함하는 많은 인자에 따라 변한다. 일반적으로, 가용성 융합 단백질은 대략 45 kDA 초과의 분자량을 갖고, 여기에서 V-α 및 V-β 쇄는 약 20 kDA 초과의 분자량, 보다 전형적으로는 약 21 내지 약 26 kDa 의 분자량을 갖는다. 전형적으로, 본 발명의 융합 단백질은 약 50 내지 약 75 kDA의 분자량을 갖는다. 상기 언급된 모든 분 자량은 SDS-PAGE 겔 전기 영동과 같은 통상의 분자량 크기 실험에 의해 결정된다. 일반적으로 상기 Sambrook et al., 상기 Harlow and Lane; .상기 Ausubel et al,을 참조.

일부 세팅에서, 예를들어 sc-TCR의 결합가를 증가시키기 위하여 본 발명의 sc-TCR 단백질을 다가로 만드는 것이 유용할 수 있다. 간략히 말해서, 다가 sc-TCR 단백질을 예를들어 표준 바이오틴-스트렙타비딘 표지 기술을 사용하거나, 라텍스 비드와 같은 적절한 고체 지지체에 콘쥬게이션시켜 하나 내지 네개의 단백질(동일하거나 상이함)을 함께 공유결합시켜 만든다. 화학적으로 가교 결합된 단백질(예를들어 덴드리머(dendrimer)에 가교결합된)이 또한 적절한 다가 종이다. 예를들어, 단백질은 Cys 또는 His와 같은 화학적으로 반응성인 측쇄를 갖는 아미노산 잔기를 코딩하는 서열을 포함하여 변형될 수 있다. 화학적으로 반응성인 측쇄를 갖는 이러한 아미노산은 융합 단백질에서 다양한 위치, 바람직하게는 sc-TCR의 항원 결합 영역에 가까운 곳에 위치시킬 수 있다. 예를들어, 가용성 융합 단백질의 C-β쇄 단편의 C-말단이 이러한 반응성 아미노산을 포함하는 단백질 정제 태그 또는 다른 융합된 단백질에 공유결합될 수 있다. 적절한 측쇄는 다가 분자를 제공하는 적당한 덴드리머 입자에 두개 이상의 융합 단백질을 화학적으로 연결시키기 위하여 포함될 수 있다. 덴드리머는 그 표면에 많은 상이한 기능 그룹중 어느 하나를 가질 수 있는 화학적 합성 중합체이다 (D. Tomalia, Aldrichimica Acta, 26:91: 101(1993)). 본 발명에 따라 사용하기 위한 예시적인 덴드리머는 시스테인 잔기를 결합시킬 수 있는 예로 E9 스타버스트(starburst) 폴리아민 덴드리머 및 E9 콤버스 트 폴리아민 덴드리머를 포함한다.

또한, 융합 단백질을 포함하는 세포의 활성을 증가시키기 위하여 본 발명의 가용성 단백질 및 다른 성장제, 특히 T-세포 공자극 인자, 예를들어 B-7 유전자계(예, B7-1 또는 B7-2)를 코딩하는 DNA를 작제하는 것이 또한 바람직하다.

본 발명의 가용성 단백질은 초항원을 검출하고 특성화시키기 위하여 사용될 수 있다. 예를들어, 본 발명의 방법은 다음과 같이 T-세포용 비특성화된 에피토프를 맵핑(map)하는데에 사용될 수 있다: 랜덤 펩타이드 또는 선택된 펩타이드의 라이브러리(library)를 코딩하는 서열이 펩타이드 라이브러리로 제공될 수 있다. 이어서 라이브러리를 본 발명의 가용성 sc-TCR, 바람직하게는 검출가능하게 -표지된 융합 단백질(예를들어, 방사성 원자 또는 형광분자로 표지된)로 스크리닝한다. 융합 단백질에 의해 특이적으로 결합된 펩타이드가 융합 분자로부터 방출되고 이어서 증폭된다. 펩타이드의 서열 분석은 융합 단백질에 의해 결합된 서열을 동정한다. 또한, 클로닝된 펩타이드 서열은 융합 단백질의 V-α 및 V-β쇄에 상응하는 TCR을 발현하는 T-세포에 결합하는 것에 대해 시험될 수 있다. 수개의 랜덤 펩타이드 라이브러리중 어떠한 하나도 적절하게 이용될 수 있다(참조, 예를들어 J. Scott et al., Science (1990) 249: 386; J. Devlin et al., Science, (1990) 249: 404; S. Cwirla et al., PNAS(USA), (1990); 87:6378; J. Hammaer et al., J. Exp. Med.(1992) 176:1007; Rhode, P.R. et al. J. Immunol. (1996) 157: 4885; and D. O'Sullivan et al., J. Immunolo, (1991) 147:2663).

고도로 유용한 단일-쇄 클래스 I 또는 클래스 II MHC/펩타이드 복합체(종종 scMHC 클래스 I 또는 클래스 II 복합체)가 공개된 PCT 출원들인 PCT/US95/09816 및 PCT/US97/01617 및 1995년 2월 1일 계류중인 U.S. 특허출원 제 08/382,454에 개시되어 있다. 공개된 PCT 출원 PCT/US95/09816, PCT/US97/01617, 및 계류중인 U.S. 출원 제 08/382,454 호에는 본 명세서에 개시된 sc-TCR의 기능을 시험하기에 쉽게 채택될 수 있는 고도로 유용한 시험관내 및 생체내 T-세포 결합 분석이 개시되어 있다. 상기 공개된 PCT 출원들인 PCT/US95/09816, PCT/US97/01617, 및 계류중인 U.S. 출원 제 08/382,454 호의 개시는 본 명세서에 참고로 인용된다.

T-세포의 활성을 조절하는(즉, 증식과 같은 T-세포 활성의 감소 또는 제거) 본 발명의 sc-TCR 단백질의 능력을 상기 공개된 PCT 출원들인 PCT/US95/09816, PCT/US97/01617, 및 상기 계류중인 U.S. 출원 제 08/382,454 호에 개시된 분석을 수행하기 위한 분석 및 물질에 따라 쉽게 결정될 수 있다.

보다 구체적으로, 상기 공개된 PCT 출원들인 PCT/US95/09816, PCT/US97 /01617, 및 계류중인 U.S. 출원 제 08/382,454 호에 개시된 바와 같이, 시험관내 분석은 분자가 T-세포 활성을 조절할 수 있는지를 결정하기 위하여 수행될 수있다. 이러한 분석은 sc-TCR 단백질의 기능성을 결정하기 위하여 변형될 수있다. 일반적으로, 예시적 분석이 하기 순서적 단계 1-4에 의해 다음과 같이 수행된다. T-세포는 적절하게는 분석될 수있고, T-세포 활성화, 또는 활성화후 T-세포 활성의 조절을 나타내는 마커를 발현한다. 따라서, 선행 출원에 개시된 바와 같이, 활성화시 인토류킨-2(IL-2)을 발현시키는 쥐 T-세포 하이브리도마 DO 11.10이 이용될 수있다. LL-2 농도는 특히, 특정 sc-TCR 융합 분자가 T-세포 하이브리도마의 활성을 조절할 수 있는지를(예를들어, IL-2 생성을 감소시킴) 결정하기 위하여 측정할 수있다. 이러한 적절한 분석의 일반적인 예는 다음의 순서적 단계에 의해 수행된다:

1. 본 발명의 sc-TCR 단백질에 상응하는 TCR을 포함하는 T-세포 하이브리도마 또는 T-세포를 수득한다.

2. T-세포 하이브리도마 또는 T-세포를 증식을 가능케하는 조건하에서 배양한다.

3. 증식하는 T-세포 하이브리도마 또는 T-세포를 이어서 하나이상의 sc-TCR 융합 단백질과 접촉시킨다.

4. T-세포 하이브리도마 또는 T-세포를 TCR과 특이적으로 결합하고 T-세포 하이브리도마 또는 T-세포를 활성화시킬 수있는 리간드와 접촉시킨다. 예시적인 리간드에는 초항원, 상기 개시된 바와 같은 본 펩타이드를 갖는 sc-MHC 클래스 I 또는 II 복합체, 또는 적절한 APC와 같은 항원을 포함한다.

5. T-세포 하이브리도마 또는 T-세포를 활성화에 필요한 시그널을 제공하는 적절한 공자극 인자와 접촉시킨다. T-세포 하이브리도마 또는 T-세포를 마커, 예를들어 IL-2 생산에 대해 분석한다. IL-2-생산에서의 감소, 예를들어 24시간후 IL-2 생산에서의 40 퍼센트 또는 그이상의 감소는 sc-TCR 융합 단백질이 리간드와 결합하고, 따라서, T-세포의 활성을 조절할 수 있는 것을 나타낸다.

상기 공개된 PCT 출원들인 PCT/US95/09816, PCT/US97/01617, 및 상기 계류중인 U.S. 출원 제 08/382,454 호에 개시된 바와 같이, 분석에서 이용되는 T-세포는 보통 증식에 적절한 조건하에서 배양한다. 예를들어, DO11.10 T-세포 하이브리도 마를 완전 배양 배지(10% FBS, 페니실린/스트렙토마이신, L-글루타민 및 5x10-5 M 2-머캅토에탄올로 보충된 RPMI 1640)에서 약 37℃ 및 5% CO₂에서 적절하게 배양했다. 융합 단백질의 일련의 희석물을 전형적으로 10^-8 내지 10^-5 M의 농도로 T-세포 배양 배지에 첨가할 수 있다. T-세포 활성화 시그널은 바람직하게는 적절한 항원이 적재된 항원 제시 세포에 의해 제공된다. 약간 최대 이하의 T-세포 활성을 제공하는 항원 투여량 및 APC 넘버들의 사용이 융합 단백질로 T-세포 반응을 억제하는 것을 검출하는데에 바람직하다고 믿어진다. sc-TCR과 접촉에 이어 IL-2 생산에서의 감소는 융합 단백질이 T-세포의 활성을 조절한다는 것을 나타내다.

IL-2와 같은 발현된 단백질의 측정보다는, 상기 공개된 PCT 출원들인 PCT/US95/09816, PCT/US97/01617, 및 상기 계류중인 U.S. 출원 제 08/382,454 호에 앞서 개시된 바와 같이, T-세포 활성화의 조절은 본 분야에 인식된 바와 같이 방사성표지 기술에 의해 측정된 바와 같은 항원-의존 T-세포 증식에서의 변화에 의해 적절하게 결정될 수 있다. 예를들어, 검출가능하게 표지된(예를들어, 트리티움화) 뉴클레오타이드를 분석 배양 배지에 도입시킬 수 있다. 이러한 태그된 뉴클레오타이드의 DNA로의 삽입은 T-세포 증식 측정 기능을 한다. 이 분석은 예를들어 T-세포 하이브리도마의 성장에 대해 항원 제시를 요구하지 않는 T-세포에는 적절하지 않다. 이는 포유동물로부터 단리된 비형질전환된 T-세포에 대한 T-세포 활성화의 조절 측정에는 적절하다. 융합 단백질과 접촉에 의해 T-세포 증식 수준에서의 감소는 분자가 T-세포의 활성을 조절하고 면역 반응을 억제할 수있다는 것을 나타 낸다. 시험관내 T-세포 증식 분석은 생체내에서 T-세포 콜로니 확장에서의 항원-특이적 변화에 대한 항원 단백질의 효과를 측정하는데에 바람직하다. IL-2 생성 또는 T-세포 증식의 측정은 sc-TCR 융합 단백질이 T-세포 활성화를 변형시킬 수 있는지를 결정하기 위하여 이용될 수 있다. 예를들어, 융합 단백질과의 접촉후 APC-자극된 T-세포의 IL-2 생산에서의 감소는 융합 분자가 T-세포의 활성을 조절하고 T-세포 중재된 면역 반응을 억제할 수 있다는 것을 나타낸다.

일반적으로, 분석에 적절한 T-세포는 포유동물, 예를들어 영장류, 예로 인간 또는 마우스, 래트 또는 토끼와 같은 설치류로부터 단리된 T-세포 하이브리도마 또는 T-세포와 같은 형질전환된 T-세포주에 의해 제공된다. 다른 적절한 T-세포는 1) 공중적으로 이용될 수있거나 공지된 방법에 의해 제조될 수 있는 T-세포 하이브리도마, 2) T-헬퍼 세포, 및 3) T-세포독성 세포, 바람직하게는 세포독성 CD8+ 세포를 포함한다. T-세포는 공지된 방법에 의해 포유동물로부터 단리될 수 있다(참조, 예를들어 R. Shimonkevitz et al., J. Exp. Med., (1983) 158:303).

생체내 분석은 또한 T-세포 발달을 억제하거나 불활성화시키는 능력을 포함하는 T-세포의 활성을 조절하는 가용성 융합 단백질의 능력을 결정하기 위하여 적절하게 이용될 수 있다. 예를들어, sc-TCR 융합 단백질을 면역글루불린 클래스 스위칭(즉, IgM 내지 IgG)을 억제하는 능력에 대해 분석할 수 있다(참조, 예를들어 P. Linsley et al., Science, (1992) 257:792-795)

생체내 진단 영상화 및 HLA 타이핑을 포함하는, 가용성 sc-TCR 단백질을 사용하는 진단 방법이 또한 제공된다(참조, 예를들어 A.K. Abbas, Cellula and Molecular Immunology, page 328(W.B. Saunders Co. 1991). 생체내 영상화 적용경우, 융합 단백질은 방사성 표지(예, ¹²⁵I, ³²P, ⁹⁹Tc) 또는 포유동물에 투여될 수 있는 다른 검출가능한 태그를 포함하며 이 대상(subject)는 sc-TCR의 결합에 대해 공지된 방법으로 스캐닝된다. 이러한 포유동물의 분석은 예를들어 면역 시스템 질환을 수반하는 바람직하지 않은 APC의 발현을 포함하는 많은 질환의 진단 및 치료에서 도움을 줄 수 있다.

자가면역 질환의 치료를 위해 sc-TCR 단백질(또는 가용성 융합 단백질로부터 수득된 sc-TCR)의 사용을 평가하는 분석이 또한 이용될 수 있다. 예를들어, 상기 공개된 PCT 출원들인 PCT/US95/09816, PCT/US97/01617, 및 상기 계류중인 U.S. 출원 제 08/382,454 호에 앞서 개시된 바와 같이, 실험적 알레르기 엔세팔로미엘리티스(EAE)는 마우스에서 자가면역 질환이고, 다발성 경화증에 대한 인식된 모델이다. 하나의 예시적 분석에서, 마우스 스트레인을 EAE가 발생하도록 처리하고, 이어서 적절한 sc-TCR 단백질(또는 가용성 융합 단백질로부터 수득된 sc-TCR)을 투여할 수 있다. 이어서, 동물을 EAE 발생이 융합 단백질 또는 sc-TCR의 투여후 억제 또는 방지되는지를 결정하기 위해서 평가할 수 있다.

앞서 개시된 바와 같은 표적 질환에 대한 예방접종을 포함하는, 면역 반응을 유도하는 본 발명의 sc-TCR 단백질의 능력은 생체내 분석에서 쉽게 결정될 수 있다. 예를들어, sc-TCR 단백질(또는 가용성 융합 단백질로부터 수득된 sc-TCR)을 마우스와 같은 포유동물에 투여할 수 있고, 혈액 샘플을 초기 투여시 및 그후 주기적으로 수회(예를들어, sc-TCR 단백질의 투여후 2, 5 및 8주) 채취한다. 혈청을 혈액 샘플로부터 모으고 면역화에 의해 생긴 항체의 존재에 대해서 분석한다. 항체 농도는 표준 면역학적 기술에 따라 결정될 수 있다.

본 발명은 포유동물, 특히 인간과 같은 영장류의 세포내에서 단백질의 발현을 위해서 sc-TCR 단백질을 코딩하는 DNA 서열을 투여하는 방법을 제공한다. 바람직하게는, 융합 단백질의 코딩 영역을 수반하는 DNA를, 적절하게는 CMV 프로모터와 같은 적절한 프로모터의 조절하에, 공지된 방법에 따라 대상의 골격 근육에 직접적으로 주입한다. 플라스미드 DNA의 투여, 투여된 대상물의 세포에 의한 DNA의 흡수 및 단백질의 발현 방법이 보고되어 있다(참조, J. Ulmer et al. Science, (1993) 259:1745-1749). 가용성 융합 단백질 경우, 일반적으로 코딩된 I_g-C_L 쇄 또는 그의 단편이 이용되는 숙주와 면역학적으로 조화되는 것이 바람직하다.

본 발명의 sc-TCR 단백질은 많은 치료 적용을 갖는다. 예를들어, sc-TCR 단백질은 암, 감염질병, 알레르기 또는 자가면역 질환, 예를들어 다발성 경화증, 인슐린-의존성 당뇨병 멜리투스(mellitus), 류마티스성 관절염등에 걸리거나 걸리기 쉬운 인간과 같은 포유동물을 치료하기위해 포유동물에서 면역 반응을 감소시키거나 제거하기 위하여 투여될 수 있다. 투여는 융합 단백질을 코딩하는 DNA를 직접 투여하는 것과 같은 어떠한 적절한 방법을 통해서 이뤄질 수있다. 치료하기에 적절한 대상은 바람직하지 않은 면역 반응에 걸리거나 걸릴 것 같은 대상, 예를들어 심장, 신장, 피부 또는 다른 기관의 이식과 같은 이식 수술을 겪는 환자이다. 이식 거부를 포함하는 상황에서, 치료 프로토콜은 외과 과정전에 적절하게 시작될 수 있다.

