KR20200002886A - Egfr 양성 암의 치료를 위한 t 세포 재지시성 이중특이적 항체 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 CD3 및 EGFR에 동시에 결합하는 이중특이적 항체에 관한 것이다. 이러한 부류의 항체는 T 세포를 재지시하고 활성화된 T 세포와 EGFR 발현 종양 세포 사이에 면역 시냅스를 형성하여 EGFR 발현 종양 세포의 사멸 수준을 증가시킴으로써 EGFR 종양의 치료에 유용한 것으로 본 발명자들에 의해 입증되었다. 특히, 본 발명은 CD3xEGFR_SF1(서열번호 4, 5 및 6), CD3xEGFR_SF3(서열번호 7, 2 및 8), CD3xEGFR_SF4(서열번호 4, 5 및 9), CD3xEGFR_SD1(서열번호 1, 2 및 10) 및 CD3xEGFR_SD2(서열번호 11, 10 및 2)를 포함하는 그룹으로부터 선택된 CD3xEGFR 이중특이적 항체에 관한 것이다.
Description
본 발명은 CD3 및 EGFR에 동시에 결합하는 이중특이적 항체에 관한 것이다. 이러한 부류의 항체는 T 세포를 재지시하고, 활성화된 T 세포와 EGFR 발현 종양 세포 사이에 면역 시냅스를 형성하여 EGFR 발현 종양 세포의 사멸 수준을 증가시킴으로써 EGFR 종양의 치료에 유용한 것으로 본 발명자들에 의해 입증되었다.
많은 상피 유래 암 세포에 의해 과발현된 표피 성장 인자 수용체(EGFR)를 항-EGFR 모노클로날 항체(mAb)로 표적화하는 것은 그들의 성장을 억제하여 긍정적인 임상 결과를 초래하는 것으로 입증되었다.
암 면역 요법 또는 면역 종양학은 제4 항종양 양식이고, 성장 기간 후 일부 경우에 장려하고, 다른 경우에 임상적 효능에 관한 현저한 데이터를 경험하였다.
항-EGFR 항체로 치료된 환자의 임상 반응은 가변적이었지만, EGFR 발현의 가변성, 신생물 세포에서의 신호전달, 치료를 회피하기 위해 암 세포에 의해 사용된 적응성 메카니즘 또는 이러한 모든 요소의 가능한 일부 조합을 반영할 수 있다.
암 세포가 항-EGFR mAb 요법에 내성이 될 수 있는 하나의 잘 설명된 메커니즘은 포유류 ras 유전자 계열의 Kirsten ras(KRAS) 종양 유전자 상동체의 돌연변이에 의한 것이다. 체세포 KRAS 돌연변이는 백혈병, 결장직장암, 췌장암 및 폐암에서 높은 비율로 발견된다. KRAS 돌연변이는 결장직장암에서 승인된 항-EGFR mAb 치료제 파니투무맙(Vectibix®) 및 세툭시맙(Erbitux®)에 대한 매우 열악한 반응을 예측한다. 연구는 종양이 KRAS 유전자의 돌연변이 버전을 발현하는 환자가 세툭시맙 또는 파니투무맙에 반응하지 않을 것임을 나타낸다. KRAS 돌연변이의 출현은 결장직장암 및 다른 암에서 항-EGFR mAb 요법에 대한 후천적 내성의 빈번한 구동자이다.
EGFR 암 치료와 관련된 문제를 해결하기 위해, 본 발명자들은 EGFR 과발현 암을 치료하기에 적합하고 기존 요법의 문제를 극복하는 새로운 항-종양 약제 세트를 생성하였다.
본 발명은 CD3ε 및 EGFR 상의 에피토프에 결합하는 이중특이적 항체에 관한 것이다.
여기서, CD3ε 결합제는 바람직하게는 SP34 또는 OKT3이거나 이들로부터 유래된다.
여기서, EGFR 결합체는 바람직하게는 파니투무맙 및 세툭시맙이다.
본 발명에 따라서, CD3xEGFR 이중특이적 항체는 적어도 하나의 FAB 및 하나의 scFv 결합 부분을 포함한다.
특히, 본 발명은 항체, DARPin, 피노머(Fynomer), 아피머(Affimer), 가변성 림프구 수용체, 안티칼린, 나노피틴, 가변성 신규 항원 수용체(VNAR)와 같은 단백질 기반 표적 특이적 결합 분자로부터의 결합 부분에 관한 것이지만, 이들로 제한되지는 않는다.
특히, 결합 부분은 항체, 예를 들어, Fab, Fab', Fab'-SH, Fd, Fv, dAb, F(ab')2, scFv, Fcab, 이중특이적 단일 쇄 Fv 이량체, 디아바디, 트리아바디로부터 취하거나 유래된다. 바람직한 구현예에서, 작용제는 Fab, ScFv 및 dAb로부터 취하거나 유래된 결합 부분을 포함한다.
본 발명에 따라서, CD3xEGFR 이중특이적 항체는 서로 연결된 적어도 하나의 FAB 및 하나의 scFv 부분을 포함한다.
특히, 결합 부분은 동일하거나 상이한 항체 Fc 또는 이의 일부를 포함하는 스캐폴드에 유전적으로 융합될 수 있다. 본 발명의 이 양태에 따라서, 제1 전장 항체, 예를 들어, IgG는 본 발명에 따르는 CD3xEGFR 이중특이적 항체의 기초를 형성할 수 있고, 결합 부분의 제2 세트는 본 발명에 따르는 출발 항체 상에 그래프팅될 수 있다.
바람직하게는, 2개의 결합 부분은 제2 결합 부분이 면역글로불린 중쇄의 가변 부분에 원위 위치되도록 연결된다.
대안적으로, 2개의 결합 부분은 제2 결합 부분이 면역글로불린 중쇄의 가변 부분에 근위 위치되도록 연결된다.
바람직하게는, 2개의 결합 부분은 제2 결합 부분이 면역글로불린 경쇄의 가변 부분에 원위 위치되도록 연결된다.
대안적으로, 2개의 결합 부분은 제2 결합 부분이 면역글로불린 경쇄의 가변 부분에 근위 위치되도록 연결된다.
본 발명에 따라서, 2개의 연결된 결합 부분은 펩티드 링커에 의해 분리될 수 있다.
본 발명에 따라서, CD3xEGFR 이중특이적 항체는 CD3xEGFR_SF1 (서열번호 4, 5 및 6), CD3xEGFR_SF3 (서열번호 7, 2 및 8), CD3xEGFR_SF4 (서열번호 4, 5 및 9), CD3xEGFR_SD1 (서열번호 1, 2 및 10) 및 CD3xEGFR_SD2 (서열번호 11, 10 및 2)를 포함하는 그룹으로부터 선택된다.
본 발명의 또 다른 양태에 따라서, 인간 EGFR의 도메인 4에 결합하고, 서열번호 23 및 24, 서열번호 25 및 26, 서열번호 31 및 33, 서열번호 32 및 34, 서열번호 36 및 38, 서열번호 37 및 39의 그룹으로부터 선택되거나 이로부터 유래된 중쇄 및 경쇄 가변 서열을 포함하는 항체 또는 이의 단편에 관한 것이다.
본 발명은 또한 본 발명에 따르는 CD3xEGFR 이중특이적 항체의 약제로서의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 또한 본 발명에 따르는 CD3xEGFR 이중특이적 항체의 EGFR의 과발현에 의해 특성화되거나 악화되는 암 또는 다른 질환 치료용 약제로서의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 또한 유효량의 CD3xEGFR 이중특이적 항체를 환자에게 투여함을 포함하여, 암을 앓고 있는 환자를 치료하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 환자에게 유효량의 CD3xEGFR 이중특이적 항체 및 하나 이상의 다른 제제, 예를 들어, 소분자 또는 생물학적 약물을 투여하여 환자의 면역계를 추가로 조절하는 단계를 포함하여, 암을 앓고 있는 환자를 치료하는 방법에 관한 것이다. 이러한 제제의 예는 항-PD-1 항체 및 항종양성 소분자, 예를 들어, 멀티 키나제 억제제를 포함한다.
추가로, 본 발명은 본 발명에 따르는 CD3xEGFR 이중특이적 항체 및 또 다른 약제의 환자에의 공-투여에 관한 것으로서, 여기서 다른 약제는 상승 효과 또는 부가 효과를 갖는다.
본 발명의 다른 양태에 따라서, 본 발명에 따르는 CD3xEGFR 이중특이적 항체의 치료량을 이를 필요로 하는 환자에게 투여함으로써 EGFR 발현 암을 치료하는 방법이 제공된다.
본 발명의 다른 양태에 따라서, 약제로서 사용하기 위한 본 발명에 따르는 CD3xEGFR 이중특이적 항체가 제공된다.
본 발명의 다른 양태에 따라서, EGFR 발현 암의 치료로서 사용하기 위한 본 발명에 따르는 CD3xEGFR 이중특이적 항체가 제공된다.
본 발명의 다른 양태에 따라서, EGFR 발현 암은 제공된 하나 이상의 KRAS 또는 B-Raf 돌연변이를 추가로 포함한다.
달리 정의되지 않는 한, 본 발명과 관련하여 사용된 과학 및 기술 용어는 당업자에게 일반적으로 이해되는 의미를 가질 것이다. 또한, 문맥상 달리 요구되지 않는 한, 단수형은 복수를 포함하고 복수형은 단수를 포함할 것이다. 일반적으로, 본원에 기재된 세포 및 조직 배양, 분자 생물학, 및 단백질 및 올리고- 또는 폴리뉴클레오타이드 화학 및 혼성화와 관련하여 사용된 명명법 및 이의 기술은 당업계에 잘 알려져 있고 통상적으로 사용된다. 재조합 DNA, 올리고 뉴클레오타이드 합성, 및 조직 배양 및 형질 전환(예: 전기 천공, 리포펙션)을 위한 표준 기술이 사용된다. 효소 반응 및 정제 기술은 제조업자의 사양에 따라 또는 당업계에서 일반적으로 달성되거나 본원에 기재된 바와 같이 수행된다. 전술한 기술 및 절차는 일반적으로 당업계에 익히 공지된 통상적인 방법에 따라 그리고 본 명세서 전반에 걸쳐 인용되고 논의된 다양한 일반적이고 보다 구체적인 참고 문헌에 기재된 바와 같이 수행된다. 문헌(참조: Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989))을 참조한다. 본원에 기재된 분석 화학, 합성 유기 화학, 및 의약 및 약제학적 화학과 관련하여 사용된 명명법 및 이의 실험실 절차 및 기술은 당업계에 익히 공지되어 있고 통상적으로 사용되는 것들이다. 표준 기술이 화학 합성, 화학 분석, 약제학적 제제, 제형 및 전달 및 환자의 치료에 사용된다.
염기성 항체 구조 단위는 사량체를 포함하는 것으로 공지되어 있다. 각각의 사량체는 2개의 동일한 쌍의 폴리 펩티드 쇄로 구성되며, 각 쌍은 하나의 "경"쇄(약 25kDa) 및 하나의 "중"쇄(약 50 내지 70kDa)를 갖는다. 각 쇄의 아미노-말단 부분은 주로 항원 인식을 담당하는 약 100 내지 110개 이상의 아미노산의 가변 영역을 포함한다. 각 쇄의 카복시-말단 부분은 주로 이펙터 기능을 담당하는 불변 영역을 정의한다. 일반적으로, 인간으로부터 수득된 항체 분자는 분자에 존재하는 중쇄의 특성에 의해 서로 상이한 부류 IgG, IgM, IgA, IgE 및 IgD 중 어느 하나에 관한 것이다. 특정 부류는 또한 하위 부류(이소타입이라고도 함), 예를 들어, IgG1, IgG2 등을 갖는다. 또한, 인간에서, 경쇄는 카파 쇄 또는 람다 쇄일 수 있다.
본원에 사용된 용어 "모노클로날 항체"(MAb) 또는 "모노클로날 항체 조성물"은 독특한 경쇄 유전자 생성물 및 독특한 중쇄 유전자 생성물로 이루어진 항체 분자의 하나의 분자 종만을 함유하는 항체 분자의 집단을 지칭한다. 특히, 모노클로 날 항체의 상보성 결정 영역(CDR)은 집단의 모든 분자에서 동일하다. MAb는 그것에 대한 독특한 결합 친화도를 특징으로 하는 항원의 특정 에피토프와 면역 반응할 수 있는 항원 결합 부위를 함유한다.
용어 "항원 결합 부위" 또는 "결합 부위"는 항원 결합에 참여하는 면역글로불린 분자의 일부를 지칭한다. 항원 결합 부위는 중쇄("H") 및 경쇄("L")의 N-말단 가변("V") 영역의 아미노산 잔기에 의해 형성된다. "초가변 영역"으로 지칭되는 중쇄 및 경쇄의 V 영역 내에서 3개의 고도로 발산되는 스트레치가 "프레임워크 영역" 또는 "FR"로서 공지된 보다 보존된 플랭킹 스트레치 사이에 개재된다. 따라서, 용어 "FR"은 면역글로불린에서 초가변 영역 사이에서, 그리고 그에 인접하여 자연적으로 발견되는 아미노산 서열을 지칭한다. 항체 분자에서, 경쇄의 3개의 초 가변 영역 및 중쇄의 3개의 초가변 영역은 3차원 공간에서 서로에 대해 배치되어 항원-결합 표면을 형성한다. 항원 결합 표면은 결합된 항원의 3차원 표면에 상보적이고, 중쇄 및 경쇄 각각의 3개의 초가변 영역은 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR" 로서 지칭된다. 각 도메인에 대한 아미노산의 할당은 문헌[참조: Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 and 1991)), or Chothia & Lesk J. Mol. Biol.196:901-917 (1987), Chothia et al. Nature 342:878-883 (1989)]의 정의에 따른다.
본 개시의 융합 단백질의 단일 도메인 항체(sdAb) 단편 부분은 본원에서 표적화 폴리펩티드로서 본원에서 상호교환적으로 지칭된다.
본원에 사용된 용어 "에피토프"는 면역글로불린 또는 이의 단편 또는 T-세포 수용체에/이에 의해 특이적으로 결합할 수 있는 임의의 단백질 결정 인자를 포함한다. 용어 "에피토프"는 면역글로불린 또는 T-세포 수용체에/이에 의해 특이적으로 결합할 수 있는 임의의 단백질 결정 인자를 포함한다. 에피토프 결정 인자는 일반적으로 아미노산 또는 당 측쇄와 같은 분자의 화학적 활성 표면 그룹으로 구성되며, 일반적으로 특정 3차원 구조적 특성뿐만 아니라 특정 전하 특성을 갖는다. 해리 상수가 ≤ 1 mM, 예를 들어, 일부 구현예에서 ≤ 1 μM; 예를 들어, ≤ 100 nM, ≤ 10 nM 또는 ≤ 1 nM인 경우, 항체는 항원에 특이적으로 결합하는 것으로 언급된다.
본원에 사용된 용어 "면역학적 결합" 및 "면역학적 결합 특성"은 면역글로불린 분자와 면역글로불린이 특이적인 항원 사이에서 발생하는 유형의 비공유 상호작용을 지칭한다. 면역학적 결합 상호작용의 강도 또는 친화도는 상호작용의 해리 상수(KD)와 관련하여 표현될 수 있고, 여기서 더 작은 KD는 더 큰 친화도를 나타낸다. 선택된 폴리펩티드의 면역학적 결합 특성은 당업계에 익히 공지된 방법을 사용하여 정량화할 수 있다. 하나의 이러한 방법은 항원-결합 부위/항원 복합체 형성 및 해리 속도를 측정하는 것을 수반하며, 여기서 이들 속도는 복합체 파트너의 농도, 상호작용의 친화도 및 양 방향으로 속도에 동일하게 영향을 미치는 기하학적 파라미터에 의존한다. 따라서, "온 레이트 상수(on rate constant)"(kon) 및 "오프 레이트 상수(off rate constant)"(koff)는 모두 농도 및 결합 및 해리의 실제 속도의 계산에 의해 결정될 수 있다(참조: Nature 361:186-87 (1993)). koff/kon의 비율은 친화도에 관련되지 않은 모든 파라미터의 제거를 가능하게 하고, 해리 상수 KD와 동일하다(참조: 일반적으로 Davies et al. (1990) Annual Rev Biochem 59:439-473). 본 개시의 항체는 검정, 예를 들어, 방사성 리간드 결합 검정, 표면 플라스몬 공명(SPR), 유세포 분석 결합 검정, 또는 당업자에게 공지된 유사한 검정에 의해 측정된 바와 같이 평형 결합 상수(KD)가 ≤ 1mM이고, 일부 구현예에서 ≤ 1μM, ≤ 100nM, ≤10 nM 또는 ≤ 100 pM 내지 약 1pM인 경우 항원에 특이적으로 결합하는 것으로 알려져 있다.
본원에서 지칭된 용어 "단리된 단백질"은 cDNA, 재조합 RNA 또는 합성 기원의 단백질 또는 이들의 일부 조합을 의미하며, 이의 기원 또는 유도체화 공급원에 의해 "단리된 단백질"(1)은 자연에서 발견된 단백질과 관련되지 않고, (2) 동일한 공급원으로부터의 다른 단백질을 함유하지 않고, 예를 들어, 해양 단백질을 함유하지 않고, (3) 다른 종으로부터의 세포에 의해 발현되거나, (4) 자연에서 발생하지 않는다.
용어 "폴리펩티드"는 본원에서 폴리펩티드 서열의 천연 단백질, 단편 또는 유사체를 지칭하는 일반적인 용어로 사용된다. 따라서, 천연 단백질 단편 및 유사체는 폴리펩티드 속의 종이다.
대상에 적용되는 본원에 사용된 용어 "천연"은 대상이 자연에서 발견될 수 있다는 사실을 지칭한다. 예를 들어, 자연에서의 공급원으로부터 단리될 수 있고 실험실에서 사람에 의해 의도적으로 변형되지 않았거나 다르게는 천연인 유기체(바이러스 포함)에 존재하는 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오타이드 서열.
용어 "서열 동일성"은 2개의 폴리뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열이 비교 창에 걸쳐 동일하다(즉, 뉴클레오타이드-대-뉴클레오타이드 또는 잔기-대-잔기 기준)는 것을 의미한다. 용어 "서열 동일성의 백분율"은 비교 창에 대해 2개의 최적으로 정렬된 서열을 비교하고, 동일한 핵산 염기(예: A, T, C, G, U 또는 I) 또는 잔기가 두 서열에서 발생하여 매칭 위치의 수를 산출하는 위치의 수를 결정하고, 매칭 위치의 수를 비교 창 중 총 위치의 수(즉, 창 크기)로 나누고, 결과에 100을 곱하여 서열 동일성의 백분율을 산출함으로써 계산된다. 본원에 사용된 용어 "실질적 동일성"은 폴리뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열의 특성을 나타내며, 여기서 폴리뉴클레오타이드 또는 아미노산은 적어도 18개 뉴클레오타이드(6개 아미노산) 위치의 비교 창, 빈번하게 적어도 24 내지 48개 뉴클레오타이드(8 내지 16개 아미노산) 위치의 창에 대한 참조 서열과 비교하여 적어도 85%의 서열 동일성, 예를 들어, 적어도 90 내지 95%의 서열 동일성, 보다 일반적으로 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하고, 서열 동일성의 백분율은 참조 서열을 비교 창에 걸쳐 참조 서열의 총 20% 이하인 결실 또는 첨가를 포함할 수 있는 서열과 비교함으로써 계산된다. 참조 서열은 더 큰 서열의 부분집합일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 20개의 통상적인 아미노산 및 그들의 약어는 통상적인 사용법을 따른다. 문헌[참조: Immunology - A Synthesis (2nd Edition, E.S. Golub and D.R. Gren, Eds., Sinauer Associates, Sunderland7 Mass. (1991))]을 참조한다. 20개의 통상적인 아미노산의 입체이성체(예: D-아미노산), 비천연 아미노산, 예를 들어, α-,α-이치환된 아미노산, N-알킬 아미노산, 락트산 및 다른 비통상적인 아미노산이 또한 본 개시의 폴리펩티드의 적합한 성분일 수 있다. 비통상적인 아미노산의 예는 4 하이드록시프롤린, γ-카복시글루타메이트, ε-N,N,N-트리메틸리신, ε-N-아세틸리신, O-포스포세린, N-아세틸세린, N-포르밀메티오닌, 3-메틸히스티딘, 5-하이드록시리신, σ-N-메틸아르기닌 및 다른 유사한 아미노산 및 아미노산(예: 4-하이드록시프롤린)을 포함한다. 본원에 사용된 폴리펩티드 표기법에서, 표준 사용법 및 관례에 따라, 왼쪽 방향은 아미노 말단 방향이고 오른쪽 방향은 카복시-말단 방향이다.
유사하게, 달리 명시되지 않는 한, 단일 가닥 폴리뉴클레오타이드 서열의 왼쪽 말단은 5' 말단이고, 이중 가닥 폴리뉴클레오타이드 서열의 왼쪽 방향은 5' 방향으로서 지칭된다. 초기 RNA 전사체의 5' 내지 3' 첨가의 방향은 전사 방향으로서 지칭되고, RNA와 동일한 서열을 갖고 RNA 전사체의 5' 내지 5' 말단인 DNA 가닥 상의 서열 영역은 "상류 서열"로서 지칭되고, RNA와 동일한 서열을 갖고 RNA 전사체의 3' 내지 3' 말단인 DNA 가닥 상의 서열 영역은 "하류 서열"로 지칭된다.
폴리펩티드에 적용되는 바와 같이, 용어 "실질적 동일성"은, 예를 들어, 디폴트 갭 중량을 사용하는 프로그램 GAP 또는 BESTFIT에 의해 최적으로 정렬될 때 2개의 펩티드 서열이 적어도 80%의 서열 동일성, 예를 들어, 적어도 90%의 서열 동일성, 적어도 95% 서열 동일성 또는 적어도 99% 서열 동일성을 공유한다는 것을 의미한다.
일부 구현예에서, 동일하지 않은 잔기 위치는 보존적 아미노산 치환에 의해 상이하다.
보존적 아미노산 치환은 유사한 측쇄를 갖는 잔기의 상호교환성을 지칭한다. 예를 들어, 지방족 측쇄를 갖는 아미노산의 그룹은 글리신, 알라닌, 발린, 류신 및 이소류신이고; 지방족-하이드록실 측쇄를 갖는 아미노산의 그룹은 세린 및 트레오닌이고; 아미드-함유 측쇄를 갖는 아미노산의 그룹은 아스파라긴 및 글루타민이고; 방향족 측쇄를 갖는 아미노산의 그룹은 페닐알라닌, 티로신 및 트립토판이고; 염기성 측쇄를 갖는 아미노산의 그룹은 리신, 아르기닌 및 히스티딘이고; 황 함유 측쇄를 갖는 아미노산의 그룹은 시스테인 및 메티오닌이다. 적합한 보존적 아미노산 치환 그룹은 발린-류신-이소류신, 페닐알라닌-티로신, 리신-아르기닌, 알라닌 발린, 글루탐산-아스파르트산 및 아스파라긴-글루타민이다.
본원에서 논의된 바와 같이, 항체 또는 면역글로불린 분자의 아미노산 서열의 작은 변이는 본 발명에 포함되는 것으로 고려되며, 단 아미노산 서열의 변이는 적어도 75%, 예를 들어, 적어도 80%, 90%, 95% 또는 99%를 유지한다. 특히, 보존적 아미노산 치환이 고려된다. 보존적 치환은 측쇄와 관련된 아미노산 계열 내에서 발생하는 것들이다. 유전자 코딩된 아미노산은 일반적으로 다음 계열로 나뉜다: (1) 산성 아미노산은 아스파르테이트, 글루타메이트이고; (2) 염기성 아미노산은 리신, 아르기닌, 히스티딘이고; (3) 비극성 아미노산은 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판이고, (4) 하전되지 않은 극성 아미노산은 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 시스테인, 세린, 트레오닌, 티로신이다. 친수성 아미노산은 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르테이트, 글루타민, 글루타메이트, 히스티딘, 리신, 세린 및 트레오닌을 포함한다. 소수성 아미노산은 알라닌, 시스테인, 이소류신, 류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 트립토판, 티로신 및 발린을 포함한다. 아미노산의 다른 계열은 (i) 지방족-하이드록시 계열인 세린 및 트레오닌; (ii) 아미드 함유 계열인 아스파라긴 및 글루타민; (iii) 지방족 계열인 알라닌, 발린, 류신 및 이소류신; 및 (iv) 방향족 계열인 페닐알라닌, 트립토판 및 티로신을 포함한다. 예를 들어, 이소류신 또는 발린에 의한 류신의, 글루타메이트에 의한 아스파르테이트의, 세린에 의한 트레오닌의 단리된 치환, 또는 구조적으로 관련된 아미노산에 의한 아미노산의 유사한 치환은, 특히 치환이 프레임워크 부위 내에 아미노산을 포함하지 않는 경우 생성되는 분자의 결합 또는 특성에 주요 효과를 갖지 않을 것으로 예상하는 것이 합리적이다. 아미노산 변화가 기능적 펩티드를 초래하는지의 여부는 폴리펩티드 유도체의 특이적 활성을 검정함으로써 용이하게 결정될 수 있다. 검정은 본원에서 상세하게 기재되어 있다. 항체 또는 면역글로불린 분자의 단편 또는 유사체는 당업자에 의해 용이하게 제조될 수 있다. 단편 또는 유사체의 적합한 아미노- 및 카복시-말단은 기능적 도메인의 경계 근처에서 발생한다. 구조적 및 기능적 도메인은 뉴클레오타이드 및/또는 아미노산 서열 데이터를 공개 또는 독점 서열 데이터베이스와 비교함으로써 동정될 수 있다. 일부 구현예에서, 공지된 구조 및/또는 기능의 다른 단백질에서 발생하는 서열 모티프 또는 예측된 단백질 형태 도메인을 동정하기 위해 컴퓨터화된 비교 방법이 사용된다. 공지된 3차원 구조로 접히는 단백질 서열을 동정하는 방법이 공지되어 있다(참조: Bowie et al. Science 253:164 (1991)). 따라서, 상기 실시예는 당업자가 본 발명에 따라 구조적 및 기능적 도메인을 정의하는데 사용될 수 있는 서열 모티프 및 구조적 형태를 인식할 수 있음을 입증한다.
적합한 아미노산 치환은 (1) 단백질 분해에 대한 감수성을 감소시키고, (2) 산화에 대한 감수성을 감소시키고, (3) 단백질 복합체를 형성하기 위한 결합 친화도를 변경하고, (4) 결합 친화도를 변경하고, (4) 이러한 유사체의 다른 물리화학적 또는 기능적 특성을 부여하거나 변형시키는 것들이다. 유사체는 천연 펩티드 서열 이외의 서열의 다양한 뮤테인을 포함할 수 있다. 예를 들어, 단일 또는 다수의 아미노산 치환(예: 보존적 아미노산 치환)은 천연 서열에서(예: 분자간 접촉을 형성하는 도메인(들) 외부의 폴리펩티드의 부분에서) 이루어질 수 있다. 보존적 아미노산 치환은 부모 서열의 구조적 특성을 실질적으로 변화시키지 않아야 한다(예를 들어, 치환 아미노산은 부모 서열에서 발생하는 나선을 파괴하거나 부모 서열을 특성화하는 다른 유형의 2차 구조를 방해하지 않아야 한다). 당업계 인식된 폴리펩티드 2차 및 3차 구조의 예는 문헌[참조: Proteins, Structures and Molecular Principles(Creighton, Ed., W. H. Freeman and Company, New York (1984)); Introduction to Protein Structure (C. Branden and J. Tooze, eds., Garland Publishing, New York, N.Y. (1991)); and Thornton et al. Nature 354:105 (1991)]에 기재되어 있다.
