KR20200009184A - 꿀벌 추출물을 유효성분으로 함유하는 당뇨병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 건강기능식품 - Google Patents
꿀벌 추출물을 유효성분으로 함유하는 당뇨병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 건강기능식품 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 꿀벌(Apis mellifera) 추출물을 유효성분으로 함유하는 항당뇨 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는, 양봉에 사용되는 서양꿀벌의 추출물을 유효성분으로 함유하는 알파-아밀라아제(α-amylase) 저해, 베타-아밀라아제(β-amylasse) 저해 및 알파-글루코시다아제(α-glucosidase) 저해를 통한 당뇨병의 예방 또는 치료/개선용 약학적 조성물 및 건강 기능 식품에 관한 것이다. 본 발명의 항당뇨 조성물의 유효성분으로서의 꿀벌 추출물은, 본 명세서의 실시예를 통해 증명된 바와 같이, 당뇨병의 예방 또는 개선용 의약품 및 건강 기능 식품으로 사용할 수 있는 뛰어난 효과가 있다. 뿐만 아니라, 본 발명의 꿀벌 추출물은 열 안정성이 우수하고, pH 2의 산성조건 및 혈장 내에서도 전분분해효소 저해 활성의 손실이 나타나지 않아, 액상, 크림, 분말, 환, 정 등의 다양한 형태로 손쉽게 가공될 수 있어 제약 산업 및 식품 산업상 매우 유용하게 이용될 수 있다.
Description
본 발명은 꿀벌(Apis mellifera) 추출물을 유효성분으로 함유하는 항당뇨 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는, 양봉에 사용되는 서양꿀벌의 추출물을 유효성분으로 함유하는 알파-아밀라아제(α-amylase) 저해, 베타-아밀라아제(β-amylasse) 저해 및 알파-글루코시다아제(α-glucosidase) 저해를 통한 당뇨병의 예방 또는 치료/개선용 약학적 조성물 및 건강 기능 식품에 관한 것이다.
현대인에게 가장 흔한 질병중 하나인 당뇨병은 인슐린의 분비량이 부족하거나 정상적인 기능이 이루어지지 않는 등의 대사질환의 일종으로서 혈중 포도당 농도가 높은 것이 특징이며, 고혈당으로 인하여 여러 증상 및 징후를 일으킨다. 당뇨병은 제1형과 제2형으로 구분되는데, 제1형 당뇨병은 유전적 영향에 의해 인슐린을 전혀 생산하지 못하는 것이 원인이 되어 발생하며, 제2형 당뇨병은 인슐린 기능이 떨어져 인슐린 저항성(insulin resistance)이 원인으로 알려져 있다. 특히, 제2형 당뇨병은 식생활의 서구화에 따른 고열량, 고지방, 고단백의 식단, 운동부족, 스트레스 등 환경적인 요인이 크게 작용하는 것으로 알려져 있다. 당뇨병의 치료를 위해서는 제1형 당뇨병의 경우에는 인슐린 주사가 필수적이며, 제2형 당뇨병의 경우에는 생활습관 교정 및 약물치료가 필요하며, 대표적으로 인슐린 분비 촉진제(예, 레파글리나이드, 미티글이나이드) 및 소장에서의 탄수화물 흡수 지연제[글루코바이: 성분명-아카보즈(acarbose), 베이슨: 성분명-보글리보스(voglibose)] 등이 이용되고 있다.
한편, 꿀벌(Apis mellifera)은 벌목 꿀벌과의 집단 생활을 하는 곤충으로, 인류에게 사육된 가장 오래된 곤충이다. 전 세계적으로 식물의 화분매개에 결정적인 역할을 수행하며, 또한 양봉을 통해 벌꿀, 벌집, 로열젤리, 프로폴리스, 화분, 봉독 등을 생산하여 인간 생활에 큰 도움을 주는 유익 곤충이다. 꿀벌은 전 세계적으로 가장 많이 식용되고 있는 곤충 중의 하나이기도 하며, 약용으로 이용되기도 한다.
