KR20190124753A - 항-gitr 항체 및 이의 사용 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 글루코코르티코이드 유도된 종양 괴사 인자 수용체 계열 관련된 단백질(GITR)에 결합하는 항체 및 이를 사용하는 방법을 제공한다. 항-GITR 항체는 암 및 다른 질환을 치료하기 위해 치료학적으로 단독으로 또는 다른 치료제와 조합하여 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 글루코코르티코이드 유도된 종양 괴사 인자 수용체 계열 관련된 단백질(GITR: Glucocorticoid Induced Tumor necrosis factor Receptor family related protein)에 결합하는 항체, 예를 들어 전장 항체에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 GITR에 대한 항체를 포함하는 조성물, 및 항-GITR 항체를 약제로서 사용하는 방법에 관한 것이다. 특정 실시양태는 암과 같은 과증식성 질환을 비롯한 다양한 질환의 치료, 예방 및/또는 진단을 위하여 항-GITR 항체를 사용하는 방법과 관련된다.
글루코코르티코이드 유도된 종양 괴사 인자 수용체 계열 관련된 단백질(GITR)은 NK 세포 및 T 세포, 예컨대 CD8+, CD4+, 또는 조절 T 세포(Treg)의 표면 상에서 발현된다. Treg는 CD4+ T 세포 또는 CD8+ T 세포의 다른 유형에 비해 더 높은 수준으로 GITR을 발현한다. GITR의 발현은 말초 혈액에서 낮고 Treg의 소수의 집단 상에서 존재하는 반면, 고체 종양에 침윤하는 Treg는 대부분의 Treg 상에서 증가된 GITR 발현을 갖는다.
GITR을 경유한 신호발송은 T 세포 증식 및 효과자 기능을 증가시키고 또한 활성화-유도된 세포 사멸(AICD: activation-induced cell death)로부터 T 세포를 보호하고, 이는 다시 기억 T 세포의 빈도를 증가시킨다. 예를 들어, 론체티(Ronchetti) 등의 문헌[Euro. J. of Immunology. 34(3): 613-22 (2004)]; 및 스넬(Snell) 등의 문헌[Immunological Reviews. 244(1): 197-217(2011)]을 참조한다. 이전의 연구는 작용물질 항-GITR 단일클론성 항체(mAb)가 메쓰(Meth)-A 섬유육종, CT26 결장 암종, 및 MB49 방광 암종을 포함하는 다중의 마우스 상승적 종양 모델에서 항-종양 효능을 가짐을 보여주었다. 예를 들어, 조쉬(Joshi) 등의 문헌[Immunity, 43: 1-12 (2015)]; 및 론체티(Ronchetti) 등의 문헌[J. of Immunology, 179: 5916-5916 (2007)]을 참조한다. 이러한 효능은 효과자 T 세포의 증진된 반응성에 상응하는 것으로 보여졌다. 예를 들어, 코(Ko) 등의 문헌[J. Exp. Med. 202(7): 885-891 (2005)]; 코에(Coe) 등의 문헌[Cancer Immunol. Immunother., 59(9): 1367-77 (2010)]; 및 코헨(Cohen) 등의 문헌[Cancer Res., 66(9): 4904-12 (2006)]을 참조한다. GITR 작용물질은 또한 항-CTLA-4 항체 및 항-PD-1 항체와의 상승적 항-종양 효과를 나타내었다. 예를 들어, 미츠이(Mitsui) 등의 문헌[Clinical Cancer Research: an Official Journal of the American Association for Cancer research, 16(10): 2781-91 (2010)]; 및 루(Lu) 등의 문헌[J. of Translational Medicine, 12: 36 (2014)]을 참조한다. 따라서, GITR 신호발송을 조율하는 항체-기반의 치료제의 개발은 암의 치료에 있어서 큰 가치가 있을 것이다.
본원에 개시된 발명은 GITR에 선택적으로 결합된 항체에 관한 것이다. 본 발명의 항-GITR 항체는 Treg 소모 및 T 효과자 세포 활성화의 이중 특성을 갖고, 이는 다시 종양에서의 증진된 T 효과자 대 Treg 비, 및 종양 퇴행을 환자에서 초래하는 것으로 입증된다.
하나의 양태에서, 본 발명은 GITR에 특이적으로 결합하고: 서열 번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 또는 112로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 VH의 VH 상보성 결정 영역(CDR: complementarity determining region)1(CDR1), VH CDR2, 및 VH CDR3을 포함하는 중쇄 가변성 영역(VH); 및/또는 서열 번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 또는 111로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 VL의 VL CDR1, VL CDR2, 및 VL CDR3을 포함하는 경쇄 가변성 영역(VL)을 포함하는 단리된 항체를 제공한다. 몇몇 실시양태에서, 항체는 ATCC 기탁번호 제PTA-123632호를 갖는 발현 벡터에 의해 생산되는 VH 영역을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 항체는 ATCC 기탁번호 제PTA-123633호를 갖는 발현 벡터에 의해 생산되는 VL 영역을 포함한다.
몇몇 실시양태에서, 항체는 서열 번호 24, 25, 26, 32, 33, 34, 35, 39, 40, 41, 115, 116, 117, 63, 64, 또는 65에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, 서열 번호 27, 28, 44, 45, 66, 또는 67에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2, 및 서열 번호 29, 46, 또는 68에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3; 및/또는 서열 번호 21, 30, 36, 42, 113, 또는 31에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, 서열 번호 22, 37, 43, 114, 또는 61에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2, 및 서열 번호 23, 38, 또는 62에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 항체는 서열 번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 또는 112에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH, 또는 CDR내에 존재하지 않는 잔기에서 1개 또는 수개의 보존적 아미노산 치환을 갖는 이의 변이체를 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 항체는 서열 번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 또는 111에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL, 또는 CDR내에 존재하지 않는 아미노산에서 1개 또는 수개의 보존적 아미노산 치환을 갖는 이의 변이체를 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 항체는 서열 번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 또는 112에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH, 및 서열 번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 또는 111에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 GITR에 특이적으로 결합하고: 서열 번호 16, 18, 20, 121, 및 123으로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 VH의 VH CDR1, VH CDR2, 및 VH CDR3을 포함하는 VH; 및/또는 서열 번호 15, 17, 19, 120, 및 122로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 VL의 VL CDR1, VL CDR2, 및 VL CDR3을 포함하는 VL을 포함하는 단리된 항체를 제공한다. 몇몇 실시양태에서, 항체는 서열 번호 50, 51, 52, 56, 또는 57에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, 서열 번호 53, 54, 58, 또는 59에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2, 및 서열 번호 55, 60, 또는 124에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3; 및/또는 서열 번호 47에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, 서열 번호 48에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2, 및 서열 번호 49에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3을 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 GITR에 특이적으로 결합하고: 서열 번호 70 및 72로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 VH의 VH CDR1, VH CDR2, 및 VH CDR3을 포함하는 VH; 및/또는 서열 번호 69 및 71로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 VL의 VL CDR1, VL CDR2, 및 VL CDR3을 포함하는 VL을 포함하는 단리된 항체를 제공한다. 몇몇 실시양태에서, 항체는 서열 번호 32, 76, 77, 84, 85, 또는 86에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, 서열 번호 78 또는 79에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2, 및 서열 번호 80 또는 87에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3; 및/또는 서열 번호 73 또는 81에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, 서열 번호 74 또는 82에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2, 및 서열 번호 75 또는 83에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3을 포함한다.
몇몇 실시양태에서, 항체는 인간 항체, 인간화된 항체, 또는 키메라성 항체일 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 항체는 단일클론성 항체이다.
몇몇 실시양태에서, 항체는 불변성 영역을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 항체는 인간 IgG1, IgG2, IgG2△a, IgG3, IgG4, IgG4△b, IgG4△c, IgG4 S228P, IgG4△b S228P 및 IgG4△c S228P 하위부류이다. 몇몇 실시양태에서, 항체는 IgG1 이소타입이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 GITR에 특이적으로 결합하고, 본원에 기재된 바와 같은 항-GITR 항체에 의해 인식되는 GITR 에피토프와 경쟁하고/하거나, 이에 결합하거나, 또는 이와 중첩되는 단리된 항체를 제공한다.
몇몇 실시양태에서, 본원에 제공된 항-GITR 항체는 Treg 소모를 촉진시키고 T 효과자 세포를 활성화시킨다(예를 들어, 상승적 종양 모델을 CT26 세포에서 사용하여 생체내 측정시).
몇몇 실시양태에서, 본원에 제공된 항-GITR 항체는 효과자 T 세포로부터 염증성 사이토킨 IFNγ 및 TNFα의 방출을 증가시킨다(예를 들어, CD4+ 및 CD8+ T 세포에서 시험관내 측정시).
몇몇 실시양태에서, 본원에 제공된 항-GITR 항체는 항종양 면역 반응을 증진시킨다(예를 들어, 종양 성장을 저해하고, 비-T 세포, 예컨대 NK 및 다른 선천적 세포에 대한 영향을 증진시킴).
몇몇 실시양태에서, 본원에 제공된 항-GITR 항체는 인간 GITR에 결합한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 치료 효과량의 본원에 기재된 바와 같은 항-GITR 항체 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 바와 같은 항-GITR 항체를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 또 다른 양태에서, 본 발명은 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 바와 같은 항-GITR 항체를 재조합적으로 생산하는 단리된 숙주 세포를 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 바와 같은 항체를 재조합적으로 생산하는 세포주를 항체가 생산되는 조건하에 배양하는 단계, 및 항체를 회수하는 단계를 포함하는, 항-GITR 항체를 생산하는 방법을 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 서열 번호 110에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 번호 109에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체를 인코딩하는 핵산을 포함하는 세포주를 항체가 생산되는 조건하에 배양하는 단계, 및 항체를 회수하는 단계를 포함하는, 항-GITR 항체를 생산하는 방법을 제공한다.
몇몇 실시양태에서, 중쇄 및 경쇄는 별도의 벡터 상에서 인코딩된다. 다른 실시양태에서, 중쇄 및 경쇄는 동일한 벡터 상에서 인코딩된다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 증상의 치료가 필요한 피험체에게 효과량의 본원에 기재된 바와 같은 약학 조성물을 투여함을 포함하는, 피험체에서 증상을 치료하는 방법을 제공한다. 몇몇 실시양태에서, 증상은 암이다. 몇몇 실시양태에서, 암은 B-세포 관련된 암, 위암, 소장암, 육종, 두경부암, 흉선암, 상피암, 침샘암, 간암, 담즙암, 신경내분비 종양, 위점막암, 갑상선암, 폐암, 중피종, 난소암, 유방암, 전립선암, 식도암, 췌장암, 신경교종, 신장암, 방광암, 경부암, 자궁암, 외음부암, 음경암, 고환암, 항문암, 융모암종, 대장암, 구강암, 피부암, 메르켈(Merkel) 세포 암종, 교모세포종, 뇌종양, 골암, 안암, 및 흑색종으로 구성된 군에서 선택된다.
몇몇 실시양태에서, B-세포 관련된 암은 다발성 골수종, 약성 형질 세포 종양, 호지킨 림프종(Hodgkin's lymphoma), 결절 림프구 우세형 호지킨 림프종, 칼러병(Kahler's disease) 및 골수종증, 형질구성 백혈병, 형질세포종, B-세포 전림프구성 백혈병, 모양 세포 백혈병, B-세포 비-호지킨 림프종(NHL), 급성 골수성 백혈병(AML), 만성 림프구성 백혈병(CLL), 급성 림프구성 백혈병(ALL), 만성 골수성 백혈병(CML), 소포성 림프종, 버킷(Burkitt)의 림프종, 변연부(marginal zone) 림프종, 외투(mantle) 세포 림프종, 대세포 림프종, 전구체 B-림프아구성 림프종, 골수성 백혈병, 왈덴스트롬의 마크로글로불린혈증(Waldenstrom's macroglobulienemia), 미만성 거대 B 세포 림프종, 소포성 림프종, 변역부 림프종, 점막-관련 림프 조직 림프종, 소세포 림프구성 림프종, 외투 세포 림프종, 버킷 림프종, 원발성 종격동 (흉선) 거대 B-세포 림프종, 림프형질세포성 림프종, 왈덴스트롬 마크로글로불린혈증, 결절 변연부 B 세포 림프종, 비장의 변연부 림프종, 혈관내 거대 B-세포 림프종, 원발성 삼출성 림프종, 림프종모양 육아종증, T 세포/조직구-풍부한 거대 B-세포 림프종, 원발성 중추 신경계 림프종, 원발성 피부 광범위 거대 B-세포 림프종(다리 유형), 노인의 EBV 양성 광범위 거대 B-세포 림프종, 염증과 연관된 광범위 거대 B-세포 림프종, 혈관내 거대 B-세포 림프종, ALK-양성 거대 B-세포 림프종, 형질아세포성 림프종, HHV8-연관된 다중심 캐슬만병(Castleman disease)에서 발생하는 거대 B-세포 림프종, 광범위 거대 B-세포 림프종 및 버킷 림프종 사이의 중간 특징을 갖는 분류되지 않은 B-세포 림프종, 광범위 거대 B-세포 림프종 및 전형적 호지킨 림프종 사이의 중간 특징을 갖는 분류되지 않은 B-세포 림프종, 및 기타 B-세포 관련된 림프종으로 구성된 군에서 선택된다.
몇몇 실시양태에서, 암은 재발되거나 난치성이다.
몇몇 실시양태에서, 암은 국소 진행성 또는 전이성 흑색종, 편평상피 세포 두경부암(SCHNC: squamous cell head and neck cancer), 난소암, 신장암, 위암, 또는 폐암이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 종양을 앓는 피험체에게 효과량의 본원에 기재된 바와 같은 약학 조성물을 투여함을 포함하는, 종양을 앓는 피험체에서 종양 성장 또는 진행을 저해하는 방법을 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 암 세포의 전이를 저해하거나 예방할 필요가 있는 피험체에게 효과량의 본원에 기재된 바와 같은 약학 조성물을 투여함을 포함하는, 피험체에서 암 세포의 전이를 저해하거나 예방하는 방법을 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 GITR 발현 종양을 앓는 피험체에게 효과량의 본원에 기재된 바와 같은 약학 조성물을 투여함을 포함하는, GITR 발현 종양을 앓는 피험체에서 종양 퇴행을 유도하는 방법을 제공한다.
몇몇 실시양태에서, 항체는 본원에서 피험체에 비경구적으로 투여될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 피험체는 인간이다.
몇몇 실시양태에서, 방법은 효과량의 제2 치료제를 투여함을 추가로 포함할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 제2 치료제는 생물치료제이고, 예를 들면, 제한되지 않지만 항-CTLA-4 항체, 항-4-1BB 항체, 항-PD-1 항체, 항-PD-L1 항체, 항-TIM3 항체, 항-LAG3 항체, 항-TIGIT 항체, 항-OX40 항체, IL-8 항체, 항-HVEM 항체, 항-BTLA 항체, 항-CD40 항체, 항-CD40L 항체, 항-CD47 항체, 항-CSF1R 항체, 항-CSF1 항체, 항-MARCO 항체, 항-CXCR4 항체, 항-VEGFR1 항체, 항-VEGFR2 항체, 항-TNFR1 항체, 항-TNFR2 항체, 항-CD3 이중특이적 항체, 항-CD19 항체, 항-CD20, 항-Her2 항체, 항-EGFR 항체, 항-ICOS 항체, 항-CD22 항체, 항-CD52 항체, 항-CCR4 항체, 항-CCR8 항체, 항-CD200R 항체, 항-VISG4 항체, 항-CCR2 항체, 항-LILRb2 항체, 항-CXCR4 항체, 항-CD206 항체, 항-CD163 항체, 항-KLRG1 항체, 항-FLT3 항체, 항-B7-H4 항체, 항-B7-H3 항체, 또는 제2 항-GITR 항체를 비롯한 항체이다.
몇몇 실시양태에서, 제2 치료제는 TNFα, PAP 저해제, 종양세포 붕괴성 바이러스, 키나아제(kinase) 저해제, ALK 저해제[예를 들어, 수니티닙(sunitinib) 또는 크리조티닙], MEK 저해제, IDO 저해제, GLS1 저해제, 티로신 키나아제 저해제[예를 들어, 악시티닙(axitinib) 또는 팔보시클립(palbociclib)], CAR(키메라성 항원 수용체)-T 세포 또는 T 세포 요법, TLR(Toll-유사 수용체) 작용물질(예를 들어, TLR3, TLR4, TLR5, TLR7, TLR9), 또는 종양 백신이다.
피험체에서 암을 치료하거나 또는 종양 성장 또는 진행을 저해하기 위한 약제의 제조에 있어서의 본원에 제공된 임의의 항-GITR 항체의 용도가 또한 제공된다.
도 1a는 CD4+ Foxp3+ T 조절(Treg) 세포, CD4+ Foxp3- T 통상적(Tconv) 세포, 및 CD8+ T(CD8) 세포를 비롯한 인간 말초 혈액 T 세포에서의 GITR 발현을 요약하는 그래프를 도시한다.
도 1b는 Treg, CD8 세포, 및 Tconv 세포 상에서의 GITR 양성 세포에 결합하는 항-GITR 항체(m3G7)의 밀도(MFI)를 요약하는 그래프를 도시한다.
도 1c는 인간 말초 혈액 단핵 세포에서 Treg, Tconv 및 CD8 세포의 빈도를 요약하는 그래프를 도시한다.
도 2a는 CD4+ Foxp3+ T 조절(Treg) 세포, CD4+ Foxp3- T 통상적(Tconv) 세포, 및 CD8+ T(CD8) 세포를 비롯한 신장 세포 암종-연관된 T 세포에 의한 GITR 및 OX40의 발현을 요약하는 그래프를 도시한다.
도 2b는 RCC-연관된 T 세포 하위집합 상에서의 GITR 및 OX40 항체 결합 밀도(MFI)를 요약하는 그래프를 도시한다.
도 2c는 신장 세포 암종 조직에서 면역 침윤물(CD45+)에서의 Treg, Tconv 및 CD8 세포의 빈도를 요약하는 그래프를 도시한다.
도 3a는 활성화된 T 세포로의 항-GITR 항체 m3G7 및 m10H2의 결합을 요약하는 그래프를 도시한다.
도 3b는 활성화된 Treg로의 항-GITR 항체 R5(h3G7 R5), R9(h3G7 N9), R13(10H2 N13), 및 R14(10H2 N14)의 결합을 요약하는 그래프를 도시한다.
도 4a는 비-분별화된 PBMC에 의해 중재된 항체-의존성 세포독성(ADCC)의 시험관내 검정에서 GITR 항체가 세포독성을 중재함을 보여준다. hIgG1 GITR 항체(m3G7 및 m10H2)는 대식세포가 GITR+ T 세포의 용량 의존적 살해를 중재할 수 있도록 한다.
도 4b는 대식세포에 의해 중재된 항체-의존성 세포 식세포작용(ADCP)의 시험관내 검정에서 GITR 항체가 세포독성을 중재함을 보여준다. 도시된 hIgG1 GITR 항체는 h3G7 R5("R5"), h3G7 R9("R9"), h10H2 R13("R13"), 및 h10H2 R14("R14")이다.
도 4c는 대식세포에 의해 중재된 항체-의존성 세포 식세포작용(ADCP)의 시험관내 검정에서 GITR 항체가 세포독성을 중재함을 보여준다.
도 5a는 플레이트 결합된 경우 본 발명의 GITR 항체(h3G7 R5("R5"), h3G7 R9("R9"), h10H2 R13("R13"), 및 h10H2 R14("R14"))가 GITR+ 3A9 세포로부터 TNFα의 분비를 용량 의존적 방식으로 증진시켰음을 요약하는 그래프를 보여준다.
도 5b는 또한 가용성 항-GITR 항체 R5, R9, R13, 및 R14가 B 세포 림프종 주(LK35.2)와 공-배양된 GITR+ 3A9 세포 사이에서 TNFα의 분비를 증진시켰음을 요약하는 그래프를 보여준다.
도 5c는 플레이트-결합된 항-GITR 항체 R5, R9, R13 및 R14가 항-CD3 항체에 의해 활성화된 인간 혈액 CD4+ 및 CD8+ T 세포로부터 분비된 IFNγ의 용량 의존적 증가를 초래하였음을 보여준다.
도 5d는 플레이트-결합된 항-GITR 항체 R5, R9, R13, 및 R14가 항-CD3 항체에 의해 활성화된 인간 혈액 CD4+ 및 CD8+ T 세포로부터 분비된 TNFα의 용량 의존적 증가를 초래하였음을 보여준다.
도 6a, 도 6b, 및 도 6c는 인간 GITR을 (A) 발현하지 않거나, (B) 낮게 발현하거나, (C) 높게 발현하는 T 세포주에 대하여 항-GITR 항체 m10H2에 의한 염색 밀도가 상관됨을 보여준다.
도 6d는 도 6a에 기재된 0, 낮은, 및 높은 GITR-발현 세포주의 항-GITR m10H2 항체 유세포분석 염색을 보여준다.
도 6e는 0, 낮은 및 높은 인간 GITR-발현 T 세포주의 정량적 PCR 및 액틴 B 발현으로의 정규화를 보여준다.
도 6f는 NSCLC 종양으로부터 단리된 포르말린 고정되고 파라핀 함침된(FFPE: Formalin Fixed Paraffin Embedded) 조직의 m10H2에 의한 염색을 보여준다.
도 6g는 NSCLC 종양으로부터 단리된 FFPE 조직의 이소타입 대조 마우스 항체에 의한 염색을 보여준다.
도 7a 내지 도 7d는 각각 5 mpk(mg/kg)의 mIgG2a 이소타입 대조군 및 0.2, 1 및 5 mpk(mg/kg)의 항-GITR 21B6 마우스(m) Fc IgG2a에 의해 처리된 개별 마우스의 종양 성장을 보여준다.
도 7e 내지 도 7h는 각각 5 mpk(mg/kg)의 mIgG1 이소타입 대조군, 0.2, 1 및 5 mpk(mg/kg)의 항-GITR 21B6 마우스(m) Fc IgG1에 의해 처리된 개별 마우스의 종양 성장을 보여준다.
도 7i는 IgG1 처리가 이소타입 대조군 처리된 마우스와 비교하여 종양 함유 마우스의 생존을 향상시키지 않았지만, IgG2a 처리는 0.2 mpk, 1 mpk 및 5 mpk에서 각각 40%, 44.4% 및 80% 생존율을 초래하였음을 보여준다.
도 7j는 21B6 mIgG2a에 의해 중재된 종양 성장의 저해가 1 mg/kg 용량에서 CD8+ T 세포 대 Treg의 비의 증가와 상관되었음을 보여준다.
도 7k는 21B6 mIgG2a에 의해 중재된 종양 성장의 저해가 모든 용량에서 CD4+ Teff 세포 대 Treg의 비의 증가와 상관되었음을 보여준다.
도 7l, 도 7m, 및 도 7n은 21B6 mIgG2a 처리된 마우스가 종양-침윤 Treg의 수에 있어서 비-유의적으로 감소된 반면, CD8+ T 세포 및 CD4+ Teff가 영향받지 않았음을 보여준다.
도 7o는 모든 용량의 21B6 mIgG2a가 종양 침윤 CD45+ 면역 세포내에서 Treg의 비율을 감소시켰고, 면역 침윤물중의 Treg의 비율이 21B6 mIgG1 처리에 의해 영향받지 않았음을 보여준다.
도 7p 및 도 7q는 종양 침윤물에서 CD8+ T 세포 및 CD4+ T 효과자 세포의 비율의 변화가 유의적이지 않았음을 보여준다.
도 7r, 도 7s, 및 도 7t는 21B6 mIgG2a 처리된 마우스가 0.2 mg/kg 용량으로 처리된 경우 비장에서 Treg 및 CD4+ Teff 비율이 가장 감소하였고(도 7r 및 도 7t), 다른 용량에서의 변화가 유의적이지 않았음을 보여준다. 비장의 CD8+ T 세포는 어떠한 용량에서도 영향받지 않았다(도 7s).
도 1b는 Treg, CD8 세포, 및 Tconv 세포 상에서의 GITR 양성 세포에 결합하는 항-GITR 항체(m3G7)의 밀도(MFI)를 요약하는 그래프를 도시한다.
도 1c는 인간 말초 혈액 단핵 세포에서 Treg, Tconv 및 CD8 세포의 빈도를 요약하는 그래프를 도시한다.
도 2a는 CD4+ Foxp3+ T 조절(Treg) 세포, CD4+ Foxp3- T 통상적(Tconv) 세포, 및 CD8+ T(CD8) 세포를 비롯한 신장 세포 암종-연관된 T 세포에 의한 GITR 및 OX40의 발현을 요약하는 그래프를 도시한다.
도 2b는 RCC-연관된 T 세포 하위집합 상에서의 GITR 및 OX40 항체 결합 밀도(MFI)를 요약하는 그래프를 도시한다.
도 2c는 신장 세포 암종 조직에서 면역 침윤물(CD45+)에서의 Treg, Tconv 및 CD8 세포의 빈도를 요약하는 그래프를 도시한다.
도 3a는 활성화된 T 세포로의 항-GITR 항체 m3G7 및 m10H2의 결합을 요약하는 그래프를 도시한다.
도 3b는 활성화된 Treg로의 항-GITR 항체 R5(h3G7 R5), R9(h3G7 N9), R13(10H2 N13), 및 R14(10H2 N14)의 결합을 요약하는 그래프를 도시한다.
도 4a는 비-분별화된 PBMC에 의해 중재된 항체-의존성 세포독성(ADCC)의 시험관내 검정에서 GITR 항체가 세포독성을 중재함을 보여준다. hIgG1 GITR 항체(m3G7 및 m10H2)는 대식세포가 GITR+ T 세포의 용량 의존적 살해를 중재할 수 있도록 한다.
도 4b는 대식세포에 의해 중재된 항체-의존성 세포 식세포작용(ADCP)의 시험관내 검정에서 GITR 항체가 세포독성을 중재함을 보여준다. 도시된 hIgG1 GITR 항체는 h3G7 R5("R5"), h3G7 R9("R9"), h10H2 R13("R13"), 및 h10H2 R14("R14")이다.
도 4c는 대식세포에 의해 중재된 항체-의존성 세포 식세포작용(ADCP)의 시험관내 검정에서 GITR 항체가 세포독성을 중재함을 보여준다.
도 5a는 플레이트 결합된 경우 본 발명의 GITR 항체(h3G7 R5("R5"), h3G7 R9("R9"), h10H2 R13("R13"), 및 h10H2 R14("R14"))가 GITR+ 3A9 세포로부터 TNFα의 분비를 용량 의존적 방식으로 증진시켰음을 요약하는 그래프를 보여준다.
도 5b는 또한 가용성 항-GITR 항체 R5, R9, R13, 및 R14가 B 세포 림프종 주(LK35.2)와 공-배양된 GITR+ 3A9 세포 사이에서 TNFα의 분비를 증진시켰음을 요약하는 그래프를 보여준다.
도 5c는 플레이트-결합된 항-GITR 항체 R5, R9, R13 및 R14가 항-CD3 항체에 의해 활성화된 인간 혈액 CD4+ 및 CD8+ T 세포로부터 분비된 IFNγ의 용량 의존적 증가를 초래하였음을 보여준다.
도 5d는 플레이트-결합된 항-GITR 항체 R5, R9, R13, 및 R14가 항-CD3 항체에 의해 활성화된 인간 혈액 CD4+ 및 CD8+ T 세포로부터 분비된 TNFα의 용량 의존적 증가를 초래하였음을 보여준다.
도 6a, 도 6b, 및 도 6c는 인간 GITR을 (A) 발현하지 않거나, (B) 낮게 발현하거나, (C) 높게 발현하는 T 세포주에 대하여 항-GITR 항체 m10H2에 의한 염색 밀도가 상관됨을 보여준다.
도 6d는 도 6a에 기재된 0, 낮은, 및 높은 GITR-발현 세포주의 항-GITR m10H2 항체 유세포분석 염색을 보여준다.
도 6e는 0, 낮은 및 높은 인간 GITR-발현 T 세포주의 정량적 PCR 및 액틴 B 발현으로의 정규화를 보여준다.
도 6f는 NSCLC 종양으로부터 단리된 포르말린 고정되고 파라핀 함침된(FFPE: Formalin Fixed Paraffin Embedded) 조직의 m10H2에 의한 염색을 보여준다.
도 6g는 NSCLC 종양으로부터 단리된 FFPE 조직의 이소타입 대조 마우스 항체에 의한 염색을 보여준다.
도 7a 내지 도 7d는 각각 5 mpk(mg/kg)의 mIgG2a 이소타입 대조군 및 0.2, 1 및 5 mpk(mg/kg)의 항-GITR 21B6 마우스(m) Fc IgG2a에 의해 처리된 개별 마우스의 종양 성장을 보여준다.
도 7e 내지 도 7h는 각각 5 mpk(mg/kg)의 mIgG1 이소타입 대조군, 0.2, 1 및 5 mpk(mg/kg)의 항-GITR 21B6 마우스(m) Fc IgG1에 의해 처리된 개별 마우스의 종양 성장을 보여준다.
도 7i는 IgG1 처리가 이소타입 대조군 처리된 마우스와 비교하여 종양 함유 마우스의 생존을 향상시키지 않았지만, IgG2a 처리는 0.2 mpk, 1 mpk 및 5 mpk에서 각각 40%, 44.4% 및 80% 생존율을 초래하였음을 보여준다.
도 7j는 21B6 mIgG2a에 의해 중재된 종양 성장의 저해가 1 mg/kg 용량에서 CD8+ T 세포 대 Treg의 비의 증가와 상관되었음을 보여준다.
도 7k는 21B6 mIgG2a에 의해 중재된 종양 성장의 저해가 모든 용량에서 CD4+ Teff 세포 대 Treg의 비의 증가와 상관되었음을 보여준다.
도 7l, 도 7m, 및 도 7n은 21B6 mIgG2a 처리된 마우스가 종양-침윤 Treg의 수에 있어서 비-유의적으로 감소된 반면, CD8+ T 세포 및 CD4+ Teff가 영향받지 않았음을 보여준다.
도 7o는 모든 용량의 21B6 mIgG2a가 종양 침윤 CD45+ 면역 세포내에서 Treg의 비율을 감소시켰고, 면역 침윤물중의 Treg의 비율이 21B6 mIgG1 처리에 의해 영향받지 않았음을 보여준다.
도 7p 및 도 7q는 종양 침윤물에서 CD8+ T 세포 및 CD4+ T 효과자 세포의 비율의 변화가 유의적이지 않았음을 보여준다.
도 7r, 도 7s, 및 도 7t는 21B6 mIgG2a 처리된 마우스가 0.2 mg/kg 용량으로 처리된 경우 비장에서 Treg 및 CD4+ Teff 비율이 가장 감소하였고(도 7r 및 도 7t), 다른 용량에서의 변화가 유의적이지 않았음을 보여준다. 비장의 CD8+ T 세포는 어떠한 용량에서도 영향받지 않았다(도 7s).
GITR에 결합하는 항체가 본원에 개시된다. 항-GITR 항체를 제조하는 방법, 이들 항체를 포함하는 조성물, 및 이들 항체를 약제로서 사용하는 방법이 제공된다. 항-GITR 항체는 종양 진행을 저해하기 위해 사용될 수 있고, 암 및/또는 다른 질환의 예방 및/또는 치료에 사용될 수 있다. 본 발명의 항-GITR 항체는 항-종양 면역력을 북돋는 2가지 이상의 기작을 갖고, 이는 다시 종양 퇴행을 초래하는 것으로 나타난다. 제1 기작은 종양에 침윤하는 Treg의 소모에 관한 것이고, 이는 특별히 증진된 T 효과자 세포 활성화에서 국소 면역 활성화를 유도한다. 제2 기작은 T 효과자 세포의 효과자 기능의 직접적인 증진 및 GITR 작용물질로서의 CD8+ 세포의 생존이다. Treg 소모 및 T 효과자 세포 활성화의 조합된 효과는 불응성 종양(cold tumor)에서 T 효과자 대 Treg 비를 증진시키고, 특히 기존의 순응성 항-종양 반응을 갖는 환자에서 종양 퇴행을 유도할 수 있다.
일반적 기법
본 발명의 실행은, 달리 지시되지 않는 한, 당분야의 기술에 속하는 분자 생물학(재조합 기법 포함), 미생물학, 세포 생물학, 생화학, 및 면역학의 통상적 기법을 사용할 것이다. 이러한 기법은 문헌[Molecular Cloning: Laboratory Manual, second edition(Sambrook et al., 1989) Cold Spring Harbor Press];[ Oligonucleotides Synthesis(M.J. Gait, ed., 1984)]; [Methods in Molecular Biology, Humana Press]; [Cell Biology: Laboratory Notebook(J.E. Cellis, ed., 1998) Academic Press]; [Animal Cell Culture(R. I. Freshney, ed., 1987)]; [Introduction to Cell and Tissue Culture(J. P. Mather and P.E. Roberts, 1998) Plenum Press]; [Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures(A. Doyle, J.B. Griffiths, and D.G. Newell, eds., 1993-1998) J. Wiley and Sons]; [Methods in Enzymology(Academic Press, Inc.)]; [Handbook of Experimental Immunology(D.M. Weir and C.C. Blackwell, eds.)]; [Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells(J.M. Miller and M.P. Calos, eds., 1987)]; [Current Protocols in Molecular Biology(F.M. Ausubel et al., eds., 1987)]; [PCR: The Polymerase Chain Reaction(Mullis et al., eds., 1994)]; [Current Protocols in Immunology(J.E. Coligan et al., eds., 1991)]; [Short Protocols in Molecular Biology(Wiley and Sons, 1999)]; [Immunobiology(C.A. Janeway and P. Travers, 1997)]; [Antibodies(P. Finch, 1997)]; [Antibodies: a practical approach(D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989)]; [Monoclonal antibodies: a practical approach(P. Shepherd and C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000)]; [Using antibodies: a laboratory manual(E. Harlow and D. Lane(Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999)]; [The Antibodies(M. Zanetti and J.D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995)] 등에서 충분히 설명된다.
정의
다음의 용어들은, 달리 지시되지 않는 한, 다음의 의미를 갖는 것으로 이해될 것이다: 용어 "단리된 분자"는, 그의 기원 또는 유래되는 공급원에 의하여 (1) 그의 자연 상태에서 그에 수반되는 자연적으로 회합되는 성분들과 회합되지 않거나, (2) 동일한 공급원, 예를 들어, 종, 이것이 발현되는 세포, 라이브러리 등으로부터의 다른 분자가 실질적으로 존재하지 않거나, (3) 상이한 종으로부터 세포에 의해 발현되거나, 또는 (4) 자연에서 발생되지 않는 분자(여기서 분자는, 예를 들면, 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 또는 항체임)를 지칭한다. 이와 같이, 화학적으로 합성되거나 자연적으로 기원되는 세포계와 상이한 세포계에서 발현되는 분자는 그의 천연적으로 회합된 성분들로부터 "단리될" 것이다. 분자는 또한 당분야에 공지된 정제 기법을 사용하여 천연적으로 회합된 성분들이 실질적으로 존재하지 않도록 될 수 있다. 분자 순도 또는 동종성은 당분야에 공지된 다수의 수단에 의해 검정될 수 있다. 예를 들면, 폴리펩티드 샘플의 순도는 당분야에 공지된 기법에 의해 폴리아크릴아미드 겔 전기영동을 사용하고 폴리펩티드를 시각화하는 겔을 염색하여 검정될 수 있다. 특정 목적을 위해, HPLC 또는 정제를 위해 당분야에 공지된 다른 수단을 사용함으로서 더 높은 분해능이 제공될 수 있다.
"항체"는 면역글로불린 분자의 가변성 영역에 위치된, 적어도 하나의 항원 인식 자리를 통해 탄수화물, 폴리뉴클레오티드, 지질, 폴리펩티드 등과 같은 표적에 특이적으로 결합할 수 있는 면역글로불린 분자이다. 본원에서 사용되는 이 용어는 온전한 다중클론성 또는 단일클론성 항체 뿐만 아니라, 별도의 규정이 없는 한, 특이적 결합을 위해 온전한 항체와 경쟁하는 이의 임의의 항원 결합 부분, 항원 결합 부분을 포함하는 융합 단백질, 및 항원 인식 자리를 포함하는 면역글로불린 분자의 임의의 다른 변형된 입체배치를 포괄한다. 항원 결합 부분은, 예를 들면, Fab, Fab', F(ab')2, Fd, Fv, 도메인 항체(dAb, 예를 들어, 상어 및 낙타과 항체), 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하는 단편, 단일 쇄 가변성 단편 항체(scFv), 맥시바디(maxibody), 미니바디(minibody), 인트라바디(intrabody), 디아바디(diabody), 트리아바디(triabody), 테트라바디(tetrabody), v-NAR 및 bis-scFv, 및 폴리펩티드로의 특이적 항원 결합을 제공하기에 충분한 면역글로불린의 적어도 일부를 함유하는 폴리펩티드를 포함한다. 항체는 임의의 부류의 항체, 예컨대 IgG, IgA, 또는 IgM(또는 이의 하위부류)을 포함하고, 항체는 임의의 특별한 부류일 필요는 없다. 면역글로불린은, 그의 중쇄의 불변성 영역의 항체 아미노산 서열에 따라서, 상이한 부류로 나눠질 수 있다. 면역글로불린의 5가지 주요 부류: IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM이 있고, 이들중 몇몇은 추가로 하위부류(이소타입), 예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2로 나뉜다. 면역글로불린의 상이한 부류에 상응하는 중쇄 불변성 영역은 각각 알파, 델타, 엡실론, 감마, 및 뮤로 지칭된다. 상이한 부류의 면역글로불린의 서브유닛 구조 및 3차원 입체배치는 잘 공지되어 있다.
항체의 "가변성 영역"은 항체 경쇄의 가변성 영역 또는 항체 중쇄의 가변성 영역을, 단독으로 또는 조합하여 지칭한다. 당분야에 공지된 바와 같이, 중쇄 및 경쇄의 가변성 영역은 각각 과가변성 영역으로서도 공지된 3개의 상보성 결정 영역(CDR)에 연결된 4개의 골격구조 영역(FR)으로 구성되고, 항체의 항원 결합 자리의 형성에 기여한다. 해당 가변성 영역의 변이체, 특별히 CDR 영역의 바깥쪽(즉, 골격구조 영역)에서 아미노산 잔기의 치환을 갖는 변이체가 요망된다면, 적절한 아미노산 치환, 바람직하게는, 보존적 아미노산 치환은, 해당 가변성 영역과 동일한 전형적 부류에서 CDR1 및 CDR2 서열을 함유하는 다른 항체의 가변성 영역과 해당 가변성 영역을 비교함으로써 식별될 수 있다[코티아(Chothia) 및 레스크(Lesk)의 문헌 "J Mol Biol 196(4): 901-917, 1987"].
특정 실시양태에서, 항체의 결합 자리를 포함하는 잔기의 식별 및 CDR의 확정적 묘사는 항체의 구조를 알아내고/내거나 항체-리간드 복합체의 구조를 알아냄으로써 달성된다. 특정 실시양태에서, 이는 당분야의 숙련가에게 공지된 임의의 다양한 기법, 예컨대 X-선 결정학에 의해 달성될 수 있다. 특정 실시양태에서, 분석의 다양한 방법은 CDR 영역을 식별하거나 이에 접근하기 위해 사용될 수 있다. 특정 실시양태에서, 분석의 다양한 방법은 CDR 영역을 식별하거나 이에 접근하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 방법의 예로는, 제한되지 않지만, 카밧(Kabat) 정의, 코티아(Chothia) 정의, AbM 정의, 접점(contact) 정의, 및 입체배좌적 정의가 포함된다.
카밧 정의는 항체에서 잔기를 넘버링하기 위한 표준법이고, 전형적으로 CDR 영역을 식별하기 위해 사용된다. 예를 들어, 존슨(Johnson) 및 우(Wu)의 문헌[2000, Nucleic Acids Res., 28: 214-8]을 참조한다. 코티아 정의는 카밧 정의와 유사하지만, 코티아 정의는 특정 구조의 루우프(loop) 영역의 위치를 고려한다. 예를 들어, 코티아(Chothia) 등의 문헌[1986, J. Mol. Biol., 196: 901-17]; 코티아(Chothia) 등의 문헌[1989, Nature, 342: 877-83] 참조한다. AbM 정의는 항체 구조물을 모델링하는 옥스포드 몰레큘라 그룹(Oxford Molecular Group)에 의해 생산된 컴퓨터 프로그램의 통합 도구(integrated suite)를 사용한다. 예를 들어, 마르틴(Martin) 등의 문헌[1989, Proc Natl Acad Sci (USA), 86: 9268-9272: "AbM(상표명), 항체의 다양한 영역을 모델링하기 위한 컴퓨터 프로그램(AbM™, Computer Program for Modeling Variable Regions of Antibodies)", Oxford, UK; Oxford Molecular, Ltd.]을 참조한다. AbM 정의는, 예컨대 사무드랄라(Samudrala) 등의 문헌[1999, "조합된 계층적 접근을 사용하는 최초의 단백질 구조 예측(Ab Initio Protein Structure Prediction Using Combined Hierarchical Approach)" PROTEINS, Structure, Function and Genetics Suppl., 3: 194-198]에 기재된 최초의(ab initio) 방법 및 지식 데이터베이스의 조합을 사용하는 1차 서열로부터 항체의 3급 구조물을 모델링한다. 접점 정의는 이용가능한 복합체 결정 구조의 분석에 기초한다. 예를 들어, 맥칼룸(MacCallum) 등의 문헌[1996, J. Mol. Biol., 5: 732-45]을 참조한다. CDR의 "입체배좌적 정의"로서 본원에 지칭된 또 다른 접근법에서, CDR의 위치는 항원 결합에 엔탈피를 기여하게 만드는 잔기로서 식별될 수 있다. 예를 들어, 마카베(Makabe) 등의 문헌[2008, Journal of Biological Chemistry, 283: 1156-1166]을 참조한다. 또 다른 CDR 경계 정의는 상기 접근법중 하나를 엄격히 따르지 않을 것이고, 그렇더라도 카밧 CDR의 적어도 일부와 겹칠 것이지만, 이들은, 특별한 잔기 또는 잔기의 그룹이 항원 결합에 그다지 영향을 주지 않는다는 예측 또는 실험적 발견의 견지에서 단축되거나 길어질 수 있다. 본원에서 사용되는 CDR은 접근법들의 조합을 포함하여 당분야에 공지된 임의의 접근법에 의해 정의된 CDR을 지칭할 수 있다. 본원에 사용된 방법은 임의의 이들 접근법에 따라 정의되는 CDR을 이용할 수 있다. 하나 보다 많은 CDR을 함유하는 임의의 제공된 실시양태의 경우, CDR은 카밧 정의, 코티아 정의, 연장된 정의, AbM 정의, 접점 정의, 및/또는 입체배좌적 정의중 임의의 정의에 따라 정의될 수 있다.
