KR101599589B1 - Fluorescent protein nanopaticles for in vivo imaging - Google Patents
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Abstract
본 발명은 높은 형광강도를 가지는 동시에 생체 적합성 및 안정성이 뛰어난 재조합 형광 단백질 나노입자 및 상기 재조합 형광 단백질 나노입자의 인 비보 이미징을 위한 용도에 관한 것이다. 본 발명에 따른 형광 단백질 나노입자는 형광단백질 단량체에 비하여 현저히 증폭된 형광 강도를 보이며, 체온에 상응하는 온도에서 형광단백질의 구조적 변성을 방지하여 형광단백질의 구조적, 기능적 안정성을 향상시킬 수 있다. 또한 표적 지향성 펩타이드가 표면 발현된 형광 단백질 나노입자는 표적 특이적으로 타겟팅이 가능하며, 증폭된 형광 강도를 통해 생체 진단 이미징이 가능하므로, 타겟팅과 이미징이 동시에 가능한 생체 진단에 적합한 신소재를 제공한다.The present invention relates to recombinant fluorescent protein nanoparticles having high fluorescence intensity, excellent biocompatibility and stability, and use for in vivo imaging of the recombinant fluorescent protein nanoparticles. The fluorescent protein nanoparticles according to the present invention exhibit significantly enhanced fluorescence intensity as compared to the fluorescent protein monomers and can prevent the structural modification of the fluorescent protein at a temperature corresponding to the body temperature, thereby improving the structural and functional stability of the fluorescent protein. In addition, fluorescent protein nanoparticles surface-expressing the target-directed peptide can be target-specifically targeted, and biomedical imaging can be performed through amplified fluorescence intensity, thus providing a new material suitable for biodiagnosis that can simultaneously perform targeting and imaging.
Description
본 발명은 높은 형광강도를 가지는 동시에 생체 적합성 및 안정성이 뛰어난 재조합 형광 단백질 나노입자 및 상기 재조합 형광 단백질 나노입자의 인 비보 이미징을 위한 용도에 관한 것이다.
The present invention relates to recombinant fluorescent protein nanoparticles having high fluorescence intensity, excellent biocompatibility and stability, and use for in vivo imaging of the recombinant fluorescent protein nanoparticles.
고령화 사회로 접어들면서 질병 예방 및 조기 검진의 중요성이 대두됨에 따라 질병 조기 진단 시스템의 개발이 중요시되고 있다. 혈청 및 체액을 이용한 진단 시스템에서 나아가 체내에 직접 적용하여 조직 및 기관 내 질환 발병 유무를 판단하기 위한 생체 진단 시스템의 개발이 활발히 진행되고 있다. 특히 나노 크기의 무기, 유기 소재는 독특한 구조적 특성을 기반으로 생체 진단 소재로 개발하기 위한 노력이 지속되고 있으며, 특히 형광을 띠는 나노소재는 높은 민감도와 편의성으로 인해 각광받고 있다.As the aging society becomes more important, prevention of disease and early screening become important. Therefore, it is important to develop an early disease diagnosis system. There has been actively developed a bio-diagnostic system for diagnosing whether tissue or organ disease has occurred by directly applying it to a diagnostic system using serum or body fluids. In particular, nano-sized inorganic and organic materials have been continuously developed to develop biomedical materials based on their unique structural characteristics. In particular, fluorescent nanomaterials are attracting attention due to their high sensitivity and convenience.
생체 이미징 소재는 높은 형광 신호를 보이고, 생체 적합성이 뛰어나야 하며, 특정 조직 및 질환 특이적으로 타겟팅이 가능해야 한다. 최근 광학적 생체 이미징 소재의 기능성 향상을 위하여 1) 이미징 소재의 형광 강도 증폭 기술, 2) 생체 적합성 나노 소재 개발을 위한 표면 처리 기술 및 생체 적합성 소재 발굴, 3) 조직, 질환 특이적 타겟팅 모티프 표출 이미징 소재 개발이 활발히 진행 중이다.Biological imaging materials should exhibit high fluorescence signals, be biocompatible, and be able to target specific tissue and disease specific targets. In order to improve the functionality of optical bioimaging materials, the following technologies have been developed: 1) fluorescence intensity amplification technology for imaging materials, 2) surface treatment technology and biocompatible materials for developing biocompatible nanomaterials, and 3) tissue and disease specific targeting motifs. Development is underway.
현재 잘 알려진 화학적 형광 물질(organic dye)인 Cy3, Cy5, 그 외 FITC 등은 단백질 및 DNA의 형광 수식 기법이 널리 알려지면서 생체 진단 소재로 개발하기 위한 노력이 계속 되어왔으나 낮은 구조적 안정성과, 낮은 광 안정성(photostability)으로 인해 효용성이 떨어질 뿐 아니라, 형광 신호 증폭 기술의 부재로 낮은 민감도를 나타내는 단점이 있다. Currently, well-known chemical dyes Cy3, Cy5, and other FITC have been widely used for the development of bio-diagnostic materials due to the well-known techniques of fluorescence modification of proteins and DNA. However, low structural stability, Not only does this deteriorate due to photostability, but it also has a disadvantage of low sensitivity due to the absence of fluorescence signal amplification technology.
최근 퀀텀닷(Quantum dot)이 높은 안정성과 형광 강도로 각광받고 있지만 중금속을 기반으로 제조되기 때문에 생체 적합성 문제나 독성문제가 해결되어야 할 과제로 남아있으며 제조 단가가 높고 생산 및 수식화에 복잡한 공정이 요구된다.Quantum dot has recently been spotted for its high stability and fluorescence intensity, but because it is manufactured based on heavy metal, the biocompatibility and toxicity problems remain to be solved, and the manufacturing cost is high and complicated processes are required for production and formulation do.
반면 형광 검출 신호 물질로 널리 사용되고 있는 형광 단백질은 구조적 안정성, 높은 양자 효율, 높은 형광 밝기 등을 가지며, 대장균을 통해 쉽게 생산이 가능하고, 생체 유래의 단백질 기반의 소재이므로 이를 생체 진단에 활용하기 위한 다양한 연구가 수행되고 있다. 하지만 생체 내에서의 안정성 및 검출 가능한 수준의 형광 강도를 충족시키지는 못하는 실정이며, 이러한 제한 점을 극복하고 효용성을 증대시킬 수 있는 형광 단백질 기반의 새로운 기능성 소재 개발이 필요한 실정이다.On the other hand, fluorescent proteins widely used as fluorescence detection signal materials have structural stability, high quantum efficiency, high fluorescence brightness, and are easily produced through E. coli. Since they are protein-based materials derived from living bodies, Various studies have been conducted. However, in vivo stability and detectable fluorescence intensity can not be satisfied. Therefore, it is necessary to develop new functional materials based on fluorescent proteins that can overcome these limitations and increase utility.
또한, 나노 크기의 무기입자, 고분자기반의 구조체에 화학 공정을 거쳐 화학적 형광 물질을 고정한 소재를 이미징 소재로 개발하기 위한 시도가 활발히 진행되고 있으나, 이들이 독성으로 인한 안전성 문제는 끊임없는 이슈가 되고 있다.In addition, attempts have been actively made to develop an imaging material in which a chemical fluorescent substance is immobilized through a chemical process on a nano-sized inorganic particle or a polymer-based structure, but safety problems due to toxicity are a constant issue .
재현성 있는 생체 이미징 결과를 얻기 위해서는 입자의 입도 분포 및 표면 성질이 일정해야 하는데, 기존 생체 이미징에 적용하고자 연구 개발되고 있는 무기 입자, 자성입자, 고분자 소재 기반의 나노입자는 재현성 있는 균일한 입자의 제조가 어려울 뿐 아니라, 형광 물질을 추가로 화학적 반응을 통해 표면 고정화 내지는 입자 내 캡슐화(encapsulation) 과정을 거쳐야 하는 단점이 있다. 특히 생체 이미징 소재가 최종 질환 조직까지 도달하기 위해서는, 생체 내에서 면역 세포에 의해 제거되지 않아야 하고, 신장을 통해 빠져가 나가는 신장 클리어런스(renal clearance)를 극복해야 한다. 신장 클리어런스는 30 nm 이하 입자의 경우 주로 일어난다고 알려져 있으므로 30 nm 이상의 입자를 제조하는 기술 연구가 진행되고 있으나 화학적 반응을 통해 제조되는 입자는 균일한 크기로 재현성 있게 제조하는데 한계가 있다. 또한 기존 연구되고 있는 무기소재 기반의 이미징 소재는 면역 세포에 의해 빠르게 외부 물질로 인식되어 대부분이 간에 축적되는 현상을 보이며, 이를 방지하려면 표면 개질을 추가로 수행해야 하는 단점이 있다.In order to obtain reproducible biomedical imaging results, particle size distribution and surface properties must be constant. Inorganic particles, magnetic particles, and polymer-based nanoparticles, which have been researched and developed for existing biological imaging, And it is disadvantageous in that the fluorescent substance is further subjected to a surface immobilization through a chemical reaction or an encapsulation process in a particle. In particular, in order for the biomedical material to reach the final diseased tissue, it must not be removed by the immune cells in vivo and overcome renal clearance through the kidneys. Although it is known that the elongation clearance mainly occurs in the case of particles of 30 nm or less, technical studies for producing particles of 30 nm or more are under way, but the particles produced through chemical reaction are limited in reproducibility in uniform size. In addition, existing inorganic materials based imaging materials are quickly recognized as foreign substances by immune cells, and most of them accumulate in the liver. To prevent this, there is a disadvantage that surface modification must be additionally performed.
또한 생체에 적용 가능한 나노입자를 개발하고 그 응용 범위를 확대하기 위하여 다양한 크기와 형태의 나노소재 개발이 활발이 진행되고 있다. 기존 무기 나노입자의 생체 분포 및 입자의 특성을 응용한 특정 장기 및 질환의 이미징 기술이 다수 보고된 바 있으나, 아직까지 단백질 나노입자 기반의 이미징 소재 개발은 단백질 나노입자를 생체에 적용하는데 있어서 정보가 충분하지 않아 그 응용에 한계가 있는 실정이다. 즉, 기존 무기 나노입자를 대체할 수 있는 생체 유래의 단백질 나노입자 라이브러리를 확보하고, 이의 적절한 생체 적용을 위해서는 다양한 크기와 형태의 단백질 나노입자에 대한 인 비보 연구가 요구되고 있다.
In addition, nanomaterials of various sizes and shapes have been actively developed in order to develop nanoparticles applicable to living bodies and to expand the application range thereof. Many imaging technologies for specific organs and diseases have been reported using bio-distribution and particle characteristics of conventional inorganic nanoparticles. However, development of imaging materials based on protein nanoparticles has not yet been reported in the application of protein nanoparticles to living bodies. There is a limit to the application because it is not enough. In other words, in vivo research on protein nanoparticles of various sizes and shapes is required for securing a bio-based protein nanoparticle library capable of replacing existing inorganic nanoparticles and appropriately applying it to a living body.
본 발명의 목적은 형광 강도 증폭, 생체 안정성이 향상된 생체 진단용 신소재로서 형광 단백질 나노입자 및 이의 용도를 제공하는 것이다.
An object of the present invention is to provide a fluorescent protein nanoparticle and its use as a biomedical new material with improved fluorescence intensity and improved biostability.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 표면에 형광물질 및 표적 지향성 펩타이드를 표출하는 형광 단백질 나노입자를 제공한다.In order to achieve the above object, the present invention provides a fluorescent protein nanoparticle expressing a fluorescent substance and a target-oriented peptide on a surface thereof.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 형광 단백질 나노입자; 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 표적 지향형 조영제 조성물을 제공한다.The present invention also relates to fluorescent protein nanoparticles according to the present invention; ≪ / RTI > and a pharmaceutically acceptable carrier.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 형광 단백질 나노입자; 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 동시 진단 또는 치료용 조영제 조성물을 제공한다.The present invention also relates to fluorescent protein nanoparticles according to the present invention; And a pharmaceutically acceptable carrier. ≪ Desc /
본 발명은 또한 본 발명에 따른 형광 단백질 나노입자; 및 진단 프로브를 포함하고, 상기 진단 프로브는 영상 판독을 위한 표지 물질인 다중 진단 프로브를 제공한다.The present invention also relates to fluorescent protein nanoparticles according to the present invention; And a diagnostic probe, wherein the diagnostic probe provides multiple diagnostic probes that are markers for image reading.
본 발명은 또한 자기조립성 단백질에 형광물질이 결합된 10 내지 50 nm 크기의 형광 단백질 나노입자; 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하고, 상기 형광 단백질 나노입자는 B형 간염 바이러스 코어 단백질, 페리틴 중쇄 단백질(Ferritin Heavy chain), 써모플라즘 애시도필룸(Thermoplasm acidophilum) 유래의 프로테아좀(tPTS) 또는 대장균 유래의 DNA 결합 단백질(eDPS)을 포함하는 자기조립성 단백질로부터 자기조립된 단백질 나노입자에 형광물질을 표면 결합시켜 제조된 것인, 생체 이미징용 조성물을 제공한다.
The present invention also relates to fluorescent protein nanoparticles of 10 to 50 nm in size, to which a fluorescent substance is bound to a self-assembling protein; And a pharmaceutically acceptable carrier, wherein the fluorescent protein nanoparticle is selected from the group consisting of a hepatitis B virus core protein, a ferritin heavy chain protein, a thermoplasm A composition for bioimaging, which is prepared by surface-binding a fluorescent substance to protein nanoparticles self-assembled from self-assembling proteins comprising proteasome (tPTS) derived from acidophilum or DNA binding protein (eDPS) derived from E. coli .
본 발명에 따른 형광 단백질 나노입자는 형광 단백질 단량체에 비하여 현저히 증폭된 형광 강도를 보이며, 체온에 상응하는 온도에서 형광 단백질의 구조적 변성을 방지하여 형광단백질의 구조적, 기능적 안정성을 향상시킬 수 있다. 또한 표적 지향성 펩타이드가 표면 발현된 형광 단백질 나노입자는 표적 특이적으로 타겟팅이 가능하며, 증폭된 형광강도를 통해 생체 진단 이미징이 가능하므로, 타겟팅과 이미징이 동시에 가능한 생체 진단에 적합한 신소재를 제공한다.The fluorescent protein nanoparticles according to the present invention exhibit significantly enhanced fluorescence intensity as compared to the fluorescent protein monomers and can prevent the structural modification of the fluorescent protein at a temperature corresponding to the body temperature, thereby improving the structural and functional stability of the fluorescent protein. In addition, fluorescent protein nanoparticles surface-expressing the target-directed peptide can be target-specifically targeted, and biomedical imaging can be performed through amplified fluorescence intensity, thus providing a new material suitable for biodiagnosis that can simultaneously perform targeting and imaging.
표적 지향성 펩타이드를 표출하지 않으나, 일정 크기와 구조의 특성을 갖는 형광 단백질 나노입자는 감시림프절 이미징에 사용할 수 있다.
Fluorescent protein nanoparticles that do not display target-directed peptides but have a certain size and structure characteristics can be used for surveillance lymph node imaging.
도 1은 녹색(eGFP), 적색(DsRed) 형광단백질을 융합한 캡시드 단백질 나노입자 제조를 위한 발현 벡터의 모식도를 나타낸 것이다((A) gFCNP(w/o linker), (A) rFCNP(w/o linker), (C) gFCNP(w/ linker), (D) rFCNP(w/ linker)).
도 2는 형광단백질이 표면 표출된 구형의 단백질 나노입자의 모식도를 나타낸 것이다((A) gFCNP (w/ linker), (B) rFCNP (w/ linker)).
도 3은 대장균에서 발현 후 분리 정제한 HBV 캡시드 유래 키메릭 형광 나노입자의 구조를 보여주는 TEM 사진도이다((A) gFCNP (w/ linker), (B) rFCNP (w/ linker)).
도 4는 형광단백질 단량체(eGFP, DsRed)와 링커를 삽입하지 않은 형광 단백질 나노입자[gFFNP, gFCNP(w/o linker), rFFNP, rFCNP(w/o linker)], 링커를 삽입한 형광 단백질 나노입자[gFFNP, gFCNP(w/ linker), rFFNP, rFCNP(w/ linker)]의 형광 세기를 비교한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 PBS에 존재하는 형광단백질 단량체[eGFP(○), DsRed(▽)], 링커를 삽입한 형광 단백질 나노입자 [gFCNP(w/ linker)(●), rFCNP(w/ linker)(▼)]의 보관 시간에 따른 형광 세기를 비교한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 30%, 50% 혈청에 존재하는 형광단백질 단량체, 링커를 삽입한 형광 단백질 나노입자의 보관 시간에 따른 형광 세기를 비교한 결과를 나타낸 것이다((A) 적색형광단백질 단량체와 적색형광단백질 융합 나노입자 [30% 혈청내 rFCNP (●), 30% 혈청 내 DsRed (○), 50% 혈청 내 rFCNP (▼), 50% 혈청 내 DsRed (▽)], (B) 녹색형광단백질 단량체와 녹색형광단백질 융합 나노입자 [30% 혈청내 gFCNP (●), 30% 혈청 내 eGFP (○), 50% 혈청 내 gFCNP (▼), 50% 혈청 내 eGFP (▽)]).
도 7은 반복된 광원 노출에 대한 광안정성을 비교한 결과를 나타낸 것이다([gFCNP(●), FAM (▽), eGFP (○), Qdot655(▲), rFCNP (■), DsRed(□)]).
도 8은 동물 모델의 복부에 피하 주사한 형광단백질 단량체와 형광 단백질 나노입자의 생체 안정성을 비교한 결과를 나타낸 것이다((DsRed: 형광단백질 단량체, rFFNP: 페리틴 기반 적색형광단백질 나노입자, rFCNP: 캡시드 기반 적색형광단백질 나노입자)).
도 9는 생체진단용 표적 지향적 펩타이드(RGD)를 표출하는 본 발명에 따른 형광 단백질 나노입자 제조를 위한 발현 벡터의 모식도를 나타낸 것이다((A) RGD-rFFNP, (B) RGD-rFCNP).
