KR20190137820A - 펩티드 리가아제 및 그의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 2 개의 펩티드 태그 또는 링커의 공유 컨쥬게이션을 촉진할 수 있는 폴리펩티드에 관한 것으로, 특히 a) 서열식별번호: 1에 명시된 바와 같은 아미노산 서열; 또는 b) 서열식별번호: 1에 명시된 바와 같은 서열과 적어도 80 %의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드로서, 상기 아미노산 서열은 위치 61에서의 글루탐산, 및 1) 위치 66에서 프롤린; 2) 위치 95에서 프롤린; 3) 위치 96에서 글리신; 및 4) 위치 97에서 발린 중 1개 이상을 포함하고, 상기 특정된 아미노산 잔기는 서열식별번호: 1에서의 위치와 동등한 위치에 있고, 상기 폴리펩티드는 서열식별번호: 2의 위치 9에서의 라이신 잔기와 서열식별번호: 3의 위치 17에서의 아스파라긴 잔기 사이에서 이소펩티드 결합의 형성을 촉진할 수 있는 것인 폴리펩티드에 관한 것이다.

Description

펩티드 리가아제 및 그의 용도
본 발명은 2 개의 펩티드 태그 또는 링커의 공유 컨쥬게이션을 촉진할 수 있는 폴리펩티드에 관한 것이다. 특히, 본 발명의 폴리펩티드는 2 개의 특정 펩티드 태그 또는 링커 사이에서 이소펩티드 결합의 형성을 촉진할 수 있으며, 즉, 본 발명의 폴리펩티드는 펩티드 리가아제로 볼 수 있다. 본 발명은 또한 본 발명의 펩티드 리가아제에 의해 효율적으로 컨쥬게이션될 수 있는 (즉, 이소펩티드 결합을 통해 공유 결합, 커플링 또는 연결될 수 있는) 펩티드 태그 또는 링커를 제공한다. 상기 폴리펩티드 (펩티드 리가아제) 및 펩티드 태그를 인코딩하는 핵산 분자, 상기 핵산 분자를 포함하는 벡터 및 상기 벡터와 핵산 분자를 포함하는 숙주 세포가 또한 제공된다. 상기 펩티드 태그, 폴리펩티드 및/또는 핵산 분자/벡터를 포함하는 키트가 또한 제공된다. 상기 폴리펩티드 (펩티드 리가아제) 및/또는 펩티드 태그의 생성 방법 및 본 발명의 폴리펩티드 및 펩티드 태그의 용도가 또한 제공된다.
생물학적 현상은 일반적으로 다수의 단백질의 협동 활동에 좌우되고 복합체 내 단백질의 정확한 배열이 그의 기능에 영향을 미치고 결정한다. 따라서, 제어된 방식으로 복합체 내에서 개별 단백질을 배열하는 능력은 단백질 기능을 특성규명하는데 있어서 유용한 툴(tool)을 대표한다. 또한, 소위 "융합 단백질"을 형성하기 위한 다수 단백질의 컨쥬게이션은 유용한 특징을 갖는 분자를 초래할 수 있다. 예를 들어, 단일 종류의 단백질의 클러스터링은 종종 생물학적 신호, 예컨대, 백신에 대한 반복 항원 구조를 크게 향상시킨다. 상이한 활성을 갖는 단백질의 클러스터링은 또한 개선된 활성을 갖는 복합체, 예를 들어 효소에 의한 기질 채널링을 초래할 수 있다.
펩티드 태그는 그의 작은 크기가 단백질 기능에 대한 섭동을 최소화하기 때문에 단백질 분석 및 변형을 위한 편리한 툴이다. 펩티드 태그는 유전자 인코딩하기에 간단하고, 그의 작은 크기는 다른 상호작용과의 간섭, 생합성 비용 및 면역원성(immunogenecity) 도입을 감소시킨다. 그러나, 펩티드 태그간의 상호작용은 좀처럼 친화도가 높지 않으며, 이는 안정한 복합체를 형성하는데 있어서 이들의 유용성을 제한한다.
자발적 이소펩티드 결합 형성이 가능한 단백질은 서로 공유 결합하고 비가역적인 상호작용을 제공하는 펩티드 태그/결합 파트너 쌍을 개발하기 위해 유리하게 사용되어왔다 (예를 들어, WO 제2011/098772호 및 WO 제2016/193746호는 모두 본원에 참조로 포함됨). 이와 관련하여, 자발적 이소펩티드 결합 형성이 가능한 단백질은 별도의 단편으로 발현될 수 있어서, 펩티드 태그 및 상기 펩티드 태그에 대한 결합 파트너를 제공할 수 있으며, 상기 2개의 단편은 이소펩티드 결합 형성에 의해 공유적으로 재구성될 수 있다. 상기 펩티드 태그 및 결합 파트너 쌍에 의해 형성된 이소펩티드 결합은 비-공유적 상호작용이 빠르게 해리되는 조건 하에서, 예를 들어 장시간 (예: 수 주)에 걸쳐, 고온 (적어도 95 ℃ 까지)에서, 강한 힘으로, 또는 강한 화학 처리 (예: pH 2-11, 유기 용매, 세정제 또는 변성제)에 의해 안정하다.
이소펩티드 결합은 카복실/카복스아미드와 아미노 기 사이에 형성된 아미드 결합이며, 상기 카복실 또는 아미노 기 중 적어도 1개는 상기 단백질 주쇄 (상기 단백질의 골격)의 외부에 있다. 이러한 결합은 전형적인 생물학적 조건 하에서 화학적으로 비가역적이고, 이들은 대부분의 프로테아제에 대해 저항성이 있다. 이소펩티드 결합은 본질적으로 공유성이기 때문에, 이들은 가장 강한 측정된 단백질 상호작용을 초래한다.
요약하면, 펩티드 태그/결합 파트너 쌍은 이소펩티드 결합을 자발적으로 형성할 수 있는 단백질 (이소펩티드 단백질)로부터 유래될 수 있으며, 상기 단백질의 도메인은, 상기 이소펩티드 결합에 관련된 잔기 중 1개(예를 들어, 라이신)를 포함하는 펩티드 태그, 및 상기 이소펩티드 결합에 관련된 다른 잔기 (예를 들어, 아스파라긴 또는 아스파테이트) 및 상기 이소펩티드 결합을 형성하는데 필요한 적어도 1개의 다른 잔기 (예를 들어, 글루타메이트)를 포함하는 펩티드 결합 파트너 (또는 "캐처")를 생성하도록 개별적으로 발현된다. 상기 펩티드 태그와 결합 파트너의 혼합은 상기 태그와 결합 파트너 사이에서 이소펩티드 결합의 자발적 형성을 초래한다. 따라서, 상기 펩티드 태그 및 결합 파트너를 상이한 분자, 예를 들어 단백질에 개별적으로 융합시킴으로써, 상기 펩티드 태그와 결합 파트너 사이에 형성된 이소펩티드 결합을 통해 상기 분자를 함께 공유적으로 연결할 수 있다.
이소펩티드 단백질로부터 유래된 펩티드 태그/결합 파트너 쌍 (태그/캐처 시스템이라고도 알려져 있음, 예를 들어, SpyTag와 SpyCatcher)은 전 세계에서 다양한 용도로 밝혀졌으며, 그의 유용성은 융합 파트너로서 결합 파트너 ("캐처")의 크기에 의해 제한되었다. 이소펩티드 단백질로부터 유래된 펩티드 태그 결합 파트너 ("캐처")는 전형적으로 80 개 초과의 아미노산, 예를 들어 적어도 90 또는 100 개의 아미노산을 포함하는데, 이는 많은 문제점을 야기한다.
예를 들어, 태그/캐처 시스템은 바이러스-유사 입자를 항원으로 장식하는데 유용성을 갖는 것으로 밝혀졌고(예: 문헌[Brune et al. 2016, Scientific Reports, 6: 19234]), 여기서 바이러스-유사 입자는 캐처에 융합되어, 상기 태그에 융합된 임의의 항원을 디스플레이하는데 사용될 수 있는 백신 시스템 플랫폼을 생성한다. 그러나, "캐처"의 큰 크기는 이들이 높은 면역원성이 갖는 경향이 더 크고, 백신 시스템 플랫폼의 생성에서 태그/캐처 시스템의 사용을 손상시킬 수 있음을 의미한다. 이러한 플랫폼을 사용하여 생성된 백신은 표적 항원보다는 상기 캐처에 대한 항체 또는 T 세포의 유도를 초래할 수 있다. 이러한 면역원성은 또한 2 개의 별도 질병에 대한 순차적 백신접종을 위해 동일한 백신 시스템 플랫폼을 사용하지 못하도록 할 수 있다.
태그/캐처 시스템에서 캐처의 큰 크기는 또한 융합 분자, 예컨대, 융합 단백질에서 이들의 위치를 제한한다. 캐처는 일반적으로 단백질 접힘에 대한 간섭을 피하기 위해 단백질 말단에 융합될 필요가 있다. 또한, 캐처는 부분적으로 접힌 단백질처럼 보이고, 그래서, 발현 수율을 감소시킬 수 있다.
상기 캐처의 크기에 의해 야기되는 태그/캐처 시스템의 추가적인 중요한 제한은 상기 태그와 캐처 사이의 반응의 유도성에 관한 것이다. 전형적으로, 태그 및 캐처 단백질 융합체는 세포에서 발현될 때 자발적으로 반응하고, 일부 상황에서 이러한 반응을 피하거나 제어하는 것이 유리할 것이다.
따라서, 이소펩티드 단백질로부터 유도된 태그/캐처 시스템, 즉 상기 논의된 바와 같이 안정하고 강력한 공유 결합을 형성하지만 펩티드 결합 파트너 (캐처)의 큰 크기와 관련된 문제를 피할 수 있는 펩티드 태그와 관련된 유리한 특성을 갖는 펩티드 태그 시스템을 개발하려는 요구가 있다.
개별적으로 이소펩티드 결합 형성에 관여하는 잔기를 포함하는 이소펩티드 단백질의 도메인을, 즉 3 개의 별도의 단편으로, 즉 2 개의 펩티드와 폴리펩티드로서 발현할 수 있음이 밝혀졌다 (예를 들어, 문헌 [Fierer et al. 2014, PNAS E1176-E1181]). 간단히 말하면, 1개의 펩티드 태그 (KTag)는 상기 이소펩티드 결합에 관련된 잔기 중 1개 (예를 들어, 라이신)를 포함하고, 제 2 펩티드 태그 (SpyTag)는 상기 이소펩티드 결합에 관련된 다른 잔기 (예를 들어, 아스파 테이트)를 포함하며, 폴리펩티드 (SpyLigase)는 상기 이소펩티드 결합 형성을 매개하는데 관여하는 잔기 (예를 들어, 글루타메이트)를 포함한다. 모든 3개의 단편, 즉 모든 펩티드와 폴리펩티드의 혼합은, 상기 이소펩티드 결합을 형성하도록 반응하는 잔기를 포함하는 2개의 펩티드, 즉 SpyTag 및 KTag 사이에서 이소펩티드 결합의 형성을 초래한다. 따라서, 상기 폴리펩티드 (SpyLigase)는 상기 펩티드 태그의 컨쥬게이션을 매개하지만 결과로 생성되는 구조의 일부를 형성하지는 않으며, 즉 상기 폴리펩티드는 상기 펩티드 태그에 공유적으로 연결되지 않는다. 이와 같이, 상기 폴리펩티드는 단백질 리가아제 또는 펩티드 리가아제로 볼 수 있다.
전술한 SpyLigase 시스템은 상기 분자, 즉, 관심 단백질에 융합될 필요가 있는 펩티드 태그의 크기를 최소화하고, 그에 의해, 상기 논의된 펩티드 태그 결합 파트너(캐처(Catcher))의 첨가에 의해 야기되는 원치 않는 상호작용, 예컨대, 잘못 접힘(misfolding)의 가능성을 감소시키기 때문에 이론적으로 특히 유용하다. 그러나, 상기 SpyLigase 시스템은 펩티드 파트너들 사이의 컨쥬게이션의 불량한 수율 (전형적으로 50 % 이하)을 보여주고, 4 ℃ 이상에서 낮은 활성을 갖는다. 더욱이, SpyLigase의 유용성은 조건, 예를 들어, 버퍼 및 느린 반응 속도, 전형적으로 약 24 시간 (상기의 문헌[Fierer et al. 2014])의 광범위한 범위에서 기능할 수 없기 때문에 제한된다.
본 발명자들은 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 부착분자, RrgA (서열식별번호: 4)의 C-말단 도메인으로부터 펩티드 리가아제 시스템, 즉 펩티드 리가아제와 한 쌍의 펩티드 태그를 개발하였으며, 이들은 인접(apposed) 글루탐산에 의해 촉진되는, 라이신과 아스파라긴 사이의 자발적 이소펩티드 결합을 자연적으로 함유한다. 하기에서 논의되고 실시예에서 상세히 설명된 바와 같이, 본 발명의 펩티드 리가아제 시스템을 발생시키기 위해 많은 단계가 필요하였다.
먼저, 본 발명자들은 변형을 위해 광범위한 후보로부터 적절한 이소펩티드 단백질을 선택하고, 그 후에, 상기 단백질을 분할할 적절한 위치를 결정해야 하였다. 이와 관련하여, RrgA의 C-말단 도메인은 8 개의 β-가닥을 함유하고, 반응성 잔기를 함유하는 도메인으로부터 이소펩티드 결합의 형성을 촉진시키는 원인이 되는 글루탐산 잔기를 포함하는 도메인의 단리는 3β-β 가닥의 제거를 초래하였다 (도 1a 참조). 소 단백질 도메인으로부터 3 개의 β-가닥을 제거하는 것이 주된 변형이며, 절단된 폴리펩티드 (즉, RrgALigase로도 알려진 추정 펩티드 리가아제)는 불량한 안정성을 갖는 것으로 생각되었다. 특히, 상기 절단된 폴리펩티드는 (특히 NaCl을 포함하는 용액, 예를 들어 포스페이트-완충된 식염수 중에서) 낮은 용해도를 보여주었고, 낮은 리가아제 활성을 보여주었다. 실제로, 상기 절단된 폴리펩티드 (RrgALigase)는 말토스 결합 단백질 (MBP)에 융합되어, RrgALigase의 용해도를 개선시키고 상기 단백질의 특성규명 및 변형을 용이하게 한다.
따라서, 본 발명의 펩티드 리가아제 시스템의 개발에서 제 2 측면은 상기 이소펩티드 단백질, 특히 추정 펩티드 리가아제로부터 유래된 별도의 구성요소로의 다양한 변형 (즉, 돌연변이)의 설계 및 도입을 요구하였다. 상기 변형은 2개의 펩티드 태그 사이에서 이소펩티드 결합의 형성을 촉진할 수 있는 활성 펩티드 리가아제를 초래할 뿐만 아니라, 상기 펩티드 리가아제 도메인의 용해도 및 활성을 향상시켰음, 즉, 변형된 펩티드 리가아제가 MBP에 연결되지 않았을 때 상기 변형된 펩티드 리가아제는 광범위한 조건에서 가용성이고 활성이었음이 놀랍게도 결정되었다. 또한, 본 발명의 펩티드 리가아제 시스템은 상기에서 논의된 SpyLigase 시스템에 대하여 개선된 특성, 예를 들면, 높은 수율 (즉, 95 %), 광범위한 반응 조건 (예를 들어, 최대 37 ℃의 온도, 다양한 버퍼 등), 보다 빠른 반응 속도 (즉, 약 4 시간후의 높은 수율), 및 TMAO (트리메틸아민 N-옥사이드)와 같은 화학적 샤페론의 부재하에 기능할 수 있는 능력을 보여준다.
특히, 본 발명의 펩티드 리가아제 시스템은 장기간에 걸쳐 자연적으로 발달하는 펩티드 리가아제 시스템, 예를 들어 소르타제 및 트랜스글루타미나제를 능가하는 개선을 나타낸다. 예를 들어, 소르타제 효소는 20 억년 전에 분화된 다양한 그람-양성 박테리아에 존재한다 (문헌[Antos et al., J. Am. Chem. Soc. 2009, vol. 131 (31), pp. 10800-10801]).
실제로, 본 발명자들은 본 발명의 펩티드 리가아제 시스템이 펩티드 태그의 비교적 낮은 농도에서도 높은 수율을 갖는다는 것을 예기치 않게 발견하였다. 비교하면, 본 발명의 펩티드 리가아제 시스템은, 전형적으로 소르타제와 함께 사용되는 올리고글리신-반응 파트너의 농도보다 10 배 더 낮은 펩티드 태그 농도에서 효과적이다 (문헌[Chen et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 2011, vol. 108 (28), pp. 11399-11404]).
본 발명은 이제 하기 도면을 참조하여 하기 비제한적인 실시예에서 보다 상세하게 설명될 것이다.
도 1 (a)는 RrgA가 본 발명의 펩티드 태그 및 펩티드 리가아제에 도달하도록 분할 및 변형되는 방법의 삽화를 보여준다. RrgA의 C-말단 도메인 (단백질 데이터 뱅크 2WW8)을 3 개 부분으로 분할하여, 반응성 Lys가 SnoopTagJr 상에 위치하고, 반응성 Asn은 DogTag 상에 위치하며, 촉매적 Glu는 SnoopLigase 상에 위치하도록 조작하였다. (b)는 RrgA에서 이소펩티드 결합 형성을 위한 분자 기초를 보여주는 것으로, Glu803 촉매가 암모니아를 제거하며 Lys 742와 Asn 854 사이에서 이소펩티드 결합 형성을 촉매작용한다 (잔기 번호는 PDB 파일에서와 같음). (c)는 펩티드-펩티드 리게이션을 위한 DogTag 및 SnoopTagJr 용도의 삽화를 보여준다.
도 2 (a)는 상이한 RrgALigase 돌연변이체의 반응성을 보여주는 그래프이고, 여기서: RrgALigase는 서열식별번호: 8에 명시된 바와 같은 서열을 포함하는 폴리펩티드를 지칭하고; A808P는 서열식별번호: 8에 명시된 바와 같은 서열을 포함하는 폴리펩티드를 지칭하되, 잔기 66은 프롤린이고; A808P Q837P는 서열식별번호: 8에 명시된 바와 같은 서열을 포함하는 폴리펩티드를 지칭하되, 잔기 66 및 95는 모두 프롤린이고; A808P Q837P D838G는 서열식별번호: 8에 명시된 바와 같은 서열을 포함하는 폴리펩티드를 지칭하되, 잔기 66 및 95는 모두 프롤린이고 잔기 96은 글리신이고; SnoopLigase는 서열식별번호: 1에 명시된 바와 같은 서열을 포함하는 폴리펩티드를 지칭한다. (b) 상기 SnoopLigase, SnoopTagJr 및 DogTag 반응성을 함께 특성규명하는 쿠마시 염색을 갖는 SDS-PAGE 겔의 사진은 SnoopTagJr의 반응성 Lys (KA) 및 DogTag의 반응성 Asn (NA)의 알라닌 돌연변이체 및 SnoopLigase 반응성 Glu (EQ)의 글루타민 돌연변이체에 의해 제어되며, 여기서 SnoopTagJr는 HER2에 대한 어피바디(affibody)를 갖는 융합 단백질로서 발현되고, DogTag는 SUMO를 갖는 융합 단백질로서 발현되었다.
도 3은 실시예 4에 기재된 고체상 리게이션 반응으로부터의 생성물의 분석을 특성규명하는 쿠마시 염색을 갖는 SDS-PAGE 겔의 사진을 보여준다.
도 4는 SnoopTagJr-AffiHER2 및 SUMO-DogTag를 리게이션시키는 SnoopLigase의 활성에 대한 (a) pH 및 (b) 온도의 영향을 실증하는 그래프를 보여준다.
도 5는 SnoopTagJr-AffiHER2 및 SUMO-DogTag를 리게이션시키는 SnoopLigase의 활성에 대한 (a) NaCl 농도, (b) 세정제 및 (c) 글리세롤의 효과를 실증하는 그래프를 보여준다.
도 6은 낮은 pH 조건을 사용하여 반응 생성물의 용출 후에 고체 기질 상에 고정된 SnoopLigase의 반복 반응에서 형성된 생성물의 상대적인 양을 보여주는 막대 차트를 보여준다. 상기 생성물의 수율은 반응 사이클 1로부터의 수율에 대해 정규화되었다. n = 9, 평균 +/-1 S.D.
도 7은 (a) 실시예 6에 기재된 IMX-DogTag와 SnoopTagJr-MBP 사이의 반응으로부터의 생성물의 분석을 특성규명하는 쿠마시 염색된 SDS-PAGE의 사진; 및 (b) (a)에 기재된 반응의 정량화를 보여주는 그래프를 보여준다 (n = 3, 평균 +/-1 S.D).
도 8은 (a) 실시예 6에 기재된 SnoopTagJr-AffiHER2와 SUMO-DogTag 사이의 반응으로부터의 생성물의 분석을 특성규명하는 쿠마시 염색된 SDS-PAGE의 사진; 및 (b) (a)에 기재된 반응의 정량화를 보여주는 그래프를 보여준다 (n = 3, 평균 +/-1 S.D).
도 9는 실시예 7에 기재된 SnoopLigase로부터의 생성물의 온도-의존적 용출의 분석을 특성규명하는 쿠마시 염색된 SDS-PAGE의 사진을 보여주되, "경쟁자"는 AffiHER2-DogTag에 공유 연결된 SnoopTag 펩티드를 지칭한다.
도 10은 실시예 8에 기재된 SnoopLigase로부터의 생성물의 첨가제-의존적 용출의 분석을 특성규명하는 쿠마시 염색된 SDS-PAGE의 사진을 보여주되, "대조군"은 용출 버퍼에 첨가제를 갖지 않고 "반응"은 수지 포획 전의 혼합물이다.
도 11은 실시예 8에 기재된 SnoopLigase로부터의 생성물 용출을 위한 이미다졸 적정의 분석을 특성규명하는 쿠마시 염색된 SDS-PAGE의 사진을 보여준다. "수지 상의 잔류"는 수지 상에 잔류한 것을 시각화하기 위해 SDS-로딩 버퍼로 용출한 후에 수지를 비등한 것으로부터의 샘플을 지칭한다. 이 비등은 상기 스트렙타비딘-아가로스로부터 스트렙타비딘 서브유닛을 방출하였다.
도 12는 SnoopLigase에 의해 촉매작용된 SUMO-DogTag와, SnoopTag-AffiHER2 또는 SnoopTagJr-AffiHER2 중 하나와의 사이에 형성된 반응 생성물의 양을 보여주는 그래프를 보여준다 (n = 3, 평균 +/-1 S.D).
도 13은 TMAO의 다양한 농도에서 SnoopLigase에 의해 촉매작용된 SUMO-DogTag와 SnoopTagJr-AffiHER2 사이에 형성된 반응 생성물의 양을 보여주는 그래프를 보여준다 (n = 3, 평균 +/-1 S.D).
도 14는 실시예 11에 기재된 SnoopLigase에 의해 촉매작용된, DogTag-MBP 내부 융합 단백질과 SnoopTagJr-AffiHER2의 반응성의 분석을 특성규명하는 쿠마시 염색된 SDS-PAGE의 사진을 보여준다.
도 15는 SUMO-DogTag 단백질과 SnoopTagJr-AffiHER2의 반응 생성물을 SnoopLigase로부터 분리시키는 상이한 용출 방법의 분석을 특성규명하는 쿠마시 염색된 SDS-PAGE의 사진을 보여준다. "펩티드에 의한 용출"은 실시예 12에 기재된 SnoopTagJr: DogTag 경쟁자 펩티드를 사용한 용출을 지칭한다.
