KR20190095372A - 호중구 활성화 조절제 - Google Patents

호중구 활성화 조절제 Download PDF

Info

Publication number
KR20190095372A
KR20190095372A KR1020197020257A KR20197020257A KR20190095372A KR 20190095372 A KR20190095372 A KR 20190095372A KR 1020197020257 A KR1020197020257 A KR 1020197020257A KR 20197020257 A KR20197020257 A KR 20197020257A KR 20190095372 A KR20190095372 A KR 20190095372A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
neutrophil
neutrophil activation
neutrophils
activation
batroxobin
Prior art date
Application number
KR1020197020257A
Other languages
English (en)
Inventor
하루치카 마스다
다카유키 아사하라
히로부미 센가
Original Assignee
토비시 파마슈티칼 컴패니 리미티드
토카이 유니버시티 에듀케이셔널시스템
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 토비시 파마슈티칼 컴패니 리미티드, 토카이 유니버시티 에듀케이셔널시스템 filed Critical 토비시 파마슈티칼 컴패니 리미티드
Publication of KR20190095372A publication Critical patent/KR20190095372A/ko

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/46—Hydrolases (3)
    • A61K38/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • A61K38/482—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/18—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for pancreatic disorders, e.g. pancreatic enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/46—Hydrolases (3)
    • A61K38/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/46—Hydrolases (3)
    • A61K38/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • A61K38/4806—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4) from animals other than mammals, e.g. snakes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/46—Hydrolases (3)
    • A61K38/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • A61K38/482—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • A61K38/4833—Thrombin (3.4.21.5)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6402—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from non-mammals
    • C12N9/6418—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from non-mammals from snakes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12Y304/21074—Venombin A (3.4.21.74)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
  • Steroid Compounds (AREA)

Abstract

본 발명은 호중구 활성화 조절제 및 호중구 활성화에 의한 질병에 대한 치료제에 관한 것이다. 트롬빈-유사 효소는 호중구 활성화 조절제의 유효 성분 및 호중구 활성화에 기인한 질병에 대한 치료제로서 사용된다.

Description

호중구 활성화 조절제
본 발명은 트롬빈-유사 효소(thrombin-like enzyme)를 유효 성분으로 함유하는 호중구 활성화 조절제(neutrophil activation regulator), 및 호중구 활성화 조절제를 함유하는, 호중구 활성화에 기인한 질병 치료제에 관한 것이다.
혈액에는 세포 구성 요소로서 적혈구, 백혈구 및 혈소판이 포함된다. 그 중에서 백혈구는 생물학적 방어에 관여하는 면역 세포이며, 호중구(neutrophils), 호산구(eosinophils), 호염기구(basophils), 림프구(lymphocytes) 및 단핵구(monocytes)의 5 가지 유형으로 분류된다. 이 중 호중구의 세포수가 가장 많으며, 백혈구 유형의 50-70 %를 차지한다. 호중구는 예를 들어, 외부로부터 생체에 들어가는 박테리아 또는 바이러스 등의 이물질을 제거하는 등의 기능을 가지고 있다.
박테리아와 같은 이물질이 생체에 들어가면, 즉시 대식세포(macrophages)가 반응하여, 인터류킨-1(IL-1)(interleukin-1)과 같은 사이토카인(cytokines)을 방출한다. 이러한 사이토카인은 조직 내의 세포에서 염증성 변화를 일으킨다. 염증성 변화를 겪은 조직은 인터류킨-8(IL-8) 및 호중구 이동 자극 인자로 대표되는 많은 사이토카인을 방출한다.
표면 수용체 상의 호중구는, 호중구 이동 자극 인자와 박테리아에 의해 생성된 물질을 스스로 인식하고, 이동 운동을 활성화시킨다. 이동 후에, 호중구는 예를 들어, 박테리아와 접촉하여, 표면 수용체를 통해 박테리아를 이물질로 인식하고, 박테리아에 부착하여 결합한다. 결합된 박테리아는 호중구의 원형질 막에 의해 삼켜지고, 호중구에 혼입되어, 탐식된다.
호중구에 혼입된 박테리아는 3 가지 수단에 의해 사멸(식균)된다.
박테리아를 죽이기 위한 제1 수단은, 효소 시스템의 작용으로 생성된 과산화수소와 같은 반응성 산소 종(reactive oxygen species)에 의해 수행된다.
박테리아를 죽이기 위한 제2 수단은, 살균성 단백질 및 리소자임(lysozyme)과 같은 효소, 및 호중구의 과립(granules)에서 방출되는 디펜신(defensins)에 의해 수행된다.
그러나, 반응성 산소 종 또는 살균성 단백질 및 효소가 호중구로부터 과도하게 방출되면, 조직이 손상되고, 염증 증상이 더욱 악화된다.
박테리아를 죽이기 위한 제3 수단은, 활성화된 호중구에 의해 핵 내 염색질의 세포밖 방출을 통해 NETs(neutrophil extracellular traps)(호중구 세포밖 트랩)라고 불리는 염색질 웹을 형성함으로써 수행된다(비특허문헌 1). 이 과정에서 발생하는 호중구의 세포 사멸은, 박테리아에 대한 작용에서 중요한 역할을 한다. 이것은 괴사(necrosis) 및 세포자연사(apoptosis)와는 다른 유형의 세포 사멸이기 때문에, 넷토시스(NETosis)라고 불린다.