본원에 사용된 용어 "폴리펩티드 단편"은 아미노 말단 및/또는 카복시 말단 결실을 갖지만, 나머지 아미노산 서열이, 예를 들어, 전장 cDNA 서열로부터 추론된 천연 서열 중 상응하는 위치와 동일한 폴리펩티드를 지칭한다. 단편은 전형적으로 적어도 5, 6, 8 또는 10개의 아미노산 길이, 예를 들어, 적어도 14개의 아미노산 길이, 적어도 20개의 아미노산 길이, 적어도 50개의 아미노산 길이 또는 적어도 70개의 아미노산 길이이다. 본원에 사용된 용어 "유사체"는 추론된 아미노산 서열의 일부와 실질적인 동일성을 갖는 적어도 25개의 아미노산의 세그먼트로 구성되고 적합한 결한 조건하에 CD47에 특이적으로 결합하는 폴리펩티드를 지칭한다. 전형적으로, 폴리펩티드 유사체는 천연 서열과 관련하여 보존적 아미노산 치환 (또는 첨가 또는 결실)을 포함한다. 유사체는 전형적으로 적어도 20개의 아미노산 길이, 예를 들어, 적어도 50개의 아미노산 길이 또는 그 이상이고, 종종 전장 천연 폴리펩티드만큼의 길이일 수 있다.
펩티드 유사체는 일반적으로 약제 산업에서 주형 펩티드의 특성과 유사한 특성을 갖는 비-펩티드 약물로서 사용된다. 이러한 유형의 비-펩티드 화합물은 "펩티드 모방체" 또는 "펩티도미메틱(peptidomimetics)"으로 칭명된다[참조: Fauchere, J. Adv. Drug Res.15:29 (1986), Veber and Freidinger TINS p.392 (1985); and Evans et al. J. Med. Chem.30:1229 (1987)]. 이러한 화합물은 종종 컴퓨터화된 분자 모델링의 도움으로 개발된다. 치료적으로 유용한 펩티드와 구조적으로 유사한 펩티드 모방체는 동등한 치료 또는 예방 효과를 생성하는데 사용될 수 있다. 일반적으로, 펩티도미메틱은 인간 항체와 같은 패러다임 폴리펩티드(즉, 생화학적 특성 또는 약리학적 활성을 갖는 폴리펩티드)와 구조적으로 유사하지만, 당업계에 익히 공지된 방법에 의해 -- CH2NH--, --CH2S-, --CH2-CH2--, --CH=CH-(시스 및 트랜스), --COCH2--, CH(OH)CH2-- 및 -CH2SO--로 이루어진 그룹으로부터 선택된 연결로 임의로 치환된 하나 이상의 펩티드 연결을 갖는다. 동일한 유형의 D-아미노산(예: L-리신 대신에 D-리신)에 의한 컨센서스 서열의 하나 이상의 아미노산의 체계적 치환을 사용하여 보다 안정한 펩티드를 생성할 수 있다. 또한, 컨센서스 서열 또는 실질적으로 동일한 컨센서스 서열 변이를 포함하는 구속된 펩티드는 당업계에 공지된 방법(참조: Rizo and Gierasch Ann. Rev. Biochem.61:387 (1992))에 의해; 예를 들어, 펩티드를 사이클릭화하는 분자내 디설파이드 브릿지를 형성할 수 있는 내부 시스테인 잔기를 첨가함으로써 생성될 수 있다.
용어 "제제"는 화학적 화합물, 화학적 화합물의 혼합물, 생물학적 거대 분자 및/또는 생물학적 물질로부터 제조된 추출물을 나타내기 위해 본원에 사용된다.
본원에서 사용된 용어 "표지" 또는 "표지된"은, 예를 들어, 방사성 표지된 아미노산의 도입 또는 마킹된 아비딘(예: 광학적 또는 열량 측정법에 의해 검출될 수 있는 형광성 마커 또는 효소 활성을 함유하는 스트렙타비딘)에 의해 검출될 수 있는 비오티닐 잔기의 폴리펩티드에의 부착에 의해 검출가능한 마커의 도입을 지칭한다. 특정 상황에서, 표지 또는 마커는 또한 치료적일 수 있다. 폴리펩티드 및 당단백질을 표지하는 다양한 방법이 당업계에 공지되어 있으며 사용될 수 있다. 폴리펩티드에 대한 표지의 예는 다음을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다: 방사성 동위원소 또는 방사성 핵종(예: 3H, 14C, 15N, 35S, 90Y, 99Tc, 111In, 125I, 131I), 형광성 표지(예: FITC, 로다민, 란타나이드 형광체), 효소 라벨(예: 서양 고추냉이 퍼옥시다제, β-갈락토시다제, 루시페라제, 알칼리성 포스파타제), 화학 발광, 비오티닐 그룹, 이차 리포터(예: 류신 지퍼 쌍 서열, 이차 항체의 결합 부위, 금속 결합 도메인, 에피토프 태그)에 의해 인식되는 소정의 폴리펩티드 에피토프. 일부 구현예에서, 표지는 잠재적 입체 장애를 감소시키기 위해 다양한 길이의 스페이서 아암에 의해 부착된다. 본원에 사용된 용어 "약제학적 제제 또는 약물"은 환자에게 적절하게 투여될 때 목적하는 치료 효과를 유도할 수 있는 화학적 화합물 또는 조성물을 지칭한다.
용어 "항신생물제"는 인간에서 신생물, 특히 암종, 육종, 림프종 또는 백혈병과 같은 악성 (암성) 병변의 발달 또는 진행을 억제하는 기능적 특성을 갖는 제제를 지칭하기 위해 본원에 사용된다. 전이의 억제는 종종 항신생물제의 특성이다.
본원에 사용된 용어 "치료하다", "치료하는", "치료" 등은 이와 관련된 장애 및/또는 증상을 감소시키고/시키거나 개선시키는 것을 지칭한다. "경감시키다" 및/또는 "경감시키는"이란, 예를 들어, 암과 같은 질환의 발달 또는 진행을 감소시키고, 억제하고, 약화시키고, 감소시키고, 정지시키고/시키거나 안정화시키는 것을 의미한다. 배제되지는 않지만, 장애 또는 상태를 치료하는 것은 이와 관련된 장애, 상태 또는 증상이 완전히 제거될 필요가 없다는 것이 이해될 것이다.
본원의 다른 화학 용어는 문헌[참조: The McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms (Parker, S., Ed., McGraw-Hill, San Francisco (1985))]에 예시된 바와 같이, 당업계의 통상적인 사용법에 따라 사용된다.
본원에 사용된 "실질적으로 순수한"은 대상 종이 존재하는 우세한 종을 의미하고(즉, 몰 기준으로, 조성물에서 임의의 다른 개별 종보다 더 풍부하다), 일부 구현예에서, 실질적으로 정제된 분획은 대상 종이 존재하는 모든 거대분자 종의 적어도 약 50%(몰 기준)를 포함하는 조성물이다.
일반적으로, 실질적으로 순수한 조성물은 조성물에 존재하는 모든 거대분자 종의 약 80% 이상, 예를 들어, 약 85%, 90%, 95% 및 99% 이상을 포함할 것이다. 일부 구현예에서, 대상 종은 조성물이 본질적으로 단일 거대분자 종으로 구성되는 필수 균질성으로 정제된다(오염물 종은 통상적인 검출 방법에 의해 조성물에서 검출될 수 없다).
본 개시에서, "포함한다", "포함하는", "함유하는", "갖는" 등은 미국 및/또는 유럽 특허법에서 그들에게 부여된 의미를 가질 수 있고, "포함한다", "포함하는" 등을 의미할 수 있고; 용어 "본질적으로 구성되는" 또는 "본질적으로 구성된다"는 마찬가지로 미국 특허법에 규정된 의미를 가지며, 이러한 용어는 개방형이며, 인용된 것의 기본적이거나 신규한 특성이 인용된 것 이상의 존재에 의해 변화되지 않지만 종래 기술 구현예를 배제하는 한, 인용된 것 이상의 존재를 가능하게 한다.
"유효량"은 치료되지 않은 환자에 비해 질환의 증상을 개선하는데 필요한 양을 의미한다. 질환의 치료적 치료를 위해 본 발명을 실시하는데 사용되는 활성 화합물(들)의 유효량은 투여 방식, 연령, 체중 및 대상체의 일반적인 건강에 따라 달라진다. 궁극적으로, 주치의 또는 수의사는 적절한 양 및 투여 요법을 결정할 것이다. 이러한 양은 "유효한" 양으로서 지칭된다.
"대상체"는 소, 말, 개, 설치류, 양, 영장류, 낙타 또는 고양이과 같은 인간 또는 비인간 포유동물을 포함하지만 이에 제한되지 않는 포유동물을 의미한다.
본원에 사용된 용어 "투여하는"은 치료제를 이러한 제제로의 치료를 필요로하는 대상체에게 옮기고, 전달하고, 도입하거나 수송하는 임의의 방식을 지칭한다. 이러한 방식은 경구, 국소, 정맥내, 복강내, 근육내, 피내, 비강내 및 피하 투여를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.
다음은 도면의 간단한 요약이다.
도 1: 다양한 상이한 BEAT 구조로 조립된 파니투무맙 항-EGFR 결합제(검정) 및 인간화 SP34 항-CD3 결합제(회색).
도 2: 막-결합된 EGFR을 발현하는 BAF 세포에서 3A6 및 10E6 하이브리도마 후보의 유세포 분석. 이 도면은 BAF 세포 상에서 발현된 막-결합된 EGFR에 대한 부모 3A6 및 10E6 하이브리도마 상청액의 FACS 프로파일을 도시한다. 두 하이브리도마 클론으로부터 수거된 100㎕를 106 세포/ml로 희석된 100ul의 EGFR-형질감염된 BAF 세포와 함께 배양하였다. 음성 대조군으로서, 정제된 마우스 IgG 이소타입은 10㎍/㎖로 희석되어 사용되었다. 항체 결합은 염소 항-마우스 IgG-PE로 검출시켰다.
도 3: 3A6A12B5 및 10E6F5는 EGFR 수용체의 세포외 도메인 IV에 특이적으로 결합한다. 이 도면은 정제된 3A6A12F5 및 10E6F5 하이브리도마 서브클론의 다수의 농도(10 내지 0.01㎍/㎖ 범위)가 고정화된 재조합 가용성 EGFR(A) 또는 EGFR-Her3 키메라 분자(B 및 C) 또는 EGFR의 단일 도메인 IV(D)에 대해 시험되었던 ELISA 결과를 도시한다. Vectibix®는 또한 검정에서 시험되었다.
도 4: CD3-EGFR_5 및 CD3-EGFR_8은 EGFR + A549 표적 세포의 사멸 활성을 나타낸다. EGFR + A549 세포(표적 세포, T)에 대한 CD3-재지시된 사멸 검정은 48시간 동안 10:1의 E:T 비율로 이펙터 세포(E)로서 3개의 건강한 공여체의 PBMC를 사용하여 수행되었다. 히스토그램은 3명의 개체 공여체로부터 계산된 특정 사멸의 평균 백분율을 보여준다. 2개의 BEAT 분자를 검정에서 10nM로 사용하였다.
도 5: (A) 키메라 3A6 항체에 대한 KD 측정. (B) 키메라 10E6 항체에 대한 KD 측정.
도 6: (A) 10E6-최적 적합 항체에 대한 KD 측정. (B) 10E6-안정한 항체에 대한 KD 측정.
도 7: (A) 3A6 키메라 항체에 의한 결합 테스트의 센서그램, (B) 10E6 키메라 항체에 의한 결합 테스트의 센서그램. (C) 폴리클로날 염소 항-EGFR 항체를 사용하는 제어 실험의 센서그램.
도 8: (A) 10E6-최적 적합 항체에 대한 서모그램. 제1 피크는 IgG1 CH2-CH3 도메인에 상응하고, 71.7℃의 Tm을 나타내고, 제2 피크는 Fab에 상응한다. (B) 10E6-안정한 항체에 대한 서모그램. 제1 피크는 IgG1 CH2-CH3 도메인에 상응하고, 71.8℃의 Tm을 나타내고, 제2 피크는 Fab에 상응한다.
도 9: CD3xEGFR_1은 A549 종양에서 효능이 없다.
도 10: CD3xEGFR-SF1 및 CD3xEGFR-SF3은 A549 종양에서 동일한 효능을 갖는다.
도 11: CD3xEGFR-SF3은 SNU-216 종양에서 벡티빅스보다 더 우수한 효능을 나타낸다.
도 12: 이종 이식 모델에서 CD3xEGFR-SF3 항-종양 활성에 대한 덱사마타손의 영향. (A) 그래프는 평균 종양 크기(mm3) ± SEM을 나타낸다. (B) 그래프는 37일째에 마우스당 종양 성장을 나타낸다.
도 13: EGFR(A) 및 CD3(B)에 대한 간단한 결합 ELISA 포맷 개략도.
도 14: 이중 결합 ELISA 포맷 개략도.
도 15: 간단한 EGFR 결합 ELISA에 의한 마우스 혈청에서 CD3xEGFR-SF3의 검출.
도 16: 간단한 CD3 결합 ELISA에 의한 마우스 혈청에서 CD3xEGFR-SF3의 검출.
도 17: 이중 CD3 및 EGFR 결합 ELISA에 의한 마우스 혈청에서 CD3xEGFR-SF3의 검출.
도 18: 스프라그-다우리 래트 혈청에서 CD3xEGFR-SF3의 약동학적 프로파일. CD3xEGFR-SF3의 약동학을 1mg/kg 체중의 용량으로 단일 정맥 주사 후 수컷 스프라그-다우리 래트(n = 4)에서 평가하였다. 약동학(PK) 평가를 위한 혈액 샘플을 42일의 기간 동안(6주) 투약 후 0.25, 1, 6, 24, 48, 96, 168, 336, 530, 672, 840 및 1008시간의 미리 지정된 시점에서 수집하였다. 이들 혈청 샘플에서 CD3xEGFR-SF3의 농도를 적합한 ELISA 방법을 사용하여 정량화하였다. 시험된 4마리 동물을 나타내는 데이터(N = 1).
도 19. ELISA에 의한 CD3xEGFR-SF3 결합의 검출. CD3xEGFR-SF3 및 대조군 항체의 용량 반응을 코팅된 인간 CD3-Fc(huCD3-Fc, A), 인간 EGFR 도메인 I-IV His-태그(huEGFR-His; B) 또는 huEGFR-His(C) 상에서 배양한 다음, HRP(A 및 B)와 커플링된 항-인간 IgG Fab 또는 huCD3-비오틴에 이어서 HRP-커플링된 스트렙타비딘(C)으로 검출했다. 그래프는 각 치료에 대한 S자형 용량-반응 결합 곡선(450nM에서의 흡광도)을 나타낸다. 각 데이터 포인트는 3개의 독립적인 복제물로부터 중복 값의 평균 ± SEM이다.
도 20. 유세포 분석에 의한 CD3xEGFR-SF3 결합의 검출. CD3xEGFR-SF3 및 대조군 항체의 용량 반응을 PBMCS(A-C) 또는 편평 암 세포주 NCI-H1703(D) 상에서 배양하고, PE-표지된 항-인간 IgG (Fc-γ)로 검출하였다. PBMC의 경우, 세포는 또한 항-CD4 또는 항-CD8 항체로 표지화했다. 그래프는 각 치료에 대한 평균 형광 강도(MFI)의 비선형 S자형 회귀 결합 곡선을 나타낸다. 각 데이터 포인트는 3개의 독립적인 복제물로부터 중복값의 평균 ± SEM이다.
도 21. CD3xEGFR-SF3은 EGFR-발현 인간 암 세포주의 재지시된 용해를 유도한다. CD3xEGFR-SF3 또는 대조군 항체의 용량 반응의 존재하에 표적 암 세포(T) 및 이펙터 세포(E; PBMC)를 1:10의 E:T 비로 배양하였고, 암 세포의 재지시된 용해를 세포독성 검정(MTS)에 의해 결정했다. EC50 값을 특정 사멸의 S자형 용량-반응 곡선으로부터 추출하였다. 오차 막대는 평균 ± SEM을 나타낸다. 세포주 재지시된 용해는 통계적으로 상이하였다(일원 ANOVA; F = 5,6; p <0.0001).
도 22. CD3xEGFR-SF3은 낮은 항체-의존적 세포-매개 세포독성 잠재력을 갖는다. CD3xEGFR의 항체-의존적 세포-매개 세포독성(ADCC)을 EGFR + 암종 세포주 A-431 및 A549(A)뿐만 아니라 CD3 + HPB-ALL 세포(B)에서 평가하고, 특정 사멸의 S자형 용량-반응 곡선으로부터 추출된 EC50 값으로 표시된다. 오차 막대는 두개의 독립적인 실험에서 평균 ± SEM을 나타낸다. 치료의 효과는 EGFR + 암종 세포(최소 제곱 모델, F = 29, p <0.0001) 및 CD3 + HPB-ALL 세포(T 테스트, t = 3, p <0.05)에 대해 통계적으로 유의했다. 통계적으로 유의한 차이(p <0.05)는 별표(*)로 표시된다.
도 23. CD3xEGFR-SF3은 보체 의존적 세포독성을 갖지 않는다. CD3 + HPB-ALL 세포(B)뿐만 아니라 EGFR + 암종 세포 A549(A)에서 특이적 보체-의존적 세포독성(CDC)이 평가되었고, 특이적 CDC의 S자형 용량-반응 곡선이 표시된다.
도 24. PBMC의 증식에 대한 CD3xEGFR-SF3의 효과. 증가하는 용량의 CD3xEGFR 또는 대조군의 존재하에 PBMC를 48시간 동안 배양했다. 그래프는 6개의 독립적인 실험으로부터 3H-티미딘 혼입 결과를 나타낸다. AE042, P1069 및 TRS는 상이한 배치의 CD3xEGFR-SF3 및 0.0005, 0.005, 0.05, 0.5 및 5의 농도를 ㎍/ml로 나타낸다. 다른 치료에서, "c"는 코팅된 것을 나타내고, "s"는 가용성을 나타낸다. 오차 막대는 평균 ± SEM을 나타낸다.
도 25. PBMC의 증식에 대한 CD3xEGFR-SF3의 효과의 통계적 분석. 도 24의 데이는 적합한 최소 제곱 모델에 이어 던넷 비교(Dunnett's comparison)(α = 0.05)로 분석하여 mAb 비함유 대조군(A) 및 이소타입 대조군(B)에 대한 평균을 비교했다. 평균의 유의한 차이는 결정 한계를 벗어난 바늘 막대로 표시된다(각 치료에 대해 95% CI 간격; 회색 영역).
도 26. CD3xEGFR-SF3에 대한 비특이적 CD4+ T 세포 활성화. 증가하는 용량의 CD3xEGFR 또는 대조군의 존재하에 PBMC를 24시간 또는 48시간 동안 배양했다. CD4+ T 세포의 활성화는 유세포 분석에 의해 활성화 마커 CD69의 발현으로서 측정되었다. AE042, P1069 및 TRS는 상이한 배치의 CD3xEGFR-SF3 및 0.0005, 0.005, 0.05, 0.5 및 5의 농도를 ㎍/ml로 나타낸다. 다른 치료의 경우, "c"는 코팅된 것을 나타내고, "s"는 가용성을 나타낸다. 오차 막대는 6개의 독립적인 실험에서 평균 ± SEM을 나타낸다.
도 27. CD3xEGFR-SF3과 mAb 부재 조건 사이의 비특이적 CD4+ T 세포 활성화의 통계적 비교. 도 26의 데이터는 적합한 최소 제곱 모델에 이어 던넷 비교(α = 0.05)로 분석하여 mAb 비함유 대조군에 대해 24시간(A) 및 48시간(B) 평균을 비교했다. 평균의 유의한 차이는 결정 한계를 벗어난 바늘 막대로 표시된다(각 치료에 대한 95% CI 간격; 회색 영역).
도 28. CD3xEGFR-SF3과 이소타입 대조군 사이의 비특이적 CD4+ T 세포 활성화의 통계적 비교. 도 26의 데이터는 적합한 최소 제곱 모델에 이어 던넷 비교(α = 0.05)로 분석하여 이소타입 대조군에 대해 24시간(A) 및 48시간(B)에 평균을 비교했다. 평균의 유의한 차이는 결정 한계를 벗어난 바늘 막대로 표시된다(각 치료에 대한 95% CI 간격; 회색 영역).
도 29. CD3xEGFR-SF3에 대한 비특이적 CD8+ T 세포 활성화. 증가하는 용량의 CD3xEGFR-SF3 또는 대조군의 존재하에 PBMC를 24시간 또는 48시간 동안 배양했다. CD8+ T 세포의 활성화는 유세포 분석에 의해 활성화 마커 CD69의 발현으로서 측정되었다. AE042, P1069 및 TRS는 상이한 배치의 CD3xEGFR-SF3 및 0.0005, 0.005, 0.05, 0.5 및 5의 농도를 ㎍/ml로 나타낸다. 다른 치료에서, "c"는 코팅된 것을 나타내고, "s"는 가용성을 나타낸다. 오차 막대는 6개의 독립적인 실험에서 평균 ± SEM을 나타낸다.
도 30. CD3xEGFR-SF3과 mAb 부재 조건 사이의 비특이적 CD8+ T 세포 활성화의 통계적 비교. 도 29의 데이터는 적합한 최소 제곱 모델에 이어 던넷 비교(α = 0.05)로 분석하여 mAb 비함유 대조군에 대해 24시간(A) 및 48시간(B)에 평균을 비교했다. 평균의 유의한 차이는 결정 한계를 벗어난 바늘 막대로 표시된다(각 치료에 대한 95% CI 간격; 회색 영역).
도 31. CD3xEGFR-SF3과 이소타입 대조군 사이의 비특이적 CD8+ T 세포 활성화의 통계적 비교. 도 29의 데이터는 적합한 최소 제곱 모델에 이어 던넷 비교(α = 0.05)로 분석하여 이소타입 대조군에 대해 24시간(A) 및 48시간(B)에 평균을 비교했다. 평균의 유의한 차이는 결정 한계를 벗어난 바늘 막대로 표시된다(각 치료에 대한 95% CI 간격; 회색 영역).
도 32. 24시간에서 CD3xEGFR-SF3에 대한 비특이적 T 세포 사이토카인 반응. 증가하는 용량의 CD3xEGFR-SF3 또는 대조군의 존재하에 PBMC를 24시간 동안 배양하고, 방출된 IL-2, IL-6, TNF-α 및 IFN-γ의 수준을 상청액에서 Luminex에 의해 측정하였다. AE042 및 P1069는 상이한 배치의 CD3xEGFR-SF3 및 0.0005, 0.005, 0.05, 0.5 및 5의 농도를 ㎍/ml로 나타낸다. 다른 치료의 경우, "c"는 코팅된 것을 나타내고, "s"는 가용성을 나타낸다. 오차 막대는 6개의 독립적인 실험에서 평균 ± SEM을 나타낸다.
도 33. 24시간에서 CD3xEGFR-SF3과 mAb 부재 조건 사이의 비특이적 T 세포 사이토카인 반응의 통계적 비교. 도 32의 데이터는 적합한 최소 제곱 모델에 이어 던넷 비교(α= 0,05)로 분석하여 IL-2(a), IL-6(b), IFN-γ(c) 및 TNF-α(d)의 mAb 비함유 대조군에 대해 평균을 비교했다. 평균의 유의한 차이는 결정 한계를 벗어난 바늘 막대로 표시된다(각 치료에 대한 95% CI 간격; 회색 영역).
도 34. 24시간에서 CD3xEGFR-SF3과 이소타입 대조군 사이의 비특이적 T 세포 사이토카인 반응의 통계적 비교. 도 32의 데이터는 적합한 최소 제곱 모델에 이어 던넷 비교(α= 0,05)로 분석하여 IL-2(a), IL-6(b), IFN-γ(c) 및 TNF-α(d)의 이소타입 대조군에 대해 평균을 비교했다. 평균의 유의한 차이는 결정 한계를 벗어난 바늘 막대로 표시된다(각 치료에 대한 95% CI 간격; 회색 영역).
도 35. 48시간에서 CD3xEGFR-SF3에 대한 비특이적 T 세포 사이토카인 반응. 증가하는 용량의 CD3xEGFR-SF3 또는 대조군의 존재하에 PBMC를 48시간 동안 배양하였고, 방출된 IL-2, IL-6, TNF-α 및 IFN-γ의 수준을 상청액에서 Luminex에 의해 측정하였다. AE042, P1069 및 TRS는 상이한 배치의 CD3xEGFR-SF3 및 0.0001, 0.0005, 0.001, 0.005, 0.01, 0.05, 0.1, 0.5, 1, 5 및 10 농도를 ㎍/ml로 나타낸다. 다른 치료에서, "c"는 코팅된 것을 나타내고, "s"는 가용성을 나타낸다. 오차 막대는 6개의 독립적인 실험으로부터의 평균 ± SEM을 나타낸다.
도 36. 48시간에서 CD3xEGFR-SF3과 mAb 부재 조건 사이의 비특이적 T 세포 사이토카인 반응의 통계적 비교. 도 35의 데이터는 적합한 최소 제곱 모델에 이어 던넷 비교(α= 0,05)로 분석하여 IL-2(a), IL-6(b), IFN-γ(c) 및 TNF-α(d)의 mAb 비함유 대조군에 대해 평균을 비교했다. 평균의 유의한 차이는 결정 한계를 벗어난 바늘 막대로 표시된다(각 치료에 대한 95% CI 간격; 회색 영역).
도 37. 48시간에서 CD3xEGFR-SF3과 이소타입 대조군 사이의 비특이적 T 세포 사이토카인 반응의 통계적 비교. 도 35의 데이터는 적합한 최소 제곱 모델에 이어 던넷 비교(α= 0,05)로 분석하여 IL-2(a), IL-6(b), IFN-γ(c) 및 TNF-α(d)의 이소타입 대조군에 대해 평균을 비교했다. 평균의 유의한 차이는 결정 한계를 벗어난 바늘 막대로 표시된다(각 치료에 대한 95% CI 간격; 회색 영역).
도 38. CD3xEGFR-SF3은 고밀도 PBMC 검정에서 비특이적 T 세포 사이토카인 반응을 유도하지 않는다. PBMC를 고밀도(107 세포/ml)에서 48시간 동안 배양하였다. 이어서, 세포를 정상 밀도(106 세포/ml)로 플레이팅하고, 증가하는 용량의 CD3xEGFR-SF3 또는 대조군의 존재하에 24시간 동안 배양하고, 방출된 IL-2, IL-6, TNF-α 및 IFN-γ의 수준을 상청액에서 Luminex에 의해 측정하였다. AE042 및 TRS는 상이한 배치의 CD3xEGFR-SF3 및 0.0001, 0.001, 0.01, 0.1, 1 및 10 농도를 ㎍/ml로 나타낸다. 오차 막대는 4개의 독립적인 실험으로부터의 평균 ± SEM을 나타낸다.
