KR20200018645A - 표적화된 비-바이러스 dna 삽입 - Google Patents
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Abstract
본원에는 세포의 게놈을 편집하기 위한 방법 및 조성물이 제공된다. 일부 실시양태에서, 길이가 적어도 200개 뉴클레오티드인 뉴클레오티드 서열이 세포의 게놈 내의 표적 영역 내로 삽입된다.
Description
이전 관련 출원
본 출원은 2017년 6월 15일에 출원된 미국 가출원 번호 62/520,117; 및 2017년 8월 30일에 출원된 미국 가출원 번호 62/552,180을 우선권 주장하며, 이들 가출원은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
연방 정부의 지원을 받는 연구 및 개발 하에 이루어진 발명에 대한 권리에 관한 성명서
본 발명은 미국 국립 보건 연구소가 수주한 허가 번호 P50 GM082250 하의 정부 지원으로 만들어졌다. 정부가 본 발명에 대한 특정 권리를 갖고 있다.
Cas9-gRNA 복합체 (RNP)를 세포 내로 전기천공함으로써 세포 게놈 내의 표적화된 부위에 작은 돌연변이 (삽입-결실)를 도입할 수 있는 능력이 개발되었다. 그러나, 이들 돌연변이는 무작위적이고 비-상동 말단 결합에 의해 도입되기 때문에, 단백질을 프레임 밖으로 녹아웃시킬 수 있다 (Schumann et al. PNAS 112(33): 10437-10442 (2015)). 화학적 합성에 의해 생산된 작은 ssDNA 올리고뉴클레오티드 (ssODN)를 전기천공함으로써 게놈 내의 명시된 표적 부위에 특정의 규정된 DNA 서열을 도입하기 위한 다른 방법이 개발되었다. 이는 NHEJ보다 덜 효율적이지만, 최종 서열을 규정할 수 있게 해주는 상동성 지향 복구 (HDR로 일컬어짐)를 통해 매우 소량의 외인성 DNA [통상적으로 약 1개 염기쌍 (bp) 내지 약 30개 염기쌍 (bp)]의 통합을 허용한다. 그러나, 이들 올리고뉴클레오티드의 크기는 화학적으로 합성될 수 있는 DNA의 길이 (< 약 200 bp)로 제한되고, 이중 상당 부분이 상동성 아암에 의해 흡수되기 때문에, 제한된 크기의 통합으로 인해 이러한 방법에 의해서는 많은 적용이 제공될 수 없다. 크기 제한 외에도, 있는 그대로의 DNA, 특히 약 200 bp 초과의 있는 그대로의 DNA를 세포 내로 전기천공시키는 것이 종종, 고유 세포 방어 메커니즘의 활성화로 인해 대규모 세포 사멸을 초래하는 것으로 널리 확립되어 있다 (Cornu et al. Nat. Med. 23: 415-423 (2017); Hornung and Latz, Nature Reviews Immunology 10: 123-130 (2010); Zhao et al., Mol. Ther. 13(1): 151-159 (2006)). 비-통합 바이러스 벡터, 예컨대 인테그라제 결함 렌티바이러스 벡터 또는 아데노 관련 바이러스 (AAV) 벡터가 큰 공여자 핵산 서열을 세포로 전달하기 위해 사용되었지만, 이들 벡터는 바이러스 감염을 필요로 하고 오프-타겟 효과를 유발한다. 따라서, 세포의 게놈 내로 큰 뉴클레오티드 서열의 표적화된 삽입을 위한 조성물 및 방법이 필요하다.
본 발명은 세포의 게놈을 편집하기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 본 발명자들은 큰 뉴클레오티드 서열, 예를 들어, 길이가 약 200개 뉴클레오티드 초과인 서열이 세포의 게놈 내의 표적화된 영역 내로 삽입될 수 있다는 것을 발견하였다. 일부 방법에서, 오프-타겟 효과를 감소시키고/시키거나 세포 생존율의 상실을 감소시키면서, 길이가 약 200개 뉴클레오티드 초과인 서열의 통합이 발생한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은
a) 하기를 포함하는 Cas9 리보핵단백질 복합체 (RNP)-DNA 주형 복합체를 제공하는 단계이며:
(i) Cas9 뉴클레아제 도메인 및 가이드 RNA를 포함하는 RNP이며, 여기서 가이드 RNA가 세포의 게놈의 표적 영역과 특이적으로 혼성화되고, Cas9 뉴클레아제 도메인이 표적 영역을 절단하여 세포의 게놈 내에 삽입 부위를 생성시키는 것인 RNP; 및
(ii) 이중 가닥 또는 단일 가닥 DNA 주형이며, 여기서 DNA 주형의 크기가 약 200개 뉴클레오티드 초과이고, DNA 주형의 5' 및 3' 말단이 삽입 부위를 플랭킹하는 게놈 서열과 상동인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 이중 가닥 또는 단일 가닥 DNA 주형,
여기서 복합체 내에서의 RNP 대 DNA 주형의 몰 비가 약 3:1 내지 약 100:1인 단계; 및
b) RNP-DNA 주형 복합체를 세포 내로 도입하는 단계
를 포함하는, 세포의 게놈을 편집하는 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, DNA 주형은 선형 DNA 주형이다. 일부 예에서, DNA 주형은 단일 가닥 DNA 주형이다. 특정 실시양태에서, 단일 가닥 DNA 주형은 순수한 단일 가닥 DNA 주형이다.
일부 실시양태에서, RNP-DNA 주형 복합체는 약 20℃ 내지 25℃의 온도 하에 약 1분 내지 약 30분 동안 RNP를 DNA 주형과 함께 인큐베이션함으로써 형성된다. 일부 실시양태에서, RNP-DNA 주형 복합체와 세포는 RNP-DNA 주형 복합체를 세포 내로 도입하기 이전에 혼합된다.
일부 실시양태에서, RNP는 Cas9 뉴클레아제를 포함한다. 일부 실시양태에서, RNP는 Cas9 닉카제를 포함한다. 일부 실시양태에서, RNP-DNA 주형 복합체는 적어도 2개의 구조적으로 상이한 RNP 복합체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 적어도 2개의 구조적으로 상이한 RNP 복합체는 구조적으로 상이한 Cas9 뉴클레아제 도메인을 함유한다. 일부 실시양태에서, 적어도 2개의 구조적으로 상이한 RNP 복합체는 구조적으로 상이한 가이드 RNA를 함유한다. 적어도 2개의 구조적으로 상이한 RNP 복합체가 구조적으로 상이한 가이드 RNA를 함유하는 일부 실시양태에서, 구조적으로 상이한 RNP 복합체 각각은 Cas9 닉카제를 포함하고, 구조적으로 상이한 가이드 RNA는 표적 영역의 반대 가닥과 혼성화된다.
일부 실시양태에서, RNP-DNA 주형 복합체를 세포 내로 도입하는 것은 전기천공을 포함한다. 일부 실시양태에서, RNP 대 DNA 주형의 몰 비는 약 5:1 내지 약 15:1이다. 일부 실시양태에서, RNP 대 DNA 주형의 몰 비는 약 5:1 내지 약 10:1이다. 일부 실시양태에서, RNP 대 DNA 주형의 몰 비는 약 8:1 내지 약 12:1이다. 일부 실시양태에서, DNA 주형은 약 2.5 pM 내지 약 25 pM의 농도 하에 있다. 일부 실시양태에서, DNA 주형의 크기는 약 1 kb 초과이다. 일부 실시양태에서, DNA 주형의 양은 약 1 μg 내지 약 10 μg이다.
일부 실시양태에서, RNP-DNA 주형 복합체는 약 1 x 105 내지 약 2 x 106개의 세포 내로 도입된다. 일부 실시양태에서, 세포는 1차 조혈 세포 또는 1차 조혈 줄기 세포이다. 일부 실시양태에서, 1차 조혈 세포는 면역 세포이다. 일부 실시양태에서, 면역 세포는 T 세포이다. 일부 실시양태에서, T 세포는 조절 T 세포, 이펙터 T 세포, 또는 나이브(naive) T 세포이다. 일부 실시양태에서, T 세포는 CD8+ T 세포이다. 일부 실시양태에서, T 세포는 CD4+CD8+ T 세포이다.
본 출원은 하기 도면을 포함한다. 도면은 조성물 및 방법의 특정 실시양태 및/또는 특색을 예시하고, 조성물 및 방법의 임의의 설명(들)을 보충하도록 의도된다. 서면 설명이 그러한 경우임을 명시적으로 표시하지 않는 한, 본 도면은 조성물 및 방법의 범위를 제한하지 않는다.
도 1은 세포에서 실행 가능한 편집 효율을 달성하는 데 필요한 고 농도의 있는 그대로의 DNA를 전기천공한 후의 낮은 세포 생존율을 도시한다.
도 2는 전기천공시 세포를 부가하기 전에 짧은 실온 인큐베이션에 의해, DNA 주형 (플라스미드)을 RNP와 복합체 형성하는 것이, 일정 양의 긴 플라스미드 dsDNA의 전기천공시 정상적으로 관찰되는 생존율 상실을 감소시킨다는 것을 도시한다.
도 3은 전기천공시 세포를 부가하기 전에 짧은 실온 인큐베이션에 의해, DNA 주형 (선형, 이중 가닥 DNA (dsDNA) 주형)을 RNP와 복합체 형성하는 것이, 길고 선형인 이중 가닥 DNA의 전기천공시 정상적으로 관찰되는 생존율 상실을 감소시킨다는 것을 도시한다.
도 4는 약 10:1 RNP 대 DNA 주형의 예시적인 몰 비가, 전기천공 후 생존율뿐만 아니라 통합 효율 둘 다를 유지시킨다는 것을 도시한다.
도 5는 약 10:1 RNP 대 DNA 주형의 예시적인 몰 비가, 생존율 상실과 효율의 효과를 균형있게 하였고, 통합 양성 세포의 수를 최대화한다는 것을 도시한다.
도 6은 약 10:1 RNP 대 DNA 주형의 예시적인 몰 비가, 크기가 약 750개 염기쌍 초과인 큰 주형의 고 효율 삽입을 허용한다는 것을 도시한다.
도 7은 긴 DNA 주형의 삽입이 여전히, 일정 양의 오프-타겟 통합을 초래할 수 있다는 것을 도시한다.
도 8은 오프-타겟 통합이, 긴 단일 가닥 DNA (ssDNA) 주형을 공여자로서 사용함으로써 감소될 수 있다는 것을 도시한다.
도 9는 본원에 개시된 비-바이러스 통합이 2개의 gRNA 및 Cas9 닉카제 (D10A)를 사용하여 삽입될 수 있으며, 이는 오프-타겟 dsDNA 절단을 방지한다는 것을 도시한다.
도 10A-F는 CRISPR/Cas9 RNP 공동-전기천공이 dsDNA 유도된 생존율 상실을 감소시킨다는 것을 도시한다. (A) 1차 인간 T 세포 내로 전기천공된 선형 dsDNA 주형 (RAB11A에 대한 GFP 융합을 표적으로 하는 상동성 지향 복구 주형, 약 1350 bp 길이; 도 11A)은 주형의 양이 증가함에 따라 현저한 생존율 상실을 야기한다. 100 pmol의 RNP와 함께 동일한 양의 dsDNA 주형을 전기천공하면 놀랍게도 생존율이 증가하였다. (B) 플라스미드와 선형 dsDNA 주형 둘 다에 대해, RNP의 부가는 전기천공 후 생존율을 증가시켰다. 주목할만한 것은, 짧은 ssDNA 올리고 공여자 뉴클레오티드 (ssODN)를 이용한 경우에는 생존율에 있어서의 상실이 관찰되지 않았다. (C) 증가된 생존율을 알아보기 위해 RNP를 DNA와 공동으로 전달해야만 한다. 2명의 공여자로부터의 T 세포를 전기천공 사이에 8시간의 휴식기를 가지면서 각각 2회 전기천공시켰다. 밀접하게 산재된 2가지 전기천공이 높은 정도의 세포 사멸을 야기시켰지만, RNP 및 선형 dsDNA 주형의 전달은 별도로 전달될 수 있었다. 그러나, 초기의 RNP 전기천공은, DNA를 먼저 받고 RNP를 두 번째로 받은 세포와 비교해서 DNA 주형이 후속으로 전기천공될 때 생존율을 증가시키지 않았다. (D-F) RNP와 DNA를 공동으로 도입할 필요가 있다는 것을 고려하여, 본 발명자들은 전기천공 전에 이들을 함께 부가로 미리 인큐베이션하는 것이, 생존율을 추가로 증가시킬지의 여부를 검정하였다. 미리 인큐베이션하는 시간 (0 내지 15분)을 증가시켜도 생존율 상의 차이는 관찰되지 않았지만, 놀랍게도 RNP와 세포를 먼저 혼합하고, 전기천공 직전에 DNA 주형을 부가한 경우에는 (RNP + 세포; + HDRT), 생존율이 증가하였다 (E). 그러나, 세포를 부가하기 전에 RNP와 DNA HDR 주형을 함께 혼합한 웰에서는 (RNP + HDRT; + 세포), RNP와 DNA 주형이 얼마 동안 미리 인큐베이션되었는 지에 관계없이, HDR 백분율이 급격히 증가되었다 (GFP+ 세포). 전기천공 후 2일에 생존율을 측정하였고 제4일에 GFP 발현을 측정하였다. 그래프 (B, D, F)는 2명의 건강한 인간 공여자로부터의 데이터를 표시한다.
도 11A-F는 효율적인 큰 비-바이러스 유전자 표적화의 발생을 도시한다. (A) 96-웰 고 처리량 전기천공을 통한 세포 배양 및 자극 조건, RNP 및 DNA 주형 제형 및 전기천공 조건의 효과에 대한 체계적인 분석을 통해, 세포 생존율 (배양물 중 살아있는 세포의 총 수)과 HDR 효율 (GFP 양성인 세포의 %) 둘 다의 신속한 최적화가 가능하였다. (B) 하우스키핑 유전자 RAB11A의 N-말단과 상동인 영역에 의해 플랭킹된 GFP 서열을 코딩하는 긴 (1350 bp) 선형 dsDNA 주형의 개략도 (규모에 맞게 그려지지 않음). dsDNA 절단이 RAB11A의 N-말단에서 유도될 때, GFP 서열은 상동성 지향 복구 (HDR)를 통해 원활하게 도입되어, 내인성-태그부착된 RAB11A-GFP 융합 단백질을 생성할 수 있다. (C) 1차 인간 T 세포를, RAB11A 표적화 RNP 및 HDR 주형의 전기천공 전에 T 세포 수용체 (TCR) 자극 및 시토카인의 다양한 조합을 사용한 다음, 전기천공 후 5일 동안 배양 조건을 다양하게 하여 2일 동안 배양하였다. (D) 여기서 시험된 RNP 및 HDR 주형 농도 중에서, 시약의 중간 농도에서 RAB11A 내로의 최적의 GFP 삽입이 달성되었다. 추가 시험 (도 16)은 최적 농도를 50 pmol의 RNP 및 4 ug의 dsDNA HDRT로 좁혔다. (E) 전기천공 펄스 조건의 어레이된 시험은 일반적으로, 더 높은 HDR 효율을 산출하는 조건이 생존율을 감소시켰다는 것을 보여주었다. 충분한 생존율을 유지하면서도 HDR을 최적화하기 위해 EH115가 선택되었다. (F) C-D에 최적화된 파라미터를 사용하여, 내인성 RAB11A 유전자 내로의 GFP의 고 효율 삽입은 1차 인간 CD4+ 및 CD8+ T 세포 둘 다에서 비-바이러스 표적화에 의해 달성되었다. 전기천공 후 3일 (E) 또는 5일 (C, D 및 F)에 생존율 및 효율을 검정하였다. 개별 포인트는 개별 혈액 공여자 (C 및 D) 또는 2명의 개별 공여자의 평균 플러스 표준 편차 (E)를 나타낸다. 녹색 하이라이트는 비-바이러스 유전자 표적화 프로토콜에 대해 궁극적으로 선택된 조건을 표시한다.
도 12A-B는 비-바이러스 유전자 표적화가 1차 인간 T 세포에서 신속하고 효율적인 유전 공학을 가능하게 한다는 것을 도시한다. (A) 비-바이러스 유전자 표적화의 도식적 연대표. 게놈 편집 시약의 임의의 새로운 조합 (상동성 지향 복구 주형과 함께 gRNA)을 설계하고, 상업적 공급업체로부터 주문하며, 이를 어셈블리하기 위해서는 대략 1주가 소요된다. 전기천공하기 2일 전에, 혈액 또는 다양한 다른 공급원으로부터 단리된 1차 인간 T 세포 (도 15)를 자극한다. dsDNA HDR 주형은 PCR에 이어 SPRI 정제에 의해 쉽게 만들어져서, 전기천공에 적합한 고도로 농축된 산물을 달성할 수있다. 전기천공 당일에, RNP와 복합체 형성한 gRNA, HDR 주형, 및 수거된 자극된 T 세포를 혼합하고 전기천공시키는데, 이러한 프로세스에는 대략 1시간 30분이 소요된다. 전기천공 후, 조작된 T 세포는 부가의 2주 동안 쉽게 확장될 수 있다. (B) 생존율은 실제의 전기천공을 제외한 모든 프로토콜 단계를 거친 동등한 집단 (전기천공 없음 대조군)에 비해 살아있는 세포의 백분율을 지칭하기 위해 사용된다. 전기천공 후 살아있는 세포에서의 최저점은 2일 후에 오는 것으로 경험적으로 결정되었고, 달리 언급되지 않는 한 모든 생존율 측정 기준은 그 시점에 기록되었다. 용어 효율은 "녹인된(knocked in)" 외인성 서열 (예컨대 GFP)을 발현하는 배양물 중의 살아있는 세포의 백분율을 지칭하기 위해 사용된다. 최종적으로, 원하는 통합에 대해 양성인 세포의 총 수는 효율에 절대 세포 계수를 곱합으로써 계산되었다. 효율을 최대화하는 방법론적 변화는 종종, 양성 세포의 총 수에 대해 항상 최적인 것은 아니며 그 반대도 마찬가지이다.
도 13A-D는 비-바이러스 유전자 표적화를 위한 1차 인간 T 세포 자극의 최적화를 도시한다. (A) 전기천공하기 전 2일 동안 대안적인 전기천공 전 자극 조건을 적용하였다. IL-2, IL-7 및 IL-15의 시토카인 자극 칵테일과 함께 CD3/CD28 비드 결합 자극은 플레이트 결합 항체 자극보다 더 높은 생존율, 편집 속도 및 총 양성 세포를 달성하였다. (B) 비드 대 세포의 또 다른 비는 전기천공 전에 비드의 제거와 함께 최적의 1:1 비를 나타냈다. (C) 비-비드 기반 CD3/CD28/CD2 자극은 최적의 비에서 CD3/CD28 비드보다 더 낮은 편집 효율을 산출하였다. (D) 상업적 XVivo15 배지는 RPMI와 비교해서 유사한 생존율을 달성하였지만, 편집 효율은 더 높았다. 중요하게도, 무혈청 이뮤노컬트(Immunocult) 배지는 또한, 인간 1차 CD3+ T 세포의 고 효율 편집을 가능하게 하였다. 전기천공 후 4일에 GFP 삽입 효율 (dsDNA RAB11A-GFP HDRT) 및 총 GFP+ 세포의 절대 계수를 수행하였다. 조건 당 2개의 도트는 2명의 건강한 혈액 공여자로부터 수득된 값을 나타낸다.
도 14A-D는 전기천공 후 1차 인간 T 세포 취급의 최적화를 도시한다. (A) 자극 후 제2일 또는 제3일에 건강한 인간 공여자로부터의 CD3+ T 세포의 전기천공은 효율적인 표적화된 GFP 통합을 달성하였다. 2일에 걸친 이중 전기천공은 효율을 약간 증가시켰지만, DNA 주형이 2가지 전기천공 (도 10)에 포함되었을 때 생존율을 현저하게 감소시켰다. (B) 전기천공 후 부가의 CD3/CD28 자극은 증식 가능성을 감소시켰다. (C) 전기천공 후 높은 용량의 IL-2은 효율과 생존율 둘 다를 개선시켰다. 전기천공 전 자극 (도 13)과 달리, IL-7 및 IL-15의 추가의 부가는 개선된 편집에 기여하지 않았다. (D) 배양 후 밀도는 삽입 효율에 거의 영향을 미치지 않았다. 전기천공 후 4일에 GFP 삽입 효율 (dsDNA RAB11A-GFP HDRT) 및 총 GFP+ 세포의 절대 계수를 수행하였다. 조건 당 2개의 도트는 2명의 건강한 혈액 공여자로부터 수득된 값을 나타낸다.
도 15A-B는 다수의 공급원으로부터 단리된 신선한 T 세포 및 동결된 T 세포에서의 효율적인 비-바이러스 유전자 표적화를 도시한다. (A) dsDNA RAB11A-GFP HDR 주형을 2명의 건강한 공여자로부터의 신선한 T 세포와 동결된 T 세포 둘 다 내로 삽입하였다. 두 조건에서 높은 비율의 GFP 삽입이 관찰되었으며, 이는 세포의 동결을 요구하는 연구 또는 임상 프로토콜에 대한 비-바이러스 유전자 표적화의 적응성을 명확하게 보여준다. (B) 유사하게, 전혈, 혈장 성분 채집술 잔류물뿐만 아니라 백혈구 성분 채집술로부터 단리된 1차 인간 CD3+ T 세포에서, 고 효율의 GFP 표적화된 통합이 관찰되었다.
도 16A-B는 비-바이러스 유전자 표적화를 위한 RNP 및 HDR 주형 제형의 최적화를 도시한다. (A) 3명의 공여자 전체에 걸쳐, 증가하는 양의 dsDNA HDR 주형 (RAB11A-GFP)의 전기천공이 세포 생존율을 점진적으로 감소시키면서 효율을 또한 증가시켰지만, HDR 주형과 RNP 둘 다의 중간 농도 시험은 GFP+ 세포의 가장 큰 총 수를 제공하였다는 일관된 추세가 나타났다. (B) 3명의 부가 공여자에서의 추가로 표적화된 최적화 시리즈는, 50 pmol의 RNP와 공동으로 전기천공된 4 ug의 HDR 주형의 최적 제형을 산출하였다. 전기천공 후 4일에 GFP 삽입 효율 및 총 GFP+ 세포의 절대 계수를 수행하였다. 그래프 (B) 당 다수의 도트는 기술적 반복실험을 나타낸다.
도 17A-C는 큰 비-바이러스 HDR 주형의 전달을 위한 전기천공 파라미터의 최적화를 도시한다. (A) 여기에 제시된 미가공 데이터는 도 11E에 요약되어 있다. 론자(Lonza) 4D 뉴클레오펙터 상에서의 전기천공 조건의 체계적인 변동. 전기천공 완충제 론자 P3를 사용할 때, 궁극적으로 선택된 펄스 코드 EH115는 일관되게 가장 효율적인 코드였다. 다른 대체 코드, 예컨대 EO-148이 총 양성 세포에 대해 최적화되었다. (B) 전기천공 조건의 서브세트의 확증적 시험은 또한, OMEM 완충제 중의 펄스 코드 EO-155를 중간 정도의 효율이지만 높은 총 양성 세포 조합으로서 확인하였다. (C) 24 uL의 총 용적 (RNP + HDRT + 세포)를 전기천공하는 것은, 세포 생존율에 큰 기여를 하였고 고 효율을 유지시켰다. 24 uL 초과의 전기천공 용적은 통상적으로 전기천공 실패를 야기시킨다. 전기천공 후 4일에 dsDNA RAB11A-GFP 삽입 (A, C) 또는 dsDNA BATF-GFP 삽입 (B)의 효율 및 총 GFP+ 세포의 절대 계수를 수행하였다.
도 18A-D는 1차 인간 T 세포에서 비-바이러스 유전자 표적화의 다양한 적용을 도시한다. (A) 비-바이러스 HDR 주형 및 상응하는 RNP를 사용하여 1차 인간 T 세포 내의 다수의 내인성 유전자에서, GFP-융합 구축물을 이용한 고 효율 게놈 표적화가 달성될 수 있었다. (B) 표시된 HDR 주형의 전기천공 후 7일에 살아 있는 1차 인간 T 세포의 공초점 현미경 검사는 융합-단백질 표적화의 특이성을 확증시켜 주었다. 각각의 영상 내의 스케일 바는 5 um이다. (C) 벌크 인간 1차 T 세포에서 RAB11A 및 CD4 유전자에 대한 GFP-융합 구축물의 비-바이러스 표적화. RAB11A-융합물은 CD4+ 및 CD8+ 세포 둘 다에서 GFP 양성인 반면, CD4+-융합물은 CD4+ T 세포에서만 양성이었다 (상기의 대표적인 유동 세포계수법, 하기 정량화). (D) 내인성 전사 인자, BATF와 융합된 GFP를 발현하도록 1차 인간 T 세포를 조작하였다. 전기천공 후 11일에, 핵을 단리하고 컷 앤 런(CUT & RUN)을 수행하였다. 항-GFP 또는 항-BATF 항체를 사용하여 GFP-BATF 및 총 BATF 염색질 상호 작용 부위를 확인하였다. 생존율 및 효율을 검정하기 위한 유동 세포계수법을 전기천공 후 4일에 수행하였다 (A, C, D). 표시된 데이터는 적어도 2명의 상이한 공여자를 나타낸다.
도 19A-B는 표적 유전자좌 전체에 걸쳐 재현 가능한 비-바이러스 유전자 표적화를 도시한다. (A) 6명의 건강한 공여자로부터의 1차 CD3+CD8+ T 세포 내로 상응하는 RNP와 함께 5개의 상이한 GFP 주형 중 하나를 전기천공 한지 4일 후에, 주형 및 공여자 모두 전체에 걸쳐 GFP 발현이 관찰된다. 5개의 유전자좌 각각에 대한 공여자 전체에 걸친 GFP 양성 세포 내의 GFP 발현 수준에 있어서의 일관성에 주목해야 한다 (TUBA1B 및 ACTB에서 더 높고, RAB11A 및 FBL 태그에서 더 낮음). (B) (A)에서의 GFP 삽입 백분율의 그래픽 요약.
도 20A-B는 건강한 공여자의 코호트에서 재현 가능한 비-바이러스 유전자 표적화를 도시한다. (A) 일정한 dsDNA RAB11A-GFP HDR 주형 및 RNP를, 12명의 건강한 공여자의 코호트로부터 수득된 세포에서 비-바이러스 유전자 표적화를 위해 개발된 최적화된 조건을 사용하여 전기천공시켰다. 개별 공여자들 간에는 GFP 삽입 백분율에 있어서 상당한 변동성이 있었지만, 모두 GFP의 강력한 통합을 달성하였다 (CD8+ T 세포에서 22% 내지 57% 범위). 전기천공 없음 대조군과 비교해서 CXCR4를 표적으로 하는 오프-타겟 RNP와 함께 dsDNA RAB11A-GFP HDR 주형으로 전기천공된 세포에서 일부 GFP 발현이 관찰되었다. (B) (A)에서의 GFP 삽입 백분율의 요약 그래프. 12명의 건강한 공여자 코호트 전체에 걸쳐, 약간 더 높은 비율의 GFP 발현이, CD3+CD4+ T 세포 (평균 35.2%)와 비교해서 CD3+CD8+ T 세포 (평균 42.0%)에서 관찰되었다.
도 21은 염색질 점유율을 분석하기 위한 전사 인자 BATF의 내인성 태그부착을 도시한다. 1차 인간 T 세포 집단으로부터 수득된 컷 앤 런 데이터의 항-BATF, 항-GFP 및 항체 없는 히트맵을 GFP-BATF 융합 HDR 주형으로 전기천공시켰다 (태그부착되지 않은 세포는 전기천공되지 않았다). 각각의 샘플에 대해 정렬된 컷 앤 런 결합 프로파일을, 태그부착되지 않은 세포 내의 BATF 컷 앤 런 피크에 집중시켰고, 태그부착되지 않은 세포에서의 BATF 피크 강도에 의해 정렬하였다.
도 22A-E는 조합 비-바이러스 유전자 표적화를 도시한다. (A) 1차 인간 T 세포에서 RAB11A-GFP 및/또는 RAB11A-mCherry 융합물을 생성하기 위한 HDR 주형의 동시 전기천공. 두 주형이 공동으로 도입될 때 이중 GFP+ mCherry+ 세포의 별개의 집단이 발견되었는데, 이는 이중 대립유전자 표적화와 일치한다. (B) 사분면의 개별 세포에 대한 잠재적 유전자형은 두 형광단의 발현에 의해 규정된다. 이중 대립유전자 통합의 관찰된 수준은 우연히 예상되는 것보다 적어도 하나의 통합을 획득하는 세포에서 더 높다 (도 23). 개별 포인트는 형광 단백질을 코딩하는 유전자의 조합이 HDR 주형의 양 (3 내지 6 ug)과 같이 변하는 (GFP + mCherry, GFP + BFP, mCherry + BFP) 반복실험을 나타낸다. (C-D) 동일한 1차 인간 T 세포 내의 2개의 별도의 게놈 유전자좌에서 HDR 주형의 다중화된 통합. 2 ug의 각각의 주형 (전기천공 당 총 4 ug)을 25 pmol의 각각의 RNP (총 50 pmol)와 함께 전기천공시켰다. 하나의 부위 (예를 들어 GFP+)에서의 통합에 대해 양성인 세포는, 제1 통합이 결여된 세포보다 제2 부위 (예를 들어, mCherry+일 수 있다)에서 통합을 가질 가능성이 훨씬 더 높았다. (E) 3개의 별개의 게놈 유전자좌에 대한 큰 삽입의 동시 비-바이러스 유전자 표적화. 1.5 ug의 각각의 주형 (총 4.5 ug)을 20 pmol의 각각의 상응하는 RNP (총 60 pmol)와 함께 전기천공시켰다. 2개의 부위 다중화와 유사하게, 단일 통합 (Q-II에서 mCherry+ 및 Q-III에서 GFP+)에 대해 양성인 세포는 (Q-I)이 없는 것과 비교해서 제2 통합 (BFP+)을 가질 가능성이 더 컸다. 2개의 통합 (GFP+ 및 mCherry+, Q-IV)에 대해 양성인 세포는 제3 유전자 (BFP+)의 통합을 가질 가능성이 훨씬 더 크다. 아래는 형광단에 대해 단일, 이중 및 삼중 양성인 세포의 막대 그래프 정량이다. 모든 형광 판독은 전기천공 후 4일에 수행되었다. 표시된 데이터는 패널 E (1명의 공여자)를 제외한 적어도 2명의 상이한 공여자를 나타낸다.