본 발명에 따라 포유동물의 면역 반응을 감소시키거나 제거하는데에 많은 특징적인 접근이 이용될 수 있다. 예를들어, 바람직하지 않은 면역 반응을 감소시키기 위한 하나의 처리 방법은 병원성 T-세포와 초항원 또는 펩타이드-MHC 복합체사이의 상호작용을 감소시키거나 제거하기 위하여 유효량의 원하는 sc-TCR 융합물을 투여하는 것이다. 따라서 T-세포 증식, 분화, 활성화 또는 B 림프구 자극과 같은 T-세포 중재된 면역 반응은 선택적으로 선택적으로 조절될 수 있다. 바람직하게는, 융합 단백질은 바람직하지 않은 면역 반응을 중재하는 병원성 T-세포와 같은 항원에 대해 적어도 동일하거나 바람직하게는 증가된 특이적 결합 친화성을 나타낸다. 이와 관련하여 특히 바람직한 것은 리간드에 대해 증가된 특이적 결합 친화성을 나타내는 앞서 기술된 sc-TCR 융합 단백질 뮤테인(muteins)이다. 융합된 I_g-C_L 쇄 또는 단편은 표준 면역학적 분석에 의해 표적 세포에 결합하는 융합 단백질을 동정하는데에 사용될 수 있다.

본 명세서에 개시된 방법에 따라 제조된 sc-TCR 단백질, 적절한 sc-TCR 융합 단백질로부터 유래된 sc-TCR, 또는 항체의 투여는 포유동물에 주사, 예를들어 복강내 또는 정맥내 주사에 의해 투여될 수 있다. 치료 적용에서 사용된 분자인 융합 단백질은 바람직하게는 포유동물 세포 또는 다른 적절한 세포로부터 생산되고, 사용하기 전에 본질적으로 또는 완전히 피로겐이 없도록 정제된다. 소정의 치료 적용을 위한 최적의 투여량은 통상적인 방법에 의해 결정될 수있고, 일반적으로 투여 경로, 환자의 체중, 일반적인 건강, 성 및 본 분야에 숙련된 자에 의해 인식되는 다른 인자와 같은 많은 인자에 따라 변한다.

투여는 단일 투여량, 분리된 일련의 투여량으로 수일 또는 수주 간격으로 이뤄질 수있다. 본 명세서에서 사용된 용어"단일 투여량"은 단독(solitary) 투여량, 및 또한 서방형 투여량일 수있다. 대상은 포유동물(예, 인간 또는 소와 같은 가축 및 개 및 고양이와 같은 애완동물)이고, sc-TCR, sc-TCR 융합 단백질, 또는 항체를 포함하는 약제학적 조성물로서의 치료를 포함한다. 본 발명의 이러한 약제학적 조성물은 본 분야에 공지된 과정에 따라 제조되고 사용된다. 예를들어, 치료유효량의 융합 단백질을 함유하는 제제는 단위-투여량 또는 다중 투여량 용기, 예를들어 밀봉된 앰플 및 바이알로 제공되고, 멸균 액체 담체의 첨가, 예를들어 사용직전 물 주입만을 요구하는 동결건조 상태로 저장될 수 있다. 리포좀 제제가 많은 적용경우 또한 바람직할 수 있다. 비경구 투여를 위한 다른 조성물이 또한 적절할 수있고, 제제를 의도된 수용자의 혈액과 등장성인 제제를 만드는 항산화제, 버퍼, 정균제 및 용질을 함유할 수 있는 수성 및 비수성 멸균 주사 용액; 현탁화제 및 농후화제를 포함할 수 있는 수성 및 비수성 멸균 현탁액을 포함한다.

T-세포의 반응을 감소시키거나 제거하는 것을 포함하는 본 발명의 방법은 또한 T-세포 중재된 질환의 보다 효과적인 치료를 제공하기 위하여 공지된 면역억제, 항바이러스, 항암 또는 항염증제와 조합하여 사용될 수 있다. 예를들어, 융합 단백질은 사이클로스포린 또는 자가면역질환 및 알레르기의 치료용 코르티코스테로이드 및 비-스테로이드성 약제와 같은 항염증제와 같은 통상적인 면역억제 약제와 조합하여 사용될 수 있다.

상기 언급된 바와 같이, sc-TCR 단백질(또는 원하는 sc-TCR 융합 단백질로부 터 유래된 sc-TCR 분자)이 본 분야에 일반적으로 알려진 기술에 의해 항체를 생산하는데에 사용될 수 있고, 융합 단백질의 정제된 샘플로 만들어진다. 항체를 생성시키기위해 선택된 sc-TCR 융합 단백질은 면역글로불린 쇄에 대해 면역학적 반응을 감소시키기 위하여 상기 기술된 바와 같은 I_g-C_L 쇄 또는 단편으로부터 절단될 수 있다. 수득된 sc-TCR은 면역원으로 사용된다. 항체는 또한 중요한 sc-TCR의 하나이상의 에피토프를 포함하는 면역원 펩타이드로부터 발생될 수있다.

보다 구체적으로, 항체는 포유동물을 단독 또는 적절한 담체와 복합화된 sc-TCR 단백질의 정제된 샘플, 원하는 sc-TCR 융합 단백질로부터 분리된 sc-TCR 분자 또는 상기 언급된 바와 같은 면역원 펩타이드로 면역화시켜 제조할 수 있다. 바람직하게는, sc-TCR 분자는 면역원으로 사용될 수 있다. 적절한 포유동물은 전형적인 실험실 동물, 예를들어 양, 염소, 토끼, 기니아 피그, 래트 및 마우스이다. 래트 및 마우스, 특히 마우스가 모노클로날 항체를 수득하는데에 바람직하다. 항원은 피하, 복강내, 정맥내, 근육내 또는 피내 주사와 같은 많은 적절한 경로에 의해 포유동물에 투여될 수 있다. 최적의 면역화 간격 면역화 투여량등은 비교적 넓은 범위에서 변할 수있고, 경험적으로 이 개시에 기초하여 결정될 수있다. 적절한 과정은 많은 주에 걸쳐 수회의 항원 주사를 포함한다. 항체를 표준 기술에 의해 면역화된 동물의 혈청으로부터 모으고 sc-TCR에 특이한 항첼르 발견하기 위하여 스크리닝했다. 특히 중요한 것은 선형 또는 배좌 에피토프를 인식하는 항체를 포함하는 V-α 또는 V-β쇄, 특히 과가변 영역과 특이적으로 결합하는 항체이다. 모노클로날 항체는 항체를 생산하는 세포에서 생산되고 이들 세포는 하이브리도마 세포를 형성하기 위한 표준 융합 기술을 사용하여 모노클로날 항체를 생성시키는데에 사용될 수 있다(참조, G. Kohler, et al.(1997), Nature, 256:456). 전형적으로, 이는 항체 생산 세포를 하이브리드 세포를 생성하기 위하여 골수종 세포와 같은 영구 세포주와 융합시키는 것을 포함한다. 별도로, 모노크로날 항체는 Huse, et al.((1989), Science, 256:1275)의 방법에 의해 세포로부터 생산될 수 있다.

하나의 적절한 프로토콜은 약 2 내지 7개월의 기간에 걸쳐 수행되는 정제된 sc-TCR 복합체를 포함하는 조성물로 마우스를 복강내 면역화시키는 것을 제공한다. 이어서 비장 세포를 면역화된 마우스로부터 제거할 수 있다. 면역화된 마우스로부터의 혈청을 비장 세포로부터 절개하기전 sc-TCR에 특이적인 항체의 역가를 위해 분석한다. 이어서 절개된 마우스 비장 세포를 하이포크산틴-구아닌 포스포리보실트랜스퍼라제 결핍(HGPRT-) 또는 티미딘 키나제 결핍(TK-)과 같은 마커를 갖는 적절한 동종성 또는 이종성(heterogenic)(바람직하게는 동종성) 림프성 세포에 융합시킨다. 바람직하게는 골수종 세포를 림프성 세포주로서 이용한다. 골수종 세포 및 비장 세포를 골수종 세포 대 비장세포 약 1 대 4의 비율로 혼합한다. 세포를 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 방법으로 융합할 수 있다(참조, 상기 G. Kohler, et al., Nature). 이렇게 클로닝된 하이브리도마를 배양 배지, 예를들어 RPMI-1640에서 배양시킨다(참조, G.E. More, et al.(1967), Journal of American Medicinal Association, 199:549). 융합과정후 배양된 하이브리도마를 정제된 sc-TCR에 특이적으로 결합하는 항체의 분비에 대해 방사성 면역 분석 또는 효소 면역분석에 의해 스크리닝한다. ELISA는 통상적인 방법에 따라 항체를 함유하는 혈청을 스크린 하는데에 사용될 수 있다. 이러한 스크리닝시 양의 결과를 나타내는 하이브리도마는 확장되고 제한 희석 방법에 의해 클로닝될 수 있다. 추가의 스크리닝이 바람직하게는 용액 및 생물학적 샘플에서 sc-TCR에 결합하는 항체를 선택하기 위하여 수행된다. 단리된 항체는 친화성 크로마토그래피를 포함하는 적절한 면역학적 기술에 의해 추가로 정제될 수 있다.

일부 적용 경우, sc-TCR에 특이적으로 결합하는 키메라 항체, 예를들어 비-인간 동물 가변 영역 및 인간 불변 영역을 결합하는 항체로서 항체를 상응하는 비-키메라 항체보다 인간 대상에 덜 면역원성으로 만드는 항체 분자를 생산하는 것이 바람직할 수 있다. 다양한 형의 이러한 키메라 항체가 가변 영역의 부분, 특히 항원-결합 영역의 보존된 영역이 인간 기원이고 오직 과가변 영역이 비-인간 기원인 인간 가변 영역을 생성하는 것을 포함하여 제조할 수 있다. 인간화된 (humanized) 키메라 항체 및 그를 생산하는 방법에 대한 논의를 문헌[S.L. Morison, (1985) Science, 229:1202; Oi et al.(1969), BioTechniques, 4:214; Teng et al.(1983), PNAS. U.S.A., 80:7308; Kozbor et al.(1983), Immunology Today, $:7279; Olsson et al.(1982), Meth. Enzymol., 9:3]을 참조.

상기 언급된 바와 같이, sc-TCR 단백질은 원하는 리간드에 대한 특이적 결합을 개선시키기 위하여 통상적인 돌연변이 유발 기술에 따라 쉽게 변형될 수있다. 예를들어, 원하는 sc-TCR은 상기 기술된 바와 같이 펩타이드 결합 서열에 의해 결합된 적절한 V-α 및 V-β 쇄를 코딩하는 DNA 세그먼트를 단리하여 만들 수 있다. DNA를 원한다면 I_g-C_L에 결찰시키고, 이어서 원하는 V-α 또는 V-β쇄안에 부위 지정된 돌연변이 유발과 같은 돌연변이 처리한다. 예시적인 돌연변이 유발 방법은 알라닌 스캐닝 돌연변이 유발을 포함한다(참조, 예를들어 Nisbet, I.T. et al., (1985) Gene Anal. Tech. 2, 23; Hines, J.C., Gene(1980) 11, 207; 또한 상기 Sambrook et al. 참조). sc-TCR 융합 단백질의 특이적 결합 특이성을 조절하기를 원하는 경우, 선택된 돌연변이는 sc-TCR의 상보적 결정 영역(즉, CDR, 때로 과가변 영역이라고 언급됨)의 결합 친화성에 영향을 끼치는 아미노산 치환이다. 보다 구체적으로, 아미노산 치환은 본 명세서에서 사용된 또다른 아미노산을 sc-TCR중의 하나의 아미노산으로 치환하는 것을 의미하는 보존성 치환 또는 비-보존성 치환이다. 일부 경우에, 치환은 한 아미노산을 실질적으로 유사한 화학적 성질(보존성)을 가진 또다른 아미노산으로 대체하는 것으로 구성된다. 다른 경우에 치환은 실질적으로 상이한 화학적 성질(비보존성)을 갖는 또다른 아미노산으로 대체하는 것으로 구성된다. 따라서, 페닐알라닌 잔기로 대체된 sc-TCR중의 티로신 잔기는 보존성 아미노산 치환을 나타내고, 반면에 프롤린 잔기로 대체된 알라닌 잔기는 비-보존성 치환을 나타낸다. 본 분야에 숙련된 자는 돌연변이유발이 sc-TCR의 V-α및 V-β쇄를 분리하는 펩타이드 결합 서열의 아미노산 조성 및 길이를 변화시킨다는 것을 이해할 것이다. 또한, 돌연변이 유발은 원하는대로 길이 및 아미노산 조성을 변화시킨 I_g-C_L 쇄에 관한 것일 수 있다. 그러나, 대부분의 경우, 돌연변이 유발은 V-α 또는 V-β쇄를 표적화하고, 융합 단백질의 V-α 또는 V-β쇄중에 평균 하나의 아미노산 돌연변이 치환을 제공한다. 돌연변이 유발의 정도는 편리하게는 돌연변이된 V-α 또는 V-β쇄의 DNA를 서열화하여 분석될 수 있다.

바람직하게는, V-α 또는 V-β쇄의 돌연변이 유발은 천연 TCR보다 적어도 2배 높은 수준으로 리간드에 대한 sc-TCR 융합 단백질의 특이적 결합을 증가시킨다.

덜 바람직한 방법이지만, sc-TCR 융합 단백질은 원하는 데로 잘 알려진 화학적 돌연변이 유발 기술에 의해 변형될 수 있다.

본 발명은 또한 리간드와 T-세포 수용체사이의 특이적 결합을 억제할 수 있는 분자를 검출하는 방법을 특징으로 한다. 이 방법은 T-세포 수용체에 특이적으로 결합할 수 있는 리간드의 존재하에서 단일쇄 T-세포 수용체 융합 단백질을 배양시키고; 리간드와 중요한 분자의 존재하에서 단일쇄 T-세포 수용체 융합 단백질을 배양시키며; 분자의 부재 및 존재하에서 리간드와 단일쇄 T-세포 수용체 융합 단백질사이의 상호작용을 평가하는 것을 포함하며, 분자의 부재하보다는 분자의 존재하에서 융합 단백질과 리간드사이의 보다 덜한 상호작용은 리간드와 T-세포 수용체사이의 특이적 결합을 억제할 수 있는 분자를 나타낸다. 이 방법은 원한다면 sc-TCR 융합 단백질대신에 sc-TCR 분자와 함께 사용될 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 용어 항체는 가용성 융합 단백질의 sc-TCR 분자와 결합하는 전체 면역글로불린 및 면역학적으로 활성인 단편을 언급한다. 면역글로불린 및 그의 면역학적으로 활성인 단편은 항체 결합 부위(즉, 융합 단백질과 특이적으로 결합할 수있는 페리토프(peritope))를 포함한다. 예시적인 항체 단편에는 면역글로불린, 단일쇄 면역글로불린, 또는 다른 적절한 항원 결합 단편의 디설파이드 결합을 환원시켜 유래된 "반 분자"인 예를들어 Fab, F(v), Fab', F(ab')2 단편을 포함한다(참조, 예를들어 Bird et al., (1988), Science, 242; Huston et al.(1988), PNAS, (USA), 85:5879; Webber et al.(1995), Mol. Immunol., 32:249). 항체 또는 그의 면역학적으로 활성인 단편은 동물성(예, 마우스 또는 래트와 같은 설치류), 또는 키메라 형태일 수 있다(참조, Morrison et al.(1984), PNAS, 81:6851; Jones et al.(1986), Nature, 321).

용어 "특이적 결합" 또는 유사한 용어는 또다른 분자와 결합하여, 특정 결합 쌍을 형성하는 본 명세서에 개시된 분자를 의미한다. 그러나, 이 분자는 본 분야에 알려진 웨스턴 블로팅 ELISA, RIA, 운동 이동 분석(mobility shift assay), 효소-면역 분석, 캄피티티브 분석, 포화 분석 또는 다른 단백질 결합 분석에 의해 결정된 다른 분자를 인식하거나 결합하지 않는다(참조, 일반적으로 상기 Ausubel, et al.; 상기 Sambrook, et al,; 상기 Harlow and Lane)(참조 문헌은 분자들 사이의 특이적 결합을 검출하는 방법의 예에 대하여 인용된다).

실질적으로, 순수한 가용성 융합 단백질 또는 핵산은 적어도 약 90 내지 95% 순수 및 바람직하게는 적어도 98% 내지 99% 이상, 보다 순수하게는 약제학적 용도로 순수하다. 일단 부분적으로 또는 실질적인 순도로 정제되면, 가용성 융합 단백질은 치료적으로(몸 밖 포함), 또는 본 명세서에 개시된대로 시험관내 또는 생체내 분석을 수행하는데 있어서 사용될 수 있다.