도 16은 실시예 11에 기재된 SnoopLigase에 의해 촉매작용되는, SnoopTagJr-AffiHER2와 HaloTag7SS-DogTag 내부 융합 단백질 사이의 반응으로부터의 생성물의 분석을 특성규명하는 쿠마시 염색된 SDS-PAGE의 사진을 보여준다.
도 17은 (a) 실시예 14에 기재된 바와 같이 비-동결건조된 샘플의 활성에 대하여, 지정된 일수 동안 37 ℃에서 보관한 후의 동결건조된 SnoopLigase의 활성을 보여주는 막대 차트, 및 (b) 실시예 14에 기재된 바와 같이 환원제없는 SnoopLigase에 대하여, 환원제를 갖는 SnoopLigase의 활성을 보여주는 막대 차트를 보여준다.
따라서, 일 측면에서, 본 발명은,
a) 서열식별번호: 1에 명시된 바와 같은 아미노산 서열; 또는
b) 서열식별번호: 1에 명시된 바와 같은 서열과 적어도 80 %의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로서, 상기 아미노산 서열은 위치 61에서 글루탐산 및 다음 중 개 이상을 포함하는 것인 아미노산 서열을 포함하고,
1) 위치 66에서 프롤린;
2) 위치 95에서 프롤린;
3) 위치 96에서 글리신; 및
4) 위치 97에서 발린,
상기 특정된 아미노산 잔기는 서열식별번호: 1에서의 위치와 동등한 위치에 있고, 상기 폴리펩티드는 서열식별번호: 2의 위치 9에 있는 라이신 잔기와 서열식별번호: 3의 위치 17에 있는 아스파라긴 잔기 사이의 이소펩티드 결합의 형성을 촉진할 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드는 본 발명의 펩티드 태그 (하기 논의된 바와 같이 서열식별번호: 2 및 3)의 공유 컨쥬게이션을 매개하므로, 펩티드 리가아제로 볼 수 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, 본 발명의 폴리펩티드는 본 발명의 펩티드 태그 사이에서 이소펩티드 결합의 형성을 촉진시키는 촉매로 볼 수 있다. 이와 관련하여, 촉매는 그 자체의 조성을 변화시키지 않으면서 반응이 일어나도록 할 수 있는 분자로 정의될 수 있으며, 본 발명의 펩티드 태그와의 상호작용 및 상기 펩티드 태그들 사이의 이소펩티드 결합 형성의 후속적인 촉진에 따른 본 발명의 폴리펩티드의 구조는 상기 상호작용 전의 구조와 정확히 동일한 것으로 믿어진다. 따라서, 본 발명의 폴리펩티드는 본 발명의 펩티드 태그 사이에서 이소펩티드 결합의 형성을 촉매작용하는 펩티드 리가아제로 볼 수 있다.
실시예에서 보여지는 바와 같이, 다수의 변형이 능숙하게 설계되고, 절단된 RrgA C-말단 도메인 폴리펩티드 (추정 리가아제 또는 RrgALigase) 내로 도입되고, 상기 폴리펩티드의 리가아제 활성에 대한 이들의 효과를 결정하기 위해 시험되었다. 본 발명자들은 단지 선택된 변형이 상기 리가아제 활성의 활성 개선을 초래함을 결정하였다 (도 2a 참조). 더욱이, 각각의 선택된 변형은 상기 리가아제의 활성을 독립적으로 개선시키는 것으로 밝혀졌다.
따라서, 일부 실시양태에서, 본 발명의 폴리펩티드는 서열식별번호: 1에 명시된 바와 같은 서열과 적어도 80 %의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있으며, 상기 아미노산 서열은 위치 61에서의 글루탐산 및 다음 중 2 개, 3 개 또는 4 개를 포함한다:
1) 위치 66에서 프롤린;
2) 위치 95에서 프롤린;
3) 위치 96에서 글리신; 및
4) 위치 97에서 발린.
따라서, 예를 들어, 본 발명의 폴리펩티드 변이체는 위치 66 및 95에서 적어도 프롤린 잔기를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 폴리펩티드 변이체는 위치 66 및/또는 95에서 적어도 프롤린 잔기 및 위치 96에서 글리신 잔기를 포함할 수 있다. 더 추가적인 실시양태에서, 본 발명의 폴리펩티드 변이체는 위치 66 및/또는 95에서 적어도 프롤린 잔기 및 위치 97에서 발린 잔기를 포함할 수 있다. 특히 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 폴리펩티드는 서열식별번호: 1에 명시된 바와 같은 서열과 적어도 80 %의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열 및 다음 중 모두를 포함한다:
1) 위치 61에서 글루탐산;
2) 위치 66에서 프롤린;
3) 위치 95에서 프롤린;
4) 위치 96에서 글리신; 및
5) 위치 97에서 발린.
더 추가적인 실시양태에서, 본 발명의 폴리펩티드 변이체는 위치 100에서 트레오닌 잔기를 포함할 수 있다.
따라서, 본 발명의 폴리펩티드 (펩티드 리가아제)는 구체적으로 서열식별번호: 1에 명시된 바와 같은 예시된 서열과 적어도 80 % 동일할 수 있고, 더욱 구체적으로 서열식별번호: 1과 적어도 85, 90, 95, 96, 97, 98 또는 99 % 동일하며, 상기 폴리펩티드 변이체는 위치 61 (또는 동등한 위치)에서 글루탐산 잔기 및 다음 중 1개 이상을 포함한다:
1) 위치 66에서 프롤린;
2) 위치 95에서 프롤린;
3) 위치 96에서 글리신; 및
4) 위치 97에서 발린,
또는 하기에 정의된 바와 같은 이들의 동등한 위치.
본 발명의 폴리펩티드는 상기 펩티드 태그 사이의 이소펩티드 결합의 형성에 적합하고/하거나 본 발명의 폴리펩티드의 리가아제 활성에 적합한 조건하에서, 서열식별번호: 2의 위치 9에서의 라이신 잔기와 서열식별번호: 3의 위치 17에서의 아스파라긴 잔기 사이에서 이소펩티드 결합의 형성을 촉진할 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드가 다양한 조건 하에서 활성임이 하기 실시예로부터 명백하다. 예를 들어, 6.0-9.0, 예를 들어, 7.0-9.0, 7.25-8.75, 예컨대, 약 7.5-8.5의 pH에서 광범위한 온도, 예를 들어, 0-40 ℃, 예컨대 5-39, 10-38, 15-37 ℃, 예컨대, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 12, 15, 18, 20, 22, 25, 27, 29, 31, 33, 35 또는 37 ℃, 바람직하게는 약 15 ℃에서 트리스 보레이트 (TB) 버퍼. 상기 폴리펩티드는 NaCl의 세포외 농도, 예를 들어 약 150 mM NaCl 이하의 존재 하에서 기능한다. 그러나, 일부 실시양태에서, NaCl 부재하에 리게이션 반응을 수행하는 것이 바람직할 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드는 또한 최대 약 2 % (v/v)의 농도에서 통상적으로 사용되는 세정제, 예컨대 트윈(Tween) 20 및 트리톤(Triton) X-100의 존재하에 활성이다. 또한, 상기 폴리펩티드는 최대 약 적어도 40 % (v/v)의 농도에서 글리세롤의 존재하에 활성이다. 따라서, 일부 실시양태에서, 예를 들어 약 5-50 %, 10-40 %, 바람직하게는 약 15-30 % (v/v)의 글리세롤의 존재하에 리게이션 반응을 수행하는 것이 바람직할 수 있다. 당업자는 다른 적절한 조건을 쉽게 결정할 수 있을 것이다.
따라서, 일부 실시양태에서, 상기 펩티드 태그 사이의 이소펩티드 결합의 형성에 적합하고/하거나 본 발명의 폴리펩티드의 리가아제 활성에 적합한 조건은, 본 발명의 폴리펩티드를 본원에 정의된 바와 같은 펩티드 태그와의 접촉이, 상기 펩티드 태그 사이, 특히 서열식별번호: 2의 위치 9에서의 라이신 잔기와 서열식별번호: 3의 위치 17에서의 아스파라긴 잔기 사이에서 이소펩티드 결합의 형성을 초래하는 임의의 조건을 포함한다. 예를 들어, 완충된 조건, 예를 들어, 완충된 용액 또는 트리스 보레이트 버퍼와 같은 버퍼로 평형화된 고체상(예: 컬럼)에서 상기 폴리펩티드와 펩티드 태그의 접촉. 접촉 단계는 임의의 적합한 pH, 예컨대 pH 6.0-9.0, 예를 들어 pH 6.5-9.0, 예컨대 pH 6.8, 7.0, 7.2, 7.4, 7.6, 7.8, 8.0, 8.2, 8.4, 8.6 또는 8.8 에서일 수 있다. 부가적으로 또는 대안적으로, 상기 접촉 단계는 임의의 적합한 온도, 예를 들어 약 0-40 ℃, 예컨대, 약 1-39, 2-38, 3-37, 4-36, 5-35, 6-34, 7-33, 8-32, 9-31 또는 10-30 ℃, 예를 들어, 약 10, 12, 15, 18, 20, 22 또는 25 ℃, 바람직하게는 약 15 ℃에서일 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 접촉 단계는 NaCl 부재하에서 일 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 접촉 단계는 예를 들어 글리세롤의 존재하에, 예컨대, 약 5-50 %, 10-40 %, 바람직하게는 약 15-30 % (v/v)에서일 수 있다.
일부 실시양태에서, "이소펩티드 결합의 형성에 적합한 조건 하에" 본원에 정의된 바와 같은 폴리펩티드 및 펩티드 태그의 접촉은 화학적 샤페론, 예를 들어, 상기 폴리펩티드 및/또는 펩티드 태그의 반응성을 향상시키거나 또는 개선시키는 분자의 존재하에 상기 폴리펩티드 및 펩티드 태그의 접촉을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 화학적 샤페론은 TMAO (트리메틸아민 N-옥사이드)이다. 일부 실시양태에서, 상기 화학적 샤페론, 예를 들어 TMAO는 적어도 약 0.2M, 예를 들어 적어도 0.3, 0.4, 0.5, 1.0, 1.5, 2.0 또는 2.5M, 예를 들어 약 0.2-3.0 M, 0.5-2.0 M, 1.0-1.5 M 농도에서 반응에 존재한다.
따라서, 본 발명의 폴리펩티드는, 서열식별번호: 1에 명시된 바와 같은 예시된 폴리펩티드와 구조적으로 유사하고 펩티드 리가아제로서 기능할 수 있으며, 특히 상기에서 정의된 바와 같은 적합한 조건 하에서 본 발명의 펩티드 태그 (서열식별번호: 2 및 3에 명시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 펩티드) 사이에서 이소펩티드 결합의 형성을 특히 촉진할 수 있는 폴리펩티드의 돌연변이 형태 (즉, 본원에서는 상동체, 변이체 또는 유도체로 지칭됨)를 포괄한다. 폴리펩티드 변이체가 서열식별번호: 1과 관련하여 돌연변이, 예를 들어 결실 또는 삽입을 포함하는 경우, 상기에서 명시된 잔기가 변이체 폴리펩티드 서열에서 동등한 아미노산 위치에 존재한다. 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 폴리펩티드 변이체에서의 결실은 N-말단 및/또는 C-말단 절단이 아니다.
따라서, 일부 실시양태에서, 본 발명의 폴리펩티드 변이체는 서열식별번호: 1과는, 예를 들어 1 내지 20, 1 내지 15, 1 내지 10, 1 내지 8, 1 내지 6, 1 내지 5, 1 내지 4, 예를 들어, 1, 2 내지 3 개의 아미노산 치환, 삽입 및/또는 결실, 바람직하게는 치환으로 차이날 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 폴리펩티드 (펩티드 리가아제)에 존재하는 임의의 다른 돌연변이는 보존적 아미노산 치환일 수 있다. 보존적 아미노산 치환은 아미노산을, 상기 폴리펩티드의 물리화학적 특성을 보존하는 또 다른 것으로 대체하는 것을 지칭한다 (예를 들어, D는 E로 또는 그 반대로, N은 Q로, 또는 L 또는 I는 V로 또는 역으로 대체될 수 있다). 따라서, 일반적으로 치환 아미노산은 대체되는 아미노산과 유사한 특성, 예를 들어 소수성, 친수성, 전기 음성도, 부피가 큰 측쇄 등을 갖는다. 천연 L-아미노산의 이성질체, 예컨대, D-아미노산이 포함될 수 있다.
서열 동일성은 당업계에 공지된 임의의 적합한 수단, 예를 들어 가변 팸팩터(pamfactor)를 갖는 FASTA pep-cmp, 및 12.0으로 설정된 갭 생성 페널티 및 4.0으로 설정된 갭 확장 페널티 및 2 개의 아미노산 윈도우를 사용하는 SWISS-PROT 단백질 서열 데이터뱅크를 사용하여 결정될 수 있다. 아미노산 서열 동일성을 결정하기위한 다른 프로그램은 위스콘신 대학(University of Wisconsin)의 Genetics Computer Group (GCG) 버전 10 소프트웨어 패키지의 BestFit 프로그램을 포함한다. 상기 프로그램은 디폴트 값: 갭 생성 페널티 -8, 갭 확장 페널티 = 2, 평균 매치 = 2.912, 평균 미스매치 = -2.003인 스미쓰 앤 워터맨(Smith and Waterman)의 로컬 상동성 알고리즘을 사용한다.
바람직하게 상기 비교는 상기 서열의 전체 길이에 걸쳐 이루어지지만, 보다 작은 비교 윈도우, 예를 들어 100, 80 또는 50 미만의 연속 아미노산에 걸쳐 이루어질 수 있다.
바람직하게 이러한 서열 동일성-관련 단백질 (폴리펩티드 변이체)은 인용된 서열식별번호에 명시된 바와 같은 폴리펩티드와 기능적으로 동등하다. 본원에서 지칭될 때 "기능적 동등성"은 친계 분자 (즉, 서열 상동성을 보여주는 분자)에 대해 리게이션 반응에서의 일부 감소된 효능 (예를 들어, 반응 조건의 제한된 범위 (예를 들어, 10-30 ℃와 같은 보다 좁은 온도 범위)에서 보다 낮은 반응 수율, 보다 낮은 반응 속도 또는 활성)을 나타낼 수 있지만, 바람직하게는 마찬가지로 효율적이거나 또는 더 효율적인 상기 논의된 본 발명의 폴리펩티드 (펩티드 리가아제)의 변이체를 지칭한다.
서열식별번호: 1에 명시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 폴리펩티드의 리가아제 또는 촉매 활성과 "동등한" 리가아제 또는 촉매 활성을 갖는 본 발명의 돌연변이체 또는 변이체 폴리펩티드는 서열식별번호: 1에 명시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 폴리펩티드의 리가아제 또는 촉매 활성과 유사한 (즉, 필적할만한) 리가아제 또는 촉매 활성을 가질 수 있어서, 즉 상기 펩티드 리가아제의 실제 적용이 예컨대, 실험 오차 범위 내에서 유의미하게 영향받지 않는다. 따라서, 동등한 리가아제 또는 촉매 활성은, 본 발명의 돌연변이체 또는 변이체 폴리펩티드가 동일한 조건 하에서 서열식별번호: 1에 명시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이로 구성된 폴리펩티드와 유사한 반응 속도 및/또는 반응 수율을 갖는 본 발명의 펩티드 태그들 사이에서 이소펩티드 결합의 형성을 촉진할 수 있음을 의미한다.
동일한 반응 조건, 예를 들어 상기에서 예시된 온도, 기질 (즉, 펩티드 태그 서열) 및 이들의 농도, 버퍼, 염 등에서 측정된 상이한 펩티드 리가아제 폴리펩티드 (예를 들어, 서열식별번호: 1 대 돌연변이체)의 리가아제 또는 촉매 활성은 각각의 단백질에 대한 리가아제 또는 촉매적 활성이 보다 높은지, 보다 낮은지 또는 동등한지를 결정하기 위해 쉽게 비교될 수 있다.
따라서, 상기 변이체 (예를 들어, 돌연변이체) 폴리펩티드의 리가아제 또는 촉매 활성은 서열식별번호: 1에 명시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이로 구성된 폴리펩티드의 리가아제 또는 촉매 활성의 적어도 60 %, 예를 들어 적어도 70, 75, 80, 85 또는 90 %, 예컨대 서열식별번호: 1에 명시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이로 구성된 폴리펩티드의 리가아제 또는 촉매 활성의 적어도 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99 %일 수 있다. 대안적으로 볼 때, 상기 돌연변이체 폴리펩티드의 리가아제 또는 촉매 활성은 서열식별번호: 1에 명시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이로 구성된 폴리펩티드의 리가아제 또는 촉매 활성보다 단지 40 % 이하, 예컨대, 서열식별번호: 1에 명시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이로 구성된 폴리펩티드의 리가아제 또는 촉매 활성보다 단지 35, 30, 25 또는 20 % 이하, 예컨대 서열식별번호: 1에 명시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이로 구성된 폴리펩티드의 리가아제 또는 촉매 활성보다 단지 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1 % 이하일 수 있다.
일부 실시양태에서, 상기 변이체 (예를 들어, 돌연변이체) 폴리펩티드의 리가아제 또는 촉매 활성은 상기 펩티드 태그의 반응 수율을 측정함으로써 평가될 수 있다. 상기 반응 수율은 상기 펩티드 태그 사이에서 이소펩티드 결합의 형성에 적합한 및/또는 본 발명의 폴리펩티드의 리가아제 활성에 적합한 조건 하에 상기 펩티드 태그를 본 발명의 폴리펩티드 (펩티드 리가아제)와 접촉한 후에 미반응 구성요소에 대한 파트너 펩티드 태그 (예를 들어, 서열식별번호: 3)와의 공유 복합체 내의 태그 (예를 들어, 서열식별번호: 2)의 비율을 결정함으로써 측정된다. 따라서, 반응 수율은 다음을 지칭한다: 파트너 펩티드 태그 (예를 들어, 서열식별번호: 3)와의 공유 복합체에서 태그 (예를 들어, 서열식별번호 2)의 비율 / (파트너 펩티드 태그 (예를 들어, 서열식별번호: 3)와의 공유 복합체에서의 태그 (예를 들어, 서열식별번호: 2)의 비율 + 파트너 펩티드 태그 (예를 들어, 서열식별번호: 3)와의 공유 복합체에 있지 않은 태그 (예를 들어, 서열식별번호: 2)의 비율) x 100.
상기 언급된 바와 같이, 서열식별번호: 1에 명시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 펩티드 리가아제는 약 95 %의 반응 수율로 서열식별번호: 2와 서열식별번호: 3의 반응을 촉매작용할 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 서열식별번호: 1에 명시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드와 기능적으로 동등한 본 발명의 변이체 폴리펩티드는 적어도 약 57 % 이상의 반응 수율로, 예를 들면, 적어도 약 67, 71, 76, 81 또는 86 %의 반응 수율로, 예컨대 적어도 86.5, 87.4, 88.4, 89.3, 90.3, 91.2, 92.2, 93.1 또는 94 %의 반응 수율로 서열식별번호: 2와 서열식별번호: 3의 반응 (즉, 서열식별번호: 2와 서열식별번호: 3 사이에서 이소펩티드 결합의 형성)을 촉매작용할 수 있다.
따라서, 변이체 폴리펩티드가 서열식별번호: 1의 위치 61과 동등한 위치에 글루탐산 잔기 및 상기 정의된 바와 같은 서열식별번호: 1의 위치 66, 95, 96 및 97과 동등한 위치에 적어도 1개 (바람직하게는 2, 3 또는 4 개)의 다른 아미노산 잔기(들)를 포함하고 상기 정의된 기능적 특징을 유지하는 경우, 즉, 본 발명의 펩티드 태그들 사이에 이소펩티드 결합의 형성을 촉진할 수 있는 펩티드 리가아제를 초래하고 임의로는 서열식별번호: 1에 명시된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드에 대하여 동등하거나 또는 보다 높은 반응 수율, 반응 속도, 온도 및/또는 버퍼 범위를 갖는 경우, 본 발명의 변이체 폴리펩티드 (펩티드 리가아제)를 생성하기 위해 임의의 변형 또는 변형들의 조합이 서열식별번호: 1에 이루어질 수 있다.
동등한 위치는 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 참조하여 결정된다. 상동성 또는 상응하는 위치는 예를 들어 BLAST 알고리즘을 사용하여 서열 사이의 상동성 또는 동일성에 기반하여 상동체 (돌연변이체, 변이체 또는 유도체) 폴리펩티드의 서열 및 서열식별번호: 1의 서열을 라이닝함으로써 용이하게 추론될 수 있다.
상기 논의된 바와 같이, 상기 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 부착 단백질인 RrgA의 C-말단 도메인을 3 개 도메인으로 분할하고, 이들 각각을 그 다음에 변형시켜 본 발명의 폴리펩티드 (펩티드 리가아제) 및 2 개의 펩티드 태그를 생성시켰다. 따라서, 본 발명의 펩티드 태그는 본 발명의 펩티드 리가아제와 조합하여 구체적인 용도를 갖는다. 따라서, 본 발명의 펩티드 태그는 펩티드 리게이션 또는 컨쥬게이션 반응에서 본 발명의 펩티드 리가아제의 기질로 볼 수 있다. 특히, 본 발명의 폴리펩티드 리가아제는 서열식별번호: 2의 위치 9에서의 라이신 잔기와 서열식별번호: 3의 위치 17에서의 아스파라긴 잔기 사이에서 특이적 트랜스아미드화를 지시할 수 있다. 따라서, 본 발명의 펩티드 태그는 트랜스아미드화 반응에서 본 발명의 펩티드 리가아제의 기질로 볼 수 있다.
따라서, 추가적인 측면에서, 본 발명은 서열식별번호: 2 또는 서열식별번호: 3에 명시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 펩티드 태그를 제공한다.
본원에 사용될 때 용어 "펩티드 태그" 또는 "펩티드 링커"는 일반적으로 펩티드 또는 올리고펩티드를 지칭한다. 펩티드 또는 올리고펩티드가 의미하는 것 사이의 크기 경계에 관한 표준 정의는 없지만, 전형적으로 펩티드는 2 내지 20 개의 아미노산을 포함하는 것으로 볼 수 있고 올리고펩티드는 21 내지 39 개의 아미노산을 포함하는 것으로 볼 수 있다. 따라서, 폴리펩티드는 적어도 40 개의 아미노산, 바람직하게는 적어도 50, 60, 70 또는 80 개의 아미노산을 포함하는 것으로 볼 수 있다. 따라서, 본원에 정의된 바와 같은 펩티드 태그 또는 링커는 길이에서 적어도 12 개의 아미노산, 예를 들어 12-39 개의 아미노산, 예를 들어 13-35 개, 14-34 개, 15-33 개, 16-31 개, 17-30 개의 아미노산을 포함하는 것으로 볼 수 있고, 예를 들어 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 또는 23 개의 아미노산을 포함하거나 이들로 구성될 수 있다.
상기 논의된 바와 같이, 펩티드 태그는 다수의 유용성을 가지며, 본 발명의 펩티드 태그 및 펩티드 리가아제는 이소펩티드 결합을 통해 2 개의 분자 또는 구성요소를 컨쥬게이션 (즉, 결합 또는 연결)하는데 특히 유용하다. 예를 들어, 상기 펩티드 태그는 관심 분자 또는 구성요소에 개별적으로 컨쥬게이션되거나 또는 융합된 후에 펩티드 태그 사이에서 이소펩티드 결합의 형성을 허용하기에 적합한 조건 하에서 펩티드 리가아제의 존재하에 함께 접촉될 수 있으며, 이에 의해 이소펩티드 결합을 통해 상기 분자 또는 구성요소를 결합(즉, 연결 또는 컨쥬게이션)할 수 있다.