도 23A-G는 동일한 유전자좌 내로 다수의 형광 단백질을 삽입함으로써 이중 대립유전자 HDR 통합의 모델링 및 분석을 도시한다. (A) 2개의 형광 단백질이 동일한 유전자좌 내로 삽입될 때 가능한 세포 표현형. (B) 이들 표현형 집단 중 2개의 유전자형이 즉시 공지된다. 임의의 기능적 삽입이 없는 세포 (하단 왼쪽 사분면, 유전자형 A)는 NA/NA 유전자형을 가져야만 한다 (여기서, NA는 WT 대립유전자 및 NHEJ 편집된 대립유전자를 포함하여, HDR이 없는 대립유전자를 표시한다). 이중 형광 세포 (상단 오른쪽 사분면, 유전자형 E)는 각각의 주형의 하나의 카피를 획득해야만 하며 (상염색체 표적 유전자좌 및 오프-타겟 통합이 없다고 가정함), GFP/RFP의 유전자형을 가질 것이다. 그러나, 2개의 단일 양성 집단은 HDR 삽입을 위해서는 이형접합성인 세포들 (유전자형 B 및 C) 사이에서 혼합되거나 또는 동일한 형광 주형의 2개의 카피를 위해서는 동형접합성 세포들 (유전자형 D 및 F) 사이에서 혼합될 것이다. (C) 이중 대립유전자 HDR 통합을 갖는 세포의 총 백분율은 유전자형 D, E 및 F의 합이어야만 한다. 유전자형 E를 갖는 세포 (이중 플루오르 양성물)의 분율은 그 표현형으로부터 즉시 명백하지만, 유전자형 D 및 F는 그렇지 않다. 간단한 확률 모델의 적용은 단일 플루오로 양성 표현형에서 다중 유전자형의 디콘볼루션(de-convolution)을 허용하므로, HDR에 대해 동형접합성 세포의 실제 백분율을 추정한다. (D) RAB11A 유전자좌 내로 삽입된 다양한 형광단 순열 전체에 걸쳐 적용된 이중 대립유전자 HDR 분석. (E-F) 이중 형광 이중 대립유전자 통합이 표적 유전자좌 전체에 걸쳐 관찰되었다. 삽입을 갖는 세포의 총 백분율이 각각의 표적 부위의 효율에 따라 다양하였지만, 무작위 우연에 의해 예측된 것보다 동형접합성 세포의 관찰된 백분율에 있어서의 배수 강화는 유전자좌 전체에 걸쳐 일관되었다. (G) HDR에 의해 동일한 유전자좌로 3개의 별개의 형광단의 통합을 시도하였다. 최대 2개의 표적화된 삽입이 가능하기 때문에 (유전자좌의 2개의 대립유전자에서; 2배체 게놈을 가정함), 3개의 유전자좌 모두에 대해 양성인 세포 (삼중 양성물)는 관찰되지 않아야 한다. 실제로, 다수의 단일 형광단 통합이 관찰되고 (단일 양성물), 또한 두 플루오르의 다양한 순열에 대해 양성인 세포 (이중 양성물)가 관찰되지만, 이중 양성물과 비교해서 삼중 양성 세포의 수가 30배 감소한다. 형광 단백질 발현의 모든 유동 세포계수 분석은 전기천공 후 4일에 수행되었다. 디스플레이는 1명 (E, F) 또는 2명 (D, G)의 건강한 인간 공여자로부터의 다수의 기술적 반복실험을 나타낸다. 막대 그래프는 평균 + 표준 편차를 표시한다.
도 24A-B는 하나의 유전자좌에서 HDR 통합의 획득이 부가의 유전자좌에서의 HDR의 가능성을 증가시킨다는 것을 보여주는 다중화된 통합을 도시한다. (A) 6개의 dsDNA HDR 주형 세트 (RAB11A, CD4 및 CLTA를 표적으로 함; 각각의 부위는 GFP 또는 RFP를 수반함)으로부터의 2개의 HDR 주형 순열을, 건강한 인간 공여자로부터 단리된 CD3+ T 세포 내로 전기천공시켰다. 표시된 2개의 HDR 주형을 그의 2개 각각의 온-타겟 RNP와 함께 전기천공한지 4일 후에, 각각의 주형에 대해 양성인 세포의 백분율을, 다른 주형에 대해 양성 또는 음성인 세포 상에서 게이팅할 때 분석하였다. 다양한 주형 조합 전체에 걸쳐 2-주형 다중화가 가능했을 뿐만 아니라, 하나의 주형에 대해 양성인 세포 (주형 1+ 세포) 상에서 게이팅하면, 제1 주형에 대해 음성인 세포 (주형 1- 세포, 흑색)와 비교해서 제2 주형에 대해 양성일 것으로 더 많이 예상되는 세포 집단이 강화되었다. 각각의 연관된 RNP 30 pmol과 함께 2 ug의 각각의 주형을, 이중 다중화 실험을 위해 전기천공시켰다. (B) 부가 주형의 전기천공은 다양한 HDR 주형 조합을 사용하여 3개의 부위 다중화를 허용한다. 단일 양성 세포와 비교 시 다른 두 주형에 대해 양성인 세포 상에 게이팅함으로써 제3 주형에 대해 양성인 세포를 추가로 강화시킬 수 있다. 표시되는 데이터는 2명의 건강한 인간 공여자로부터의 다수의 기술적 반복실험으로부터의 평균 + 표준 편차이다.
도 25A-F는 D10A 닉카제 및 ssDNA HDR 주형이 오프-타겟 통합을 감소시킨다는 것을 도시한다. (A) Cas9 RNP 및 RAB11A-GFP dsDNA HDR 주형의 조합을 1차 인간 T 세포 내로 전기천공시켰다. dsDNA 주형 단독, 또는 인간 게놈에서 서열이 일치하지 않는 스크램블된 gRNA를 함유하는 RNP를 갖는 dsDNA 주형은 작지만 검출 가능한 양의 GFP 발현을 산출시켰는데, 이는 dsDNA 주형이 표적화된 RAB11A-GFP 통합 부위와 상이한 부위를 표적으로 하는 gRNA와 함께 전기천공될 때 현저하게 증가되었다 ("오프-타겟 RNP"는 CXCR4 엑손 1을 표적으로 한다). (B) RAB11A-GFP dsDNA HDR 주형이 오프-타겟 RNP와 함께 전기천공될 때, 오프-타겟 통합이 상이한 공여자로부터의 세포에 일관되게 존재하였고, dsDNA HDR 주형 단독이 전기천공되는 경우에는, 더 적은 수의 오프-타겟 통합이 발생하였다. (C) Cas9 뉴클레아제 변이체 D10A (닉카제) 및 불활성 dCas9는, 오프-타겟 단일 CXCR4 gRNA가 사용될 때 오프-타겟 통합을 상당히 감소시켰지만, D10A 닉카제 (PAM-out 방향에서 "온-타겟" gRNA 쌍을 수반한다)는 RAB11A dsDNA HDR 주형의 효율적인 온-타겟 통합을 야기시켰다. (D) ssDNA HDR 주형의 전기천공은 오프-타겟 통합을, 뉴클레아제가 부가되지 않은 것과 오프-타겟 dsDNA 절단이 유도된 것 (오프-타겟 gRNA + Cas9) 둘 다의 경우에 검출 한계 (주형이 전기천공되지 않은 경우의 수준과 거의 동등한 수준임)까지 감소시켰다. (E-F) RAB11A 부위에서의 GFP 융합의 통합을 위해, ssDNA HDR 주형과 함께 D10A 닉카제를 사용하면, dsDNA 주형과 함께 Cas9를 사용하는 경우와 비교해서 온-타겟 HDR (온-타겟 gRNA와의 GFP 통합)이 감소되었지만, 오프-타겟 통합은 검출할 수 없는 수준으로 크게 감소되었다. 모든 형광 판독은 전기천공 후 4일에 수행되었다. 표시된 데이터는 적어도 2명의 상이한 공여자 (A 및 E) 또는 표준 편차가 제시된 2명의 상이한 공여자의 평균 (C, D 및 F)을 나타낸다.
도 26A-D는 다수의 HDR 주형 전체에 걸친 오프-타겟 통합 이벤트의 형광 추정 및 정량을 도시한다. (A) 표적 유전자좌의 N-말단에서의 HDR 매개된 삽입의 다이어그램 (규모에 맞게 그려지지 않음). 상동성 아암은 삽입물 (이러한 경우 GFP 태그)이 삽입될 정확한 서열을 명시하여, 외인성 서열의 무흉터 통합을 허용한다. GFP 융합 단백질이 생성됨에 따라, GFP 형광은 통합 부위에 인접한 RNP 커팅에 의존하여 이러한 온-타겟 통합의 결과로서 보여질 것이다. (B) 이중 가닥 DNA는 자연적으로 발생하는 dsDNA 절단물에서의 무작위 통합 또는 잠재적으로 유도된 이중 가닥 절단물에서의 무작위 통합, 예컨대 RNP의 오프-타겟 커트 부위에서의 무작위 통합을 통하여 오프-타겟 부위에서 상동성-비의존적 복구 메커니즘을 통해 통합될 수 있다. 이러한 효과는 HDR을 수행할 능력이 결여된 노화 세포 유형에서 원하는 유도된 dsDNA 절단물 (HITI)에서의 dsDNA 서열의 표적화된 통합을 허용하기 위해 이용될 수 있지만, 결정적으로 임의의 잠재적 상동성 아암을 포함하여 dsDNA 주형 전체가 통합된다. 상동성 아암이 프로모터 서열을 함유하는 경우 (예컨대, N-말단 융합 태그의 경우), 이들 오프-타겟 통합은 원하는 정확한 HDR 삽입 없이 삽입된 서열의 관찰 가능한 발현을 구동시킬 수 있다. (C) 바는 표시된 성분과 함께 전기천공된 인간 CD3+ T 세포로부터의 실제 GFP+ 백분율을 나타낸다. 형광 단백질 발현에 대한 유동 세포계수법을 이용하여 오프-타겟 기능적 통합을 신속하게 평가할 수 있다. 주형 단독이 전기천공될 때 검출 한계를 초과하는 형광 세포의 백분율 상의 증가는, 자연적으로 발생하는 dsDNA 절단물에서의 무작위 통합을 나타내는 것으로 예상된다. 오프-타겟 모든 통합이 형광 단백질 발현을 산출하는 것은 아니지만, 상이한 주형 간의 오프-타겟 기능적 발현에 있어서의 상대적 차이가 검정될 수 있다. CXCR4를 표적으로 하는 RNP의 포함은 HITI-유형 삽입 이벤트를 통해 가능하게 관찰된 오프-타겟 상동성-비의존적 통합을 극적으로 증가시킨다. 그러나, 가장 큰 증가 (본 공여자에서는 1%에서 >30%로의 증가)는 정확한 RNP 및 HDR 매개된 삽입의 전기천공을 통해 이루어진다. (D) 5개 주형 전체에 걸친 온-타겟 GFP 발현 (오른쪽 컬럼) 대 오프-타겟 기능적 통합 (중간 컬럼)의 비교. 2개의 생물학적 공여자 (도트)의 평균 발현 (바)을 그래프로 나타내었다.
도 27A-B는 HDR 주형 대 gRNA 매트릭스 전체에 걸친 GFP 발현을 도시한다. (A) GFP 발현을 CXCR4 gRNA 및 RNP 없는 대조군과 함께 dsDNA HDR 주형 및 그의 상응하는 gRNA의 매트릭스의 전기천공 후 7일에 건강한 공여자로부터의 CD3+CD4+ 1차 인간 T 세포에서 분석하였다. dsDNA 주형으로 예상된 바와 같이, 오프-타겟 통합이 조합 전체에 걸쳐 관찰되었지만, 모든 gRNA 및 HDR 주형에 대해 가장 높은 GFP 발현이, 온-타겟 조건에서 관찰되었다. (B) (A)에서의 유동 세포계수법 데이터의 히트 맵 요약. 핵 인자 FBL로의 C-말단 GFP 융합 태그인 하나의 HDR 주형은 gRNA 전체에 걸쳐 일관되게 더 높은 오프-타겟 발현을 가졌다.
도 28A-D는 Cas9 닉카제를 사용한 1차 인간 T 세포에서의 효율적인 HDR을 도시한다. (A) RAB11A의 제1 엑손을 함유하는 게놈 유전자좌의 다이어그램. 출발 코돈 바로 다음에 RAB11A와 프레임을 유지하면서 GFP를 통합한 dsDNA HDR 주형과 함께 단일 가이드 RNA (gRNA 1)를 spCas9와 함께 사용하면, 효율적인 GFP 발현이 초래된다 (도 11F). Cas9 닉카제 (D10A 변이체)를 2개의 gRNA와 함께 사용하면, 오프-타겟 커팅의 가능성을 감소시킬 수 있었다. (B-C) 일련의 단일 gRNA 및 이중 gRNA 조합을 대상으로, RAB11A N-말단 유전자좌에서 GFP 삽입 효율에 관하여 시험하였다. 예상한 바와 같이, 뉴클레아제 데드(dead) Cas9 (dCas9)를 사용할 때 어떠한 gRNA도 주목할 만한 수준의 GFP 삽입을 나타내지 않았다. 삽입 부위에 인접한 다수의 단일 gRNA 커팅은 Cas9를 사용할 때 GFP 통합을 보여주었지만, gRNA 1만큼 효율적이지 않았다. D10A 닉카제는 단일 가이드와의 GFP 통합이 거의 또는 전혀 없음을 보여주었지만, 다수의 2-가이드 조합은 효율적인 GFP 통합을 보여주었다. 2개의 PAM 서열이 서로 멀어지는 (PAM Out) gRNA 조합에서만 GFP 통합이 관찰되었다. (D) dsDNA 절단을 유도하기 위해서는 D10A 닉카제가 2개의 gRNA 결합을 아주 근접하여 가져야 한다는 요구 사항으로 인해, 오프-타겟 gRNA (CXCR4를 표적으로 함)를 전기천공할 때 더 낮은 수준의 오프-타겟 기능적 통합을 명확히 보여주는 미가공 데이터가 도 25C에 제시된다. 모든 디스플레이 (B-D) 내의 도트는 표지된 2명의 건강한 공여자에서의 기술적 반복실험을 나타낸다.
도 29A-H는 2가지 기능 상실 IL2RA 돌연변이를 갖는 대상체에서 감소된 Treg 빈도 및 결함있는 Treg 억제 능력을 도시한다. (A) 건강한 공여자, 및 IL2RA 이형 접합체 (c.530 het 1, c.800 hets 1-3)뿐만 아니라 복합 이형 접합체 어린이 (Comp. Hets 1-3)를 포함한 모든 가족 구성원 (기능 상실 IL2RA 돌연변이를 수반함)으로부터의 CD3+CD4+ T 세포를 대상으로, CD25hiCD127lo Treg의 존재를 평가하기 위해 유동 세포계수법에 의해 분석하였다. (B) 건강한 공여자 및 단일 hets에서, CD4+FoxP3+ T 세포는 주로 CD25hiCD127lo이다. 복합 이형 접합체에는, CD127lo CD4+FoxP3+ 집단이 존재하지만 IL2RA를 발현하지는 않는다. (C) 2개의 별도의 부위에서 수행된 임상 표현형 검사는 복합 이형 접합체가 CD127lo FoxP3+ 세포의 정상 빈도를 보유하고 있다는 것을 확증시켜 준다. (D) 복합 이형 접합체 3에서의 IL2RA 표면 발현 상의 결핍은, IL-2로의 자극 후 pStat5 발현에 의해 측정된 바와 같이 비정상적인 하류 시그널링을 야기시켰지만, IL-7 또는 IL-15의 경우에는 그렇지 않았다. (E) CD25-결핍 복합 이형 접합체로부터 CD25hi Treg를 분류할 수 없기 때문에, 표면 마커 CD127loCD45RO+TIGIT+를 사용하여 CD3+CD4+ T 세포로부터 FoxP3+ 세포를 강화시키는 대체 게이팅 전략이 확립되었다. 표시된 게이트된 집단으로부터의 세포내 FoxP3 염색이 도시된다. (F) 이들 CD3+CD4+CD127loCD45RO+TIGIT+ 잠재적 "Treg"는 FoxP3에 대해 고도로 강화되었고 건강한 공여자로부터의 CFSE-표지된 자극된 반응인자 T 세포 (Tresp)와 함께 배양될 때 약간의 억제 능력을 보인 반면, 복합 이형 접합체로부터의 CD3+CD4+CD127loCD45RO+TIGIT+는 억제 능력을 나타내지 않았다. 자극된 Tresp 집단 (실선 곡선), 자극되지 않은 Tresp (파선 곡선). (G) 복합 이형 접합체에서 어느 하나의 CD25 돌연변이의 교정은 개별적으로, 여전히 다른 돌연변이를 남길 것이므로, 세포를 단일 이형 접합체로서 남겨둔다. 이러한 잠재적인 교정이 일정 수준의 기능적 억제를 초래할 것임을 확증하기 위해, c.530 및 c.800 단일 이형 접합체 가족 구성원으로부터의 CD4+CD25hiCD127lo Treg를 단리하고 그들의 억제 능력을 (F)에서와 같이 검정하였다. (H) 건강한 공여자, CD25-결핍 복합 이형 접합체 (F) 및 CD25+/- c.530 또는 c.800 이형 접합체 (G)로부터의 세포에서의 Treg 억제 능력의 도트 플롯 요약. 복합 이형 접합체로부터의 CD3+CD4+CD127loCD45RO+TIGIT+ "Treg"는 억제 능력을 나타내지 않았지만, 단일 이형 접합체 가족 구성원으로부터의 통상적인 CD4+CD25hiCD127lo Treg는 일부 억제 능력을 나타냈는데, 이는 복합 het와 비교해서 현저한 임상 표현형의 결여와 일치한다.
도 30A-E는 1차 인간 T 세포에서 비-바이러스 유전자 표적화에 의해 교정된 단성 자가 면역 돌연변이를 도시한다. (A) 한 가족 내의 3명의 형제 자매는 2개의 상이한 IL2RA (고 친화도 IL-2 수용체, CD25를 코딩함) 돌연변이 (IL2RA 엑손 4에서 정지 코돈을 생성하는 c.530A>G; 거의 100개 아미노산 런-온을 야기하는 IL2RA 엑손 8에서 프레임 시프트 돌연변이를 생성하는 c.800delA)를 보유하고 있다. (B) 이들 3명의 복합 이형 접합체 형제 자매는 그들의 1차 T 세포 상에서의 IL2RA의 세포 표면 발현이 크게 감소되었지만, 완전히 부재하지는 않은 것으로 나타났다. Cas9 RNP 및 정확한 IL2RA 서열을 함유하는 dsDNA HDR 주형의 전기천공에 의한 c.530 돌연변이의 비-바이러스 유전자 표적화는 (표적화된 PAM 서열에서의 침묵 돌연변이와 함께) 전기천공 후 2일에 각각의 복합 이형 접합체 형제로부터의 T 세포의 일부분에서의 IL2RA 세포 표면 발현을 성공적으로 구제하였다. (C) 비-바이러스 유전자 표적화 후 7일에, 표적화된 T 세포는 비-표적화된 대조군과 비교해서 IL-2 자극시 Stat5의 인산화 수준이 증가된 것으로 나타났다. (D) c.530 돌연변이를 교정하기 위한 비-바이러스 유전자 표적화 후 9일에, 3명의 복합 이형 접합체 공여자로부터의 IL2RA+ T 세포는 비-표적화된 세포 또는 건강한 공여자 세포와 비교해서 증가된 수준의 FoxP3+ 세포를 포함한다. (E) c.530 돌연변이의 비-바이러스 유전자 표적화 및 교정은 최적화된 치료제 세트 (ssDNA HDR 주형과 함께 D10A 닉카제)를 사용하여 가능하고 효율적이다. 1명의 복합 이형 접합체 공여자로부터의 T 세포를 전기천공 후 9일의 생체외 확장 후 (재자극 후 2일) IL2RA 표면 발현에 대해 염색하였다.
도 31A-D는 IL2RA에서의 복합 이형접합성 돌연변이의 확인 및 교정 CRISPR-Cas9 게놈 표적화 시약의 설계를 도시한다. (A) 단성 형태의 당뇨병에 관여하는 것으로 공지된 40개 초과의 유전자의 사내 표적화된 차세대 시퀀싱 다중 유전자 패널을 사용한 발단자 (proband)의 초기 유전적 시험은 음성이었다. 발단자 및 부모의 트리오에서 후속 엑솜 시퀀싱은 IL2RA 유전자에서의 2개의 원인 돌연변이를 밝혀내었다. 어머니는 IL2RA의 엑손 4 [서열식별번호 (SEQ ID NO): 1] (AGACAAGGTRGACCCAGCC)에 단일 이형접합성 돌연변이 (c.530G>A)를 보유하였으며, 이는 미숙한 정지 코돈을 초래하였다. (B) 아버지는 IL2RA의 엑손 8 [서열식별번호: 2 (ACAGGAGGARRRKWRRARAA)]에 단일 이형접합성 돌연변이 (c.800delA)를 보유하였으며, 이는 95개 아미노산 길이 런-온을 초래하는 프레임 시프트 돌연변이를 야기시켰다. 생어 시퀀싱 결과, 발단자가 두 돌연변이 모두에 대한 복합 이형 접합체였다는 것이 확증되었다. (C) 2개의 확인된 IL2RA 돌연변이의 대략적인 위치로 주석이 달린 IL2RA 단백질의 선형 묘사. SD1, 스시 도메인 1; SD2, 스시 도메인 2; TM, 막횡단; C, 세포질. (D) 명시된 돌연변이 [c.530G>A 대립유전자의 경우 (서열식별번호: 3)(CAAAATGACCCACGGGAAGACAAGGTAGACCC) 및 c.800delA 대립유전자의 경우 서열식별번호: 4 (GACTTTGTTACACCACTACAGGAGGAGAGTA)]를 포함한 게놈 서열을 사용하여, 2개의 IL2RA 돌연변이를 교정하기 위한 CRISPR-Cas9 게놈 표적화 시약을 설계하였다. gRNA는 각각의 돌연변이 부위에 인접하여, c.530 돌연변이의 경우에는 8 bp 떨어진 곳, 및 c.800의 경우에는 7 bp 떨어진 곳에 커팅하도록 설계되었다. 각각의 돌연변이에 대해, 각각의 가이드 RNA에 대한 PAM 서열 ("NGG")을 붕괴시키기 위한 변성 염기 내에서의 침묵 돌연변이뿐만 아니라 교정된 서열을 포함한 HDR 주형 [c.530 돌연변이의 경우 (서열식별번호: 5) (ACAAGATGGACCC) 및 c.800의 경우 (서열식별번호: 6)(AGGAGAAAGAGTA)]을 설계하였다. c.530 (CAAAATGACCCACGGGAAGACAAGATGGACCC) (서열식별번호: 7) 및 c.800 (서열식별번호: 8) (GACTTTGTTACACCACTACAGGAGAAAGAGTA)에 대한 교정된 대립유전자 + 침묵 PAM 붕괴 서열이 제시된다. c.530 돌연변이 부위 (hg38 ch10:6021526-6021557) 및 c800 돌연변이 부위 (hg38 ch10:6012886-6012917)에 대한 게놈 영역 (실물에 비례하지 않음)을 표시하였다. ssODN HDR 주형 (60 bp 상동성 아암이 있는 ssDNA)과 큰 dsDNA 또는 ssDNA HDR 주형 (표시된 바와 같이, 약 300 bp 상동성 아암이 있다) 둘 다가 사용되었다.
도 32A-C는 IL2RA c.530A>G 기능 상실 돌연변이의 HDR 매개된 교정을 도시한다. (A) IL2RA의 C-말단에서 c.800delA 돌연변이를 표적으로 하는 gRNA와 달리, c.530A>G 돌연변이 (내부 엑손에 정지 코돈을 유발함)를 표적으로 하는 gRNA는 CD3+ T 세포 내로의 RNP 단독 (청색)의 전기천공 후 2일에 건강한 공여자 및 단일 이형 접합체 (c.800 Het 2 및 3)에서 IL2RA의 실질적 (약 90%) 녹다운을 초래한다. 매우 작은 IL2RA+ 백분율에서 출발하긴 하지만, c.800delA 대립유전자로부터 일부 소량의 단백질이 표면으로 발현될 수 있기 때문에, 3가지 복합 이형 접합체 모두에서 녹다운이 또한 관찰되었다. 이러한 감소된 CD25 발현은 ssODN HDR 주형을 포함시킴으로써 부분적으로 구제될 수 있고, 큰 dsDNA HDR 주형을 사용하여 훨씬 더 실질적으로 구제될 수 있다. 2가지 주형 유형 모두는 교정된 서열, gRNA의 PAM 서열을 제거하기 위한 침묵 돌연변이, 및 60 bp (ssODN) 또는 약 300 bp (큰 dsDNA) 상동성 아암을 함유하였다 (도 32). 교정을 위한 c.800delA 돌연변이의 표적화와 달리, 복합 이형 접합체로부터 T 세포에서의 CD25 표면 발현은 HDR 주형이 포함된 경우에만 관찰된다. 3가지 복합 이형 접합체 모두에서, dsDNA HDR 주형은 더 큰 백분율의 CD25+ 세포를 산출하였다. (B) 전기천공 없음 또는 RNP 단독 대조군과 비교해서 HDR-매개된 돌연변이 교정을 받는 복합 이형 접합체 환자로부터의 CD3+ T 세포에서 전기천공 후 7일에 IL-2 자극 (200 U/mL)에 반응하여 pStat5 시그널링이 증가되었다. (C) 유사하게, 복합 이형 접합체 환자에서 HDR 교정 조건에서 전기천공 후 9일에 증가된 분율의 CD25+ FoxP3+ 세포가 관찰된다. 잠재적으로 환자의 질환 또는 환자의 면역 억제 약물 요법과 연관된 변경된 세포 상태로 인해, 복합 이형 접합체 3에서의 HDR 교정을 위한 c.530 돌연변이를 표적으로 할 때 더 낮은 백분율의 교정이 관찰되었다. 본 실시예에 제시된 최적화된 비-바이러스 게놈 표적화 프로토콜에 따라 전기천공을 수행하였다. ssODN 전기천공의 경우, 1 uL H2O 중 100 pmol이 전기천공되었다.
도 33A-C는 IL2RA c.800delA 프레임 시프트 기능 상실 돌연변이의 비-HDR 매개된 교정을 도시한다. (A) 그의 표면 상에 최소량의 IL2RA를 발현하는 3가지 복합 이형 접합체를 포함하여, 2개의 기능 상실 IL2RA 돌연변이를 갖는 가족으로부터의 모든 어린이에서 CD3+ T 세포에서의 CD25 표면 발현의 히스토그램 (전기천공 없음, 회색). 2개의 돌연변이 중 하나의 부위에 대항하여 gRNA를 함유하는 RNP를 전기천공한 후 2일에, 정상 정지 코돈을 초과하는 런-온을 유발하는 IL2RA의 최종 엑손 내에서의 1개 염기쌍 결실 (c.800delA), 건강한 공여자로부터의 CD3+ T 세포 및 단일 het (c.800 Het 2 및 3)가 CD25- 세포에 있어서의 약간의 증가를 보여준다 (RNP 단독, 청색). 낮은 녹아웃은 잠재적으로, 작은 삽입-결실이 표면 단백질 발현의 덜 현저한 상실을 야기할 수 있는 단백질의 C-말단을 표적으로 하는 gRNA에 기인한다. 놀랍게도, RNP 단독은 3가지 복합 이형 접합체 모두에서 편집된 T 세포의 거의 50%에서의 CD25 표면 발현을 초래하였다. 돌연변이 교정과 함께 ssODN HDR 주형 서열을 포함시킴으로써 RNP 단독과 비교해서 CD25 교정을 수반한 세포의 퍼센트 상의 증가가 달성될 수 있었고 (RNP + ssODN, 자주색), 돌연변이를 교정하기 위해 더 긴 dsDNA HDR 주형을 사용할 때 추가로 증가되었다 (RNP + dsDNA HDRT, 녹색) (도 32). (B) 전기천공 후 7일의 확장 후 편집된 CD3+ T 세포에서 고 용량 IL-2 자극 (200 U/mL)에 반응하는 포스포 Stat5 시그널링. pStat5+ 세포의 증가된 수는 CD25 표면 발현 상의 증가 (A)와 상관 관계가 있었다. (C) 전기천공 후 9일의 확장 후, 세포내 FoxP3 염색 결과, 전기천공 없음 대조군과 비교해서 CD3+ T 세포에서 CD25+ FoxP3+ 세포의 분율이 극적으로 증가하여, 유사하게 배양된 건강한 공여자에서 관찰된 CD25+ FoxP3+ 세포의 분율에 근접한 것으로 밝혀졌다. 최적화된 비-바이러스 게놈 표적화 프로토콜 (실시예)에 따라 전기천공을 수행하였다. ssODN 전기천공의 경우, 1 uL H2O 중 100 pmol이 전기천공되었다.