도 10은 생체진단용 표적 지향성 펩타이드(RGD)를 표출하는 본 발명에 따른 형광 단백질 나노입자(RGD-rFFNP)와 형광 단백질 나노입자(rFFNP)의 암세포(U87MG) 업테이크 효율을 비교한 실험 결과이다.
도 11은 U87MG 암세포를 이식한 동물 모델에 rFFNP와 RGD-rFFNP를 각각 정맥 주사한 후 암 타겟팅 효율을 인 비보 이미징을 통해 비교한 결과를 나타낸 것이다.
도 12는 생체 진단용 표적 지향적 펩타이드(RGD)를 표출하는 본 발명에 따른 형광 단백질 나노입자를 적용한 동물 실험 후 조직별 형광 세기 비교 결과를 나타낸 것이다((A) SCC7 종양 모델, (B) U87MG 종양 모델).
도 13은 본 발명에 따른 eDPS 및 tPTS 기반 형광 단백질 나노입자와 RGD 표출 형광 단백질 나노입자의 제작을 위한 발현 벡터 모식도(A)와 각 나노입자의 크기와 형태를 보여주는 DLS 결과와 TEM 사진도(B)이다.
도 14는 본 발명에 따른 eDPS, RGD-eDPS, tPTS, RGD-tPTS 형광 단백질 나노입자를 이용한 인 비보 암 타겟팅 결과(A)와 암에 나타나는 형광 세기 측정을 통해 암 타겟팅 효율을 비교해서 보여주는 그래프(B) 이다.
도 15는 감시림프절 이미징에 적용한 본 발명에 따른 4개의 형광 단백질 나노입자의 크기와 구조를 보여주는 TEM 사진도(A)와 각 입자의 형광세기(B)를 나타낸 것이다.
도 16은 본 발명에 따른 4개의 형광 단백질 나노입자를 이용한 감시림프절 이미징 결과이다((A) eDPS, (B) tPTS, (C) FTN-h, (D) HBVcAg).
Figure 1 is a schematic diagram of an expression vector for the production of capsid protein nanoparticles fused with green (eGFP) and red (DsRed) fluorescent proteins (A) gFCNP (w / o linker), (A) rFCNP o linker), (C) gFCNP (w / linker), and (D) rFCNP (w / linker).
FIG. 2 is a schematic view of a spherical protein nanoparticle on which a fluorescent protein is surface-expressed ((A) gFCNP (w / linker) and (B) rFCNP (w / linker)).
FIG. 3 is a TEM photograph showing (a) gFCNP (w / linker) and (b) rFCNP (w / linker) showing the structure of HBV capsid-derived chimeric fluorescent nanoparticles isolated and purified after expression in E. coli.
Fig. 4 is a graph showing the relationship between fluorescence protein nano-particles (eGFP, DsRed) and fluorescent protein nanoparticles (gFFNP, gFCNP (w / o linker), rFFNP, rFCNP (W / linker), rFFNP, and rFCNP (w / linker)] of the particles [gFFNP, gFCNP
Fig. 5 shows the results of fluorescence analysis of fluorescent protein monomers [eGFP (O), DsRed (∇)] in PBS, fluorescent protein nanoparticles [gFCNP (w / linker) ] Were compared with fluorescence intensities according to storage time.
FIG. 6 shows fluorescence intensities of fluorescent protein monomers and linker-inserted fluorescent protein nanoparticles present in 30% and 50% serum, respectively, according to storage time ((A) Red fluorescent protein monomer and red fluorescent protein Fused nanoparticles (rfcNP in 30% serum, DsRed in 30%, rfcNP in 50%, DsRed in 50% serum), (B) green fluorescent protein monomer and green Fluorescent protein fusion nanoparticles [30% serum gFCNP (●), 30% serum eGFP (○), 50% serum gFCNP (▼), 50% serum eGFP (∇)].
Figure 7 shows the results of comparing the light stability against repeated light source exposure (gFCNP (), FAM (), eGFP (), Qdot655 (), rFCNP (), DsRed ).
FIG. 8 shows a comparison of the biostability between the fluorescent protein monomers injected subcutaneously into the abdominal region of an animal model and the fluorescent protein nanoparticles ((DsRed: fluorescent protein monomer, rFFNP: ferritin-based red fluorescent protein nanoparticles, rFCNP: capsid Based red fluorescent protein nanoparticles).
FIG. 9 is a schematic diagram of an expression vector for producing fluorescent protein nanoparticles according to the present invention, which expresses a target-oriented peptide (RGD) for biological diagnosis ((A) RGD-rFFNP and (B) RGD-rFCNP).
FIG. 10 shows experimental results comparing the uptake efficiency of cancer cells (U87MG) of the fluorescent protein nanoparticles (RGD-rFFNP) and the fluorescent protein nanoparticles (rFFNP) according to the present invention expressing the biologically-derived target-oriented peptide (RGD).
FIG. 11 shows the results obtained by intravenously injecting rFFNP and RGD-rFFNP into an animal model transplanted with U87MG cancer cells and then comparing the cancer targeting efficiency with in vivo imaging.
FIG. 12 shows fluorescence intensities of tissues after animal experiment using fluorescent protein nanoparticles according to the present invention for expressing a target-directed peptide for biological diagnosis (RGD) ((A) SCC7 tumor model, (B) U87MG tumor model ).
FIG. 13 is a schematic diagram (A) of an expression vector for the production of eDPS and tPTS-based fluorescent protein nanoparticles and RGD-expressing fluorescent protein nanoparticles according to the present invention, a DLS result and a TEM photograph showing the size and shape of each nanoparticle )to be.
FIG. 14 is a graph (A) showing in vivo tumor targeting results using eDPS, RGD-eDPS, tPTS, and RGD-tPTS fluorescent protein nanoparticles according to the present invention and a graph showing a comparison of cancer targeting efficiencies B).
FIG. 15 shows a TEM photograph (A) showing the size and structure of four fluorescent protein nanoparticles according to the present invention applied to the monitoring lymph node imaging, and the fluorescence intensity (B) of each particle.
FIG. 16 shows results of monitoring lymph node imaging using four fluorescent protein nanoparticles according to the present invention ((A) eDPS, (B) tPTS, (C) FTN-h, and (D) HBVcAg).
이하, 본 발명의 구성을 구체적으로 설명한다.Hereinafter, the configuration of the present invention will be described in detail.
본 발명은 표면에 형광물질 및 표적 지향성 펩타이드를 표출하는 형광 단백질 나노입자에 관한 것이다.The present invention relates to a fluorescent protein nanoparticle which expresses a fluorescent substance and a target-oriented peptide on a surface thereof.
본 발명의 형광 단백질 나노입자는 나노미터의 크기의 직경을 가지는 구형의 단백질 입자로서 자기조립성 단백질에 의한 자기조립에 의해 입자를 이루고 있어 매우 균일한 입도 분포를 보이는 입자를 재현성 있게 제조할 수 있을 뿐 아니라, 생체 내에서 사용된 후 분해될 수 있는 생체친화성 물질이기 때문에 생체 이미징 후의 나노입자의 잔존으로 인한 독성의 문제가 없다. 특히 인간 유래의 자기조립성 단백질을 사용할 경우 생체 이미징에 사용 시 안전성과 독성에 전혀 문제가 없고, 면역세포에 의한 제거 또한 타 무기 소재 입자에 비해 현저히 낮은 편이다. The fluorescent protein nanoparticles of the present invention are spherical protein particles having a diameter of nanometer size and are self-assembled by self-assembling proteins, so that particles having a very uniform particle size distribution can be reproducibly prepared In addition, since it is a biocompatible substance which can be decomposed after being used in vivo, there is no problem of toxicity due to the remaining nanoparticles after biomedical imaging. In particular, when human-derived self-assembling proteins are used, there is no problem in safety and toxicity when used for biological imaging, and removal by immune cells is significantly lower than that of other inorganic particles.
따라서, 본 발명의 형광 단백질 나노입자는 생체 적용이 가능하고 입자에 따른 표적 타겟팅 효과가 우수하여 진단 조직 또는 질환에 적합한 것을 특징으로 한다.Accordingly, the fluorescent protein nanoparticles of the present invention are suitable for living tissues or diseases by being biologically applicable and having excellent target targeting effect depending on the particle.
본 발명의 형광 단백질 나노입자는 한 구체예에 따르면 형광단백질, 자기조립성 단백질, 및 표적 지향성 펩타이드가 융합된 단량체가 자가조립되어 하나의 구형 형광 단백질 나노입자를 이룰 수 있다. 다른 구체예에 따르면, 자기조립성 단백질에 표적 지향성 펩타이드가 결합된 키메릭 단백질로부터 단백질 나노입자가 제조되고 형광물질로 표면 수식시켜 형광 단백질 나노입자를 제조할 수도 있다.According to one embodiment, the fluorescent protein nanoparticle of the present invention can self-assemble a fluorescent protein, a self-assembling protein, and a monomer fused with a target-directed peptide to form a spherical fluorescent protein nanoparticle. According to another embodiment, protein nanoparticles may be prepared from a chimeric protein to which a target-directed peptide is bound to a self-assembling protein, and fluorescent protein nanoparticles may be prepared by surface modification with a fluorescent material.
본 명세서에서, 용어 "자기조립성 단백질"은 단백질, 단백질의 서브유닛 또는 펩타이드가 수 개가 모였을 때 이들이 스스로 조직적인 구조 또는 패턴을 형성하며 집합체를 형성하는 단백질, 단백질의 서브유닛 또는 펩타이드를 의미한다. 이러한 자기조립성 단백질은 별도의 조작 없이도 단백질의 나노입자 형성을 가능하게 하므로 본 발명에 따른 단백질 나노입자의 제조를 위해 유리하게 사용할 수 있다. As used herein, the term "self-assembling protein" refers to a protein, a subunit of a protein, or a subunit or peptide of a protein that forms a self-organizing structure or pattern when a plurality of subunits or peptides are assembled . Such self-assembling proteins enable the formation of nanoparticles of the protein without any special manipulations, and thus can be advantageously used for the production of the protein nanoparticles according to the present invention.
상기 자기조립성 단백질은 외래 단백질과 융합할 수 있고, 상기 외래 단백질은 목적에 따라 자기조립 시 내부 또는 외부에 위치시킬 수 있다. 본 발명은 단백질 나노입자를 타겟 물질의 탐지 목적으로 사용하므로 외래 단백질로 형광단백질과 표적 지향성 펩타이드를 사용할 수 있고, 상기 형광단백질과 표적 지향성 펩타이드는 자기조립성 단백질의 자기조립 시 외부에 위치하도록 조절된다. 만일 형광단백질이 자기조립성 단백질의 자기조립시 내부에 위치하도록 발현되면 형광 강도의 저하를 야기하게 된다. 그러므로, 형광단백질과 표적 지향성 펩타이드가 융합단백질의 외부에 위치할 수 있도록 융합 파트너로서 사용되게 되는 자기조립성 단백질의 종류나 융합되는 부위, 또는 단백질의 융합이나 발현의 방법 등을 적절히 선택하는 것이 바람직하다. The self-assembling protein may be fused with the exogenous protein, and the exogenous protein may be located inside or outside the self-assembly depending on the purpose. Since the present invention uses protein nanoparticles for the purpose of detecting a target substance, a fluorescent protein and a target-oriented peptide can be used as an exogenous protein, and the fluorescent protein and the target-directed peptide are adjusted to be located outside the self- do. If the fluorescent protein is expressed inside the self-assembling protein during self-assembly, the fluorescence intensity is lowered. Therefore, it is preferable to appropriately select the type of self-assembling protein to be used as a fusion partner so that the fluorescent protein and the target-oriented peptide can be located outside the fusion protein, the site to be fused or the method of fusion or expression of the protein Do.
이러한, 자기조립성 단백질로, B형 간염 바이러스 코어 단백질(이하, 'HBV'라 함)을 사용할 수 있다.As such a self-assembly protein, a hepatitis B virus core protein (hereinafter referred to as HBV) can be used.
HBV 코어 단백질은 180-240개의 단량체가 자가조립되어 하나의 구형 단백질 나노입자를 이루며, 유전자 재조합 기술을 이용하여 대장균에서 대량 생산이 가능하다. 특히 스파이크 부위에 외래 단백질을 융합 발현할 경우 외래 단백질이 단백질 나노입자의 표면에 표출되는 특징이 있다. The HBV core protein is self-assembled with 180-240 monomers to form a single spherical protein nanoparticle, which can be mass-produced in E. coli using recombinant DNA technology. Especially, when foreign proteins are fused and expressed in the spike region, foreign proteins are expressed on the surface of protein nanoparticles.
상기 HBV 코어 단백질은 구조상 스파이크에 해당하는 79-80번째 아미노산 서열 사이, N-말단 또는 C-말단에 외래 단백질을 융합 발현할 경우, 발현된 외래 단백질이 단백질 나노입자의 바깥 표면에 표출될 수 있다. 다만, 이러한 외래 단백질의 표면 표출은 HBV 코어 단백질의 3차 구조를 형성하는데 영향을 줄 수 있으므로 상기 3차 구조를 형성할 수 있는 범위에서 외래 단백질을 채택할 수 있다.When the exogenous protein is fused and expressed at the N-terminal or C-terminal between the 79-80th amino acid sequence corresponding to the structural spike, the expressed foreign protein can be expressed on the outer surface of the protein nanoparticle . However, since the surface expression of such foreign proteins may affect the formation of the tertiary structure of the HBV core protein, it is possible to adopt an exogenous protein within a range capable of forming the tertiary structure.
본 발명의 일 구체예에 따르면, HBV 코어 단백질의 1-78번째 아미노산 서열 부분과 상기 코어 단백질의 81-149번째 아미노산 서열 부분 사이에 증강된 녹색형광단백질(enhanced green fluorescent protein) 또는 적색형광단백질(DsRed)을 위치시키고, 상기 형광단백질의 N-말단 부분은 헥사 히스티딘과 링커 펩타이드를, C-말단 부분은 링커 펩타이드를 결합시키며, HBV 코어 단백질의 N-말단 또는 C-말단에는 표적 지향성 펩타이드를 결합시킨 키메릭 단백질을 제조할 수 있다. 1개의 키메릭 단백질 즉 단량체 180-240개가 자가조립되어 표면에 형광단백질과 표적 지향성 펩타이드를 표출하는 형광 단백질 나노입자를 형성할 수 있다.According to one embodiment of the present invention, an enhanced green fluorescent protein or a red fluorescent protein (hereinafter, referred to as " amplified green fluorescent protein ") is inserted between the 1-78th amino acid sequence portion of the HBV core protein and the 81-149th amino acid sequence portion of the core protein DsRed), wherein the N-terminal portion of the fluorescent protein binds to hexa histidine and the linker peptide, the C-terminal portion binds to the linker peptide, and the N-terminal or C-terminal of the HBV core protein binds to the target- To produce a chimeric protein. One chimeric protein, i.e., 180-240 monomers, can self-assemble to form fluorescent protein nanoparticles that express fluorescent proteins and target-oriented peptides on their surface.
또는, 자기조립성 단백질의 아미노 말단과 카르복실 말단이 표면으로 표출되는 특징을 이용하여 형광 단백질 나노입자를 제조할 수도 있다. 예컨대, HBV 코어 단백질의 N-말단 또는 C-말단에 표적 지향성 펩타이드가 결합된 키메릭 단백질로부터 자기조립된 단백질 나노입자에 화학적 공정을 통해 형광물질을 표면 결합시켜 형광 단백질 나노입자를 형성할 수 있다.Alternatively, the fluorescent protein nanoparticles may be prepared using the feature that the amino terminus and the carboxyl terminus of the self-assembling protein are expressed on the surface. For example, fluorescent protein nanoparticles can be formed by surface-binding a fluorescent substance through a chemical process to protein nanoparticles self-assembled from a chimeric protein having a target-oriented peptide bound to the N-terminal or C-terminal of HBV core protein .
상기 자기조립성 단백질로, 인간 유래의 자기조립성 단백질을 사용할 수 있다. 상기 인간 유래의 자기조립성 단백질 또는 이를 포함하는 단백질 나노입자는 인간화된 자기조립성 단백질 또는 인간화된 단백질 나노입자를 또한 포함하는 것으로 간주된다. 예컨대, 상기 자기조립성 단백질은 페리틴일 수 있다. 페리틴은 중쇄와 경쇄로 구성된 24개의 동일한 단백질 서브유닛으로 구성되며, 자기조립성을 갖고 있어 생체 내에서 구형의 속이 빈 쉘 구조(hollow shell)을 형성한다. 한 구체예에서, 상기 자기조립성 단백질은 페리틴 중쇄 단백질(Ferritin Heavy Chain: 이하 'FTN-H'이라고도 함)일 수 있다.As the self-assembling protein, a self-assembling protein derived from a human can be used. The human-derived self-assembling protein or protein nanoparticles comprising it are also considered to comprise humanized self-assembling proteins or humanized protein nanoparticles. For example, the self-assembling protein may be ferritin. Ferritin is composed of 24 identical protein subunits composed of heavy chain and light chain, and has self-assembly properties, forming a spherical hollow shell in vivo. In one embodiment, the self-assembling protein may be a ferritin heavy chain (FTN-H).
본 발명의 일 구체예에 따르면, FTN-H은 양 말단에 링커 펩타이드에 의해 표적 지향성 펩타이드와 형광단백질이 각각 결합될 수 있다. 보다 구체적으로, 표적 지향성 펩타이드는 FTN-H의 N-말단에, 형광단백질은 C-말단에 융합될 수 있다. FTN-H과 융합되는 표적 지향성 펩타이드와 형광단백질은 단백질 나노입자의 표면에 표출됨으로써 강한 형광 강도를 제공하여 표적 물질의 탐지시 매우 유용하게 활용될 수 있다. According to one embodiment of the present invention, FTN-H can be bound to a target protein and a fluorescent protein by a linker peptide at both ends, respectively. More specifically, the targeting peptide can be fused to the N-terminus of FTN-H and the fluorescent protein to the C-terminus. The target-oriented peptide and fluorescent protein fused with FTN-H are expressed on the surface of protein nanoparticles and thus can be very useful in detecting a target substance by providing strong fluorescence intensity.
