KR20190098542A - Double-layered fluorescent protein nanoparticles - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 내부 및 외부 표면에 형광 단백질이 융합된 이중층의 형광 단백질 나노입자 및 상기 이중층 형광 단백질 나노입자의 생체 내 이미징을 위한 용도에 관한 것이다.The present invention relates to bilayer fluorescent protein nanoparticles in which fluorescent proteins are fused to inner and outer surfaces and uses for in vivo imaging of the bilayer fluorescent protein nanoparticles.
최근 암 수술 치료 분야에서 실시간 이미지 안내 수술이 크게 주목을 받고 있다. 수술 중 이미징 기술에서 형광 조영제를 이용하여 특정 암 조직을 시각화할 수 있는 형광 기술은 일반적으로 비광학 기술, 예를 들면 자가 공명 이미징(magnetic resonance imaging), 컴퓨터 단층촬영(computed tomography), 양전자방출 단층촬영술(positron emission tomography) 보다 일반적으로 적절하고 나은 성능을 낸다.Recently, real-time image guided surgery has attracted much attention in the field of cancer surgery treatment. Fluorescence techniques that can visualize specific cancer tissues using fluorescence contrast agents in intraoperative imaging techniques are generally non-optical techniques, such as magnetic resonance imaging, computed tomography, and positron emission tomography. It is generally more appropriate and performs better than positron emission tomography.
종래의 근적외선 파장의 형광 프로브, 퀀텀닷(CdSe, ZnS, 등) 및 합성 유기 염색물질(Cy5, Cy5.5, 등)은 생체 독성과 불필요한 화학적 특성, 예를 들면 알부민과 같은 혈청 단백질과의 비특이적 결합 등으로 인해 현재 수술 중 이미징 기술에 적용하기에 부족하다. Conventional near-infrared wavelength fluorescence probes, quantum dots (CdSe, ZnS, etc.) and synthetic organic dyes (Cy5, Cy5.5, etc.) are not specific for biotoxicity and unnecessary chemical properties such as serum proteins such as albumin. Combinations and the like are currently insufficient for application to imaging techniques during surgery.
위와 같은 문제를 해결하기 위해 리포좀 또는 속이 빈 실리카 구형 나노입자 안에 형광 프로브를 캡슐화하는 것이 하나의 해결책으로 제시되었지만, 상기의 경우 몸 속 장기간 축적에 의한 독성에 대한 문제에 대해서 충분히 안전하지 못하다.In order to solve the above problems, encapsulating fluorescent probes in liposomes or hollow silica spherical nanoparticles has been suggested as one solution, but in the above case, it is not sufficiently safe for the problem of toxicity due to long-term accumulation in the body.
이와 같은 문제점이 해결된, 어느 정도 안정적인 구조를 갖는 속이 빈 합성 나노입자는 물리, 화학적 합성이 용이하지만, 합성된 입자는 수 나노미터에서 수백 나노미터까지로 그 크기의 범위가 넓어 균일도가 떨어지며, 이에 따라 입자당 채워진 형광 물질의 개수의 변화가 일어나는 문제점이 있다.Hollow synthetic nanoparticles having a stable structure to solve this problem is easy to physically and chemically synthesized, but the synthesized particles range from a few nanometers to several hundred nanometers in size, resulting in inferior uniformity. Accordingly, there is a problem that a change in the number of filled fluorescent materials per particle occurs.
게다가, 캡슐화된 형광입자의 방출은 대표적인 문제로 대두되고 있다. 그리고 지금까지 캡슐화된 형광입자의 공간적 분포를 정밀하게 컨트롤할 수 있는 방법이 제시된 적이 없으며, 형광입자의 공간 분포를 정밀하게 컨트롤할 수 없었기 때문에 캡슐화된 형광입자 간의 자가 형광 꺼짐 현상(self-quenching effect)을 해결하기 어려웠다. 또한, 친수성 형광 단백질은 각각의 단백질이 밀어내는 정전기적 상호 작용을 일으켜 작은 캡슐에 형광단백질을 고농도로 넣는 것이 어렵다. In addition, the release of encapsulated fluorescent particles has become a major problem. And until now, no method has been proposed to precisely control the spatial distribution of the encapsulated fluorescent particles, and since the spatial distribution of the fluorescent particles could not be precisely controlled, the self-quenching effect between the encapsulated fluorescent particles (self-quenching effect) ) Was difficult to solve. In addition, hydrophilic fluorescent proteins cause electrostatic interactions pushed by each protein, making it difficult to put high concentrations of fluorescent proteins in small capsules.
본 발명자들은 위와 같은 기존의 캡슐화 방법의 한계를 극복할 수 있는 새로운 캡슐화 방법을 개발하였다. 본 발명은 생물학적 단백질 나노입자인 B형 간염 바이러스 입자(hepatitis B virus capsid, HBVC)를 균일한 사이즈와 구성물을 가진 속이 빈 나노 구조체로 활용하였다.The present inventors have developed a new encapsulation method that can overcome the limitation of the existing encapsulation method as described above. The present invention utilizes hepatitis B virus capsid (HBVC), a biological protein nanoparticle, as a hollow nanostructure having a uniform size and composition.
HBVC 나노입자는 세포 안에서 세밀하게 조절된 자가 조립 과정을 통해 형성된다. 최근 화학적 결합 방법을 이용하여 형광 물질을 바이러스 유래 입자에 결합한 나노입자를 의료 이미징 분야에 적용된 보고들이 있지만, 같은 화학적 결합 방법을 쓸지라도 그 수율이 형광 물질의 구조에 따라 변할 수 있다고 보고되어 있다. 예를 들면, 동부 모자이크 바이러스(Cowpea mosaic virus, CPMV) 유래 단백질 나노입자에 화학적으로 A555(Alexa Fluor 555)와 A488(Alexa Fluor 488)이 각각 접합되었을 때, 그 결과 다른 입자당 형광물질 비율이 각각 70과 120을 보였다. 또한, 다른 기존 연구 개발에서도 화학적 결합방법을 사용하였을 경우, 300개의 소단위 구조를 가진 CPMW 입자가 입자당 결합 형광물질 200개로 제한되었음이 발표되었다.HBVC nanoparticles are formed through finely regulated self-assembly processes in cells. Recently, reports have been applied to the medical imaging field of nanoparticles in which fluorescent materials are bound to virus-derived particles using chemical binding methods. However, even when the same chemical binding method is used, the yield may be changed depending on the structure of fluorescent materials. For example, when A555 (Alexa Fluor 555) and A488 (Alexa Fluor 488) are chemically conjugated to protein mosaic particles derived from Eastern mosaic virus (CPMV), respectively, the result is that the ratio of phosphors per particle is different. 70 and 120 were shown. In addition, in other existing research and development, when chemical bonding was used, it was announced that CPMW particles having 300 subunit structures were limited to 200 binding phosphors per particle.
한편, 최근에 강한 형광특성과 광안정성을 가지는 근적외선 형광 단백질(mCardinal)이 개발되었다. 이 형광 단백질은 깊은 조직 이미징에 적합한 광파장 범위(600-1000 nm)의 여기 스펙트럼을 가지고 있다. 현재 이 형광 단백질은 체외 이미징이나 이식형 체내 세포 이미징에만 적용되었으며, 체내 암 이미징에는 적용된 사례는 알려지지 않았다. On the other hand, near-infrared fluorescent protein (mCardinal) has recently been developed that has strong fluorescence and light stability. This fluorescent protein has an excitation spectrum in the light wavelength range (600-1000 nm) suitable for deep tissue imaging. At present, the fluorescent protein has been applied only to in vitro or implanted in vivo cell imaging, and there is no known case for in vivo cancer imaging.
특허문헌 1에서는 표면에 표적 지향성 펩타이드와 형광 단백질을 융합하는 형광 단백질 나노입자를 개시하고 있다. 상기 형광 단백질 나노입자는 외부 표면에만 형광 입자를 표출한 경우이므로 형광도가 본 발명보다 낮고 광안정성도 내부보다 떨어지는 문제점이 있다.
이에, 종래 기술보다 형광도와 광안정성이 우수한 형광 단백질 나노입자의 개발이 요구되는 실정이다.Therefore, the development of fluorescent protein nanoparticles having superior fluorescence and light stability than the prior art is required.
본 발명의 목적은 형광강도 증폭 및 생체 안정성이 향상된 생체 진단용 신소재로서 이중층의 형광 단백질 나노입자 및 이의 용도를 제공하는 것이다.Disclosure of Invention An object of the present invention is to provide a bilayer fluorescent protein nanoparticle and its use as a new material for biodiagnosis with improved fluorescence intensity amplification and biostability.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은, In order to achieve the above object, the present invention,
B형 간염 바이러스 코어 단백질의 내부 및 외부 표면(both inner and outersurface)에 형광 단백질이 융합되어 있고 외부 표면(outer surface)에는 표적 지향성 펩타이드가 표출되어 있는 형광 단백질 나노입자를 제공한다.Fluorescent protein nanoparticles are provided in which the fluorescent protein is fused to the inner and outer surfaces of the hepatitis B virus core protein and the target directional peptide is expressed on the outer surface.
또한, 본 발명은, In addition, the present invention,
본 발명에 따른 형광 단백질 나노입자; 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 표적 지향형 조영제 조성물을 제공한다.Fluorescent protein nanoparticles according to the present invention; And a pharmaceutically acceptable carrier.
또한, 본 발명은, In addition, the present invention,
본 발명에 따른 형광 단백질 나노입자; 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 동시 진단 또는 치료용 조영제 조성물을 제공한다.Fluorescent protein nanoparticles according to the present invention; And it provides a contrast diagnostic or therapeutic contrast composition comprising a pharmaceutically acceptable carrier.
또한 본 발명은,In addition, the present invention,
본 발명에 따른 형광 단백질 나노입자; 및 진단 프로브를 포함하고, 상기 진단 프로브는 영상 판독을 위한 표지 물질인 다중 진단 프로브를 제공한다.Fluorescent protein nanoparticles according to the present invention; And a diagnostic probe, wherein the diagnostic probe provides multiple diagnostic probes that are markers for image reading.
또한, 본 발명은 In addition, the present invention
본 발명에 따른 형광 단백질 나노입자; 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 생체 이미징용 조성물을 제공한다.Fluorescent protein nanoparticles according to the present invention; And it provides a composition for biological imaging comprising a pharmaceutically acceptable carrier.
이하, 본 발명의 구성을 구체적으로 설명한다.EMBODIMENT OF THE INVENTION Hereinafter, the structure of this invention is demonstrated concretely.
본 발명은 B형 간염 바이러스 코어 단백질의 내부 및 외부 표면(both inner and outer surface)에 형광 단백질이 융합되어 있고, 외부 표면(outer surface)에는 표적 지향성 펩타이드가 표출되어 있는 형광 단백질 나노입자에 관한 것이다.The present invention relates to fluorescent protein nanoparticles in which fluorescent proteins are fused to the inner and outer surfaces of the hepatitis B virus core protein, and target-directed peptides are expressed on the outer surface. .
본 발명의 형광 단백질 나노입자는 나노미터 크기의 직경을 가지는 구형의 단백질 입자로서, 자기조립성 단백질에 의한 자기조립에 의해 입자를 이루고 있어 매우 균일한 입도 분포를 보이는 입자를 재현성 있게 제조할 수 있을 뿐만 아니라, 생체 내에서 사용된 후 분해될 수 있는 생체친화성 물질이기 때문에 생체 이미징 후의 나노입자의 잔존으로 인한 독성의 문제가 없다. The fluorescent protein nanoparticles of the present invention are spherical protein particles having a diameter of nanometers, and are formed by self-assembly by self-assembled proteins, so that particles having a very uniform particle size distribution can be reproducibly produced. In addition, since it is a biocompatible material that can be degraded after being used in vivo, there is no problem of toxicity due to the remaining of the nanoparticles after bioimaging.
따라서, 본 발명의 형광 단백질 나노입자는 생체 적용이 가능하고 입자에 따른 표적 타겟팅 효과가 우수하여 진단 조직 또는 질환에 적합한 것을 특징으로 한다.Therefore, the fluorescent protein nanoparticles of the present invention can be applied to a living body and excellent in target targeting effect according to the particles, characterized in that suitable for diagnostic tissue or disease.
한 구체예에 따르면, 본 발명의 형광 단백질 나노입자는 형광 단백질, B형 간염 바이러스 코어 단백질, 및 표적 지향성 펩타이드가 융합된 단량체가 자가조립되어 하나의 구형 형광 단백질 나노입자를 이룰 수 있다. According to one embodiment, the fluorescent protein nanoparticles of the present invention may self-assemble a fluorescent protein, hepatitis B virus core protein, and a monomer fused with a target directional peptide to form one spherical fluorescent protein nanoparticle.
본 명세서에서, 용어 “자기조립성 단백질”은 단백질, 단백질의 서브유닛 또는 펩타이드가 수 개가 모였을 때 이들이 스스로 조직적인 구조 또는 패턴을 형성하여 집합체를 형성하는 단백질, 단백질의 서브유닛 또는 펩타이드를 의미한다. 이러한 자기조립성 단백질은 별도의 조작 없이도 단백질의 나노입자 형성을 가능하게 하므로 본 발명에 따른 단백질 나노입자의 제조를 위해 유리하게 사용할 수 있다.As used herein, the term "self-assembled protein" refers to a protein, a subunit or peptide of a protein, when a plurality of proteins, subunits or peptides of the protein are collected, they form an organizational structure or pattern by themselves to form an aggregate. . Such self-assembled protein can be advantageously used for the production of protein nanoparticles according to the present invention because it enables the nanoparticle formation of the protein without a separate manipulation.