당분야에 공지된 바와 같이, 항체의 "불변성 영역"은 항체 경쇄의 불변성 영역 또는 항체 중쇄의 불변성 영역을 단독으로 또는 조합하여 지칭한다.
본원에서 사용되는 "단일클론성 항체"는 실질적으로 동종성 항체의 집단으로부터 수득된 항체를 지칭하고, 즉, 집단을 이루는 개별 항체는 소량으로 존재할 수 있는 가능한 자연-발생 돌연변이를 제외하고는 동일하다. 단일클론성 항체는 매우 특이적이고, 단일 항원성 자리에 대하여 인도된다. 게다가, 전형적으로 상이한 결정인자(에피토프)에 대하여 인도되는 항체를 포함하는 다중클론성 항체 제조물과 대조적으로, 각각의 단일클론성 항체는 항원상의 단일 결정인자에 대하여 인도된다. 수식어 "단일클론성"은 항체의 실질적으로 동종성인 집단으로부터 수득될 경우의 항체 특징을 지시하고, 임의의 특별한 방법에 의해 항체를 생산할 필요성으로서 해석되어서는 안된다. 예를 들면, 본 발명에 따라서 사용되는 단일클론성 항체는 코흘러(Kohler) 및 밀스타인(Milstein)의 문헌[1975, Nature 256: 495]에 의해 최초로 기재된 하이브리도마 방법에 의해 제조될 수 있거나, 또는 예컨대 미국 특허 제4,816,567호에 기재된 재조합 DNA 방법에 의해 제조될 수 있다. 단일클론성 항체는 또한 예를 들면 맥카퍼티(McCafferty) 등의 문헌[1990, Nature 348: 552-554]에 기재된 기법을 사용하여 생성된 파아지 라이브러리로부터 단리될 수 있다. 본원에서 사용되는 "인간화된" 항체는 비-인간 면역글로불린으로부터 유래된 최소한의 서열을 함유하는 키메라성 면역글로불린, 면역글로불린 쇄, 또는 이의 단편(예컨대 항체의 Fv, Fab, Fab', F(ab')2 또는 기타 항원-결합 하위서열)인 비-인간(예를 들어 뮤린) 항체를 지칭한다. 바람직하게는, 인간화된 항체는, 수여자의 CDR로부터의 잔기가 원하는 특이성, 친화도 및 수용력을 갖는 비-인간 종류(공여자 항체), 예컨대 마우스, 래트, 또는 토끼의 CDR로부터의 잔기에 의해 대체되는 인간 면역글로불린(수여자 항체)이다. 인간화된 항체는 수여자 항체 뿐만 아니라 들여온 CDR 또는 골격구조 서열에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있지만, 항체 성능을 추가로 개선시키고 최적화하기 위해 포함된다.
"인간 항체"는 인간에 의해 생산된 항체의 아미노산 서열에 상응하는 아미노산 서열을 소유하고/하거나 본원에 개시된 바와 같은 인간 항체를 제조하기 위한 임의의 기법을 사용하여 제조될 수 있는 항체이다. 인간 항체의 이러한 정의는 비-인간 항원 결합 잔기를 포함하는 인간화된 항체를 특정적으로 배제한다.
용어 "키메라성 항체"는 가변성 영역 서열이 하나의 종으로부터 유래되고 불변성 영역 서열이 또 다른 종으로부터 유래되는 항체를 지칭하고자 하고, 예컨대 가변성 영역 서열이 마우스 항체로부터 유래되고 불변성 영역 서열이 인간 항체로부터 유래되는 항체이다.
용어 "에피토프"는 하나 이상의 항체의 항원-결합 영역에서 항체에 의해 인식되고 이에 의해 결합될 수 있는 분자의 부분을 지칭한다. 에피토프는 종종 분자, 예컨대 아미노산 또는 당 측쇄의 표면 분류로 구성되고, 특이적인 3차원 구조적 특징 뿐만 아니라 특이적 하전 특징을 갖는다. 몇몇 실시양태에서, 에피토프는 단백질 에피토프일 수 있다. 단백질 에피토프는 선형이거나 입체배좌를 가질 수 있다. 선형 에피토프에서, 단백질 및 상호작용 분자(예컨대 항체) 사이의 상호작용의 모든 지점은 단백질의 주요 아미노산 서열에 따라 선형으로 발생한다. "비선형 에피토프" 또는 "입체배좌 에피토프"는 에피토프에 특이적인 항체가 결합하는 항원성 단백질내에 인접하지 않은 폴리펩티드(또는 아미노산)을 포함한다. 본원에서 사용되는 용어 "항원성 에피토프"는 당분야에 공지된 임의의 방법, 예를 들면, 통상적 면역검정에 의해 결정될 경우 항체가 특이적으로 결합할 수 있는 항원의 부분으로서 정의된다. 일단 항원 상의 원하는 에피토프가 결정되면, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 기법을 사용하여 그러한 에피토프에 대한 항체를 생성하는 것이 가능하다. 다르게는, 발견 과정 동안, 항체의 생성 및 특징결정은 원하는 에피토프에 대한 정보를 설명할 수 있다. 이러한 정보로부터, 동일한 에피토프로의 결합에 대하여 항체를 경쟁적으로 스크리닝할 수 있다. 이를 달성하기 위한 접근법은 GITR에 결합하기 위해 서로 경쟁하거나 교차-경쟁하는 항체를 밝혀내기 위한 경쟁 및 교차-경쟁 연구를 수행하는 것이고, 예를 들어, 항체는 항원에 결합하기 위해 경쟁한다.
본원에서 사용되는 용어 "GITR"은 GITR의 임의의 형태, 및 GITR의 활성의 적어도 일부를 보유하는 이의 변이체를 지칭한다. 다르게 지시되지 않는 한, 예컨대 인간 GITR에 대하여 구체적으로 언급하지 않는 한, GITR은 모든 포유동물 종, 예를 들어, 인간, 개, 고양이, 말, 및 소의 고유의 서열 GITR를 포함한다. 하나의 예시적인 인간 GITR은 유니프롯(Uniprot) 등록번호 Q9Y5U5(서열 번호 108)로서 발견된다.
용어 "작용물질"은 또 다른 분자의 생물학적 활성 또는 효과를 촉진시키는(즉 유도하거나, 일으키거나, 증진시키거나, 또는 증가시키는) 물질을 지칭한다. 용어 작용물질은 수용체, 예컨대 항체에 결합하는 물질, 및 수용체에 결합하지 않고 이의 기능을 촉진시키는(예를 들어, 연결된 단백질을 활성화시킴으로써) 물질을 포괄한다.
용어 "길항물질 항체"는 표적에 결합하여 이러한 표적의 생물학적 효과를 방지하거나 감소시키는 항체를 지칭한다. 몇몇 실시양태에서, 이 용어는 이들이 결합하는 표적이 생물학적 기능을 수행하지 못하도록 방지하는 항체를 나타낸다.
용어 "폴리펩티드", "올리고펩티드", "펩티드" 및 "단백질"은 임의의 길이의 아미노산 쇄를 지칭하기 위해 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 쇄는 선형 또는 분지형일 수 있고, 이는 변형된 아미노산을 포함하고/하거나 비-아미노산에 의해 중단될 수 있다. 이 용어는 또한 자연적으로 또는 개입; 예를 들면, 디설파이드 결합 형성, 글리코실화, 지질화, 아세틸화, 인산화, 또는 임의의 다른 조작 또는 변형, 예컨대 표지화 성분과의 컨주게이션(conjugation)에 의해 변형된 아미노산 쇄를 포괄한다. 또한 이러한 정의에, 예를 들면, 아미노산의 하나 이상의 유사체(예를 들면, 비천연 아미노산 등), 뿐만 아니라 당분야에 공지된 다른 변형을 함유하는 폴리펩티드가 포함된다. 폴리펩티드는 단일 쇄로서 또는 회합된 쇄로서 발생될 수 있는 것으로 이해된다.
당분야에 공지된 바와 같이, 본원에서 상호교환적으로 사용되는 "폴리뉴클레오티드", 또는 "핵산"은 임의의 길이의 뉴클레오티드의 쇄를 지칭하고, DNA 또는 RNA를 포함한다. 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드, 리보뉴클레오티드, 변형된 뉴클레오티드 또는 염기, 및/또는 이들의 유사체, 또는 DNA 또는 RNA 폴리머라아제(polymerase)에 의해 쇄내로 혼입될 수 있는 임의의 기질일 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오티드, 예컨대 메틸화된 뉴클레오티드 및 이들의 유사체를 포함할 수 있다. 존재한다면, 뉴클레오티드 구조에 대한 변형은 쇄의 조립 이전 및 이후에 부여될 수 있다. 뉴클레오티드의 서열은 비-뉴클레오티드 성분에 의해 중단될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는, 예컨대 표지화 성분과의 컨주게이션에 의해 중합 이후에 추가로 변형될 수 있다. 변형의 다른 유형으로는, 예를 들면, "캡(cap)", 하나 이상의 자연 발생 뉴클레오티드의 유사체에 의한 치환, 뉴클레오티드간의 변형, 예컨대, 예를 들면, 하전되지 않은 연결기(예를 들어, 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포아미데이트, 카바메이트 등) 및 하전된 연결기(예를 들어, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)에 의한 변형, 펜던트 부분(moiety), 예컨대, 예를 들면, 단백질[예를 들어, 뉴클레아제(nuclease), 독소, 항체, 신호 펩티드, 폴리-L-라이신 등]을 함유하는 변형, 삽입제[예를 들어, 아크리딘(acridine), 소랄렌(psoralen) 등]에 의한 변형, 킬레이트제(예를 들어, 금속, 방사성 금속, 붕소, 산화 금속 등)를 함유하는 변형, 알킬화제를 함유하는 변형, 변형된 연결기(예를 들어, 알파 아노머성(anomeric) 핵산 등)에 의한 변형, 뿐만 아니라 폴리뉴클레오티드(들)의 변형되지 않은 형태가 포함된다. 추가로, 당분에 보통 존재하는 임의의 하이드록실 기는, 예를 들면, 포스포네이트 기, 포스페이트 기에 의해 대체되거나, 표준 보호기에 의해 보호되거나, 또는 활성화되어 추가의 연결기를 추가의 뉴클레오티드에 제공할 수 있거나, 또는 고체 지지체에 컨주게이션될 수 있다. 5' 및 3' 말단 OH는 인산화되거나, 또는 탄소수 1 내지 20의 유기 캡핑기(capping group) 부분 또는 아민에 의해 치환될 수 있다. 다른 하이드록실은 또한 표준 보호기로 유도체화될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 또한 당분야에 일반적으로 공지된 리보스 또는 데옥시리보스 당의 유사 형태, 예를 들면, 2'-O-메틸-, 2'-O-알릴, 2'-플루오로- 또는 2'-아지도-리보스, 카복실 당 유사체, 알파- 또는 베타-아노머성 당, 에피머성 당, 예컨대 아라비노스, 자일로스 또는 릭소오스, 피라노스 당, 퓨라노스 당, 세도헵툴로스, 아크릴계 유사체 및 무염기 뉴클레오시드 유사체, 예컨대 메틸 리보시드를 함유할 수 있다. 하나 이상의 포스포디에스테르 연결기는 대안의 연결기로 대체될 수 있다. 이들 대안의 연결기로는, 제한되지 않지만, 포스페이트가 P(O)S("티오에이트"), P(S)S("디티오에이트"), (O)NR2("아미데이트"), P(O)R, P(O)OR', CO 또는 CH2("포름아세탈")로 대체되는 실시양태가 포함되고, 여기서 R 또는 R'는 각각 독립적으로 H 또는 치환되거나 비치환된 알킬(1-20C)이고, 임의적으로 (-O-) 연결기, 아릴, 알케닐, 사이클로알킬, 사이클로알케닐 또는 아르알킬을 함유한다. 폴리뉴클레오티드중 모든 연결기가 동일할 필요는 없다. 이전의 설명은 RNA 및 DNA를 포함하여 본원에 지칭된 모든 폴리뉴클레오티드에 적용된다.
에피토프에 "우선적으로 결합하는" 또는 "특이적으로 결합하는"(본원에서 상호교환적으로 사용됨) 항체는 당분야에 잘 이해되어진 용어이고, 이러한 특이적이거나 우선적인 결합을 결정하는 방법 또한 당분야에 잘 공지되어 있다. 분자는, 이것이 다른 세포 또는 물질에 비해 특별한 세포 또는 물질에 더욱 빈번히, 더욱 신속히, 더 긴 기간으로, 및/또는 더 큰 친화도로 반응하거나 회합된다면, "특이적 결합" 또는 "우선적 결합"을 나타낸다고 일컬어 진다. 항체는, 이것이 다른 물질에 결합하는 것에 비해 더 큰 친화도, 결합력으로, 더욱 신속히, 및/또는 더 긴 기간 동안 결합한다면, 표적에 "우선적으로 결합하거나" 또는 "특이적으로 결합한다". 예를 들면, GITR 에피토프에 특이적으로 또는 우선적으로 결합하는 항체는, 다른 GITR 에피토프 또는 비-GITR 에피토프에 결합하는 것에 비해 더 큰 친화도, 결합력으로, 더욱 신속히, 및/또는 더 긴 기간 동안 GITR 에피토프에 결합하는 항체이다. 이는 또한, 예를 들면, 제1 표적에 특이적으로 또는 우선적으로 결합하는 항체(또는 부분 또는 에피토프)가 제2 표적에 특이적으로 또는 우선적으로 결합하거나 하지 않을 수 있다는 이러한 정의를 통해 이해될 것이다. 이처럼, "특이적 결합" 또는 "우선적 결합"은 독점적 결합을 반드시 필요로 하는 것은 아니다(이는 포함될 수도 있음). 일반적으로, 필수적인 것은 아니지만, 결합에 대한 언급은 우선적 결합을 의미한다.
본원에서 사용되는 "실질적으로 순수한"은 적어도 50% 순수하고(즉, 오염물이 없음), 더욱 바람직하게는, 적어도 90% 순수하고, 더욱 바람직하게는, 적어도 95% 순수하고, 역시 더욱 바람직하게는, 적어도 98% 순수하고, 가장 바람직하게는, 적어도 99% 순수한 물질을 지칭한다.
용어 "숙주 세포"는 폴리뉴클레오티드 삽입물의 혼입을 위한 벡터(들)에 대한 수여자일 수 있거나 수여자인 개별 세포 또는 세포 배양액을 포함한다. 숙주 세포는 단일 숙주 세포의 자손을 포함하고, 이러한 자손은 자연적, 우연적, 또는 고의적 돌연변이에 기인하여 본래의 모 세포에 대해 완전히 동일해야할 필요는 없다(형태 또는 게놈 DNA 보체에 있어서). 숙주 세포는 본 발명의 폴리뉴클레오티드(들)에 의해 생체내 형질감염된 세포를 포함한다.
당분야에 공지된 바와 같이, 용어 "Fc-영역"은 면역글로불린 중쇄의 C-말단 영역을 정의하기 위해 사용된다. "Fc 영역"은 고유의 서열 Fc 영역 및 변형 Fc 영역일 수 있다. 면역글로불린 중쇄의 Fc 영역의 경계가 다양할 수 있지만, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 대체적으로 Cys226 위치에서의 아미노산 잔기로부터, 또는 Pro230으로부터 이의 카복실-말단으로 연장되는 것으로 정의된다. Fc 영역에서 잔기의 넘버링은, 카밧(Kabat, E.A.) 등의 문헌[Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1991]에 기재된 바와 같은, EU 지수의 넘버링이다. 면역글로불린의 Fc 영역은 일반적으로 2개의 불변성 도메인, CH2 및 CH3을 포함한다. 당분야에 공지된 바와 같이, Fc 영역은 이량체 또는 단량체 형태로 존재할 수 있다.
당분야에서 사용되는 "Fc 수용체" 및 "FcR"은 항체의 Fc 영역에 결합하는 수용체를 설명한다. 바람직한 FcR은 고유의 서열 인간 FcR이다. 게다가, 바람직한 FcR은 IgG 항체(감마 수용체)에 결합하고 FcγRI, FcγRII, 및 FcγRIII 하위부류의 수용체를 포함(대립형질 변이체, 및 이들 수용체로부터 다르게 스플라이싱된 형태를 포함함)하는 것이다. FcγRII 수용체로는 FcγRIIA("활성화 수용체") 및 FcγRIIB("저해 수용체")가 포함되고, 이는 주로 이의 세포질 도메인에서 차이가 나는 유사한 아미노산 서열을 갖는다. FcR은 라베취(Ravetch) 및 키넷(Kinet)의 문헌[1991, Ann. Rev. Immunol., 9: 457-92]; 카펠(Capel) 등의 문헌[1994, Immunomethods, 4: 25-34]; 및 데 하스(de Haas) 등의 문헌[1995, J. Lab. Clin. Med., 126:330-41]에 검토되어 있다. "FcR"은 또한 모 IgG를 태아에게 전달하는데 책임이 있는 신생아 수용체, FcRn을 포함한다[구이어(Guyer) 등의 문헌 "1976, J. Immunol., 117: 587"; 및 김(Kim) 등의 문헌 "1994, J. Immunol., 24: 249"].
용어 "경쟁"은, 항체와 관련하여 본원에서 사용될 경우, 제1 항체와 그의 동족 에피토프의 결합 결과가 제2 항체의 부재하의 제1 항체의 결합과 비교하여 제2 항체의 존재하에 검출가능하게 감소하도록, 제1 항체, 또는 이의 항원-결합 부분이 제2 항체, 또는 이의 항원-결합 부분의 결합과 충분히 유사한 방식으로 에피토프에 결합함을 의미한다. 제2 항체의 그의 에피토프로의 결합이 제1 항체의 존재하에 또한 검출가능하게 감소되는 다른 상황이 가능하지만 반드시 그럴 필요는 없다. 즉, 제2 항체가 제1 항체의 그의 개개의 에피토프로의 결합을 저해하지 않으면서도, 제1 항체는 제2 항체가 그의 에피토프에 결합하는 것을 저해할 수 있다. 그러나, 각각의 항체가 나머지 항체의 그의 동족 에피토프 또는 리간드로의 결합을 저해하는 경우, 동일하거나, 더 크거나, 또는 더 적은 정도와는 무관하게, 항체는 이들 개개의 에피토프(들)의 결합에 대해 서로 "교차-경쟁"하는 것으로 일컬어 진다. 경쟁 및 교차-경쟁 항체는 둘 다 본 발명에 포괄된다. 이러한 경쟁 또는 교차-경쟁이 발생되는 기작(예를 들어, 입체 장해, 입체배좌적 변화, 또는 공통의 에피토프, 또는 이의 부분으로의 결합)과 무관하게, 숙련가라면 본원에 제공된 교시에 기초하여 이러한 경쟁 및/또는 교차-경쟁 항체가 포괄되고 본원에 개시된 방법을 위해 유용할 수 있음을 인식할 것이다.
"기능성 Fc 영역"은 고유의 서열 Fc 영역의 적어도 하나의 효과자 기능을 갖는다. 예시적인 "효과자 기능"은 C1q 결합; 보체 의존성 세포독성; Fc 수용체 결합; 항체-의존성 세포-중재된 세포독성; 식세포작용; 세포 표면 수용체(예를 들어 B 세포 수용체)의 하향-조절 등을 포함한다. 이러한 효과자 기능은 일반적으로 결합 도메인(예를 들어 항체 가변성 도메인)과 조합되는 Fc 영역을 필요로 하고, 이러한 항체 효과자 기능을 평가하기 위해 당분야에 공지된 다양한 검정을 사용하여 평가될 수 있다.
"고유의 서열 Fc 영역"은 자연에서 발견되는 Fc 영역의 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 포함한다. "변형 Fc 영역"은 적어도 하나의 아미노산 변형에 의해 고유의 서열 Fc 영역의 아미노산 서열과 상이한 아미노산 서열을 포함하지만, 여전히 고유의 서열 Fc 영역의 적어도 하나의 효과자 기능을 보유한다. 바람직하게는, 변형 Fc 영역은 고유의 서열 Fc 영역 또는 모 폴리펩티드의 Fc 영역과 비교하여 적어도 하나의 아미노산 치환, 예를 들어 약 1 내지 약 10개의 아미노산 치환, 바람직하게는, 약 1 내지 약 5개의 아미노산 치환을 고유의 서열 Fc 영역 또는 모 폴리펩티드의 Fc 영역에 갖는다. 변형 Fc 영역은 본원에서 바람직하게는 고유의 서열 Fc 영역 및/또는 모 폴리펩티드의 Fc 영역과 적어도 약 80%의 서열 동일성을 갖고, 가장 바람직하게는, 이들과 적어도 약 90% 서열 동일성, 더욱 바람직하게는, 이들과 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%의 서열 동일성을 갖는다.
본원에서 사용되는 "치료"는 유리한 또는 원하는 임상적 결과를 수득하기 위한 접근법이다. 본 발명의 목적을 위하여, 유리한 또는 원하는 임상적 결과는, 제한되지 않지만, 다음중 하나 이상을 포함한다: 신생의 또는 암성 세포의 증식 감소(또는 파괴), 신생 세포 전이의 저해, 종양 크기의 수축 또는 감소, 암의 차도, 암으로부터 야기된 증후의 감소, 암으로 고통받는 사람의 삶의 품질 증가, 암을 치료하기 위해 필요한 다른 약 용량의 감소, 암 진행의 지연, 암 치유, 및/또는 암 환자의 생존 연장.
"개선"은 항-GITR 항체를 투여하지 않은 경우와 비교하여 하나 이상의 증후의 경감 또는 향상을 의미한다. "개선"은 또한 증후의 기간의 단축 또는 감소를 포함한다.
본원에서 사용되는 약물, 화합물, 또는 약학 조성물의 "효과적 투여량" 또는 "효과량"은 임의의 하나 이상의 유리한 또는 원하는 결과에 영향을 주기에 충분한 양이다. 더욱 구체적인 양태에서, 효과량은 질환의 중후를 예방, 완화 또는 개선하고/하거나, 치료되는 피험체의 생존을 연장시킨다. 예방학적 사용의 경우, 유리한 또는 원하는 결과는 질환의 생화학적, 조직학적 및/또는 행동학적 증후, 그의 합병증, 및 질환의 발달동안 나타나는 중간 병리학적 표현형을 포함하여 질환의 위험을 제거 또는 감소시키거나, 그의 위중성을 줄이거나, 또는 그의 개시를 지연시킴을 포함한다. 치료학적 사용의 경우, 유리한 또는 원하는 결과는 예를 들면 제한없이, B-세포 관련된 암, 위암, 소장암, 육종, 두경부암, 흉선암, 상피암, 침샘암, 간암, 담즙암, 신경내분비 종양, 위점막암, 갑상선암, 폐암, 중피종, 난소암, 유방암, 전립선암, 식도암, 췌장암, 신경교종, 신장암(예를 들어, 신장 세포 암종), 방광암, 경부암, 자궁암, 외음부암, 음경암, 고환암, 항문암, 융모암종, 대장암, 구강암, 피부암, 메르켈 세포 암종, 교모세포종, 뇌종양, 골암, 안암, 및 흑색종을 비롯한 암과 같은 질환의 하나 이상의 증후를 경감시키고, 이들 질환을 치료하기 위해 필요한 다른 약제의 용량을 감소시키고, 또 다른 약제의 효과를 증진시키고/거나, 환자에서 암의 진행을 지연시키는 것과 같은 임상적 결과를 포함한다. 효과적 투여량은 1회 이상의 투여로 투여될 수 있다. 본 발명의 목적을 위해, 약물, 화합물, 또는 약학 조성물의 효과적 투여량은 예방학적 또는 치료학적 처리를 직접적으로 또는 간접적으로 달성하기 위해 충분한 양이다. 임상적 맥락에서 이해되는 바와 같이, 약물, 화합물, 또는 약학 조성물의 효과적 투여량은 또 다른 약물, 화합물, 또는 약학 조성물과 협력하여 달성되거나 달성되지 않을 수 있다. 이와 같이, "효과적 투여량"은 하나 이상의 치료제를 투여함과 관련하여 고려될 수 있고, 단일 제제는, 만일 하나 이상의 다른 제제와 함께 원하는 결과가 달성될 수 있거나 달성된다면, 효과량으로 제공된 것으로 고려될 수 있다.
"개체" 또는 "피험체"는 포유동물이고, 더욱 바람직하게는, 인간이다. 포유동물은 또한, 제한되지 않지만, 농장 동물(예를 들어, 소, 돼지, 말, 닭 등), 스포츠 동물, 애완 동물, 영장류, 말, 개, 고양이, 마우스, 및 래트를 포함한다.
본원에 사용되는 "벡터"는 숙주 세포에서 관심있는 하나 이상의 유전자(들) 또는 서열(들)을 전달하고, 바람직하게는 발현할 수 있는 작성물을 의미한다. 벡터의 예로는, 제한되지 않지만, 바이러스성 벡터, 네이키드(naked) DNA 또는 RNA 발현 벡터, 플라스미드, 코스미드(cosmid) 또는 파아지 벡터, 양이온성 축합제에 의해 결합된 DNA 또는 RNA 발현 벡터, 리포솜에 캡슐화된 DNA 또는 RNA 발현 벡터, 및 특정 진핵 세포, 예컨대 생산자 세포가 포함된다.
본원에서 사용되는 "발현 제어 서열"은 핵산의 전사를 지시하는 핵산 서열을 의미한다. 발현 제어 서열은 프로모터, 예컨대 항시성 또는 유도성 프로모터, 또는 인헨서일 수 있다. 발현 제어 서열은 전사되는 핵산 서열에 작동적으로 연결된다.
본원에서 사용되는 "약학적으로 허용가능한 담체" 또는 "약학적으로 허용가능한 부형제"는, 활성 구성성분과 조합될 경우, 구성성분이 생물학적 활성을 보유하도록 허용하고, 피험체의 면역계와는 비-반응성인 임의의 물질을 포함한다. 예로는, 제한되지 않지만, 임의의 표준 약학 담체, 예컨대 인산염 완충된 식염수, 물, 유화액, 예컨대 오일/물 유화액, 및 다양한 유형의 습윤제가 포함된다. 에어로졸 또는 비경구 투여를 위한 바람직한 희석제는 인산염 완충된 식염수(PBS) 또는 일반(0.9%) 식염수이다. 이러한 담체를 포함하는 조성물은 공지된 통상적 방법에 의해 제형화된다[예를 들면, 레밍턴(Remington)의 문헌 "Pharmaceutical Sciences, 18th edition, A. Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990"; 및 레밍턴(Remington)의 문헌 "The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed. Mack Publishing, 2000" 참조].
용어 "효과자 기능"은 항체의 Fc-영역에 기여할 수 있는 생물학적 활성을 지칭한다. 항체 효과자 기능의 예로는, 제한되지 않지만, 항체-의존성 세포-중재된 세포독성(ADCC), Fc 수용체 결합, 보체 의존성 세포독성(CDC), 식세포작용, C1q 결합, 및 세포 표면 수용체(예를 들어 B-세포 수용체; BCR)의 하향-조절이 포함된다. 예를 들어, 미국 특허 제6,737,056호를 참조한다. 이러한 효과자 기능은 일반적으로 결합 도메인(예를 들어, 항체 가변성 도메인)과 조합되는 Fc 영역을 필요로 하고, 이러한 항체 효과자 기능을 평가하기 위한 당분야에 공지된 다양한 검정을 사용하여 평가될 수 있다. 효과자 기능의 예시적인 측정은 Fcγ3 및/또는 C1q 결합을 통해서이다.
본원에서 사용될 경우 "항체-의존성 세포-중재된 세포독성" 또는 "ADCC"는 Fc 수용체(FcR)를 발현하는 비특이적 세포독성 세포(예를 들어 천연 킬러(NK) 세포, 호중구, 및 대식세포)가 표적 세포 상에 결합된 항체를 인식하고 후속적으로 표적 세포의 용해를 일으키는 세포-중재된 반응을 지칭한다. 관심있는 분자의 ADCC 활성은 시험관내 ADCC 검정, 예컨대 미국 특허 제5,500,362호 또는 제5,821,337호에 기재된 검정을 사용하여 평가될 수 있다. 이러한 검정에 유용한 효과자 세포로는 말초 혈액 단핵 세포(PBMC) 및 NK 세포가 포함된다. 다르게는, 또는 추가적으로, 관심있는 분자의 ADCC 활성은 생체내에서, 예를 들어, 클라이네스(Clynes) 등의 문헌[1998, PNAS(USA), 95: 652-656]에 개시된 바와 같은 동물 모델에서 평가될 수 있다.
"보체 의존성 세포독성" 또는 "CDC"는 보체의 존재하에서 표적의 용해를 지칭한다. 보체 활성화 경로는 보체 시스템(C1q)의 제1 성분이 동족 항원과 착화된 분자(예를 들어 항체)에 결합함으로써 개시된다. 보체 활성화를 평가하기 위해, 예를 들어 가차노-산토로(Gazzano-Santoro) 등의 문헌[J. Immunol. Methods, 202: 163 (1996)]에 기재된 바와 같은 CDC 검정이 수행될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "kon" 또는 "ka"는 항체의 항원으로의 회합에 대한 속도 상수를 지칭한다. 구체적으로, 이러한 속도 상수(kon 또는 ka 및 koff 또는 kd) 및 평형 해리 상수는 전체 항체(즉, 2가) 및 단량체성 GITR 단백질을 사용하여 측정된다.
본원에서 사용되는 용어 "koff" 또는 "kd"는 항체/항원 복합체로부터의 항체의 해리에 대한 속도 상수를 지칭한다.
본원에서 사용되는 용어 "KD"는 항체-항원 상호작용의 평형 해리 상수를 지칭한다.
본원에서 수치 또는 매개변수에 대한 "약" 이라는 언급은 그러한 수치 또는 매개변수 그 자체를 지시하는 실시양태를 포함(및 설명)한다. 예를 들면, "약 X"를 언급하는 설명은 "X"에 대한 설명을 포함한다. 수치 범위는 그 범위를 한정하는 수를 포함한다. 일반적으로 말해서, 용어 "약"은 변수의 지시된 값, 및 지시된 값의 실험적 오차내(예를 들어 평균에 대한 95% 신뢰 구간 이내) 또는 아무리 크더라도 지시된 값의 10 퍼센트 이내의 변수의 모든 값을 지칭한다. 용어 "약"이 시간 간격(연, 개월, 주, 일 등)의 맥락에서 사용되는 경우, 용어 "약"은 시간 간격 ± 그 다음의 하위 시간 간격의 양을 의미하거나(예를 들어 약 1 년은 11 내지 13 개월을 의미하고; 약 6 개월은 6 개월 ± 1 주를 의미하며; 약 1 주는 6 내지 8 일을 의미하는 등임), 또는 아무리 크더라도 지시된 값의 10 퍼센트 이내이다.
용어 "면역-효과자-세포 증진인자" 또는 "IEC 증진인자"는 포유동물의 하나 이상의 유형의 면역 효과자 세포의 수, 품질 또는 기능을 증가시키거나 증진시킬 수 있는 물질을 지칭한다. 면역 효과자 세포의 예로는 세포용해성 CD8 T 세포, CD4 T 세포, NK 세포, 및 B 세포를 포함한다.
용어 "면역 조절인자"는 숙주 포유동물의 선천적, 체액성 또는 세포성 면역계의 임의의 성분의 면역 반응(본원에 기재된 바와 같음) 또는 작업을 변경(예를 들어 저해, 감소, 증가, 증진, 또는 자극)시킬 수 있는 물질을 지칭한다. 이와 같이, 용어 "면역 조절인자"는 본원에 정의된 바와 같은 "면역-효과자-세포 증진인자" 및 본원에 정의된 바와 같은 "면역-억제성-세포 저해제", 뿐만 아니라 포유동물의 면역계의 다른 성분들에 영향을 줄 수 있는 물질을 포괄한다.
용어 "면역 반응"은 숙주 포유동물의 면역계에 의한 특별한 물질에 대한 임의의 검출가능한 반응, 예컨대 선천적 면역 반응[예를 들어, Toll 수용체 신호발송 캐스캐이드(cascade)의 활성화], 세포-중재된 면역 반응(예를 들어, 면역계의 T 세포, 예컨대 항원-특이적 T 세포, 및 비-특이적 세포에 의해 중재되는 반응), 및 체액성 면역 반응(예를 들어, B 세포에 의해 중재되는 반응, 예컨대 혈장, 림프 및/또는 조직 유체내로의 항체의 분비 및 생성)을 지칭한다.
용어 "면역원성"은, 보조제의 존재 또는 부재하에, 단독으로 사용되든지 담체에 연결되든지와 무관하게, 특별한 항원에 대하여, 면역 반응을 일으키거나, 야기하거나, 자극하거나 또는 유도하거나, 또는 이미 존재하는 면역 반응을 향상시키거나, 증진시키거나, 증가시키거나 또는 연장시키는 물질의 능력을 지칭한다.
용어 "면역-억제성-세포 저해제" 또는 "ISC 저해제"는 포유동물의 면역 억제성 세포의 수 또는 기능을 감소 또는 억제시킬 수 있는 물질을 지칭한다. 면역 억제성 세포의 예로는 조절성 T 세포("Treg"), 골수-유래 억제제 세포, 및 종양-연관된 대식세포가 포함된다.
인간을 비롯한 포유동물에 물질을 투여함과 관련하여, 용어 "피내 투여" 또는 "피내로 투여된"은 포유동물의 피부의 진피 층내로의 물질의 전달을 지칭한다. 포유동물의 피부는 표피 층, 진피 층, 및 피하 층으로 구성된다. 표피는 피부의 외부 층이다. 피부의 중간 층인 진피는 신경 말단, 땀샘 및 유선(피지선), 모공, 및 혈관을 포함한다. 피하 층은 더 큰 혈관과 신경을 수용하는 연결 조직 및 지방으로 구성된다. 피내 투여와 대조적으로, "피하 투여"는 피하 층내로의 물질의 투여를 지칭하고, "국부 투여"는 피부의 표면 상으로의 물질의 투여를 지칭한다.
용어 "신생 질환"은 세포가 비정상적으로 높고 제어되지 않는 속도로 증식하는 증상을 지칭하고, 이러한 속도는 주변의 정상 조직의 속도를 초과하고 조화를 이루지 않는다. 이는 대체적으로 고체 병변 또는 "종양"으로서 공지된 덩어리를 만들어 낸다. 이러한 용어는 양성 및 악성 신생 질환을 포괄한다. 본원에서 용어 "암"과 상호교환적으로 사용되는 "악성의 신생 질환"은, 신체의 다른 위치로 퍼지는 종양 세포의 능력("전이"로서 공지됨)을 특징으로 하는 신생 질환을 지칭한다. 용어 "양성의 신생 질환"은 종양 세포가 전이되는 능력이 결핍된 신생 질환을 지칭한다.
용어 "예방하는" 또는 "예방하다"는 (a) 질환이 발병되는 것을 막거나, (b) 질환의 개시 또는 질환의 증후의 개시를 지연시킴을 지칭한다.
용어 "종양-연관된 항원" 또는 "TAA"는 종양 세포에 의해 특이적으로 발현되거나, 또는 동일한 조직 유형의 비-종양 세포에 비해 종양 세포에 의해 더 높은 빈도 또는 밀도로 발현되는 항원을 지칭한다. 종양-연관된 항원은 숙주에 의해 정상적으로 발현되지 않는 항원일 수 있거나; 이들은 돌연변이되거나, 절단되거나(truncated), 잘못 절첩되거나(misfolded), 또는 다르게는 숙주에 의해 정상적으로 발현된 분자의 비정상적인 징후일 수 있거나; 이들은 정상적으로 발현되지만 비정상적으로 높은 수준에서 발현되는 분자와 동일할 수 있거나; 또는 이들은 비정상적인 상황 또는 환경에서 발현될 수 있다. 종양-연관된 항원은, 예를 들면, 단백질 또는 단백질 단편, 복합체 탄수화물, 강글리오시드(ganglioside), 합텐(hapten), 핵산, 또는 이들 또는 다른 생물 분자의 임의의 조합물일 수 있다.
용어 "백신"은 포유동물에서 특별한 항원에 대하여 면역 반응을 이끌어내기 위하여 포유동물에 투여하기 위한 면역원성 조성물을 지칭한다. 백신은 전형적으로 면역 반응의 표적, 예컨대 질환-발생 미생물 또는 종양 세포와 유사하거나 또는 이로부터 유래된 제제("항원" 또는 "면역원"으로서 공지됨)를 함유한다. 종양, 예컨대 암을 치료하고자 하는 백신은, 전형적으로 표적 종양 상에서 발견되는 TAA로부터 유래되고 표적 종양 상의 TAA에 대하여 면역원성을 이끌어낼 수 있는 항원을 함유한다.
실시양태가 어디에서나 "포함하는"이라는 말과 함께 본원에 기재되지만, 다르게는 "구성되는" 및/또는 "본질적으로 구성되는"과 관련하여 기재되는 유사한 실시양태가 또한 제공됨을 알아야 한다.
본 발명의 양태 또는 실시양태가 마쿠쉬 그룹(Markush group) 또는 다른 대안의 분류와 관련하여 기재되어 있지만, 본 발명은 전체적으로 열거된 전체 그룹(개별적으로 그룹의 각각의 구성원, 및 주요 그룹의 모든 가능한 하위 그룹), 뿐만 아니라 하나 이상의 그룹 구성원이 빠진 주요 그룹을 포괄한다. 본 발명은 청구된 발명에서 하나 이상의 임의의 그룹 구성원의 명백한 예외를 예상한다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 분야의 숙련가에 의해 공통적으로 이해되는 동일한 의미를 갖는다. 모순되는 경우, 정의를 포함하여 본 명세서는 조절될 것이다. 본 명세서 및 청구범위 전체를 통해, "포함하다"라는 단어, 또는 그의 변형어, 예컨대 "포함하는"은 언급된 정수, 또는 정수의 그룹을 포함함을 내포하지만, 임의의 다른 정수 또는 정수의 그룹을 배제하지 않는 것으로 이해될 것이다. 달리 문맥상 필요하지 않다면, 단수 용어는 복수를 포함할 것이고, 복수 용어는 단수를 포함할 것이다. 용어 "예를 들어" 또는 "예를 들면"에 수반되는 임의의 예(들)는 빠짐이 없거나 제한함을 의미하지 않는다.
예시적인 방법 및 재료가 본원에 기재되지만, 본원에 기재된 것과 유사하거나 동등한 방법 및 재료가 본 발명의 실행 또는 검사에 사용될 수 있다. 재료, 방법, 및 실시예는 단지 예시적이고, 제한하려는 것이 아니다.
항-GITR 항체
항-종양 면역력을 북돋아서 종양 퇴행을 일으키는 특성을 갖는 항-GITR 항체가 본원에 제공된다. 본 발명의 항-GITR 항체는 다음의 특징들을 나타낸다: (a) 항체 의존성 세포독성(ADCC) 및/또는 항체 의존성 식세포작용(ADCP)의 기능을 통해 종양 침윤 Treg를 소모시키고; (b) T 효과자 세포 상의 GITR에 결합하여 T 효과자 세포 활성화를 직접적으로 증진시키고/시키거나; (c) T 효과자 세포의 효과자 기능 및 CD8+ T 세포의 생존을 증진시킨다.
본 발명에 유용한 항체는 단일클론성 항체, 다중클론성 항체, 항체 단편(예를 들어, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, Fc 등), 키메라성 항체, 이중특이적 항체, 헤테로컨주게이트 항체, 단일 쇄(ScFv), 이의 돌연변이체, 항체 부분(예를 들어, 항체 도메인)를 포함하는 융합 단백질, 인간화된 항체, 및 필요한 특이성의 항원 인식 자리를 포함하는 면역글로불린 분자의 임의의 다른 변형된 입체배치, 예컨대 항체의 글리코실화 변이체, 항체의 아미노산 서열 변이체, 및 공유적으로 변형된 항체를 포괄할 수 있다. 항체는 뮤린, 래트, 인간, 또는 임의의 다른 기원(키메라성 또는 인간화된 항체 포함)일 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 항-GITR 항체는 단일클론성 항체이다. 몇몇 실시양태에서, 항체는 인간 또는 인간화된 항체이다.
항-GITR 항체는 당분야에 공지된 임의의 방법에 의해 제조될 수 있다. 인간 및 마우스 항체를 생산하기 위한 일반적 기법은 당분야에 공지되어 있고/있거나 본원에 기재되어 있다.
항-GITR 항체는 당분야에 공지된 방법을 사용하여 식별되거나 특징지워질 수 있고, 이로써 GITR 결합 활성이 검출된다. 몇몇 실시양태에서, 항-GITR 항체는 후보 제제를 GITR과 함께 항온처리하고 결합을 모니터링함으로써 식별된다. 결합 검정은, 예를 들어, 정제된 GITR 폴리펩티드(들)에 의해, 또는 GITR 폴리펩티드(들)를 자연 발현하거나(예를 들어, 다양한 균주), 또는 발현하도록 형질감염된 세포에 의해 수행될 수 있다. 하나의 실시양태에서, 결합 검정은 경쟁 결합 검정이고, 여기서 GITR 결합에 대하여 공지된 항-GITR 항체와 경쟁하는 후보 항체의 능력이 평가된다. 이러한 검정은 ELISA 형식을 비롯한 다양한 형식으로 수행될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 항-GITR 항체는 후보 항제를 GITR과 함께 항온처리하고 결합을 모니터링함으로써 식별된다.