그러나, NETs의 구성 성분인 히스톤(histones), 미엘퍼옥시다제(myeloperoxidase) 및 엘라스타제(elastase)와 같은 항균 작용을 갖는 물질은, 숙주의 혈액 또는 조직 내로 방출되며, 숙주의 조직 및 세포의 손상 인자 역할을 한다.
따라서, 활성화된 호중구에 의해 형성된 NETs를 억제하는 것이, 과도한 염증 반응을 억제할 수 있다고 믿어진다.
이러한 사실로부터, 호중구 활성화를 조절함으로써 염증 반응을 억제하려는 노력이 있어 왔다.
지금까지, 호중구 활성화를 조절하기 위한 몇 가지 물질이 보고되었다.
예를 들어, 간에서 합성되고, 혈장 중에 함유되어 있으며, 응고 섬유소용해 시스템(coagulation fibrinolysis system)의 조절 및 혈관 신생(angiogenesis)의 조절에 관여하는 것으로 알려진, 히스티딘이 풍부한 당단백질(histidine-rich glycoprotein)은, 호중구 활성화 조절제로 보고되었다(특허문헌 1).
또한, 2-아데노신 N-피라졸 화합물 및 2-아데노신 티오펜 화합물이, 혈소판 응집 억제제 또는 호중구 활성화 억제제로서 유용하다고 보고되었다(특허문헌 2 및 특허문헌 3).
또한, 벤즈옥사지논 유도체(benzoxazinone derivatives) 및 아제티디논 유도체(azetidinone derivatives)가 호중구 침윤 억제제이고, 소염 작용을 하는 것으로 보고되었다(특허문헌 4 및 5).
또한, 백혈구 세포밖 트랩의 형성에 관한 락토페린-함유 억제제 및 백혈구 세포밖 트랩(leukocyte extracellular traps)의 형성과 관련된 질병을 치료하기 위한 락토페린 함유-조성물이 보고되었다(특허문헌 6).
일본 특허 제 5807937 호 PCT 국제 출원 2003-506461 호의 일본어 공보 PCT 국제 출원 2003-502434 호의 일본어 공보 일본 특허 공개 평성 제 5-148249 호 공보 일본 특허 공개 평성 제 7-242624 호 공보 국제 공개 제 WO2014/168253 호
브린크만 브이(Brinkmann V) 외: 박테리아를 죽이는 호중구 세포밖 트랩. 사이언스. 303: 1532-1535, 2004.
그러나, 효능, 안전성 등의 관점에서, 새로운 호중구 활성화 조절제 및 호중구 활성화에 기인하는 질병에 대한 조절제를 함유하는 치료제가 여전히 요구되고 있다.
본 발명자들은 전술한 문제점을 해결하기 위해 연구를 거듭하였다. 그 결과, 트롬빈-유사 효소가 호중구 활성화(특히, 탈과립화(degranulation), Mac-1 발현(Mac-1 expression), NETs 형성(NETs formation), 내피세포 이동(transendothelial migration) 및 조직 침윤(tissue infiltration)을 조절하고, 호중구 활성화에 기인한 질병을 치료할 수 있다는 것을 발견하였다. 본 발명은 이러한 발견에 기초하여 이루어진 것이다.
구체적으로, 본 발명은 하기 [1] 내지 [10]에 관한 것이다.
[1] 트롬빈-유사 효소를 유효 성분으로 구비하는 호중구 활성화 조절제.
[2] 상기 트롬빈-유사 효소가 배트록소빈(batroxobin), 앵크로드(ancrod) 및 크로타라제(crotalase)로 이루어진 군에서 선택되는 [1]에 기재된 호중구 활성화 조절제.
[3] 상기 트롬빈-유사 효소가 배트록소빈인, [1]에 기재된 호중구 활성화 조절제.
[4] 호중구 활성화가 호중구 탈과립화를 억제함으로써 조절되는, [1]에 기재된 호중구 활성화 조절제.
[5] 상기 호중구 활성화가 호중구 Mac-1 발현을 억제함으로써 조절되는, [1]에 기재된 호중구 활성화 조절제.
[6] 상기 호중구 활성화가 호중구 NETs 형성을 억제함으로써 조절되는, [1]에 기재된 호중구 활성화 조절제.
[7] 상기 호중구 활성화가 호중구 내피세포 이동을 억제함으로써 조절되는, [1]에 기재된 호중구 활성화 조절제.
[8] 상기 호중구 활성화가 호중구 조직 침윤을 억제함으로써 조절되는, [1]에 기재된 호중구 활성화 조절제.
[9] 호중구 활성화에 기인한 질병에 대한 치료제로서, 상기 치효제는 [1]에 기재된 호중구 활성화제를 구비하는, 치료제.
[10] 상기 호중구 활성화에 기인한 질병은 패혈증, 급성 호흡곤란 증후군, 급성 췌장염 및 급성 폐질병으로 이루어진 군으로부터 선택되는, [9]에 기재된 치료제.
실시예에서 후술하는 바와 같이, 트롬빈-유사 효소를 유효 성분으로 함유하는 본 발명의 호중구 활성화 조절제는, 호중구 활성화(특히, 탈과립화, Mac-1 발현, NETs 형성, 내피세포 이동, 조직 침윤)를 조절하고, 호중구 활성화에 기인한 질병에 대한 치료제로서 유용하다.