하기 실시예에서 보여지는 바와 같이, 본 발명자들은 본 발명의 펩티드 리가아제가 그의 반응 생성물, 즉 이소펩티드 결합에 의해 결합된 본 발명의 2 개의 펩티드 태그 및 상기 펩티드 태그에 융합 또는 컨쥬게이션된 임의의 분자 또는 구성요소에 강하게 결합하는 것으로 결정하였다. 그러나, 다양한 선택된 조건, 예를 들어 낮은 pH, 증가된 온도 (예를 들어, 45 ℃ 이상), 이미다졸 또는 펩티드 경쟁자의 첨가, 또는 이들의 조합을 사용하여 상기 강한 상호작용이 붕괴될 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 상기 펩티드 리가아제와 그의 반응 생성물 사이의 강한 상호작용은 유리하게는 상기 반응 생성물의 효율적인 정제를 용이하게 한다.
예를 들어, 본 발명의 펩티드 리가아제는 하기에서 보다 상세히 논의되는 바와 같이 임의의 편리한 수단에 의해, 예컨대, 펩티드 리가아제를 태그, 예를 들어 비오틴으로 라벨링함으로써, 또한 태그된 리가아제를 상기 태그의 결합 파트너에 연결된 고체 지지체, 예를 들어 스트렙타비딘 아가로스와 접촉시킴으로써 고체 지지체 또는 고체상에 고정될 수 있다. 이어서, 상기 펩티드 태그 사이에 이소펩티드 결합의 펩티드 리가아제-매개된 형성을 허용하는 조건 하에서 상기 고체 지지체 또는 고체상은 상기 펩티드 태그에 융합 또는 컨쥬게이션된 분자 또는 구성요소와 접촉되어, 그에 의해, 상기 분자 또는 구성요소 사이에 공유 복합체를 형성한다. 상기 고정화된 펩티드 리가아제와 반응 생성물 사이의 강한 상호작용으로 인해, 상기 고체상은 미-반응된 구성요소의 제거를 용이하게 하는 엄격한 조건 하에서 세척될 수 있다. 이어서, 상기 고체상은 상기 고정화된 펩티드 리가아제와 반응 생성물 사이의 상호작용을 붕괴하는 조건에 적용되고, 그에 의해 상기 반응 생성물의 분리를 허용한다.
예를 들어, 상기 고체상은 낮은 pH 용액, 예를 들어 낮은 pH 버퍼, 예컨대 pH 4.0 이하의 버퍼와 접촉될 수 있어서, 상기 고정화된 펩티드 리가아제와 반응 생성물 사이의 상호작용을 붕괴하고, 그에 의해 상기 반응 생성물의 분리를 허용할 수 있다. 예를 들어, 상기 고체상은 컬럼일 수 있고, 상기 컬럼과 낮은 pH 용액의 접촉은 실질적으로 순수한 반응 생성물을 용출시키는 결과를 초래한다.
후술하는 바와 같이, 본 발명의 펩티드 태그를 통해 컨쥬게이션될 분자 또는 구성요소 중 1개 이상이 단백질일 수 있다. 그러나, 모든 단백질이 낮은 pH의 처리를 용인하는 것은 아니다. 따라서, 본 발명자들은 중성 pH (즉, 6.5-7.5)에서 상기 펩티드 리가아제 및 그의 반응 생성물의 분리를 허용하는 다른 조건을 확인하고자 노력하였다.
본 발명자들은 상기 고체상의 온도를 55 ℃까지 올리는 것이 대부분의 단백질에 의해 용인되는 조건, 예를 들어 포스페이트-완충된 식염수, pH 7.4 하에서 상기 반응 생성물을 효율적으로 용출시키기에 충분하였음을 결정하였다.
또한, 본 발명자들은 상기 반응 생성물과 상기 펩티드 리가아제 사이의 비-공유 상호작용을 붕괴(경쟁)시키기 위해 경쟁자 반응 생성물 (예를 들어, 사전-리게이션된 단백질)을 첨가함으로써 보다 낮은 온도에서 효율적인 용출이 달성될 수 있음을 결정하였다. 경쟁자 반응 생성물은 (예를 들어, 투석 또는 크기-배제 크로마토그래피에 의해) 의도된 반응 생성물로부터 쉽게 분리될 수 있는 본 발명의 펩티드 태그를 포함하는 임의의 생성물일 수 있다.
실시예에서 보여지는 바와 같이, 35 μM 경쟁자 반응 생성물 (즉, 비오티닐화된 SnoopLigase를 사용하는 AffiHER2-펩티드 태그 (서열식별번호: 7)융합에 커플링되고 이어서 글리신 버퍼 (pH 2)를 사용하는 고체상으로부터 용리에 의해 정제된 펩티드 태그 (서열식별번호: 9)를 포함하는 경쟁사 단백질)의 첨가는 55 ℃ 대신 45 ℃에서 반응 생성물의 효율적인 용출을 허용하였다. 바람직한 실시양태에서, 상기 경쟁자 반응 생성물은 서열식별번호: 3에 명시된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 펩티드에 (이소펩티드 결합을 통해) 리게이션된, 서열식별번호: 2에 명시된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 펩티드를 포함하거나 또는 이로 구성된다. 일부 실시양태에서, 상기 경쟁자 반응 생성물은 반응에 사용된 반응물(즉, 펩티드 태그 컨쥬게이션체)의 고 농도, 즉 적어도 60 %, 예를 들어 적어도 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150 또는 200 %에서 상기 고체상과 접촉한다. 특히 바람직한 실시양태에서, 상기 경쟁자 반응 생성물은 승온, 즉 실온 초과, 예를 들어 적어도 30, 35, 40 또는 45 ℃에서 고체상과 접촉한다.
경쟁자 반응 생성물의 사용이 본 발명의 펩티드 리가아제로부터의 일부 반응 생성물 (예를 들어, 단백질 컨쥬게이션체)의 용출에 적합할 수 있지만, 생리적 상관 조건, 예를 들면, 생리학적 온도 및 pH 하에서 본 발명의 펩티드 리가아제와 상기 반응 생성물간의 상호작용을 붕괴시킬 수 있는 것이 바람직하다. 따라서, 실시예에서 논의된 바와 같이, 본 발명자들은 생리학적 조건 하에서 본 발명의 펩티드 리가아제와 반응 생성물간의 상호작용을 붕괴시키기에 효과적일 수 있는 다양한 첨가제를 숙련되게 선택하는 반면, 접힌 구조를 유지하는 SnoopLigase에 의해 리게이션된 대부분의 단백질과 여전히 양립 가능하다.
시험된 12종의 첨가제 중에서, 단 1종의 첨가제 (1M 이미다졸)만이 생리학적 조건 (pH 6.5-7.0, 37 ℃)에서 효과적인 것으로 밝혀졌으며, 놀랍게도, 보다 높은 농도의 이미다졸 (2M)이 보다 낮은 온도 (25 ℃)에서 효과적인 용출을 가능하게 함이 결정되었다. 이미다졸은 대부분의 단백질에 잘 용인되며, Ni-NTA 수지로부터 히스티딘-태그된 단백질을 정제하기 위해 가장 통상적인 단백질 정제 방법 중 하나에서 사용된다.
따라서, 일부 실시양태에서, 상기 고체상은 예를 들어 적어도 1 M, 바람직하게는 약 2 M의 농도로 이미다졸을 포함하는 용액과 접촉되어, 고정화된 펩티드 리가아제와 상기 반응 생성물간의 상호작용을 붕괴할 수 있다. 특히 바람직한 실시양태에서, 상기 고체상은 pH 6.5-7.5 (바람직하게는 약 pH 7.0)에서, 약 20-30 ℃ (바람직하게는 약 25 ℃)에서 약 2M 이미다졸을 포함하는 용액과 접촉된다.
본 발명의 펩티드 태그와 접촉하기 이전에 고체 지지체 상에 상기 펩티드 리가아제를 고정화하는 것이 유용할 수 있지만, 이것이 필수적인 것은 아님이 명백할 것이다. 예를 들어, 상기 리게이션 반응은 용액에서 일어날 수 있으며, 이는 이후에 고체 지지체 또는 고체상, 예컨대, 컬럼에 적용되어, 상기 반응 생성물과 펩티드 리가아제를 분리할 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 펩티드 리가아제-반응 생성물 복합체는 상기 반응 생성물 또는 펩티드 리가아제를 통해 상기 고체상에 상기 복합체를 고정시키기에 적합한 조건 하에서 상기 고체상에 적용될 수 있고, 적합한 조건 하에서 세척된 후에, 상기 언급된 조건 중 하나 이상의 조건에 적용될 수 있으며, 예컨대, 낮은 pH 용액 또는 이미다졸을 포함하는 용액과 접촉하여, 상기 복합체를 붕괴함으로써 상기 반응 생성물과 펩티드 리가아제를 분리시킬 수 있다. 대안적으로, 상기 펩티드 리가아제-반응 생성물 복합체는 용액 중에서 상기 언급된 조건 중 하나 이상에 적용될 수 있으며, 예를 들어 낮은 pH 용액, 이미다졸 또는 경쟁자 반응 생성물을 포함하는 용액과 접촉시킨 후, 임의의 적합한 수단, 예를 들어 반응 생성물 또는 펩티드 리가아제에 대해 친화도를 갖는 고체상과의 접촉, 크기 배제 크로마토그래피, 투석 등에 의해 분리될 수 있다.
고체 지지체 또는 고체상의 사용이 실질적으로 순수한 반응 생성물을 발생시키기에 유리하지만, 이것이 필수적인 것은 아님이 명백할 것이다. 예를 들어, 상기 리게이션 반응은 용액에서 일어날 수 있고 상기 펩티드 리가아제-반응 생성물 복합체는 상기 펩티드 리가아제의 분해에 의해 분리될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 펩티드 리가아제는 절단 도메인을 삽입하도록 변형될 수 있으며, 예를 들어 프로테아제를 사용하는 절단 도메인의 절단이 상기 펩티드 리가아제와 반응 생성물간의 상호작용을 붕괴시키기에 충분하다. 분해된 펩티드 리가아제는 당업계에 공지된 임의의 적합한 수단을 사용하여 반응 생성물로부터 후속적으로 분리될 수 있다.
다른 실시양태에서, 상기 펩티드 리가아제와 그의 반응 생성물간의 강한 상호작용은 상기 펩티드 태그에 융합 또는 컨쥬게이션된 분자 또는 구성요소와, 상기 펩티드 리가아제에 융합 또는 컨쥬게이션된 분자 또는 구성요소간의 복합체를 생성하는데 사용될 수 있다. 이와 관련하여, 상기 펩티드 태그에 융합 또는 컨쥬게이션된 분자 또는 구성요소는 이소펩티드 결합을 통해 결합되어, 상기 기재된 바와 같은 반응 생성물을 생성하고, 이는 상기 펩티드 리가아제에 융합 또는 컨쥬게이션된 분자 또는 구성요소와 비-공유적으로 상호작용함으로써 3 개의 분자 또는 구성요소의 복합체를 생성하며, 상기 분자 또는 구성요소 중 2 개가 이소펩티드 결합을 통해 연결된다.
따라서, 일부 실시양태에서, 본 발명은 본원에 정의된 바와 같은 폴리펩티드 (펩티드 리가아제)의 용도로서,
(1) 이소펩티드 결합을 통한 2 개의 분자 또는 구성요소의 컨쥬게이션; 또는
(2) 3개의 분자 또는 구성요소간의 복합체로서, 상기 복합체 내의 분자 또는 구성요소 중 2개가 이소펩티드 결합을 통해 컨쥬게이션되어 있는 복합체의 생성에서의 용도를 제공하는 것으로 볼 수 있으며,
이소펩티드 결합을 통해 컨쥬게이션된 상기 분자 또는 구성요소는 하기 a) 및 b)를 포함하고:
a) 하기를 포함하는 펩티드 태그를 포함하는 제 1 분자 또는 구성요소:
(i) 서열식별번호: 2에 명시된 바와 같은 아미노산 서열; 또는
(ii) 서열식별번호: 2에 명시된 바와 같은 서열과 적어도 80 %의 서열 동일성을 갖고, 상기 아미노산 서열은 서열식별번호: 2의 위치 9와 동등한 위치에서 라이신 잔기를 포함하는 것인 아미노산 서열; 및
b) 하기를 포함하는 펩티드 태그를 포함하는 제2 분자:
(i) 서열식별번호: 3에 명시된 바와 같은 아미노산 서열; 또는
(ii) 서열식별번호: 3에 명시된 바와 같은 서열과 적어도 80%의 서열 동일성을 갖고, 상기 아미노산 서열은 서열식별번호: 3의 위치 17와 동등한 위치에서 아스파라긴 잔기를 포함하는 것인 아미노산 서열,
(2)에서 상기 복합체의 제 3 분자 또는 구성요소는 상기 정의된 바와 같은 본 발명의 폴리펩티드 (펩티드 리가아제)를 포함한다.
상기 의견의 관점에서, (2)에서 상기 복합체의 제 3 분자 또는 구성요소는 이소펩티드 결합을 통해 컨쥬게이션된 복합체의 분자 또는 구성요소에 비-공유적으로 상호작용하거나 결합하는 것이 명백하다. 특히, 상기 복합체의 제 3 분자 또는 구성요소와, 이소펩티드 결합을 통해 컨쥬게이션된 상기 복합체의 분자 또는 구성요소간의 비-공유 상호작용은 펩티드 리가아제와 본 발명의 컨쥬게이션된 펩티드 태그간의 상호작용에 의해 매개된다 (또는 그로부터 발생되거나 또는 그를 통해 발생된다).
대안적으로 볼 때, 본 발명은 하기를 포함하는, 이소펩티드 결합을 통해 2 개의 분자 또는 구성요소를 컨쥬게이션시키는 방법을 제공한다:
a) 하기를 포함하는 펩티드 태그를 포함하는 제 1 분자 또는 구성요소를 제공하는 단계:
(i) 서열식별번호: 2에 명시된 바와 같은 아미노산 서열; 또는
(ii) 서열식별번호: 2에 명시된 바와 같은 서열과 적어도 80 %의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로서, 상기 아미노산 서열은 서열식별번호: 2의 위치 9와 동등한 위치에서 라이신 잔기를 포함하는 아미노산 서열;
b) 하기를 포함하는 펩티드 태그를 포함하는 제 2 분자 또는 구성요소를 제공하는 단계:
(i) 서열식별번호: 3에 명시된 바와 같은 아미노산 서열; 또는
(ii) 서열식별번호: 3에 명시된 바와 같은 서열과 적어도 80 %의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로서, 상기 아미노산 서열은 서열식별번호: 3의 위치 17과 동등한 위치에서 아스파라긴 잔기를 포함하는 것인 아미노산 서열;
c) 상기 제 1 및 제 2 분자 또는 구성요소를 본 발명의 폴리펩티드 (펩티드 리가아제)와 접촉시키는 단계로서, 바람직하게는 서열식별번호: 2의 위치 9와 동등한 위치에 있는 라이신 잔기와 서열식별번호: 3의 위치 17과 동등한 위치에 있는 아스파라긴 잔기 사이에서 이소펩티드 결합의 형성을 가능하게 하는 조건 하에서 상기 폴리펩티드는 고체 기질 상에 고정화되고, 그에 의해, 이소펩티드를 통해 상기 제 1 분자를 상기 제 2 분자에 컨쥬게이션시켜 복합체를 형성하는 단계.
일부 실시양태에서, 본 발명의 폴리펩티드 (펩티드 리가아제)는 제 3 분자 또는 구성요소를 제공하도록 분자 또는 구성요소에 컨쥬게이션 또는 융합되고, 단계 c)는 3 개의 분자 또는 구성요소를 포함하는 복합체의 형성을 초래하고, 상기 복합체에 있는 제 3 분자 또는 구성요소는, 이소펩티드 결합을 통해 컨쥬게이션된 상기 복합체에 있는 제 1 및 제 2 분자 또는 구성요소와 상호작용하거나 또는 비공유적으로 결합한다. 특히, 상기 복합체에 있는 제 3 분자 또는 구성요소와, 이소펩티드 결합을 통해 컨쥬게이션된 복합체에 있는 제 1 및 제 2 분자 또는 구성요소 간의 비-공유 상호작용은 상기 펩티드 리가아제 및 본 발명의 컨쥬게이션된 펩티드 태그 사이의 상호작용에 의해 매개된다 (또는 그로부터 발생되거나 또는 그를 통해 발생된다).
일부 실시양태에서, 상기 폴리펩티드가 고체 기질 상에 고정화될 때, 상기 방법은 상기 고체 기질로부터 (이소펩티드 결합을 통해 컨쥬게이션된 제 1 및 제 2 분자 또는 구성요소만을 포함하는) 상기 복합체를 분리하는 추가적인 단계를 포함하고, 상기 단계는 상기 복합체를 붕괴시키기에 적합한 조건, 즉 상기 폴리펩티드와 상기 반응 생성물간의 비-공유 상호작용을 붕괴시키기에 적합한 조건에 상기 복합체를 적용하는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 상기 언급된 바와 같이, 상기 복합체를 붕괴시키기에 적합한 조건은 상기 복합체를 낮은 pH 용액 또는 버퍼와 접촉시키는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 복합체를 붕괴시키기에 적합한 조건은 상기 복합체를 승온, 예를 들어 적어도 30, 35, 40 또는 45 ℃, 예컨대 30-65, 35-60, 40-55 ℃에 적용하는 단계 및/또는 상기 복합체를, 이미다졸을 포함하는 용액 (예를 들어, 적어도 1 M, 예를 들어 1-4 M, 1-3 M 또는 1.5-2.5 M, 바람직하게는 약 2 M 이미다졸) 또는 경쟁자 반응 생성물을 포함하는 용액 (예를 들어, 상기 정의된 바와 같은 고 농도의 경쟁자 반응 생성물)과 접촉시키는 단계를 포함한다.
더 추가적인 실시양태에서, 상기 방법은 상기 복합체를 상기 고체 기질로부터 분리시키기 전에 상기 고체 기질을 버퍼로 세척하는 단계를 포함한다. 상기 펩티드 태그에 융합된 분자 또는 구성요소에 기반하여 임의의 적합한 버퍼가 선택될 수 있음이 명백할 것이다. 또한, 상기 고체 기질을 세척하는 단계는 다수 회, 예컨대, 2, 3, 4, 5 회 이상 반복될 수 있다. 대안적으로 볼 때, 일부 실시양태에서, 상기 방법은 다수 회의 세척 단계를 포함하고, 동일 또는 상이한 세척 조건이 각각의 단계에서 사용될 수 있다.
상기 언급된 바와 같이, 일부 실시양태에서, 상기 고체 기질은 엄격한 세척 조건에 적용된다. 엄격한 세척 조건의 특성은 상기 펩티드 태그에 융합된 분자 또는 구성요소 및/또는 상기 고체 기질의 조성에 따라 좌우될 것이다. 당업자는 통상적인 업무로 이러한 조건을 선택할 수 있다. 그러나, 예로서, 엄격한 세척 조건은 50 mM 글리신 및 300 mM NaCl (pH 3.0)을 포함하는 용액으로 세척한 후에 50 mM 글리신 (pH 3.0)을 포함하는 용액으로 세척하는 것을 포함할 수 있으며, 각각의 세척은 반복될 수 있다.
"낮은 pH 용액 또는 버퍼"는 본 발명의 펩티드 리가아제와 그의 반응 생성물, 즉 이소펩티드 결합을 통해 컨쥬게이션된 본 발명의 펩티드 태그 사이의 비-공유 상호작용을 붕괴시키기에 적합한 임의의 용액 또는 버퍼로 볼 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 낮은 pH 용액 또는 버퍼는 항체 용출 버퍼이다. 이와 관련하여, 본 발명의 펩티드 리가아제와 그의 반응 생성물 사이의 상호작용을 붕괴시키기에 필요한 용액의 pH는 상기 용액 중의 구성요소에 좌우될 수 있음이 명백하다. 예로서, 항체 용출 버퍼는 50 mM 글리신 pH 2.2-2.8 또는 100 mM 시트르산 버퍼 pH 3.5-4.0를 포함하거나 또는 이로 구성될 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 상기 낮은 pH 용액 또는 버퍼는 4.0 이하의 pH, 예를 들어 3.9, 3.8, 3.7, 3.6, 3.5, 3.4, 3.3, 3.2, 3.1 , 3.0 이하, 예를 들어, 약 1.5-3.5, 1.6-3.4, 1.7-3.3, 1.8-3.2, 1.9-3.1 또는 2.0-3.0, 예컨대 약 2.2-2.8 또는 2.5-2.7의 pH를 갖는다.
복합체를 형성하기 위해 2 개 이상의 분자 또는 구성요소를 잇는 것과 관련하여 본 발명의 맥락에서 용어 "컨쥬게이션" 또는 "연결"은, 상기 분자 또는 구성요소, 예컨대, 단백질 (예를 들어, 상기 단백질의 도메인을 형성하는 펩티드 태그)을, 공유 결합, 특히 상기 분자 또는 구성요소에 포함되거나 또는 이들에 융합된 펩티드 태그 사이에 형성된 이소펩티드 결합을 통해 결합 또는 컨쥬게이션시키는 것을 지칭한다.
일부 실시양태에서, 전술한 상기 펩티드 태그 서열은 비교되는 서열 (서열식별번호: 2 또는 3)과 적어도 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100 % 동일하다.
바람직하게, 이러한 서열 동일성-관련 펩티드 태그는 상기 인용된 서열식별번호들에 명시된 바와 같은 펩티드 태그와 기능적으로 동등하다. 상기에서 논의된 바와 같이, "기능적 동등"은 예시된 펩티드 태그(즉, 서열식별번호: 2 또는 3, 서열 상동성을 보여주는 분자)에 대하여 본 발명의 펩티드 리가아제에 의해 매개되는, 각각의 파트너와 이소펩티드 결합을 형성하는데 있어서 일부 감소된 효능을 보여줄 수 있지만, 바람직하게는 마찬가지로 효율적이거나 또는 보다 효율적인 상기에서 논의된 펩티드 태그의 상동체를 지칭한다.
따라서, 본 발명의 펩티드 리가아제에 의해 매개되는, 각각의 파트너와 함께 이소펩티드 결합을 형성하기 위한 돌연변이체 펩티드 태그의 능력은 서열식별번호: 2 또는 3에 명시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이들로 구성된 펩티드 태그의 능력의 적어도 60 %, 예를 들어, 적어도 70, 75, 80, 85 또는 90 %, 예컨대 서열식별번호: 2 또는 3에 명시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이들로 구성된 펩티드 태그의 능력의 적어도 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99 %일 수 있다. 대안적으로 볼 때, 본 발명의 펩티드 리가아제에 의해 매개되는, 각각의 파트너와 함께 이소펩티드 결합을 형성하기 위한 돌연변이체 펩티드 태그의 능력은 서열식별번호: 2 또는 3에 명시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이들로 구성된 펩티드 태그의 능력의 단지 40 % 이하, 예를 들어 서열식별번호: 2 또는 3에 명시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이들로 구성된 펩티드 태그의 능력의 단지 35, 30, 25 또는 20 % 이하, 예컨대 서열식별번호: 2 또는 3에 명시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이들로 구성된 펩티드 태그의 능력의 단지 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1 % 이하일 수 있다.