초기 식별 이후, 후보 항-GITR 항체의 활성은 표적화된 생물학적 활성을 시험하는 것으로 공지된 생물검정에 의해 추가로 확인되고 정밀화된다. 몇몇 실시양태에서, 시험관내 세포 검정은 후보 항-GITR 항체를 추가로 특징짓기 위해 사용된다.
항-GITR 항체는 당분야에 잘 공지된 방법을 사용하여 특징지워질 수 있다. 예를 들면, 하나의 방법은 항체가 결합하는 에피토프의 식별, 또는 "에피토프 맵핑(mapping)"이다. 단백질 상의 에피토프의 위치를 특징짓고 맵핑하기 위해 당분야에 많은 방법들이 공지되어 있고, 예를 들면, 할로우(Harlow) 및 래인(Lane)의 문헌[Using Antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1999]의 11 장에 기재된 바와 같은 항체-항원 복합체의 결정 구조의 해결, 경쟁 검정, 유전자 단편 발현 검정, 및 합성 펩티드-기반의 검정이 포함된다. 추가적인 예에서, 에피토프 맵핑은 항-GITR 항체가 결합하는 서열을 결정하기 위해 사용될 수 있다. 에피토프 맵핑은 다양한 공급업체, 예를 들면, 펩스칸 시스템스(Pepscan Systems)(네덜란드 8219 PH 렐리스타드 에델헤르트벡 15 소재)로부터 상업적으로 입수가능하다. 에피토프는 선형 에피토프일 수 있거나, 즉 아미노산의 단일 연장부에 포함되거나, 또는 반드시 단일 연장부에 함유될 필요가 없는 아미노산의 3차원 상호작용에 의해 형성된 입체배좌적 에피토프일 수 있다. 다양한 길이(예를 들어, 적어도 4 내지 6개 아미노산 길이)의 펩티드가 단리되거나 합성되어(예를 들어, 재조합적으로), 항-GITR 항체에 의한 결합 검정을 위해 사용될 수 있다. 또 다른 예에서, 항-GITR 항체가 결합하는 에피토프는 GITR 서열로부터 유래된 펩티드의 중첩을 사용하고 항-GITR 항체에 의한 결합을 결정함으로써 체계적 스크리닝에서 결정될 수 있다. 유전자 단편 발현 검정에 따라서, GITR을 인코딩하는 개방 판독 프레임(open reading frame)은 무작위적으로 또는 특이적인 유전적 작성에 의해 단편화되고, GITR의 발현된 단편과 시험된 항체의 반응성이 결정된다. 유전자 단편은, 예를 들면, PCR에 의해 생산되고, 이어서 시험관내에서 방사성 아미노산의 존재하에 단백질로 전사 및 번역될 수 있다. 이어서 방사성 표지화된 GITR 단편으로의 항체의 결합은 면역침전 및 겔 전기영동에 의해 결정된다. 특정 에피토프는 또한 파아지 입자(파아지 라이브러리) 또는 효모(효모 디스플레이)의 표면 상에 표시된 무작위 펩티드 서열의 거대 라이브러리를 사용하여 식별될 수 있다. 다르게는, 펩티드 단편을 중첩하는 규정된 라이브러리는 단순 결합 검정에서 시험 항체에 대한 결합에 대해 검사될 수 있다. 추가적인 예에서, 항원의 돌연변이생성, 도메인 스와핑(swapping) 실험, 및 알라닌 스캐닝 돌연변이생성을 수행하여 에피토프 결합을 위해 필요하고, 충분하고/하거나 필수적인 잔기를 식별할 수 있다. 예를 들면, 알라닌 스캐닝 돌연변이생성 실험은 돌연변이체 GITR을 사용하여 수행될 수 있고, 여기서 GITR 폴리펩티드의 다양한 잔기는 알라닌에 의해 대체될 수 있다. 돌연변이체 GITR로의 항체의 결합을 평가함으로써, 항체 결합에 대한 특별한 GITR 잔기의 중요성이 평가될 수 있다.
항-GITR 항체를 특징짓기 위해 사용될 수 있는 또 다른 방법은 동일한 항원에 결합하는 것으로 공지된 다른 항체, 즉 GITR의 다양한 단편에 의한 경쟁 검정을 사용하여, 항-GITR 항체가 다른 항체와 동일한 에피토프에 결합하는지의 여부를 결정한다. 경쟁 검정은 당분야의 숙련가에게 잘 공지되어 있고, 예컨대 ELISA 형식이다.
항-GITR 항체의 GITR로의 결합 친화도(KD)는 약 0.001 내지 약 200 nM이다. 몇몇 실시양태에서, 결합 친화도는 약 200 nM, 약 150 nM, 약 100 nM, 약 50 nM, 약 20 nM, 약 19 nM, 약 18 nM, 약 17 nM, 약 16 nM, 약 15 nM, 약 14 nM, 약 13 nM, 약 12 nM, 약 11 nM, 약 10 nM, 약 9 nM, 약 8 nM, 약 7 nM, 약 6 nM, 약 5 nM, 약 4 nM, 약 3 nM, 약 2 nM, 약 1 nM, 약 500 pM, 약 100 pM, 약 60 pM, 약 50 pM, 약 20 pM, 약 15 pM, 약 10 pM, 약 5 pM, 약 2 pM, 또는 약 1 pM중 임의의 값이다. 몇몇 실시양태에서, 결합 친화도는 약 250 nM, 약 200 nM, 약 100 nM, 약 50 nM, 약 10 nM, 약 1 nM, 약 500 pM, 약 100 pM, 약 50 pM, 약 20 pM, 약 10 pM, 약 5 pM, 또는 약 2 pM중 임의의 값의 미만이다.
따라서, 본 발명은 임의의 하기 물질, 또는 표 1에서 볼 수 있는 부분적 경쇄 서열 및 부분적 중쇄 서열을 갖는 항체, 또는 이의 변이체를 포함하는 조성물(약학 조성물 포함)을 제공한다. 표 1에서, 밑줄 쳐진 서열은 카밧에 따른 CDR 서열이고 진한 서열은 코티아에 따른다. 표 1은 항-GITR 항체의 가변성 영역 서열을 나타낸다.
[표 1a]
[표 1b]
[표 1c]
본 발명은 또한 GITR에 항체의 CDR 부분을 제공한다. CDR 영역의 결정은 당분야의 기술내에 속한다. 몇몇 실시양태에서, CDR은 카밧 및 코티아 CDR의 조합(또한 "조합된 CDR" 또는 "연장된 CDR"로 지칭됨)일 수 있는 것으로 이해된다. 본원에서 CDR의 "입체배좌적 정의"로서 지칭되는 또 다른 접근법에서, CDR의 위치는 항원 결합에 엔탈피 기여하는 잔기로서 식별될 수 있다. 예를 들어, 마카베(Makabe) 등의 문헌[2008, Journal of Biological Chemistry, 283: 1156-1166]을 참조한다. 일반적으로, "입체배좌적 CDR"은 카밧 CDR 및 베르니에(Vernier) 대역중에서의 잔기 위치를 포함하고, 이는 특이적 항원에 결합하는 항체에 대한 적절한 루우프 구조를 유지하기 위해 제약된다. 입체배좌적 CDR의 결정은 당분야의 기술에 속한다. 몇몇 실시양태에서, CDR은 카밧 CDR이다. 다른 실시양태에서, CDR은 코티아 CDR이다. 다른 실시양태에서, CDR은 연장된 CDR, AbM CDR, 입체배좌적 CDR, 또는 접점 CDR이다. 달리 말하면, 하나 보다 많은 CDR을 갖는 실시양태에서, CDR은 카밧 CDR, 코티아 CDR, 연장된 CDR, AbM CDR, 입체배좌적 CDR, 접점 CDR 또는 이의 조합중 임의의 것일 수 있다.
몇몇 실시양태에서, 항체는 표 1에 제시된 중쇄 가변성 영역들중 임의의 하나의 3개의 CDR을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 항체는 표 1에 제시된 경쇄 가변성 영역들중 임의의 하나의 3개의 CDR을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 항체는 표 1에 제시된 중쇄 가변성 영역들중 임의의 하나의 3개의 CDR, 및 표 1에 제시된 경쇄 가변성 영역들중 임의의 하나의 3개의 CDR을 포함한다.
몇몇 실시양태에서, GITR에 특이적으로 결합하고: 서열 번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 또는 112로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 VH의 VH CDR1, VH CDR2, 및 VH CDR3을 포함하는 중쇄 가변성 영역(VH); 및/또는 서열 번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 또는 111로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 VL의 VL CDR1, VL CDR2, 및 VL CDR3을 포함하는 경쇄 가변성 영역(VL)을 포함하는 단리된 항체가 제공된다.
몇몇 실시양태에서, 항체는 서열 번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 또는 112에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH, 또는 CDR내에 존재하지 않는 잔기에서 1개 또는 수개의 보존적 아미노산 치환을 갖는 이의 변이체를 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 항체는 서열 번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 또는 111에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL, 또는 CDR내에 존재하지 않는 아미노산에서 1개 또는 수개의 아미노산 치환을 갖는 이의 변이체를 포함한다.
몇몇 실시양태에서, GITR에 특이적으로 결합하고: 서열 번호 16, 18, 20, 121, 및 123으로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 VH의 VH CDR1, VH CDR2, 및 VH CDR3을 포함하는 VH; 및/또는 서열 번호 15, 17, 19, 120, 및 122로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 VL의 VL CDR1, VL CDR2, 및 VL CDR3을 포함하는 VL을 포함하는 단리된 항체가 제공된다.
몇몇 실시양태에서, GITR에 특이적으로 결합하고: 서열 번호 70 및 72로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 VH의 VH CDR1, VH CDR2, 및 VH CDR3을 포함하는 VH; 및/또는 서열 번호 69 및 71로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 VL의 VL CDR1, VL CDR2, 및 VL CDR3을 포함하는 VL을 포함하는 단리된 항체가 제공된다.
몇몇 실시양태에서, 항체는 C-말단 라이신의 존재 또는 부재하에 항-GITR 항체의 전장 중쇄, 및/또는 전장 경쇄를 포함한다. 예를 들면, 항-GITR 항체는 서열 번호 110에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 및 서열 번호 109에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.
표 2는 본원에 제공된 항-GITR 항체의 CDR 서열의 예를 제공한다. 표 2는 카밧 및 코티아에 따른 항-GITR 항체(mAb) 및 이들의 항원-결합 CDR 서열을 나타낸다.
[표 2a]
[표 2b]
[표 2c]
[표 2d]
몇몇 실시양태에서, 항체는 표 2로부터의 3개의 경쇄 CDR 및 3개의 중쇄 CDR을 포함한다.
선택적 수의 항-GITR 항체로부터의 경쇄 CDR의 정렬이 표 3에 제공된다. 가변성 잔기는 진한 글자로 제공된다. 컨센서스(consensus) 경쇄 CDR 서열은 표 3의 마지막 열에 제공된다.
[표 3]
선택적 수의 항-GITR 항체로부터의 중쇄 CDR의 정렬이 표 4에 제공된다. 가변성 잔기는 진한 글자로 제공된다. 컨센서스 중쇄 CDR 서열은 표 4의 마지막 열에 제공된다. 표 4는 항-GITR 중쇄 CDR의 정렬을 나타낸다.
[표 4a]
[표 4b]
[표 4c]
몇몇 실시양태에서, 항체는 표 3으로부터의 3개의 경쇄 CDR 및 표 4로부터의 3개의 중쇄 CDR을 포함한다.
몇몇 실시양태에서, 항체는 서열 번호 24, 25, 26, 32, 33, 34, 35, 39, 40, 41, 115, 116, 117, 63, 64, 또는 65에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, 서열 번호 27, 28, 44, 45, 66, 또는 67에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2, 및 서열 번호 29, 46, 또는 68에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3; 및/또는 서열 번호 21, 30, 36, 42, 113, 또는 31에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, 서열 번호 22, 37, 43, 114, 또는 61에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2, 및 서열 번호 23, 38, 또는 62에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3을 포함한다.
몇몇 실시양태에서, 항체는 서열 번호 50, 51, 52, 56, 또는 57에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, 서열 번호 53, 54, 58, 또는 59에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2, 및 서열 번호 55, 60, 또는 124에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3; 및/또는 서열 번호 47에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, 서열 번호 48에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2, 및 서열 번호 49에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3을 포함한다.
몇몇 실시양태에서, 항체는 서열 번호 32, 76, 77, 84, 85, 또는 86에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, 서열 번호 78 또는 79에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2, 및 서열 번호 80 또는 87에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3; 및/또는 서열 번호 73 또는 81에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, 서열 번호 74 또는 82에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2, 및 서열 번호 75 또는 83에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3을 포함한다.
본 발명은 또한 항-GITR 항체를 생성하고, 선택하고, 제조하는 방법을 제공한다. 본 발명의 항체는 당분야에 공지된 절차에 의해 제조될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 항체는 당분야에 공지된 임의의 방법을 사용하여 재조합적으로 제조되고 발현될 수 있다.
몇몇 실시양태에서, 항체는 파아지 디스플레이(phage display) 기술에 의해 제조되고 선택될 수 있다. 예를 들면, 미국 특허 제5,565,332호; 제5,580,717호; 제5,733,743호; 및 제6,265,150호; 및 윈터(Winter) 등의 문헌[Annu. Rev. Immunol. 12: 433-455, 1994]을 참조한다. 다르게는, 파아지 디스플레이 기술[맥카퍼티(McCafferty) 등의 문헌 "Nature 348: 552-553, 1990"]은 면역화되지 않은 공여자로부터의 면역글로불린 가변성(V) 도메인 유전자 레퍼토리(repertoire)로부터, 시험관내에서 인간 항체 및 항체 단편을 생산하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 기법에 따라서, 항체 V 도메인 유전자는 실모양의 박테리오파아지(bacteriophage), 예컨대 M13 또는 fd의 주요 또는 부수적 외피 단백질 유전자내로 프레임내(in-frame) 클로닝되고, 기능성 항체 단편으로서 파아지 입자의 표면 상에 표시된다. 실모양의 입자가 파아지 게놈의 단일-가닥 DNA 복사물을 함유하므로, 항체의 기능적 특성에 기초한 선택은 또한 이들 특성을 나타내는 항체를 인코딩하는 유전자를 선택하게 되는 것이다. 이와 같이, 파아지는 B 세포의 일부 특성을 모방한다. 파아지 디스플레이는 다양한 형식으로 수행될 수 있다; 검토를 위해, 예를 들어, 존슨 케빈(Johnson, Kevin S.) 및 키스웰 데이빗(Chiswell, David J.)의 문헌[Current Opinion in Structural Biology 3: 564-571, 1993]을 참조한다. V-유전자 분절의 몇몇 공급원은 파아지 디스플레이를 위해 사용될 수 있다. 클락손(Clackson) 등의 문헌[Nature 352: 624-628, 1991]은, 면역화된 마우스의 비장으로부터 유래된 V 유전자의 작은 무작위 조합 라이브러리로부터 다양한 종류의 항-옥사졸론 항체를 단리하였다. 인간 공여자로부터의 V 유전자의 레퍼토리가 작성될 수 있고 다양한 종류의 항원(자기-항원 포함)에 대한 항체는 본질적으로 마크(Mark) 등의 문헌[J. Mol. Biol. 222: 581-597, 1991], 또는 그리피트(Griffith) 등의 문헌[EMBO J. 12: 725-734, 1993]에 기재된 기법에 따라 단리될 수 있다. 천연 면역 반응에서, 항체 유전자는 높은 속도로 돌연변이를 축적시킨다(체세포 초돌연변이). 도입된 몇몇 변화는 더 높은 친화도를 부여할 것이고, 고-친화도 표면 면역글로불린을 표시하는 B 세포는 후속적인 항원 챌린지(challenge) 동안 우선적으로 복제되고 분화된다. 이러한 천연 과정은 "쇄 셔플링(shuffling)"으로서 공지된 기법을 사용함으로써 모방될 수 있다[마크스(Marks) 등의 문헌 "Bio/Technol. 10: 779-783, 1992"]. 이러한 방법에서, 파아지 디스플레이에 의해 수득된 "1차" 인간 항체의 친화도는 중쇄 및 경쇄 V 영역 유전자를 면역화되지 않은 공여자로부터 수득된 V 도메인 유전자의 자연 발생 변이체의 레퍼토리로 순차적으로 대체함으로써 향상될 수 있다. 이러한 기법은 pM-nM 범위에서 친화도를 갖는 항체 및 항체 단편의 생산을 허용한다. 매우 큰 파아지 항체 레퍼토리를 제조하기 위한 전략[또한 "모든 라이브러리의 모체"로서 공지됨]은 워터하우스(Waterhouse) 등의 문헌[Nucl. Acids Res. 21: 2265-2266, 1993]에 기재되어 있다. 유전자 셔플링은 또한 설치류 항체로부터 인간 항체를 유도하기 위해 사용될 수 있고, 여기서 인간 항체는 출발 설치류 항체와 유사한 친화도 및 특이성을 갖는다. "에피토프 각인(imprinting)"으로서도 지칭되는 이러한 방법에 따라서, 파아지 디스플레이 기법에 의해 수득된 설치류 항체의 중쇄 또는 경쇄 V 도메인 유전자는 인간 V 도메인 유전자의 레퍼토리에 의해 대체되어, 설치류-인간 키메라를 생성한다. 항원에 대한 선택은 기능성 항원-결합 자리를 복원할 수 있는 인간 가변성 영역을 단리시키고, 즉, 에피토프는 파트너의 선택을 지배(각인)한다. 남은 설치류 V 도메인을 대체하기 위해 이러한 과정이 반복될 경우, 인간 항체가 수득된다(PCT 공개 공보 제WO 93/06213호 참조). CDR 그래프팅에 의한 설치류 항체의 전통적인 인간화와는 달리, 이러한 기법은 완전한 인간 항체를 제공하고, 이는 설치류 기원의 골격구조 또는 CDR 잔기를 갖지 않는다.
몇몇 실시양태에서, 항체는 하이브리도마 기술을 사용하여 제조될 수 있다. 인간을 비롯한 포유동물의 하이브리도마 세포주를 생산하기 위한 기초로서 작용하도록 인간을 비롯한 임의의 포유동물 피험체 또는 이로부터의 항체 생산 세포가 조작될 수 있는 것으로 고려된다. 숙주 동물의 면역화 경로 및 계획은, 일반적으로, 본원에 추가로 기재된 바와 같이, 항체 자극 및 생산에 대하여 확립된 통상적 기법과 일치한다. 전형적으로, 숙주 동물에게 본원에 기재된 면역원을 비롯한 면역원의 일정량이 복강내, 근육내, 경구, 피하, 족부내, 및/또는 피내로 접종된다.
하이브리도마는 림프구 및 불멸화(immortalized) 골수종 세포로부터 코흘러(Kohler, B.) 및 밀스타인(Milstein, C)의 문헌[1975, Nature 256: 495-497]의 일반적 체세포 하이브리드화 기법을 사용하여, 또는 벅(Buck, D. W.) 등의 문헌[In Vitro, 18: 377-381, 1982]에서 변형된 바와 같이 제조될 수 있다. 제한되는 것은 아니지만 X63-Ag8.653 및 솔크 연구소(Salk Institute)의 세포 분화 센터(Cell Distribution Center)(미국 캘리포니아주 샌 디에고 소재)로부터의 세포주를 비롯한 입수가능한 골수종 세포주가 하이브리드화에 사용될 수 있다. 일반적으로, 이러한 기법은, 융합유도물질(fusogen), 예컨대 폴리에틸렌 글리콜을 사용하여, 또는 당분야의 숙련가에게 공지된 전기적 수단에 의해, 골수종 세포 및 림프구 세포를 융합시킴을 포함한다. 융합 이후, 세포를 융합 배지로부터 분리하고 선택적 성장 배지, 예컨대 하이포크산틴-아미노프테린-티미딘(HAT: hypoxanthine-aminopterin-thymidine) 배지에서 성장시켜 하이브리드화되지 않은 모 세포를 제거한다. 혈청이 보충되거나 보충되지 않은 본원에 기재된 임의의 배지가 단일클론성 항체를 분비하는 하이브리도마를 배양하기 위해 사용될 수 있다. 세포 융합 기법의 또 다른 대안으로서, 본 발명의 GITR 단일클론성 항체를 생산하기 위해 EBV 불멸화 B 세포가 사용될 수 있다. 하이브리도마 또는 다른 불멸화 B-세포는 팽창되고, 원할 경우, 서브클로닝되며, 상청액은 통상적 면역검정 절차(예를 들어, 방사면역검정, 효소면역검정, 또는 형광 면역검정)에 의해 항-면역원 활성에 대해 검정된다.
항체의 공급원으로서 사용될 수 있는 하이브리도마는 GITR에 특이적인 단일클론성 항체, 또는 이의 일부를 생산하는 모 하이브리도마의 모든 유도체, 자손 세포를 포괄한다.
이러한 항체를 생산하는 하이브리도마는 공지된 절차를 사용하여 시험관내에서 또는 생체내에서 성장된다. 단일클론성 항체는, 원한다면, 통상적 면역글로불린 정제 절차, 예컨대 황산 암모늄 석출, 겔 전기영동, 투석, 크로마토그래피, 및 한외여과에 의해 배양 배지 또는 체액으로부터 단리될 수 있다. 존재할 경우 원치않는 활성은, 고체 상에 부착된 면역원으로 제조된 흡착체 위로 제조물을 흘려보내고, 원하는 항체를 면역원으로부터 용출하거나 방출함으로써 제거될 수 있다. 이작용성 또는 유도화 제제, 예를 들면, 말레이미도벤조일 설포석신이미드 에스테르(시스테인 잔기를 통한 컨주게이션), N-하이드록시석신이미드(라이신 잔기를 통해), 글루타르알데히드, 무수 석신산, SOCl2, 또는 R1N=C=NR(여기서 R 및 R1은 상이한 알킬 기임)을 사용하여, 면역화될 종에서 면역원성인 단백질, 예를 들어, 열쇠구멍 삿갓조개 헤모시아닌(keyhole limpet hemocyanin), 혈청 알부민, 소의 티로글로불린, 또는 대두 트립신 저해제에 컨주게이션된 표적 아미노산 서열을 함유하는 GITR 폴리펩티드, 또는 단편으로 숙주 동물을 면역화하는 것은 항체(예를 들어, 단일클론성 항체)의 집단을 수득할 수 있다.
원한다면, 관심있는 항-GITR 항체(단일클론성 또는 다중클론성)는 서열화될 수 있고, 이어서 폴리뉴클레오티드 서열은 발현 또는 번식을 위해 벡터내로 클로닝될 수 있다. 관심있는 항체를 인코딩하는 서열은 숙주 세포중의 벡터내에 유지될 수 있고, 이어서 숙주 세포는 팽창되고 미래의 사용을 위해 동결될 수 있다. 세포 배양액에서의 재조합 단일클론성 항체의 생산은 당분야에 공지된 수단에 의해 B 세포로부터 항체 유전자의 클로닝을 통해 실행될 수 있다. 예를 들어 틸러(Tiller) 등의 문헌[2008, J. Immunol. Methods 329, 112]; 미국 특허 제7,314,622호를 참조한다.
몇몇 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드 서열은 항체를 "인간화"하거나 항체의 친화도, 또는 다른 특징을 향상시키기 위해 유전자 조작에 사용될 수 있다. 항체는 또한, 예를 들면, 개, 고양이, 영장류, 말 및 소에서 사용하기 위해 맞춤제작될 수 있다.
몇몇 실시양태에서, 완전한 인간 항체는 특정한 인간 면역글로불린 단백질을 발현하도록 조작된 시판 마우스를 사용함으로써 수득될 수 있다. 더욱 요망되거나(예를 들어, 완전한 인간 항체) 또는 더욱 견고한 면역 반응을 생산하도록 고안된 유전자이식 동물이 또한 인간화된 또는 인간 항체의 생성을 위해 사용될 수 있다. 이러한 기술의 예는 아브게닉스 인코포레이티드(Abgenix, Inc.)(미국 캘리포니아주 프레몬트 소재)로부터의 제노마우스(상표명), 및 메다렉스 인코포레이티드(Medarex, Inc.)(미국 뉴저지주 프린스턴 소재)로부터의 후맙-마우스(등록상표) 및 TC 마우스(상표명)이다.
항체는, 우선 항체 및 항체 생산 세포를 숙주 동물로부터 단리하고, 유전자 서열을 수득하고, 유전자 서열을 사용하여 항체를 숙주 세포(예를 들어, CHO 세포)에서 재조합적으로 발현시킴으로써 재조합적으로 제조될 수 있다. 이용될 수 있는 또 다른 방법은 식물(예를 들어, 담배) 또는 유전자이식 밀크(milk)에서 항체 서열을 발현시키는 것이다. 식물 또는 밀크에서 항체를 재조합적으로 발현시키는 방법은 개시되어 있다. 예를 들면, 피터스(Peeters) 등의 문헌[Vaccine 19: 2756, 2001]; 론베르그(Lonberg, N.) 및 후스자(D. Huszar)의 문헌[Int. Rev. Immunol 13: 65, 1995]; 및 폴락(Pollock) 등의 문헌[J Immunol Methods 231: 147, 1999]을 참조한다. 항체의 유도체, 예를 들어, 도메인, 단일 쇄 등을 제조하기 위한 방법은 당분야에 공지되어 있다.
면역검정 및 유세포분석 분류 기법, 예컨대 형광 활성화된 세포 분류(FACS)는 또한 GITR에 특이적인 항체를 단리하기 위해 이용될 수 있다.
단일클론성 항체를 인코딩하는 DNA는 통상적 절차를 사용하여(예를 들어, 단일클론성 항체의 중쇄 및 경쇄를 인코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용함으로써) 쉽게 단리되고 서열화된다. 하이브리도마 세포는 이러한 DNA의 바람직한 공급원으로서 작용한다. 일단 단리되면, DNA는 발현 벡터(예컨대 PCT 공개 번호 제WO 87/04462호에 개시된 발현 벡터)내로 위치될 수 있고, 이는 이어서 숙주 세포, 예컨대 이. 콜라이(E. coli) 세포, 원숭이(simian) COS 세포, 중국 햄스터 난소(CHO: Chinese hamster ovary) 세포, 또는 골수종 세포(다르게는 면역글로불린 단백질을 생산하지 않음)내로 형질감염되어, 재조합 숙주 세포에서 단일클론성 항체의 합성을 수득한다. 예를 들어, PCT 공개 번호 제WO 87/04462호를 참조한다. DNA는 또한, 예를 들면, 인간 중쇄 및 경쇄 불변성 도메인에 대한 코딩 서열을 동종성 뮤린 서열 대신에 치환시킴으로써[모리슨(Morrison) 등의 문헌 "Proc. Nat. Acad. Sci. 81: 6851, 1984"], 또는 비-면역글로불린 폴리펩티드에 대한 코딩 서열의 전부 또는 일부를 면역글로불린 코딩 서열에 공유 결합시킴으로써 변형될 수 있다. 이러한 방식으로, 본원에서 GITR 단일클론성 항체의 결합 특이성을 갖는 "키메라성" 또는 "혼성" 항체가 제조된다.
항체 단편은 항체의 단백질분해 또는 다른 분해에 의해, 상기 기재된 바와 같은 재조합 방법(즉, 단일 또는 융합 폴리펩티드)에 의해, 또는 화학적 합성에 의해 생산될 수 있다. 항체의 폴리펩티드, 특히 약 50개 이하의 아미노산의 더 짧은 폴리펩티드는 화학적 합성에 의해 편리하게 제조된다. 화학적 합성 방법은 당분야에 공지되어 있고 상업적으로 이용가능하다. 예를 들면, 항체는 고체 상 방법을 이용하는 자동화된 폴리펩티드 합성기에 의해 생산될 수 있다. 또한, 미국 특허 제5,807,715호; 제4,816,567호; 및 제6,331,415호를 참조한다.
몇몇 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 항체 m3G7, h3G7VL1.1, h3G7H1, h3G7H2, h3G7AM, h3G7R5, h3G7LF, h3G7N9, m10H2, h10H2HU, h10H2AM, h10H2N13, h10H2N14, r18H12, 및 r21B6의 중쇄 및/또는 경쇄 가변성 영역을 인코딩하는 서열을 포함한다. 관심있는 항체를 인코딩하는 서열은 숙주 세포중의 벡터내에 유지될 수 있고, 이어서 숙주 세포는 팽창되고 미래의 사용을 위해 동결될 수 있다. 벡터(발현 벡터 포함) 및 숙주 세포는 추가로 본원에 기재된다.
본 발명은 친화도 성숙된 실시양태를 포함한다. 예를 들면, 친화도 성숙된 항체는 당분야에 공지된 절차에 의해 생산될 수 있다[마크스(Marks) 등의 문헌 "1992, Bio/Technology, 10: 779-783"; 바바스(Barbas) 등의 문헌 "1994, Proc Nat. Acad. Sci, USA 91: 3809-3813"; 쉬에르(Schier) 등의 문헌 "1995, Gene, 169: 147-155"; 옐턴(Yelton) 등의 문헌 "1995, J. Immunol., 155: 1994-2004"; 잭슨(Jackson) 등의 문헌 "1995, J. Immunol., 154(7): 3310-9"; 호킨스(Hawkins) 등의 문헌 "1992, J. Mol. Biol., 226: 889-896"; 및 PCT 공개 번호 제WO 2004/058184호].
다음의 방법들은 항체의 친화도를 조정하고 CDR을 특징짓기 위해 사용될 수 있다. 항체의 CDR을 특징짓고/짓거나 폴리펩티드, 예컨대 항체의 결합 친화도를 변경(예컨대 향상)시키기 위한 한가지 방식은 "라이브러리 스캐닝 돌연변이생성"으로 지칭된다. 일반적으로, 라이브러리 스캐닝 돌연변이생성은 다음과 같이 작동한다. CDR에서 하나 이상의 아미노산 위치는 2개 이상(예컨대 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20개)의 아미노산에 의해 당분야에 인식된 방법을 사용하여 대체된다. 이는 클론의 작은 라이브러리를 생성하고(몇몇 실시양태에서, 분석되는 모든 아미노산 위치마다 1개), 각각 2개 이상의 구성원의 복잡성을 갖는다체(2개 이상의 아미노산이 모든 위치마다 치환될 경우). 일반적으로, 라이브러리는 또한 고유의(치환되지 않은) 아미노산을 함유하는 클론을 포함한다. 각각의 라이브러리로부터의 소수의 클론, 예를 들어, 약 20 내지 80개의 클론(라이브러리의 복잡성에 의존함)은, 표적 폴리펩티드(또는 다른 결합 표적)에 대한 결합 친화도에 관하여 스크리닝되고, 결합이 증가되거나, 동일하거나, 감소하거나, 또는 존재하지 않는 후보가 식별된다. 결합 친화도를 결정하기 위한 방법은 당분야에 잘 공지되어 있다. 결합 친화도는, 예를 들면, 약 2배 이상의 결합 친화도의 차이를 검출하는 비아코어(Biacore: 상표명) 표면 플라스몬 공명 분석, 키넥사(Kinexa: 등록상표) 바이오센서, 섬광 근접 검정, ELISA, 오리겐(ORIGEN: 등록상표) 면역검정, 형광 급랭(quenching), 형광 전달, 및/또는 효모 디스플레이를 사용하여 결정될 수 있다. 결합 친화도는 또한 적합한 생물검정을 사용하여 스크리닝될 수 있다. 출발 항체가 이미 비교적 높은 친화도, 예를 들면 약 10 nM 이하의 KD로 결합하는 경우, 비아코어(상표명)는 특별히 유용하다.
몇몇 실시양태에서, CDR에서 각각의 모든 아미노산 위치는 당분야에 인식된 돌연변이생성 방법(이중 몇몇은 본원에 기재됨)을 사용하여 모든 20개의 천연 아미노산에 의해 대체된다(몇몇 실시양태에서, 한번에 하나씩). 이는 클론의 작은 라이브러리를 생성하고(몇몇 실시양태에서, 분석된 각각의 모든 아미노산 위치마다 하나), 각각은 20개 구성원의 복합성을 갖는다(모든 20개 아미노산이 모든 각각의 위치마다 치환되는 경우).
몇몇 실시양태에서, 스크리닝되는 라이브러리는 둘 이상의 위치에서 치환을 포함하고, 이는 동일한 CDR 또는 둘 이상의 CDR에 존재할 수 있다. 이와 같이, 라이브러리는 하나의 CDR에서 둘 이상의 위치에 치환을 포함할 수 있다. 라이브러리는 둘 이상의 CDR에서 둘 이상의 위치에 치환을 포함할 수 있다. 라이브러리는 3, 4, 5개, 또는 그 이상의 위치에서 치환을 포함할 수 있고, 이러한 위치는 2, 3, 4, 5 또는 6개의 CDR에서 발견된다. 치환은 낮은 중복 코돈을 사용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 배린트(Balint) 등의 문헌[1993, Gene 137(1): 109-18]의 표 2를 참조한다.
CDR은 중쇄 가변성 영역(VH) CDR3 및/또는 경쇄 가변성 영역(VL) CDR3일 수 있다. CDR은 VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3, VL CDR1, VL CDR2, 및/또는 VL CDR3중 하나 이상일 수 있다. CDR은 카밧 CDR, 코티아 CDR, 연장된 CDR, AbM CDR, 접점 CDR, 또는 입체배좌적 CDR일 수 있다.
결합이 향상된 후보는 서열화되고, 이로써 향상된 친화도(또한 "향상된" 치환으로 칭해짐)를 야기하는 CDR 치환을 식별할 수 있다. 결합하는 후보는 또한 서열화되어, 결합을 보유하는 CDR 치환을 식별할 수 있다.
다중 라운드의 스크리닝이 실행될 수 있다. 예를 들면, 향상된 결합을 갖는 후보(각각 하나 이상의 CDR의 하나 이상의 위치에 아미노산 치환을 포함함)는 또한 각각의 향상된 CDR 위치(즉, 치환 돌연변이체가 향상된 결합을 나타내는 CDR에서의 아미노산 위치)에서 적어도 고유의 아미노산 및 치환된 아미노산을 함유하는 제2 라이브러리의 고안을 위해 유용하다. 이러한 라이브러리의 제조, 및 스크리닝 또는 선택은 추가로 이후 논의된다.
라이브러리 스캐닝 돌연변이생성은 또한 향상된 결합, 동일한 결합, 감소된 결합을 갖는 클론 또는 결합이 없는 클론의 빈도에 한해서 CDR을 특징짓기 위한 수단을 제공하고, 또한 항체-항원 복합체의 안정성을 위해 각각의 아미노산 위치의 중요성과 관련한 정보를 제공한다. 예를 들면, 모든 20개 아미노산으로 변경될 경우 CDR의 위치가 결합을 보유한다면, 그 위치는 항원 결합에 요구될 것 같지 않은 위치로서 식별된다. 역으로, CDR의 위치가 단지 치환의 낮은 백분율에서 결합을 보유한다면, 그 위치는 CDR 기능에 중요한 위치로서 식별된다. 이와 같이, 라이브러리 스캐닝 돌연변이생성 방법은 많은 상이한 아미노산(모든 20개의 아미노산 포함)으로 변경될 수 있는 CDR에서의 위치, 및 단지 소수의 아미노산으로 변경될 수 있거나 변경될 수 없는 CDR에서의 위치에 관한 정보를 생성한다.
향상된 친화도를 갖는 후보는 제2 라이브러리에서 조합될 수 있고, 이는 그 위치에 향상된 아미노산, 고유의 아미노산을 포함하고, 원하는 라이브러리의 복합성에 따라서, 또는 원하는 스크리닝 또는 선택 방법을 사용하여 허용되는 추가적인 치환을 그 위치에 추가로 포함할 수 있다. 또한, 원한다면, 인접한 아미노산 위치는 적어도 둘 이상의 아미노산으로 무작위화될 수 있다. 인접한 아미노산의 무작위화는 돌연변이체 CDR에서 추가적인 입체배좌적 가요성을 허용할 수 있고, 이는 다시 더 많은 수의 돌연변이 향상을 도입하는 것을 허용하거나 용이하게 할 수 있다. 라이브러리는 스크리닝의 제1 라운드에서 향상된 친화도를 나타내지 않았던 위치에서 치환을 포함할 수 있다.
파아지 디스플레이, 효모 디스플레이, 및 리보솜 디스플레이를 비롯하여 선택을 위해 당분야에 공지된 임의의 방법을 사용하는 선택, 및 키넥사(상표명)를 사용하는 스크리닝과 같은 당분야에 공지된 임의의 방법을 사용하여 향상된 및/또는 변경된 결합 친화도를 갖는 라이브러리 구성원을 위해 제2 라이브러리가 스크리닝되고 선택된다.
본 발명의 항-GITR 항체를 발현하기 위해, VH 및 VL 영역을 인코딩하는 DNA 단편이 상기 기재된 임의의 방법을 사용하여 우선 수득될 수 있다. 다양한 변형, 예를 들어 돌연변이, 결실, 및/또는 부가는 또한 당분야의 숙련가에게 공지된 표준 방법을 사용하여 DNA 서열내로 도입될 수 있다. 예를 들면, 돌연변이생성은 표준 방법, 예컨대 PCR-중재된 돌연변이생성을 사용하여 실행될 수 있고, 여기서 돌연변이된 뉴클레오티드는 PCR 생성물이 원하는 돌연변이 또는 자리-지정 돌연변이생성을 함유하도록 PCR 프라이머내로 혼입된다.
본 발명은 표 1에 제시된 가변성 영역 및 표 2, 3 또는 4에 제시된 CDR에 대한 변형을 포괄한다. 예를 들면, 본 발명은 기능적으로 동등한 가변성 영역 및 이들의 특성에 그다지 영향을 주지 않는 CDR을 포함하는 항체, 뿐만 아니라 증진되거나 감소된 활성 및/또는 친화도를 갖는 변이체를 포함한다. 예를 들면, 아미노산 서열은 GITR에 대한 원하는 결합 친화도를 갖는 항체를 수득하도록 돌연변이될 수 있다. 폴리펩티드의 변형은 당분야의 일상적인 관행이고, 본원에 상세히 기재될 필요가 없다. 변형된 폴리펩티드의 예는, 기능적 활성을 그다지 해롭게 변화시키지 않거나, 폴리펩티드의 그의 리간드에 대한 친화도를 성숙(증진)시키는, 아미노산 잔기의 보존적 치환, 아미노산의 하나 이상의 결실 또는 부가를 갖는 폴리펩티드, 또는 화학적 유사체의 사용을 포함한다.
아미노산 서열 삽입은 1개의 잔기 내지 100개 이상의 잔기를 함유하는 폴리펩티드 길이 범위의 아미노- 및/또는 카복실-말단 융합, 뿐만 아니라 단일 또는 다중의 아미노산 잔기의 서열내 삽입을 포함한다. 말단 삽입의 예는 N-말단 메티오닐 잔기를 갖는 항체 또는 에피토프 태그에 융합된 항체를 포함한다. 항체 분자의 다른 삽입 변이체는 혈액 순환시 항체의 반감기를 증가시키는 효소 또는 폴리펩티드의 항체의 N- 또는 C-말단으로의 융합을 포함한다.
치환 변이체는 항체 분자에서 적어도 하나의 아미노산 잔기가 제거되고 그 위치에 상이한 잔기가 삽입된다. 치환적 돌연변이생성에 대하여 가장 크게 관심있는 자리는 과가변성 영역을 포함하지만, 골격구조 변경이 또한 고려된다. 보존적 치환은 "보존적 치환"이라는 표제하에 표 5에 제시된다. 만일 이러한 치환이 생물학적 활성에 변화를 일으킨다면, 표 5에 "예시적 치환"으로 표시되거나, 아미노산 부류와 관련하여 아래에 추가로 기재된 바와 같은 더욱 실질적인 변화가 이어서 도입되고 생성물이 스크리닝될 것이다.
[표 5]
항체의 생물학적 특성에 있어서의 실질적인 변형은 (a) 예를 들면, β-시이트(sheet) 또는 나선형 입체배좌로서의 치환 영역에서의 폴리펩티드 주쇄의 구조, (b) 표적 자리에서 분자의 전하 또는 소수성, 또는 (c) 측쇄의 부피를 유지하는데 대한 영향에 있어서 상당히 다른 치환을 선택함으로써 달성된다. 자연 발생 잔기는 공통의 측쇄 특성에 기초하여 하기의 군으로 분류된다:
(1) 비-극성: 노르로이신, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
(2) 전하가 없는 극성: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
(3) 산성(음성으로 하전됨): Asp, Glu;
(4) 염기성(양성으로 하전됨): Lys, Arg;
(5) 쇄 배향에 영향을 주는 잔기: Gly, Pro; 및
(6) 방향족: Trp, Tyr, Phe, His.
비-보존적 치환은 이들 부류중 하나의 구성원을 또 다른 부류로 교환함으로써 이루어 진다.
예를 들면, 만들어 질 수 있는 치환의 한 유형은 항체에서 화학적으로 반응성일 수 있는 하나 이상의 시스테인을 또 다른 잔기, 예컨대, 제한없이, 알라닌 또는 세린으로 바꾸는 것이다. 예를 들면, 비-전형적 시스테인의 치환이 존재할 수 있다. 치환은 항체의 불변성 영역, 또는 가변성 도메인의 골격구조 영역 또는 CDR에서 만들어질 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 시스테인이 전형적이다. 항체의 적절한 입체배좌를 유지하는데 관여하지 않는 임의의 시스테인 잔기는 또한, 일반적으로 세린에 의해 치환되어 분자의 산화 안정성을 향상시키고 비정상적 가교결합을 방지한다. 역으로, 시스테인 결합(들)은 항체에 첨가되어, 특별히 항체가 항체 단편, 예컨대 Fv 단편인 경우 그의 안정성을 향상시킬 수 있다.