본 명세서에 언급된 모든 문헌은 그들 전체로 본 명세서에 참고로 인용된다.

하기 비-제한적인 실시예는 본 발명의 예시이다.

실시예 1. 가용성 sc-TCR 융합 단백질의 작제

쥐 DO11.10 세포 TCR의 DNA 서열이 보고된 바 있다[참조:Kappler, J. et al, PNAS(1994) 91 8462). TCR 은 I-A^d MHC 클래스 II 분자와 관련하여 아미노산 323-339에 걸친 닭의 오브알부민 펩타이드(즉, OVA)를 인지하고 결합한다. TCR을 코딩하는 DNA는 일반적으로 상기 문헌[Kappler and Marrack]에 개시된 방법에 따라 제조하였다.

요약하면, 올리고-dT 코팅된 자기(magnetic) 비드를 제조회사(Dynal)의 지시에 따라 사용하여 1×10⁶ DO11.10 세포로부터 mRNA를 단리시켰다. DO11.10 mRNA 와 함께 C-α특이적 "백(back)" 프라이머(primer), KC113(SEQ ID NO.6)를 포함하는 혼합물을 인큐베이션하여 TCR α쇄 cDNA를 제조하였다. 이어서, 표준량의 뉴클레오타이드 및 역전사효소를 혼합물에 가하여 cDNA 를 형성하였다. "백" 프라이머 KC111(SEQ Id NO. 4)가 KC113 프라이머 대신에 사용된다는 점을 제외하고 유사한 방법으로 β쇄 cDNA를 제조하였다. PCR 반응에서 프라이머 KC112(SEQ ID NO. 5) 및 KC113과 함께 알파쇄 cDNA를 주형(template)으로 사용하여, 650bp 5'XhoI-3'XmaI α쇄 단편을 증폭시켰다. 5' 및 3' 말단에 각각 SfiI 및 SpeI 부위를 포함하는 프라이머 KC111 및 KC110(SEQ ID NO. 3)을 사용하여 750bp쇄 단편을 PCR-증폭시켰다.

DO11.10 TCR 의 공유결합된 V-α쇄와 V-β쇄를 포함하도록 sc-TCR 을 작제하였다. 일부 경우, V-α쇄는 추가로 C-β쇄 단편 및 C-β쇄 단편을 포함할 수 있다(참조 : 도 5). 더 큰 C-α쇄가 하기 실시예 4에 개시되지만, 일반적으로 Cα 쇄 단편은 길이가 약 9 아미노산 사이었다. C-β쇄는 전형적으로 전체 길이의 C-β쇄의 아미노산 잔기 127의 시스테인 잔기 직전의 아미노산 잔기 126에서 절단된다. 이러한 시스테인 잔기를 포함하는 것이 sc-TCR 발현에 해롭다는 것이 밝혀졌다.

실시예 2. E. coli 에서 sc-TCR 융합 단백질을 발현하기 위한 벡터

박테이로파지 코팅 단백질에 융합된 sc-TCR 분자를 코딩하는 DNA 세그먼트(segment)(유전자 III 또는 유전자 VIII)를 포함하는 DNA 벡터의 작제는 상기 출원 중인 U.S.특허 출원 제08/813,781호에 기술되어 있다. 요약하면, 가용성 융합 단백질을 코딩하는 본 DNA 벡터를 작제하기 위해서 상기 출원중인 U.S.특허 출원의 선택된 DNA 벡터를 변형하였다. 실시예 4-7을 참조하라.

A. DNA 벡터 pJRS149

pJRS149 DNA 벡터는 pBluScript^TM (Invitrogen) 백본(backbone)을 갖는 파지미드(phagemid)이다.

B. DNA 벡터 pKC12

박테리오파지 유전자 III을 코딩하는 DNA 를 도 1에 예시된 pKC12 벡터에 클로닝하였다.

C. DNA 벡터 pKC14 및 pKC15

박테리오파지 유전자 VIII DNA 서열을 프라이머 OPR156("프론트(front)" SEQ ID NO. 58) 및 OPR 157("백" SEQ ID NO. 59)를 사용하여 주형으로서의 fd tet 박테리오파지(ATCC 번호 제37000호)로부터 PCR 증폭시켰다. 유전자 VIII PCR 생성물을 XmaI-EcoRI 단편으로서 벡터 pLL001로 클로닝하여 벡터 pKC14를 생성시켰다. pLL001 플라스미드는 PUC-19 DNA로부터 유도되었고, XmaI 및 EcoRI 부위를 폴리결합(polylinker) 영역에 포함하였다. 상기 부위는 유전자 VIII 세그먼트를 서브클로닝하기에 용이하다. 추가로 pLL001 벡터를 셔틀 벡터로 사용하여 유전자 VIII DNA 를 클로닝하였다. 벡터 pKC15 는 96 bp NcoI-EcoRI 단편을 도 1에 나타낸 pJRS149 벡터로 클로닝하여 pKC 14 로부터 유도되었다. NcoI-EcoRI 단편은 다중 클로닝 부위(예를 들어, SfiI, NcoI, SpeI. XhoI 및 XmaI), pelB 리더, phoA 프로모터 및 유전자 VIII 유전자를 갖는 합성 폴리결합을 포함한다. 벡터 pKC15는 pJRS149 백본으로부터 유래된 제2 pelB 리더를 갖고, 디-시스트론 오페론 조절 하에서 유전자 클로닝을 가능하게 한다.

D. DNA 벡터 pKC16 및 pKC18

pKC16으로부터의 XhoI-XmaI 단편을 클로닝하기 위해 알파쇄 cDNA 를 주형으로 사용하며, 프라이머 KC113(SEQ ID NO. 6)("프론트") 및 KC112(SEQ ID NO. 5)("백")를 사용하여 TCR V-α, C-α 유전자를 증폭시켰다. 프라이머 KC 110(SEQ ID NO. 3)("프론트") 및 KC111(SEQ ID NO. 4)("백")과 주형으로 β쇄 cDNA를 사용하는 PCR을 이용하여 V-β, C-β 유전자 단편을 증폭시켰다.

E. DNA 벡터 pKC27, pKC42 및 pKC44

프라이머 JA301(SEQ ID NO. 95) 및 JA302(SEQ ID NO. 96)을 어닐링하여 (annealing) 벡터 pKC27을 작제하여 (G4S)4 폴리펩타이드 결합을 제조하였다. 상기 결합을 이어서 SpeI-XhoI 단편으로서 pKC15 벡터로 클로닝하였다. V-α 13.1 및 V-β, C-β 영역을 이후 각각 pKC27 DNA로 클로닝하였다. 요약하면, 프라이머 KC114(SEQ ID NO. 7)("프론트") 및 KC126("백")(SEQ ID NO. 19)및 주형으로서 벡터 pKC16 DNA를 사용하여 PCR 증폭으로 V-α 13.1 유전자 단편을 제조하였다. V-α13.1 유전자를 SfiI-SpeI 단편에 클로닝시켰다. V-β8.2, 및 C-β쇄 DNA를 XhoI 및 XmaI로 pKC18을 분해한 후 겔정제하였다. 단편을 pKC42로 클로닝하여 pKC44 벡터를 제조하였다. 일반적으로 pKC44 벡터는 sc-TCR을 sc-TCR/유전자 VIII 융합 단백질로서 phoA 프로모터의 전자 조절 하에 포함하였다.

F. pKC12, pKC45, pKC46, 및 pKC51 DNA 벡터

pKC12로부터 벡터 pKC45, pKC46, 및 pKC51의 작제를 도 3에 나타내었고, 하기와 같이 기술한다.

pKC12 벡터를 변형하여 실시예 1의 sc-TCR을 코팅하는 DNA가 lacZ 프로모터의 전사 조절 하에 발현되었다. 요약하면, 어닐링된 프라이머 KC134(서열번호 27)("프론트") 및 KC135(서열번호 28)("백")를 pKC 12로 클로닝함으로써 pKC 12 벡터를 변형하여 벡터 pKC45를 제조하였다. 변형은 XmaI 부위를 SfiI 및 EcoRI 부위를 이미 포함하는 pKC12의 폴리결합 영역에 첨가하였다. 추가로 pKC45는 EE-태그의 5' 말단 및 앰버(amber) 종결 코돈에 결합된 유전자 III을 코딩하는 DNA 서열을 포함하였다.

앰버 종결 코돈은 lacI^q 앰버 억제 호스트, 예를 들어, XL1-blue 중에서 sc-TCR 융합 단백질 발현 수준을 약 15-20%로 감소시켰다. sc-TCR/유전자 III 융합 단백질을 코딩하는 DNA를 pKC45로 클로닝하기 위하여 pKC44 DNA를 SfiI 및 XmaI로 절단하였다. sc-TCR 단편을 이후 겔 정제하고, pKC45로 클로닝하여 pKC46을 제조하였다. pKC46의 sc-TCR 삽입물을 EE-태그 및 유전자 III 코트 단백질에 융합된 도 3에 도시하였다.

pKC44 및 pKC46 벡터를 XmaI 및 EcoRI로 분해시켜(digest) sc-TCR/유전자 VIII 융합 단백질을 lacZ 프로모터의 전사 조절 하에 두었다. 유전자 VIII DNA 서열을 분해된 pKC 44 DNA로부터 단리하고, SfiI-EcoRI 단편으로서 겔-정제된 벡터 DNA pKC46으로 클로닝하여 벡터 pKC51을 제조하였다. 벡터 pKC51에서 sc-TCR 삽입물을 이후 유전자 VIII 코트 단백질에 융합시켰다. pKC46과 달리 pKC51 벡터는 EE-태그 또는 앰버 종결 코돈을 포함하지 않는다.

실시예 3. 융합 단백질을 코딩하는 DNA의 DNA 벡터 pEN2로의 클로닝

도 4에 도시한 바와 같이 pEN2 벡터로 서브클로닝하여 실시예 1에서 제조한 가용성 sc-TCR의 발현을 증가시켰다. pEN2 벡터는 phoA 프로모터, 유전자 10 리보솜 결합 부위, 및 변형된 pelB 리더를 포함한다. pEN2 벡터 백그라운드 중에서 sc-TCR 삽입물 pKC60 및 pKC67 를 도 5에 도식적으로 나타내었고 하기와 같이 기술한다.

A. DNA 벡터 pKC60의 작제

1204 bp SfiI-EcoRI 단편을 pEN2에 도입하여 pKC60 벡터를 제조하였다. SfiI-EcoRI 단편은 V-α 및 V-β, C-β 영역으로 구성된다. 주형으로서 pKC51 DNA를 증폭시키고 프라이머 KC114("프론트" 서열번호 7) 및 JWTCR208("백" 서열번호 75)를 사용하여 단편을 제조하였다. JWTCR209 프라이머는 EE-태그 및 C-영역의 XmaI 부위 3' 을 포함하였다. XmaI 부위의 첨가는 유전자 III 및 유전자 VIII 유전자의 클로닝을 용이하게 하였다. sc-TCR XmaI-EcoRI 단편을 상기한 바와 같이 pEN2 벡터로 클로닝하여 pKC60 벡터를 제조하였다.

B. DNA 벡터 pKC61 의 작제

sc-TCR의 절단된 형을 제조하기 위하여, 벡터 pKC46의 V-α, V-β 서열을 프라이머 KC115("프론트" 서열번호 8) 및 JWTCR209("백" 서열번호 74)로 PCR-증폭시켰다. 생성된 PCR 증폭 생성물을 벡터 pKC60으로 서브클로닝하여 벡터 pKC61을 수득하였다. 6XHis 태그를 EE-태그 서열의 3' 말단에 첨가하여 pKC61 벡터를 추가로 변형시켰다.

C. pKC62 및 pKC64 DNA 벡터의 작제

박테리오파지 유전자 III을 코딩하는 DNA를 주형으로 pKC46 벡터 DNA를 사용하여 프라이머 TCR215(서열번호 6F) 및 218(서열번호 64)로 증폭시키고 pKC60으로 클로닝하여 벡터 pKC64를 제조하였다. 유전자 VIII 유전자를 주형으로 벡터 pKC51 DNA를 사용하여 프라이머 TCR212(서열번호 71) 및 213(서열번호 70)으로 증폭시키고, pKC60 으로 클로닝하여 벡터 pKC62를 제조하였다.

D. DNA 벡터 pKC63 및 pKC65 의 작제

각각의 유전자 단편을 PCR 증폭시킨 후, 유전자 III(pKC65) 및 유전자 VIII(pKC63) 융합 단백질을 벡터 백본 pKC61로 클로닝하였다. 그러면, pKC65 및 pKC63은 프라이머 서열에서 코딩된 6xHis 꼬리(tail)를 포함할 것이다.

E. pKC66 및 pKC67 DNA 벡터의 작제

주형으로 pKC51 DNA를 사용하고, 프라이머 KC114(프론트 서열번호 7) 및 JWTCR217(백 서열번호 66)를 사용하여 V-α 및 C-α쇄의 처음 8개의 아미노산을 포함하는 SfiI-SpeI 단편을 증폭시켜 pKC66 및 pKC67 벡터를 제조하였다. pKC66 및 pKC67 벡터를 제조하기 위하여 KC114 및 JWTCR 217- 프라이머를 사용하여 TCR DNA를 PCR-증폭시키고, 이후, 증폭된 DNA를 이전에 SfiI 및 SpeI로 분해된 pKC62 또는 pKC60으로 서브클로닝하였다. 이러한 벡터는 각각 C-α 영역의 N-말단으로부터 8개의 아미노산 잔기를 포함한다. 벡터가 하기 TCR 라이브러리의 작제에 사용된다. 벡터 pKC66은 유전자 VIII 유전자를 포함한다.

계류중인 미국특허 출원 제08/813,781호에 개시된 바와 같이, DNA 벡터 pKC46(pSUN18) 및 pKC62(pSUN19)는 부다페스트 조약에 따라 MD 록빌(Rockville) 파크론(Parklawn) 드라이브 12301에 소재하는 어메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(ATCC)에 기탁되었다. DNA 벡터는 ATCC에 1997. 2. 26일자로 기탁되어 수탁번호 제97895호(pSUN18) 및 제97896호(pSUN19)를 부여받았다. DNA 벡터 pKC62(pSUN19)는 phoA 프로모터, 변형된 pelB 서열, 유전자 10 리보솜 결합 부위 및 박테리오파지 유전자 VIII 프로모터를 포함한다. DNA 벡터 pKC46(pSUN18)은 lacZ 프로모터, EE 태그 및 박테리오파지 유전자 III 단백질을 포함한다. DNA 벡터는 E. coli 또는 다른 적합한 숙주 세포에서 표준 방법에 따라 증식시킬 수 있다.

DNA 벡터 pKC46(pSUN18) 및 pKC62(pSUN19)는 다양한 Vα, Vβ-Cβ 및 폴리펩타이드 결합 서열을 수용하기 위하여 설계되었다. 두 DNA 벡터의 Vα쇄를 SfiI 및 SpeI 과의 제한 분해에 의하여 제거할 수 있다. Vβ-Cβ쇄를 XhoI-XmaI 으로의 제한 분해에 의하여 제거할 수 있다. 추가로 DNA 벡터는 펩타이드 결합서열을 SpeI 및 XhoI 으로의 제한 분해에 의하여 교환할 수 있다.

실시예 4 : 벡터 pKC24, pKC73, pKC74, pKC75의 작제

쥐 IgG 카파쇄와의 단백질 융합으로서 실시예 1 에서 제조한 DO11.11 sc-TCR 을 발현시키기 위하여 DNA 벡터를 작제하였다.

쥐 IgG 카파쇄에 융합된 DO11.11 sc-TCR 을 코딩하는 DNA 세그먼트를 포함하는 DNA 벡터를 제조하기 위하여, pKC16의 VαCα쇄를 프라이머 KC114(서열번호 7) 및 KC117(서열번호 10)로의 PCR로 재증폭시켜 5'SfiI-3'SpeI 단편을 제조하였다. DNA를 pKC15로 클로닝하고 시퀀싱하였다. 정확한 단편을 제한 분해시키고 SfiI-SpeI 분해된 pKC15 DNA 벡터로 결합시켜 pKC24 벡터를 수득하였다. pKC15 및 pKC16 작제물의 유래를 상기 실시예 2C 및 2D에서 기술하였다.

그후 pKC24 DNA를 프라이머 KC114(서열번호 7) 및 KC165(서열번호 131), KC114 및 KC116(서열번호 132), 및 KC114 및 KC167(서열번호 133)로의 PCR에서 주형으로 사용하여 다른 길이의 C-α쇄를 가하여 V-α쇄를 제조하였다. 이러한 PCR 생성물을 DNA 서열 결정을 위한 pGEM-T 이지 벡터 시스템(Easy Vector System, Promega)으로 클로닝하였다. 정확한 단편을 제한분해하고 발현 벡터 pKC60으로 클로닝하였다. 3개의 단편 모두에서, C-α쇄 단편은 시스테인 잔기로 종결되었다. 이러한 "최종" 시스테인은 세린 잔기로 변화되었으나 내부의 시스테인은 돌연변이시키지 않았다. 최종 작제물 pKC73은 C-α쇄의 22개의 아미노산을 갖고, pKC74는 72개의 아미노산을 가지며, pKC75는 90개의 아미노산(즉, 전체 C-α쇄)을 갖는다. pKC73, pKC74 및 pKC75 DNA 벡터 삽입물을 도 9A에 도식적으로 나타내었다.