도 39. 고밀도 PBMC 검정에서 CD3xEGFR-SF3과 mAb 부재 조건 사이의 비특이적 T 세포 사이토카인 반응의 통계적 비교. 도 38의 데이터는 적합한 최소 제곱 모델에 이어 던넷 비교(α= 0,05)로 분석하여 IL-2(a), IL-6(b), IFN-γ(c) 및 TNF-α(d)의 mAb 비함유 대조군에 대해 평균을 비교했다. 평균의 유의한 차이는 결정 한계를 벗어난 바늘 막대로 표시된다(각 치료에 대한 95% CI 간격; 회색 영역).
도 40. 고밀도 PBMC 검정에서 CD3xEGFR-SF3과 이소타입 대조군 사이의 비특이적 T 세포 사이토카인 반응의 통계적 비교. 도 38의 데이터는 적합한 최소 제곱 모델에 이어 던넷 비교(α= 0,05)로 분석하여 IL-2(a), IL-6(b), IFN-γ(c) 및 TNF-α(d)의 이소타입 대조군에 대해 평균을 비교했다. 평균의 유의한 차이는 결정 한계를 벗어난 바늘 막대로 표시된다(각 치료에 대한 95% CI 간격; 회색 영역).
도 41. CD3xEGFR-SF3은 전혈 검정에서 사이토카인 반응을 유도하지 않는다. 이어서, 건강한 지원자의 전혈을 증가하는 용량의 CD3xEGFR-SF3 또는 대조군의 존재하에 24시간 동안 배양하고, IL-2, IL-6, TNF-α 및 IFN-γ의 수준을 혈청에서 Luminex에 의해 측정하였다. AE042 및 TRS는 상이한 배치의 CD3xEGFR-SF3 및 0.001, 0.01, 0.1 및 1 농도를 ㎍/ml로 나타낸다. 오차 막대는 4개의 독립적인 실험으로부터의 평균 ± SEM을 나타낸다.
도 42. 전혈 검정에서 CD3xEGFR-SF3과 mAb 부재 조건 사이의 사이토카인 반응의 통계적 비교. 도 41의 데이터는 적합한 최소 제곱 모델에 이어 던넷 비교(α= 0,05)로 분석하여 IL-2(a), IL-6(b), IFN-γ(c) 및 TNF-α(d)의 mAb 비함유 대조군에 대해 평균을 비교했다. 평균의 유의한 차이는 결정 한계를 벗어난 바늘 막대로 표시된다(각 치료에 대한 95% CI 간격; 회색 영역).
도 43. 전혈 검정에서 CD3xEGFR-SF3과 이소타입 대조군 사이의 사이토카인 반응의 통계적 비교. 도 41의 데이터는 적합한 최소 제곱 모델에 이어 던넷 비교(α= 0,05)로 분석하여 IL-2(a), IL-6(b), IFN-γ(c) 및 TNF-α(d)의 이소타입 대조군에 대해 평균을 비교했다. 평균의 유의한 차이는 결정 한계를 벗어난 바늘 막대로 표시된다(각 치료에 대한 95% CI 간격; 회색 영역).
도 44. NOD SCID 이종 이식 마우스 모델에서 CD3xEGFR-SF3 치료적 치료의 효능. A549 세포에서 EGFR의 발현 수준은 그래프 전에 sABC에 의해 결정되었다. 종양 세포(표적 세포, T) 및 PBMC(이펙터 세포, E)의 혼합물을 2:1의 E:T 비로 NOD.CB17/AlhnRj-Prkdcscid/Rj(NOD/SCID) 마우스(PBMC 공여체당 그룹당 n = 4 내지 5)의 우측 옆구리 영역에 s.c.로 주사하였다. CD3xEGFR-SF3은 3주 동안 2일째에 시작하여 일주일에 1회 2mg/kg으로 정맥내 투여했다. 외부 캘리퍼 측정에 의해 종양 성장을 결정하였다. 그래프는 평균 종양 크기(mm3) ± SEM을 나타낸다. 2 PBMC 공여체가 포함되었다. 연구명: A549_15.
도 45. 41일째에 치료적 치료군 중 CD3 x EGFR-SF3과 대조군 사이의 A549 종양 용적 비교. 데이터는 41일째에 각 동물의 종양 용적을 그룹당 나타냈다. 데이터는 도 44로부터 추출된다. 연구명: A549_15.
도 1: 다양한 상이한 BEAT 구조로 조립된 파니투무맙 항-EGFR 결합제(검정) 및 인간화 SP34 항-CD3 결합제(회색).
도 2: 막-결합된 EGFR을 발현하는 BAF 세포에서 3A6 및 10E6 하이브리도마 후보의 유세포 분석. 이 도면은 BAF 세포 상에서 발현된 막-결합된 EGFR에 대한 부모 3A6 및 10E6 하이브리도마 상청액의 FACS 프로파일을 도시한다. 두 하이브리도마 클론으로부터 수거된 100㎕를 106 세포/ml로 희석된 100ul의 EGFR-형질감염된 BAF 세포와 함께 배양하였다. 음성 대조군으로서, 정제된 마우스 IgG 이소타입은 10㎍/㎖로 희석되어 사용되었다. 항체 결합은 염소 항-마우스 IgG-PE로 검출시켰다.
도 3: 3A6A12B5 및 10E6F5는 EGFR 수용체의 세포외 도메인 IV에 특이적으로 결합한다. 이 도면은 정제된 3A6A12F5 및 10E6F5 하이브리도마 서브클론의 다수의 농도(10 내지 0.01㎍/㎖ 범위)가 고정화된 재조합 가용성 EGFR(A) 또는 EGFR-Her3 키메라 분자(B 및 C) 또는 EGFR의 단일 도메인 IV(D)에 대해 시험되었던 ELISA 결과를 도시한다. Vectibix®는 또한 검정에서 시험되었다.
도 4: CD3-EGFR_5 및 CD3-EGFR_8은 EGFR + A549 표적 세포의 사멸 활성을 나타낸다. EGFR + A549 세포(표적 세포, T)에 대한 CD3-재지시된 사멸 검정은 48시간 동안 10:1의 E:T 비율로 이펙터 세포(E)로서 3개의 건강한 공여체의 PBMC를 사용하여 수행되었다. 히스토그램은 3명의 개체 공여체로부터 계산된 특정 사멸의 평균 백분율을 보여준다. 2개의 BEAT 분자를 검정에서 10nM로 사용하였다.
도 5: (A) 키메라 3A6 항체에 대한 KD 측정. (B) 키메라 10E6 항체에 대한 KD 측정.
도 6: (A) 10E6-최적 적합 항체에 대한 KD 측정. (B) 10E6-안정한 항체에 대한 KD 측정.
도 7: (A) 3A6 키메라 항체에 의한 결합 테스트의 센서그램, (B) 10E6 키메라 항체에 의한 결합 테스트의 센서그램. (C) 폴리클로날 염소 항-EGFR 항체를 사용하는 제어 실험의 센서그램.
도 8: (A) 10E6-최적 적합 항체에 대한 서모그램. 제1 피크는 IgG1 CH2-CH3 도메인에 상응하고, 71.7℃의 Tm을 나타내고, 제2 피크는 Fab에 상응한다. (B) 10E6-안정한 항체에 대한 서모그램. 제1 피크는 IgG1 CH2-CH3 도메인에 상응하고, 71.8℃의 Tm을 나타내고, 제2 피크는 Fab에 상응한다.
도 9: CD3xEGFR_1은 A549 종양에서 효능이 없다.
도 10: CD3xEGFR-SF1 및 CD3xEGFR-SF3은 A549 종양에서 동일한 효능을 갖는다.
도 11: CD3xEGFR-SF3은 SNU-216 종양에서 벡티빅스보다 더 우수한 효능을 나타낸다.
도 12: 이종 이식 모델에서 CD3xEGFR-SF3 항-종양 활성에 대한 덱사마타손의 영향. (A) 그래프는 평균 종양 크기(mm3) ± SEM을 나타낸다. (B) 그래프는 37일째에 마우스당 종양 성장을 나타낸다.
도 13: EGFR(A) 및 CD3(B)에 대한 간단한 결합 ELISA 포맷 개략도.
도 14: 이중 결합 ELISA 포맷 개략도.
도 15: 간단한 EGFR 결합 ELISA에 의한 마우스 혈청에서 CD3xEGFR-SF3의 검출.
도 16: 간단한 CD3 결합 ELISA에 의한 마우스 혈청에서 CD3xEGFR-SF3의 검출.
도 17: 이중 CD3 및 EGFR 결합 ELISA에 의한 마우스 혈청에서 CD3xEGFR-SF3의 검출.
도 18: 스프라그-다우리 래트 혈청에서 CD3xEGFR-SF3의 약동학적 프로파일. CD3xEGFR-SF3의 약동학을 1mg/kg 체중의 용량으로 단일 정맥 주사 후 수컷 스프라그-다우리 래트(n = 4)에서 평가하였다. 약동학(PK) 평가를 위한 혈액 샘플을 42일의 기간 동안(6주) 투약 후 0.25, 1, 6, 24, 48, 96, 168, 336, 530, 672, 840 및 1008시간의 미리 지정된 시점에서 수집하였다. 이들 혈청 샘플에서 CD3xEGFR-SF3의 농도를 적합한 ELISA 방법을 사용하여 정량화하였다. 시험된 4마리 동물을 나타내는 데이터(N = 1).
도 19. ELISA에 의한 CD3xEGFR-SF3 결합의 검출. CD3xEGFR-SF3 및 대조군 항체의 용량 반응을 코팅된 인간 CD3-Fc(huCD3-Fc, A), 인간 EGFR 도메인 I-IV His-태그(huEGFR-His; B) 또는 huEGFR-His(C) 상에서 배양한 다음, HRP(A 및 B)와 커플링된 항-인간 IgG Fab 또는 huCD3-비오틴에 이어서 HRP-커플링된 스트렙타비딘(C)으로 검출했다. 그래프는 각 치료에 대한 S자형 용량-반응 결합 곡선(450nM에서의 흡광도)을 나타낸다. 각 데이터 포인트는 3개의 독립적인 복제물로부터 중복 값의 평균 ± SEM이다.
도 20. 유세포 분석에 의한 CD3xEGFR-SF3 결합의 검출. CD3xEGFR-SF3 및 대조군 항체의 용량 반응을 PBMCS(A-C) 또는 편평 암 세포주 NCI-H1703(D) 상에서 배양하고, PE-표지된 항-인간 IgG (Fc-γ)로 검출하였다. PBMC의 경우, 세포는 또한 항-CD4 또는 항-CD8 항체로 표지화했다. 그래프는 각 치료에 대한 평균 형광 강도(MFI)의 비선형 S자형 회귀 결합 곡선을 나타낸다. 각 데이터 포인트는 3개의 독립적인 복제물로부터 중복값의 평균 ± SEM이다.
도 21. CD3xEGFR-SF3은 EGFR-발현 인간 암 세포주의 재지시된 용해를 유도한다. CD3xEGFR-SF3 또는 대조군 항체의 용량 반응의 존재하에 표적 암 세포(T) 및 이펙터 세포(E; PBMC)를 1:10의 E:T 비로 배양하였고, 암 세포의 재지시된 용해를 세포독성 검정(MTS)에 의해 결정했다. EC50 값을 특정 사멸의 S자형 용량-반응 곡선으로부터 추출하였다. 오차 막대는 평균 ± SEM을 나타낸다. 세포주 재지시된 용해는 통계적으로 상이하였다(일원 ANOVA; F = 5,6; p <0.0001).
도 22. CD3xEGFR-SF3은 낮은 항체-의존적 세포-매개 세포독성 잠재력을 갖는다. CD3xEGFR의 항체-의존적 세포-매개 세포독성(ADCC)을 EGFR + 암종 세포주 A-431 및 A549(A)뿐만 아니라 CD3 + HPB-ALL 세포(B)에서 평가하고, 특정 사멸의 S자형 용량-반응 곡선으로부터 추출된 EC50 값으로 표시된다. 오차 막대는 두개의 독립적인 실험에서 평균 ± SEM을 나타낸다. 치료의 효과는 EGFR + 암종 세포(최소 제곱 모델, F = 29, p <0.0001) 및 CD3 + HPB-ALL 세포(T 테스트, t = 3, p <0.05)에 대해 통계적으로 유의했다. 통계적으로 유의한 차이(p <0.05)는 별표(*)로 표시된다.
도 23. CD3xEGFR-SF3은 보체 의존적 세포독성을 갖지 않는다. CD3 + HPB-ALL 세포(B)뿐만 아니라 EGFR + 암종 세포 A549(A)에서 특이적 보체-의존적 세포독성(CDC)이 평가되었고, 특이적 CDC의 S자형 용량-반응 곡선이 표시된다.
도 24. PBMC의 증식에 대한 CD3xEGFR-SF3의 효과. 증가하는 용량의 CD3xEGFR 또는 대조군의 존재하에 PBMC를 48시간 동안 배양했다. 그래프는 6개의 독립적인 실험으로부터 3H-티미딘 혼입 결과를 나타낸다. AE042, P1069 및 TRS는 상이한 배치의 CD3xEGFR-SF3 및 0.0005, 0.005, 0.05, 0.5 및 5의 농도를 ㎍/ml로 나타낸다. 다른 치료에서, "c"는 코팅된 것을 나타내고, "s"는 가용성을 나타낸다. 오차 막대는 평균 ± SEM을 나타낸다.
도 25. PBMC의 증식에 대한 CD3xEGFR-SF3의 효과의 통계적 분석. 도 24의 데이는 적합한 최소 제곱 모델에 이어 던넷 비교(Dunnett's comparison)(α = 0.05)로 분석하여 mAb 비함유 대조군(A) 및 이소타입 대조군(B)에 대한 평균을 비교했다. 평균의 유의한 차이는 결정 한계를 벗어난 바늘 막대로 표시된다(각 치료에 대해 95% CI 간격; 회색 영역).
도 26. CD3xEGFR-SF3에 대한 비특이적 CD4+ T 세포 활성화. 증가하는 용량의 CD3xEGFR 또는 대조군의 존재하에 PBMC를 24시간 또는 48시간 동안 배양했다. CD4+ T 세포의 활성화는 유세포 분석에 의해 활성화 마커 CD69의 발현으로서 측정되었다. AE042, P1069 및 TRS는 상이한 배치의 CD3xEGFR-SF3 및 0.0005, 0.005, 0.05, 0.5 및 5의 농도를 ㎍/ml로 나타낸다. 다른 치료의 경우, "c"는 코팅된 것을 나타내고, "s"는 가용성을 나타낸다. 오차 막대는 6개의 독립적인 실험에서 평균 ± SEM을 나타낸다.
도 27. CD3xEGFR-SF3과 mAb 부재 조건 사이의 비특이적 CD4+ T 세포 활성화의 통계적 비교. 도 26의 데이터는 적합한 최소 제곱 모델에 이어 던넷 비교(α = 0.05)로 분석하여 mAb 비함유 대조군에 대해 24시간(A) 및 48시간(B) 평균을 비교했다. 평균의 유의한 차이는 결정 한계를 벗어난 바늘 막대로 표시된다(각 치료에 대한 95% CI 간격; 회색 영역).
도 28. CD3xEGFR-SF3과 이소타입 대조군 사이의 비특이적 CD4+ T 세포 활성화의 통계적 비교. 도 26의 데이터는 적합한 최소 제곱 모델에 이어 던넷 비교(α = 0.05)로 분석하여 이소타입 대조군에 대해 24시간(A) 및 48시간(B)에 평균을 비교했다. 평균의 유의한 차이는 결정 한계를 벗어난 바늘 막대로 표시된다(각 치료에 대한 95% CI 간격; 회색 영역).
도 29. CD3xEGFR-SF3에 대한 비특이적 CD8+ T 세포 활성화. 증가하는 용량의 CD3xEGFR-SF3 또는 대조군의 존재하에 PBMC를 24시간 또는 48시간 동안 배양했다. CD8+ T 세포의 활성화는 유세포 분석에 의해 활성화 마커 CD69의 발현으로서 측정되었다. AE042, P1069 및 TRS는 상이한 배치의 CD3xEGFR-SF3 및 0.0005, 0.005, 0.05, 0.5 및 5의 농도를 ㎍/ml로 나타낸다. 다른 치료에서, "c"는 코팅된 것을 나타내고, "s"는 가용성을 나타낸다. 오차 막대는 6개의 독립적인 실험에서 평균 ± SEM을 나타낸다.
도 30. CD3xEGFR-SF3과 mAb 부재 조건 사이의 비특이적 CD8+ T 세포 활성화의 통계적 비교. 도 29의 데이터는 적합한 최소 제곱 모델에 이어 던넷 비교(α = 0.05)로 분석하여 mAb 비함유 대조군에 대해 24시간(A) 및 48시간(B)에 평균을 비교했다. 평균의 유의한 차이는 결정 한계를 벗어난 바늘 막대로 표시된다(각 치료에 대한 95% CI 간격; 회색 영역).
도 31. CD3xEGFR-SF3과 이소타입 대조군 사이의 비특이적 CD8+ T 세포 활성화의 통계적 비교. 도 29의 데이터는 적합한 최소 제곱 모델에 이어 던넷 비교(α = 0.05)로 분석하여 이소타입 대조군에 대해 24시간(A) 및 48시간(B)에 평균을 비교했다. 평균의 유의한 차이는 결정 한계를 벗어난 바늘 막대로 표시된다(각 치료에 대한 95% CI 간격; 회색 영역).
도 32. 24시간에서 CD3xEGFR-SF3에 대한 비특이적 T 세포 사이토카인 반응. 증가하는 용량의 CD3xEGFR-SF3 또는 대조군의 존재하에 PBMC를 24시간 동안 배양하고, 방출된 IL-2, IL-6, TNF-α 및 IFN-γ의 수준을 상청액에서 Luminex에 의해 측정하였다. AE042 및 P1069는 상이한 배치의 CD3xEGFR-SF3 및 0.0005, 0.005, 0.05, 0.5 및 5의 농도를 ㎍/ml로 나타낸다. 다른 치료의 경우, "c"는 코팅된 것을 나타내고, "s"는 가용성을 나타낸다. 오차 막대는 6개의 독립적인 실험에서 평균 ± SEM을 나타낸다.
도 33. 24시간에서 CD3xEGFR-SF3과 mAb 부재 조건 사이의 비특이적 T 세포 사이토카인 반응의 통계적 비교. 도 32의 데이터는 적합한 최소 제곱 모델에 이어 던넷 비교(α= 0,05)로 분석하여 IL-2(a), IL-6(b), IFN-γ(c) 및 TNF-α(d)의 mAb 비함유 대조군에 대해 평균을 비교했다. 평균의 유의한 차이는 결정 한계를 벗어난 바늘 막대로 표시된다(각 치료에 대한 95% CI 간격; 회색 영역).
도 34. 24시간에서 CD3xEGFR-SF3과 이소타입 대조군 사이의 비특이적 T 세포 사이토카인 반응의 통계적 비교. 도 32의 데이터는 적합한 최소 제곱 모델에 이어 던넷 비교(α= 0,05)로 분석하여 IL-2(a), IL-6(b), IFN-γ(c) 및 TNF-α(d)의 이소타입 대조군에 대해 평균을 비교했다. 평균의 유의한 차이는 결정 한계를 벗어난 바늘 막대로 표시된다(각 치료에 대한 95% CI 간격; 회색 영역).
도 35. 48시간에서 CD3xEGFR-SF3에 대한 비특이적 T 세포 사이토카인 반응. 증가하는 용량의 CD3xEGFR-SF3 또는 대조군의 존재하에 PBMC를 48시간 동안 배양하였고, 방출된 IL-2, IL-6, TNF-α 및 IFN-γ의 수준을 상청액에서 Luminex에 의해 측정하였다. AE042, P1069 및 TRS는 상이한 배치의 CD3xEGFR-SF3 및 0.0001, 0.0005, 0.001, 0.005, 0.01, 0.05, 0.1, 0.5, 1, 5 및 10 농도를 ㎍/ml로 나타낸다. 다른 치료에서, "c"는 코팅된 것을 나타내고, "s"는 가용성을 나타낸다. 오차 막대는 6개의 독립적인 실험으로부터의 평균 ± SEM을 나타낸다.
도 36. 48시간에서 CD3xEGFR-SF3과 mAb 부재 조건 사이의 비특이적 T 세포 사이토카인 반응의 통계적 비교. 도 35의 데이터는 적합한 최소 제곱 모델에 이어 던넷 비교(α= 0,05)로 분석하여 IL-2(a), IL-6(b), IFN-γ(c) 및 TNF-α(d)의 mAb 비함유 대조군에 대해 평균을 비교했다. 평균의 유의한 차이는 결정 한계를 벗어난 바늘 막대로 표시된다(각 치료에 대한 95% CI 간격; 회색 영역).
도 37. 48시간에서 CD3xEGFR-SF3과 이소타입 대조군 사이의 비특이적 T 세포 사이토카인 반응의 통계적 비교. 도 35의 데이터는 적합한 최소 제곱 모델에 이어 던넷 비교(α= 0,05)로 분석하여 IL-2(a), IL-6(b), IFN-γ(c) 및 TNF-α(d)의 이소타입 대조군에 대해 평균을 비교했다. 평균의 유의한 차이는 결정 한계를 벗어난 바늘 막대로 표시된다(각 치료에 대한 95% CI 간격; 회색 영역).
도 38. CD3xEGFR-SF3은 고밀도 PBMC 검정에서 비특이적 T 세포 사이토카인 반응을 유도하지 않는다. PBMC를 고밀도(107 세포/ml)에서 48시간 동안 배양하였다. 이어서, 세포를 정상 밀도(106 세포/ml)로 플레이팅하고, 증가하는 용량의 CD3xEGFR-SF3 또는 대조군의 존재하에 24시간 동안 배양하고, 방출된 IL-2, IL-6, TNF-α 및 IFN-γ의 수준을 상청액에서 Luminex에 의해 측정하였다. AE042 및 TRS는 상이한 배치의 CD3xEGFR-SF3 및 0.0001, 0.001, 0.01, 0.1, 1 및 10 농도를 ㎍/ml로 나타낸다. 오차 막대는 4개의 독립적인 실험으로부터의 평균 ± SEM을 나타낸다.
도 39. 고밀도 PBMC 검정에서 CD3xEGFR-SF3과 mAb 부재 조건 사이의 비특이적 T 세포 사이토카인 반응의 통계적 비교. 도 38의 데이터는 적합한 최소 제곱 모델에 이어 던넷 비교(α= 0,05)로 분석하여 IL-2(a), IL-6(b), IFN-γ(c) 및 TNF-α(d)의 mAb 비함유 대조군에 대해 평균을 비교했다. 평균의 유의한 차이는 결정 한계를 벗어난 바늘 막대로 표시된다(각 치료에 대한 95% CI 간격; 회색 영역).
도 40. 고밀도 PBMC 검정에서 CD3xEGFR-SF3과 이소타입 대조군 사이의 비특이적 T 세포 사이토카인 반응의 통계적 비교. 도 38의 데이터는 적합한 최소 제곱 모델에 이어 던넷 비교(α= 0,05)로 분석하여 IL-2(a), IL-6(b), IFN-γ(c) 및 TNF-α(d)의 이소타입 대조군에 대해 평균을 비교했다. 평균의 유의한 차이는 결정 한계를 벗어난 바늘 막대로 표시된다(각 치료에 대한 95% CI 간격; 회색 영역).
도 41. CD3xEGFR-SF3은 전혈 검정에서 사이토카인 반응을 유도하지 않는다. 이어서, 건강한 지원자의 전혈을 증가하는 용량의 CD3xEGFR-SF3 또는 대조군의 존재하에 24시간 동안 배양하고, IL-2, IL-6, TNF-α 및 IFN-γ의 수준을 혈청에서 Luminex에 의해 측정하였다. AE042 및 TRS는 상이한 배치의 CD3xEGFR-SF3 및 0.001, 0.01, 0.1 및 1 농도를 ㎍/ml로 나타낸다. 오차 막대는 4개의 독립적인 실험으로부터의 평균 ± SEM을 나타낸다.
도 42. 전혈 검정에서 CD3xEGFR-SF3과 mAb 부재 조건 사이의 사이토카인 반응의 통계적 비교. 도 41의 데이터는 적합한 최소 제곱 모델에 이어 던넷 비교(α= 0,05)로 분석하여 IL-2(a), IL-6(b), IFN-γ(c) 및 TNF-α(d)의 mAb 비함유 대조군에 대해 평균을 비교했다. 평균의 유의한 차이는 결정 한계를 벗어난 바늘 막대로 표시된다(각 치료에 대한 95% CI 간격; 회색 영역).
도 43. 전혈 검정에서 CD3xEGFR-SF3과 이소타입 대조군 사이의 사이토카인 반응의 통계적 비교. 도 41의 데이터는 적합한 최소 제곱 모델에 이어 던넷 비교(α= 0,05)로 분석하여 IL-2(a), IL-6(b), IFN-γ(c) 및 TNF-α(d)의 이소타입 대조군에 대해 평균을 비교했다. 평균의 유의한 차이는 결정 한계를 벗어난 바늘 막대로 표시된다(각 치료에 대한 95% CI 간격; 회색 영역).
도 44. NOD SCID 이종 이식 마우스 모델에서 CD3xEGFR-SF3 치료적 치료의 효능. A549 세포에서 EGFR의 발현 수준은 그래프 전에 sABC에 의해 결정되었다. 종양 세포(표적 세포, T) 및 PBMC(이펙터 세포, E)의 혼합물을 2:1의 E:T 비로 NOD.CB17/AlhnRj-Prkdcscid/Rj(NOD/SCID) 마우스(PBMC 공여체당 그룹당 n = 4 내지 5)의 우측 옆구리 영역에 s.c.로 주사하였다. CD3xEGFR-SF3은 3주 동안 2일째에 시작하여 일주일에 1회 2mg/kg으로 정맥내 투여했다. 외부 캘리퍼 측정에 의해 종양 성장을 결정하였다. 그래프는 평균 종양 크기(mm3) ± SEM을 나타낸다. 2 PBMC 공여체가 포함되었다. 연구명: A549_15.
도 45. 41일째에 치료적 치료군 중 CD3 x EGFR-SF3과 대조군 사이의 A549 종양 용적 비교. 데이터는 41일째에 각 동물의 종양 용적을 그룹당 나타냈다. 데이터는 도 44로부터 추출된다. 연구명: A549_15.
이하에, 본 발명에 관한 일련의 비배타적 실시예가 제공된다.
실시예 1: 상이한 포맷으로 CD3xEGFR 이중특이적 항체의 조작
문헌[참조: Hombach et al. (2007)]은 표적 분자 내에서 표적화된 에피토프의 위치가 T 세포 활성화의 효능에 중대한 영향을 미치고, T-세포와 표적 세포 막 사이의 거리를 단축시키는 것이 이중특이적 항체의 세포독성 잠재력을 증가시킬 수 있음을 입증하였다. 본 가설은 CD3xEGFR BEAT 이중특이적 항체에서 결합 도메인을 재정렬하면 재지시된 T-세포와 EGFR 발현 암 세포 사이의 거리를 변화시켜 본 분자의 세포독성 잠재력을 조절할 수 있다는 것이었다.
파니투무맙 항-EGFR 결합제 및 인간화 SP34 항-CD3 결합제는 하기 기재된 바와 같이 다수의 상이한 BEAT 포맷으로 조작되었다.