따라서, 예를 들어 서열식별번호: 2에 명시된 바와 같은 서열과 적어도 80 %의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 펩티드 태그로서, 상기 아미노산 서열은 서열식별번호: 2의 위치 9와 동등한 위치에서 라이신 잔기를 포함하고, 바람직하게는 서열식별번호: 2에 명시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 펩티드 태그의 반응 효능 (예를 들어, 수율, 반응 속도 등)의 적어도 60 %을 가지며 서열식별번호: 3에 명시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 펩티드 태그와 함께 이소펩티드 결합을 형성할 수 있어야 한다.
유사하게, 서열식별번호: 3에 명시된 바와 같은 서열과 적어도 80 %의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 펩티드 태그로서, 상기 아미노산 서열은 서열식별번호: 3의 위치 17과 동등한 위치에서 아스파라긴 잔기를 포함하는 펩티드 태그는, 바람직하게는 서열식별번호: 3에 명시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 펩티드 태그의 반응 효능 (예를 들어, 수율, 반응 속도 등)의 적어도 60 %을 갖는, 서열식별번호: 2에 명시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 펩티드 태그와 함께 이소펩티드 결합을 형성할 수 있어야 한다.
즉, 치환, 결실 및 삽입과 관련하여 전술한 본 발명의 폴리펩티드 변이체의 정의는 본 발명의 용도 및 방법정과 관련하여 전술한 펩티드 태그 변이체에 동일하게 적용될 수 있다.
따라서, 변이체 펩티드 태그가 서열식별번호: 2의 위치 9와 동등한 위치에서 라이신 잔기 또는 서열식별번호: 3의 위치 17과 동등한 위치에서 아스파라긴 잔기를 포함하고 전술한 기능 특징을 유지한다면, 즉, 적합한 조건 하에 본 발명의 펩티드 리가아제에 의해 매개되는 각각의 파트너와 이소펩티드 결합을 형성할 수 있는 펩티드 태그를 초래하는 경우, 본 발명에서 사용하기 위한 변이체 펩티드 태그를 생성하기 위해 서열식별번호: 2 또는 3에 임의의 변형 또는 변형들의 조합이 이루어질 수 있다.
상기 펩티드 태그에서 동등한 위치는 서열식별번호: 2 또는 3의 아미노산 서열을 참조하여 결정된다. 상기 상동성 또는 상응하는 위치는 상동성 (돌연변이체, 변이체 또는 유도체) 펩티드 태그의 서열 및 예컨대, BLAST 알고리즘을 이용한 서열 사이의 상동성 또는 동일성에 기반한 서열식별번호: 2 또는 3의 서열을 라이닝함으로써 용이하게 추론될 수 있다.
상기 언급된 바와 같이, 일부 실시양태에서, 본 발명의 펩티드 태그는 다른 분자에 또는 다른 구성요소 또는 엔티티(entity)에 융합 또는 컨쥬게이션된다. 이러한 분자 또는 구성요소(즉, 엔티티)는 핵산 분자, 단백질, 펩티드, 소-분자 유기 화합물, 형광단, 금속-리간드 복합체, 다당류, 나노입자, 나노튜브, 중합체, 세포, 바이러스, 바이러스-유사 입자 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 펩티드 태그가 융합 또는 컨쥬게이션되는 구성요소 또는 엔티티는 하기에 정의된 바와 같은 고체 지지체, 즉 고체 기질 또는 상이다.
따라서, 대안적으로 볼 때, 본 발명은 핵산 분자, 단백질, 펩티드, 소-분자 유기 화합물, 형광단, 금속-리간드 복합체, 다당류, 나노입자, 나노튜브, 중합체, 세포, 바이러스, 바이러스-유사 입자 또는 이들의 임의의 조합 또는 본 발명의 펩티드 태그에 융합 또는 컨쥬게이션된 고체 지지체를 제공한다.
상기 세포는 원핵 또는 진핵 세포일 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 세포는 원핵 세포, 예를 들어 박테리아 세포이다.
일부 실시양태에서, 상기 펩티드 태그는 예를 들어 치료적 또는 예방적 효과를 갖는 화합물 또는 분자, 예를 들어, 항생제, 항바이러스제, 백신, 항종양제, 예를 들어 방사성 화합물 또는 동위 원소, 사이토카인, 독소, 올리고뉴클레오티드, 및 유전자 또는 핵산 백신을 인코딩하는 핵산에 컨쥬게이션 또는 융합될 수 있다.
일부 실시양태에서, 상기 펩티드 태그는 라벨에, 예를 들어, 방사성 라벨, 형광 라벨, 발광 라벨, 발색단 라벨에 및 검출 가능한 기질을 발생시키는 물질 및 효소, 예를 들어 호스 래디쉬 퍼옥시다제, 루시퍼라제 또는 알칼리성 포스파타제에 컨쥬게이션 또는 융합될 수 있다. 이 검출은 웨스턴 블롯/면역블롯, 조직화학, 효소-결합 면역흡착분석 (ELISA) 또는 유세포분석 (FACS) 포맷을 포함하여 항체가 통상적으로 사용되는 수많은 검정에 적용될 수 있다. 중성자 포획 요법을 위해 자기공명영상, 양전자 방출 단층촬영 프로브 및 붕소 10을 위한 라벨이 또한 본 발명의 펩티드 태그에 컨쥬게이션될 수 있다. 특히, 상기 펩티드 태그는 또 다른 펩티드, 예를 들어 His6 태그와 함께 융합 또는 생성될 수 있고/있거나, 예를 들어 말토스 결합 단백질에 융합함으로써 재조합 단백질 발현을 강화시킬 목적을 위해 또 다른 단백질과 함께 융합 또는 생성될 수 있다.
특히 유용한 실시양태에서, 상기 펩티드 태그 및/또는 펩티드 리가아제는 또 다른 펩티드, 올리고펩티드 또는 폴리펩티드와 함께 융합 또는 컨쥬게이션된다. 예를 들어, 상기 펩티드 태그는 하기 논의된 바와 같은 재조합 기술을 이용하여 또 다른 펩티드, 올리고펩티드 또는 폴리펩티드의 일부로서, 즉 재조합 또는 합성 단백질 또는 폴리펩티드로서 생성될 수 있다.
본 발명의 펩티드 태그 및/또는 펩티드 리가아제는 임의의 단백질 또는 폴리펩티드에 융합되는 것에 기반함이 명백할 것이다. 상기 단백질은 임의의 적합한 공급원으로부터 유래되거나 또는 수득될 수 있다. 예를 들어, 상기 단백질은 생물학적 및 임상적 샘플, 예를 들어 유기체 (진핵 생물, 원핵 생물)의 임의의 세포 또는 조직 샘플, 또는 이로부터 유래된 임의의 체액 또는 제제, 및 세포 배양물, 세포 제제, 세포 용해물 등과 같은 샘플로부터 시험관 내에서 번역 또는 정제될 수 있다. 단백질은 예를 들어 환경 샘플, 예컨대, 토양 및 물 샘플 또는 식품 샘플이 또한 포함된 환경 샘플로부터 정제되어, 유래되거나 수득될 수 있다. 상기 샘플은 새롭게 준비될 수 있거나 또는 예컨대, 보관을 위해, 임의의 편리한 방식으로 전-처리될 수 있다.
상기에서 언급된 바와 같이, 바람직한 실시양태에서, 상기 단백질은 재조합에 의해 생성될 수 있고, 이에 의해, 상기 단백질을 인코딩하는 핵산 분자는 임의의 적합한 공급원, 예를 들어 모든 원핵 또는 진핵 세포, 바이러스, 박테리오파지, 마이코플라스마, 원형질체 및 소기관을 포함하는 임의의 바이러스 또는 세포 물질로부터 유래되거나 또는 수득될 수 있다. 따라서, 이러한 생물학적 물질은 모든 유형의 포유 동물 및 비-포유 동물 세포, 식물 세포, 남조류를 포함한 조류, 진균, 박테리아, 원생 동물, 바이러스 등을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 단백질은 합성 단백질일 수 있다. 예를 들어, 본원에 개시된 펩티드 및 폴리펩티드 (단백질)는 고체상 펩티드 합성과 같은 화학적 합성에 의해 생성될 수 있다.
재조합 단백질 내의 펩티드 태그의 위치는 특별히 중요하지 않다. 따라서, 일부 실시양태에서, 상기 펩티드 태그는 상기 재조합 또는 합성 폴리펩티드의 N-말단 또는 C-말단에 위치할 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 펩티드 태그는 상기 재조합 또는 합성 폴리펩티드 내의 내부에 위치할 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 상기 펩티드 태그는 상기 재조합 또는 합성 폴리펩티드의 N-말단, C-말단 또는 내부 도메인으로 볼 수 있다.
상기 펩티드 리가아제는 바람직하게는 상기 재조합 또는 합성 폴리펩티드의 N-말단 또는 C-말단에 위치한다. 일부 실시양태에서, 상기 펩티드 리가아제는 상기 재조합 또는 합성 폴리펩티드 내에 내부적으로 위치할 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 상기 펩티드 리가아제는 상기 재조합 또는 합성 폴리펩티드의 N-말단, C-말단 또는 내부 도메인으로 볼 수 있다.
일부 실시양태에서, 펩티드 태그 및/또는 펩티드 리가아제와 결합 또는 컨쥬게이션될 상기 펩티드, 올리고펩티드 또는 폴리펩티드 사이에 1개 이상의 스페이서, 예를 들어 펩티드 스페이서를 포함하는 것이 유용할 수 있다. 따라서, 상기 펩티드, 올리고펩티드 또는 폴리펩티드 및 펩티드 태그 및/또는 펩티드 리가아제가 서로 직접 연결될 수 있거나 또는 이들은 1개 이상의 스페이서 서열에 의해 간접적으로 연결될 수 있다. 따라서, 스페이서 서열은 상기 재조합 또는 합성 폴리펩티드의 둘 이상의 개별 부분을 이격(interspace) 또는 분리할 수 있다. 일부 실시양태에서, 스페이서는 상기 펩티드 태그 및/또는 펩티드 리가아제에 대해 N-말단 또는 C-말단일 수 있다. 일부 실시양태에서, 스페이서는 상기 펩티드 태그 및/또는 펩티드 리가아제의 양 측에 있을 수 있다.
상기 스페이서 서열의 정확한 성질은 중요하지 않으며, 가변적인 길이 및/또는 서열일 수 있으며, 예를 들어 1-40 개, 보다 특히 2-20, 1-15, 1-12, 1-10, 1-8 또는 1-6 개의 잔기, 예를 들어 6, 7, 8, 9, 10 개 이상의 잔기일 수 있다. 대표적인 예로서, 상기 스페이서 서열은, 존재한다면, 1-15, 1-12, 1-10, 1-8 또는 1-6 개의 잔기 등을 가질 수 있다. 상기 잔기의 성질은 중요하지 않으며, 예를 들어 임의의 아미노산, 예컨대, 중성 아미노산, 또는 지방족 아미노산일 수 있거나, 또는 대안적으로 이들은 소수성, 또는 극성 또는 하전된 또는 구조-형성성일 수 있으며, 예컨대, 프롤린일 수 있다. 일부 바람직한 실시양태에서, 상기 링커는 바람직하게는 적어도 6 개의 아미노산 잔기, 예를 들어 6, 7 또는 8개의 잔기를 포함하는 세린 및/또는 글리신-풍부 서열이다.
따라서, 예시적인 스페이서 서열은 임의의 단일 아미노산 잔기, 예를 들어 S, G, L, V, P, R, H, M, A 또는 E 또는 이러한 잔기의 1개 이상으로 구성된 디-, 트리- 테트라- 펜타- 또는 헥사-펩티드를 포함한다.
따라서, 일부 실시양태에서, 본 발명은 상기 정의된 바와 같은 본 발명의 펩티드 태그 또는 펩티드 리가아제를 포함하는 재조합 또는 합성 폴리펩티드, 즉 본 발명의 펩티드 태그 또는 펩티드 리가아제에 융합된 펩티드, 올리고펩티드 또는 폴리펩티드를 포함하는 재조합 또는 합성 폴리펩티드를 제공한다. 상기 재조합 또는 합성 폴리펩티드는 임의적으로 상기 정의된 바와 같은 스페이서를 포함한다.
본 발명의 재조합 또는 합성 폴리펩티드는 또한 (예를 들어, 하기 논의되는 본 발명의 방법 및 용도에 사용하기 이전에) 그의 정제를 용이하게 하기 위해 정제 모이어티 또는 태그를 포함할 수 있다. 임의의 적합한 정제 모이어티 또는 태그가 상기 폴리펩티드에 혼입될 수 있고, 이러한 모이어티가 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 상기 재조합 또는 합성 폴리펩티드는 펩티드 정제 태그 또는 모이어티, 예를 들어 His-태그 서열을 포함할 수 있다. 이러한 정제 모이어티 또는 태그는 상기 폴리펩티드 내의 임의의 위치에 혼입될 수 있다. 일부 바람직한 실시양태에서, 상기 정제 모이어티는 상기 폴리펩티드의 N- 또는 C- 말단에 또는 이들 쪽에서 (즉, 이들의 5, 10, 15, 20개의 아미노산 이내에) 위치한다.
위에서 언급한 바와 같이, 본 발명의 이점은 상기 펩티드, 올리고펩티드 또는 폴리펩티드 (예를 들어, 본 발명의 재조합 또는 합성 폴리펩티드)에 혼입된 펩티드 태그 및/또는 펩티드 리가아제가 완전히 유전적으로 인코딩될 수 있다는 사실에서 발생한다. 따라서, 추가적인 측면에서, 본 발명은 상기 정의된 바와 같은 펩티드 태그, 펩티드 리가아제 또는 재조합 또는 합성 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 분자를 제공한다.
일부 실시양태에서, 상기 정의된 펩티드 태그를 인코딩하는 핵산 분자는 서열식별번호: 6-7 중 임의의 하나에 명시된 바와 같은 뉴클레오티드 서열, 또는 서열식별번호: 6-7 중 임의의 하나에 명시된 바와 같은 서열과 적어도 80 %의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 상기 정의된 펩티드 리가아제를 인코딩하는 핵산 분자는 서열식별번호: 5에 명시된 바와 같은 뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 5에 명시된 바와 같은 서열과 적어도 80 %의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
바람직하게, 상기 핵산 분자는 그것이 비교되는 서열과 적어도 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100 % 동일하다.
핵산 서열 동일성은 예를 들어 디폴트 값과 가변적인 팸팩터(pamfactor)와 함께 갭 생성 페널티를 12.0으로 설정하고 갭 확장 페널티는 4.0으로 설정하며 6 개의 뉴클레오티드의 윈도우를 갖는 GCG 패키지를 사용하는 FASTA Search에 의해 결정될 수 있다. 바람직하게 상기 비교는 상기 서열의 전체 길이에 걸쳐 이루어지지만, 예를 들어 600, 500, 400, 300, 200, 100 또는 50 개 미만의 인접 뉴클레오티드의 보다 작은 비교 윈도우에 걸쳐 이루어질 수 있다.
본 발명의 핵산 분자는 리보뉴클레오티드 및/또는 데옥시리보뉴클레오티드뿐만 아니라 Watson-Crick 유형 또는 유사한 염기쌍 상호작용에 참여할 수 있는 합성 잔기, 예를 들어 합성 뉴클레오티드로 구성될 수 있다. 바람직하게, 상기 핵산 분자는 DNA 또는 RNA이다.
전술한 핵산 분자는 발현 제어 서열, 또는 이러한 재조합 DNA 분자를 함유하는 재조합 DNA 클로닝 비히클 또는 벡터에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 이는 유전자 산물로서 본 발명의 펩티드 및 폴리펩티드의 세포내 발현을 허용하며, 그의 발현은 관심 세포 내로 도입되는 유전자(들)에 의해 지시된다. 유전자 발현은 관심 세포에서 활성인 프로모터로부터 지시되고, 상기 게놈에 혼입시키기 위해 또는 독립적인 복제 또는 일시적인 형질감염/발현을 위해 임의의 형태의 선형 또는 원형의 핵산(예를 들어, DNA) 벡터에 삽입될 수 있다. 적합한 형질전환 또는 형질감염 기술은 문헌에 잘 기재되어있다. 대안적으로, 상기 네이키드 핵산 (예를 들어, 1개 이상의 합성 잔기를 포함할 수 있는 DNA 또는 RNA, 예를 들어 염기 유사체) 분자는 본 발명의 펩티드 및 폴리펩티드의 생성을 위해 상기 세포 내로 직접 도입될 수 있다. 대안적으로, 상기 핵산은 시험관내 전사에 의해 mRNA로 전환될 수 있고, 관련 단백질은 시험관내 번역에 의해 발생될 수 있다.
적절한 발현 벡터는 예를 들어 해독 틀(reading frame)을 본 발명의 핵산 분자와 함께 매칭시키는데 연결된 번역 (예를 들어, 시작 및 정지 코돈, 리보솜 결합 부위) 및 전사 제어 요소 (예를 들어, 프로모터-오퍼레이터 영역, 종결 정지 서열)와 같은 적절한 제어 서열을 포함한다. 적절한 벡터는 플라스미드 및 바이러스 (박테리오파지 및 진핵 바이러스 모두 포함)를 포함할 수 있다. 적합한 바이러스 벡터는 바큘로바이러스 및 또한 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스, 헤르페스 및 백시니아/폭스 바이러스를 포함한다. 많은 다른 바이러스 벡터가 당업계에 기재되어 있다. 적합한 벡터의 예는 박테리아 및 포유 동물 발현 벡터 pGEX-KG, pEF-neo 및 pEF-HA를 포함한다.
상기 언급한 바와 같이, 본 발명의 재조합 또는 합성 폴리펩티드는 추가적인 서열 (예를 들어, 상기 폴리펩티드의 정제를 용이하게하기 위한 펩티드/폴리펩티드 태그)을 포함할 수 있고, 따라서 상기 핵산 분자는 추가적인 펩티드 또는 폴리펩티드, 예를 들어 His-태그, 말토오스-결합 단백질을 인코딩하는 DNA와 함께 융합되어, 발현시 융합 단백질을 생성할 수 있다.
이와 같이 추가적인 측면에서 볼 때, 본 발명은 상기 정의된 바와 같은 핵산 분자를 포함하는 벡터, 바람직하게는 발현 벡터를 제공한다.
본 발명의 다른 측면은 본 발명의 펩티드 태그 및/또는 폴리펩티드를 인코딩하는 본 발명의 핵산 분자를 벡터 핵산에 삽입하는 단계를 포함하는, 본 발명에 따른 재조합 핵산 분자의 제조 방법을 포함한다.
바람직하게 벡터에 함유된 본 발명의 핵산 분자는 임의의 적절한 수단에 의해 세포 내로 도입될 수 있다. 적합한 형질전환 또는 형질감염 기술은 문헌에 잘 기재되어있다. 다수의 기술이 공지되어 있고, 발현을 위해 이러한 벡터를 원핵 또는 진핵 세포 내로 도입하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 목적을 위해 바람직한 숙주 세포는 곤충 세포주, 효모, 포유 동물 세포주 또는 대장균, 예컨대 균주 BL21/DE3을 포함한다. 본 발명은 또한 핵산 분자, 특히 상기 정의된 바와 같은 벡터를 함유하는 형질전환된 또는 형질감염된 원핵 또는 진핵 숙주 세포로 확장된다.
따라서, 또 다른 측면에서, 전술된 바와 같은 핵산 분자 및/또는 벡터를 함유하는 재조합 숙주 세포가 제공된다.
"재조합"은 상기 핵산 분자 및/또는 벡터가 상기 숙주 세포 내로 도입되었음을 의미한다. 상기 숙주 세포는 상기 핵산 분자의 내인성 카피를 자연적으로 함유할 수 있거나 또는 함유하지 않을 수 있지만, 상기 핵산 분자 및/또는 벡터의 외인성 또는 추가적인 내인성 카피가 도입되었으므로 재조합이다.
본 발명의 추가적인 측면은 상기 정의된 바와 같은 본 발명의 펩티드 태그 및/또는 폴리펩티드의 제조 방법으로, 상기 펩티드 태그 및/또는 폴리펩티드를 인코딩하는 상기 핵산 분자가 발현되는 조건 하에, 상기 정의된 바와 같은 핵산 분자를 함유하는 숙주 세포를 배양하는 단계와 이와 같이 생성된 상기 분자 (펩티드 태그 및/또는 폴리펩티드)를 회수하는 단계를 포함하는 제조방법을 제공한다. 상기 발현된 펩티드 태그 및/또는 폴리펩티드는 본 발명의 추가적인 측면을 형성한다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 또는 본 발명의 방법 및 용도에서 사용하기 위한 펩티드 태그 및/또는 폴리펩티드는 예를 들어 아미노산 또는 보다 작은 합성적으로 발생된 펩티드의 리게이션에 의해, 또는 보다 편리하게는 앞서 기재된 바와 같은 상기 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 분자의 재조합 발현에 의해 합성적으로 발생될 수 있다.
본 발명의 핵산 분자는 당업계에 공지된 임의의 적합한 수단에 의해 합성적으로 발생될 수 있다.
이와 같이, 본 발명의 펩티드 태그 및/또는 폴리펩티드는 단리, 정제, 재조합 또는 합성된 펩티드 태그 또는 폴리펩티드일 수 있다.
용어 "폴리펩티드"는 용어 "단백질"과 상호 교환적으로 본원에서 사용된다. 상기에서 언급된 바와 같이, 용어 폴리펩티드 또는 단백질은 전형적으로 적어도 40 개의 연속된 아미노산 잔기, 예를 들면, 적어도 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150 개의 아미노산, 예컨대 40-1000, 50-900, 60-800, 70-700, 80-600, 90-500, 100-400 개의 아미노산을 포함하는 임의의 아미노산 서열을 포함한다.
유사하게, 본 발명의 핵산 분자는 단리, 정제, 재조합 또는 합성된 핵산 분자일 수 있다.
따라서, 대안적으로 볼 때, 본 발명의 펩티드 태그, 폴리펩티드 및 핵산 분자는 바람직하게는 비-천연, 즉 비-자연 발생의 분자이다.
표준 아미노산 명명법이 본원에 사용된다. 이와 같이, 아미노산 잔기의 전체 명칭은 1 개 문자 코드 또는 3 개 문자 약어와 상호교환적으로 사용될 수 있다. 예를 들어, 라이신은 K 또는 Lys로 대체될 수 있고, 이소류신은 I 또는 Ile 등으로 대체될 수 있다. 또한, 용어 아스파르테이트 및 아스파르트산, 및 글루타메이트 및 글루탐산은 본원에서 상호교환적으로 사용되며, Asp 또는 D, 또는 Glu 또는 E로 각각 교체될 수 있다.
본 발명의 및 본 발명에서 사용하기 위한 펩티드 태그 또는 폴리펩티드는 재조합에 의해 생성될 수 있고, 또한, 이것이 본 발명의 바람직한 실시양태인 것으로 예상되지만, 본 발명의 펩티드 태그는 다른 수단에 의해 상기 정의된 바와 같이 단백질 또는 다른 엔티티, 예를 들어 분자에 컨쥬게이션될 수 있음이 명백할 것이다. 즉, 상기 펩티드 태그 및 다른 분자, 구성요소 또는 엔티티, 예를 들어 단백질은 임의의 적합한 수단에 의해, 예를 들어 재조합에 의해 별도로 생성될 수 있으며, 이후에 본 발명의 방법 및 용도에서 사용될 수 있는 펩티드 태그-다른 구성요소 컨쥬게이션체를 형성하도록 컨쥬게이션(결합)될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 펩티드 태그는 상기 정의된 바와 같이 합성적으로 또는 재조합적으로 생성될 수 있고, 비-펩티드 링커 또는 스페이서를 통해, 예컨대 화학적 링커 또는 스페이서를 통해 또 다른 구성요소, 예를 들어 단백질에 컨쥬게이션될 수 있다.