V-βC-β쇄를 프라이머 JWTCR222(서열번호 60) 및 JWTCR208(서열번호 75)을 사용하여 5'SfiI-3'XmaI 단편으로서 PCR 증폭시켰다. 이것을 시퀀싱하고 (쇄만의 음성대조군)으로서 발현 벡터로 클로닝하였다.

실시예 5 : 포유동물 세포에서 가용성 DO11.10 sc-TCR 융합 단백질의 작제 및 발현

유의량의 가용성 sc-TCR을 제조하는 것이 매우 바람직하다. 가용성 단백질 발현 수준을 증가시키기 위하여, sc-TCR 작제물을 포유동물 세포 발현 시스템으로 클로닝하였다.

상기 실시예 3A, E 에서 기술한 바와 같이 제조된 E. coli DNA 작제물 pKC60 및 pKC67을 프라이머 KC169(서열번호 143) 및 KC170(서열번호 144)로의 PCR로 재증폭시켜 5'Agel-3'BstBl sc-TCR-IgG 카파쇄(C_κ) 융합 유전자를 제조하였다. TCR-IgC_κ 발현 벡터의 작제는 다음과 같다: 벡터의 백본은 플라스미드 pCDNA3(Invitrogen)이다. 이 플라스미드를 HindIII/XhoI 절단하고 "경쇄 폴리결합" DNA 단편을 삽입하여 출발 "경쇄 벡터"를 제조하였다. 이 결합은 제한 부위 HindIII, KpnI, ClaI, PmII, EcoRV, AgeI, XmaI, BamHI 및 XhoI 을 포함하여 플라스미드 pCDNA.LCPL 을 제조하는 연속된 클로닝 단계가 용이하다. 경쇄 리더, 항-DKMB 카파 경쇄 유전자 단편, 및 3'UTR 을 포함하는 SmaI/BeII DNA 단편을 pCDNA3.LCPL 의 EcoRV/BamHI 부위로 클로닝하였다. 이 단편의 마우스 카파 인트론, 엑손 및 3'UTR을 리차드 니어(Richard Near) 박사로부터 받은 pNeo/26-IOVL(Near, r., et al., (1990), Mol. Immunol. 27:901-909)로부터 유래되었다. 이후, NruI(209bP), MIuI(229bP), 및 BstBI(2962bp)를 제거하고 NheI(1229bp) 및 BamHI(1214bP) 부위를 도입하기 위하여 돌연변이를 수행하여 pCDNA3mut. LCPL.LCVK 를 제조하였다.

이후, 벡터로부터 가변 경쇄 CKMB V_κ를 제거하기 위하여 벡터를 추가로 변형시켰다. 플라스미드 pCDNA3mut.LCPL.LCVK 를 EcoRV/XhoI 로 분해하고 EcoRV, AgeI, BstBI, 및 XhoI 부위를 포함하는 결합 올리고뉴클레오타이드 단편을 삽입하여 수행하여 pSUN9를 제조하였다.

프라이머 세트 KC169 프론트(5'gAg gTg ACC ggT, gAg, Cag, TAC g TTT gTC Tcg gCC CCA g-3) 및 KC170 백(5'gTg gAg TTC gAA Aag TgT ACT TAC g TTT gTC TgC Tcg gCC CCA g-3)을 사용하는 PCR 증폭 후, DO11.10 sc-TCR을 AgeI/BstBI 단편으로서 pSUN6 벡터로 클로닝하여 pSUN27 벡터(pKC60-M)를 작제하고 벡터를 sc-TCR-_κ 불변 융합 단백질로서 발현시켰다.

pSUN27 주형 DNA를 또한 프라이머 KC169(서열번호 143) 및 KC201(서열번호 145)를 사용하여 PCR로 증폭시켜 IgG 카파쇄 융합없이 5'Agel-3'BstBl sc-TCR을 제조하였다. pKC73, pKC74 및 pKC75 DNA를 또한 프라이머 쌍으로 PCR 증폭시켜 적합한 포유동물 발현 벡터로 결찰시키기 위한 sc-TCR 및 sc-TCR-IgG C_κ 융합 단편을 제조하였다.

예를 들어, DO11.10 sc-TCR-IgG C_κ 융합 단편을 DNA 서열 결정을 위한 pGEM-T 이지 벡터 시스템(Promega)으로 클로닝하였다. 정확한 단편을 제한 분해시키고 포유동물 발현 벡터로 클로닝하였다. 생성된 포유동물 발현 벡터는 CMV 프로모터, 네오마이신 내성 유전자, 마우스 IgG 카파 리더 펩타이드, 마우스 카파 인트론 및 마우스 카파 불변영역 엑손 서열을 포함한다. 생성된 벡터를 pKC60-M(pSUN27) 및 pKC67-M으로 명명하였다. 이들 벡터의 sc-TCR 삽입물을 도 9A에 나타내었다. 벡터를 도 10에 나타내었다.

CHO 세포를 차가운 PBS로 세척하여 형질감염을 위하여 준비하였다. 세포를 PBS에 재현탁하고 10-40㎍ Pvul 선형 pKC60KM과 혼합하였다. 얼음상에서 10분 후, 하나의 250볼트, 960μ Fd 펄스를 전달하기 위한 Gene Pulser(BioRad) 세트를 사용하여 세포를 일렉트로포레이션시켰다(electroporate). 펄스된 세포를 얼음 상에 놓고, 10% IMDM 배지(IMDM, 10% FBS, 2mM 글루타민, 5000 유니트/ml 페니실린, 5000㎍/ml 스트렙토마이신)을 가하였다. 세포를 희석하고, 96웰 플레이트에 플레이팅하였다. 37℃에서 10% CO₂ 로 밤새 배양후, 세포에 네오마이신 선택 배지(IMDM, 0.77mg/ml G418)를 공급하고, 이후 3-7일마다 행하였다. 오직 음성 대조군으로서의 세포 및 PBS를 사용하여 "모의(mock)" 형질감염을 수행하였다.
ELISA 분석 포맷 중에서 항-이디오 타입, 항-DO11.10 TCR mAb, KJ-1을 사용하여 가용성 sc-TCR-IgG C_κ 분자의 발현에 대하여 형질감염체를 스크리닝하였다. 이전에 공개된 sc-TCR에 관한 보고서는 작용성 TCR 및 항-이디오 타입 mAb에 대한 결합과의 강력한 상관관계, 즉, 항-이디오 타입 mAb에 의해 인식된 sc-TCR은 반드시 MHC와 관련된 펩타이드를 인식할 수 있음을 나타낸다. 문헌[Relter, Y., et al., (1995) Immunity 2, 281-287)을 참조하라. 형질감염체를 스크리닝하기 위하여, 96웰 플레이트를 중탄산나트륨 완충용액, pH 8.2 중의 KJ-1로 밤새 수동 코팅하였다. 분석일에, 플레이트를 3-5% 탈지분유(NFDM)로 최소한 1시간 차단하였다. 웰을 세척하고, 형질도입체의 상등액을 플레이트에 가하였다. 배양 및 세척후, 바이오티닐화된 항-Cβ mAb H57-597 (ATCC-수탁번호 제HB-218)를 플레이트에 30분간 가하고, 세척하고, 스트렙타비딘(streptavidin)-HRP 로 배양하였다. TMB 기질을 가하여 양성 웰을 확인하고, 1N 황산으로 퀀칭하고, 450nM에서 흡광도를 측정하였다. E. coli 에서 제조된 정제된 sc-TCR을 표준 참조로 사용하였다.

다중 양성 형질감염체를 확인하였으나, 가장 묽은 플레이트의 클론만이 증식을 위하여 선택되었다. 4개의 클론을 본래의 96웰로부터 계대하기 전에 ELISA로 재시험하였다. 이러한 초기 정량 스크리닝에 기초하여, 클론이 200-400ng/ml 범위의 가용성 DO11.10 sc-TCR-IgG C_κ 를 생산한다. 데이터는 가용성 sc-TCR-IgG C_κ 융합 단백질이 정확하게 폴딩된 Vα 및 Vβ 쌍을 가짐을 강력히 암시한다.

pSUN27 벡터를 부다페스트 조약에 따라 상기한 주소에 소재한 ATCC 에 기탁하였다. DNA 벡터를 ATCC 에 1997. 9. 17일자로 기탁하고, 수탁번호 제209276호를 부여받았다. pSUN27 벡터는 CMV 프로모터, 쥐 경쇄 리터 서열, 코자크(Kozak) 공통 서열, 및 쥐 C_κ 유전자 인트론 및 엑손 서열을 포함한다. 도 10 및 상기 문헌[Near, et al.]을 참조하라.

pSUN27 벡터는 다양한 sc-TCR 분자가 쥐 C_κ 쇄와 융합할 수 있도록 설계되었다. 예를 들어, 원하는 sc-TCR 분자를 pSUN27 벡터에 삽입하기 위하여, 벡터 폴리결합 서열을 제한 효소 Age I 및 BSTBI 으로 분해하고, Age I 및 BSTBI 또는 Cla I 로 분해된 sc-TCR 분자로 결합시킬 수 있다. 또한, pSUN9 벡터는 몇몇 Ig-C_L쇄 또는 다른 Ig-C_L쇄 단편을 수용할 수 있다. 예를 들어, 인간 C_κ쇄를 포함하는 가용성 융합 단백질을 작제하기 위하여, pSUN9 벡터를 BstBI 및 XhoI 로 분해한다. 인간 카파 단편을 벡터 pDRHK 로부터 EcoNI 및 XhoI 로 제한 분해하여 수득하고, pSUN9 벡터의 BstBI 및 XhoI 부위로 클로닝하였다.

pDRHK 벡터를 부다페스트 조약에 따라 상기한 주소에 소재한 ATCC 에 기탁하였다. DNA 벡터를 ATCC 에 1997. 9. 17일자로 기탁하고, 수탁번호 제209274호를 부여받았다. pDRHK 벡터는 CMV 프로모터, 쥐 IgC 카파 리더 펩타이드, 클로닝 영역, 마우스 카파 인트론 및 인간 카파 불변 도메인 엑손 서열을 포함하는 포유동물 발현 벡터이다.

도 12는 CHO 세포가 생산한 단일쇄 TCR(DO11.10)-카파 융합의 웨스턴 블랏을 나타낸다. 친화성 정제(2 레인) 이전에 플로우-스루(flow-thru) 분획(3 레인)으로부터 상등액을 취한다. 5㎕ 샘플을 2x SDS-크래킹 완충액과 1:1 비로 혼합하고 변성 및 비-환원 조건하에서 12% SDS-PAGE 상에서 러닝시켰다. 2단계 검출 시스템을 사용하여 단백질을 검출하였다. 먼저, 막을 바이오틴 표지된 H57 mAb 로 1:5000 희석에서 프로브(probe)하고, 이어서 스트렙타비딘-호스래디쉬(horseradish) 퍼옥시다제(1:2500)으로 배양하였다. 데이터는 CHO 세포에 의한 sc-TCR-카파 융합의 발현을 나타내고, CNBr 활성화된 세파로스 비드와 커플링된 H57 mAb 가 sc-TCR-카파 융합을 배양 상등액으로부터 효율적으로 제거하기 위하여 사용될 수 있음을 암시한다.

도 13은 정제된 sc-TCR(DO11.10)-카파 융합의 웨스턴 블랏을 나타낸다. sc-TCR-카파 융합(도 12 참조)을 포함하는 300ml의 배양 상등액을 H57 mAb 친화성 컬럼에 통과시켰다. 표준 친화성 크로마토그래피 방법은 하기와 같고, sc-TCR-카파 융합을 0.1M 글리신 pH 3.0 중의 컬럼에서 용리시켰다. 1 레인은 E. coli(양성 대조군)가 생산한 sc-TCR(DO11.10)을 나타내고, 약 50킬로달톤(kD)에 이동하였음을 나타낸다. 2-4 레인은 정제 sc-TCR(DO11.10)-카파 융합이 가장 높은 농축물(2 레인)으로부터 가장 낮은 농축물(4 레인) 까지 진행함을 나타낸다. 막은 반드시 도 12에 기술한 바와 같은 방법으로 프로브되었다.

도 14는 정제된 sc-TCR-카파 융합의 쿠마시 브릴리언트 블루 염색을 나타낸다. 2개의 항체 친화성 컬럼을 사용하여 정제를 수행하였다. 제1단계로 sc-TCR-카파 융합을 포함하는 배양 상등액을 KJ-1 항체 컬럼에 통과시켰다. KJ-1은 DO11.10 TCR 의 정확한 쌍의 Va 및 Vb쇄를 인지하는 항-클로노타입 mAb이다. 1 레인(가장 큰) 내지 3 레인(가장 작은)은 정제된 sc-TCR-카파 융합의 분액을 나타낸다. KJ-1 컬럼으로부터의 정제된 sc-TCR-카파 융합을 포함하는 분획을 풀링시킨 후, 샘플을 H57-mAb 컬럼에 통과시켰다. 5 및 6 레인은 정확한 크기의 단백질 분자가 풍부함을 나타낸다. 샘플을 변성 및 비-환원 조건하에서 12% SDS-PAGE 상에서 러닝시키고, 완료 후 겔을 쿠마시 브릴리언트 블루로 염색하였다.

3-도메인 sc-TCR-카파 융합 및 4-도메인 sc-TCR-카파 융합의 일시적(transient) 발현 연구를 수행하였다. COS 세포를 일시적으로 플라스미드 pKC60-M(pSUN27), 3-도메인 sc-TCR 또는 pKC75-M, 4-도메인 sc-TCR로 형질도입시켰다. 48시간 후, 1ml의 배양 상등액을 0.5㎍의 mAb F23.1(항-Vb8.2)로 밤새 배양하였다. 다음날 sc-TCR-카파 융합과 F23.1 mAb 사이에 형성된 면역 복합체(immune complex)를 염소 항-마우스 코팅된 자기 비드(Dynal)를 사용하여 침전시켰다. 잘 세척한 후, 비드를 10㎕의 1x SDS-크래킹 완충액에 현탁시키고 끓였다. 변성 및 비-환원 조건하에 12% SDS-PAGE 겔상에서의 전기영동 및 단백질의 이동 후, sc-TCR-카파 융합 분자에 대한 나일론 막의 프로빙을 바이오틴 표지된 H57 mAb 및 스트렙타비딘-HRP 컨쥬게이트(conjugate)를 사용하여 수행하였다. 결과를 도 15에 나타내었다. 1 레인은 모의 형질전환된 COS 세포로부터의 상등액으로 배양한 음성 대조군 F23.1이고; 2 레인은 pSUN27(3-도메인 sc-TCR, Vα-VβCβ-카파 융합으로 구성)이며; 4 레인 및 5 레인은 2개의 다른 pKC75-M 단리물(4-도메인 sc-TCR, 추가로 Cα 단편 포함)이다. 중요한 것은 4-도메인 sc-TCR-카파 융합도 또한 발현되 고, 3-도메인 sc-TCR 보다 좋지 않은 경우, pSUN27 sc-TCR-카파 융합과 달리, pKC75-M 융합은 호모다이머 및 모노머로서 모두 외견상 동등한 비로 존재한다.

도 16은 일시적으로 발현된 sc-TCR(DO11.10)-카파 융합 변이체의 ELISA를 나타낸다. KJ-1 및 항-클로노타입 mAB가 포획을 위하여 사용되는 샌드위치 ELISA를 사용하여 sc-TCR 융합 분석을 수행하고, 결합된 sc-TCR-카파 융합을 검출하기 위하여 바이오틴-표지된 H57 mAb 및 스트렙타비딘-HRP를 사용하였다.

도 17은 sc-TCR(p-149)-카파 융합 단백질의 포유동물 세포 발현을 검출하기 위한 샌드위치 ELISA를 나타낸다. 웰은 Vα2.3에 특이적인 mAb 로 코팅되고, 결합된 sc-TCR 융합을 mAb 항-Vβ11 또는 mAb H57을 사용하여 검출하였다.

도 18은 COS 세포에서 sc-TCR p149 및 sc-TCR p149 카파 융합 단백질의 일시적 발현을 나타낸다. sc-TCR의 설계는 카파 불변 도메인이 있거나 없는 Vα-Cα_8.2-Vβ/Cβ이다. 세포가 α-V_α2.1 mAb 로 코팅된 샌드위치 ELISA를 사용하여 발현된 단백질을 검출하고, 수용체를 α-V_β11.0 바이오틴-표지된 mAb 및 스트렙타비딘-HRP을 컨쥬게이트로 결합시켜 검출하였다.