최근, 식용 곤충의 사회적 인식 변화 및 곤충 산업 활성화에 의해 곤충의 고부가가치화 연구가 진행되고 있으며, 봉독의 항균 활성(Somwongin S. et al., 2018. Toxicon. 145:32-39; 한상미 외, 2011. Journal of Fish Pathology 24: 113-120), 봉독의 항응고 활성(H. Zolfagharian 등, 2015. J. Pharmacopuncture, 18(4): 7-11), 꿀벌 유충 추출물의 fibrin 혈전의 용해 활성(김현애 등, 2013, Journal of Sericultural and Entomological Science v.51 no.2 ,pp. 147-152), 봉독으로부터 다양한 효소저해제(정태숙 외, 1997. Korean Journal of Apiculture 12: 85-92; 양결, 2017. 동아대학교 석사논문) 등이 알려지고 있다.
꿀벌과 관련된 특허는 [양봉용 관제시스템] (대한민국 등록특허 제10-1867985호), [차량용 벌통 다단 수납장치] (대한민국 등록특허 제10-1856641호)과 같은 꿀벌 양봉 관련 장치에 대한 것이 대부분이며, 최근에는 [꿀벌의 전염병 예방 및 치료용 조성물] (대한민국 등록특허 제10-1847532호), [부저병의 예방 및 치료용 조성물] (대한민국 등록특허 제10-1828563호), [꿀벌의 면역증강용 조성물] (대한민국 등록특허 제10-1424083호), [양봉장 수의학 조성물] (대한민국 등록특허 제10-1185328호)와 같은 꿀벌 양봉 관련 조성물 특허가 개시되어 있다. 특히, 꿀벌과 관련된 유용 기능성 특허는 대부분이 봉독에 집중되어 있으며, 대한민국 등록특허 제10-1316600호에는 [봉독을 함유하는 어류용 사료조성물], 대한민국 등록특허 제10-1834758호에는 [봉독을 유효성분으로 포함하는 치주염의 예방 또는 치료용 조성물]가 개시되어 있으며, 공개특허로 제10-2009-0114999호에 [봉독을 포함하는 간경변 치료용 약학 조성물], 제10-2012-0047593호에 [봉독을 유효성분으로 포함하는 유방암 전이 억제용 조성물]이 알려져 있다.
2017년도 한국생명과학회 58회 정기총회 및 국제학술대회 포스터 P2-31.
2017년도 한국생명과학회 58회 정기총회 및 국제학술대회 포스터 P2-33.
본 발명은 상기와 같은 종래 기술의 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로서, 본 발명에서 해결하고자 하는 과제는 꿀벌 추출물을 유효성분으로 함유하는 항당뇨 활성을 갖는 약학 조성물 및 건강 기능 식품을 제공하고자 하는 것이다.
상기와 같은 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 꿀벌(Apis mellifera) 추출물을 유효성분으로 함유하는 당뇨병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 꿀벌 추출물은 꿀벌 유충의 열수 추출물 또는 에탄올 추출물인 것이 바람직하다.
상기 꿀벌 추출물은 꿀벌 번데기 또는 성충의 에탄올 추출물인 것이 바람직하다.
상기 꿀벌 추출물은 꿀벌 성충의 열수 추출물의 에틸아세테이트 분획물인 것이 바람직하다.
상기 꿀벌 추출물은 꿀벌 성충의 에탄올 추출물의 헥센 분획물, 에틸아세테이트 분획물 또는 부탄올 분획물인 것이 바람직하다.
또한, 본 발명은 꿀벌(Apis mellifera) 추출물을 유효성분으로 함유하는 당뇨병의 예방 또는 개선용 건강 기능 식품을 제공한다.
상기 꿀벌 추출물은 꿀벌 유충의 열수 추출물 또는 에탄올 추출물인 것이 바람직하다.
상기 꿀벌 추출물은 꿀벌 번데기 또는 성충의 에탄올 추출물인 것이 바람직하다.
상기 꿀벌 추출물은 꿀벌 성충의 열수 추출물의 에틸아세테이트 분획물인 것이 바람직하다.
상기 꿀벌 추출물은 꿀벌 성충의 에탄올 추출물의 헥센 분획물, 에틸아세테이트 분획물 또는 부탄올 분획물인 것이 바람직하다.