또는, 자기조립성 단백질의 아미노 말단과 카르복실 말단이 표면으로 표출되는 특징을 이용하여 형광 단백질 나노입자를 제조할 수도 있다. FTN-H의 N-말단 또는 C-말단에 표적 지향성 펩타이드가 결합된 키메릭 단백질로부터 자기조립된 단백질 나노입자에 화학적 공정을 통해 형광물질을 표면 결합시켜 형광 단백질 나노입자를 형성할 수 있다.Alternatively, the fluorescent protein nanoparticles may be prepared using the feature that the amino terminus and the carboxyl terminus of the self-assembling protein are expressed on the surface. The fluorescent protein nanoparticles can be formed by surface-bonding the fluorescent substance to the protein nanoparticle self-assembled from the chimeric protein having the target-oriented peptide bound to the N-terminal or C-terminal of FTN-H through a chemical process.
상기 자기조립성 단백질로, 써모플라즘 애시도필룸(Thermoplasm acidophilum) 유래의 프로테아좀(이하, 'tPTS'라 함)을 사용할 수 있다. 상기 tPTS는 서열이 다른 14개의 알파 단백질과 14개의 베타 단백질이 자기조립에 의해 약 원기둥 형태의 단백질 나노입자를 이루며, 유전자 재조합 기술을 이용하여 대장균에서 발현이 가능하다. 이 단백질 나노입자는 매우 높은 열안정성을 보일 뿐 아니라, 알파 단백질의 아미노 말단과 카르복실 말단, 베타 단백질의 카르복실 말단이 외부로 표출되어 있어 각 부분에 외래 단백질을 융합발현할 경우 외래 단백질이 단백질 나노입자의 표면에 표출되는 특징이 있다.As the self-assembling protein, a proteasome derived from thermoplasmic acidophilum (hereinafter referred to as 'tPTS') can be used. The tPTS is composed of 14 alpha proteins and 14 beta proteins of different sequences, which are self-assembled to form a weakly columnar protein nanoparticle, which can be expressed in Escherichia coli using genetic recombination technology. This protein nanoparticle not only shows a very high thermal stability, but also has an amino terminal of the alpha protein and a terminal carboxyl terminal and a carboxyl terminal of the beta protein. Therefore, when an exogenous protein is fused and expressed in each part, There is a feature that appears on the surface of nanoparticles.
이에 제한되는 것은 아니나, tPTS는 일 말단에 표적 지향성 펩타이드가 결합될 수 있다. 표적 지향성 펩타이드를 표면에 표출하는 단백질 나노입자로 자기조립된 후 화학적 공정을 통해 형광물질을 표면에 결합시킴으로써 형광 단백질 나노입자가 제조되는 것이다.But are not limited to, tPTS can be conjugated to a targeting peptide at one end. The fluorescent protein nanoparticles are produced by self-assembling the target-oriented peptide with protein nanoparticles that expose the surface and then bonding the fluorescent material to the surface through a chemical process.
상기 자기조립성 단백질로, 대장균 유래의 DNA 결합 단백질(이하 'eDPS'라 함)을 사용할 수 있다. eDPS는 12개의 동일한 단량체의 자기조립에 의해 8-10 nm의 구형 단백질 나노입자를 이룬다. 유전자 재조합 기술을 이용하여 대장균에서 대량 발현이 가능하며, 이의 아미노 말단과 카르복실 말단이 표면으로 표출되어 있어 외래 단백질의 표출을 위한 융합 발현이 가능하다.As the self-assembling protein, a DNA binding protein (hereinafter referred to as eDPS) derived from E. coli can be used. eDPS forms spherical protein nanoparticles of 8-10 nm by self-assembly of 12 identical monomers. It is possible to express a large amount in Escherichia coli by using recombinant DNA technology. Its amino terminal and carboxyl terminal are expressed on the surface, and fusion expression for expression of foreign protein is possible.
이에 제한되는 것은 아니나, eDPS는 일 말단에 표적 지향성 펩타이드가 결합될 수 있다. 표적 지향성 펩타이드를 표면에 표출하는 단백질 나노입자로 자기조립된 후 화학적 공정을 통해 형광물질을 표면에 결합시킴으로써 형광 단백질 나노입자가 제조되는 것이다.But are not limited to, eDPS may be conjugated to a target-directed peptide at one end. The fluorescent protein nanoparticles are produced by self-assembling the target-oriented peptide with protein nanoparticles that expose the surface and then bonding the fluorescent material to the surface through a chemical process.
상기 자기조립성 단백질은 형광단백질 또는 표적 지향성 펩타이드와 링커 펩타이드를 통해 융합될 수 있다.The self-assembling protein may be fused via a linker peptide with a fluorescent protein or target-directed peptide.
상기 링커 펩타이드는 자기조립성 단백질과 외래 단백질 간의 간격을 만들어 주는데, 자기조립성 단백질과 형광단백질 사이에 링커 펩타이드를 연결할 경우, 일반적으로 형광물질들이 1 내지 10 nm 이내로 서로 위치할 형광의 퀀칭 현상이 나타나는 것으로 알려져 있고, 링커 펩타이드는 형광단백질 간의 공간을 넓혀줌으로써 이러한 형광 ?칭을 억제하고 형광의 강도를 증가시키는 효과를 제공할 수 있다. 따라서, 링커 펩타이드는 형광단백질 간의 적절한 공간을 확보해 줄 수 있는 길이를 가질 수 있다. 예컨대, 링커 펩타이드의 길이는 형광단백질의 종류 및 크기에 따라 달라질 수 있을 것이다. 예를 들어 링커 펩타이드는 5 내지 20개, 예컨대, 5 내지 15개의 아미노산으로 이루어진 펩타이드일 수 있다. When linker peptides are linked between a self-assembling protein and a fluorescent protein, the linker peptide generally generates a fluorescence quenching phenomenon where fluorescent substances are positioned within 1 to 10 nm And linker peptides can increase the intensity of fluorescence by suppressing such fluorescence by broadening the space between fluorescent proteins. Thus, the linker peptide may have a length sufficient to ensure adequate space between fluorescent proteins. For example, the length of the linker peptide may vary depending on the type and size of the fluorescent protein. For example, the linker peptide may be a peptide consisting of 5 to 20, such as 5 to 15 amino acids.
본 발명의 한 구체예에서, 링커 펩타이드는 글라이신을 포함하는 것일 수 있다. 이에 제한되는 것은 아니나, 본 발명의 링커 펩타이드는 예를 들어, SEQ ID NO: 35 내지 39에 기재된 아미노산 서열 중 어느 하나로 표시될 수 있다. In one embodiment of the invention, the linker peptide may be one comprising glycine. The linker peptide of the present invention can be represented, for example, by any one of the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 35 to 39, though it is not limited thereto.
또한, 본 발명의 형광 단백질 나노입자는 자기조립성 단백질에 형광단백질을 연결하는 대신 형광물질을 표면 고정시켜 사용할 수 있다. 상술한 자기조립성 단백질은 모두 아미노산의 작용기가 표면에 표출되어 있으므로, 유전자 재조합 기술에 의한 외래 단백질의 표면 표출뿐 아니라 화학적 반응을 통한 기능성 소재의 표면 고정화가 가능하다. 따라서, 자기조립성 단백질의 자기조립 후 화학적 공정을 통해 형광물질을 표면에 고정할 수 있다.In addition, the fluorescent protein nanoparticles of the present invention can be used by immobilizing a fluorescent substance on a surface instead of connecting a fluorescent protein to a self-assembling protein. Since the above-mentioned self-assembling proteins all have amino acid functional groups expressed on the surface, it is possible to immobilize the surface of the functional material by chemical reaction as well as surface expression of the foreign protein by the gene recombination technique. Thus, the fluorescent material can be fixed to the surface through chemical processing after self-assembly of self-assembling proteins.
이러한 형광물질로, 플루오레신(fluorescein), 보디피(BODYPY), ATTO Dyes, 로다민(Rhodamine), 헵타메틴(Heptamethine), DyLight Fluor, 알렉사(Alexa), 시아닌(Cyanine) 또는 알로피코시아닌(allopicocyanine) 등을 사용할 수 있으나, 이에 특별히 제한하는 것은 아니다.Such fluorescent materials include fluorescein, BODYPY, ATTO Dyes, Rhodamine, Heptamethine, DyLight Fluor, Alexa, Cyanine or Alopicosyl (allopicocyanine) or the like can be used, but it is not particularly limited.
또한, 본 발명의 형광 단백질 나노입자에 사용할 수 있는 형광단백질은 녹색형광단백질(GFP), 변형된 녹색형광단백질(modified green fluorescent protein), 증강된 녹색형광단백질(enhanced green fluorescent protein; EGFP), 적색형광단백질(RFP, DSRed), 증강된 적색형광단백질(ERFP), 청색형광단백질(BFP), 증강된 청색형광단백질(EBFP), 황색형광단백질(YFP), 증강된 황색형광단백질(EYFP), 남색형광단백질(CFP), 증강된 남색형광단백질(ECFP) 등을 사용할 수 있다. 보다 구체적으로는, 증강된 녹색형광단백질 또는 적색형광단백질일 수 있다.Fluorescent proteins that can be used for the fluorescent protein nanoparticles of the present invention include a green fluorescent protein (GFP), a modified green fluorescent protein, an enhanced green fluorescent protein (EGFP) (RFP, DSRed), Enhanced Red Fluorescent Protein (ERFP), Blue Fluorescent Protein (BFP), Enhanced Blue Fluorescent Protein (EBFP), Yellow Fluorescent Protein (YFP), Enhanced Yellow Fluorescent Protein Fluorescent protein (CFP), enhanced blue fluorescent protein (ECFP) and the like can be used. More specifically, it may be an enhanced green fluorescent protein or a red fluorescent protein.
한편, 본 명세서에서, 용어 "표적 지향성 펩타이드"는 본 발명에 따른 형광 단백질 나노입자에 표적 지향성을 부여할 수 있는 펩타이드를 의미한다. 생체 이미징 소재 개발에 있어서, 표적 특이적으로 타겟팅을 가능하게 하기 위하여 표적 지향성 펩타이드를 나노입자의 표면에 고정하는 기술이 활발히 연구되고 있다. 하지만 기존 무기, 고분자 기반 나노입자의 경우 화학적 결합을 통해 형광물질을 표면 수식화하므로, 동시에 표적 지향성 펩타이드를 표면에 수식화하는데 어려움이 있으며 형광물질과 표적 지향성 펩타이드의 표출 빈도를 조절하는데 어려움이 있다. 반면 본 발명에서는 유전공학적 기법을 이용하여 추가 화학적 공정 없이 표적 지향성 펩타이드와 형광단백질을 동시에 표출하는 단백질 나노입자를 제조하거나, 표적 지향성 펩타이드를 표출하는 단백질 나노입자의 표면 아민기와 형광물질의 결합을 통해 형광 단백질 나노입자를 제조할 수 있으며, 표적 지향성 펩타이드의 표면 표출 빈도 및 표출 위치를 조절할 수 있는 장점이 있다. In the present specification, the term "target-directed peptide" means a peptide capable of imparting target-directed properties to the fluorescent protein nanoparticles according to the present invention. In the development of biomedical imaging materials, techniques for immobilizing target-oriented peptides on the surface of nanoparticles have been actively studied in order to enable target-specific targeting. However, in the case of conventional inorganic and polymer-based nanoparticles, it is difficult to formulate the target-oriented peptide on the surface because the fluorescent substance is surface-modified through chemical bonding, and it is difficult to control the expression frequency of the fluorescent substance and the target-oriented peptide. In contrast, in the present invention, it is possible to produce protein nanoparticles that simultaneously express a target-oriented peptide and a fluorescent protein using a genetic engineering technique without additional chemical processing, or to combine the surface amine groups of the protein nanoparticles expressing the target- Fluorescent protein nanoparticles can be prepared, and the surface expression frequency and expression position of the target-oriented peptide can be controlled.
본 발명에 따른 표적 지향성 펩타이드는 형광 단백질 나노입자의 표면에 표출되어 있다. 따라서, 인 비보 이미징에 적용시 본 발명에 따른 형광 단백질 나노입자를 특정 타겟 부위에 전달해 주는 역할을 충실히 수행한다. The target-directed peptide according to the present invention is expressed on the surface of the fluorescent protein nanoparticles. Accordingly, when the present invention is applied to in vivo imaging, the fluorescent protein nanoparticles according to the present invention are faithfully delivered to a specific target site.
본 발명에 있어서, 형광단백질, 자기조립성 단백질 및 표적 지향성 펩타이드가 융합된 단백질; 또는 자기조립성 단백질과 표적 지향성 펩타이가 융합된 단백질은 하나의 발현 벡터를 통해 발현된다.In the present invention, a protein fused with a fluorescent protein, self-assembling protein and target-oriented peptide; Or proteins into which a self-assembling protein and a target-directed peptide are fused are expressed through an expression vector.
따라서, 표적 지향성 펩타이드는 상기 발현 벡터에 쉽게 삽입 가능하면서, 본 발명에 따른 형광 단백질 나노입자의 형광 강도 및 나노입자의 구조에 영향을 미치지 않는 것이라면 펩타이드 서열의 길이와 관계없이 어떠한 것이든 사용할 수 있다. 특히 특정 질환 조직 및 세포에서 특이적으로 과발현되는 수용체에 실제 호르몬과 유사하게 대신 결합하여 신호 전달을 억제한다고 알려진 다수 펩타이드 형태의 수용체 길항근(receptor antagonist); 소마토스타틴(somatostatins), 어피바디(affibody), 봄베신(bombesin), 콜레시스토키닌(cholecystokinin) 또는 가스트린 유사체(gastrin analog) 등의 펩타이드 호르몬 등으로 대체 가능하다. Therefore, the target-oriented peptide can be easily inserted into the expression vector, and any of the peptide sequences can be used regardless of the length of the peptide sequence, as long as it does not affect the fluorescence intensity of the fluorescent protein nanoparticle according to the present invention and the structure of the nanoparticle . A receptor antagonist in the form of a plurality of peptides known to inhibit signal transduction by binding specifically to receptors specifically overexpressed in certain disease tissues and cells, similar to the real hormones; Peptide hormones such as somatostatins, affibodies, bombesin, cholecystokinin or gastrin analogs, and the like.
본 발명의 일 구체예에서, 표적 지향성 펩타이드는 RGD(Arginine-Glycine-Aspartic acid) 펩타이드일 수 있다. 암세포는 정상 세포에 비해 빠른 성장을 위해서 주변에 새로운 혈관 생성을 촉진하기 위한 수용체를 표출하고 있다고 알려져 있다. 특히 인테그린(integrin) αvβ3 수용체는 혈관생성(angiogenesis)에 결정적인 역할을 한다고 알려져 있으며 기존 연구를 통해 RGD(Arginine-Glycine-Aspartic acid) 서열을 가지는 특정 펩타이드와 결합한다고 알려져 있다. 이에 본 발명에서는 암세포 특이적 타겟팅을 목적으로 RGD 서열을 표면 표출하는 형광 단백질 나노입자를 제조하여 암특이적 타겟팅과 이미징이 동시에 가능하도록 하였다. In one embodiment of the invention, the target-directed peptide may be an Arginine-Glycine-Aspartic acid (RGD) peptide. Cancer cells are known to express receptors to promote new blood vessel formation in the periphery for faster growth than normal cells. In particular, integrin αvβ3 receptors are known to play a crucial role in angiogenesis and are known to bind specific peptides having an Arginine-Glycine-Aspartic acid (RGD) sequence. Thus, in the present invention, fluorescent protein nanoparticles that express RGD sequence on the surface for cancer cell-specific targeting are prepared to allow cancer-specific targeting and imaging simultaneously.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 본 발명의 표적 지향성 펩타이드가 표출된 형광 단백질 나노입자는 암세포에 특이적으로 업테이크되며, 인 비보 이미징에 적용하기 위해, 인테그린 수용체 발현 빈도가 높은 U87MG 암세포를 누드 마우스에 주사하여 암을 신장시킨 동물 모델에서 2시간 이후에도 암에서 형광이 측정되었다. 또한 상대적으로 인테그린 수용체 발현 빈도가 낮은 SCC7 암세포, 인테그린 수용체 발현 빈도가 높은 U87MG 암세포를 각각 준비하여 누드 마우스에 주사하여 암을 신장시킨 동물 모델에 형광 단백질 나노입자 및 형광단백질 단량체를 정맥 주사한 후 각 조직에 남아있는 형광을 측정한 결과, SCC7, U87MG 암 모델 모두 형광 단백질 단량체는 RGD 펩타이드가 있음에도 신장을 통해 체내에서 제거되나, 본 발명에 따른 표적 지향성 펩타이드가 표출된 형광 단백질 나노입자는 상대적으로 간에 주로 축적됨을 확인하였다. 이는 단백질 나노입자 기반의 형광 나노입자는 단량체에 비해 구조적 안정성이 향상되고, 체내 순환률이 향상됨을 보여주며, 형광단백질 단량체에 비해 인 비보 이미징에 적합한 소재임을 보여준다. 또한 암세포 특이적 펩타이드를 표출하는 형광 단백질 나노입자는 암세포에 특이적으로 타겟팅이 가능하며, 동시에 높은 형광 세기를 통해 이미징이 가능함을 보여준다.According to one embodiment of the present invention, the fluorescent protein nanoparticle expressed by the target-oriented peptide of the present invention is specifically up-regulated in cancer cells. For application to in vivo imaging, U87MG cancer cells having a high frequency of integrin receptor expression are nude In an animal model in which the mouse was injected and the cancer was extended, fluorescence was measured in the cancer even after 2 hours. In addition, SCC7 cancer cells with relatively low integrin receptor expression frequencies and U87MG cancer cells with high frequency of integrin receptor expression were prepared, and fluorescent protein nanoparticles and fluorescent protein monomers were intravenously injected into an animal model in which nude mice were injected into nude mice. As a result of measuring fluorescence remaining in the tissues, the fluorescent protein monomers in the SCC7 and U87MG cancer models were removed from the body through the kidneys in spite of the presence of the RGD peptide. However, the fluorescent protein nanoparticles expressed with the target- Mainly accumulation. This shows that the fluorescent nanoparticles based on protein nanoparticles have improved structural stability and improved circulation rate in comparison with monomers, and are more suitable for in vivo imaging than fluorescent protein monomers. In addition, fluorescent protein nanoparticles expressing cancer cell-specific peptides can be specifically targeted to cancer cells, and at the same time, can be imaged through high fluorescence intensity.