도 1은 TNF-α에 의해 유발된 호중구 탈과립화에 대한 배트록소빈의 억제 작용을 검증한 결과를 나타낸다.
도 2는 TNF-α에 의해 유발된 호중구 Mac-1 발현에 대한 배트록소빈의 억제 작용을 검증한 결과를 나타낸다.
도 3은 TNF-α에 의해 유발된 호중구 NETs 형성에 대한 배트록소빈의 억제 작용을 검증한 결과를 나타낸다.
도 4는 TNF-α에 의해 유발된 호중구 내피세포 이동에 대한 배트록소빈의 억제 작용을 검증한 결과를 나타낸다.
도 5는 허혈성 뒷다리 근육 조직(ischemic hindlimb muscle tissue)으로의 호중구 조직 침윤에 대한 배트록소빈의 억제 작용을, HE 염색으로 확인한 결과를 나타낸다.
도 6은 허혈성 뒷다리 근육 조직으로의 호중구 조직 침윤에 대한 배트록소빈의 억제 작용을, MPO 염색으로 확인한 결과를 나타낸다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 명세서에서 사용된 용어는 달리 구체적으로 언급되지 않는 한 당업계에서 통상적으로 사용되는 의미로 사용된다는 것을 이해해야 한다. 따라서, 달리 정의되지 않는 한, 명세서에 사용된 모든 기술 용어 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 상충되는 경우, 여기서 정의된 것이 우선된다.
본 발명은 트롬빈-유사 효소를 유효 성분으로 함유하는 호중구 활성화 조절제 (이하, 간단히 "조절제"라고도 함), 및 상기 조절제를 포함하며, 호중구 활성화에 기인한 질병에 대한 치료제(이하, 간단히 "치료제"라고도 함)에 관한 것이다.
"호중구 활성화"를 나타내는 지표(indicator)는 호중구 활성화 인자, 특히 탈과립화, Mac-1 발현, NETs 형성, 내피세포 이동, 및 조직 침윤 등의 자극이 호중구에 의해 나타나는 현상을 포함한다.
호중구 "탈과립화"는 이물질과 접촉하거나 사이토카인의 자극에 의해 과립의 물질이 과립 외부로 방출되는 현상을 말한다.
호중구 "Mac-1 발현"은 호중구 표면에서 세포 접착 분자(cell adhesion molecule)(CD18/CD11b)가 발현되는 현상을 말한다.
호중구 "NETs 형성"은 핵 내의 염색질이 세포 밖으로 방출되어 염색질 웹을 형성하는 현상을 말한다.
호중구 "내피세포 이동"은 호중구가 혈액 순환에서 떨어져 나와 혈관 내피 세포의 틈새를 통해 조직으로 들어가는 현상을 말한다.
호중구 "조직 침윤"는 호중구가 혈관 내피 세포를 통해 빠져 나와, 조직의 실질 세포 주위로 이동하고 머물러 있는 현상을 말한다.
"호중구 활성화에 기인하는 질병"은 NETs 형성, 활성 산소 종, 및 전술한 활성화 지표를 나타내는 호중구 (활성화된 호중구)로부터 과도하게 생성된 살균성 단백질 및 효소의 결과로서, 조직 또는 기관의 손상에 의해 발생하는 질병을 말한다.
질병의 구체적인 예로는 패혈증, 급성 호흡곤란 증후군, 급성 췌장염, 급성 폐질병, 복합 장기부전, 인플루엔자-관련 뇌증, 간질, 바이러스성 뇌염 등이 포함된다. 이들 질병 중에서, 본 발명은 패혈증, 급성 호흡곤란 증후군, 급성 췌장염 및 급성 폐질병에 적합하게 사용할 수 있다.
본 명세서에 사용된 "트롬빈-유사 효소"란, 응고되는 피브리노겐의 특성을 갖는 트롬빈 이외의 프로테아제를 말한다. 트롬빈-유사 효소의 구체적인 예로는 배트록소빈(batroxobin), 앵크로드(ancrod), 크로타라제(crotalase), 플라옥소빈(flavoxobin), 아스페라제(asperase), 아쿠타인(acutin), 보트로파즈(botropase), 클로타제(clotase), 가보나제(gabonase), 벤자임(venzyme) 등이 있다.
트롬빈-유사 효소는 기질 내의 한 부위에서, 효소가 공격하는 피브리노겐에 기초하여 3개의 카테고리로 분류된다. 구체적으로, 분류된 3개의 카테고리는, (1) 피브리노겐으로부터 피브리노펩타이드 A만을 분리하여 피브린 I를 생성하는 프로테아제(배트록소빈, 앵크로드, 크로타라제 등), (2) 피브리노겐으로부터 피브리노펩타이드 A와 피브리노펩타이드 B를 분리하여, 피브린(fibrin)이라고도 하는 피브린 II를 생성하는 프로테아제(예를 들면, 가보나제), 및 피브리노겐으로부터 주로 피브리노펩타이드 B를 분리하는 프로테아제(예를 들면, 벤자임)를 포함한다.
본 명세서에서, "피브린 I"이란 용어는 피브리노겐으로부터 피브리노펩타이드 A만이 분리될 때 생성되는 모노머를 의미한다. 이 피브린 I는 데스 아 피브린(Des A fibrin)이라고도 한다.
또한, 용어 "피브리노펩타이드 A"는 피브리노겐의 Aα 사슬의 NH2 말단에서 16 개의 아미노산에 상응하는 펩타이드를 지칭한다.