본 발명의 항당뇨 조성물의 유효성분으로서의 꿀벌 추출물은, 본 명세서의 실시예를 통해 증명된 바와 같이, 당뇨병의 예방 또는 개선용 의약품 및 건강 기능 식품으로 사용할 수 있는 뛰어난 효과가 있다. 뿐만 아니라, 본 발명의 꿀벌 추출물은 열 안정성이 우수하고, pH 2의 산성조건 및 혈장 내에서도 전분분해효소 저해 활성의 손실이 나타나지 않아, 액상, 크림, 분말, 환, 정 등의 다양한 형태로 손쉽게 가공될 수 있어 제약 산업 및 식품 산업상 매우 유용하게 이용될 수 있다.
도 1은 실시예에서 사용된 꿀벌 유충, 번데기, 성충 분말의 사진도이다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명의 발명자들은 우수한 영양성과 다양한 약리 활성이 알려진 꿀벌을 대상으로 항당뇨 효능을 검정하기 위하여, 먼저, 꿀벌의 유충, 번데기 및 성충을 각각 구입한 후, 이를 -20℃로 급속냉동하여 사멸시킨 다음, -50℃에서 동결건조하였으며, 이후 막자사발을 이용하여 꿀벌 유충, 번데기 및 성충 분말을 각각 제조하였다. 이후, 제조분말을 이용하여 열수 추출물과 에탄올 추출물을 조제하고, 상기 열수 추출물 및 에탄올 추출물로부터 헥센, 에틸아세테이트 및 부탄올의 순차적 유기용매 분획물 및 물 잔류물을 각각 회수하여, 항당뇨 활성 성분을 회수하였으며, 상기 활성 성분들은 열 안정성과 산 안정성이 우수한 특징을 가짐을 확인함으로써 상기 활성 성분들을 당뇨병의 예방 또는 치료/개선용 약학적 조성물 및 건강 기능 식품으로 활용하고자 하였다.
구체적으로, 본 발명자들은 항염증 및 항고혈압 효과가 있다고 알려진 꿀벌을 이용하여 항당뇨 조성물을 개발하기 위하여, 꿀벌 유충, 번데기 및 성충을 대상으로 열수 추출물과 에탄올 추출물을 조제하고, 이들 추출물을 대상으로 알파-아밀라아제(α-amylase), 베타-아밀라아제(β-amylase) 및 알파-글루코시다아제(α-glucosidase)에 대한 저해 활성을 평가한 결과, 유충의 열수 추출물과 에탄올 추출물, 번데기와 성충의 에탄올 추출물에서 우수한 항당뇨 활성을 확인하였으며, 특히, 꿀벌 성충의 열수 추출물로부터 분획된 에틸아세테이트 분획물, 에탄올 추출물로부터 분획된 헥센 분획물, 에틸아세테이트 분획물 및 부탄올 분획물에서 강력한 효소 저해 활성을 확인하였다.
따라서, 본 발명은 꿀벌(Apis mellifera) 추출물을 유효성분으로 함유하는 당뇨병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 꿀벌 추출물은 꿀벌 유충의 열수 추출물 또는 에탄올 추출물인 것이 바람직하다.
상기 꿀벌 추출물은 꿀벌 번데기 또는 성충의 에탄올 추출물인 것이 바람직하다.
상기 꿀벌 추출물은 꿀벌 성충의 열수 추출물의 에틸아세테이트 분획물인 것이 바람직하다.
상기 꿀벌 추출물은 꿀벌 성충의 에탄올 추출물의 헥센 분획물, 에틸아세테이트 분획물 또는 부탄올 분획물인 것이 바람직하다.
또한, 본 발명은 꿀벌(Apis mellifera) 추출물을 유효성분으로 함유하는 당뇨병의 예방 또는 개선용 건강 기능 식품을 제공한다.
상기 꿀벌 추출물은 꿀벌 유충의 열수 추출물 또는 에탄올 추출물인 것이 바람직하다.
상기 꿀벌 추출물은 꿀벌 번데기 또는 성충의 에탄올 추출물인 것이 바람직하다.
상기 꿀벌 추출물은 꿀벌 성충의 열수 추출물의 에틸아세테이트 분획물인 것이 바람직하다.