상술한 바와 같이, 본 발명에 따른 표적 지향성 펩타이드가 표출된 형광 단백질 나노입자는 높은 형광강도, 우수한 생체 안정성, 다양한 표면 수식화를 토대로 표적 타겟팅과 이미징이 가능하며, 그 효용성이 검증되었다.As described above, the target protein and the fluorescent protein nanoparticle of the present invention can be targeted and imaged based on high fluorescence intensity, excellent biostability, and various surface formulations, and its effectiveness has been verified.
따라서, 본 발명은 또한 본 발명에 따른 형광 단백질 나노입자; 및Accordingly, the present invention also relates to fluorescent protein nanoparticles according to the present invention; And
약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 표적 지향형 조영제 조성물을 제공한다. The present invention provides a target-oriented contrast agent composition comprising a pharmaceutically acceptable carrier.
본 발명의 형광 단백질 나노입자는 표적 지향성 펩타이드가 결합되어 있어 특정 세포나 조직에서 표적 지향이 가능하므로 자기공명 및 광학영상장치를 등을 통해 표적 부위의 이미징이 가능한 조영제로 사용할 수 있다.The fluorescent protein nanoparticles of the present invention can be targeted to specific cells or tissues due to binding of target-oriented peptides, and thus can be used as a contrast agent capable of imaging a target site through magnetic resonance and an optical imaging device.
상기 약제학적으로 허용가능한 담체는 의약 분야에서 통상 사용되는 담체 및 비히클을 포함하며, 구체적으로 이온 교환 수지, 알루미나, 알루미늄 스테아레이트, 레시틴, 혈청 단백질(예, 사람 혈청 알부민), 완충 물질(예, 각종 인산염, 글리신, 소르브산, 칼륨 소르베이트, 포화 식물성 지방산의 부분적인 글리세라이드 혼합물), 물, 염 또는 전해질(예, 프로타민 설페이트, 인산수소이나트륨, 인산수소캄륨, 염화나트륨 및 아연 염), 교질성 실리카, 마그네슘 트리실리케이트, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로즈계 기질, 폴리에틸렌 글리콜, 나트륨 카르복시메틸셀룰로즈, 폴리아릴레이트, 왁스, 폴리에틸렌 글리콜 또는 양모지 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 또한, 본 발명의 조영제 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 유화제, 현탁제, 또는 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. Such pharmaceutically acceptable carriers include carriers and vehicles commonly used in the medical field and specifically include ion exchange resins, alumina, aluminum stearate, lecithin, serum proteins (e.g., human serum albumin), buffer substances Water, salts or electrolytes (e.g., protamine sulfate, disodium hydrogen phosphate, potassium hydrogen phosphate, sodium chloride and zinc salts), colloidal silicon dioxide But are not limited to, silica, magnesium trisilicate, polyvinylpyrrolidone, cellulose based substrate, polyethylene glycol, sodium carboxymethylcellulose, polyarylate, wax, polyethylene glycol or wool. In addition, the contrast agent composition of the present invention may further include a lubricant, a wetting agent, an emulsifier, a suspending agent, or a preservative in addition to the above components.
한 양태로서, 본 발명에 따른 조영제 조성물은 비경구 투여를 위한 수용성 용액으로 제조할 수 있으며, 바람직하게는 한스 용액(Hank's solution), 링거 용액(Ringer's solution) 또는 물리적으로 완충된 염수와 같은 완충 용액을 사용할 수 있다. 수용성 주입(injection) 현탁액은 소디움 카르복시메틸셀룰로즈, 솔비톨 또는 덱스트란과 같이 현탁액의 점도를 증가시킬 수 있는 기질을 첨가할 수 있다. In one embodiment, the contrast agent composition according to the present invention may be prepared as an aqueous solution for parenteral administration, preferably a buffer solution such as Hank's solution, Ringer's solution or physically buffered saline solution Can be used. Aqueous injection suspensions may contain a substrate capable of increasing the viscosity of the suspension, such as sodium carboxymethyl cellulose, sorbitol or dextran.
본 발명의 조영제 조성물의 다른 바람직한 양태는 멸균 주사용 수성 또는 유성 현탁액의 멸균 주사용 제제의 형태일 수 있다. 이러한 현탁액은 적합한 분산제 또는 습윤제(예를 들면 트윈 80) 및 현탁화제를 사용하여 본 분야에 공지된 기술에 따라 제형화할 수 있다. Another preferred embodiment of the contrast agent composition of the present invention may be in the form of a sterile injectable preparation of a sterile injectable aqueous or oleaginous suspension. Such suspensions may be formulated according to techniques known in the art using suitable dispersing or wetting agents (e. G., Tween 80) and suspending agents.
또한, 상기 멸균 주사용 제제는 무독성의 비경구적으로 허용되는 희석제 또는 용매 중의 멸균 주사 용액 또는 현탁액(예를 들면 1,3-부탄디올 중의 용액)일 수 있다. 사용될 수 있는 비히클 및 용매로는 만니톨, 물, 링거 용액 및 등장성 염화나트륨 용액이 있다. 또한, 멸균 비휘발성 오일이 통상적으로 용매 또는 현탁화 매질로서 사용된다. 이러한 목적을 위해 합성 모노 또는 디글리세라이드를 포함하여 자극성이 적은 비휘발성 오일은 그 어느 것도 사용할 수 있다.The sterile injectable preparation may also be a sterile injectable solution or suspension in a non-toxic parenterally acceptable diluent or solvent (for example, a solution in 1,3-butanediol). Vehicles and solvents that may be used include mannitol, water, Ringer's solution and isotonic sodium chloride solution. In addition, sterile, nonvolatile oils are conventionally used as a solvent or suspending medium. For this purpose, any non-volatile oil including synthetic mono or diglycerides and less irritant may be used.
본 발명의 조영제 조성물은 진단 대상에서 분리한 조직 또는 세포에 투여하여 형광 단백질 나노입자가 발산하는 신호를 감지하여 영상을 수득하는데 이용될 수 있다. 상기 형광 단백질 나노입자에 의해 발산되는 신호를 감지하기 위해서는 자기공명영상장치(MRI)와 광학 이미징의 이용이 바람직하다. The contrast agent composition of the present invention can be used to obtain images by sensing signals emitted by fluorescent protein nanoparticles by administering them to tissues or cells isolated from a subject to be diagnosed. It is preferable to use magnetic resonance imaging (MRI) and optical imaging to sense signals emitted by the fluorescent protein nanoparticles.
자기공명영상장치는 강력한 자기장 속에 생체를 넣고 특정 주파수의 전파를 조사하여 생체조직에 있는 수소 등의 원자핵에 에너지를 흡수시켜 에너지가 높은 상태로 만든 후, 상기 전파를 중단하여 상기 수소 등의 원자핵 에너지가 방출되게 하고 이 에너지를 신호로 변환하여 컴퓨터로 처리하여 영상화한 장치이다. 자기 또는 전파는 골에 방해를 받지 않기 때문에 단단한 골 주위 또는 뇌나 골수의 종양에 대하여 종단, 횡단, 임의의 각도에서 선명한 입체적인 단층상을 얻을 수 있다. 특히 상기 자기공명영상장치는 T2 스핀-스핀 이완 자기공명영상장치인 것이 바람직하다.
A magnetic resonance imaging apparatus puts a living body in a strong magnetic field and irradiates a radio wave of a specific frequency to absorb energy into an atomic nucleus such as hydrogen in a biological tissue to make the state high in energy, And the energy is converted into a signal, processed by a computer, and imaged. Since the magnetic or radio waves are not disturbed by the bone, a sharp three-dimensional tomographic image can be obtained at the end, transverse, or any angle with respect to the hard bone around or the brain or the bone marrow. In particular, the magnetic resonance imaging apparatus is preferably a T2 spin-spin relaxation magnetic resonance imaging apparatus.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 형광 단백질 나노입자; 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 동시 진단 또는 치료용 조영제 조성물에 관한 것이다. The present invention also relates to fluorescent protein nanoparticles according to the present invention; ≪ / RTI > and a pharmaceutically acceptable carrier.
본 발명의 형광 단백질 나노입자는 약제학적 활성성분과 물리 화학적으로 결합하여 표적 지향성 펩타이드가 타겟팅하는 세포 또는 조직에서 형광을 나타낼 수 있어 자기공명 및 광학영상장치 등을 통해 생체 분자의 분리, 진단 또는 치료 등의 나노 프로브 및 약물 또는 유전자 전달체(delivery vehicle)등에 이용할 수 있다. The fluorescent protein nanoparticles of the present invention can physically and chemically bind to a pharmaceutical active ingredient to exhibit fluorescence in cells or tissues targeted by the target-directed peptide, and can be used for the separation, diagnosis, or treatment of biomolecules through magnetic resonance and optical imaging devices And a drug or a gene delivery vehicle.
상기 형광 단백질 나노입자를 이용한 생체 진단의 한 대표적인 예로서 분자 자기공명영상 진단 또는 자기 이완 센서(magnetic relaxation sensor)를 들 수 있다. 형광 단백질 나노입자는 그 크기가 커짐에 따라 더 큰 T2 조영효과를 나타내는데, 이러한 성질을 이용하면 생체 분자를 검출하는 센서로 사용될 수 있다. 즉, 특정한 생체 분자가 형광 단백질 나노입자의 엉김을 유도하게 되면 이에 의해 T2 자기 공명 영상 효과가 증대된다. 이러한 차이를 이용하여 생체 분자를 검출한다.Molecular magnetic resonance imaging or a magnetic relaxation sensor is a typical example of the biomedical diagnosis using the fluorescent protein nanoparticles. Fluorescent protein nanoparticles exhibit a larger T2 contrast as their size increases. Using these properties can be used as a sensor to detect biomolecules. That is, when a specific biomolecule induces aggregation of fluorescent protein nanoparticles, the T2 magnetic resonance imaging effect is enhanced. Biomolecules are detected using these differences.
또한, 본 발명의 형광 단백질 나노입자는 종양과 관련된 다양한 질병, 예를 들어 편평상피세포암, 자궁암, 자궁경부암, 전립선암, 두경부암, 췌장암, 뇌종양, 유방암, 간암, 피부암, 식도암, 고환암, 신장암, 대장암, 직장암, 위암, 신장암, 방광암, 난소암, 담관암, 담낭암을 진단 및/또는 치료하는데 이용될 수 있다. 또한, 류마티스 관절염, 골관절염과 같은 염증성 질환과, 치매, 뇌졸중 등을 포함하는 난치성 질환에서 영상화하는 방법에 이용될 수 있다. 보다 구체적으로 설명하면, 종양 세포는 정상 세포에서는 거의 또는 전혀 생산되지 않는 특정 물질을 발현 및/또는 분비하는데 이들을 일반적으로 "종양 마커(tumor marker)"라고 명명한다. 그러한 종양 마커와 특이적으로 결합할 수 있는 물질을 상기 형광 단백질 나노입자에 결합시켜 만든 형광 단백질 나노입자는 종양 진단에 유용하게 이용될 수 있다. 당업계에는 다양한 종양 마커뿐만 아니라 이들과 특이적으로 결합할 수 있는 물질이 공지되어 있다. 본 발명에서는 표적 지향성 펩타이드로 종양 마커와 특이적으로 결합할 수 있는 펩타이드를 사용함으로써 종양 진단에 이용될 수 있다. In addition, the fluorescent protein nanoparticles of the present invention can be used for various diseases related to tumors such as squamous cell carcinoma, uterine cancer, cervical cancer, prostate cancer, head and neck cancer, pancreatic cancer, brain tumor, breast cancer, liver cancer, Cancer, colon cancer, rectal cancer, stomach cancer, kidney cancer, bladder cancer, ovarian cancer, cholangiocarcinoma and gallbladder cancer. In addition, it can be used for imaging in inflammatory diseases such as rheumatoid arthritis and osteoarthritis, and in refractory diseases including dementia, stroke and the like. More specifically, tumor cells express and / or secrete specific substances that are produced in normal cells with little or no production, and these are generally referred to as "tumor markers ". Fluorescent protein nanoparticles made by binding a substance capable of specifically binding to such a tumor marker to the fluorescent protein nanoparticles can be usefully used for tumor diagnosis. There are a variety of tumor markers in the art as well as materials that are capable of specifically binding to them. In the present invention, a peptide capable of specifically binding to a tumor marker with a target-directed peptide can be used for tumor diagnosis.
상기 종양 마커는 작용 기작에 따라 리간드, 항원, 수용체, 및 이들을 코딩하는 핵산으로 분류할 수 있다. 종양 마커가 "리간드"인 경우에는 상기 리간드와 특이적으로 결합하는 수용체 또는 항체를 표적 지향성 펩타이드로 사용할 수 있고, 수용체의 예로는 시냅토타그민의 C2(synaptotagmin의 C2)와 포스파티딜세린, 아넥신 V(annexin V)와 포스파티딜세린, 인테그린(integrin)과 이의 수용체, VEGF(Vascular Endothelial Growth Factor)와 이의 수용체, 안지오포이에틴(angiopoietin)과 Tie2 수용체, 소마토스타틴(somatostatin)과 이의 수용체, 바소인테스티날 펩타이드(vasointestinal peptide)와 이의 수용체 등이 있지만 이에 제한되는 것은 아니다.
The tumor markers can be classified into ligands, antigens, receptors, and nucleic acids encoding them depending on the action mechanism. When the tumor marker is a "ligand ", a receptor or an antibody that specifically binds to the ligand can be used as a target-directed peptide. Examples of the receptor include C2 of synaptotagmin (C2 of synaptotagmin) and phosphatidylserine, (Annexin V), phosphatidylserine, integrin and its receptor, VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor) and its receptor, angiopoietin and Tie2 receptor, somatostatin and its receptor, Vasoin testin But are not limited to, peptides (vasointestinal peptides) and receptors thereof.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 형광 단백질 나노입자; 및 진단 프로브를 포함하고, 상기 진단 프로브는 영상 판독을 위한 표지 물질인 다중 진단 프로브에 관한 것이다. The present invention also relates to fluorescent protein nanoparticles according to the present invention; And a diagnostic probe, wherein the diagnostic probe is a labeling substance for image reading.
상기 진단 프로브는 T1 자기공명 영상 진단 프로브, 광학 진단 프로브, CT 진단 프로브, 또는 방사선 동위원소 등을 사용할 수 있다. The diagnostic probe may be a T1 magnetic resonance imaging probe, an optical diagnostic probe, a CT diagnostic probe, or a radioactive isotope.
상기 다중 진단 프로브는 예를 들면, 단백질 나노입자에 T1 자기공명 영상 진단 프로브를 결합시키면 T2 자기공명영상 및 T1 자기공명영상 진단을 동시에 진행할 수 있고, 광학 진단 프로브를 결합시키면 자기공명 영상과 광학 이미징을 동시에 할 수 있으며, CT 진단 프로브를 결합시키면 자기공명영상과 CT 진단을 동시에 할 수 있다. 또한 방사선 동위원소와 결합시키면 자기공명영상과 PET, SPECT 진단을 동시에 할 수 있다. The multiple diagnostic probes can, for example, combine a T1 magnetic resonance imaging probe with a protein nanoparticle to simultaneously perform T2 magnetic resonance imaging and T1 magnetic resonance imaging, and when combined with an optical diagnostic probe, Can be performed simultaneously. Combining the CT diagnostic probe can simultaneously perform magnetic resonance imaging and CT diagnosis. In addition, when combined with radioisotope, MRI, PET, and SPECT can be performed simultaneously.
상기 T1 자기공명 영상 진단 프로브로는 Gd 화합물, 또는 Mn 화합물 등을 포함하며, 광학 진단 프로브로는 유기 형광 염료(dye), 양자점, 또는 염료 표지(dye labelled) 무기 지지체(예 SiO2, Al2O3))를 포함하며, CT 진단 프로브로는 I(요오드) 화합물, 또는 금 나노 입자를 포함하고, 방사선 동위원소로는 In, Tc, 또는 F 등을 포함한다.
The T1 magnetic resonance imaging probe includes a Gd compound or a Mn compound and the optical diagnostic probe includes an organic fluorescent dye, a quantum dot, or a dye-labeled inorganic support such as SiO 2 , Al 2 O 3 )). CT diagnostic probes include I (iodine) compounds or gold nanoparticles, and the radioisotopes include In, Tc, or F, and the like.
본 발명은 또한 자기조립성 단백질에 형광물질이 결합된 10 내지 50 nm 크기의 형광 단백질 나노입자; 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하고, 상기 형광 단백질 나노입자는 B형 간염 바이러스 코어 단백질, 페리틴 중쇄 단백질(Ferritin Heavy chain), 써모플라즘 애시도필룸(Thermoplasm acidophilum) 유래의 프로테아좀(tPTS) 또는 대장균 유래의 DNA 결합 단백질(eDPS)을 포함하는 자기조립성 단백질로부터 자기조립된 단백질 나노입자에 형광물질을 표면 결합시켜 제조된 것인, 생체 이미징용 조성물에 관한 것이다.The present invention also relates to fluorescent protein nanoparticles of 10 to 50 nm in size, to which a fluorescent substance is bound to a self-assembling protein; And a pharmaceutically acceptable carrier, wherein the fluorescent protein nanoparticle is selected from the group consisting of a hepatitis B virus core protein, a ferritin heavy chain protein, a thermoplasm A composition for bioimaging, which is prepared by surface-binding a fluorescent substance to protein nanoparticles self-assembled from self-assembling proteins comprising proteasome (tPTS) derived from acidophilum or DNA binding protein (eDPS) derived from E. coli .
표적 지향성 펩타이드를 표면 표출하지 않은 본 발명의 형광 단백질 나노입자는 그 자체의 크기와 구조의 특성만으로 특정 조직이나 질환을 타겟팅할 수 있다. 예컨대, 형광 단백질 나노입자를 이용하여 감시림프절 (Sentinel lymphnode) 이미징에 적용할 수 있다. The fluorescent protein nanoparticles of the present invention, which are not surface expressed on the target-directed peptide, can be targeted to specific tissues or diseases only by their size and structure. For example, fluorescence protein nanoparticles can be used for imaging of sentinel lymph nodes.