또한, 용어 "피브리노펩타이드 B"는 피브리노겐의 Bβ 사슬의 NH2 말단에서 14 개의 아미노산에 상응하는 펩타이드를 지칭한다.
또한, 본 명세서에서는, 배트록소빈, 앵크로드, 크로타라제, 플라옥소빈, 아스페라제, 아쿠타인 등은, 피브리노겐으로부터 피브린 Ⅰ을 생성하는 프로테아제의 일례로서 언급되어 있다.
본 발명의 바람직한 트롬빈-유사 효소는, 배트록소빈, 앵크로드 및 크로타라제를 함유한다. 이들 모두는 트롬빈-유사 효소로 알려져 있다.(Stocker KF : 뱀 독 단백질의 의학적 사용, Stocker KF: 지혈 및 섬유소 용해에 영향을 미치는 뱀 독 단백질, Stocker KF,ed., CRC Press, Boston, p130-131; 1990).
배트록소빈, 앵크로드 및 크로타라제 중, 본 발명의 조절제의 유효 성분으로는 배트록소빈이 가장 바람직하다.
배트록소빈은 바쓰롭스 문제니(Bothrops moojeni)의 독에서 얻어진 트롬빈-유사 효소이며, 약 36,000 Da의 분자량을 갖는 당단백질(glycoprotein)이다. 배트록소빈은 피브리노겐으로부터 피브리노펩타이드 A만을 분리하여 피브린 I를 생성한다 (Aronson DL : 트롬빈과 트롬빈-유사 독 효소 앵크로드와 배트록소빈의 작용 비교, 트롬보스 헤모스타스(Thrombos Haemostas)(stuttg) 36 : 9-13, 1976). 또한, 배트록소빈의 기본 구조는 이미 결정되었고, 배트록소빈은 231 개의 아미노산으로 구성된 단일 사슬의 당단백질이다 (이또 엔(Itoh N) 등: 배트록소빈에 대한 cDNA의 분자 클로닝 및 서열 분석. 트롬빈-유사 뱀 독 효소. J Biol Chem 262 : 3132-3135, 1987).
배트록소빈과 트롬빈은 당단백질 구조를 갖는 서로 유사한 효소이다. 그럼에도 불구하고, 배트록소빈은 피브리노겐으로부터 피브리노펩타이드 A만을 분리하여 피브린 I를 생성하며, 한편 트롬빈은 피브리노겐으로부터 피브리노펩타이드 A뿐만 아니라 피브리노펩타이드 B를 분리하여 피브린 II(피브린이라고도 함)를 생성한다는 점에서 배트록소빈과 상이하다. 또한 배트록소빈은 피브리노겐 이외의 혈액 응고 인자에는 작용하지 않지만, 트롬빈은 다른 혈액 응고 인자에도 작용한다는 점에서 둘은 다르다.
배트록소빈은 공지된 물질이며, 미국 특허 제 4137127 호에 기재된 방법에 따라 제조할 수 있다. 또한, 배트록소빈 제품은 토비시 제약(도쿄, 일본) 및 베이징 토비시 제약(중국)에서 쉽게 구입할 수 있다.
앵크로드는 아키스트로돈 로도스토마(Agkistrodon rhodostoma)의 독에서 얻어진 트롬빈-유사 효소이며, 약 35,400 Da의 분자량을 갖는 당단백질이다. 앵크로드는 배트록소빈처럼, 피브리노겐으로부터 피브리노펩타이드 A만을 분리하여 피브린Ⅰ를 생성한다. (Stocker KF : 뱀 독 단백질의 의학적 사용, Stocker KF: 지혈 및 섬유소 용해에 영향을 미치는 뱀 독 단백질, Stocker KF,ed., CRC Press, Boston, p134-135; 1990).
크로타라제는 크로타루스 아다만테우스(Crotalus adamanteus)의 독에서 얻어진 트롬빈-유사 효소이며, 약 32,700 Da의 분자량을 갖는 당단백질이다. 크로타라제는 배트록소빈처럼, 피브리노겐으로부터 피브리노펩타이드 A만을 분리하고 피브린Ⅰ를 생성한다. (Stocker KF : 뱀 독 단백질의 의학적 사용, Stocker KF: 지혈 및 섬유소 용해에 영향을 미치는 뱀 독 단백질, Stocker KF,ed., CRC Press, Boston, p140-141; 1990).
본 발명에서 배트록소빈, 앵크로드 및 크로타라제와 같은 트롬빈-유사 효소는 천연 생성물 또는 유전자 재조합 생성물일 수 있다.
본 발명의 조절제는 트롬빈-유사 효소 단독일 수도 있고 (예를 들어, 배트록소빈 단독), 또는 적어도 하나의 트롬빈-유사 효소를 함유할 수 있다.
대안적으로, 본 발명의 조절제는 효소 이외의 적어도 하나의 활성 물질(예를 들어, 스테로이드, 면역 억제제 등)과 조합된 트롬빈-유사 효소를 함유할 수 있다.