항체는 또한, 예를 들어 중쇄 및/또는 경쇄의 가변성 도메인에서 변형되어, 예를 들어, 항체의 결합 특성을 변경시킬 수 있다. 가변성 영역에서의 변화는 결합 친화도 및/또는 특이성을 변경시킬 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 1 내지 5개 이하의 보존적 아미노산 치환이 CDR 도메인내에서 만들어 진다. 다른 실시양태에서, 1 내지 3개 이하의 보존적 아미노산 치환이 CDR 도메인내에서 만들어 진다. 예를 들면, 돌연변이는 하나 이상의 CDR 영역에서 만들어져 GITR에 대한 항체의 KD를 증가 또는 감소시키거나, k0ff를 증가 또는 감소시키거나, 또는 항체의 결합 특이성을 변경시킨다. 자리-지정된 돌연변이생성에서의 기법은 당분야에 잘 공지되어 있다. 예를 들어, 샘브룩(Sambrook) 등 및 어수벨(Ausubel) 등의 상기 문헌을 참조한다.
변형 또는 돌연변이는 골격구조 영역 또는 불변성 영역에서 만들어져서 항-GITR 항체의 반감기를 증가시킬 수 있다. 예를 들어, PCT 공개 번호 제WO 00/09560호를 참조한다. 골격구조 영역 또는 불변성 영역에서의 돌연변이가 또한 만들어져 항체의 면역원성을 변경시키거나, 또 다른 분자로의 공유 또는 비-공유 결합을 위한 자리를 제공하거나, 또는 보체 고착, FcR 결합 및 항체-의존성 세포-중재된 세포독성과 같은 특성을 변경시킬 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 1 내지 5개 이하의 보존적 아미노산 치환이 골격구조 영역 또는 불변성 영역내에 만들어진다. 다른 실시양태에서, 1 내지 3개 이하의 보존적 아미노산 치환이 골격구조 영역 또는 불변성 영역내에 만들어진다. 본 발명에 따라서, 단일 항체는 가변성 도메인의 임의의 하나 이상의 CDR 또는 골격구조 영역 또는 불변성 영역에서 돌연변이를 가질 수 있다.
변형은 글리코실화된 폴리펩티드 및 글리코실화되지 않은 폴리펩티드, 뿐만 아니라 다른 번역후 변형, 예컨대, 예를 들면, 상이한 당에 의한 글리코실화, 아세틸화, 및 인산화를 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 항체는 이들의 불변성 영역의 보존적 위치에서 글리코실화된다[제페리스(Jefferis) 및 룬드(Lund)의 문헌 "1997, Chem. Immunol. 65: 111-128"; 롸이트(Wright) 및 모리슨(Morrison)의 문헌 "1997, TibTECH 15: 26-32"]. 면역글로불린의 올리고당 측쇄는 단백질의 기능[보이드(Boyd) 등의 문헌 "1996, Mol. Immunol. 32: 1311-1318"; 위트위(Wittwe) 및 하워드(Howard)의 문헌 "1990, Biochem. 29: 4175-4180"] 및 당단백질의 부분들 사이의 분자내 상호작용(이는 당단백질의 입체배좌 및 제시된 3차원 표면에 영향을 줄 수 있음)[제페리스(Jefferis) 및 룬드(Lund)의 상기 문헌; 위스(Wyss) 및 와그너(Wagner)의 문헌 "1996, Current Opin. Biotech. 7: 409-416"]에 영향을 준다. 올리고당은 또한 특이적 인식 구조에 기초하여 특정 분자에 대하여 소정의 당단백질을 표적화하는 작용을 할 수 있다. 항체의 글리코실화는 또한 항체-의존성 세포독성(ADCC)에 영향을 주는 것으로 보고되어 있다. 특별히, β(1,4)-N-아세틸글루코스아미닐전달효소 III(GnTIII), 2등분 GlcNAc의 형성을 촉매화하는 글리코실전달효소의 테트라사이클린-조절된 발현을 갖는 CHO 세포에 의해 생산된 항체는, 향상된 ADCC 활성을 갖는 것으로 보고되었다[우마나(Umana) 등의 문헌 "1999, Nature Biotech. 17: 176-180"].
항체의 글리코실화는 전형적으로 N-연결되거나 또는 O-연결된다. "N-연결된"은 탄수화물 부분이 아스파라긴 잔기의 측쇄에 결합됨을 지칭한다. 트리펩티드 서열, 아스파라긴-X-세린, 아스파라긴-X-트레오닌, 및 아스파라긴-X-시스테인(여기서 X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산임)은 탄수화물 부분의 아스파라긴 측쇄로의 효소적 결합을 위한 인식 서열이다. 이와 같이, 폴리펩티드에서 이들 트리펩티드 서열의 존재는 잠재적인 글리코실화 자리를 생성한다. O-연결된 글리코실화는 당 N-아세틸갈락토스아민, 갈락토스, 또는 자일로스중 하나가 하이드록시아미노산, 가장 흔히는 세린 또는 트레오닌에 결합함을 지칭하지만, 5-하이드록시프롤린 또는 5-하이드록시라이신이 또한 사용될 수 있다.
항체로의 글리코실화 자리의 부가는 편리하게는 하나 이상의 상기 기재된 트리펩티드 서열을 함유하도록 아미노산 서열을 변경함으로써 달성된다(N-연결된 글리코실화 자리의 경우). 변경은 또한 하나 이상의 세린 또는 트레오닌 잔기를 본래의 항체의 서열에 부가하거나 치환함으로써 이루어질 수 있다(O-연결된 글리코실화 자리의 경우).
항체의 글리코실화 패턴은 근본적인 뉴클레오티드 서열을 변경하지 않고 변경될 수 있다. 글리코실화는 항체를 발현시키기 위해 사용되는 숙주 세포에 크게 좌우된다. 잠재적 치료제로서의 재조합 당단백질, 예를 들어 항체의 발현을 위해 사용되는 세포 유형은 거의 고유의 세포가 아니므로, 항체의 글리코실화 패턴에서의 변화가 예상될 수 있다[예를 들어 세(Hse) 등의 문헌 "1997, J. Biol. Chem. 272: 9062-9070"].
숙주 세포의 선택에 더하여, 항체의 재조합 생산 동안 글리코실화에 영향을 주는 인자로는 성장 방식, 배지 제형, 배양 밀도, 산소화, pH, 정제 계획 등이 포함된다. 특별한 숙주 유기체에서 달성되는 글리코실화 패턴을 변경하기 위해 올리고당 생산에 관여하는 특정 효소의 도입 또는 과발현을 비롯한 다양한 방법이 제안되어 왔다(미국 특허 제5,047,335호; 제5,510,261호 및 제5,278,299호). 글리코실화, 또는 글리코실화의 특정 유형은, 예를 들면, 엔도글리코시다아제(endoglycosidase) H(Endo H), N-글리코시다아제 F, 엔도글리코시다아제 F1, 엔도글리코시다아제 F2, 엔도글리코시다아제 F3을 사용하여, 당단백질로부터 효소적으로 제거될 수 있다. 또한, 재조합 숙주 세포는 유전적으로 조작되어 다당류의 특정 유형을 가공하는데 있어서 결함이 있을 수 있다. 이러한 기법 및 유사 기법은 당분야에 잘 공지되어 있다.
변형의 다른 방법으로는 효소 수단, 산화적 치환 및 킬레이트화를 포함하나 이에 제한되지 않는 당분야에 공지된 커플링 기법을 사용함을 포함한다. 변형은, 예를 들면, 면역검정을 위한 표지의 부착을 위해 사용될 수 있다. 변형된 폴리펩티드는 당분야에 확립된 절차를 사용하여 만들어지고, 당분야에 공지된 표준 검정을 사용하여 스크리닝될 수 있는데, 이들중 몇몇은 아래 및 실시예에 기재된다.
몇몇 실시양태에서, Fc는 인간 IgG1일 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 불변성 영역은 서열 번호 129에 제시된 서열을 갖는다.
몇몇 실시양태에서, Fc는 인간 IgG2 또는 인간 IgG4일 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 항체는 하기 돌연변이를 포함하는 IgG4의 불변성 영역을 포함한다[아모르(Armour) 등의 문헌 "2003, Molecular Immunology 40 585-593"]: E233F234L235 내지 P233V234A235(IgG4△c), 여기서 넘버링은 야생형 IgG4와 관련된다. 역시 또 다른 실시양태에서, Fc는 결실 G236을 갖는 인간 IgG4 E233F234L235 내지 P233V234A235이다(lgG4△b). 몇몇 실시양태에서, Fc는 힌지 안정화 돌연변이 S228 내지 P228을 함유하는 임의의 인간 IgG4 Fc(IgG4, IgG4△b 또는 IgG4△c)이다[알베르세(Aalberse) 등의 문헌 "2002, Immunology 105, 9-19"]. 다른 실시양태에서, Fc는 돌연변이 A330P331 내지 S330S331을 함유하는 인간 IgG2일 수 있고(IgG2△a), 여기서 아미노산 잔기는 야생형 IgG2 서열과 관련하여 넘버링된다[문헌 "Eur. J. Immunol., 1999, 29: 2613-2624"].
몇몇 실시양태에서, 항체는 인간 Fc 감마 수용체에 대하여 증가되거나 감소된 결합 친화도를 갖는 변형된 불변성 영역을 포함하고, 면역학적으로 비활성 또는 부분적으로 비활성이며, 예를 들어, 보체 중재된 용해를 개시하지 않고, 항체-의존성 세포 중재된 세포독성(ADCC)을 자극하지 않거나, 또는 미세아교세포를 활성화시키지 않거나; 또는 임의의 하나 이상의 하기 작용에서 감소된 활성(변형되지 않은 항체와 비교하여)을 갖는다: 보체 중재된 용해의 개시, ADCC의 자극, 또는 미세아교세포의 활성화. 불변성 영역의 상이한 변형은 효과자 기능의 최적의 수준 및/또는 조합을 달성하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들면, 모르간(Morgan) 등의 문헌[Immunology 86: 319-324, 1995]; 룬드(Lund) 등의 문헌[J. Immunology 157: 4963-9157: 4963-4969, 1996]; 이두소기에(Idusogie) 등의 문헌[J. Immunology 164: 4178-4184, 2000]; 타오(Tao) 등의 문헌[J. Immunology 143: 2595-2601, 1989]; 및 제페리스(Jefferis) 등의 문헌[Immunological Reviews 163: 59-76, 1998]을 참조한다. 몇몇 실시양태에서, 불변성 영역은 문헌[Eur. J. Immunol., 1999, 29: 2613-2624]; PCT 공개 번호 제WO 99/058572호에 기재된 바와 같이 변형된다.
몇몇 실시양태에서, 항체 불변성 영역은 Fc 감마 수용체, 보체 및 면역계와의 상호작용을 피하기 위해 변형될 수 있다. 이러한 항체의 제조를 위한 기법은 국제 특허출원 공개공보 제WO 99/58572호에 기재되어 있다. 예를 들면, 불변성 영역은, 항체가 인간에서 임상적 실험 및 치료에 사용될 경우, 면역 반응을 피하기 위해 인간 불변성 영역과 더욱 닮도록 조작될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 제5,997,867호 및 제5,866,692호를 참조한다.
또 다른 실시양태에서, 불변성 영역은 N-연결된 글리코실화에 대해 비글리코실화된다. 몇몇 실시양태에서, 불변성 영역은 불변성 영역에서 N-글리코실화 인식 서열의 일부인 올리고당 결합 잔기 및/또는 플랭킹(flanking) 잔기를 돌연변이시킴으로써 N-연결된 글리코실화에 대해 비글리코실화된다. 예를 들면, N-글리코실화 자리 N297은, 예를 들어, A, Q, K, 또는 H로 돌연변이될 수 있다. 타오(Tao) 등의 문헌[J. Immunology 143: 2595-2601, 1989]; 및 제페리스(Jefferis) 등의 문헌[Immunological Reviews 163: 59-76, 1998]을 참조한다. 몇몇 실시양태에서, 불변성 영역인 N-연결된 글리코실화에 대해 비글리코실화된다. 불변성 영역은 효소적으로(예컨대, 효소 PNG아제에 의한 탄수화물의 제거), 또는 글리코실화 결핍 숙주 세포에서의 발현에 의해 N-연결된 글리코실화에 대해 비글리코실화될 수 있다.
다른 항체 변형은 PCT 공개 번호 제WO 99/58572호에 기재된 바와 같이 변형된 항체를 포함한다. 이들 항체는 표적 분자로 인도되는 결합 도메인에 더하여, 인간 면역글로불린 중쇄의 불변성 영역 전부 또는 일부와 실질적으로 상동성인 아미노산 서열을 갖는 효과자 도메인을 포함한다. 이들 항체는 상당한 보체 의존성 용해, 또는 표적의 세포-중재된 파괴를 개시하지 않으면서 표적 분자와 결합할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 효과자 도메인은 FcRn 및/또는 FcYRIIb에 특이적으로 결합할 수 있다. 이들은 둘 이상의 인간 면역글로불린 중쇄 CH2 도메인으로부터 유래된 키메라성 도메인에 기초한다. 이러한 방식으로 변형된 항체는, 통상적 항체 치료법에 대한 염증 및 기타 부작용을 방지하기 위해, 만성 항체 치료법에서 사용하기에 특별히 적합하다.
몇몇 실시양태에서, 항체는 변형되지 않은 항체와 비교할 경우 FcRn에 대한 증가된 결합 친화도 및/또는 증가된 혈청 반감기를 갖는 변형된 불변성 영역을 포함한다.
"생식계열화(germlining)"로서 공지된 과정에서, VH 및 VL 서열중의 특정 아미노산은 생식계열 VH 및 VL 서열에서 자연으로 발견되는 아미노산과 부합되도록 돌연변이될 수 있다. 특별히, VH 및 VL 서열에서 골격구조 영역의 아미노산 서열은 항체가 투여될 경우 면역원성의 위험을 감소시키기 위해 생식계열 서열과 부합되도록 돌연변이될 수 있다. 인간 VH 및 VL 유전자에 대한 생식계열 DNA 서열은 당분야에 공지되어 있다[예를 들어, "Vbase" 인간 생식계열 서열 데이터베이스 참조; 또한 카밧(Kabat, E. A.) 등의 문헌 "1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242"; 톰린슨(Tomlinson) 등의 문헌 "1992, J. Mol. Biol. 227: 776-798"; 및 콕스(Cox) 등의 문헌 "1994, Eur. J. Immunol. 24: 827-836 참조].
만들어질 수 있는 아미노산 치환의 또 다른 유형은 항체에서 잠재적인 단백질분해 자리를 제거하는 것이다. 이러한 자리는 항체의 가변성 도메인의 CDR 또는 골격구조 영역에서 또는 불변성 영역에서 발생될 수 있다. 시스테인 잔기의 치환 및 단백질분해 자리의 제거는 항체 생성물에서 이종성의 위험을 감소시키고, 이에 따라 그의 동종성을 증가시킨다. 아미노산 치환의 또 다른 유형은 아스파라긴-글리신 쌍을 제거하는 것이고, 이는 잔기중 하나 또는 둘 다를 변경시킴으로써 잠재적인 탈아미드화 자리를 형성한다. 또 다른 예에서, 본 발명의 항-GITR 항체의 중쇄의 C-말단 라이신은 분열될 수 있다. 본 발명의 다양한 실시양태에서, 항-GITR 항체의 중쇄 및 경쇄는 임의적으로 신호 서열을 포함할 수 있다.
일단 본 발명의 VH 및 VL 분절을 인코딩하는 DNA 단편이 수득되면, 이들 DNA 단편은 표준 재조합 DNA 기법에 의해 추가로 조작되어, 예를 들면 가변성 영역 유전자를 전장 항체 쇄 유전자로, Fab 단편 유전자로, 또는 scFv 유전자로 전환시킬 수 있다. 이들 조작에서, VL- 또는 VH-인코딩 DNA 단편은 또 다른 단백질을 인코딩하는 또 다른 DNA 단편, 예컨대 항체 불변성 영역 또는 가요성 연결기에 작동적으로 연결된다. 이와 관련하여 사용되는 용어 "작동적으로 연결된"은, 2개의 DNA 단편에 의해 인코딩된 아미노산 서열이 프레임내에 유지되도록 2개의 DNA 단편이 연결됨을 의미하고자 한다.
VH 영역을 인코딩하는 단리된 DNA는 중쇄 불변성 영역(CH1, CH2 및 CH3)을 인코딩하는 또 다른 DNA 분자에 VH-인코딩 DNA를 작동적으로 연결시킴으로써 전장 중쇄 유전자로 전환될 수 있다. 인간 중쇄 불변성 영역 유전자의 서열은 당분야에 공지되어 있고[예를 들어, 카밧(Kabat, E. A.) 등의 문헌 "1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242" 참조], 이들 영역을 포괄하는 DNA 단편은 표준 PCR 증폭에 의해 수득될 수 있다. 중쇄 불변성 영역은 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM 또는 IgD 불변성 영역일 수 있지만, 가장 바람직하게는 IgG1 또는 IgG2 불변성 영역이다. IgG 불변성 영역 서열은 상이한 개체 사이에서 발생하는 것으로 공지된 다양한 대립유전자 또는 알로타입(allotype)중 임의의 것일 수 있고, 예컨대 Gm(1), Gm(2), Gm(3), 및 Gm(17)이다. 이들 알로타입은 IgG1 불변성 영역에서 자연 발생되는 아미노산 치환을 나타낸다. Fab 단편 중쇄 유전자의 경우, VH-인코딩 DNA는 단지 중쇄 CH1 불변성 영역을 인코딩하는 또 다른 DNA 분자에 작동적으로 연결될 수 있다. CH1 중쇄 불변성 영역은 임의의 중쇄 유전자로부터 유래될 수 있다.
VL 영역을 인코딩하는 단리된 DNA는 경쇄 불변성 영역, CL을 인코딩하는 또 다른 DNA 분자에 VL-인코딩 DNA를 작동적으로 연결시킴으로써 전장 경쇄 유전자 (뿐만 아니라 Fab 경쇄 유전자)로 전환될 수 있다. 인간 경쇄 불변성 영역 유전자의 서열은 당분야에 공지되어 있고[예를 들어, 카밧(Kabat, E. A.) 등의 문헌 "1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242" 참조], 이들 영역을 포괄하는 DNA 단편은 표준 PCR 증폭에 의해 수득될 수 있다. 경쇄 불변성 영역은 카파 또는 람다 불변성 영역일 수 있다. 카파 불변성 영역은 상이한 개체 사이에서 발생하는 것으로 공지된 다양한 대립유전자중 임의의 것일 수 있고, 예컨대 Inv(1), Inv(2), 및 Inv(3)이다. 람다 불변성 영역은 3가지 람다 유전자중 임의의 유전자로부터 유래될 수 있다.
scFv 유전자를 생성하기 위해, VH- 및 VL-인코딩 DNA 단편은, 가요성 연결기에 의해 VL 및 VH 영역이 연결되면서 VH 및 VL 서열이 인접한 단일-쇄 단백질로서 발현될 수 있도록, 가요성 연결기를 인코딩하는 또 다른 단편에 작동적으로 연결된다[예를 들어, 버드(Bird) 등의 문헌 "1988, Science 242: 423-426"; 휴스턴(Huston) 등의 문헌 "1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883"; 맥카퍼티(McCafferty) 등의 문헌 "1990, Nature 348: 552-554" 참조]. 연결 펩티드의 일예는 (GGGGS)3(서열 번호 130)이고, 이는 하나의 가변성 영역의 카복시 말단 및 나머지 가변성 영역의 아미노 말단 사이를 대략 3.5 nm 거리로 가교연결한다. 다른 서열의 연결기가 고안되고 사용되었다[버드(Bird) 등의 상기 1988년도 문헌]. 다시, 연결기는 추가적인 기능, 예컨대 약물의 결합 또는 고체 지지체로의 결합을 위해 변형될 수 있다. 단일 쇄 항체는 단지 단일한 VH 및 VL이 사용될 경우 1가일 수 있고, 2가지 VH 및 VL이 사용될 경우 2가일 수 있으며, 2가지 이상의 VH 및 VL이 사용될 경우 다가일 수 있다. GITR 및 또 다른 분자에 특이적으로 결합하는 이중특이적 또는 다가 항체가 생성될 수 있다. 단일 쇄 변이체는 재조합적으로 또는 합성적으로 생산될 수 있다. scFv의 합성적 생산을 위해, 자동화된 합성기가 사용될 수 있다. scFv의 재조합 생산을 위해, scFv를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 적합한 플라스미드가 적합한 숙주 세포, 즉 진핵 세포, 예컨대 효모, 식물, 곤충 또는 포유동물 세포, 또는 원핵 세포, 예컨대 이. 콜라이에 도입될 수 있다. 관심있는 scFv를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 일상적 조작에 의해, 예컨대 폴리뉴클레오티드의 결찰에 의해 제조될 수 있다. 생성된 scFv는 당분야에 공지된 표준 단백질 정제 기법을 사용하여 단리될 수 있다.
단일 쇄 항체의 다른 형태, 예컨대 디아바디가 또한 포괄된다. 디아바디는 2가의 이중특이적 항체이고, 여기서 VH 및 VL은 단일 폴리펩티드 쇄 상에서 발현되지만, 동일한 쇄 상의 2개의 도메인 사이에 짝형성을 허용하기에는 너무 짧은 연결기를 사용하고, 이로써 도메인이 또 다른 쇄의 상보성 도메인과 쌍을 이루도록 압박하여 2개의 항원 결합 자리를 생성한다[예를 들어, 홀리거(Holliger, P.) 등의 문헌 "1993, Proc. Natl. Acad Sci. USA 90: 6444-6448"; 폴작(Poljak, R. J.) 등의 문헌 "1994, Structure 2: 1121-1123"].
2개의 공유적으로 연결된 항체를 포함하는 헤테로컨주게이트 항체는 또한 본 발명의 범주내에 속한다. 이러한 항체는 면역계 세포를 원치않는 세포에 표적화시키기 위해(미국 특허 제4,676,980호), 및 HIV 감염의 치료를 위해(PCT 공개 번호 제WO 91/00360호 및 제WO 92/200373호; EP 제03089호) 사용되어 왔다. 헤테로컨주게이트 항체는 임의의 편리한 가교결합 방법을 사용하여 만들어질 수 있다. 적합한 가교결합제 및 기법은 당분야에 잘 공지되어 있고, 미국 특허 제4,676,980호에 기재되어 있다.
키메라성 또는 혼성 항체는 또한 가교결합제를 포함하는 방법을 비롯하여 합성 단백질 화학에 대한 공지된 방법을 사용하여 시험관내에서 제조될 수 있다. 예를 들면, 면역독소는 디설파이드 교환 반응을 사용하여, 또는 티오에테르 결합을 형성함으로써 작성될 수 있다. 이러한 목적을 위해 적합한 시약의 예로는 이미노티올레이트 및 메틸-4-머캅토부티르이미데이트가 포함된다.
본 발명은 또한 본원에 개시된 항체로부터의 하나 이상의 단편 또는 영역을 포함하는 융합 단백질을 포괄한다. 몇몇 실시양태에서, 또 다른 폴리펩티드에 연결된 본 발명의 항-GITR 항체의 전부 또는 일부를 포함하는 융합 항체가 만들어질 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 단지 항-GITR 항체의 가변성 도메인만이 폴리펩티드에 연결된다. 또 다른 실시양태에서, VH 및 VL 도메인이 서로 상호작용하여 항원 결합 자리를 형성하는 방식으로, 항-GITR 항체의 VH 도메인 제1 폴리펩티드에 연결되는 반면, 항-GITR 항체의 VL 도메인은 제1 폴리펩티드와 회합된 제2 폴리펩티드에 연결된다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, VH 및 VL 도메인이 서로 상호작용할 수 있는 방식으로 VH 도메인은 VL 도메인으로부터 연결기에 의해 분리된다. 이어서 VH-연결기-VL 항체는 관심있는 폴리펩티드에 연결된다. 또한, 2개(또는 그 이상)의 단일-쇄 항체가 서로 연결된 융합 항체가 생성될 수 있다. 이는 2가 또는 다가 항체를 단일 폴리펩티드 쇄 상에서 생성하고자 하거나, 이중특이적 항체를 생성하고자 할 경우 유용하다.
몇몇 실시양태에서, 서열 번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 111, 120, 122, 69, 또는 71에 제시된 가변성 경쇄 영역의 적어도 10개의 인접한 아미노산, 및/또는 서열 번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 70, 72, 112, 121, 또는 123에 제시된 가변성 중쇄 영역의 적어도 10개의 인접한 아미노산을 포함하는 융합 폴리펩티드가 제공된다. 다른 실시양태에서, 가변성 경쇄 영역의 적어도 약 10개, 적어도 약 15개, 적어도 약 20개, 적어도 약 25개, 또는 적어도 약 30개의 인접한 아미노산 및/또는 가변성 중쇄 영역의 적어도 약 10개, 적어도 약 15개, 적어도 약 20개, 적어도 약 25개, 또는 적어도 약 30개의 인접한 아미노산을 포함하는 융합 폴리펩티드가 제공된다. 또 다른 실시양태에서, 융합 폴리펩티드는 서열 번호 1 및 2, 3 및 4, 5 및 6, 7 및 8, 9 및 10, 11 및 12, 13 및 14, 111 및 112, 15 및 16, 17 및 18, 19 및 20, 120 및 121, 122 및 123, 69 및 70, 또는 71 및 72로부터 선택된 임의의 서열 쌍에 제시된 바와 같은 경쇄 가변성 영역 및/또는 중쇄 가변성 영역을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 융합 폴리펩티드는 하나 이상의 CDR(들)을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 융합 폴리펩티드는 VH CDR3 및/또는 VL CDR3을 포함한다. 본 발명의 목적을 위해, 융합 단백질은 하나 이상의 항체, 및 고유의 분자에 결합되어 있지 않은 또 다른 아미노산 서열, 예를 들면, 이종성 서열 또는 또 다른 영역으로부터의 동종성 서열을 함유한다. 예시적인 이종성 서열로는, 제한되지 않지만, "태그" 예컨대 FLAG 태그 또는 6His 태그가 포함된다. 태그는 당분야에 잘 공지되어 있다.
융합 폴리펩티드는 당분야에 공지된 방법에 의해, 예를 들면, 합성적으로 또는 재조합적으로 생성될 수 있다. 전형적으로, 본 발명의 융합 단백질은 이들을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 본원에 기재된 재조합 방법에 따라 제조하고 발현함으로써 만들어 지지만, 이들은 또한 예를 들면, 화학 합성을 포함하여 당분야에 공지된 다른 수단에 의해 제조될 수 있다.
다른 실시양태에서, 다른 변형된 항체는 항-GITR 항체 인코딩 핵산 분자를 사용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, "카파 바디(Kappa body)"[III 등의 문헌 " 1997, Protein Eng. 10: 949-57"], "미니바디(Minibody)"[마틴(Martin) 등의 문헌 "1994, EMBO J. 13: 5303-9"], "디아바디(Diabody)"[홀리거(Holliger) 등의 상기 문헌], 또는 "자누신(Janusin)"[트라우네커(Traunecker) 등의 문헌 "1991, EMBO J. 10: 3655-3659" 및 트라우네커 등의 문헌 "1992, Int. J. Cancer (Suppl.) 7: 51 -52"]은 본 명세서의 교시에 따라 표준 분자 생물학적 기법을 사용하여 제조될 수 있다.
예를 들면, 적어도 2개의 상이한 항원에 대하여 결합 특이성을 갖는 단일클론성 항체인 이중특이적 항체는 본원에 개시된 항체를 사용하여 제조될 수 있다. 이중특이적 항체를 제조하는 방법은 당분야에 공지되어 있다[예를 들어, 수레쉬(Suresh) 등의 문헌 "1986, Methods in Enzymology 121: 210"]. 예를 들면, 이중특이적 항체 또는 항원-결합 단편은 하이브리도마의 융합 또는 Fab' 단편의 연결에 의해 생산될 수 있다. 예를 들어, 송시빌라이(Songsivilai) 및 라흐만(Lachmann)의 문헌[1990, Clin. Exp. Immunol. 79: 315-321], 코스텔니(Kostelny) 등의 문헌[1992, J. Immunol. 148: 1547-1553]을 참조한다. 전통적으로, 이중특이적 항체의 재조합 생산은 2개의 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍의 공-발현에 기초하였고, 이때 2개의 중쇄는 상이한 특이성을 가졌다[밀스타인(Millstein) 및 쿠엘로(Cuello)의 문헌 "1983, Nature 305, 537-539"]. 또한, 이중특이적 항체는 "디아바디" 또는 "자누신"으로서 형성될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 이중특이적 항체는 GITR의 2가지 상이한 에피토프에 결합한다. 몇몇 실시양태에서, 상기 기재된 변형된 항체는 본원에 제공된 항-GITR 항체로부터의 하나 이상의 가변성 도메인 또는 CDR 영역을 사용하여 제조된다.
이중특이적 항체를 제조하는 하나의 접근법에 따라서, 원하는 결합 특이성(항체-항원 조합 자리)을 갖는 항체 가변성 도메인은 면역글로불린 불변성 영역 서열에 융합된다. 융합은 바람직하게는 힌지, CH2 및 CH3 영역의 적어도 일부를 포함하는, 면역글로불린 중쇄 불변성 영역에 의해서이다. 경쇄 결합에 필수적인 자리를 함유하는 제1 중쇄 불변성 영역(CH1)이 적어도 하나의 융합물에 존재하도록 하는 것이 바람직하다. 면역글로불린 중쇄 융합물을 인코딩하는 DNA 및, 원한다면, 면역글로불린 경쇄는 별도의 발현 벡터내로 삽입되고, 적합한 숙주 유기체내로 공형질감염된다. 이는, 작성시 사용되는 3개의 폴리펩티드 쇄의 동일하지 않은 비가 최적의 수율을 제공할 경우의 실시양태에서 3개의 폴리펩티드 단편의 상호 비율을 조정하는데 있어서 큰 유연성을 제공한다. 그러나, 동일한 비의 적어도 2개의 폴리펩티드 쇄의 발현이 높은 수율을 생성할 경우, 또는 그 비가 특별한 의미를 갖지 않는 경우, 하나의 발현 벡터에서 2개 또는 3개의 모든 폴리펩티드 쇄에 대한 코딩 서열을 삽입하는 것이 가능하다.
하나의 접근법에서, 이중특이적 항체는 한쪽 아암(arm)중의 제1 결합 특이성을 갖는 혼성 면역글로불린 중쇄, 및 나머지 아암중의 혼성 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍(제2 결합 특이성을 제공함)으로 구성된다. 이중특이적 분자의 단지 1/2에 면역글로불린 경쇄를 갖는 이러한 비대칭 구조는, 원치않는 면역글로불린 쇄 조합으로부터 원하는 이중특이적 화합물을 분리하는 것을 용이하게 한다. 이러한 접근법은 PCT 공개 번호 제WO 94/04690호에 기재되어 있다.
또 다른 접근법에서, 이중특이적 항체는 하나의 아암중의 제1 힌지 영역에서의 아미노산 변형으로 구성되고, 제1 힌지 영역에서의 치환된/대체된 아미노산은 또 다른 아암중의 제2 힌지 영역에서의 상응하는 아미노산에 반대 전하를 갖는다. 이러한 접근법은 국제 특허 출원 번호 제PCT/US2011/036419호(제WO 2011/143545호)에 기재되어 있다. 몇몇 실시양태에서, 이중특이적 항체의 형성은 제1 및 제2 Fc 영역 사이의 계면(예를 들어, 힌지 영역 및 CH3 영역)을 변경시키거나 조작함으로써 증진된다. 이러한 접근법에서, 이중특이적 항체는 CH3 영역으로 구성될 수 있고, 여기서 CH3 영역은 함께 상호작용하여 CH3 계면을 형성하는 제1 CH3 폴리펩티드 및 제2 CH3 폴리펩티드를 포함하고, 이때 CH3 계면내의 하나 이상의 아미노산은 동종이량체(예를 들어, 일특이적 항체) 형성을 불안정화시킨다. 예를 들어, 국제 특허 출원 번호 제PCT/US2011/036419호(제WO 2011/143545호)를 참조한다.
또 다른 접근법에서, 트랜스글루타미나아제(transglutaminase)의 존재하에, 하나의 아암중의 에피토프(예를 들어,GITR)로 인도되는 항체로 조작된 글루타민-함유 펩티드 태그, 및 또 다른 아암중의 제2 에피토프로 인도되는 제2 항체로 조작되는 또 다른 펩티드 태그(예를 들어, Lys-함유 펩티드 태그 또는 반응성 내생성 Lys)를 사용하여 이중특이적 항체가 생성될 수 있다. 이러한 접근법은 국제 특허 출원 PCT/IB2011/054899호(제WO 2012/059882호)에 기재되어 있다.
본 발명은 또한 고체 지지체(예컨대 비오틴 또는 아비딘)로의 커플링을 용이하게 하는 제제에 컨주게이션되는(예를 들면, 연결되는) 항체를 포함하는 조성물을 제공한다. 간편성을 위해, 일반적으로 항체에 대해 언급될 것이고, 이들 방법이 본원에 기재된 임의의 GITR 결합 실시양태에 적용되는 것으로 이해된다. 컨주게이션은 일반적으로 본원에 기재된 바와 같은 이들 성분을 연결시키는 것을 말한다. 연결(이는 일반적으로 이들 성분을 적어도 투여의 경우 가깝게 회합되도록 고정시킴)은 임의의 수의 방식으로 달성될 수 있다. 예를 들면, 제제와 항체 사이의 직접적인 반응은, 각각 서로 반응할 수 있는 치환기를 소유할 경우 가능하다. 예를 들면, 한 성분 상의 친핵성 기, 예컨대 아미노 또는 설프하이드릴 기는 나머지 성분 상의 카보닐-함유 기, 예컨대 무수물 또는 산 할로겐화물, 또는 양호한 이탈기(예를 들어, 할로겐화물)를 갖는 알킬 기와 반응할 수 있다.
항체는 많은 상이한 담체에 결합될 수 있다. 담체는 활성 및/또는 비활성일 수 있다. 공지된 담체의 예로는 폴리프로필렌, 폴리스티렌, 폴리에틸렌, 덱스트란, 나일론, 아밀라아제, 유리, 천연 및 변형 셀룰로오스, 폴리아크릴아미드, 아가로스 및 자철석이 포함된다. 담체의 성질은 본 발명의 목적을 위해 가용성이거나 불용성일 수 있다. 당분야의 숙련가는 결합 항체에 대한 다른 적합한 담체를 잘 알거나, 또는 일상적 실험을 사용하여 이를 확인할 수 있을 것이다. 몇몇 실시양태에서, 담체는 폐, 심장, 또는 심장 판막을 표적화하는 부분을 포함한다.
본 발명의 항체 또는 폴리펩티드는 표지화제, 예컨대 형광 분자, 방사능 분자 또는 당분야에 공지된 임의의 다른 표지에 연결될 수 있다. 표지는 당분야에 공지되어 있고, 이는 일반적으로(직접적으로 또는 간접적으로) 신호를 제공한다.
폴리뉴클레오티드, 벡터, 및 숙주 세포
본 발명은 또한 본원에 기재된 항체 단편 및 변형된 항체를 비롯한 임의의 항체를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 또 다른 양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 임의의 폴리뉴클레오티드를 제조하는 방법을 제공한다. 폴리뉴클레오티드는 당분야에 공지된 절차에 의해서 제조되거나 발현될 수 있다. 따라서, 몇몇 실시양태에서, 본 발명은 m3G7, h3G7VL1.1, h3G7H1, h3G7H2, h3G7AM, h3G7R5, h3G7LF, h3G7N9, m10H2, h10H2HU, h10H2AM, h10H2N13, h10H2N14, r18H12, r21B6, 또는 GITR에 결합하는 능력을 갖는 임의의 단편 또는 이의 일부를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드(또는 약학 조성물을 비롯한 조성물)를 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 본 발명의 임의의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조성물(예컨대 약학 조성물)을 제공한다. 몇몇 실시양태에서, 조성물은 본원에 기재된 임의의 항체를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 조성물은 서열 번호 88 및 89; 서열 번호 90 및 91; 서열 번호 92 및 93; 서열 번호 94 및 95; 서열 번호 96 및 97; 서열 번호 98 및 99; 서열 번호 100 및 101; 서열 번호 102 및 103; 서열 번호 104 및 105; 서열 번호 106 및 107; 서열 번호 118 및 119; 서열 번호 125 및 126; 서열 번호 127 및 128에 제시된 폴리뉴클레오티드중 하나 또는 둘 다를 포함한다.
임의의 이러한 서열에 대하여 상보성인 폴리뉴클레오티드는 또한 본 발명에 포괄된다. 폴리뉴클레오티드는 단일-가닥(코딩 또는 안티센스) 또는 이중-가닥일 수 있고, DNA(게놈성, cDNA 또는 합성) 또는 RNA 분자일 수 있다. RNA 분자는, 인트론을 함유하고 일-대-일 방식으로 DNA 분자에 상응하는 HnRNA 분자, 및 인트론을 함유하지 않는 mRNA 분자를 포함한다. 추가적인 코딩 또는 비-코딩 서열은, 필수적인 것은 아니지만, 본 발명의 폴리뉴클레오티드에 존재할 수 있고, 폴리뉴클레오티드는, 필수적인 것은 아니지만, 다른 분자 및/또는 지지 물질에 연결될 수 있다.
폴리뉴클레오티드는 고유의 서열(즉, 항체 또는 이의 단편을 인코딩하는 내생성 서열)을 포함하거나, 또는 이러한 서열의 변이체를 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드 변이체는, 인코딩된 폴리펩티드의 면역반응성이 고유의 면역반응성 분자에 비해 감소되지 않도록, 하나 이상의 치환, 부가, 결실 및/또는 삽입을 함유한다. 인코딩된 폴리펩티드의 면역반응성에 대한 영향은 일반적으로 본원에 기재된 바와 같이 평가될 수 있다. 변이체는 바람직하게는 고유의 항체 또는 이의 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열에 적어도 약 70% 동일성, 더욱 바람직하게는, 적어도 약 80% 동일성, 역시 더욱 바람직하게는, 적어도 약 90% 동일성, 및 가장 바람직하게는, 적어도 약 95%의 동일성을 나타낸다.
2개의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열은, 뉴클레오티드의 서열 또는 2개의 서열중의 아미노산이 이후 기재된 바와 같이 최대 관련성(maximum correspondence)에 대해 정렬되었을 때 같다면, "동일한" 것으로 일컬어 진다. 두 서열 사이의 비교는, 서열 유사성에 대해 국소 영역을 식별하여 비교하기 위한 비교 창(comparison window) 위에서 서열을 비교함으로써 전형적으로 수행된다. 본원에서 사용되는 "비교 창"은 적어도 약 20개, 대체적으로 30 내지 약 75개, 또는 40 내지 약 50개의 인접한 위치의 분절을 지칭하고, 여기서 하나의 서열과 기준 서열이 최적으로 정렬된 후 그 서열은 인접한 위치의 동일한 수의 기준 서열에 비교될 수 있다.
비교를 위한 서열의 최적의 정렬은, 디폴트(default) 매개변수를 사용하여, 생물정보 소프트웨어(디엔에이스타(DNASTAR, 등록상표) 인코포레이티드, 미국 위스콘신주 메디슨 소재]의 라세르겐(Lasergene: 등록상표) 도구 세트에서 메그얼라인(MegAlign: 등록상표) 프로그램을 사용함으로써 실행될 수 있다. 이러한 프로그램은 다음의 인용문헌에 기재된 몇몇 정렬 체계를 구현한다: 데이호프(Dayhoff, M.O.)의 문헌[1978, "원거리 관련성을 검출하기 위한 단백질-기질에서의 진화적 변화의 모델(A model of evolutionary change in Proteins-Matrices for detecting distant relationships)". In Dayhoff, M.O. (ed.) Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, Washington DC Vol. 5, Suppl. 3, pp. 345-358]; 하인(Hein J.)의 문헌[1990, 얼라인먼트 및 필로겐에 대한 통합된 접근법(Unified Approach to Alignment and Phylogenes) pp. 626-645 Methods in Enzymology vol. 183, Academic Press, Inc., San Diego, CA]; 히긴스(Higgins, D.G.) 및 샤프(Sharp, P.M.)의 문헌[1989, CABIOS 5: 151-153]; 마이어스(Myers, E.W.) 및 뮬러(Muller W.)의 문헌[1988, CABIOS 4: 11-17]; 로빈슨(Robinson, E.D.)의 문헌[1971, Comb. Theor. 11: 105]; 산토우(Santou, N.), 네스(Nes, M.)의 문헌[1987, Mol. Biol. Evol. 4: 406-425]; 스니쓰(Sneath, P.H.A.) 및 소칼(Sokal, R.R.)의 문헌[1973, Numerical Taxonomy the Principles and Practice of Numerical Taxonomy, Freeman Press, San Francisco, CA]; 윌버(Wilbur, W. J.) 및 립만(Lipman, D. J.)의 문헌[1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 726-730].
바람직하게는, "서열 동일성의 백분율"은 적어도 20개 위치의 비교 창 위에서 2개의 최적으로 정렬된 서열을 비교함으로써 결정되고, 여기서 비교 창에서의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열의 일부는, 두 서열의 최적의 정렬을 위한 기준 서열(이는 부가 또는 결실을 포함하지 않음)과 비교할 경우, 20 퍼센트 이하, 대체적으로 5 내지 15 퍼센트, 또는 10 내지 12 퍼센트의 부가 또는 결실(즉, 갭)을 포함할 수 있다. 백분율은 위치의 수를 결정하고(여기서 동일한 핵산 염기 또는 아미노산 잔기가 양쪽 서열에서 발생하여 부합되는 위치의 수를 산출함), 기준 서열에서의 위치의 총 수(즉, 윈도우 크기)에 의해 부합된 위치의 수를 나누고, 결과에 100을 곱하여 서열 동일성의 백분율을 산출함으로써 계산된다.