도 34A-B는 면역 억제제를 투여받은 복합 이형 접합체 IL2RA 기능 상실 환자에서 감소된 HDR 잠재력 및 변경된 임상 표현형을 도시한다. (A) 표시된 환자로부터의 CD3+ T 세포 내로의 양성 HDR 대조군 RAB11A-GFP dsDNA HDR 주형의 전기천공 후 6일에 GFP 발현의 유동 세포계수 분석 결과, 그의 2명의 c.800 이형 접합체 형제 자매와 비교해서 3명의 복합 이형 접합체에서 더 낮은 GFP 발현을 나타냈다. 유사하게 편집된 12명의 건강한 공여자의 코호트와 비교해서 (도 20), c.800 이형 접합체뿐만 아니라 복합 het 1 및 2 모두는 건강한 공여자 전체에 걸쳐 관찰된 일반적인 범위 내에 있는 반면, 복합 het 3은 분석된 어떠한 건강한 공여자보다도 더 낮은 GFP 발현을 나타냈다. 주목할 것은, 복합 het 3에서는 c.530 돌연변이 하의 HDR 매개된 교정이 다른 두 복합 het보다 실질적으로 더 낮았지만 (도 31A), RNP 단독을 표적으로 하는 c.800delA의 전기천공 후 CD25 표면 발현은 유사하였다. HDR 매개된 복구와 달리, c.800delA에서의 NHEJ 매개 프레임 시프트 교정은 세포 증식을 필요로 하지 않을 수 있는데, 이는 복합 het 3이 혈액 채취 및 T 세포 단리 시 활성 면역 억제제에 대한 유일한 복합 이형 접합체 환자인 것과 일치한다. (B) 환자의 질환과 연관된 변경된 세포 상태는 HDR 비율의 감소에 기여할 수도 있었다. 각각의 표시된 환자로부터의 비-편집되고 단리된 CD4+ T 세포에서의 TIGIT 및 CTLA4 발현 수준은 유동 세포계수법에 의해 측정되었다. 변경된 활성화 상태와 일관되게, 복합 het 3으로부터의 세포는 건강한 공여자, 이형접합성 가족 구성원뿐만 아니라 다른 두 복합 이형접합성 형제 자매 모두와 비교해서 증가된 TIGIT 및 CTLA4 발현을 갖는 별개의 표현형을 가졌다.
도 35A-B는 긴 ssDNA HDR 주형을 생산하는 여러 가지 방법을 도시한다. (A) 전기천공을 위해 충분한 양의 긴 단일 가닥 DNA 서열이 생산될 수 있다면, 온-타겟 효율을 과도하게 저하시키지 않으면서 오프-타겟 통합이 감소될 수 있었다. 한 가지 방법은 2-단계 선택적 엑소뉴클레아제 소화를 수반하는데, 이는 5' 인산화에 의해 표지된 PCR 산물의 하나의 가닥을 특이적으로 분해하여, 증폭 이전에 PCR 프라이머 상으로 용이하게 부가한다. (B) 순차적 시험관내 전사 (IVT) 및 역전사 (RT) 반응에 근거한 제2의 ssDNA 생산 방법이 또한 적용되었다. 짧은 T7 프로모터가 부착된 PCR 산물이 ssRNA 산물을 생산하기 위한 IVT 주형으로서 작용한다. RT 프라이머의 어닐링 및 역전사 후에, 수산화 나트륨에서 인큐베이션함으로써 (RNA 가닥을 선택적으로 분해한다) 긴 ssDNA 주형으로 용이하게 변환될 수 있는 RNA/DNA 혼성체가 형성된다. (C) 전기천공 후 2일에, ssDNA 주형만으로 전기천공된 CD3+ T 세포에서의 생존율은 dsDNA 주형만으로 전기천공된 것보다 더 높았다 (도 11). (D) ssDNA RAB11A-GFP HDR 주형은 dsDNA 주형과 유사한 고 효율 GFP 통합을 보여주었고, 더 높은 몰 양의 주형에서 고 효율 통합을 유지하였는데, 이는 잠재적으로, 증가된 생존율 (C)뿐만 아니라 DNA 주형 몰 당 질량이 덜한 것에 기인한다. 개별 포인트는 적어도 2명의 건강한 공여자를 나타낸다 (C, D).
도 1은 세포에서 실행 가능한 편집 효율을 달성하는 데 필요한 고 농도의 있는 그대로의 DNA를 전기천공한 후의 낮은 세포 생존율을 도시한다.
도 2는 전기천공시 세포를 부가하기 전에 짧은 실온 인큐베이션에 의해, DNA 주형 (플라스미드)을 RNP와 복합체 형성하는 것이, 일정 양의 긴 플라스미드 dsDNA의 전기천공시 정상적으로 관찰되는 생존율 상실을 감소시킨다는 것을 도시한다.
도 3은 전기천공시 세포를 부가하기 전에 짧은 실온 인큐베이션에 의해, DNA 주형 (선형, 이중 가닥 DNA (dsDNA) 주형)을 RNP와 복합체 형성하는 것이, 길고 선형인 이중 가닥 DNA의 전기천공시 정상적으로 관찰되는 생존율 상실을 감소시킨다는 것을 도시한다.
도 4는 약 10:1 RNP 대 DNA 주형의 예시적인 몰 비가, 전기천공 후 생존율뿐만 아니라 통합 효율 둘 다를 유지시킨다는 것을 도시한다.
도 5는 약 10:1 RNP 대 DNA 주형의 예시적인 몰 비가, 생존율 상실과 효율의 효과를 균형있게 하였고, 통합 양성 세포의 수를 최대화한다는 것을 도시한다.
도 6은 약 10:1 RNP 대 DNA 주형의 예시적인 몰 비가, 크기가 약 750개 염기쌍 초과인 큰 주형의 고 효율 삽입을 허용한다는 것을 도시한다.
도 7은 긴 DNA 주형의 삽입이 여전히, 일정 양의 오프-타겟 통합을 초래할 수 있다는 것을 도시한다.
도 8은 오프-타겟 통합이, 긴 단일 가닥 DNA (ssDNA) 주형을 공여자로서 사용함으로써 감소될 수 있다는 것을 도시한다.
도 9는 본원에 개시된 비-바이러스 통합이 2개의 gRNA 및 Cas9 닉카제 (D10A)를 사용하여 삽입될 수 있으며, 이는 오프-타겟 dsDNA 절단을 방지한다는 것을 도시한다.
도 10A-F는 CRISPR/Cas9 RNP 공동-전기천공이 dsDNA 유도된 생존율 상실을 감소시킨다는 것을 도시한다. (A) 1차 인간 T 세포 내로 전기천공된 선형 dsDNA 주형 (RAB11A에 대한 GFP 융합을 표적으로 하는 상동성 지향 복구 주형, 약 1350 bp 길이; 도 11A)은 주형의 양이 증가함에 따라 현저한 생존율 상실을 야기한다. 100 pmol의 RNP와 함께 동일한 양의 dsDNA 주형을 전기천공하면 놀랍게도 생존율이 증가하였다. (B) 플라스미드와 선형 dsDNA 주형 둘 다에 대해, RNP의 부가는 전기천공 후 생존율을 증가시켰다. 주목할만한 것은, 짧은 ssDNA 올리고 공여자 뉴클레오티드 (ssODN)를 이용한 경우에는 생존율에 있어서의 상실이 관찰되지 않았다. (C) 증가된 생존율을 알아보기 위해 RNP를 DNA와 공동으로 전달해야만 한다. 2명의 공여자로부터의 T 세포를 전기천공 사이에 8시간의 휴식기를 가지면서 각각 2회 전기천공시켰다. 밀접하게 산재된 2가지 전기천공이 높은 정도의 세포 사멸을 야기시켰지만, RNP 및 선형 dsDNA 주형의 전달은 별도로 전달될 수 있었다. 그러나, 초기의 RNP 전기천공은, DNA를 먼저 받고 RNP를 두 번째로 받은 세포와 비교해서 DNA 주형이 후속으로 전기천공될 때 생존율을 증가시키지 않았다. (D-F) RNP와 DNA를 공동으로 도입할 필요가 있다는 것을 고려하여, 본 발명자들은 전기천공 전에 이들을 함께 부가로 미리 인큐베이션하는 것이, 생존율을 추가로 증가시킬지의 여부를 검정하였다. 미리 인큐베이션하는 시간 (0 내지 15분)을 증가시켜도 생존율 상의 차이는 관찰되지 않았지만, 놀랍게도 RNP와 세포를 먼저 혼합하고, 전기천공 직전에 DNA 주형을 부가한 경우에는 (RNP + 세포; + HDRT), 생존율이 증가하였다 (E). 그러나, 세포를 부가하기 전에 RNP와 DNA HDR 주형을 함께 혼합한 웰에서는 (RNP + HDRT; + 세포), RNP와 DNA 주형이 얼마 동안 미리 인큐베이션되었는 지에 관계없이, HDR 백분율이 급격히 증가되었다 (GFP+ 세포). 전기천공 후 2일에 생존율을 측정하였고 제4일에 GFP 발현을 측정하였다. 그래프 (B, D, F)는 2명의 건강한 인간 공여자로부터의 데이터를 표시한다.
도 11A-F는 효율적인 큰 비-바이러스 유전자 표적화의 발생을 도시한다. (A) 96-웰 고 처리량 전기천공을 통한 세포 배양 및 자극 조건, RNP 및 DNA 주형 제형 및 전기천공 조건의 효과에 대한 체계적인 분석을 통해, 세포 생존율 (배양물 중 살아있는 세포의 총 수)과 HDR 효율 (GFP 양성인 세포의 %) 둘 다의 신속한 최적화가 가능하였다. (B) 하우스키핑 유전자 RAB11A의 N-말단과 상동인 영역에 의해 플랭킹된 GFP 서열을 코딩하는 긴 (1350 bp) 선형 dsDNA 주형의 개략도 (규모에 맞게 그려지지 않음). dsDNA 절단이 RAB11A의 N-말단에서 유도될 때, GFP 서열은 상동성 지향 복구 (HDR)를 통해 원활하게 도입되어, 내인성-태그부착된 RAB11A-GFP 융합 단백질을 생성할 수 있다. (C) 1차 인간 T 세포를, RAB11A 표적화 RNP 및 HDR 주형의 전기천공 전에 T 세포 수용체 (TCR) 자극 및 시토카인의 다양한 조합을 사용한 다음, 전기천공 후 5일 동안 배양 조건을 다양하게 하여 2일 동안 배양하였다. (D) 여기서 시험된 RNP 및 HDR 주형 농도 중에서, 시약의 중간 농도에서 RAB11A 내로의 최적의 GFP 삽입이 달성되었다. 추가 시험 (도 16)은 최적 농도를 50 pmol의 RNP 및 4 ug의 dsDNA HDRT로 좁혔다. (E) 전기천공 펄스 조건의 어레이된 시험은 일반적으로, 더 높은 HDR 효율을 산출하는 조건이 생존율을 감소시켰다는 것을 보여주었다. 충분한 생존율을 유지하면서도 HDR을 최적화하기 위해 EH115가 선택되었다. (F) C-D에 최적화된 파라미터를 사용하여, 내인성 RAB11A 유전자 내로의 GFP의 고 효율 삽입은 1차 인간 CD4+ 및 CD8+ T 세포 둘 다에서 비-바이러스 표적화에 의해 달성되었다. 전기천공 후 3일 (E) 또는 5일 (C, D 및 F)에 생존율 및 효율을 검정하였다. 개별 포인트는 개별 혈액 공여자 (C 및 D) 또는 2명의 개별 공여자의 평균 플러스 표준 편차 (E)를 나타낸다. 녹색 하이라이트는 비-바이러스 유전자 표적화 프로토콜에 대해 궁극적으로 선택된 조건을 표시한다.
도 12A-B는 비-바이러스 유전자 표적화가 1차 인간 T 세포에서 신속하고 효율적인 유전 공학을 가능하게 한다는 것을 도시한다. (A) 비-바이러스 유전자 표적화의 도식적 연대표. 게놈 편집 시약의 임의의 새로운 조합 (상동성 지향 복구 주형과 함께 gRNA)을 설계하고, 상업적 공급업체로부터 주문하며, 이를 어셈블리하기 위해서는 대략 1주가 소요된다. 전기천공하기 2일 전에, 혈액 또는 다양한 다른 공급원으로부터 단리된 1차 인간 T 세포 (도 15)를 자극한다. dsDNA HDR 주형은 PCR에 이어 SPRI 정제에 의해 쉽게 만들어져서, 전기천공에 적합한 고도로 농축된 산물을 달성할 수있다. 전기천공 당일에, RNP와 복합체 형성한 gRNA, HDR 주형, 및 수거된 자극된 T 세포를 혼합하고 전기천공시키는데, 이러한 프로세스에는 대략 1시간 30분이 소요된다. 전기천공 후, 조작된 T 세포는 부가의 2주 동안 쉽게 확장될 수 있다. (B) 생존율은 실제의 전기천공을 제외한 모든 프로토콜 단계를 거친 동등한 집단 (전기천공 없음 대조군)에 비해 살아있는 세포의 백분율을 지칭하기 위해 사용된다. 전기천공 후 살아있는 세포에서의 최저점은 2일 후에 오는 것으로 경험적으로 결정되었고, 달리 언급되지 않는 한 모든 생존율 측정 기준은 그 시점에 기록되었다. 용어 효율은 "녹인된(knocked in)" 외인성 서열 (예컨대 GFP)을 발현하는 배양물 중의 살아있는 세포의 백분율을 지칭하기 위해 사용된다. 최종적으로, 원하는 통합에 대해 양성인 세포의 총 수는 효율에 절대 세포 계수를 곱합으로써 계산되었다. 효율을 최대화하는 방법론적 변화는 종종, 양성 세포의 총 수에 대해 항상 최적인 것은 아니며 그 반대도 마찬가지이다.
도 13A-D는 비-바이러스 유전자 표적화를 위한 1차 인간 T 세포 자극의 최적화를 도시한다. (A) 전기천공하기 전 2일 동안 대안적인 전기천공 전 자극 조건을 적용하였다. IL-2, IL-7 및 IL-15의 시토카인 자극 칵테일과 함께 CD3/CD28 비드 결합 자극은 플레이트 결합 항체 자극보다 더 높은 생존율, 편집 속도 및 총 양성 세포를 달성하였다. (B) 비드 대 세포의 또 다른 비는 전기천공 전에 비드의 제거와 함께 최적의 1:1 비를 나타냈다. (C) 비-비드 기반 CD3/CD28/CD2 자극은 최적의 비에서 CD3/CD28 비드보다 더 낮은 편집 효율을 산출하였다. (D) 상업적 XVivo15 배지는 RPMI와 비교해서 유사한 생존율을 달성하였지만, 편집 효율은 더 높았다. 중요하게도, 무혈청 이뮤노컬트(Immunocult) 배지는 또한, 인간 1차 CD3+ T 세포의 고 효율 편집을 가능하게 하였다. 전기천공 후 4일에 GFP 삽입 효율 (dsDNA RAB11A-GFP HDRT) 및 총 GFP+ 세포의 절대 계수를 수행하였다. 조건 당 2개의 도트는 2명의 건강한 혈액 공여자로부터 수득된 값을 나타낸다.
도 14A-D는 전기천공 후 1차 인간 T 세포 취급의 최적화를 도시한다. (A) 자극 후 제2일 또는 제3일에 건강한 인간 공여자로부터의 CD3+ T 세포의 전기천공은 효율적인 표적화된 GFP 통합을 달성하였다. 2일에 걸친 이중 전기천공은 효율을 약간 증가시켰지만, DNA 주형이 2가지 전기천공 (도 10)에 포함되었을 때 생존율을 현저하게 감소시켰다. (B) 전기천공 후 부가의 CD3/CD28 자극은 증식 가능성을 감소시켰다. (C) 전기천공 후 높은 용량의 IL-2은 효율과 생존율 둘 다를 개선시켰다. 전기천공 전 자극 (도 13)과 달리, IL-7 및 IL-15의 추가의 부가는 개선된 편집에 기여하지 않았다. (D) 배양 후 밀도는 삽입 효율에 거의 영향을 미치지 않았다. 전기천공 후 4일에 GFP 삽입 효율 (dsDNA RAB11A-GFP HDRT) 및 총 GFP+ 세포의 절대 계수를 수행하였다. 조건 당 2개의 도트는 2명의 건강한 혈액 공여자로부터 수득된 값을 나타낸다.
도 15A-B는 다수의 공급원으로부터 단리된 신선한 T 세포 및 동결된 T 세포에서의 효율적인 비-바이러스 유전자 표적화를 도시한다. (A) dsDNA RAB11A-GFP HDR 주형을 2명의 건강한 공여자로부터의 신선한 T 세포와 동결된 T 세포 둘 다 내로 삽입하였다. 두 조건에서 높은 비율의 GFP 삽입이 관찰되었으며, 이는 세포의 동결을 요구하는 연구 또는 임상 프로토콜에 대한 비-바이러스 유전자 표적화의 적응성을 명확하게 보여준다. (B) 유사하게, 전혈, 혈장 성분 채집술 잔류물뿐만 아니라 백혈구 성분 채집술로부터 단리된 1차 인간 CD3+ T 세포에서, 고 효율의 GFP 표적화된 통합이 관찰되었다.
도 16A-B는 비-바이러스 유전자 표적화를 위한 RNP 및 HDR 주형 제형의 최적화를 도시한다. (A) 3명의 공여자 전체에 걸쳐, 증가하는 양의 dsDNA HDR 주형 (RAB11A-GFP)의 전기천공이 세포 생존율을 점진적으로 감소시키면서 효율을 또한 증가시켰지만, HDR 주형과 RNP 둘 다의 중간 농도 시험은 GFP+ 세포의 가장 큰 총 수를 제공하였다는 일관된 추세가 나타났다. (B) 3명의 부가 공여자에서의 추가로 표적화된 최적화 시리즈는, 50 pmol의 RNP와 공동으로 전기천공된 4 ug의 HDR 주형의 최적 제형을 산출하였다. 전기천공 후 4일에 GFP 삽입 효율 및 총 GFP+ 세포의 절대 계수를 수행하였다. 그래프 (B) 당 다수의 도트는 기술적 반복실험을 나타낸다.
도 17A-C는 큰 비-바이러스 HDR 주형의 전달을 위한 전기천공 파라미터의 최적화를 도시한다. (A) 여기에 제시된 미가공 데이터는 도 11E에 요약되어 있다. 론자(Lonza) 4D 뉴클레오펙터 상에서의 전기천공 조건의 체계적인 변동. 전기천공 완충제 론자 P3를 사용할 때, 궁극적으로 선택된 펄스 코드 EH115는 일관되게 가장 효율적인 코드였다. 다른 대체 코드, 예컨대 EO-148이 총 양성 세포에 대해 최적화되었다. (B) 전기천공 조건의 서브세트의 확증적 시험은 또한, OMEM 완충제 중의 펄스 코드 EO-155를 중간 정도의 효율이지만 높은 총 양성 세포 조합으로서 확인하였다. (C) 24 uL의 총 용적 (RNP + HDRT + 세포)를 전기천공하는 것은, 세포 생존율에 큰 기여를 하였고 고 효율을 유지시켰다. 24 uL 초과의 전기천공 용적은 통상적으로 전기천공 실패를 야기시킨다. 전기천공 후 4일에 dsDNA RAB11A-GFP 삽입 (A, C) 또는 dsDNA BATF-GFP 삽입 (B)의 효율 및 총 GFP+ 세포의 절대 계수를 수행하였다.
도 18A-D는 1차 인간 T 세포에서 비-바이러스 유전자 표적화의 다양한 적용을 도시한다. (A) 비-바이러스 HDR 주형 및 상응하는 RNP를 사용하여 1차 인간 T 세포 내의 다수의 내인성 유전자에서, GFP-융합 구축물을 이용한 고 효율 게놈 표적화가 달성될 수 있었다. (B) 표시된 HDR 주형의 전기천공 후 7일에 살아 있는 1차 인간 T 세포의 공초점 현미경 검사는 융합-단백질 표적화의 특이성을 확증시켜 주었다. 각각의 영상 내의 스케일 바는 5 um이다. (C) 벌크 인간 1차 T 세포에서 RAB11A 및 CD4 유전자에 대한 GFP-융합 구축물의 비-바이러스 표적화. RAB11A-융합물은 CD4+ 및 CD8+ 세포 둘 다에서 GFP 양성인 반면, CD4+-융합물은 CD4+ T 세포에서만 양성이었다 (상기의 대표적인 유동 세포계수법, 하기 정량화). (D) 내인성 전사 인자, BATF와 융합된 GFP를 발현하도록 1차 인간 T 세포를 조작하였다. 전기천공 후 11일에, 핵을 단리하고 컷 앤 런(CUT & RUN)을 수행하였다. 항-GFP 또는 항-BATF 항체를 사용하여 GFP-BATF 및 총 BATF 염색질 상호 작용 부위를 확인하였다. 생존율 및 효율을 검정하기 위한 유동 세포계수법을 전기천공 후 4일에 수행하였다 (A, C, D). 표시된 데이터는 적어도 2명의 상이한 공여자를 나타낸다.
도 19A-B는 표적 유전자좌 전체에 걸쳐 재현 가능한 비-바이러스 유전자 표적화를 도시한다. (A) 6명의 건강한 공여자로부터의 1차 CD3+CD8+ T 세포 내로 상응하는 RNP와 함께 5개의 상이한 GFP 주형 중 하나를 전기천공 한지 4일 후에, 주형 및 공여자 모두 전체에 걸쳐 GFP 발현이 관찰된다. 5개의 유전자좌 각각에 대한 공여자 전체에 걸친 GFP 양성 세포 내의 GFP 발현 수준에 있어서의 일관성에 주목해야 한다 (TUBA1B 및 ACTB에서 더 높고, RAB11A 및 FBL 태그에서 더 낮음). (B) (A)에서의 GFP 삽입 백분율의 그래픽 요약.
도 20A-B는 건강한 공여자의 코호트에서 재현 가능한 비-바이러스 유전자 표적화를 도시한다. (A) 일정한 dsDNA RAB11A-GFP HDR 주형 및 RNP를, 12명의 건강한 공여자의 코호트로부터 수득된 세포에서 비-바이러스 유전자 표적화를 위해 개발된 최적화된 조건을 사용하여 전기천공시켰다. 개별 공여자들 간에는 GFP 삽입 백분율에 있어서 상당한 변동성이 있었지만, 모두 GFP의 강력한 통합을 달성하였다 (CD8+ T 세포에서 22% 내지 57% 범위). 전기천공 없음 대조군과 비교해서 CXCR4를 표적으로 하는 오프-타겟 RNP와 함께 dsDNA RAB11A-GFP HDR 주형으로 전기천공된 세포에서 일부 GFP 발현이 관찰되었다. (B) (A)에서의 GFP 삽입 백분율의 요약 그래프. 12명의 건강한 공여자 코호트 전체에 걸쳐, 약간 더 높은 비율의 GFP 발현이, CD3+CD4+ T 세포 (평균 35.2%)와 비교해서 CD3+CD8+ T 세포 (평균 42.0%)에서 관찰되었다.
도 21은 염색질 점유율을 분석하기 위한 전사 인자 BATF의 내인성 태그부착을 도시한다. 1차 인간 T 세포 집단으로부터 수득된 컷 앤 런 데이터의 항-BATF, 항-GFP 및 항체 없는 히트맵을 GFP-BATF 융합 HDR 주형으로 전기천공시켰다 (태그부착되지 않은 세포는 전기천공되지 않았다). 각각의 샘플에 대해 정렬된 컷 앤 런 결합 프로파일을, 태그부착되지 않은 세포 내의 BATF 컷 앤 런 피크에 집중시켰고, 태그부착되지 않은 세포에서의 BATF 피크 강도에 의해 정렬하였다.
도 22A-E는 조합 비-바이러스 유전자 표적화를 도시한다. (A) 1차 인간 T 세포에서 RAB11A-GFP 및/또는 RAB11A-mCherry 융합물을 생성하기 위한 HDR 주형의 동시 전기천공. 두 주형이 공동으로 도입될 때 이중 GFP+ mCherry+ 세포의 별개의 집단이 발견되었는데, 이는 이중 대립유전자 표적화와 일치한다. (B) 사분면의 개별 세포에 대한 잠재적 유전자형은 두 형광단의 발현에 의해 규정된다. 이중 대립유전자 통합의 관찰된 수준은 우연히 예상되는 것보다 적어도 하나의 통합을 획득하는 세포에서 더 높다 (도 23). 개별 포인트는 형광 단백질을 코딩하는 유전자의 조합이 HDR 주형의 양 (3 내지 6 ug)과 같이 변하는 (GFP + mCherry, GFP + BFP, mCherry + BFP) 반복실험을 나타낸다. (C-D) 동일한 1차 인간 T 세포 내의 2개의 별도의 게놈 유전자좌에서 HDR 주형의 다중화된 통합. 2 ug의 각각의 주형 (전기천공 당 총 4 ug)을 25 pmol의 각각의 RNP (총 50 pmol)와 함께 전기천공시켰다. 하나의 부위 (예를 들어 GFP+)에서의 통합에 대해 양성인 세포는, 제1 통합이 결여된 세포보다 제2 부위 (예를 들어, mCherry+일 수 있다)에서 통합을 가질 가능성이 훨씬 더 높았다. (E) 3개의 별개의 게놈 유전자좌에 대한 큰 삽입의 동시 비-바이러스 유전자 표적화. 1.5 ug의 각각의 주형 (총 4.5 ug)을 20 pmol의 각각의 상응하는 RNP (총 60 pmol)와 함께 전기천공시켰다. 2개의 부위 다중화와 유사하게, 단일 통합 (Q-II에서 mCherry+ 및 Q-III에서 GFP+)에 대해 양성인 세포는 (Q-I)이 없는 것과 비교해서 제2 통합 (BFP+)을 가질 가능성이 더 컸다. 2개의 통합 (GFP+ 및 mCherry+, Q-IV)에 대해 양성인 세포는 제3 유전자 (BFP+)의 통합을 가질 가능성이 훨씬 더 크다. 아래는 형광단에 대해 단일, 이중 및 삼중 양성인 세포의 막대 그래프 정량이다. 모든 형광 판독은 전기천공 후 4일에 수행되었다. 표시된 데이터는 패널 E (1명의 공여자)를 제외한 적어도 2명의 상이한 공여자를 나타낸다.
도 23A-G는 동일한 유전자좌 내로 다수의 형광 단백질을 삽입함으로써 이중 대립유전자 HDR 통합의 모델링 및 분석을 도시한다. (A) 2개의 형광 단백질이 동일한 유전자좌 내로 삽입될 때 가능한 세포 표현형. (B) 이들 표현형 집단 중 2개의 유전자형이 즉시 공지된다. 임의의 기능적 삽입이 없는 세포 (하단 왼쪽 사분면, 유전자형 A)는 NA/NA 유전자형을 가져야만 한다 (여기서, NA는 WT 대립유전자 및 NHEJ 편집된 대립유전자를 포함하여, HDR이 없는 대립유전자를 표시한다). 이중 형광 세포 (상단 오른쪽 사분면, 유전자형 E)는 각각의 주형의 하나의 카피를 획득해야만 하며 (상염색체 표적 유전자좌 및 오프-타겟 통합이 없다고 가정함), GFP/RFP의 유전자형을 가질 것이다. 그러나, 2개의 단일 양성 집단은 HDR 삽입을 위해서는 이형접합성인 세포들 (유전자형 B 및 C) 사이에서 혼합되거나 또는 동일한 형광 주형의 2개의 카피를 위해서는 동형접합성 세포들 (유전자형 D 및 F) 사이에서 혼합될 것이다. (C) 이중 대립유전자 HDR 통합을 갖는 세포의 총 백분율은 유전자형 D, E 및 F의 합이어야만 한다. 유전자형 E를 갖는 세포 (이중 플루오르 양성물)의 분율은 그 표현형으로부터 즉시 명백하지만, 유전자형 D 및 F는 그렇지 않다. 간단한 확률 모델의 적용은 단일 플루오로 양성 표현형에서 다중 유전자형의 디콘볼루션(de-convolution)을 허용하므로, HDR에 대해 동형접합성 세포의 실제 백분율을 추정한다. (D) RAB11A 유전자좌 내로 삽입된 다양한 형광단 순열 전체에 걸쳐 적용된 이중 대립유전자 HDR 분석. (E-F) 이중 형광 이중 대립유전자 통합이 표적 유전자좌 전체에 걸쳐 관찰되었다. 삽입을 갖는 세포의 총 백분율이 각각의 표적 부위의 효율에 따라 다양하였지만, 무작위 우연에 의해 예측된 것보다 동형접합성 세포의 관찰된 백분율에 있어서의 배수 강화는 유전자좌 전체에 걸쳐 일관되었다. (G) HDR에 의해 동일한 유전자좌로 3개의 별개의 형광단의 통합을 시도하였다. 최대 2개의 표적화된 삽입이 가능하기 때문에 (유전자좌의 2개의 대립유전자에서; 2배체 게놈을 가정함), 3개의 유전자좌 모두에 대해 양성인 세포 (삼중 양성물)는 관찰되지 않아야 한다. 실제로, 다수의 단일 형광단 통합이 관찰되고 (단일 양성물), 또한 두 플루오르의 다양한 순열에 대해 양성인 세포 (이중 양성물)가 관찰되지만, 이중 양성물과 비교해서 삼중 양성 세포의 수가 30배 감소한다. 형광 단백질 발현의 모든 유동 세포계수 분석은 전기천공 후 4일에 수행되었다. 디스플레이는 1명 (E, F) 또는 2명 (D, G)의 건강한 인간 공여자로부터의 다수의 기술적 반복실험을 나타낸다. 막대 그래프는 평균 + 표준 편차를 표시한다.
도 24A-B는 하나의 유전자좌에서 HDR 통합의 획득이 부가의 유전자좌에서의 HDR의 가능성을 증가시킨다는 것을 보여주는 다중화된 통합을 도시한다. (A) 6개의 dsDNA HDR 주형 세트 (RAB11A, CD4 및 CLTA를 표적으로 함; 각각의 부위는 GFP 또는 RFP를 수반함)으로부터의 2개의 HDR 주형 순열을, 건강한 인간 공여자로부터 단리된 CD3+ T 세포 내로 전기천공시켰다. 표시된 2개의 HDR 주형을 그의 2개 각각의 온-타겟 RNP와 함께 전기천공한지 4일 후에, 각각의 주형에 대해 양성인 세포의 백분율을, 다른 주형에 대해 양성 또는 음성인 세포 상에서 게이팅할 때 분석하였다. 다양한 주형 조합 전체에 걸쳐 2-주형 다중화가 가능했을 뿐만 아니라, 하나의 주형에 대해 양성인 세포 (주형 1+ 세포) 상에서 게이팅하면, 제1 주형에 대해 음성인 세포 (주형 1- 세포, 흑색)와 비교해서 제2 주형에 대해 양성일 것으로 더 많이 예상되는 세포 집단이 강화되었다. 각각의 연관된 RNP 30 pmol과 함께 2 ug의 각각의 주형을, 이중 다중화 실험을 위해 전기천공시켰다. (B) 부가 주형의 전기천공은 다양한 HDR 주형 조합을 사용하여 3개의 부위 다중화를 허용한다. 단일 양성 세포와 비교 시 다른 두 주형에 대해 양성인 세포 상에 게이팅함으로써 제3 주형에 대해 양성인 세포를 추가로 강화시킬 수 있다. 표시되는 데이터는 2명의 건강한 인간 공여자로부터의 다수의 기술적 반복실험으로부터의 평균 + 표준 편차이다.