본 발명의 조절제의 제형(dosage forms)으로서는, 일본 약전 일반 조제법에 기재된 제형을 특별히 제한없이 사용할 수 있다. 예를 들면, 생체에 직접 투여되는 주사제 (현탁제 및 유탁제 포함); 연고와 같은 외용제 (유성 연고, 에멀젼 연고(크림), 수용성 연고 등), 흡입제, 액체 (안과용 용액, 콜라륨 등), 좌제, 패치, 습포제, 및 로션, 그리고, 정제 (설탕, 필름, 젤라틴 코팅 정제 포함), 액체, 캡슐, 과립, 분말 (미세한 과립 포함), 환약, 시럽 및 트로키와 같은 내복약을 포함할 수 있다.
이들 제제는 일본 약전 일반 조제법에 기재된 방법으로 제형화 할 수 있다.
또한, 본 발명의 조절제는 제형에 따라, 제약상 허용되는 고체 또는 액체 담체 또는 중재적인 치료 베이스를 함유할 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 고체 또는 액체 담체는 용매, 안정화제, 방부제, 가용화제, 유화제, 현탁제, 완충제, 등장화제, 착색제, 증점제, 부형제, 윤활제, 결합제, 붕괴제, 코팅제, 정화제 등을 들 수 있다.
전술한 제형, 담체 및 중재 요법은 본 발명의 치료제에도 적용된다.
본 발명의 조절제의 투여량 및 투여 횟수는 통상적으로 트롬빈-유사 효소의 형태, 환자의 체중 및 질병의 성질 및 상태에 따라 변화된다.
예를 들면, 성인에게 하루에 한 번, 트롬빈-유사 효소로서 배트록소빈을 투여하는 경우, 투여량은 0.1 내지 50 배트록소빈 단위(batroxobin unit)(약칭 BU)이다. 더욱 바람직한 배트록소빈 투여량으로서, 성인의 단일 투여량은 1 내지 20 BU이며, 투여는 격일로 수행된다. 외용제의 경우, 외용제 그램 당 0.01 내지 500 mg이다.
여기서, 배트록소빈 단위는 배트록소빈의 효소 활성을 나타내는 단위이며, 2 BU는, 0.1 mL의 배트록소빈 용액을 0.3 mL의 구연산 처리된 표준 인간에게 37℃에서 첨가한 후, 19.0 ± 0.2 초에서의 응고 활성과 동등하다.
성인에게 하루에 한번, 트롬빈-유사 효소로서 앵크로드를 투여하는 경우, 투여량은 0.01 내지 10 IU/kg이고, 더욱 바람직한 투여량은 0.5 IU/kg이다.
본 발명의 조절제는 필요에 따라 트롬빈-유사 효소를 희석한 후, 정맥내 투여, 정맥내 주사, 동맥내 주사, 근육내 주사, 피하 주사, 피내 주사, 심장내 주사, 복강내 주사, 또는 지주막하 주사; 직장내 투여, 설하 투여, 코점막 투여, 경피 투여, 또는 흡입; 또는 호중구 활성화에 의한 질병이 있는 기관 및/또는 조직 내로 국소 투여할 수 있다. 바람직하게는, 트롬빈-유사 효소를 100 ㎖ 이상의 식염수로 희석하고, 1시간 이상 정맥 내로 투여한다.
상기 투여량, 투여 횟수 및 투여 방법은 본 발명의 치료제에도 적용된다.
생쥐, 쥐, 토끼 및 개에서 배트록소빈의 급성 독성(LD50 (BU/kg))은 하기 표 1에 나타낸 바와 같다. 급성 독성 시험은 배트록소빈의 정맥 투여에 의해 평가되었다.
Figure pct00001
본 발명의 조절제 및 치료제는 호중구를 갖는 동물에 적용될 수 있다. 동물의 구체적인 예는 인간, 원숭이, 개, 돼지, 고양이, 토끼, 쥐 및 생쥐를 포함한다. 그 중에서도 인간이 바람직하다.
이하, 제조예 및 실시예를 나타내며, 본 발명을 구체적으로 설명한다. 그러나, 본 발명은 이에 한정되지 않는다.
[제조예 1] 조절제(치료제)의 준비
하기 조성을 갖는 배트록소빈 제제를 주사제로 제형화하였다.
Figure pct00002
[호중구의 준비]
1. 혈액 수집
건강한 성인 자원자가 실험 목적에 대한 설명을 듣고 동의하였다. 그런 다음, 20 mL 헤파린 주사기를 사용하여 중앙 정대 정맥으로부터 말초 정맥혈 15 mL를 채취하였다.
2. 호중구의 분리와 준비
혈액-세포 분리 용액으로는, 폴리모프레프 밀도 구배 용액(Polymorphprep density gradient solution)(PROGEN Biotechnik GmbH 제조)을 사용하였다. 말초 정맥혈 15mL에, 동일한 양의 분리 용액을 넣고, 480×g의 조건에서 30 분간 원심 분리한다. 상층의 단핵구를 흡인 제거한 후, 하층의 다핵 과립구를 10 mL의 행크 완충액(Hanks' buffer solution)에 옮기고, 400×g의 조건으로 20 분간 원심 분리했다. 그 다음, 세포 덩어리를 2 mL의 BD Pharm LyseTM (Becton Dickinson Sciences 제조)에 현탁시키고, 5 분 동안 얼음 조에서 용해 처리하였다. 용해 처리 후, 세포 현탁액을 300×g의 조건 하에서 10 분간 원심 분리하였다. 이어서, PBS-2mM EDTA 완충 용액을 사용하여 세포 덩어리를 다시 현탁시키고, 최종 부피를 15 mL로 조정하였다. 그 결과물을 하기 실시예에서 인간 호중구로 사용하였다.