변이체는 또한, 또는 다르게는, 고유의 유전자, 또는 이의 일부 또는 보체에 실질적으로 상동성이다. 이러한 폴리뉴클레오티드 변이체는 고유의 항체를 인코딩하는 자연 발생 DNA 서열(또는 상보성 서열)에 중간 정도로 엄격한 조건하에 하이브리드화될 수 있다.
적합한 "중간 정도로 엄격한 조건"은 5x SSC, 0.5% SDS, 1.0 mM EDTA(pH 8.0)에서 예비세척하고; 50℃ 내지 65℃, 5x SSC에서 하룻밤 하이브리드화하고; 이어서 65℃에서 20 분 동안 0.1% SDS가 함유된 2x, 0.5x 및 0.2x SSC 각각에 의해 2회 세척함을 포함한다.
본원에서 사용되는 "매우 엄격한 조건" 또는 "고도의 엄격한 조건"은 다음과 같은 조건들이다: (1) 세척을 위해 낮은 이온 강도 및 높은 온도, 예를 들면 0.015M 염화 나트륨/0.0015M 시트르산 나트륨/0.1% 황산 도데실 나트륨을 50℃에서 사용하거나; (2) 하이브리드화 동안 변성제, 예컨대 포름아미드, 예를 들면, 50%(v/v) 포름아미드를 0.1% 소 혈청 알부민/0.1% 피콜(Ficoll)/0.1% 폴리비닐피롤리돈/50 mM 인산 나트륨 완충액(pH 6.5)(750 mM 염화 나트륨, 75 mM 시트르산 나트륨 포함)과 함께 42℃에서 사용하거나; 또는 (3) 50% 포름아미드, 5x SSC(0.75 M NaCl, 0.075M 시트르산 나트륨), 50 mM 인산 나트륨 완충액(pH 6.8), 0.1% 피로인산 나트륨, 5x 덴하르트(Denhardt)의 용액, 초음파처리된 연어 정자 DNA(50 ㎍/㎖), 0.1% SDS, 및 10% 황산 덱스트란을 42℃에서 이용하고, 이때 42℃에서 0.2x SSC(염화 나트륨/시트르산 나트륨)에 의해, 및 55℃에서 50% 포름아미드에 의해 세척한 후, 55℃에서 EDTA를 함유한 0.1x SSC로 구성된 고도로 엄격한 세척을 수행한다. 숙련가라면 프로브 길이 등과 같은 인자를 수용하기 위해 필요할 경우, 온도, 이온 강도 등을 어떻게 조정하는지를 인식할 것이다.
당분야의 숙련가라면, 유전 암호의 동의성(degeneracy)의 결과로서, 본원에 기재된 바와 같은 폴리펩티드를 인코딩하는 많은 뉴클레오티드 서열이 존재함을 이해할 것이다. 이들 폴리뉴클레오티드중 몇몇은 임의의 고유의 유전자의 뉴클레오티드 서열에 최소한의 상동성을 갖는다. 그럼에도 불구하고, 코돈 사용빈도(codon usage)에서의 차이에 기인하여 다양한 폴리뉴클레오티드는 본 발명에 의해 특별히 고려된다. 추가로, 본원에 제공된 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 유전자의 대립유전자는 본 발명의 범주내에 속한다. 대립유전자는 뉴클레오티드의 하나 이상의 돌연변이, 예컨대 결실, 부가 및/또는 치환의 결과로서 변경된 내생성 유전자이다. 생성된 mRNA 및 단백질은, 필수적인 것은 아니지만, 변경된 구조 또는 기능을 가질 수 있다. 대립유전자는 표준 기법(예컨대 하이브리드화, 증폭 및/또는 데이터베이스 서열 비교)을 사용하여 식별될 수 있다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드는 화학 합성, 재조합 방법, 또는 PCR을 사용하여 수득될 수 있다. 화학적 폴리뉴클레오티드 합성 방법은 당분야에 잘 공지되어 있고, 본원에 상세히 기재될 필요가 없다. 당분야의 숙련가라면 본원에 제공된 서열 및 상업용 DNA 합성기를 사용하여 원하는 DNA 서열을 생산할 수 있다.
재조합 방법을 사용하여 폴리뉴클레오티드를 제조하기 위해, 본원에 추가로 논의되는 바와 같이, 원하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드는 적합한 벡터내로 삽입될 수 있고, 다시, 이러한 벡터는 복제 및 증폭을 위해 적합한 숙주 세포내로 도입될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 당분야에 공지된 임의의 수단에 의해 숙주 세포내로 삽입될 수 있다. 외래성 폴리뉴클레오티드를 직접적 흡취, 엔도시토시스(endocytosis), 형질감염, F-메이팅(mating) 또는 전기천공에 의해 도입함으로써 세포가 형질전환될 수 있다. 일단 도입되면, 외래성 폴리뉴클레오티드는 비-통합 벡터(예컨대 플라스미드)로서 세포내에 유지되거나, 또는 숙주 세포 게놈내로 통합될 수 있다. 이렇게 증폭된 폴리뉴클레오티드는 당분야에 공지된 방법에 의해 숙주 세포로부터 단리될 수 있다. 예를 들어, 샘브룩(Sambrook) 등의 1989년도 문헌을 참조한다.
다르게는, PCR은 DNA 서열의 재현을 허용한다. PCR 기술은 당분야에 잘 공지되어 있고 미국 특허 제4,683,195호, 제4,800,159호, 제4,754,065호 및 제4,683,202호, 뿐만 아니라 문헌[PCR: The Polymerase Chain Reaction, Mullis et al. eds., Birkauswer Press, Boston, 1994]에 기재되어 있다.
RNA는 단리된 DNA를 적절한 벡터에서 사용하고 이를 적합한 숙주 세포에 삽입함으로써 수득될 수 있다. 세포가 복제되고 DNA가 RNA로 전사될 경우, 이어서 RNA는 당분야의 숙련가에게 공지된 방법을 사용하여 단리될 수 있고, 이는 예를 들면 샘브룩(Sambrook) 등의 상기 1989년도 문헌에 제시된 바와 같다.
적합한 클로닝 벡터는 표준 기법에 따라서 작성되거나, 당분야에서 이용가능한 다수의 클로닝 벡터로부터 선택될 수 있다. 선택된 클로닝 벡터는 사용하고자 하는 숙주 세포에 따라 달라질 수 있지만, 유용한 클로닝 벡터는 일반적으로 자가-복제 능력을 갖고, 특별한 제한 엔도뉴클레아제(endonuclease)에 대한 단일 표적을 소유하고/하거나, 벡터를 함유하는 클론을 선택하는데 사용될 수 있는 마커를 위한 유전자를 전달할 수 있다. 적합한 예로는 플라스미드 및 세균성 바이러스, 예를 들어, pUC18, pUC19, 블루스크립트(Bluescript)(예를 들어, pBS SK+) 및 그의 유도체, mp18, mp19, pBR322, pMB9, ColE1, pCR1, RP4, 파아지 DNA, 및 셔틀(shuttle) 벡터, 예컨대 pSA3 및 pAT28이 포함된다. 이들 및 많은 다른 클로닝 벡터는 예컨대 바이오래드(BioRad), 스트라테겐(Strategene), 및 인비트로겐(Invitrogen)과 같은 상업적 판매 회사로부터 입수가능하다.
발현 벡터는 추가로 제공된다. 발현 벡터는 일반적으로 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드를 함유하는 복제가능한 폴리뉴클레오티드 작성물이다. 발현 벡터가 에피솜(episome)으로서 또는 염색체 DNA의 통합 부분으로서 복제가능해야 한다는 뜻은 내포되어 있다. 적합한 발현 벡터로는, 제한되지 않지만, 플라스미드, 바이러스성 벡터, 예컨대 아데노바이러스, 아데노-연관된 바이러스, 레트로바이러스, 코스미드(cosmids) 및 PCT 공개 번호 제WO 87/04462호에 개시된 발현 벡터(들)가 포함된다. 벡터 성분은 일반적으로, 제한되지 않지만, 다음중 하나 이상을 포함한다: 신호 서열; 복제의 기원; 하나 이상의 마커 유전자; 적합한 전사 제어 요소(예컨대 프로모터, 인헨서 및 종결자). 발현(즉, 번역)을 위해, 하나 이상의 번역된 제어 요소가 또한 대체적으로 필요하고, 예컨대 리보솜 결합 자리, 번역 개시 자리, 및 종결 코돈이다.
관심있는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 벡터는 전기천공, 염화 칼슘, 염화 루비듐, 인산 칼슘, DEAE-덱스트란, 또는 기타 물질을 사용한 형질감염; 미립자가속장치 폭탄(microprojectile bombardment); 리포펙틴; 및 감염(예를 들어, 여기서 벡터는 감염제, 예컨대 백신 바이러스임)을 비롯한 임의의 수의 적절한 수단에 의해 숙주 세포내로 도입될 수 있다. 벡터 또는 폴리뉴클레오티드를 도입하는 선택 사항은 종종 숙주 세포의 특징에 좌우될 것이다.
본 발명은 또한 본원에 기재된 임의의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 이종성 DNA를 과발현시킬 수 있는 임의의 숙주 세포는 관심있는 항체, 폴리펩티드 또는 단백질을 인코딩하는 유전자를 단리할 목적으로 사용될 수 있다. 포유동물 숙주 세포의 비제한적인 예로는, COS, HeLa, 및 CHO 세포가 포함되지만 이에 제한되지 않는다. 또한 PCT 공개 번호 제WO 87/04462호를 참조한다. 적합한 비-포유동물 숙주 세포는 원핵[예컨대 이. 콜라이 또는 비. 섭틸리스(B. subtillis)] 및 효모[예컨대 에스. 세레비시에(S. cerevisae), 에스. 폼베(S. pombe); 또는 케이. 락티스(K. lactis)]를 포함한다. 바람직하게는, 숙주 세포는, 존재한다면 숙주 세포에서 관심있는 상응하는 내생성 항체 또는 단백질의 경우에 비해, 약 5 배 더 높은, 더욱 바람직하게는, 10 배 더 높은, 더 더욱 바람직하게는, 20 배 더 높은 수준으로 cDNA를 발현한다. GITR 또는 GITR 도메인으로의 특이적 결합에 대한 숙주 세포의 스크리닝은 면역검정 또는 FACS에 의해 실행된다. 관심있는 항체 또는 단백질을 과발현하는 세포는 식별될 수 있다.
발현 벡터는 항-GITR 항체의 발현을 지시하기 위해 사용될 수 있다. 당분야의 숙련가라면 외래성 단백질의 발현을 생체내에서 수득하기 위한 발현 벡터의 투여가 친숙할 것이다. 예를 들어, 미국 특허 제6,436,908호; 제6,413,942호; 및 제6,376,471호를 참조한다. 발현 벡터의 투여는 국소 또는 전신 투여, 예컨대 주사, 경구 투여, 입자 권총(particle gun) 또는 카테터화(catheterized) 투여, 및 국부 투여를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 발현 벡터는 교감신경간 또는 결절종으로, 또는 관상 동맥, 심방, 심실, 또는 심막내로 직접적으로 투여된다.
발현 벡터, 또는 서브게놈성(subgenomic) 폴리뉴클레오티드를 함유하는 치료학적 조성물의 표적화된 전달이 또한 사용될 수 있다. 수용체-중재된 DNA 전달 기법은, 예를 들면, 핀데이스(Findeis) 등의 문헌[Trends Biotechnol., 1993, 11: 202]; 치우(Chiou) 등의 문헌[Gene Therapeutics: Methods and Applications Of Direct Gene Transfer, J.A. Wolff, ed., 1994]; 우(Wu) 등의 문헌[J. Biol. Chem., 1988, 263: 621]; 우(Wu) 등의 문헌[J. Biol. Chem., 1994, 269: 542]; 젠케(Zenke) 등의 문헌[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1990, 87: 3655]; 우(Wu) 등의 문헌[J. Biol. Chem., 1991, 266: 338]에 기재되어 있다. 폴리뉴클레오티드를 함유하는 치료학적 조성물은 유전자 치료법 프로토콜에서 국소 투여를 위해 DNA의 약 100 ng 내지 약 200 mg의 범위로 투여된다. DNA의 약 500 ng 내지 약 50 mg 약 1 g 내지 약 2 mg, 약 5 ㎍ 내지 약 500 ㎍, 및 약 20 ㎍ 내지 약 100 ㎍ 농도 범위가 또한 유전자 치료법 프로토콜 동안 사용될 수 있다. 치료학적 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드는 유전자 전달 비히클을 사용하여 전달될 수 있다. 유전자 전달 비히클은 바이러스성 또는 비-바이러스성 기원일 수 있다[일반적으로, 졸리(Jolly)의 문헌 "Cancer Gene Therapy, 1994, 1: 51"; 기무라(Kimura)의 문헌 "Human Gene Therapy, 1994, 5: 845"; 코넬리(Connelly)의 문헌 "Human Gene Therapy, 1995, 1: 185"; 및 카플리트(Kaplitt)의 문헌 "Nature Genetics, 1994, 6: 148" 참조]. 이러한 코딩 서열의 발현은 내생성 포유동물 또는 이종성 프로모터를 사용하여 유도될 수 있다. 코딩 서열의 발현은 항시성이거나 조절될 수 있다.
원하는 폴리뉴클레오티드의 전달 및 원하는 세포에서의 발현을 위한 바이러스-기반의 벡터는 당분야에 잘 공지되어 있다. 예시적인 바이러스-기반의 비히클로는, 제한되지 않지만, 재조합 레트로바이러스(예를 들어, PCT 공개 번호 제WO 90/07936호; 제WO 94/03622호; 제WO 93/25698호; 제WO 93/25234호; 제WO 93/11230호; 제WO 93/10218호; 제WO 91/02805호; 미국 특허 제5,219,740호 및 제4,777,127호; GB 특허 제2,200,651호; 및 EP 특허 제0 345 242호 참조], 알파바이러스-기반의 벡터[예를 들어, 신드비스(Sindbis) 바이러스 벡터, 셈리키 포레스트(Semliki forest) 바이러스(ATCC VR-67; ATCC VR-1247), 로스 리버(Ross River) 바이러스(ATCC VR-373; ATCC VR-1246) 및 베네주엘라 말 뇌염 바이러스(ATCC VR-923; ATCC VR-1250; ATCC VR 1249; ATCC VR-532)], 및 아데노-연관된 바이러스(AAV) 벡터(예를 들어, PCT 공개 번호 제WO 94/12649호, 제WO 93/03769호; 제WO 93/19191호; 제WO 94/28938호; 제WO 95/11984호 및 제WO 95/00655호 참조]가 포함된다. 쿠리엘(Curiel)의 문헌[Hum. Gene Ther, 1992, 3: 147]에 기재된 바와 같은 사멸된 아데노바이러스에 연결된 DNA의 투여가 또한 이용될 수 있다.
사멸된 아데노바이러스에 연결되거나 연결되지 않은 다가양이온 축합된 DNA 단독[예를 들어, 쿠리엘(Curiel)의 문헌"Hum. Gene Ther, 1992, 3: 147" 참조]; 리간드-연결된 DNA[예를 들어, 우(Wu)의 문헌 "J. Biol. Chem., 1989, 264: 16985" 참조]; 진핵 세포 전달 비히클 세포[예를 들어, 미국 특허 제5,814,482호; PCT 공개 번호 제WO 95/07994호; 제WO 96/17072호; 제WO 95/30763호; 및 제WO 97/42338호 참조] 및 세포 막과의 융합 또는 핵 전하 중화를 포함하나 이에 제한되지 않는 비-바이러스성 전달 비히클 및 방법 또한 이용될 수 있다. 네이키드 DNA가 또한 사용될 수 있다. 예시적인 네이키드 DNA 도입 방법은 PCT 공개 번호 제WO 90/11092호 및 미국 특허 제5,580,859호에 기재되어 있다. 유전자 전달 비히클로서 작용할 수 있는 리포솜은 미국 특허 제5,422,120호; PCT 공개 번호 제WO 95/13796호; 제WO 94/23697호; 제WO 91/14445호; 및 EP 제0524968호에 기재되어 있다. 추가적인 접근법은 필립(Philip)의 문헌[Mol. Cell Biol., 1994, 14: 2411], 및 워펜딘(Woffendin)의 문헌[Proc. Natl. Acad. Sci., 1994, 91: 1581]에 기재되어 있다.
조성물
본 발명은 효과량의 본원에 기재된 항-GITR 항체를 포함하는 약학 조성물을 또한 제공한다. 이러한 조성물의 예, 뿐만 아니라 제형화 방법이 또한 본원에 기재되어 있다. 몇몇 실시양태에서, 조성물은 하나 이상의 항-GITR 항체를 포함한다. 다른 실시양태에서, 항-GITR 항체는 GITR을 인식한다. 다른 실시양태에서, 항-GITR 항체는 인간 항체이다. 다른 실시양태에서, 항-GITR 항체는 인간화된 항체이다. 몇몇 실시양태에서, 항-GITR 항체는 원하는 면역 반응, 예컨대 항체-중재된 용해, ADCC, 및/또는 ADCP를 개시할 수 있는 불변성 영역을 포함한다. 다른 실시양태에서, 항-GITR 항체는 원치않거나 바람직하지 않은 면역 반응, 예컨대 항체-중재된 용해, ADCC, 및/또는 ADCP를 개시하지 않는 불변성 영역을 포함한다. 다른 실시양태에서, 항-GITR 항체는 항체의 하나 이상의 CDR(들)(예컨대 1, 2, 3, 4, 5개, 또는 몇몇 실시양태에서, 모두 6개의 CDR)을 포함한다.
조성물은 하나 보다 많은 항-GITR 항체를 포함할 수 있는 것으로 이해된다(예를 들어, GITR의 상이한 에피토프를 인식하는 GITR 항체의 혼합물). 다른 예시적인 조성물은 동일한 에피토프(들)를 인식하는 하나 보다 많은 항-GITR 항체, 또는 GITR의 상이한 에피토프에 결합하는 항-GITR 항체의 상이한 종을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 조성물은 GITR의 상이한 변이체를 인식하는 항-GITR 항체의 혼합물을 포함한다.
본 발명에 사용된 조성물은 동결건조된 제형 또는 수성 용액의 형태로 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제, 또는 안정화제를 추가로 포함할 수 있다[레밍턴(Remington)의 문헌 "The Science and practice of Pharmacy 20th Ed., 2000, Lippincott Williams and Wilkins, Ed. K. E. Hoover"]. 허용가능한 담체, 부형제, 또는 안정화제는 투여량 및 농도에서 수여자에게 무독성이고, 완충액, 예컨대 인산염, 시트르산염, 및 기타 유기 산; 항산화제, 예컨대 아스코르브산 및 메티오닌; 보존제(예컨대 염화 옥타데실디메틸벤질 암모늄; 염화 헥사메토늄; 염화 벤즈알코늄, 염화 벤제토늄; 페놀, 부틸 또는 벤질 알코올; 알킬 파라벤, 예컨대 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜(catechol); 레소르시놀(resorcinol); 사이클로헥사놀; 3-펜타놀; 및 m-크레솔); 저분자량(약 10 미만의 잔기) 폴리펩티드; 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예컨대 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예컨대 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌, 또는 라이신; 단당류, 이당류, 및 다른 탄수화물, 예컨대 글루코스, 만노스, 또는 덱스트란; 킬레이트화제, 예컨대 EDTA; 당분, 예컨대 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 염-형성 대이온, 예컨대 나트륨; 금속 복합체(예를 들어 Zn-단백질 복합체); 및/또는 비-이온성 계면활성제, 예컨대 트윈(TWEEN: 상표명), 플루로닉스(PLURONICS: 상표명) 또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG: polyethylene glycol)을 포함할 수 있다. 약학적으로 허용가능한 부형제는 추가로 본원에 기재된다.
항-GITR 항체 및 이의 조성물은 또한 제제의 효능을 증진시키고/시키거나 보완하는 작용을 하는 다른 제제와 함께 사용되거나, 이와 별도로, 동시에, 또는 순차적으로 투여될 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 임의의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조성물, 예컨대 약학 조성물을 제공한다. 몇몇 실시양태에서, 조성물은 본원에 기재된 바와 같은 항체를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터를 포함한다. 다른 실시양태에서, 조성물은 본원에 기재된 임의의 항체를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터를 포함한다.
GITR에 의해 중재된 증상을 예방하거나 치료하기 위한 방법
본 발명의 항체 및 항체 컨주게이트는, 제한되지 않지만, 치료학적 처리 방법 및 진단학적 처리 방법을 비롯한 다양한 적용에 유용하다.
하나의 양태에서, 본 발명은 암을 치료하기 위한 방법을 제공한다. 몇몇 실시양태에서, 피험체에서 암을 치료하는 방법은 본원에 기재된 바와 같은 임의의 GITR 항체를 포함하는 효과량의 조성물(예를 들어, 약학 조성물)을 암의 치료가 필요한 피험체에게 투여함을 포함한다. 본원에서 사용될 경우, 암으로는 B-세포 관련된 암, 위암, 소장암, 육종, 두경부암(예를 들어, 편평상피 세포 두경부암), 흉선암, 상피암, 침샘암, 간암, 담즙암, 신경내분비 종양, 위점막암, 갑상선암, 폐암, 중피종, 난소암, 유방암, 전립선암, 식도암, 췌장암, 신경교종, 신장암(예를 들어, 신장 세포 암종), 방광암, 경부암, 자궁암, 외음부암, 음경암, 고환암, 항문암, 융모암종, 대장암, 구강암, 피부암, 메르켈 세포 암종, 교모세포종, 뇌종양, 골암, 안암, 및 흑색종을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
몇몇 실시양태에서, B-세포 관련된 암은, 제한되지 않지만, 다발성 골수종, 약성 형질 세포 종양, 호지킨 림프종, 결절 림프구 우세형 호지킨 림프종, 칼러병 및 골수종증, 형질구성 백혈병, 형질세포종, B-세포 전림프구성 백혈병, 모양 세포 백혈병, B-세포 비-호지킨 림프종(NHL), 급성 골수성 백혈병(AML), 만성 림프구성 백혈병(CLL), 급성 림프구성 백혈병(ALL), 만성 골수성 백혈병(CML), 소포성 림프종, 버킷의 림프종, 변연부 림프종, 외투 세포 림프종, 대세포 림프종, 전구체 B-림프아구성 림프종, 골수성 백혈병, 왈덴스트롬의 마크로글로불린혈증, 미만성 거대 B 세포 림프종, 소포성 림프종, 변역부 림프종, 점막-관련 림프 조직 림프종, 소세포 림프구성 림프종, 외투 세포 림프종, 버킷 림프종, 원발성 종격동(흉선) 거대 B-세포 림프종, 림프형질세포성 림프종, 왈덴스트롬 마크로글로불린혈증, 결절 변연부 B 세포 림프종, 비장의 변연부 림프종, 혈관내 거대 B-세포 림프종, 원발성 삼출성 림프종, 림프종모양 육아종증, T 세포/조직구-풍부한 거대 B-세포 림프종, 원발성 중추 신경계 림프종, 원발성 피부 광범위 거대 B-세포 림프종(다리 유형), 노인의 EBV 양성 광범위 거대 B-세포 림프종, 염증과 연관된 광범위 거대 B-세포 림프종, 혈관내 거대 B-세포 림프종, ALK-양성 거대 B-세포 림프종, 형질아세포성 림프종, HHV8-연관된 다중심 캐슬만병에서 발생하는 거대 B-세포 림프종, 광범위 거대 B-세포 림프종 및 버킷 림프종 사이의 중간 특징을 갖는 분류되지 않은 B-세포 림프종, 광범위 거대 B-세포 림프종 및 전형적 호지킨 림프종 사이의 중간 특징을 갖는 분류되지 않은 B-세포 림프종, 및 기타 B-세포 관련된 림프종이다.
몇몇 실시양태에서, 암은 재발되거나 난치성이다.
몇몇 실시양태에서, 암은 국소 진행성 또는 전이성 흑색종, 편평상피 세포 두경부암(SCHNC), 난소암, 신장암, 위암, 또는 폐암[예를 들어, NSCLC(비-소 세포 폐암)]이다.
몇몇 실시양태에서, 종양 성장 또는 진행을 저해할 필요가 있는 피험체에게 본원에 기재된 바와 같은 항-GITR 항체를 포함하는 효과량의 조성물을 투여함을 포함하는, 피험체에서 종양 성장 또는 진행을 저해하는 방법이 제공된다. 몇몇 실시양태에서, 암 세포의 전이를 저해할 필요가 있는 피험체에게 본원에 기재된 바와 같은 임의의 항-GITR 항체를 포함하는 효과량의 조성물을 투여함을 포함하는, 피험체에서 암 세포의 전이를 저해하는 방법이 제공된다. 다른 실시양태에서, 종양의 퇴행을 유도할 필요가 있는 피험체에게 본원에 기재된 바와 같은 임의의 항-GITR 항체를 포함하는 효과량의 조성물을 투여함을 포함하는, 피험체에서 종양의 퇴행을 유도하는 방법이 제공된다.
또 다른 양태에서, 암을 검출, 진단, 및/또는 모니터링하는 방법이 제공된다. 예를 들면, 본원에 기재된 바와 같은 항-GITR 항체는 검출가능한 부분, 예컨대 영상화 제제 및 효소-기질 표지에 의해 표지화될 수 있다. 본원에 기재된 바와 같은 항체는 또한 생체내 진단학적 검정, 예컨대 생체내 영상화(예를 들어, PET 또는 SPECT), 또는 염색 시약을 위해 사용될 수 있다.
몇몇 실시양태에서, 본원에 기재된 방법은 치료법의 추가의 형태에 의해 피험체를 치료하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 치료법의 추가적인 형태는 제한되지 않지만 화학치료법, 방사선치료, 수술, 호르몬 치료법 및/또는 추가적인 면역치료법을 비롯한 추가적인 항-암 치료법이다.
본원에 기재된 모든 방법에 있어서, 항-GITR 항체에 대한 언급은 하나 이상의 추가적인 제제를 포함하는 조성물을 포함한다. 이들 조성물은 적합한 부형제, 예컨대 완충제를 비롯한 약학적으로 허용가능한 부형제를 추가로 포함할 수 있고, 이는 당분야에 잘 공지되어 있다. 본 발명은 단독으로 다른 치료 방법과 함께 사용될 수 있다.
항-GITR 항체는 임의의 적합한 경로를 경유해 피험체에게 투여될 수 있다. 당분야의 숙련가라면, 본원에 기재된 예는 제한하려는 것이 아니고 이용가능한 기법을 보여주기 위한 것임을 알아야 한다. 따라서, 본 발명의 몇몇 양태에서, 항-GITR 항체는 공지된 방법에 따라서, 예컨대 정맥내 투여, 예를 들어, 일시정맥 투여로서, 또는 일정 기간에 걸친 연속적인 주입에 의해, 근육내, 복강내, 뇌척수내, 두개내(intracranial), 경피, 피하, 관절내, 설하, 활액내(intrasynovial), 취입, 척추강내, 경구, 흡입 또는 국부적 경로에 의해 투여된다. 투여는 전신성, 예를 들어, 정맥내 투여이거나, 또는 국소적일 수 있다. 액체 제형을 위한 상업적으로 입수가능한 네뷸라이저(nebulizer), 예컨대 제트 네뷸라이저 및 초음파 네뷸라이저가 투여를 위해 유용하다. 액체 제형은 직접적으로 분무될 수 있고, 동결건조된 분말은 재구성 이후 분무화될 수 있다. 다르게는, 항-GITR 항체는 플루오로카본 제형 및 정량 흡입기를 사용하여 분무화되거나, 동결건조되고 제분된 분말로서 흡입될 수 있다.
몇몇 실시양태에서, 항-GITR 항체는 자리-특이적 또는 표적화된 국소 전달 기법을 통해 투여된다. 자리-특이적 또는 표적화된 국소 전달 기법의 예는 항-GITR 항체의 다양한 이식가능한 저장 공급원(depot source) 또는 국소 전달 카테터(catheter), 예컨대 주입 카테터, 내재(indwelling) 카테터, 또는 바늘 카테터, 합성 이식편, 외막 랩(adventitial wrap), 션트(shunt) 및 스텐트(stent) 또는 다른 이식가능한 장치, 자리 특이적 담체, 직접 주사, 또는 직접 적용을 포함한다. 예를 들어, PCT 공개 번호 제WO 00/53211호 및 미국 특허 제5,981,568호를 참조한다.
항-GITR 항체의 다양한 제형은 투여를 위해 사용될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 항-GITR 항체는 희석되지 않고 투여될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 항-GITR 항체 및 약학적으로 허용가능한 부형제는 다양한 제형으로 존재할 수 있다. 약학적으로 허용가능한 부형제는 당분야에 공지되어 있고, 약리학적으로 효과적인 물질의 투여를 용이하게 하는 비교적 비활성의 물질이다. 예를 들면, 부형제는 형태 또는 점조도(consistency)를 제공하거나, 또는 희석제로서 작용할 수 있다. 적합한 부형제로는 안정화제, 습윤제 및 유화제, 삼투압 농도를 다양하게 하기 위한 염, 캡슐화제, 완충제, 및 피부 침투 증진제가 포함되나 이에 제한되지 않는다. 장관외 및 비장관외 약물 전달을 위한 부형제 뿐만 아니라 제형은 레밍턴(Remington)의 문헌[The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed. Mack Publishing, 2000]에 제시되어 있다.
본 발명의 몇몇 실시양태에서, 이들 제제는 주사에 의한(예를 들어, 복강내, 정맥내, 피하, 근육내 등) 투여를 위해 제형화된다. 따라서, 이들 제제는 약학적으로 허용가능한 비히클, 예컨대 식염수, 링거(Ringer) 용액, 덱스트로스 용액 등과 조합될 수 있다. 특별한 투여량 섭생, 즉, 용량, 시기 선택 및 반복은 특별한 개체 및 그러한 개체의 병력에 따라 달라질 것이다.
항-GITR 항체는 주사(예를 들어, 복강내, 정맥내, 피하, 근육내 등)를 비롯한 임의의 적합한 방법을 사용하여 투여될 수 있다. 항-GITR 항체는 또한 본원에 기재된 바와 같이 국부적으로 또는 흡입을 통해 투여될 수 있다. 일반적으로, 항-GITR 항체의 투여를 위해, 후보 투여량은 매일, 매주, 격주에 한번, 3주에 한번, 4주에 한번, 5주에 한번, 6주에 한번, 7주에 한번, 8주에 한번, 10주에 한번, 12주에 한번, 또는 12주 이상에 1회 투여될 수 있다. 증상에 따라서, 수 일 또는 그 이상에 걸친 반복된 투여의 경우, 증후의 원하는 억제가 발생될 때까지 또는 충분한 치료학적 수준이 달성되어, 예를 들면 암과 연관된 증후를 감소시킬 때까지 치료가 지속된다. 이러한 치료법의 진행은 통상적 기법 및 검정에 의해 쉽게 모니터링된다. 투약 섭생(사용된 항-GITR 항체 포함)은 시간에 따라 달라질 수 있다.
몇몇 실시양태에서, 후보 투여량은, 상기 언급된 인자에 따라서, 1 ㎍/kg 내지 30 ㎍/kg 내지 300 ㎍/kg 내지 3 mg/kg, 30 mg/kg까지, 100 mg/kg까지 또는 그 이상의 범위로 매일 투여되고, 예를 들면, 약 0.01 mg/kg, 약 0.03 mg/kg, 약 0.1 mg/kg, 약 0.3 mg/kg, 약 1 mg/kg, 약 2.5 mg/kg, 약 3 mg/kg, 약 5 mg/kg, 약 10 mg/kg, 약 15 mg/kg, 및 약 25 mg/kg의 1일 투여량이 사용될 수 있다.
몇몇 실시양태에서, 후보 투여량은, 상기 언급된 인자에 따라서, 약 1 ㎍/kg 내지 30 ㎍/kg 내지 300 ㎍/kg 내지 3 mg/kg, 30 mg/kg까지, 100 mg/kg까지 또는 그 이상의 범위의 투여량으로 매주 투여된다. 예를 들면, 약 0.01 mg/kg, 약 0.03 mg/kg, 약 0.1 mg/kg, 약 0.3 mg/kg, 약 0.5 mg/kg, 약 1 mg/kg, 약 2.5 mg/kg, 약 3 mg/kg, 약 5 mg/kg, 약 10 mg/kg, 약 15 mg/kg, 약 25 mg/kg, 및 약 30 mg/kg의 1주 투여량이 사용될 수 있다.
몇몇 실시양태에서, 후보 투여량은, 상기 언급된 인자에 따라서, 약 1 ㎍/kg 내지 30 ㎍/kg 내지 300 ㎍/kg 내지 3 mg/kg, 30 mg/kg까지, 100 mg/kg까지 또는 그 이상의 범위의 투여량으로 격주에 1회 투여된다. 예를 들면, 약 0.1 mg/kg, 약 0.3 mg/kg, 약 1 mg/kg, 약 2.5 mg/kg, 약 3 mg/kg, 약 5 mg/kg, 약 10 mg/kg, 약 15 mg/kg, 약 25 mg/kg, 및 약 30 mg/kg의 2주 투여량이 사용될 수 있다.
몇몇 실시양태에서, 후보 투여량은, 상기 언급된 인자에 따라서, 약 1 ㎍/kg 내지 30 ㎍/kg 내지 300 ㎍/kg 내지 3 mg/kg, 30 mg/kg까지, 100 mg/kg까지 또는 그 이상의 범위의 투여량으로 3주에 1회 투여된다. 예를 들면, 약 0.1 mg/kg, 약 0.3 mg/kg, 약 1 mg/kg, 약 2.5 mg/kg, 약 3 mg/kg, 약 5 mg/kg, 약 10 mg/kg, 약 15 mg/kg, 약 25 mg/kg, 약 30 mg/kg, 약 35 mg/kg, 약 40 mg/kg, 약 45 mg/kg, 및 약 50 mg/kg의 3주 투여량이 사용될 수 있다.
몇몇 실시양태에서, 후보 투여량은, 상기 언급된 인자에 따라서, 약 1 ㎍/kg 내지 30 ㎍/kg 내지 300 ㎍/kg 내지 3 mg/kg, 30 mg/kg까지, 100 mg/kg까지 또는 그 이상의 범위의 투여량으로 한달에 1회 또는 4주에 1회 투여된다. 예를 들면, 약 0.1 mg/kg, 약 0.3 mg/kg, 약 1 mg/kg, 약 2.5 mg/kg, 약 3 mg/kg, 약 5 mg/kg, 약 10 mg/kg, 약 15 mg/kg, 약 25 mg/kg, 약 30 mg/kg, 약 35 mg/kg, 약 40 mg/kg, 약 45 mg/kg, 및 약 50 mg/kg의 한달 투여량이 사용될 수 있다.
다른 실시양태에서, 후보 투여량은, 상기 언급된 인자에 따라서, 약 0.01 mg 내지 약 1200 mg 또는 그 이상의 범위의 투여량으로 매일 투여된다. 예를 들면, 약 0.01 mg, 약 0.1 mg, 약 1 mg, 약 10 mg, 약 50 mg, 약 100 mg, 약 200 mg, 약 300 mg, 약 400 mg, 약 500 mg, 약 600 mg, 약 700 mg, 약 800 mg, 약 900 mg, 약 1000 mg, 약 1100 mg, 또는 약 1200 mg의 1일 투여량이 사용될 수 있다.
다른 실시양태에서, 후보 투여량은, 상기 언급된 인자에 따라서, 약 0.01 mg 내지 약 2000 mg 또는 그 이상의 범위의 투여량으로 매주 투여된다. 예를 들면, 약 0.01 mg, 약 0.1 mg, 약 1 mg, 약 10 mg, 약 50 mg, 약 100 mg, 약 200 mg, 약 300 mg, 약 400 mg, 약 500 mg, 약 600 mg, 약 700 mg, 약 800 mg, 약 900 mg, 약 1000 mg, 약 1100 mg, 약 1200 mg, 약 1300 mg, 약 1400 mg, 약 1500 mg, 약 1600 mg, 약 1700 mg, 약 1800 mg, 약 1900 mg, 또는 약 2000 mg의 1주 투여량이 사용될 수 있다.
다른 실시양태에서, 후보 투여량은, 상기 언급된 인자에 따라서, 약 0.01 mg 내지 약 2000 mg 또는 그 이상의 범위의 투여량으로 2주마다 1회 투여된다. 예를 들면, 약 0.01 mg, 약 0.1 mg, 약 1 mg, 약 10 mg, 약 50 mg, 약 100 mg, 약 200 mg, 약 300 mg, 약 400 mg, 약 500 mg, 약 600 mg, 약 700 mg, 약 800 mg, 약 900 mg, 약 1000 mg, 약 1100 mg, 약 1200 mg, 약 1300 mg, 약 1400 mg, 약 1500 mg, 약 1600 mg, 약 1700 mg, 약 1800 mg, 약 1900 mg, 또는 약 2000 mg의 2주 투여량이 사용될 수 있다.
다른 실시양태에서, 후보 투여량은, 상기 언급된 인자에 따라서, 약 0.01 mg 내지 약 2500 mg 또는 그 이상의 범위의 투여량으로 3주마다 1회 투여된다. 예를 들면, 약 0.01 mg, 약 0.1 mg, 약 1 mg, 약 10 mg, 약 50 mg, 약 100 mg, 약 200 mg, 약 300 mg, 약 400 mg, 약 500 mg, 약 600 mg, 약 700 mg, 약 800 mg, 약 900 mg, 약 1000 mg, 약 1100 mg, 약 1200 mg, 약 1300 mg, 약 1400 mg, 약 1500 mg, 약 1600 mg, 약 1700 mg, 약 1800 mg, 약 1900 mg, 약 2000 mg, 약 2100 mg, 약 2200 mg, 약 2300 mg, 약 2400 mg, 또는 약 2500 mg의 3주 투여량이 사용될 수 있다.
다른 실시양태에서, 후보 투여량은, 상기 언급된 인자에 따라서, 약 0.01 mg 내지 약 3000 mg 또는 그 이상의 범위의 투여량으로 4주마다 1회 또는 매달 투여된다. 예를 들면, 약 0.01 mg, 약 0.1 mg, 약 1 mg, 약 10 mg, 약 50 mg, 약 100 mg, 약 200 mg, 약 300 mg, 약 400 mg, 약 500 mg, 약 600 mg, 약 700 mg, 약 800 mg, 약 900 mg, 약 1000 mg, 약 1100 mg, 약 1200 mg, 약 1300 mg, 약 1400 mg, 약 1500 mg, 약 1600 mg, 약 1700 mg, 약 1800 mg, 약 1900 mg, 약 2000 mg, 약 2100 mg, 약 2200 mg, 약 2300 mg, 약 2400 mg, 약 2500, 약 2600 mg, 약 2700 mg, 약 2800 mg, 약 2900 mg, 또는 약 3000 mg의 한달 투여량이 사용될 수 있다.
본 발명의 목적을 위해, 항-GITR 항체의 적절한 투여량은 이용된 항-GITR 항체(또는 이의 조성물), 치료되는 증후의 유형 및 위중성, 제제가 예방을 목적으로 투여되는지 치료를 목적으로 투여되는지의 여부, 이전의 치료법, 환자의 임상적 병력 및 제제에 대한 반응, 투여된 제제에 대한 환자의 소거율, 및 담당 의사의 재량에 따라 달라질 것이다. 전형적으로 임상가는 원하는 결과를 달성하는 투여량이 도달될 때까지 항-GITR 항체를 투여할 것이다. 용량 및/또는 빈도는 치료 과정에 걸쳐 다양할 수 있다. 실험적인 고려사항, 예컨대 반감기는, 일반적으로 투여량의 결정에 기여할 것이다. 예를 들면, 인간 면역계와 상용가능한 항체, 예컨대 인간화된 항체 또는 완전한 인간 항체는 항체의 반감기를 연장시키고 항체가 숙주의 면역계에 의해 공격받는 것을 방지하기 위해 사용될 수 있다. 투여 빈도는 치료법 과정에 걸쳐 결정되고 조정될 수 있고, 일반적으로, 필수적이지는 않지만, 증후의 치료 및/또는 억제 및/또는 개선 및/또는 지연에 기초한다. 다르게는, 항-GITR 항체의 지속된 연속 방출 제형이 적절할 수 있다. 지속된 방출을 달성하기 위한 다양한 제형 및 장치는 당분야에 공지되어 있다.
하나의 실시양태에서, 항체 투여량은 항체의 1회 이상의 투여(들)가 제공되는 개체에서 실험적으로 결정될 수 있다. 예를 들면, 개체는 항-GITR 항체의 증가하는 투여량을 제공받는다. 효능을 평가하기 위해, 질병의 지표가 수반될 수 있다.
본 발명에서의 방법에 따른 본원에 기재된 바와 같은 항-GITR 항체의 투여는, 예를 들면, 수여자의 생리학적 조건, 투여 목적이 치료학적인지 예방학적인지의 여부, 및 숙련가에게 공지된 기타 인자에 따라서 연속적이거나 간헐적일 수 있다. 항-GITR 항체의 투여는 미리 선택된 기간에 걸쳐 본질적으로 연속적이거나 일련의 간격을 둔 투약일 수 있다.
몇몇 실시양태에서, 1종 보다 많은 항-GITR 항체가 존재할 수 있다. 적어도 1종, 적어도 2종, 적어도 3종, 적어도 4종, 적어도 5종 또는 그 이상의 상이한 항체가 존재할 수 있다. 일반적으로, 이들 항-GITR 항체는 서로 악영향을 주지 않는 상보성 활성을 가질 수 있다.