도 25A-F는 D10A 닉카제 및 ssDNA HDR 주형이 오프-타겟 통합을 감소시킨다는 것을 도시한다. (A) Cas9 RNP 및 RAB11A-GFP dsDNA HDR 주형의 조합을 1차 인간 T 세포 내로 전기천공시켰다. dsDNA 주형 단독, 또는 인간 게놈에서 서열이 일치하지 않는 스크램블된 gRNA를 함유하는 RNP를 갖는 dsDNA 주형은 작지만 검출 가능한 양의 GFP 발현을 산출시켰는데, 이는 dsDNA 주형이 표적화된 RAB11A-GFP 통합 부위와 상이한 부위를 표적으로 하는 gRNA와 함께 전기천공될 때 현저하게 증가되었다 ("오프-타겟 RNP"는 CXCR4 엑손 1을 표적으로 한다). (B) RAB11A-GFP dsDNA HDR 주형이 오프-타겟 RNP와 함께 전기천공될 때, 오프-타겟 통합이 상이한 공여자로부터의 세포에 일관되게 존재하였고, dsDNA HDR 주형 단독이 전기천공되는 경우에는, 더 적은 수의 오프-타겟 통합이 발생하였다. (C) Cas9 뉴클레아제 변이체 D10A (닉카제) 및 불활성 dCas9는, 오프-타겟 단일 CXCR4 gRNA가 사용될 때 오프-타겟 통합을 상당히 감소시켰지만, D10A 닉카제 (PAM-out 방향에서 "온-타겟" gRNA 쌍을 수반한다)는 RAB11A dsDNA HDR 주형의 효율적인 온-타겟 통합을 야기시켰다. (D) ssDNA HDR 주형의 전기천공은 오프-타겟 통합을, 뉴클레아제가 부가되지 않은 것과 오프-타겟 dsDNA 절단이 유도된 것 (오프-타겟 gRNA + Cas9) 둘 다의 경우에 검출 한계 (주형이 전기천공되지 않은 경우의 수준과 거의 동등한 수준임)까지 감소시켰다. (E-F) RAB11A 부위에서의 GFP 융합의 통합을 위해, ssDNA HDR 주형과 함께 D10A 닉카제를 사용하면, dsDNA 주형과 함께 Cas9를 사용하는 경우와 비교해서 온-타겟 HDR (온-타겟 gRNA와의 GFP 통합)이 감소되었지만, 오프-타겟 통합은 검출할 수 없는 수준으로 크게 감소되었다. 모든 형광 판독은 전기천공 후 4일에 수행되었다. 표시된 데이터는 적어도 2명의 상이한 공여자 (A 및 E) 또는 표준 편차가 제시된 2명의 상이한 공여자의 평균 (C, D 및 F)을 나타낸다.
도 26A-D는 다수의 HDR 주형 전체에 걸친 오프-타겟 통합 이벤트의 형광 추정 및 정량을 도시한다. (A) 표적 유전자좌의 N-말단에서의 HDR 매개된 삽입의 다이어그램 (규모에 맞게 그려지지 않음). 상동성 아암은 삽입물 (이러한 경우 GFP 태그)이 삽입될 정확한 서열을 명시하여, 외인성 서열의 무흉터 통합을 허용한다. GFP 융합 단백질이 생성됨에 따라, GFP 형광은 통합 부위에 인접한 RNP 커팅에 의존하여 이러한 온-타겟 통합의 결과로서 보여질 것이다. (B) 이중 가닥 DNA는 자연적으로 발생하는 dsDNA 절단물에서의 무작위 통합 또는 잠재적으로 유도된 이중 가닥 절단물에서의 무작위 통합, 예컨대 RNP의 오프-타겟 커트 부위에서의 무작위 통합을 통하여 오프-타겟 부위에서 상동성-비의존적 복구 메커니즘을 통해 통합될 수 있다. 이러한 효과는 HDR을 수행할 능력이 결여된 노화 세포 유형에서 원하는 유도된 dsDNA 절단물 (HITI)에서의 dsDNA 서열의 표적화된 통합을 허용하기 위해 이용될 수 있지만, 결정적으로 임의의 잠재적 상동성 아암을 포함하여 dsDNA 주형 전체가 통합된다. 상동성 아암이 프로모터 서열을 함유하는 경우 (예컨대, N-말단 융합 태그의 경우), 이들 오프-타겟 통합은 원하는 정확한 HDR 삽입 없이 삽입된 서열의 관찰 가능한 발현을 구동시킬 수 있다. (C) 바는 표시된 성분과 함께 전기천공된 인간 CD3+ T 세포로부터의 실제 GFP+ 백분율을 나타낸다. 형광 단백질 발현에 대한 유동 세포계수법을 이용하여 오프-타겟 기능적 통합을 신속하게 평가할 수 있다. 주형 단독이 전기천공될 때 검출 한계를 초과하는 형광 세포의 백분율 상의 증가는, 자연적으로 발생하는 dsDNA 절단물에서의 무작위 통합을 나타내는 것으로 예상된다. 오프-타겟 모든 통합이 형광 단백질 발현을 산출하는 것은 아니지만, 상이한 주형 간의 오프-타겟 기능적 발현에 있어서의 상대적 차이가 검정될 수 있다. CXCR4를 표적으로 하는 RNP의 포함은 HITI-유형 삽입 이벤트를 통해 가능하게 관찰된 오프-타겟 상동성-비의존적 통합을 극적으로 증가시킨다. 그러나, 가장 큰 증가 (본 공여자에서는 1%에서 >30%로의 증가)는 정확한 RNP 및 HDR 매개된 삽입의 전기천공을 통해 이루어진다. (D) 5개 주형 전체에 걸친 온-타겟 GFP 발현 (오른쪽 컬럼) 대 오프-타겟 기능적 통합 (중간 컬럼)의 비교. 2개의 생물학적 공여자 (도트)의 평균 발현 (바)을 그래프로 나타내었다.
도 27A-B는 HDR 주형 대 gRNA 매트릭스 전체에 걸친 GFP 발현을 도시한다. (A) GFP 발현을 CXCR4 gRNA 및 RNP 없는 대조군과 함께 dsDNA HDR 주형 및 그의 상응하는 gRNA의 매트릭스의 전기천공 후 7일에 건강한 공여자로부터의 CD3+CD4+ 1차 인간 T 세포에서 분석하였다. dsDNA 주형으로 예상된 바와 같이, 오프-타겟 통합이 조합 전체에 걸쳐 관찰되었지만, 모든 gRNA 및 HDR 주형에 대해 가장 높은 GFP 발현이, 온-타겟 조건에서 관찰되었다. (B) (A)에서의 유동 세포계수법 데이터의 히트 맵 요약. 핵 인자 FBL로의 C-말단 GFP 융합 태그인 하나의 HDR 주형은 gRNA 전체에 걸쳐 일관되게 더 높은 오프-타겟 발현을 가졌다.
도 28A-D는 Cas9 닉카제를 사용한 1차 인간 T 세포에서의 효율적인 HDR을 도시한다. (A) RAB11A의 제1 엑손을 함유하는 게놈 유전자좌의 다이어그램. 출발 코돈 바로 다음에 RAB11A와 프레임을 유지하면서 GFP를 통합한 dsDNA HDR 주형과 함께 단일 가이드 RNA (gRNA 1)를 spCas9와 함께 사용하면, 효율적인 GFP 발현이 초래된다 (도 11F). Cas9 닉카제 (D10A 변이체)를 2개의 gRNA와 함께 사용하면, 오프-타겟 커팅의 가능성을 감소시킬 수 있었다. (B-C) 일련의 단일 gRNA 및 이중 gRNA 조합을 대상으로, RAB11A N-말단 유전자좌에서 GFP 삽입 효율에 관하여 시험하였다. 예상한 바와 같이, 뉴클레아제 데드(dead) Cas9 (dCas9)를 사용할 때 어떠한 gRNA도 주목할 만한 수준의 GFP 삽입을 나타내지 않았다. 삽입 부위에 인접한 다수의 단일 gRNA 커팅은 Cas9를 사용할 때 GFP 통합을 보여주었지만, gRNA 1만큼 효율적이지 않았다. D10A 닉카제는 단일 가이드와의 GFP 통합이 거의 또는 전혀 없음을 보여주었지만, 다수의 2-가이드 조합은 효율적인 GFP 통합을 보여주었다. 2개의 PAM 서열이 서로 멀어지는 (PAM Out) gRNA 조합에서만 GFP 통합이 관찰되었다. (D) dsDNA 절단을 유도하기 위해서는 D10A 닉카제가 2개의 gRNA 결합을 아주 근접하여 가져야 한다는 요구 사항으로 인해, 오프-타겟 gRNA (CXCR4를 표적으로 함)를 전기천공할 때 더 낮은 수준의 오프-타겟 기능적 통합을 명확히 보여주는 미가공 데이터가 도 25C에 제시된다. 모든 디스플레이 (B-D) 내의 도트는 표지된 2명의 건강한 공여자에서의 기술적 반복실험을 나타낸다.
도 29A-H는 2가지 기능 상실 IL2RA 돌연변이를 갖는 대상체에서 감소된 Treg 빈도 및 결함있는 Treg 억제 능력을 도시한다. (A) 건강한 공여자, 및 IL2RA 이형 접합체 (c.530 het 1, c.800 hets 1-3)뿐만 아니라 복합 이형 접합체 어린이 (Comp. Hets 1-3)를 포함한 모든 가족 구성원 (기능 상실 IL2RA 돌연변이를 수반함)으로부터의 CD3+CD4+ T 세포를 대상으로, CD25hiCD127lo Treg의 존재를 평가하기 위해 유동 세포계수법에 의해 분석하였다. (B) 건강한 공여자 및 단일 hets에서, CD4+FoxP3+ T 세포는 주로 CD25hiCD127lo이다. 복합 이형 접합체에는, CD127lo CD4+FoxP3+ 집단이 존재하지만 IL2RA를 발현하지는 않는다. (C) 2개의 별도의 부위에서 수행된 임상 표현형 검사는 복합 이형 접합체가 CD127lo FoxP3+ 세포의 정상 빈도를 보유하고 있다는 것을 확증시켜 준다. (D) 복합 이형 접합체 3에서의 IL2RA 표면 발현 상의 결핍은, IL-2로의 자극 후 pStat5 발현에 의해 측정된 바와 같이 비정상적인 하류 시그널링을 야기시켰지만, IL-7 또는 IL-15의 경우에는 그렇지 않았다. (E) CD25-결핍 복합 이형 접합체로부터 CD25hi Treg를 분류할 수 없기 때문에, 표면 마커 CD127loCD45RO+TIGIT+를 사용하여 CD3+CD4+ T 세포로부터 FoxP3+ 세포를 강화시키는 대체 게이팅 전략이 확립되었다. 표시된 게이트된 집단으로부터의 세포내 FoxP3 염색이 도시된다. (F) 이들 CD3+CD4+CD127loCD45RO+TIGIT+ 잠재적 "Treg"는 FoxP3에 대해 고도로 강화되었고 건강한 공여자로부터의 CFSE-표지된 자극된 반응인자 T 세포 (Tresp)와 함께 배양될 때 약간의 억제 능력을 보인 반면, 복합 이형 접합체로부터의 CD3+CD4+CD127loCD45RO+TIGIT+는 억제 능력을 나타내지 않았다. 자극된 Tresp 집단 (실선 곡선), 자극되지 않은 Tresp (파선 곡선). (G) 복합 이형 접합체에서 어느 하나의 CD25 돌연변이의 교정은 개별적으로, 여전히 다른 돌연변이를 남길 것이므로, 세포를 단일 이형 접합체로서 남겨둔다. 이러한 잠재적인 교정이 일정 수준의 기능적 억제를 초래할 것임을 확증하기 위해, c.530 및 c.800 단일 이형 접합체 가족 구성원으로부터의 CD4+CD25hiCD127lo Treg를 단리하고 그들의 억제 능력을 (F)에서와 같이 검정하였다. (H) 건강한 공여자, CD25-결핍 복합 이형 접합체 (F) 및 CD25+/- c.530 또는 c.800 이형 접합체 (G)로부터의 세포에서의 Treg 억제 능력의 도트 플롯 요약. 복합 이형 접합체로부터의 CD3+CD4+CD127loCD45RO+TIGIT+ "Treg"는 억제 능력을 나타내지 않았지만, 단일 이형 접합체 가족 구성원으로부터의 통상적인 CD4+CD25hiCD127lo Treg는 일부 억제 능력을 나타냈는데, 이는 복합 het와 비교해서 현저한 임상 표현형의 결여와 일치한다.
도 30A-E는 1차 인간 T 세포에서 비-바이러스 유전자 표적화에 의해 교정된 단성 자가 면역 돌연변이를 도시한다. (A) 한 가족 내의 3명의 형제 자매는 2개의 상이한 IL2RA (고 친화도 IL-2 수용체, CD25를 코딩함) 돌연변이 (IL2RA 엑손 4에서 정지 코돈을 생성하는 c.530A>G; 거의 100개 아미노산 런-온을 야기하는 IL2RA 엑손 8에서 프레임 시프트 돌연변이를 생성하는 c.800delA)를 보유하고 있다. (B) 이들 3명의 복합 이형 접합체 형제 자매는 그들의 1차 T 세포 상에서의 IL2RA의 세포 표면 발현이 크게 감소되었지만, 완전히 부재하지는 않은 것으로 나타났다. Cas9 RNP 및 정확한 IL2RA 서열을 함유하는 dsDNA HDR 주형의 전기천공에 의한 c.530 돌연변이의 비-바이러스 유전자 표적화는 (표적화된 PAM 서열에서의 침묵 돌연변이와 함께) 전기천공 후 2일에 각각의 복합 이형 접합체 형제로부터의 T 세포의 일부분에서의 IL2RA 세포 표면 발현을 성공적으로 구제하였다. (C) 비-바이러스 유전자 표적화 후 7일에, 표적화된 T 세포는 비-표적화된 대조군과 비교해서 IL-2 자극시 Stat5의 인산화 수준이 증가된 것으로 나타났다. (D) c.530 돌연변이를 교정하기 위한 비-바이러스 유전자 표적화 후 9일에, 3명의 복합 이형 접합체 공여자로부터의 IL2RA+ T 세포는 비-표적화된 세포 또는 건강한 공여자 세포와 비교해서 증가된 수준의 FoxP3+ 세포를 포함한다. (E) c.530 돌연변이의 비-바이러스 유전자 표적화 및 교정은 최적화된 치료제 세트 (ssDNA HDR 주형과 함께 D10A 닉카제)를 사용하여 가능하고 효율적이다. 1명의 복합 이형 접합체 공여자로부터의 T 세포를 전기천공 후 9일의 생체외 확장 후 (재자극 후 2일) IL2RA 표면 발현에 대해 염색하였다.
도 31A-D는 IL2RA에서의 복합 이형접합성 돌연변이의 확인 및 교정 CRISPR-Cas9 게놈 표적화 시약의 설계를 도시한다. (A) 단성 형태의 당뇨병에 관여하는 것으로 공지된 40개 초과의 유전자의 사내 표적화된 차세대 시퀀싱 다중 유전자 패널을 사용한 발단자 (proband)의 초기 유전적 시험은 음성이었다. 발단자 및 부모의 트리오에서 후속 엑솜 시퀀싱은 IL2RA 유전자에서의 2개의 원인 돌연변이를 밝혀내었다. 어머니는 IL2RA의 엑손 4 [서열식별번호 (SEQ ID NO): 1] (AGACAAGGTRGACCCAGCC)에 단일 이형접합성 돌연변이 (c.530G>A)를 보유하였으며, 이는 미숙한 정지 코돈을 초래하였다. (B) 아버지는 IL2RA의 엑손 8 [서열식별번호: 2 (ACAGGAGGARRRKWRRARAA)]에 단일 이형접합성 돌연변이 (c.800delA)를 보유하였으며, 이는 95개 아미노산 길이 런-온을 초래하는 프레임 시프트 돌연변이를 야기시켰다. 생어 시퀀싱 결과, 발단자가 두 돌연변이 모두에 대한 복합 이형 접합체였다는 것이 확증되었다. (C) 2개의 확인된 IL2RA 돌연변이의 대략적인 위치로 주석이 달린 IL2RA 단백질의 선형 묘사. SD1, 스시 도메인 1; SD2, 스시 도메인 2; TM, 막횡단; C, 세포질. (D) 명시된 돌연변이 [c.530G>A 대립유전자의 경우 (서열식별번호: 3)(CAAAATGACCCACGGGAAGACAAGGTAGACCC) 및 c.800delA 대립유전자의 경우 서열식별번호: 4 (GACTTTGTTACACCACTACAGGAGGAGAGTA)]를 포함한 게놈 서열을 사용하여, 2개의 IL2RA 돌연변이를 교정하기 위한 CRISPR-Cas9 게놈 표적화 시약을 설계하였다. gRNA는 각각의 돌연변이 부위에 인접하여, c.530 돌연변이의 경우에는 8 bp 떨어진 곳, 및 c.800의 경우에는 7 bp 떨어진 곳에 커팅하도록 설계되었다. 각각의 돌연변이에 대해, 각각의 가이드 RNA에 대한 PAM 서열 ("NGG")을 붕괴시키기 위한 변성 염기 내에서의 침묵 돌연변이뿐만 아니라 교정된 서열을 포함한 HDR 주형 [c.530 돌연변이의 경우 (서열식별번호: 5) (ACAAGATGGACCC) 및 c.800의 경우 (서열식별번호: 6)(AGGAGAAAGAGTA)]을 설계하였다. c.530 (CAAAATGACCCACGGGAAGACAAGATGGACCC) (서열식별번호: 7) 및 c.800 (서열식별번호: 8) (GACTTTGTTACACCACTACAGGAGAAAGAGTA)에 대한 교정된 대립유전자 + 침묵 PAM 붕괴 서열이 제시된다. c.530 돌연변이 부위 (hg38 ch10:6021526-6021557) 및 c800 돌연변이 부위 (hg38 ch10:6012886-6012917)에 대한 게놈 영역 (실물에 비례하지 않음)을 표시하였다. ssODN HDR 주형 (60 bp 상동성 아암이 있는 ssDNA)과 큰 dsDNA 또는 ssDNA HDR 주형 (표시된 바와 같이, 약 300 bp 상동성 아암이 있다) 둘 다가 사용되었다.
도 32A-C는 IL2RA c.530A>G 기능 상실 돌연변이의 HDR 매개된 교정을 도시한다. (A) IL2RA의 C-말단에서 c.800delA 돌연변이를 표적으로 하는 gRNA와 달리, c.530A>G 돌연변이 (내부 엑손에 정지 코돈을 유발함)를 표적으로 하는 gRNA는 CD3+ T 세포 내로의 RNP 단독 (청색)의 전기천공 후 2일에 건강한 공여자 및 단일 이형 접합체 (c.800 Het 2 및 3)에서 IL2RA의 실질적 (약 90%) 녹다운을 초래한다. 매우 작은 IL2RA+ 백분율에서 출발하긴 하지만, c.800delA 대립유전자로부터 일부 소량의 단백질이 표면으로 발현될 수 있기 때문에, 3가지 복합 이형 접합체 모두에서 녹다운이 또한 관찰되었다. 이러한 감소된 CD25 발현은 ssODN HDR 주형을 포함시킴으로써 부분적으로 구제될 수 있고, 큰 dsDNA HDR 주형을 사용하여 훨씬 더 실질적으로 구제될 수 있다. 2가지 주형 유형 모두는 교정된 서열, gRNA의 PAM 서열을 제거하기 위한 침묵 돌연변이, 및 60 bp (ssODN) 또는 약 300 bp (큰 dsDNA) 상동성 아암을 함유하였다 (도 32). 교정을 위한 c.800delA 돌연변이의 표적화와 달리, 복합 이형 접합체로부터 T 세포에서의 CD25 표면 발현은 HDR 주형이 포함된 경우에만 관찰된다. 3가지 복합 이형 접합체 모두에서, dsDNA HDR 주형은 더 큰 백분율의 CD25+ 세포를 산출하였다. (B) 전기천공 없음 또는 RNP 단독 대조군과 비교해서 HDR-매개된 돌연변이 교정을 받는 복합 이형 접합체 환자로부터의 CD3+ T 세포에서 전기천공 후 7일에 IL-2 자극 (200 U/mL)에 반응하여 pStat5 시그널링이 증가되었다. (C) 유사하게, 복합 이형 접합체 환자에서 HDR 교정 조건에서 전기천공 후 9일에 증가된 분율의 CD25+ FoxP3+ 세포가 관찰된다. 잠재적으로 환자의 질환 또는 환자의 면역 억제 약물 요법과 연관된 변경된 세포 상태로 인해, 복합 이형 접합체 3에서의 HDR 교정을 위한 c.530 돌연변이를 표적으로 할 때 더 낮은 백분율의 교정이 관찰되었다. 본 실시예에 제시된 최적화된 비-바이러스 게놈 표적화 프로토콜에 따라 전기천공을 수행하였다. ssODN 전기천공의 경우, 1 uL H2O 중 100 pmol이 전기천공되었다.
도 33A-C는 IL2RA c.800delA 프레임 시프트 기능 상실 돌연변이의 비-HDR 매개된 교정을 도시한다. (A) 그의 표면 상에 최소량의 IL2RA를 발현하는 3가지 복합 이형 접합체를 포함하여, 2개의 기능 상실 IL2RA 돌연변이를 갖는 가족으로부터의 모든 어린이에서 CD3+ T 세포에서의 CD25 표면 발현의 히스토그램 (전기천공 없음, 회색). 2개의 돌연변이 중 하나의 부위에 대항하여 gRNA를 함유하는 RNP를 전기천공한 후 2일에, 정상 정지 코돈을 초과하는 런-온을 유발하는 IL2RA의 최종 엑손 내에서의 1개 염기쌍 결실 (c.800delA), 건강한 공여자로부터의 CD3+ T 세포 및 단일 het (c.800 Het 2 및 3)가 CD25- 세포에 있어서의 약간의 증가를 보여준다 (RNP 단독, 청색). 낮은 녹아웃은 잠재적으로, 작은 삽입-결실이 표면 단백질 발현의 덜 현저한 상실을 야기할 수 있는 단백질의 C-말단을 표적으로 하는 gRNA에 기인한다. 놀랍게도, RNP 단독은 3가지 복합 이형 접합체 모두에서 편집된 T 세포의 거의 50%에서의 CD25 표면 발현을 초래하였다. 돌연변이 교정과 함께 ssODN HDR 주형 서열을 포함시킴으로써 RNP 단독과 비교해서 CD25 교정을 수반한 세포의 퍼센트 상의 증가가 달성될 수 있었고 (RNP + ssODN, 자주색), 돌연변이를 교정하기 위해 더 긴 dsDNA HDR 주형을 사용할 때 추가로 증가되었다 (RNP + dsDNA HDRT, 녹색) (도 32). (B) 전기천공 후 7일의 확장 후 편집된 CD3+ T 세포에서 고 용량 IL-2 자극 (200 U/mL)에 반응하는 포스포 Stat5 시그널링. pStat5+ 세포의 증가된 수는 CD25 표면 발현 상의 증가 (A)와 상관 관계가 있었다. (C) 전기천공 후 9일의 확장 후, 세포내 FoxP3 염색 결과, 전기천공 없음 대조군과 비교해서 CD3+ T 세포에서 CD25+ FoxP3+ 세포의 분율이 극적으로 증가하여, 유사하게 배양된 건강한 공여자에서 관찰된 CD25+ FoxP3+ 세포의 분율에 근접한 것으로 밝혀졌다. 최적화된 비-바이러스 게놈 표적화 프로토콜 (실시예)에 따라 전기천공을 수행하였다. ssODN 전기천공의 경우, 1 uL H2O 중 100 pmol이 전기천공되었다.
도 34A-B는 면역 억제제를 투여받은 복합 이형 접합체 IL2RA 기능 상실 환자에서 감소된 HDR 잠재력 및 변경된 임상 표현형을 도시한다. (A) 표시된 환자로부터의 CD3+ T 세포 내로의 양성 HDR 대조군 RAB11A-GFP dsDNA HDR 주형의 전기천공 후 6일에 GFP 발현의 유동 세포계수 분석 결과, 그의 2명의 c.800 이형 접합체 형제 자매와 비교해서 3명의 복합 이형 접합체에서 더 낮은 GFP 발현을 나타냈다. 유사하게 편집된 12명의 건강한 공여자의 코호트와 비교해서 (도 20), c.800 이형 접합체뿐만 아니라 복합 het 1 및 2 모두는 건강한 공여자 전체에 걸쳐 관찰된 일반적인 범위 내에 있는 반면, 복합 het 3은 분석된 어떠한 건강한 공여자보다도 더 낮은 GFP 발현을 나타냈다. 주목할 것은, 복합 het 3에서는 c.530 돌연변이 하의 HDR 매개된 교정이 다른 두 복합 het보다 실질적으로 더 낮았지만 (도 31A), RNP 단독을 표적으로 하는 c.800delA의 전기천공 후 CD25 표면 발현은 유사하였다. HDR 매개된 복구와 달리, c.800delA에서의 NHEJ 매개 프레임 시프트 교정은 세포 증식을 필요로 하지 않을 수 있는데, 이는 복합 het 3이 혈액 채취 및 T 세포 단리 시 활성 면역 억제제에 대한 유일한 복합 이형 접합체 환자인 것과 일치한다. (B) 환자의 질환과 연관된 변경된 세포 상태는 HDR 비율의 감소에 기여할 수도 있었다. 각각의 표시된 환자로부터의 비-편집되고 단리된 CD4+ T 세포에서의 TIGIT 및 CTLA4 발현 수준은 유동 세포계수법에 의해 측정되었다. 변경된 활성화 상태와 일관되게, 복합 het 3으로부터의 세포는 건강한 공여자, 이형접합성 가족 구성원뿐만 아니라 다른 두 복합 이형접합성 형제 자매 모두와 비교해서 증가된 TIGIT 및 CTLA4 발현을 갖는 별개의 표현형을 가졌다.
도 35A-B는 긴 ssDNA HDR 주형을 생산하는 여러 가지 방법을 도시한다. (A) 전기천공을 위해 충분한 양의 긴 단일 가닥 DNA 서열이 생산될 수 있다면, 온-타겟 효율을 과도하게 저하시키지 않으면서 오프-타겟 통합이 감소될 수 있었다. 한 가지 방법은 2-단계 선택적 엑소뉴클레아제 소화를 수반하는데, 이는 5' 인산화에 의해 표지된 PCR 산물의 하나의 가닥을 특이적으로 분해하여, 증폭 이전에 PCR 프라이머 상으로 용이하게 부가한다. (B) 순차적 시험관내 전사 (IVT) 및 역전사 (RT) 반응에 근거한 제2의 ssDNA 생산 방법이 또한 적용되었다. 짧은 T7 프로모터가 부착된 PCR 산물이 ssRNA 산물을 생산하기 위한 IVT 주형으로서 작용한다. RT 프라이머의 어닐링 및 역전사 후에, 수산화 나트륨에서 인큐베이션함으로써 (RNA 가닥을 선택적으로 분해한다) 긴 ssDNA 주형으로 용이하게 변환될 수 있는 RNA/DNA 혼성체가 형성된다. (C) 전기천공 후 2일에, ssDNA 주형만으로 전기천공된 CD3+ T 세포에서의 생존율은 dsDNA 주형만으로 전기천공된 것보다 더 높았다 (도 11). (D) ssDNA RAB11A-GFP HDR 주형은 dsDNA 주형과 유사한 고 효율 GFP 통합을 보여주었고, 더 높은 몰 양의 주형에서 고 효율 통합을 유지하였는데, 이는 잠재적으로, 증가된 생존율 (C)뿐만 아니라 DNA 주형 몰 당 질량이 덜한 것에 기인한다. 개별 포인트는 적어도 2명의 건강한 공여자를 나타낸다 (C, D).
정의
본 명세서 및 첨부된 청구 범위에 사용된 바와 같이, 단수 형태는 문맥상 달리 명백하게 지시되지 않는 한 복수의 언급 대상을 포함한다.
용어 "핵산" 또는 "뉴클레오티드"는 단일 가닥 또는 이중 가닥 형태의 데옥시리보핵산 (DNA) 또는 리보핵산 (RNA) 및 그의 중합체를 지칭한다. 달리 구체적으로 제한되지 않는 한, 상기 용어는 참조 핵산과 유사한 결합 특성을 갖고 자연적으로 발생하는 뉴클레오티드와 유사한 방식으로 대사되는 자연 뉴클레오티드의 공지된 유사체를 함유하는 핵산을 포괄한다. 달리 표시되지 않는 한, 특별한 핵산 서열은 또한, 그의 보존적으로 변형된 변이체 (예를 들어, 변성 코돈 치환), 대립유전자, 오르소로그, SNP 및 상보적 서열뿐만 아니라 명시적으로 표시된 서열을 암시적으로 포괄한다. 구체적으로, 하나 이상의 선택된 (또는 모든) 코돈의 제3 위치가 혼합-염기 및/또는 데옥시이노신 잔기로 치환되는 서열을 생성함으로써 변성 코돈 치환이 달성될 수 있다 (Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991); Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985); and Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994)). 용어 핵산은 유전자, 유전자에 의해 코딩된 cDNA 및 mRNA와 상호 교환 가능하게 사용된다.
용어 "유전자"는 폴리펩티드 쇄를 생산하거나 또는 이를 코딩하는 데 관여하는 DNA의 세그먼트를 지칭할 수 있다. 이는 코딩 영역의 앞뒤에 있는 영역 (리더 및 트레일러)뿐만 아니라 개별 코딩 세그먼트 (엑손) 사이의 중재 서열 (인트론)을 포함할 수 있다. 또 다른 한편으론, 용어 "유전자"는 비-번역된 RNA, 예컨대 rRNA, tRNA, 가이드 RNA (예를 들어, 작은 가이드 RNA) 또는 마이크로 RNA를 생산하거나 또는 이를 코딩하는 데 관여하는 DNA 세그먼트를 지칭할 수 있다.