상기 자기조립성 단백질은 외래 단백질과 융합할 수 있고, 상기 외래 단백질은 목적에 따라 자기조립시 내부 및/또는 외부에 위치시킬 수 있다. 본 발명은 단백질 나노입자를 표적 물질의 탐지 목적으로 사용하고 있으므로, 외래 단백질로 형광 단백질과 표적 지향성 펩타이드를 사용할 수 있고, 상기 형광 단백질은 자기조립성 단백질의 자기조립시 내부 및/또는 외부 표면에, 표적 지향성 펩타이드는 자기조립성 단백질의 자기조립시 외부 표면에 위치하도록 조절할 수 있다. The self-assembled protein may be fused with a foreign protein, and the foreign protein may be located inside and / or outside upon self-assembly according to the purpose. Since the present invention uses protein nanoparticles for the purpose of detecting a target substance, fluorescent proteins and target-directed peptides may be used as foreign proteins, and the fluorescent proteins may be formed on the inner and / or outer surfaces of the self-assembled protein. In addition, the target directional peptide may be adjusted to be located on an outer surface during self-assembly of the self-assembled protein.
이러한 자기조립성 단백질로 B형 간염 바이러스 코어 단백질(이하, 'HBV 코어 단백질'이라 함)을 사용할 수 있다.Hepatitis B virus core protein (hereinafter referred to as 'HBV core protein') can be used as such self-assembled protein.
HBV 코어 단백질은 180 내지 240개의 단량체가 자가조립되어 하나의 구형 단백질 나노입자를 형성하며, 유전자 재조합 기술을 이용하여 대장균으로부터 대량 생산이 가능하다. The HBV core protein is self-assembled from 180 to 240 monomers to form one spherical protein nanoparticle, and can be mass produced from E. coli using genetic recombination technology.
본 발명에 따른 형광 단백질 나노입자는 HBV 코어 단백질의 내부 및 외부 표면에 형광 단백질이 융합되어 있고, 외부 표면(outer surface)에는 표적 지향성 펩타이드가 표출되어 있는 것을 포함한다.The fluorescent protein nanoparticles according to the present invention include those in which fluorescent proteins are fused to the inner and outer surfaces of the HBV core protein, and the target directional peptide is expressed on the outer surface.
본 발명에 있어서, 형광 단백질 나노입자의 “내부 표면(inner surface)” 및 “외부 표면(outer surface)”은 형광 단백질과 접하여 상기 형광 단백질이 융합될 수 있는 영역을 의미한다. 본 발명에 있어서, 상기 “외부 표면”에는 단백질 나노입자의 표적 지향성 펩타이드가 표출될 수 있다.In the present invention, the "inner surface" and "outer surface" of the fluorescent protein nanoparticles refer to a region in which the fluorescent protein can be fused in contact with the fluorescent protein. In the present invention, the "outer surface" may be a target-directed peptide of the protein nanoparticles.
본 발명과 같이, 형광 단백질 나노입자의 내부 및 외부 표면에 형광 단백질이 융합되어 있는 경우, 기존의 단일 형광 단백질 나노입자(외부 표면에만 형광 단백질이 융합되어 있는 나노입자)에 비해 형광도가 향상되고 광안전성이 우수한 단백질 나노입자를 제공할 수 있다. As in the present invention, when the fluorescent protein is fused to the inner and outer surfaces of the fluorescent protein nanoparticles, the fluorescence is improved compared to the existing single fluorescent protein nanoparticles (nanoparticles in which the fluorescent protein is fused only to the outer surface). It is possible to provide protein nanoparticles having excellent light safety.
상기 형광 단백질 나노입자는 HBV 코어 단백질을 이루고 있는 180 내지 240개의 단량체의 1-44번째 아미노산 서열 부분과 상기 단량체의 45-149번째 아미노산 서열 부분 사이; 상기 단량체의 1-45번째 아미노산 서열 부분과 상기 단량체의 46-149번째 아미노산 서열 부분 사이; 또는 상기 단량체의 1-48번째 아미노산 서열 부분과 상기 단량체의 49-149번째 아미노산 서열 부분 사이에 형광 단백질이 위치하고 있다. 형광 단백질이 B형 간염 바이러스 코어 단백질 단량체의 상기 위치에 위치함으로써, 상기 코어 단백질의 자가조립 시 형광 단백질이 내부와 외부 표면에 위치하도록 조절될 수 있다. 다만, 이러한 형광 단백질의 융합은 HBV 코어 단백질의 3차 구조를 형성하는데 영향을 줄 수 있으므로 상기 3차 구조를 형성할 수 있는 범위에서 형광 단백질을 채택할 수 있다.The fluorescent protein nanoparticles comprise between 1-44th amino acid sequence portion of 180-240 monomers and 45-149th amino acid sequence portion of the monomer constituting the HBV core protein; Between the 1-45th amino acid sequence portion of the monomer and the 46-149th amino acid sequence portion of the monomer; Or a fluorescent protein is located between the 1-48th amino acid sequence portion of the monomer and the 49-149th amino acid sequence portion of the monomer. By placing the fluorescent protein at this position of the hepatitis B virus core protein monomer, the fluorescent protein can be controlled to be located on the inner and outer surfaces during self-assembly of the core protein. However, since the fusion of the fluorescent protein may affect the formation of the tertiary structure of the HBV core protein, the fluorescent protein may be adopted in a range capable of forming the tertiary structure.
본 발명의 일 구체예에 따르면, HBV 코어 단백질 단량체의 1-44번째 아미노산 서열 부분과 상기 단량체의 45-149번째 아미노산 서열 부분 사이; 상기 단량체의 1-45번째 아미노산 서열 부분과 상기 단량체의 46-149번째 아미노산 서열 부분 사이; 또는 상기 단량체의 1-48번째 아미노산 서열 부분과 상기 단량체의 49-149번째 아미노산 서열 부분 사이에 mCardinal; 증강된 녹색 형광 단백질(enhanced green fluorescent protein); 또는 적색형 광단백질(DsRed)을 위치시키고, HBV 코어 단백질의 N-말단 또는 C-말단에는 표적 지향성 펩타이드를 결합시킨 키메릭 단백질을 제조할 수 있다. 1개의 키메릭 단백질, 즉 단량체 180 내지 240개가 자가조립되어 내부 표면에는 형광 단백질이 융합되어 있고 외부 표면에는 형광 단백질이 융합되어 있으면서 표적 지향성 펩타이드가 표출되어 있는 형광 단백질 나노입자를 형성할 수 있다.According to one embodiment of the invention, between the 1-44th amino acid sequence portion of the HBV core protein monomer and the 45-149th amino acid sequence portion of the monomer; Between the 1-45th amino acid sequence portion of the monomer and the 46-149th amino acid sequence portion of the monomer; Or mCardinal between the 1-48th amino acid sequence portion of the monomer and the 49-149th amino acid sequence portion of the monomer; Enhanced green fluorescent protein; Alternatively, a chimeric protein may be prepared in which a red type photoprotein (DsRed) is positioned and a target directed peptide is bound to the N-terminus or C-terminus of the HBV core protein. One chimeric protein, ie, 180 to 240 monomers, may be self-assembled to form fluorescent protein nanoparticles in which a fluorescent protein is fused on an inner surface and a fluorescent protein is fused on an outer surface, and a target-directed peptide is expressed.
한 구체예에서, 상기 형광 단백질 나노입자의 외부 표면의 형광 단백질은 HBV 코어 단백질의 N-말단에 결합되는 것일 수 있다.In one embodiment, the fluorescent protein of the outer surface of the fluorescent protein nanoparticles may be bound to the N-terminus of the HBV core protein.
본 발명에 따르면 자기조립성 단백질의 아미노 말단과 카르복실 말단이 표면으로 표출되는 특징을 이용하여 내부 표면에는 형광 단백질이 융합되어 있으면서도 외부 표면에 형광 단백질이 표출되어 있는 나노입자를 제조할 수 있다. 예컨대, 내부 표면에 형광 단백질이 융합되어 있으며 외부 표면에는 표적 지향성 펩타이드가 표출되어 있는 형광 단백질 나노입자에 화학적 공정을 통해 형광 단백질을 표면 결합시켜 형광 단백질 나노입자를 형성할 수 있다.According to the present invention, the amino terminal and the carboxyl terminus of the self-assembled protein can be manufactured by using a feature that the fluorescent protein is fused to the inner surface while the fluorescent particles are expressed on the outer surface. For example, the fluorescent protein is fused to the inner surface and the fluorescent protein nanoparticles on which the target-directed peptide is expressed on the outer surface can be bonded to the surface of the fluorescent protein through a chemical process to form the fluorescent protein nanoparticles.
본 발명의 일 구체예에 따르면, HBV 코어 단백질 단량체의 1-44번째 아미노산 서열 부분과 상기 단량체의 45-149번째 아미노산 서열 부분 사이; 1-45번째 아미노산 서열 부분과 46-149번째 아미노산 서열 부분 사이; 또는 1-48번째 아미노산 서열 부분과 49-149번째 아미노산 서열 부분 사이에 mCardinal, 증강된 녹색 형광 단백질(enhanced-green fluorescence protein) 또는 적색 형광 단백질(DsRed)을 위치시키고, 상기 표적 지향성 펩타이드는 HBV 코어 단백질 단량체의 1-78번째 아미노산 서열 부분과 상기 단량체의 81-149번째 아미노산 서열 부분 사이에 결합시켜 키메릭 단백질을 제조할 수 있다. 1개의 키메릭 단백질 즉, 단량체 180 내지 240개가 자가조립되어 내부 및 외부 표면에 형광 단백질을 융합되어 있고 외부 표면에 표적 지향성 펩타이드가 표출되는 형광 단백질 나노입자를 형성할 수 있다.According to one embodiment of the invention, between the 1-44th amino acid sequence portion of the HBV core protein monomer and the 45-149th amino acid sequence portion of the monomer; Between 1-45 amino acid sequence portion and 46-149 amino acid sequence portion; Or between a 1-48th amino acid sequence portion and a 49-149th amino acid sequence portion, an mCardinal, enhanced-green fluorescence protein or red fluorescence protein (DsRed), wherein the target directional peptide is an HBV core Chimeric proteins can be prepared by binding between the 1-78th amino acid sequence portion of a protein monomer and the 81-149th amino acid sequence portion of the monomer. One chimeric protein, i.e., 180 to 240 monomers, may be self-assembled to form fluorescent protein nanoparticles in which the fluorescent protein is fused to the inner and outer surfaces and the target directional peptide is expressed on the outer surface.
일반적으로 형광 단백질들이 1 내지 10nm 이내에 서로 위치할 때 형광의 퀀칭(quenching) 현상이 나타나는 것으로 알려져 있다. 본 발명에 따른 형광 단백질 나노입자는 내부 및 외부 표면에 형광 단백질이 융합되어 있어 퀀칭 현상이 일어나지 않는 간격으로 형광 단백질이 위치할 수 있다. 이에, 본 발명에 따른 형광 단백질 나노입자는 링커 펩타이드 없이 B형 간염 바이러스 코어 단백질과 형광 단백질 및 표적 지향성 펩타이드를 결합시킴으로써 형광 단백질 간의 퀀칭 현상이 일어나지 않는 형광 단백질 나노입자를 형성할 수 있다. 다만, 본 발명의 형광 단백질 나노입자는 형광 단백질 간의 적절한 공간이 확보되는 선에서 링커 펩타이드를 포함할 수도 있다. In general, it is known that quenching of fluorescence occurs when fluorescent proteins are positioned within 1 to 10 nm. In the fluorescent protein nanoparticles according to the present invention, fluorescent proteins are fused to inner and outer surfaces thereof so that fluorescent proteins may be positioned at intervals where quenching does not occur. Thus, the fluorescent protein nanoparticles according to the present invention can form fluorescent protein nanoparticles without quenching between fluorescent proteins by combining the hepatitis B virus core protein with the fluorescent protein and the target directional peptide without a linker peptide. However, the fluorescent protein nanoparticles of the present invention may include a linker peptide in a line that ensures an appropriate space between the fluorescent proteins.
한 구체예에서, 상기 자기조립성 단백질은 형광 단백질 또는 표적 지향성 펩타이드와 링커 펩타이드를 통해 융합될 수 있다. In one embodiment, the self-assembled protein can be fused through a linker peptide with a fluorescent protein or target directed peptide.
상기 링커 펩타이드는 형광 단백질 간의 적절한 공간을 확보해줄 수 있는 길이를 가질 수 있다. 예컨대, 링커 펩타이드는 1 내지 20개, 3 내지 17개, 4 내지 14개의 아미노산으로 이루어진 펩타이드일 수 있다. The linker peptide may have a length to secure an appropriate space between fluorescent proteins. For example, the linker peptide may be a peptide consisting of 1 to 20, 3 to 17, 4 to 14 amino acids.
본 발명의 한 구체예에서, 상기 링커 펩타이드는 글라이신을 포함하는 것일 수 있다. 이에 제한되는 것은 아니나, 본 발명의 링커 펩타이드는 예를 들어, SEQ ID NO: 21 및 22에 기재된 아미노산 서열 중 어느 하나로 표시될 수 있다.In one embodiment of the invention, the linker peptide may comprise glycine. Although not limited thereto, the linker peptides of the present invention may be represented by any of the amino acid sequences set forth in, for example, SEQ ID NOs: 21 and 22.
또한, 본 발명의 형광 단백질 나노입자는 자기조립성 단백질의 내부 및 외부 표면에 형광 단백질이 융합되어 있으면서도 형광 물질을 표면에 고정시켜 사용할 수 있다. 자기조립성 단백질은 아미노산의 작용기가 표면에 표출되어 있으므로, 유전자 재조합 기술에 의한 외래 단백질의 표면 표출뿐만 아니라 화학적 반응을 통한 기능성 소재의 표면 고정화가 가능하다. 따라서, 자기조립성 단백질의 자기조립 후 화학적 공정을 통해 형광 물질을 표면에 고정할 수 있다.In addition, the fluorescent protein nanoparticles of the present invention can be used by fixing the fluorescent material on the surface while the fluorescent protein is fused to the inner and outer surfaces of the self-assembled protein. Since self-assembled protein has an amino acid functional group on its surface, not only surface expression of foreign protein by genetic recombination technology but also surface immobilization of functional material through chemical reaction. Therefore, after self-assembly of the self-assembled protein, the fluorescent material may be fixed to the surface through a chemical process.