감시림프절 생검은 유방암이나 흑색종 등의 암의 전이 여부를 판단하는데 널리 사용되는 방법이다. 감시림프절은 고형암에서 가장 가까운 림프절을 지칭하는 용어로, 감시림프절을 적출하여 그 안에 암세포의 유무를 확인함으로써 암세포의 전이 여부를 진단한다. 이때 정확한 감시림프절을 찾아내는 것이 매우 중요한데, 림프절은 주변 조직, 특히 지방과 육안으로 구분하기 어려울 뿐 아니라, 특히 여러 림프절이 림프관을 따라 존재하므로 종양에서 가장 가까이 존재하는 감시 림프절을 구분하는데 어려움이 있다. 기존에 감시림프절을 찾는데 사용되는 이소설판블루(Isosulfan blue)는 일부 환자에서 과민성 쇼크를 유발한다고 알려져 있으며 실제 감시림프절에 머무르는 시간이 짧고 다음 림프절로 쉽게 이동하는 단점이 있다. 반면 방사성 물질 테크네티움(Technetium(Tc) 99m-labeled colloid)은 시료를 주사한 부위에서 림프절로 이동하는데 오랜 시간이 소요되는 단점이 있다. Surveillance lymph node biopsy is a widely used method for determining the metastasis of cancer, such as breast cancer or melanoma. Surveillance lymph node is the term referring to the lymph node closest to the solid tumor. The surveillance lymph node is extracted and the presence of cancer cells is checked to diagnose whether the cancer cell is metastasized. In this case, it is very important to identify the precise surveillance lymph nodes. In addition to the difficulty of distinguishing the lymph nodes from the surrounding tissues, especially the lip and the human eye, it is difficult to distinguish the surveillance lymph nodes closest to the tumor, especially because several lymph nodes are present along the lymphatic vessels. Isosulfan blue, which is used to detect surveillance lymph nodes, is known to induce hypersensitivity shock in some patients and has a disadvantage in that it takes a short time to stay in the actual surveillance lymph node and moves easily to the next lymph node. On the other hand, Technetium (Tc) 99m-labeled colloid has a disadvantage that it takes a long time to move from the injection site to the lymph node.
본 발명에서는 감시림프절 이미징에 적절하다고 알려진 10 내지 50 nm 크기의 형광 단백질 나노입자를 이용하여 감시림프절 이미징에 적용하였으며 그 효용성을 검증하였다. In the present invention, fluorescence protein nanoparticles of 10 to 50 nm size, which are known to be suitable for surveillance lymph node imaging, have been applied to surveillance lymph node imaging and its utility has been verified.
그 결과, 크기가 다른 4개의 형광 단백질 나노입자, eDPS, tPTS, FTN-h, HBVcAg 나노입자를 동물 모델의 앞발에 주사하였을 때 주사한 부위로부터 가장 가까운 림프절에 형광 단백질 나노입자가 축적되는 것을 확인하였다. 주사한 즉시 감시림프절에서 표지 신호가 특정될 뿐 아니라 1시간 이상으로 표지 신호가 유지되며 다른 림프절로 확산되지 않는 것을 통해, 형광 단백질 나노입자가 감시림프절을 타겟팅하는데 매우 효과적임을 검증하였다. 특히, tPTS 나노입자의 경우 다른 입자에 비해 가장 높은 감시림프절 타겟팅 효율을 보였으며, 이는 표적 지향성 펩타이드가 없이도 단백질 나노입자 고유의 크기나 구조적 특성이 특정 조직을 타겟팅하여 이미징하는 소재로 활용될 수 있음을 보여준다.As a result, when fluorescent protein nanoparticles, eDPS, tPTS, FTN-h and HBVcAg nanoparticles of different sizes were injected into the forefoot of an animal model, it was confirmed that fluorescent protein nanoparticles were accumulated in the lymph node nearest to the injection site Respectively. It was verified that fluorescent protein nanoparticles are very effective in targeting surveillance lymph nodes, not only because the labeling signal is identified in the surveillance lymph node immediately after injection, but also because the label signal is maintained for more than one hour and is not diffused into other lymph nodes. In particular, tPTS nanoparticles showed the highest targeting lymph node targeting efficiency as compared to other particles, which can be used as a material to target specific tissues by the size or structural characteristics inherent in protein nanoparticles without target-oriented peptide Lt; / RTI >
따라서, 표적 지향성 펩타이드를 표출하지 않으나 일정 크기나 구조적 특성을 갖는 단백질 나노입자는 감시림프절 인 비보 이미징에 적합한 소재일 수 있다. Thus, protein nanoparticles that do not display target-directed peptides but have a certain size or structural characteristics may be suitable materials for non-imaging, the surveillance lymph node.
상기 형광 단백질 나노입자는 입자 크기가 10 내지 50 nm가 되도록 자기조립성 단백질을 자기조립한 후 형광물질로 표면 수식하여 제조한 것일 수 있다. The fluorescent protein nanoparticles may be prepared by self-assembling the self-assembling protein to have a particle size of 10 to 50 nm and then surface-modifying the self-assembling protein with a fluorescent material.
상기 자기조립성 단백질로, B형 간염 바이러스 코어 단백질, 페리틴 중쇄 단백질(Ferritin Heavy chain), 써모플라즘 애시도필룸(Thermoplasm acidophilum) 유래의 프로테아좀(tPTS) 또는 대장균 유래의 DNA 결합 단백질(eDPS) 등을 사용할 수 있다.
The self-assembling protein may be a hepatitis B virus core protein, a ferritin heavy chain protein, a thermoplasm acidophilum- derived proteasome (tPTS) or E. coli-derived DNA binding protein (eDPS).
본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하고, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.
Advantages and features of the present invention and methods of achieving them will become apparent with reference to the embodiments described in detail below. The present invention may, however, be embodied in many different forms and should not be construed as being limited to the embodiments set forth herein. Rather, these embodiments are provided so that this disclosure will be thorough and complete, and will fully convey the scope of the invention to those skilled in the art. Is provided to fully convey the scope of the invention to those skilled in the art, and the invention is only defined by the scope of the claims.
<< 실시예Example 1> 1> HBVHBV 캡시드Capsid 유래 origin 키메릭Chimeric 형광 나노입자의 제조 Production of fluorescent nanoparticles
(HBV 캡시드 유래 키메릭 형광 나노입자의 생합성을 위한 발현 벡터 제조)(Preparation of expression vector for biosynthesis of chimeric fluorescent nanoparticles derived from HBV capsid)
하기 표 1에 기재된 프라이머를 사용한 PCR 후에, HBV 코어 단백질(HBVcAg) 유전자로부터 유래한 N-NdeI-HBVcAg(1-78)-XhoI-C 및 N-BamHI-HBVcAg(81-149)-HindIII-C의 합성을 코드하는 두 유전자 클론을 얻었다. 또한, 형광단백질(enhanced green fluorescent protein; eGFP 또는 red fluorescent protein; DsRed)로 HBVcAg의 P79A80를 대체하기 위하여, 4가지의 다른 클론, 5’-XhoI-hexahistidine-EGFP-BamHI-3’, 5’-XhoI-hexahistidine-DsRed-BamHI-3’와 링커 펩타이드(G3SG3TG3SG3)가 삽입된 5’-XhoI-hexahistidine-linker-eGFP-linker-BamHI-3’와 5’-XhoI-hexahistidine-linker-DsRed-linker-BamHI-3’를 PCR 또는 extention PCR을 이용하여 제조하였다. 플라즈미드 pT7-7에 상기 유전자 클론의 일련의 라이게이션을 통하여, A) N-HBVcAg(1-78)-His6-eGFP-HBVcAg(81-149)-C, B) N-HBVcAg(1-78)-His6-DsRed-HBVcAg(81-149)-C, C) N-HBVcAg(1-78)-His6-linker-eGFP-linker-HBVcAg(81-149)-C 및 D) N-HBVcAg(1-78)-His6-linker-DsRed-linker-HBVcAg(81-149)-C의 합성을 코딩하는 4개의 플라즈미드 발현 벡터 pT7-형광단백질-HBVcAg를 구축하였다(도 1). 제작된 모든 플라즈미드 발현 벡터는 젤-정제 후 완전한 DNA 시퀀싱을 통해 서열을 확인하였다. N-NdeI-HBVcAg (1-78) -XhoI-C and N-BamHI-HBVcAg (81-149) -HindIII-C (HBVcAg) derived from the HBV core protein (HBVcAg) gene after PCR using the primers shown in Table 1 Were obtained. In order to replace P79A80 of HBVcAg with an enhanced green fluorescent protein (eGFP or red fluorescent protein; DsRed), four different clones, 5'-XhoI-hexahistidine-EGFP-BamHI-3 ' XhoI-hexahistidine-linker-eGFP-linker-BamHI-3 'and 5'-XhoI-hexahistidine-linker-DsRed-linker-BamHI-3' inserted with a linker peptide (G3SG3TG3SG3) BamHI-3 'was prepared by PCR or extention PCR. HBVcAg (1-78) -His6-eGFP-HBVcAg (81-149) -C, B) N-HBVcAg (1-78) through a series of ligations of the gene clone to plasmid pT7-7. -His6-DsRed-HBVcAg (81-149) -C, C) N-HBVcAg (1-78) -His6-linker-eGFP- linker- HBVcAg 78) -His6-linker-DsRed-linker-HBVcAg (81-149). Four plasmid expression vectors pT7-fluorescent protein-HBVcAg were constructed (FIG. All plasmid expression vectors were sequenced by complete DNA sequencing after gel - purification.
HBV 캡시드 유래 키메릭 나노입자의 제조와 관련된 프라이머 서열(표 1)과 주형에 대한 정보 및 이에 대한 좀 더 상세한 기재는 아래와 같다.Information on the primer sequences (Table 1) and templates related to the production of HBV capsid-derived chimeric nanoparticles and a more detailed description of them are given below.
번호order
number
1) 첫 번째 부분은 HBV 코어 단백질의 유전자 서열(NCBI Nucleotide accession number: AF286594 서열 중 1901-2452 서열)을 주형으로 하여 제한 효소 NdeI이 포함되어 있는 프라이머 1과 XhoI을 포함하고 있는 프라이머 2를 이용하여 PCR을 진행하였다. 그 결과 5‘-NdeI-HBV 코어 단백질(아미노산 서열 1-78)-XhoI-3' 으로 이루어진 PCR 산물을 확보하였다.1)
2) 두 번째 부분은 HBV 코어 단백질의 유전자 서열을 주형으로 하여 제한 효소 BamHI이 포함되어 있는 프라이머 3과 HindIII를 포함하고 있는 프라이머 4를 이용하여 PCR 을 진행하였다. 그 결과 5‘-BamHI-HBV 코어 단백질(아미노산 서열 81-149)-HindIII-3' 으로 이루어진 PCR 산물을 확보하였다.2) In the second part, PCR was performed using
3) 세 번째 부분은 eGFP(또는 DsRed)의 염기서열을 주형으로 하여(NCBI Nucleotide accession number of eGFP: AJ566337, NCBI Nucleotide accession number of DsRed: EU827527) XhoI과 hexahistidine을 포함하고 있는 프라이머 5(또는 프라이머 7), BamHI을 포함하는 프라이머 6(또는 프라이머 8)을 이용하여 PCR을 수행하였다. 5’-XhoI-His6-eGFP-BamHI-3’제작을 위해서 프라이머 5와 6을 이용하였으며, 5’-XhoI-His6-DsRed-BamHI-3’제작을 위해서 프라이머 7과 8을 이용하였다.3) The third part consists of primer 5 (or primer) containing Xho I and hexahistidine with the nucleotide sequence of eGFP (or DsRed) as a template (NCBI Nucleotide Accession Number of eGFP: AJ566337, NCBI Nucleotide Accession Number of DsRed: 7), and primer 6 (or primer 8) containing Bam HI.
4) 네 번째 부분은 eGFP(또는 DsRed)의 염기서열을 주형으로 하여 링커서열(아미노산 서열 G3SG3TG3SG3)을 포함하고 있는 프라이머 9 및 10 (eGFP) 또는 프라이머 11 및 12 (DesRed)을 이용하여 PCR을 수행한 후, 합성된 PCR 산물을 다시 주형으로 하여 프라이머 13 및 15를 이용하여 확장 PCR을 수행하였다. 합성된 PCR 산물을 주형으로 다시 프라이머 14 및 15를 이용하여 이차 확장 PCR을 수행하였으며, 그 결과 5‘-XhoI-His6-linker (G3SG3TG3SG3)-eGFP-linker(G3SG3TG3SG3)-BamHI-3', 5‘-XhoI-His6-linker(G3SG3TG3SG3)-DsRed-linker(G3SG3TG3SG3)-BamHI-3'으로 이루어진 PCR 산물을 확보하였다.4) The fourth part is subjected to
이렇게 만들어진 6개의 PCR 산물을 순차적으로 pT7-7 벡터에 삽입하여 HBV 캡시드 유래 키메릭 형광 나노입자를 합성할 수 있는 발현 벡터를 구성하였다. 또한, 형광 단백질 나노입자의 형광 강도 개선을 위하여 형광단백질과 코어 단백질 사이에 링커를 삽입한 발현벡터를 제조하였다(도 1). Six PCR products were sequentially inserted into the pT7-7 vector to construct an expression vector capable of synthesizing chimeric fluorescent nanoparticles derived from HBV capsid. In order to improve the fluorescence intensity of the fluorescent protein nanoparticles, an expression vector in which a linker was inserted between the fluorescent protein and the core protein was prepared (FIG. 1).
본 발명에서 구축한 발현 벡터를 통해 제조하고자 하는 형광 단백질 나노입자의 모식도는 도 2와 같다.
The schematic diagram of the fluorescent protein nanoparticles to be produced through the expression vector constructed in the present invention is shown in FIG.
(HBV 캡시드 유래 키메릭 형광 나노입자의 생합성 및 분리정제)(Biosynthesis and separation and purification of chimeric fluorescent nanoparticles derived from HBV capsid)
대장균 균주 BL21(DE3)[F-ompThsdSB(rB-mB-)]를 상기 제조된 발현 벡터로 각각 형질전환하고, 앰피실린-저항성 형질전환체를 선택하였다. 형질전환된 대장균을 50 mL의 Luria-Bertani(LB) 배지(100 mg L-앰피실린 함유)를 함유하는 플라스크(250 mL Erlenmeyer flasks, 37 ℃, 150 rpm)에서 배양하였다. 배지 탁도(O.D600)가 약 0.6-0.7에 도달할 때, IPTG(Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid) (0.7 mM)를 첨가하여 재조합 유전자의 발현을 유도하였다. The E. coli strain BL21 (DE3) [F-ompThsdSB (rB-mB-)] was transformed with each of the above-prepared expression vectors, and an ampicillin-resistant transformant was selected. The transformed Escherichia coli was cultured in a flask (250 mL Erlenmeyer flasks, 37 DEG C, 150 rpm) containing 50 mL of Luria-Bertani (LB) medium (containing 100 mg L-ampicillin). When the medium turbidity (OD 600 ) reached about 0.6-0.7, IPTG (Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside) (0.7 mM) was added to induce the expression of the recombinant gene.
20 ℃에서 16~18 시간 배양 후, 배양한 대장균을 4,500 rpm으로 10분간 원심 분리하여 균체 침전물을 회수한 후 5 ㎖의 파쇄 용액(10 mM Tris-HCl 완충액, pH 7.5, 10 mM EDTA)에 현탁하여 초음파 파쇄기(Branson Ultrasonics Corp., Danbury, CT, USA)를 이용하여 파쇄하였다. 파쇄한 후 13,000 rpm으로 10분간 원심분리한 뒤 상등액과 불용성 응집체를 분리하였다. After culturing at 20 ° C for 16-18 hours, the cultured Escherichia coli was centrifuged at 4,500 rpm for 10 minutes to collect the cell precipitate, and then suspended in 5 ml of a disruption solution (10 mM Tris-HCl buffer, pH 7.5, 10 mM EDTA) And then disrupted using an ultrasonic wave crusher (Branson Ultrasonics Corp., Danbury, CT, USA). After crushing, the mixture was centrifuged at 13,000 rpm for 10 minutes to separate the supernatant and the insoluble aggregate.
분리된 상등액에 대해 자가조립된 형광단백질이 융합된 단백질 나노입자를 정제하기 위하여 3단계의 정제 과정을 거쳐 진행하였다. The purified protein nanoparticles fused with the self - assembled fluorescent protein were purified through a three - step purification process.
먼저 1) 재조합 단백질에 융합 발현된 히스티딘과 니켈의 결합을 이용한 Ni2+-NTA 친화성 크로마토그래피(Ni2 +-NTA affinity chromatography)를 진행한 후, 2) 재조합 단백질의 자가조립 효율을 향상시키기 위하여 Ultracentrifugal filter (Amicon Ultra 100K, Millipore, Billerica, MA)를 이용하여 재조합 단백질이 포함된 수용액을 조성이 다른 자가조립용 버퍼(500mM NaCl .50mM Tris-HCl pH 7.0)로 변경해 줌과 동시에 재조합 단백질을 농축하였으며, 3) 마지막으로 자가조립된 단백질 나노입자만을 분리하기 위하여 수크로스 구배 초고속 원심분리(sucrose gradient ultracentifugation)를 진행하였다. 각 단계별 상세한 기재는 아래와 같다.First, 1) and then proceed to the Ni 2+ -NTA affinity chromatography (Ni 2 + -NTA affinity chromatography) using a combination of a fused protein expressed in a recombinant histidine and nickel, and 2) to enhance the self-assembly efficiency of the recombinant protein (500 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 7.0) was added to the solution containing the recombinant protein using an ultracentrifugal filter (Amicon Ultra 100K, Millipore, Billerica, MA) 3) Finally, sucrose gradient ultracentrifugation was performed to separate only self-assembled protein nanoparticles. Details of each step are as follows.