"치료하는"은 임의의 객관적 또는 주관적 파라미터, 예컨대 완해; 차도; 증상의 감소 또는 질환 상태를 환자가 더 견딜 수 있게 하는 것; 변성 또는 감퇴 속도를 느리게 하는 것; 또는 변성의 최종 지점을 덜 쇠약하게 만드는 것을 포함하여, 질환, 병태 또는 장애의 치료 또는 완화 또는 예방에 있어서의 성공의 임의의 표식을 지칭한다. 증상의 치료 또는 완화는 객관적 또는 주관적 파라미터에 근거할 수 있으며; 이는 의사에 의한 검사 결과를 포함한다. 따라서, 용어 "치료하는"은 본원에 기재된 바와 같은 질환, 병태 또는 장애와 연관된 증상 또는 병태의 발생을 예방 또는 지연, 경감 또는 정지 또는 억제하기 위해 본 발명의 화합물 또는 작용제를 투여하는 것을 포함한다. 용어 "치료 효과"는 대상체에서 질환, 질환의 증상 또는 질환의 부작용의 감소, 제거 또는 예방을 지칭한다. 본 발명의 방법을 사용하여 "치료하는" 또는 "치료"는 본원에 기재된 바와 같은 질환, 병태 또는 장애와 연관된 질환 또는 장애의 위험이 증가될 수 있지만, 아직까지는 그 증상을 경험하거나 나타내지 않은 대상체에서 증상의 발병을 예방하는 것; 질환 또는 장애의 증상을 억제하는 것 (그의 발생을 늦추거나 또는 정지시키는 것); 질환의 증상 또는 부작용의 경감을 제공하는 것 (고통 완화적 치료 포함); 및 질환의 증상을 경감시키는 것 (퇴행을 유발시키는 것)을 포함한다. 치료는 예방적일 수 있거나 (질환의 발병을 예방 또는 지연시키거나, 또는 그의 임상적 또는 준임상적 증상의 징후를 예방하기 위함) 또는 질환 또는 병태의 증상이 나타난 후 증상의 치료적 억제 또는 경감일 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "치료"는 예방적 (예를 들어, 예방), 치료적 또는 고통 완화적 처치를 포함한다.
"프로모터"는 핵산의 전사를 지시하는 하나 이상의 핵산 제어 서열로서 정의된다. 본원에 사용된 바와 같은, 프로모터는 전사의 출발 부위 근처에 필요한 핵산 서열, 예컨대 폴리머라제 II 유형 프로모터의 경우 TATA 요소를 포함한다. 프로모터는 또한 임의로, 원위 인핸서 또는 리프레서 요소를 포함하며, 이는 전사의 출발 부위로부터 수천 개 정도로 많은 염기쌍에 위치할 수 있다.
"폴리펩티드", "펩티드" 및 "단백질"은 아미노산 잔기의 중합체를 지칭하기 위해 본원에서 상호 교환 가능하게 사용된다. 본원에 사용된 바와 같은, 상기 용어는 완전한 길이의 단백질을 포함한, 임의의 길이의 아미노산 쇄를 포괄하며, 여기서 아미노산 잔기는 공유 펩티드 결합에 의해 연결된다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "상보적" 또는 "상보성"은 뉴클레오티드 또는 핵산 간의 특이적 염기쌍 형성을 지칭한다. 상보적 뉴클레오티드는 일반적으로 A 및 T (또는 A 및 U), 및 G 및 C이다.
전체적으로 사용된 바와 같이, 대상체는 개체를 의미한다. 예를 들어, 대상체는 포유 동물, 예컨대 영장류, 및 보다 구체적으로 인간이다. 비-인간 영장류도 또한 대상체이다. 용어 대상체는 사육 동물, 예컨대 고양이, 개 등, 가축 (예를 들어, 소, 말, 돼지, 양, 염소 등) 및 실험실 동물 (예를 들어, 흰 족제비, 친칠라, 마우스, 토끼, 래트, 게르빌루스쥐, 기니아 피그 등)을 포함한다. 따라서, 수의학적 용도 및 의학적 용도 및 제형이 본원에 고려된다. 이러한 용어는 특별한 연령이나 성별을 나타내지 않는다. 따라서, 남성이든 여성이든 상관없이 성인 및 신생아 대상체가 포괄되는 것으로 의도된다. 본원에 사용된 바와 같이, 환자 또는 대상체는 상호 교환 가능하게 사용될 수 있으며, 질환 또는 장애를 앓고 있는 대상체를 지칭할 수 있다.
"CRISPR/Cas" 시스템은 외래 핵산에 대항한 방어를 위한 광범위한 부류의 박테리아 시스템을 지칭한다. CRISPR/Cas 시스템은 광범위한 유박테리아 및 고세균 유기체에서 발견된다. CRISPR/Cas 시스템은 유형 I, II 및 III 하위 유형을 포함한다. 야생형 유형 II CRISPR/Cas 시스템은 외래 핵산을 인식하고 절단하기 위해 가이드 및 활성화 RNA와 복합체화되는 RNA-매개된 뉴클레아제, Cas9를 활용한다. 가이드 RNA와 활성화 RNA 둘 다의 활성을 갖는 가이드 RNA가 또한 관련 기술분야에 공지되어 있다. 일부 경우에, 이러한 이중 활성 가이드 RNA는 작은 가이드 RNA (sgRNA)로서 지칭된다.
Cas9 상동체는 하기 분류학 군의 박테리아를 포함하나 그에 제한되지는 않는 광범위한 유박테리아에서 발견된다: 악티노박테리아(Actinobacteria), 아쿠이피카에(Aquificae), 박테로이데테스-클로로비(Bacteroidetes-Chlorobi), 클라미디아에-베루코마이크로비아(Chlamydiae-Verrucomicrobia), 클로로플렉시(Chloroflexi), 시아노박테리아(Cyanobacteria), 피르미쿠테스(Firmicutes), 프로테오박테리아(Proteobacteria), 스피로카에테스(Spirochaetes) 및 써모토가에(Thermotogae). 예시적인 Cas9 단백질은 스트렙토코쿠스 피오게네스(Streptococcus pyogenes) Cas9 단백질이다. 부가의 Cas9 단백질 및 그의 상동체는, 예를 들어, 문헌 [Chylinksi, et al., RNA Biol. 2013 May 1; 10(5): 726-737 ; Nat. Rev. Microbiol. 2011 June; 9(6): 467-477; Hou, et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2013 Sep 24;110(39):15644-9; Sampson et al., Nature. 2013 May 9;497(7448):254-7; and Jinek, et al., Science. 2012 Aug 17;337(6096):816-21]에 기재되어 있다. Cas9 뉴클레아제 도메인은 숙주 세포에서 효율적인 활성 또는 증강된 안정성을 위해 최적화될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "Cas9"는 RNA-매개된 뉴클레아제 (예를 들어, 박테리아 또는 고세균 기원, 또는 그로부터 유래됨)를 지칭한다. 예시적인 RNA-매개된 뉴클레아제는 전술한 Cas9 단백질 및 그의 상동체를 포함하고, CPF1을 포함하나 이에 제한되지는 않는다 (예를 들어, 문헌 [Zetsche et al., Cell, Volume 163, Issue 3, p759-771, 22 October 2015] 참조). 유사하게, 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "Cas9 리보핵단백질" 복합체 등은 Cas9 단백질과 crRNA (예를 들어, 가이드 RNA 또는 작은 가이드 RNA)의 복합체, Cas9 단백질과 트랜스-활성화 crRNA (tracrRNA)의 복합체, Cas9 단백질과 작은 가이드 RNA의 복합체, 또는 그의 조합 (예를 들어, Cas9 단백질, tracrRNA 및 crRNA 가이드 RNA를 함유하는 복합체)을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같은, 세포의 게놈의 편집의 맥락에서 문구 "편집"은 표적 게놈 영역에서 게놈의 서열에 있어서의 구조적 변화를 유도하는 것을 지칭한다. 예를 들어, 편집은 뉴클레오티드 서열을 세포의 게놈 내로 삽입하는 형태를 취할 수 있다. 뉴클레오티드 서열은 폴리펩티드 또는 그의 단편을 코딩할 수 있다. 이러한 편집은 표적 게놈 영역 내에서 이중 가닥 절단, 또는 반대 가닥 상의 한 쌍의 단일 가닥 닉(nick)을 유도하고 표적 게놈 영역을 플랭킹함으로써 수행될 수 있다. 표적 게놈 영역에서 또는 표적 게놈 영역 내에서 단일 또는 이중 가닥 절단을 유도하는 방법은 표적 게놈 영역으로 향하는 Cas9 뉴클레아제 도메인 또는 그의 유도체, 및 가이드 RNA 또는 가이드 RNA 쌍의 사용을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은, RNP-DNA 주형 복합체를 도입하는 맥락에서 문구 "도입하는 것"은 세포 외부에서 세포 내부로의 RNP-DNA 주형 복합체의 전위를 지칭한다. 일부 경우에, 도입하는 것은 세포 외부에서 세포의 핵 내부로의 RNP-DNA 주형 복합체의 전위를 지칭한다. 전기천공, 나노 와이어 또는 나노 튜브와의 접촉, 수용체 매개된 내재화, 세포 침투 펩티드를 통한 전위, 리포솜 매개된 전위 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는, 상기 전위의 다양한 방법이 고려된다.
본원에 사용된 바와 같은 문구 "이종"은 자연에서 정상적으로 발견되지 않는 것을 지칭한다. 용어 "이종 서열"은 자연에서 주어진 세포에서 정상적으로 발견되지 않는 서열을 지칭한다. 따라서, 이종 뉴클레오티드 또는 단백질 서열은 (a) 그의 숙주 세포에 대해 외래일 수 있거나 (즉, 세포에 대해 외인성이다); (b) 숙주 세포에서 자연적으로 발견되지만 (즉, 내인성), 세포에서 부자연스러운 양 (즉, 숙주 세포에서 자연적으로 발견되는 것보다 더 많거나 더 적은 양)으로 존재할 수 있거나; 또는 (c) 숙주 세포에서 자연적으로 발견되지만, 그의 자연 유전자좌를 벗어나 위치할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은, 1차 세포 또는 1차 줄기 세포와 관련하여 문구 "1차"는 형질 전환되지 않거나 또는 불멸화되지 않은 세포를 지칭한다. 이러한 1차 세포는 제한된 횟수만큼 배양, 계대 배양 또는 계대 접종될 수 있다 (예를 들어, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20회 배양됨). 일부 경우에, 1차 세포는 시험관내 배양 조건에 맞도록 적응된다. 일부 경우에, 1차 세포는 유기체, 시스템, 기관 또는 조직으로부터 단리되고, 임의로 분류되며, 배양 또는 계대 배양없이 직접 활용된다. 일부 경우에, 1차 세포가 자극, 활성화 또는 분화된다. 예를 들어, 1차 T 세포는 CD3, CD28 효능제, IL-2, IFN-γ 또는 그의 조합과의 접촉 (예를 들어, 이들의 존재 하에서의 배양)에 의해 활성화될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은, 문구 "조혈 줄기 세포"는 혈액 세포를 생성시킬 수 있는 특정 유형의 줄기 세포를 지칭한다. 조혈 줄기 세포는 골수 또는 림프계 계통의 세포, 또는 그의 조합을 생성시킬 수 있다. 조혈 줄기 세포는 말초 혈액 또는 그의 분획으로부터 단리될 수 있지만, 골수에서 주로 발견된다. 조혈 줄기 세포를 확인, 분류 또는 정제하기 위해 다양한 세포 표면 마커가 사용될 수 있다. 일부 경우에, 조혈 줄기 세포는 c-kit+ 및 lin-으로서 확인된다. 일부 경우에, 인간 조혈 줄기 세포는 CD34+, CD59+, Thy1/CD90+, CD38lo/-, C-kit/CD117+, lin-으로서 확인된다. 일부 경우에, 인간 조혈 줄기 세포는 CD34-, CD59+, Thy1/CD90+, CD38lo/-, C-kit/CD117+, lin-으로서 확인된다. 일부 경우에, 인간 조혈 줄기 세포는 CD133+, CD59+, Thy1/CD90+, CD38lo/-, C-kit/CD117+, lin-으로서 확인된다. 일부 경우에, 마우스 조혈 줄기 세포는 CD34lo/-, SCA-1+, Thy1+/lo, CD38+, C-kit+, lin-으로서 확인된다. 일부 경우에, 조혈 줄기 세포는 CD150+CD48-CD244-이다.
본원에 사용된 바와 같은, 문구 "조혈 세포"는 조혈 줄기 세포로부터 유래된 세포를 지칭한다. 조혈 세포는 유기체, 시스템, 기관 또는 조직 (예를 들어, 혈액 또는 그의 분획)으로부터 단리함으로써 수득되거나 또는 제공될 수 있다. 또 다른 한편으론, 조혈 줄기 세포는 단리될 수 있고, 줄기 세포를 분화함으로써 조혈 세포가 수득되거나 또는 제공될 수 있다. 조혈 세포는 추가 세포 유형으로 분화될 가능성이 제한된 세포를 포함한다. 이러한 조혈 세포는 다능성 전구 세포, 계통 제한 전구 세포, 공통 골수 전구 세포, 과립구-대식 세포 전구 세포 또는 거핵구-적혈구 전구 세포를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 조혈 세포는 림프계 및 골수 계통의 세포, 예컨대 림프구, 적혈구, 과립구, 단핵구 및 혈소판을 포함한다. 일부 실시양태에서, 조혈 세포는 면역 세포, 예컨대 T 세포, B 세포, 대식세포, 자연 살해 (NK) 세포 또는 수지상 세포이다. 일부 실시양태에서, 세포는 선천 면역 세포이다.
본원에 사용된 바와 같은, 문구 "T 세포"는 T 세포 수용체 분자를 발현하는 림프계 세포를 지칭한다. T 세포는 나이브 T 세포, 자극된 T 세포, 1차 T 세포 (예를 들어, 배양되지 않은), 배양된 T 세포, 불멸화된 T 세포, 헬퍼 T 세포, 세포 독성 T 세포, 기억 T 세포, 조절 T 세포, 자연 살해 T 세포, 그의 조합, 또는 그의 하위 집단을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. T 세포는 CD4+, CD8+, 또는 CD4+ 및 CD8+일 수 있다. T 세포는 헬퍼 세포, 예를 들어 유형 Th1, Th2, Th3, Th9, Th17 또는 TFH의 헬퍼 세포일 수 있다. T 세포는 세포 독성 T 세포일 수 있다. 조절 T 세포는 FOXP3+ 또는 FOXP3-일 수 있다. T 세포는 알파/베타 T 세포 또는 감마/델타 T 세포일 수 있다. 일부 경우에, T 세포는 CD4+CD25hiCD127lo 조절 T 세포이다. 일부 경우에, T 세포는 Tr1, Th3, CD8+CD28-, Treg17, 및 Qa-1 제한된 T 세포, 또는 그의 조합 또는 하위 집단으로 이루어진 군으로부터 선택된 조절 T 세포이다. 일부 경우에, T 세포는 FOXP3+ T 세포이다. 일부 경우에, T 세포는 CD4+CD25loCD127hi 이펙터 T 세포이다. 일부 경우에, T 세포는 CD4+CD25loCD127hiCD45RAhiCD45RO- 나이브 T 세포이다.
T 세포는 유전적으로 조작된 재조합 T 세포일 수 있다. 일부 경우에, 재조합 T 세포는 재조합 (예를 들어, 돌연변이된 또는 이종) T 세포 수용체 또는 키메라 항원 수용체 (CAR)를 갖는다. 예를 들어, T 세포 수용체는 항원 특이성을 변경시키기 위해 T 세포 수용체의 상보성 결정 영역 내에 하나 이상의 돌연변이를 가질 수 있다. 또 다른 예로서, T 세포 수용체는 (예를 들어, 엔도도메인에서) 돌연변이되어 시그널링을 증가 또는 감소시킬 수 있다. 또 다른 예로서, T 세포 수용체는 이종 T 세포 수용체로 대체될 수 있다. 또 다른 예로서, T 세포 수용체는 상이한 수용체 도메인, 예컨대 항체 또는 항체 단편을 갖는 폴리펩티드로 대체될 수 있다. 일부 경우에, T 세포 수용체는 표적화 도메인 (예를 들어, 항체 단편), 막횡단 도메인, 및 세포내 또는 엔도도메인 도메인을 함유하는 키메라 수용체이다. 엔도도메인은 강력한 T 세포 활성화 및 항-항원 활성을 제공하기 위해 하나 이상의 시그널링 도메인 및/또는 어댑터 도메인을 함유할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "비-상동 말단 결합" 또는 NHEJ는 DNA 가닥의 커팅 또는 닉킹된 말단이 상동 주형 핵산에 대한 필요없이 직접 라이게이션되는 세포성 프로세스를 지칭한다. NHEJ는 복구 부위에서 하나 이상의 뉴클레오티드의 부가, 결실, 치환 또는 그의 조합으로 이어질 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 상동성 지향 복구 (HDR)는 DNA 가닥의 커팅 또는 닉킹된 말단이 상동 주형 핵산으로부터의 중합에 의해 복구되는 세포성 프로세스를 지칭한다. 따라서, 원래 서열은 주형의 서열로 대체된다. 상동 주형 핵산은 게놈 내의 다른 곳 (자매 염색분체, 상동 염색체, 또는 동일하거나 상이한 염색체 상의 반복 영역)에 있는 상동 서열에 의해 제공될 수 있다. 또 다른 한편으론, 외인성 주형 핵산을 도입하여, 표적 부위에서 서열의 특이적 HDR-유도된 변화를 수득할 수 있다. 이러한 방식으로, 특이적 돌연변이가 커팅 부위에 도입될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은, 단일 가닥 DNA 주형 또는 이중 가닥 DNA 주형은 HDR에 대한 주형으로서 세포에 의해 사용될 수 있는 DNA 올리고뉴클레오티드를 지칭한다. 일반적으로, 단일 가닥 DNA 주형 또는 이중 가닥 DNA 주형은 표적 부위에 대해 적어도 하나의 상동성 영역을 갖는다. 일부 경우에, 단일 가닥 DNA 주형 또는 이중 가닥 DNA 주형은 표적 커팅 부위에 삽입될 이종 서열을 함유하는 영역을 플랭킹하는 2개의 상동 영역을 갖는다.
하기 설명은 본 발명의 조성물 및 방법의 다양한 측면 및 실시양태를 언급한다. 특별한 실시양태가 상기 조성물 및 방법의 범위를 규정하도록 의도되지 않는다. 오히려, 그러한 실시양태는 적어도 개시된 조성물 및 방법의 범위 내에 포함되는 다양한 조성물 및 방법의 비-제한적인 예를 제공할 뿐이다. 본 설명은 관련 기술분야의 통상의 기술자의 관점에서 판독되어야 하므로; 통상의 기술자에게 널리 공지된 정보가 반드시 포함되는 것은 아니다.
세포의 게놈을 편집하기 위한 조성물 및 방법이 본원에 제공된다. 본 발명자들은 놀랍게도, 큰 뉴클레오티드 서열, 예를 들어, 길이가 약 200개 뉴클레오티드 또는 염기쌍 초과인 뉴클레오티드 서열이 바이러스 벡터의 부재 하에서도, 세포의 게놈 내로 삽입될 수 있다는 것을 발견하였다. 일부 실시양태에서, 길이가 약 200개 뉴클레오티드 또는 염기쌍 초과인 뉴클레오티드 서열은 바이러스 벡터의 부재 하에서도, 1차 면역 세포의 게놈 내로 삽입될 수 있다.
큰 핵산, 예를 들어 크기가 200개 뉴클레오티드 초과인 핵산의 세포 내로의 통합은 낮은 통합 효율, 오프-타겟 효과 및/또는 세포 생존율의 상실에 의해 제한될 수 있다. 뉴클레오티드 서열, 예를 들어, 크기가 약 200개 뉴클레오티드 초과인 뉴클레오티드 서열의 세포 게놈 내로의 통합을 달성하기 위한 방법 및 조성물이 본원에 기재되어 있다. 일부 방법에서, 통합 효율이 증가되고, 오프-타겟 효과가 감소되고/되거나 세포 생존율의 상실이 감소된다.
방법
세포의 게놈을 편집하는 방법은
a) 하기를 포함하는 Cas9 리보핵단백질 복합체 (RNP)-DNA 주형 복합체를 제공하는 단계이며:
(i) Cas9 뉴클레아제 도메인 및 가이드 RNA를 포함하는 RNP이며, 여기서 가이드 RNA가 세포의 게놈의 표적 영역과 특이적으로 혼성화되고, Cas9 뉴클레아제 도메인이 표적 영역을 절단하여 세포의 게놈 내에 삽입 부위를 생성시키는 것인 RNP; 및
(ii) 이중 가닥 또는 단일 가닥 DNA 주형이며, 여기서 DNA 주형의 크기가 약 200개 뉴클레오티드 초과이고, DNA 주형의 5' 및 3' 말단이 삽입 부위를 플랭킹하는 게놈 서열과 상동인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 이중 가닥 또는 단일 가닥 DNA 주형,
여기서 복합체 내에서의 RNP 대 DNA 주형의 몰 비가 약 3:1 내지 약 100:1인 단계; 및
b) RNP-DNA 주형 복합체를 세포 내로 도입하는 단계
를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법은 적어도 약 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97.5%, 99%, 99.5%, 99%, 또는 그 초과의 RNP-DNA 주형 복합체의 전달 효율을 제공한다. 일부 경우에, RNP-DNA 주형을 세포 내로 도입한 후 생육성인 세포에 기준하여 효율이 결정된다. 일부 경우에, RNP-DNA 주형이 세포 내로 도입되는 세포 (생육성 또는 비-생육성)의 총 수에 기준하여 효율이 결정된다.
또 다른 예로서, 전달 효율은 (도입 단계 후에 수득된 총 세포 또는 총 생육성 세포와 비교 시) 세포 집단 내의 게놈 편집된 세포의 수를 정량화함으로써 결정될 수 있다. 게놈 편집을 정량화하기 위한 다양한 방법이 활용될 수 있다. 이들 방법은 미스매치-특이적 뉴클레아제, 예컨대 T7 엔도뉴클레아제 I을 사용하는 것; 하나 이상의 표적 유전자좌의 시퀀싱 (예를 들어, 클로닝된 표적 유전자좌 증폭 단편의 생어 시퀀싱에 의해); 및 고 처리량 심층 시퀀싱을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
일부 실시양태에서, 바이러스 벡터를 사용하여 있는 그대로의 DNA를 세포 내로 도입하거나 또는 DNA를 세포 내로 도입한 후 세포 생존율의 상실과 비교 시 세포 생존율의 상실이 감소된다. 이러한 감소는 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% 또는 이들 백분율 사이의 임의의 백분율의 감소일 수 있다. 일부 실시양태에서, 바이러스 벡터를 사용하여 있는 그대로의 DNA를 세포 내로 도입하거나 또는 DNA를 세포 내로 도입한 후 오프-타겟 통합과 비교 시, 오프-타겟 통합 효과가 감소된다. 이러한 감소는 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% 또는 이들 백분율 사이의 임의의 백분율의 감소일 수 있다.
일부 경우에, 본원에 기재된 방법은 RNP-DNA 주형이 도입된 세포의 높은 세포 생존율을 제공한다. 일부 경우에, RNP-DNA 주형이 도입된 세포의 생존율은 적어도 약 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97.5%, 99%, 99.5%, 99%, 또는 그 초과이다. 일부 경우에, RNP-DNA 주형이 도입된 세포의 생존율은 약 20% 내지 약 99%, 약 30% 내지 약 90%, 약 35% 내지 약 85% 또는 90% 이상, 약 40% 내지 약 85% 또는 90% 이상, 약 50% 내지 약 85% 또는 90% 이상, 약 50% 내지 약 85% 또는 90% 이상, 약 60% 내지 약 85% 또는 90% 이상, 또는 약 70% 내지 약 85% 또는 90% 이상이다.
본원에 제공된 방법에서, RNP 대 DNA 주형의 몰 비는 약 3:1 내지 약 100:1일 수 있다. 예를 들어, 상기 몰 비는 약 5:1 내지 10:1, 약 5:1 내지 약 15:1, 5:1 내지 약 20:1; 5:1 내지 약 25:1; 약 8:1 내지 약 12:1; 약 8:1 내지 약 15:1, 약 8:1 내지 약 20:1, 또는 약 8:1 내지 약 25:1일 수 있다.
일부 실시양태에서, DNA 주형은 약 2.5 pM 내지 약 25 pM의 농도 하에 있다. 예를 들어, DNA 주형의 농도는 약 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5, 10, 10.5, 11, 11.5, 12, 12.5, 13, 13.5, 14, 14.5, 15, 15.5, 16, 16.5, 17, 17.5, 18, 18.5, 19, 19.5, 20, 20.5, 21, 21.5, 22, 22.5, 23, 23.5, 24, 24.5, 25 pM 또는 이들 농도 사이 내의 임의의 농도일 수 있다. 일부 실시양태에서, DNA 주형의 크기 또는 길이는 약 200 bp, 250 bp, 300 bp, 350 bp, 400 bp, 450 bp, 500 bp, 550 bp, 600 bp, 650 bp, 700 bp, 750 bp, 800 bp, 850 bp, 900 bp, 1 kb, 1.1 kb, 1.2 kb, 1.3 kb, 1.4 kb, 1.5 kb, 1.6 kb, 1.7 kb, 1.8 kb, 1.9 kb, 2.0 kb, 2.1 kb, 2.2 kb, 2.3 kb, 2.4 kb, 2.5 kb, 2.6 kb, 2.7 kb, 2.8 kb, 2.9 kb, 3 kb, 3.1 kb, 3.2 kb, 3.3 kb, 3.4 kb, 3.5 kb, 3.6 kb, 3.7 kb, 3.8 kb, 3.9 kb, 4.0 kb, 4.1 kb, 4.2 kb, 4.3 kb, 4.4 kb, 4.5 kb, 4.6 kb, 4.7 kb, 4.8 kb, 4.9 kb, 5.0 kb 초과 또는 이들 크기 사이 내의 DNA 주형의 임의의 크기이다. 예를 들어, DNA 주형의 크기는 약 200 bp 내지 약 500 bp, 약 200 bp 내지 약 750 bp, 약 200 bp 내지 약 1 kb, 약 200 bp 내지 약 1.5 kb, 약 200 bp 내지 약 2.0 kb, 약 200 bp 내지 약 2.5 kb, 약 200 bp 내지 약 3.0 kb, 약 200 bp 내지 약 3.5 kb, 약 200 bp 내지 약 4.0 kb, 약 200 bp 내지 약 4.5 kb, 약 200 bp 내지 약 5.0 kb일 수 있다. 일부 실시양태에서, DNA 주형의 양은 약 1 μg 내지 약 10 μg이다. 예를 들어, DNA 주형의 양은 약 1 μg 내지 약 2 μg, 약 1 μg 내지 약 3 μg, 약 1 μg 내지 약 4 μg, 약 1 μg 내지 약 5 μg, 약 1 μg 내지 약 6 μg, 약 1 μg 내지 약 7 μg, 약 1 μg 내지 약 8 μg, 약 1 μg 내지 약 9 μg, 약 1 μg 내지 약 10 μg일 수 있다. 일부 실시양태에서 DNA 주형의 양은 약 2 μg 내지 약 3 μg, 약 2 μg 내지 약 4 μg, 약 2 μg 내지 약 5 μg, 약 2 μg 내지 약 6 μg, 약 2 μg 내지 약 7 μg, 약 2 μg 내지 약 8 μg, 약 2 μg 내지 약 9 μg, 또는 2 μg 내지 약 10 μg이다. 일부 실시양태에서 DNA 주형의 양은 약 3 μg 내지 약 4 μg, 약 3 μg 내지 약 5 μg, 약 3 μg 내지 약 6 μg, 약 3 μg 내지 약 7 μg, 약 3 μg 내지 약 8 μg, 약 3 μg 내지 약 9 μg, 또는 약 3 μg 내지 약 10 μg이다. 일부 실시양태에서, DNA 주형의 양은 약 4 μg 내지 약 5 μg, 약 4 μg 내지 약 6 μg, 약 4 μg 내지 약 7 μg, 약 4 μg 내지 약 8 μg, 약 4 μg 내지 약 9 μg, 또는 약 4 μg 내지 약 10 μg이다. 일부 실시양태에서, DNA 주형의 양은 약 5 μg 내지 약 6 μg, 약 5 μg 내지 약 7 μg, 약 5 μg 내지 약 8 μg, 약 5 μg 내지 약 9 μg, 또는 약 5 μg 내지 약 10 μg이다. 일부 실시양태에서, DNA 주형의 양은 약 6 μg 내지 약 7 μg, 약 6 μg 내지 약 8 μg, 약 6 μg 내지 약 9 μg, 또는 약 6 μg 내지 약 10 μg이다. 일부 실시양태에서, DNA 주형의 양은 약 7 μg 내지 약 8 μg, 약 7 μg 내지 약 9 μg, 또는 약 7 μg 내지 약 10 μg이다. 일부 실시양태에서, DNA 주형의 양은 약 8 μg 내지 약 9 μg, 또는 약 8 μg 내지 약 10 μg이다. 일부 실시양태에서, DNA 주형의 양은 약 9 μg 내지 약 10 μg이다. 일부 경우에, DNA 주형의 크기는 있는 그대로의 DNA로서 치명적이기에 충분히 크고 충분한 양으로 존재한다. 일부 실시양태에서, DNA 주형은 이종 단백질 또는 그의 단편을 코딩한다. 일부 실시양태에서, DNA 주형은 조절 서열, 예를 들어, 세포의 게놈 내로의 삽입 후 이종 단백질 또는 그의 단편의 발현을 조절하기 위한 프로모터 서열 및/또는 인핸서 서열을 포함한다.
일부 경우에, DNA 주형은 선형 DNA 주형이다. 일부 경우에, DNA 주형은 단일 가닥 DNA 주형이다. 일부 경우에, 단일 가닥 DNA 주형은 순수한 단일 가닥 DNA 주형이다. 본원에 사용된 바와 같은, "순수한 단일 가닥 DNA"란 DNA의 다른 또는 반대 가닥이 실질적으로 결여된 단일 가닥 DNA를 의미한다. "실질적으로 결여된"이란 순수한 단일 가닥 DNA에는, DNA의 하나의 가닥이 또 다른 가닥보다 적어도 100배 더 결여된다는 것을 의미한다.