이와 같이, 일부 실시양태에서, 상기 펩티드 태그 및 다른 구성요소, 예를 들어 단백질은 결합을 통해 직접적으로 또는 링크 기를 통해 간접적으로 함께 결합될 수 있다. 링크 기가 이용되는 경우, 이러한 기는 상기 링크 기를 통해 상기 펩티드 태그 및 다른 엔티티, 예컨대 단백질의 공유 부착을 제공하도록 선택될 수 있다. 관심 링크 기는 상기 다른 엔티티, 예컨대 단백질의 성질에 따라 크게 달라질 수 있다. 상기 링크 기는, 존재하는 경우, 많은 실시양태에서 생물학적으로 불활성이다.
다양한 링크 기가 당업자에게 공지되어 있으며 본 발명에서 용도를 갖는다. 대표적인 실시양태에서, 상기 링크 기는 일반적으로 적어도 약 50 달톤, 일반적으로 적어도 약 100 달톤이고, 상기 링크 기가 스페이서를 함유하는 경우에는 1000 달톤 이상, 예를 들어 최대 1000000 달톤 정도의 크기일 수 있지만, 일반적으로 약 500 달톤을 초과하지 않을 것이고 일반적으로 약 300 달톤을 초과하지 않을 것이다. 일반적으로, 이러한 링커는 상기 펩티드 태그 및 다른 분자 또는 구성요소, 예를 들어 단백질에 공유 결합할 수 있는 반응성 작용기에 의해 어느 일 말단이 종결된 스페이서 기를 포함할 것이다.
관심 스페이서 기는 지방족 및 불포화 탄화수소 사슬, 산소 (폴리에틸렌 글리콜과 같은 에테르) 또는 질소 (폴리아민)와 같은 헤테로 원자를 함유하는 스페이서, 펩티드, 탄수화물, 헤테로 원자를 가능하게 함유할 수 있는 환형 또는 비환형 시스템을 포함할 수 있다. 스페이서 기는 또한 금속 이온의 존재가 2개 이상의 리간드를 배위하여 복합체를 형성하도록 금속에 결합한 리간드로 구성될 수 있다. 특정 스페이서 요소는 하기를 포함한다: 1,4-디아미노헥산, 자일릴렌디아민, 테레프탈산, 3,6-디옥사옥탄디오산, 에틸렌디아민-N, N-디아세트산, 1,1'-에틸렌비스(5-옥소-3-피롤리딘카르복실산), 4,4'-에틸렌디피페리딘, 올리고에틸렌 글리콜 및 폴리에틸렌 글리콜. 잠재적 반응성 작용기는 친핵성 작용기 (아민, 알코올, 티올, 히드라지드), 친전자성 작용기 (알데히드, 에스테르, 비닐 케톤, 에폭시드, 이소시아네이트, 말레이미드), 고리첨가 반응할 수 있거나, 이황화 결합을 형성할 수 있거나, 또는 금속에 결합할 수 있는 작용기를 포함한다. 특정 예는 1 차 및 2 차 아민, 히드록삼산, N-하이드록시숙신이미딜 에스테르, N-하이드록시숙신이미딜 카보네이트, 옥시 카보닐이미다졸, 니트로페닐에스테르, 트리플루오로에틸 에스테르, 글리시딜 에테르, 비닐설폰 및 말레이미드를 포함한다. 본 발명의 차단제에 사용될 수 있는 특정 링커 기는 이종작용성 화합물, 예컨대 아지도벤조일 히드라지드, N-[4-(p-아지도살리실아미노)부틸]-3'-[2'-피리딜디티오]프로피온아미드), 비스-설포숙신이미딜 수베레이트, 디메틸아디프이미데이트, 디숙신이미딜타르트레이트, N-말레이미도부티릴옥시숙신이미드 에스테르, N-하이드록시 설포숙신이미딜-4-아지도벤조에이트, N-숙신이미딜[4-아지도페닐]-1,3'-디티오프로피오네이트, N-숙신이미딜[4-요오도아세틸] 아미노벤조에이트, 글루타르알데히드 및 숙신이미딜-4-[N-말레이미도메틸]시클로헥산-1-카복실레이트, 3-(2-피리딜디티오)프로피온산 N-하이드록시숙신이미드 에스테르 (SPDP), 4-(N-말레이미도메틸)-시클로헥산-1-카복실산 N-하이드록시숙신이미드 에스테르 (SMCC) 등을 포함한다. 예를 들어, 스페이서는 알킨(alkyne)과 반응하는 아지드 또는 트랜스-시클로옥텐 또는 노르보르넨과 반응하는 테트라진을 사용하여 형성될 수 있다.
일부 실시양태에서, 이들 분자의 컨쥬게이션을 용이하게 하고/하거나 상기 펩티드 태그 및/또는 폴리펩티드의 안정성을 개선시키기 위해 상기 펩티드 태그 및/또는 폴리펩티드에서 1개 이상의 잔기를 변형시키는 것이 유용할 수 있다. 이와 같이, 일부 실시양태에서, 본 발명의 또는 본 발명에서 사용하기 위한 펩티드 태그 또는 폴리펩티드는 비천연 또는 비-표준 아미노산을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 또는 본 발명에서 사용하기 위한 펩티드 태그 또는 폴리펩티드는 1개 이상, 예를 들어, 적어도 1, 2, 3, 4, 5 개의 비-통상의 아미노산, 예컨대 10, 15, 20 개 이상의 비-통상의, 즉 표준 유전자 코드에 의해 코딩되지 않은 측쇄를 갖는, 본원에서 "비-코딩된 아미노산"으로 지칭되는 아미노산을 포함할 수 있다 (예를 들어, 표 1 참조). 이들은 오르니틴 또는 타우린과 같이 대사 과정을 통해 형성되는 아미노산, 및/또는 9H-플루오렌-9-일메톡시카보닐 (Fmoc), (tert)-(부)틸(옥)시(카)보닐(Boc), 2,2,5,7,8-펜타메틸크로만-6-설포닐 (Pmc) 보호된 아미노산, 또는 벤질옥시-카보닐 (Z) 기를 갖는 아미노산과 같은 인위적 변형된 아미노산으로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 및 본 발명에서 사용하기 위한 펩티드 링커 또는 폴리펩티드에서 사용될 수 있는 비-표준 또는 구조적 유사체 아미노산의 예는 D 아미노산, 아미드 이소스테레 (예를 들어, N-메틸아미드, 레트로-역 아미드, 티오아미드, 티오에스테르, 포스포네이트, 케토메틸렌, 하이드록시메틸렌, 플루오로비닐, (E)-비닐, 메틸렌아미노, 메틸렌티오 또는 알칸), L-N 메틸아미노산, D-α 메틸아미노산, D-N-메틸 아미노산이다. 비-통상의, 즉 비-코딩된 아미노산의 예가 표 1에 나열되어 있다.
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004
상기에서 논의된 바와 같이, 일부 실시양태에서, 본 발명의 펩티드 태그 및/또는 폴리펩티드 (펩티드 리가아제)를 고체 기질 (즉, 고체 상 또는 지지체)에 융합 또는 컨쥬게이션시키는 것이 유용할 수 있으며, 이것이 임의의 편리한 방식으로 달성될 수 있음이 명백할 것이다. 따라서, 고정화의 방식 또는 수단 및 고체 지지체가 당업계에 널리 공지되어 있고 문헌에 기재된 바와 같은 많은 고정화 수단 및 고체 지지체로부터 선정에 따라 선택될 수 있다. 따라서, 상기 펩티드 태그 및/또는 폴리펩티드는, 예를 들어 상기 펩티드 태그 또는 폴리펩티드의 도메인 또는 모이어티를 통해 (예를 들어 화학적으로 가교-연결된) 상기 지지체에 직접 결합될 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 펩티드 태그 또는 폴리펩티드는 링커 기에 의해 또는 중간 결합 기(들)에 의해 (예를 들어, 비오틴-스트렙타비딘 상호작용에 의해) 간접적으로 결합될 수 있다. 따라서, 상기 펩티드 태그 또는 폴리펩티드는 상기 고체 지지체에 공유적으로 또는 비-공유적으로 연결될 수 있다. 상기 연결은 가역적인 (예를 들어, 절단가능한) 또는 비가역적인 연결일 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 상기 연결은 효소적으로, 화학적으로 또는 빛으로 절단될 수 있으며, 예컨대, 상기 연결은 감광성 연결일 수 있다.
따라서, 일부 실시양태에서, 펩티드 태그 또는 폴리펩티드에 상기 지지체 상에 제공된 고정화를 위한 수단 (예를 들어, 친화성 결합 파트너, 예를 들어 그의 결합 파트너, 즉, 동족 결합 파트너, 예를 들어 스트렙타비딘 또는 항체에 결합할 수 있는 비오틴 또는 합텐)이 제공될 수 있다)이 제공될 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 펩티드 태그 또는 폴리펩티드와 상기 고체 지지체 사이의 상호작용은 세척 단계를 허용하기에 충분할 정도로 견고해야 하며, 즉, 상기 펩티드 태그 또는 폴리펩티드와 상기 고체 지지체 사이의 상호작용이 전술한 세척 단계에 의해 붕괴되지 않는다 (유의미하게 붕괴되지 않는다). 예를 들어, 각각의 세척 단계를 사용하여, 상기 펩티드 태그 또는 폴리펩티드의 5 % 미만, 바람직하게는 4, 3, 2, 1, 0.5 또는 0.1 % 미만이 상기 고체 상으로부터 제거 또는 용출되는 것이 바람직하다.
상기 고체 지지체 (상 또는 기질)는 고정화, 분리 등을 위해 현재 널리 사용되거나 또는 제안된 잘 알려진 지지체 또는 매트릭스 중 임의의 것일 수 있다. 이들은 입자 (예를 들어, 자성, 상자성 또는 비자성일 수 있는 비드), 시트, 겔, 필터, 막, 섬유, 모세관, 슬라이드, 어레이 또는 미세역가 스트립, 튜브, 플레이트 또는 웰 등의 형태를 취할 수 있다.
상기 지지체는 유리, 실리카, 라텍스 또는 중합성 물질로 만들어질 수 있다. 상기 융합 단백질의 결합을 위해 높은 표면적을 제공하는 물질이 적합하다. 이러한 지지체는 불규칙한 표면을 가질 수 있고, 예를 들어 다공성 또는 미립자, 예컨대, 입자, 섬유, 웹, 소결체. 시브(sieve)일 수 있다. 미립자 물질, 예컨대, 비드, 특히 중합체 비드가 이들의 보다 큰 결합 능력으로 인해 유용하다.
편의상, 본 발명에 따라 사용되는 미립자 고체 지지체는 구형 비드를 포함할 것이다. 상기 비드의 크기는 중요하지 않지만, 예를 들어 적어도 1, 또한 바람직하게는 적어도 2 ㎛의 직경 수준일 수 있고, 바람직하게는 최대 10, 및 예를 들어, 최대 6 ㎛ 미만의 최대 직경을 가질 수 있다.
실질적으로 균일한 크기인 것인 단분산 입자 (예를 들어, 5 % 미만의 직경 표준 편차를 갖는 크기)는 이들이 반응의 매우 균일한 재현성을 제공한다는 이점을 갖는다. 대표적인 단분산 중합체 입자는 US-A-제4336173호에 기재된 기술에 의해 생성될 수 있다.
그러나, 조작 및 분리를 돕기 위해, 자성 비드가 유리하다. 본원에서 사용될 때 용어 "자기"는 상기 지지체가 자기장에 배치될 때 상기 지지체에 부여된 자기 모멘트를 가질 수 있고, 따라서 상기 자기장의 작용 하에 변위될 수 있음을 의미한다. 다시 말해, 자성 입자를 포함하는 지지체는 자성 응집에 의해 쉽게 제거될 수 있으며, 이는 상기 이소펩티드 결합 형성 단계 후에 상기 입자를 신속하고 간단하며 효율적으로 분리하는 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 상기 고체 지지체는 아가로스 수지이다.
상기 실시예에서 논의된 바와 같이, 본 발명자들은 놀랍게도 본 발명의 펩티드 리가아제가 현저한 활성 손실없이 동결건조될 수 있음을 결정하였다. 이는 주변 온도에서, 즉 냉각할 필요없이 상기 폴리펩티드의 장기 보관 및/또는 운송에 특히 유리할 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 본 발명의 폴리펩티드 (펩티드 리가아제) 및 펩티드 태그는 동결건조된 상태일 수 있다. 대안적으로 볼 때, 본 발명은 상기 정의된 바와 같은 동결건조된 폴리펩티드 (펩티드 리가아제)를 제공한다. 본 발명은 또한 상기 정의된 바와 같은 동결건조된 펩티드 태그를 제공할 수 있다. 동결건조는 당업계에 공지된 임의의 적합한 수단을 사용하여 달성될 수 있다.
추가적인 실시양태에서, 본 발명은 키트, 특히 본 발명의 방법 및 용도에서 사용하기 위한 키트로서, 즉 이소펩티드 결합을 통해 2 개의 분자 또는 구성요소를 컨쥬게이션하기 위한 또는 3 개의 분자 또는 구성요소 사이의 복합체로서 상기 복합체 내의 분자 또는 구성요소 중 2 개가 이소펩티드 결합을 통해 컨쥬게이션된 복합체를 생성하기 위한 키트이며, 상기 키트는 하기를 포함한다:
(a) 임의적으로 분자 또는 구성요소, 예를 들어 단백질에 컨쥬게이션 또는 융합된, 상기 정의된 바와 같은 펩티드 리가아제; 및
(b) 펩티드 태그로서, 하기를 포함하고:
(i) 서열식별번호: 2에 명시된 바와 같은 아미노산 서열;
(ii) 서열식별번호: 2에 명시된 바와 같은 서열과 적어도 80 %의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로서, 상기 아미노산 서열은 서열식별번호: 2의 위치 9와 동등한 위치에서 라이신 잔기를 포함하는 것인 아미노산 서열,
(iii) 서열식별번호: 3에 명시된 바와 같은 아미노산 서열; 또는
(iv) 서열식별번호: 3에 명시된 바와 같은 서열과 적어도 80 %의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로서, 상기 아미노산 서열은 서열식별번호: 3의 위치 17과 동등한 위치에서 아스파라긴 잔기를 포함하는 것인 아미노산 서열,
상기 펩티드 태그는 분자 또는 구성요소, 예를 들어 상기 정의된 바와 같은 펩티드 태그를 포함하는 재조합 또는 합성 폴리펩티드와 같은 단백질에 컨쥬게이션 또는 융합되는 것인 펩티드 태그; 및/또는
(c) (a)에 정의된 바와 같은 펩티드 리가아제를 인코딩하는 핵산 분자, 특히 벡터; 및
(d) (b)에 정의된 바와 같은 펩티드 태그를 인코딩하는 핵산 분자, 특히 벡터.
일부 실시양태에서, 상기 키트는 예를 들어 분자 또는 구성요소, 에컨대, 상기 정의된 바와 같은 펩티드 태그를 포함하는 재조합 또는 합성 폴리펩티드와 같은 단백질에 컨쥬게이션 또는 융합된 제 2 펩티드 태그를 추가로 포함할 수 있되, 상기 제 2 펩티드 태그는 상기 정의된 바와 같은 이소펩티드 결합의 형성에 적합한 조건 하에서 (a)의 펩티드 리가아제와 접촉할 때 (b)에서 상기 펩티드 태그와 이소펩티드 결합을 형성할 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 상기 키트는 분자 또는 구성요소에 컨쥬게이션 또는 융합된 서열식별번호: 2에 명시된 바와 같은 아미노산 서열 (또는 이의 변이체) 및 분자 또는 구성요소에 컨쥬게이션 또는 융합된 서열식별번호: 3에 명시된 바와 같은 아미노산 서열 (또는 이의 변이체)을 포함하는 펩티드 태그를 포함한다.
본 발명의 펩티드 리가아제 및 펩티드 태그는 광범위한 유용성을 가짐이 명백할 것이다. 대안적으로 볼 때, 본 발명의 펩티드 리가아제 및 펩티드 태그는 다양한 산업에 이용될 수 있다.
예를 들어, 일부 실시양태에서, 본 발명의 펩티드 리가아제 및 펩티드 태그는 형광 또는 다른 생물물리학적 프로브 또는 라벨을 특정 단백질로 표적화하는데 유용할 수 있다. 이와 관련하여, 관심 단백질은 상기 논의된 바와 같이 제 1 펩티드 태그 (예를 들어, 서열식별번호: 2)를 혼입하도록 변형될 수 있고, 상기 형광 또는 다른 생물물리학적 프로브 또는 라벨은 제 2 펩티드 태그 (예를 들어, 서열식별번호: 3)에 융합 또는 컨쥬게이션될 수 있다. 상기 변형된 단백질 및 프로브 또는 라벨은 상기 펩티드 태그 사이에 이소펩티드 결합의 형성을 허용하기에 적합한 조건 하에서 상기 펩티드 리가아제의 존재하에 함께 접촉될 수 있으며, 이로써 이소펩티드 결합을 통해 상기 단백질을 상기 라벨 또는 프로브로 라벨링할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 펩티드 리가아제 및 펩티드 태그는 프로테오믹스(proteomics)에 대한 단백질 고정화에서 유용할 수 있다. 이와 관련하여, 상기 관심 단백질은 제 1 펩티드 태그 (예를 들어, 서열식별번호: 2)를 혼입하도록 변형될 수 있고, 고체 기질은 제 2 펩티드 태그 (예를 들어, 서열식별번호: 3) 에 융합 또는 컨쥬게이션될 수 있다. 상기 변형된 단백질 및 고체 기질은 상기 펩티드 태그 사이에 이소펩티드 결합의 형성을 허용하기에 적합한 조건 하에서 상기 펩티드 리가아제의 존재하에 함께 접촉될 수 있으며, 이에 의해 이소펩티드 결합을 통해 상기 고체 기질 상에 상기 단백질을 고정시킬 수 있다. 본 발명의 펩티드 태그 및 리가아제는 고체 상/기질 상에 다수의 단백질을 동시에 고정시키기 위해 사용될 수 있음이 명백할 것이다.
더 추가적인 실시양태에서, 본 발명의 펩티드 리가아제 및 펩티드 태그는 바이러스-유사 입자, 바이러스, 박테리아 또는 백신 접종용 다량체화 스캐폴드로의 항원 컨쥬게이션에 유용할 수 있다. 예를 들어, 표면 상에 제 1 펩티드 태그를 진열한 바이러스-유사 입자, 바이러스 또는 박테리아의 생성은 이소펩티드 결합의 형성을 매개하는 본 발명의 펩티드 리가아제를 사용하여, 제 2 펩티드 태그를 포함하는 항원을 그 표면에 상기 이소펩티드 결합을 통해 컨쥬게이션하는 것을 용이하게 할 것이다. 이와 관련하여, 항원 다량체화가 발생하여, 크게 보강된 면역 반응을 일으킨다. 따라서, 일부 실시양태에서, 본 발명의 제 1 펩티드에 융합된 분자 또는 구성요소는 바이러스 캡시드 단백질이고/이거나 본 발명의 제 2 펩티드 태그에 융합된 분자 또는 구성요소는 항원, 예를 들어 특정 질병, 예를 들어 감염과 관련된 항원이다.
다른 실시양태에서, 상기 펩티드 태그는 예를 들어 펩티드 태그를 상기 단백질의 각 말단에 융합시키고, 이후에 상기 단백질을 본 발명의 펩티드 리가아제와 접촉시켜서 상기 펩티드 태그 사이에서 이소펩티드 결합의 형성을 매개 또는 촉진함으로써 단백질을 또는 고리화하는데 사용될 수 있다. 이와 관련하여, 단백질의 고리화는 예를 들어 가열, 유기 용매, 극도의 pH 또는 단백질 분해에 대한 단백질 복원력을 증가시키는 것으로 나타났다.
특히, 효소 또는 효소 중합체 (융합 단백질)의 고리화는 상기 효소 중합체에있는 단백질 또는 단백질 단위의 열안정성을 향상시킬 수 있다. 이러한 측면에서, 효소는 많은 공정에서 유용한 도구이지만, 불안정하고 복구하기 어렵다. 효소 중합체는 온도, pH 및 유기 용매에 대해 더 큰 안정성을 가지며, 공업 공정에서 효소 중합체를 사용하려는 요구가 증가하고있다. 그러나, 효소 중합체 발생은 통상적으로 글루타르알데히드 비-특이적 반응을 사용하며, 이는 잠재적으로 유용한 많은 효소를 손상 또는 변성(즉, 그의 활성을 감소)시킬 것이다. 본 발명의 펩티드 태그 및 펩티드 리가아제를 사용하여 이소펩티드 결합을 통해 사슬 (중합체) 내로의 단백질의 부위-특이적 연결은 예컨대, 진단 또는 동물 사료에 첨가된 효소에서 효소 복원력을 강화시킬 것으로 예상된다. 특히 바람직한 실시양태에서, 효소는 상기 논의된 바와 같이 고리화에 의해 안정화될 수 있다.
WO 제2016/193746호에 기재된 바와 같이, 본 발명의 펩티드 리가아제 및 펩티드 태그는 또한 대사 효능을 증진시키는 경로에 다수의 효소를 연결시키는데 사용될 수 있다. 이와 관련하여, 효소는 종종 세포 내부의 경로에서 기능하기 위해 함께 제공되며, 전통적으로 다수의 효소를 세포 외부에서 (시험관 내에서) 함께 연결시키기가 어려웠다. 따라서, 본 발명의 펩티드 태그 및 펩티드 리가아제는 융합 단백질을 생성하는 효소를 커플링 또는 컨쥬게이션시키기 위해 사용되고, 따라서, 다단계 효소 경로의 활성을 강화시키는데 사용될 수 있으며, 이는 다양한 공업 전환에서 및 진단을 위해 유용할 수 있었다. 예를 들어, 상기 융합 단백질은 예를 들어 분화 또는 치료에서 세포 반응을 유도하기 위한 신호전달 팀을 형성할 수 있다.
본 발명의 펩티드 태그 및 펩티드 리가아제는 또한 항체 중합체의 생성에 유용할 것이다. 이와 관련하여, 항체는 가장 중요한 의약품 부류 중 하나이며, 종종 표면에 부착되어 사용된다. 그러나, 샘플에서의 항원 혼합, 그리고 그에 따른 상기 샘플에서 상기 항원의 포획은 표면 근처에서 비효율적이다. 항체 사슬을 연장시킴으로써 포획 효율이 개선될 것으로 예상된다. 이것은 순환 종양 세포 단리에서 특히 중요할 것이며, 이는 조기 암 진단을 가능하게 하는 현재 가장 유망한 방법 중 하나이다. 또한, 상이한 특이성의 항체는 임의의 원하는 순서로 조합될 수 있다.
더 추가적인 실시양태에서, 본 발명의 펩티드 태그 및 펩티드 리가아제는 세포 신호전달을 활성화시키기위한 약물의 생성에서 유용할 수 있다. 이와 관련하여, 세포 기능을 활성화시키는 가장 효과적인 방법 중 다수는 단백질 리간드를 통한 것이다. 그러나, 사실상, 단백질 리간드는 일반적으로 단독으로 작용하지 않을 것이지만, 다른 신호전달 분자의 특정 조합과 함께 작용할 것이다. 따라서, 본 발명의 펩티드 태그 및 펩티드 리가아제는 세포 신호전달의 최적 활성화를 제공할 수 있는 맞춤형 융합 단백질 (즉, 단백질 팀)의 발생을 허용한다. 이들 융합 단백질 (단백질 팀)은 세포 생존, 분열 또는 분화를 제어하기 위해 적용될 수 있다.