실시예 6 : E. coli 에서 가용성 p-149 sc-TCR 융합 단백질의 작제 및 발현

T 세포 클론, p-149는 HLA-A2.1에 의하여 제한된 Hu 야생형 p53의 펩타이드(STPPPGTRV)를 인지한다. 문헌[Theobald, M. et al., (1995) PNAS(USA)92, 11993-11997)을 참조하라. T 세포 수용체 유전자를 이미 가용성 TCR 및 작용성 수용체 분자를 생산하는 것으로 나타난 3 도메인 단일쇄 형태로 클로닝하였다.

요약하면, mRNA를 T 세포 클론으로부터 단리시키고, cDNA를 마라톤(Marathon) cDNA 증폭 키트(Clontech)를 사용하여 제조하였다. cDNA를 프라이머 KC171(서열번호 134) 및 KC173(서열번호 136)과의 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)에서 주형으로 사용하여 5'SfiI-3'SpeI V( 쇄 단편을 생산하고, 다시 프라이머 KC171(서열번호 134) 및 KC174(서열번호 137)로 C 쇄의 7개의 아미노산이 포함된 유사한 V( 단편을 생산하였다. 이후, 동일한 cDNA가 PCR 주형으로서 프라이머 KC172(서열번호 135) 및 KC176(서열번호 138)과 사용되어 5'XhoI-3'XmaI VβCβ쇄 단편을 생산하였다. Cβ쇄를 전체 길이 Cβ쇄의 아미노산 127에서의 시스테인 잔기 앞에서 절단하였다.

α 및 β 쇄 단편을 DNA 서열 결정을 위한 pGEM-T 이지 벡터 시스템으로 클로닝하였다. 정확한 단편을 제한 분해하고 발현 벡터 pKC60 또는 pKC67로 클로닝하여 Vα-(G₄S)₄-VβCβ sc-TCR 분자를 제조하였다.

pKC60 및 pKC67 벡터를 적합한 제한 효소로 분해하여 단일쇄 분자를 코딩하는 이전의 유전자 단편을 분리하고 p-149 α 및 β쇄 단편으로 결찰할 수 있도록 하였다. 신규 벡터를 pNAG1 및 pNAG2로 명명하였다. pNAG1 및 pNAG2 벡터의 DNA 삽입물을 도 9B에 나타내었다.

VβCβ 유전자를 포함하는 DNA 단편을 프라이머 KC199(서열번호 139) 및 KC176(서열번호 138)을 사용하여 5'SfiI-3'XmaI 단편으로서 PCR 증폭시켰다. 이것을 시퀀싱하고 β쇄-만의 음성대조군으로서 발현 벡터로 클로닝하였다.

K91 E. coli 세포를 sc-TCR 작제물 pNAG1으로 형질전환(transformation)시켰다. 형질전환된 세포를 단백질 유도를 예방하기 위한 고인산염 배지에서 밤새 증식시킨 후, 세척하고, 인산염-결핍 배지에 재현탁시켜 sc-TCR 단백질이 발현되도록 하였다. 요약하면, 진탕 플라스크에서 밤새 증식시킨 후, 세포를 인산염 결핍 배지에서 수회 세척하였다. sc-TCR 융합 단백질의 발현을 세척된 세포를 인산염 결핍 배지에서 재현탁시켜 개시시켰다. 약 4 시간 유도 후, 세포를 수획하였다. 전형적으로, 4 시간의 유도 시간이 예를 들어, 웨스턴 블롯 분석에 의하여 결정된 바와 같은 적합한 수준의 가용성 sc-TCR 융합 단백질을 생산하였다. phoA 프로모터 조절 하에서 더 많은 수율의 sc-TCR 융합 단백질(예를 들어, 약 10 내지 400mg)을 세포를 3 및 10리터 발효조 또는 다른 대규모 분취 용기, 예를 들어 바이오반응기(bioreactor)에서 증식시켜 얻을 수 있다.

느린 유도 조건하에서 sc-TCR 융합 단백질의 발현이 융합 단백질의 가용성 발현을 용이하게 함이 밝혀졌다.

실시예 7 : 포유동물 세포에서 가용성 p-149 sc-TCR 융합 단백질의 작제 및 발현

E. coli DNA 작제물 pNAG1 및 pNAG2를 프라이머 KC203(서열번호 140) 및 KC204(서열번호 141)를 이용한 PCR에서 주형 DNA로서 사용하여 5'AgeI-3'ClaI sc-TCR-카파쇄 융합 단편을 생산하였다. 동일한 주형 DNA가 프라이머 KC203(서열번호 140) 및 KC205(서열번호 142)를 이용한 PCR에 의하여 증폭되어 카파쇄 없는 발현을 위한 5'AgeI-3'ClaI sc-TCR을 생산할 수 있다. 포유동물 세포를 DNA로 형질감염시키고, ELISA 분석에 의하여 sc-TCR 단백질 발현을 스크리닝하였다.

실시예 8 : sc-TCR 융합 단백질 스트레인의 생산

sc-TCR 융합 단백질의 가용성 발현을 극대화하기 위하여 특이적 E. coli 균주를 선별하는 것이 바람직하다. 예를 들어, 주지된 몇몇의 E. coli 균주를 sc-TCR 융합 단백질(예를 들어, XL1-B, MM294, TB1, UT5600 및 K91Kan)을 발현하는 능력에 대하여 분석할 수 있다. 요약하면, 숙주 세포 스트레인을 예를 들어, pKC60, pKC73, pKC74 또는 pKC75로 형질전환시키고, 코딩된 sc-TCR 융합 단백질의 발현에 유리한 조건하에 증식시킬 수 있다. 이후, 형질전환된 스트레인을 30℃ 인산염 배지 증식에 적응시킨다. 인산염 결핍 배지에서 증식시켜 sc-TCR 융합 단백질을 유도하였다. sc-TCR 발현 수준은 sc-TCR 융합 단백질을 특이적으로 인식하는 항체로 프로브된 웨스턴 블롯을 포함하는 몇몇 통상적인 방법으로 결정될 수 있다.

요약하면, 형질전환된 세포의 5 OD/ml 세포 현탁액 5㎕를 12% SDS-PAGE 겔상에 가하고, 표준 웨스턴 블롯 기술에 따라 블롯으로 전이시켜 웨스턴 블롯을 수행한다. 블롯을 예를 들어, 캘리포니아 샌디에고의 샌디에고 대학 Gernot Walter 연구소로부터 허가된 항-EE 태그 항체로 프로브하여 sc-TCR을 검출한다. 대안으로, 다른 항-EE 태그 항체 및 EE-태그를 사용할 수 있다(예를 들어, Pharmacia 로부터 수득한 것). 항체 결합 후, 염소 항-마우스-HRP 표지 컨쥬게이트를 첨가한다(Jackson 연구소).

계류중인 미국특허 출원 제08/813,781호에서 E. coli 스트레인 K91KAN 이 sc-TCR 분자, 특히 pKC60 벡터를 포함하는 융합 단백질의 발현에 매우 적합함이 밝혀졌다. K91KAN 균주는 유의량의 본 sc-TCR 융합 단백질을 생산할 수 있다.

실시예 9 : sc-TCR 융합 단백질의 정제

여기에서 개시된 sc-TCR 융합 단백질은 원하는 경우, 형질전환된 세포로부터 면역친화성 크로마토그래피로 통상의 방법에 따라 정제할 수 있다. 박테리오파지 코트 단백질을 포함하는 sc-TCR 융합 단백질의 정제 방법이 계류중인 미국특허 출원 제08/813,781호에 개시된 바 있다.

요약하면, 하나의 적합한 정제 방법은 다음과 같다. 크로마토그래피 컬럼을 단백질-A 코팅된 세파로스 비드 ml 당 약 5mg의 햄스터 항-마우스 αβ TCR 항체 H57-597(ATCC 수탁번호 제HB-218호)에 커플링시킬 수 있다. 50g의 발효조-유래 세포 페이스트를 100의 용해 완충액(0.05M 트리스, pH 8.0, 150mM NaCl 및 5mM EDTA)에 용해시켜 E. coli 용균물을 제조하였다. 재현탁된 세포를 프렌치 프레스를 2 회 통과시켜 용균시켰다. 불용성 물질을 10,000g 에서 20분간 원심분리하여 제거히였다. 상등액을 보유하고, 항체 컬럼에 0.2ml/분의 유속으로 적용시켰다. 이어서, 컬럼을 20 컬럼 부피의 PBS 로 세척하고, 결합된 sc-TCR 융합 단백질을 0.1M 글리신 pH 3.0 에서 용리시키고, 1ml 분획물을 0.05ml의 2M 트리스, ph 8.0을 포함 하는 튜브에 모았다. sc-TCR을 포함하는 분획물을 풀링(pooling)시키고, 4 리터의 PBS 에 대하여 밤새 투석하였다. 다음날 정제된 단백질을 센트리콘(centricon) 여과 장치(mw 100 차단)를 사용하여 5 내지 10배 농축시켰다.

sc-TCR 융합 단백질 제제의 순도를 몇 가지 공지된 방법, 예를 들어, SDS-PAGE 겔 전기영동과 이어서 쿠마시 브릴리언트 블루 염색으로 측정하였다. 단백질 강도를 상기 실시예 5 에 개시된 방법으로 또는 항체 H57-597을 사용하여 결정하였다. 대안으로, 작동 가능하게 결합된 EE 태그를 포함하는 DNA 벡터를 위하여, EE 태그 항체를 프로브(probe)로 사용할 수 있다. EE 항체는 9개의 아미노산 선형 에피토프를 인식한다. 항-Glu-Glu (EE) EEEEYMPME(SEQ ID NO. 98)

실시예 10 sc-TCR 융합 단백질의 특성화

계류중인 U.S. 출원 제 08/813,781 호에 개시된 하기 분석법은 본 발명의 sc-TCR 융합 단백질의 특징을 밝히는데에 사용될 수 있다.

A. 분자량

DO11.10 sc-TCR 융합 단백질 경우 상기 실시예 5에 언급된 바와 같이, 다른 sc-TCR 융합 단백질의 분자량은 통상적인 SDS-PAGE 겔 전기영동후 은 염색 또는 쿠마시 브릴리언트 블루와 같은 염색에 의해 결정될 수 있다. U.S. 출원 제 08/813,781 호는 SDS-PAGE 전기영동을 사용하여 sc-TCR 분자의 분자량을 결정하는 예를 제공한다. 대부분의 sc-TCR 단백질의 분자량은 일반적으로 40 내지 60 Kd, 바람직하게는 약 45 내지 58 Kd의 범위일 것으로 예상된다.

B. 항체 경쟁

항-αβTCR mAbs의 패널은 본 명세서에 언급된 sc-TCR 융합 단백질, 특히 마우스 카파쇄를 포함하는 것의 특징을 밝히는데에 사용될 수 있다. 예를들어, 햄스터 mAb, H57-597은 C-β영역상의 에피토프를 인식한다. 단일쇄 가변쇄상에 가깝게 위치한 에피토프에 결합하는 선택된 항체사이의 경쟁 효과를 분석하는 경쟁 시험을 수행하는 것이 가능하다. 예를들어, MR5-2 및 H57-597 항체는 적절한 Vα, Vβ 영역을 포함하는 sc-TCR 융합 단백질상의 에피토프를 맵핑하는데에 사용될 수 있다. 계류중인 U.S. 출원 제 08/813,781 호에 개시된 바와 같이, MR5-2 및 H57-597 항체는 가깝게 위치한 에피토프를 인식한다는 것이 밝혀졌다. 다른 항체가 9개 아미노산 EE 서열과 같은 태그를 특이적으로 인식하는 것을 포함하는, 가용성 융합 단백질의 sc-TCR 부분의 특징을 추가로 밝히는데에 사용될 수 있다.

C. 배좌 폴딩(folding)

다양한 항-이디오타입 mAbs가 본 명세서에 개시된 sc-TCR 융합 단백질의 Vα,β 영역의 적절한 폴딩에 대해 시험하는데에 사용될 수있다. 예를들어, U.S. 출원 제 08/813,781 호에 개시된 바와 같이, pKC60 DNA 벡터에 의해 코딩되는 융합 단백질은 항-V-β8.2 항체(MR5-2 및 F23.1)의 결합에 의해 및 항-이디오타입 mab KJ1(Drs. Kappler and Marrack으로부터의 친절한 선물) 으로 입증된 바와 같이 적절하게 폴딩되어 있다. 간략하게는, sc-TCR 융합 단백질을 4℃에서 밤새 항-V-β8.2 항체와 배양하고 다음날 염소 항-마우스 코팅된 자기 비드(Dynal)와 결합시켰다. 물질을 실온(RT)에서 추가로 1 시간 동안 배양시켰다. 면역 복합체를 가 표준 과정에 따라 침전시켰다. 그후 비드를 비-특이적으로 결합된 단백질을 제거하기 위하여 0.5 ml의 PBS+0.5 M NaCl로 철저하게 세척하였다. 4회 세척후, 자기 비드를 β-2 머캅토에탄올이 있거나 없는 SDS를 함유하는 50㎕의 크래킹 버퍼중에 재현탁시키고, 3분동안 비등시켰다. 자기 비드를 제거하고, 용액을 12% SDS-PAGE에 적재시키고 120볼트에서 1시간동안 런닝시켰다. 샘플을 전기영동시키고 블랏을 항-TCR 항체-HRP 표지된(Pharmingen으로부터 입수된 H57) 또는 항-EE 태그 항체로 프로빙하여 샘플에 웨스턴 블랏을 수행하였다.

상기 실시예 5는 D011.10 sc-TCR 단백질 융합의 적절한 폴딩을 시험하기 위하여 사용된 특별한 항-이디오타입 항체를 개시하고 있다.

D. 표면 플라즈몬 공명(Surface Plasmon Resonance)(BioCore)

본 발명의 sc-TCR 융합 단백질의 특징을 밝히는데에 표면 플라즈몬 공명을 사용할 수 있다. 예를들어, 계류중인 U.S. 출원 제 08/813,781 호에 개시된 바와 같이, pKC51에 의해 코딩되는 sc-TCR 융합 단백질의 특징은 표면 플라즈몬 공명을 사용하여 밝힐 수 있다. 융합 단백질은 제조자(Pharmacia)의 일반적인 지시에 따라 MR5-2 또는 H57 항체로 코팅된 바이오센서 칩상에 sc-TCR 분자를 먼저 포획하여 통상적인 샌드위치 분석으로 검출하였다. 일반적으로 항체중 하나가 sc-TCR 융합 단백질을 포획하는데 사용하면, 다른 항체는 샌드위치 복합체를 형성하는데에 사용하였다. 데이타는 두개의 항체가 가변 쇄의 상이한 영역들을 인식하고 sc-TCR과의 결합에 경쟁한다는 것을 나타냈다.

초항원(즉, SAg)은 MHC 포맷으로의 제시와 관계없이 일부 V-β쇄와 결합할 수 있다. TCR과 SAg사이의 상호작용은 V-β쇄의 과가변 4(HV4) 영역내에서 일어난다. HV4 영역과 SAg 상호작용은 배좌 의존성이기 때문에, 표면 플라즈몬 공명은 sc-TCR 융합 단백질이 칩상에 코팅된 SAg에 결합하는지를 결정하기 위하여 사용될 수 있다. SAg는 TCR V-β8.2와 결합하는 것으로 알려졌다. 표면 플라즈몬 공명을 사용하여 보고된 가장 높은 친화력은 5x10^-5 몰이어서, 상호작용이 TCR-MHC/펩타이드의 상호작용과 비교될만 한 것으로 믿어진다.

초항원과 결합하는 단일쇄 가변영역을 포함하는 sc-TCR 융합 단백질을 작제하는 것은 본 발명의 범위내에 속한다. 예를들어, 계류중인 U.S. 출원 제 08/813,781 호에 개시된 바와 같이, SEC3로서 알려진 스트렙토코커스(Streptococcus) SAg(Toxin Technology, Tampa FL.)는 V-β8.2 영역을 포함하는 sc-TCR 분자와 결합한다. 개시된 바와 같이, 초항원을 표준 아민 커플링 화학을 이용하여 칩에 커플링시켰다. 정제된 융합 단백질을 대략 2μM 내지 16 μM 범위의 농도로 1분당 2 ㎕의 유속으로 칩을 통과시켰다. 대조군으로서, 블랭크 칩에 대한 융합 단백질의 비-특이적 결합을 SEC3 코팅된 칩에대한 특이적 결합을 측정하는 실험과 병행하여 수행하였다. 결합 데이타를 두칩사이의 sc-TCR 결합에 있어서의 차이를 비교하여 수집하였다. 데이타는 sc-TCR 분자와 칩상의 SEC3 SAg사이의 특이적 상호작용이 있다는 것을 나타냈다. 이들 데이타는 sc-TCR 분자가 배좌적으로 정확한 V-β8.2 영역을 포함함을 나타냈다.

계류중인 U.S. 출원 제 08/813,781 호에는 pKC60 벡터에 의해 생성된 융합 단백질이 Biocore에 의해 결정된 SEC3 초항원과 결합한다고 개시되어 있다. 관련 된 Biocore 실험을 정확한 폴딩을 결정하기 위하여 초항원과 결합할 수 있는 본 발명의 sc-TCR 융합 단백질상에서 수행할 수 있다.