일부 경우에, RNP-DNA 주형 복합체는 약 20℃ 내지 약 25℃의 온도 하에 약 1분 미만 내지 약 30분 동안 RNP를 DNA 주형과 함께 인큐베이션함으로써 형성된다. 예를 들어, RNP는 약 20℃, 21℃, 22℃, 23℃, 24℃, 또는 25℃의 온도 하에 약 5초, 10초, 15초, 20초, 25초, 30초, 35초, 40초, 45초, 50초, 55초, 1분, 2분, 3분, 4분, 5분, 6분, 7분, 8분, 9분, 10분, 11분, 12분, 13분, 14분, 15분, 16분, 17분, 18분, 19분, 20분, 21분, 22분, 23분, 24분, 25분, 26분, 27분, 28분, 29분 또는 30분 또는 이들 시간 사이 내의 임의의 시간 양 동안 DNA 주형과 함께 인큐베이션될 수 있다. 또 다른 예에서, RNP는 약 20℃ 내지 약 25℃의 온도 하에 약 1분 미만 내지 약 1분 동안, 약 1분 미만 내지 약 5분 동안, 약 1분 미만 내지 약 10분 동안, 약 5분 내지 10분 동안, 약 5분 내지 15분 동안, 약 10분 내지 약 15분 동안, 약 10분 내지 약 20분 동안, 또는 약 10분 내지 약 30분 동안 DNA 주형과 함께 인큐베이션될 수 있다. 일부 실시양태에서, RNP-DNA 주형 복합체를 세포 내로 도입하기 전에 RNP-DNA 주형 복합체를 세포와 혼합한다.
일부 실시양태에서 RNP-DNA 주형 복합체를 도입하는 것은 전기천공을 포함한다. RNP-DNA 주형 복합체를 도입하기 위해 세포를 전기천공하기 위한 방법, 조성물 및 장치는 본원의 실시예에 기재된 것을 포함할 수 있다. RNP-DNA 주형 복합체를 도입하기 위해 세포를 전기천공하기 위한 부가의 또는 대안적 방법, 조성물 및 장치는 WO/2006/001614 또는 문헌 [Kim, J.A. et al. Biosens. Bioelectron. 23, 1353-1360 (2008)]에 기재된 것을 포함할 수 있다. RNP-DNA 주형 복합체를 도입하기 위해 세포를 전기천공하기 위한 부가의 또는 대안적 방법, 조성물 및 장치는 미국 특허 출원 공개 번호 2006/0094095; 2005/0064596; 또는 2006/0087522에 기재된 것을 포함할 수 있다. RNP-DNA 주형 복합체를 도입하기 위해 세포를 전기천공하기 위한 부가의 또는 대안적 방법, 조성물 및 장치는 문헌 [Li, L.H. et al. Cancer Res. Treat. 1, 341-350 (2002)]; 미국 특허 번호 6,773,669; 7,186,559; 7,771,984; 7,991,559; 6485961; 7029916; 및 미국 특허 출원 공개 번호 2014/0017213; 및 2012/0088842에 기재된 것을 포함할 수 있다. RNP-DNA 주형 복합체를 도입하기 위해 세포를 전기천공하기 위한 부가의 또는 대안적 방법, 조성물 및 장치는 문헌 [Geng, T. et al.. J. Control Release 144, 91-100 (2010); and Wang, J., et al. Lab. Chip 10, 2057-2061 (2010)]에 기재된 것을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, Cas9 단백질은 활성 엔도뉴클레아제 형태일 수 있으며, 따라서 가이드 RNA와의 복합체의 일부로서 또는 DNA 주형과의 복합체의 일부로서 표적 핵산과 결합될 때, 이중 가닥 절단물이 표적 핵산 내로 도입된다. 이중 가닥 절단물은 무작위 돌연변이를 도입하기 위해 NHEJ에 의해 복구될 수 있거나, 또는 특이적 돌연변이를 도입하기 위해 HDR에 의해 복구될 수 있다. 다양한 Cas9 뉴클레아제가 본원에 기재된 방법에 활용될 수 있다. 예를 들어, 가이드 RNA에 의해 표적화된 영역의 3' 바로 옆에 NGG 프로토스페이서 인접 모티프 (PAM)를 필요로 하는 Cas9 뉴클레아제가 활용될 수 있다. 이러한 Cas9 뉴클레아제는 NGG 서열을 함유하는 게놈의 임의의 영역을 표적으로 할 수 있다. 또 다른 예로서, 직교 PAM 모티프 요건을 갖는 Cas9 단백질은 인접한 NGG PAM 서열을 갖지 않는 서열을 표적화하는 데 활용될 수 있다. 직교 PAM 서열 특이성을 갖는 예시적인 Cas9 단백질은 CFP1, 문헌 [Nature Methods 10, 1116-1121 (2013)]에 기재된 것, 및 문헌 [Zetsche et al., Cell, Volume 163, Issue 3, p759-771, 22 October 2015]에 기재된 것을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
일부 경우에, Cas9 단백질은 닉카제이므로, 가이드 RNA와의 복합체의 일부로서 표적 핵산과 결합될 때 단일 가닥 절단물 또는 닉이 표적 핵산 내로 도입된다. 각각 구조적으로 상이한 가이드 RNA와 결합된 한 쌍의 Cas9 닉카제는 표적 게놈 영역의 2개의 근위 부위에 표적화될 수 있으므로, 한 쌍의 근위 단일 가닥 절단물이 표적 게놈 영역 내로 도입될 수 있다. 오프-타겟 효과가 단일 닉을 초래할 가능성이 있기 때문에 닉카제 쌍은 증강된 특이성을 제공할 수 있으며, 이러한 닉은 일반적으로, 염기 절제 복구 메커니즘에 의해 병변없이 복구된다. 예시적인 Cas9 닉카제는 D10A 또는 H840A 돌연변이를 갖는 Cas9 뉴클레아제를 포함한다.
일부 실시양태에서, RNP는 Cas9 뉴클레아제를 포함한다. 일부 실시양태에서, RNP는 Cas9 닉카제를 포함한다. 일부 실시양태에서, RNP-DNA 주형 복합체는 적어도 2개의 구조적으로 상이한 RNP 복합체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 적어도 2개의 구조적으로 상이한 RNP 복합체는 구조적으로 상이한 Cas9 뉴클레아제 도메인을 함유한다. 일부 실시양태에서, 적어도 2개의 구조적으로 상이한 RNP 복합체는 구조적으로 상이한 가이드 RNA를 함유한다. 적어도 2개의 구조적으로 상이한 RNP 복합체가 구조적으로 상이한 가이드 RNA를 함유하는 일부 실시양태에서, 구조적으로 상이한 RNP 복합체 각각은 Cas9 닉카제를 포함하고, 구조적으로 상이한 가이드 RNA는 표적 영역의 반대 가닥과 혼성화된다.
일부 경우에, 구조적으로 상이한 리보핵단백질 복합체를 포함하는 복수 개의 RNP-DNA 주형이 세포 내로 도입된다. 예를 들어, Cas9 단백질은 복수 개의 구조적으로 상이한 표적 게놈 영역에서 DNA 주형의 삽입을 표적으로 하기 위해 복수 개 (예를 들어, 2, 3, 4, 5개 또는 그 초과, 예를 들어, 2-10, 5-100, 20-100개)의 구조적으로 상이한 가이드 RNA와 복합체를 형성할 수 있다.
본원에 제공된 방법 및 조성물에서, 세포는 진핵 세포, 원핵 세포, 동물 세포, 식물 세포, 진균 세포 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 임의로, 세포는 포유 동물 세포, 예를 들어 인간 세포이다. 세포는 시험관내, 생체외 또는 생체내일 수 있다. 세포는 또한, 1차 세포, 생식 세포, 줄기 세포 또는 전구체 세포일 수 있다. 전구체 세포는, 예를 들어, 다능성 줄기 세포 또는 조혈 줄기 세포일 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포는 1차 조혈 세포 또는 1차 조혈 줄기 세포이다. 일부 실시양태에서, 1차 조혈 세포는 면역 세포이다. 일부 실시양태에서, 면역 세포는 T 세포이다. 일부 실시양태에서, T 세포는 조절 T 세포, 이펙터 T 세포, 또는 나이브 T 세포이다. 일부 실시양태에서, T 세포는 CD4+ T 세포이다. 일부 실시양태에서, T 세포는 CD8+ T 세포이다. 일부 실시양태에서, T 세포는 CD4+CD8+ T 세포이다. 일부 실시양태에서, T 세포는 CD4-CD8- T 세포이다. 본원에 기재된 방법 중 임의의 것에 의해 변형된 세포 중 임의의 것의 집단이 또한 제공된다. 일부 실시양태에서, 방법은 변형된 세포의 집단을 확장시키는 단계를 추가로 포함한다.
일부 경우에, 세포를 대상체로부터 제거하고, 본원에 기재된 방법 중 임의의 것을 사용하여 변형시키며, 환자에게 투여한다. 다른 경우에, 본원에 기재된 구축물 중 임의의 것이 생체내에서 환자에게 전달된다. 예를 들어, 미국 특허 번호 9737604 및 문헌 [Zhang et al. "Lipid nanoparticle-mediated efficient delivery of CRISPR/Cas9 for tumor therapy," NPG Asia Materials Volume 9, page e441 (2017)]을 참조할 수 있다.
일부 실시양태에서, RNP-DNA 주형 복합체는 약 1 x 105 내지 약 2 x 106개의 세포 내로 도입된다. 예를 들어, RNP-DNA 주형 복합체는 약 1 x 105 내지 약 5 x 105개의 세포, 약 1 x 105 내지 약 1 x 106개의 세포, 1 x 105 내지 약 1.5 x 106개의 세포, 1 x 105 내지 약 2 x 106개의 세포, 약 1 x 106 내지 약 1.5 x 106개의 세포 또는 약 1 x 106 내지 약 2 x 106개의 세포 내로 도입될 수 있다.
일부 경우에, 본원에 기재된 방법 및 조성물은 재조합 T 세포, 예컨대 키메라 항원 수용체 T 세포 (CAR T 세포)의 생성, 변형, 사용 또는 제어를 위해 사용될 수 있다. 이러한 CAR T 세포는 대상체에서 암, 감염성 질환 또는 자가 면역 질환을 치료 또는 예방하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 이종 단백질 (예를 들어, 키메라 항원 수용체 (CAR))을 발현시키기 위해 하나 이상의 유전자 산물이 T 세포에 삽입되거나 또는 녹인된다.
조성물
또한, 세포의 적어도 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% 또는 그 초과의 게놈이 이종 DNA 주형의 표적화된 삽입을 포함되는, 복수 개의 세포가 본원에 제공되며, 여기서 상기 DNA 주형은 크기가 적어도 약 200 bp이다. 일부 실시양태에서, 복수 개의 세포는 1차 조혈 세포 또는 1차 조혈 줄기 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 1차 조혈 세포는 면역 세포이다. 일부 실시양태에서, 면역 세포는 T 세포이다. 일부 실시양태에서, T 세포는 조절 T 세포, 이펙터 T 세포, 또는 나이브 T 세포이다. 일부 실시양태에서, T 세포는 CD8+ T 세포이다. 일부 실시양태에서, T 세포는 CD4+CD8+ T 세포이다.
개시된 방법 및 조성물에 사용될 수 있거나, 이와 연계해서 사용될 수 있거나, 이의 제조에 사용될 수 있거나, 또는 개시된 방법 및 조성물의 산물인 물질, 조성물 및 성분이 개시된다. 이들 및 다른 물질이 본원에 개시되어 있고, 이들 물질의 조합, 서브세트, 상호 작용, 군 등이 개시될 때, 이들 화합물의 각각의 다양한 개별 및 집단 조합 및 순열에 대한 구체적인 언급이 명시적으로 개시되지 않을 수 있지만, 각각이 본원에 구체적으로 고려되고 기재되는 것으로 이해된다. 예를 들어, 특정 방법이 개시되고 논의되며, 이러한 방법에 포함되는 하나 이상의 분자에 대해 이루어질 수 있는 다수의 변형이 논의되는 경우, 그러한 방법의 각각의 및 모든 조합 및 순열, 및 가능한 변형이, 달리 반대로 구체적으로 표시되지 않는 한은 구체적으로 고려된다. 마찬가지로, 이들의 임의의 서브세트 또는 조합이 또한, 구체적으로 고려되고 개시된다. 이러한 개념은 개시된 조성물을 사용하는 방법에서의 단계를 포함하나 이에 제한되지는 않는, 본 개시내용의 모든 측면에 적용된다. 따라서, 수행될 수 있는 다양한 부가 단계가 존재하는 경우, 이들 부가 단계 각각은 개시된 방법의 임의의 구체적 방법 단계 또는 방법 단계의 조합으로 수행될 수 있고, 각각의 이러한 조합 또는 조합의 서브세트가 구체적으로 고려되고 개시된 것으로 간주되어야 하는 것으로 이해된다.
본원에 인용된 공보 및 이들에 인용된 자료는 그 전문이 본원에 구체적으로 참조로 포함된다.
실시예
하기 실시예는 단지 예시를 위한 것이며 제한하려는 것이 아니다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 본질적으로 동일하거나 유사한 결과를 산출하도록 변화되거나 또는 변형될 수 있는 다양한 비-임계 파라미터를 용이하게 인식할 것이다.
실시예 I
실시예 I에 제공된 데이터는 하기 프로토콜에 요약된 바와 같이 생성되었다.
● 임상 프로토콜/공여자 동의가 확립되었다.
● PBMC의 단리는 제조업체의 프로토콜을 사용하여 셉메이트(SepMate)로 수행되었다.
● 벌크 T 세포의 단리는 제조업체의 프로토콜을 사용하여 이지셉(EasySep)으로 수행되었다.
● 동결은 제조업체의 프로토콜을 사용하여 밤뱅커(Bambanker) 배지로 수행되었다.
○ 1 mL 당 20백만 개의 세포
● 해동
○ 1 mL 로즈웰 파크 기념 연구소 배지 (RPMI)를 해동된 세포의 상단에 부가한 다음, 배지에 합하고 세척하였다
○ 세포를 자극하기 전에 밤새 배지에 단지 놓아두었다
1차 T 세포 배양
● 배지
○ RPMI + 10% FBS
○ XVivo15 + 5% FBS; 또는
○ 이뮤노컬트 (무혈청)
■ 무혈청 환경에서 세포를 배양하는 데 유용함
● 자극
○ 1:1 CD3/CD28 자기 다이나비드
■ 0.25:1 내지 2:1 이하의 비가 사용될 수 있다
■ 전기천공 전에 자기 비드를 제거하는 것이 효율을 개선시킬 수 있다
● 시토카인
■ 전기천공 전
■ 200 U/mL 하의 IL-2 (필수적)
■ 5 ng/mL 하의 IL-7 (비필수적)
■ 5 ng/mL 하의 IL-15 (비필수적)
○ 전기천공 후
■ 500 U/mL 하의 IL-2 (필수적)
● 배양 밀도
○ 전기천공 전
■ 배양 배지 1 mL 당 1 X 106개의 세포
● 통상적으로 1 mL를 24 웰 플레이트 내로 부가하거나, 30 mL를 T75 플라스크 내로 부가하거나, 또는 70 mL를 T175 플라스크 내로 부가한다
○ 전기천공 후
■ 제0일 - 0.25 106개의 전기천공된 세포를 200 uL 배지 중의 96 웰 둥근 바닥 플레이트 내의 1 웰 내로 부가한다
■ 제2일 - 웰은 100 uL의 신선한 배지로 채워졌으며 (3X 농도 하에 전기천공 후 시토카인을 수반함)
■ 제4일 - 추가 확장을 위해 신선한 시토카인이 있는 48 웰 플레이트에서 500 uL 배지로 옮긴 후, 2 내지 3일마다 분할하여 1 mL 배양물 당 약 1 X 106개의 세포를 유지하고, 매번 신선한 시토카인을 부가한다
RNP 생산
● 160 uM crRNA를 160 uM tracrRNA와 1:1로 혼합하였다
○ 등분된 스톡을 -80℃ 하에 저장하였다
■ 동결 건조된 RNA를, 150 mM MgCl을 수반한 트리-HCL (7.4 pH)에 재현탁시켰다
○ crRNA 및 tracrRNA는 다르마콘(Dharmacon) 또는 IDT로부터 구입하였고, tracrRNA는 그의 crRNA와 함께 항상 사용되었던 각각의 제조업체로부터 구입하였다
● 37℃ 하에 30분 동안 인큐베이션하였다
○ 80 uM gRNA가 생산된다
● 80 uM gRNA를 40 uM Cas9와 1:1로 혼합하였다
○ Cas9 침전물이 용액에 유입될 때까지 측면을 두드려 튜브를 혼합하였다
● 37℃ 하에 15분 동안 인큐베이션하였다
○ 20 uM RNP가 생산된다
● RNP는 즉시 사용하거나, 사용하기 전에 4℃ 하에 간단히 저장하거나, 또는 -80℃ 하에 장기간 저장하고, 해동 후 사용할 수 있다
상동성 지향 복구 주형 (HDRT) 생산
● 구축
○ HDRT 서열은 깁슨 어셈블리즈(Gibson Assemblies)를 사용하여 PCR 산물 및 진블록(GeneBlock) (IDT)로부터 구축되어, 5' 및 3' 상동성 아암을 포함한 최종 HDRT 및 향후 전파를 위해 클로닝 벡터 내로 원하는 삽입물을 배치하였다
● 생산
○ 선형 dsDNA HDRT 서열은 고 처리량 PCR 증폭 [카파 핫스타트(Kapa Hotstart) 폴리머라제]에 의해 생산되었다
○ PCR 앰플리콘을 SPRI 정제하고 PCR 반응 입력 100 uL 당 4 uL H2O의 최종 용적으로 농축시켰다
○ 1:20 희석으로 나노 드롭에 의해 HDRT의 농도를 분석하였다
○ 순도를 겔 전기 영동에 의해 검정하였다
1차 T 세포 전기천공
● 전기천공 파라미터
○ 세포 수 - 1,000,000개 (최저 200,000개 또는 최대 2,000,000개가 작동될 것이다)
○ 세포 용적 - 20 uL (이 양은 약 10 μl 내지 약 20 μl로 다양할 수 있다)
■ 세포를 90G에서 10분 동안 회전시키고, 흡인하며, 전기천공 직전에 전기천공 완충제에 재현탁시켰다
○ 전기천공 완충제 - P3
■ P2 및 OMEM을 포함한 대체 완충제가 또한 작동하지만, 상이한 최적의 펄스 코드를 갖는다
■ 완충제 P2는 더 높은 생존율과 더 낮은 효율을 산출하지만, 양성 세포의 총 수는 유사하다
■ 최적의 펄스 코드 (EO155)를 가진 OMEM 완충제는 그의 최적의 펄스 코드를 가진 P3과 유사한 생존율과 효율을 산출하였다
○ RNP 용적 - 약 .5 uL (50 pmol)
■ 최저 1 uL (20 pmol) 및 최대 5 uL (100 pmol) 작업
■ 최적의 RNP 양은 HDRT의 양에 따라 다르지만, 대략 10:1 RNP 대 HDRT의 예시적인 몰 비가 작동된다
○ HDRT 용적 - 약 1 uL
■ 용적은 약 0.5 μL 내지 약 2 uL로 다양할 수 있다
○ HDRT 총 양 - 약 5 pmol
■ 다양한 효율을 나타내는 더 적은 양과 더 많은 양이 가능하다
○ 총 전기천공 용적- 약 24 uL
○ 펄스 코드 - EH115
■ 많은 다른 펄스 코드가 가능하지만, EH115가 가장 효율적인 것으로 입증되었다
● 전기천공 프로토콜
○ 먼저, HDRT를 96-웰 전기천공 플레이트의 웰에 상응하는 96-웰 폴리프로필렌 V-바닥 플레이트의 웰 내로 등분하였다.
○ 이어서, 표시된 RNP를 96-웰 폴리프로필렌 V-바닥 플레이트에 유사하게 부가하였다
○ HDRT 및 RNP를 RT 하에 5분 동안 함께 인큐베이션하였다
■ 30초 정도의 짧은 시간에는 효능 상의 차이가 나타나지 않는다
■ 세포를 부가하기 전에 HDRT와 RNP를 함께 인큐베이션하는 것이 중요하다
○ 최종적으로, 세포를 전기천공 완충제에 재현탁시키고, 96-웰 폴리프로필렌 V-바닥 플레이트의 각각의 웰에 20 uL의 세포를 부가하며, 웰에 이미 존재하는 HDRT 및 RNP와 함께 3회 위 아래로 피펫팅하여 혼합하였다
○ 24 uL의 세포 + RNP + HDRT 혼합물을 각각의 웰로부터, 전기천공을 위한 96 웰 전기천공 플레이트의 상응하는 웰로 옮겼다
● 전기천공 후 취급
○ 전기천공 직후, 80 uL의 미리 가온된 배지를 전기천공 플레이트의 각각의 웰에 부가하였다
○ 플레이트를 37℃ 인큐베이터에서 15분 동안 인큐베이션하였다
■ 전기천공 후 인큐베이션이 없는 것은 약간 덜 효율적이었다. 효율 상실 없이 약 15분 내지 약 60분의 인큐베이션이 가능하다.
○ 세포를 전술한 밀도 하에 전기천공 플레이트로부터 배양 플레이트로 옮겼다
■ 통상적으로, 전기천공 플레이트는 배지와 시토카인으로 미리 채워진 4개의 동일한 96 웰 둥근 바닥 플레이트로 분할되었다
결과
예를 들어 PCR을 사용하여 더 큰 삽입 크기 (>1 kb)를 허용하는 선형 dsDNA 구축물을 생산함으로써, 더 긴 DNA 구축물을 만드는 것이 유용할 것이다. 이는 고 처리량으로 수행될 수 있지만, 본 발명까지는 DNA의 도입이 매우 독성이 있고 대량의 세포 사멸을 초래하기 때문에 이것이 불가능하였다. 도 1에 도시된 바와 같이, 작업 가능한 편집 효율을 달성하는데 필요한 있는 그대로의 DNA의 농도에서는, 세포 생존율이 너무 낮아서 본 방법이 작동할 수 없다.
긴 DNA 주형과 RNP의 복합체 형성은 세포 생존율을 구제한다
많은 양의 세포 사멸을 유발하는 일정 양의 긴 dsDNA (플라스미드 또는 선형 dsDNA)를 전기천공할 때, 본 발명자들은 DNA를 RNP와 복합체 형성시켜 RNP-DNA 주형 복합체를 형성하는 것이 (전기천공할 때 세포를 부가하기 전에, 간단한 실온 인큐베이션에 의함), 생존율 상실을 감소시킨다는 것을 발견하였다. 이는 플라스미드 주형 (도 2)과 선형 dsDNA 주형 (도 3)에도 해당된다. 전기천공된 DNA의 양이 증가함에 따라, 생존율을 유지하기 위한 RNP의 양이 또한 증가하였다 (도 3).
생존율과 통합 효율을 위한 Cas9 대 DNA 주형의 비
약 10:1 RNP 대 DNA 주형의 몰 비는 전기천공 후 통합 효율뿐만 아니라 생존율 둘 다를 유지시켰다 (도 4). 그러나, 3:1 내지 약 100:1 범위의 비가 또한 작동되었다. 약 10:1 RNP 대 DNA 주형의 비를 사용하여, 생존율 상실과 효율의 효과를 균형있게 하였고, 최대 수의 통합 양성 세포를 달성하였다 (도 5). 이러한 비는 또한, 큰 주형 (>750 bp)을 고 효율로 삽입할 수 있게 하였다 (도 6).
dsDNA 주형은 ssDNA 주형을 사용하여 감소되는 일부 오프-타겟 통합을 갖는다
긴 DNA 주형을 삽입하면 소량의 오프-타겟 통합이 발생할 수 있으며 (도 7), 이는 공여자 주형으로 AAV를 사용할 때 관찰되는 오프-타겟 통합과 유사하다. 그러나, 본원에 제공된 방법 중 일부는 긴 ssDNA 주형을 공여자로서 사용하며, 이로써 오프-타겟 통합이 감소된다 (도 8).
Cas9 닉카제를 사용하면, 오프-타겟 dsDNA 절단이 방지된다
오프-타겟 통합 이외의 또 다른 문제는 Cas9에 의해 도입된 오프-타겟 dsDNA 절단이다 (이는 NHEJ를 통해 돌연변이로서 복구될 수 있다). 본원에 제시된 바와 같이, 본원에 개시된 고 효율 비-바이러스 통합은 2개의 gRNA 및 Cas9 닉카제 (D10A)를 사용하여 삽입될 수 있으며 (도 9), 이는 오프-타겟 dsDNA 절단을 방지한다.
실시예 II
유전자 표적화를 위한 인간 1차 T 세포의 단리
1차 인간 T 세포는 신선한 전혈 샘플, 트리마 어페러시스(Trima Apheresis) (더 퍼시픽의 혈액 센터) 이후 백혈구 제거 챔버로부터의 잔류물, 또는 백혈구 성분 채집술 산물 [스템셀(StemCell)]로부터의 건강한 인간 공여자로부터 단리되었다. 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 셉메이트 튜브 (스템셀, 제조업체의 지시에 따름)를 사용하여 피콜(Ficoll) 원심 분리에 의해 전혈 샘플로부터 단리하였다. 이지셉 인간 T 세포 단리 키트 (스템셀, 제조업체의 지시에 따름)를 사용하여 자기 음성 선택에 의해 모든 세포 공급원으로부터의 PBMC로부터 T 세포를 단리하였다. 달리 언급되지 않는 한, 단리된 T 세포를 자극하고 직접 사용하였다 (신선함). 동결된 세포를 사용하는 경우, 제조업체의 지시에 따라 밤뱅커 냉동 배지 [불독 바이오(Bulldog Bio)]에서 동결시킨 이전에 단리된 T 세포를 해동하였고, 1일 동안 자극없이 배지에서 배양한 다음, 신선하게 단리된 샘플에 대해 기재된 바와 같이 자극 및 취급하였다. 신선한 건강한 인간 혈액 공여자는 UCSF 인간 연구 위원회 (CHR)에 의해 승인된 프로토콜에 동의하였다. 유전자 편집을 위한 환자 샘플은 예일(Yale) 내부 검토 위원회 (IRB)에 의해 승인된 프로토콜 하에서 수득되었다.
1차 T 세포 배양
달리 언급되지 않는 한, 벌크 T 세포를 5% 태아 소 혈청, 50 mM 2-메르캅토 에탄올 및 10 mM N-아세틸 L-시스틴을 수반한 XVivo15 배지 (스템셀)에서 배양하였다. 첨가제를 수반하지 않는 무혈청 배지 (이뮤노컬트 XF T 세포 확장 배지; 스템셀)뿐만 아니라 RPMI + 10% FBS를 표시된 실험에 사용하였다 (도 15). 단리 직후, T 세포를 200 U/mL 하의 IL-2 (UCSF 파르마시), 5 ng/mL 하의 IL-7 [써모피셔(ThermoFisher)], 및 5 ng/mL 하의 IL-15 [라이프 테크(Life Tech)]의 시토카인 칵테일과 함께, 1:1의 비드 대 세포 농도에서 항-인간 CD3/CD28 자기 다이나비드 (써모피셔)로 2일 동안 자극하였다. 전기천공 후, T 세포를 500 U/mL 하의 IL-2를 수반한 배지에서 배양하였다. 배양 전체에 걸쳐 T 세포를 배지 1 mL 당 대략 1백만 개의 세포 밀도로 유지시켰다. 전기천공 후 2 내지 3일마다 부가의 배지를 부가의 신선한 IL-2와 함께 부가하여, 최종 농도가 500 U/mL이 되도록 하였고, 필요에 따라 세포를 더 큰 배양 용기로 옮겨 1백만 개의 세포/mL의 밀도를 유지시켰다.
RNP 생산
RNP는 이전에 보고된 바와 같이, 2-성분 gRNA를 Cas9로 어닐링함으로써 생산되었다 (7, 16). 간략하게, crRNA 및 tracrRNA를 화학적으로 합성하였고 (다르마콘, IDT), 재조합 Cas9-NLS, D10A-NLS 또는 dCas9-NLS를 재조합적으로 생산 및 정제하였다 [QB3 매크로랩(Macrolab)]. 동결 건조된 RNA를 160 uM의 농도 하에 150 mM KCl을 수반한 트리스-HCL (7.4 pH)에 재현탁시키고 -80℃ 하의 분취액에 저장하였다. crRNA 및 tracrRNA 분취액을 해동시키고, 용적을 기준으로 1:1 혼합하며, 37℃ 하에 30분 동안 인큐베이션하여 80 uM gRNA 용액을 형성하였다. 이어서, 20 mM HEPES-KOH pH 7.5, 150 mM KCl, 10% 글리세롤, 1 mM DTT 중의 40 uM 하에 저장된 재조합 Cas9 및 변이체를, 37℃ 하에 15분 동안 80 uM gRNA와 1:1 용적 비 (2:1 gRNA 대 Cas9 몰 비)로 혼합하여 20 uM 하의 RNP를 형성하였다. RNP는 일반적으로, 복합체 형성 직후에 전기천공되었다.
dsDNA HDRT 생산
이중 가닥 DNA HDRT 서열은 PCR 산물로부터 생성되었다. 깁슨 어셈블리즈를 사용하여 신규 HDR 서열을 구축하여, 상동성 아암 (통상적으로 IDT로부터 gBlocks으로서 합성됨) 및 서열 확증 및 향후 전파를 위해 클로닝 벡터 내로의 원하는 삽입물 (예컨대 GFP)로 이루어진 HDR 주형 서열을 배치시켰다. 이들 플라스미드를 고 처리량 PCR 증폭 (카파 핫스타트 폴리머라제)을 위한 주형으로서 사용하였다. PCR 앰플리콘 (dsDNA HDRT)을 SPRI 정제하고 (1.0X), PCR 반응 입력 100 uL 당 3 uL H2O의 최종 용적으로 용출시켰다. 1:20 희석으로 나노 드롭에 의해 HDRT의 농도를 분석하였다. 증폭된 HDRT의 크기는 1.0% 아가로스 겔에서 겔 전기영동에 의해 확증되었다.