대안적인 BEAT 구조의 구축
대안적인 BEAT 구조는 파니투무맙 항-EGFR 결합제 및 인간화 SP34 항-CD3 결합제의 위치를 변경함으로써 설계되었다(도 1). 구조에 따라, 결합제는 단일 쇄 단편(scFv) 또는 Fab로 포맷화되었다. scFv 포맷의 결합제는 유연성을 부여하기 위해 Gly4Ser 또는 Gly4Thr 링커(서열번호 13 및 14)를 통해 융합되었다. Fab가 scFv에 융합될 때, Gly4Ser 링커가 사이에 첨가되었다. 상이한 폴리펩티드 쇄를 부분적으로 또는 전체로 코딩하는 코딩 DNA(cDNA)를 먼저 GENEART AG(독일 레겐스 부르크)에 의해 유전자 합성하고, 표준 분자 생물학 기술을 사용하여 변형시켰다. PCR 산물을 적절한 DNA 제한 효소로 분해하고, 정제하고 CMV 프로모터 및 이전에 동일한 DNA 제한 효소로 분해된 소 호르몬 폴리-아데닐화(폴리(A))를 수반하는 변형된 pcDNA3.1 플라스미드(Invitrogen AG, Zug, Switzerland)에 결찰시켰다. 모든 폴리펩티드 쇄는 분비가 뮤린 VJ2C 리더 펩티드에 의해 구동되는 이 발현 벡터에서 독립적으로 결찰시켰다. 폴리펩티드 쇄 A(도 1 참조)는 일반적으로 가변 도메인 이외에, IgG1 힌지, 이어서 L234A 및 L235A 치환(EU 넘버링)을 모두 갖는 IgG3 CH2 도메인 및 BEAT(A) 치환을 함유하는 IgG3 CH3 도메인을 함유했다. 인간화 SP34 항-CD3 결합제의 VH3 유형 프레임워크로 인한 단백질 A 결합을 방지하기 위해, SP34가 쇄 A 상에 위치될 때 단백질 A 결합 폐기 돌연변이 N82aS 및/또는 G65S가 첨가되었다. 폴리펩티드 쇄 B는 일반적으로 IgG1 힌지, 이어서 L234A 및 L235A 치환 둘 다를 갖는 IgG1 CH2 도메인 및 BEAT(B) 치환을 함유하는 IgG1 CH3 도메인을 함유했다. 결합제가 Fab 포맷으로 존재할 때, IgG1 CH1 도메인은 또한 폴리펩티드 쇄의 일부였다. 다음과 같은 분자가 구성되었다: CD3xEGFR_1(서열번호 1, 2 및 3), CD3xEGFR_SF1(서열번호 4, 5 및 6), CD3xEGFR_SF3(서열번호 7, 2 및 8), CD3xEGFR_SF4(서열번호 4, 5 및 9), CD3xEGFR_SD1(서열번호 1, 2 및 10), CD3xEGFR_SD2(서열번호 11, 10 및 2) 및 CD3xEGFR_9(서열번호 1, 2 및 12).
대체 BEAT 구조에서 CD3xEGFR의 생산
일시적인 발현을 위해, 각각 조작된 쇄 벡터의 동일량을 폴리에틸렌이민(PEI; Sigma, Buchs, Switzerland)을 사용하여 현탁액 적응된 HEK293-EBNA 세포(ATCC-LGL 표준, Teddington, UK; Cat. No: CRL-10852)에 공동-형질감염시켰다. 전형적으로, ml당 80만 120만 세포의 밀도로 현탁액 중 세포 100ml를 DNA-PEI 혼합물로 형질감염시킨다. 각각의 쇄를 코딩하는 재조합 발현 벡터가 숙주 세포 내로 도입될 때, 면역글로불린 작제물은 배양 배지(EX-CELL 293, HEK293-무혈청 배지(Sigma), 0.1% 플루론산 및 4mM 글루타민이 보충됨) 내로의 분비를 허용하도록 세포를 4 내지 5일의 기간 동안 추가로 배양함으로써 생성된다. 분비된 단백질을 함유하는 무세포 배양 상청액을 원심분리에 이어 멸균 여과로 제조하였다. 이어서, BEAT를 단백질 A 친화도 수지(Repligen)를 사용하여 무세포 상청액으로부터 정제하였다. 정화된 상청액을 0.2M에서 NaH2PO4로 pH 6.0으로 조정하고, 중력 흐름에 의해 단백질 A에 적재하였다. 컬럼을 20CV의 0.2M 시트레이트 포스페이트 완충액 pH 6.0으로 세척하였다. 단백질을 pH 4.1에서 16CV의 20mM 나트륨 아세테이트로 용출시키고, 0.1용적의 1M 트리스 pH 8.0(Sigma)으로 중화시켰다. Illustra NAP-10 컬럼(GE Healthcare)을 사용하여 샘플을 PBS pH 7.4로 완충액 교환하였다. 예외적으로, CD3xEGFR_SF3 무세포 상청액을 0.2M 시트레이트 포스페이트 완충액 pH 6.0에서 사전 평형화된 1ml HiTrap™ MabSelect SuRe™ 단백질 A 컬럼에 적재하고, AKTApurifier™ 크로마토그래피 시스템(둘 다 GE Healthcare Europe GmbH으로부터, 컬럼 Cat. No: 11-0034-93)에서 1ml/분의 유속으로 작동시켰다. 작동 완충액은 0.2M 시트레이트 포스페이트 완충액 pH 6.0이었다. 세척 완충제는 0.2M 시트레이트 포스페이트 완충액 pH 5.0이었다. 20mM 나트륨 아세테이트 완충액 pH 4.1을 사용하여 용출을 수행하였다. 용출 후 280nm에서 OD 판독이 이어졌고; CD3xEGFR 항체를 함유하는 분획을 풀링시키고, 0.1용적%의 1M 트리스 pH 8.0으로 중화시켰다. Illustra NAP-10 컬럼(GE Healthcare Europe GmbH, Glattbrugg, Switzerland)을 사용하여 샘플을 PBS pH 7.4로 완충액 교환하였다.
실시예 2: EGFR의 도메인 IV에 특이적인 항-EGFR 항체의 생성 및 특성화.
면역화
7주령의 암컷 BALB/c 마우스(Harlan)를 사용하여 EGFR의 세포외 도메인 4에 대한 항체를 생성하였다. 마우스를 100㎕의 애쥬번트와 함께 50㎍ 인간 EGFR His-태그된 단백질(서열번호 15) 또는 50㎍ 세포외 도메인 IV EGFR His-태그된 단백질(서열번호 16)의 혼합물로 복강내(i.p) 및 피하(s.c.) 경로로 3회 면역화시켰다. 면역화된 마우스 혈청에서 도메인 IV에 특이적인 순환성 항-EGFR 항체의 존재는 재조합 인간 EGFR his 또는 도메인 IV His 단백질로 코팅된 플레이트를 사용하여 직접 ELISA에 의해 평가했다. 마우스 혈청을 연속적으로 희석시키고(1:100 내지 1:109), 96-웰 ELISA 플레이트에 첨가하고, 결합된 항체를 염소 항-마우스 분자-HRP(Jackson Immunoresearch)를 사용하여 검출하였다. 희생 3일 전에 최고의 항-EGFR 도메인 IV IgG 혈청 역가를 나타내는 동물에서 애주번트 없이 항원 10㎍을 사용하는 최종 정맥내 부스트를 수행하였다. 동물을 안락사시키고, 비장을 융합을 위해 수거하였다.
융합 프로토콜
1㎖의 따뜻한 PEG1500을 와동시키면서 1분에 걸쳐 세포 슬러리에 천천히 첨가하였다. 세포를 추가의 2분 동안 부드럽게 혼합하였다. 이어서, 4ml의 따뜻한 SFM을 4분에 걸쳐 첨가하였다. 10ml의 따뜻한 SFM을 천천히 첨가하고, 세포를 37 ℃의 수욕에서 5분 동안 배양하였다. 세포를 1000rpm에서 5분 동안 원심분리하고 200ml의 완전 배지에 재현탁시켰다. 융합을 위해, 세포를 10개의 96 평저 웰 플레이트에 200㎕/웰로 플레이팅하였다.
유세포 분석에 의한 막-결합 EGFR 상의 하이브리도마 상청액의 스크리닝
2개의 융합체로부터 대략 1900개의 웰을 재조합 인간 EGFR에 특이적인 뮤린 IgG에서의 함량에 대해 ELISA에 의해 분석하였다. 양성 하이브리도마 상청액을 96-웰 ELISA 플레이트 상에 고정된 인간 EGFR의 재조합 도메인 IV에 대해 추가로 스크리닝하였다. 시험된 모든 클론 중에서, 2개의 부모 후보인 3A6 및 10E6을 동정하고, 막-결합된 EGFR로 형질감염된 BAF 세포 상에서 유세포 분석법에 의해 시험하였다. 이 검정에서, 105개 세포/웰을 4℃에서 1시간 동안 100㎕의 상청액과 함께 배양했다. 이 1차 배양 후, 세포를 1300rpm에서 2분 동안 원심분리하고, 펠렛을 FACS 완충액 중에서 1/100으로 희석된 100㎕의 PE-표지된 염소 항-마우스 2차 항체로 재현탁시켰다. 이어서, 세포를 4℃에서 30분 동안 배양한 다음, 2회 세척하고, 상청액을 제거하고, 세포를 150㎕의 FACS 완충액에 재현탁시켰다. 유세포 분석법으로 샘플을 분석하였다. 도 2에 도시된 바와 같이, 유세포 분석법 실험 결과는, 3A6 및 10E6 하이브리도마 후보 모두가 10㎍/㎖로 사용된 이소타입 대조군과 비교하여 BAF 세포에서 발현되는 막-결합 인간 EGFR 수용체를 인식한다는 것을 보여준다. 이러한 두 하이브리도마 후보는 확장시키고 서브클로닝하였다.
ELISA에 의한 가용성 EGFR 상의 하이브리도마 상청액의 스크리닝
서브클론 3A6A12B5 및 10E6F5는 각각 3A6 및 10E6 부모 클론으로부터 유래되었다. 두 서브클론으로부터의 상청액을 제조업체의 지침에 따라 LC-카파 마우스 친화도 매트릭스(Life Technologies)를 사용하여 수거하고 정제하였다. 이들 정 제된 항체를 가용성 인간 EGFR 또는 재조합 EGFR-Her3 키메라 작제물로 코팅된 96- 웰 플레이트 상에서 ELISA에 의해 시험하였다. 이들 분자를 PBS에서 2㎍/ml로 희석하고, 높은 결합 96-웰 플레이트 상에 4℃에서 밤새 고정시켰다. 플레이트를 PBS 2% 소 혈청 알부민(BSA)으로 차단하고, 3A6A12B5 또는 10E6F5의 연속 희석으로 1시간 동안 배양하였다. 대조군으로서, 파니투무맙(Vectibix®)을 동일한 농도로 사용하였다. 이어서, 플레이트를 PBS 0.01% 트윈으로 세척하고, 100㎕의 염소 항-마우스 IgG(3A6A12B5 및 10E6F5를 검출하기 위해)(Jackson ImmunoResearch Europe Ltd, Newmarket, UK) 또는 염소 항-인간 IgG, F(ab')2 단편 특이적-HRP(파니투무맙을 검출하기 위해)와 함께 1시간 동안 배양하였다. 이 배양 후, 플레이트를 세척하고, 100㎕의 TMB 기질과 함께 배양하였다. 100㎕의 H2SO4 2N을 첨가하여 반응을 정지시키고, Synergy HT2 분광광도계(Biotek, USA; 배급사: WITTEC AG, Littau, Switzerland)에서 450nm에서 흡광도를 판독하였다. 도 3의 결과는 정제된 3A6A12B5 및 10E6F5 항체가 용량 의존 방식으로 가용성 EGFR 분자(A)를 인식하고, 또한 키메라 Her3I-III-EGFR IV(C) 및 EGFR IV(D) 분자에 결합한다는 것을 보여준다. 반대로, 이 두 후보 중 어느 것도 키메라 EGFR I-III Her3 IV 분자(B)를 인식하지 못한다. 이들 결과는 3A6A12B5 및 10E6F5 항체가 모두 EGFR에 결합하고, 도메인 IV에 특이적으로 결합한다는 것을 보여준다.
재지시된 용해 검정(RDL)
이 검정은 실시예에 기재된 절차에 따라 수행되었다. 도 4는 BEAT CD3-EGFR_5 및 CD3-EGFR_8 분자가 모두 EGFR+ A549 표적 세포에 대해 사멸 잠재력을 나타낸다는 것을 보여준다.
실시예 3: 항-EGFR 도메인 IV 항체 3A6 및 10E6의 인간화
3.1 마우스 면역화 및 항체 특성화에 사용되는 인간 EGFR 및 키메라 인간 EGFR-ErbB3 단백질
C-말단 폴리-히스티딘 태그를 갖는 인간 EGFR 가용성 세포외 영역의 폴리펩티드 쇄(UniProt 수탁 번호: P00533 잔기 25-638, 본원에서 hEGFR로서 지칭됨, 서열번호 15)를 코딩하는 코딩 DNA(cDNA)를 GENEART AG(독일 레겐스부르크)에 의해 합성하고, 표준 분자 생물학 기술을 사용하여 변형시켰다. PCR 산물을 적절한 DNA 제한 효소로 분해하고, 정제하고 CMV 프로모터 및 동일한 DNA 제한 효소로 미리 분해된 소 호르몬 폴리-아데닐화(폴리(A)) 신호를 수반하는 변형된 pcDNA3.1 플라스미드에 결찰시켰다.
하기 EGFR 도메인 IV 전용 작제물은 상기 기재된 hEGFR 작제물로부터 PCR 증폭시키고, 상기 언급된 발현 플라스미드로 제한 결찰시켰다: hEGFR-IV_505-638 (505-638은 잔기 범위를 나타내며, 이 작제물은 돌연변이 W516A를 추가로 수반하여 용해도를 증가시키고, 돌연변이는 적절한 돌연변이를 포함하는 프라이머를 사용하여 표준 중첩 PCR에 의해 첨가되었다), hEGFR-IV_556-638 및 hEGFR-IV_580-638(서열번호 16, 17 및 18 ). 시노몰구스 EGFR-IV_556-638 및 580-638(본원에서 cEGFR-IV_556-638 및 580-638로서 지칭됨)은 중첩 PCR(서열번호 19 및 20)에 의해 돌연변이 A566V(잔기 556-638을 포함하는 작제물에 한함), P637A 및 T638R을 인간 작제물에 첨가함으로써 생성되었다.
하기 키메라 인간 EGFR-ErbB3 작제물(인간 ErbB3, UniProt 수탁 번호: P21860)을 설계하고, 그들의 폴리펩티드 쇄를 코딩하는 cDNA를 유로핀 게놈(Eurofins Genomics)에 의해 합성하였다: hEGFR-I-II-III_hErbB3-IV 및 hErbB3-I-II-III_hEGFR-IV(서열번호 21 및 22).
상기 기재된 EGFR 작제물의 일시적 발현을 위해, 적절한 발현 벡터를 폴리에틸렌이민(PEI)을 사용하여 현탁액-적응된 HEK-EBNA 세포(ATCC-CRL-10852)로 형질 감염시켰다. 전형적으로, ml당 80만 120만 세포의 밀도로 현탁액 중 세포 100ml를 100㎍의 발현 벡터를 함유하는 DNA-PEI 혼합물로 형질감염시킨다. 재조합 발현 벡터가 숙주 세포 내로 도입될 때, 단백질은 배양 배지(EX-CELL 293, HEK293-무혈청 배지; Sigma, Buchs, Switzerland), 0.1% 플루론산, 4mM 글루타민이 보충됨)로의 분비를 허용하기 위해 세포를 4 내지 5일의 기간 동안 추가로 배양함으로써 생성된다. 이어서, EGFR을 Ni 세파로스 엑셀(GE Healthcare Europe GmbH, Glattbrugg, Switzerland)을 사용하여 무세포 상청액으로부터 정제시키고, 추가 분석에 사용하였다.
3.2 키메라 3A6 및 10E6
표준 분자 생물학 기술을 사용하여, 하이브리도마 세포의 항체로부터 추출된 VH 및 VL 서열을 마우스-인간 키메라 IgG1 항체로 재포맷화하였다. 마우스 3A6 및 10E6 VH 도메인을 인간 IgG1 Fc(CH1-힌지-CH2-CH3)에 융합시키고, 상응하는 VL 도메인을 IgG1 불변 카파에 융합시켰다. 생성되는 작제물을 상기 기재된 변형된 pcDNA3.1 플라스미드에 결찰시켰다(3A6 키메라 항체 서열번호 23 및 24, 10E6 키메라 항체 서열번호 25 및 26).
키메라 항체의 일시적 발현을 위해, 중쇄 및 경쇄에 대한 재조합 벡터를 PEI를 사용하여 현탁액-적응된 HEK-EBNA 세포에 1:1 몰 비로 형질감염시켰다. 이어서, 항체를 단백질 A 친화도 수지(Repligen, Waltham MA, USA)를 사용하여 무세포 상청액으로부터 정제하였다. 정화된 상청액을 중력 흐름에 의해 단백질 A에 적재시켰다. 단백질을 0.1M 글리신 pH 3.0으로 용출시켰다. Illustra NAP-10 컬럼(GE Healthcare Europe GmbH, Glattbrugg, Switzerland)을 사용하여 샘플을 PBS pH 7.4로 완충액 교환하였다.
3.3 마우스 모노클로날 3A6의 인간화
인간 CDR-그래프팅된 수용체 프레임워크의 결합 특성을 실질적으로 유지하는 인간 수용체 프레임워크의 선택을 포함하는 항-인간 EGFR 마우스 항체 3A6의 인간화가 본원에 기재되어 있다. 2개의 그래프트가 제조되었고, 하나는 가장 적합한 프레임워크를 사용하고 다른 하나는 안정한 프레임워크를 사용한다.
상동성 매칭을 사용하여 3A6 CDR을 그래프팅하기 위한 인간의 가장 적합한 수용체 프레임워크를 선택하였다. 데이터베이스, 예를 들어, 인간 및 마우스의 면역글로불린 유전자좌로부터의 생식계열 가변 유전자의 데이터베이스(상기 IMGT 데이터베이스) 또는 VBASE2(Retter I et al, (2005) Nucleic Acids Res. 33, Database issue D671-D674) 또는 카바트 데이터베이스(Johnson G et al, (2000) Nucleic Acids Res. 28: 214-218) 또는 간행물(예: Kabat EA 등, 상기)은 뮤린 중쇄 및 경쇄 V 영역이 속하는 인간 서브패밀리를 동정하고 수용체 분자로서 사용하기 위한 가장 적합한 인간 생식 계열 프레임워크를 결정하는데 사용될 수 있다. 수용체로서 사용되는 이들 서브패밀리 내에서 중쇄 및 경쇄 가변 서열(VH 및 VL)의 선택은 서열 상동성 및/또는 CDR1 및 CDR2 영역의 구조의 일치에 기초하여 그래프팅 후 6개의 CDR의 적절한 상대적 제시를 보존하는 것을 도울 수 있다.
예를 들어, IMGT 데이터베이스의 사용은 3A6 중쇄 가변 도메인 프레임워크와 인간 중쇄 가변 도메인 서브패밀리 4의 구성원 사이의 양호한 상동성을 나타낸다. CDR 및 프레임워크 서열 둘 다의 최고 상동성 및 동일성이 CDR3까지의 전체 서열에 대해 59.4%의 서열 동일성을 갖는 생식 계열 서열 IGHV4-4*08(서열번호 27)에 대해 관찰되었다.
동일한 접근법을 사용하여, 3A6 경쇄 가변 도메인 서열은 인간 경쇄 가변 도메인 카파 서브패밀리 6의 구성원에 대해 양호한 상동성을 나타냈다. CDR 및 프레임워크 서열 둘 다의 최고 상동성 및 동일성이 69.5%의 서열 동일성을 갖는 생식 계열 서열 IGKV6-21*02(서열번호 28)에 대해 관찰되었다.
수용체로서 사용될 인간 중쇄 및 경쇄 가변 서열(VH 및 VL)의 선택은 우수한 생물 물리학적 특성[문헌(참조: Ewert S et al., (2003) J.Mol. Biol, 325, 531-553)에 기록됨] 및/또는 천연 항체 레퍼토리에서 발견되는 쌍[문헌(참조: Glanville J et al. (1999) Proc Natl Acad Sci USA, 106 (48):20216-21; DeKosky BJ et al., (2015)) Nat Med, 21 (1): 86-91)에 기록됨]을 갖는 생식계열에 기초할 수 있다. 양호한 쌍 및/또는 안정성을 위해 당해 분야에 공지된 프레임워크 서열은 3A6 안정한 그래프트 인간화를 위한 수용체 프레임워크로서 사용된 인간 IGHV3-23*04(서열번호 29) 및 IGKV1-39*01(서열번호 30) 프레임워크이다.
인간 감마 하나의 이소타입의 2개의 인간화 항체를 제조했다. 항체는 인간-마우스 하이브리드 중쇄 가변 도메인 및 인간-마우스 하이브리드 경쇄 가변 도메인을 포함하였다. 제1 하이브리드 중쇄 가변 도메인은 인간 중쇄 가변 도메인 IGHV4-4*08에 기초하였고, 여기서 생식계열 CDRH1 및 H2는 각각 3A6 CDRH1 및 CDRH2로 대체된다. 인간 수용체 프레임워크에 가장 매칭되는 JH 세그먼트 서열은 상동성 검색을 사용하여 IMGT 데이터베이스로부터 동정되었다. 인간 수용체 프레임워크에 CDR을 수용하기 위해, 인간 잔기를 마우스 잔기로 치환함으로써 중요 위치를 변형시켰다. 이 과정은 역-돌연변이(back-mutation)로 칭명되고, 모노클로날 항체의 인간화에서 가장 예측할 수 없는 절차이다. 그것은 인간화 항체에서 잠재적인 면역원성을 최소화하는 동시에 친화도를 유지하기 위해 보유되어야 하는 마우스 항체로부터 중요한 프레임워크 잔기의 동정 및 선택을 필요로 한다. 인간 IGHV4-4*08 프레임워크 영역, 3A6 마우스 CDR, 중요한 인간 대 마우스 프레임워크 역-돌연변이 및 인간 수용체에 가장 매칭되는 JH를 갖는 생성되는 인간-마우스 하이브리드 중쇄 가변 서열은 본원에서 서열번호 31을 갖는 중쇄 가변 도메인 3A6-최적-적합-VH로 지칭된다. 제2 하이브리드 중쇄 가변 도메인은 인간 중쇄 가변 도메인 IGHV3-23*04에 기초하고, 여기서 생식계열 CDRH1 및 H2는 각각 3A6 CDRH1 및 CDRH2로 대체된다. 인간 수용체 프레임워크에 가장 매칭되는 JH 세그먼트 서열은 상동성 검색을 사용하여 IMGT 데이터베이스로부터 동정되었다. 인간 IGHV3-23*04 프레임워크 영역, 3A6 마우스 CDR, 중요한 인간 대 마우스 프레임워크 역-돌연변이 및 인간 수용체에 가장 매칭되는 JH를 갖는 생성되는 인간-마우스 하이브리드 중쇄 가변 서열은 본원에서 서열번호 32를 갖는 중쇄 가변 도메인 3A6-안정성-VH로서 지칭된다.
유사하게, 이러한 제1 인간화 항체 후보에 사용된 제1 인간-마우스 하이브리드 경쇄 가변 도메인은 인간 IGKV6-21*02 프레임워크 영역, 3A6 마우스 CDR 및 인간 수용체에 가장 매칭되는 JK를 갖고, 본원에서는 서열번호 33을 갖는 경쇄 가변 도메인 3A6-최고-적합-VL로서 지칭된다(이 경우, 모든 중요 위치가 마우스 및 인간 프레임워크에서 동일하므로 프레임워크에서 역-돌연변이는 필요하지 않았다). 3A6-최고-적합-VH 및 3A6-최고-적합-VL을 포함하는 제1 인간화 항체는 본원에서 3A6-최고-적합 항체로서 약칭된다. 제2 인간화 항체 후보에 사용된 제2 인간-마우스 하이브리드 경쇄 가변 도메인은 인간 IGKV1-39*01 프레임워크 영역, 3A6 마우스 CDR, 중요한 인간 대 마우스 프레임워크 역-돌연변이 및 인간 수용체에 가장 매칭되는 JK를 갖고, 본원에서 서열번호 34를 갖는 경쇄 가변 도메인 3A6-안정성-VL로서 지칭된다. 3A6-안정성-VH 및 3A6-안정성-VL을 포함하는 제2 인간화 항체는 본원에서 3A6-안정성 항체로서 약칭된다.
3.4 마우스 모노클로날 10E6의 인간화
인간 CDR-그래프팅된 수용체 프레임워크의 결합 특성을 실질적으로 유지하는 인간 수용체 프레임워크의 선택을 포함하는 항-인간 EGFR 마우스 항체 10E6의 인간화가 본원에 기재되어 있다. 2개의 그래프트가 제조되었고, 하나는 가장 적합한 프레임워크를 사용하고, 다른 하나는 가장 안정한 프레임워크를 사용한다.
상동성 매칭을 상기한 바와 같이 사용하여 10E6 CDR을 그래프팅하기 위한 인간 최고 적합 수용체 프레임워크를 선택하였다. IMGT 데이터베이스는 10E6 중쇄 가변 도메인 프레임워크와 인간 중쇄 가변 도메인 서브패밀리 4의 구성원 사이의 양호한 상동성을 나타낸다. CDR 및 프레임워크 서열 둘 다의 최고 상동성 및 동일성이 CDR3까지의 전체 서열에 대해 73.2%의 서열 동일성을 갖는 생식 계열 서열 IGHV4-30-4*01(서열번호 35)에 대해 관찰되었다.
동일한 접근법을 사용하여, 10E6 경쇄 가변 도메인 서열은 인간 경쇄 가변 도메인 카파 서브패밀리 6의 구성원에 대해 양호한 상동성을 나타냈다. CDR 및 프레임워크 서열 둘 다의 최고 상동성 및 동일성이 69.5%의 서열 동일성을 갖는 생식 계열 서열 IGKV6-21*02(서열번호 14)에 대해 관찰되었다.
안정한 프레임워크가 상기한 바와 같이 선택되었다. 인간 IGHV3-23*04(서열번호 29) 및 IGKV1-39*01(서열번호 30)을 안정한 그래프트 인간화를 위한 수용체 프레임워크로서 사용하였다.
인간 감마 하나의 이소타입의 2개의 인간화 항체를 제조했다. 항체는 인간-마우스 하이브리드 중쇄 가변 도메인 및 인간-마우스 하이브리드 경쇄 가변 도메인을 포함하였다. 제1 하이브리드 중쇄 가변 도메인은 인간 중쇄 가변 도메인 IGHV4-30-4*01에 기초하였고, 여기서 생식계열 CDRH1 및 H2는 각각 10E6 CDRH1 및 CDRH2로 대체된다. 인간 수용체 프레임워크에 가장 매칭되는 JH 세그먼트 서열은 상동성 검색을 사용하여 IMGT 데이터베이스로부터 동정되었다. 인간 IGHV4-30-4*01 프레임워크 영역, 10E6 마우스 CDR, 중요한 인간 대 마우스 프레임워크 역-돌연변이 및 인간 수용체에 가장 매칭되는 JH를 갖는 생성되는 인간-마우스 하이브리드 중쇄 가변 서열은 본원에서 서열번호 36을 갖는 중쇄 가변 도메인 10E6-최적-적합-VH로 지칭된다. 제2 하이브리드 중쇄 가변 도메인은 인간 중쇄 가변 도메인 IGHV3-23*04에 기초하고, 여기서 생식계열 CDRH1 및 H2는 각각 10E6 CDRH1 및 CDRH2로 대체된다. 인간 수용체 프레임워크에 가장 매칭되는 JH 세그먼트 서열은 상동성 검색을 사용하여 IMGT 데이터베이스로부터 동정되었다. 인간 IGHV3-23*04 프레임워크 영역, 10E6 마우스 CDR, 중요한 인간 대 마우스 프레임워크 역-돌연변이 및 인간 수용체에 가장 매칭되는 JH를 갖는 생성되는 인간-마우스 하이브리드 중쇄 가변 서열은 본원에서 서열번호 37을 갖는 중쇄 가변 도메인 10E6-안정성-VH로서 지칭된다.