상기 꿀벌 추출물은 꿀벌 성충의 에탄올 추출물의 헥센 분획물, 에틸아세테이트 분획물 또는 부탄올 분획물인 것이 바람직하다.
이하에서는, 본 발명의 꿀벌 추출물 및 항당뇨 활성 성분의 제조 방법 및 효능 실험 등을 보다 구체적으로 설명한다.
본 발명의 발명자들은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 꿀벌 사육 단계; 꿀벌 유충, 번데기, 성충의 회수/전처리 및 동결건조 단계; 꿀벌 유충, 번데기, 성충의 분말화 단계; 꿀벌 유충, 번데기, 성충의 추출물 조제 단계; 꿀벌 성충 추출물로부터 헥센, 에틸아세테이트, 부탄올의 순차적 유기용매 분획물 조제 및 이후 얻어지는 물 잔류물 조제 단계; 상기 추출물 및 분획물의 항당뇨 활성 평가 단계 및 활성 물질의 안정성 조사 단계의 실험들을 수행하였다.
바람직한 구체예로서, 본 발명은 통상의 곤충 사육과 동일한 방법으로 꿀벌을 사육한 후, 양봉 현장에서 유충, 번데기, 성충을 각각 회수하고, 이후 -20℃로 급속냉동하여 사멸시킨 다음, -50℃에서 동결건조 후, 막자사발을 이용하여 분말로 제조하여 용매로 추출한 다음, 추출액을 0.06mm 이하의 여과망을 사용하여 여과하고, 이를 감압농축하여 추출물을 조제하며, 이를 유기용매로 순차 분획하여 유기용매 분획물과 물 잔류물을 수득할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용매는 물(냉수, 열수), 주정, 탄소수 1~4의 무수 또는 함수 저급 알코올(메탄올, 에탄올, 주정, 프로판올, 부탄올 등), 상기 저급 알코올과 물과의 혼합용매 등을 이용할 수 있으며, 열수, 또는 95% 에탄올 추출이 가장 바람직하다.
본 발명에서 사용되는 유기용매는 헥센, 에틸아세테이트 및 부탄올을 이용할 수 있으며, 이들 유기용매로 추출물을 순차 또는 각각 분획하여 헥센 분획물, 에틸아세테이트 분획물, 부탄올 분획물 및 물 잔류물을 수득할 수 있다.
본 발명에서는, 꿀벌 유충, 번데기, 성충의 열수 추출물과 에탄올 추출물을 0.5mg/ml의 농도로 하여 알파-아밀라아제(α-amylase), 베타-아밀라아제(β-amylase) 및 알파-글루코시다아제(α-glucosidase) 저해 활성을 측정한 결과, 꿀벌 유충의 열수 추출물에서 알파-글루코시다아제(α-glucosidase) 저해 활성에 의한 항당뇨 활성이 우수함을 확인하고, 에탄올 추출물에서 알파-아밀라아제(α-amylase) 저해 활성에 의한 항당뇨 활성이 우수함을 확인하였다. 또한, 꿀벌 번데기와 성충의 에탄올 추출물에서도 알파-아밀라아제(α-amylase) 저해 활성에 의한 항당뇨 활성이 우수함을 확인하였다. 특히, 성충의 경우, 열수 추출물의 에틸아세테이트 분획물에서 우수한 알파-아밀라아제(α-amylase) 저해 활성을 확인하였고, 에탄올 추출물의 헥센 분획물에서는 알파-아밀라아제(α-amylase), 베타-아밀라아제(β-amylase) 및 알파-글루코시다아제(α-glucosidase) 저해 활성이 모두 우수하였으며, 에틸아세테이트 분획물과 부탄올 분획물에서는 알파-아밀라아제(α-amylase) 및 알파-글루코시다아제(α-glucosidase) 저해 활성이 우수함을 확인하여, 이들 활성 추출물 및 분획물들을 항당뇨 활성 성분의 소재로 사용할 수 있을 것으로 기대되었다.
본 발명의 꿀벌 추출물을 포함하는 항당뇨 활성 성분은 감압건조 및 동결건조, 또는 분무건조 등과 같은 통상적인 분말화 과정을 거쳐 분말로 제조될 수 있다. 꿀벌 추출물을 포함하는 항당뇨 활성 성분은 혈장 내의 다양한 분해효소에 분해되지 않으며, 100℃의 열처리와 pH 2의 인체 위 내의 pH에서도 활성을 유지한다.