실시예 11- OVA 특이적 T-세포 하이브리도마 결합 분석에서 융합 단백질의 활성

sc-MHC 클래스 I 또는 II 분자를 포함하는 MHC 복합체의 기능성을 시험하기 위한 분석이 상기 공개된 PCT 출원, 제 PCT/US95/09816 호, PCT/US97/01617 호 및 상기 계류중인 U.S. 특허출원 제 08/382,454 호에 개시되어 있다. 보다 특히, 공개된 PCT 출원 PCT/US97/01617에는 T-세포 하이브리도마 세포 분석, 이러한 분석에서 사용하기 위한 세포(예를들어 DO11.10), 공유결합되거나 비공유적으로 결합된 펩타이드(예, OVa 또는 HSV gD12 펩타이드)를 수반하는 sc-MHC 클래스 I 및 II 분자가 개시되어 있다.

상기 개시된 분석은 특히 본 명세서에 개시된 sc-TCR 융합 단백질의 기능성을 결정하기에 특히 적합하다. 일반적으로 말해서, 분석은 sc-TCR 융합 단백질의 기능 및 생물학적 활성을 결정하기 위하여 사용될 수 있는 세포-기초 경쟁 억제 분석이다. 예를들어, 상기 실시예 1 및 2에서 생산된 가용성 융합 단백질은 DO11.10 세포가 MHC 분자의 컨텍스트(context)에서 초항원 또는 항원과 결합하는 것을 차단하는데 사용될 수 있다. 앞서 개시된 방법에 따라, 상호작용은 IL-2 생산을 측정하여 검출된다.

A) T-세포 하이브리도마 세포 분석

T-세포 하이브리도마 분석이 공개된 PCT 출원, 제 PCT/US95/09816 호, PCT/US97/01617 호 및 상기 계류중인 U.S. 특허출원 제 08/382,454 호에 개시되어 있다. 분석은 본 발명의 sc-TCR 융합 단백질의 기능성을 시험하는데에 쉽게 적응된다.

간략히 해서, DO11.10 T-세포 하이브리도마주는 닭 오브알부민(ovalbumin)으로부터 유래된 17개 아미노산 OVA 펩타이드 단편(아미노산 323-339)에 특이적인 세포 표면 T-세포 수용체를 발현한다. OVA 펩타이드는 쥐 클래스 II ㅡMHC 분자 I-Ad를 발현하는 APC에 의해 DO11.10 세포에 제시된다. 펩타이드가 적절한 APC에 의해 제공될 때, DO11.10 세포는 IL-2를 생산하여 반응하고, 이는 T-세포의 활성화의 척도로서 사용될 수 있다. 예시적인 T-세포 하이브리도마 세포 분석이 하기에 간략하게 기술된다.

sc-IA^d/OVA 복합체를 sc-TCR 융합 단백질을 갖는 DPBS(Mg²⁺ 및 Ca²⁺ 이온이 없는)로 희석시키고, 96 웰 플레이트의 웰에 수동적으로 코팅시킨다. 바람직하게는, sc-IAd/OVA 펩타이드는 공유결합된 제시된 펩타이드를 포함한다. 실온에서 밤새 배양후, 웰을 Mg²⁺ 및 Ca²⁺ 이온이 없는 DPBS로 2회 세척할 수 있다. 1x10⁵ DO11.10 세포를 0.5 ㎍ MHC/펩타이드 분자로 코팅된 웰의 존재 또는 부재하에서 37℃에서 4 또는 7시간 동안 배양시킨다. 관련된 실험에서, sc-TCR 융합 단백질은 DO11.10 세포와 함께 첨가될 수 있다.

DO11.10 주로부터 유래된 sc-TCR 융합 단백질의 특이성을 입증하기 위해서( 참조, 상기 실시예 1 및 2), IAd에 의해 제한되나 HSV 펩타이드를 인식하는 제 2 T-세포 하이브리도마(gD)가 사용될 수 있다. gD T-세포 하이브리도마가 공개된 PCT 출원 PCT/US97/01617에 개시되어 있다. 이 분석은 sc-TCR 융합 단백질이 DO11.10 하이브리도마 세포에 의한 IL-2의 생산을 억제할 수 있고, gD 12 T-세포 하이브리도마에 의한 IL-2 생산에 대해 억제 활성이 있다 하더라도 거의 없다는 것을 나타내기 위해 사용된다. 배양은 96웰 평저 마이크로티터 플레이트중의 완전 배양 배지(10% FBS, 페니실린/스트렙토마이신 및 L-글루타민으로 보충된 RPMI 1640)중에서 수행된다. 4 또는 7시간의 배양후, 배양 상등액을 IL-2 샌드위치 ELISA를 사용하여 IL-2의 존재에 대해 분석하였다.

적절한 IL-2 검출 프로토콜이 상기 공개된 PCT 출원, 제 PCT/US95/09816 호, PCT/US97/01617 호 및 상기 계류중인 U.S. 특허출원 제 08/382,454 호 및 08/596,387 호에 개시되어 있다. 적절한 IL-2-샌드위치 ELISA 프로토콜이 특히 PharMingen에 의해 기술된대로 필수적으로 수행되는 것이다. 간략히, 웰을 50 ㎕ 의 2㎍/ml 래트 항-마우스 IL-2-항체로 코팅시킨다. 항체는 4℃에서 밤새 배양한후, 수동 확산에 의해 플라스틱에 결합한다. 플레이트는 PBs/0.5% Tween-20중에서 2회 세척하고, 이어서 100㎕의 세포 배양 상등액을 각 웰에 첨가하고, 실온에서 4시간동안 배양시킨다. 이어서 플레이트를 바이오티닐화 래트 항-마우스 IL-2 항체인 제 2 항체를 첨가하기전에 PBS/Tween 으로 6회 세척한다. 이 항체를 RT에서 1시간동안 배양하고, 이어서 플레이트를 PBS/Tween으로 6회 세척한다. 마지막으로 25 ㎍/ml의 스트레파비딘 퍼옥시다제 100㎕를 각 웰에 첨가하고 RT에서 30분간 배 양시킨다. PBS/Tween에서 8회 세척하고, 100 ㎕의 ABTS 기질을 첨가하고, 신호를 OD 405 nm에서 읽는다. 생성된 IL-2의 농도를 IL-2 표준 곡선에 대해 플로팅하여 정량화한다.

DO11.10 및 gD12 세포의 활성화를 위한 I-A^d/펩타이드 분자의 최적 용량은 약간 최대이하의 반응을 제공하는 것이다. 따라서, 0.5 ㎍의 I-A^d/펩타이드로 코팅된 웰로 4 또는 7시간동안 배양하여 수행할 수 있다.

일반적으로, 본 발명의 가용성 sc-TCR 융합 단백질을 약 10^-9 내지 10^-4 M 범위의 농도에 걸쳐 DO11.10 세포에서 IL-2 생산을 차단하는 능력에 대해 시험할 수 있다. 약 10:1 내지 1:1 몰비의 가용성 sc-TCR 및 플레이트에 코팅된 I-Ad/펩타이드 분자로 시험을 수행할 수 있다. 농도는 필요에 따라 조정할 수 있다. 가장 바람직하게는, 가용성 sc-TCR 융합 단백질로 예비배양한후 gD 12 IL-2 생산에 비한 DO11.10 IL-2 생산의 감소가 가용성 sc-TCR 융합 단백질이 TCR 특이적 방식으로 면역 반응을 억제할 수 있음을 가리킬 것이다.

TCR은 MHC/펩타이드에 대한 낮은 결합 친화력을 가지므로, 저해 분석에서 sc-TCR 융합 단백질을 사용하여 IL-2 생산의 감소를 관찰하는 것이 언제나 가능한 것은 아니다. 그러나, 하기하는 바와 같이 다가 sc-TCR 융합 단백질을 제조함으로써 상호작용의 친화력을 증가시킬 수 있다. sc-TCR 융합 단백질의 친화력을 증가시킴으로써(또한 그의 해리를 방해함으로써), 더 적은 TCRs이 MHC/펩타이드 복합체에 결합할 기회를 갖는 것으로 믿어진다.

실시예 12: 다가 융합 단백질의 제조

몇몇 잘 알려진 방법을 다가 분자를 제조하는데 이용할 수 있다. 다가 sc-TCR 융합 단백질을 표준 방법에 따라 본 발명의 sc-TCR 융합 단백질을 바이오티닐화한후, 스트렙타비딘 첨가후 분자를 가교-결합시켜 제조할 수 있다. 바이오틴-스트렙타비딘 컨쥬게이션은 다가 sc-TCR 융합 단백질을, 전형적으로는 4량체 형태로, 제조한다.

또한 본 다가 sc-TCR 융합 단백질을 공지의 방법에 따라(Newman, S.L. 등, J. Immunol. (1995) 154, 753 참조) 융합 단백질을 라텍스 비드(Polysciences, Inc. Warrington, PA)에 가교결합시켜 제조할 수 있다. 예를들어, sc-TCR 융합 단백질을 아민 그룹 또는 디설파이드 그룹을 통해 비드에 직접 커플링시킬 수 있다. 라텍스 비드를 스트렙타비딘이나 sc-TCR에 특이적으로 결합하는 항체로 코팅하여 sc-TCR의 변성을 최소화할 수 있다. 예를들어, sc-TCR이 EE-태그를 포함하는 경우 라텍스 비드를 코팅하는데 EE-태그 항체를 사용할 수 있다.

실시예 13: 인 비트로에서 항원 자극된 T-세포 증식에 대한 sc-TCR 융합 단백질의 영향

본 발명의 sc-TCR 융합 단백질을 항원 자극된 T-세포 증식을 억제하는 능력에 대해 시험할 수 있다.

예를들어, 공개된 PCT 출원 제 US95/09816, PCT/US97/01617 및 계류중인 U.S. 특허출원 제 08/382,454 호에 개시된 예시적인 방법에서 T-세포를 처음에 마 우스와 같은 포유동물로부터 단리한다. 예를들어, 완전 프로인트 어쥬번트내의 OVA 323-339-KLH 50 ㎍으로 꼬리 밑부분에서 피하로 면역화시켜(상기 Harlow 및 Lane 참조) OVA-프라임된 T-세포를 BALB/c 마우스로부터 얻을 수 있다(MHC 클래스 II: I-Ad). 예를들어, 2 회의 면역화를 7 일 간격으로 수행할 수 있으며, 두번째 주사 1 주일후, 마우스를 도살하여 서혜부 및 기생성 림프절을 제거하고 단일 세포 현탁액에 분산시킨다. 연속적으로, 나일론 울 및 세파덱스 G-10 칼럼에서 배양함으로써 단일 세포 현탁액으로부터 항원 제시 세포를 제거할 수 있다. 정제된 T-세포 집단을 클릭 배지 단독이나, 클릭 배지에 용해된 sc-TCR 융합 단백질로 추가로 배양할 수 있다.

BALB/c 마우스로부터의 활성화된 B 세포를 통상적인 B 세포 증식 분석에서 APC로 사용할 수 있다. 예를들어, 활성화된 세포를 Ficoll/Hypaque(Pharmacia) 밀도 구배 원심분리에 의해 단리하는 48 내지 72 시간동안 지라 세포를 50 ㎍/㎖의 LPS(즉, 리포당)로 배양하여 B 세포를 제조할 수 있다. 그후 활성화된 B 세포를 OVA 323-339 펩타이드로 3 시간동안 펄스하고, 잘 세척하며, 파라포름알데히드로 고정시켜 B 세포의 증식을 저해하고, 정제된 T-세포 단독이나 T-세포와 가용성 sc-TCR 융합 단백질에 첨가할 수 있다. 일반적으로 Selected Methods in Cellular Immunol. (1980) B.B. Mishell and S.M. Hiigi W.H. Freeman and Co. 샌프란시스코를 참조하라.

상기 실시예 1-2에서 제조된 sc-TCR 융합 단백질을 APCs에 대한 T-세포 결합을 저해하기 위해 첨가할 수 있다.

표준 B 세포 증식 분석을 37 ℃, 5% CO₂의 96 웰 환저 마이크로타이터 플레이트에서 3-5 일동안 수행할 수 있다. 배양 종료전 4 시간동안 웰을 WST-1(Boehringer Mannheim) 시약으로 펄스할 수 있다. 그후 배양물의 광학 밀도를 기록할 수 있다. sc-TCR 융합 단백질 존재하에 펩타이드-반응성 T-세포 증식의 정도는 면역화후 마우스에서 일어나는 Th 세포 반응(즉, 클론 증식(clonal expansion))의 지표이다.

실시예 14: 인 비트로에서 항원 자극된 T-세포 증식에 대한 sc-TCR 융합 단백질의 영향

본 발명의 sc-TCR 융합 단백질을 상기 공개 PCT 출원 제 US95/09816 및 상기 계류중인 U.S. 특허출원 제 08/382,454 및 08/596,387 호에 이미 개시되어 있는 방법에 따라 인 비보에서 T-세포 클론 증식의 저해에 대해 추가로 시험할 수 있다.

예를들어, 3 시험군을 하기와 같이 셋팅할 수 있다: 15 BALB/c 마우스에 완전 프로인트 어쥬번트내 OVA 323-339-KLH 컨쥬게이트 약 10 내지 100 ㎍를 복강내(IP)주사하여 OVA 323-339 펩타이드에 대한 면역 반응을 유도할 수 있다. OVA-KLH로의 면역화 1 일전과 면역화 2 일후, 5 마리의 마우스에 PBS내의 DO11.10 세포로부터 유래된 sc-TCR 융합 단백질(실시예 1 및 2) 약 10 내지 100 ㎍을 IP 주사할 수 있다. sc-TCR 융합 단백질은 I-Ad/OVA MHC 클래스 II 분자에 결합하고 항원-특이적 T-세포상의 TCR 분자에 의한 결합을 감소시키거나 제거한다. 남은 10 마리의 마우스를 대조군으로 사용할 수 있다. 예를들어, 5 마리의 마우스에게 PBS 를 투여하고 나머지 5 마리에게 sc-TCR 융합 단백질을 투여할 수 있다. 마우스를 면역화 10 일후 도살할 수 있다. 림프절을 제거하고 단일 세포 현탁액에 분산시켰다. 나일론 울 및 세파덱스 G-10 칼럼에서 배양하여 현탁액으로부터 항원 제시 세포를 제거할 수 있다.

그 결과 정제된 T-세포 집단을 OVA 323-339 펩타이드로 펄스된 APCs로 배양할 수 있다. BALB/c 마우스로부터의 활성화된 B 세포를 증식 분석에서 APCs로 사용할 수 있다. 활성화된 세포를 림포프랩(Lymphoprep) 밀도 구배 원심분리로 단리할 수 있는 48 내지 72 시간동안 마우스 지라 세포를 50 ㎍/㎖의 LPS로 배양하여 B 세포를 제조할 수 있다. 그후 활성화된 B 세포를 OVA 323-339 펩타이드로 3 시간동안 펄스하고, 잘 세척하며, 파라포름알데히드로 고정하여 B 세포의 증식을 저해하고, 정제된 T-세포에 첨가할 수 있다.

T-세포 증식 분석을 37 ℃, 5% CO₂의 96 웰 환저 마이크로타이터 플레이트에서 3-5 일동안 수행할 수 있다. 웰을 WST-1 시약으로 배양 종료전 4 시간동안 펄스한후 다른 흡광도에서 측정할 수 있다. 이 분석에서 펩타이드-반응성 T-세포 증식의 정도는 면역화후 마우스에서 일어나는 Th 세포 반응(즉, 클론 증식)의 지표이다. OVA-KLH 또는 HSV-KLH 면역화와 sc-TCR 융합 단백질의 공동-주사는 HSV-반응성 T-세포주의 증식에 영향을 미치지 않으면서 클론 증식량과 OVA-반응성 T-세포주의 연속적인 인 비트로 증식을 제한한다.

실시예 15: 쥐 자가면역 질환의 억제

실험 알러지성 뇌척수염(EAE)은 다중 경화증의 동물 모델로 일반적으로 인식되는 쥐 자가면역 질환이다. 두 단백질, 마이엘린 염기성 단백질(MBP 아미노산 91-103)과 프로테오리포단백질(PLP 아미노산 139-151)이 규명되어 있다. 일반적으로 Martin, R. 등 (1992) Ann. Rev. Immunol. 10: 153을 참조하라.

SJL 마우스 스트레인에서, 뇌염유발성 펩타이드로의 추후 면역화나 MBP-반응성 T-세포의 채택 전이(adoptive transfer)를 발현시키기 위하여 EAE를 유도할 수 있다. 가용성 항-MBP 91-103 또는 항-PLP 139-151 T-세포 수용체로 처리하는 경우 T-세포 활성화후 EAE 발현이 저해되는지 여부를 결정하기 위하여, SJL 마우스를 인 비보에서 MBP 91-103 및 PLP 139-151 반응성 T-세포 블라스트로 주사할 수 있다. 그러한 마우스에서 T-세포 증식을 검출하는 적당한 분석법은 상기 공개 PCT 출원 제 US95/09816, PCT/US/01617 및 상기 계류중인 U.S. 특허출원 제 08/382,454 호에 개시되어 있다.