유사하게, 이러한 제1 인간화 항체 후보에 사용된 제1 인간-마우스 하이브리드 경쇄 가변 도메인은 인간 IGKV6-21*02 프레임워크 영역, 10E6 마우스 CDR 및 중요한 인간 대 마우스 프레임워크 역-돌연변이 및 인간 수용체에 가장 매칭되는 JK를 갖고, 본원에서는 서열번호 38을 갖는 경쇄 가변 도메인 10E6-최고-적합-VL로서 지칭된다. 10E6-최고-적합-VH 및 10E6-최고-적합-VL을 포함하는 제1 인간화 항체는 본원에서 10E6-최고-적합 항체로서 약칭된다. 제2 인간화 항체 후보에 사용된 제2 인간-마우스 하이브리드 경쇄 가변 도메인은 인간 IGKV1-39*01 프레임워크 영역, 10E6 마우스 CDR, 중요한 인간 대 마우스 프레임워크 역-돌연변이 및 인간 수용체에 가장 매칭되는 JK를 갖고, 본원에서 서열번호 39를 갖는 경쇄 가변 도메인 10E6-안정성-VL로서 지칭된다. 10E6-안정성-VH 및 10E6-안정성-VL을 포함하는 제2 인간화 항체는 본원에서 10E6-안정성 항체로서 약칭된다.
3.5 인간화 3A6 및 10E6 항체의 생산
가장 적합한 VH 및 VL 및 안정한 VH 및 VL에 대한 코딩 DNA 서열(cDNA)은 Eurofins Genomics(Ebersberg, Germany)에 의해 합성되고, 표준 분자 생물학 기술을 사용하여 변형되었다. VH 도메인을 인간 IgG1 CH1-힌지-CH2-CH3 부분에 융합시키고, 상기한 발현 벡터에 제한 결찰시켰다. 유사하게, VL 도메인에 대한 유전자를 인간 불변 카파 도메인에 융합시키고 별도의 발현 벡터에 결찰시켰다. 생성되는 항체는 3A6-최고-적합성(서열번호 40 및 41), 3A6-안정성(서열번호 42 및 43), 10E6-최고-적합성(서열번호 44 및 45) 및 10E6-안정성(서열번호 46 및 47)이었다.
항체의 일시적 발현을 위해, 중쇄 및 경쇄에 대한 재조합 벡터를 PEI를 사용하여 현탁액-적응된 HEK-EBNA 세포에 1:1 몰 비로 형질감염시켰다. 이어서, 단백질 A 친화도 수지를 사용하여 무세포 상청액으로부터 항체를 정제시켰다. 정화된 상청액을 중력 흐름에 의해 단백질 A에 적재하였다. 단백질을 0.1M 글리신 pH 3.0으로 용출시켰다. Illustra NAP-10 컬럼을 사용하여 샘플을 PBS pH 7.4로 완충액 교환하였다.
3.6 표면 플라즈몬 공명(SPR)에 의한 인간 EGFR에 대한 키메라 및 인간화 항체의 동역학적 결합 친화도 상수
동역학적 결합 친화도 상수(KD)를 측정하였다. 실온에서 BIAcore T200(스웨덴 웁살라 소재의 GE Healthcare-BIAcore)에서 측정을 수행하였고, Biacore T200 평가 소프트웨어로 분석하였다. 시리즈 S CM5 센서 칩을 단백질 G와 공유 결합시키고, 목적하는 항체 100 RU를 포획하였다. hEGFR을 HBS-EP + 완충액에서 30㎕/분의 유속으로 3A6의 경우 19.53-2500nM 및 10E6 기반 항체의 경우 2.4-312.5nM 또는 1-250nM 범위의 농도로 주사하였다(도 5 및 6, 데이터는 반응 단위의 수(약칭된 RU; Y축) 대 시간(X축)으로서 표현된다). 각각의 결합 사건 후, 표면을 10㎕의 글리신 완충액 pH 1.5로 재생시켰다. 해리 시간은 4분이었다. 실험 데이터는 글로벌 Rmax와 함께 1:1 Langmuir 모델을 사용하여 처리하였다.
3.7 SP34와 함께 3A6 및 10E6 이중특이적 항체의 생산
인간화 SP34와 3A6 및 10E6 결합제를 조합한 이중특이적 BEAT 항체를 생성하기 위해, 상기 언급된 VH 단편을 인간 IgG1 CH1-힌지에 융합시킨 후, IgG1 CH2 및 BEAT (A) 치환을 함유하는 IgG1 CH3 도메인에 융합시켰다. CH2 도메인은 L234A 및 L235A 치환(EU 넘버링)을 모두 함유하였다. scFv 포맷의 인-하우스 인간화 SP34에 이어 짧은 5개의 아미노산 링커(Gly4Thr)를 인간 IgG3 CH2에 융합시킨 후 BEAT (B) 치환을 함유하는 IgG3 CH3 도메인에 융합시켰다. CH2 도메인은 L234A 및 L235A 치환 둘 다를 함유하였다. 작제물을 상기 기재된 바와 같이 발현 벡터에 결찰시켰다. 생성되는 분자는 CD3xEGFR_5(서열번호 48, 24 및 49), CD3xEGFR_6(서열번호 50, 26 및 49), CD3xEGFR_7(서열번호: 48, 35 및 49) 및 CD3xEGFR_8(서열번호: 52, 36 및 47)이었다.
BEAT 항체의 일시적인 발현을 위해, 중쇄 및 경쇄 및 scFv-Fc 쇄에 대한 재조합 벡터를 상기 기재된 바와 같이 PEI를 사용하여 현탁액-적응된 HEK-EBNA 세포에 1:1:1 몰 비로 형질감염시켰다. 무세포 상청액을 0.2M 시트레이트 포스페이트 완충액 pH 6.0에서 사전 평형화된 1ml HiTrap™ MabSelect SuRe™ 단백질 A 컬럼에 적재하고, AKTApurifier™ 크로마토그래피 시스템(둘 다 GE Healthcare Europe GmbH; 컬럼 Cat. No: 11-0034-93)에서 1ml/분의 유속으로 작동시켰다. 작동 완충액은 0.2M 시트레이트 포스페이트 완충액 pH 6.0이었다. 세척 완충액은 0.2M 시트레이트 포스페이트 완충액 pH 5.0이었다. 20mM 나트륨 아세테이트 완충액 pH 4.1을 사용하여 용출을 수행하였다. 용출 후 280nm에서 OD 판독하였고; CD3xEGFR 항체를 함유하는 분획을 풀링하고 0.1용적%의 1M 트리스 pH 8.0으로 중화시켰다.
3.8 에피토프 맵핑 및 시노몰구스 원숭이와의 교차 반응성
표면 플라즈몬 공명을 사용하여 EGFR 도메인 IV 내에서 에피토프를 좁히고 시노몰구스 EGFR과의 교차 반응성을 입증할 목적으로 다양한 인간 및 시노몰구스 EGFR 도메인 IV 작제물에 대한 3A6 및 10E6 항체의 결합을 평가하였다.
Biacore 2000 기기(GE)에서 측정을 수행하였다. CM5 센서 칩을 단백질 G와 공유 결합시키고, 100 RU의 3A6 또는 10E6 키메라 항체를 포획하였다. 다양한 인간 및 시노몰구스 EGFR 작제물을 HBS-EP 완충액에서 30㎕/분의 유속으로 200nM의 농도로 분석물로서 주사하였다. 해리 시간은 4분이었다. 각각의 결합 사건 후, 표면을 10㎕의 글리신 완충액 pH 1.5로 재생시켰다. EGFR 도메인 IV 작제물의 완전성을 검증하기 위해, 적어도 하나의 항-EGFR 도메인 IV 결합제(AF231, Bio-Techne AG, Zug, Switzerland)를 함유하는 것으로 공지된 폴리클로날 염소 항-EGFR을 상기 기재된 바와 같이 고정시키고, 인간 및 시노몰구스 EGFR 작제물을 상기한 바와 같이 주사하였다. 결과는 도 7에 도시되어 있다. 3A6 및 10E6 항체는 모두 인간 및 시노몰구스 EGFR-IV_556-638에 결합할 수 있었다. EGFR-IV_580-638은 항체 중 하나에 의해 결합되지 않았다. 따라서, 본 발명자들은 3A6 및 10E6 항체의 결합 에피토프가 EGFR 도메인 IV 내에, 보다 정확하게는 잔기 556-638 내에 있다고 결론을 내린다. 또한, 잔기 556-580은 에피토프의 필요한 부분을 함유한다. 또한, 본 발명자들은 3A6 및 10E6 항체가 모두 시노몰구스 EGFR에 대해 교차 반응성임을 입증한다.
3.9 10E6-최적-적합성 및 10E6-안정성 항체의 열안정성
PBS 완충액에서 10E6-최적 적합성 및 10E6-안정성 항체의 열 안정성을 시차 주사 열량 측정법(DSC)에 의해 조사하였다. VP-DSC 모세관 시차 주사 미세열량계(Malvern Instruments Ltd, Malvern, UK)에서 열량 측정을 수행하였다. 세포 용적은 0.128ml이었고, 가열 속도는 1℃/분이고, 과압은 64p.s.i.로 유지시켰다. 모든 샘플은 PBS(pH 7.4)에서 1mg/ml의 농도로 사용되었다. 단백질이 생략된 동일한 완충액을 함유하는 중복 샘플과 비교하여 각 단백질의 몰 열용량을 추정하였다. 부분적 몰 열용량 및 용융 곡선은 표준 절차를 사용하여 분석하였다. 써모그램을 기준선 보정하고, 농도를 정규화하고, Origin v7.0 소프트웨어(Malvern Instruments Ltd 제공)를 사용하여 비-두 상태(Non-Two state) 모델을 사용하여 추가로 분석하였다. 결과는 도 8에 도시되어 있다. 10E6-최적-적합성 Fab 및 10E6-안정성 Fab에 대한 용융 온도(Tm)가 결정되었고, 각각 82.8℃ 및 84.9℃였다.
실시예 4: s.c.로 이종 이식된 A549 종양에서 CD3-EGFR_1 효능
재료 및 방법
4.1. 세포주 배양 조건
세포는 37℃에서 5% CO2의 가습 분위기에서 표준 배지에서 배양했다. 세포를 주당 2 내지 3회 통과시켜 그들을 최적 컨플루언시(confluency)로 유지시키고, MycoAlert 검출 키트(LT07-318, Lonza)를 사용하여 마이코플라즈마 오염에 대해 통상적으로 시험하였다. 세포는 지속적으로 마이코플라즈마 오염이 없는지 시험했다.
4.2. 이펙터 세포: 인간 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)
La Chaux-de-Fonds 수혈 센터에서 얻은 혈액 필터에서 말초 혈액 단핵 세포(PMBC)를 수거했다. 혈액 필터 처리를 위해, 1% Liquemine®(Drossapharm)이 보충된 40ml의 PBS를 혈액 필터에 주사하고, PBMC를 함유하는 용액을 미리 피콜(GE Healthcare, 17-1440-03)이 적재된 50ml 혈액 분리 튜브(Chemie Brunschwig, PAA535710)로 수집했다. 피콜 튜브를 브레이크 없이 실온(RT)에서 800g에서 20분 동안 원심분리하고, PBMC "버피 코트" 환을 수거하고 30ml의 PBS를 함유하는 50ml 팔콘 튜브로 옮겼다. PBMC를 처리하기 전에 PBS에서 3회 세척하였다.
4.3. 동물 사육
생체내 실험은 T 세포, B 세포 및 자연 살해 세포 결핍(Harlan, Guana, France)에 의해 특징지어지는 암컷 7주령 면역결핍 NOD.CB17/AlhnRj-Prkdcscid/Rj(NOD/SCID) 마우스에서 수행되었다. 마우스를 설치류 마이크로-단리기 케이지 (20 ± 1℃ 실온, 50 ± 10% 상대 습도, 12시간 명암 주기)에서 표준화된 환경 조건하에 유지시켰다. 마우스는 조사된 음식 및 침구와 0.22㎛-여과 식수를 수용했다. 모든 실험은 스위스 동물 보호법에 따라 스위스 주 및 연방수의 당국의 사전 승인을 받아 수행되었다. 동물 보호법에 따라, 피하(s.c.) 이종 이식편에 의해 유도된 종양이 2000mm3에 도달했을 때 마우스를 안락사시켰다.
4.4. 이종 이식 실험
종양 세포(표적 세포, T) 및 PBMC(이펙터 세포, E)의 혼합물을 2:1의 E:T 비로 NOD.CB17/AlhnRj-Prkdcscid/Rj(NOD/SCID) 마우스(PBMC 공여체 당 그룹당 n = 5)의 우측 옆구리 영역에 s.c. 주사하였다.
프로토콜은 예방적이며, 치료는 세포 이식 후 3시간에 정맥내(i.v.) 투여했다.
CD3xEGFR_1은 3주 동안 1주일에 한 번 i.v. 투여했다.
종양 크기 정량화를 캘리퍼 측정에 의해 수행하였다. 종양 용적은 다음 식을 사용하여 계산하였다:
종양 용적(mm3) = 0.5 x 길이 x 너비2
요약 및 결과
도 9를 참조하면, A549 세포에서 EGFR의 발현 수준은 sABC에 의해 결정되었다. 건강한 인간 공여체로부터 얻은 A549 종양 세포 및 PBMC를 암컷 NOD/SCID 마우스의 오른쪽 옆구리에 s.c. 주사하였다. 각각의 PBMC 공여체에 대해 총 5마리의 마우스를 그래프팅하였다. CD3xEGFR_1은 3주 동안 0일째에 시작하여 일주일에 한 번 i.v. 투여하였다. 종양 성장은 섹션 4.4에서 기재된 바와 같이 외부 캘리퍼 측정에 의해 결정하였다. 대조군 마우스는 PBS로 처리하였다. 통계적 분석을 수행했다: 다중 비교를 위한 일원 분산 분석(ANOVA)에 이어 던넷 사후 분석(Dunnett's post hoc). 각 조건(대조군 또는 CD3xEGFR_1)에 대해, 2개의 PBMC 공여체가 포함되었다(조건 당 n = 10 동물).
결론적으로, CD3xEGFR_1은 A549 종양에서 효능을 나타내지 않았다.
실시예 5. 피하 이종 이식된 A549 종양에서 CD3-EGFR-SF1 및 CD3-EGFR-SF3 효능의 비교
재료 및 방법
5.1. 세포주 배양 조건
세포를 37℃에서 5% CO2의 가습 분위기에서 표준 배지에서 배양하였다. 세포를 주당 2 내지 3회 통과시켜 그들을 최적 컨플루언시로 유지시키고, MycoAlert 검출 키트(LT07-318, Lonza)를 사용하여 마이코플라즈마 오염에 대해 통상적으로 시험하였다. 세포는 지속적으로 마이코플라즈마 오염이 없는지 시험했다.
5.2. 이펙터 세포: 인간 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)
La Chaux-de-Fonds 수혈 센터에서 얻은 혈액 필터에서 말초 혈액 단핵 세포(PMBC)를 수거했다. 혈액 필터 처리를 위해, 1% Liquemine®(Drossapharm)이 보충된 40ml의 PBS를 혈액 필터에 주사하고, PBMC를 함유하는 용액을 미리 피콜(GE Healthcare, 17-1440-03)이 적재된 50ml 혈액 분리 튜브(Chemie Brunschwig, PAA535710)로 수집했다. 피콜 튜브를 브레이크 없이 실온(RT)에서 800g에서 20분 동안 원심분리하고, PBMC "버피 코트" 환을 수거하고 30ml의 PBS를 함유하는 50ml 팔콘 튜브로 옮겼다. PBMC를 처리하기 전에 PBS에서 3회 세척하였다.
5.3. 동물 사육
생체내 실험은 T 세포, B 세포 및 자연 살해 세포 결핍(Harlan, Guana, France)에 의해 특징지어지는 암컷 7주령 면역결핍 NOD.CB17/AlhnRj-Prkdcscid/Rj(NOD/SCID) 마우스에서 수행하였다. 마우스를 설치류 마이크로-단리기 케이지(20 ± 1℃ 실온, 50 ± 10% 상대 습도, 12시간 명암 주기)에서 표준화된 환경 조건하에 유지시켰다. 마우스는 조사된 음식 및 침구와 0.22㎛-여과 식수를 수용했다. 모든 실험은 스위스 동물 보호법에 따라 스위스 주 및 연방수의 당국의 사전 승인을 받아 수행되었다. 동물 보호법에 따라, 피하(s.c.) 이종 이식편에 의해 유도된 종양이 2000mm3에 도달했을 때 마우스를 안락사시켰다.
5.4. 이종 이식 실험
종양 세포(표적 세포, T) 및 PBMC(이펙터 세포, E)의 혼합물을 1:1의 E:T 비로 NOD.CB17/AlhnRj-Prkdcscid/Rj(NOD/SCID) 마우스(PBMC 공여체 당 그룹당 n = 5)의 우측 옆구리 영역에 s.c. 주사하였다.
프로토콜은 예방적이며, 치료는 세포 이식 후 3시간에 정맥내(i.v.) 투여했다.
· CD3xEGFR-SF1은 3주 동안 1주일에 한 번 i.v. 투여했다.
· CD3xEGFR-SF3은 3주 동안 1주일에 한 번 i.v. 투여했다.
종양 크기 정량화를 캘리퍼 측정에 의해 수행하였다. 종양 용적은 다음 식을 사용하여 계산하였다:
종양 용적(mm3) = 0.5 x 길이 x 너비2
5.5 통계적 치료
데이터는 Graphpad Prism 5 소프트웨어를 사용하여 분석하였고; 데이터는 평균 ± SEM으로 제시된다. 통계적 분석은 다중 비교를 위한 일원 분산 분석(ANOVA)에 이어, 던넷 사후 실험에 의해 수행하였다. P <0.05는 통계적으로 유의한 것으로 간주되었다.
요약 및 결과
도 10을 참조하면, CD3xEGFR-SF1 및 CD3xEGFR-SF3은 A549 세포에서 동일한 효능을 갖는다. A549 세포에서 EGFR의 발현 수준은 sABC에 의해 결정되었다. 건강한 인간 공여체로부터 얻은 A549 종양 세포 및 PBMC의 동일한 수(10x106)를 암컷 NOD/SCID 마우스의 오른쪽 옆구리에 s.c. 주사하였다. 각각의 PBMC 공여체에 대해 총 5마리의 마우스를 그래프팅하였다. CD3xEGFR-SF1 및 CD3xEGFR-SF3은 3주 동안 0일째에 시작하여 일주일에 한 번 i.v. 투여하였다. 종양 성장은 섹션 5.4에서 기재된 바와 같이 외부 캘리퍼 측정에 의해 결정하였다. 대조군 마우스는 PBS로 처리하였다. 통계적 분석을 수행했다: 다중 비교를 위한 일원 분산 분석(ANOVA)에 이어 던넷 사후 실험. 각 조건(대조군, CD3xEGFR-SF1 또는 CD3xEGFR-SF3)에 대해, 3개의 PBMC 공여체가 포함되었다(조건 당 n = 15 동물).
결론적으로, CD3xEGFR-SF1 및 CD3xEGFR-SF3은 이종 이식된 A549 종양에서 동일한 효능을 갖는다.
| 던넷 다중 비교 시험 | 유의성 | 요약 | 조정된 P 값 |
| CD3xEGFR-SF1 - 0.2mg/kg 대 대조군 | 존재 | *** | <0.001 |
| CD3xEGFR-SF1 - 0.04mg/kg 대 대조군 | 존재 | *** | <0.001 |
| CD3xEGFR-SF3 - 0.2mg/kg 대 대조군 | 존재 | *** | <0.001 |
| CD3xEGFR-SF3 - 0.04mg/kg 대 대조군 | 존재 | *** | <0.001 |
통계적 분석이 수행되었다: 다중 비교를 위한 일원 분산 분석(ANOVA)에 이어 던넷 사후 분석.
실시예 6: CD3xEGFR-SF3은 다른 EGFR 표적화 요법보다 더 나은 생체내 항암 효능을 나타낸다(i).
재료 및 방법
6.1. 세포주 배양 조건
세포를 37℃에서 5% CO2의 가습 분위기에서 표준 배지에서 배양하였다. 세포를 주당 2 내지 3회 통과시켜 그들을 최적 컨플루언시로 유지시키고, MycoAlert 검출 키트(LT07-318, Lonza)를 사용하여 마이코플라즈마 오염에 대해 통상적으로 시험하였다. 세포는 지속적으로 마이코플라즈마 오염에 대해 음성으로 시험되었다.
6.2. 이펙터 세포: 인간 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)
La Chaux-de-Fonds 수혈 센터에서 얻은 혈액 필터에서 말초 혈액 단핵 세포(PMBC)를 수거했다. 혈액 필터 처리를 위해, 1% Liquemine®(Drossapharm)이 보충된 40ml의 PBS를 혈액 필터에 주사하고, PBMC를 함유하는 용액을 미리 피콜(GE Healthcare, 17-1440-03)이 적재된 50ml 혈액 분리 튜브(Chemie Brunschwig, PAA535710)로 수집했다. 피콜 튜브를 브레이크 없이 실온(RT)에서 800g에서 20분 동안 원심분리하고, PBMC "버피 코트" 환을 수거하고 30ml의 PBS를 함유하는 50ml 팔콘 튜브로 옮겼다. PBMC를 처리하기 전에 PBS에서 3회 세척하였다.
6.3. 동물 사육
생체내 실험은 T 세포, B 세포 및 자연 살해 세포 결핍(Harlan, Guana, France)에 의해 특징지어지는 암컷 7주령 면역결핍 NOD.CB17/AlhnRj-Prkdcscid/Rj(NOD/SCID) 마우스에서 수행하였다. 마우스를 설치류 마이크로-단리기 케이지(20 ± 1℃ 실온, 50 ± 10% 상대 습도, 12시간 명암 주기)에서 표준화된 환경 조건하에 유지시켰다. 마우스는 조사된 음식 및 침구와 0.22㎛-여과 식수를 수용했다. 모든 실험은 스위스 동물 보호법에 따라 스위스 주 및 연방수의 당국의 사전 승인을 받아 수행되었다. 동물 보호법에 따라, 피하(s.c.) 이종 이식편에 의해 유도된 종양이 2000mm3에 도달했을 때 마우스를 안락사시켰다.
6.4. 이종 이식 실험
종양 세포(표적 세포, T) 및 PBMC(이펙터 세포, E)의 혼합물을 1:1의 E:T 비로 NOD.CB17/AlhnRj-Prkdcscid/Rj(NOD/SCID) 마우스(PBMC 공여체 당 그룹당 n = 5)의 우측 옆구리 영역에 s.c. 주사하였다.
프로토콜은 예방적이며, 치료는 세포 이식 후 3시간에 정맥내(i.v.) 투여했다.
· CD3xEGFR-SF3은 3주 동안 1주일에 한 번 i.v. 투여했다.
· 벡티빅스는 6주 동안 1주일에 두 번 i.v. 투여했다.
종양 크기 정량화를 캘리퍼 측정에 의해 수행하였다. 종양 용적은 다음 식을 사용하여 계산하였다:
종양 용적(mm3) = 0.5 x 길이 x 너비2
6.5. 통계적 치료
데이터는 Graphpad Prism 5 소프트웨어를 사용하여 분석하였고; 데이터는 평균 ± SEM으로 제시된다. 통계적 분석은 다중 비교를 위한 일원 분산 분석(ANOVA)에 이어, 던넷 사후 실험에 의해 수행하였다. P <0.05는 통계적으로 유의한 것으로 간주되었다.
요약 및 결과
도 11을 참조하면, SNU-216 세포에서 EGFR의 발현 수준은 sABC에 의해 결정되었다. 건강한 인간 공여체로부터 얻은 SNU-216 종양 세포 및 PBMC의 동일한 수(10x106)를 암컷 NOD/SCID 마우스의 오른쪽 옆구리에 s.c. 주사하였다. 각각의 PBMC 공여체에 대해 총 5마리의 마우스를 그래프팅하였다. CD3xEGFR-SF3은 3주 동안 0일째에 시작하여 일주일에 한 번 i.v. 투여하였다. 벡티빅스는 6주 동안 0일째에 시작하여 일주일에 두 번 i.v. 투여하였다. 종양 성장은 섹션 1.4에서 기재된 바와 같이 외부 캘리퍼 측정에 의해 결정되었다. 그래프는 평균 종양 크기(mm3) ± SEM을 나타낸다. 대조군 마우스는 PBS로 처리하였다. 1개의 PBMC 공여체가 포함되었다(조건당 n= 5 동물). 연구명: SNU_2.
결론적으로, CD3xEGFR-SF3은 SNU-216 종양에서 벡티빅스보다 더 우수한 효능을 나타낸다.
실시예 7
CD3XEGFR-SF3은 다른 EGFR 표적화 요법보다 더 나은 생체내 항암 효능을 나타낸다(ii).
재료 및 방법
7.1. 세포주 배양 조건
세포를 37℃에서 5% CO2의 가습 분위기에서 표준 배지에서 배양하였다. 세포를 주당 2 내지 3회 통과시켜 그들을 최적 컨플루언시로 유지시키고, MycoAlert 검출 키트(LT07-318, Lonza)를 사용하여 마이코플라즈마 오염에 대해 통상적으로 시험하였다. 세포는 지속적으로 마이코플라즈마 오염에 대해 음성으로 시험되었다.
7.2. 이펙터 세포: 인간 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)
La Chaux-de-Fonds 수혈 센터에서 얻은 혈액 필터에서 말초 혈액 단핵 세포(PMBC)를 수거했다. 혈액 필터 처리를 위해, 1% Liquemine®(Drossapharm)이 보충된 40ml의 PBS를 혈액 필터에 주사하고, PBMC를 함유하는 용액을 미리 피콜(GE Healthcare, 17-1440-03)이 적재된 50ml 혈액 분리 튜브(Chemie Brunschwig, PAA535710)로 수집했다. 피콜 튜브를 브레이크 없이 실온(RT)에서 800g에서 20분 동안 원심분리하고, PBMC "버피 코트" 환을 수거하고 30ml의 PBS를 함유하는 50ml 팔콘 튜브로 옮겼다. PBMC를 처리하기 전에 PBS에서 3회 세척하였다.