엑소뉴클레아제 소화에 의한 ssDNA HDRT 생산
HDR 공여자로서 긴 ssDNA를 생산하기 위해, 관심 DNA를 하나의 규칙적인 비-변형된 PCR 프라이머 및 제2 인산화된 PCR 프라이머를 사용하여 PCR을 통해 증폭시켰다. 인산화된 프라이머를 사용하여 증폭될 DNA 가닥은 이러한 방법을 사용하여 분해될 가닥일 것이다. 이는 각각의 인산화된 PCR 프라이머를 사용하여 단일 가닥 센스 또는 단일 가닥 안티센스 DNA를 제조할 수 있게 한다. 관심 ssDNA 가닥을 생산하기 위해, PCR 산물의 인산화된 가닥을 37℃ 하에 각각 5분 동안 (1 kb 당) 2개의 효소, 스트랜다제(Strandase) 혼합 A 및 스트랜다제 혼합 B로 후속 처리함으로써 분해시켰다. 80℃ 하에 5분간 인큐베이션함으로써 효소를 불활성화시켰다. 이로써 생성되는 ssDNA HDR 주형을 SPRI 정제하고 (1.0X) H2O에서 용출시켰다. 가이드-잇(Guide-it™) 긴 ssDNA 생산 시스템 [다카라 바이오 USA, 인크.(Takara Bio USA, Inc.) #632644]에 대한 보다 상세한 프로토콜은 제조업체의 웹사이트에서 찾을 수 있다.
역 합성에 의한 ssDNA HDRT 생산
ssDNA 공여자는 (28)에 기재된 바와 같이, RNA 중간체의 역전사에 이어, 생성된 RNA:DNA 혼성체 산물에서 RNA 가닥의 가수 분해에 의해 합성되었다. 간략하게, 원하는 HDR 공여자는 먼저, T7 프로모터의 하류에서 클로닝되었고 T7-HDR 공여자 서열은 PCR에 의해 증폭되었다. RNA는 HiScribe T7 RNA 폴리머라제 [뉴 잉글랜드 바이오랩스(New England Biolabs)]를 사용하는 시험관내 전사에 의해 합성되었고, TGIRT-III [인젝스(InGex)]을 사용하여 역전사되었다. 역전사 후, NaOH 및 EDTA를 각각 0.2 M 및 0.1 M에 부가하고, RNA 가수 분해를 95℃ 하에 10분 동안 수행하였다. 반응물을 HCl로 켄칭하고, 최종 ssDNA 산물을, 앰퓨어(Ampure) XP 자기 비드 [베크만 쿨터(Beckman Coulter)]를 사용하여 정제하고, 멸균 RNAse-무함유 H2O에서 용출시켰다. ssDNA 품질은 모세관 전기 영동 [바이오 분석기; 애질런트(Agilent)]에 의해 분석되었다.
1차 T 세포 전기천공
RNP 및 HDR 주형은 초기 T 세포 자극 후 2일에 전기천공되었다. T 세포를 그의 배양 용기로부터 수거하고, 자석 위에 2분 동안 세포를 놓아둠으로써 자기 CD3/CD28 다이나비드를 제거하였다. 전기천공 직전에, 비드를 제거한 세포를 90 g 하에 10분 동안 원심 분리하고, 흡인하며, 1백만 개의 세포 당 20 uL 완충제 하에 론자 전기천공 완충제 P3에 재현탁시켰다. 최적의 편집을 위해, 펄스 코드 EH115를 갖는 론자 4D 96-웰 전기천공 시스템을 사용하여 웰당 1백만 개의 T 세포를 전기천공시켰다. 웰당 200,000개 내지 2백만 개 이하의 대체 세포 농도는 더 낮은 효율을 나타냈다. 대체 전기천공 완충제가 표시된 바와 같이 사용되었지만, 상이한 최적 펄스 설정 (OMEM 완충제의 경우 EO155)을 가졌다. 달리 표시되지 않는 한, 2.5 uL의 RNP (총 50 pmol)를 2 ug/uL 하에 2 uL의 HDR 주형 (총 4 ug HDR 주형)과 함께 전기천공시켰다.
세포, RNP 및 HDRT 부가의 순서는 중요한 것처럼 보였다 (도 10). 96-웰 실험을 위해, HDRT를 먼저, 96-웰 폴리프로필렌 V-바닥 플레이트의 웰에 등분하였다. 이어서, RNP를 HDRT에 부가하고 적어도 30초 동안 RT에서 함께 인큐베이션하였다. 최종적으로, 전기천공 완충제에 재현탁된 세포를 부가하고, HDRT 및 RNP로 피펫팅함으로써 간단히 혼합하며, 24 uL의 총 용적 (세포 + RNP + HDRT)을 96 웰 전기천공 큐벳 플레이트로 옮겼다. 전기천공 직후, 80 μL의 미리 가온된 배지 (시토카인 없음)를 각각의 웰에 부가하고, 세포를 전기천공 큐벳에 잔류시키면서 세포 배양 인큐베이터에서 37℃ 하에 15분 동안 휴지시켰다. 15 분 후, 세포를 최종 배양 용기로 옮겼다.
유동 세포계수법
유동 세포계수 분석을 애튠(Attune) NxT 아쿠스틱 포커싱 세포 계측기 (써모피셔)에서 수행하였다. CD3-APC-이플루오르(eFluor) 780 [SK7, 이바이오사이언시스(eBiosciences)], CD4-PerCP [SK3, 톤보(Tonbo)], CD8-PE-Cy7 (SK1, BD), IL2RA/CD25-APC (BC96, 톤보)에 대한 표면 염색. pStat5(Y694)-PacBlue (클론 47, BD)를 사용하여 세포내 인산화 염색을 수행하였다. FoxP3에 대한 세포내 시토카인 염색은 FoxP3-AF488 [206D, 바이오레전드(Biolegend)]을 사용하여 수행하였다.
공초점 현미경 검사
25 mm2의 커버슬립이 배치된 3x1" 현미경 슬라이드 상에 10 μl의 현탁된 살아있는 T 세포 용액을 적하 캐스팅함으로써 샘플을 제조하였다. 직립 입체 배치 니콘(Nikon) A1r 레이저 스캐닝 공초점 현미경으로 영상화를 수행하였다. 여기는 488 nm OBIS 레이저 [코히런트(Coherent)]를 통해 달성되었다. 긴 작동 거리 (LWD) 60x 플랜 아포 1.20 NA 수침 대물 렌즈는 NIS-엘리먼츠 소프트웨어를 통해 달성된 부가의 디지털 줌과 함께 사용되었다. 2x 라인 평균화가 활성화된 "갈바노(Galvano)" 미러 설정 하에 영상을 획득하고, 이를 TIFF로서 보내기하여 FIJI [이미지제이(ImageJ), NIH]에서 분석하였다.
컷 앤 런
전기천공 후 11일 및 항-CD3/항-CD28 비드로 재 자극한 후 4일에 에피토프-태그부착된 1차 인간 T 세포 상에서 컷 앤 런을 수행하였다 (태그부착되지 않은 세포는 전기천공되지 않았다). 전기천공된 세포의 대략 20% 및 10%는 공여자 1 및 공여자 2 샘플에서 각각 유동 세포계수법에 의해 결정된 바와 같은 GFP-BATF 발현을 보여주었다. 항-GFP (ab290), 항-BATF (sc-100974) 및 토끼 항-마우스 (ab46540) 항체를 사용하여 (18)에 기재된 바와 같이 컷 앤 런을 수행하였다. 간략하게, 6백만 개의 세포 (GFP-BATF 함유 세포에서 항-GFP 컷 앤 런을 위한 3천만 개의 세포)를 수집하고 세척하였다. 핵을 단리하고 4℃ 하에 2시간 동안 1차 항체 (GFP 또는 BATF)와 함께 회전하면서 인큐베이션하였다. BATF 컷 앤 런 샘플을 토끼 항-마우스 항체와 함께 1시간 더 인큐베이션하였다. 그 다음, 핵을 4℃ 하에 1시간 동안 단백질 A-마이크로코쿠스 뉴클레아제 [헤니코프 랩(Henikoff lab)에 의해 친절하게 제공됨]와 함께 인큐베이션하였다. 핵을 0℃로 평형시키고, MNase 소화를 30분 동안 진행시켰다. 가용화된 염색질 컷 앤 런 단편을 단리하고 정제하였다. 페어드 엔드 시퀀싱 라이브러리를 준비하고 일루미나(Illumina) Nextseq 머신에서 실행하며, 시퀀싱 데이터를 문헌 [Skene and Henikoff, "An efficient targeted nuclease strategy for high resolution mapping of DNA binding sites," Elife 6 (2017) doi: 10.7554/eLife.21856]에 기재된 바와 같이 프로세싱하였다. 피크 호출 및 히트 맵 생성을 위해, 센트롬에 대한 읽기 매핑이 필터링되었다.
TLA 시퀀싱 및 분석
TLA 시퀀싱은 이전에 보고된 바와 같이16 세르겐티스(Cergentis)에 의해 수행되었다. 유사하게, 통합 부위 및 트랜스진 융합의 데이터 분석은 이전에 보고된 바와 같이16 세르겐티스에 의해 수행되었다. TLA 시퀀싱은 2명의 건강한 공여자에서 수행되었으며, 각각은 dsDNA 또는 ssDNA HDR 주형으로 RAB11A 유전자좌에서 편집되어 GFP 융합물을 통합하였다. 프라이머 이량체 또는 프라이머 편향의 증거를 보여주는 시퀀싱 판독 값 (즉, 관찰된 판독 값의 99% 초과가 단일 프라이머 세트로부터 비롯된다)을 제거하였다.
시험관내 Treg 억제 검정
이지셉 인간 CD4+ T 세포 강화 키트 [스템셀 테크놀로지스(STEMCELL Technologies)]를 사용하여 CD4+ T 세포를 강화시켰다. IL2RA-결핍 대상체 및 HD로부터의 CD3+CD4+CD127loCD45RO+TIGIT+ Treg-강화된 세포 및 CD25+/- 개체로부터의 CD3+CD4+CD25hiCD127lo Treg를 유동 세포계수법에 의해 분류하였다. CD3+CD4+CD25-CD127+ 반응인자 T 세포 (Tresp)를 5 μM 하에 셀트레이스(CellTrace) CFSE [인비트로젠(Invitrogen)]로 표지하였다. Treg 및 HD Tresp를 1개 비드:1개 세포 비에서 항-CD2, 항-CD3 및 항-CD28이 부하된 비드 [Treg 억제 검사기; 밀테니이 바이오텍(Miltenyi Biotec)]의 존재 하에서 1:1 비로 공동 배양하였다. 3.5 내지 4.5일에, 공동 배양물을 CFSE 희석에 대해 FACS에 의해 분석하였다. 억제 %는 하기 공식을 사용하여 계산된다: 1 - (Treg를 수반한 증식 %/Treg를 수반하지 않은 자극된 Tresp의 증식 %).
교정된 Treg의 분류 및 TSDR 분석
건강한 대조군 및 IL2RA 복합 이형접합성 돌연변이 (D6)를 갖는 환자로부터의 생체외 확장된 Treg 및 T 이펙터 세포를 해동시키고 염색하였다. 살아있는 세포를 CD25 및 CD62L 마커의 발현에 근거하여, 프로테이나제 K가 보충된 자이모리서치(ZymoResearch) M-소화 완충제 (2x) (cat# D5021-9) 내로 직접적으로 분류하였다. 용해물을 65℃ 하에 2시간 초과 동안 인큐베이션한 후 동결시켰다. 샘플의 바이술파이트 전환 및 파이로시퀀싱을 에피젠디엑스(EpigenDx) (검정 ID ADS783-FS2)에 의해 수행하여, ATG로부터 -2330 내지 -2263에 걸쳐 있는 FOXP3 유전자의 9 CpG 부위 인트론 1의 메틸화 상태를 조사하였다.
이형접합성/동형접합성 통합 예측 모델
단일 상염색체 게놈 유전자좌에서 이중 대립유전자 삽입 (2개의 잠재적 대립유전자)을 갖는 세포의 백분율의 추정치는, 상이한 형광 단백질을 그러한 동일한 부위 내로 통합시키는 2개의 HDR 주형이 세포 내로 도입된 경우 (전기천공된 경우)에는 형광 표현형에서만 만들어질 수 있다. 단순 확률 모형에는 2가지 가정만 필요하다.
가정 1: 형광 표현형에 기여하는 표적 유전자좌 이외의 다른 부위에는 오프-타겟 통합이 없다.
가정 2: 특이적 제2 형광 단백질 (즉, RFP)의 통합은 어느 형광 단백질이 세포의 다른 대립유전자에 통합되었는지에 좌우되지 않는다 (즉, 첫 번째 대립유전자 상에서의 GFP 또는 RFP 통합은 동일하게, 두 번째 대립유전자에서의 RFP 통합을 가질 것으로 예상된다).
도 26A-C에서의 표지화 후, 4가지 상이한 표현형 집단의 백분율이 공지된다:
· % GFP-RFP-
· % GFP+RFP-
· % GFP-RFP+
· % GFP+RFP+
이들로부터 즉시 2가지 유전자형이 공지된다:
1) 유전자형 A = NA/NA = % GFP-RFP-
2) 유전자형 E = GFP/RFP = % GFP+RFP+
나머지 4개의 유전자형은 나머지 2개의 단일 플루오로 양성 표현형과 합산된다:
3) 유전자형 B + 유전자형 D = GFP/NA + GFP/GFP = % GFP+RFP-
4) 유전자형 C + 유전자형 F = RFP/NA + RFP/RFP = % GFP-RFP+
RFP+ 세포가 또한 GFP+가 될 확률과 그 반대의 확률도 상기 표현형으로부터 공지된다:
5) GFP+가 RFP+로 될 확률 = P(GFP|RFP) = (% GFP+RFP+) / (% RFP+ + % GFP+RFP+)
6) RFP+가 GFP+로 될 확률 = P(RFP|GFP) = (% GFP+RFP+) / (% GFP+ + % GFP+RFP+)
가정 2에 따라, 세포가 그의 두 번째 대립유전자에서 GFP 통합을 받을 확률이, 첫 번째 통합이 GFP인지 아니면 RFP인지의 여부와 관계가 없는 경우에는, 단일 양성 유전자형 간의 관계가 결정될 수 있다 (도 26):
7) D = P(GFP|RFP) * B
8) F = P(RFP|GFP) * C
방정식 7과 8을 각각 방정식 3과 4에 삽입하고 단순화하면, 공지된 표현형의 관점에서 나머지 유전자형에 대하여 해결된다:
9) B = % GFP+RFP- / (1 + (% GFP+RFP+) / (% RFP+ + % GFP+RFP+))
10) C = % GFP-RFP+ / (1 + (% GFP+RFP+) / (% GFP+ + % GFP+RFP+))
11) D = % GFP+RFP- - B
12) F = % GFP-RFP+ - C
공지된 유전자형으로부터, 단일-대립유전자 또는 이중-대립유전자 삽입을 갖는 세포의 관찰된 % 뿐만 아니라 다른 통계는 용이하게 계산될 수 있다:
· 이형접합성인 세포의 관찰된 % = B + C
· 동형접합성 세포의 관찰된 % = D + E + F
· 적어도 1개의 삽입을 갖는 세포의 관찰된 % = B + C + D + E + F = 1 - A = 1 - % GFP-RFP-
· GFP를 갖는 대립유전자의 관찰된 % = (B + E + 2D) / 2
· RNP를 갖는 대립유전자의 관찰된 % = (C + E + 2F) / 2
· 삽입을 갖는 대립유전자의 관찰된 % = % 대립유전자GFP + % 대립유전자RFP
HDR 대립유전자가 무작위로 분포된 경우 [본질적으로 하디-바인베르크(Hardy-Weinberg) 평형에서]에 동형접합성 세포의 예상된 %는, 적어도 하나의 삽입 (HDR)을 갖는 세포의 관찰된 %로부터 계산될 수 있다:
· p = HDR 대립유전자 (GFP 또는 RFP)
· q = 비-HDR 대립유전자 (NA)
· X = 적어도 하나의 HDR을 갖는 것으로 관찰된 세포의 %
13) p + q = 1
14) p2 + 2*p*q + q2 = 1
HDR (GFP 또는 RFP) 대립유전자를 갖는 임의의 세포가 표현형 (이러한 경우 GFP+ 또는 RFP+)을 나타낼 것이므로:
15) X = p2 + 2*p*q이다.
X를 방정식 14로 대체하고 단순화하면:
16) q = (1 - X)½
17) p = 1 - q
18) p = 1 - (1 - X)½이다.
HDR 주형 삽입이 표적 대립유전자 사이에서 무작위적인 경우에, p2가 제공될 것이고, 이어서 HDR 통합에 대해 동형접합성 세포의 예상된 %가 제공될 것이다:
19) p2 = 2 - 2(1 - X)½ - X
X가 공지되기 때문에, 동형접합성 세포의 예상된 %는 적어도 하나의 HDR을 갖는 세포의 관찰된 총 %로부터 직접 계산될 수 있고, 이어서 2개의 별도의 형광단의 통합에 의해 제공된 정보를 고려하여 계산된 동형접합성 세포의 관찰된 %를 비교할 수 있다.
자가 면역/면역 조절 이상을 동반한 가족의 임상 병력
발단자는 구토, 까탈스러움 및 빈맥 후에 의학적으로 평가한 결과, 중증의 당뇨병성 케톤산증 및 혈청 글루코스 수준 920 mg/dL으로 밝혀진 생후 15주생의 백인 영아이다. 진단 1주 후에, GAD65, IA-2 및 인슐린 자가 항체에 대한 시험은 음성이었지만; 세 군데의 상이한 실험실에서 5 내지 7개월령 하에 반복 항체 시험이 IA-2 및 인슐린 자가 항체에 대해 양성 결과를 보였을뿐만 아니라 그러한 실험실 중 두 군데에서 매우 높은 수준의 GAD65 항체가 나타났을 때 [마요(Mayo) 실험실에는 42.8 nmol/L (<0.02)이고 바바라 데이비스 센터(Barbara Davis Center)에서는 896 IU/mL (0.0-5.0)이었다] 자가 면역성 당뇨병이 확증되었다. 갑상선 기능 장애 및 셀리악병(celiac disease)에 대한 시험은 음성이었지만, 약간 낮은 IgA 수준은 부분적인 IgA 결핍증을 시사한다. C-펩티드 시험은 혈청 글루코스 수준이 202 mg/dL인 피드(feed) 후 90분에 측정되었을 때 7개월령을 포함하여 반복적으로 완전히 검출할 수 없었다 (이 시점에서는 프로인슐린이 또한 검출 가능하지 않았다). 초기 DKA를 정맥내 인슐린으로 치료한 후, 그는 초기에 피하 인슐린 [글라르긴(glargine) 및 리스프로(lispro)]을 매일 여러 번 주사하여 배출하였고, 이후 지속적인 글루코스 모니터링을 통해 인슐린 펌프로 전환되었다. 그는 0.8-0.9 단위/kg/일 (7개월령에 기준선의 48%)의 범위의 높은 대체 용량의 인슐린을 지속적으로 요구하였다. 그는 어떠한 합병증도 없이 3.629 kg의 신생아 체중으로 (75번째 백분위 수) 임신 37주에 반복 제왕절개 수술에 의해 분만되었으며, 그의 발달 과정에 관한 우려는 없었으며 그의 병력은 달리 두드러지지 않았다. 그의 부모는 이질적인 백인 조상을 가지고 있으며 혈연 관계를 부인하였다.
가족 구성원에 대한 임상 정보는 표 1에 제공된다. 더 상세한 정보는 하기와 같다:
1. 어머니 (37세):
a. 어린 시절 바이러스성 폐렴을 앓았음
b. 어린 시절 귀 감염을 앓았고 항생제로 치료받았음
c. 치아 문제 (아마도 항생제와 관련됨)
d. 그녀의 아버지는 30대에 인슐린 의존성 당뇨병이 발병하였다. 그는 WBC가 낮았고 두피의 동전 피부염을 앓고 있었다.
e. 그녀의 어머니는 루푸스가 있었다
2. 아버지 (44세)
a. 모로코 출신
b. 큰 의학적 문제가 없음
c. 흔한 바이러스성 감염에 대한 그의 반응 시간이 연장될 수 있다는 일부 우려가 있다.
3. 병에 걸린 어린이 (14세)
a. 면역성 혈소판 감소성 자반증: (+ 항-혈소판 항체)
b. 호중구 감소증 (항-호중구 Ab)
c. 자가 면역 용혈성 빈혈 [DAT+, 즉 직접 쿰즈(Coombs)+]
d. 두피의 동전 피부염
e. 세포과다 골수: 역 CD4/CD8 비 (0.36).
f. 구강 궤양
g. 튜브로 귀 감염을 치료하였다
h. 어린 시절의 설사
i. 46XX - 공지된 염색체 이상이 없음
j. 말초 혈액의 유동 세포계수법: CD45+ 세포의 82.7%는 CD3+이고 5.9%는 CD19+이다. CD19+CD5+ 세포는 결핍 B 세포이다. CD45+ 세포의 43.6%는 역 CD4/CD8 비 (0.6)를 갖는 CD8+이다. TCR(알파 베타)+ CD3+ CD4- CD8- T 림프구 (TCR 알파 베타+ CD3+ 세포의 26% 및 CD45+ 백혈구의 5%)가 상대적으로 증가한다.
k. 프레드니손 (20 mg), IgG-프로-IgA, 플로나제(Flonase) 비강 스프레이 및 국소 스테로이드 및 심비코르트(Symbicort)를 포함한 면역억제제로 치료받은 적이 있었다. 또한 뉴포겐(Neupogen)으로 치료받은 적이 있었다.
4. 병에 걸린 어린이
a. 3+ 당뇨병 자가 항체 (항-GAD, MIAA, ICA, 음성 ZnT8 및 ICA512/IA-2) 정상 OGTT
b. 1세에 튜브로 귀 감염을 치료하였다
c. 겨울에 습진에 걸림
5. 병에 걸리지 않은 딸 (15세)
a. 알레르기가 있지만, 그 밖에는 건강함
6. 병에 걸린 아들 (4세)
a. 겨울에 습진에 걸림
b. HSV에 대한 양성 시험
c. 생후 1년 이내에 인슐린 의존성 당뇨병에 걸림, 제시시 C-펩티드 < 0.1, 진단 후 1년에는 항-GAD ab+ (> 30 (nl<1U/ml))이지만 진단 시에는 음성, 진단 후 1년에는 ICA512 Ab+ (1.3 (nl<1.0))이지만, 진단 시에는 음성임.
7. 병에 걸리지 않은 딸 (9세)
a. 천식
IL2RA
돌연변이를 확인하기 위한 유전적 시험
단성 형태의 당뇨병에 관여하는 것으로 공지된 40개 초과 유전자의 사내 표적화된 차세대 시퀀싱 다중 유전자 패널을 사용한 발단자의 초기 유전적 시험은 음성이었다. 발단자 및 부모의 트리오에서 후속 엑솜 시퀀싱은 IL2RA 유전자에서의 원인 복합 이형접합성 돌연변이를 밝혀내었다. 두 형제 자매는 단지 하나의 돌연변이를 가지고 있지만, 돌연변이 둘 다를 가진 다른 2명은 자가 면역에 대한 증거를 가지고 있다: 나이가 많은 남자 형제 (4세 또는 5세)는 고혈당증이 없는 상태에서 당뇨병 자가 항체 양성을 나타내는 것으로 밝혀졌으며, 나이가 많은 여자 형제는 11세에 자가 면역 매개성 범혈구 감소증으로 진단되었다. CD25 발현은 3명의 복합 이형접합성 어린이에서 현저하게 감소되었다.
IL2RA 환자의 임상 표현형 검사
CD25-결핍 어린이는 T 세포 상에서의 IL2-RA 세포 표면 발현이 거의 완전히 상실되므로, 자신의 혈액 내에서 검출 가능한 CD3+CD4+CD25hiCD127lo Treg가 사실상 없는 반면, 이형접합성 IL2RA 돌연변이를 수반하는 가족 친척은 자신의 Treg 상에서 감소된 CD25 발현을 나타낸다 (도 34). 그러나, CD25-결핍 대상체에서의 CD3+CD4+CD127loFOXP3+ T 세포의 빈도는 HD 및 CD25+/- 개체에서의 것과 유사하므로, 이는 IL2-Ra 기능의 부재 하에서도 Treg가 발생할 수 있다는 것을 시사한다 (도 34). CD25 발현 없이 Treg를 단리하는 전략을 사용하여, 본 발명자들은 CD25-결핍 대상체로부터의 CD3+CD4+CD127loCD45RO+TIGIT+ Treg-강화된 세포가, HD 대응물과 비교 시 반응인자 T 세포 (Tresp)의 증식을 억제할 수 있는 결함 능력을 나타냈다는 것을 밝혀내었다 (도 34). 대조적으로, 단일 이형접합성 IL2RA 돌연변이를 갖는 친척으로부터의 Treg는 최적 이하의 능력을 갖긴 하지만 Tresp 증식을 억제할 수 있었다 (도 34). 따라서, 이들 환자로부터의 FOXP3+ T 세포의 표면 상의 기능적 IL2-Ra 발현을 교정하는 것은 생체외 유전자 요법을 개발하기 위한 가치있는 접근법을 나타낼 수 있다.
결과
인간 T 세포를 혈액으로부터 정제하고 생체외에서 조작된 다음, 자가 이식을 통해 순환계로 돌려 보낼 수 있다. 암 및 감염성 질환을 치료하기 위해 조작된 T 세포가 개발되고 있다 (Fesnak et al. "Engineered T cells: the promise and challenges of cancer immunotherapy," Nat. Rev. Cancer 16, 566-581 (2016); and Esensten et al. "Engineering Therapeutic T Cells: From Synthetic Biology to Clinical Trials," Annu. Rev. Pathol. 12, 305-330 (2017)).
이러한 세포-기반 치료는 T 세포를 유전적으로 재프로그램할 수 있는 능력, 예를 들어 특이적 항원을 인식하고 공격할 수 있는 그의 능력을 증강시키는 능력에 좌우된다 (Roybal et al. "Synthetic Immunology: Hacking Immune Cells to Expand Their Therapeutic Capabilities," Annu. Rev. Immunol. 35, 229-253 (2017)). 자가 면역 질환 및 장기 이식을 위해, 염증을 억제하도록 설계된 변형된 조절 T 세포 (Treg)를 포함하는 세포-기반 요법이 개발되고 있다 (Bluestone et al. "Type 1 diabetes immunotherapy using polyclonal regulatory T cells," Sci. Transl. Med. 7, 315ra189 (2015)).
1차 인간 T 세포의 게놈을 변형시키기 위해 다양한 접근법이 사용되어 왔다. 긴 DNA 서열 (다수의 킬로염기)은 렌티바이러스 벡터를 사용하여 삽입될 수 있지만, 통합 부위는 표적화되지 않는다 (Verhoeyen et al. in Methods in Molecular Biology (2009), pp. 97-114). 렌티바이러스는 유전자 구축물, 예컨대 키메라 항원 수용체 (CAR)를 도입하기 위한 주요 수단이었다 (Kalos et al., "T cells with chimeric antigen receptors have potent antitumor effects and can establish memory in patients with advanced leukemia" Sci. Transl. Med. 3, 95ra73 (2011)). 특이적 내인성 유전자를 녹아웃시키기 위해, 서열 특이적 뉴클레아제, 예컨대 Cas9, TALEN 또는 징크 핑거 뉴클레아제 (ZFN)가 T 세포 내로 전기천공될 수 있어 (문헌 [Schumann et al., "Generation of knock-in primary human T cells using Cas9 ribo nucleoproteins," Proceedings of the National Academy of Sciences. 112, 10437-10442 (2015); and Perez et al. "Establishment of HIV-1 resistance in CD4+ T cells by genome editing using zinc-finger nucleases," Nat. Biotechnol. 26, 808-816 (2008)]), 비-상동 말단 결합 (NHEJ)을 통해 삽입 및 결실 돌연변이의 비-무작위 스펙트럼을 초래하는 이중 가닥 절단물이 생성될 수 있다 (van Overbeek et al., "DNA Repair Profiling Reveals Nonrandom Outcomes at Cas9-Mediated Breaks," Mol. Cell. 63, 633-646 (2016)). 특이적 뉴클레아제 절단 부위를 플랭킹하는 서열과 상동성을 갖는 작은 (<200 bp) 화학적으로 합성된 ssDNA 올리고 (ssODN)의 공동-전달을 이용하여, 상동성 지향 복구를 통해 짧은 DNA 서열을 변형시켰다 (Schumann et al. (2015)).
훨씬 긴 DNA 서열의 표적화된 통합은 보다 다양한 적용을 가능하게 할 것이다. 이는 최근에, 서열-특이적 뉴클레아제의 전기천공에 이어, HDR 주형을 함유하는 인테그라제 결핍 아데노 관련 벡터 (AAV)로 감염시킴으로써 달성되었다 (Sather et al., "Efficient modification of CCR5 in primary human hematopoietic cells using a megaTAL nuclease and AAV donor template," Sci. Transl. Med. 7, 307ra156 (2015); and Hubbard et al. "Targeted gene editing restores regulated CD40L function in X-linked hyper-IgM syndrome." Blood 127, 2513-2522 (2016)). 이러한 전기천공 및 감염 접근법은 새로운 치료용 T 세포 공학 전략을 가능하게 하였지만 (문헌 [Eyquem et al., "Targeting a CAR to the TRAC locus with CRISPR/Cas9 enhances tumour rejection," Nature 543, 113-117 (2017)]), 오프-타겟 통합을 야기시키고, 잠재적으로 바람직하지 않은 바이러스 감염을 필요로 하며, 바이러스 생산에 있어서의 어려움으로 인해 처리량이 제한된다.
세포 배양 조건, Cas9 RNP 및 HDR 주형의 농도 및 전기천공 파라미터를 시험하여 고 효율 비-바이러스 게놈 표적화를 위한 방법을 개발하였다. 고 농도의 Cas9 RNP 및 긴 DNA 주형 (>1 Kb)이 세포 생존율에 제한적인 영향을 주면서 1차 인간 T 세포에서 다수의 유전자좌 내로 공동 전달될 수 있었던 조건이 확인되었다.