몇몇 실시양태에서, 항-GITR 항체는 하나 이상의 추가적인 치료제의 투여와 함께 투여될 수 있다. 이들로는, 제한되지 않지만, 생물치료제, 화학치료제, 백신, CAR-T 세포-기반의 치료법, 방사선치료법, 사이토킨 치료법(예를 들어, IL-2, IL-7, IL-15, IL-12, IFNγ, IFNα, IL-8), 백신, 기타 면역억제성 경로의 저해제, 혈관형성 저해제, T 세포 활성화제, 대사 경로의 저해제, mTOR[라파마이신(rapamycin)의 기계론적 표적] 저해제[예를 들어, 라파마이신, 라파마이신 유도체, 시롤리무스(sirolimus), 템시롤리무스(temsirolimus), 에베롤리무스(everolimus), 및 데포롤리무스(deforolimus)], 아데노신 경로의 저해제, 티로신 키나아제 저해제, 예컨대 제한되지 않지만, 인리타(inlyta), ALK(역형성 림프종 키나아제) 저해제[예를 들어, 크리조티닙(crizotinib), 세리티닙(ceritinib), 알렉티닙(alectinib), 및 수니티닙(sunitinib)], BRAF 저해제[예를 들어, 베무라페닙(vemurafenib) 및 다브라페닙(dabrafenib)], 후성적 변형제, Treg 세포 및/또는 골수-유래된 억제제 세포의 저해제 또는 소모제, JAK[자누스(Janus) 키나아제] 저해제[예를 들어, 룩솔리티닙(ruxolitinib) 및 토파시티닙(tofacitinb), 바리시티닙(varicitinib), 필고티닙(filgotinib), 간도티닙(gandotinib), 레스타우르티닙(lestaurtinib), 모메로티닙(momelotinib), 파크리티닙(pacritinib), 및 우파다시티닙(upadacitinib)], 신호 전달제 및 전사 활성화제(STAT: Signal Transducers and Activators of Transcription) 저해제[예를 들어, STAT1, STAT3, 및 STAT5 저해제, 예컨대 플루다라빈(fludarabine)], 사이클린-의존성 키나아제 저해제, 면역원성 제제(예를 들면, 약화된 암성 세포, 종양 항원, 항원 제시 세포, 예컨대 종양 유래된 항원 또는 핵산에 의해 맥동화된 수지상 세포, 면역 자극 사이토킨(예를 들면, IL-2, IFNα2, GM-CSF), MEK 저해제[예를 들어, 트라메티닙(trametinib), 코비메티닙(cobimetinib), 비니메티닙(binimetinib), 및 셀루메티닙(selumetinib)], GLS1 저해제, PAP 저해제, 종양세포 붕괴성 바이러스, IDO(인돌아민-피롤 2,3-디옥시게나아제) 저해제, 및 면역 자극 사이토킨(예컨대 제한되지 않지만 GM-CSF)을 인코딩하는 유전자로 형질감염된 세포의 투여가 포함된다.
몇몇 실시양태에서, 생물치료제로는 항-CTLA-4 항체, 항-4-1BB 항체, 항-PD-1 항체, 항-PD-L1 항체, 항-TIM3 항체, 항-LAG3 항체, 항-TIGIT 항체, 항-OX40 항체, IL-8 항체, 항-HVEM 항체, 항-BTLA 항체, 항-CD40 항체, 항-CD40L 항체, 항-CD47 항체, 항-CSF1R 항체, 항-CSF1 항체, 항-MARCO 항체, 항-CXCR4 항체, 항-VEGFR1 항체, 항-VEGFR2 항체, 항-TNFR1 항체, 항-TNFR2 항체, 항-CD3 이중특이적 항체, 항-CD19 항체, 항-CD20, 항-Her2 항체, 항-EGFR 항체, 항-ICOS 항체, 항-CD22 항체, 항-CD52 항체, 항-CCR4 항체, 항-CCR8 항체, 항-CD200R 항체, 항-VISG4 항체, 항-CCR2 항체, 항-LILRb2 항체, 항-CXCR4 항체, 항-CD206 항체, 항-CD163 항체, 항-KLRG1 항체, 항-FLT3 항체, 항-B7-H4 항체, 항-B7-H3 항체, 또는 제2 항-GITR 항체가 포함되나 이에 제한되지 않는다.
따라서, 몇몇 실시양태에서, 항-GITR 항체는, 예를 들면, 항-PD-L1 길항물질 항체, 예컨대 BMS-936559(MDX-1105), MPDL3280A, 및 아벨루맙(avelumab)(MSB0010718C); 항-PD-1 길항물질 항체, 예컨대 예를 들면, 니볼루맙(nivolumab)[옵디보(OPDIVO: 등록상표)], 펨브롤리추맙(pembrolizumab)[케이트루다(KEYTRUDA: 등록상표)], 및 피딜리추맙(pidilizumab); 항-CTLA-4 길항물질 항체, 예컨대 예를 들면 이필리무맙(ipilimumab)[예르보이(YERVOY: 등록상표)]; 항-LAG-3 길항물질 항체, 예컨대 BMS-986016 및 IMP701; 항-TIM-3 길항물질 항체; 항-B7-H3 길항물질 항체, 예컨대 예를 들면 MGA271; 항-VISTA 길항물질 항체; 항-TIGIT 길항물질 항체; 항-CD28 길항물질 항체; 항-CD80 항체; 항-CD86 항체; 항-B7-H4 길항물질 항체; 항-ICOS 작용물질 항체; 항-CD28 작용물질 항체; 선천적 면역 반응 조절인자(예를 들어, TLR, KIR, NKG2A), 및 IDO 저해제와 함께 사용된다. 몇몇 실시양태에서, 항-GITR 항체는 4-1BB(CD137) 작용물질, 예컨대, 예를 들면, PF-05082566 또는 우렐루맙(urelumab)(BMS-663513)과 함께 사용된다. 몇몇 실시양태에서, 항-GITR 항체는 OX40 작용물질, 예컨대, 예를 들면, 항-OX-40 작용물질 항체와 함께 사용된다. 몇몇 실시양태에서, 항-GITR 항체는 또 다른 GITR 작용물질, 예컨대, 예를 들면, TRX518과 함께 사용된다. 몇몇 실시양태에서, 항-GITR 항체는 IDO 저해제와 함께 사용된다. 몇몇 실시양태에서, 항-GITR 항체는 사이토킨 치료제, 예컨대, 예를 들면 제한없이, IL-2, IL-12, IL-7, IL-15, IL-21, IL-33, CSF-1, MCSF-1 등과 함께 사용된다.
화학치료제의 예로는 알킬화제, 예컨대 티오테파(thiotepa) 및 사이클로포스파미드; 알킬 설포네이트, 예컨대 부설판(busulfan), 임프로설판(improsulfan) 및 피포설판(piposulfan); 아지리딘(aziridine), 예컨대 벤조도파(benzodopa), 카보쿠온(carboquone), 메투레도파(meturedopa), 및 우레도파(uredopa); 에틸렌이민 및 메틸멜라민, 예컨대 알트레타민(altretamine), 트리에틸렌멜라민; 트리에틸렌포스포르아미드, 트리에틸렌티오포스포르아미드 및 트리메틸올로멜라민; 아세토게닌(acetogenin)[특히 불라타신(bullatacin) 및 불라타시논(bullatacinone)]; 캄토테신(camptothecin)[합성 유사체 토포테칸(topotecan) 포함]; 브리요스타틴(bryostatin); 칼리스타틴(callystatin); CC-1065[그의 아도젤레신(adozelesin), 카르젤레신(carzelesin) 및 비젤레신(bizelesin) 합성 유사체 포함]; 크립토피신(cryptophycin)[특별히 크립토피신 1 및 크립토피신 8); 돌라스타틴(dolastatin); 두오카르마이신(duocarmycin)(예컨대 합성 유사체, KW-2189 및 CBI-TMI); 엘레우테로빈(eleutherobin); 판크라티스타틴(pancratistatin); 사르코딕티인(sarcodictyin); 스폰기스타틴(spongistatin); 질소 머스타드, 예컨대 클로람부실, 클로르나파진(chlornaphazine), 클로로포스파미드, 에스트라무스틴(estramustine), 이포스파미드(ifosfamide), 메클로르에타민(mechlorethamine), 메클로르에타민 옥사이드 하이드로클로라이드, 멜팔란(melphalan), 노벰비킨(novembichin), 페네스테린(phenesterine), 프레드니무스틴(prednimustine), 트로포스파미드(trofosfamide), 우라실 머스터드(uracil mustard); 니트로스우레아(nitrosurea), 예컨대 카르무스틴(carmustine), 클로로조토신(chlorozotocin), 포테무스틴(fotemustine), 로무스틴(lomustine), 니무스틴(nimustine), 라니무스틴(ranimustine); 항생제, 예컨대 에네디인(enediyne) 항생제{예를 들어 칼리케아미신(calicheamicin), 특별히 칼리케아미신 감마 1 및 칼리케아미신 phil1[예를 들어, 아그뉴(Agnew)의 문헌 "Chem. Intl. Ed. Engl., 33: 183-186 (1994)" 참조]; 다이네미신(dynemicin), 예컨대 다이네미신 A; 비스포스포네이트, 예컨대 클로드로네이트(clodronate); 에스페라미신(esperamicin); 뿐만 아니라 네오카르지노스타틴(neocarzinostatin) 발색단 및 관련된 색소단백질 에네디인 항생제 발색단}, 아클라시노마이신(aclacinomycin), 악티노마이신(actinomycin), 아우트라마이신(authramycin), 아자세린(azaserine), 블레오마이신(bleomycin), 칵티노마이신(cactinomycin), 카라비신(carabicin), 카르미노마이신(carminomycin), 카르지노필린(carzinophilin), 크로모마이신(chromomycin), 닥티노마이신(dactinomycin), 다우노루비신(daunorubicin), 데토루비신(detorubicin), 6-디아조-5-옥소-L-노르로이신, 독소루비신(예컨대, 모폴리노-독소루비신, 시아노모폴리노-독소루비신, 2-피롤리노-독소루비신, 및 데옥시독소루비신), 페길화된(pegylated) 리포솜성 독소루비신, 에피루비신(epirubicin), 에소루비신(esorubicin), 이다루비신(idarubicin), 마르셀로마이신(marcellomycin), 미토마이신(mitomycin), 예컨대 미토마이신 C, 마이코페놀산, 노갈라마이신(nogalamycin), 올리보마이신(olivomycins), 페플로마이신(peplomycin), 포트피로마이신(potfiromycin), 퓨로마이신(puromycin), 쿠엘라마이신(quelamycin), 로도루비신(rodorubicin), 스트렙토니그린(streptonigrin), 스트렙토조신(streptozocin), 투베르시딘(tubercidin), 우베니멕스(ubenimex), 지노스타틴(zinostatin), 조루비신(zorubicin); 대사길항물질, 예컨대 메토트렉세이트(methotrexate) 및 5-플루오로우라실(5-FU); 엽산 유사체, 예컨대 데노프테린(denopterin), 메토트렉세이트, 프테로프테린(pteropterin), 트리메트렉세이트(trimetrexate); 퓨린 유사체, 예컨대 플루다라빈(fludarabine), 6-머캅토퓨린(mercaptopurine), 티아미프린(thiamiprine), 티오구아닌(thioguanine); 피리미딘 유사체, 예컨대 안시타빈(ancitabine), 아자시티딘(azacitidine), 6-아자우리딘(azauridine), 카르모푸르(carmofur), 사이타라빈(cytarabine), 디데옥시우리딘(dideoxyuridine), 독시플루리딘(doxifluridine), 에노시타빈(enocitabine), 플록수리딘(floxuridine); 안드로겐, 예컨대 칼루스테론(calusterone), 드로모스타놀론(dromostanolone) 프로피오네이트, 에피티오스타놀(epitiostanol), 메피티오스탄(mepitiostane), 테스토락톤(testolactone); 항-부신성 제제, 예컨대 아미노글루테티미드(aminoglutethimide), 미토탄(mitotane), 트릴로스탄(trilostane); 엽산 보충액, 예컨대 프롤린산(frolinic acid); 아세글라톤(aceglatone); 알도포스파미드 글리코시드(aldophosphamide glycoside); 아미노레불린산(aminolevulinic acid); 에닐우라실(eniluracil); 암사크린(amsacrine); 베스트라부실(bestrabucil); 비산트렌(bisantrene); 에다트렉세이트(edatraxate); 데포파민(defofamine); 데메콜신(demecolcine); 디아지쿠온(diaziquone); 엘포르미틴(elformithine); 엘립티니움(elliptinium) 아세테이트; 에포틸론(epothilone); 에토글루시드(etoglucid); 질산 갈륨; 하이드록시우레아; 레티난(lentinan); 로니다민(lonidamine); 메이탄시노이드(maytansinoid), 예컨대 메이탄신(maytansine) 및 안사미토신스(ansamitocins); 미토구아존(mitoguazone); 미톡산트론(mitoxantrone); 모피다몰(mopidamol); 니트라크린(nitracrine); 펜토스타틴(pentostatin); 페나메트(phenamet); 피라루비신(pirarubicin); 이속잔트론(losoxantrone); 포도필린산(podophyllinic acid); 2-에틸하이드라자이드; 프로카르바진(procarbazine); 라족산(razoxane); 리족신(rhizoxin); 시조피란(sizofiran); 스피로게르마늄(spirogermanium); 테누아존산(tenuazonic acid); 트리아지쿠온(triaziquone); 2,2',2'-트리클로로트리에틸아민; 트리코테센(trichothecene)[특히 T-2 독소, 베라쿠린(verracurin) A, 로리딘(roridin) 및 안구이딘(anguidine)]; 우레탄; 빈데신; 다카르바진(dacarbazine); 만노무스틴(mannomustine); 미토브로니톨(mitobronitol); 미토락톨(mitolactol); 피포브로만(pipobroman); 가사이토신(gacytosine); 아라비노시드(arabinoside)(Ara-C); 사이클로포스파미드; 티오테파; 탁소이드(taxoid), 예를 들어 파클리탁셀(paclitaxel) 및 도세탁셀(doxetaxel); 클로람부실(chlorambucil); 겜시타빈(gemcitabine); 6-티오구아닌; 머캅토퓨린; 메토트렉세이트; 백금 유사체, 예컨대 시스플라틴(cisplatin) 및 카보플라틴(carboplatin); 빈블라스틴; 백금; 에토포시드(etoposide)(VP-16); 이포스파미드(ifosfamide); 미톡산트론(mitoxantrone); 빈크리스틴(vincristine); 비노렐빈(vinorelbine); 노반트론(novantrone); 테니포시드(teniposide); 에다트렉세이트(edatrexate); 다우노마이신(daunomycin); 아미노프테린(aminopterin); 젤로다(xeloda); 이반드로네이트(ibandronate); CPT-11; 토포이소머라아제(topoisomerase) 저해제 RFS 2000; 디플루오로메틸오르니틴(DMFO); 레티노이드, 예컨대 레티노산; 카페시타빈(capecitabine); 및 상기 임의의 물질의 약학적으로 허용가능한 염, 산 또는 유도체가 포함된다. 또한 항-에스트로겐제 및 선택적 에스트로겐 수용체 조절인자(SERM)와 같은, 종양에 대해 호르몬 작용을 조절하거나 저해하는 항-호르몬제가 포함되고, 예를 들면, 타목시펜(tamoxifen), 랄록시펜(raloxifene), 드롤록시펜(droloxifene), 4-하이드록시타목시펜, 트리옥시펜(trioxifene), 케옥시펜(keoxifene), LY117018, 오나프리스톤(onapristone), 및 토레미펜(toremifene)[파레스톤(Fareston)]; 부신에서 에스트로겐 생산을 조절하는, 방향화효소를 저해하는 방향화효소 저해제, 예컨대, 예를 들면, 4(5)-이미다졸, 아미노글루테티미드, 메게스트롤 아세테이트, 엑세메스탄(exemestane), 포르메스탄(formestane), 파드로졸(fadrozole), 보로졸(vorozole), 레트로졸(letrozole), 및 아나스트로졸(anastrozole); 및 항-안드로겐제, 예컨대 플루타미드(flutamide), 닐루타미드(nilutamide), 비칼루타미드(bicalutamide), 류프롤리드(leuprolide), 및 고세렐린(goserelin); 및 상기 임의의 물질의 약학적으로 허용가능한 염, 산 또는 유도체가 포함된다.
몇몇 실시양태에서, 항-GITR 항체는, 면역 관문 조절인자를 표적화하는 하나 이상의 다른 치료제, 예컨대, 예를 들면 제한없이, PD-1, PD-L1, CTLA-4, LAG-3, B7-H3, B7-H4, B7-DC(PD-L2), B7-H5, B7-H6, B7-H8, B7-H2, B7-1, B7-2, ICOS, ICOS-L, TIGIT, CD2, CD47, CD80, CD86, CD48, CD58, CD226, CD155, CD112, LAIR1, 2B4, BTLA, CD160, TIM1, TIM-3, TIM4, VISTA(PD-H1), OX40, OX40L, GITRL, CD70, CD27, 4-1BB, 4-BBL, DR3, TL1A, CD40, CD40L, CD30, CD30L, LIGHT, HVEM, SLAM(SLAMF1, CD150), SLAMF2(CD48), SLAMF3(CD229), SLAMF4(2B4, CD244), SLAMF5(CD84), SLAMF6(NTB-A), SLAMCF7(CS1), SLAMF8(BLAME), SLAMF9(CD2F), CD28, CEACAM1(CD66a), CEACAM3, CEACAM4, CEACAM5, CEACAM6, CEACAM7, CEACAM8, CEACAM1-3AS, CEACAM3C2, CEACAM1-15, PSG1-11, CEACAM1-4C1, CEACAM1-4S, CEACAM1-4L, IDO, TDO, CCR2, CD39-CD73-아데노신 경로(A2AR), BTKs, TIKs, CXCR2, CCR4, CCR8, CCR5, VEGF 경로, CSF-1, 또는 선천적 면역 반응 조절인자를 표적화하는 제제와 함께 사용될 수 있다.
몇몇 실시양태에서, 항-GITR 항체는 생물치료제 및 화학치료제와 함께 사용된다. 예를 들면, 효과량의 본원에 기재된 바와 같은 항-GITR 항체, 항-PD-L1 길항물질 항체(예를 들어, 아벨루맙), 및 화학치료제(예를 들어, 겜시타빈, 메토트렉세이트, 또는 백금 유사체)를 암의 치료가 필요한 피험체에게 투여함을 포함하는, 상기 피험체에서 암을 치료하는 방법이 제공된다. 몇몇 실시양태에서, 효과량의 본원에 기재된 바와 같은 항-GITR 항체, 항-PD-L1 길항물질 항체[예를 들어, 니볼루맙(옵디보: 등록상표), 또는 펨브롤리추맙(케이트루다: 등록상표)], 및 화학치료제(예를 들어, 겜시타빈, 메토트렉세이트, 또는 백금 유사체)를 암의 치료가 필요한 피험체에게 투여함을 포함하는, 상기 피험체에서 암을 치료하는 방법이 제공된다. 몇몇 실시양태에서, 효과량의 본원에 기재된 바와 같은 항-GITR 항체, 항-CTLA-4 길항물질 항체[예를 들어, 이필리무맙(예르보이: 등록상표)], 및 화학치료제(예를 들어, 겜시타빈, 메토트렉세이트, 또는 백금 유사체)를 암의 치료가 필요한 피험체에게 투여함을 포함하는, 상기 피험체에서 암을 치료하는 방법이 제공된다.
몇몇 실시양태에서, 항-GITR 항체 치료법은 수 분 내지 수 주 범위의 간격에 의해 다른 치료제에 선행되거나 후속될 수 있다. 다른 제제 및/또는 단백질 또는 폴리뉴클레오티드가 별도로 투여되는 실시양태에서, 일반적으로 본 발명의 조성물 및 제제가 여전히 유리하게 조합된 영향을 피험체에 부여할 수 있도록, 유의미한 시간 간격이 각각의 전달 사이에서 만료되지 않도록 확실히 해야 한다. 이러한 경우, 서로 약 12 내지 24 시간, 더욱 바람직하게는 서로 약 6 내지 12 시간 이내에 양쪽 양상을 투여할 것이 고려된다. 그러나 몇몇 상황에서, 투여 시간 간격을 유의적으로 연장시키는 것이 바람직할 수 있고, 이때 수 일(2, 3, 4, 5, 6 또는 7 일) 내지 수 주(1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8 주)가 각각의 투여 사이에 경과된다.
몇몇 실시양태에서, 항-GITR 항체 조성물은 크리조티닙, 팔보시클립, 겜시타빈, 사이클로포스파미드, 플루오로우라실, FOLFOX, 폴리닌산, 옥살리플라틴(oxaliplatin), 악시티닙, 수니티닙 말레이트, 토파시티닙(tofacitinib), 베바시추맙(bevacizumab), 리툭시맙(rituximab), 및 트라스투추맙(trastuzumab)으로부터 선택된 제2 제제를 포함한다.
몇몇 실시양태에서, 항-GITR 항체 조성물은 수술, 방사선 치료법, 화학치료법, 표적화 치료법, 면역치료법, 호르몬 치료법, 혈관형성 저해 및 완화 치료로 구성된 군에서 선택된 전통적인 치료법을 추가로 포함하는 치료 섭생과 조합된다.
제형
본 발명에 따라 사용된 항-GITR 항체의 치료학적 제형은 원하는 순도를 갖는 항체를 임의적인 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제, 또는 안정화제[레밍턴(Remington)의 문헌 "The Science and ractice of Pharmacy 20th Ed.,Mack Publishing, 2000"]와 혼합함으로써 동결건조된 제형 또는 수성 용액의 형태로 저장을 위해 제조된다. 허용가능한 담체, 부형제, 또는 안정화제는 이용되는 투여량 및 농도에서 수여자에게 무독성이고, 완충액, 예컨대 인산염, 시트르산염, 및 기타 유기 산; 염, 예컨대 염화 나트륨; 항산화제, 예컨대 아스코르브산 및 메티오닌; 보존제(예컨대 염화 옥타데실디메틸벤질 암모늄; 염화 헥사메토늄; 염화 벤즈알코늄, 염화 벤제토늄; 페놀, 부틸 또는 벤질 알코올; 알킬 파라벤, 예컨대 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜(catechol); 레소르시놀(resorcinol); 사이클로헥사놀; 3-펜타놀; 및 m-크레솔); 저분자량(약 10 미만의 잔기) 폴리펩티드; 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예컨대 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예컨대 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌, 또는 라이신; 단당류, 이당류, 및 다른 탄수화물, 예컨대 글루코스, 만노스, 또는 덱스트린; 킬레이트화제, 예컨대 EDTA; 당분, 예컨대 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 염-형성 대이온, 예컨대 나트륨; 금속 복합체(예를 들어 Zn-단백질 복합체); 및/또는 비-이온성 계면활성제, 예컨대 트윈(TWEEN: 상표명), 플루로닉스(PLURONICS: 상표명) 또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG: polyethylene glycol)을 포함할 수 있다.
항-GITR 항체를 함유하는 리포솜은, 예컨대 엡스타인(Epstein) 등의 문헌[Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 3688 (1985)]; 황(Hwang) 등의 문헌[Proc. Natl Acad. Sci. USA 77: 4030 (1980)]; 및 미국 특허 제4,485,045호 및 제4,544,545호에 기재된 바와 같은 당분야에 공지된 방법에 의해 제조된다. 증진된 순환 시간을 갖는 리포솜은 미국 특허 제5,013,556호에 개시되어 있다. 특별히 유용한 리포솜은 포스파티딜콜린, 콜레스테롤 및 PEG-유도체화된 포스파티딜에탄올아민(PEG-PE)을 포함하는 지질 조성물에 의한 역상 증발 방법에 의해 생성될 수 있다. 리포솜은 한정된 기공 크기의 필터를 통해 압출되어 원하는 직경을 갖는 리포솜을 수득한다.
활성 구성성분은, 각각 콜로이드성 약물 전달계(예를 들면, 리포솜, 알부민 미소구체, 미소유화액, 나노-입자 및 나노캡슐)에서 또는 거대유화액에서, 예를 들면, 코아세르베이션(coacervation) 기법에 의해 또는 계면 중합화에 의해 제조된 마이크로캡슐, 예를 들면, 하이드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐에 트래핑(trapping)될 수 있다. 이러한 기법은 레밍턴(Remington)의 문헌[The Science and ractice of Pharmacy 20th Ed., Mack Publishing, 2000]에 개시되어 있다.
서방성 제제가 제조될 수 있다. 서방성 제제의 적합한 예로는 항체를 함유한 고체 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스가 포함되고, 이러한 매트릭스는 성형 제품, 예를 들어 필름, 또는 마이크로캡슐의 형태이다. 서방성 매트릭스의 예로는 폴리에스테르, 하이드로겔[예를 들면, 폴리(2-하이드록시에틸-메타크릴레이트), 또는 폴리(비닐알코올)], 폴리락티드(미국 특허 제3,773,919호), L-글루탐산 및 7- 에틸-L-글루타메이트의 공중합체, 비-분해성 에틸렌-비닐 아세테이트, 분해성 락트산-글리콜산 공중합체, 예컨대 루프론 데폿(LUPRON DEPOT: 상표명)(락트산-글리콜산 공중합체 및 류프롤리드 아세테이트로 구성된 주사용 미소구체), 수크로스 아세테이트 이소부티레이트, 및 폴리-D-(-)-3-하이드록시부티르산이 포함된다.
생체내 투여를 위해 사용되는 제형은 무균성이어야 한다. 이는, 예를 들면, 멸균 여과막을 통한 여과에 의해 쉽게 달성된다. 치료학적 항-GITR 항체 조성물은 일반적으로 멸균 진입 포트(access port)를 갖는 용기, 예를 들면, 피하 주사 바늘에 의해 천공가능한 마개를 갖는 정맥내 용액 백(bag) 또는 바이알(vial)내로 위치된다.
본 발명에 따른 조성물은, 경구, 비경구 또는 직장 투여, 또는 흡입 또는 취입에 의한 투여를 위해 단위 투여형, 예컨대 정제, 환제, 캡슐, 분말, 과립, 용제 또는 현탁제, 또는 좌제의 형태로 존재할 수 있다.
고체 조성물, 예컨대 정제를 제공하기 위해, 주요 활성 구성성분은 약학 담체, 예를 들어 통상적 타정 구성성분, 예컨대 옥수수 전분, 락토스, 수크로스, 소르비톨, 활석, 스테아르산, 스테아르산 마그네슘, 인산 이칼슘 또는 고무, 및 다른 약학 희석제, 예를 들어 물과 혼합되어, 본 발명의 화합물, 또는 이의 무독성의 약학적으로 허용가능한 염의 균일한 혼합물을 함유하는 고체 예비제형 조성물을 형성한다. 이들 예비제형 조성물이 균일한 것으로 지칭될 경우, 활성 구성성분이 조성물 전체를 통해 균일하게 분산되어, 조성물이 동일하게 효과적인 단위 투여형, 예컨대 정제, 환제 및 캡슐로 쉽게 세분될 수 있음을 의미한다. 이어서 이러한 고체 예비제형 조성물은 약 0.1 내지 약 500 mg의 본 발명의 활성 구성성분을 함유하는 상기 기재된 유형의 단위 투여형으로 세분된다. 신규 조성물의 정제 또는 환제는 코팅되거나 달리는 화합되어 연장된 작용의 이점을 부여하는 투여형을 제공한다. 예를 들면, 정제 또는 환제는 내부 투여량 및 외부 투여량 성분을 포함할 수 있고, 후자는 전자 위의 외피 형태이다. 두 성분들은 위에서 붕해되는 것을 막는 작용을 하고 내부 성분이 십이지장 내로 온전히 통과할 수 있거나 방출이 지연되도록 작용하는 장용(enteric) 층에 의해 분리될 수 있다. 이러한 장용 층 또는 코팅물을 위해 다양한 물질이 사용될 수 있고, 이러한 물질은 다수의 중합체성 산, 및 쉘락(shellac), 세틸 알코올 및 셀룰로스 아세테이트와 같은 물질과 중합체성 산의 혼합물을 포함한다.
적합한 표면-활성제로는, 특별히 비-이온성 제제, 예컨대 폴리옥시에틸렌소르비탄[예를 들어 트윈(상표명) 20, 40, 60, 80 또는 85] 및 다른 소르비탄[예를 들어 스판(Span: 상표명) 20, 40, 60, 80 또는 85]이 포함된다. 표면-활성제를 갖는 조성물은 편리하게는 0.05 내지 5%의 표면-활성제를 포함하고, 0.1 내지 2.5%일 수 있다. 필요하다면, 다른 구성성분들, 예를 들면 만니톨 또는 다른 약학적으로 허용가능한 비히클이 첨가될 수 있음을 인식할 것이다.
적합한 유화액은 상업적으로 입수가능한 지방 유화액, 예컨대 인트라리피드(INTRALIPID: 상표명), 리포신(LIPOSYN: 상표명), 인포누트롤(INFONUTROL: 상표명), 리포푼딘(LIPOFUNDIN: 상표명) 및 리피파이산(LIPIPHYSAN: 상표명)을 사용하여 제조될 수 있다. 활성 구성성분은 예비-혼합된 유화액 조성물에 용해되거나, 또는 다르게는 이는 오일(예를 들어 대두유, 홍화씨유, 목화씨유, 참깨유, 옥수수유 또는 아몬드유), 및 인지질(예를 들어 계란 인지질, 대두 인지질 또는 대두 레시틴)과 물을 혼합할때 형성되는 유화액에 용해될 수 있다. 유화액의 장성(tonicity)을 조절하기 위해 다른 구성성분, 예를 들면 글리세롤 또는 글루코스가 첨가될 수 있음을 인식할 것이다. 적합한 유화액은 전형적으로 20% 이하의 오일, 예를 들면, 5 내지 20%의 오일을 함유한다. 지방 유화액은 0.1 내지 1.0 ㎛, 특별히 0.1 내지 0.5 ㎛의 지방 방울(fat droplet)을 포함할 수 있고, 5.5 내지 8.0 범위의 pH를 갖는다.
유화액 조성물은 항-GITR 항체를 인트라리피드(상표명) 또는 이의 성분(대두유, 계란 인지질, 글리세롤 및 물)과 혼합함으로써 제조된 것일 수 있다.
흡입 또는 취입용 조성물은 약학적으로 허용가능한 수성 또는 유기 용매, 또는 이의 혼합물중의 용액 및 현탁액, 및 분말을 포함한다. 액체 또는 고체 조성물은 상기 제시된 바와 같이 적합한 약학적으로 허용가능한 부형제을 함유할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 조성물은 경구 또는 비강 호흡 경로에 의해 국소 또는 전신 효과를 위해 투여된다. 바람직하게는 멸균성의 약학적으로 허용가능한 용매중의 조성물은 기체의 사용에 의해 분무된다. 분무된 용액은 분무 장치로부터 직접 호흡되거나, 분무 장치는 페이스 마스크, 텐트(tent) 또는 간헐적 양압 호흡기에 부착될 수 있다. 용액, 현탁액 또는 분말 조성물은, 바람직하게는 경구적으로 또는 비강으로, 적절한 방식으로 제형을 전달하는 장치로부터 투여될 수 있다.
키트
본 발명은 또한 본원에 기재된 바와 같은 임의의 또는 모든 항체를 포함하는 키트를 제공한다. 본 발명의 키트는 본원에 기재된 항-GITR 항체를 포함하는 하나 이상의 용기 및 본원에 기재된 본 발명의 임의의 방법에 따라 사용하기 위한 지침서를 포함한다. 일반적으로, 이들 지침서는 상기 기재된 치료학적 처리를 위한 항-GITR 항체의 투여에 대한 설명을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 키트는 단일-용량 투여 단위를 생산하기 위해 제공된다. 특정 실시양태에서, 키트는 건조된 단백질을 갖는 제1 용기 및 수성 제형을 갖는 제2 용기 둘 다를 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 단일 및 다중-챔버를 갖는 예비-충전된 주사기(예를 들어, 액체 주사기 및 리오시린지(lyosyringe)가 함유된 키트가 포함된다.
몇몇 실시양태에서, 항체는 인간 항체이다. 몇몇 실시양태에서, 항체는 인간화된 항체이다. 몇몇 실시양태에서, 항체는 단일클론성 항체이다. 항-GITR 항체의 사용과 관련된 지침서는 일반적으로 의도된 치료를 위한 투여량, 투약 계획, 및 투여 경로에 대한 정보를 포함한다. 용기는 단위 용량, 벌크 패키지(bulk package)(예를 들어, 다중-용량 패키지) 또는 하위-단위 용량일 수 있다. 본 발명의 키트에 공급된 지침서는 전형적으로 표지상의 서면 지침서 또는 패키지 삽입물(예를 들어, 키트내에 포함된 종이)이지만, 기계-판독형 지침서(예를 들어, 자기 또는 광학 저장 디스크 상에서 실행되는 지침서)가 또한 허용될 수 있다.
이러한 본 발명의 키트는 적합한 포장물내에 존재한다. 적합한 포장물로는, 제한되지 않지만, 바이알, 보틀(bottle), 병, 가요성 포장물[예를 들어, 밀봉된 마일러(Mylar) 또는 플라스틱 백] 등이 포함된다. 또한, 특정 장치, 예컨대 흡입기, 비강 투여 장치(예를 들어, 분사기) 또는 주입 장치, 예컨대 미니펌프와 함께 사용하기 위한 패키지가 고려된다. 키트는 멸균 진입 포트를 가질 수 있다(예를 들면 용기는 피하 주사 바늘에 의해 천공가능한 마개를 갖는 정맥내 용액 백 또는 바이알일 수 있다). 용기는 또한 멸균 진입 포트를 가질 수 있다(예를 들면 용기는 피하 주사 바늘에 의해 천공가능한 마개를 갖는 정맥내 용액 백 또는 바이알일 수 있다). 조성물중 적어도 하나의 활성제는 항-GITR 항체이다. 용기는 추가로 제2의 약학적으로 활성인 제제를 포함할 수 있다.
키트는 임의적으로 추가적인 성분, 예컨대 완충액 및 해석 정보를 제공할 수 있다. 정상적으로, 키트는 용기 및 용기 위의 또는 용기와 연결된 표지 또는 패키지 삽입물(들)을 포함한다.
생물 기탁
본 발명의 대표적인 물질은 미국 버지니아주 20110-2209 머내서스 유니버서티 불러바드 10801 소재의 미국 종균협회(아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션; American Type Culture Collection; ATCC)에 2016년 11월 10일자로 기탁되었다. ATCC 기탁번호 제PTA-123632호를 갖는 벡터 h3G7R5-VH는 h3G7R5 중쇄 가변성 영역을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드이고, ATCC 기탁번호 제PTA-123633호를 갖는 벡터는 h3G7R5 경쇄 가변성 영역을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드이다. 기탁은 특허 절차 및 규제 목적을 위해 미생물 기탁의 국제 승인에 대한 부다페스트 조약(Budapest Treaty)의 조항하에 이루어졌다(부다페스트 조약).
이는 기탁일로부터 30 년 동안 기탁물의 생존가능한 배양물의 유지를 보장한다. 기탁물은 부다페스트 조약의 조항하에 화이자 인코포레이티드(Pfizer, Inc.) 및 ATCC 사이의 합의를 조건으로 ATCC에 의해 이용가능할 것이고, 이는 관련성이 있는 미국 특허의 허여시, 또는 임의의 미국 또는 외국 특허 출원의 공개시, 대중에게 기탁물의 배양물의 후대(progeny)에 대한 영속적이고 비제한적인 이용성을 보장하는데, 어느 것이든 먼저 진행되며, 35 U.S.C. §122에 따라 권한을 부여받은 미국의 특허 및 상표청장(Commissioner of Patents and Trademarks) 및 이에 따른 규정(37 C.F.R. §1.14 포함, 특히 886 OG 638에 관함)에 의해 결정된 자에게 배양물의 후대의 이용성을 보장한다.
본 출원의 양수인은, 기탁물의 배양물이 적합한 조건하에 배양될때 사멸되거나 소실되거나 파괴되어야 한다면, 통지하에 기탁물을 또 다른 동일한 것으로 신속히 대체할 것을 동의하였다. 기탁물의 이용성은 정부의 권한하에 그의 특허법에 따라 부여된 권리에 위반하여 본 발명을 실행하는 자격으로 해석되어서는 안된다.
하기 실시예는 본 발의 범주를 단지 예시할 목적으로 제공되는 것이지 어떠한 방식으로도 제한하려는 것이 아니다. 실제로, 본원에 제시되고 기재된 변형에 더하여 본 발명의 다양한 변형은 상기 기재내용으로부터 당분야의 숙련가에게 명백할 것이고 첨부된 청구범위의 범주에 속할 것이다.
실시예
실시예 1: 인간 말초 혈액 T 세포에서의 GITR 발현
본 실시예는 인간의 말초 혈액에서 적은 비율의 T 세포 하위집합에 의한 GITR 발현을 예시한다.
건강한 공여자의 말초 혈액중의 T 세포 상에서의 GITR의 발현을 평가하였다. CD4+ Foxp3+ T 조절 세포(Treg)는 CD4+ Foxp3- T 통상적 세포(Tconv)(4.75 +/- 1.3% GITR 양성 세포), 또는 CD8+ T 세포(1.68 +/- 0.4%GITR 양성 세포)와 비교하여 유의적으로 더 높은 비율의 GITR-발현 세포(14.35 +/- 1.9%)를 함유하였다(도 1a). GITR 양성 세포에 결합하는 항-GITR 항체의 밀도는 Treg 또는 CD8+ T 세포와 비교하여 CD4+ Tconv 세포 상에서 유의적으로 더 낮았다(도 1b). Treg 세포의 경우 말초 혈액 단핵 세포의 1.723 +/- 0.61%의 적은 비율을 포함하는 반면, CD4+ Tconv는 이의 33.88 +/- 3%를, CD8+ T 세포는 이의 20.95 +/- 5.4%를 포함한다(도 1c).
실시예 2: 인간의 신장 세포 암종 면역 세포 침윤물에서의 GITR 및 OX40 발현
본 실시예는 신장 세포 암종(RCC)-연관된 Treg에서의 GITR 및 OX40의 발현 수준을 예시한다.
신장 세포 암종에 침윤하는 T 세포 상에서의 GITR 및 OX40의 발현을 평가하였다. RCC에 침윤하는 CD4+ Foxp3+ 헬리오스(Helios)+ Treg는 CD8+ T 세포에 비하여 더 많은 GITR 및 OX40-발현 세포를 함유하고, CD8+ T 세포에 비하여 더 많은 OX40-발현 Treg 및 Tconv 세포를 함유한다(도 2a). Treg중 67.8 +/- 12.2%가 GITR을 발현하고 76.5 +/- 6.5%가 OX40을 발현하였다. 반면, RCC-연관된 CD4+ Tconv중 22.8 +/- 7.5%가 GITR을 발현하고 32.97 +/- 3.9%가 OX40을 발현하였으며, CD8+ T 세포중 12.3 +/- 5%가 GITR을 발현하고 9.7 +/- 3.4%가 OX40을 발현하였다(도 2a). RCC-연관된 T 세포 상에서의 GITR 및 OX40 항체 결합 밀도를 또한 평가하였다. 항체 결합 GITR 및 OX40의 밀도는 CD8+ T 세포 또는 CD4+ Tconv 세포에 비해 Treg 상에서 유의적으로 더 높았다(도 2b). 이와 같이, OX40 및 GITR은 종양-연관된 T 세포에 의해 유사하게 발현되고, CD8+ T 세포 및 CD4+ Teff 세포와 비교하여 Treg 상에서 차별되게 더 높다.
Treg 세포는 신장 세포 암종 조직을 침윤하는 CD45+ 면역 세포의 3.29 +/- 0.82%의 적은 비율을 포함하는 반면, CD4+ Tconv는 15.3 +/- 3%를, CD8+ T 세포는 41.29 +/- 5.6%를 포함한다(도 2c).
방법
농축된 전혈로부터의 PBMC의 강화
스탠포드 혈액 은행(Stanford Blood Bank)에 의해 제공된 농축된 전혈을 우선 인산염 완충된 식염수(PBS, Ca2+ 및 Mg2+ 부재)에 1:4로 희석시킴으로써 혈액으로부터 1차 인간 림프구를 단리하였다. 피콜 구배 언더레이(Ficoll gradient underlay)[피콜-플라크 플러스(Ficoll-Paque PLUS), 지이 헬쓰케어 라이프 사이언시즈(GE Healthcare Life Sciences), 미국 펜실바니아주 피츠버그 소재]를 사용하여 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 단리하였다. 수거된 담황색 층을 PBS로 2회 세척하고 계수하였다. 세포를 PBS + 2% 태아 소 혈청(FBS)에 50*10e6 세포/㎖로 재현탁시키고, CD3 음성 강화 키트[스템 셀 테크(Stem Cell Tech), 캐나다 브리티시컬럼비아주 밴쿠버 소재]에 의해 제조업체의 지시에 따라 처리하였다.
종양 연관된 림프구의 단리 및 분석:
인간 종양 샘플의 소화
원발성 종양 조직을 전체로 받아 내부에서(in house) 처리하였다. 조직을 해부용 칼 또는 면도날에 의해 0.5 ㎤ 이하의 작은 조각으로 절단하였다. 인간 종양 해리 키트[밀테니이 바이오텍(Miltenyi Biotec), 미국 캘리포니아주 샌 디에고 소재]를 사용하여 효소적 해리를 수행하였다. 세포 현탁액을 70 um 스트레이너(strainer) 상으로 통과시켜 종양의 단일현탁액을 확보하였다. (적절하다면) ACK 용해 완충액[써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific), 미국 매사추세츠주 왈탐 소재]을 사용하여 5 분 동안 RT에서 RBC의 용해를 실행하였다. 처리된 종양 샘플을 동결시키고 미래의 분석을 위해 -80℃에서 90% 인간 혈청 + 10% DMSO중에서 저장하였다. 분석을 위해, 동결된 해리 종양 세포를 10% HI FBS가 보충된 RPMI내로 해동시키고, 하룻밤 그대로 둔 다음 FACS 분석하였다. 세포를 배지로부터 세척하고 FACS 완충액에 재현탁시켰다.