이러한 형광 물질로, 플루오레신(fluorescein), 보디피(BODDPY), ATTO Dyes, 로다민(Rhodamine), 헵타메틴(Heptamethine), DyLight Fluor, 알렉사(Alexa), 시아닌(Cyanine) 또는 알로피코시아닌(allopicocyanine) 등을 사용할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.Such fluorescent materials include fluorescein, BODDPY, ATTO Dyes, Rhodamine, Heptamethine, DyLight Fluor, Alexa, Cyanine or Allophycocyanin. (allopicocyanine) may be used, but is not limited thereto.
또한, 본 발명의 형광 단백질 나노입자에 사용할 수 있는 형광 단백질은 mCardinal, 녹색 형광 단백질(GFP), 변형된 녹색 형광 단백질(modified green fluorescenct protein), 증강된 녹색 형광 단백질(enhanced green fluorescent protein, eGFP), 적색 형광 단백질(RFP, DsRed), 증강된 적색 형광 단백질(eRFP), 청색 형광 단백질(BFP), 증강된 청색 형광 단백질(eBFP), 황색 형광 단백질(YFP), 증강된 황색 형광 단백질(eYFP), 남색 형광 단백질(CFP), 증강된 남색 형광 단백질(eCFP) 등을 사용할 수 있다. In addition, fluorescent proteins that can be used in the fluorescent protein nanoparticles of the present invention are mCardinal, green fluorescent protein (GFP), modified green fluorescent protein (modified green fluorescenct protein), enhanced green fluorescent protein (eGFP) , Red fluorescent protein (RFP, DsRed), enhanced red fluorescent protein (eRFP), blue fluorescent protein (BFP), enhanced blue fluorescent protein (eBFP), yellow fluorescent protein (YFP), enhanced yellow fluorescent protein (eYFP) , Navy blue fluorescent protein (CFP), enhanced navy blue fluorescent protein (eCFP) and the like can be used.
한 구체예에서, 상기 형광 단백질은 mCardinal 또는 eGFP일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.In one embodiment, the fluorescent protein may be mCardinal or eGFP, but is not limited thereto.
하기 실시예에서는, mCardinal 형광 단백질을 이용하여 HBV 코어 단백질 나노입자의 내부 표면과 외부 표면에 상기 형광 단백질을 유전학적으로 접합하였으며, 결과적으로 증강된 형광도와 광안정성을 가진 이중층 mCardinal HBVC 나노입자(mC-DL-HBVC)를 제조하였다. In the following example, the fluorescent protein was genetically conjugated to the inner surface and the outer surface of the HBV core protein nanoparticles using mCardinal fluorescent protein, resulting in double layer mCardinal HBVC nanoparticles (mC) having enhanced fluorescence and photostability. -DL-HBVC) was prepared.
본 발명자들은 이중층 형광 단백질 나노입자(mC-DL-HBVC)의 세세한 구조적, 광학적 특성을 발견하였고, 이의 체외 및 체내 암 세포 표적 이미징과 체내 분포 특성을 발견하였다. 이 결과들은 발명된 이중층 형광 단백질 나노입자(mC-DL-HBVC)가 체내 형광 암 이미징을 위한 조영제로서 큰 잠재력을 가지고 있음을 뒷받침할 수 있다. We have found the detailed structural and optical properties of the bilayer fluorescent protein nanoparticles (mC-DL-HBVC), as well as their in vitro and in vivo cancer cell target imaging and in vivo distribution. These results can support that the invented bilayer fluorescent protein nanoparticles (mC-DL-HBVC) have great potential as contrast agents for in vivo fluorescent cancer imaging.
한편, 본 발명에서, 용어 “표적 지향성 펩타이드”는 본 발명에 따른 형광 단백질 나노입자에 표적 지향성을 부여할 수 있는 펩타이드를 의미한다. 생체 이미징 소재 개발에 있어서, 표적 특이적으로 타겟팅을 가능하게 하기 위하여 표적 지향성 펩타이드를 나노입자의 표면에 고정하는 기술이 활발하게 연구되고 있다. 하지만 기존 무기, 고분자 기반 나노입자의 경우 화학적 결합을 통해 형광 물질을 표면 수식화 하므로, 동시에 표적 지향성 펩타이드를 표면에 수식화하는데 어려움이 있으며, 형광 물질과 표적 지향성 펩타이드의 표출 빈도를 조절하는데 어려움이 있다. 반면 본 발명에서는 유전공학적 기법을 이용하여 추가 화학적 공정 없이 표적 지향성 펩타이드를 표출하고 형광 단백질이 융합된 단백질 나노입자를 제조할 수 있으며, 표적 지향성 펩타이드의 표면 표출 빈도 및 표출 위치를 조절할 수 있는 장점이 있다.Meanwhile, in the present invention, the term "target directional peptide" refers to a peptide capable of imparting target directivity to fluorescent protein nanoparticles according to the present invention. In the development of biological imaging materials, techniques for immobilizing a target-directed peptide on the surface of nanoparticles in order to enable target-specific targeting have been actively studied. However, in the case of existing inorganic and polymer-based nanoparticles, the surface-modified fluorescent substance through chemical bonding, it is difficult to simultaneously formulate the target-directed peptide on the surface, it is difficult to control the display frequency of the fluorescent material and the target-directed peptide. On the other hand, in the present invention, by using genetic engineering techniques, the target-directed peptide can be expressed and the protein nanoparticles fused with fluorescent proteins can be prepared without additional chemical process, and the surface-expression frequency and position of the target-directed peptide can be controlled. have.
본 발명에 따른 표적 지향성 펩타이드는 형광 단백질 나노입자의 표면에 표출되어 있다. 따라서, 인비보 이미징에 적용시 본 발명에 따른 형광 단백질 나노입자를 특정 타겟 부위에 전달해주는 역할을 충실히 수행한다.Target directed peptides according to the invention are expressed on the surface of fluorescent protein nanoparticles. Therefore, when applied to in vivo imaging, the fluorescent protein nanoparticles according to the present invention faithfully plays a role of delivering to a specific target site.
본 발명에 있어서, 형광 단백질, 자기조립성 단백질 및 표적 지향성 펩타이드가 융합된 단백질; 또는 자기조립성 단백질과 표적 지향성 펩타이드가 융합된 단백질은 하나의 발현 벡터를 통해 발현된다.In the present invention, a protein in which a fluorescent protein, a self-assembled protein and a target directional peptide are fused; Alternatively, the protein in which the self-assembled protein and the target directed peptide are fused is expressed through one expression vector.
따라서, 표적 지향성 펩타이드는 상기 발현 벡터에 쉽게 삽입 가능하면서, 본 발명에 따른 형광 단백질 나노입자의 형광 강도 및 나노입자의 구조에 영향을 미치지 않는 것이라면 펩타이드 서열의 길이와 관계없이 어떠한 것이든 사용할 수 있다. 특히 특정 질환 조직 및 세포에서 특이적으로 과발현되는 수용체에 실제 호르몬과 유사하게 대신 결합하여 신호 전달을 억제한다고 알려진 다수 펩타이드 형태의 수용체 길항제(receptor antagonist); 소마토스타틴(somatostatin), 어피바디(affibody), 봄베신(bombesin), 콜레시스토키닌(cholecystokinin) 또는 가스트린 유사체(gastrin analog) 등의 펩타이드 호르몬 등으로 대체 가능하다.Therefore, the target directional peptide can be easily inserted into the expression vector, and may be used regardless of the length of the peptide sequence as long as it does not affect the fluorescence intensity of the fluorescent protein nanoparticles and the structure of the nanoparticles. . Receptor antagonists in the form of a number of peptides known to inhibit signal transduction by binding similarly to actual hormones to receptors specifically overexpressed in particular disease tissues and cells; Peptide hormones such as somatostatin, affibody, bombesin, cholecystokinin or gastrin analog can be substituted.
본 발명의 일 구체예에서, 표적 지향성 펩타이드는 어피바디(affibody)일 수 있다. 상기 어피바디는 매우 많은 수의 타겟 단백질에 특이적으로 결합되도록 조작가능한 작고 강건한 고친화성 단백질 분자를 의미한다. 이에 본 발명에서는 암 세포 특이적 타겟팅을 목적으로 어피바디를 표면 표출하는 형광 단백질 나노입자를 제조하여 암 특이적 타겟팅과 이미징이 동시에 가능하도록 하였다.In one embodiment of the invention, the target directional peptide may be affibody. Affibody refers to a small, robust, high affinity protein molecule that is operable to specifically bind to a very large number of target proteins. Accordingly, in the present invention, the fluorescent protein nanoparticles expressing the aphibody for the purpose of cancer cell specific targeting were prepared to enable cancer specific targeting and imaging at the same time.
상술한 바와 같이, 본 발명에 따른 표적 지향성 펩타이드가 표출된 형광 단백질 나노입자는 높은 형광강도, 우수한 생체 안정성, 다양한 표면 수식화를 토대로 표적 타겟팅과 이미징이 가능하며, 그 효용성이 검증되었다.As described above, the fluorescent protein nanoparticles expressing the target-directed peptides according to the present invention are capable of targeting and imaging based on high fluorescence intensity, excellent biostability, and various surface modifications, and their effectiveness has been verified.
이에, 본 발명은Thus, the present invention
본 발명에 따른 형광 단백질 나노입자; 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 표적 지향형 조영제 조성물을 제공한다.Fluorescent protein nanoparticles according to the present invention; And a pharmaceutically acceptable carrier.
본 발명의 형광 단백질 나노입자는 표적 지향성 펩타이드가 결합되어 있어 특정 세포나 조직에서 표적 지향이 가능하므로 자기공명 및 광학영상장치를 통해 표적 부위의 이미징이 가능한 조영제로 사용할 수 있다.The fluorescent protein nanoparticles of the present invention can be used as a contrast agent capable of imaging a target site through magnetic resonance and an optical imaging apparatus because the target directional peptide is coupled to enable target orientation in specific cells or tissues.
상기 약제학적으로 허용가능한 담체는 의약 분야에서 통상 사용되는 담체 및 비히클을 포함하며, 구체적으로 이온 교환 수지, 알루미나, 알루미늄 스테아레이트, 레시틴, 혈청 단백질(예컨대, 사람 혈청 알부민), 완충 물질(예컨대 각종 인산염, 글리신, 소르브산, 칼륨 소르베이트, 포화 식물성 지방산의 부분적인 글리세라이드 혼합물), 물, 염 또는 전해질(예컨대 프로타민 설페이트, 인산수소이나트륨, 인산수소칼륨, 염화나트륨 및 아연 염), 교질성 실리카, 마그네슘 트리실리케이드, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로즈계 기질, 폴리에틸렌 글리콜, 나트륨 카르복시메틸 셀룰로즈, 폴리아릴레이트, 왁스 또는 양모지를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 또한, 본 발명의 조영제 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 유화제, 현탁제, 또는 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.Such pharmaceutically acceptable carriers include carriers and vehicles commonly used in the medical arts, and specifically include ion exchange resins, alumina, aluminum stearate, lecithin, serum proteins (eg, human serum albumin), buffer materials (eg, various Phosphates, glycine, sorbic acid, potassium sorbate, partial glyceride mixtures of saturated vegetable fatty acids), water, salts or electrolytes (such as protamine sulfate, disodium hydrogen phosphate, potassium hydrogen phosphate, sodium chloride and zinc salts), colloidal silica, Magnesium trisilicate, polyvinylpyrrolidone, cellulose based substrates, polyethylene glycols, sodium carboxymethyl cellulose, polyarylates, waxes or wool papers. In addition, the contrast agent composition of the present invention may further include a lubricant, a humectant, an emulsifier, a suspending agent, or a preservative in addition to the above components.
한 양태로서, 본 발명에 따른 조영제 조성물은 비경구 투여를 위한 수용성 용액으로 제조할 수 있으며, 바람직하게는 한스 용액(Hank's solution), 링거 용액(Ringer's solution) 또는 물리적으로 완충된 염수와 같은 완충 용액을 사용할 수 있다. 수용성 주입(injection) 현탁액은 소디움 카르복시메틸셀룰로즈, 솔비톨 또는 덱스트란과 같이 현탁액의 점도를 증가시킬 수 있는 기질을 첨가할 수 있다.In one embodiment, the contrast agent composition according to the present invention may be prepared as an aqueous solution for parenteral administration, preferably a buffered solution such as Hanks' solution, Ringer's solution or physically buffered saline. Can be used. Aqueous injection suspensions can be added with a substrate that can increase the viscosity of the suspension, such as sodium carboxymethylcellulose, sorbitol or dextran.
본 발명의 조영제 조성물의 다른 바람직한 양태로는 멸균 주사용 수성 또는 유성 현탁액의 멸균 주사용 제제의 형태일 수 있다. 이러한 현탁액은 적합한 분산제 또는 습윤제(예를 들면, 트윈 80) 및 현탁화제를 사용하여 본 분야에 공지된 기술에 따라 제형화할 수 있다.Another preferred embodiment of the contrast composition of the present invention may be in the form of sterile injectable preparations of sterile injectable aqueous or oily suspensions. Such suspensions may be formulated according to techniques known in the art using suitable dispersing or wetting agents (eg, Tween 80) and suspending agents.
또한, 상기 멸균 주사용 제제는 무독성의 비경구적으로 허용되는 희석제 또는 용매 중의 멸균 주사 용액 또는 현탁액(예를 들면 1,3-부탄디올 중의 용액)일 수 있다. 사용될 수 있는 비히클 및 용매로는 만니톨, 물, 링거 용액 및 등장성 염화나트륨 용액이 있다. 또한, 멸균 비휘발성 오일이 통상적으로 용매 또는 현탁화 매질로서 사용된다. 이러한 목적을 위해 합성 모노 또는 디글리세라이드를 포함하여 자극성이 적은 비휘발성 오일은 그 어느 것도 사용할 수 있다. In addition, the sterile injectable preparation may be a sterile injectable solution or suspension (eg, a solution in 1,3-butanediol) in a nontoxic parenterally acceptable diluent or solvent. Vehicles and solvents that may be used include mannitol, water, Ringer's solution, and isotonic sodium chloride solution. In addition, sterile, nonvolatile oils are conventionally employed as a solvent or suspending medium. For this purpose any non-irritating non-volatile oil can be used including synthetic mono or diglycerides.