1) Ni2 +-NTA 친화성 크로마토그래피1) Ni 2 + -NTA affinity chromatography
재조합 단백질을 정제하기 위하여 상기 명시된 동일한 방법으로 배양된 대장균을 회수하여 그 세포 펠렛을 5 mL 라이시스 버퍼(pH 8.0, 50 mM sodium phosphate, 300 mM NaCl, 20 mM imidazole)에 재부유하고 초음파 파쇄기를 이용하여 세포를 파쇄하였다. 파쇄된 세포액을 13,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 그 상등액만 분리한 후 각 재조합 단백질을 Ni2 +-NTA 컬럼(Qiagen, Hilden, Germany)을 사용하여 각각 분리하였다(세척 버퍼: pH 8.0, 50 mM sodium phosphate, 300 mM NaCl, 80 mM imidazole / 용출 버퍼: pH 8.0, 50 mM sodium phosphate, 300mM NaCl, 200 mM imidazole).
To purify the recombinant protein, the E. coli cultured in the same manner as described above was recovered, and the cell pellet was resuspended in 5 mL of lysis buffer (pH 8.0, 50 mM sodium phosphate, 300 mM NaCl, 20 mM imidazole) And the cells were disrupted. The disrupted cell lysate was centrifuged at 13,000 rpm for 10 minutes and the supernatant was separated. Each recombinant protein was separated using a Ni 2 + -NTA column (Qiagen, Hilden, Germany) (washing buffer: pH 8.0, 50 mM sodium phosphate, 300 mM NaCl, 80 mM imidazole / elution buffer: pH 8.0, 50 mM sodium phosphate, 300 mM NaCl, 200 mM imidazole).
2) 자가조립 촉진을 위한 버퍼 변경 및 농축2) Buffer modification and concentration to facilitate self-assembly
Ni2 +-NTA 친화성 크로마토그래피를 거쳐 용출된 3 mL의 재조합 단백질을 Ultracentrifugal filter(Amicon Ultra 100K, Millipore, Billerica, MA)에 담아 5,000 g로 10분간 원심분리한 후 컬럼 상부를 자가조립용 버퍼(500 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl pH 7.0)로 가득 채운 후 컬럼 위에 500㎕의 용액이 남을 때까지 5,000 g로 원심분리를 진행하였다. 이를 3회 반복한 후 최종 부피를 1 mL로 맞춘 후 아래 단계를 진행하였다.
3 mL of the recombinant protein eluted through Ni 2 + -NTA affinity chromatography was loaded into an Ultracentrifugal filter (Amicon Ultra 100K, Millipore, Billerica, Mass.) And centrifuged at 5,000 g for 10 minutes. (500 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl pH 7.0) and centrifuged at 5,000 g until 500 μl of solution remained on the column. After repeating this three times, the final volume was adjusted to 1 mL and the following steps were carried out.
3) 수크로스 구배 초고속 원심 분리 3) sucrose gradient ultra-high speed centrifugation
자가조립용 버퍼에 수크로스를 농도별로 각각 첨가하여 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%의 수크로스를 포함하는 용액을 각각 준비한 후 초고속 원심 분리용 튜브(ultraclear 13.2 mL tube, Beckman)에 각 농도별(60~20%) 수크로스 용액을 농도가 높은 용액부터 2 mL씩 담았다. 마지막으로 10% 수크로스 용액을 0.5 mL 담은 후 상기 준비된 자가조립용 버퍼에 존재하는 재조합 단백질 용액을 1 mL 채운 후 24,000 rpm으로 12시간 동안 20 ℃로 초고속 원심분리를 시행하였다(Ultracentrifuge L-90k, Beckman). 원심분리 후 조심스럽게 피펫을 이용하여 위 층(10~30% 수크로스 용액 부분)을 없애주고 40~60% 수크로스 용액 부분을 2)에 명시된 바와 같이 ultracentrifugal filter와 자가조립용 버퍼를 이용하여 재조합 단백질의 버퍼를 교체해 주었다.
Each solution containing 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, and 10% sucrose was prepared by adding sucrose to the self-assembly buffer at each concentration. Then, ultracentrifugation tubes (ultraclear 13.2 mL tube, Beckman) containing 2 mL of the sucrose solution (60 ~ 20%) for each concentration. Finally, 0.5 mL of 10% sucrose solution was added, 1 mL of the recombinant protein solution in the prepared self-assembly buffer was filled, and ultracentrifugation was carried out at 20 ° C. for 12 hours at 24,000 rpm (Ultracentrifuge L-90k, Beckman). After centrifugation, carefully remove the upper layer (10 ~ 30% sucrose solution) using a pipette, and mix the 40-60% sucrose solution with an ultracentrifugal filter and self-assembly buffer as described in 2) The buffer of the protein was changed.
(HBV 캡시드 유래 키메릭 형광 나노입자의 구조 분석)(Structural Analysis of Chimeric Fluorescent Nanoparticles Derived from HBV Capsid)
상기 과정을 거친 후 정제된 재조합 단백질 나노입자의 구조 분석을 위하여 투과전자현미경(TEM)으로 재조합 단백질 나노입자를 촬영하였다. 먼저 염색하지 않은 정제한 단백질 샘플을 탄소 코팅된 구리 전자 현미경 그리드(grids)에 올린 후 자연 건조하였다. 단백질 나노입자의 염색된 이미지를 얻기 위해, 자연 건조된 샘플을 포함하는 전자 현미경 그리드를 2%(w/v) 수성 우라닐 아세테이트 용액과 함께 10분 동안 실온에서 인큐베이션하고, 증류수로 3-4회 세척하였다. After the above procedure, the recombinant protein nanoparticles were photographed with a transmission electron microscope (TEM) to analyze the structure of the purified recombinant protein nanoparticles. The unfiltered, untreated protein samples were loaded onto carbon-coated copper electron microscope grids and air-dried. To obtain a stained image of the protein nanoparticles, an electron microscope grid containing the naturally dried sample was incubated with a 2% (w / v) aqueous uranyl acetate solution for 10 minutes at room temperature and 3-4 times with distilled water And washed.
단백질 나노입자 이미지를 Philips Technai 120 kV 전자 현미경을 이용하여 관찰한 결과 형광단백질이 표면 표출된 30 내지 35 nm의 구형 나노입자가 형성된 것을 확인하였으며 그 결과는 도 3과 같다.
The protein nanoparticle image was observed using a Philips Technai 120 kV electron microscope. As a result, it was confirmed that spherical nanoparticles of 30 to 35 nm surface-expressed with fluorescent protein were formed. The results are shown in FIG.
<< 실험예Experimental Example 1> 1> HBVHBV 캡시드Capsid 유래 origin 키메릭Chimeric 형광 나노입자와 페리틴 유래 Fluorescent nanoparticles and ferritin derived 키메릭Chimeric 형광 나노입자의 형광 측정 Fluorescence measurement of fluorescent nanoparticles
상기 실시예 1에서 제조한 4개의 HBV 캡시드 유래 키메릭 형광 나노입자: The four HBV capsid-derived chimeric fluorescent nanoparticles prepared in Example 1
gFCNP(w/o linker) : N-HBVcAg(1-78)-His6-eGFP-HBVcAg(81-149)-C, (1-78) -His6-eGFP-HBVcAg (81-149) -C
rFCNP(w/o linker) : N-HBVcAg(1-78)-His6-DsRed-HBVcAg(81-149)-C, (1-78) -His6-DsRed-HBVcAg (81-149) -C-RcNP (w / o linker): N-HBVcAg
gFCNP(w/ linker): N-HBVcAg(1-78)-His6-linker-eGFP-linker-HBVcAg(81-149)-C, 및(g / l): N-HBVcAg (1-78) -His6-linker-eGFP-linker-HBVcAg (81-149) -C
rFCNP(w/ linker) : N-HBVcAg(1-78)-His6-linker-DsRed-linker-HBVcAg(81-149)-CrcfNP (w / linker): N-HBVcAg (1-78) -His6-linker-DsRed-linker-HBVcAg (81-149) -C
기존에 본 발명자가 출원한 출원번호 US13/487,921, KR2011-0128615에서 제조한 4개의 페리틴 유래 키메릭 형광 나노입자:Four ferritin-derived chimeric fluorescent nanoparticles prepared by the present inventors as filed by US13 / 487,921 and KR2011-0128615:
gFFNP(w/o linker) : N-Ferritin-eGFP-H6-C, gFFNP (w / o linker): N-Ferritin-eGFP-H6-C,
rFFNP(w/o linker) : N-Ferritin-DsRed-H6-C, rFFNP (w / o linker): N-Ferritin-DsRed-H6-C,
gFFNP(w/ linker) : N-Ferritin-linker-eGFP-H6-C, 및gFFNP (w / linker): N-Ferritin-linker-eGFP-H6-C, and
rFFNP(w/ linker) : N-Ferritin-linker-DsRed-H6-CrFFNP (w / linker): N-Ferritin-linker-DsRed-H6-C
의 형광 세기를 측정 및 나노입자당 형광 세기를 비교하기 위하여 eGFP 단량체, DsRed 단량체, 페리틴 유래 키메릭 형광 나노입자, 캡시드 유래 키메릭 형광 나노입자를 각각 준비하여 블랙 96-웰 플레이트(black 96-well plate(Nunc, Roskide, Denmark))에 1 pmole(단백질 나노입자 기준) 씩 담아 형광을 측정하였다. eGFP 단량체 및 eGFP 융합 단백질 나노입자의 형광 측정은 λex = 485 nm/λem = 535 nm로, DsRed 단량체 및 DsRed 융합 단백질 나노입자의 형광 측정은 λex = 550 nm/λem = 590 nm에서 GENios (Tecan, Austria)을 이용하여 각각 3번씩 측정하였다. DsRed monomer, ferritin-derived chimeric fluorescent nanoparticles, and capsid-derived chimeric fluorescent nanoparticles were prepared and tested in a black 96-well plate plate (Nunc, Roskide, Denmark)) containing 1 pmole (based on protein nanoparticles). Fluorescence measurement of eGFP monomer and eGFP fusion protein nanoparticles was performed at λex = 485 nm / λem = 535 nm. Fluorescence measurement of DsRed monomer and DsRed fusion protein nanoparticles was performed at a wavelength of 550 nm / λem = 590 nm by GENios (Tecan, Austria ), Respectively.
도 4에 나타난 바와 같이, 단량체나 페리틴 융합 형광단백질에 비해 HBVcAg 캡시드 융합 형광단백질이 단백질 나노입자당 표출된 형광단백질의 수의 증대로 인해 높은 형광 세기를 나타낸 것을 확인하였다. 또한 링커가 삽입된 경우 형광 세기가 증가하였는데, 이는 링커를 삽입함으로써 단백질 나노입자 표면에 고밀도로 표출된 형광 단백질 간의 ?칭(quenching) 현상이 해소되었기 때문이다. 링커를 삽입하지 않았을 때에도 형광단백질 단량체에 비해 현저히 증폭된 형광강도를 보이는 것을 확인하였으며, 링커를 삽입함으로써 최적의 형광 단백질 나노입자를 제조하였다.
As shown in FIG. 4, the fluorescence intensity of HBVcAg capsid fusion fluorescent protein was higher than that of monomer or ferritin fusion fluorescent protein due to an increase in the number of fluorescent proteins expressed per protein nanoparticle. When the linker is inserted, the fluorescence intensity is increased because the quenching phenomenon between the fluorescent proteins expressed at high density on the surface of the protein nanoparticles is solved by inserting the linker. When the linker was not inserted, it was confirmed that the fluorescence intensity was remarkably amplified as compared with that of the fluorescent protein monomer. Optimum fluorescent protein nanoparticles were prepared by inserting the linker.
<< 실험예Experimental Example 2> 인 2 > 비트로에서From bitro HBVHBV 캡시드Capsid 유래 origin 키메릭Chimeric 형광 나노입자의 안정성 검증 Stability verification of fluorescent nanoparticles
상기 실시예 1에서 제조한 형광 단백질 나노입자(gFCNP, rFCNP w/ linker)의 구조적, 기능적 안정성 유지 여부를 확인하기 위하여 eGFP, DsRed 단량체와 비교 실험을 진행하였다. eGFP, DsRed, gFCNP, rFCNP를 각각 1 nM을 최종 부피가 100 ㎕이 되도록 PBS에 준비하여 37 ℃에서 30분 간격으로 3.5시간 동안 형광 강도를 측정, 비교하였다.In order to confirm the structural and functional stability of the fluorescent protein nanoparticles (gFCNP, rFCNP w / linker) prepared in Example 1, a comparison experiment with eGFP and DsRed monomers was conducted. eGFP, DsRed, gFCNP, and rFCNP were each prepared in PBS to have a final volume of 100 μl, and the fluorescence intensity was measured at 37 ° C for 3.5 hours at intervals of 30 minutes.
또한 동일한 형광단백질을 5 nM이 되도록 30%, 50% 의 인간 혈청(Cat. No. H4522, Sigma-Aldrich) 100 ㎕에 혼합하여 30분 간격으로 상기 실험예 1의 방법대로 형광 세기 변화를 측정하였다. The same fluorescent protein was added to 100 μl of 30% and 50% human serum (Cat. No. H4522, Sigma-Aldrich) to have a concentration of 5 nM and the fluorescence intensity change was measured at intervals of 30 minutes according to the method of Experimental Example 1 .
도 5에 나타난 바와 같이, 형광단백질 단량체는 3.5시간 이후 초기 형광값의 20% 이하로 형광 세기가 감소했지만, 형광 단백질 나노입자의 경우 시간이 지나도 초기 형광값의 80% 이상이 유지되는 것을 확인하였다. As shown in FIG. 5, the fluorescence intensity of the fluorescent protein monomer decreased to 20% or less of the initial fluorescence value after 3.5 hours, but it was confirmed that 80% or more of the initial fluorescence value was maintained even after the lapse of time in the fluorescent protein nanoparticles .
또한, 도 6에 나타난 바와 같이, 형광단백질 단량체는 혈청에 혼합 후 1시간 이내에 초기 형광의 절반 이하로 형광 세기가 감소하였으나, 형광 단백질 나노입자는 5시간 동안 60% 이상의 형광 세기를 유지하는 것을 확인하였다. Also, as shown in FIG. 6, the fluorescence intensity of the fluorescent protein monomer decreased to less than half of the initial fluorescence within 1 hour after mixing with serum, but the fluorescence protein nanoparticles showed fluorescence intensity of 60% or more for 5 hours Respectively.
이는 형광단백질 단량체의 경우 혈청 내에서 안정성이 낮으므로 생체 진단에 적용하기에 제약이 있으나 형광단백질을 단백질 나노입자에 융합 발현할 경우, 안정성이 향상되어 생체 진단에 적용 가능함을 보여준다.This is because the fluorescence protein monomer has low stability in the serum and thus has a limitation to be applied to the biomedical diagnosis. However, when the fluorescent protein is fused to the protein nanoparticle, the stability is improved and it is applicable to the biomedical diagnosis.
또한 형광물질을 생체 진단에 이용하는데 제한점인 광원 노출에 대한 광안정성(photostability)을 비교하였다. 형광단백질이나 형광염료 등은 반복된 광원에 노출될 경우 광퇴색(photobleaching)에 의해 형광기능을 소실하는 단점이 있다. 형광물질을 생체 진단에 활용할 경우 시간별로, 조직별로 반복해서 형광 신호를 검출하므로 광원 노출에 대한 안정성이 보장되어야만 생체 진단에 적용가능하다. We also compared photostability for exposure to light sources, which is a limitation of using fluorescent materials for biopsy. Fluorescent proteins and fluorescent dyes are disadvantageous in that they lose fluorescence by photobleaching when exposed to repeated light sources. When a fluorescent material is used for biopsy, fluorescence signals are repeatedly detected by time and tissue, so that stability against light source exposure must be ensured so that it can be applied to biopsy.
생명공학분야에서 널리 사용되고 있는 형광 물질인 FAM과 광퇴색에 대해 안정성이 뛰어나다고 알려져 있는 퀀텀닷(FAM, Genotech, Quantum dot(Qdot655/CdSe, invitrogen)을 대조군으로 하여 형광단백질 단량체와 형광 단백질 나노입자의 초기 형광 세기를 45,000 RFU (Relatuve fluorescnce unit)가 되도록 조정 후 각 시료를 10 ㎕씩 슬라이드 글라스 위에 떨어뜨린 다음, 15분간 30초 간격으로 형광 현미경 (Olympus BX51)으로 관측하여 형광 변화를 비교하였다.(FAM, Genotech, Quantum dot (Qdot655 / CdSe, invitrogen), which is known to have excellent stability against light discoloration, is used as a control group, and a fluorescent protein monomer and a fluorescent protein nanoparticle Was adjusted to 45,000 RFU (Relatuve fluorescence unit), 10 μL of each sample was dropped on a slide glass, and fluorescence changes were compared with a fluorescence microscope (Olympus BX51) at intervals of 30 seconds for 15 minutes.
그 결과 FAM을 비롯하여 형광단백질 단량체의 경우 광원에 노출되는 횟수가 증가할수록 형광 강도가 급격히 감소하지만, 형광 단백질 나노입자의 경우 퀀텀닷과 유사하게 형광 세기가 유지되는 것을 확인하였다(도 7). As a result, fluorescence intensity of fluorescence protein nanoparticles decreased rapidly as the number of times of exposure to the light source was increased in the case of FAM and fluorescent protein monomers, but fluorescence intensity was maintained similar to that of Quantum dot in fluorescence protein nanoparticles (FIG. 7).
이는 형광단백질의 아미노 말단과 카르복실 말단이 단백질 나노입자(capsid)의 스파이크 부위에 융합됨으로써 형광단백질의 베타-베럴(beta-barrel) 구조가 온전히 유지되기 때문에 형광단백질의 형광단(fluorophore)이 광원에 노출되는 것을 방지하기 때문이다.
Since the beta-barrel structure of the fluorescent protein is completely maintained by the fusion of the amino terminal and the carboxyl terminal of the fluorescent protein to the spike site of the protein nanoparticle (capsid), the fluorophore of the fluorescent protein is separated from the light source As shown in Fig.