7.3. 동물 사육
생체내 실험은 T 세포, B 세포 및 자연 살해 세포 결핍(Harlan, Guana, France)에 의해 특징지어지는 암컷 7주령 면역결핍 NOD.CB17/AlhnRj-Prkdcscid/Rj(NOD/SCID) 마우스에서 수행하였다. 마우스를 설치류 마이크로-단리기 케이지(20 ± 1℃ 실온, 50 ± 10% 상대 습도, 12시간 명암 주기)에서 표준화된 환경 조건하에 유지시켰다. 마우스는 조사된 음식 및 침구와 0.22㎛-여과 식수를 수용했다. 모든 실험은 스위스 동물 보호법에 따라 스위스 주 및 연방수의 당국의 사전 승인을 받아 수행되었다. 동물 보호법에 따라, 피하(s.c.) 이종 이식편에 의해 유도된 종양이 2000mm3에 도달했을 때 마우스를 안락사시켰다.
7.4. 이종 이식 실험
종양 세포(표적 세포, T) 및 PBMC(이펙터 세포, E)의 혼합물을 1:1의 E:T 비로 NOD.CB17/AlhnRj-Prkdcscid/Rj(NOD/SCID) 마우스(PBMC 공여체 당 그룹당 n = 5)의 우측 옆구리 영역에 s.c. 주사하였다.
프로토콜은 예방적이며, 치료는 세포 이식 후 3시간에 정맥내(i.v.) 투여했다.
· CD3xEGFR-SF3은 3주 동안 1주일에 한 번 i.v. 투여했다.
· 덱사메타손은 3주 동안 1주일에 3회 i.p. 투여했다.
종양 크기 정량화를 캘리퍼 측정에 의해 수행하였다. 종양 용적은 다음 식을 사용하여 계산하였다:
종양 용적(mm3) = 0.5 x 길이 x 너비2
7.5. 통계적 치료
데이터는 Graphpad Prism 5 소프트웨어를 사용하여 분석하였고; 데이터는 평균 ± SEM으로 제시된다. 통계적 분석은 다중 비교를 위한 일원 분산 분석(ANOVA)에 이어, 던넷 사후 실험에 의해 수행하였다. P <0.05는 통계적으로 유의한 것으로 간주되었다.
요약 및 결과
도 12를 참조하면, 덱사메타손은 이종이식 모델에서 CD3xEGFR-SF3 항종양 활성에 영향을 미친다. A549 세포에서 EGFR의 발현 수준은 sABC에 의해 결정되었다. 건강한 인간 공여체로부터 얻은 A549 종양 세포 및 PBMC의 동일한 수(10x106)를 암컷 NOD/SCID 마우스의 오른쪽 옆구리에 s.c. 주사하였다. 각각의 PBMC 공여체에 대해 총 5마리의 마우스를 그래프팅하였다. CD3xEGFR-SF3은 3주 동안 0일째에 시작하여 일주일에 한 번 i.v. 투여하였다. 덱사메타손은 3주 동안 0일째에 시작하여 일주일에 3번 i.p. 투여하였다. 종양 성장은 섹션 7.4에서 기재된 바와 같이 외부 캘리퍼 측정에 의해 결정하였다. 대조군 마우스는 PBS로 처리하였다. 통계적 분석을 수행하였다: 다중 비교를 위한 일원 분산 분석(ANOVA)에 이어 던넷 사후 시험. 각각의 조건(대조군, CD3xEGFR-SF3, 덱사메타손 또는 콤보)에 대해, 1개의 PBMC 공여체가 포함되었다(조건당 n= 5 동물). (A) 그래프는 평균 종양 크기(mm3) ± SEM을 나타낸다. (B) 그래프는 37일째 마우스당 종양 성장을 나타낸다. 연구명: A549_10.
| 던넷 다중 비교 시험 | 유의성 | 요약 | 조정된 P 값 |
| 대조군 대 CD3xEGFR-SF3 - 0.05mg/kg | 존재 | **** | 0.0001 |
| 대조군 대 CD3xEGFR-SF3 - 0.05mg/kg + DEX - 0.5mg/kg | 존재 | *** | 0.0002 |
| 대조군 대 CD3xEGFR -SF3 - 0.05mg/kg + DEX - 5mg/kg | 존재 | *** | 0.0005 |
| 대조군 대 DEX - 5mg/kg | 존재 | ** | 0.0066 |
통계적 분석이 수행되었다: 다중 비교를 위한 일원 분산 분석(ANOVA)에 이어 던넷 사후 실험
결론적으로, 덱사메타손의 투여는 A549 세포의 이종이식 모델에서 CD3xEGFR-SF3 항-종양 활성을 감소시켰다.
실시예 8: 마우스 혈청에서 CD3xEGFR-SF3의 생체내 안정성
재료 및 방법
8.1. 세포주 배양 조건
세포를 37℃에서 5% CO2의 가습 분위기에서 배지에서 배양하였다. 세포를 주당 2 내지 3회 통과시켜 그들을 최적 컨플루언시로 유지시키고, MycoAlert 검출 키트(LT07-318, Lonza)를 사용하여 마이코플라즈마 오염에 대해 통상적으로 시험하였다. 세포는 지속적으로 마이코플라즈마 오염에 대해 음성으로 시험되었다.
8.2. 이펙터 세포: 인간 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)
La Chaux-de-Fonds 수혈 센터에서 얻은 혈액 필터에서 말초 혈액 단핵 세포(PMBC)를 수거했다. 혈액 필터 처리를 위해, 1% Liquemine®(Drossapharm)이 보충된 40ml의 PBS를 혈액 필터에 주사하고, PBMC를 함유하는 용액을 미리 피콜(GE Healthcare, 17-1440-03)이 적재된 50ml 혈액 분리 튜브(Chemie Brunschwig, PAA535710)로 수집했다. 피콜 튜브를 브레이크 없이 실온(RT)에서 800g에서 20분 동안 원심분리하고, PBMC "버피 코트" 환을 수거하고 30ml의 PBS를 함유하는 50ml 팔콘 튜브로 옮겼다. PBMC를 처리하기 전에 PBS에서 3회 세척하였다.
8.3. 동물 사육
생체내 실험은 T 세포, B 세포 및 자연 살해 세포 결핍(Harlan, Guana, France)에 의해 특징지어지는 암컷 7주령 면역결핍 NOD.CB17/AlhnRj-Prkdcscid/Rj(NOD/SCID) 마우스에서 수행하였다. 마우스를 설치류 마이크로-단리기 케이지(20 ± 1℃ 실온, 50 ± 10% 상대 습도, 12시간 명암 주기)에서 표준화된 환경 조건하에 유지시켰다. 마우스는 조사된 음식 및 침구와 0.22㎛-여과 식수를 수용했다. 모든 실험은 스위스 동물 보호법에 따라 스위스 주 및 연방수의 당국의 사전 승인을 받아 수행되었다. 동물 보호법에 따라, 피하(s.c.) 이종 이식편에 의해 유도된 종양이 2000mm3에 도달했을 때 마우스를 안락사시켰다.
8.4. 이종 이식 실험
- 배치 P1027이 주사된 IVS_3 (간단한 ELISA 결합 - EGFR 아암)이라 칭명된 실험에서
종양 이종 이식편이 없는 15 NOD.CB17/AlhnRj-Prkdcscid/Rj (NOD/SCID) 마우스에 2mg/kg의 CD3XEGFR-SF3 분자를 i.v.로 1회 주사하였다.
CD3XEGFR-SF3 주사 후 여러 시점의 혈액 샘플을 수행하였다: t = 0h (주사 1주일 전), t = 6h, t = 24h, t = 48h, t = 96h, t = 148h. 각각의 시점에 대해, 3 마리 마우스를 채혈하였다.
혈액 샘플을 14'000RPM에서 10분 동안 원심분리하고, 마우스 혈청을 수집하고 -20℃에서 동결시켰다.
- 배치 P1069로 주사된 IVS_3 비스 (단순한 ELISA 결합 - CD3 아암 & 이중 ELISA 결합 - CD3 및 EGFR 아암)라 칭명된 실험에서
IVS_3 연구에 사용된 마우스는 IVS_3 연구 3주 후에 재사용되었다. 주사 전 CD3xEGFR-SF3의 검출은 동물의 혈액에 CD3xEGFR-SF3이 더 이상 남아 있지 않음을 동정하기 위해 수행되었다. 종양 이종 이식편이 없는 NOD.CB17/AlhnRj-Prkdcscid/Rj (NOD/SCID) 마우스에 2mg/kg의 CD3xEGFR-SF3 분자를 i.v.로 1회 주사하였다.
CD3xEGFR-SF3 주사 후 여러 시점의 혈액 샘플을 수행하였다: t = 0h (주사 1주일 전), t = 6h, t = 24h, t = 48h, t = 96h, t = 148h. 각각의 시점에 대해, 3 마리 마우스를 채혈하였다 .
혈액 샘플을 14'000RPM에서 10분 동안 원심분리하고, 마우스 혈청을 수집하고 -20℃에서 동결시켰다.
- 배치 P1027로 주사된 IVS_4 (간단한 ELISA 결합 - EGFR 아암)라 칭명된 실험에서
종양 세포 HT29 (표적 세포, T) 및 PBMC (이펙터 세포, E)의 혼합물을 2:1의 E:T 비로 20 NOD.CB17/AlhnRj-Prkdcscid/Rj (NOD/SCID) 마우스 (PBMC 공여체 당 그룹당 n = 10)의 오른쪽 옆구리 영역에 s.c. 주사하였다 .
종양 크기 정량화를 캘리퍼 측정에 의해 수행하였다. 종양 용적은 다음 식을 사용하여 계산되었다: 종양 부피 (mm3) = 0.5 x 길이 x 폭2
종양이 150-200mm3에 도달했을 때, CD3xEGFR-SF3을 2mg/kg으로 1회 i.v. 투여하였다.
CD3xEGFR-SF3 주사 후 여러 시점의 혈액 샘플을 수행하였다: t = 6h, t = 24h, t = 48h, t = 96h, t = 148h. 각각의 시점에 대해, 4마리 마우스를 채혈하였다(대조군에서 2마리 마우스 및 CD3xEGFR-SF3 처리 그룹에서 2마리 마우스).
혈액 샘플을 14'000 RPM에서 10분 동안 원심분리하고, 마우스 혈청을 수집하고 -20℃에서 동결시켰다.
8.5. 간단한 ELISA 결합
도 13은 검정 포맷을 도시한다.
인간 EGFR-I-IV-C-His-태그된 또는 Hs CD3 1-26 N-말단 펩티드-Fc-태그된 단백질을 1x PBS에서 2㎍/ml로 희석하고, 100㎕를 96 웰 플레이트의 각 웰에 첨가하고, 4℃에서 밤새 배양하였다.
다음 날, 상청액을 제거하고 플레이트를 실온(RT)에서 1시간 동안 200㎕ PBS 2% BSA/웰로 차단하였다. 상청액을 제거했다. CD3xEGFR-SF3을 1/100 + 1/200 + 1/400 + 1/800 + 1/1600 + 1/3200에서 마우스 혈청으로 PBS 2% BSA 또는 PBS 2% BSA 스파이크에서 농도 범위로 희석하였고, 플레이트 레이아웃에 따라 100㎕의 항체 희석액을 각 웰에 첨가하였다. 샘플(마우스 처리된 혈청 -IVS3-IVS4)을 1/100 + 1/200 + 1/400 + 1/800 + 1/1600 + 1/3200으로 희석하고, 100㎕의 혈청 희석액을 플레이트 레이아웃에 따라서 각 웰에 첨가하고, RT에서 1시간 동안 배양했다. 플레이트를 PBS 0.01% 트윈으로 5회 세척하였다. 100㎕ 염소 항-인간 Fc HRP(PBS 2% BSA에서 1/1000) 또는 100㎕ 염소 항-인간 Fab HRP(PBS 2% BSA에서 1/1000)를 각 웰에 첨가하고 플레이트를 RT에서 1시간 동안 배양하였다. 플레이트를 PBS 0.01% 트윈으로 5회 세척하고, 100㎕의 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘(TMB) 용액을 각 웰에 첨가하였다. 100㎕의 H2SO4 2N/웰을 첨가하여 5분 후에 반응을 정지시켰다. 450 nm에서 흡광도를 판독하였다.
이어서, 데이터를 플롯팅하고, Prism (GraphPad) 소프트웨어를 사용하여 분석했다. STD 곡선을 수득하기 위해: GraphPad Prism 5, X = Log(X)를 사용하는 형질전환 X 값, 분석 비선형 회귀, 방정식: S자형 용량 반응을 사용했다. 샘플에서 항체 농도의 ㎍/ml로 농도를 수득하기 위해: X = Log(X)를 사용하는 형질전환 X 값으로부터 다음 방식을 사용하면 분석 비선형 회귀, 방정식: S자형 용량 반응 및 STD 곡선과 함께 혼입된 미지수 값을 다시 사용한다.
8.6. CD3 및 EGFR 상의 이중 결합 ELISA
CD3XEGFR-SF3의 표적 CD3 및 EGFR에 대한 결합을 정량화하는 이중 결합 효소-연결 면역흡착 검정(ELISA) 검정은 CD3XEGFR-SF3 생물학적 활성을 동정하기 위해 개발되었다. 도 14는 검정 포맷을 도시한다.
고 결합 96-웰 평저 플레이트를 2㎍/ml로 항파니투무맙으로 코팅하고, 플레이트를 4℃에서 밤새 배양하였다. 이어서, 플레이트를 실온에서 1시간 동안 PBS-2% BSA로 차단하였다. CD3xEGFR-SF3을 1/100 + 1/200 + 1/400 + 1/800 + 1/1600 + 1/3200에서 마우스 혈청으로 PBS 2% BSA 또는 PBS 2% BSA 스파이크에서 농도 범위로 희석하고, 플레이트 레이아웃에 따라 100㎕의 항체 희석액을 각 웰에 첨가하였다. 샘플(마우스 처리된 혈청 -IVS3-IVS4)을 1/100 + 1/200 + 1/400 + 1/800 + 1/1600 + 1/3200으로 희석하고, 100㎕의 혈청 희석액을 플레이트 레이아웃에 따라 각 웰에 첨가하고, RT에서 1시간 동안 배양하였다. 이어서, 플레이트를 PBS 0.01% 트윈으로 5회 세척하였다. 비오티닐화된 100㎕의 항-Id SP34를 0.1㎍/ml로 첨가하고, 플레이트를 RT에서 1시간 동안 배양하였다.
PBS-2% BSA 중 1/4000 희석에서 스트렙타비딘-HRP 용액을 첨가하고, 플레이트를 RT에서 1시간 동안 배양하였다. 이어서, 플레이트를 PBS 0.01% 트윈으로 5회 세척하였다. 마지막으로, 100㎕의 SuperSignal West Femto 최대 감수성 기질 용액을 각 웰에 첨가하였다. Synergy HT2-분광광도계로 발광성을 측정하였다(Gain 100, 광학 위치 상부, 방출 구멍, 통합 시간 1초, 판독 높이 1.00mm 사용).
이어서, 데이터를 플롯팅하고, Prism(GraphPad) 소프트웨어를 사용하여 분석했다. STD 곡선을 수득하기 위해: GraphPad Prism 5, X = Log(X)를 사용하는 형질전환 X 값, 분석 비선형 회귀, 방정식: S자형 용량 반응을 사용했다. 샘플에서 항체 농도의 ㎍/ml로 농도를 수득하기 위해: X = Log(X)를 사용하는 형질전환 X 값으로부터 다음 방식을 사용하면 분석 비선형 회귀, 방정식: S자형 용량 반응 및 STD 곡선과 함께 혼입된 미지수 값을 다시 사용한다.
요약 및 결과
도 15, 16 및 17을 참조하면, 간단한 이중 결합 ELISA에 의해 마우스 혈청 내 CD3XEGFR-SF3의 검출을 수행하였고, CD3xEGFR-SF3은 주사 후 1주일까지 검출되었다.
실시예 9. 스프라그-다우리 래트 혈청에서 CD3XEGFR-SF3의 약동학적 프로파일.
CD3xEGFR-SF3의 약동학을 1mg/kg 체중의 용량으로 단일 정맥내 주사 후 수컷 스프라그-다우리 래트(n = 4)에서 평가하였다. 약동학(PK) 평가를 위한 혈액 샘플을 42일(6주)의 기간 동안 투약 후 0.25, 1, 6, 24, 48, 96, 168, 336, 530, 672, 840 및 1008시간의 미리 지정된 시점에서 수집하였다.
이들 혈청 샘플에서 CD3xEGFR-SF3의 농도는 ELISA 방법을 사용하여 정량화하였다. 이 방법에서, 포획 항체로서 인간 α-파니투무맙 항체를 사용하고, 검출 항체로서 비오티닐화된 항-id 비오틴 SP34를 사용하였다. 검정의 LLOQ는 희석되지 않은 SD 래트 혈청에서 6.25ng/ml였다. 혈청 농도 대 시간 프로파일을 Phoneix WinNonlin® 버전 7.0을 사용하여 비구획 분석(NCA)에 적용하여 PK 파라미터를 추정하였다.
정맥내 볼러스 주사 후, 1시간째 동물 #M2를 제외하고 투여 후 0.25시간의 초기 시점에서 최대 농도(Cmax)가 관찰되었다. #M3을 제외한 모든 동물에서 주사 후 35일 동안 혈청 농도는 LLOQ(6.25ng/mL) 이상이었다. 동물 #M3에서, 혈청 농도는 672시간까지만 정량화할 수 있었다. 혈청 농도는 1008시간째(42일)에 모든 동물에서 LLOQ 미만이었다.
정맥내 약동학 프로파일은 4마리의 랫트 모두에서 필적할 만하였다(도 18). 혈청 농도 프로파일은 초기 분배 단계에 이은 더 긴 말단 제거 단계를 갖는 이중 지수 배치를 따르는 것으로 나타났다. CD3xEGFR-SF3은 느린 클리어런스 및 제한된 분포 용적을 나타냈다. 스프라그-다우리 랫트에서 CD3xEGFR-SF3의 말단 제거 반감기(t1/2)는 대략 4일로 추정되었다.
| 평균 PK 파라미터 | 단위 | 평균(%CV) |
| Cmax | (㎍/mL) | 19(12.9) |
| AUC0-1008 | (hr*㎍/mL) | 842.7(11) |
| AUC0-inf | (hr*㎍/mL) | 844.4(11) |
| *Tmax | (hr) | 0.25(0.25-1) |
| t1/2 | (hr) | 98.0(8.2) |
| Vz | (mL/kg) | 168.5(10.1) |
| Vss | (mL/kg) | 119.6(11.4) |
| CL | (mL/hr/kg) | 1.195(11) |
| MRTINF | (hr) | 100.11(3.5) |
*: 중앙값(범위)
Cmax: 투여 후 약물의 피크 혈장 농도. AUC: 곡선하 면적, 농도-시간 곡선의 적분. Tmax: Cmax에 도달하는 시간. T1/2, 약물의 농도가 원래 값의 절반에 도달하는데 필요한 시간. Vz: 정맥내 투여 후 말단 단계 동안 분포 용적. Vss: 정맥내 투여 후 결정된 평형에서 분포의 겉보기 용적. CL: 클리어런스, 단위 시간 당 약물의 제거된 혈장 용적. MRTINF: 평균 체류 시간 무한대.
실시예 10: 시험관내 약리학의 추가 조사
재료 및 방법
10.1 간단한 ELISA 결합
고 결합 96-웰 평저 플레이트(Corning)를 인간 EGFR-1IV-his 또는 인간 CD3 1-26 N-말단 펩티드(0.01M PBS 중 2㎍/ml)로 4℃에서 밤새 코팅시켰다. 플레이트를 실온(RT)에서 1시간 동안 PBS + 2% BSA로 차단하였다. CD3xEGFR-SF3의 연속 희석물(10㎍/ml에서 시작, 1/3 희석) 및 대조군 항체(10㎍/ml)를 PBS + 2% BSA에서 제조하고, 100㎕를 검정 플레이트로 옮기고, RT에서 1시간 동안 배양하였다. 이어서, 플레이트를 PBS + 0.01% 트윈 20으로 5회 세척하고, 항-인간 IgG (Fab) HRP (1/2000)를 RT에서 1시간 동안 첨가하였다. 플레이트를 PBS + 0.01% 트윈 20으로 5회 세척하고, 100㎕의 TMB 기질 용액(3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘)을 각 웰에 첨가하고, 100㎕의 H2SO4(2N)를 첨가하여 1 내지 10분 사이에 반응을 정지시켰다. Synergy HT2-분광광도계로 450nm에서 광학 밀도를 측정하였다.
10.2 CD3 및 EGFR 상의 이중 결합 ELISA
CD3xEGFR-SF3의 표적 CD3 및 EGFR에 대한 결합을 정량화하는 이중 결합 효소-결합 면역흡착 검정(ELISA) 검정은 CD3xEGFR-SF3 생물학적 활성을 동정하기 위해 개발되었다. 이를 위해, 인간 재조합 EGFR-Fc(2㎍/ml, 0.01M PBS)를 사용하여 고 결합 96-웰 평저 플레이트(Corning)를 4℃에서 밤새 코팅시켰다. 플레이트를 PBS + 0.01% 트윈 20으로 5회 세척하고 실온(RT)에서 1시간 동안 PBS + 2% BSA로 차단시켰다. CD3xEGFR-SF3의 연속 희석(4㎍/ml에서 시작, 1/4 희석) 및 대조군 항체를 PBS + 2% BSA에서 수행하고, 100㎕를 검정 플레이트로 옮기고 RT에서 1시간 동안 배양하였다. 이어서, 플레이트를 PBS + 0.01% 트윈 20으로 5회 세척하고, 스트렙타비딘-HRP(1/1000)로 RT에서 1시간 동안 배양하기 전에 RT에서 1시간 동안 비오티닐화된 항-인간 CD3ε(0.5㎍/ml)을 첨가하였다. 이어서, 플레이트를 PBS + 0.01% 트윈 20으로 5회 세척하고, 100㎕의 TMB 기질 용액(3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘)을 각각의 웰에 첨가하고, 100㎕의 H2SO4(2N)를 첨가함으로써 반응을 1 내지 10분 사이에 정지시켰다. Synergy HT2-분광광도계로 450nm에서 광학 밀도를 측정하였다.
10.3 간단한 FACS 결합
FBMC(CD3에 대한 결합을 평가하기 위해) 또는 NCI-H1703 편평 암 세포(EGFR에 대한 결합을 평가하기 위해)를 사용하여 FACS 간단한 결합을 수행하였다. 세포를 FACS 완충액(1X PBS + 10% Versene + 2% FBS)에 106 세포/ml로 재현탁시키고, 100㎕를 U-바닥 96-웰 플레이트에 첨가한 다음, 350g에서 3분 동안 원심분리시켰다. CD3xEGFR-SF3의 연속 희석물(10㎍/ml, 1/3 희석) 및 대조군 항체를 세포에 첨가하고, 4℃에서 30분 동안 배양하였다. 세포를 FACS 완충액으로 세척하고, 다음 항체(ThermoFishe): 항-인간 CD4 PE-eF610(1/100), 항-인간 CD8a APC(1/100) 및 항-인간 IgG(Fc-감마 특이적) PE(1/200)로 4℃에서 20분 동안 염색했다. 세포를 FACS 완충액으로 세척하고, 4℃에서 20분 동안 Sytox 그린 생존력 염료(1/200)를 함유하는 FACS 완충액에 재현탁시키고, CytoFlex(Beckman Coulter)에서 획득하였다.
10.4 항체 의존적 세포 매개 세포독성(ADCC) 검정
이펙터 세포의 경우, 피콜 구배 정제를 사용하여 전혈 필터로부터 PBMC를 수거하였다. 간략하게, 리퀘민(Drossapharm)을 함유하는 PBS를 필터에 주사하고, 피콜이 적재된 50ml 혈액 분리 튜브(SepMate-50; Stemcell)로 수집하고, 1200g에서 10분 동안 원심분리시켰다. PBMCS를 수거하고 제조업자의 프로토콜에 따라 NK 세포 단리 키트(eBiosciences)를 사용하여 NK 세포를 단리시키기 전에 PBS로 3회 세척하였다. 단리된 NK를 106 세포/mL로 재현탁시키고, 37℃에서 IL-2(100U/mL Peprotech)와 함께 밤새 배양하였다. 표적 세포에 대해, HPB-ALL, A-431 및 A549를 ADDC 배지(RPMI + 2% FCS + 1% Glut + 1% NEAA + 1% NaPyr + 1% P/S)로 세척하고, CDC 배지에 0.2 x 106 세포/ml로 재현탁시켰다. CD3xEGFR-SF3의 연속 희석물(80nM, 1/10 희석) 및 대조군 항체를 표적 세포에 첨가하고(1:1 비), 37℃에서 15-20분 동안 배양하였다. 처리되지 않은 표적 세포를 사용하여 자발적 사멸(낮은 기준선)을 수득하였다. 열-충격 세포를 사용하여 최대 사멸(상위 기준선)을 수득하였다(세포를 -80℃에서 동결시키고, 3회 해동시켰다). 이어서, NK 세포(50,000 세포)를 첨가하고(E:T 비 5:1), 샘플을 37℃에서 4.5시간 동안 배양하였다. A549 및 A-413의 경우, 샘플을 350g에서 3분 동안 원심분리시키고, 상청액을 수거하고, 제조업체의 프로토콜에 따라 CytoTox 96R 비-방사성 세포독성 검정(Promega)을 사용하여 세포독성(LDH 방출)에 대해 분석하였다. 간략하게, 상청액을 50㎕의 정지 용액으로 정지시키기 전에 20 내지 60분 동안 LDH 기질 용액으로 배양하고, 플레이트를 시너지 HT2-분광광도계로 490nM에서 판독하였다. HPB-ALL 세포의 경우, 세포를 CytoFlex(Beckman Coulter) 상의 분석을 위해 7-AAD(1/100)를 함유하는 1X PBS + 10% Versene + 2% FBS에 재현탁시켰다.
10.5 보체 의존적 세포독성(CDC) 검정
표적 세포(A549 또는 HPB-ALL)를 CDC 배지(RPMI + 2% FCS + 1% Glut + 1% NEAA + 1% NaPyr + 1% P/S)로 세척하고, CDC 배지에 106 세포/mL로 재현탁시켰다. CD3xEGFR-SF3의 연속 희석물(100nM, 1/5 희석) 및 대조군 항체를 표적 세포에 첨가하고(1:1 비), 15%의 베이비 래빗 보체를 첨가하기 전에 37℃에서 15분 동안 배양하였다. 처리되지 않은 표적 세포를 사용하여 자발적 사멸(낮은 기준선)을 수득하였다. 열-충격 세포에 의해 최대 사멸(상위 기준선)을 수득하였다(세포를 -80℃에서 동결시키고, 3회 해동시켰다). 샘플을 37℃에서 4.5시간 동안 배양하였고, 350g에서 3분 동안 원심분리시켰다. A549 세포의 경우, 상청액을 수거하고 제조업체의 프로토콜에 따라 CytoTox 96R 비-방사성 세포독성 검정(Promega)을 사용하여 세포독성(LDH 방출)에 대해 분석하였다. 간단히, 상청액을 50㎕의 정지 용액으로 정지시키기 전에 20 내지 60분 동안 LDH 기질 용액으로 배양하고, 플레이트를 Synergy HT2-분광광도계로 490nM에서 판독하였다. HPB-ALL 세포의 경우, 세포를 CytoFlex(Beckman Coulter)에서 획득하기 위해 7-AAD(1/100)를 함유하는 1X PBS + 10% Versene + 2% FBS에 재현탁시켰다. FlowJo(BD)를 사용하여 데이터를 분석하였다.