본 발명의 꿀벌 추출물은 강력한 α-amylase, β-amylase 및 α-glucosidase에 대한 전분분해효소 저해 활성을 나타내어, 제1형 당뇨병, 제2형 당뇨병 또는 당뇨병성 망막증, 당뇨병성 신증 등과 같은 당뇨 합병증의 예방 및 치료/개선과 관련되는 약학적 조성물 및 건강 기능 식품의 소재로 사용될 수 있다.
바람직한 구체예로서, 본 발명의 항당뇨 조성물은 약학적 조성물의 용도로서 적용될 수 있다.
상기 약학적 조성물은 각각의 사용 목적에 맞게 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁제, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구 제형, 멸균 주사용액의 주사제 등 다양한 형태로 제형화하여 사용할 수 있으며, 경구 투여하거나 정맥 내, 복강 내, 피하, 직장, 국소 투여 등을 포함한 다양한 경로를 통해 투여될 수 있다. 이러한 약학적 조성물에는 추가적으로 담체, 부형제 또는 희석제 등이 더 포함될 수 있으며, 포함될 수 있는 적합한 담체, 부형제 또는 희석제의 예로는 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리쓰리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로스, 메틸 셀룰로스, 비정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등을 들 수 있다. 또한, 본 발명의 약학적 조성물은 충전제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제, 방부제 등을 추가로 더 포함할 수도 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에서, "약제학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고, 종래의 치료제와 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물에서 항당뇨 활성을 갖는 성분의 유효량은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로는 체중 당 1 내지 5,000mg, 바람직하게는 100 내지 3,000mg을 매일 또는 격일 투여하거나 1일 1 내지 3회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나, 투여 경로, 질병의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다. 본 발명의 약학적 조성물은 다양한 경로를 통하여 대상에 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관 내(intra-cerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다. 본 발명에서 "투여"는 임의의 적절한 방법으로 환자에게 소정의 물질을 제공하는 것을 의미하며, 본 발명의 약학적 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 일반적인 모든 경로를 통하여 경구 또는 비경구 투여될 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물은 유효성분을 표적 세포로 전달할 수 있는 임의의 장치를 이용해 투여될 수도 있다. 본 발명에서 "대상"은, 특별히 한정되는 것은 아니지만, 예를 들어, 인간, 원숭이, 소, 말, 양, 돼지, 닭, 칠면조, 메추라기, 고양이, 개, 마우스, 쥐, 토끼 또는 기니아 피그를 포함하고, 바람직하게는 포유류, 보다 바람직하게는 인간을 의미한다.
바람직한 구체예로서, 본 발명의 항당뇨 조성물은 건강 기능 식품의 용도로서 적용될 수 있다.
본 발명의 항당뇨 활성이 우수한 유효성분을 포함하는 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강보조 식품류 등이 있고, 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 음료인 형태로 사용할 수 있다. 본 발명의 활성 성분은 일반적으로 전체 식품 중량의 0.01 내지 15중량%로 가할 수 있으며, 건강음료 조성물은 100 ml를 기준으로 0.02 내지 10g, 바람직하게는 0.3 내지 1g의 비율로 가할 수 있다. 본 발명의 건강 기능 식품은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 화합물을 함유하는 것 외에 식품학적으로 허용 가능한 식품보조 첨가제, 예컨대, 천연 탄수화물 및 다양한 향미제 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 예로는 포도당, 과당 등의 단당류, 말토오스, 수크로오스 등의 이당류 및 덱스트린, 시클로덱스트린 등의 다당류와 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리쓰리톨 등의 당알코올이 있다. 상기 향미제로는 타우마틴, 레바우디오시드 A, 글리시르히진, 사카린, 아스파르탐 등을 사용할 수 있다. 상기 향미제의 비율은 본 발명의 건강 기능 식품 100ml당 일반적으로 약 1 내지 20g, 바람직하게는 약 5 내지 12g을 사용한다. 상기 외에 본 발명의 건강 기능 식품은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물, 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 건강 기능 식품은 천연 과일 주스 및 과일 주스 음료 및 야채 음료 등의 제조를 위한 과육을 함유할 수도 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 본 발명의 상기 활성 분획물 100 중량부 당 0.01 내지 약 20중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
이하에서는 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 하기 실시예는 본 발명의 바람직한 일 구체예일 뿐이며, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예의 범위로 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
실시예 1: 꿀벌 사육, 유충, 번데기, 성충의 동결건조 분말 조제
꿀벌은 집단사회를 구성하며, 여왕벌, 일벌, 숫벌로 구성되어 있으며, 유충, 번데기, 성충 단계를 거치게 된다. 따라서, 본 실시예에서는 다양한 봉분으로부터 꿀벌의 유충, 번데기, 성충을 각각 회수하고, 이를 -20℃로 급속냉동하여 사멸시킨 다음, -50℃에서 동결건조하였으며, 동결건조물을 막자사발을 이용하여 분말로 제조하였다(도 1). 제조된 분말의 색차는 표 1에 나타내었으며, 성충 분말은 유충 및 번데기와는 달리 낮은 명도 및 황색도와 높은 적색도를 나타내어 다른 시료들과 확연히 구분되었다.