항체 염색 및 유세포분석
대조 패널을 사용하여, 세포내 항체 또는 알렉사(Alexa) 647(A647) 항체를 포함하지 않는 형광 마이너스 원(FMO: Florescence Minus One)에 의해 항체의 배경을 보정할 수 있었다. 모두 FACS 완충액중 1:50으로 희석된 BD[비디 바이오사이언시즈(BD Biosciences), 미국 캘리포니아주 산 호세 소재]로부터의 인간 표면 수용체 CD45, CD3, CD4, CD8에 대해 특이적인 항체 및 생존한/사멸된 정착성 바이올렛 세포 염색약(LIVE/DEAD Fixable Violet Cell Stain)(써모 피셔 사이언티픽, 미국 매사추세츠주 왈탐 소재)과 함께, A647-컨주게이션된 m3G7 항체에 의해 1 ㎍/㎖로 세포를 염색하였다. Foxp3 픽스 펌 키트(fix perm kit)[이바이오사이언스(eBioscience), 미국 캘리포니아주 샌 디에고 소재]를 사용하여, 세포를 세포내 마커인 헬리오스[22F6, 바이오레전드(Biolegend)] 및 Foxp3(259D, 바이오레전드)에 의해 제조업체의 지시에 따라서 염색하였다.
유세포분석을 위한 분석 및 게이팅(gating)
샘플을 획득한 후 플로우조(FlowJo) 소프트웨어[트리스타(Treestar), CA]를 사용하여 분석하였다. 살아있는 면역 세포를 식별하고, 생존한/사멸된 염료 음성의, CD45hi, CD4+ 통상적 세포(CD3+CD4+Foxp3-), CD8+ 세포(CD3+), 및 Treg(CD3+CD4+Foxp3+헬리오스+/-)로서 게이팅하였다. 게이팅을 설정하기 위한 FMO 샘플 및 보상을 설정하기 위한 단일 색상 대조군을 이용하면서, A647의 평균 형광 강도를 사용하여 샘플에 대한 상대적 형광 신호 및 발현율(%)을 검사하였다. 그래프 표시 및 통계적 분석을 위한 그래프패드 프리즘(GraphPad Prism) 소프트웨어로 데이터 값을 발송하였다. 지시된 바와 같이 가이서-그린하우스(Geisser-Greenhouse) 보정 및 던네츠(Dunnets) 다중 비교 보정을 갖는 페어드 원-웨이(paired one-way) ANOVA, 또는 언페어드 스튜던츠(unpaired students) T 시험을 사용하여 데이터 세트를 분석하였다. P 값 유의성은 < 0.05*인 경우 유의적이고, < 0.01**인 경우 더욱 유의적이며, < 0.001***인 경우 가장 유의적인 것으로 특징지워진다.
실시예 3: 상이한 종에서의 GITR/IgG 상호작용의 동역학 및 친화도의 결정
본 실시예는 37℃에서 상이한 항-GITR 항체와 인간 GITR/IgG, 사이노몰구스 GITR/IgG, 및 마우스 GITR/IgG의 상호작용에 대한 동역학 및 친화도를 보여준다. 표 6 및 7을 참조한다.
[표 6]
[표 7]
모든 실험을 비아코어 T200 표면 플라스몬 공명 바이오센서[지이 라이프사이언시즈(GE Lifesciences), 미국 뉴저지주 피스카타웨이 소재] 상에서 수행하였다.
a. 인간 GITR/IgG 및 사이노몰구스 GITR/IgG 상호작용
센서 칩 제조
센서 칩 제조를 25℃에서 10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 0.05%(v/v) 트윈-20의 이동 완충액(pH 7.4)에 의해 수행하였다. 400 mM EDC 및 100 mM NHS의 1:1(v/v) 혼합물에 의해 10 ㎕/분의 유속으로 7 분 동안 비아코어 CM4 센서 칩의 모든 유동 세포를 활성화시킴으로써 항-인간 Fc 센서 칩을 제조하였다. 항-인간 Fc 시약[염소 항-인간 IgG Fc, 서던바이오텍(SouthernBiotech) 카탈로그 #2081-01]을 10 mM 아세트산 나트륨(pH 4.5)중에서 30 ㎍/㎖로 희석시키고, 모든 유동 세포상에 7 분 동안 20 ㎕/분으로 주입하였다. 모든 유동 세포를 150 mM 붕산염 완충액(pH 8.5)중 100 mM 에틸렌디아민에 의해 7 분 동안 10 ㎕/분으로 차단시켰다.
동역학 및 친화도 검정
실험을 10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 0.05%(v/v) 트윈-20의 이동 완충액(pH 7.4), 1 mg/㎖ BSA를 사용하여 수행하였다.
희석되지 않은 상청액으로부터 하류 유동 세포(유동 세포 2, 3 및 4) 상으로 10 ㎕/분의 유속으로 2 분 동안 항체를 포획하였다. 상이한 항체를 각각의 유동 세포 상에서 포획하였다. 유동 세포 1을 기준 표면으로서 사용하였다. 항체를 포획한 다음, 피분석물(완충액, hGITR, 또는 cyGITR)을 2분 동안 모든 유동 세포 상에 30 ㎕/분으로 주입하였다. 피분석물 주입 이후, 10 분 동안 해리를 모니터링하였고, 이후 75 mM 인산의 3회 1-분 주입에 의해 모든 유동 세포를 재생시켰다. 각각 포획된 항체에 대하여, 다음과 같은 피분석물 주입을 수행하였다: 완충액, 20 nM hGITR, 200 nM hGITR, 20 nM cyGITR 및 200 nM cyGITR. 이중-참조[미스즈카(Myszka)의 문헌 "J. Mol. Recognit. 12: 279-284 (1999)"에 기재된 바와 같은 이중-참조]를 목적으로 완충액 순환물을 각각의 포획된 항체에 대하여 수집하였다. 이중-참조된 센서그램을 질량 수송 결합 모델에 의해 단순 1:1 랑뮤(Langmuir)로 전체적으로 정합시켰다.
b. 마우스 GITR/IgG 상호작용
센서 칩 제조
센서 칩 제조를 10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 0.05%(v/v) 트윈-20의 이동 완충액(pH 7.4)에 의해 수행하였다. 비아코어 CM4 센서 칩의 모든 유동 세포를 400 mM EDC 및 100 mM NHS의 1:1(v/v) 혼합물에 의해 7 분 동안 10 ㎕/분의 유속으로 활성화시킴으로써 항-마우스 Fc 센서 칩을 제조하였다. 항-마우스 면역글로불린 시약(비아코어 마우스 항체 포획 키트로부터의 토끼 항-마우스 면역글로불린 항체, 지이 라이프사이언시즈 카탈로그# BR-1008-38)을 10 mM 아세트산 나트륨(pH 5.0)중 60 ㎍/㎖로 희석시키고, 모든 유동 세포상에 7 분 동안 20 ㎕/분으로 주입하였다. 모든 유동 세포를 150 mM 붕산염 완충액(pH 8.5)중 100 mM 에틸렌디아민으로 7 분 동안 10 ㎍/㎖로 차단시켰다.
동역학 및 친화도 검정
실험을 37℃에서 10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 0.05%(v/v) 트윈-20(pH 7.4)의 이동 완충액, 1 mg/㎖의 BSA를 사용하여 수행하였다.
하류 유동 세포(유동 세포 2, 3 및 4) 상으로 10 ㎕/분의 유속으로 2 분 동안 정제된 항체를 10 ㎍/㎖으로 포획하였다. 상이한 항체를 각각의 유동 세포상에서 포획하였다. 유동 세포 1을 기준 표면으로서 사용하였다. 항체를 포획한 다음, 피분석물(완충액, 또는 mGITR)을 2분 동안 모든 유동 세포상에서 30 ㎕/분으로 주입하였다. 피분석물 주입 이후, 10 분 동안 해리를 모니터링하였고, 이후 10 mM 글리신 pH 1.7의 1회 3-분 주입에 의해 모든 유동 세포를 재생시켰다. mGITR의 5-단계의 일련의 희석물을 이러한 방법에 의해 분석하였고, 여기서 상위 농도는 300 nM이었고, 희석 인자는 3-배였다. 33 nM 희석을 2중으로 실행하였다. 이중-참조[미스즈카(Myszka)의 문헌 "J. Mol. Recognit. 12: 279-284 (1999)"에 기재된 바와 같은 이중-참조]를 목적으로 완충액 순환물을 각각의 포획된 항체에 대하여 수집하였다. 이중-참조된 센서그램을 질량 수송 결합 모델에 의해 단순 1:1 랑뮤로 전체적으로 정합시켰다.
실시예 4: 활성화된 T 세포 및 T
reg
에 결합하는 GITR 항체 결합
본 실시예는 상이한 항-GITR 항체가 T 효과자 및 Treg에 용량 반응으로 유사하게 결합함을 보여준다.
항-GITR 항체를 T 세포 및 Treg로의 이들의 결합 특징에 대해 평가하였다. 신선하게 단리된 말초 혈액 T 세포상에서의 GITR 발현을 증가시키기 위해, 정제된 T 세포 및 Treg를 시험관내에서 활성화시켰다. GITR 항체 m3G7 및 m10H2는, 항-인간 GITR 항체에 결합하는 제2 항체 결합의 평균 형광 강도에서 평가될 경우, 활성화된 T 세포에 대해 유사한 결합을 나타내었다(도 3a). GITR 항체 R5(h3G7R5), R9(h3G7N9) 및 R13(10H2N13)은 활성화된 Treg에 대하여 유사한 결합을 가졌고, 항체 R14(10H2 N14)는 나머지 항체와 비교하여 더 낮은 밀도 결합을 가졌다(도 3b).
방법
시험관내에서의 T 세포 강화 및 활성화
스탠포드 혈액 은행에 의해 제공된 농축된 전혈을 우선 인산염 완충된 식염수(PBS, Ca2+ 및 Mg2+ 부재)에 1:4로 희석시킴으로써 혈액으로부터 1차 인간 림프구를 단리하였다. 피콜 구배 언더레이(피콜-플라크 플러스, 지이 헬쓰케어 라이프 사이언시즈, 미국 펜실바니아주 피츠버그 소재)를 사용하여 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 단리하였다. 수거된 담황색 층을 PBS로 2회 세척하고 계수하였다. 세포를 PBS + 2% 태아 소 혈청(FBS)에 50*10e6 세포/㎖로 재현탁시키고, CD3 음성 강화 키트(스템 셀 테크, 캐나다 브리티시컬럼비아주 밴쿠버 소재)에 의해 제조업체의 지시에 따라 처리하였다. 강화 이후, 세포를 계수하고, 미래의 사용을 위해 10-20*10e6의 분취량으로 90% FBS 10% DMSO 동결 배지에서 동결시켰다. 활성화를 위해, 공여자 T 세포로부터의 세포 바이알을 해동시키고, T75 플라스크에서 R10c(RPMI 1640 + 10% FBS + 1x NEAA + 1x 피루브산 나트륨 + 1x 페니실린-스트렙토마이신)중에서 1*10e6 세포/㎖로 하룻밤 그대로 두었다. 세포를 계수하고, 48 시간 동안 다이나비즈(Dynabeads) 인간 CD3/28 T 세포 활성화 비이드에 의해 1:1의 비이드 대 세포 비로 자극하였다[써모 피셔(Thermo Fisher)]. 48 시간 후, 세포를 매질로부터 제거하고 1x PBS에 의해 세척하였다. 세포를 96 웰 플레이트내로 적정하였고, 여기서 이들을 표지화되지 않은 마우스 항-인간 GITR 항체(100-0.001 ug/㎖)에 의해 PBS중에서 염색하고, 30 분 동안 37℃에서 항온처리하였다. 결합되지 않은 항체를 세포로부터 세척하고, APC 표지화된 Fc 감마(Fcγ) 단편 특이적 염소-항-마우스 어피니퓨어 F(ab')2 IgG[잭슨 이뮤노리서치 래보레이토리즈 인코포레이티드(Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc), 미국 펜실바니아주 웨스트 그로브 소재]를 사용하여 1차 결합된 항체를 검출하였다. 2차 염색 이후, 플레이트를 1x PBS로 세척하고, 335×g(1200rpm)에서 회전시켰다. 웰을 PBS + 2% FBS에 재현탁시키고 HTS 상에서 획득하였다.
1차 T
reg
의 분류 및 팽창
Treg 단리 및 팽창은 푸트남(Putnam) 등의 문헌[Diabetes. 58(3): 652-62 (2009)]에 의한 프로토콜에 근거하였다. 구체적으로, 스탠포드 혈액 은행에 의해 제공된 농축된 전혈을 우선 인산염 완충된 식염수(PBS, Ca2+ 및 Mg2+ 부재)에 1:4로 희석시킴으로써 혈액으로부터 1차 인간 림프구를 단리하였다. 피콜 구배 언더레이(피콜-플라크 플러스, 지이 헬쓰케어 라이프 사이언시즈, 미국 펜실바니아주 피츠버그 소재)를 사용하여 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 단리하였다. 수거된 담황색 층을 PBS로 2회 세척하고 계수하였다. 세포를 PBS + 2% 태아 소 혈청(FBS)에 50*10e6 세포/㎖로 재현탁시키고, CD4 음성 강화 키트(스템 셀 테크, 캐나다 브리티시컬럼비아주 밴쿠버 소재)에 의해 제조업체의 지시에 따라 처리하였다. 강화 이후, 세포를 계수하고, FACS 분류를 위해 준비하였다.
Treg 염색 완충액을 2% 정상 마우스 혈청(잭슨 이뮤노리서치 래보레이토리즈 인코포레이티드, 미국 펜실바니아주 웨스트 그로브 소재) 및 2% 인간 AB 혈청[코닝 셀그로(Corning CellGro), 미국 버지니아주 머내서스 소재]을 갖는 PBS로서 제조하였다. Treg 염색 완충액에서 1:50으로 희석된 CD3, CD4, CD8, CD25, 및 CD127(단, CD25는 1:12.5로 희석됨)에 의해 CD4 음성 강화 세포를 30 분 동안 RT에서 염색하였다. 모든 항체는 BD에 의해 제공되었다[CD3-APC(UCHT1), CD4:PacBlue(RFP-T4, BD26986), CD8:BV786(HIT8a, BD555635), CD127:PECy7(M21, BD650822), CD25:PE(2A3, BD340938]. 염색 세포를 세척한 후 Treg 완충액에 50*10e6 세포/㎖로 재현탁시켰다. FACS 분류를 아리아 플랫폼(Aria platform)(비디 바이오사이언시즈, 미국 캘리포니아주 산 호세 소재) 상에서 실행하였다. CD3+ CD4+ CD25고(hi) CD127저(low)의 이들 표현형 특징에 의해 식별된 Treg를 FACS 분류하고, 분류된 샘플의 적은 부분을 획득하여 98%+ 순도에 대해 검사하였다. 적절하다면, 순도를 최대화하기 위해 세포를 2차 분류하였다.
FACS 분류로부터 수득한 세포를 계수하고, 5% 인간 AB 혈청 및 1x MEM-NEAA, 피루브산 나트륨, 및 페니실린-스트렙토마이신[라이프 테크놀로지스(Life Technologies), 미국 캘리포니아주 샌 디에고 소재]이 보충된 로스웰 파크 메모리얼 인스티튜트(RPMI: Roswell Park Memorial Institute)-1640으로 이루어진 Treg 팽창 배지에서 1:1 Treg 익스팬더(expander) 비이드(라이프 테크놀로지스, 미국 캘리포니아주 샌 디에고 소재)에 의해 0.25*10e6 세포/㎖로 재현탁시켰다. 2 일 후, 배지 부피를 2배로 하고, 재조합 인간 IL-2를 300 IU/㎖로 첨가하였다. 5, 7, 및 9 일째 세포를 계수하고, 0.25*10e6 세포/㎖로 300 IU/㎖의 IL2와 함께 계대배양하였다. 9 일째 계대배양물에 더하여, Treg의 "재-자극"을 위해 1:1 Treg 익스팬더 비이드를 배양액에 첨가하였다. 13 일째, 결합 및 기능적 검정을 위해 세포를 수거하였다.
1차 팽창된 T
reg
의 표현형
배양된 Treg를 팽창 전반에 걸쳐 추적하여 순도를 검사하였다. 형광단 컨주게이션된 CD 마커를 사용하여 분석하기 위해 세포를 FACS 완충액, 2% FBS가 함유된 PBS에 재현탁시켰다. GITR 및 기타 CD 림프구 마커에 대한 FACS 항체를 FACS 완충액에서 적절한 농도로 제조하고, 30 분 동안 실온에서 항온처리하였다. Treg 순도 염색은 세포내 표적을 이용하고 Foxp3 픽스/펌 키트[어피메트릭스(Affymetrix)/이바이오사이언스(eBiosciense), 미국 캘리포니아주 샌 디에고 소재]에 의해 처리하였다. 염색된 세포를 신선한 FACS 완충액에 재현탁시키고, FACS 분석기 LSRII 또는 포르테사(Fortessa)(비디 바이오사이언시즈, 미국 캘리포니아주 산 호세 소재) 상에서 분석하였다. 동역학 및 결합 데이터를 생성하기 위해, 컨주게이션되지 않은 항체를 10에서 0.001 ug/㎖로 적정하고(1:10의 연속 희석물, 농도 당 3중 웰), 4℃에서 60 분 동안 항온처리하였고, 12 일째 웰 당 Treg는 1*10e5으로 팽창하였다. 결합되지 않은 항체를 세포로부터 세척하고, A647 표지화된 Fc 감마(Fcγ) 단편 특이적 염소-항-인간 어피니퓨어 F(ab')2 IgG를 사용하여 결합된 항체를 검출하였다(잭슨 이뮤노리서치 래보레이토리즈 인코포레이티드, 미국 펜실바니아주 웨스트 그로브 소재). 염색된 세포의 분석은 플로우조(트리스타)에 의해 완결되었다. APC의 기하 평균을 사용하여 몰 농도를 로그 전환하고 그래프패드 프리즘에서 비-선형 정합 곡선을 생성함으로써 EC50을 계산하였다.
실시예 5: GITR 항체는 세포독성을 중재한다.
본 실시예는 GITR 항체가 2가지 시험관내 검정에서 세포독성을 중재함을 보여준다: 1) 분별화되지 않은 PBMC에 의해 중재된, 항체 중재된 세포독성(ADCC), 및 2) 대식세포에 의해 중재된, 항체 중재된 세포 식세포작용(ADCP).
hIgG1 항-GITR 항체 m3G7 및 m10H2는 이소타입 대조군과 비교하여 GITR+ T 세포주의 ADCC의 유사한 수준을 나타내었고, 0.01 ug/㎖에서 m3G7의 경우 78.5% 및 m10H2의 경우 83.4%의 최대 표적 세포 살해를 나타내었다(도 4a).
종양 연관된 대식세포(TAM)는 마우스에서 Treg의 항체 인도된 세포독성을 중재하는 세포 집단으로서 관여되어 왔다[심슨(Simpson) 등의 문헌 "J. Exp. Med. 210(9): 1695-1710 (2013)"; 불리아드(Bulliard) 등의 문헌 "J. Exp. Med. 210(9): 1685-93(2013)"]. 본 발명자들은 GITR+ T 세포주의 GITR 항체-중재된 세포독성을 인간 단핵구-유래된 대식세포에 의해 평가하였다. hIgG1 GITR 항체는 대식세포가 GITR+ T 세포의 용량 의존적 살해를 중재할 수 있도록 만들었다(도 4b). GITR 항체는 동등하지 않았다; 항체 h3G7 R5("R5"), h3G7 R9("R9"), h10H2 R13("R13"), 및 h10H2 R14("R14")는 각각 919.7, 692.2, 4450. 2013 pM의 EC50을 가졌다. 대식세포-중재된 세포독성은 GITR 항체의 Fc에 대해 의존적이었다. 세포독성 활성은 FcR로의 결합이 감소된 N297A 돌연변이에 의해 소실되었다[카오(Chao) 등의 문헌 "Immunol. Invest. 38(1): 76-92 (2009)"](도 4c).
방법
효과자 PBMC 및 GITR+ 표적에 의한 ADCC 검정
스탠포드 혈액 은행에 의해 제공된 농축된 전혈을 우선 인산염 완충된 식염수(PBS, Ca2+ 및 Mg2+ 부재)에 1:4로 희석시킴으로써 혈액으로부터 1차 인간 림프구를 단리하였다. 피콜 구배 언더레이(피콜-플라크 플러스, 지이 헬쓰케어 라이프 사이언시즈, 미국 펜실바니아주 피츠버그 소재)를 사용하여 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 단리하였다. 수거된 담황색 층을 PBS로 2회 세척하고 계수하였다. PBMC를 10% FBS 및 1x MEM-NEAA, 피루브산 나트륨, 및 페니실린-스트렙토마이신(라이프 테크놀로지스, 미국 캘리포니아주 샌 디에고 소재)이 보충된 RPMI중 3*10e6 세포/㎖로 재현탁시켰다. GITR+ 주르캣(Jurkat) T 세포주를 PBS에서 세포 트레이스 바이올렛(Trace Violet)(라이프 테크놀로지스, 미국 캘리포니아주 샌 디에고 소재)에 의해 염색시켰다. 표지화 이후, 주르캣을 3*10e5 세포/㎖로 재현탁시켰다. 40 ug/㎖에서 0.0004 ug/㎖(6가지 농도)(1:10)로 용액을 적정함으로써 항-GITR 항체의 일련의 희석물을 제조하였다. 50 uL의 적정된 항체를 96-웰 U형 바닥 플레이트의 웰마다 50 uL의 표지화된 주르캣 및 100 uL의 PBMC와 함께 플레이팅하여, 최종 항체에 의해 20:1의 효과자 대 표적 비를 달성하였다[10 내지 0.0001 ug/㎖]. 플레이트를 하룻밤 항온처리하고(∼18 시간), 다음 날 플레이트를 분석을 위해 수거하였다.
U-웰 플레이트를 1200 rpm으로 회전시켜 세포로부터 배지를 제거하고, PBS에 의해 세척하였다. PBS중 1:500의 PI(라이프 테크놀로지스, 미국 캘리포니아주 샌 디에고 소재)를 웰 마다 30 uL로 10 분 동안 실온에서 첨가하였다. HTS 분석 이전에, 2% FBS(PI를 급랭시키기 위함)가 보충된 대략 100 uL의 PBS를 PI에 첨가하여 웰 마다 부피가 100 내지 150 uL이 되도록 만들었다. 획득 직전에, 1*10e4의 카운트 브라이트(Count Bright) 계수 비이드(라이프 테크놀로지스, 미국 캘리포니아주 샌 디에고 소재)를 각각의 웰에 첨가하였다. 생존가능한 Treg 표적 총계 대 비이드 총계의 비를 사용하여 플레이트에 대하여 정규화시키고, 대조군 IgG1의 비와 비교하여 세포독성 퍼센트를 생성하였다.
ADCP 검정: 단핵구 유래된 대식세포 및 팽창된 T
reg
표적
PBMC를 상기 기재된 바와 같이 제조하였다. 이지셉(EasySep: 상표명) CD14+ 음성 강화 키트(스템 셀 테크, 캐나다 브리티시컬럼비아주 밴쿠버 소재)를 사용하여, 단핵구를 양성으로 강화시키고, 20 ng/㎖의 MCSF[알 앤 디 시스템스(R&D systems), 미국 미네소타주 미네아폴리스 소재]가 보충된 R10c에서 1*10e6 세포/㎖로 재현탁시키고, 플라스크당 55 내지 65 ㎖의 세포 현탁액과 함께 T175에 플레이팅하였다. 단핵구는 조직 배양 플라스크에 강하게 달라붙었고, 배양 2 일 및 5 일째 20 ng/㎖의 MCSF가 보충된 새로운 R10c에 의해 배지를 새로 교환할 경우 제거되지 않았다. 5 일째 배지에 10 ng/㎖의 IL10(알 앤 디 시스템스, 미국 미네소타주 미네아폴리스 소재)을 보충시켰다. 배양한지 1 주 이후, 세포를 수거하고 96-웰 평저 플레이트에서 1 mg/㎖의 PGE2[시그마(Sigma), 미국 미주리주 세인트 루이스 소재], 10 ng/㎖의 각각의 TNF, IL1B, 및 IL6(모두 알 앤 디 시스템스 제품, 미국 미네소타주 미네아폴리스 소재)으로 구성된 활성화 배지중에 1*10e5 세포/웰로 플레이팅하였다. 다음 날, 플레이팅된 단핵구를 활성화 배지로부터 세척하고, 5*10e4의 세포 트레이스 바이올렛 표지화된 주르캣 벌크 GITR+ 세포를 대조 IgG1 항체 또는 적정된 GITR 항체와 함께 웰 마다 첨가하였다(2:1의 효과자 대 표적 최종 비를 위함). 플레이트를 하룻밤 항온처리하고(∼18 시간), 다음 날 플레이트를 분석을 위해 수거하였다. 96-웰 평저 플레이트로부터의 세포를 철저히 분쇄하고, 96-웰 U형 바닥 플레이트에 옮겼다. 플레이트를 1200rpm에서 회전시켜 세포로부터 배지를 제거하고, PBS에 의해 세척하였다. 남은 절차는 PI 염색으로 시작되는 ADCC 획득 및 분석 섹션을 따른다.
실시예 6: GITR 항체에 의한 T 세포 사이토킨 생산 증진
본 실시예는 본 발명의 항-GITR 항체가 시험관내에서 T 세포 사이토킨 생산을 증진시킴을 보여준다.
GITR은 T 세포상의 공-자극성 수용체이다. GITR의 그의 리간드와의 결찰은 분화된 T 헬퍼(helper) 세포의 증식을 증진시킨다[톤(Tone) 등의 문헌 "Proc. Natl. Acad. Sci. 100(25): 15059-15064 (2003)"]. 증진된 T 세포 활성화 및 염증전 사이토킨 생산(예컨대 IFNγ)은 마우스 모델에서 종양 퇴행으로 귀결된다[고(Ko) 등의 문헌 "J. Exp. Med. 2005. 202(7): 885-891 (2005)"]. 본 실시예에서, IFNγ 및 TNFα의 분비에 의한 T 세포 활성화에 대하여 GITR 항체를 평가하였다. 인간 GITR을 발현하는 T 세포 하이브리도마[3A9; 더스틴(Dustin) 등의 문헌 "J. Immunol. 157(5): 2014-2021(1996)"]를 항-CD3 항체(클론 2C11, 이바이오사이언스)에 의해 활성화시켰고, 플레이트 고정화된 항-GITR 항체(h3G7 R5("R5"), h3G7 R9("R9"), h10H2 R13("R13"), 및 h10H2 R14("R14"))의 농도는 증가하였다. 4개의 GITR 항체는 용량 의존적 방식으로 0.01 내지 0.1 ㎍/㎖에 도달될 때까지 TNFα의 분비를 증진시켰다. 더 높은 GITR 항체 농도에서, TNFα 분비는 강하하였다(도 5a). 유사한 실험을 GITR 발현 3A9 세포 및 CD3 항체 2C11에 의해 B 세포 림프종 주(LK35.2)의 존재하에 수행하여, GITR의 군집화 및 신호발송에 필수적인 FcR을 제공하였다[주(Zhou) 등의 문헌 "Proc. Natl. Acad. Sci. 105(14): 5465-5470 (2008)"]. GITR 항체 R5, R9, R13 및 R14를 용액에 첨가하였고, 4가지 모두 0.01 내지 10 ㎍/㎖의 농도에서 TNFα의 분비를 증진시켰다(도 5b).
활성화된 1차 T 세포의 사이토킨 분비에 대한 GITR 항체의 영향을 시험관내에서 평가하였다. GITR 항체 R5, R9, R13 및 R14는 CD4+ 및 CD8+ T 세포로부터 분비된 IFNγ 및 TNFα를 용량 의존적 방식으로 증가시켰고, 이때 0.01 내지 0.1 μg/㎖에서 피이크가 나타났으며, 이어서 더 높은 농도에서 강하하였다(도 5c 및 도 5d). 따라서, 본 실시예는 GITR 항체가 T 세포 활성화에 용량-의존적으로 기여함을 보여준다.
방법
GITR 항체 T 세포 작용물질 검정
고정화된 GITR 항체 배양 플레이트를 제조하기 위해, 멸균된 눈크 맥시소프(Nunc maxisorp) 96-웰 평저 플레이트를 PBS에 희석된 2 ug/㎖ 항-마우스 및 항-인간 Fc 단편 특이적 단백질 100 uL에 의해 하룻밤 4℃에서 코팅하였다. 1x PBS에 의해 2회 세척한 후, 10 ng/㎖으로 100 uL의 마우스 CD3(2C11)을 37℃에서 60 내지 90 분 동안 항온처리하였다. GITR 항체 R5, R9, R13 및 R12를 10에서 0.0001 ug/㎖로 PBS에서 적정하고, 100 uL을 각각의 농도에 대해 3중으로 각각의 웰에 첨가하였다. 플레이트를 37℃에서 60 내지 90 분 동안 항온처리하고 세포를 첨가하기 이전에 세척하였다.
제조된 고정화된 GITR 플레이트를 사용하여, 200 uL의 DMEM + 10% FBS 배지중에서 50,000개의 인간 GITR+ 3A9 세포를 웰 마다 플레이팅하였다. 배양한지 48 시간 이후, 사이토킨 분석을 위해 마우스 가용성 단백질 검정[벡톤-딕킨슨(Becton-Dinkinson)]을 사용하여 상청액을 수집하였다.
인간 GITR+ 3A9 세포를 또한 LK35.2, 마우스 B 세포 림프종 주를 이용하여 가용성 GITR 항체 검정에서 시험하였다. 이러한 검정에서, 3A9 및 LK35.2를 2:1의 비로 0.1 ug/㎖의 마우스 항-CD3 항체(2C11)와 함께 플레이팅하고, GITR 항체를 10에서 0.0001 ug/㎖로 적정하였다.
신선하게 단리된 인간 팬(pan) T 세포(CD4+CD8+)를 사용하고 이를 상기 기재된 바와 같은 고정화된 플레이트 상으로 플레이팅함으로써 인간 사이토킨 분비를 또한 검정하였다. RPMI + 10% FBS중 100,000개의 세포를 웰 마다 플레이팅하고, 4 일 동안 항온처리 한 후 상청액을 수집하였다.
실시예 7: GITR 면역조직화학 염색
본 실시예는 포르말린 고정되고 파라핀 함침된(FFPE: formalin fixed paraffin embedded) 조직을 특이적으로 염색하는, 면역조직화학(IHC: immunohistochemistry) 시약으로서의 항-GITR 항체의 최적화를 설명한다.
항-인간 GITR 항체 m10H2를 평가하였고, 인간 GITR을 발현하지 않거나, 낮게 발현하거나 높게 발현하는 T 세포주의 염색의 상관된 밀도를 보여주었다(도 6a, 도 6b, 및 도 6c). 최소한의, 낮은 및 높은 GITR 발현은 표면 단백질을 m10H2 클론으로 염색하는 유세포 분석(도 6d) 및 정량적 PCR 및 액틴(actin) B 발현으로의 정규화(도 6e)에 의해 확인되었다. 또한, NSCLC 종양으로부터 단리된 FFPE 조직을 m10H2(도 6f) 또는 이소타입 대조 항체(도 6g)에 의해 염색하였다. m10H2 염색은 종양 조직중의 단핵 침윤물내의 세포 막에 국한되었다(도 6f). 따라서, 본 실시예는 m10H2가 GITR 발현을 정량화하기 위해 FFPE 조직에 사용될 수 있는 유효한 항-GITR 항체임을 입증한다.
방법
GITR 과발현 주르캣 세포주 상에서의 표면 염색:
IHC 분석 이전에, 표면 GITR 발현에 대하여 FACS에 의해 A647 표지화된 m10H2 항체를 사용하여 3가지 주르캣 세포주를 분석하였다. 이들 세포주는 모 주르캣 세포주 뿐만 아니라, GITR 플라스미드를 주르캣 모 세포내로 형질감염시켜 생성된 2가지 세포주를 포함한다. 각각의 세포주로부터 대략 5*10e6의 세포를 표지화된 항체에 의해 1 ug/㎖의 농도로 염색시켰다. 염색 후, 세포를 1x PBS에 의해 결합되지 않은 항체로부터 세척하고, FACS에 의해 분석하였다.
결과
FACS에 의해, 주르캣 모 세포는 GITR 발현이 검출되지 않은 반면, 2가지 형질전환된 세포주는 염색 양성 반응을 나타내었다. 2가지 세포주 상에서 GITR 발현 중간값 사이에 대략 1.5 로그 배수의 차이가 존재하여, 본 발명자들은 이들을 GITR+ 저 발현주 및 GITR+ 고 발현주로 구별할 수 있었다.
qPCR에 의한 정량적 GITR 발현 분석:
주르캣 모 세포주, GITR+ 저 발현주, 및 GITR+ 고 발현주상에서의 GITR 발현에 대한 정량적 분석을 qPCR에 의해 실행하였다. 각 세포주로부터의 5 내지 10*10e6의 세포로부터 알엔이지 미니 키트(RNeasy Mini Kit)[퀴아겐(Quiagen)]를 사용하여 RNA를 단리하였다. 200 ng의 단리된 RNA를 사용하여 고 용량 cDNA 역전사 키트(써모 피셔)에 의해 cDNA 주형을 제조하였다. 타크만(TaqMan) FAST 시약을 사용하여 cDNA 주형에 의해 qPCR을 실행하였다. 항존 유전자 액틴 B(Hs99999903_m1) 및 맞춤형 GITR 둘 다를 위한 프라이머를 각각의 반응에서 실행하였다. GITR 형질감염된 플라스미드의 벡터 서열(ABI에 의해 개시되지 않은 서열)을 사용하여 ABI에 의해 맞춤형 GITR 프라이머를 생성하였다. qPCR을 Viia7 시스템상에서 제조업체의 지시 및 타크만 FAST 열 순환 사양에 따라 실행하였다. 델타 Ct를 다음의 식을 사용하여 계산하였다: 2＾(-{Ct(GITR)-Ct(ActB}).
결과
qPCR 분석에 의해 3가지 세포주의 발현 순위를 확인하였는데, 여기서 GITR+ 저 발현주는 모 발현주에 비해 2.7 로그 더 높은 발현을 나타내었고, GITR+ 고 발현주는 GITR+ 저 발현주에 비해 2 로그 더 높은 GITR 발현을 나타내었다.
IHC 세포 가공:
FACS 및 qPCR에 의해 검정된 GITR 발현 수준에 의해, 주르캣 모 세포주(GITR 음성), GITR+ 저 발현주, 및 GITR+ 고 발현주로부터의 세포를 제조하고 다음과 같이 절편화를 위해 가공하였다. 20 내지 30*10e6의 세포를 50 ㎖의 원추형 튜브에 수집하고 ∼750×g에서 10 분 동안 회전시켰다. 상청액을 제거한 후, 펠릿을 10% 중성 완충된 포르말린중 15 ㎖의 원추형 튜브에 옮기고, ∼750×g에서 10 분 동안 회전시켰다. 50℃에서 제조된 히스토겔(HistoGel)을 세포 펠릿과 혼합하고, 4℃에서 냉장하여 시원하게 만들었다. 이어서 고정을 위해 히스토겔 세포 펠릿을 10% 중성 완충된 포르말린으로 > 12 시간 동안 옮겨놓고, 파라핀 함침을 위해 카세트(cassette)로 옮겼다. 슬라이드의 절편화를 수행하여 4 uM 두께로 펠릿의 슬라이스를 생성하였다. IHC 염색을 위해, 써모 사이언티픽(Thermo Scientific)으로부터의 울트라비전 원 디텍션 시스템(UltraVision One Detection System)을 사용하였다. 간단히, 60℃에서 1 시간 동안 베이킹함으로써 슬라이드를 제조하고 각각 3 분 동안 자일렌 세척을 3 라운드 진행하면서 탈파라핀화하였다. 절편화된 펠릿을 2 분 동안 각각 100% ETOH(2x), 95% ETOH(1x), 70% ETOH(1x), 및 PBS(1x)중에서 연속 항온처리함으로써 다시 수화시켰다. 슬라이드를 5 분 동안 DIVA 완충액 및 데클로킹 챔버(Decloaking chamber)[둘 다 바이오케어 메디칼(Biocare Medical) 제품](110℃로 가열되고 5 PSI로 가압됨)에서 처리한 후, PBS에서 2회 세척함으로써 항원 회수를 수행하였다. 슬라이드를 3% H2O2(과산화효소)에서 10 분 동안 차단시키고, PBS에서 세척하였다. 1차 항체, m10H2를 1 ug/㎖로 차단 용액에서 희석시키고, 슬라이드를 하룻밤 4℃에서 항온처리하였다. PBS(3x)에서 3 분 동안 세척한 후, 슬라이드를 HRP 중합체에서 30 분 동안 실온에서 항온처리하고 PBS(3x)에서 세척하였다. DAB 시약을 제조하고, 슬라이드를 5 분 동안 노출시켰다. 헤마톡실린(Hematoxylin)으로 대비염색을 실행하고, 탈수한 후, 장착된 슬라이드가 완성되었다. 슬라이드를 GITR 수준에 대해 분석하였다.
NSCLC 샘플의 염색
비-소 세포 폐 암종(NSCLC) 샘플의 제조된 슬라이드를 내부 은행으로부터 받았다. 써모 사이언티픽으로부터의 울트라비전 원 디텍션 시스템을 상기와 같이 사용하였다. 세포 펠릿의 염색과 같이, 1 ug/㎖의 m10H2 항-GITR 항체를 5 ug/㎖의 마우스 IgG1 대조 항체와 함께 검정하였다.
실시예 8: GITR 항체의 항-종양 활성
본 실시예는 mIgG2a 이소타입을 갖는 항-마우스 GITR 항체가 CT26 결장 암종의 치료학적 처리 모델에서 종양 성장 감소 활성을 갖는 것을 보여준다.
mIgG2a는 ADCC 활성을 중재할 수 있는 인간 IgG1 이소타입을 가장 면밀히 반영하는 반면, mIgG1 이소타입 대부분은 최소한의 ADCC 활성을 갖는 hIgG2a와 매우 유사하다[니메르잔(Nimmerjahn) 및 라베취(Ravetch)의 문헌 "Science, 310: 1510-1512 (2005)"].
항-GITR 21B6 mIgG2a 이소타입 항체는 항-종양 활성을 가진 반면, mIgG2a 이소타입 대조 항체는 이를 갖지 않았다(도 7a 내지 도 7d). 21B6 mIgG2a는 0.2, 1 및 5 mpk(mg/kg)에서 각각 95%, 94%, 102%의 종양 성장 저해를 나타내었다(표 8, 도 7a 내지 도 7d). mIgG1 이소타입은 0.2, 1 및 5 mg/kg에서 각각 33%, 9%, 및 22%의 종양을 유도하였다(표 9, 도 7e 내지 도 7h). 연구의 종료시(초기 투약 후 43 일), 80%(8/10)의 마우스가 5 mpk의 mIgG2a 그룹에서 생존한 반면, 44.4%(4/9)가 1 mg/kg의 mIgG2a 그룹에서 생존하였고, 40%(4/10)가 0.2 mg/kg의 mIgG2a 그룹에서 생존하였다(표 8 및 표 9, 도 7i). mIgG1 치료는 생존을 일으키지 않았고; 모두 연구 종료(43 일) 이전에 갖고 있던 종양으로 인해 희생시켜야 했다(표 8 및 표 9, 도 7i).
[표 8]
[표 9]
21B6 IgG2a에 의해 중재된 종양 성장의 저해는 종양에 침윤하는 CD8 : Treg의 비의 증가와 상관관계를 가졌었다(도 7j). 1 mg/kg 용량의 21B6 IgG2a는 가장 높은 CD8 : Treg 비를 생성하였다(IgG2a 이소타입 대조군의 10.9배, p = 0.049). 21B6 IgG2a에 의한 치료는 또한 모든 용량에서 종양에 침윤하는 CD4 Teff : Treg의 비를 증가시켰고(도 7k), 이때 0.2 mg/kg 용량의 21B6 IgG2a는 가장 높은 평균 비를 제공하였다(IgG2a 이소타입 대조군에 비해 4.7배 더 높음). 이소타입 IgG2a 대조군과 비교하여 통계적 유의성이 5 mg/kg, 1 mg/kg, 및 0.2 mg/kg 사이에서 관찰되었고, p 값은 각각 0.043, 0.003, 및 < 0.0001이었다. 이들 변화는 21B6 IgG1으로 치료된 마우스에서는 관찰되지 않았는데, 여기서 CD8 T 세포 : Treg 및 CD4 Teff 세포 : Treg는 IgG1 이소타입 대조군과 비교하여 통계적인 유의성을 나타내지 않았다(도 7j 및 도 7k).
종양 성장 저해는 21B6 IgG2a 치료된 마우스에서 종양내 Treg의 손실에 상응하였다(도 7l). 모든 용량 수준의 21B6 IgG2a는 원발성 종양과 연관된 1 그램 당 Treg 세포의 수를 감소시켰지만, 이들 변화는 통계적으로 유의적이지 않았다. 5 mg/kg에서 CD8+ T 세포가 감소하였고(도 7m), 5 mg/kg 및 1 mg/kg에서 CD4+ T 효과자(Teff) 세포가 감소하였지만(도 7n), 이들 변화는 통계적으로 유의적이지 않았다. 유사하게, 모든 용량의 21B6 mIgG2a는 종양에 침투하는 CD45+ 면역 세포에서 Treg의 비율을 2.56%에서 0.2 mg/kg 용량의 경우 0.69%로 감소시켰고(p = 0.0018), 1 mg/kg 용량에서 0.42%로 감소시켰으며(p = 0.0005), 5 mg/kg 용량에서 1.29%로 감소시켰다(p = 0.0287)(도 7o). 면역 침윤물중의 Treg의 비율은 21B6 mIgG1 치료에 의해 영향받지 않았다(도 7o). 종양 침윤물에서 CD8+ T 세포 및 CD4+ Teff 세포의 비율의 변화는 유의적이지 않았다(도 7p 및 도 7q). 동시에 이들 분석은, mIgG2a에 의존성이고 mIgG1 Fc 이소타입이 아닌 GITR 항체 투여 이후에 증진된 T 효과자 세포 : Treg 비, 항-종양 효능 및 마우스 생존을, 감소된 종양 Treg가 설명할 수 있음을 시사한다.