10.6 정상 밀도 PBMC 검정
피콜 구배 정제를 사용하여 전혈 필터로부터 PBMC를 수거하였다. 간략하게, 리퀘민(Drossapharm)을 함유하는 PBS를 필터에 주사하고, 피콜이 적재된 50ml 혈액 분리 튜브(SepMate-50; Stemcell)에 수집하고, 1200g에서 10분 동안 원심분리하였다. PBMCS를 수거하고, PBS로 3회 세척하고, 106 세포/ml로 재현탁시키고, 96-웰 플레이트에 시딩하고, CD3xEGFR-SF3의 연속 희석물(10㎍/ml, 1/3 희석) 및 대조군 항체의 존재하에 37℃에서 24시간 동안 또는 48시간 동안 배양하였다.
활성화 마커를 유세포 분석으로 24시간 및 48시간에 평가하였다. 세포를 다음 항체(ThermoFisher): 항-인간 CD4 PE-eF610, CD8 AF700, CD25 PE 및 CD69 PeCy7로 4℃에서 20분 동안 염색한 후, 1X PBS + 10% Versene + 2% FBS로 세척하고 350g에서 3분 동안 원심분리하고, 4℃에서 20분 동안 Sytox 그린 생존력 염료(1/2000)를 함유하는 1X PBS + 10% Versene + 2% FBS에 재현탁시키고, CytoFlex(Beckman Coulter)에서 획득하였다. FlowJo(BD)를 사용하여 데이터를 분석하였다.
24시간 및 48시간에 사이토카인 방출을 위해, 플레이트를 350g에서 5분 동안 원심분리하고, 상청액을 수거하고, 사이토카인을 제조업체의 프로토콜에 따라 Luminex에 의해 정량화하였다.
증식을 평가하기 위해, 30시간 배양 후 3H-티미딘(0.5uCu/웰)을 첨가하고, 섬광 유체가 베타 섬광 계수기를 사용하여 백만당 계수(cpm)를 판독하기 전에 첨가된 사용자 필터메이트 필터를 48시간 시점에 수거한다.
10.7 고밀도 PBMC 검정에서 비특이적 T 세포 활성화
피콜 구배 정제를 사용하여 전혈 필터로부터 PBMC를 수거하였다. 간략하게, 리퀘민(Drossapharm)을 함유하는 PBS를 필터에 주사하고, 피콜이 적재된 50ml 혈액 분리 튜브(SepMate-50; Stemcell)로 수집하고, 1200g에서 10분 동안 원심분리하였다. PBMC를 수거하고, PBS로 3회 세척하고 37℃에서 48시간 동안 배양을 위해 107 세포/ml로 24-웰 플레이트에 시딩하였다. 이어서, 세포를 350g에서 5분 동안 원심분리하고, 96-웰 플레이트에 106 세포/ml의 정상 밀도로 재현탁시키고, CD3xEGFR-SF3(10㎍/ml, 1/3)의 연속 희석물 및 대조군 항체의 존재하에 37℃에서 24시간 동안 배양했다. 방출된 사이토카인을 측정하기 위해, 플레이트를 350g에서 5분 동안 원심분리하고, 상청액을 수거하고 사이토카인을 제조업체의 프로토콜에 따라 Luminex에 의해 정량화하였다.
10.8 전혈 검정(WBA)
신선한 전혈을 건강한 지원자로부터 수거하고, 0.5ml/웰을 48-웰 플레이트에 시딩하였다. CD3xEGFR-SF3(10㎍/ml, 1/10 희석)의 연속 희석물 및 대조군 항체의 존재하에 혈액을 37℃에서 24시간 동안 배양하였다. 샘플을 3000g에서 5분 동안 원심분리하고 상청액을 수거하고, 1/2로 희석하고, 방출된 사이토카인을 제조업체의 프로토콜에 따라 Luminex에 의해 정량화하였다.
10.9 재지시된 용해 검정(RDL)
표적 세포로서 사용하기 위해 ATCC로부터 다양한 세포주를 수득하고, 트립신으로 2-3회/주로 통과시켜 공급업체가 권장하는 배지에서 최적의 컨플루언시로 유지시켰다. 세포는 Mycoalert 검출 키트(LT07-318, Lonza)를 사용하여 마이코플라즈마 오염에 대해 통상적으로 시험하였고, 지속적으로 음성이었다. 각각의 검정 전에, 표면 EGFR 발현을 동정하기 위해 세포를 특이적 항체 결합 용량(sABC; QIFIKIT®)에 대해 평가하였다.
피콜 구배 정제를 사용하여 전혈 필터로부터 PBMC(이펙터 세포)를 수거하였다. 간략하게, 리퀘민(Drossapharm)을 함유하는 PBS를 필터에 주사하고, 피콜이 적재된 50ml 혈액 분리 튜브(SepMate-50; Stemcell)로 수집하고, 1200g에서 10분 동안 원심분리하였다. PBMCS를 수거하고, PBS로 3회 세척하고 2x106 세포/ml로 재현탁시켰다.
재지시된 용해를 위해, 표적 세포(T; 1x104 세포/웰) 및 이펙터 세포(E; 1x105 세포/웰)(E:T 비율 10:1)를 96-웰 평저 플레이트에 플레이팅하여 48시간 동안 37℃에서 CD3xEGFR-SF3(10nM, 1/10 희석)의 연속 희석물 및 대조군 항체의 존재하에 배양하였다. 표적 세포의 생존력은 제조업체의 프로토콜에 따라 CellTiter 96® AQueous 한 용액 세포 증식 검정(Promega)을 사용하는 MTS 검정에 의해 48시간 평가하였다. 간단히, 플레이트를 3회 세척한 다음, MTS 용액을 웰에 첨가하였다. 플레이트를 Synergy HT2-분광광도계에서 490nm에서 판독하였다. 플레이트는 최대 사멸(용해 용액을 사용하여 사멸된 표적만)과 자발적 사멸(표적만 갖는 웰) 사이에 충분한 차이가 관찰될 때 유효한 것으로 간주되었다.
10.10 데이터 및 통계적 분석
용량 반응 분석: 데이터를 프리즘(GraphPad)을 사용하여 플롯팅하고 분석하였다. 데이터는 X = Log(X)를 사용하여 먼저 변환시켰다. 변환된 데이터를 사용하여 a 4 파라미터 로지스틱 회귀(4PL) 피팅을 적용하여 S자형 용량-반응 곡선(1로 고정된 사면(Hillslope))을 유도했다. 시험된 샘플의 최대 효능의 백분율 F에 상응하는 ECF 값(F = 20, 50 및 80)을 곡선 피팅에 따라 수득했다.
유세포 분석 데이터: 데이터를 FlowJo(BD)를 사용하여 분석하고, 평균 형광 강도(MFI), 특이적 세포 집단의 백분율 또는 ul에 의한 사건을 추출하였다. 이어서, 데이터를 각 실험을 위해 처리했다.
Luminex 데이터: Luminex 데이터는 ProcartaPlex 분석가(eBioscience)를 사용하여 분석하였다. 사이토카인 농도를 정량화의 상한치 및 하한치로 정규화하였다.
특정 ADCC 사멸 식의 백분율:
샘플이 샘플에서 측정된 사멸에 상응하는 경우, RS는 자발적 사멸에 상응하고 RM은 최대 사멸에 상응한다. 이어서, 특정 사멸의 백분율은 용량 반응 분석 방법을 사용하여 분석하였다.
특정 CDC 사멸 식의 백분율:
% 특정 사멸샘플이 샘플에 대해 측정된 특정 사멸에 상응하는 경우, % 특정 사멸항체 부재는 비처리된 표적에 대한 특정 사멸에 상응한다. 이어서, 특정 사멸 백분율은 용량 반응 분석 방법을 사용하여 분석하였다.
RDL에서 특정 사멸 식의 백분율:
Abs490nm(샘플)가 샘플에 대해 수득된 OD에 상응하는 경우, Abs490nm(자발적 사멸)는 표적 유일 웰의 평균에 대해 수득된 OD에 상응하고 Abs490nm(최대 사멸)는 용해된 표적 세포에 대해서만 수득된 평균 OD에 상응한다. 이러한 방식으로 수득된 백분율은 상기 기재된 용량 반응 분석 방법을 사용하여 추가로 분석하였다.
공여체 배제: 공여체 배제는 JMP 소프트웨어를 사용하여 수행하였다.
RDL 공여체 배제: 용량 반응 곡선의 피팅이 R2 < 0.7를 갖는 경우, 또는 어떤 mAb 샘플도 40%보다 큰 특정 사멸을 갖지 않는 경우, 공여체를 배제시켰다.
안전성 실험 공여체 배제: 판독 데이터(활성화 백분율, 증식 또는 사이토카인 농도)를 각 공여체에 대한 치료에 대해 개별적으로 적합화했다. 이어서, mAb 부재 조건을 대조군으로 사용하여 던넷 비교 시험을 수행하였다. mAb 부재 조건과 그 공여체에 대한 적어도 하나의 양성 대조군 사이에 통계적 차이가 없는 경우 공여체를 배제시켰다.
통계적 분석: 통계적 비교는 JMP를 사용하여 수행하였다. 치료의 효과, 치료의 농도 및 치료의 배치를 비교하기 위해 적합한 최소 제곱 내포 모델을 수행하였다. 모델 피팅 후, mAb 부재 조건 및 IgG 이소타입 조건을 대조군으로서 사용하여 던넷 비교를 수행하였다. 이러한 비교는 공여체 배제 후 및 각 시점(적용가능한 경우)에 대해 개별적으로 수행하였다.
요약 및 결과
CD3xEGFR-SF3 생물학적 활성을 동정하고 CD3xEGFR-SF3의 표적 CD3 및 EGFR에 대한 결합을 정량화하기 위해, ELISA 검정을 수행하였다.
특히, CD3xEGFR-SF3 및 대조군 항체의 용량 반응은 코팅된 인간 CD3-FC 또는 인간 EGFR his-태그 상에서 배양한 후, HRP(단일 EGFR 또는 CD3; 각각 도 19A 및 B)와 결합된 항-인간 IgG Fab 또는 huCD3-비오틴에 이어, HRP-커플링된 스트렙타비 딘(이중 결합; 도 19C)으로 검출시켰다. 표 4는 3개의 독립적 복제물의 S자형 용량-반응 결합 곡선으로부터 추출된 EC20, 50 및 80 값을 나타낸다(도 19).
| ELISA 결합 | EC20(㎍/ml) | EC50(㎍/ml) | EC80(㎍/ml) |
| 단일 EGFR(A) | 0.0132 ± 0.004 | 0.053 ± 0.016 | 0.053 ± 0.016 |
| 단일 CD3(B) | 0.023 ± 0.001 | 0.091 ± 0.005 | 0.363 ± 0.022 |
| 이중 결합(C) | 0.043 ± 0.01 | 0.171 ± 0.04 | 0.685 ± 0.18 |
값은 평균 ± SEM을 나타낸다.
CD3 및 EGFR에 대한 CD3xEGFR-SF3 결합을 추가로 평가하기 위해, FACS 간단한 결합을 각각 PBMC 또는 NCI-H1703 편평 암 세포를 사용하여 수행하였다. 특히 CD3xEGFR-SF3 및 대조군 항체의 용량 반응을 PBMCS(도 20 A-C) 또는 편평 암 세포주 NCI-H1703(도 20D) 상에서 배양하고, PE-표지된 항-인간 IgG(Fc-γ)로 검출시켰다. PBMC의 경우, 세포는 또한 항-CD4 또는 항-CD8 항체로 표지화했다. 표 5는 3개의 독립적인 복제물(도 20)의 비선형 s자형 회귀 결합 곡선으로부터 추출된 EC20, 50, 80 값을 나타낸다.
| FACS 결합 | / | EC20(㎍/ml) | EC50(㎍/ml) | EC80(㎍/ml) |
| CD3 | T 세포(A) | 1.48 ± 0.32 | 5.93 ± 1.29 | 23.74 ± 5.162 |
| CD4+ T 세포(B) | 1.51 ± 0.29 | 6.05 ± 1.16 | 24.22 ± 4.67 | |
| CD8+ T 세포(C) | 0.976 ± 0.43 | 3.91 ± 1.75 | 15.617 ± 6.99 | |
| EGFR | NCI-H1703(D) | 0.046 ± 0.01 | 0.182 ± 0.05 | 0.730 ± 0.2 |
값은 평균 ± SEM을 나타낸다.
다양한 EGFR-발현 인간 암 세포주의 재지시된 용해를 유도하는 CD3xEGFR-SF3 의 능력을 평가하기 위해, 표적 암 세포(T) 및 이펙터 세포(E; PBMC)를 CD3xEGFR-SF3 또는 대조군 항체의 용량 반응의 존재하에 1:10의 E:T 비에서 배양하였다. 암 세포의 재지시된 용해는 세포독성 검정(MTS)에 의해 결정되었다. EC50 값은 특정 사멸의 S자형 용량-반응 곡선으로부터 추출하였다(도 21). 세포주 재지시된 용해는 통계적으로 상이하였다(일원 ANOVA; F= 5, 6; p <0.0001). 결론적으로, CD3xEGFR-SF3은 시험된 모든 EGFR-발현 인간 암 세포주의 재지시된 용해를 유도한다.
CD3xEGFR-SF3의 항체-의존적 세포-매개 세포독성(ADCC)은 EGFR + 암종 세포주 A-431 및 A549(도 22A)뿐만 아니라, CD3 + HPB-ALL 세포(도 22B)에서 평가되었고, 특정 사멸의 S자형 용량-반응 곡선으로부터 추출된 EC50 값으로 나타냈다. CD3xEGFR-SF3에 의한 치료는 A-431 및 A549 둘 다에서 얼비툭스와 비교하여(도 22A; 최소 제곱 모델, F = 29, p <0.0001) 및 HPB-ALL 세포에서 인간 항-SP34 항체와 비교하여(도 22B; T 테스트, t = 3, p <0.05) ADCC를 감소시켰다. 결론적으로, CD3xEGFR-SF3은 시험된 EGFR- 또는 CD3-발현 세포주에서 ADCC를 유도하지 않는다.
특이적 보체-의존적 세포독성(CDC)은 EGFR + 암종 세포 A549(도 23A)뿐만 아니라 CD3 + HPB-ALL 세포(도 23B)에서 평가하였고, EC50 값은 특정 CDC의 S자형 용량-반응 곡선으로부터 추출되었다. A549 및 HPB-ALL 세포 둘 다에 대해, CD3xEGFR-SF3은 임의의 특정 보체-의존적 세포독성을 유도하지 않는다.
비특이적 세포 증식에 대한 CD3xEGFR-SF3의 효과를 평가하기 위해, 건강한 공여체(n = 19)로부터의 PBMC를 증가하는 용량의 CD3xEGFR-SF3 또는 대조군의 존재하에 48시간 동안 배양하였다. 48시간에 3H-티미딘의 혼입을 측정하여 증식을 평가하였다(도 24). 증식의 통계적 분석은 적합한 최소 제곱 모델에 이어 던넷 비교를 사용하여 수행하여 mAb 부재 대조군(도 25a) 또는 이소타입 대조군(도 25b)에 대한 평균을 비교하였다.
mAb 부재 조건과 비교하여, CD3xEGFR-SF3은 CD3xEGFR-SF3 AE042 및 P1069의 배치의 고농도에서 가장 최근의 벌크 약물 물질인 TRS 배치에서 관찰되지 않은 약간의 증식을 유발하였다. 이소타입 대조군과 비교할 때, CD3xEGFR-SF3만이 최고 농도(5㎍/ml)에서 AE042 배치에서 통계적으로 유의한 증식을 유도하였다. 수성 또는 습윤 코팅된 형태의 CD3xEGFR-SF3의 다른 배치는 이소타입 대조군과 비교하여 임의의 유의한 증식 증가를 유도하지 않았다. 결론적으로, CD3xEGFR-SF3의 TRS 배치는 PBMC 검정에서 임의의 증식을 유도하지 않는다.
CD3xEGFR이 CD4+ T 세포의 비특이적 활성화를 유도할 수 있는지를 평가하기 위해, 건강한 공여체(n = 23)의 PBMC를 증가하는 용량의 CD3xEGFR-SF3 또는 대조군의 존재하에 24시간 또는 48시간 동안 배양하였다. CD4+ T 세포의 활성화는 유세포 분석에 의해 T 세포 활성화 마커 CD69의 발현으로서 측정되었다(도 26). CD4+ T 세포 활성화의 통계적 분석은 적합한 최소 제곱 모델에 이어 던넷 비교를 이용하여 각각의 시점에 대해 수행하여 mAb 부재 대조군(도 27a 및 b) 또는 이소타입 대조군(도 28a 및 b)에 대한 평균을 비교하였다.
mAb 부재 조건과 비교될 경우(즉, 가장 엄격한 비교), 고농도(1-10㎍/ml)에서 CD3xEGFR-SF3의 코팅된 및 수성 TRS 배치, 및 5㎍/㎖에서 CD3xEGFR-SF3 수성 AE042 배치만이 24시간 및 48시간에 CD4+ T 세포의 비특이적 활성화를 유도하였고, 수성이지만 코팅되지 않은 CD3xEGFR-SF3 배치 P1069(0.005㎍/ml에서 시작하는 농도에서)는 48시간에 CD4+ T 세포 활성화를 유도하였다. 이소타입 대조군과 비교될 경우, 시험된 CD3xEGFR-SF3의 배치 중 어느 것도 24시간에 비특이적 CD4+ T 세포의 활성화를 유도하지 않았고, 48시간에는 CD3xEGFR-SF3의 TRS 배치가 아닌 배치 AE042 및 P1069의 수성 형태의 최고 농도(5㎍/㎖)만이 CD4+ T 세포의 활성화를 유도하였다. 결론적으로, 이소타입 항체와 비교하여 CD3xEGFR-SF3의 TRS 배치는 비특이적 PBMC에서 통계적으로 유의한 CD4+ T 세포 활성화를 유도하지 않는다.
CD3xEGFR이 CD8+ T 세포의 비특이적 활성화를 유도할 수 있는지를 평가하기 위해, 건강한 공여체(n = 23)의 PBMC를 증가하는 용량의 CD3xEGFR-SF3 또는 대조군의 존재하에 24시간 또는 48시간 동안 배양하였다. CD8+ T 세포의 활성화는 유세포 분석에 의해 활성화 마커 CD69의 발현으로서 측정되었다(도 29). CD8+ T 세포 활성화의 통계적 분석은 적합한 최소 제곱 모델에 이어 던넷 비교를 사용하여 각 시점에 대해 수행하여 mAb 부재 대조군(도 30a 및 b) 또는 이소타입 대조군(도 31a 및 b)에 대한 평균을 비교하였다.
mAb 부재 조건과 비교될 경우(즉, 가장 엄격한 비교), 고농도(1-10㎍/ml)에서 수성이거나 코팅된 상이한 배치의 CDxEGFR-SF3은 PBMC 검정에서 24시간 및 48시간에 CD8+ T 세포 활성화를 유도하였다. 이소타입 대조군과 비교될 경우, 24시간 에는 10㎍/ml가 아닌 1㎍/ml에서 CD3xEGFR-SF3의 코팅된 TRS 배치만이 CD8+ T 세포 활성화를 유도하였고, 48시간에는 상이한 배치의 최고 농도만이 CD8+ T 세포 활성화를 유도하였다. 결론적으로, 이소타입 항체와 비교하여, CD3xEGFR-SF3은 저용량에서 비특이적 PBMC 검정에서 통계적으로 유의한 CD8+ T 세포 활성화를 유도하지 않는다.
임상적 환경에서 임의의 잠재적인 사이토카인 방출을 예측하기 위해, PBMC는 사이토카인 방출 검정을 위한 전임상 시험에서 통상적으로 사용된다(참조: Stebbings et al. J Immunol 179:3325-3331 (2007)). CD3xEGFR-SF3이 비특이적 T 세포 사이토카인 반응을 유도할 수 있는지의 여부를 평가하기 위해, 건강한 공여체(n = 23)의 PBMC를 증가하는 용량의 CD3xEGFR-SF3 또는 대조군의 존재하에 24시간 동안 배양하였고, 방출된 IL-2, IL-6, TNF-α 및 IFN-γ의 수준은 상청액에서 Luminex에 의해 측정되었다(도 32). 방출된 사이토카인의 통계적 분석은 적합한 최소 제곱 모델에 이어 던넷 비교를 사용하여 각 시점에 대해 수행하여 mAb 부재 대조군(도 33a-d) 또는 이소타입 대조군(도 34a-d)에 대한 평균을 비교하였다.
mAb 부재 조건과 비교될 경우(즉, 가장 엄격한 비교), CD3xEGFR-SF3의 배치 중 어느 것도 IL-2의 방출을 유도하지 않았고, CD3xEGFR-SF3의 수성 AE042 배치만이 IL-6의 방출을 유도하였고, CD3xEGFR-SF3의 코팅된 AE042 및 P1069 배치의 고용량(0.5 및 5㎍/ml)만이 비특이적 T 세포 검정에서 IFN-γ 및 TNF-α 방출을 유도하였다. 이소타입 대조군과 비교될 때, CD3xEGFR-SF3은 24시간에는 IL-2 또는 IFN-γ의 방출을 유도하지 않았고, IL-6은 최고 농도에서 CD3xEGFR-SF3의 수성 AE042 배치의 존재하에서만 유도되었고, TNF-α는 단지 최고 농도에서 CD3xEGFR-SF3의 코팅된 P1069 배치에 의해서였다. 요약하면, CD3xEGFR-SF3만이 PBMC와의 24시간 배양 후 배치-의존적 방식으로 시험된 최고 농도에서 IL-2 또는 IFN-γ가 아니라 IL-6 및 TNF-α의 방출을 유도한다.
건강한 공여체(n = 23)의 PBMC를 증가하는 용량의 CD3xEGFR-SF3 또는 대조군의 존재하에 48시간 동안 배양하였고, 방출된 IL-2, IL-6, TNF-α 및 IFN-γ의 수준을 상청액에서 Luminex에 의해 측정하였다(도 35). 방출된 사이토카인의 통계적 분석은 적합한 최소 제곱 모델에 이어 던넷 비교를 사용하여 각 시점에 대해 수행하여 mAb 부재 대조군(도 36a-d) 또는 이소타입 대조군(도 37a-d)에 대한 평균을 비교하였다.
mAb 부재 조건과 비교될 경우(즉, 가장 엄격한 비교), CD3xEGFR-SF3의 배치 중 어느 것도 IL-2 또는 IFN-γ의 방출을 유도하지 않았으며, 고농도에서 코팅된 CD3xEGFR-SF3만이 TNF-α의 방출을 유도하였고, IL-6 방출은 CD3xEGFR-SF3의 배치 및 농도에 따라 훨씬 더 가변적이었다. 이소타입 대조군과 비교될 경우, CD3xEGFR-SF3은 IL-2 또는 IFN-γ의 임의의 방출을 유도하지 않았으며, 코팅된 CD3xEGFR-SF3은 고농도에서만 TNF-α의 방출을 유도하였고, IL-6 방출은 CD3xEGFR-SF3의 수성이지만 코팅되지 않은 AE042 배치(0.05, 0.5 및 5㎍/㎖)로, 코팅된 TRS에서는 임의의 고농도에서가 아니라 0.01 및 0.1㎍/ml에서 유도하였다. 요약하면, CD3xEGFR-SF3만이 PBMC와의 48시간 배양 후 배치-의존적 방식으로 고농도에서 IL-2 및 IFN-γ가 아니라 IL-6 및 TNF-α의 방출을 유도한다.
PBMC의 고밀도 전배양 후 가용성 mAbs와의 배양은 사이토카인 방출 검정 방법으로서 사용되어 mAb의 전임상 안전성을 평가한다(참조: Romer et al. Blood 118:6772-6782 (2011)). 건강한 공여체(n = 16)의 PBMC를 고밀도(107 세포/ml)로 48시간 동안 예비배양하였다. 이어서, 세포를 정상 밀도(106 세포/ml)로 플레이팅하고, 증가하는 용량의 수성 CD3xEGFR-SF3 또는 대조군의 존재하에 24시간 동안 배양하고, 방출된 IL-2, IL-6, TNF-α 및 IFN-γ의 수준은 상청액에서 Luminex에 의해 측정하였다(도 38). 방출된 사이토카인의 통계적 분석은 적합한 최소 제곱 모델에 이어 던넷 비교를 사용하여 수행하여 mAb 부재 대조군(도 39a-d) 또는 이소타입 대조군(도 40a-d)에 대한 평균을 비교하였다. CD3xEGFR-SF3은 고밀도 PBMC 검정에서 처리되지 않은(mAb 부재) 조건 또는 이소타입 대조군과 비교하여 IL-2, IL-6, TNF-α 또는 IFN-γ의 수준의 임의의 유의한 증가를 유도하지 않았다.
전혈 검정은 모노클로날 항체 요법으로의 주사 후 임상 환경에서 사이토카인의 잠재적 방출을 동정하기 위한 위험 평가 방법으로서 널리 사용된다(참조: Vessillier et al. Immunol Methods 424:43-52 (2015)). CD3xEGFR-SF3이 사이토카인 생성을 유도할 수 있는지를 평가하기 위해, 건강한 지원자(n = 16)의 전혈을 증가하는 용량의 CD3xEGFR-SF3 또는 대조군의 존재하에 24시간 동안 배양하고, IL-2, IL-6, TNF-α, 및 IFN-γ의 혈장 수준은 상청액에서 Luminex로 측정하였다(도 41). 방출된 사이토카인의 통계적 분석은 적합한 최소 제곱 모델에 이어 던넷 비교를 사용하여 수행하여 mAb 부재 대조군(도 42a-d) 또는 이소타입 대조군(도 43a-d)에 대한 평균을 비교하였다. CD3xEGFR-SF3은 전혈 검정에서 처리되지 않은(mAb 부재) 조건 또는 이소타입 대조군과 비교하여 IL-2, IL-6, TNF-α 또는 IFN-γ의 수준의 임의의 유의한 증가를 유도하지 않았다.
실시예 11. NOD SCID 이종 이식 마우스 모델에서 CD3xEGFR_SF3의 추가의 생체내 특성화
재료 및 방법
11.1 세포주 배양 조건
A549 세포를 37℃에서 5% CO2의 가습 분위기에서 배지에서 배양하였다. 세포를 주당 2 내지 3회 통과시켜 그들을 최적 컨플루언시로 유지시키고, MycoAlert 검출 키트를 사용하여 마이코플라즈마 오염에 대해 통상적으로 시험하였다. 세포는 지속적으로 음성으로 시험되었다.
11.2. 이펙터 세포: 인간 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)
La Chaux-de-Fonds 수혈 센터에서 얻은 혈액 필터에서 말초 혈액 단핵 세포(PMBC)를 수거했다. 혈액 필터 처리를 위해, 1% Liquemine®(Drossapharm)이 보충된 40ml의 PBS를 혈액 필터에 주사하고, PBMC를 함유하는 용액을 미리 피콜(GE Healthcare)이 적재된 50ml 혈액 분리 튜브(Chemie Brunschwig)로 수집했다. 피콜 튜브를 브레이크 없이 실온(RT)에서 800g에서 20분 동안 원심분리하고, PBMC "버피 코트" 환을 수거하고 30ml의 PBS를 함유하는 50ml 팔콘 튜브로 옮겼다. PBMC를 처리하기 전에 PBS에서 3회 세척하였다.