더 추가적인 실시양태에서, 본 발명의 펩티드 태그 및 펩티드 리가아제는 줄기 세포의 성장, 생체물질의 제조, 염료 또는 효소에 의한 항체 기능화, 및 고리화에 의한 효소 안정화를 위한 하이드로 겔의 발생에 유용할 수 있다.
실시예
실시예 1 - 펩티드 리가아제 (SnoopLigase) 및 펩티드 태그의 개발
RrgA (서열식별번호: 4)는 인간에게서 패혈증, 폐렴 및 수막염을 유발할 수 있는 그람-양성 박테리아인 스트렙토코쿠스 뉴모니아에(Streptococcus pneumoniae)로부터의 부착분자(adhesin)이다. 잔기 Lys742와 Asn854 사이에서 RrgA의 D4 면역글로불린-유사 도메인에서 자발적 이소펩티드 결합이 형성된다.
본 발명자들은 D4 도메인을, SnoopTag (RrgA의 잔기 734-745, 서열식별번호: 9) 및 RrgATag2 (RrgA의 잔기 838-860, 서열식별번호: 10)로 명명된 한 쌍의 펩티드 태그 및 RrgALigase로 명명된 단백질 (잔기 743-846, 서열 8)의 3 개 부분으로 "분할"하였다. 특히, RrgATag2의 N-말단과 RrgALigase의 C-말단 사이에 9 개 아미노산 중첩부가 있다. 유사하게, SnoopTag의 C-말단과 RrgALigase의 N-말단 사이에 3 개의 아미노산 중첩부가 있다. 또한, 상기 RrgALigase 및 RrgATag2 서열은 상기 이소펩티드 결합 형성의 반응 속도를 촉진시키는데 중요한 것으로 알려진 최초 RrgA 서열에 대한 변형을 혼입시킨다. 특히, RrgA의 위치 842에서의 글리신은 RrgALigase 및 RrgATag2에서 상응하는 (동등한) 위치에서 트레오닌으로 치환되었다. 또한, RrgA의 위치 848에서 아스파르트산은 RrgATag2에서 상응하는 위치에서 글리신으로 치환되었다.
상기 RrgA D4 도메인을 "분할"하는 부위의 선택은 상기 펩티드 리가아제 및 펩티드 태그의 활성에 중요한 것으로 밝혀졌다. 이와 관련하여, 펩티드 태그의 설계에 있어서 함께 연결될 분자 또는 구성요소, 예컨대 단백질에 혼입될 때 임의의 원치 않는 상호작용을 제한하도록 펩티드 태그가 가능한 한 짧아야 하는 것이 일반적인 원칙이다. 따라서, 상기 펩티드 리가아제와 중첩되는 펩티드 태그에 서열을 포함시키는 것은 표준 설계 원리와 일치하지 않는다. 그러나, 상기 태그 또는 리가아제로부터 이들 서열의 제거는 상기 리게이션 반응의 효능을 유의하게 붕괴시키는 것으로 밝혀졌기 때문에, 중첩 서열이 상기 리가아제 및 펩티드 태그의 활성에 필수적인 것으로 결정되었다. 이론에 구속되고 싶지는 않지만, 중첩 서열의 존재가 RrgA의 D4 도메인의 펩티드 태그와 리가아제 부분 사이의 상호작용의 안정성을 향상시킨다는 가설이 있다.
상기 RrgALigase 단백질에 대해 선택된 N- 및 C- 말단 부위는 3 개의 β-가닥의 제거를 초래하였으며, 이는 특히 소 단백질, 즉 RrgA의 D4 도메인에 있어서 주요한 변형이다. 이와 관련하여, 상기 RrgALigase는 불량한 용해도 및 제한된 리가아제 활성을 갖는 것으로 보여졌다 (도 2 참조). 실제로, RrgALigase는 포스페이트 완충 식염수 (PBS)와 같은 NaCl을 포함하는 용액 중에서 불용성인 것으로 보여졌으며, 이는 특히 살아있는 유기체의 세포 환경에서 그의 유용성을 심각하게 제한한다. 더욱이, 많은 시험관내 생물학적 검정은 NaCl의 존재를 필요로 한다.
RrgALigase는 4 ℃에서 가장 활성이었으므로, 분할된 도메인의 안정화는 리가아제 성능을 보강시키는데 중요할 것이라는 가설을 세웠다. 이러한 안정화를 달성하기 위해, 본 발명자들은 적절한 잔기를 프롤린으로 치환함으로써 단백질 도메인의 β-턴을 조작하려고 노력하였다. β-턴은 가요성 단백질 요소이다. 프롤린은 -60 °의 고정 φ 각도를 갖고, 이에 의해 단백질 입체형태 가요성을 제한한다.
상기 RrgALigase 서열은 결정 구조에 기반하여 프롤린으로의 돌연변이에 적합한 부위에 대해 수동으로 스크리닝하였다. 20 개 부위가 식별되었고, 6 개 부위가 변형을 위해 선택되었다. 그러나, 단지 2 개의 프롤린 치환 (서열식별번호: 8에서의 넘버링에 기반한 A66P 및 Q95P)만이 활성을 개선시키는 것으로 나타났다, 도 2 참조.
상기 단백질을 추가로 안정화시킴으로써 상기 리게이션 반응 속도가 개선될 수 있다고 가정하였다. 따라서, 본 발명자들은 Protein Repair One Stop Shop (PROSS)를 사용하여 RrgA C-말단 도메인을 분석하였다. PROSS는 단백질 서열 상동성 및 원자론적 로제타 모델화에 기반하여 단백질을 분석한다. 그러나, PROSS에 의해 사용된 다중 서열 정렬 (MSA)은 단지 35 개의 상동성 서열을 식별하였으며, 이는 의미있는 결과를 제공하기에 불충분하다. 따라서, 본 발명자들은 PROSS에 입력할 RrgA를 위한 별도의 MSA를 수동으로 발생시켰다.
PROSS 분석은 RrgA C-말단 도메인의 안정성을 향상시킬 수 있는 15 개의 돌연변이체를 제안하였고, 새롭게 도입된 아미노산 측쇄에 의해 이루어진 잠재적 접촉의 구조-기반의 조사에 기반하여 추가적인 분석을 위한 5 개를 선택하였다 (RrgA, 서열식별번호: 4의 넘버링에 기반한 D737S, A820E, D830N, D838G 및 I839V). 특히, PROSS 분석에서 식별된 돌연변이 중 1개인 D737S는 상기 SnoopTag 서열에 있었다. 상기 언급된 돌연변이를 혼입시킨 SnoopTag 및 RrgALigase의 조작된 버전은 SnoopTagJr (서열식별번호: 2) 및 SnoopLigase (서열식별번호: 1)로 각각 명명되었다. RrgATag2의 절단 연구에 기반하여, 본 발명자들은 또한 아스파르트산에 대한 RrgA의 위치 847 (RrgATag2의 위치 10, 서열식별번호: 10)에서 아스파라긴 잔기의 돌연변이가 펩티드-태그된 단백질의 이질성을 감소시킬 것이라는 가설을 세웠다. RrgATag2의 변형된 버전은 DogTag로 명명되었다.
RrgALigase에서의 PROSS 돌연변이 중 일부는 반응 수율 및 속도를 실질적으로 개선시켰지만 (도 2), A820E와 D830N은 상기 리가아제의 활성을 개선시키지 않았다. 유사하게, SnoopTag에서의 D737S 돌연변이 (즉, SnoopTagJr를 초래함)는 또한 DogTag와의 반응을 개선시키는데 매우 성공적이었다.
RrgALigase의 불량한 용해도 측면에서, 상기 단백질은 발현 후 응집을 감소시키고 분석을 용이하게하기 위해 초기에 말토오스 결합 단백질 (MBP) 융합 단백질로서 발현되었다. 그러나, 놀랍게도, SnoopLigase가 MBP 융합없이 생성될 때, SnoopLigase의 용해도는 RrgALigase에 비해 개선되었다는 것이 밝혀졌다. SnoopLigase는 대장균에서 효율적으로 발현되었고 (배양물 1 리터당 10mg 초과) 고도로 가용성 (> 500μM)이었다. 실시예 3에서 하기에 논의된 바와 같이, SnoopLigase는 NaCl의 생리학적 세포외 농도에서를 포함하여 다양한 조건에서 활성이다. 따라서, SnoopLigase (서열식별번호: 1)를 발생시키는 RrgALigase (서열식별번호: 8)의 돌연변이는 또한 상기 단백질의 용해도를 개선시켰다.
SnoopLigase에 의한 잔기 리게이션의 제안된 반응 메커니즘 및 특이성을 검증하기 위해, 돌연변이된 주요 잔기 각각이 돌연변이된 SDS-PAGE에 의해 상기 반응을 분석하였다. SnoopLigase는 SnoopTagJr와 융합된 어피바디를, DogTag에 융합된 SUMO 도메인에 효율적으로 리게이션하였다. 그러나, SnoopTagJr에서 Lys 9, DogTag에서 Asn 17, 또는 SnoopLigase에서 Glu 61의 돌연변이는 생성물 형성을 폐기시켰다 (도 2b).
실시예 2 - SnoopLigase - 매개된 펩티드-펩티드 리게이션
SnoopLigase에 의한 잔기 리게이션의 제안된 반응 메커니즘 및 특이성을 검증하기 위해, SnoopTagJr 및 DogTag를 모델 단백질에 융합시켰다. DogTag는 소형 유비퀴틴-유사 변형제 (Small Ubiquitin-like Modifier: SUMO)에 융합된 반면, SnoopTagJr는 HER2에 대한 어피바디에 융합되었다. SUMO-DogTag 및 SnoopTagJr-AffiHER2와, SnoopLigase의 혼합은 새로운 고 분자량 밴드의 출현을 초래하였으며, 공유 연결된 리게이션 생성물을 나타낸다. 상기 밴드는 예상된 분자량을 가졌고, SDS 로딩 버퍼에서의 비등에 저항성을 가졌다. 3 개의 반응성 트라이어드(triad) 잔기 (SnoopTagJr의 위치 9에서의 라이신, DogTag의 위치 17에서의 아스파라긴 및 SnoopLigase의 위치 61에서의 글루탐산) 중 임의의 것의 돌연변이는 상기 리게이션 생성물 밴드의 발생을 방지하였다 (도 2b). 질량 분광법은 펩티드 기질 반응 후의 예상된 분자량 변화를 제공하였다.
실시예 3 - SnoopLigase 반응 조건
SnoopLigase 반응은 중성 pH 주변에서 잘 기능하였으며, 7.25 내지 8.75 에서 차이가 거의 없었다 (도 4a). 광범위한 온도 범위 (4-37 ℃)에서 효율적인 리게이션이 발생하였으며, 15 ℃에서 최적이었다 (도 4b). SnoopLigase는 NaCl의 세포외 농도의 존재하에서 기능하였지만, NaCl의 부재하에 트리스 보레이트 버퍼를 사용시 반응이 가장 효율적으로 진행한다 (도 5a). SnoopLigase는 최대 2 %의 통상적으로 사용되는 세정제인 트윈(Tween) 20과 트리톤(Triton) X-100의 존재하에서 잘 반응하였지만, SDS는 상기 반응을 억제하였다 (도 5b). 15-30 % (v/v)에서 단백질 안정화제 글리세롤의 첨가는 반응 속도를 증강시켰다 (도 5c).
SnoopLigase는 DSC로부터 45 ℃의 용융 온도를 가졌으며, 최대 70 ℃의 열처리 후에 완전한 활성을 회복하였다. 99 ℃에서 가열한 후 부분 활성을 되찾았다. 부분적인 활성은 99 ℃에서 가열 이후에 복구되었다.
실시예 4 - SnoopLigase 반응 생성물 정제
반응시에, SnoopLigase는 반응 생성물에 강하게 결합하였으며, 리게이션 반응 생성물의 효율적인 정제를 허용하였다 (도 3a). 비오티닐화된 SnoopLigase를 사용하여 SnoopTagJr-AffiHER2를 SUMO-DogTag와 반응시킨 후, 상기 리가아제를 스트렙타비딘-아가로스에 의해 포획하였다. 비오틴-스트렙타비딘과 SnoopLigase-반응 생성물 사이의 강한 상호작용은 엄격한 세척을 허용하여, 미-반응된 단백질이 제거되도록 하였다. 항체 용출 버퍼에 의한 상기 수지의 인큐베이션은 상기 비오틴-스트렙타비딘 상호작용에 영향을 미치지 않았지만, SnoopLigase-반응 생성물 상호작용을 붕괴하였고, 고순도 리게이션된 생성물을 생성하여 (도 3a), 미-반응된 생성물 및 SnoopLigase를 제거하였다. 이 절차는 크기 배제 크로마토그래피 또는 투석에 의해 후속적인 시간-소모적 정제의 필요성을 없앤다. 또한, 용출 체적을 조정함으로써, 반응 동안에 사용된 반응물 농도에 관계없이, 고도로 농축된 리게이션 생성물을 용출할 수 있었다.
실시예 5 - SnoopLigase 고상 반응
고체 상에 효소 고정화는 반응 효율을 개선시킬 수 있고, 정제된 효소의 비용-효과적인 재-사용을 용이하게 할 수 있다. SnoopLigase가 항체 용출 버퍼 처리 후에 "재활용"될 수 있는지 여부를 시험하기 위해, 본 발명자들은 스트렙타비딘 아가로스 상에 비오티닐화된 SnoopLigase를 고정시켰고, SnoopTagJr-AffiHER2 및 SUMO-DogTag의 첨가에 의해 리게이션 반응을 수행하였다. 상기 반응 생성물의 세척 및 용출시, 상기 SnoopLigase-커플링된 아가로스 수지를 또 다른 리게이션 반응에 사용하였다. 형성된 생성물의 양은 적어도 8 회의 반응 사이클 동안에 일정하게 유지되었으며, 이는 SnoopLigase가 다수의 턴-오버를 수행할 수 있고, 낮은 pH에 의한 SnoopLigase의 처리가 상기 효소를 비가역적으로 변성시키지 않음을 가리킨다 (도 6).
실시예 6-SnoopLigase 반응 수율
50 mM TB pH 7.25 + 15 % 글리세롤 (v/v) 중에서 20 μM의 각각의 SnoopLigase 및 SnoopTagJr-MBP와 함께 10μM의 IMX-DogTag를 15분 내지 48시간의 다양한 시간동안 4 ℃에서 인큐베이션함으로써, SnoopLigase에 의해 촉매작용된 DogTag와 SnoopTagJr 사이의 반응의 수율을 결정하였다. 샘플을 쿠마시 염색을 사용하여 환원 조건 하에서 SDS-PAGE를 사용하여 분석하였고, 도 7a 및 b는 SnoopLigase가 상기 IMX-DogTag 융합 단백질의 거의 전부의 커플링을 용이하게 함을 보여준다. 특히, IMX-DogTag에 대한 96 %의 반응 수율이 48 시간 후에 달성되었다.
유사하게, 도 8a 및 b는 50mM TB pH 7.25 + 15 % 글리세롤 (v/v) 중에서 10 μM의 각각의 SnoopLigase 및 SUMO-DogTag와 함께 5 μM의 SnoopTagJr-AffiHER2를 4 ℃에서 인큐베이션함은 24 시간 후에 SnoopTagJr-AffiHER2 융합 단백질의 거의 전부의 커플링을 용이하게 함, 즉 SnoopTagJr-AffiHER2에 대한 99 %의 반응 수율이 24 시간 후에 달성되었음을 보여주었다.
실시예 7 - 고체 상으로부터 반응 생성물의 용출을 위한 대안적인 조건
실시예 5에 기재된 SnoopTagJr-AffiHER2 및 SUMO-DogTag 융합 단백질 및 비오티닐화된 SnoopLigase를 사용하여, 고체 상으로부터의 반응 생성물의 용출에 대한 온도 및 경쟁의 효과를 조사하였다. 상기 융합 단백질 및 SnoopLigase (각각 50 μM)를 4 ℃에서 5 시간 동안 50 mM TB pH 7.25 + 15 % 글리세롤 (v/v)에서 인큐베이션하였다. 스트렙타비딘 아가로스를 사용하여 비오틴-SnoopLigase를 풀-다운(pull-down)시키고, 상기 수지를 PBS의 5 수지 체적으로 5 회 세척하였다. 35 μM의 경쟁자 단백질 (AffiHER2-DogTag에 공유 연결된 SnoopTag 펩티드)을 갖거나 또는 갖지 않는 10 μl PBS로 2 회 용출을 수행하였으며, 각각은 25-55 ℃ 범위의 온도에서 5 분 동안 수행하였다. 도 9는 55 ℃의 온도에서 효율적인 용출이 달성되었고, 경쟁자 단백질의 첨가가 45 ℃에서 효율적인 용출을 가능하게 함을 보여준다.
실시예 8 - SnoopLigase로부터의 생성물의 첨가제-의존적 용출
SnoopLigase와 그의 반응 생성물 사이의 비-공유 상호작용을 붕괴시킬 수 있는지를 결정하기 위해 12 종의 첨가제(도 10에서 보여짐)를 선택하였다.
비오티닐화된 SnoopLigase를 각각 50 μM의 SUMO-DogTag 및 SnoopTagJr-AffiHER2와 함께 24 시간동안 4 ℃에서 인큐베이션하였다. 스트렙타비딘 아가로스로 비오틴-SnoopLigase를 풀-다운시키고, 상기 수지를 25 ℃에서 PT 버퍼 (10mM 트리스 포스페이트, pH 6.5)의 5 수지 체적으로 5 회 세척하였다. 16 μM AffiHER2-DogTag:SnoopTag 단백질 경쟁자 (실시예 7에 기재됨) 및 도 10에서 지정된 12 종의 선택된 첨가제 중 1 종을 함유하는 PT 버퍼, pH 6.5의 4 수지 체적을 사용하여 37 ℃에서 5 분 동안 2 회 용출을 수행하였다. 대조군 반응은 상기 용충 버퍼에 첨가제를 사용하지 않았다.
도 10은 1M 이미다졸 및 상기 단백질 경쟁자를 포함하는 용액이 상기 고체 상으로부터의 반응 생성물 (공유 컨쥬게이션체)의 효율적인 용출을 초래하였음을 보여준다.
단백질 경쟁자의 부재하에서 이미다졸의 상이한 농도의 효과를 조사하였다. 4 ℃에서 24 시간 동안 50mM TB pH 7.25 + 15 % 글리세롤 (v/v) 중에서 각각 50 μM로 비오틴-SnoopLigase와 함께 SnoopTagJr-AffiHER2 및 SUMO-DogTag를 인큐베이션하였다. 비오틴-SnoopLigase를 스트렙타비딘 아가로스 수지로 풀-다운시키고, 이 수지를 25 ℃에서 5 수지-체적의 PT 버퍼 (25mM 트리스 포스페이트 pH 7.0)로 4 회 세척하였다. 25 ℃에서 5 분 동안 PT 버퍼 중 0.5-4 M, pH 7.0 범위의 이미다졸 농도를 사용하여 용출을 수행하였다.
도 11은 2M 이미다졸을 포함하는 용액이 생리학적으로 관련된 조건, 즉 pH 7.0 및 25 ℃에서 상기 고체 상으로부터 반응 생성물을 효율적으로 용출하기에 충분함을 보여준다. 특히, 이미다졸의 보다 높은 농도는 상기 고체 상으로부터 SnoopLigase 및 스트렙타비딘의 용출을 초래하였다.
실시예 9 - SnoopTag (서열식별번호: 9)와 SnoopTagJr (서열식별번호: 2) 활성의 비교
상기 SnoopTag (서열식별번호: 9) 서열을 변형시켜 SnoopTagJr (서열식별번호: 2)를 발생시킴으로써 생성된 활성의 차이를 측정하기 위해 비교 검정을 수행하였다.
15 분 내지 24 시간 사이의 시간 간격동안 4 ℃로 50 mM TB pH 7.25 + 15 % 글리세롤 (v/v) 중에서 SnoopTag-AffiHER2 또는 SnoopTagJr-AffiHER2 중 하나의 10 μM와 함께, 각각 10 μM의 SnoopLigase 및 SUMO-DogTag를 인큐베이션하였다.
도 12는 형성된 반응 생성물의 전체 양에 의해 측정될 때 모든 시점에서 SnoopTag보다 SnoopTagJr가 더 효율적으로 반응하였음을 보여준다.
실시예 10 - SnoopLigase 활성에 대한 화학적 샤페론의 효과
전술한 바와 같이, SpyLigase는 화학적 샤페론 TMAO (트리메틸아민 N-옥사이드)의 존재 하에서만 그의 펩티드 태그 기질 (SpyTag 및 KTag)을 리게이션할 수 있다. 따라서, TMAO의 존재 하에서 SnoopLigase의 활성을 평가하였다.
각각 10 μM의 SnoopLigase, SnoopTagJr-AffiHER2 및 SUMO-DogTag를 50 mM TB pH 7.25 + 15 % 글리세롤 + 일정 범위 농도의 TMAO (0-1.5 M) 중에서 4 ℃에서 1.5 시간동안 인큐베이션하였다. 상기 SnoopLigase의 활성은 형성된 반응 생성물의 양을 측정함으로써 평가되었다. 도 13은 상기 반응에 TMAO의 첨가가 SnoopLigase 활성을 개선시키지 않았으며, 이는 TMAO의 부재 하에서 기능할 수 있음을 보여준다.
실시예 11 - 융합 단백질의 내부 부위에서 DogTag (서열식별번호: 3) 반응성의 평가
상기 태그 중 적어도 하나가 단백질 내에 위치할 때 (즉, 상기 태그가 단백질의 내부 도메인을 형성하는 경우) 상기 펩티드 태그가 서로 반응할 수 있는지를 결정하기 위해, DogTag (서열식별번호: 3)를 말토오스 결합 단백질 (MBP) 및 HaloTag7에 삽입하였다. 특히, 상기 DogTag 서열은 링커 서열이 상이한 길이 (2-8개 아미노산)로 어느 한 측의 측부에 있었고, 잔기 317 이후 및 잔기 319 이전에 MBP에 삽입하여 잔기 318을 결실시켰다. 상기 펩티드 태그의 측부에 있는 링커 서열은 Gly-Ser의 반복체이었다. 어느 한 측에 3 개의 Gly-Ser 반복체를 측부에 갖는 DogTag 서열을 잔기 D139와 E140 사이에서 HaloTag7SS에 삽입하였다. HaloTag7SS는 위치 61 및 261의 시스테인 잔기를 세린 잔기로 대체하도록 변형된 HaloTag7을 지칭한다.
각각 10 μM의 DogTag-MBP 융합 단백질, SnoopTagJr-AffiHER2 및 SnoopLigase를 4 ℃에서 4 시간동안 50 mM TB pH 7.25 + 15 % 글리세롤에서 인큐베이션하였고, 쿠마시 염색된 SDS-PAGE를 사용하여 분석하였다. 도 14는 모든 4 개의 MBP-DogTag 삽입 구조체가 반응성이었고, 6 또는 8 개 잔기의 링커 길이에서 가장 높은 반응성을 보였다.
상기 DogTag-HaloTag7SS 융합 단백질 (10μM)을 4 ℃에서 0.5-48 시간동안 50mM TB pH 7.25 + 15 % 글리세롤에서 SnoopTagJr-AffiHER2 및 SnoopLigase (모두 20μM)와 함께 인큐베이션하였고, 쿠마시 염색된 SDS-PAGE를 사용하여 분석하였다. 도 16은 상기 DogTag-HaloTag7SS 삽입 구조체가 반응성이었고, 24 시간 후에 약 90 %의 반응 수율을 가짐을 보여준다.