[표 1] 꿀벌의 유충, 번데기, 성충 분말의 색차 분석
실시예 2: 꿀벌 유충, 번데기, 성충 분말의 추출물 조제
실시예 1에서 제조된 꿀벌 유충, 번데기, 성충 분말을 대상으로 에탄올 추출물과 열수 추출물을 제조하였다. 에탄올 추출물의 경우, 각각의 시료에 대해 10배의 에탄올을 가하고, 상온에서 1회 추출한 후 추출액을 모아 필터링한 후, 감압 농축하여 분말로 제조하였다. 또한, 열수 추출물의 경우, 각각의 시료에 대해 10배의 증류수를 가하고, 100℃에서 1시간 추출한 후 상기와 동일한 방법으로 필터, 감압 농축하여 분말로 조제하였다.
실시예 3: 꿀벌 유충, 번데기, 성충 분말 추출물의 항당뇨 활성 평가
실시예 2에서 제조된 꿀벌 유충, 번데기 및 성충의 열수 및 에탄올 추출물을 대상으로 항당뇨 활성을 평가하였으며, in-vitro α-amylase 저해 활성, β-amylase 저해 활성 및 α-glucosidase 저해 활성을 평가하여 나타내었다.
먼저, α-amylase 저해 활성은 Lim 등이 보고한 방법(Lim, CS 등, 2005. J. Kor. Soc. Appl. Biol. Chem. 48: 103-108)을 수정하여 사용하였다. 시료 2.5μl와 50mM phosphate buffer(pH 6.8)로 희석한 α-amylase(0.25U/ml) 25μl를 혼합하여 37℃에서 10분간 1차 반응한 후, 0.5% soluble starch(Samchun Chemicals Co., Korea) 25μl를 가하여 37℃에서 10분간 2차 반응하였다. 이후, 2N acetic acid를 25μl를 가하여 반응을 정지시켰으며, 반응액에 0.75% KI/I2 용액 10μl를 가하여 발색하였다. 발색액은 540nm에서 흡광도를 측정하였으며, 각각의 실험은 3반복한 후 평균값을 구하여 다음의 식으로 저해율을 계산하였다.
저해율 (%) = 시료 첨가구 효소활성/대조구 첨가구 효소활성 x 100
또한, β-amylase(4-alpha-D-glucan maltohydrolase) 저해 활성은 시료 2.5μl와 50mM phosphate buffer(pH 6.8)로 희석한 α-amylase(0.25U/ml) 25μl를 혼합하여 37℃에서 10분간 1차 반응한 후, 0.5% soluble starch(Samchun Chemicals Co., Korea) 25μl를 가하여 37℃에서 10분간 2차 반응한 후 100℃에서 5분간 가열하여 반응을 정지시켰으며, 반응액에 150μl의 DNS(3,5-dinitrosalicylic acid, Sigma Co., st. Louis, USA) 용액을 가하여 100℃에서 5분간 가열하여 발색한 후 상온에서 방냉하였다. 발색액은 540nm에서 흡광도를 측정하여 저해율을 계산하였다.