본 발명의 조영제 조성물은 진단 대상에서 분리한 조직 또는 세포에 투여하여 형광 단백질 나노입자가 발산하는 신호를 감지하여 영상을 수득하는데 이용될 수 있다. 상기 형광 단백질 나노입자에 의해 발산되는 신호를 감지하기 위해서는 자기공명영상장치(MRI)와 광학 이미징의 이용이 바람직하다.The contrast agent composition of the present invention can be used to obtain an image by detecting a signal emitted from the fluorescent protein nanoparticles by administering to tissues or cells isolated from the diagnosis target. In order to detect signals emitted by the fluorescent protein nanoparticles, magnetic resonance imaging (MRI) and optical imaging are preferably used.
자기공명영상장치는 강력한 자기장 속에 생체를 넣고 특정 주파수의 전파를 조사하여 생체조직에 있는 수소 등의 원자핵에 에너지를 흡수시켜 에너지가 높은 상태로 만든 후, 상기 전파를 중단하여 상기 수소 등의 원자핵 에너지가 방출되게 하고 이 에너지를 신호로 변환하여 컴퓨터로 처리하여 영상화한 장치이다. 자기 또는 전파는 골에 방해를 받지 않기 때문에 단단한 골 주위 또는 뇌나 골수의 종양에 대하여 종단, 횡단, 임의의 각도에서 선명한 입체적인 단층상을 얻을 수 있다. 특히 상기 자기공명영상장치는 T2 스핀-스핀 이완 자기공명영상장치인 것이 바람직하다.A magnetic resonance imaging apparatus places a living body in a strong magnetic field and irradiates radio waves of a specific frequency to absorb energy into atomic nuclei such as hydrogen in biological tissues to make the energy high, and then stops propagating the atomic nuclei energy such as hydrogen. It is a device that processes the energy by converting this energy into a signal and processing it with a computer. Since magnetism or propagation is not obstructed by bone, clear three-dimensional tomograms can be obtained at longitudinal, transverse, and arbitrary angles around solid bones or tumors of the brain or bone marrow. In particular, the magnetic resonance imaging apparatus is preferably a T2 spin-spin relaxation magnetic resonance imaging apparatus.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 형광 단백질 나노입자; 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 동시 진단 또는 치료용 조영제 조성물에 관한 것이다.The invention also relates to fluorescent protein nanoparticles according to the invention; And a pharmaceutically acceptable carrier.
본 발명의 형광 단백질 나노입자는 약제학적 활성성분과 물리 화학적으로 결합하여 표적 지향성 펩타이드가 타겟팅하는 세포 또는 조직에서 형광을 나타낼 수 있어 자기공명 및 광학영상장치 등을 통해 생체 분자의 분리, 진단 또는 치료 등의 나노 프로브 및 약물 또는 유전자 전달체(delivery vehicle)등에 이용할 수 있다.The fluorescent protein nanoparticles of the present invention can be fluoresce in cells or tissues targeted by the target-directed peptide by physicochemically binding to a pharmaceutically active ingredient, so as to isolate, diagnose or treat biomolecules through magnetic resonance and optical imaging devices. Nano probes, drugs, and gene delivery vehicles.
상기 형광 단백질 나노입자를 이용한 생체 진단의 한 대표적인 예로서 분자 자기공명영상 진단 또는 자기 이완 센서(magnetic relaxation sensor)를 들 수 있다. 형광 단백질 나노입자는 그 크기가 커짐에 따라 더 큰 T2 조영효과를 나타내는데, 이러한 성질을 이용하면 생체 분자를 검출하는 센서로 사용될 수 있다. 즉, 특정한 생체 분자가 형광 단백질 나노입자의 엉김을 유도하게 되면 이에 의해 T2 자기 공명 영상 효과가 증대된다. 이러한 차이를 이용하여 생체 분자를 검출한다.As a representative example of biological diagnosis using the fluorescent protein nanoparticles, molecular magnetic resonance imaging or magnetic relaxation sensors may be used. Fluorescent protein nanoparticles show a larger T2 contrast effect as their size increases, which can be used as a sensor to detect biomolecules. That is, when a specific biomolecule induces entanglement of fluorescent protein nanoparticles, the T2 magnetic resonance imaging effect is increased. This difference is used to detect biomolecules.
또한, 본 발명의 형광 단백질 나노입자는 종양과 관련된 다양한 질병, 예를 들어 편평상피세포암, 자궁암, 자궁 경부암, 전립선암, 두경부암, 췌장암, 뇌종양, 유방암, 간암, 피부암, 식도암, 고환암, 신장암, 대장암, 직장암, 위암, 신장암, 방광암, 난소암, 담관암, 담낭암을 진단 및/또는 치료하는데 이용될 수 있다. 또한, 류마티스 관절염, 골관절염과 같은 염증성 질환과, 치매, 뇌졸중 등을 포함하는 난치성 질환에서 영상화하는 방법에 이용될 수 있다. 보다 구체적으로 설명하면, 종양 세포는 정상 세포에서는 거의 또는 전혀 생산되지 않는 특정 물질을 발현 및/또는 분비하는데 이들을 일반적으로 "종양 마커(tumor marker)"라고 명명한다. 그러한 종양 마커와 특이적으로 결합할 수 있는 물질을 상기 형광 단백질 나노입자에 결합시켜 만든 형광 단백질 나노입자는 종양 진단에 유용하게 이용될 수 있다. 당업계에는 다양한 종양 마커뿐만 아니라 이들과 특이적으로 결합할 수 있는 물질이 공지되어 있다. 본 발명에서는 표적 지향성 펩타이드로 종양 마커와 특이적으로 결합할 수 있는 펩타이드를 사용함으로써 종양 진단에 이용될 수 있다.In addition, the fluorescent protein nanoparticles of the present invention can be used for various diseases associated with tumors, such as squamous cell carcinoma, cervical cancer, cervical cancer, prostate cancer, head and neck cancer, pancreatic cancer, brain tumor, breast cancer, liver cancer, skin cancer, esophageal cancer, testicular cancer, kidney. Cancer, colorectal cancer, rectal cancer, gastric cancer, kidney cancer, bladder cancer, ovarian cancer, cholangiocarcinoma, gallbladder cancer. In addition, the present invention can be used for imaging in inflammatory diseases such as rheumatoid arthritis, osteoarthritis, and refractory diseases including dementia, stroke, and the like. More specifically, tumor cells express and / or secrete certain substances that are produced little or no in normal cells and are generally termed "tumor markers". Fluorescent protein nanoparticles made by binding a substance capable of specifically binding such a tumor marker to the fluorescent protein nanoparticles can be usefully used for tumor diagnosis. Various tumor markers are known in the art, as well as materials capable of specifically binding to them. In the present invention, a target-directed peptide may be used for tumor diagnosis by using a peptide capable of specifically binding a tumor marker.
상기 종양 마커는 작용 기작에 따라 리간드, 항원, 수용체, 및 이들을 코딩하는 핵산으로 분류할 수 있다. 종양 마커가 "리간드"인 경우에는 상기 리간드와 특이적으로 결합하는 수용체 또는 항체를 표적 지향성 펩타이드로 사용할 수 있고, 수용체의 예로는 시냅토타그민의 C2(synaptotagmin의 C2)와 포스파티딜세린, 아넥신 V(annexin V)와 포스파티딜세린, 인테그린(integrin)과 이의 수용체, VEGF(Vascular Endothelial Growth Factor)와 이의 수용체, 안지오포이에틴(angiopoietin)과 Tie2 수용체, 소마토스타틴(somatostatin)과 이의 수용체, 바소인테스티날 펩타이드(vasointestinal peptide)와 이의 수용체 등이 있지만 이에 제한되는 것은 아니다.The tumor markers can be classified into ligands, antigens, receptors, and nucleic acids encoding them according to the mechanism of action. When the tumor marker is "ligand", a receptor or antibody that specifically binds to the ligand can be used as a target directional peptide. Examples of the receptor include synaptotagmin C2 (synaptotagmin C2), phosphatidylserine, and annexin V. (annexin V) and phosphatidylserine, integrin and its receptors, Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) and its receptors, angiopoietin and Tie2 receptors, somatostatin and its receptors, basointestinal There are peptides (vasointestinal peptide) and its receptor, but are not limited thereto.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 형광 단백질 나노입자; 및 진단 프로브를 포함하고, 상기 진단 프로브는 영상 판독을 위한 표지 물질인 다중 진단 프로브에 관한 것이다.The invention also relates to fluorescent protein nanoparticles according to the invention; And diagnostic probes, wherein the diagnostic probes relate to multiple diagnostic probes that are markers for image reading.
상기 진단 프로브는 T1 자기공명 영상 진단 프로브, 광학 진단 프로브, CT 진단 프로브, 또는 방사선 동위원소 등을 사용할 수 있다.The diagnostic probe may use a T1 magnetic resonance imaging diagnostic probe, an optical diagnostic probe, a CT diagnostic probe, or a radioisotope.
상기 다중 진단 프로브는 예를 들면, 단백질 나노입자에 T1 자기공명 영상 진단 프로브를 결합시키면 T2 자기공명영상 및 T1 자기공명영상 진단을 동시에 진행할 수 있고, 광학 진단 프로브를 결합시키면 자기공명 영상과 광학 이미징을 동시에 할 수 있으며, CT 진단 프로브를 결합시키면 자기공명영상과 CT 진단을 동시에 할 수 있다.For example, when the T1 magnetic resonance imaging diagnostic probe is coupled to protein nanoparticles, the multiple diagnostic probe may simultaneously perform T2 magnetic resonance imaging and T1 magnetic resonance imaging, and when the optical diagnostic probe is combined, the magnetic resonance imaging and the optical imaging may be performed. At the same time, CT diagnostic probes can be combined to perform MRI and CT diagnosis at the same time.
또한 방사선 동위원소와 결합시키면 자기공명영상과 PET, SPECT 진단을 동시에 할 수 있다.In addition, when combined with radioisotopes, magnetic resonance imaging, PET, and SPECT can be simultaneously diagnosed.
상기 T1 자기공명 영상 진단 프로브로는 Gd 화합물, 또는 Mn 화합물 등을 포함하며, 광학 진단 프로브로는 유기 형광 염료(dye), 양자점, 또는 염료 표지(dye labelled) 무기 지지체(예 SiO2, Al2O3))를 포함하며, CT 진단 프로브로는 I(요오드) 화합물, 또는 금 나노 입자를 포함하고, 방사선 동위원소로는 In, Tc, 또는 F 등을 포함한다.The T1 magnetic resonance imaging diagnostic probe may include a Gd compound or a Mn compound, and the optical diagnostic probe may be an organic fluorescent dye (dye), a quantum dot, or a dye labeled inorganic support (eg SiO 2 , Al 2). O 3 )), CT diagnostic probes include I (iodine) compounds, or gold nanoparticles, and radioisotopes include In, Tc, F, and the like.
본 발명은 또한 상기 형광 단백질 나노입자; 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 생체 이미징용 조성물에 관한 것이다.The invention also the fluorescent protein nanoparticles; And it relates to a composition for biological imaging comprising a pharmaceutically acceptable carrier.
본 발명에 따르면, 상기 형광 단백질 나노입자는 영상 유도 수술(Image-guided surgery) 이미징에 적용할 수 있다.According to the present invention, the fluorescent protein nanoparticles can be applied to image-guided surgery imaging.
영상 유도 수술은 수술장에서 수술 도구의 위치를 추적하여 CT 또는 MR 등 환자의 진단 영상에 중첩하여 시각화함으로써 수술의 정확성과 안정성을 높일 수 있는 방법이다. Image-guided surgery is a method that improves the accuracy and stability of surgery by tracking the location of surgical instruments in the operating room and visualizing them superimposed on the diagnosis images of patients such as CT or MR.
본 발명은 이중층 형광 단백질 나노입자에 관한 것으로, 내부 및 외부 표면에 형광 단백질이 융합되어 있고 외부 표면에는 표적 지향성 펩타이드가 표출되어 있음으로써 형광도와 광안정성이 우수한 형광 단백질 나노입자를 제공할 수 있다. 본 발명에 따른 형광 단백질 나노입자는 우수한 형광도와 광안정성으로부터 생체 이미징 용도로 활용될 수 있다.The present invention relates to a double-layer fluorescent protein nanoparticles, it is possible to provide a fluorescent protein nanoparticles excellent in fluorescence and light stability by the fluorescent protein is fused to the inner and outer surfaces and the target directional peptide is expressed on the outer surface. Fluorescent protein nanoparticles according to the present invention can be utilized for biological imaging applications from excellent fluorescence and light stability.
도 1은 형광 단백질로 eGFP를 HBVC에 융합한 형광 단백질 나노입자를 제조하기 위한 발현 벡터의 모식도를 나타낸 것이다.
도 2는 형광 단백질로 mCardinal을 HBVC에 융합한 형광 단백질 나노입자를 제조하기 위한 발현 벡터의 모식도를 나타낸 것이다.
도 3은 유전적 캡슐화와 자기조립을 통한 암 이미징을 위한 이중층 형광 단백질 나노입자의 개발에 대한 전체적인 모식도를 나타낸 것이다. 도 3의 (a)는 기존 B형 간염 바이러스 유래 구형 단백질 입자에 암 표적 펩타이드를 표면 고정화한 방법과 형광 단백질의 유전적 캡슐화를 위한 방법을 나타내며, (b)는 나노입자 내부의 링커 길이에 따른 형광 입자의 위치 조절과 이에 따른 형광도를 나타낸 것이다.
도 4는 도 3에 따라 순차적으로 제작된 단백질 나노입자(a, b, c, d, f)와 대조군으로 제작된 표면에만 형광 단백질을 가지고 있는 나노입자(e)를 관찰한 TEM 사진을 나타낸 것이다.
도 5는 형광 단백질 나노입자들의 형광 세기 비교(a, c), 구조를 고려한 형광도 계산 예측 결과 비교(b) 및 연속적 레이저 표출에 의한 시간에 따른 형광 단백질 나노입자의 광안정성 측정 결과(d)를 나타낸 것이다.