비-바이러스 표적화는 Treg 기능 장애 및 단성 자가 면역 질환을 유발하는 병원성 돌연변이를 교정하는 데 사용될 수 있다. 본원에서는 두 명의 어린이가 조기 발병 자가 면역 질환을 앓고 있고 세 번째는 유형 1 당뇨병 (T1D)의 매우 높은 위험을 암시하는 자가 항체를 갖고 있으며, 엑솜 시퀀싱을 통해 IL2RA에서 원인이 되는 기능 상실 돌연변이가 확인된 가족이 본원에 기재된다. IL2RA는 조절 T 세포 기능 및 면역 생체 항상성에 중요하다. 본원에 제공된 비-바이러스 CRISPR 게놈 표적화 방법을 사용하여, 기능적 하류 시그널링과 함께 IL2RA의 세포 표면 발현을 복원시키는 효율적인 돌연변이 교정이 달성되었다. 1차 인간 면역 세포에서의 비-바이러스 게놈 표적화는 환자로부터의 세포에서의 돌연변이의 기능적 연구 및 교정을 가능하게 할 것이다. 개선된 유전자 표적화 (비-바이러스 주형, 고 효율 및 특이성, 및 긴 표적화 구축물)와 커플링된 세포 요법은 자가 면역 질환의 치료뿐만 아니라 면역 결핍증, 감염성 질환, 장기 이식 및 암 면역 요법에 대한 엄청난 가능성을 보유하고 있다.
비-바이러스 인간 T 세포 게놈 표적화의 개발
인간 T 세포에서의 게놈 표적화에 대한 주요 제한은 DNA 전달이 세포 사멸을 초래한다는 점이다 (Cornu et al., "Refining strategies to translate genome editing to the clinic," Nat. Med. 23, 415-423 (2017)). 짧은 단일 가닥 올리고데옥시뉴클레오티드 (ssODN) HDR 주형의 도입이 T 세포에서 생존율의 상당한 상실을 유발하지는 않았지만, 더 큰 선형 dsDNA 주형은 광범위한 독성을 야기하였다 (Y. Zhao et al., "High-Efficiency Transfection of Primary Human and Mouse T Lymphocytes Using RNA Electroporation," Mol. Ther. 13, 151-159 (2006); and Hornung et al. "Intracellular DNA recognition," I10, 123-130 (2010)).
본원에 나타낸 바와 같이, 긴 (>1 kb) 선형 dsDNA 주형은 CRISPR-Cas9 리보핵단백질 (Cas9 RNP)과 공동 전기천공될 때 독성이 적었다 (도 10). 이것은 Cas9 RNP와 긴 dsDNA의 적절한 혼합물의 공동 전달이 HDR을 가능하게 하고 세포 생존율을 보존할 것이란 사실을 시사하였다.
비-바이러스 게놈 표적화는 1차 인간 T 세포에서 최적화되었다. 프로토콜은 표적 통합 효율, 세포 생존율 및 통합 양성 세포의 총 수에 맞게 조정되었다 (도 11A 및 도 12). Cas9 RNP를 하우스키핑 유전자 RAB11A에 N-말단 GFP-융합물을 도입하도록 설계된 dsDNA HDR 주형과 함께 전기천공시켰다 (도 11B). 전기천공 후 3 내지 5일에 수행된 고 처리량 유동 세포계수법을 사용하여 통합 및 세포 생존율을 모니터링하였다. 먼저, 유전자 표적화 속도를 현저하게 증가시킨, 전기천공 전후 둘 다의 자극 및 시토카인 처리를 확인하였다 (도 11C 및 도 13 및 14). 이들 조건은 다양한 공급원으로부터 단리된 신선한 또는 동결된 1차 T 세포에서 효율적인 표적화를 가능하게 하였다 (도 15). Cas9 RNP 및 HDR 주형 농도의 다양한 비를 이들 널리 자극된 T 세포에서 상이한 양으로 시험하였고 (도 11D 및 도 16), 효율적인 유전자 표적화를 가능하게 하는 적절한 농도를 확인하였다. 최종적으로, 높은 수준의 세포 생존율을 유지하면서 유전자 표적화를 최대화하기 위한 전기천공 조건을 시험하였다 (도 11E 및 도 17). 비-바이러스 유전자 표적화는 1차 인간 CD4+ 및 CD8+ T 세포 둘 다에서 세포의 50% 초과에서 내인성 RAB11A 하우스키핑 유전자에 GFP 융합물의 도입을 달성할 수 있게 하였다 (도 11F).
신속하고 조합적인 유전자 표적화 적용
게놈 부위 및 인간 혈액 공여자 전체에 걸쳐 본원에 제공된 방법의 비-바이러스 유전자 표적화 적용의 단순성 및 속도 (도 18 및 도 12). 상동 플랭킹 서열을 갖는 GFP-융합물을 코딩하는 구축물은 게놈 전체의 다양한 부위를 효율적이고 재현 가능하게 표적화하였다 (도 18A 및 도 19). 이들 표적화된 GFP 융합물은 다양한 하위 세포 구조로 분류되었다 (Leonetti et al. "A scalable strategy for high-throughput GFP tagging of endogenous human proteins," Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 113, E3501-8 (2016)). 공초점 현미경 검사는 다양한 유전자를 표적으로 하여 생산된 융합 단백질의 특이성을 확증하였으며, 또한 GFP로 내인성 유전자를 표적화하면 살아 있는 인간 T 세포에서의 단백질 국재화를 영상화할 수 있다는 것을 입증하였다 (도 18B). 12명의 건강한 인간 공여자의 코호트로부터의 세포에서, 다양한 유전자로의 GFP 통합을 표적으로 하는 것은 1차 인간 T 세포에서 매우 재현 가능한 것으로 입증되었다 (도 19 및 20). 내재적으로 코딩된 CD4 표면 수용체를 GFP로 태그부착함으로써, 표적화된 통합의 특이성 및 태그부착된 유전자의 세포 유형 특이적 발현 패턴을 추가로 확증하였다. 태그부착된 CD4+ T 세포에서는 특이적으로 CD4와 GFP 발현 간의 선형 관계가 관찰되었지만, CD8+ T 세포에서는 그렇지 않았다 (도 18C). 취합해 보면, 이들 발견은 비-바이러스 게놈 표적화가, 게놈 내의 표적화된 부위 내로 큰 DNA 서열을 삽입함으로써 내인성 유전자를 변형시키는 데 사용될 수 있다는 것을 확립시켜 준다.
융합 태그는 내인성 단백질의 영상화를 허용할 뿐만 아니라 특이적 단백질의 생화학적 표적화에 사용될 수 있었다. 예를 들어, ChIP-Seq 및 보다 최근의 컷 앤 런 (문헌 [Skene and Henikoff, "An efficient targeted nuclease strategy for high resolution mapping of DNA binding sites," Elife 6(2017), doi:10.7554/eLife.21856.])은 전사 인자 결합 부위를 매핑하는데 널리 사용되지만; 이러한 검정은 종종, 효과적이고 특이적인 항체의 가용성에 의해 제한된다. 원리 증명 항-GFP 항체를 사용하여, 중요한 TF인 BATF를 코딩하는 내인성 유전자가 GFP-융합물을 생성하도록 표적화시킨 1차 T 세포에서 컷 앤 런을 수행하였다. 항-GFP 컷 앤 런으로 확인된 결합 부위는 항-BATF 항체로 확인된 부위와 밀접하게 일치하였다 (도 18D 및 도 21).
2개의 별개의 형광단으로 동일한 유전자의 2개 대립유전자를 표적화하는 것은 이중 대립유전자 유전자 변형을 갖는 세포를 정량화하고 강화시키는 방식을 제공할 것이다. RAB11A 유전자에서 동일한 부위를 표적으로 하는 2개의 별개의 형광 단백질 (도 22A 및 도 23)이 도입되었고, 세포의 >5%가 성공적인 이중 대립유전자 통합을 가졌다는 것을 보여주었다. 중요하게도, 두 형광 단백질을 발현하는 세포의 수는 이중 대립유전자 통합을 갖는 세포의 백분율을 과소 평가하는데, 이는 일부 세포가 양쪽 대립유전자 상에 GFP 또는 mCherry를 받을 것이기 때문이다. 동일한 형광 단백질의 동형접합성 통합을 설명하기 위해 모델이 구축되었다 (도 22B, 도 23). 이러한 모델은 세포의 약 10% 이하에서 RAB11A 유전자에 이중 대립유전자 통합이 있었다고 추정한다. 이는 하나의 RAB11A 통합을 갖는 세포가 또한, 두 번째 표적화된 통합을 겪을 가능성이 더 높으며, 이러한 효과가 3개의 게놈 유전자좌 전체에 걸쳐 관찰되었다는 것을 시사한다 (도 23). RAB11A 유전자좌를 표적화하는 3개의 형광 태그의 공동 전달은 3개의 모든 형광단을 발현하는 세포의 매우 낮은 비율을 명확히 보여주었는데, 이는 이들 실험에서 오프-타겟 통합의 낮은 비율과 일치한다 (도 23G). 요약하면, 동일한 유전자좌를 표적화하기 위해 다수의 비-바이러스 구축물을 사용하는 것은, 인간 T 세포에서 이중 대립유전자 게놈 편집을 확인할 수 있게 해준다.
게놈 부위의 조합 세트의 다중 편집은 확장된 연구 및 치료 적용을 제공할 것이다. 다수의 비-바이러스 HDR 주형이 다수의 RNP와 함께 공동 전달되어 2개 이상의 변형된 유전자좌가 있는 1차 세포를 생성할 수 있었는지의 여부가 시험되었다. 다중화된 유전자 표적화가 가능할뿐만 아니라 (도 22C), 하나의 변형을 갖는 세포 상에 게이팅함으로써 2개의 변형을 갖는 세포를 강화시킨 것으로 밝혀졌다 (도 22D 및 도 24) (Agudelo et al., "Marker-free coselection for CRISPR-driven genome editing in human cells," Nat. Methods. 14, 615-620 (2017)). 삼중 유전자 표적화가 또한 달성되었고, 2개의 표적화된 삽입으로 세포 상에 게이팅함으로써 제3의 변형을 갖는 세포를 상당히 강화시킬 수 있었다 (도 22E 및 도 24). 전반적으로, 비-바이러스 유전자 표적화는 다양한 연구 및 치료 적용에 사용될 수 있는 1차 T 세포의 복잡한 유전적 변형을 가능하게 하기 위해 사용될 수 있다.
D10A 닉카제 및 ssDNA HDR 주형은 오프-타겟 통합을 감소시킨다
특히 치료 적용을 위해 HDR 주형을 사용하는 경우의 주요 관심사 중 하나는 오프-타겟 통합의 가능성이다. 이는 인테그라제-결핍 AAV가 공여자 주형으로서 사용된 경우에도 관찰되었다 (Dever et al., "CRISPR/Cas9 β-globin gene targeting in human haematopoietic stem cells," Nature 539, 384-389 (2016)). 비-바이러스 유전자 표적화를 위해 선형 dsDNA 주형을 사용하는 오프-타겟 기능적 통합의 유사한 증거가 여기에서 발견되었다. 이중 가닥 DNA 주형은 자연적으로 발생하는 dsDNA 절단 부위에서 뿐만 아니라 (문헌 [Murnane et al. "Recombination events during integration of transfected DNA into normal human cells," Nucleic Acids Res. 18, 2733-2738 (1990)]), 상동성-비의존적 표적화된 통합으로 지칭되는 효과인, 표적화된 뉴클레아제, 예컨대 Cas9에 의해 유도된 특이적 dsDNA 절단에서의 HDR-비의존적 방식으로 통합될 수 있다 (Auer et al. "Highly efficient CRISPR/Cas9-mediated knock-in in zebrafish by homology-independent DNA repair," Genome Res. 24, 142-153 (2014); and Suzuki et al. "In vivo genome editing via CRISPR/Cas9 mediated homology-independent targeted integration," Nature 540, 144-149 (2016)). 5' 상동성 아암 내에 내인성 RAB11A 프로모터 서열을 함유한 N-말단 GFP-RAB11A 융합 구축물을 사용한 의도하지 않은 비-상동 통합을 찾고 있었으며; 이러한 구축물은 오프-타겟 통합 부위에서 GFP 발현을 구동시킬 수 있다 (도 25A 및 도 26). 오프-타겟 기능적 통합이 상이한 생물학적 공여자로부터의 세포에 존재하고 (도 25B), 상이한 표적 서열 및 HDR 주형을 사용한 실험에서 관찰된 것으로 밝혀졌다 (도 26 및 27). 통합된 서열이 적절한 내인성 조절 하에 유지된다는 것과, 오프-타겟 부위가 붕괴되지 않는다는 것을 보장하기 위해, 치료 용도로 예정된 세포에서는 오프-타겟 통합이 최소화되어야만 한다.
오프-타겟 Cas9 커팅에 의해 유발된 오프-타겟 통합을 감소시키기 위해, D10A Cas9 닉카제 변이체를 사용하여 비-바이러스 유전자 표적화를 수행하였다. 이러한 변이체는 2개의 gRNA가 이중 가닥 절단물을 생산하기 위해서는 아주 근접하여 결합 및 절단되어야 하므로, 오프-타겟 dsDNA 절단물의 수를 감소시킨다 (Miyaoka et al., "Systematic quantification of HDR and NHEJ reveals effects of locus, nuclease, and cell type on genome-editing," Sci. Rep. 6 (2016), doi:10.1038/srep23549; Vriend et al., "Distinct genetic control of homologous recombination repair of Cas9-induced double-strand breaks, nicks and paired nicks," Nucleic Acids Res. 44, 5204-5217 (2016); and Bothmer et al., "Characterization of the interplay between DNA repair and CRISPR/Cas9-induced DNA lesions at an endogenous locus," Nat. Commun. 8, 13905 (2017)). GFP 통합을 위한 RAB11A 유전자좌에서의 일련의 gRNA 조합을 시험하였고, D10A 닉카제를 사용할 때 GFP의 효율적인 도입을 보여준 특정 세트의 "PAM-Out" 가이드가 밝혀졌다 (도 28). 예상한 바와 같이, 단일의 오프-타겟 가이드와 함께 D10A를 사용하면, Cas9와 비교 시 오프-타겟 기능적 통합이 현저하게 감소된 것으로 나타났으며, 이는 뉴클레아제-부적격 dCas9가 사용될 때 관찰된 수준과 동일하였다 (도 25C).
D10A 닉카제를 사용해도, dsDNA HDR 주형은 아마도 자연적으로 발생하는 dsDNA 절단물에서 드물지만 관찰 가능한 오프-타겟 통합 (Cas9 뉴클레아제가 없는 경우에 관찰된 속도와 거의 동등한 수준)을 여전히 야기시켰다 (도 25A 및 C). dsDNA HDR 주형을 긴 ssDNA HDR 주형으로 대체함으로써, 이중 가닥 절단물에서 비-특이적으로 통합될 수 없는 나머지 오프-타겟 통합을 제거될 수 있었다고 추론되었다 (Quadros et al., "Easi-CRISPR: a robust method for one-step generation of mice carrying conditional and insertion alleles using long ssDNA donors and CRISPR ribonucleoproteins," Genome Biol. 18, 92 (2017); and Leonetti et al. http://www.biorxiv.org/content/early/2017/08/21/178905).
이러한 가설을 시험하기 위해, 전기천공에 필요한 많은 양의 긴 ssDNA를 생산하는 2가지 방법으로 ssDNA HDR 주형을 생성하였다 (도 35). ssDNA HDR 주형은 효율적인 온-타겟 통합은 유지하면서도 오프-타겟 기능적 통합을 대략 100배 감소시켰다 (도 25D). D10A Cas9 닉카제를 ssDNA 주형과 함께 사용하는 것이 가능하였다. 이들 실험에서, 온-타겟 통합 속도는 감소했지만, 비-특이적 통합은 주형 없이 관찰된 배경 수준으로 감소하였다 (도 25E 및 F). 잠재적 오프-타겟 활성이 우려되는 부위의 경우, D10A Cas9 닉카제 및 ssDNA HDR 주형을 이용하여, 오프-타켓 유도된 이중 가닥 절단 및 자연적으로 발생하는 절단 각각으로부터 발생하는 통합 속도를 감소시킬 수 있으며, 이는 환자 T 세포의 치료적 변형을 위한 매력적인 방법이 될 수 있다.
비-바이러스 유전자 표적화에 의한 치료적 돌연변이 교정
환자로부터의 T 세포에서 단성 면역 조절 이상을 유발하는 돌연변이를 교정하기 위한 비-바이러스 유전자 표적화의 적용이 추구되었다. CD25로서 공지되기도 한 IL-2 알파 수용체 (IL2RA)를 코딩하는 유전자 내의 열성 기능 상실 돌연변이에 의해 야기된 자가 면역 질환을 갖는 단성 1차 면역 조절 이상이 있는 가족이 확인되었다 (Sharfe et al. "Human immune disorder arising from mutation of the alpha chain of the interleukin-2 receptor," Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 94, 3168-3171 (1997); Caudy et al. "CD25 deficiency causes an immune dysregulation, polyendocrinopathy, enteropathy, X-linked-like syndrome, and defective IL-10 expression from CD4 lymphocytes," J. Allergy Clin. Immunol. 119, 482-487 (2007); and Goudy et al., "Human IL2RA null mutation mediates immunodeficiency with lymphoproliferation and autoimmunity," Clin. Immunol. 146, 248-261 (2013)). IL2RA는 Treg 및 면역 생체 항상성에 필수적이고 (문헌 [Sakaguchi et al. "Immunologic self-tolerance maintained by activated T cells expressing IL-2 receptor alpha-chains (CD25). Breakdown of a single mechanism of self-tolerance causes various autoimmune diseases," J. Immunol. 155, 1151-1164 (1995); and Rudensky et al. "Regulatory T cells and Foxp3," Immunol. Rev. 241, 260-268 (2011)]), 2개의 기능 상실 돌연변이를 갖는 복합 이형 접합체인 가족 내의 어린이는 다면 발현성 자가 면역 증상을 나타낸다 (표 1). 1명은 신생아 발병 유형 1 당뇨병 (T1D)에 걸렸고, 또 다른 1명은 유년기 동안 난치성 자가 면역성 혈구감소증이 발병하였다. 3명의 IL2RA-결핍 가족 구성원 모두는 병리학적 혈청 자가 항체를 명확하게 보여주었다. IL2RA-결핍 어린이는 IL2RA 세포 표면 발현의 거의 완전한 상실을 보이므로, 자신의 혈액에서 CD3+CD4+CD25hiCD127lo Treg가 거의 검출 가능하지 않는 반면, 이형접합성 IL2RA 돌연변이를 보유하는 가족 친척은 자신의 Treg에서 감소된 IL2RA 발현을 나타낸다 (도 30). 그러나, IL2RA-결핍 대상체에서의 CD3+CD4+CD127loFOXP3+ T 세포의 빈도는 건강한 공여자 (HD) 및 이형접합성 가족 구성원에서의 것과 유사하며, 이는 IL2RA 돌연변이에도 불구하고 Treg-유사 세포가 발생하고 지속된다는 것을 시사한다. CD25 발현 없이 Treg를 단리하기 위한 전략을 사용하여, CD25-결핍 대상체로부터의 CD3+CD4+CD127loCD45RO+TIGIT+ Treg-강화된 세포가, HD 대응물과 비교 시 반응인자 T 세포 (Tresp)의 증식을 억제할 수 있는 결함있는 능력을 나타내는 것으로 밝혀졌다 (도 29). 대조적으로, 단일 이형접합성 IL2RA 돌연변이를 갖는 친척으로부터의 Treg는 최적 이하의 능력을 갖긴 하지만 Tresp 증식을 억제할 수 있었다 (도 29). 따라서, 이들 환자로부터의 FOXP3+ T 세포의 표면 상의 기능적 IL2RA 발현을 교정하는 것은 생체외 유전자 요법을 개발하기 위한 가치있는 접근법을 나타낼 수 있다.
<표 1>
전체 엑솜 시퀀싱 결과, IL2RA 결핍 어린이에게 IL2RA에 있어서의 복합 이형접합성 돌연변이가 정착된 것으로 밝혀졌다 (도 30A 및 도 31). c.530A>G에서의 하나의 돌연변이는 미숙한 정지 코돈을 생성한다. 세포 배양 및 전기천공 방법론에 있어서의 개선으로, 약 120 bp의 화학적으로 합성된 ssDNA HDR 주형을 사용하여 상기 돌연변이를 효율적으로 교정하는 것이 가능하였다 (도 32). 더 긴 dsDNA 주형을 사용하여 속도가 훨씬 더 높아졌다 (도 30B 및 도 32 및 33). 교정된 환자-유래 T 세포는 그들의 표면 상에 IL2RA를 발현시켰다. 3명의 형제 자매 모두에서 교정이 성공적이었음에도 불구하고, 복합 het 3에서 더 낮은 IL2RA 발현 속도가 관찰되었는데, 이는 환자의 질환과 연관된 세포 상태의 변경 또는 그녀가 면역 억제제로 치료받은 유일한 형제 자매라는 사실 때문일 수 있다 (표 1 및 도 34). 두 번째 돌연변이인 c.800delA는 최종 IL2RA 엑손의 리딩 프레임 내에 프레임 시프트를 유발시켜, 최종 엑손에서 코딩된 유전자 일부분의 오독뿐만 아니라 정상 정지 코돈을 지나는 런-온 번역을 초래한다. 이러한 프레임 시프트는 HDR 주형 없이도 완화될 수 있었다 (도 33). 이러한 부위에서, Cas9 RNP 단독에 의해 야기된 게놈 커팅은 아마도 삽입/결실 돌연변이를 갖는 정확한 프레임을 복원함으로써, IL2RA의 생산적인 세포 표면 발현을 유발하기에 충분하였다 (도 33). 취합해 보면, 이들 데이터는 HDR 주형-의존적 및 비-HDR 주형-의존적 복구 메커니즘을 사용하여 환자 T 세포에서 별개의 돌연변이를 어떻게 교정할 수 있는지를 보여준다.
단성 Treg 결함을 갖는 이러한 가족으로부터의 환자에 대한 한 가지 잠재적 치료 전략은 생체외 T 세포 유전자 교정에 이어 자가 교정된 Treg의 수혈일 것이다. 표적화된 교정에 의해 생산된 Treg 세포는 조혈 줄기 세포 이식의 잠재적 위험 중 일부를 제한할 수 있었다. IL2RA 돌연변이 중 하나를 교정하는 것이 생산적인 시그널링을 유발하였는지의 여부와, FOXP3+ Treg의 의미있는 분획에서 교정이 발생했는지의 여부를 시험하였다. c.530A>G 돌연변이의 교정 후, 세포는 고 친화도 IL-2 수용체인 IL2RA를 통해 기능적으로 신호를 보낼 수 있었다. IL-2 처리에 반응하여, 변형된 세포는 생산적인 시그널링의 특징인 증가된 STAT5 인산화를 명확하게 보여주었다 (도 31C 및 도 33 및 34). 또한, 유동 세포계수법은 IL2RA 교정된 세포의 일정 분획이 Treg에서 중요한 전사 인자인 FOXP3을 발현하였다는 것을 확증시켜 주었다 (도 30D 및 도 32 및 33).
IL2RA를 코딩하는 내인성 유전자는 슈퍼-인핸서를 구성하는 다수의 시스-조절 요소에 의해 엄격하게 제어된다 (Farh et al., "Genetic and epigenetic fine mapping of causal autoimmune disease variants," Nature 518, 337-343 (2015); and Simeonov et al. "Discovery of Stimulation-Responsive Immune Enhancers with Unbiased CRISPR Activation," Nature 549 (7670): 111-115 (2017)). 따라서, IL2RA의 치료적 교정은 그의 내인성 게놈 유전자좌에서의 유전자의 특이적 복구에 의존하는 것으로 예상된다. Cas9 및 dsDNA를 사용한 GFP 삽입이 dsDNA의 비-특이적 통합 가능성 있음을 보여주었다는 것으로 고려해 볼 때, 본 발명자들은 c.530A>G 환자 돌연변이를 특이적으로 복구하기 위해 D10A Cas9 닉카제 및 긴 ssDNA 주형을 사용하였다. 이들 시약을 사용하여 환자로부터 T 세포의 약 20%에서 돌연변이체 유전자를 특이적이고 선택적으로 교정할 수 있었다 (도 30E).
비-바이러스 유전자 표적화는 1차 인간 T 세포의 게놈 전체에 걸쳐 규정된 서열의 효율적인 삽입을 가능하게 한다. 이러한 삽입은 단일 염기쌍 돌연변이의 도입 또는 교정에서부터, 내인성 유전자좌에서의 큰 기능적 서열 및 태그의 통합에 이르기까지 다양할 수 있으며, 게놈 전체에 걸친 다중화된 통합이 가능하다. 조작된 T 세포의 치료적 적용을 위해, D10A Cas9 닉카제 및 ssDNA HDR 주형을 사용함으로써 오프-타겟 통합을 상당히 감소시킬 수 있다. 본원에 제공된 방법 및 결과는 조작된 T 세포 요법의 가속화된 개발 및 유전적 질환의 치료를 가능하게 할 것이다.
SEQUENCE LISTING
<110> The Regents of the University of California
<120> TARGETED NON-VIRAL DNA INSERTIONS
<130> 081906-226110PC-1091693
<150> 62/520117
<151> 2017-06-15
<150> 62/552,180
<151> 2017-08-30
<160> 8
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 1
agacaaggtr gacccagcc 19
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 2
acaggaggar rrkwrraraa 20
<210> 3
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 3
caaaatgacc cacgggaaga caaggtagac cc 32
<210> 4
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 4
gactttgtta caccactaca ggaggagagt a 31
<210> 5
<211> 13
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 5
acaagatgga ccc 13
<210> 6
<211> 13
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 6
aggagaaaga gta 13
<210> 7
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 7
caaaatgacc cacgggaaga caagatggac cc 32
<210> 8
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 8
gactttgtta caccactaca ggagaaagag ta 32
Claims (28)
- a) 하기를 포함하는 Cas9 리보핵단백질 복합체 (RNP)-DNA 주형 복합체를 제공하는 단계이며:
(i) Cas9 뉴클레아제 도메인 및 가이드 RNA를 포함하는 RNP이며, 여기서 가이드 RNA가 세포의 게놈의 표적 영역과 특이적으로 혼성화되고, Cas9 뉴클레아제 도메인이 표적 영역을 절단하여 세포의 게놈 내에 삽입 부위를 생성시키는 것인 RNP; 및
(ii) 이중 가닥 또는 단일 가닥 DNA 주형이며, 여기서 DNA 주형의 크기가 약 200개 뉴클레오티드 초과이고, DNA 주형의 5' 및 3' 말단이 삽입 부위를 플랭킹하는 게놈 서열과 상동인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 이중 가닥 또는 단일 가닥 DNA 주형,
여기서 복합체 내에서의 RNP 대 DNA 주형의 몰 비가 약 3:1 내지 약 100:1인 단계; 및
b) RNP-DNA 주형 복합체를 세포 내로 도입하는 단계
를 포함하는, 세포의 게놈을 편집하는 방법. - 제1항에 있어서, RNP-DNA 주형 복합체가 약 20℃ 내지 25℃의 온도 하에 약 1분 미만 내지 약 30분 동안 RNP를 DNA 주형과 함께 인큐베이션함으로써 형성되는 것인 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, DNA 주형이 선형 DNA 주형인 방법.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, DNA 주형이 단일 가닥 DNA 주형인 방법.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, DNA 주형이 순수한 단일 가닥 DNA 주형인 방법.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, RNP-DNA 주형 복합체와 세포가 RNP-DNA 주형 복합체를 세포 내로 도입하기 이전에 혼합되는 것인 방법.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, RNP가 Cas9 뉴클레아제를 포함하는 것인 방법.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, RNP가 Cas9 닉카제를 포함하는 것인 방법.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, RNP-DNA 주형 복합체가 적어도 2개의 구조적으로 상이한 RNP 복합체를 포함하는 것인 방법.
- 제9항에 있어서, 적어도 2개의 구조적으로 상이한 RNP 복합체가 구조적으로 상이한 가이드 RNA를 함유하는 것인 방법.
- 제10항에 있어서, 각각의 구조적으로 상이한 RNP 복합체가 Cas9 닉카제를 포함하고, 구조적으로 상이한 가이드 RNA가 표적 영역의 반대 가닥과 혼성화되는 것인 방법.
- 제9항에 있어서, 적어도 2개의 구조적으로 상이한 RNP 복합체가 구조적으로 상이한 Cas9 뉴클레아제 도메인을 함유하는 것인 방법.
- 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 도입하는 단계가 전기천공을 포함하는 것인 방법.
- 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, RNP 대 DNA 주형의 몰 비가 약 5:1 내지 약 15:1인 방법.
- 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, RNP 대 DNA 주형의 몰 비가 약 5:1 내지 약 10:1인 방법.
- 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, RNP 대 DNA 주형의 몰 비가 약 8:1 내지 약 12:1인 방법.
- 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, DNA 주형의 크기가 약 1 kb 초과인 방법.
- 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, DNA 주형이 약 2.5 pM 내지 약 25 pM의 농도 하에 있는 것인 방법.
- 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, DNA 주형의 양이 약 1 μg 내지 약 10μg인 방법.
- 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 1차 조혈 세포 또는 1차 조혈 줄기 세포인 방법.
- 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, RNP-DNA 주형 복합체가 약 1 x 105 내지 약 2 x 106개의 세포 내로 도입되는 것인 방법.
- 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 1차 조혈 세포인 방법.
- 제22항에 있어서, 1차 조혈 세포가 면역 세포인 방법.
- 제23항에 있어서, 면역 세포가 T 세포인 방법.
- 제24항에 있어서, T 세포가 조절 T 세포, 이펙터 T 세포, 또는 나이브 T 세포인 방법.
- 제25항에 있어서, 조절 T 세포, 이펙터 T 세포, 또는 나이브 T 세포가 CD4+ T 세포인 방법.
- 제24항에 있어서, T 세포가 CD8+ T 세포인 방법.
- 제24항에 있어서, T 세포가 CD4+CD8+ T 세포인 방법.
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