TNF-α에 의해 유발된 호중구의 탈과립화에 대한 배트록소빈의 억제 작용
1. 실험 방법
1 % FBS-RPMI 1640 배양액을 사용하여, 1 x 106 세포/100 μL의 호중구 세포 현탁액을 준비하고 접종할 때까지 얼음 조에 넣었다.
호중구 탈과립화를 유발하는 인자로서, 염증성 사이토카인 인간 재조합 TNF-α(Peprotech, Inc. 제조의 hrTNF-α)를 50 ng/mL의 최종 농도로 사용하였다.
현탁액 세포를 위한 24 웰 플레이트(24 well plate)(Greiner Bio One International GmbH 제조) 내의 1 % FBS-RPMI 1640 배양액에, 배트록소빈(Tobishi Pharmaceutical Co., Ltd. 제조의 DF-521)(최종 농도: 0.2 BU/mL ) 단독, 인간 피브리노겐(Sigma-Aldrich Co. 제조의 hFbg)(최종 농도: 2 mg/mL) 단독, 또는 배트록소빈(최종 농도: 0.2 BU/mL)과 인간 피브리노겐(최종 농도: 2 mg/mL)을 조합하여, 시험 물질로서 첨가하였다. 따라서, 조건 배양액(900 μL/well)을 준비하였다.
양성 제어 물질로서, N- 포르밀메티오닐-류일-페닐알라닌(Sigma-Aldrich Co. 제조의 fMLP)(최종 농도: 20 nM)을 사용하였다.
인간 피브리노겐이 첨가된 웰에 대해, 인간 피브리노겐이 최종적으로 첨가 되었음에 유의한다. 인간 피브리노겐을 첨가 한 후, 37℃에서 15 분간 사전 배양하였다.
배트록소빈 및 인간 피브리노겐이 첨가된 웰에 대하여, 데스 아 피브린 젤 형성(Des A fibrin gel formation)이 확인되면, 각 조건의 배양액(웰)에 100㎕의 중성 현탁액을 접종하고, 37℃의 조건하에서 60 분간 배양하였다.
배양이 완료된 후, 200 ㎕ 피펫을 사용하여 겔을 제거하였다. 배양된 호중구를 포함하는 조건의 배양액 400 ㎕에 PerCP-Cy5.5-라벨 생쥐 항-인간 CD66b 항체 (BioLegend, Inc. 제조)를 첨가하여 반응시켰다. 이어서, FACSVerseTM 유동 세포계측법(Becton Dickinson Sciences 제조)를 사용하여, CD66b-양성 호중구를 탈과립화 호중구로서 측정하였다. FlowJoTM ver10.1 소프트웨어(Tommy Digital Biology Co., Ltd. 제조)를 사용하여 데이터를 분석하고, 그 값을 평균 형광 강도(mean fluorescence intensity)(MFI)로 나타내었다.
2. 결과
도 1에 나타낸 바와 같이, hrTNF-α는 호중구 탈과립화를 유도하였다.
호중구-활성화 양성 물질로서의 fMLP는 hrTNF-α에 의해 유발된 호중구 탈과립화를 분명히 향상시켰다.
배트록소빈(DF-521)을 단독으로 첨가하고, 인간 피브리노겐(hFbg)을 단독으로 첨가하면, hrTNF-α에 의해 유발된 호중구 탈과립화에 거의 영향을 미치지 않았다.
반면에 배트록소빈과 인간 피브리노겐을 첨가하면, hrTNF-α에 의해 유발된 호중구 탈과립화가 분명히 억제되었다.
이런 점에서, 피브리노겐은 생체 내에서 항상 호중구 주위에 존재한다. 따라서, 생체에 투여되는 배트록소빈은 호중구 탈과립화, 즉 호중구 활성화를 조절할 수 있으며, 즉, 염증이 발생하면 염증성 사이토카인에 의해 유발되는 호중구의 활성화를 조절할 수 있다.
TNF-α에 의해 유발된 호중구 Mac-1(CD18/CD11b)의 발현에 대한 배트록소빈의 억제 작용
1. 실험 방법
실시예 1의 1. 실험 방법과 동일한 방법으로, 각 시험 물질로 호중구를 배양하였다.
배양이 완료된 후, 200 ㎕ 피펫을 사용하여 겔을 제거하였고, 배양된 호중구를 포함하는 조건의 배양액 400 ㎕에 APC-Cy-라벨 생쥐 항-인간 CD11b 항체(BioLegend, Inc. 제조)와 PE-라벨 생쥐 항-CD18b 항체(BioLegend, Inc. 제조)를 첨가하여 반응시켰다. 이어서, FACSVerseTM 유동 세포 계측법(Becton Dickinson Sciences 제조)를 사용하여, Mac-1-양성 호중구를 활성화된 호중구로서 측정하였다. FlowJoTM ver10.1 소프트웨어(Tommy Digital Biology Co., Ltd. 제조)를 사용하여 데이터를 분석하고, 그 값을 평균 형광 강도(MFI)로 나타내었다.
2. 결과
도 2에 나타낸 바와 같이, hrTNF-α는 호중구 Mac-1 발현을 유도하였다.
호중구-활성화 양성 물질로서의 fMLP는 hrTNF-α에 의해 유발된 호중구 Mac-1 발현을 분명히 향상시켰다.