도 6의 (a)는 단독 형광 단백질과 이중층 형광 단백질 나노입자의 암 표적 인자 성능을 확인한 실험 결과로서, 체외 암세포 타겟팅을 관찰한 근적외선 형광이미지이며, (b)는 (a)의 형광 세기를 나타낸 것이다.
도 7의 (a)는 형광 단백질 나노입자의 암세포 타겟팅 이후 세포 내에서 형광도를 유지하는 정도를 실시간으로 관찰한 사진이며, (b)는 (a)의 형광 세기를 나타낸 것이다.
도 8의 (a)는 이중층 형광 단백질 나노입자가 암 세포 표적 인자가 있는 경우와 없는 경우를 쥐에 주입하여 실시간으로 나노입자의 체내 암세포 표적 성능을 나타낸 것이며, (b)는 (a)의 암 부위의 형광 세기를 시간에 따라 나타낸 그래프이다. (c)는 쥐에 주입한 후 24시간 동안 주요 5 장기(간, 허파, 이자, 신장, 심장)과 암 조직을 적출하여 형광 나노입자의 분포를 관찰한 근적외선 사진이다. (d)는 (c)의 사진에서 간 대비 암에 존재하는 형광 세기를 나타낸 것이다.1 shows a schematic diagram of an expression vector for preparing fluorescent protein nanoparticles in which eGFP is fused to HBVC as a fluorescent protein.
Figure 2 shows a schematic diagram of the expression vector for producing fluorescent protein nanoparticles fused mCardinal to HBVC as a fluorescent protein.
3 shows an overall schematic of the development of bilayer fluorescent protein nanoparticles for cancer imaging through genetic encapsulation and self-assembly. Figure 3 (a) shows a method of surface immobilizing the cancer target peptide to the existing hepatitis B virus-derived spherical protein particles and a method for the genetic encapsulation of fluorescent proteins, (b) is according to the linker length in the nanoparticles It shows the position control of the fluorescent particles and the fluorescence accordingly.
FIG. 4 shows TEM images of protein nanoparticles (a, b, c, d, f) sequentially prepared according to FIG. 3 and nanoparticles (e) having fluorescent proteins only on the surface prepared as a control. FIG. .
5 is a comparison of fluorescence intensities of fluorescent protein nanoparticles (a, c), comparison of fluorescence calculation prediction results considering structure (b), and photostability measurement results of fluorescent protein nanoparticles with time by continuous laser display (d) It is shown.
Figure 6 (a) is an experimental result confirming the cancer target factor performance of the single fluorescent protein and double-layer fluorescent protein nanoparticles, a near infrared fluorescence image observed in vitro cancer cell targeting, (b) shows the fluorescence intensity of (a) will be.
Figure 7 (a) is a photograph observing in real time the degree of maintenance of fluorescence in cells after cancer cell targeting of fluorescent protein nanoparticles, (b) shows the fluorescence intensity of (a).
Figure 8 (a) is a bilayer fluorescent protein nanoparticles in the presence or absence of cancer cell targeting factors in the mice showing the cancer cell target performance of the nanoparticles in real time, (b) is the cancer of (a) It is a graph showing the fluorescence intensity of the site over time. (c) is a near-infrared photograph showing the distribution of fluorescent nanoparticles by extracting five major organs (liver, lung, interest, kidney, heart) and cancer tissues for 24 hours after injection into rats. (d) shows the fluorescence intensity present in the liver versus cancer in the photograph of (c).
본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하고, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.Advantages and features of the present invention and methods for achieving them will be apparent with reference to the embodiments described below in detail. However, the present invention is not limited to the embodiments disclosed below, but will be implemented in various forms, and only the embodiments are intended to complete the disclosure of the present invention, and the general knowledge in the technical field to which the present invention pertains. It is provided to fully convey the scope of the invention to those skilled in the art, and the present invention is defined only by the scope of the claims.
[[ 실시예Example 1] 형광 단백질 나노입자의 제조 1] Preparation of Fluorescent Protein Nanoparticles
1) 형광 단백질 나노입자의 제조를 위한 발현 벡터의 제조1) Preparation of Expression Vector for Preparation of Fluorescent Protein Nanoparticles
하기 표 1의 벡터 모식도에 따라 PCR을 수행하여 형광 단백질 나노입자(eGFPin-linker0-HBVC, eGFPin-linker4-HBVC, eGFPin-linker14-HBVC, mCin-HBVC-Affi, mCout-HBVC-Affi, mC-DL-HBVC-Affi, mC-DL-HBVC)를 제작하였다(도 1 및 도 2). 제작된 모든 플라즈미드 발현 벡터는 아가로스 젤에서 정제한 후, 완전한 DNA 시퀀싱을 통해 서열을 확인하였다.PCR was performed according to the vector schematic diagram of Table 1 below for fluorescent protein nanoparticles (eGFP in -linker0-HBVC, eGFP in -linker4-HBVC, eGFP in -linker14-HBVC, mC in -HBVC-Affi, mC out -HBVC- Affi, mC-DL-HBVC-Affi, mC-DL-HBVC) was produced (FIGS. 1 and 2). All the plasmid expression vectors thus prepared were purified on agarose gel, and then sequenced through complete DNA sequencing.
상기 과정을 통해 만들어진 PCR 산물을 순차적으로 플라스미드 pT7-7 벡터에 삽입하여 각각의 단백질 나노입자를 발현할 수 있는 발현 벡터를 구성하였다.PCR products produced through the above procedure were sequentially inserted into the plasmid pT7-7 vector to construct an expression vector capable of expressing each protein nanoparticle.
HBVC 유래 단백질 나노입자의 제조와 관련된 프라이머 서열과 각각의 단백질 나노입자의 발현용 벡터는 아래 표 1 및 2에 기재하였으며, 이에 대한 상세한 기재는 아래와 같다.Primer sequences related to the preparation of HBVC-derived protein nanoparticles and expression vectors for each protein nanoparticle are described in Tables 1 and 2 below, and the detailed description thereof is as follows.
1) 첫 번째 부분은 HBV 코어 단백질의 유전자 서열(NCBI Nucleotideaccession number:[0085] AF286594 서열 중 1901-2452 서열)을 주형으로 프라이머 1과 프라이머 4번을 이용하여 Chain Reaction(CR)을 진행하였다. L1 5'에 서열의 2분의 1과 3'에 제한 효소 NcoI 을 포함한 5‘-L1(1/2)-HBV 코어 단백질(아미노산 서열 1-48)-NcoI-3'으로 이루어진 PCR 산물을 확보하였다. 이를 다시 주형으로, 프라이머 2와 프라이머 4번을 이용하여 CR을 진행하였고 L1 전체 서열을 5'에 부착한 후, 이를 다시 주형으로 프라이머 3과 프라이머 4를 이용하여 CR을 진행하였다. 그 결과, 5'에 제한 효소 NdeI, 6개 히스티딘, 제한 효소 XhoI 서열을 부착한 5‘-NdeI-h6-XhoI-L1-HBV 코어 단백질(아미노산 서열 1-48)-NcoI-3'을 확보하였다.1) The first portion of the gene sequence of the HBV core protein (NCBI Nucleotideaccession number: 1901-2452 sequence of AF286594 sequence) was carried out Chain Reaction (CR) using
2) 두 번째 부분은 HBV 코어 단백질의 유전자 서열을 주형으로 하여 제한 효소 SacI이 포함되어 있는 프라이머 5와 ClaI를 포함하고 있는 프라이머 6를 이용하여 PCR을 진행하였다. 그 결과 5‘-SacI-HBV 코어 단백질(아미노산 서열 49-149)-ClaI-3'으로 이루어진 PCR 산물을 확보하였다.2) In the second part, the gene sequence of the HBV core protein was used as a template, and PCR was performed using
3) 세 번째 부분은 eGFP의 염기서열을 주형으로 하여(NCBI Nucleotideaccession numberof eGFP: AJ566337) NcoI 및 SacI을 각각 포함하고 있는 프라이머 7과 프라이머 8, NcoI 및 G4를 포함하는 프라이머 9과 SacI 및 G4를 포함하는 프라이머 10, NcoI 및 G3SG3TG6를 포함하는 프라이머 11과 SacI 및 G3SG3TG6를 포함하는 프라이머 12의 3쌍의 프라이머를 이용하여 각각 PCR을 수행하였다. 결과적으로 5'-NcoI-eGFP-SacI-3'과 5'-NcoI-G4-eGFP-G4-SacI-3'과 5'-NcoI-G3SG3TG6-eGFP-G3SG3TG6-SacI-3', 총 3개의 PCR 산물을 확보하였다.3) The third part is based on the base sequence of the eGFP (NCBI Nucleotideaccession number of eGFP: AJ566337),
1) 내지 3)의 과정을 통해서 만들어진 5개의 PCR 산물을 순차적으로 pT7-7 벡터에 삽입하여 HBV 캡시드 유래 키메릭 eGFP 내부 형광 나노입자를 합성할 수 있는 발현 벡터를 구성하였다(도 1). Five PCR products made through the steps 1) to 3) were sequentially inserted into the pT7-7 vector to construct an expression vector capable of synthesizing fluorescent nanoparticles inside the HBV capsid-derived chimeric eGFP (FIG. 1).
4) mCardinal(NCBI Nucleotideaccession numberof mCardinal: KJ131552))의 염기서열을 주형으로 하여 제한 효소 NcoI 및 SacI을 각각 포함하고 있는 프라이머 13과 프라이머 14, 그리고 제한 효소 NdeI 및 여섯 개의 히스티딘을 포함한 프라이머 15과, 제한 효소 XhoI을 포함한 프라이머 16을 이용하여 각각 PCR을 수행한 후, 5'-NcoI-mC-SacI-3'과 5'-NdeI-h6-mC-XhoI-3'의 PCR 산물을 확보하였다.4) Primer 13 and
5) 도 1에서 사용한 HBV 코어 단백질 서열을 주형으로 하여, 프라이머 5와 EcoRI을 포함하는 프라이머 17, 그리고 BamHI을 포함하는 프라이머 18과 프라이머 6의 두 쌍을 이용하여 각각 PCR을 수행하였으며, 5'-SacI-HBVC(49-63)-EcoRI-3'과 5'-BamHI-HBVC(64-149)-ClaI-3' 두 개의 PCR 산물을 확보하였다.5) PCR was performed using the HBV core protein sequence used in FIG. 1 as a template, using
6) US20160074511에서 사용한 EGFR(epidermal growth factor receptor I)-binding affibody 염기 서열을 주형으로 하여 제한 효소 EcoRI 및 G3SG3TG3SG3을 포함하는 프라이머 19와 제한 효소 BamHI 및 G3SG3TG3SG3을 포함하는 프라이머 20과 PCR을 진행하여, 5'-EcoRI-L2-EA-L2-BamHI-3' PCR 산물을 확보하였다.6) Primer 19 and restriction enzymes BamH I and G 3 SG 3 containing restriction enzymes EcoR I and G 3 SG 3 TG 3 SG 3 , with the EGFR (binding growth factor receptor I) -binding affibody base sequence used in US20160074511 as a template. PCR was performed with
4) 내지 6)의 과정을 통해서 만들어진 5개의 PCR 산물과 도 1에서 이용되었던 5‘-NdeI-h6-XhoI-L1-HBV 코어 단백질(아미노산 서열 1-48)-NcoI-3'을 순차적으로 pT7-7 벡터에 삽입하여 HBV 캡시드 유래 키메릭 mCardinal 형광 나노입자를 합성할 수 있는 발현 벡터를 구성하였다. 또한, 형광 단백질 나노입자의 암세포 표적 기능과 형광 강도 개선을 위한 형광단백질 발현벡터를 제조하였다(도 2).5 PCR products made through the process of 4) to 6) and 5'- Nde I-h6- Xho I-L1-HBV core protein (amino acid sequence 1-48) -Nco I-3 'used in FIG. It was sequentially inserted into the pT7-7 vector to construct an expression vector capable of synthesizing HBV capsid-derived chimeric mCardinal fluorescent nanoparticles. In addition, a fluorescent protein expression vector for improving cancer cell target function and fluorescence intensity of the fluorescent protein nanoparticles was prepared (FIG. 2).
본 발명에서 구축한 형광 나노입자 발현 벡터는 표 2와 같다.The fluorescent nanoparticle expression vector constructed in the present invention is shown in Table 2.
2) 형광 단백질 나노입자의 생합성2) Biosynthesis of Fluorescent Protein Nanoparticles
HBVC의 자가조립을 통한 형광 단백질의 캡슐화를 위해서, 도 3의 모식도와 같은 유전적 조작을 체계적으로 수행하였다. HBVC 단량체는 형광 단백질(enhanced-green fluorescent protein; eGFP 또는 mCardinal; mC)과 유전적으로 연결되어 자가조립을 통해 E. coli의 세포질에서 단일(ML-) 또는 이중층(DL-FPNPs)의 형광 단백질 나노입자를 형성하였다. 이때 HBVC의 48번째 cystein과 49번째 serine 아미노산 사이에 형광 단백질을 유전적으로 삽입하여 자가조립을 통해 내부층으로 형광 단백질이 융합되도록 하였다. 추가적으로, 형광 단백질을 HBVC 단량체의 N-말단에 유전적으로 삽입하여 기존의 단일 형광 단백질에 비해 향상된 형광도와 광안정성을 갖는 이중층 형광 단백질 나노입자를 제조하였다. 이때 형광 단백질로는 eGFP를 이용하였으며, 상기 eGFP와 HBVC 단량체를 이어주는 링커 펩타이드는 아미노산 개수가 n=0, 4, 14인 펩타이드를 이용하였다. 구조물 간의 입체 장해를 최소화하기 위해 유연한 Glycine이 많은 링커를 사용하였다. In order to encapsulate fluorescent proteins through self-assembly of HBVC, genetic manipulations such as the schematic diagram of FIG. 3 were systematically performed. HBVC monomers are genetically linked to enhanced-green fluorescent protein (eGFP or mCardinal; mC) and are self-assembled to form single (ML-) or bilayer (DL-FPNPs) fluorescent protein nanoparticles in the cytoplasm of E. coli . Was formed. The fluorescent protein was genetically inserted between the 48th cystein and 49th serine amino acids of HBVC to allow the fluorescent protein to fuse into the inner layer through self-assembly. Additionally, fluorescent proteins were genetically inserted at the N-terminus of the HBVC monomer to prepare bilayer fluorescent protein nanoparticles having improved fluorescence and photostability compared to conventional single fluorescent proteins. At this time, eGFP was used as a fluorescent protein, and the linker peptide connecting the eGFP and HBVC monomers used peptides having an amino acid number of n = 0, 4, 14. In order to minimize steric hindrance between structures, a linker with a lot of flexible glycine was used.