실시예 12 - 고체 상으로부터 반응 생성물의 용출을 위한 추가적인 조건
실시예 4, 7 및 8은, 상기 SnoopLigase 반응 생성물이 다양한 조건 하에서 고체 상으로부터 용출될 수 있음을 실증한다. 그러나, pH 2.0 또는 2M 이미다졸에서 또는 비교적 높은 온도에서의 인큐베이션은 모든 단백질에 적합하지 않을 수 있다. 본 발명자들은 SnoopTagJr:DogTag 펩티드 컨쥬게이션체가 항체 용출 버퍼 (글리신 pH 2.0) 및 2M 이미다졸과 동등한 효능으로 상기 SnoopLigase 반응 생성물을 능가할 수 있음을 확인하였다 (도 15).
상기 SnoopTagJr:DogTag 경쟁자 펩티드는 SUMO-DogTag 및 SUMO 프로테아제를 통해 발생되었다. HaloTag7을 통해 고체 상에 고정된 SnoopLigase를 사용하여 SUMO-DogTag 및 SnoopTagJr 펩티드를 공유 컨쥬게이션하였다. 상기에 기재된 바와 같이 이미다졸을 사용하여 상기 반응 생성물 (SUMO-DogTag:SnoopTagJr)을 용출시켰다. 이어서, 상기 반응 생성물을 SUMO-프로테아제 Ulp1과 함께 인큐베이션하고, 이는 SUMO로부터 상기 DogTag:SnoopTagJr 펩티드를 절단한다. Ni-NTA와의 반응 생성물의 인큐베이션은 His-태그된 SUMO 및 Ulp1 단백질을 결실시켜, 정제된 DogTag:SnoopTagJr 펩티드를 생성시켰다.
상기 경쟁자 펩티드는 생리학적 조건, 즉 37 ℃ 하에, 스트렙타비딘-아가로스 컬럼 (도 15) 상에 고정된 비오틴-SnoopLigase로부터 SnoopLigase 반응 생성물 (SUMO-DogTag:SnoopTagJrAffiHER2)의 깨끗한 용출을 허용하였다. 고체-상 정제는 크기 배제 크로마토그래피에 의해 SnoopLigase 및 미반응된 출발 물질로부터 반응 생성물을 후속적으로 분리할 필요성을 제거하였는데, 크기 배제 크로마토그래피는 시간-소모적이며 종종 상당한 손실을 초래한다.
실시예 13 - 다양한 단백질에서 N- 또는 C-말단 융합체로서 DogTag (서열식별번호: 3) 및 SnoopTagJr (서열식별번호: 2) 반응성의 평가
상기 펩티드 태그가 범용 링커로서 사용될 수 있음을 검증하기 위해, 상기 태그를 N- 또는 C-말단에서 다양한 단백질 (AffiHER2, SUMO, mClover3, MBP, mEGFP 및 HaloTag7SS)에 융합하였으며, 조합하여 시험하였다. 상기 DogTag-연결된 단백질 (10 μM [표 2] 또는 20 μΜ [표 3])을 4 ℃에서 24 시간동안 50mM TB pH 7.25 + 15 % 글리세롤에서 SnoopTagJr-연결된 단백질 (20μM [표 2] 또는 10μM [표 3]) 및 SnoopLigase (20μM)와 함께 인큐베이션하였고, 쿠마시 염색된 SDS-PAGE을 이용하여 분석하였다. 표 2 및 3은 각각 반응한 DogTag 파트너와 SnoopTagJr 파트너의 백분율을 보여준다. N/A는 밴드 중첩부가 정량화를 방지한 반응을 지칭한다. 하기에 열거된 구성요소의 순서는 상기 태그가 N-말단 또는 C-말단이었는지를 가리키며, 즉, AffiHER2-DogTag는 AffiHER2의 C-말단에 연결된 DogTag를 지칭하고, DogTag-mClover3은 mClover3의 N-말단에 연결된 DogTag를 지칭한다.
상기 결과는 상기 조합의 대부분은 95 % 초과의 반응 수율을 가졌으며, 그에 의해, 상기 펩티드 태그가 다양한 단백질의 N- 및 C-말단에 위치할 때 효율적으로 반응함을 보여준다.
Figure pct00005
Figure pct00006
실시예 14 - SnoopLigase 반응성은 친유화 및 환원제에 저항성이다
SnoopLigase를 동결건조하였고, 37 ℃에서 0-120일 동안 보관하였다. 다양한 시점에서, 동결건조된 SnoopLigase의 샘플을 15 % (v/v) 글리세롤과 함께 TB pH 7.25에서 4 ℃에서 2 시간동안 SnoopTagJr-AffiHER2 및 SUMO-DogTag (각각 10μM)와의 반응 버퍼에서 재구성하였다. 도 17a는 상기 비-동결건조된 대조군 샘플에 대한 생성물 형성을 보여주고, 재구성 후에 활성의 거의 전부가 유지되었음을 실증한다.
SnoopLigase 또는 상기 펩티드 태그에는 시스테인이 없기 때문에, 상기 반응이 환원제에 의해 영향받지 않을 것이라는 가설을 세웠다. 이는 환원제와 함께 또는 환원제:100 mM β-머캅토에탄올 (βMΕ) 또는 20mM 디티오트레이톨 (DTT)과 함께 상기에 기재된 반응을 수행함으로써 확인되었다. 도 17b는 환원제가 없는 대조군 반응에 대한 생성물 형성을 보여주고, 환원제가 SnoopLigase 활성에 영향을 주지 않음을 실증한다.
방법
클로닝
표준 PCR 절차 및 깁슨 등온 어셈블리를 사용하여, 단백질 발현을 위한 플라스미드 구조체를 클로닝하였다. 유전자 삽입물의 뉴클레오티드 서열을 생어 서열분석(Sanger sequencing)에 의해 검증하였다. 대장균에서 발현을 위한 구조체는 N-말단 His6-태그, 이어서 가요성 GS-풍부 링커를 함유하였다.
RrgA의 서열은 단백질 정보 은행(Protein Data Bank) ID 코드 2WW8로부터 온 것이다.
단백질 발현 및 정제
발현 플라스미드를 대장균 BL21 (DE3)-RIPL (애질런트(Agilent))로 형질전환시켰고, 세포를 37 ℃에서 16 시간동안 50 ㎍/㎖의 카나마이신을 함유하는 LB-아가 플레이트 상에서 성장시켰다. 개별 콜로니를 0.8 % (w/v) 글루코오스, 50 μg/ml 카나마이신과 함께 2 x YT에서 16 시간동안 37 ℃, 200 rpm에서 성장시켰다. 스타터 배양물을 0.8 % (w/v) 글루코오스, 50 μg/mL 카나마이신과 함께 1 L 2 x YT에서 1: 100으로 희석하였고, 0.5의 A600에 도달할 때까지 37 ℃, 200 rpm에서 성장시켰다. 배양물을 0.42 mM IPTG를 사용하여 유도하였고, 수확 전에 30 ℃, 200 rpm로 4 시간동안 성장시켰다. 단백질을 표준 Ni-NTA 방법 (퀴아겐(Qiagen))을 사용하여 정제하였고, 1: 1000으로 3 회 투석하였다. 투석용 버퍼는 AP-SnoopLigase (여기서 AP는 BirA 비오티닐화를 위한 기질 펩티드이다)와 SnoopTagJr-MBP을 위해서는 TB (붕산으로 pH 조정된 50mM 트리스·HCl) pH 8.0 및 RrgALigase (및 점 돌연변이체), SnoopLigase, SnoopTag-AffiHER2, SnoopTagJr-AffiHER2 및 SUMO-DogTag을 위해서는 50mM 붕산 pH 10.0이었다.
SnoopLigase 시험관내 재구성
SnoopLigase에 의해 매개되는 SnoopTagJr과 DogTag 사이의 이소펩티드 결합의 형성을 평가하기 위해, 달리 지시되지 않는 한, 단백질을 각각 10 μM의 TB pH 7.25 + 15 % (v/v) 글리세롤에서 2 시간동안 4 ℃로 인큐베이션하였다. 상기 반응을 종결시키기 위해, 6 x SDS 로딩 버퍼 (0.23 M 트리스 HCl, pH 6.8, 24 % (v/v) 글리세롤, 120 μM 브로모페놀 블루, 0.23 M SDS)를 1 x의 최종 농도로 첨가하였다. 샘플을 95 ℃에서 3 분동안 가열하였고, 로딩하기 전에 10 분동안 25 ℃로 냉각시켰다.
SnoopLigase 점 돌연변이의 식별
프롤린 치환을 위한 잔기를 식별하기 위해, MrgProbity를 사용하여 RrgA (PDB 코드 2WW8)의 아미노산 잔기의 라마칸드란 분석을 수행하였다. 프롤린 치환을 위해 -70°내지 -50°의 φ 각도 및 루프 영역에서의 위치를 갖는 잔기가 고려되었다. 상기 PROSS 서버를 사용하기 위해, 별도의 다중 서열 정렬 (MSA)이 발생되었다. 위치- 특이적인 반복 기본 국소 정렬 검색 툴 (PSI-BLAST)을 사용하여, RrgA 잔기 734-860을 위한 상동성 서열을 수집하였다. 로그-예측에 의한 다중 서열 비교 (MUSCLE)를 사용하여 MSA를 발생시켰다. 공차를 갖는 높은 동일성에서의 클러스터 데이터베이스(CD-HIT)를 이용하여, 서열 중복성을 최소화하고 상기 데이터세트의 크기를 조정하였다. 상기 RrgA PDB 구조 2WW8의 변형된 MSA 및 잔기 734-860을 상기 PROSS 서버에 공급하였다. 상기 제안된 아미노산 치환을 수동으로 검토하였다.
SnoopLigase 비오티닐화
25 ℃에서 1 시간동안 TB pH 8.0 중 14.7 μM GST-BirA, 0.5 mM MgCl2, 3.3 mM D-비오틴 및 1 mM ATP와 함께 220 μM AP-SnoopLigase를 인큐베이션함으로써 AP-SnoopLigase의 비오티닐화를 수행하였다. 동일한 양의 GST-BirA 및 D-비오틴을 다시 첨가하고, 상기 혼합물을 25 ℃에서 1 시간동안 인큐베이션하였다. GST-BirA를 결실시키기 위해, 상기 샘플을 샘플 로터상에서 25 ℃에서 30 분동안 0.1 mL의 글루타티온-HiCap 수지와 함께 인큐베이션하였고, 17,000 g에서 30 초동안 원심분리하였다. 상기 상청액을 수집하고, TB pH 8.0으로 1: 1000으로 3 회 투석하였다.
SnoopLigase 반응 생성물의 정제
총 부피 200 μL 중 15 % (v/v) 글리세롤과 함께 TB pH 7.25에서 각각 10 μM의 SUMO-DogTag, SnoopTagJr-AffiHER2 및 비오티닐화된 SnoopLigase를 4 ℃에서 20 시간동안 인큐베이션하였다. SnoopLigase를 포획하기 위해, 25 μL 세척 및 평형화된 HiCap 스트렙타비딘 아가로스 (써모 피셔(Thermo Fisher), 20357)를 첨가하고, 샘플을 튜브 로터 상에서 25 ℃에서 30 분동안 인큐베이션하였다. 상기 수지를 1 mL 폴리-프렙 컬럼 (바이오-래드(Bio-Rad))에서 수집하였고, 300 g으로 1 분동안 회전시켰다. 상기 수지를 300 mM NaCl과 함께 125 μL의 50 mM 글리신 pH 3.0으로 2 회 및 125 μL의 50 mM 글리신 pH 3.0으로 3 회 세척한 후에, 500 g으로 1 분동안 1회 추가 회전하여, 상기 수지로부터 과량의 액체가 확실히 제거되도록 하였다. 상기 SnoopLigase 반응 생성물을 용출시키기 위해, 2.5 μL의 1 M Tris·HCl을 함유하는 튜브 내로 용출액을 300 g으로 1 분동안 회전시키기 전에, 상기 수지를 25 μL 항체 용출 버퍼 (50 mM 글리신 pH 2.0)과 함께 1 분동안 인큐베이션하였다. 상기 용출을 2회 더 반복하였다.
질량 분광법
75μM의 SUMO-DogTag 및 300μM의 SnoopTag 고체-상 합성된 펩티드 (GKLGDIEFIKVNKGY, 서열식별번호: 11 순도 95 %의 인사이트 바이오테크놀러지(Insight Biotechnology))를, 총 부피 200 μL 중 TB pH 7.25 중의 75μM 비오티닐화된 SnoopLigase 및 15 % (v/v) 글리세롤과 함께 4 ℃에서 36 시간동안 인큐베이션하였다. 100 μL HiCap 스트렙타비딘 아가로스 및 500 μL 세척 버퍼를 사용하는 것을 제외하고 상기에 따라 상기 반응 생성물을 정제하였다. Micromass LCT 비행 시간 전기분무 이온화 질량 분광기 (Micromass)를 사용하여 분석을 수행하였다. 최대 엔트로피 알고리즘을 갖는 V4.00.00 소프트웨어 (Waters)를 사용하여 m/z 스펙트럼으로부터 상기 분자 질량 프로파일을 생성시켰다. N-말단 fMet이 없는 아미노산 서열 및 이소펩티드 결합 형성 동안의 암모니아의 손실 (17.0 Da)에 기반하여 ExPASy ProtParam에 의해 단백질의 분자 질량을 예측하였다.
고체-상 리게이션 반응 사이클
TB pH 8.0에서 50 μM의 비오티닐화된 SnoopLigase를, 튜브 로터 상에서 25 ℃로 30 분동안 총 부피 50μL 중 10μL의 세척 및 평형화된 HiCap 스트렙타비딘 아가로스 (써모 피셔)에 커플링시켰다. 상기 수지를 1mL 폴리-프렙 컬럼 (바이오-래드)에서 수집하고, 300 g으로 1 분동안 회전시켰고, 이후에 100 μL TB pH 8.0으로 5 회 세척하였다. 50 μL 반응 믹스 (15 % (v/v) 글리세롤과 함께 TB pH 7.25 중에서 100 μM SUMO-DogTag 및 100 μM SnoopTagJr-AffiHER2)을 첨가하여 반응을 시작하였고, 상기 샘플을 써모믹서 상에서 800 rpm으로 25 ℃로 3 시간동안 인큐베이션하였다. 상기 반응 혼합물을 300 g으로 1 분동안 회전시켰고, 상기 수지를 300 mM NaCl와 함께 50 μL의 50 mM 글리신 pH 3.0으로 2 회, 및 50 μL의 50 mM 글리신 pH 3.0으로 3 회 세척하였다. 500 g으로 1 분동안 1회 추가 회전시켜, 상기 수지에서 과량의 액체가 확실히 제거되도록 하였다. 상기 SnoopLigase 반응 생성물을 용출시키기 위해, 1 μL의 1 M 트리스·HCl을 함유하는 튜브 내로 상기 용출액을 300 g으로 1 분동안 회전시키기 전에, 상기 수지를 10 μL 항체 용출 버퍼와 함께 1 분동안 인큐베이션하였다. 상기 용출을 3 회 더 반복하였다. 상기 수지를 100 μL의 50 mM 글리신 pH 2.0으로 2 회, 및 100 μL의 TB pH 7.25로 2 회 세척하였다. 상기 반응 사이클을 3 회 더 반복하였다.
SnoopLigase 열안정성 테스트
15 % (v/v) 글리세롤과 함께 TB pH 7.25에서 12.5 μM의 SnoopLigase를 지시된 온도로 15분 동안 인큐베이션하였고, 5분 동안 4℃로 냉각시켰다. SnoopTagJr-AffiHER2 및 SUMO-DogTag의 리게이션을 위해, 열-처리된 SnoopLigase를 사용하였다.
SDS-PAGE 및 반응 정량화
겔을 InstantBlue 쿠마시 염색 (엑스페데온(Expedeon))으로 염색하였고, MilliQ 물로 오염물 제거하고, ImageLab 소프트웨어 (바이오-래드)를 갖는 ChemiDoc XRS 이미저를 사용하여 영상화하였다. 밴드 정량화를 위해 ImageLab을 또한 사용하였다. 반응된 태그의 백분율은 밴드 강도로부터 [제품 밴드]/([제품 밴드] + [레프트오버(leftover) 기질 밴드])로 계산되었다. 상대 반응성은 ([샘플]/[대조군])의 반응된 태그 백분율로 계산되었다.
DogTaq:SnoopTagJr 경쟁자의 생성
0.01 % (v/v) 트윈 20과 함께 50 mM TB pH 7.25 중 20μM의 HaloTag7-SnoopLigase 4mL 양을, 튜브 로터 상에서 25 ℃로 2 시간동안 500 μL의 패킹된(packed) HaloLink 수지(프로메가(Promega))와 함께 배양하였다. 상기 샘플을 5 개의 버퍼-평형화된 1mL 폴리프렙 컬럼 (바이오-래드)으로 분할하였고, 25 ℃에서 300 g으로 1 분동안 회전시켰다. 각 수지 샘플을 0.01 % (v/v) 트윈 20과 함께 500 μL의 50mM TB pH 7.25와 함께 2 회 세척하였다. 컬럼을 캡핑하고, 200 μL의 반응 버퍼 [15 % (v/v) 글리세롤과 함께 TB pH 7.25 중 50 μM SUMO-DogTag 및 75 μM SnoopTagJr 펩티드]를 각 컬럼에 첨가하였다. SnoopTagJr 펩티드를 > 95 % 순도로 Activotec에 의해 고체-상 합성하였다. 써모믹서 상에서 300 rpm으로 25 ℃에서 4 시간동안 인큐베이션한 후, 샘플을 25 ℃에서 300g으로 1 분동안 회전시켰고, 각각의 수지 샘플을 0.5M 이미다졸 및 0.01 % (v/v) 트윈 20과 함께 640 μL의 트리스-포스페이트 pH 7.0으로 5 회 세척하였다. 상기 SnoopLigase 반응 생성물을 용출시키기 위해, 상기 용출물을 튜브 내로 25 ℃에서 300 g으로 1 분동안 회전시키기 전에, 각각의 수지 샘플을 2.5M 이미다졸 pH 7.0 및 0.01 % (v/v) 트윈 20과 함께 100 μL의 트리스-포스페이트로 써모믹서 상에서 800 rpm으로 25 ℃에서 2 분동안 인큐베이션하였다. 상기 용출을 2 회 더 반복하였고, 각각의 수지를 0.01 % (v/v) 트윈 20과 함께 500 μL의 TB pH 7.25로 2 회 세척하였다. 후속 반응 사이클을 시작하기 위해, 새로운 반응 믹스를 상기 수지에 첨가하였고, 상기 반응 및 정제 절차를 반복하였다. 총 6 회의 반응 사이클을 수행하였다. 모든 용출물을 풀링(pooling)하고 TB pH 7.5로 투석하고, SUMO-DogTag:SnoopTagJr를 10 kDa MWCO 스핀 필터 (싸토리우스(Sartorius))를 사용하여 118 μM로 농축시켰다. SUMO 프로테아제 Ulp1을 2.4 μM의 최종 농도까지 1:50 몰비로 첨가하였고, 이 후에, 25 ℃에서 45 분 인큐베이션하였다. 반응 후에, 트윈 20을 0.01 % (v/v)의 최종 농도까지 첨가하였다. His-태그된 단백질 (SUMO 및 Ulp1)을 결실시키기 위해, 600 μL의 샘플을 튜브 로터상에서 25 ℃로 1 시간동안 150 μL의 패킹된 Ni-NTA 아가로스 (퀴아겐)를 사용하여 인큐베이션하였고, 상기 샘플을 1 분동안 25 ℃에서 16900 g으로 원심 분리하였고, 상기 DogTag:SnoopTagJr 컨쥬게이션체를 함유하는 상청액을 수집하였다. ExPASy ProtParam으로부터의 OD280 흡광 계수를 사용하여 농도를 계산하였다.
펩티드 용출에 의한 SnoopLigase 제거
총 부피 150 μL 중 15 % (v/v) 글리세롤과 함께 TB pH 7.25에서 각각 10 μM의 SUMO-DogTag, SnoopTagJr-AffiHER2 및 비오틴-SnoopLigase를 4 ℃에서 16 시간동안 인큐베이션하였다. 트윈 20을 0.01 % (v/v)의 최종 농도로 첨가하였다. 비오틴-SnoopLigase를 포획하기 위해, 15 μL의 세척 및 평형화된 HiCap 스트렙타비딘-아가로즈 (써모 피셔)를 첨가하였고, 상기 샘플을 튜브 로터 상에서 25 ℃로 30 분동안 인큐베이션하였다. 상기 수지를 PCR 튜브 (스타랩(StarLab))에서 수집하고, 25 ℃에서 300 g으로 1 분동안 회전시켰고, 이후에 0.01 % (v/v) 트윈 20과 함께 75 μL의 트리스-포스페이트 pH 7.0으로 5 회 세척하였다. 0.01 % (v/v) 트윈 20와 함께 TB pH 7.5 중 DogTag:SnoopTagJr 30 μL 양을 첨가하였고, 상기 샘플을 써모믹서 상에서 800 rpm으로 37 ℃에서 4 시간동안 인큐베이션하였다. 상기 샘플을 16900 g으로 1 분동안 원심분리하였고, 상기 상청액을 수집하였다.
동결건조 안정성
TB pH 7.25 중 10 μM의 SnoopLigase 30 μL 분취액을, 100 μL 의 얇은 벽 PCR 튜브 (스타랩)에서 제조하였다. 샘플을 드라이아이스-에탄올 배쓰에서 10 분동안 급속-냉동시켰고, 벤치 탑(Bench Top) 2K 동결-건조기 (비르티스(VirTis))를 사용하여 0.14 mbar 및 -72.5 ℃에서 48 시간동안 동결건조시켰다. 동결건조된 샘플은 샘플 수화를 최소화하기 위해 드라이어라이트(Drierite) (시그마-알드리치(Sigma-Aldrich)) 층 상에서 파라필름(Parafilm) (시그마-알드리치)으로 밀봉된 유리 섬광 바이알에서 지시된 시간 동안 37 ℃로 보관하였다. 샘플을 반응 버퍼에서 재구성하였고, 여기서, SnoopTagJr-AffiHER2 및 SUMO-DogTag의 작용을 4 ℃에서 2 시간동안 수행하였고, 이후에, SDS-PAGE, 쿠마시 염색 및 밀도 측정을 수행하였다.