상기 공개된 PCT 출원 제 US95/09816, PCT/US/97/01617 호 및 계류중인 U.S.특허출원 제 08/382,454 호에 추가로 개시되어 있는 바와 같이, 완전 프로인트 어쥬번트내의 MBP 91-103 약 400 ㎍으로 등에 면역화시켜 EAE를 SJL 마우스에서 유도할 수 있다. 10 내지 14 일후에, 국부 드레인 림프절 세포를 상기한 바와 같이 수획하고 24-웰 플레이트에서 웰당 6×10⁶ 세포 농도로 1.5 ㎖ RPMI 1640 배지/ 10% 우태아 혈청/ 1% 페니실린/ 스트렙토마이신/ 50 ㎍/㎖ MBP에서 배양할 수 있다. 인 비트로 자극 4 일후, MBP 91-103 반응성 T-세포 블라스트를 Ficoll/Hypaque 밀 도 구배(Pharmacia)를 통해 수획하고, PBS에서 2 회 세척하며, 1.3×10⁷ 세포를 각 마우스로 주사할 수 있다.

뇌염유발성 MBP 91-103 반응성 T-세포를 투여받은 마우스에게 MBP 91-103에 특이적인 Vαβ 쇄, PLP 139-151에 특이적인 100 ㎍의 sc-TCR 융합 단백질 Vαβ 쇄(음성 대조군), 또는 식염수(위대조군)를 포함하는 약 100 ㎍의 sc-TCR 융합 단백질을 0, 3 및 7 일에 i.v.로(총용량 300 ㎍) 추가 주사할 수 있다. MBP 91-103 + IAs에 반응하는 sc-TCR 분자가 마우스에서 EAE 발현을 저해하는지를 확인하기 위하여 임상 및 조직학적 측정을 수행하였다.

상기 공개된 PCT 출원 제 US95/09816, PCT/US/97/01617 호 및 계류중인 U.S.특허출원 제 08/382,454 호에 추가로 개시되어 있는 바와 같이, PLP 펩타이드 139-151을 갖는 SJL 마우스에서 EAE를 유도하기 위하여 마우스를 PBS에 용해된 PLP 펩타이드 139-151로 면역화시키고 4 mg/㎖의 마이코박테리움 튜베르쿨로시스 H37Ra를 함유하는 완전 프로인트 어쥬번트와 1:1의 비율로 혼합할 수 있다. 그후 마우스에게 152 ㎍의 펩타이드 어쥬번트 혼합물을 주사할 수 있다. 같은 날과 48 시간후에, 모든 동물에게 400 ng의 백일해 독소를 투여할 수 있다. 그후 EAE의 채택 전이를 상기한 바와 같이 수행한다.

상기한 바와 같은 방법에 따라(실시예 1 참조), TCR DNA를 정상 및 EAE를 앓고있는 SJC 마우스로부터 얻을 수 있다. 그후 TCR DNA를 적당한 DNA 벡터에 결찰되어 마우스 카파 쇄 또는 그 적당한 단편을 포함하는 본 발명의 sc-TCR 융합 단백질을 제조할 수 있는 sc-TCRs를 제조하는데 사용할 수 있다. 그후 PLP 또는 MBP 반응성 sc-TCR 융합물을 발현시키고 필요한 경우 상기 실시예에 따라 정제할 수 있다. 그후 sc-TCR 융합 단백질을 EAE 발현을 방지하는 능력에 대해 시험할 수 있다.

본 발명을 그 바람직한 실시예를 언급하여 기재하였다. 그러나, 당업자는, 이 개시내용을 고려하여, 본 발명의 사상 및 범위내에서 변형 및 개량을 행할 수 있을 것이다.

<110> Sunol Molecular Corporation <120> Soluble single-chain T-cell receptor proteins <130> PC00-0081-DIKE <150> US 08/943,086 <151> 1997-10-02 <160> 146 <170> KOPATIN 1.5 <210> 1 <211> 28 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> strandedness: single, topology: linear <400> 1 cggccatggc ccagctgcag actagtgc 28 <210> 2 <211> 35 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> strandedness: single, topology: linear <400> 2 ggccgcacta gtctgcagct gggccatggc cggct 35 <210> 3 <211> 45 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> strandedness: single, topology: linear <400> 3 ctcgcggccc agccggccat ggccgaggct gcagtcaccc aaagc 45 <210> 4 <211> 32 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> strandedness: single, topology: linear <400> 4 cttcctcact agtacagtct gctcggcccc ag 32 <210> 5 <211> 30 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> strandedness: single, topology: linear <400> 5 gatggcctcg aggagcaggt ggagcagctt 30 <210> 6 <211> 33 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> strandedness: single, topology: linear <400> 6 gactagcccg ggacagggaa 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<223> strandedness: single, topology: linear <400> 20 gatggctcga gtgagcaggt ggagcagctt cct 33 <210> 21 <211> 33 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> strandedness: single, topology: linear <400> 21 ctagtccccg ggtacaactg tgagtctggt tcc 33 <210> 22 <211> 33 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> strandedness: single, topology: linear <400> 22 ctcgagacta gttacaactg tgagtctggt tcc 33 <210> 23 <211> 33 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> strandedness: single, topology: linear <400> 23 cggccgagga agaagagtac atcccgatgg atc 33 <210> 24 <211> 40 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> strandedness: single, topology: linear <400> 24 gggccatcca tcgggatgta ctcttcttcc tcggccggct 40 <210> 25 <211> 36 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> strandedness: single, topology: linear <400> 25 ccggggagga agaagagtac atcccgatgg attgag 36 <210> 26 <211> 36 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> strandedness: single, topology: linear <400> 26 aattctcaat ccatcgggat gtactcttct tcctcc 36 <210> 27 <211> 15 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> strandedness: single, topology: linear <400> 27 gcccgggact agtgc 15 <210> 28 <211> 23 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> strandedness: single, topology: linear <400> 28 ggccgcacta gtcccgggct gca 23 <210> 29 <211> 75 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> strandedness: single, topology: linear <400> 29 ctagtccccg ggtcatcaag cggcgccttc catcggcatg tactcttctt cctctacaac 60 tgtgagtctg gttcc 75 <210> 30 <211> 72 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> strandedness: single, topology: linear <400> 30 ctagtccccg ggtcatcaag cggcgccttc catcggcatg tactcttctt cctcgtctgc 60 tcggccccag gc 72 <210> 31 <211> 33 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> strandedness: single, topology: linear <400> 31 ctagtccccg ggtacaactg tgagtctggt tcc 33 <210> 32 <211> 45 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> strandedness: single, topology: linear <400> 32 ccggggagga agaagagtac atgccgatgg aaggcgccgc ttagc 45 <210> 33 <211> 45 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> strandedness: single, topology: linear <400> 33 cctccttctt ctcatgtacg gctaccttcc gcggcgaatc gggcc 45 <210> 34 <211> 33 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> strandedness: single, topology: linear <400> 34 gatcagcccg gggaggctgc agtcacccaa agc 33 <210> 35 <211> 33 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> strandedness: single, topology: linear <400> 35 ctagtccccg ggacagtctg ctcggcccca ccg 33 <210> 36 <211> 42 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> strandedness: single, topology: linear <400> 36 ccggggagga agaagagtac atgccgatgg aaggcgccgc tc 42 <210> 37 <211> 42 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> strandedness: single, topology: linear <400> 37 cctccttctt ctcatgtacg gctaccttcc gcggcgaggg cc 42 <210> 38 <211> 32 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> strandedness: single, topology: linear <400> 38 cgccgctcac catcaccatc atcactgatg ac 32 <210> 39 <211> 34 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> strandedness: single, topology: linear <400> 39 ggcgagtggt agtggtagta gtgactactg ggcc 34 <210> 40 <211> 33 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> strandedness: single, topology: linear <400> 40 gatcagggcg ccgctactgt tgaaagttgt tta 33 <210> 41 <211> 33 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> strandedness: single, topology: linear <400> 41 ctgatcggat cctcattaaa gccagaatgg aaa 33 <210> 42 <211> 45 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> strandedness: single, topology: linear <400> 42 ccgggctaag cggcgccttc catcggcatg tactcttctt cctcc 45 <210> 43 <211> 42 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> strandedness: single, topology: linear <400> 43 ccgggagcgg cgccttccat cggcatgtac tcttcttcct cc 42 <210> 44 <211> 28 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> strandedness: single, topology: linear <400> 44 ccgggtcatc agtgatgatg gtgagcgg 28 <210> 45 <211> 15 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> strandedness: single, topology: linear <400> 45 gctcgagctt actcc 15 <210> 46 <211> 14 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> strandedness: single, topology: linear <400> 46 cgctcattag gcgg 14 <210> 47 <211> 15 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> strandedness: single, topology: linear <400> 47 gtgtacttct gtgcc 15 <210> 48 <211> 15 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> strandedness: single, topology: linear <400> 48 ctgtgagtct ggttc 15 <210> 49 <211> 15 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> strandedness: single, topology: linear <400> 49 gcaggttctg ggttc 15 <210> 50 <211> 17 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> strandedness: single, topology: linear <400> 50 catttactaa cgtctgg 17 <210> 51 <211> 15 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> strandedness: single, topology: linear <400> 51 cgcctggtac tgagc 15 <210> 52 <211> 15 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> strandedness: single, topology: linear <400> 52 cctcaacctc ctgtc 15 <210> 53 <211> 16 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> strandedness: single, topology: linear <400> 53 cttattccgt ggtgtc 16 <210> 54 <211> 15 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> strandedness: single, topology: linear <400> 54 ccaccctcag aaccg 15 <210> 55 <211> 16 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> strandedness: single, topology: linear <400> 55 gaatttaccg ttccag 16 <210> 56 <211> 16 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> strandedness: single, topology: linear <400> 56 ctttagcgtc agactg 16 <210> 57 <211> 16 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> strandedness: single, topology: linear <400> 57 gaaacgcaaa gacacc 16 <210> 58 <211> 39 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> strandedness: single, topology: linear <400> 58 ggggggcccg ggctgctgag ggtgacgatc ccgcaaaag 39 <210> 59 <211> 39 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> strandedness: single, topology: linear <400> 59 gggggggaat tctattagct tgctttcgag gtgaatttc 39 <210> 60 <211> 41 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> strandedness: single, topology: linear <400> 60 gagcacggcc cagccggcca tggccgaggc tgcagtcacc c 41 <210> 61 <211> 69 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> strandedness: single, topology: linear <400> 61 gagcacgaga ctagtagcac gaacaacacg gtcgtcgatc ggttccggcg ggtttggctc 60 tacagtgag 69 <210> 62 <211> 86 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> strandedness: single, topology: linear <400> 62 gatccctcct ggacacgcag gatggaagga agctgctcca cctgctcagc acgaacaaca 60 cggtcgtcga tcggttccgg cggggc 86 <210> 63 <211> 86 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> strandedness: single, topology: linear <400> 63 catggccccg ccggaaccga tcgacgaccg tgttgttcgt gctgagcagg tggagcagct 60 tcctcccatc ctgcgtgtcc aggagg 86 <210> 64 <211> 39 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> strandedness: single, topology: linear <400> 64 gaggtggaat tctattaaga ctccttatta cgcagtatg 39 <210> 65 <211> 60 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> strandedness: single, topology: linear <400> 65 gaggaggtgg tgactagtag caggttctgg tgggttctgg atgtttggct ctacagtgag 60 60 <210> 66 <211> 57 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> strandedness: single, topology: linear <400> 66 gaggaggtgg tgactagaag caggttctgg gttctggatg tttggctcta cagtgag 57 <210> 67 <211> 51 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> strandedness: single, topology: linear <400> 67 gaggtggaat tctattagtg atgatggtga tggtgagact ccttattacg c 51 <210> 68 <211> 32 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> strandedness: single, topology: linear <400> 68 gaggtgcccg ggactgttga aagttgttta gc 32 <210> 69 <211> 49 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> strandedness: single, topology: linear <400> 69 gaggtggaat tctattagtg atgatggtga tggtggcttg ctttcgagg 49 <210> 70 <211> 31 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> strandedness: single, topology: linear <400> 70 gaggtggaat tctattagct tgctttcgag g 31 <210> 71 <211> 31 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> strandedness: single, topology: linear <400> 71 gaggtgcccg gggctgaggg tgacgatccc g 31 <210> 72 <211> 30 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> strandedness: single, topology: linear <400> 72 aattctcatc agtgatgatg gtgatggtgc 30 <210> 73 <211> 30 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> strandedness: single, topology: linear <400> 73 ccgggcacca tcaccatcat cactgatgag 30 <210> 74 <211> 56 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> strandedness: single, topology: linear <400> 74 gtggagcccg ggttccatcg gcatgtactc ttcttcctct acaactgtga gtctgg 56 <210> 75 <211> 64 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> strandedness: single, topology: linear <400> 75 gaggtggaat tctcacccgg gttccatcgg catgtactct tcttcctcgt ctgctcggcc 60 ccag 64 <210> 76 <211> 61 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> strandedness: single, topology: linear <400> 76 gaggtgctgc aggttccatc ggcatgtact cttcttcctc gtctagacgg ccccaggcct 60 c 61 <210> 77 <211> 34 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> strandedness: single, topology: linear <400> 77 gtggagctgc agggtctaga cggccccagg cctc 34 <210> 78 <211> 59 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> strandedness: single, topology: linear <400> 78 gtggagctgc aggtgatcca ccccctccag atccaccccc tccgtctgct cggccccag 59 <210> 79 <211> 32 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> strandedness: single, topology: linear <400> 79 gtggagaagc tttgccgagc aggtggagca gc 32 <210> 80 <211> 34 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> strandedness: single, topology: linear <400> 80 gggggggagg tgctggagcg aggcagcagt cacc 34 <210> 81 <211> 35 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> strandedness: single, topology: linear <400> 81 gagcccacta gtttggctct acagtgagtt tggtg 35 <210> 82 <211> 65 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> strandedness: single, topology: linear <400> 82 ctagaccagc aaatctgcac ccacagaatc cctaggacag ctcccaggtt cctctgcatg 60 gtgga 65 <210> 83 <211> 65 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> strandedness: single, topology: linear <400> 83 agcttccacc atgcagagga acctgggagc tgtcctaggg attctgtggg tgcagatttg 60 ctggt 65 <210> 84 <211> 35 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> strandedness: single, topology: linear <400> 84 gatcggtcta gaggtgagca ggtggagcag cttcc 35 <210> 85 <211> 19 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> strandeness: single, topology: linear <400> 85 gcctggagac tcagccatg 19 <210> 86 <211> 21 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> strandedness: single, topology: linear <400> 86 gaagtacatg gctgagtctc c 21 <210> 87 <211> 23 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> strandedness: single, topology: linear <400> 87 gatgaacgtt ccagattcca tgg 23 <210> 88 <211> 22 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> strandedness: single, topology: linear <400> 88 cccaaatcaa tgtgccgaaa ac 22 <210> 89 <211> 53 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> strandedness: single, topology: linear <400> 89 ctagaacaca ggagactgga gagcacgaag aagagcctgg agcccatggt gga 53 <210> 90 <211> 20 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> strandedness: single, topology: linear <400> 90 gctctccttg taggcctgag 20 <210> 91 <211> 20 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> strandedness: single, topology: linear <400> 91 gtacttctgt gccagcggtg 20 <210> 92 <211> 22 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> strandedness: single, topology: linear <400> 92 gagcaattat agctactgcc tg 22 <210> 93 <211> 20 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> strandedness: single, topology: linear <400> 93 ggtctggagg ccttgtatcc 20 <210> 94 <211> 53 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> strandedness: single, topology: linear <400> 94 agcttccacc atgggctcca ggctcttctt cgtgctctcc agtctcctgt gtt 53 <210> 95 <211> 65 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> strandedness: single, topology: linear <400> 95 tcgaggaacc gccaccgcca gaaccgccgc caccggaacc accaccgccg ctgccaccgc 60 cacca 65 <210> 96 <211> 65 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> strandedness: single, topology: linear <400> 96 ctagtggtgg cggtggcagc ggcggtggtg gttccggtgg cggcggttct ggcggtggcg 60 gttcc 65 <210> 97 <211> 8 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> strandedness: single, topology: linear <400> 97 ccaccatg 8 <210> 98 <211> 9 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> strandedness: single, topology: linear <400> 98 Glu Glu Glu Glu Tyr Met Pro Met Glu 1 5 <210> 99 <211> 63 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> strandedness: single, topology: linear <400> 99 atgaaatacc tgctgccgac cgcagctgct ggtctgctgc tgctggcggc ccagccgatg 60 gcc 63 <210> 100 <211> 20 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> strandedness: single, topology: linear <400> 100 Met Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala Leu Leu Leu Leu Ala Ala 1 5 10 15 Gln Pro Ala Met 20 <210> 101 <211> 29 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> strandedness: single, topology: linear <400> 101 gccggccatg gccrgtgctg tcrtctctc 29 <210> 102 <211> 29 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> strandedness: single, topology: linear <400> 102 gccggccatg gccgamrccm argtsaccc 29 <210> 103 <211> 29 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> strandedness: single, topology: linear <400> 103 gccggccatg gccgatgtga aagtaaccc 29 <210> 104 <211> 29 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> strandedness: single, topology: linear <400> 104 gccggccatg gccgamrcwg mcrtytmcc 29 <210> 105 <211> 29 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> strandedness: single, topology: linear <400> 105 gccggccatg gccarkgctg gdgtcactc 29 <210> 106 <211> 29 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> strandedness: single, topology: linear <400> 106 gccggccatg gccaatgccg gcgtcatgc 29 <210> 107 <211> 29 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> strandedness: single, topology: linear <400> 107 gccggccatg gccgrtrctg gagtctccc 29 <210> 108 <211> 29 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> strandedness: single, topology: linear <400> 108 gccggccatg gccgatgctr gartcaccc 29 <210> 109 <211> 29 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> strandedness: single, topology: linear <400> 109 gccggccatg gccgattctg gagtcacac 29 <210> 110 <211> 29 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> strandedness: single, topology: linear <400> 110 gccggccatg gccgaygctg gwgttatcc 29 <210> 111 <211> 29 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> strandedness: single, topology: linear <400> 111 gccggccatg gccgatgctg ryrttaycc 29 <210> 112 <211> 31 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> strandedness: single, topology: linear <400> 112 gccggccatg gccgaagctg gagttactca g 31 <210> 113 <211> 36 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> strandedness: single, topology: linear <400> 113 gccggccatg gccgatgcta ctattcatca atggcc 36 <210> 114 <211> 31 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> strandedness: single, topology: linear <400> 114 gctgccaccg ccacccacct tgttcaggtc c 31 <210> 115 <211> 30 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> strandedness: single, topology: linear <400> 115 gctgccaccg ccacccacgt tttcaggtcc 30 <210> 116 <211> 34 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> strandedness: single, topology: linear <400> 116 ggaggcggcg gttctgctaa gagaccacmc agcc 34 <210> 117 <211> 34 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> strandedness: single, topology: linear <400> 117 ggaggcggcg gttctcagaa grtaactcaa rcsc 34 <210> 118 <211> 31 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> strandedness: single, topology: linear <400> 118 ggaggcggcg gttctcagtc kgtgasccag c 31 <210> 119 <211> 32 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> strandedness: single, topology: linear <400> 119 ggaggcggcg gttctcagag agtgactcag cc 32 <210> 120 <211> 35 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> strandedness: single, topology: linear <400> 120 ggaggcggcg gttctcwgma sgtgraacaa rgtcc 35 <210> 121 <211> 35 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> strandedness: single, topology: linear <400> 121 ggaggcggcg gttctcagca agttaagcaa aattc 35 <210> 122 <211> 34 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> strandedness: single, topology: linear <400> 122 ggaggcggcg gttctgagar tgtggrgcwg catc 34 <210> 123 <211> 35 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> strandedness: single, topology: linear <400> 123 ggaggcggcg gttctaakga rgtggmgcag rrtyc 35 <210> 124 <211> 32 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> strandedness: single, topology: linear <400> 124 ggaggcggcg gttctcagct gctggagcag ag 32 <210> 125 <211> 35 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> strandedness: single, topology: linear <400> 125 ggaggcggcg gttctcaama grkagaasag ratyc 35 <210> 126 <211> 33 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> strandedness: single, topology: linear <400> 126 ggaggcggcg gttctggaca aarcmttgar cag 33 <210> 127 <211> 33 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> strandedness: single, topology: linear <400> 127 ggaggcggcg gttctaagga ccaagtgttt cag 33 <210> 128 <211> 29 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> strandedness: single, topology: linear <400> 128 ttcatagact agtagggtca gggttctgg 29 <210> 129 <211> 45 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> strandedness: single, topology: linear <400> 129 ggtggcggtg gcagcggcgg tggtggttcc ggaggcggcg gttct 45 <210> 130 <211> 47 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> strandedness: single, topology: linear <400> 130 ccaccgccac cgtcgcccgc caccaccaag gccatccgcc gccaaga 47 <210> 131 <211> 38 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> strandedness: single, topology: linear <400> 131 gaggaggtgg tgactagtgc tgagggtgct gtcctgag 38 <210> 132 <211> 34 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> strandedness: single, topology: linear <400> 132 gaggaggtga ctagtgctgg tgaagcttgt ctgg 34 <210> 133 <211> 39 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> strandedness: single, topology: linear <400> 133 gaggaggtgg tgactagtac tgggaacgtc tgaactggg 39 <210> 134 <211> 41 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> strandedness: single, topology: linear <400> 134 gaggtggagg cccagccggc catggcccag gtgagacaaa g 41 <210> 135 <211> 39 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> strandedness: single, topology: linear <400> 135 gaggtggagc tcgagcaatg ctgctggtgt catccaaac 39 <210> 136 <211> 33 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> strandedness: single, topology: linear <400> 136 gaggtggaga ctagtgtcaa ggttgacctg aag 33 <210> 137 <211> 33 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> strandedness: single, topology: linear <400> 137 gaggtggaga ctagtagcag gttctgggtt ctg 33 <210> 138 <211> 33 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> strandedness: single, topology: linear <400> 138 gaggtggagc ccggggtctg ctcggcccca ggc 33 <210> 139 <211> 32 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> strandedness: single, topology: linear <400> 139 ggcccagccg ccaatgctgg tgtcatccaa ac 32 <210> 140 <211> 32 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> strandedness: single, topology: linear <400> 140 gaggtgaccg gtcagcaggt gagacaaagt cc 32 <210> 141 <211> 45 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> strandedness: single, topology: linear <400> 141 gtggagatcg ataaagtgta cttacgtttg tctgctcggc cccag 45 <210> 142 <211> 53 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> strandedness: single, topology: linear <400> 142 gtggagatcg ataagtgtac ttacgttttc attaacagtc tgctcggccc cag 53 <210> 143 <211> 32 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> strandedness: single, topology: linear <400> 143 gaggtgaccg gtgagcaggt ggagcagctt cc 32 <210> 144 <211> 43 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> strandedness: single, topology: linear <400> 144 gtggagttcg aaaagtgtac ttacgtttgt ctgctcggcc cca 43 <210> 145 <211> 49 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> strandedness: single, topology: linear <400> 145 gtggagttcg aaaagtgtac ttacgttttc attagtctgc tcggcccca 49 <210> 146 <211> 9 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> strandedness: single, topology: linear <400> 146 Ser Thr Pro Pro Pro Gly Thr Arg Val 1 5