<< 실험예Experimental Example 3> 페리틴 유래 3> Derived from ferritin 키메릭Chimeric 형광 나노입자, Fluorescent nanoparticles, HBVHBV 캡시드Capsid 유래 origin 키메릭Chimeric 형광 나노입자의 생체 안정성 검증 Verification of biostability of fluorescent nanoparticles
형광 단백질 나노입자를 생체 진단에 적용하기 위해서는 혈청 내에서 구조적, 기능적으로 안정성을 유지해야 한다. 이를 확인하기 위하여 형광단백질 단량체와 형광 단백질 나노입자를 30%, 50% 혈청에 희석한 후 시간별로 형광 세기의 변화를 비교하였다. 이를 위해, 형광단백질 단량체와 형광 단백질 나노입자를 초기 형광 세기가 40,000 RFU가 되도록 조정하여 20 ㎕를 각각 BALB/cSlc-nude mice(female, 4wnfud, JAPAN SLC, Inc) 3 마리의 복부에 피하주사한 후 6시간 동안 피하에 남아 있는 물질의 형광 세기를 비교하였다. 복부 형광 이미지는 KODAK 12 bit CCD camera를 이용해 얻었으며 Excitation은 523-635 nm, Emission은 560-675 nm 형광 필터를 사용하였으며 최종적으로 550 nm/590nm에서 이미지를 촬영하였다. Fluorescent protein nanoparticles must be structurally and functionally stable within the serum in order to be applied to biopsy. To confirm this, fluorescent protein monomers and fluorescent protein nanoparticles were diluted in 30% and 50% serum, and the changes in fluorescence intensity were compared over time. For this, 20 μl of the fluorescent protein monomer and the fluorescent protein nanoparticles were adjusted to have an initial fluorescence intensity of 40,000 RFU and subcutaneously injected into the abdomen of three BALB / cSlc-nude mice (female, 4wnfud, JAPAN SLC, Inc) The fluorescence intensities of the remaining subcutaneous substances were compared for 6 hours. The abdominal fluorescence image was obtained using a
도 8에 나타난 바와 같이, 형광단백질 단량체는 주사 후 1.5 시간 이후 모두 형광을 소실한 반면 형광 단백질 나노입자는 6 시간 이후에도 형광을 나타내는 것을 확인하였다. As shown in FIG. 8, it was confirmed that the fluorescent protein monomer lost fluorescence after 1.5 hours from the injection, while the fluorescent protein nanoparticles showed fluorescence even after 6 hours.
이는 위에서 확인한 바와 같이 형광 단백질 나노입자는 단량체에 비해 온도, 생체 조건, 광원에 대한 구조적 안정성 유지가 가능하기 때문이다. 이는 형광 단백질 나노입자의 생체 이미징 또는 약물 전달 소재로 적합함을 입증하는 자료이다.
This is because fluorescent protein nanoparticles can maintain structural stability against temperature, living condition, and light source as compared with monomers as described above. This is data proving that it is suitable as a bioimaging or drug delivery material of fluorescent protein nanoparticles.
<< 실시예Example 2> 생체 진단용 표적 지향성 2> Target Orientation for Biopsy 펩타이드Peptides 표출 형광 단백질 나노입자의 제조 Fabrication of Expressed Fluorescent Protein Nanoparticles
형광 단백질 나노입자의 인 비보 표적 타겟팅이 가능한지 검증하기 위하여 암세포 표면의 인테그린(integrin)과 특이적으로 결합한다고 알려진 RGD 펩타이드를 표출하는 형광 단백질 나노입자를 제조하였다.Fluorescent protein nanoparticles expressing RGD peptides, which are known to specifically bind integrin on the surface of cancer cells, were prepared in order to verify the in vivo target targeting of fluorescent protein nanoparticles.
아미노 말단에 표적 지향성 펩타이드(GRGDSG3SG3SG3SG)을 포함하는 형광 단백질 나노입자를 제조하기 위하여 출원번호 US13/487,921에 기재된 클론 6을 주형으로 프라이머 서열 16 및 17을 이용하여 PCR을 시행하고 합성된 PCR 산물을 주형으로 프라이머 서열 19, 17을 이용하여 확장 PCR을 수행하였다. 마찬가지로 실시예 1에서 제조한 N-HBVcAg(1-78)-His6-linker-DsRed-linker-HBVcAg(81-149)-C를 주형으로 프라이머 18, 4를 이용하여 PCR을 시행 후 합성된 PCR 산물을 주형으로 다시 프라이머 19, 4를 이용하여 확장 PCT을 수행하였다. In order to prepare fluorescent protein nanoparticles containing the target-oriented peptide (G RGD SG3SG3SG3SG) at the amino terminus, PCR was performed using
그 결과 5‘-NdeI-GRGDSG3SG3SG3SG-FTH-linker-DsRed-H6-HindIII-3’과 5‘-NdeI-GRGDSG3SG3SG3SG-HBVcAg(1-79)-linker-DsRed-linker-HBVcAg(81-149)-HindIII-3’로 이루어진 PCR 산물을 확보하였으며 이를 pT7-7 벡터에 삽입하여 도 9와 같이 페리틴 기반 적색 형광 나노입자의 아미노 말단, 캡시드 기반 적색 형광 나노입자의 아미노 말단에 RGD 펩타이드를 표출하는 나노입자 제조를 위한 발현 벡터를 제조하였다. 이를 실시예 1에 명시한 대로 발현, 정제하여 인 비보 이미징에 적용하기 위한 형광 단백질 나노입자를 확보하였다.
As a result, 5'-NdeI-G RGD SG3SG3SG3SG- FTH-linker-DsRed-H6-HindIII-3 ' and 5'-NdeI-G RGD SG3SG3SG3SG- HBVcAg (1-79) -linker-DsRed-linker-HBVcAg (81- 149) -HindIII-3 ', and inserted into the pT7-7 vector to express the RGD peptide at the amino terminal of the ferritin-based red fluorescent nanoparticles and the amino terminal of the capsid-based red fluorescent nanoparticles as shown in FIG. Expression vectors for the production of nanoparticles were prepared. This was expressed and purified as described in Example 1 to obtain fluorescent protein nanoparticles for in vivo imaging.
<< 실험예Experimental Example 4> 표적 지향성 4> Targeting direction 펩타이드Peptides 표출 형광 단백질 나노입자를 이용한 생체 진단 가능성 검증 Verification of biodegradability using fluorescent protein nanoparticles
실시예 2에서 제조한 표적 지향성 펩타이드(RGD)를 표출하는 형광 단백질 나노입자가 실제 인 비보 이미징에 적합한지 검증하기 위하여 RGD가 결합한다고 알려진 인테그린 표출 암 세포를 선정하여 암 모델을 준비하였다. To test whether the fluorescent protein nanoparticles expressing the target-directed peptide (RGD) prepared in Example 2 are suitable for actual bibofection, an integrin expressing cancer cell known to bind RGD was selected and a cancer model was prepared.
먼저 암세포에 표적 지향성 펩타이드 융합 형광단백질이 선택적으로 업테이크 되는지 확인하기 위하여 6-웰 플레이트에 인테그린 발현 빈도가 높은 U87MG 암세포를 한 웰당 1×105 개를 부착시킨 후 각 1 μM의 rFFNP, RGD-rFFNP를 37℃, CO2 인큐베이터에서 1시간 동안 반응시킨 후 형광현미경을 이용하여 세포내 형광을 검경하였다. 인 비보 이미징을 위해서는 U87MG 암세포를 이식한 암모델에 각 형광 단백질 나노입자를 정맥 주사하여 IVIS 이미지 분석장비를 이용하여 형광 필터 550 nm/590nm 를 이용하여 암 부위의 형광을 측정하였다.In order to confirm whether target-specific peptide-fused fluorescent protein was selectively uptake into cancer cells, 1 × 10 5 U87MG cancer cells with high frequency of integrin expression were attached to 6-well plate, and 1 μM of each of rFFNP, RGD- rFFNP was incubated in a CO 2 incubator at 37 ° C for 1 hour, and the intracellular fluorescence was examined using a fluorescence microscope. For in vivo imaging, each fluorescent protein nanoparticle was intravenously injected into a cancer model transplanted with U87MG cancer cells, and fluorescence of the cancer site was measured using a fluorescence filter 550 nm / 590 nm using an IVIS image analyzer.
도 10에 나타난 바와 같이, RGD가 융합발현된 형광 단백질 나노입자가 암세포로 업테이크 된 것을 확인하였다. 이는 RGD 펩타이드가 형광 단백질 나노입자의 표면에 효과적으로 표출되어 암세포에 특이적으로 업테이크 되는 것을 도운 것으로 생각된다. As shown in Fig. 10, it was confirmed that the fluorescent protein nanoparticles fused with RGD were uptaken into cancer cells. It is believed that the RGD peptide has been effectively expressed on the surface of the fluorescent protein nanoparticles to specifically uptake cancer cells.
이후 실제 인 비보 이미징에 적용하기 위하여 인테그린 수용체 발현 빈도가 높은 U87MG 암세포를 각각 준비하여 누드 마우스에 주사 후 암을 신장 시킨 동물 모델에 형광 단백질 나노입자를 정맥 주사하였다.U87MG cancer cells with high frequency of integrin receptor expression were prepared for application to actual vivo imaging, and fluorescent protein nanoparticles were intravenously injected into an animal model in which nude mice were injected into nude mice.
먼저 RGD가 융합된 적색형광단백질 단량체(RGD-rFFNP), RGD가 없는 페리틴 기반 적색 형광 나노입자, RGD가 융합발현된 페리틴 기반 적색 형광 나노입자(rFFNP)를 동일한 형광값을 보이도록 농도를 맞춰 정맥 주사 후 암에서의 형광단백질의 축적량을 비교하였다. First, the red fluorescent protein monomer (RGD-rFFNP) fused with RGD, the ferritin-based red fluorescent nanoparticle without RGD, and the ferritin-based red fluorescent nanoparticle (rFFNP) The accumulation of fluorescent protein in cancer after injection was compared.
도 11에 나타난 바와 같이, 2시간 이후에도 RGD-rFFNP에서 암에서 형광이 측정되었고, RGD가 없는 rFFNP 또한 초기 시간에 암에서 형광이 측정되나 RGD-rFFNP에 비해 낮은 형광 세기를 보이는 것을 확인하였다.As shown in FIG. 11, fluorescence was measured in cancer in RGD-rFFNP even after 2 hours, and rFFNP without RGD also showed fluorescence intensity in cancer at the initial time but showed a lower fluorescence intensity than RGD-rFFNP.
또한 형광 재조합 단백질의 체내 분포를 분석하기 위하여 인테그린 수용체 발현 빈도가 낮다고 알려진 SCC7 암세포와 인테그린 수용체 발현 빈도가 높다고 알려진 U87MG 암세포를 준비하여 누드 마우스에 이식한 후 종양이 5-8 mm 크기가 되도록 성장시킨 후 RGD-DsRed, rFFNP, RGD-rFFNP를 동일한 형광값을 보이도록 준비하여 정맥 주사한 후 24 시간 후에 조직을 절개하여 12-bit CCD 카메라로 조직의 형광 세기를 비교하였다.In order to analyze the distribution of the fluorescent recombinant protein, SCC7 cancer cells known to have low integrin receptor expression and U87MG cancer cells known to have a high frequency of integrin receptor expression were prepared and transplanted into nude mice and then grown to 5-8 mm in size After RGD-DsRed, rFFNP and RGD-rFFNP were prepared to show the same fluorescence value, the tissues were incised 24 hours after intravenous injection, and the fluorescence intensities of tissues were compared with a 12-bit CCD camera.
도 12에 나타난 바와 같이, SCC7, U87MG 암 모델 모두 형광단백질 단량체는 RGD 펩타이드가 있음에도 신장을 통해 체내에서 제거되는 것을 확인하였으며, 페리틴 기반 형광 나노입자는 상대적으로 간에 주로 축적됨을 확인하였다. 이는 단백질 나노입자 기반의 형광 나노입자는 단량체에 비해 구조적 안정성이 향상되고, 체내 순환률이 향상됨을 보여주며, 형광단백질 단량체에 비해 인 비보 이미징에 적합한 소재임을 보여준다. 또한 페리틴 기반 형광 나노입자에 RGD를 융합발현 한 경우 RGD 펩타이드가 표출되지 않은 형광 나노입자에 비해 암세포에 축적되는 비율이 높아짐을 확인하였다. 이는 암세포 특이적 펩타이드를 표출한 형광 단백질 나노입자가 암세포를 특이적으로 타겟팅하며, 동시에 높은 형광 세기를 통해 이미징이 가능함을 보여준다.
As shown in FIG. 12, in the SCC7 and U87MG cancer models, it was confirmed that the fluorescent protein monomer was removed from the body through the kidney even in the presence of the RGD peptide, and the ferritin-based fluorescent nanoparticles were relatively accumulated in the liver. This shows that the fluorescent nanoparticles based on protein nanoparticles have improved structural stability and improved circulation rate in comparison with monomers, and are more suitable for in vivo imaging than fluorescent protein monomers. In addition, when RGD was fused and expressed in ferritin-based fluorescent nanoparticles, the proportion of RGD peptides accumulated in cancer cells was higher than that of uncharacterized fluorescent nanoparticles. This indicates that fluorescent protein nanoparticles expressing cancer cell-specific peptides specifically target cancer cells and can simultaneously perform imaging with high fluorescence intensity.
<< 실시예Example 3> 3> eDPSeDPS 및 And tPTStPTS 기반 표적 지향성 Based target orientation 펩타이드Peptides 표출 형광 나노입자의 제조 Fabrication of Expressed Fluorescent Nanoparticles
(eDPS 및 tPTS 기반 형광 단백질 나노입자의 생합성을 위한 발현 벡터의 제조)(Preparation of expression vector for biosynthesis of eDPS and tPTS-based fluorescent protein nanoparticles)
표적 지향성 펩타이드를 융합 발현하지 않은 크기와 형태가 다른 형광 단백질 나노입자를 제작하여 암 타겟팅이 가능한지, 가능하다면 효율이 어떻게 달라지는지 비교하였다. 또한 상기 단백질 나노입자에 표적 펩타이드를 융합 발현할 경우 암 타겟팅 효율이 향상되는지를 검증하기 위한 실험을 진행하였다.Fluorescent protein nanoparticles of different size and shape that did not fuse target-directed peptides were prepared to compare cancer targeting and, if possible, how efficiency varied. In addition, an experiment was conducted to verify whether cancer targeting efficiency is improved when a target peptide is fused and expressed in the protein nanoparticles.
이를 위해 크기와 형태가 다른 eDPS와 tPTS 나노입자를 생산하기 위한 발현 벡터를 제작하였다. 구체적으로 설명하면, 하기 표 2에 기재된 프라이머를 사용한 PCR 후에, 대장균 유전자로부터 유래한 N-NdeI-His6-eDPS-HindIII-C 및 N-NdeI-RGD-eDPS-His6-HindIII-C의 합성을 코드하는 두 유전자 클론을 얻었다. 써모플라즘 애시도필룸(Thermoplasm acidophilum) 유전자로부터 유래한 N-NdeI-tPTSα-HindIII-C, NdeI-tPTSα-RGD-HindIII-C 및 N-NdeI-tPTSβ-His6-HindIII-C의 합성을 코드하는 세 개의 유전자 클론을 얻었다. 플라즈미드 pT7-7에 상기 유전자 클론의 라이게이션을 통하여, N-eDPS-His6-C, N-RGD-eDPS-His6 -C, N-tPTSβ-His6-C 합성을 코딩하는 3개의 플라즈미드 발현 벡터를 구축하였다. 또한 pET28a에 상기 유전자 클론의 라이게이션을 통하여 N-tPTSα-C, N-tPTSα-RGD-C 합성을 코딩하는 3개의 플라즈미드 발현 벡터를 구축하였다(도 13A). 제작된 모든 플라즈미드 발현 벡터는 젤-종제 후 완전한 DNA 시퀀싱을 통해 서열을 확인하였다. 상기 단백질 나노입자의 제조와 관련된 프라이머 서열(표 2)과 주형에 대한 정보 및 이에 대한 좀 더 상세한 기재는 아래와 같다.For this purpose, expression vectors for producing eDPS and tPTS nanoparticles of different size and shape were prepared. Specifically, the synthesis of N-NdeI-His6-eDPS-HindIII-C and N-NdeI-RGD-eDPS-His6-HindIII-C derived from the E. coli gene was performed using the primers shown in Table 2 below Were obtained. Thermoplasm Ascoil Thermoplasm tPTSα-HindIII-C, NdeI-tPTSα-RGD-HindIII-C and N-NdeI-tPTSβ-His6-HindIII-C derived from the N-acetylglucosamine- acidophilum gene. Construction of three plasmid expression vectors coding for N-eDPS-His6-C, N-RGD-eDPS-His6-C, N-tPTSβ-His6-C synthesis via ligation of the above gene clone into plasmid pT7-7 Respectively. Three plasmid expression vectors coding for N-tPTSα-C and N-tPTSα-RGD-C synthesis were constructed by peg28a by ligation of the above gene clone (FIG. 13A). All plasmid expression vectors were sequenced by complete DNA sequencing after gel - termination. Information on the primer sequences (Table 2) and templates related to the preparation of the protein nanoparticles and a more detailed description thereof are as follows.