구체적으로, 대장균 균주 RosettaTM(DE3)를 상기 실시예 1에서 제조한 발현 벡터로 각각 형질 전환하고, 앰피실린-저항성 형질 전환체를 선택하였다. 형질 전환된 대장균을 50 mL의 Luria-Bertani(LB) 배지(100 mg L-1 앰피실린 함유)를 함유하는 플라스크(250 mL Erlenmeyer flasks, 37℃, 150 rpm)에서 배양하였다. 배지 탁도(O.D600)가 약 0.6에 도달할 때, IPTG(Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid)(1.0 mM)을 주입하여 재조합 유전자의 발현을 유도하였다. Specifically, E. coli strain Rosetta ™ (DE3) was transformed with the expression vector prepared in Example 1, respectively, and an ampicillin-resistant transformant was selected. Transformed E. coli was cultured in a flask containing 250 mL of Luria-Bertani (LB) medium (containing 100 mg L-1 ampicillin) (250 mL Erlenmeyer flasks, 37 ° C., 150 rpm). When medium turbidity (OD 600 ) reached about 0.6, IPTG (Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid) (1.0 mM) was injected to induce the expression of recombinant genes.
20℃에서 20시간 배양한 후, 배양한 대장균을 4,500 rpm으로 10분간 원심 분리하여 균체 침전물을 회수한 후 5 ㎖의 파쇄 용액(10 mM Tris-HCl 완충액, pH 7.5, 10 mM EDTA)에 현탁하여 초음파 파쇄기(Branson Ultrasonics Corp., Danbury, CT, USA)를 이용하여 파쇄하였다. 파쇄한 후 13,000 rpm으로 10분간 원심분리한 뒤 상등액과 불용성 응집체를 분리하였다. 분리된 상등액을 추후 실험에 이용하였다.After incubation at 20 ° C. for 20 hours, the cultured E. coli was centrifuged at 4,500 rpm for 10 minutes to recover the cell precipitate, and then suspended in 5 ml of crushed solution (10 mM Tris-HCl buffer, pH 7.5, 10 mM EDTA). Crushing was performed using an ultrasonic crusher (Branson Ultrasonics Corp., Danbury, CT, USA). After crushing, the mixture was centrifuged at 13,000 rpm for 10 minutes, and the supernatant and the insoluble aggregate were separated. The separated supernatant was used for later experiments.
[[ 실시예Example 2] 형광 단백질 나노입자의 정제 2] Purification of Fluorescent Protein Nanoparticles
상기 실시예 1에서 수득한 상등액에 대해 형광 단백질이 융합된 단백질 나노입자를 정제하기 위해 3단계의 정제 과정을 거쳐 진행하였다. In order to purify the protein nanoparticles in which the fluorescent protein is fused to the supernatant obtained in Example 1, it proceeded through a three step purification process.
먼저, 1) 재조합 단백질에 융합 발현된 히스티딘과 니켈의 결합을 이용한 Ni2+-NTA affinity 크로마토그래피를 진행한 후, 2) 자가조립된 구형 형광 단백질 나노입자만을 분리하기 위하여 수크로스 구배 초고속 원심분리(ultracentifugation)를 진행하였다. 3) 수크로스 구배로부터 선별된 구형 형광 단백질을 버퍼 교환 과정을 통해 수크로스 용액을 제거하였다. 각 단계의 구체적인 과정은 다음과 같다.First, 1) Ni 2+ -NTA affinity chromatography using a combination of histidine and nickel fused to recombinant protein was performed, and 2) sucrose gradient ultra-fast centrifugation to separate only self-assembled spherical fluorescent protein nanoparticles. (ultracentifugation) was performed. 3) The sucrose solution was removed from the sucrose gradient with the fluorescent fluorescent protein selected through a buffer exchange procedure. The specific process of each step is as follows.
1) One) NiNi 22 ++ -- NTANTA affinity 크로마토그래피 affinity chromatography
재조합 단백질을 정제하기 위하여 상기 명시된 동일한 방법으로 배양된 대장균을 회수하여 그 세포 펠렛(pellet)을 5 ㎖ 라이시스(lysis) 버퍼(pH 8.0, 50 mM의 sodium phosphate, 300 mM의 NaCl, 20 mM의 imidazole)에 재부유하고 초음파 파쇄기를 이용하여 세포를 파쇄하였다. 파쇄된 세포액을 13,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 그 상등액만 분리한 후 각 재조합 단백질을 Ni2 +-NTA 컬럼(Qiagen, Hilden, Germany)을 사용하여 각각 분리하였다 (세척 버퍼: pH 8.0, 50 mM의 sodium phosphate, 300 mM의 NaCl, 80 mM의 imidazole / 용출 버퍼: pH 8.0, 50 mM의 sodium phosphate, 300mM의 NaCl, 200 mM의 imidazole).To purify the recombinant protein, E. coli cultured in the same manner as described above was recovered, and the cell pellets were collected in 5 ml lysis buffer (pH 8.0, 50 mM sodium phosphate, 300 mM NaCl, 20 mM). imidazole) and cells were disrupted using an ultrasonic crusher. And the
2) 2) 수크로스Sucrose 구배gradient 초고속 원심분리 Ultra High Speed Centrifugation
자가조립용 버퍼인 PBS(2.7 mM의 KCl, 137 mM의 NaCl, 2 mM의 KH2PO4, 10mM의 Na2HPO4, pH 7.4) 버퍼에 수크로스를 농도별로 각각 첨가하여 40%, 35%, 30%, 25%, 20%의 수크로스를 포함하는 용액을 각각 준비한 후 초고속 원심 분리용 튜브(ultraclear 13.2ml tube, Beckman)에 각 농도별(45 내지 20%) 수크로스 용액을 농도가 높은 용액부터 2 ㎖씩 담은 다음, 준비된 자가조립용 버퍼에 존재하는 재조합 단백질 용액을 1 ㎖ 채운 후 35,000 rpm으로 16시간 동안 4 ℃로 초고속 원심 분리를 시행하였다(Ultracentrifuge L-90k, Beckman). 원심 분리 후 주사기를 이용하여 구형 형광 단백질 나노입자로 예측되는 층(40-50% 수크로스 용액 부분)을 수거하였다.Sucrose was added to the PBS (2.7 mM KCl, 137 mM NaCl, 2 mM KH 2 PO 4 , 10 mM Na 2 HPO 4 , pH 7.4) buffers for the self-assembly. , 30%, 25%, and 20% solution containing sucrose, respectively prepared in a high-speed centrifuge tube (ultraclear 13.2ml tube, Beckman) of each concentration (45 to 20%) sucrose solution of high concentration After 2 ml of the solution was added, 1 ml of the recombinant protein solution in the prepared self-assembly buffer was filled, and ultra-high centrifugation was performed at 35,000 rpm for 16 hours at 4 ° C. (Ultracentrifuge L-90k, Beckman). After centrifugation, a syringe was used to collect the layers (parts of 40-50% sucrose solution) that were predicted to be spherical fluorescent protein nanoparticles.
3) 버퍼 교환을 통한 3) through buffer exchange 수크로스Sucrose 용액 제거 Remove solution
수거된 용액에서 수크로스를 제거하기 위해 초고속 원심분리 필터(ultracentrifugal filter; Amicon Ultra 100K, Millipore, Billerica, MA)와 PBS 버퍼를 이용하여 재조합 단백질의 버퍼를 교체해 주었다.In order to remove sucrose from the collected solution, an ultrafast centrifugal filter (Amicon Ultra 100K, Millipore, Billerica, Mass.) And PBS buffer were used to replace the recombinant protein buffer.
[[ 실시예Example 3] 형광 단백질 입자의 조립 검증 3] Assembly verification of fluorescent protein particles
상기 실시예 3에서 제작한 정제된 재조합 단백질 나노입자의 구조 분석을 위해 투과전자현미경(TEM)을 이용하여 재조합 단백질을 촬영하였다. 먼저, 염색되지 않은 정제한 단백질 샘플을 탄소가 코팅된 구리 전자 현미경 그리드(grids)에 올린 후 자연 건조하였다. 단백질 나노입자의 염색된 이미지를 얻기 위해, 자연 건조된 샘플을 포함하는 전자 현미경 그리드를 2%(w/v) 수성 우라닐 아세테이트 용액과 함께 2분동안 실온에서 인큐베이션하고, 증류수로 3-4회 세척하였다. 상기 단백질 나노입자의 이미지를 Philips Technai 120 kV 전자 현미경을 이용하여 관찰한 결과를 도 4에 나타내었다.Recombinant proteins were photographed using a transmission electron microscope (TEM) for structural analysis of the purified recombinant protein nanoparticles prepared in Example 3. First, unstained purified protein samples were placed on carbon coated copper electron microscope grids and then naturally dried. To obtain stained images of protein nanoparticles, an electron microscope grid containing naturally dried samples was incubated with 2% (w / v) aqueous uranil acetate solution for 2 minutes at room temperature and 3-4 times with distilled water. Washed. The results of observing the image of the protein nanoparticles using a
그 결과, 각각의 입자들이 구형 또는 원기둥 모양의 약 40nm 정도의 크기를 갖는 나노입자를 형성하는 것을 통해 자가조립이 잘 이루어졌음을 확인할 수 있었다.As a result, it was confirmed that the self-assembly was well achieved by forming the nanoparticles each having a spherical or cylindrical shape having a size of about 40 nm.
[[ 실시예Example 4] 형광 단백질 입자의 4] of fluorescent protein particles 광안정성Light stability 검증 Verification
형광 단백질 나노입자의 광안정성을 확인하기 위해, pH 7.4인 버퍼 안에 들어있는 각각의 형광 단백질 입자와 컨트롤 mCardinal과 Cy5.5를 glass cover slip 위에 10㎕ 떨어뜨렸다. 계속 여기(continuous excitation; 590-650nm)를 10분동안 각 샘플들에 유지시키면서 각 샘플들의 형광을 60초에 한 번씩 Fluorescence Microscope(Olympus IX81, Tokyo, JP)를 이용하여 모니터링하였다. 형광 세기는 캡쳐된 형광 이미지들로부터 ImageJ software(National Institutes of Health, MD, USA)로 수량화하였다.To confirm the photostability of the fluorescent protein nanoparticles, 10 μl of each fluorescent protein particle and control mCardinal and Cy5.5 in buffer at pH 7.4 were dropped onto the glass cover slip. Fluorescence of each sample was monitored using a Fluorescence Microscope (Olympus IX81, Tokyo, JP) once every 60 seconds while maintaining continuous excitation (590-650 nm) in each sample for 10 minutes. Fluorescence intensity was quantified from the captured fluorescence images with ImageJ software (National Institutes of Health, MD, USA).
또한, 도 5c에서 형광 물질 중 mC-DL-HBVC은 가장 강한 형광도를 방출하는 것을 확인하였다. mC-DL-HBVC의 형광도가 mCout-HBVC와 mCin-HBVC로부터의 형광도의 합보다 대략 23% 높았다. 이는 240개의 단량체를 갖는 mC-DL-HBVC와 mCin-HBVC(T=4 symmetry)에 비해 mCout-HBVC(T=3 symmetry, 32nm)가 상대적으로 적은 수의 단량체(180개)를 갖기 때문이며, mC-DL-HBVC는 통상적으로 사용되는 유기 형광 물질인 Cy5.5의 형광 세기보다 같은 몰 농도에서 약 24배 더 높았다.In addition, it was confirmed that mC-DL-HBVC of the fluorescent material in Figure 5c emits the strongest fluorescence. The fluorescence of mC-DL-HBVC was approximately 23% higher than the sum of the fluorescence from mCout-HBVC and mCin-HBVC. This is because mCout-HBVC (T = 3 symmetry, 32 nm) has a relatively small number of monomers (180) compared to mC-DL-HBVC and mCin-HBVC (T = 4 symmetry) with 240 monomers. -DL-HBVC was about 24 times higher at the same molar concentration than the fluorescence intensity of Cy5.5, the commonly used organic fluorescent material.
도 5d에서, mC 단량체와 mCout-HBVC 나노입자는 광 노출 10분 이내에 70~80%의 초기 형광 세기를 잃었으나, mCin-HBVC 및 mC-DL-HBVC 나노입자는 10분 이상의 광 노출에도 60% 이상의 초기 형광 세기를 유지하였다. 측정된 모든 형광체들 중 Cy5.5가 가장 낮은 광 안정성을 보였다. In FIG. 5D, mC monomer and mCout-HBVC nanoparticles lost initial fluorescence intensity of 70-80% within 10 minutes of light exposure, while mCin-HBVC and mC-DL-HBVC nanoparticles lost 60% even after 10 minutes of light exposure. The initial fluorescence intensity above was maintained. Of all the phosphors measured, Cy5.5 showed the lowest light stability.
상기 결과를 통해 HBVC 단백질 나노입자는 캡슐화된 mCardinal을 광 퇴색(photobleaching)으로부터 효과적으로 보호하는 견고한 생물학적 케이지로 사용될 수 있음을 증명하였다.The results demonstrate that HBVC protein nanoparticles can be used as a robust biological cage to effectively protect encapsulated mCardinals from photobleaching.
[[ 실시예Example 5] 형광 단백질 나노입자의 내부 링커 5] Internal linker of fluorescent protein nanoparticles 펩타이드Peptide 길이에 따른 형광 효율도(η) 검증 Verification of Fluorescence Efficiency (η) over Length
형광 단백질 나노입자의 내부에 존재하는 링커 펩타이드의 길이와 자가 꺼짐 현상(self-quencing)의 상관관계를 확인하기 위해, 형광 에너지 전달식(일반식)을 이용하여 형광 효율도(η)를 분석하였다.In order to check the correlation between the length of the linker peptide present in the fluorescent protein nanoparticles and the self-quencing phenomenon, the fluorescence efficiency (η) was analyzed using a fluorescence energy transfer equation (formula).