저해율 (%) = [1-(시료 첨가구 효소활성/대조구 첨가구 효소활성)] x 100
마지막으로, α-glucosidase 저해 활성은 pNPG(p-nitrophenol glucoside; Sigma Co., USA)를 이용하여 평가하였으며, 생강 추출물 시료 2.5μl와 50mM Sodium acetate buffer(pH 5.6)로 희석한 α-glucosidase(0.25U/ml) 25μl를 혼합하여 37℃에서 10분간 1차 반응하고, 1mM pNPG 용액 25μl를 가하여 60℃에서 10분간 2차 반응하였다. 이후, 1M NaOH 25μl를 가하여 반응을 정지시키고, 405nm에서 흡광도를 측정하여 저해율을 계산하였다.
저해율 (%) = [1-(시료 첨가구 효소활성/대조구 첨가구 효소활성)] x 100
[표 2] 꿀벌 유충, 번데기 및 성충 추출물의 항당뇨 활성
그 결과, 표 2에 나타낸 바와 같이, 에탄올 추출물이 열수 추출물보다 항당뇨 활성이 전반적으로 우수하였으며, 특히, 유충의 열수 추출물과 에탄올 추출물에서 각각 우수한 α-glucosidase 저해 활성 및 α-amylase 저해 활성을 확인하였고, 번데기와 성충의 경우, 에탄올 추출물에서 우수한 α-amylase 저해 활성을 확인하였다.
실시예 4: 꿀벌 성충 추출물의 유기용매 분획물 제조 및 분획물의 성분 분석
상기 실시예 3의 실험 결과를 통해, 꿀벌 성충 열수 추출물과 에탄올 추출물을 대상으로 헥센, 에틸아세테이트, 부탄올로 순차적 유기용매 분획하였으며, 최종적으로 물 잔류물을 회수하였다. 에탄올 추출물과 열수 추출물 및 이들 추출물로부터 수득되는 유기용매 분획물들의 성분 분석으로 총 폴리페놀, 총 플라보노이드, 총 당 및 환원당 함량을 측정하였다. 총 폴리페놀 함량은 추출 검액 400μl에 50μl의 Folin-ciocalteau, 100μl의 Na2CO3 포화용액을 넣고 실온에서 1시간 방치한 후 725nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준시약으로는 tannic acid를 사용하였다. 총 플라보노이드 함량은 각각의 시료를 18시간 메탄올 교반 추출하고, 여과한 추출 검액 400μl에 90% diethylene glycol 4ml를 첨가하고 다시 1N NaOH 40μl를 넣고 37℃에서 1시간 반응 후 420nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준시약으로는 rutin을 사용하였다. 환원당은 DNS법으로, 총 당은 phenol-sulfuric acid법을 이용하여 정량하였다. 열수 추출물과 에탄올 추출물 및 이들의 유기용매 분획물의 분획 효율 및 성분 분석 결과는 표 3 및 표 4에 나타내었다.
[표 3] 꿀벌 성충 에탄올 추출물 및 이의 순차적 유기용매 분획물의 성분 분석
표 3에 나타낸 바와 같이, 꿀벌 성충 에탄올 추출물의 51.4%는 헥센 분획으로 이행되어, 성충 에탄올 추출물의 대부분이 지질 성분임을 알 수 있었으며, 추출물 중, 물 잔류물이 39.6%, 부탄올 분획물이 6.4%, 에틸아세테이트 분획물은 4.4%를 차지하였다. 분획물의 총 폴리페놀 및 총 플라보노이드 함량 측정 결과, 부탄올 분획에서 가장 높은 35.0mg/g 및 0.4mg/g을 나타내었으며, 총당 및 환원당 함량은 물 잔류물에서 가장 높은 157.0mg/g 및 183.2mg/g을 나타내었다.