배트록소빈(DF-521)을 단독으로 첨가하고, 인간 피브리노겐(hFbg)을 단독으로 첨가하면, hrTNF-α에 의해 유발된 호중구 Mac-1 발현에 거의 영향을 미치지 않았다.
반면에 배트록소빈과 인간 피브리노겐을 첨가하면 hrTNF-α에 의해 유발된 호중구 Mac-1 발현이 분명히 억제되었다.
이런 점에서, 피브리노겐은 생체 내에서 항상 호중구 주위에 존재한다. 따라서, 생체에 투여되는 배트록소빈은 호중구 Mac-1 발현을 조절할 수 있으며, 즉 호중구 활성화는 염증이 발생하면 염증성 사이토카인에 의해 유발되는 호중구의 활성화를 조절할 수 있다.
TNF-α에 의해 유발된 호중구의 NETs 형성에 대한 배트록소빈의 억제 작용
1. 실험 방법
현탁액 세포를 위한 24 웰 플레이트의 각 웰의 저부에 커버 슬립을 놓고, 전술한 실시예 1의 실험 방법과 동일한 방법으로 호중구를 각 시험 물질로 배양하였다.
그럼에도 불구하고, 양성 제어 물질 fMLP의 최종 농도는 10 nM으로 설정되었다.
배양이 완료된 후, 그 결과물을 PBS로 세정하고, 2시간 동안 2.5 % 글루타르알데히드를 함유하는 0.1 M 인산 나트륨 완충액(pH7.4)에 예비 고정하였다. 0.1 M 인산 완충액(pH7.4)으로 10분 동안 3 회 세정한 후, 1 % 오스뮴 산을 사용하여 30 분간 고정하였다.
이어서, 50 %, 70 %, 80 %, 90 %의 에탄올로 10 분 동안 1 회 탈수하고, 또한 무수 에탄올로 10 분간 3회 탈수시켰다. 그 결과물을 t-부틸 알코올에 10 분간 3 회 침지 및 치환시킨 후, t-부틸 알콜로 동결 건조(JEOL Ltd.의 JFD-310)시켰다.
커버 슬립을 24 웰 플레이트로부터 꺼내어, 도전성 양면 테이프를 사용하여 주사 전자 현미경의 샘플 스테이지 상에 붙였다. 오스뮴 플라스마 코터 (Meiwafosis Co., Ltd. 제조의 Neoc-Pro)를 사용하여 증기를 증착시키고, 주사 전자 현미경(JEOL Ltd. 제조의 JSM-6510LV)을 사용하여, 15 kv의 가속 전압 조건 하에서 관찰하고 결상시켰다.
2. 결과
결과를 도 3에 나타낸다 (화살표는 NETs을 나타낸다).
hrTNF-α는 호중구의 NETs 형성을 유도했다 (도 3의 왼쪽 위).
호중구-활성화 양성 제어 물질로서의 fMLP는 분명히 호중구 NETs 형성을 분명히 야기하였다 (도 3의 우측 상부).
인간 피브리노겐을 단독으로 첨가하는 것만으로, hrTNF-α에 의해 유발된 호중구의 NETs 형성을 분명히 향상시켰다 (도 3의 좌측 아래).
반면에, 배트록소빈과 인간 피브리노겐을 첨가하면 hrTNF-α에 의해 유발된 호중구 NETs 형성이 분명히 억제되었다 (도 3의 우측 아래).
이런 점에서, 피브리노겐은 생체 내에서 항상 호중구 주위에 존재한다. 따라서, 생체에 투여되는 배트록소빈은 호중구 NETs의 형성, 즉 염증이 발생할 때 염증성 사이토카인에 의해 유도되는 호중구의 활성화를 조절할 수 있다.
TNF-α에 의해 유발된 호중구의 내피세포 이동(Transendothelial Migration)에 대한 배트록소빈의 억제 작용
이 실시예에서는, 호중구의 내피세포 이동에 대한 배트록소빈의 억제 작용을 hrTNF-α-유발된 호중구 내피세포 이동 분석법을 사용하여 평가하였다.
1. 실험 방법
호중구 내피세포 이동 분석은 필리에브(Pliyev) 등의 방법(Boris K. Pliyev et al., Molecular Immunology, 48, 1168-1177, 2011)에 따라 수행되었다. 내피 세포로서, 5 % FBS-EGM-2 내피 성장 배양액(Lonza Group 제조)에서 사전-배양한 제대 정맥 내피 세포(umbilical vein endothelial cells) (인간 제대 정맥 내피 세포, HUVEC, Lonza Group 제조)를 사용하였다. 피브로넥틴-코팅된 필터-장착 상부 챔버 (Corning Incorporated 제조의 필터 직경: 6.5 mm, 기공 크기: 3 ㎛)가 5 %의 FBS-EGM-2 배양액에서 재조정된 7.0×104 개의 HUVEC를 함유하는 200㎕의 세포 현탁액으로 배양되고, 5 % FBS-EGM-2 배양액 800μL를 하부 챔버의 24 웰 플레이트에 첨가하였다. 3 일 동안 배양한 후, 상부 챔버의 필터를 HUVECs로 단층 상태로 채웠다.