11.3. 동물 사육
생체내 실험은 T 세포, B 세포 및 자연 살해 세포 결핍(Envigo)에 의해 특징지어지는 암컷 6-7주령 면역결핍 NOD.CB17/AlhnRj-Prkdcscid/Rj(NOD/SCID) 마우스에서 수행하였다. 마우스를 설치류 마이크로-단리기 케이지(20 ± 1℃ 실온, 50 ± 10% 상대 습도, 12시간 명암 주기)에서 표준화된 환경 조건하에 유지시켰다. 마우스는 조사된 음식 및 침구와 0.22㎛-여과 식수를 수용했다. 모든 실험은 스위스 동물 보호법에 따라 주 및 연방 수의 당국의 사전 승인을 받아 수행하였다.
11.4. 이종 이식 실험
종양 세포(표적 세포, T) 및 PBMC(이펙터 세포, E)의 혼합물을 2:1의 E:T 비로 NOD.CB17/AlhnRj-Prkdcscid/Rj(NOD/SCID) 마우스(PBMC 공여체 당 그룹당 n = 4 내지 5)의 우측 옆구리 영역에 s.c. 주사하였다. 프로토콜은 치료적이며, 치료는 세포 이식 후 2일째에 정맥내(i.v.) 투여했다. CD3xEGFR-SF3(P1069)은 2mg/kg에서 3주 동안 1주일에 한 번 i.v. 투여했다. 종양 크기 정량화를 캘리퍼 측정에 의해 수행하였다. 종양 용적은 다음 식을 사용하여 계산하였다: 종양 용적(mm3) = 0.5 x 길이 x 너비2.
11.5. 통계적 분석
데이터는 Graphpad Prism 5 소프트웨어를 사용하여 분석하였고; 데이터는 평균 ± SEM으로 제시된다. 통계적 분석은 맨-휘트니 테스트(Mann-Whitney test)에 의해 수행하였다. P <0.05는 통계적으로 유의한 것으로 간주되었다.
요약 및 결과
41일째에, CD3xEGFR-SF3 처리 그룹에서, 종양 용적의 평균은 대조군에서 1059mm3에 비해 488mm3이었다(참조: 도 44 및 45). CD3xEGFR-SF3은 유의한 A549 종양 성장 감소를 유도하였다.
SEQUENCE LISTING
<110> GLENMARK PHARMACEUTICALS S.A.
<120> T CELL REDIRECTING BISPECIFIC ANTIBODIES FOR
THE TREATMENT OF EGFR POSITIVE CANCERS
<130> IPA191299-US
<150> EP 17167709.9
<151> 2017-04-24
<160> 52
<170> PatentIn version 3.5
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370 375 380
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Gly Ser Glu Ile Val Val Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser
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<220>
<223> SEQ ID NO: 013 Gly4Ser linker
<400> 13
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 14
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SEQ ID NO: 014 Gly4Thr linker
<400> 14
Gly Gly Gly Gly Thr
1 5
<210> 15
<211> 624
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 15
Leu Glu Glu Lys Lys Val Cys Gln Gly Thr Ser Asn Lys Leu Thr Gln
1 5 10 15
Leu Gly Thr Phe Glu Asp His Phe Leu Ser Leu Gln Arg Met Phe Asn
20 25 30
Asn Cys Glu Val Val Leu Gly Asn Leu Glu Ile Thr Tyr Val Gln Arg
35 40 45
Asn Tyr Asp Leu Ser Phe Leu Lys Thr Ile Gln Glu Val Ala Gly Tyr
50 55 60
Val Leu Ile Ala Leu Asn Thr Val Glu Arg Ile Pro Leu Glu Asn Leu
65 70 75 80
Gln Ile Ile Arg Gly Asn Met Tyr Tyr Glu Asn Ser Tyr Ala Leu Ala
85 90 95
Val Leu Ser Asn Tyr Asp Ala Asn Lys Thr Gly Leu Lys Glu Leu Pro
100 105 110
Met Arg Asn Leu Gln Glu Ile Leu His Gly Ala Val Arg Phe Ser Asn
115 120 125
Asn Pro Ala Leu Cys Asn Val Glu Ser Ile Gln Trp Arg Asp Ile Val
130 135 140
Ser Ser Asp Phe Leu Ser Asn Met Ser Met Asp Phe Gln Asn His Leu
145 150 155 160
Gly Ser Cys Gln Lys Cys Asp Pro Ser Cys Pro Asn Gly Ser Cys Trp
165 170 175
Gly Ala Gly Glu Glu Asn Cys Gln Lys Leu Thr Lys Ile Ile Cys Ala
180 185 190
Gln Gln Cys Ser Gly Arg Cys Arg Gly Lys Ser Pro Ser Asp Cys Cys
195 200 205
His Asn Gln Cys Ala Ala Gly Cys Thr Gly Pro Arg Glu Ser Asp Cys
210 215 220
Leu Val Cys Arg Lys Phe Arg Asp Glu Ala Thr Cys Lys Asp Thr Cys
225 230 235 240
Pro Pro Leu Met Leu Tyr Asn Pro Thr Thr Tyr Gln Met Asp Val Asn
245 250 255
Pro Glu Gly Lys Tyr Ser Phe Gly Ala Thr Cys Val Lys Lys Cys Pro
260 265 270
Arg Asn Tyr Val Val Thr Asp His Gly Ser Cys Val Arg Ala Cys Gly
275 280 285
Ala Asp Ser Tyr Glu Met Glu Glu Asp Gly Val Arg Lys Cys Lys Lys
290 295 300
Cys Glu Gly Pro Cys Arg Lys Val Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly Glu
305 310 315 320
Phe Lys Asp Ser Leu Ser Ile Asn Ala Thr Asn Ile Lys His Phe Lys
325 330 335
Asn Cys Thr Ser Ile Ser Gly Asp Leu His Ile Leu Pro Val Ala Phe
340 345 350
Arg Gly Asp Ser Phe Thr His Thr Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu Leu
355 360 365
Asp Ile Leu Lys Thr Val Lys Glu Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile Gln
370 375 380
Ala Trp Pro Glu Asn Arg Thr Asp Leu His Ala Phe Glu Asn Leu Glu
385 390 395 400
Ile Ile Arg Gly Arg Thr Lys Gln His Gly Gln Phe Ser Leu Ala Val
405 410 415
Val Ser Leu Asn Ile Thr Ser Leu Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu Ile
420 425 430
Ser Asp Gly Asp Val Ile Ile Ser Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr Ala
435 440 445
Asn Thr Ile Asn Trp Lys Lys Leu Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys Thr
450 455 460
Lys Ile Ile Ser Asn Arg Gly Glu Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly Gln
465 470 475 480
Val Cys His Ala Leu Cys Ser Pro Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu Pro
485 490 495
Arg Asp Cys Val Ser Cys Arg Asn Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys Val
500 505 510
Asp Lys Cys Asn Leu Leu Glu Gly Glu Pro Arg Glu Phe Val Glu Asn
515 520 525
Ser Glu Cys Ile Gln Cys His Pro Glu Cys Leu Pro Gln Ala Met Asn
530 535 540
Ile Thr Cys Thr Gly Arg Gly Pro Asp Asn Cys Ile Gln Cys Ala His
545 550 555 560
Tyr Ile Asp Gly Pro His Cys Val Lys Thr Cys Pro Ala Gly Val Met
565 570 575
Gly Glu Asn Asn Thr Leu Val Trp Lys Tyr Ala Asp Ala Gly His Val
580 585 590
Cys His Leu Cys His Pro Asn Cys Thr Tyr Gly Cys Thr Gly Pro Gly
595 600 605
Leu Glu Gly Cys Pro Thr Ser Ala His His His His His His His His
610 615 620
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<211> 144
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SEQ ID NO: 016 hEGFR-IV_505-638
<400> 16
Val Cys His Ala Leu Cys Ser Pro Glu Gly Cys Ala Gly Pro Glu Pro
1 5 10 15
Arg Asp Cys Val Ser Cys Arg Asn Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys Val
20 25 30
Asp Lys Cys Asn Leu Leu Glu Gly Glu Pro Arg Glu Phe Val Glu Asn
35 40 45
Ser Glu Cys Ile Gln Cys His Pro Glu Cys Leu Pro Gln Ala Met Asn
50 55 60
Ile Thr Cys Thr Gly Arg Gly Pro Asp Asn Cys Ile Gln Cys Ala His
65 70 75 80
Tyr Ile Asp Gly Pro His Cys Val Lys Thr Cys Pro Ala Gly Val Met
85 90 95
Gly Glu Asn Asn Thr Leu Val Trp Lys Tyr Ala Asp Ala Gly His Val
100 105 110
Cys His Leu Cys His Pro Asn Cys Thr Tyr Gly Cys Thr Gly Pro Gly
115 120 125
Leu Glu Gly Cys Pro Thr Ser Ala His His His His His His His His
130 135 140
<210> 17
<211> 93
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SEQ ID NO: 017 hEGFR-IV_556-638
<400> 17
Ile Gln Cys His Pro Glu Cys Leu Pro Gln Ala Met Asn Ile Thr Cys
1 5 10 15
Thr Gly Arg Gly Pro Asp Asn Cys Ile Gln Cys Ala His Tyr Ile Asp
20 25 30
Gly Pro His Cys Val Lys Thr Cys Pro Ala Gly Val Met Gly Glu Asn
35 40 45
Asn Thr Leu Val Trp Lys Tyr Ala Asp Ala Gly His Val Cys His Leu
50 55 60
Cys His Pro Asn Cys Thr Tyr Gly Cys Thr Gly Pro Gly Leu Glu Gly
65 70 75 80
Cys Pro Thr Ser Ala His His His His His His His His
85 90
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<211> 69
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
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<400> 18
Ile Gln Cys Ala His Tyr Ile Asp Gly Pro His Cys Val Lys Thr Cys
1 5 10 15
Pro Ala Gly Val Met Gly Glu Asn Asn Thr Leu Val Trp Lys Tyr Ala
20 25 30
Asp Ala Gly His Val Cys His Leu Cys His Pro Asn Cys Thr Tyr Gly
35 40 45
Cys Thr Gly Pro Gly Leu Glu Gly Cys Pro Thr Ser Ala His His His
50 55 60
His His His His His
65
<210> 19
<211> 93
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SEQ ID NO: 019 cEGFR-IV_556-638
<400> 19
Ile Gln Cys His Pro Glu Cys Leu Pro Gln Val Met Asn Ile Thr Cys
1 5 10 15
Thr Gly Arg Gly Pro Asp Asn Cys Ile Gln Cys Ala His Tyr Ile Asp
20 25 30
Gly Pro His Cys Val Lys Thr Cys Pro Ala Gly Val Met Gly Glu Asn
35 40 45
Asn Thr Leu Val Trp Lys Tyr Ala Asp Ala Gly His Val Cys His Leu
50 55 60
Cys His Pro Asn Cys Thr Tyr Gly Cys Thr Gly Pro Gly Leu Glu Gly
65 70 75 80
Cys Ala Arg Ser Ala His His His His His His His His
85 90
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<211> 69
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SEQ ID NO: 020 cEGFR-IV_580-638
<400> 20
Ile Gln Cys Ala His Tyr Ile Asp Gly Pro His Cys Val Lys Thr Cys
1 5 10 15
Pro Ala Gly Val Met Gly Glu Asn Asn Thr Leu Val Trp Lys Tyr Ala
20 25 30
Asp Ala Gly His Val Cys His Leu Cys His Pro Asn Cys Thr Tyr Gly
35 40 45
Cys Thr Gly Pro Gly Leu Glu Gly Cys Ala Arg Ser Ala His His His
50 55 60
His His His His His
65
<210> 21
<211> 624
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SEQ ID NO: 021 hEGFR-I-II-III_hErbB3-IV
<400> 21
Leu Glu Glu Lys Lys Val Cys Gln Gly Thr Ser Asn Lys Leu Thr Gln
1 5 10 15
Leu Gly Thr Phe Glu Asp His Phe Leu Ser Leu Gln Arg Met Phe Asn
20 25 30
Asn Cys Glu Val Val Leu Gly Asn Leu Glu Ile Thr Tyr Val Gln Arg
35 40 45
Asn Tyr Asp Leu Ser Phe Leu Lys Thr Ile Gln Glu Val Ala Gly Tyr
50 55 60
Val Leu Ile Ala Leu Asn Thr Val Glu Arg Ile Pro Leu Glu Asn Leu
65 70 75 80
Gln Ile Ile Arg Gly Asn Met Tyr Tyr Glu Asn Ser Tyr Ala Leu Ala
85 90 95
Val Leu Ser Asn Tyr Asp Ala Asn Lys Thr Gly Leu Lys Glu Leu Pro
100 105 110
Met Arg Asn Leu Gln Glu Ile Leu His Gly Ala Val Arg Phe Ser Asn
115 120 125
Asn Pro Ala Leu Cys Asn Val Glu Ser Ile Gln Trp Arg Asp Ile Val
130 135 140
Ser Ser Asp Phe Leu Ser Asn Met Ser Met Asp Phe Gln Asn His Leu
145 150 155 160
Gly Ser Cys Gln Lys Cys Asp Pro Ser Cys Pro Asn Gly Ser Cys Trp
165 170 175
Gly Ala Gly Glu Glu Asn Cys Gln Lys Leu Thr Lys Ile Ile Cys Ala
180 185 190
Gln Gln Cys Ser Gly Arg Cys Arg Gly Lys Ser Pro Ser Asp Cys Cys
195 200 205
His Asn Gln Cys Ala Ala Gly Cys Thr Gly Pro Arg Glu Ser Asp Cys
210 215 220
Leu Val Cys Arg Lys Phe Arg Asp Glu Ala Thr Cys Lys Asp Thr Cys
225 230 235 240
Pro Pro Leu Met Leu Tyr Asn Pro Thr Thr Tyr Gln Met Asp Val Asn
245 250 255
Pro Glu Gly Lys Tyr Ser Phe Gly Ala Thr Cys Val Lys Lys Cys Pro
260 265 270
Arg Asn Tyr Val Val Thr Asp His Gly Ser Cys Val Arg Ala Cys Gly
275 280 285
Ala Asp Ser Tyr Glu Met Glu Glu Asp Gly Val Arg Lys Cys Lys Lys
290 295 300
Cys Glu Gly Pro Cys Arg Lys Val Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly Glu
305 310 315 320
Phe Lys Asp Ser Leu Ser Ile Asn Ala Thr Asn Ile Lys His Phe Lys
325 330 335
Asn Cys Thr Ser Ile Ser Gly Asp Leu His Ile Leu Pro Val Ala Phe
340 345 350
Arg Gly Asp Ser Phe Thr His Thr Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu Leu
355 360 365
Asp Ile Leu Lys Thr Val Lys Glu Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile Gln
370 375 380
Ala Trp Pro Glu Asn Arg Thr Asp Leu His Ala Phe Glu Asn Leu Glu
385 390 395 400
Ile Ile Arg Gly Arg Thr Lys Gln His Gly Gln Phe Ser Leu Ala Val
405 410 415
Val Ser Leu Asn Ile Thr Ser Leu Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu Ile
420 425 430
Ser Asp Gly Asp Val Ile Ile Ser Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr Ala
435 440 445
Asn Thr Ile Asn Trp Lys Lys Leu Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys Thr
450 455 460
Lys Ile Ile Ser Asn Arg Gly Glu Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly Gln
465 470 475 480
Val Cys His Ala Leu Cys Ser Pro Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu Pro
485 490 495
Arg Asp Cys Leu Ser Cys Arg Asn Tyr Ser Arg Gly Gly Val Cys Val
500 505 510
Thr His Cys Asn Phe Leu Asn Gly Glu Pro Arg Glu Phe Ala His Glu
515 520 525
Ala Glu Cys Phe Ser Cys His Pro Glu Cys Gln Pro Met Glu Gly Thr
530 535 540
Ala Thr Cys Asn Gly Ser Gly Ser Asp Thr Cys Ala Gln Cys Ala His
545 550 555 560
Phe Arg Asp Gly Pro His Cys Val Ser Ser Cys Pro His Gly Val Leu
565 570 575
Gly Ala Lys Gly Pro Ile Tyr Lys Tyr Pro Asp Val Gln Asn Glu Cys
580 585 590
Arg Pro Cys His Glu Asn Cys Thr Gln Gly Cys Lys Gly Pro Glu Leu
595 600 605
Gln Asp Cys Leu Gly Gln Ser Ala His His His His His His His His
610 615 620
<210> 22
<211> 623
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SEQ ID NO: 022 hErbB3-I-II-III_hEGFR-IV
<400> 22
Ser Glu Val Gly Asn Ser Gln Ala Val Cys Pro Gly Thr Leu Asn Gly
1 5 10 15
Leu Ser Val Thr Gly Asp Ala Glu Asn Gln Tyr Gln Thr Leu Tyr Lys
20 25 30
Leu Tyr Glu Arg Cys Glu Val Val Met Gly Asn Leu Glu Ile Val Leu
35 40 45
Thr Gly His Asn Ala Asp Leu Ser Phe Leu Gln Trp Ile Arg Glu Val
50 55 60
Thr Gly Tyr Val Leu Val Ala Met Asn Glu Phe Ser Thr Leu Pro Leu
65 70 75 80
Pro Asn Leu Arg Val Val Arg Gly Thr Gln Val Tyr Asp Gly Lys Phe
85 90 95
Ala Ile Phe Val Met Leu Asn Tyr Asn Thr Asn Ser Ser His Ala Leu
100 105 110
Arg Gln Leu Arg Leu Thr Gln Leu Thr Glu Ile Leu Ser Gly Gly Val
115 120 125
Tyr Ile Glu Lys Asn Asp Lys Leu Cys His Met Asp Thr Ile Asp Trp
130 135 140
Arg Asp Ile Val Arg Asp Arg Asp Ala Glu Ile Val Val Lys Asp Asn
145 150 155 160
Gly Arg Ser Cys Pro Pro Cys His Glu Val Cys Lys Gly Arg Cys Trp
165 170 175
Gly Pro Gly Ser Glu Asp Cys Gln Thr Leu Thr Lys Thr Ile Cys Ala
180 185 190
Pro Gln Cys Asn Gly His Cys Phe Gly Pro Asn Pro Asn Gln Cys Cys
195 200 205
His Asp Glu Cys Ala Gly Gly Cys Ser Gly Pro Gln Asp Thr Asp Cys
210 215 220
Phe Ala Cys Arg His Phe Asn Asp Ser Gly Ala Cys Val Pro Arg Cys
225 230 235 240
Pro Gln Pro Leu Val Tyr Asn Lys Leu Thr Phe Gln Leu Glu Pro Asn
245 250 255
Pro His Thr Lys Tyr Gln Tyr Gly Gly Val Cys Val Ala Ser Cys Pro
260 265 270
His Asn Phe Val Val Asp Gln Thr Ser Cys Val Arg Ala Cys Pro Pro
275 280 285
Asp Lys Met Glu Val Asp Lys Asn Gly Leu Lys Met Cys Glu Pro Cys
290 295 300
Gly Gly Leu Cys Pro Lys Ala Cys Glu Gly Thr Gly Ser Gly Ser Arg
305 310 315 320
Phe Gln Thr Val Asp Ser Ser Asn Ile Asp Gly Phe Val Asn Cys Thr
325 330 335
Lys Ile Leu Gly Asn Leu Asp Phe Leu Ile Thr Gly Leu Asn Gly Asp
340 345 350
Pro Trp His Lys Ile Pro Ala Leu Asp Pro Glu Lys Leu Asn Val Phe
355 360 365
Arg Thr Val Arg Glu Ile Thr Gly Tyr Leu Asn Ile Gln Ser Trp Pro
370 375 380
Pro His Met His Asn Phe Ser Val Phe Ser Asn Leu Thr Thr Ile Gly
385 390 395 400
Gly Arg Ser Leu Tyr Asn Arg Gly Phe Ser Leu Leu Ile Met Lys Asn
405 410 415
Leu Asn Val Thr Ser Leu Gly Phe Arg Ser Leu Lys Glu Ile Ser Ala
420 425 430
Gly Arg Ile Tyr Ile Ser Ala Asn Arg Gln Leu Cys Tyr His His Ser
435 440 445
Leu Asn Trp Thr Lys Val Leu Arg Gly Pro Thr Glu Glu Arg Leu Asp
450 455 460
Ile Lys His Asn Arg Pro Arg Arg Asp Cys Val Ala Glu Gly Lys Val
465 470 475 480
Cys Asp Pro Leu Cys Ser Ser Gly Gly Cys Trp Gly Pro Gly Pro Gly
485 490 495
Gln Cys Val Ser Cys Arg Asn Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys Val Asp
500 505 510
Lys Cys Asn Leu Leu Glu Gly Glu Pro Arg Glu Phe Val Glu Asn Ser
515 520 525
Glu Cys Ile Gln Cys His Pro Glu Cys Leu Pro Gln Ala Met Asn Ile
530 535 540
Thr Cys Thr Gly Arg Gly Pro Asp Asn Cys Ile Gln Cys Ala His Tyr
545 550 555 560
Ile Asp Gly Pro His Cys Val Lys Thr Cys Pro Ala Gly Val Met Gly
565 570 575
Glu Asn Asn Thr Leu Val Trp Lys Tyr Ala Asp Ala Gly His Val Cys
580 585 590
His Leu Cys His Pro Asn Cys Thr Tyr Gly Cys Thr Gly Pro Gly Leu
595 600 605
Glu Gly Cys Pro Thr Ser Ala His His His His His His His His
610 615 620
<210> 23
<211> 451
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SEQ ID NO: 023 3A6_VH_IGG1
<400> 23
Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Ser Tyr
20 25 30
Gly Val His Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Val Ile Trp Ser Gly Gly Thr Thr Asp Tyr Asn Ala Ala Phe Ile
50 55 60
Ser Arg Leu Ser Ile Ser Gln Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Phe
65 70 75 80
Lys Met Asn Ser Leu Gln Ala Asn Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Gly Asn Gln Gly Arg Thr Val Arg Pro Thr Trp Phe Ala Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly Lys
450
<210> 24
<211> 214
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SEQ ID NO: 024 3A6_VL_cK
<400> 24
Asp Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Val Ser Phe Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Ser
20 25 30
Ile His Trp Tyr Gln Gln Arg Ala Asn Gly Ser Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Ser
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala His Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Ser Asn Trp Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 25
<211> 450
<212> PRT
<213> SEQ ID NO: 025 10E6_VH_IGG1
<400> 25
Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Arg Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Thr Gly Tyr Ser Leu Thr Ser Asp
20 25 30
Tyr Ala Trp Ser Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Arg Leu Glu Trp
35 40 45
Met Val Tyr Ile Thr Tyr Ser Gly Ile Thr Thr Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Ser Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe
65 70 75 80
Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Gly Gly Asp Tyr Gly Leu Ser Ser Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly Lys
450
<210> 26
<211> 214
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SEQ ID NO: 026 10E6_VL_cK
<400> 26
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Val Thr Leu Ser Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ser Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser His Glu Ser Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Thr
65 70 75 80
Glu Asp Phe Gly Met Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Asn Asn Trp Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
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Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
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165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
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Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
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340 345 350
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355 360 365
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Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
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Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
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115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
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165 170 175
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420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
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Gly Lys
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<213> Artificial Sequence
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20 25 30
Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
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50 55 60
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Ser Arg Leu Ser Ile Ser Gln Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Phe
65 70 75 80
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130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
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180 185 190
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Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
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Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Lys Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
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420 425 430
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50 55 60
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Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val Val
130 135 140
Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr
145 150 155 160
Leu Ser Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Glu Ser Asn Tyr Ala
165 170 175
Asn Trp Val Gln Glu Lys Pro Gly Gln Ala Phe Arg Gly Leu Ile Gly
180 185 190
Gly Ala Asn Lys Arg Ala Pro Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
195 200 205
Leu Ser Gly Asp Glu Ala Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser Glu
210 215 220
Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Leu Phe Tyr Ser Asn Thr Trp Val
225 230 235 240
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Thr Asp
245 250 255
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly
260 265 270
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
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Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
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Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
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370 375 380
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420 425 430
Leu Glu Ser Asp Gly Ser Phe Ala Leu Ser Ser Arg Leu Arg Val Asp
435 440 445
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
450 455 460
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
465 470 475 480
Gly Lys
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Ser Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Thr Gly Tyr Ser Leu Thr Ser Asp
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Tyr Ala Trp Ser Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Arg Leu Glu Trp
35 40 45
Met Val Tyr Ile Thr Tyr Ser Gly Ile Thr Thr Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Ser Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe
65 70 75 80
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Ala Gly Gly Asp Tyr Gly Leu Ser Ser Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
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Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Gln Phe Lys Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Phe Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Ala Val Tyr
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Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Lys Leu
355 360 365
Val Cys Leu Val Thr Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Ser Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Tyr Thr Thr Pro Pro Met
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Ser Leu Val Ser Trp Leu Asn Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Ile Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly Lys
450
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SEQ ID NO: 051 CD3xEGFR_7 Chain A
<400> 51
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
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Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Ser Tyr
20 25 30
Gly Val His Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Val Ile Trp Ser Gly Gly Thr Thr Asp Tyr Asn Ala Ala Phe Ile
50 55 60
Ser Arg Leu Thr Ile Ser Gln Asp Asn Ser Lys Asn Gln Val Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
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Gly Asn Gln Gly Arg Thr Val Arg Pro Thr Trp Phe Ala Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Lys Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Phe
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Ala Val
340 345 350
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Lys
355 360 365
Leu Val Cys Leu Val Thr Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Ser Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Tyr Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Ser Leu Val Ser Trp Leu Asn Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Ile Phe Ser Cys Ser Val Met
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His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
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Pro Gly Lys
450
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SEQ ID NO: 052 CD3xEGFR_8 Chain A
<400> 52
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Tyr Ala Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
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50 55 60
Lys Ser Arg Ile Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser
65 70 75 80
Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
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Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
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Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
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Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
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Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Gln Phe Lys Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Phe Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
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340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Lys Leu
355 360 365
Val Cys Leu Val Thr Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
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Glu Ser Ser Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Tyr Thr Thr Pro Pro Met
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Ser Leu Val Ser Trp Leu Asn Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Ile Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly Lys
450
Claims (8)
- CD3ε 및 EGFR 상에서 에피토프에 결합하는 CD3xEGFR 이중특이적 항체.
- 제1항에 있어서, 적어도 하나의 FAB 및 하나의 scFv 부분을 포함하는, CD3xEGFR 이중특이적 항체.
- 제2항에 있어서, 상기 적어도 하나의 FAB 및 하나의 scFv 부분이 서로 연결되어 있는, CD3xEGFR 이중특이적 항체.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, CD3xEGFR_SF1(서열번호 4, 5 및 6), CD3xEGFR_SF3(서열번호 7, 2 및 8), CD3xEGFR_SF4(서열번호 4, 5 및 9), CD3xEGFR_SD1(서열번호 1, 2 및 10) 및 CD3xEGFR_SD2(서열번호 11, 10 및 2)를 포함하는 그룹으로부터 선택된, CD3xEGFR 이중특이적 항체.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 약제로서 사용하기 위한, CD3xEGFR 이중특이적 항체.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, EGFR 발현 암의 치료로서 사용하기 위한, CD3xEGFR 이중특이적 항체.
- 제6항에 있어서, 상기 EGFR 발현 암이 하나 이상의 KRAS 또는 B-Raf 돌연변이를 추가로 포함하는, CD3xEGFR 이중특이적 항체.
- 인간 EGFR의 도메인 4에 결합하는 항체 또는 이의 단편으로서, 서열번호 23 및 24, 서열번호 25 및 26, 서열번호 31 및 33, 서열번호 32 및 34, 서열번호 36 및 38, 서열번호 37 및 39의 그룹으로부터 선택되거나 이로부터 유도된 중쇄 및 경쇄 가변 서열을 포함하는 항체 또는 이의 단편.
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