[표 4] 꿀벌 성충 열수 추출물 및 이의 순차적 유기용매 분획물의 성분 분석
또한, 표 4에 나타낸 바와 같이, 꿀벌 성충 열수 추출물의 71.4%는 부탄올 분획, 24.0%는 물 잔류물로 이행되어, 열수 추출물의 대부분은 수용성 성분임을 예상할 수 있었다. 분획물의 총 폴리페놀 및 총 플라보노이드 함량 측정 결과, 에틸아세테이트 분획에서 가장 높은 54.7mg/g 및 6.3mg/g을 나타내었으며, 총당 및 환원당 함량은 부탄올 분획에서 가장 높은 202.4mg/g 및 205.5mg/g을 나타내었다.
실시예 5: 꿀벌 성충 추출물로부터 수득된 유기용매 분획물의 항당뇨 활성 평가
꿀벌 성충 에탄올 추출물 및 열수 추출물의 분획물들을 이용하여 실시예 3의 in-vitro α-amylase 저해 활성, β-amylase 저해 활성 및 α-glucosidase 저해 활성 평가와 동일한 방법으로 항당뇨 활성을 측정하고, 그 결과를 다음 표 5 및 표 6에 나타내었다.
[표 5] 꿀벌 성충 에탄올 추출물로부터 수득된 유기용매 분획물의 항당뇨 활성
그 결과, 표 5에 나타낸 바와 같이, 에탄올 추출물의 헥센 분획물, 에틸아세테이트 분획물 및 부탄올 분획물에서 모두 강력한 α-amylase 및 α-glucosidase 저해 활성을 확인하였으며, 특히, 헥센 분획물에서는 β-amylase 저해 활성도 매우 우수함으로 확인하였다. 따라서, 꿀벌 성충 에탄올 추출물의 헥센 분획물, 에틸아세테이트 분획물 및 부탄올 분획물은 제2형 당뇨병의 예방 및 치료에 이용 가능함을 예상할 수 있다.
[표 6] 꿀벌 성충 열수 추출물로부터 수득된 유기용매 분획물의 항당뇨 활성
또한, 표 6에 나타낸 바와 같이, 열수 추출물의 에틸아세테이트 분획물에서 강력한 α-amylase 및 α-glucosidase 저해 활성을 확인하였으며, 꿀벌 성충 열수 추출물의 에틸아세테이트 분획물은 제2형 당뇨병의 예방 및 치료에 이용 가능함을 예상할 수 있다.
실시예 6: 꿀벌 추출물 및 분획물의 혈장, 산 및 열 안정성 평가
상기 실시예 2 및 실시예 4에서 얻은 꿀벌 유충, 번데기 및 성충의 에탄올 추출물과 열수 추출물 및 성충의 에탄올 추출물과 열수 추출물로부터 분획되는 분획물들을 대상으로 항당뇨 활성에 대한 혈장 안정성, 열 안정성 및 산 안정성을 확인하였다. 상기 추출물 및 분획물들은 100℃에서 1시간 열 처리, pH 2(0.01M HCl)에서의 1시간 처리, 혈장에서 1시간 처리시에도 α-amylase, β-amylase 및 α-glucosidase 저해 활성의 심각한 소실 없이 우수한 활성을 유지하였다.
Claims (6)
- 꿀벌(Apis mellifera) 추출물을 유효성분으로 함유하는 당뇨병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 제 1항에 있어서, 상기 꿀벌 추출물은 꿀벌 유충의 열수 추출물 또는 에탄올 추출물인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
- 제 1항에 있어서, 상기 꿀벌 추출물은 꿀벌 번데기 또는 성충의 에탄올 추출물인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
- 제 1항에 있어서, 상기 꿀벌 추출물은 꿀벌 성충의 열수 추출물의 에틸아세테이트 분획물인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
- 제 1항에 있어서, 상기 꿀벌 추출물은 꿀벌 성충의 에탄올 추출물의 헥센 분획물, 에틸아세테이트 분획물 또는 부탄올 분획물인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
- 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 기재된 유효성분을 포함하는 당뇨병의 예방 또는 개선용 건강 기능 식품.
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| 2017년도 한국생명과학회 58회 정기총회 및 국제학술대회 포스터 P2-31. |
| 2017년도 한국생명과학회 58회 정기총회 및 국제학술대회 포스터 P2-33. |
| PLOS ONE, Vol. 13, No. 6, e0197071, pp. 1-17 (2018.06.05.)* * |
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