T 세포 하위집합 빈도를 말초 면역 구획에서 평가하였다; 종양을 갖는, 21B6 치료된 마우스의 비장. 0.2 mg/kg의 용량은 가장 큰 효과를 가졌고, 대조군 항체 치료된 마우스에서 CD45+ 세포의 Treg를 2.46%로부터 mIgG2a 치료된 마우스에서 1.11%로 감소시켰고(p = 0.0006), 대조군 항체 치료된 마우스에서 CD45+ 세포의 CD4+ Teff를 15.06%로부터 mIgG2a 치료된 마우스에서 11.22%로 감소시켰다(p = 0.0121)(도 7r 및 도 7t). 다른 용량에서의 변화는 유의적이지 않았다. CD8+ T 세포는 어떠한 용량에서도 영향받지 않았다(도 7s).
방법
m21B6 IgG2a의 클로닝 및 발현
항-mGITR 21B6 중쇄 및 경쇄 가변성 도메인 DNA 서열을 루이스(Lewis) 래트 하이브리도마 융합물로부터 RT-PCR에 의해 생산된 cDNA로부터 수득하였다. 생성된 번역된 아미노산 서열을, 써모 피셔 사이언티픽 진아트(Thermo Fisher Scientific Geneart)로부터의 특허 등록 알고리즘을 사용하여 인간 상피 신장 293 발현에 대해 코돈 최적화하였다. 이어서, 합성된 코돈 최적화 가변성 도메인을 포유동물의 발현 벡터 pARC mlg2a 및 pARC mKappa내로 각각 BssHII/BstEII 및 ApaLI/Pacl에 의해 클로닝하였다. 경쇄 및 중쇄 작성물에 대한 정확한 클론을 서열 확인하고, 상응하게 h3G7R5-VL 및 h3G7R5-VH로 명명하였다.
항체 발현 및 정제
1:1 질량 비의 플라스미드 h3G7R5-VL 및 h3G7R5-VH를 PEI-기반의 형질감염 프로토콜에 의해 Expi293 세포내로 공-형질감염시켰다(2 밀리온 세포 당 각각 0.5 mg의 플라스미드). 형질감염 후 5 일째, 형질감염된 세포 배양물을 수거하고, 원심분리하고, 0.2 uM 막을 사용하여 여과하였다. 이어서 여과된 상청액을 단백질 A 친화도 크로마토그래피[맵셀렉트 슈어(MabSelect Sure), 지이 헬쓰케어 라이프 사이언시즈, 미국 펜실바니아주 피츠버그 소재]에 의해 정제한 다음, 크기 분류하여 응집된 단백질을 제거하였다[수퍼덱스(Superdex) S200 26/60 지이 헬쓰케어 라이프 사이언시즈, 미국 펜실바니아주 피츠버그 소재]. 비아코어 분석과 함께 SDS-PAGE는 단량체성 활성 단백질 분별물을 확인하였다.
상승적 종양 모델: CT26
동물
7-주령의 암컷 BALB/c 마우스(BALB/cAnNCrl)의 마우스 코호트(cohort)를 잭슨 래보레이토리즈(Jackson Laboratories)(미국 메인주 바 하버 소재)로부터 수득하고, 화이자(미국 캘리포니아주 사우스 샌프란시스코 소재)의 병원체가 없는 시설에서 실험동물 윤리위원회(IACUC: Institutional Animal Care and Use Committee) 프로토콜에 따라서 사육하였다. 실험이 개시될 때 동물은 8-주령이었다.
세포 배양물
마우스 결장 암종 세포주 CT26(CRL-2638)을 미국 종균협회(ATCC, 미국 버지니아주 머내서스 소재)로부터 수득하였다. 세포를 10% FBS 및 1% 페니실린-스트렙토마이신 용액이 함유된 권고된 기본 배지에서 증식시켰다(모두 써모 피셔 사이언티픽 제품, 미국 매사추세츠주 왈탐 소재). 세포를 TrypLE 셀렉트(Select)(써모 피셔 사이언티픽, 미국 매사추세츠주 왈탐 소재)에 의해 수거하고, 세포를 펠릿화하기 전에 혈청이 함유된 2x 부피의 배지로 세척하였다. 펠릿을 혈청이 없는 기본 배지에 재현탁시키고, 세포 총수 및 생존력 검사를 수행하였다. 주사를 위해 CT26 세포를 기본 배지중에서 1 ㎖ 당 2x106의 세포로 농축시켰다.
생체내 실험 프로토콜
종양을 확립하기 위해, 100 uL의 세포 현탁액을 마우스의 왼쪽 옆구리에 피하주사하였다. 종양이 대략 80 ㎣의 평균 부피에 도달될 때까지 이식물을 모니터링하고, 거의 동일한 평균 종양 부피 및 SEM을 갖는 마우스의 그룹으로 무작위화하였다. 21B6 항체를, 5 mg/kg의 이소타입 대조군 IgG1(클론 MOPC-21) 및 IgG2 이소타입 대조군[C1.18.4, 바이옥셀(Bioxcell), 미국 뉴햄프셔주 웨스트 레바논 소재]과 함께, 5, 1, 및 0.2 mg/kg으로 투약하기 위해 제조하였다. 치료를 무작위화한 날(0 일)에 시작하였다. 마우스를 칭량하고 총 3회 투약을 위해 2 내지 3일에 한번 복강내 투약하였다.
종양 성장의 평가
주 2회 종양 길이 및 폭(밀리미터 단위)을 디지털 캘리퍼스(digital calipers)[미투토요(Mitutoyo), 미국 일리노이주 오로라 소재]로 측정하였다. 다음의 식을 사용하여 길이 및 폭 값을 이용해 종양 부피를 계산하였다: V = ½ L × W2, 여기서 L(길이)은 종양의 가장 긴 직경으로서 정의되고, W(폭)은 L에 수직이다. 효능 측정을 20 일까지 지속하고, 생존 분석을 위해 마우스를 40 일까지 계속 모니터링하였다.
종양 TIL 및 비장세포 분석
마지막 투약 후 1 일째 그룹 당 4 내지 5 마리의 마우스로부터 종양 및 비장을 절개하였다. 종양을 프로그램 IMP-002에 의해 밀테니이 옥테트(Miltenyi Octet)(밀테니이 바이오텍, 미국 캘리포니아주 샌 디에고 소재) 상에서 제조업체의 지시에 따라 분리하였다. 비장을 손으로 70 uM 메쉬 필터 상에서 분리하고, 적혈구를 ACK 완충액(써모 피셔 사이언티픽, 미국 매사추세츠주 왈탐 소재)으로 용해시켰다. 양쪽 세포 집단을 PBS에 의해 세척하고, FACS 분석을 위해 다음과 같은 형광 표지화된 항체에 의해 염색하였다: 생존한/사멸된 정착성 바이올렛 세포 염색약(써모 피셔 사이언티픽, 미국 매사추세츠주 왈탐 소재), CD90.2, CD4, 및 CD8(모두 비디 바이오사이언시즈 제품) 및 GITR 및 CD45(이바이오사이언스 제품). 30 분 동안 4℃에서 세포외 염색을 수행한 후, 세포를 PBS + 2% FBS에 의해 세척하고, 이바이오사이언스 Foxp3 픽스/퍼 키트(이바이오사이언스, 미국 캘리포니아주 샌 디에고 소재)에 의해 제조업체의 지시에 따라 처리하였다. 세포를 세포내 마커 Foxp3-이플루오르(eFlour)450(이바이오사이언스, 캘리포니아주 샌 디에고 소재) 및 Ki-67-BV605(비디 바이오사이언시즈, 미국 캘리포니아주 산 호세 소재)에 의해 염색시켰다. T 세포 하위집단의 분석을 플로우조(플로우조, 미국 오레건주 애쉬랜드 소재)에서 수행하고, 그래프패드 프리즘 소프트웨어를 사용하여 도표화하였다.
실시예 9: 항-GITR 항체 및 기타 치료제를 사용한 병용 치료법
본 실시예는 종양의 치료학적 처리를 위한 다른 면역-표적화 항체와 병용되는 항-GITR 대용 항체 21B6 mIgG2a의 평가를 기재한다.
CT26 결장 암종 모델은 단일 제제 21B6 IgG2a에 의해서는 완전한 종양 퇴행을 겪었고(실시예 8), 따라서 B16F10 흑색종 모델이 단일 제제 면역 표적화 치료법에 대해 덜 반응성이므로 이를 평가하였다[예를 들어, 모슬레이(Mosley) 등의 문헌 "Cancer Immunology Research, 5(1) 29-41(2017)" 참조]. 치료 프로토콜은 실시예 8에 기재된 연구와 유사하다: B16F10 종양을 이식하고, 일단 80 ㎣의 평균 크기에 도달되면 무작위화하고, 3회 용량의 1 mg/kg의 21B6 IgG2a 및 확립된 효과적인 용량의 병용 파트너 IP에 의해 총 3회 용량을 위해 2 내지 3일마다 한번 치료하였다. 항-GITR 항체 21B6 IgG2a와 항-PD-LI, 항-4-1BB, 항-OX40 및 항-PD-1 항체의 중복 병용은 모두 단일 제제 단독 치료와 비교하여 향상된 종양 성장 저해를 나타낸다.
이들 데이터는, 향상된 종양 성장 저해 효과를 위해 본 발명의 항-GITR 항체가 면역 관문 저해제 또는 T 세포 자극성 항체와 병용될 수 있음을 보여준다.
비록 개시된 교시내용이 다양한 적용, 방법, 키트, 및 조성물에 관하여 기재되었지만, 본원의 개시내용 및 이후 청구된 발명에서 벗어나지 않고 다양한 변화 및 변형이 이루어질 수 있음을 인식할 것이다. 상기 실시예는 개시된 교시내용을 더 잘 나타내기 위해 제공되고 본원에 제시된 교시내용의 범주를 제한하려는 것은 아니다. 본 교시내용이 이들 예시적인 실시양태과 관련하여 기재되었지만, 숙련가라면 이들 예시적인 실시양태의 다수의 변화 및 변형이 과도한 실험없이 가능함을 쉽게 이해할 것이다. 모든 이러한 변화 및 변형은 현 교시내용의 범주내에 속한다.
특허, 특허 출원, 논문, 교본 등을 비롯하여 본원에 언급된 모든 참고문헌 및 이에 언급된 참고문헌은, 이전에 존재하지 않은 정도로, 이의 전체가 참고로 본원에 인용된다. 제한되지 않지만 정의된 용어, 용어 용법, 기재된 기법 등을 비롯하여, 하나 이상의 인용된 문헌 및 유사한 자료가 본 출원과 상이하거나 모순되는 경우, 본 출원은 이를 통제한다.
상기 기재내용 및 실시예는 본 발명의 특정 실시양태를 상세히 알리고, 본 발명자들이 고려하는 최고의 방식을 설명한다. 그러나, 전술된 내용이 아무리 상세히 명세서에 나타나 있더라도, 본 발명은 많은 방식으로 실행될 수 있고, 본 발명은 첨부된 청구범위 및 이의 임의의 등가물에 따라 해석되어야 함을 인식할 것이다.
[미생물기탁]
기탁기관명: ATCC
수탁번호: PTA-123632
수탁일자: 2016.11.10
기탁기관명: ATCC
수탁번호: PTA-123633
수탁일자: 2016.11.10
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50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Leu
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Glu Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
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Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Ala
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35 40 45
Gly Leu Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Gly Ile Arg Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
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65 70 75 80
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Lys Gly Arg Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr
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<212> PRT
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<223> Synthetic Construct
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<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> Xaa is N or Q
<220>
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<222> (5)..(5)
<223> Xaa is Q or A
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (6)..(6)
<223> Xaa is G, A, or S
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (7)..(7)
<223> Xaa is S or K
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Ala Ala Ser Xaa Xaa Xaa Xaa
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<212> PRT
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<223> Synthetic Construct
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> Xaa is S or A
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> Xaa is K or L
<400> 62
Gln Gln Xaa Xaa Glu Leu Pro Trp Thr
1 5
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<212> PRT
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<220>
<223> Synthetic Construct
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa is Y or F
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> Xaa is S or T
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> Xaa is T or S
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (6)..(6)
<223> Xaa is D or G
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (7)..(7)
<223> Xaa is Y or A
<400> 63
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1 5
<210> 64
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> Xaa is D or G
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa is Y or A
<400> 64
Xaa Xaa Thr Met Asn
1 5
<210> 65
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa is Y or F
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> Xaa is S or T
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> Xaa is T or S
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (6)..(6)
<223> Xaa is D or G
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (7)..(7)
<223> Xaa is Y or A
<400> 65
Gly Xaa Xaa Phe Xaa Xaa Xaa Thr Met Asn
1 5 10
<210> 66
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> Xaa is N or T
<400> 66
Asn Pro Tyr Xaa Gly Gly
1 5
<210> 67
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (6)..(6)
<223> Xaa is N or T
<400> 67
Leu Ile Asn Pro Tyr Xaa Gly Gly Ile Arg Tyr Asn Gln Lys Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 68
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (7)..(7)
<223> Xaa is S or T
<400> 68
Ile Gly Gly Tyr Tyr Asp Xaa Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 69
<211> 113
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 69
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Ala Gly
1 5 10 15
Glu Thr Val Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser
20 25 30
Gly Asn Gln Lys Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Pro Arg Gln Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ile Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Met Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
Tyr Tyr Asp Ala Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100 105 110
Lys
<210> 70
<211> 119
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 70
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Asp Gly Val Leu Val Gln Pro Gly Lys
1 5 10 15
Ser Leu Thr Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Thr Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr Ile Ser Tyr Asp Asp Ile Thr Thr Phe Tyr Arg Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ala Lys Ser Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Gly Leu Gln Trp Pro Tyr Val Met Asp Ala Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Ala Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 71
<211> 106
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 71
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Thr Thr Met Ala Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Leu Asn Tyr Met
20 25 30
His Trp Phe Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr
35 40 45
Asp Thr Ser Glu Leu Ala Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Lys Asn Gly Tyr Pro Leu Thr
85 90 95
Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 72
<211> 123
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 72
Glu Ala Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Glu Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Lys Tyr
20 25 30
Gly Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Thr Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ser Ile Ile Asn Ser Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Arg Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Ser Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Thr Asp Tyr Tyr Asp Gly Ser Tyr His Ser Asp Val Val Asp Ala
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Val Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 73
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 73
Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser Gly Asn Gln Lys Ser Tyr Leu
1 5 10 15
Ala
<210> 74
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 74
Trp Ala Ser Pro Arg Gln Ser
1 5
<210> 75
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 75
Gln Gln Tyr Tyr Asp Ala Pro Pro Thr
1 5
<210> 76
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 76
Asp Tyr Tyr Met Ala
1 5
<210> 77
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 77
Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr Tyr Met Ala
1 5 10
<210> 78
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 78
Ser Tyr Asp Asp Ile Thr
1 5
<210> 79
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 79
Thr Ile Ser Tyr Asp Asp Ile Thr Thr Phe Tyr Arg Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 80
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 80
Gly Leu Gln Trp Pro Tyr Val Met Asp Ala
1 5 10
<210> 81
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 81
Arg Ala Ser Ser Ser Leu Asn Tyr Met His
1 5 10
<210> 82
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 82
Asp Thr Ser Glu Leu Ala Ser
1 5
<210> 83
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 83
Leu Gln Lys Asn Gly Tyr Pro Leu Thr
1 5
<210> 84
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 84
Gly Phe Thr Phe Thr Lys Tyr Gly Met Ala
1 5 10
<210> 85
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 85
Lys Tyr Gly Met Ala
1 5
<210> 86
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 86
Gly Phe Thr Phe Thr Lys Tyr
1 5
<210> 87
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 87
Asp Tyr Tyr Asp Gly Ser Tyr His Ser Asp Val Val Asp Ala
1 5 10
<210> 88
<211> 255
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 88
gatattgtcc tcacccaatc ccccgcttcg ctcgccgtgt cactgggcca gagagccacc 60
atttcctgtc gggcatccga aagcgtggac aatttcggga tcaacttcat gaactggttc 120
cagcagaagt ccggacagcc tccgaaactg ttgatctacg ccgcgagcaa ccagggatcg 180
ggagtgccag cccgcttcag cggatcaggc tccggtaccg atttctccct ggacatccac 240
ccgatggagg aggac 255
<210> 89
<211> 255
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 89
gaggtgcagc tgcagcaaag tggccccgag agagtgaaac ccggagcctc catgaagatt 60
tcttgcaagg tgagtggata cagctttacc gactacacaa tgaactgggt gaagcagtct 120
cacgggaaga acctggagtg gattggcctg atcaatcctt acaacggcgg aattagatat 180
aaccagaagt ttaaaggaaa ggcctccttg accgttgaca aaagctcaaa taccgcctac 240
atggagctgt tgtct 255
<210> 90
<211> 255
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 90
gatattcaaa tgacccaatc cccttcttct ttgtctgcat ccgttggtga tcgtgttact 60
attacctgtc gcgcgagcga atccgtggat aacttcggta ttaactttct gaattggttt 120
caacaaaagc cgggcaaggc gccgaaactg ctgatctacg cagcgtcaaa tcagggtagc 180
ggtgttccgt cgcgcttcag cggtagcggt tccggcacgg actttacgct gacgatcagc 240
agcctgcagc cagag 255
<210> 91
<211> 255
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 91
gaggtccaac tggtcgagtc tggcggtggc ctggttcagc cgggtggtag cttgcgtctg 60
agctgtgcgg ttagcggtta cagctttacc gattatacca tgaactgggt ccgtcaggca 120
ccgggtaaag gtctggagtg ggtcgctctg atcaatccgt acaacggcgg catccgctac 180
aatcaaaagt ttaagggtcg cttcacgatt tcggttgata acgcgaagaa cagcctgtat 240
ctgcaaatga atagc 255
<210> 92
<211> 255
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 92
gatattcaga tgacccagag cccgagcagc ctgagcgcca gcgtgggtga tcgcgtgacc 60
attacctgtc gcgcaagcga aagcgtggat aactttggca ttaactttct gaactggtat 120
cagcagaaac caggcaaagc cccaaaactg ctgatttatg ccgcaagcaa ccagggcagc 180
ggtgtgccga gccgctttag cggtagcggc agcggcaccg attttaccct gaccattagc 240
agcctgcagc cggaa 255
<210> 93
<211> 255
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 93
gaagtgcagc tggttgaaag cggtggcggt ctggtgcagc caggcggtag tctgcgcctg 60
agctgtgccg caagcggctt tacctttagc gattatacca tgaactgggt gcgccaggca 120
ccaggcaaag gcctggaatg ggtggccctg attaacccgt ataacggtgg cattcgctat 180
aaccagaaat tcaaaggtcg ctttaccatc agtcgcgata acgccaaaaa cagcctgtat 240
ctgcagatga acagc 255
<210> 94
<211> 255
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 94
gaaattgtgc tgacccagag cccaggcacc ctgagcctga gcccaggtga acgcgcaacc 60
ctgagctgtc gcgcaagcga aagcgtggat aactttggca ttaacttcat gaactggtat 120
cagcagaaac caggccaggc accacgcctg ctgatttatg ccgcaagcaa ccagggcagc 180
ggcattccgg atcgctttag cggcagcggt agcggcaccg attttaccct gaccattagt 240
cgcctggaac cggaa 255
<210> 95
<211> 255
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 95
caggttcagc tggtgcagag cggtgccgaa gtgaaaaaac cgggtgccag cgtgaaagtg 60
agctgcaaag ccagcggcta tacctttacc gattatacca tgaactgggt tcgccaagca 120
ccaggtcagg gcctggaatg gatgggcctg attaacccgt ataacggtgg cattcgctat 180
aaccagaaat tcaaaggtcg cgtgaccatg acccgcgata ccagcaccag caccgtgtat 240
atggaactga gcagc 255
<210> 96
<211> 255
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 96
gacatccaga tgacccagag ccccagcagc ctgtctgcca gcgtgggcga cagagtgacc 60
atcacctgta gagccagcga gagcgtggac cccagaggca tcaactttct gaactggtat 120
cagcagaagc ccggcaaggc ccccaagctg ctgatctacg ccgccagcaa tcaggccaag 180
ggcgtgccca gcagattttc cggctctggc agcggcaccg acttcaccct gaccatctct 240
agcctgcagc ccgag 255
<210> 97
<211> 255
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 97
cagctggtgc agtctggcgc cgaagtgaag aaaccaggcg ccagcgtgaa ggtgtcctgc 60
aaggccagcg gctacacctt taccggcgcc accatgaact gggtgcgcca ggctcctgga 120
cagggcctgg aatggatggg cctgatcaac ccctacaacg gcggcatccg gtacaaccag 180
aaattcaagg gcagagtgac catgacccgg gacaccagca cctccaccgt gtacatggaa 240
ctgagcagcc tgcgg 255
<210> 98
<211> 255
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 98
gacatccaaa tgacccagtc cccttcctca ctctccgctt ccgtgggcga ccgcgtgacc 60
atcacgtgtc gggcatcgga aagcgtggaa ccaagaggga ttaacttcct gaactggtac 120
cagcagaagc ctggaaaggc cccgaagctg cttatctatg ccgcgtccca agcctcaaaa 180
ggagtgccgt cgaggttctc cgggtcggga tccggaaccg acttcaccct gactattagc 240
agcctccagc ccgag 255
<210> 99
<211> 255
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 99
caggtgcagc tggtgcagtc tggcgccgaa gtgaagaaac caggcgccag cgtgaaggtg 60
tcctgcaagg ccagcggcta cacctttacc ggcgccacca tgaactgggt gcgccaggct 120
cctggacagg gcctggaatg gatgggcctg atcaacccct acaccggcgg catccggtac 180
aaccagaaat tcaagggcag agtgaccatg acccgggaca ccagcacctc caccgtgtac 240
atggaactga gcagc 255
<210> 100
<211> 255
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 100
gacatccaaa tgacccagtc cccttcctca ctctccgctt ccgtgggcga ccgcgtgacc 60
atcacgtgtc gggcatcgga aagcgtggaa ccaagaggga ttaacttcct gaactggtac 120
cagcagaagc ctggaaaggc cccgaagctg cttatctatg ccgcgtccca agcctcaaaa 180
ggagtgccgt cgaggttctc cgggtcggga tccggaaccg acttcaccct gactattagc 240
agcctccagc ccgag 255
<210> 101
<211> 255
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 101
caggtgcagc tggtgcagtc tggcgccgaa gtgaagaaac caggcgccag cgtgaaggtg 60
tcctgcaagg ccagcggcta cacctttacc ggcgccacca tgaactgggt gcgccaggct 120
cctggacagg gcctggaatg gatgggcctg atcaaccctt acaccggcgg catccggtac 180
aaccagaaat tcaagggcag agtgaccatg acccgggaca ccagcacctc caccgtgtac 240
atggaactga gcagc 255
<210> 102
<211> 255
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 102
gacatcttgc tgactcagtc tccagccatc ctgtctgtga gtccaggaga aagagtcagt 60
ttctcctgca gggccagtca gagcattggc acaagcatac actggtatca gcaaagaaca 120
aatggttctc caaggcttct cataaagtat gcttctgagt ctgtctctgg gatcccttcc 180
aggtttagtg gcagtggatc agggacagat tttactctgt tcatcaacag tgtggagtct 240
gaagatattg cagat 255
<210> 103
<211> 255
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 103
caggttcagc tgcagcagtc tggagctgag ctgatgaagc ctggggcctc agtgaagata 60
tcctgcacgg ctactggcta cacaatcagt agatattgga tagagtgggt aaagcagagg 120
cctggacatg gccttgagtg gattggagag attttacctg gaagtggtgt tactaactac 180
aatgagaagt tcaagggcaa ggccacattc actgcagata catcctccaa cacagcctac 240
atgcaactca gcagc 255
<210> 104
<211> 255
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 104
gaaatcgtgc tgactcagtc acctggaacc ctctcgttgt cccccgggga aagggccact 60
ctttcctgcc gggcatccca gtcgatcgga acctccattc actggtacca gcagaagccg 120
gggcaggcgc cccggctgct catctattac gcctccgaat ccgtgtccgg catcccggat 180
agattcagcg gaagcggctc aggcaccgac tttaccctga ctatctcgcg cctggagcct 240
gaggacttcg ctgtg 255
<210> 105
<211> 255
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 105
caagtgcagc tcgtccagtc cggcgccgaa gtcaagaagc ctggttcctc ggtgaaagtg 60
tcctgcaagg catcgggagg gaccttcagc cggtattgga tcgaatgggt cagacaggcg 120
cccggacagg gccttgagtg gatgggcgaa attctgccgg gatccggagt gaccaactac 180
aacgagaagt tcaagggtcg cgtgacgatc accgccgacg aatcaacttc caccgcctac 240
atggagctga gctcc 255
<210> 106
<211> 255
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 106
gaaatcgtgc tgactcagtc acctggaacc ctctcgttgt cccccgggga aagggccact 60
ctttcctgcc gggcatccca gtcgatcgga acctccattc actggtacca gcagaagccg 120
gggcaggcgc cccggctgct catctattac gcctccgaat ccgtgtccgg catcccggat 180
agattcagcg gaagcggctc aggcaccgac tttaccctga ctatctcgcg cctggagcct 240
gaggacttcg ctgtg 255
<210> 107
<211> 255
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 107
caagtgcaac ttgtgcagtc gggagccgaa gtcaagaagc ccggttcctc cgtgaaagtg 60
tcctgcaaag cctccggcgg tacctttagc cggtactgga tcgaatgggt cagacaggcg 120
cctgggcagg gactggaatg gatgggggaa atcctgccgg gctccggagt gaccttcgag 180
aacgagaagt tcaagggccg cgtgaccatt accgctgacg agtcgacttc aaccgcatat 240
atggaactca gcagc 255
<210> 108
<211> 137
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 108
Gln Arg Pro Thr Gly Gly Pro Gly Cys Gly Pro Gly Arg Leu Leu Leu
1 5 10 15
Gly Thr Gly Thr Asp Ala Arg Cys Cys Arg Val His Thr Thr Arg Cys
20 25 30
Cys Arg Asp Tyr Pro Gly Glu Glu Cys Cys Ser Glu Trp Asp Cys Met
35 40 45
Cys Val Gln Pro Glu Phe His Cys Gly Asp Pro Cys Cys Thr Thr Cys
50 55 60
Arg His His Pro Cys Pro Pro Gly Gln Gly Val Gln Ser Gln Gly Lys
65 70 75 80
Phe Ser Phe Gly Phe Gln Cys Ile Asp Cys Ala Ser Gly Thr Phe Ser
85 90 95
Gly Gly His Glu Gly His Cys Lys Pro Trp Thr Asp Cys Thr Gln Phe
100 105 110
Gly Phe Leu Thr Val Phe Pro Gly Asn Lys Thr His Asn Ala Val Cys
115 120 125
Val Pro Gly Ser Pro Pro Ala Glu Pro
130 135
<210> 109
<211> 218
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 109
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Glu Pro Arg
20 25 30
Gly Ile Asn Phe Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Gln Ala Ser Lys Gly Val Pro Ser
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Leu
85 90 95
Glu Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100 105 110
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
115 120 125
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
130 135 140
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
145 150 155 160
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
165 170 175
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
180 185 190
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
195 200 205
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 110
<211> 217
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 110
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Ala
20 25 30
Thr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Leu Ile Asn Pro Tyr Thr Gly Gly Ile Arg Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ile Gly Gly Tyr Tyr Asp Ser Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val
210 215
<210> 111
<211> 111
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 111
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Gln Pro Arg
20 25 30
Gly Ile Asn Phe Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Pro Ser Lys Gly Val Pro Ser
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Leu
85 90 95
Glu Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 112
<211> 119
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 112
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Thr Val Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Leu Ile Asn Pro Tyr Thr Gly Gly Ile Arg Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ile Gly Gly Tyr Tyr Asp Ser Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 113
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 113
Arg Ala Ser Glu Ser Val Gln Pro Arg Gly Ile Asn Phe Leu Asn
1 5 10 15
<210> 114
<211> 7
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 114
Ala Ala Ser Asn Pro Ser Lys
1 5
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<211> 10
<212> PRT
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<220>
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Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr Thr Val Ser
1 5 10
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<211> 7
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<400> 116
Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr
1 5
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Gly Tyr Thr Val Ser
1 5
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<211> 255
<212> DNA
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<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 118
caggtgcagc tggtgcagtc tggcgccgaa gtgaagaaac caggcgccag cgtgaaggtg 60
tcctgcaagg ccagcggcta cacctttaca ggctacaccg tgtcctgggt gcgccaggct 120
cctggacagg gactggaatg gatgggcctg atcaacccct acaccggcgg catccggtac 180
aaccagaaat tcaagggcag agtgaccatg acccgggaca ccagcacctc caccgtgtac 240
atggaactga gcagc 255
<210> 119
<211> 255
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 119
gacatccaaa tgacccagtc cccttcctca ctctccgctt ccgtgggcga ccgcgtgacc 60
atcacgtgtc gggcatcgga aagcgtgcaa ccaagaggga ttaacttcct gaactggtac 120
cagcagaagc ctggaaaggc cccgaagctg cttatctatg ccgcgtccaa cccgtcaaaa 180
ggagtgccgt cgaggttctc cgggtcggga tccggaaccg acttcaccct gactattagc 240
agcctccagc ccgag 255
<210> 120
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 120
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Ser
20 25 30
Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Ala Ser Glu Ser Val Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Tyr Ser Trp Pro Ala
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 121
<211> 118
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 121
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Arg Tyr
20 25 30
Trp Ile Glu Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Glu Ile Leu Pro Gly Ser Gly Val Glu Trp Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Lys Gly Arg Gly Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Ser Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 122
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 122
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Ser
20 25 30
Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Ala Ser Glu Ser Val Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Tyr Ser Trp Pro Ala
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 123
<211> 118
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 123
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Arg Tyr
20 25 30
Trp Ile Glu Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Glu Ile Leu Pro Gly Ser Gly Val Thr Phe Glu Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Lys Gly Arg Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Ser Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 124
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 124
Lys Gly Arg Gly Tyr Ala Met Asp Tyr
1 5
<210> 125
<211> 255
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 125
gaaatcgtgc tgactcagtc acctggaacc ctctcgttgt cccccgggga aagggccact 60
ctttcctgcc gggcatccca gtcgatcgga acctccattc actggtacca gcagaagccg 120
gggcaggcgc cccggctgct catctattac gcctccgaat ccgtgtccgg catcccggat 180
agattcagcg gaagcggctc aggcaccgac tttaccctga ctatctcgcg cctggagcct 240
gaggacttcg ctgtg 255
<210> 126
<211> 255
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 126
caagtgcaac ttgtgcagtc gggagccgaa gtcaagaagc ccggttcctc cgtgaaagtg 60
tcctgcaaag cctccggcgg tacctttagc cggtactgga tcgaatgggt cagacaggcg 120
cctgggcagg gactggaatg gatgggggaa atcctgccgg gctccggagt gaccttcgag 180
aacgagaagt tcaagggccg cgtgaccatt accgctgacg agtcgacttc aaccgcatat 240
atggaactca gcagc 255
<210> 127
<211> 255
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 127
gaaatcgtgc tgactcagtc acctggaacc ctctcgttgt cccccgggga aagggccact 60
ctttcctgcc gggcatccca gtcgatcgga acctccattc actggtacca gcagaagccg 120
gggcaggcgc cccggctgct catctattac gcctccgaat ccgtgtccgg catcccggat 180
agattcagcg gaagcggctc aggcaccgac tttaccctga ctatctcgcg cctggagcct 240
gaggacttcg ctgtg 255
<210> 128
<211> 255
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 128
caagtgcaac ttgtgcagtc gggagccgaa gtcaagaagc ccggttcctc cgtgaaagtg 60
tcctgcaaag cctccggcgg tacctttagc cggtactgga tcgaatgggt cagacaggcg 120
cctgggcagg gactggaatg gatgggggaa atcctgccgg gctccggagt gaccttcgag 180
aacgagaagt tcaagggccg cgtgaccatt accgctgacg agtcgacttc aaccgcatat 240
atggaactca gcagc 255
<210> 129
<211> 255
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 129
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225 230 235 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe
245 250 255
<210> 130
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 130
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
Claims (35)
- 글루코코르티코이드 유도된 종양 괴사 인자 수용체 계열 관련된 단백질(GITR: Glucocorticoid Induced Tumor Necrosis Factor Receptor Family Related Protein)에 특이적으로 결합하고,
서열 번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 또는 112로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변성 영역(VH)의 VH 상보성 결정 영역(CDR: complementarity determining region)1, VH CDR2, 및 VH CDR3을 포함하는 VH; 및/또는
서열 번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 또는 111로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변성 영역(VL)의 VL CDR1, VL CDR2, 및 VL CDR3을 포함하는 VL을 포함하는
단리된 항체. - 제1항에 있어서,
항체가 서열 번호 24, 25, 26, 32, 33, 34, 35, 39, 40, 41, 115, 116, 117, 63, 64, 또는 65에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, 서열 번호 27, 28, 44, 45, 66, 또는 67에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2, 및 서열 번호 29, 46, 또는 68에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3; 및/또는 서열 번호 21, 30, 36, 42, 113, 또는 31에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, 서열 번호 22, 37, 43, 114, 또는 61에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2, 및 서열 번호 23, 38, 또는 62에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3을 포함하는 단리된 항체. - 제1항에 있어서,
항체가 서열 번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 또는 112에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH, 또는 CDR내에 존재하지 않는 잔기에서 1개 또는 수개의 보존적 아미노산 치환을 갖는 이의 변이체를 포함하는 단리된 항체. - 제3항에 있어서,
항체가 서열 번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 또는 111에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL, 또는 CDR내에 존재하지 않는 아미노산에서 1개 또는 수개의 아미노산 치환을 갖는 이의 변이체를 포함하는 단리된 항체. - 제1항에 있어서,
항체가 서열 번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 또는 112에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH, 및 서열 번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 또는 111에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는 단리된 항체. - 글루코코르티코이드 유도된 종양 괴사 인자 수용체 계열 관련된 단백질(GITR)에 특이적으로 결합하고,
서열 번호 16, 18, 20, 121, 및 123으로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변성 영역(VH)의 VH 상보성 결정 영역(CDR)1, VH CDR2, 및 VH CDR3을 포함하는 VH; 및/또는
서열 번호 15, 17, 19, 120, 및 122로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변성 영역(VL)의 VL CDR1, VL CDR2, 및 VL CDR3을 포함하는 VL을 포함하는
단리된 항체. - 제6항에 있어서,
항체가 서열 번호 50, 51, 52, 56, 또는 57에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, 서열 번호 53, 54, 58, 또는 59에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2, 및 서열 번호 55, 60, 또는 124에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3; 및/또는 서열 번호 47에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, 서열 번호 48에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2, 및 서열 번호 49에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3을 포함하는 단리된 항체. - 글루코코르티코이드 유도된 종양 괴사 인자 수용체 계열 관련된 단백질(GITR)에 특이적으로 결합하고,
서열 번호 70 및 72로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변성 영역(VH)의 VH 상보성 결정 영역(CDR)1, VH CDR2, 및 VH CDR3을 포함하는 VH; 및/또는
서열 번호 69 및 71로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변성 영역(VL)의 VL CDR1, VL CDR2, 및 VL CDR3을 포함하는 VL을 포함하는
단리된 항체. - 제7항에 있어서,
항체가 서열 번호 32, 76, 77, 84, 85, 또는 86에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, 서열 번호 78 또는 79에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2, 및 서열 번호 80 또는 87에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3; 및/또는 서열 번호 73 또는 81에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, 서열 번호 74 또는 82에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2, 및 서열 번호 75 또는 83에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3을 포함하는 단리된 항체. - 제1항 내지 제9항중 어느 한 항에 있어서,
항체가 불변성 영역을 포함하는 단리된 항체. - 제1항 내지 제10항중 어느 한 항에 있어서,
항체가 IgG1, IgG2, IgG2△a, IgG4, IgG4△b, IgG4△c, IgG4 S228P, IgG4△b S228P 및 IgG4△c S228P로 구성된 군에서 선택되는 이소타입(isotype)을 갖는 단리된 항체. - GITR에 특이적으로 결합하고, GITR에 결합하기 위해 제1항, 제2항 및 제6 내지 제9항중 어느 한 항의 항체와 경쟁하고/하거나, 상기 항체에 의해 인식되는 GITR 상의 에피토프와 동일하거나 상기 에피토프와 중첩되는 에피토프에 결합하는
단리된 항체. - 서열 번호 39, 40, 또는 41에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, 서열 번호 44 또는 45에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2, 서열 번호 29에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3, 서열 번호 42에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, 서열 번호 43에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2, 및 서열 번호 38에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3을 포함하는
단리된 항-GITR 항체. - 제1항 내지 제13항중 어느 한 항에 있어서,
상승적 종양 모델을 CT26 세포에서 사용하여 생체내 측정시, 항체가 조절 T 세포(Treg) 소모를 촉진시키고 T 효과자 세포를 활성화시키는 단리된 항체. - 제1항 내지 제14항중 어느 한 항에 있어서,
항체가 T 세포로부터 염증성 사이토킨 IFNγ 및 TNFα의 방출을 증가시키는 단리된 항체. - 제1항 내지 제15항중 어느 한 항에 있어서,
항체가 항-종양 면역 반응을 증진시키는 단리된 항체. - 제1항 내지 제7항 및 제13항중 어느 한 항에 있어서,
항체가 인간 GITR에 결합하는 단리된 항체. - 제1항, 제2항 및 제6항 내지 제9항중 어느 한 항의 항체를 생산하는 단리된 세포주.
- 제1항, 제2항 및 제6항 내지 제9항중 어느 한 항의 항체를 인코딩하는 단리된 핵산.
- 제19항의 핵산을 포함하는 재조합 발현 벡터.
- 제20항의 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포.
- 제1항, 제2항 및 제6항 내지 제9항중 어느 한 항의 항체를 생산할 수 있는 하이브리도마.
- 항-GITR 항체의 생산 방법으로서,
제1항, 제2항 및 제5항 내지 제9항중 어느 한 항의 항체를 이러한 항체가 생산되는 조건하에 재조합적으로 생산하는 세포주를 배양하는 단계; 및 상기 항체를 회수하는 단계를 포함하는 방법. - 항-GITR 항체의 생산 방법으로서,
서열 번호 110에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 번호 109에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체를 인코딩하는 핵산을 포함하는 세포주를 이러한 항체가 생산되는 조건하에 배양하는 단계; 및 상기 항체를 회수하는 단계를 포함하는 방법. - 제24항에 있어서,
항체의 중쇄 및 경쇄를 별도의 벡터 상에서 인코딩하는 방법. - 제24항에 있어서,
항체의 중쇄 및 경쇄를 동일한 벡터 상에서 인코딩하는 방법. - 제1항, 제2항 및 제5항 내지 제9항중 어느 한 항의 항체 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학 조성물.
- 제27항의 약학 조성물을 포함하는 암 치료를 위한 키트.
- 암과 연관된 하나 이상의 증후가 피험체에서 개선되도록 피험체에게 효과량의 제1항, 제2항 및 제5항중 어느 한 항의 항-GITR 항체를 투여함을 포함하는, 암과 관련된 하나 이상의 증후가 개선될 필요가 있는 피험체에서 암을 치료하는 방법.
- 제29항에 있어서,
암이 B-세포 관련된 암, 위암, 소장암, 육종, 두경부암, 흉선암, 상피암, 침샘암, 간암, 담즙암, 신경내분비 종양, 위점막암, 갑상선암, 폐암, 중피종, 난소암, 유방암, 전립선암, 식도암, 췌장암, 신경교종, 신장암, 방광암, 경부암, 자궁암, 외음부암, 음경암, 고환암, 항문암, 융모암종, 대장암, 구강암, 피부암, 메르켈(Merkel) 세포 암종, 교모세포종, 뇌종양, 골암, 안암, 및 흑색종으로 구성된 군에서 선택되는 방법. - 제29항 또는 제30항에 있어서,
암이 재발되거나 난치성인 방법. - 제29항 내지 제31항중 어느 한 항에 있어서,
암이 국소 진행성 또는 전이성 흑색종, 편평상피 세포 두경부암, 난소암, 신장암, 위암, 및 폐암으로 구성된 군에서 선택되는 방법. - 제29항 내지 제32항중 어느 한 항에 있어서,
효과량의 제2 치료제를 투여함을 추가로 포함하는 방법. - 제33항에 있어서,
제2 치료제가 항-CTLA-4 항체, 항-4-1BB 항체, 항-PD-1 항체, 항-PD-L1 항체, 항-TIM3 항체, 항-LAG3 항체, 항-TIGIT 항체, 항-OX40 항체, IL-8 항체, 항-HVEM 항체, 항-BTLA 항체, 항-CD40 항체, 항-CD40L 항체, 항-CD47 항체, 항-CSF1R 항체, 항-CSF1 항체, 항-MARCO 항체, 항-CXCR4 항체, 항-VEGFR1 항체, 항-VEGFR2 항체, 항-TNFR1 항체, 항-TNFR2 항체, 항-CD3 이중특이적 항체, 항-CD19 항체, 항-CD20, 항-Her2 항체, 항-EGFR 항체, 항-ICOS 항체, 항-CD22 항체, 항-CD52 항체, 항-CCR4 항체, 항-CCR8 항체, 항-CD200R 항체, 항-VISG4 항체, 항-CCR2 항체, 항-LILRb2 항체, 항-CXCR4 항체, 항-CD206 항체, 항-CD163 항체, 항-KLRG1 항체, 항-FLT3 항체, 항-B7-H4 항체, 항-B7-H3 항체, 및 제2의 항-GITR 항체로 구성된 군에서 선택되는 항체인 방법. - 제34항에 있어서,
제2 치료제가 사이토킨, TNFα, PAP 저해제, 종양세포 붕괴성 바이러스, 키나아제 저해제, ALK 저해제, MEK 저해제, IDO 저해제, GLS1 저해제, 티로신 키나아제 저해제, CART 세포 또는 T 세포 치료제, TLR 작용물질, 및 종양 백신으로 구성된 군에서 선택되는 방법.
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