번호order
number
(eDPS 및 tPTS 기반 표적 지향성 펩타이드 표출 형광 단백질 나노입자의 생합성, 정제 및 형광입자 제조)(biosynthesis, purification and fluorescent particle production of eDPS and tPTS-based target-expressing peptide-expressing fluorescent protein nanoparticles)
eDPS, RGD-eDPS, tPTS 및 RGD-tPTS 나노입자의 생합성은 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 수행하였다. 다만 tPTS와 RGD-tPTS 나노입자는 알파단백질과 베타 단백질을 대장균에서 동시에 발현하기 위하여 상기에서 제작한 pT7 N-tPTSβ-His6-C와 pET28a N-tPTSα-C(또는 pET28a N-tPTSα-RGD-C)를 형질전환하여 암피실린과 카나마이신을 모두 포함하는 배지에서 배양하였다. 각 단백질 나노입자의 정제는 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 수행하였다. 수크로스 원심분리 후 정제한 단백질 나노입자의 버퍼를 ultracentrifugal filter를 이용하여 0.1 M 소듐 바이카보네이트(pH 8.5)로 바꿔준 후 단백질 나노입자 몰 농도의 4배에 해당하는 형광다이 Cy5.5를 섞어주고 상온에서 12시간 교반하여 반응한 후 다시 한 번 수크로스 초고속 원심분리를 통해 free-Cy5.5와 Cy5.5 가 결합된 단백질 나노입자를 분리하였다. 최종 제작된 형광 단백질 나노입자의 크기와 구조를 TEM을 통해 확인하였다.The biosynthesis of eDPS, RGD-eDPS, tPTS and RGD-tPTS nanoparticles was carried out in the same manner as in Example 1 above. However, tPTS and RGD-tPTS nanoparticles were synthesized from pT7 N-tPTSβ-His6-C and pET28a N-tPTSα-C (or pET28a N-tPTSα-RGD-C ) Was transformed and cultured in a medium containing both ampicillin and kanamycin. Purification of each protein nanoparticle was carried out in the same manner as in Example 1 above. After the sucrose centrifugation, the buffer of the purified protein nanoparticles was replaced with 0.1 M sodium bicarbonate (pH 8.5) using an ultracentrifugal filter, and the fluorescent dye Cy5.5 corresponding to four times the molar concentration of the protein nanoparticles was mixed After reacting at room temperature for 12 hours with stirring, protein nanoparticles bound with free-Cy5.5 and Cy5.5 were separated again through sucrose ultracentrifugation. The size and structure of the finally prepared fluorescent protein nanoparticles were confirmed by TEM.
도 13B에 나타난 바와 같이, 각 형광 단백질 나노입자는 대략 9-18 nm 정도의 크기를 나타내었다.
As shown in Fig. 13B, each fluorescent protein nanoparticle was about 9-18 nm in size.
<< 실험예Experimental Example 5> 5> eDPSeDPS 및 And tPTStPTS 기반 표적 지향성 Based target orientation 펩타이드Peptides 표출 형광 단백질 나노입자를 이용한 생체 진단 가능성 검증 Verification of biodegradability using fluorescent protein nanoparticles
1 μM의 eDPS, RGD-eDPS, tPTS 및 RGD-tPTS 기반 형광 단백질 나노입자를 실험예 4와 같이 준비한 U87MG 암세포 이식 동물 모델에 정맥 주사하여 eXplore Optix System (Near-infrared fluorescence(NIRF) emission(600e700 nm)을 이용하여 시간별로 형광을 측정하였다. 또한 암에서 나타나는 형광 세기를 time-correlated single photon counting system을 이용하여 정량화한 후 그래프로 나타내어 암 타겟팅 효율을 비교하였다. 1 μM of fluorescent protein nanoparticles based on eDPS, RGD-eDPS, tPTS and RGD-tPTS were intravenously injected into a U87MG cancer cell transplant animal model prepared as described in Experimental Example 4 to prepare an eXplore Optix System (near infrared fluorescence (NIRF) emission The fluorescence intensities in cancer were quantified using a time-correlated single photon counting system and plotted as a graph to compare cancer targeting efficiencies.
도 14A에 나타난 바와 같이, eDPS 나노입자는 간에 주로 축적되는 반면 tPTS 나노입자는 장에서 주로 관측되었으며 eDPS 나노입자 보다 tPTS 나노입자가 암 표적 펩타이드가 없음에도 암에 타겟팅이 더 잘 되는 것을 확인하였다. As shown in FIG. 14A, the ePDS nanoparticles accumulate mainly in the liver, while the tPTS nanoparticles are mainly observed in the intestine, confirming that the tPTS nanoparticles are more targeted to cancer than the ePTN nanoparticles even in the absence of cancer-targeting peptides.
또한 eDPS, tPTS 모두 단백질 나노입자 표면에 암 표적 펩타이드가 표출되었을 때 암 타겟팅 효율이 향상됨을 확인하였다(도 14B). 이는 단백질이라는 동일한 소재로 이루어진 단백질 나노입자라 할지라도 그 크기와 형태에 따라 생체 적용시 체내 분포뿐 아니라 특정 조직에 대한 타겟팅 효율이 달라짐을 보여준다.
In addition, it was confirmed that cancer targeting efficiency was improved when cancer target peptide was expressed on the surface of protein nanoparticles in both eDPS and tPTS (FIG. 14B). This shows that even protein nanoparticles composed of the same material as protein are not only distributed in the body according to their sizes and shapes, but also have different targeting efficiencies to specific tissues.
<< 실시예Example 4> 구조와 형태가 다른 형광 단백질 나노입자를 이용한 4> Using fluorescent protein nanoparticles with different structures and shapes 감시림프절Surveillance lymph node 이미징 Imaging
크기와 형태가 다른 형광단백질 나노입자를 제조하여 기존 감시림프절(Sentinel lymphnode) 이미징에 적용하였다. Fluorescent protein nanoparticles of different size and shape were prepared and applied to conventional monitoring lymph node imaging.
이를 위해, 상기 실시예 3에서 제작한 eDPS와 tPTS 형광 단백질 나노입자와, 추가로 FTN-h, HBVcAg 기반 형광 단백질 나노입자를 제작하였다. 하기 표 3에 기재된 프라이머를 사용한 PCR 후에 N-NdeI-His6-FTN-h-HindIII-C 및 N-NdeI-His6-HBVcAg-HindIII-C의 합성을 코드하는 두 유전자 클론을 얻었다. 플라즈미드 pT7-7에 상기 유전자 클론의 라이게이션을 통하여, N-His6-FTN-h-C, N-His6-HBVcAg-C 2개의 플라즈미드 발현 벡터를 구축하였다. 또한 FTN-h, HBVcAg 기반 형광 단백질 나노입자를 제작하는 방법은 상기 실시예 3과 같다. 최종적으로 정제, 제작한 형광 단백질 나노입자의 형광량을 비교하여 동일한 형광 세기를 보이는 농도를 설정하고 tPTS 형광단백질 나노입자 1 μM의 형광 세기와 동일한 형광 세기를 보이는 농도를 준비하여 정상 누드 마우스의 앞발에 20 ㎕씩 피하주사하였다. 10분 간격으로 KODAK imaging station(12-bit-CCD camera) 을 이용하여 형광을 측정하였다.To this end, the eDPS and tPTS fluorescent protein nanoparticles prepared in Example 3 and the fluorescent protein nanoparticles based on FTN-h and HBVcAg were further prepared. Two gene clones coding for the synthesis of N-NdeI-His6-FTN-h-HindIII-C and N-NdeI-His6-HBVcAg-HindIII-C were obtained after PCR using the primers described in Table 3 below. Two plasmid expression vectors of N-His6-FTN-h-C and N-His6-HBVcAg-C were constructed by ligating the above gene clone into plasmid pT7-7. In addition, the method of preparing FTN-h and HBVcAg-based fluorescent protein nanoparticles is the same as in the third embodiment. Finally, the fluorescence intensity of the purified and prepared fluorescent protein nanoparticles was compared and the same fluorescence intensity was set. The fluorescence intensity of the tPTS fluorescent protein nanoparticle was found to be the same as that of 1 μM fluorescence intensity. Were subcutaneously injected with 20 [mu] L each. Fluorescence was measured at 10-minute intervals using a KODAK imaging station (12-bit-CCD camera).
번호order
number
도 15에 나타난 바와 같이, 크기가 다른 4개의 형광단백질 나노입자를 제조하였으며, 이를 동물 모델의 앞발에 주사하였을 때 주사한 부위로부터 가장 가까운 림프절에 형광 단백질 나노입자가 축적되는 것을 확인하였다. 주사한 즉시 감시림프절에서 표지 신호가 특정될 뿐 아니라 1시간 이상으로 표지 신호가 유지되며 다른 림프절로 확산되지 않는 것을 통해, 형광 단백질 나노입자가 감시림프절을 타겟팅하는데 매우 효과적임을 검증하였다(도 16).As shown in FIG. 15, four fluorescent protein nanoparticles of different sizes were prepared, and when injected into the forefoot of an animal model, it was confirmed that fluorescent protein nanoparticles were accumulated in the lymph node nearest to the injected site. As shown in FIG. 16, the fluorescent protein nanoparticles were highly effective in targeting the surveillance lymph node through the detection of the labeling signal in the surveillance lymph node immediately after the injection, as well as maintaining the label signal for one hour or longer and not diffusing to other lymph nodes .
특히, tPTS 나노입자의 경우 다른 나노입자에 비해 주사한 가장 높은 감시림프절 타겟팅 효율을 보였으며, 이는 표적 지향성 펩타이드가 없이도 단백질 나노입자 고유의 크기나 구조적 특성이 특정 조직을 타겟팅하여 이미징하는 소재로 활용될 수 있음을 보여준다. In particular, the tPTS nanoparticles showed the highest targeting lymph node targeting efficiency compared to other nanoparticles, and the size or structural characteristics inherent in the protein nanoparticles can be targeted as a material to be imaged without a target-oriented peptide .
<110> Korea University Industrial & Academic Collaboration Foundation <120> Fluorescent protein nanoparticles for in vivo imaging <130> P120919 <150> KR 2012-122548 <151> 2012-10-31 <160> 39 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer No. 1 <400> 1 catatggaca ttgacccgta taaaga 26 <210> 2 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer No. 2 <400> 2 ctcgaggtct tccaaattac ttccca 26 <210> 3 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer No. 3 <400> 3 ggatcctcca gggaattagt agtcagc 27 <210> 4 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer No. 4 <400> 4 aagcttttaa acaacagtag tttccggaag tgt 33 <210> 5 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer No. 5 <400> 5 ctcgagcatc accatcacca tcacgtgagc aagggcgag 39 <210> 6 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer No. 6 <400> 6 ggatcccttg tacagctcgt ccatgcc 27 <210> 7 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer No. 7 <400> 7 ctcgagcatc accatcacca tcacgacaac accgaggac 39 <210> 8 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer No. 8 <400> 8 ggatccctgg gagccggagt ggcg 24 <210> 9 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer No. 9 <400> 9 ggctctggtg gcggaagtgg gggtggcgtg agcaagggcg ag 42 <210> 10 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer No. 10 <400> 10 agagccaccc ccacttccgc cacccttgta cagctcgtcc at 42 <210> 11 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer No. 11 <400> 11 ggctctggtg gcggaagtgg gggtggcgac aacaccgagg ac 42 <210> 12 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer No. 12 <400> 12 agagccaccc ccacttccgc caccctggga gccggagtgg cg 42 <210> 13 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer No. 13 <400> 13 ggtggcggaa gtgggggtgg ctctggtggc ggaagt 36 <210> 14 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer No. 14 <400> 14 ctcgagcatc accatcacca tcacggtggc ggaagtggg 39 <210> 15 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer No. 15 <400> 15 ggatccgcca cccccacttc cgccaccaga gccaccccca ct 42 <210> 16 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer No. 16 <400> 16 gaggcggttc gggcggaggt tctggtggcg gaacgaccgc gtccacc 47 <210> 17 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer No. 17 <400> 17 aagcttgtga tggtgatgga gatgctggga gccggagtgg 40 <210> 18 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer No. 18 <400> 18 gaggcggttc gggcggaggt tctggtggcg gagacattga cccgtataa 49 <210> 19 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer No. 19 <400> 19 catatgggac gtggtgatag cggcggaggg tctggaggcg gttcgggcg 49 <210> 20 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer No. 20 <400> 20 catatgcacc atcaccatca ccatagtacc gctaaattag tta 43 <210> 21 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer No. 21 <400> 21 aagcttttat tcgatgttag actc 24 <210> 22 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer No. 22 <400> 22 catatgagta ccgctaaatt agtta 25 <210> 23 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer No. 23 <400> 23 catatgtgcg attgccgtgg tgattgcttc tgcctcgaga gtaccgctaa attagtta 58 <210> 24 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer No. 24 <400> 24 aagcttttag tgatggtgat ggtgatgttc gatgttagac tcgataaac 49 <210> 25 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer No. 25 <400> 25 catatgcaac agggccagat ggct 24 <210> 26 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer No. 26 <400> 26 aagcttagag gaatttttta acttcctcct g 31 <210> 27 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer No. 27 <400> 27 cacgtccgca atcgcaactt ccaccgccga ggaatttttt aacttcc 47 <210> 28 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer No. 28 <400> 28 aagcttagca gaagcaatca ccacgtccgc aatcgca 37 <210> 29 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer No. 29 <400> 29 catatggccg cggttggtat tacactgaaa gacg 34 <210> 30 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer No. 30 <400> 30 aagcttaatg gtgatggtga tggtgcagaa ttaatccgag cttc 44 <210> 31 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer No. 31 <400> 31 catatgcacc atcaccatca ccatacgacc gcgtccacct cgcaggtg 48 <210> 32 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer No. 32 <400> 32 aagctttcag ctttcattat cactgtc 27 <210> 33 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer No. 33 <400> 33 catatgcacc atcaccatca ccatgacatt gacccgtata aagaa 45 <210> 34 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer No. 34 <400> 34 aagcttttaa acaacagtag tttc 24 <210> 35 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker peptide 1 <400> 35 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 1 5 10 15 <210> 36 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker peptide 2 <400> 36 Gly Gly Gly Gly Gly 1 5 <210> 37 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker peptide 3 <400> 37 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Thr Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 1 5 10 15 <210> 38 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker peptide 4 <400> 38 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Thr 1 5 10 <210> 39 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker peptide 5 <400> 39 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 <110> Korea University Industrial & Academic Collaboration Foundation <120> Fluorescent protein nanoparticles for in vivo imaging <130> P120919 <150> GB 2012-122548 <151> 2012-10-31 <160> 39 <170> Kopatentin 2.0 <210> 1 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> ≪ 223 > One <400> 1 catatggaca ttgacccgta taaaga 26 <210> 2 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> ≪ 223 > 2 <400> 2 ctcgaggtct tccaaattac ttccca 26 <210> 3 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> ≪ 223 > 3 <400> 3 ggatcctcca gggaattagt agtcagc 27 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Artificial Sequence <220> ≪ 223 > 12 <400> 12 agagccaccc ccacttccgc caccctggga gccggagtgg cg 42 <210> 13 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> ≪ 223 > 13 <400> 13 ggtggcggaa gtgggggtgg ctctggtggc ggaagt 36 <210> 14 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> ≪ 223 > 14 <400> 14 ctcgagcatc accatcacca tcacggtggc ggaagtggg 39 <210> 15 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> ≪ 223 > 15 <400> 15 ggatccgcca cccccacttc cgccaccaga gccaccccca ct 42 <210> 16 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> ≪ 223 > 16 <400> 16 gaggcggttc gggcggaggt tctggtggcg gaacgaccgc gtccacc 47 <210> 17 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> ≪ 223 > 17 <400> 17 aagcttgtga tggtgatgga gatgctggga gccggagtgg 40 <210> 18 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> ≪ 223 > 18 <400> 18 gaggcggttc gggcggaggt tctggtggcg gagacattga cccgtataa 49 <210> 19 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> ≪ 223 > 19 <400> 19 catatgggac gtggtgatag cggcggaggg tctggaggcg gttcgggcg 49 <210> 20 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> ≪ 223 > 20 <400> 20 catatgcacc atcaccatca ccatagtacc gctaaattag tta 43 <210> 21 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> ≪ 223 > 21 <400> 21 aagcttttat tcgatgttag actc 24 <210> 22 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> ≪ 223 > 22 <400> 22 catatgagta ccgctaaatt agtta 25 <210> 23 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> ≪ 223 > 23 <400> 23 catatgtgcg attgccgtgg tgattgcttc tgcctcgaga gtaccgctaa attagtta 58 <210> 24 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> ≪ 223 > 24 <400> 24 aagcttttag tgatggtgat ggtgatgttc gatgttagac tcgataaac 49 <210> 25 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> ≪ 223 > 25 <400> 25 catatgcaac agggccagat ggct 24 <210> 26 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> ≪ 223 > 26 <400> 26 aagcttagag gaatttttta acttcctcct g 31 <210> 27 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> ≪ 223 > 27 <400> 27 cacgtccgca atcgcaactt ccaccgccga ggaatttttt aacttcc 47 <210> 28 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> ≪ 223 > 28 <400> 28 aagcttagca gaagcaatca ccacgtccgc aatcgca 37 <210> 29 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> ≪ 223 > 29 <400> 29 catatggccg cggttggtat tacactgaaa gacg 34 <210> 30 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> ≪ 223 > 30 <400> 30 aagcttaatg gtgatggtga tggtgcagaa ttaatccgag cttc 44 <210> 31 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> ≪ 223 > 31 <400> 31 catatgcacc atcaccatca ccatacgacc gcgtccacct cgcaggtg 48 <210> 32 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> ≪ 223 > 32 <400> 32 aagctttcag ctttcattat cactgtc 27 <210> 33 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> ≪ 223 > 33 <400> 33 catatgcacc atcaccatca ccatgacatt gacccgtata aagaa 45 <210> 34 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> ≪ 223 > 34 <400> 34 aagcttttaa acaacagtag tttc 24 <210> 35 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker peptide 1 <400> 35 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 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Claims (13)
약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하고,
상기 형광 단백질 나노입자는 B형 간염 바이러스 코어 단백질, 페리틴 중쇄 단백질(Ferritin Heavy chain), 써모플라즘 애시도필룸(Thermoplasm acidophilum) 유래의 프로테아좀(tPTS) 또는 대장균 유래의 DNA 결합 단백질(eDPS)을 포함하는 자기조립성 단백질로부터 자기조립된 단백질 나노입자에 형광물질을 표면 결합시켜 제조된 것인, 감시림프절(Sentinel lymph node) 생체 이미징용 조성물.
Fluorescent protein nanoparticles of 10 to 50 nm in size in which a fluorescent substance is bonded to a self-assembling protein; And
A pharmaceutical composition comprising a pharmaceutically acceptable carrier,
The fluorescent protein nanoparticles can be obtained from hepatitis B virus core protein, ferritin heavy chain, thermoplasmic acidophilum- derived proteasome (tPTS) or E. coli-derived DNA binding protein (eDPS) Wherein the fluorescent nanoparticle is prepared by surface-binding a fluorescent substance to a self-assembled protein nanoparticle from a self-assembling protein containing a fluorescent substance.
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-
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Patent Citations (1)
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|---|---|---|---|---|
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