SEQUENCE LISTING <110> Oxford University Innovation Limited <120> Peptide ligase and use thereof <130> 20.131614/01 <150> GB1705750.6 <151> 2017-04-10 <160> 11 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 104 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> SnoopLigase <400> 1 Val Asn Lys Asn Asp Lys Lys Pro Leu Arg Gly Ala Val Phe Ser Leu 1 5 10 15 Gln Lys Gln His Pro Asp Tyr Pro Asp Ile Tyr Gly Ala Ile Asp Gln 20 25 30 Asn Gly Thr Tyr Gln Asn Val Arg Thr Gly Glu Asp Gly Lys Leu Thr 35 40 45 Phe Lys Asn Leu Ser Asp Gly Lys Tyr Arg Leu Phe Glu Asn Ser Glu 50 55 60 Pro Pro Gly Tyr Lys Pro Val Gln Asn Lys Pro Ile Val Ala Phe Gln 65 70 75 80 Ile Val Asn Gly Glu Val Arg Asp Val Thr Ser Ile Val Pro Pro Gly 85 90 95 Val Pro Ala Thr Tyr Glu Phe Thr 100 <210> 2 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> SnoopTagJr <400> 2 Lys Leu Gly Ser Ile Glu Phe Ile Lys Val Asn Lys 1 5 10 <210> 3 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> DogTag <400> 3 Asp Ile Pro Ala Thr Tyr Glu Phe Thr Asp Gly Lys His Tyr Ile Thr 1 5 10 15 Asn Glu Pro Ile Pro Pro Lys 20 <210> 4 <211> 893 <212> PRT <213> Streptococcus pneumoniae <400> 4 Met Leu Asn Arg Glu Thr His Met Lys Lys Val Arg Lys Ile Phe Gln 1 5 10 15 Lys Ala Val Ala Gly Leu Cys Cys Ile Ser Gln Leu Thr Ala Phe Ser 20 25 30 Ser Ile Val Ala Leu Ala Glu Thr Pro Glu Thr Ser Pro Ala Ile Gly 35 40 45 Lys Val Val Ile Lys Glu Thr Gly Glu Gly Gly Ala Leu Leu Gly Asp 50 55 60 Ala Val Phe Glu Leu Lys Asn Asn Thr Asp Gly Thr Thr Val Ser Gln 65 70 75 80 Arg Thr Glu Ala Gln Thr Gly Glu Ala Ile Phe Ser Asn Ile Lys Pro 85 90 95 Gly Thr Tyr Thr Leu Thr Glu Ala Gln Pro Pro Val Gly Tyr Lys Pro 100 105 110 Ser Thr Lys Gln Trp Thr Val Glu Val Glu Lys Asn Gly Arg Thr Thr 115 120 125 Val Gln Gly Glu Gln Val Glu Asn Arg Glu Glu Ala Leu Ser Asp Gln 130 135 140 Tyr Pro Gln Thr Gly Thr Tyr Pro Asp Val Gln Thr Pro Tyr Gln Ile 145 150 155 160 Ile Lys Val Asp Gly Ser Glu Lys Asn Gly Gln His Lys Ala Leu Asn 165 170 175 Pro Asn Pro Tyr Glu Arg Val Ile Pro Glu Gly Thr Leu Ser Lys Arg 180 185 190 Ile Tyr Gln Val Asn Asn Leu Asp Asp Asn Gln Tyr Gly Ile Glu Leu 195 200 205 Thr Val Ser Gly Lys Thr Val Tyr Glu Gln Lys Asp Lys Ser Val Pro 210 215 220 Leu Asp Val Val Ile Leu Leu Asp Asn Ser Asn Ser Met Ser Asn Ile 225 230 235 240 Arg Asn Lys Asn Ala Arg Arg Ala Glu Arg Ala Gly Glu Ala Thr Arg 245 250 255 Ser Leu Ile Asp Lys Ile Thr Ser Asp Ser Glu Asn Arg Val Ala Leu 260 265 270 Val Thr Tyr Ala Ser Thr Ile Phe Asp Gly Thr Glu Phe Thr Val Glu 275 280 285 Lys Gly Val Ala Asp Lys Asn Gly Lys Arg Leu Asn Asp Ser Leu Phe 290 295 300 Trp Asn Tyr Asp Gln Thr Ser Phe Thr Thr Asn Thr Lys Asp Tyr Ser 305 310 315 320 Tyr Leu Lys Leu Thr Asn Asp Lys Asn Asp Ile Val Glu Leu Lys Asn 325 330 335 Lys Val Pro Thr Glu Ala Glu Asp His Asp Gly Asn Arg Leu Met Tyr 340 345 350 Gln Phe Gly Ala Thr Phe Thr Gln Lys Ala Leu Met Lys Ala Asp Glu 355 360 365 Ile Leu Thr Gln Gln Ala Arg Gln Asn Ser Gln Lys Val Ile Phe His 370 375 380 Ile Thr Asp Gly Val Pro Thr Met Ser Tyr Pro Ile Asn Phe Asn His 385 390 395 400 Ala Thr Phe Ala Pro Ser Tyr Gln Asn Gln Leu Asn Ala Phe Phe Ser 405 410 415 Lys Ser Pro Asn Lys Asp Gly Ile Leu Leu Ser Asp Phe Ile Thr Gln 420 425 430 Ala Thr Ser Gly Glu His Thr Ile Val Arg Gly Asp Gly Gln Ser Tyr 435 440 445 Gln Met Phe Thr Asp Lys Thr Val Tyr Glu Lys Gly Ala Pro Ala Ala 450 455 460 Phe Pro Val Lys Pro Glu Lys Tyr Ser Glu Met Lys Ala Ala Gly Tyr 465 470 475 480 Ala Val Ile Gly Asp Pro Ile Asn Gly Gly Tyr Ile Trp Leu Asn Trp 485 490 495 Arg Glu Ser Ile Leu Ala Tyr Pro Phe Asn Ser Asn Thr Ala Lys Ile 500 505 510 Thr Asn His Gly Asp Pro Thr Arg Trp Tyr Tyr Asn Gly Asn Ile Ala 515 520 525 Pro Asp Gly Tyr Asp Val Phe Thr Val Gly Ile Gly Ile Asn Gly Asp 530 535 540 Pro Gly Thr Asp Glu Ala Thr Ala Thr Ser Phe Met Gln Ser Ile Ser 545 550 555 560 Ser Lys Pro Glu Asn Tyr Thr Asn Val Thr Asp Thr Thr Lys Ile Leu 565 570 575 Glu Gln Leu Asn Arg Tyr Phe His Thr Ile Val Thr Glu Lys Lys Ser 580 585 590 Ile Glu Asn Gly Thr Ile Thr Asp Pro Met Gly Glu Leu Ile Asp Leu 595 600 605 Gln Leu Gly Thr Asp Gly Arg Phe Asp Pro Ala Asp Tyr Thr Leu Thr 610 615 620 Ala Asn Asp Gly Ser Arg Leu Glu Asn Gly Gln Ala Val Gly Gly Pro 625 630 635 640 Gln Asn Asp Gly Gly Leu Leu Lys Asn Ala Lys Val Leu Tyr Asp Thr 645 650 655 Thr Glu Lys Arg Ile Arg Val Thr Gly Leu Tyr Leu Gly Thr Asp Glu 660 665 670 Lys Val Thr Leu Thr Tyr Asn Val Arg Leu Asn Asp Glu Phe Val Ser 675 680 685 Asn Lys Phe Tyr Asp Thr Asn Gly Arg Thr Thr Leu His Pro Lys Glu 690 695 700 Val Glu Gln Asn Thr Val Arg Asp Phe Pro Ile Pro Lys Ile Arg Asp 705 710 715 720 Val Arg Lys Tyr Pro Glu Ile Thr Ile Ser Lys Glu Lys Lys Leu Gly 725 730 735 Asp Ile Glu Phe Ile Lys Val Asn Lys Asn Asp Lys Lys Pro Leu Arg 740 745 750 Gly Ala Val Phe Ser Leu Gln Lys Gln His Pro Asp Tyr Pro Asp Ile 755 760 765 Tyr Gly Ala Ile Asp Gln Asn Gly Thr Tyr Gln Asn Val Arg Thr Gly 770 775 780 Glu Asp Gly Lys Leu Thr Phe Lys Asn Leu Ser Asp Gly Lys Tyr Arg 785 790 795 800 Leu Phe Glu Asn Ser Glu Pro Ala Gly Tyr Lys Pro Val Gln Asn Lys 805 810 815 Pro Ile Val Ala Phe Gln Ile Val Asn Gly Glu Val Arg Asp Val Thr 820 825 830 Ser Ile Val Pro Gln Asp Ile Pro Ala Gly Tyr Glu Phe Thr Asn Asp 835 840 845 Lys His Tyr Ile Thr Asn Glu Pro Ile Pro Pro Lys Arg Glu Tyr Pro 850 855 860 Arg Thr Gly Gly Ile Gly Met Leu Pro Phe Tyr Leu Ile Gly Cys Met 865 870 875 880 Met Met Gly Gly Val Leu Leu Tyr Thr Arg Lys His Pro 885 890 <210> 5 <211> 312 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> SnoopLigase <400> 5 gtgaataaga acgataaaaa gccgctgcgt ggtgccgtgt ttagcctgca gaaacagcat 60 cccgactatc ccgatatcta tggcgcgatt gatcagaatg ggacctatca aaatgtgcgt 120 accggcgaag atggtaaact gacctttaag aatctgagcg atggcaaata tcgcctgttt 180 gaaaatagcg aacccccggg ctataaaccg gtgcagaata agccgattgt ggcgtttcag 240 attgtgaatg gcgaagtgcg tgatgtgacc agcattgtgc cgccgggtgt gccggctaca 300 tatgaattta cc 312 <210> 6 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> SnoopTagJr <400> 6 aaactgggct ctattgaatt tattaaagtg aacaaa 36 <210> 7 <211> 69 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> DogTag <400> 7 gatattccgg ctacatatga atttaccgat ggtaaacatt atatcaccaa tgaaccgata 60 ccgccgaaa 69 <210> 8 <211> 104 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> RrgALigase <400> 8 Val Asn Lys Asn Asp Lys Lys Pro Leu Arg Gly Ala Val Phe Ser Leu 1 5 10 15 Gln Lys Gln His Pro Asp Tyr Pro Asp Ile Tyr Gly Ala Ile Asp Gln 20 25 30 Asn Gly Thr Tyr Gln Asn Val Arg Thr Gly Glu Asp Gly Lys Leu Thr 35 40 45 Phe Lys Asn Leu Ser Asp Gly Lys Tyr Arg Leu Phe Glu Asn Ser Glu 50 55 60 Pro Ala Gly Tyr Lys Pro Val Gln Asn Lys Pro Ile Val Ala Phe Gln 65 70 75 80 Ile Val Asn Gly Glu Val Arg Asp Val Thr Ser Ile Val Pro Gln Asp 85 90 95 Ile Pro Ala Thr Tyr Glu Phe Thr 100 <210> 9 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> SnoopTag <400> 9 Lys Leu Gly Asp Ile Glu Phe Ile Lys Val Asn Lys 1 5 10 <210> 10 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> RrgATag2 <400> 10 Asp Ile Pro Ala Thr Tyr Glu Phe Thr Asn Gly Lys His Tyr Ile Thr 1 5 10 15 Asn Glu Pro Ile Pro Pro Lys 20 <210> 11 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> SnoopTag solid-phase synthesised peptide <400> 11 Gly Lys Leu Gly Asp Ile Glu Phe Ile Lys Val Asn Lys Gly Tyr 1 5 10 15

Claims (25)

  1. 폴리펩티드로서,
    a) 서열식별번호: 1에 명시된 바와 같은 아미노산 서열; 또는
    b) 서열식별번호: 1에 명시된 바와 같은 서열과 적어도 80 %의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로서, 상기 아미노산 서열은 위치 61에서의 글루탐산 및 다음 중 1개 이상을 포함하는 것인 아미노산 서열을 포함하되,
    1) 위치 66에서 프롤린;
    2) 위치 95에서 프롤린;
    3) 위치 96에서 글리신; 및
    4) 위치 97에서 발린,
    상기 특정된 아미노산 잔기는 서열식별번호: 1에서의 위치와 동등한 위치에 있고, 상기 폴리펩티드는 서열식별번호: 2의 위치 9에서의 라이신 잔기와 서열식별번호: 3의 위치 17에서의 아스파라긴 잔기 사이에서 이소펩티드 결합의 형성을 촉진할 수 있는 것인
    폴리펩티드.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 서열식별번호: 1에 명시된 바와 같은 서열과 적어도 80 %의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 아미노산 서열이 위치 61에서의 글루탐산 및 다음 중 2개 이상을 포함하는 것인 폴리펩티드:
    1) 위치 66에서 프롤린;
    2) 위치 95에서 프롤린;
    3) 위치 96에서 글리신; 및
    4) 위치 97에서 발린.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 서열식별번호: 1에 명시된 바와 같은 서열과 적어도 80 %의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 아미노산 서열은 위치 61에서의 글루탐산 및 다음 중 3개 이상을 포함하는 것인 폴리펩티드:
    1) 위치 66에서 프롤린;
    2) 위치 95에서 프롤린;
    3) 위치 96에서 글리신; 및
    4) 위치 97에서 발린.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 서열식별번호: 1에 명시된 바와 같은 서열과 적어도 80 %의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 아미노산 서열은 위치 61에서의 글루탐산 및 다음의 모두를 포함하는 것인 폴리펩티드:
    1) 위치 66에서 프롤린;
    2) 위치 95에서 프롤린;
    3) 위치 96에서 글리신; 및
    4) 위치 97에서 발린.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 위치 100에서 트레오닌을 포함하는 것인 폴리펩티드.
  6. 펩티드 태그로서,
    서열식별번호: 2 또는 서열식별번호: 3에 명시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 펩티드 태그.
  7. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서 또는 제 6 항에 있어서,
    상기 폴리펩티드 또는 펩티드 태그가 핵산 분자, 단백질, 펩티드, 소-분자(small-molecule) 유기 화합물, 형광단, 금속-리간드 복합체, 다당류, 나노입자, 나노튜브, 중합체, 세포, 바이러스, 바이러스-유사 입자 또는 이들의 조합에 컨쥬게이션되는 것인 폴리펩티드 또는 펩티드 태그.
  8. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서 또는 제 6 항에 있어서,
    상기 폴리펩티드 또는 펩티드 태그가 고체 기질 상에 고정화되는 것인 폴리펩티드 또는 펩티드 태그.
  9. 핵산 분자로서,
    제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항의 폴리펩티드 또는 펩티드 태그를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자.
  10. 벡터로서,
    제 9 항의 핵산 분자를 포함하는 벡터.
  11. 세포로서,
    제 9 항의 핵산 분자 또는 제 10 항의 벡터를 포함하는 세포.
  12. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 폴리펩티드 및/또는 펩티드 태그를 생성 또는 발현시키기 위한 방법으로서,
    하기 단계를 포함하는 것인, 폴리펩티드 및/또는 펩티드 태그를 생성 또는 발현시키기 위한 방법:
    a) 제 10 항에 정의된 바와 같은 벡터로 숙주 세포를 형질전환 또는 형질감염시키는 단계;
    b) 상기 폴리펩티드 및/또는 펩티드 태그의 발현을 허용하는 조건 하에 상기 숙주 세포를 배양하는 단계; 및 선택적으로
    c) 상기 폴리펩티드 및/또는 펩티드 태그를 단리하는 단계를 포함하는, 폴리펩티드 및/또는 펩티드 태그를 생성 또는 발현시키기 위한 방법
  13. 제 1 항 내지 제 5 항, 제 7 항 또는 제 8 항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 폴리펩티드의 용도로서,
    (1) 이소펩티드 결합을 통한 2개의 분자 또는 구성요소의 컨쥬게이션; 또는
    (2) 3 개의 분자 또는 구성요소 사이에서 복합체의 생성으로서, 상기 복합체 내의 상기 분자 또는 구성요소 중 2개가 이소펩티드 결합을 통해 컨쥬게이션된 것인 복합체의 생성을 위한 용도이고,
    이소펩티드 결합을 통해 컨쥬게이션된 상기 분자 또는 구성요소는 하기를 포함하고:
    a) 하기를 포함하는 펩티드 태그를 포함하는 제 1 분자 또는 구성요소:
    (i) 서열식별번호: 2에 명시된 바와 같은 아미노산 서열; 또는
    (ii) 서열식별번호: 2에 명시된 바와 같은 서열과 적어도 80 %의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로서, 상기 아미노산 서열은 서열식별번호: 2의 위치 9와 동등한 위치에서 라이신 잔기를 포함하는 것인 아미노산 서열; 및
    b) 하기를 포함하는 펩티드 태그를 포함하는 제2 분자:
    (i) 서열식별번호: 3에 명시된 바와 같은 아미노산 서열; 또는
    (ii) 서열식별번호: 3에 명시된 바와 같은 서열과 적어도 80 %의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로서, 상기 아미노산 서열은 서열식별번호: 3의 위치 17과 동등한 위치에서 아스파라긴 잔기를 포함하는 것인 아미노산 서열, 그리고
    (2)에서 복합체 내의 제 3 분자 또는 구성요소는 제 1 항 내지 제 5 항, 제 7 항 또는 제 8 항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 폴리펩티드를 포함하는 것인
    용도.
  14. 제 13 항에 있어서, 상기 제 1 분자는 핵산 분자, 단백질, 펩티드, 소-분자 유기 화합물, 형광단, 금속-리간드 복합체, 다당류, 나노입자, 나노튜브, 중합체, 세포, 바이러스, 바이러스-유사 입자 또는 이들의 조합에 컨쥬게이션된, a)에 정의된 바와 같은 펩티드 태그를 포함하는 것인 용도.
  15. 제 13 항 또는 제 14 항에 있어서, 상기 제 2 분자가 핵산 분자, 단백질, 펩티드, 소-분자 유기 화합물, 형광단, 금속-리간드 복합체, 다당류, 나노입자, 나노튜브, 중합체, 세포, 바이러스, 바이러스-유사 입자 또는 이들의 조합에 컨쥬게이션된, b)에 정의된 바와 같은 펩티드 태그를 포함하는 것인 용도.
  16. 이소펩티드 결합을 통해 2 개의 분자 또는 구성요소를 컨쥬게이션하기 위한 방법으로서,
    a) 하기를 포함하는 펩티드 태그를 포함하는 제 1 분자 또는 구성요소를 제공하는 단계:
    (i) 서열식별번호: 2에 명시된 바와 같은 아미노산 서열; 또는
    (ii) 서열식별번호: 2에 명시된 바와 같은 서열과 적어도 80 %의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로서, 상기 아미노산 서열은 서열식별번호: 2의 위치 9와 동등한 위치에서 라이신 잔기를 포함하는 것인 아미노산 서열;
    b) 하기를 포함하는 펩티드 태그를 포함하는 제 2 분자 또는 구성요소를 제공하는 단계:
    (i) 서열식별번호: 3에 명시된 바와 같은 아미노산 서열; 또는
    (ii) 서열식별번호: 3에 명시된 바와 같은 서열과 적어도 80 %의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로서, 상기 아미노산 서열은 서열식별번호: 3의 위치 17과 동등한 위치에서 아스파라긴 잔기를 포함하는 것인 아미노산 서열;
    c) 상기 제 1 및 제 2 분자 또는 구성요소를, 제 1 항 내지 제 5 항 또는 제7항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 폴리펩티드와 접촉시키는 단계로서, 서열식별번호: 2의 위치 9와 동등한 위치에 있는 라이신 잔기와 서열식별번호: 3의 위치 17과 동등한 위치에 있는 아스파라긴 잔기 사이에서 이소펩티드 결합의 형성을 가능하게 하는 조건 하에, 바람직하게 상기 폴리펩티드는 고체 기질 상에 고정화되고, 그에 의해, 이소펩티드를 통해 상기 제 1 분자를 상기 제 2 분자에 컨쥬게이션시켜 복합체를 형성하는 것인 단계를 포함하는, 이소펩티드 결합을 통해 2 개의 분자 또는 구성요소를 컨쥬게이션하기 위한 방법.
  17. 제 16 항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 고체 기질 상에 고정화될 때, 상기 방법은 상기 고체 기질로부터 상기 복합체를 분리하는 추가적인 단계를 포함하고, 상기 단계는 상기 복합체를 낮은 pH 버퍼(buffer), 바람직하게는 4.0 이하의 pH를 갖는 버퍼와 접촉시키는 단계를 포함하는 것인 방법.
  18. 제 16 항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 고체 기질 상에 고정화될 때, 상기 방법은 상기 고체 기질로부터 상기 복합체를 분리하는 추가적인 단계를 포함하고, 상기 단계는 상기 복합체를, 이미다졸을 바람직하게는 적어도 1M의 농도로 포함하는 용액과 접촉시키는 단계를 포함하는 것인 방법.
  19. 제 16 항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 고체 기질 상에 고정화될 때, 상기 방법은 상기 고체 기질로부터 상기 복합체를 분리하는 추가적인 단계를 포함하고, 상기 단계는 상기 복합체를, 서열식별번호: 3에 명시된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 펩티드에 리게이션된, 서열식별번호: 2에 명시된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 펩티드를 포함하는 경쟁자 반응 생성물을 포함하는 용액과 접촉시키는 단계를 포함하는 것인 방법.
  20. 제 17 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 복합체를 상기 고체 기질로부터 분리하기 전에 상기 고체 기질을 버퍼로 세척하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
  21. 제 16 항 내지 제 20 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제 1 분자는 핵산 분자, 단백질, 펩티드, 소-분자 유기 화합물, 형광단, 금속-리간드 복합체, 다당류, 나노입자, 나노튜브, 중합체, 세포, 바이러스, 바이러스-유사 입자 또는 이들의 조합에 컨쥬게이션된, a)에 정의된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 펩티드 태그를 포함하는 것인 방법.
  22. 제 16 항 내지 제 21 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제 2 분자는 핵산 분자, 단백질, 펩티드, 소-분자 유기 화합물, 형광단, 금속-리간드 복합체, 다당류, 나노입자, 나노튜브, 중합체, 세포, 바이러스, 바이러스-유사 입자 또는 이들의 조합에 컨쥬게이션된, b)에 정의된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 펩티드 태그를 포함하는 것인 방법.
  23. 바람직하게는 제 13 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항의 용도 또는 제 16 항 내지 제 22 항 중 어느 한 항의 방법에 사용하기 위한 키트로서,
    상기 키트는,
    (a) 제 1 항 내지 제 5 항, 제 7 항 또는 제 8 항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 펩티드 리가아제; 및
    (b) 펩티드 태그로서, 하기를 포함하고:
    (i) 서열식별번호: 2에 명시된 바와 같은 아미노산 서열;
    (ii) 서열식별번호: 2에 명시된 바와 같은 서열과 적어도 80 %의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로서, 상기 아미노산 서열은 서열식별번호: 2의 위치 9와 동등한 위치에서 라이신 잔기를 포함하는 것인 아미노산 서열,
    (iii) 서열식별번호: 3에 명시된 바와 같은 아미노산 서열; 또는
    (iv) 서열식별번호: 3에 명시된 바와 같은 서열과 적어도 80 %의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로서, 상기 아미노산 서열은 서열식별번호: 3의 위치 17과 동등한 위치에서 아스파라긴 잔기를 포함하는 것인 아미노산 서열,
    상기 펩티드 태그는 분자 또는 구성요소에 컨쥬게이션 또는 융합된 것인 펩티드 태그; 및/또는
    (c) (a)에 정의된 바와 같은 펩티드 리가아제를 인코딩하는 핵산 분자, 특히 벡터; 및
    (d) (b)에 정의된 바와 같은 펩티드 태그를 인코딩하는 핵산 분자, 특히 벡터를 포함하는 것인 키트.
  24. 제 23 항에 있어서, 분자 또는 구성요소에 컨쥬게이션 또는 융합된 제 2 펩티드 태그를 추가로 포함하고, 상기 제 2 펩티드 태그는 이소펩티드 결합의 형성에 적합한 조건 하에 (a)의 펩티드 리가아제와 접촉할 때 (b)에서의 상기 펩티드 태그와 이소펩티드 결합을 형성할 수 있는 것인 키트.
  25. 제 23 항 또는 제 24 항에 있어서, 상기 분자 또는 구성요소가 핵산 분자, 단백질, 펩티드, 소-분자 유기 화합물, 형광단, 금속-리간드 복합체, 다당류, 나노입자, 나노튜브, 중합체, 세포, 바이러스, 바이러스-유사 입자 또는 이들의 조합인 것인 키트.
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