[일반식] [General Formula]
상기 일반식에서 QY는 콴텀 수율(=0.6 for eGFP); r은 두 형광체 사이의 거리; R Q 는 효과적인 ?칭 반지름[= (Nε)1/6 R F = 3.49, where N is effective number of fluorescence acceptors in the nearest neighbor (= 6 under the assumption that fluorophores inside eGFPin-HBVC are closely packed through hexagonal arrangement on the internal spherical surface), ε는 0 에서 1 사이 값을 갖는 잃음 파라미터(= 0.03 본 발명에서 사용됨), 그리고 R F 는 F
세 가지의 링커 펩타이드 길이(n=0, 4, 14)와 두 가지의 다른 symmetries(T=3, 4)의 구조를 고려하여 η 값을 예측할 수 있었다. 또한, 식 η=QY(1-E)(상기 식에서 QY와 E는 각각 quantum yield 및 eGFP의 energy transfer efficiency로 정의된다)을 이용하여 실험적으로 유추된 η와 비교하였다. eGFPin-HBVC의 형광도(F)와 표준입자 eGFPs의 형광도(Fo)를 이용하여 E=1-F/ F o 식에 대입하여 에너지 전달 효율을 구하였다. The value of η could be predicted by considering three linker peptide lengths (n = 0, 4, 14) and two different symmetries (T = 3, 4). In addition, η = QY (1-E) (where QY and E are defined as quantum yield and energy transfer efficiency of eGFP, respectively) was compared with experimentally inferred η. Energy transfer efficiency was determined by substituting the E = 1-F / F o equation using the fluorescence (F) of eGFP in -HBVC and the fluorescence (F o ) of standard particle eGFPs.
도 5b에서, 예측된 η 값은 실험적으로 유추한 값과 일치하였으나, capsid symmetry를 고려하였을 때, 값에 큰 영향은 없었다. 결과적으로 링커의 길이가 실제로 자가 꺼짐 현상에 영향을 주는 주요 인자임을 확인하였다.In FIG. 5B, the predicted value of η coincided with the experimentally inferred value, but considering the capsid symmetry, there was no significant effect on the value. As a result, it was confirmed that the length of the linker is actually a major factor affecting the self-off phenomenon.
[실시예 6] 제조된 형광 단백질 나노입자들을 이용한 NIR 이미지 분석[Example 6] NIR image analysis using the prepared fluorescent protein nanoparticles
1) 생체외(1) ex vivo ( in vitroin vitro ) 암세포 이미지 분석Cancer cell image analysis
본 발명에 따른 형광 단백질 나노입자(mC-DL-HBVC)의 EGFR을 통한 세포 표적 성능을 mCardinal 단량체의 경우와 비교하여 생체외 암세포 이미지 분석을 통해 확인하였다.Cell target performance through EGFR of fluorescent protein nanoparticles (mC-DL-HBVC) according to the present invention was confirmed through in vitro cancer cell image analysis compared to the case of mCardinal monomer.
36 시간 인큐베이션된 암세포 (1 × 104 cells/dish) 에 mC-DL-HBVC 에 affibody 펩타이드가 있는 입자(mC-DL-HBVC(affi+))와 없는 입자(mC-DL-HBVC(affi-))(2nM)와 mC 단량체(mC monomer)에 affibody 펩타이드가 있는 것(mC+)과 없는 것(-)(200nM)를 1시간 동안 처리하였다. 이후, PBS (pH 7.4) 용액으로 세척한 후, 4%의 파라포름알데하이드(paraformaldehyde)와 0.1%의 글루타르알데하이드(glutaraldehyde)로 10분 동안 세포를 고정하고 4′,6′-diamidino-2-phenylindole hydrochloride(DAPI)로 세포 핵을 염색하였다. 그리고 이와 같이 처리된 세포들을 공초점 레이저 주사 현미경(Confocal Laser Scanning Microscope; LSM 700, Carl-Zeiss, Jena, Germany)으로 형광 세포의 이미지를 관찰하였다. 형광 여기(Fluorescence excitation)와 방출(emission)은 각각 523-635nm와 560-675nm의 long pass filter를 사용하였다. 각각의 형광 이미지는 도 6에 나타내었으며, ImageJ software를 이용하여 분석하고 형광도를 정량화하였다. Particles with affibody peptide (mC-DL-HBVC (affi +)) and no particles (mC-DL-HBVC (affi-)) in mC-DL-HBVC in 36-hour incubated cancer cells (1 × 10 4 cells / dish) (2nM) and mC monomer (mC monomer) was treated with affibody peptide (mC +) and without (-) (200 nM) for 1 hour. After washing with PBS (pH 7.4) solution, the cells were fixed for 10 minutes with 4% paraformaldehyde and 0.1% glutaraldehyde and 4 ′, 6′-diamidino-2- Cell nuclei were stained with phenylindole hydrochloride (DAPI). The cells treated in this way were observed by the confocal laser scanning microscope (LSF 700, Carl-Zeiss, Jena, Germany) image of the fluorescent cells. Fluorescence excitation and emission were used for long pass filters of 523-635nm and 560-675nm, respectively. Each fluorescence image is shown in Figure 6, analyzed using ImageJ software and fluorescence quantified.
도 6a 및 6b에서와 같이, EGFR affibody 펩타이드가 없는 경우, mC-DL-HBVC와 mC 단량체 모두 세포 내부로 들어가지는 못했다. 그러나, 표면에 affibody 펩타이드가 존재하는 경우 모두 세포 안으로 들어가는 것을 확인할 수 있다. 이는 표면의 affibody 펩타이드가 세포 유입 과정에서 효과적인 중간 매개체 역할을 하고 있는 것을 보여주며, 특히 mC-DL-HBVC는 mC 단량체보다 100배 낮은 농도에서 7배 높은 형광도를 보여주었다. 이는 본 발명의 형광 단백질 나노입자의 암 세포 표적 능력이 표적 펩타이드가 단일체로 존재할 때보다 현저하게 뛰어남을 나타낸다.6A and 6B, without the EGFR affibody peptide, both mC-DL-HBVC and mC monomer did not enter the cell. However, if the affibody peptide is present on the surface it can be confirmed that all enter into the cell. This suggests that surface affibody peptides act as effective mediators in the cell influx process, especially mC-DL-HBVC showed 7 times higher fluorescence at
세포 내부에서의 형광 단백질 나노입자의 안정성을 측정하기 위해서 암 세포에 같은 농도의 mC-DL-HBVC(2nM), mCin-HBVC(2nM), mCout-HBVC(2nM)의 형광 단백질 나노입자를 3시간 동안 처리한 후, 세포 내부로 들어가지 않은 입자들을 씻어낸 다음, 새 배지를 넣어 24시간동안 37℃에서 추가로 배양하였다. 이후 특정 시간 간격(3, 6, 12 및 24시간)으로 공초점 레이저 현미경을 통해 세포의 형광도를 관찰하였다. 그 결과를 도 7a에 나타내었다.To measure the stability of fluorescent protein nanoparticles inside cells, fluorescent protein nanoparticles of mC-DL-HBVC (2nM), mCin-HBVC (2nM), and mCout-HBVC (2nM) were injected into cancer cells for 3 hours. After treatment for a while, particles which did not enter the cells were washed off, and then fresh medium was added and further incubated at 37 ° C for 24 hours. Thereafter, fluorescence of the cells was observed through confocal laser microscopy at specific time intervals (3, 6, 12 and 24 hours). The results are shown in Figure 7a.
도 7a는 세포 내부에서 점 모양의 형광 패턴을 보임으로써, mC-DL-HBVC, mCout-HBVC 및 mCin-HBVC 엔도좀(endosome) 또는 라이소좀(lysosome)에 위치하는 것을 보여준다. FIG. 7A shows a dot-shaped fluorescent pattern inside the cell, showing that it is located in mC-DL-HBVC, mC out -HBVC and mCin-HBVC endosome or lysosome.
도 7b를 보면, mC-DL-HBVC와 mCin-HBVC의 형광 단백질 나노입자가 처리된 세포는 12시간 포인트에서 40% 이상의 초기 형광도를 유지하였지만, mCout-HBVC 형광 단백질 나노입자를 처리한 세포는 12시간 이내에 90% 이상 처음 형광도를 잃는 것을 확인할 수 있다. mCout-HBVC의 경우 세포 내에서 형광 세기가 빠르게 약해지는 반면, mCin-HBVC는 가장 느리게 감소하는 양상을 보였다. 이는 낮은 pH에서 분해가 쉬운 mCardinal이 넓은 pH 범위에서 안정한 HBVC 나노입자 내부에서 효과적으로 보호되었음을 나타낸다.Referring to FIG. 7B, cells treated with fluorescent protein nanoparticles of mC-DL-HBVC and mC in -HBVC maintained initial fluorescence of 40% or more at 12 hours, but were treated with mC out -HBVC fluorescent protein nanoparticles. The cells can be seen to lose their initial fluorescence by more than 90% within 12 hours. In the case of mC out -HBVC, the fluorescence intensity was rapidly decreased in cells, while mC in -HBVC showed the slowest decrease. This suggests that mCardinal, which is easy to degrade at low pH, is effectively protected inside stable HBVC nanoparticles over a wide pH range.
2) 생체내(2) in vivo ( in vivoin vivo ) 암세포 이미지 분석Cancer cell image analysis
mC-DL-HBVCs에서 affibody peptides의 유무에 따라 (affi+)와 (affi-)로 나누었으며, 상기 나노입자들을 EGFR 과발현 암 세포를 갖는 쥐에 정맥 주사하여 mC-DL-HBVCs의 생체내 분포와 암으로의 전달 양상을 24시간동안 형광 이미징 장비로 관찰하였다(n=4).In mC-DL-HBVCs, (affi +) and (affi-) were divided according to the presence or absence of affibody peptides. The nanoparticles were injected intravenously into mice with EGFR overexpressing cancer cells. The delivery pattern to was observed with fluorescence imaging equipment for 24 hours (n = 4).
대조군으로는 상용화된 근적외선 합성 형광 물질인 Cy5.5가 부착된 affibody peptides가 표출된 HBVC(Cy5.5-HBVC(affi+))를 화학적 연결 방법을 통해 준비하였다. 상기 실시예 3에서 제작한 3가지의 단백질 나노입자(DL-HBVC(affi+), DL-HBVC(affi)와 Cy5.5-HBVC(affi+))의 형광도를 맞춘 후 5주된 누드 마우스에 주입하여 암 세포에 생체내 조건에서의 암 표적 효율을 관찰하였다. 이때, 마우스에 주입하기 전에 mC-DL-HBVC(affi+), mC-DL-HBVC(affi-) 및 Cy5.5-HBVC(affi+)는 형광도가 모두 같도록 조정하였다.As a control, HBVC (Cy5.5-HBVC (affi +)) expressing affibody peptides with Cy5.5, a commercially available near-infrared synthetic fluorescent substance, was prepared by chemical linkage. After adjusting the fluorescence of the three protein nanoparticles (DL-HBVC (affi +), DL-HBVC (affi) and Cy5.5-HBVC (affi +)) prepared in Example 3 and injected into 5 weeks nude mice Cancer cells were observed for cancer target efficiency under in vivo conditions. At this time, mC-DL-HBVC (affi +), mC-DL-HBVC (affi-) and Cy5.5-HBVC (affi +) were adjusted to have the same fluorescence before injection into the mouse.
형광 물질 주입 전, 후에 따른 시간별 쥐의 몸체를 IVIS spectrum Imaging System(Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA)을 통해 관찰하였으며, 그 결과를 도 6에 나타내었다. 이때 사용된 DL-HBVC의 여기/방출 채널(excitation/emission channel)은 600nm/670nm이며, Cy5.5-HBVC(affi(+))의 여기/방출 채널은 660nm/710nm이었다. 상기 이미지 분석 및 형광도 정량화는 IVIS software를 통해 수행하였고, 형광 세기는 radiant efficiency (photons/s/cm2/sr per μW/cm2)로 정규화하였다. The body of the mice according to the time before and after the fluorescent material injection was observed through the IVIS spectrum Imaging System (Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA), and the results are shown in FIG. 6. The excitation / emission channel of the DL-HBVC used was 600 nm / 670 nm, and the excitation / emission channel of Cy5.5-HBVC (affi (+)) was 660 nm / 710 nm. The image analysis and fluorescence quantification were performed via IVIS software, and fluorescence intensity was normalized to radiant efficiency (photons / s / cm 2 / sr per μW / cm 2 ).
형광 물질이 투입된 쥐의 시간에 따른 형광도 변화를 확인하기 위해 근적외선 형광 이미징을 관찰하였다. 또한, 쥐 내부의 형광 물질 분포도를 관찰하기 위해, 형광 이미징 실험에 사용된 쥐를 해부하여 5개의 주요 장기들(간, 허파, 이자, 신장, 심장)을 상기와 같은 기계로 ex vivo 근적외선 형광 촬영을 실시하였다. 해부된 장기와 암 조직은 PBS 버퍼로 씻겨진 후 4%의 포름알데하이드(formaldehyde)로 고정하여 형광 이미징 촬영을 실시하였다. Near-infrared fluorescence imaging was observed to confirm the change in fluorescence over time in the mice injected with the fluorescent material. In addition, in order to observe the distribution of fluorescence in the rat, the mice used in the fluorescence imaging experiment were dissected and five major organs (liver, lung, interest, kidney, heart) were ex- vivo near infrared fluorescence Photographing was performed. The dissected organs and cancerous tissues were washed with PBS buffer and fixed with 4% formaldehyde for fluorescence imaging.
그 결과, 도 8에서 보는 것과 같이, 도 8a에서 mC-DL-HBVC(affi+)의 경우가 높은 대비로 암 부위에 나타나면서 암으로 전달되었음을 확인하였다. 또한, 도 8b에서는 표적 지향성 펩타이드인 affibody가 mC-DL-HBVC의 암 표적 기능 및 전달을 증대시켰음을 보여주었다. As a result, as shown in Figure 8, it was confirmed that the case of mC-DL-HBVC (affi +) in Figure 8a was delivered to the cancer appearing on the cancer site in high contrast. 8B also showed that affibody, a target-directed peptide, augmented cancer target function and delivery of mC-DL-HBVC.