Claims (44)

1. 단일쇄 T-세포 수용체에 공유결합된 면역글로불린 경쇄 불변부위를 포함하고, 상기 단일쇄 T-세포 수용체는 V-β쇄에 펩타이드 결합 서열에 의하여 공유결합된 V-α쇄 및 N-말단의 마지막 시스테인으로부터 C-말단 끝까지가 절단된 C-β쇄를 포함하는 가용성 융합 단백질.
2. 제 1 항에 있어서, V-α쇄의 C-말단이 펩타이드 결합 서열에 의하여 V-β쇄의 N-말단에 공유결합된 가용성 융합 단백질.
3. 제 1 항에 있어서, V-β쇄의 C-말단이 펩타이드 결합 서열에 의하여 V-α쇄의 N-말단에 공유결합된 가용성 융합 단백질.
4. 제 2 항에 있어서, C-β쇄가 V-β쇄의 C-말단과 면역글로불린 경쇄 불변부위의 N-말단 사이에 공유결합된 가용성 융합 단백질.
5. 제 2 항에 있어서, 추가로 V-α쇄의 C-말단과 펩타이드 결합 서열의 N-말단 사이에 공유결합된 C-α쇄를 포함하는 가용성 융합 단백질.
6. 제 4 항에 있어서, 추가로 V-α쇄의 C-말단과 펩타이드 결합 서열의 N-말단 사이에 공유결합된 C-α쇄를 포함하는 가용성 융합 단백질.
7. 제 5항 또는 제 6 항에 있어서, C-α쇄의 길이가 1 내지 90 아미노산인 가용성 융합 단백질.
8. 삭제
9. 제 6 항에 있어서, 펩타이드 결합 서열의 길이가 2 내지 25 아미노산인 가용성 융합 단백질.
10. 제 1 항에 있어서, 면역글로불린 경쇄 불변부위가 C_κ쇄인 가용성 융합 단백질.
11. 삭제
12. 하기 순서대로 공유 결합된 1) V-α쇄, 2) 펩타이드 결합 서열, 3) V-β쇄, 4) N-말단의 마지막 시스테인으로부터 C-말단 끝까지가 절단된 C-β쇄, 및 5) C_κ쇄 또는 C_λ쇄를 포함하는 가용성 융합 단백질.
13. 제 12 항에 있어서, 추가로 V-α쇄와 펩타이드 결합 서열 사이에 공유결합된 C-α쇄 또는 1 내지 90개의 아미노산을 갖는 C-α쇄를 포함하는 가용성 융합 단백질.
14. 제 12 항에 있어서, 추가로 가용성 융합 단백질에 공유결합된 적어도 하나의 단백질 태그(tag)를 포함하는 가용성 융합 단백질.
15. 제 14 항에 있어서, 추가로 N-말단의 마지막 시스테인으로부터 C-말단 끝까지가 절단된 C-β쇄와 C_κ쇄 또는 C_λ쇄 사이에 공유결합된 단백질 태그를 포함하는 가용성 융합 단백질.
16. 제 15 항에 따른 가용성 융합 단백질을 단백질 태그를 절단할 수 있는 시약과 접촉시킴으로써 제조되는 단일쇄 T-세포 수용체.
17. 제 1 항에 있어서, V-α 및 V-β 쇄가 세포독성 T 세포 상에 존재하는 T-세포 수용체 V쇄와 적어도 90% 동일한 가용성 융합 단백질.
18. 제 16 항에 있어서, 단일쇄 T-세포 수용체 V 부위가 인간화된(humanized) 단일쇄 T-세포 수용체.
19. 제 18 항에 있어서, 단일쇄 T-세포 수용체 C 부위가 인간화된 단일쇄 T-세포 수용체.
20. 하기 순서대로 공유 결합된 1) V-α쇄, 2) C-α쇄 또는 1 내지 90개의 아미노산을 갖는 C-α쇄, 3) 펩타이드 결합 서열, 4) V-β쇄, 및 5) N-말단의 마지막 시스테인으로부터 C-말단 끝까지가 절단된 C-β쇄를 포함하는 단일쇄 T-세포 수용체.
21. 제 12 항에 있어서, 공유결합된 주효인자(effector) 분자를 포함하는 가용성 융합 단백질.
22. 제 21 항에 있어서, 주효인자 분자가 진단 또는 영상화 연구에 적합한 검출가능하도록 표지된 분자 또는 세포 독소인 가용성 융합 단백질.
23. V-β쇄에 펩타이드 결합 서열에 의하여 공유결합된 V-α쇄 및 N-말단의 마지막 시스테인으로부터 C-말단 끝까지가 절단된 C-β쇄를 포함하는 단일쇄 T-세포 수용체를 코딩하는 제 1 서열 및, 추가로 C_κ쇄 또는 C_λ쇄를 코딩하고 제 1 서열에 공유결합되는 제 2 서열을 포함하고, 추가로 제 1 서열에 작동가능하게 결합된 프로모터, 번역개시 신호 및 리더(leader) 서열을 포함하는 DNA 세그먼트 (segment).
24. 제 23 항에 있어서, 제 1 서열에 의하여 코딩되는 단일쇄 T-세포 수용체가, V-β쇄의 N-말단에 펩타이드 결합 서열에 의하여 공유결합된 V-αC-말단을 포함하는 DNA 세그먼트.
25. 제 23 항에 있어서, 제 1 서열에 의하여 코딩되는 단일쇄 T-세포 수용체가, V-α쇄의 N-말단에 펩타이드 결합 서열에 의하여 공유결합된 V-βC-말단을 포함하는 DNA 세그먼트.
26. 제 23 항에 있어서, 상기 C-β쇄가 제 1 서열에 의하여 코딩되는 V-β쇄의 C-말단과 제 2 서열에 의하여 코딩되는 C_κ쇄 또는 C_λ쇄의 N-말단 사이에 공유결합된 DNA 세그먼트.
27. 제 23 항에 있어서, 제 1 서열에 의하여 코딩되는 단일쇄 T-세포 수용체가 추가로, V-α쇄의 C-말단과 펩타이드 결합 서열의 N-말단 사이에 공유결합된 1 내지 90개의 아미노산을 갖는 C-α쇄를 포함하는 DNA 세그먼트.
28. 하기 순서대로 공유 결합된 1) V-α쇄, 2) 펩타이드 결합 서열, 3) V-β쇄, 4) N-말단의 마지막 시스테인으로부터 C-말단 끝까지가 절단된 C-β쇄, 및 5) C_κ쇄 또는 C_λ쇄를 포함하는 단백질 서열의 가용성 융합 단백질을 코딩하는 서열을 포함하는 DNA 세그먼트.
29. 제 28 항에 있어서, 추가로 V-α쇄와 펩타이드 결합 서열 사이에 1 내지 90개의 아미노산을 갖는 C-α쇄를 코딩하는 서열을 포함하는 DNA 세그먼트.
30. 제 28 항에 있어서, 추가로 리더 서열, 번역 개시 신호, 및 프로모터를 코딩하는 서열을 포함하는 DNA 세그먼트.
31. 제 30 항에 있어서, 추가로 하나 이상의 단백질 태그를 코딩하는 서열을 포함하는 DNA 세그먼트.
32. 제 30 항에 있어서, 프로모터가 phoA이고, 리더가 E. coli 의 pelB이며, 추가로 유전자 10 서열로부터 리보솜 결합 부위를 포함하는 DNA 세그먼트.
33. 제 30 항에 있어서, 프로모터가 사이토메갈로바이러스 인핸서 요소와 작동가능하게 결합된 사이토메갈로바이러스 프로모터이고, 리더가 마우스 카파 쇄 리더인 DNA 세그먼트.
34. 제 20 항 또는 제 28 항에 따른 DNA 세그먼트를 포함하는 DNA 벡터.
35. 숙주 세포에 가용성 단일쇄 T-세포 수용체 융합 단백질을 코딩하는 서열을 포함하는 DNA 벡터를 도입하고;

    숙주 세포를 배양 배지에서 가용성 단일쇄 T-세포 수용체 융합 단백질의 발현이 가능한 조건 하에 배양하며;

    가용성 단일쇄 T-세포 수용체 융합 단백질을 숙주 세포 또는 배지로부터 정제하여 가용성 융합 단백질을 단리하는 것을 포함하는,

    단일쇄 T-세포 수용체에 공유결합된 면역글로불린 경쇄 불변부위를 포함하고, 상기 단일쇄 T-세포 수용체는 V-β쇄에 펩타이드 결합 서열에 의하여 공유결합된 V-α쇄 및 N-말단의 마지막 시스테인으로부터 C-말단 끝까지가 절단된 C-β쇄를 포함하는 가용성 단일쇄 T-세포 수용체 융합 단백질의 단리 방법.
36. 제 35 항에 있어서, 추가로 숙주 세포의 추출물 또는 배양 배지를 융합 단백질과 특이적으로 결합할 수 있는 항체와 접촉시킴을 포함하는 방법.
37. 삭제
38. 포유동물 세포에 단일쇄 T-세포 수용체를 코딩하는 서열을 포함하는 DNA 벡터를 도입하고;

    포유동물 세포를 배지에서 단일쇄 T-세포 수용체의 발현이 가능한 조건 하에 배양하며;

    단일쇄 T-세포 수용체를 포유동물 세포 또는 배지로부터 정제하여 단일쇄 T-세포 수용체를 단리하는 것을 포함하는,

    V-β쇄에 펩타이드 결합 서열에 의하여 공유결합된 V-α쇄 및 N-말단의 마지막 시스테인으로부터 C-말단 끝까지가 절단된 C-β쇄를 포함하는 가용성 단일쇄 T-세포 수용체의 단리 방법.
39. V-β쇄에 펩타이드 결합 서열에 의하여 공유결합된 V-α쇄, N-말단의 마지막 시스테인으로부터 C-말단 끝까지가 절단된 C-β쇄 및 융합된 면역글로불린 경쇄 불변부위를 포함하는 단일쇄 T-세포 수용체 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 암, 감염질병, 알레르기 또는 자가면역 질환을 치료하기 위한 약제학적 조성물.
40. 삭제
41. 인간을 제외한 포유동물에, V-β쇄에 펩타이드 결합 서열에 의하여 공유결합된 V-α쇄, N-말단의 마지막 시스테인으로부터 C-말단 끝까지가 절단된 C-β쇄 및 융합된 면역글로불린 경쇄 불변부위를 포함하는 유효량의 단일쇄 T-세포 수용체를 투여하는 것을 포함하는, T-세포 수용체와 특이적으로 결합할 수 있는 항체의 제조 방법.
42. 삭제
43. 삭제
44. 삭제

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