또한, 도 8c에서 볼 수 있듯이, mC-DL-HBVC(affi+) 경우와 Cy5.5-HBVC(affi+) 경우를 비교했을 때, Cy5.5-HBVC(affi+)가 간에서 훨씬 많은 축적을 보이는 것을 확인할 수 있었다. 도 8d에서는 Cy5.5-HBVC(affi+)가 암 대비 간 형광도 비율에서 가장 낮은 값을 보였다. 이는 Cy5.5가 친유성(lipophilicity)을 가지고 있고, 음전하를 띄어 간에 축적되는 경향이 크기 때문인 것으로 보인다(측정된 Cy5.5-HBVC(affi+)의 제타포텐셜 값은 -8.45mV이다).In addition, as can be seen in Figure 8c, when compared with the case of mC-DL-HBVC (affi +) and Cy5.5-HBVC (affi +), Cy5.5-HBVC (affi +) shows much more accumulation in the liver I could confirm it. In FIG. 8D, Cy5.5-HBVC (affi +) showed the lowest value in the ratio of liver fluorescence to cancer. This seems to be due to Cy5.5 having lipophilicity and a negative charge and tending to accumulate in the liver (the measured zeta potential value of Cy5.5-HBVC (affi +) is -8.45mV).
상기 실험을 통해, mC-DL-HBVC(affi+)는 단백질 기반 친수성 형광 나노입자로서 상용화된 유기 형광 물질인 Cy5.5보다 낮은 간 축적도를 보이며, 높은 형광도와 광안정성, 그리고 우수한 생체 내 암 이미징 성능을 보이는 것을 확인할 수 있었다. 따라서, 본 발명에 따른 형광 단백질 나노입자는 형광 물질의 좋은 광안정성과 긴 방출 파장을 요구하는 실시간 이미지 도움 수술 분야에 매우 적합한 물질로 사용될 수 있다.Through these experiments, mC-DL-HBVC (affi +) has a lower liver accumulation than Cy5.5, an organic fluorescent material commercially available as protein-based hydrophilic fluorescent nanoparticles, and has high fluorescence, photostability, and excellent in vivo cancer imaging. The performance was confirmed. Therefore, the fluorescent protein nanoparticles according to the present invention can be used as a material that is very suitable for the field of real-time image assisted surgery requiring good light stability and long emission wavelength of the fluorescent material.
<110> KOREA UNIVERSITY RESEARCH AND BUSINESS FOUNDATION <120> Double-layered fluorescent protein nanoparticles <130> P17U13C0708 <160> 22 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 75 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer No. 1 <400> 1 ggctctggtg gcggaagtgg gggaggcact ggaggtggcg gcggtgggta ctattactat 60 tactatgaca ttgac 75 <210> 2 <211> 75 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer No. 2 <400> 2 atggcgtcta gtctgcgtca gattctggat tctcagaaaa tggaatggcg ttctaatgcg 60 ggtggctctg gtggc 75 <210> 3 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer No. 3 <400> 3 catatgcatc accatcacca tcacctcgag atggcgtcta gt 42 <210> 4 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer No. 4 <400> 4 ccatggacaa tgttccgg 18 <210> 5 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer No. 5 <400> 5 gagctctcac ctcaccat 18 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer No. 6 <400> 6 atcgatttaa acaacagtag tttc 24 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer No. 7 <400> 7 ccatgggtga gcaagggcga g 21 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer No. 8 <400> 8 gagctccttg tacagctcgt c 21 <210> 9 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer No. 9 <400> 9 ccatggggtg gcggtggcgt gagcaag 27 <210> 10 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer No. 10 <400> 10 gagctcgcca ccgccaccct tgtacag 27 <210> 11 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer No. 11 <400> 11 ccatggggtg gcggaagtgg gggaggcact ggaggtggtg gcggtggcgt gagcaag 57 <210> 12 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer No. 12 <400> 12 gagctcgcca cctccagtgc ctcccccact tccaccgcca ccgccaccct tgtacag 57 <210> 13 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer No. 13 <400> 13 ccatggcttg tacagctcgt c 21 <210> 14 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer No. 14 <400> 14 gagctccttg tacagctcgt c 21 <210> 15 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer No. 15 <400> 15 catatgcatc accatcacca tcacatggtg agcaagggc 39 <210> 16 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer No. 16 <400> 16 ctcgagcttg tacagctcgt c 21 <210> 17 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer No. 17 <400> 17 gaattcagta ccgccccccc cactccctcc gccaccgtct tccaaatt 48 <210> 18 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer No. 18 <400> 18 ggatccggtg gcggagggtc tgggggaggc ggttccaggg aatta 45 <210> 19 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer No. 19 <400> 19 gaattcggtg gcggaagtgg gggaggcact ggaggtggca gtggcggtgg ggtggataac 60 60 <210> 20 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer No. 20 <400> 20 ggatccccca ccgccactgc cacctccagt gcctccccca cttccgccac ctttcggcgc 60 60 <210> 21 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker peptide 1 <400> 21 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Thr Gly Gly Gly Gly Gly Gly 1 5 10 <210> 22 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker peptide 2 <400> 22 Gly Gly Gly Gly 1 <110> KOREA UNIVERSITY RESEARCH AND BUSINESS FOUNDATION <120> Double-layered fluorescent protein nanoparticles <130> P17U13C0708 <160> 22 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 75 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer No. One <400> 1 ggctctggtg gcggaagtgg gggaggcact ggaggtggcg gcggtgggta ctattactat 60 tactatgaca ttgac 75 <210> 2 <211> 75 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer No. 2 <400> 2 atggcgtcta gtctgcgtca gattctggat tctcagaaaa tggaatggcg ttctaatgcg 60 ggtggctctg gtggc 75 <210> 3 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer No. 3 <400> 3 catatgcatc accatcacca tcacctcgag atggcgtcta gt 42 <210> 4 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer No. 4 <400> 4 ccatggacaa tgttccgg 18 <210> 5 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer No. 5 <400> 5 gagctctcac ctcaccat 18 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer No. 6 <400> 6 atcgatttaa acaacagtag tttc 24 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer No. 7 <400> 7 ccatgggtga gcaagggcga g 21 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer No. 8 <400> 8 gagctccttg tacagctcgt c 21 <210> 9 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer No. 9 <400> 9 ccatggggtg gcggtggcgt gagcaag 27 <210> 10 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer No. 10 <400> 10 gagctcgcca ccgccaccct tgtacag 27 <210> 11 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer No. 11 <400> 11 ccatggggtg gcggaagtgg gggaggcact ggaggtggtg gcggtggcgt gagcaag 57 <210> 12 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer No. 12 <400> 12 gagctcgcca cctccagtgc ctcccccact tccaccgcca ccgccaccct tgtacag 57 <210> 13 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer No. 13 <400> 13 ccatggcttg tacagctcgt c 21 <210> 14 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer No. 14 <400> 14 gagctccttg tacagctcgt c 21 <210> 15 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer No. 15 <400> 15 catatgcatc accatcacca tcacatggtg agcaagggc 39 <210> 16 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer No. 16 <400> 16 ctcgagcttg tacagctcgt c 21 <210> 17 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer No. 17 <400> 17 gaattcagta ccgccccccc cactccctcc gccaccgtct tccaaatt 48 <210> 18 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer No. 18 <400> 18 ggatccggtg gcggagggtc tgggggaggc ggttccaggg aatta 45 <210> 19 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer No. 19 <400> 19 gaattcggtg gcggaagtgg gggaggcact ggaggtggca gtggcggtgg ggtggataac 60 60 <210> 20 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer No. 20 <400> 20 ggatccccca ccgccactgc cacctccagt gcctccccca cttccgccac ctttcggcgc 60 60 <210> 21 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker peptide 1 <400> 21 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Thr Gly Gly Gly Gly Gly Gly 1 5 10 <210> 22 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker peptide 2 <400> 22 Gly Gly Gly Gly One
Claims (14)
형광 단백질 나노입자 내부의 형광 단백질은 B형 간염 바이러스 코어 단백질을 이루고 있는 단량체의 1-44번째 아미노산 서열 부분과 상기 단량체의 45-149번째 아미노산 서열 부분 사이; 상기 단량체의 1-45번째 아미노산 서열 부분과 상기 단량체의 46-149번째 아미노산 서열 부분 사이; 또는 상기 단량체의 1-48번째 아미노산 서열 부분과 상기 단량체의 49-149번째 아미노산 서열 부분 사이에 위치하고 있는 형광 단백질 나노입자.The method of claim 1,
The fluorescent protein inside the fluorescent protein nanoparticles may be selected from the 1-44th amino acid sequence portion of the monomer constituting the hepatitis B virus core protein and the 45-149 amino acid sequence portion of the monomer; Between the 1-45th amino acid sequence portion of the monomer and the 46-149th amino acid sequence portion of the monomer; Or a fluorescent protein nanoparticle located between the 1-48th amino acid sequence portion of the monomer and the 49-149th amino acid sequence portion of the monomer.
형광 단백질 나노입자 외부 표면의 형광 단백질은 B형 간염 바이러스 코어 단백질의 N-말단에 결합되는 것인 형광 단백질 나노입자.The method of claim 1,
Fluorescent protein nanoparticles Fluorescent protein nanoparticles are those that bind to the N-terminus of the hepatitis B virus core protein.
형광 단백질은 m카디널(mCardinal), 녹색형광단백질(GFP), 변형된 녹색형광단백질(modified green fluorescent protein), 증강된 녹 색형광단백질(enhanced green fluorescent protein; eGFP), 적색형광단백질(RFP, DSRed), 증강된 적색형광단백질(eRFP), 청색형광단백질(BFP), 증강된 청색형광단백질(eBFP), 황색형광단백질(YFP), 증강된 황색형광단백질(eYFP), 남색형광단백질(CFP) 또는 증강된 남색형광단백질(eCFP) 중 어느 하나인, 형광 단백질 나노입자.The method of claim 1,
Fluorescent proteins include mCardinal, green fluorescent protein (GFP), modified green fluorescent protein, enhanced green fluorescent protein (eGFP), and red fluorescent protein (RFP, DSRed). ), Enhanced red fluorescent protein (eRFP), blue fluorescent protein (BFP), enhanced blue fluorescent protein (eBFP), yellow fluorescent protein (YFP), enhanced yellow fluorescent protein (eYFP), indigo fluorescent protein (CFP) or Fluorescent protein nanoparticles, which are any of the enhanced indigo fluorescent protein (eCFP).
상기 형광 단백질의 N-말단 부분과 C-말단 부분은 링커 펩타이드가 결합되어 있는 것인, 형광 단백질 나노입자.The method of claim 1,
N-terminal portion and C-terminal portion of the fluorescent protein is a linker peptide is bound, fluorescent protein nanoparticles.
표적 지향성 펩타이드는 B형 간염 바이러스 코어 단백질을 이루는 단량체의 1-78번째 아미노산 서열 부분과 상기 단량체의 81-149번째 아미노산 서열 부분 사이에 결합되어 있는 키메릭 단백질로 이루어진 것인, 형광 단백질 나노입자.The method of claim 1,
The target directional peptide is a fluorescent protein nanoparticle comprising a chimeric protein bound between a 1-78th amino acid sequence portion of a monomer constituting the hepatitis B virus core protein and a 81-149th amino acid sequence portion of the monomer.
표적 지향성 펩타이드는 수용체 길항제(receptor antagonist); 또는 어피바디(affibody), RGD 펩타이드, 소마토스타틴(somatostatins), 봄베신(bombesin), 콜레시스토키닌(cholecystokinin) 및 가스트린 유사체(gastrin analog)로 이루어진 군에서 선택되는 펩타이드 호르몬인 형광 단백질 나노입자.The method of claim 1,
Target directed peptides include receptor antagonists; Or fluorescent protein nanoparticles which are peptide hormones selected from the group consisting of affibody, RGD peptide, somatostatins, bombesin, cholescystokinin and gastrin analogs.
형광 단백질 나노입자는 자기조립성 단백질로부터 자가조립된 단백질 나노입자인 형광 단백질 나노입자.The method of claim 1,
Fluorescent protein nanoparticles are fluorescent protein nanoparticles that are protein nanoparticles self-assembled from self-assembled proteins.
형광 단백질 나노입자는 자기조립성 단백질의 일 말단에 표적 지향성 펩타이드가 결합된 키메릭 단백질로부터 자기조립된 단백질 나노입자에 형광 단백질을 내부 및 외부에 융합시켜 제조된 것인, 형광 단백질 나노입자.The method of claim 1,
Fluorescent protein nanoparticles are prepared by fusing a fluorescent protein internally and externally to a self-assembled protein nanoparticle from a chimeric protein having a target-directed peptide bound to one end of the self-assembled protein.
약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 표적 지향형 조영제 조성물.Fluorescent protein nanoparticles according to claim 1; And
A target oriented contrast agent composition comprising a pharmaceutically acceptable carrier.
약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 동시 진단 또는 치료용 조영제 조성물.Fluorescent protein nanoparticles according to claim 1; And
Concurrent diagnostic or therapeutic contrast composition comprising a pharmaceutically acceptable carrier.
진단 프로브를 포함하고,
상기 진단 프로브는 영상 판독을 위한 표지 물질인 다중 진단 프로브.Fluorescent protein nanoparticles according to claim 1; And
Includes a diagnostic probe,
The diagnostic probe is a multiple diagnostic probe that is a label for image reading.
생체 이미징용 조성물은 영상 유도 수술(Image-guidedsurgery) 이미징용인 생체 이미징용 조성물.The method of claim 13,
The composition for biological imaging is a composition for biological imaging for image-guidedsurgery imaging.
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Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
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| S. Grasso 등, Int. J. Physiol. Pathophysiol. Pharmacol., Vol.2, No.2, pp.161-178 (2010.07.06.)* * |
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