실험 당일, 현탁 세포를 배양하기 위한 24 웰 플레이트(Greiner Bio One International GmbH 제조)의 웰에, 전술한 [호중구의 준비]에서 분리 및 준비된 인간 호중구로부터 준비된 세포 현탁액을 첨가하여, 1 % FBS-RPMI 1640 배양액에서의 최종 세포 농도가 1.0×107 세포/웰이 되도록 하였다. 또한, 1 % FBS-RPMI 1640 배양액에서 준비된 시험 물질 용액을 웰에 첨가하였다. 시험 물질의 최종 농도는: 배트록소빈을 단독으로 첨가했을 때 0.2 BU/mL; 인간 피브리노겐을 단독으로 첨가했을 때 2.0 mg/mL; 배트록소빈과 인간 피브리노겐을 병용 투여한 경우, 배토록소빈은 0.2 BU/mL, 인간 피브리노겐은 2.0 mg/mL 이었다. 호중구는 이들 최종 농도와 1mL의 실험 시스템의 최종 부피의 조건하에서 1시간 동안 배양하여 전처리하였다.
전처리된 호중구를 수집하고 PBS로 세척하였다. 그런 다음, 1.0 x 107 세포/mL의 전처리된 호중구의 현탁액을 1 % FBS-RPMI 1640 배양액에서 준비하였다.
다음으로, HUVECs가 살아있는 상부 챔버를 200 μL의 1 % FBS-RPMI 1640 배양액으로 2회 세척하였다.
세척 후에, HUVECs가 살아있는 상부 챔버로, 1.0 x 107 세포/mL의 전처리된 호중구의 현탁액 100㎕를 첨가하였다. 하부 챔버에 1 % FBS-RPMI 1640 배양액에서 50 ng/mL의 최종 농도로 준비된 hrTNF-α 용액을 첨가한 다음, 3 시간 동안 배양하였다. 호중구를 하부 챔버로 이동시켰다.
하부 챔버로 이동한 인간 호중구를 수집하고, 혈구수 측정기를 사용하여 그 수효를 내피세포 이동 호중구로서 계산하였다.
2. 결과
도 4에 도시된 바와 같이, hrTNF-α는 호중구의 내피세포 이동을 유도하였다.
배트록소빈(DF-521)을 단독으로 첨가하면 hrTNF-α에 의해 유발된 호중구의 내피세포 이동에 거의 영향을 미치지 않았다.
인간 피브리노겐(hFbg)을 단독으로 첨가하면 hrTNF-α에 의해 유발된 호중구의 내피세포 이동이 분명히 향상되었다.
반면에, 배트록소빈과 인간 피브리노겐을 첨가하면 hrTNF-α에 의해 유발된 호중구의 내피세포 이동이 명확히 억제되었다.
이런 점에서, 생체 내에서 피브리노겐은 항상 호중구 주위에 존재한다. 따라서, 생체에 투여되는 배트록소빈은 호중구의 내피세포 이동, 즉 염증이 발생할 때 염증성 사이토카인에 의해 유도되는 호중구의 활성화를 조절할 수 있다.
배트록소빈의 급성 뒷다리 허혈성 근육 조직(Acute Hindlimb Ischemia Muscle Tissue)으로의 호중구 조직 침윤에 대한 억제 작용
1. 실험 방법
(1) DIO 생쥐 뒷다리 허혈성 모델의 준비
찰스 리버 레버러토리 제팬 인코포레이티드(Charles River Laboratories Japan, Inc.)에서, 출생 후 4 주차의 수컷 C57BL6/J 생쥐에게 고-지방식(American Research Diet 제조의 D12492, 5.25Kcal/g)을 지속적으로 먹였다. 이에 따라, 다이어트 유도 비만(DIO)(diet induced obesity) 생쥐를 만들었다. 고-지방식을 먹인 10주 된 DIO 생쥐를 찰스 리버 레버러토리 제팬 인코포레이티드에서 구입하여, 실험에 사용하기 위해 2 주 동안 습관화시켰다.
12주 된 DIO 생쥐를 사용하여, 한쪽의 뒷다리 허혈성 모델을 쯔카다 등의 방법에 따라 준비하였다.(Tsukada S. 등등: 출생 후의 신생 혈관 형성을 위한 생쥐 콜로니 형성 내피 전구 세포의 확인: 새로운 생쥐 콜로니 형성 분석에 의해 강조된 새로운 통찰력. Stem Cell Res Ther., 4 (1) : 20-33, 2013). 구체적으로, 생쥐들을 왼쪽 뒷다리의 사타구니 인대의 말단 부위의 피부를 절단하기 위해 1.5 내지 2.0 % 이소플루란(Baxter Limited 제조)의 흡입시켜 각각 마취시켰다. 대퇴 동맥의 근위 단부를 결찰 후, 복재 동맥의 말단을 결찰하였고, 모든 외측 가지를 해부하고 절제하였다. 그런 다음 외과용 스테플러로 피부 개구부를 닫았다.
뒷다리 허혈성 모델을 준비한 후, 모델 군(Model group)에 식염수를 복강 내에 투여하고, 30 BU/kg의 배트록소빈을 배트록소빈 군(DF-521 군)에 복강 내에 투여하였다. 그 다음, 쥐를 쥐 철장으로 돌려 보냈다. 모의 수술 군(Sham Operation group)은 피부 절개만을 받았다.
뒷다리 허혈성 모델 준비 후의 1 일차(16 시간) 또는 2 일차(36 시간)에, 1 : 1의 비율로 생리식염수 140μL/생쥐로 희석한 솜노펜틸(Somnopentyl)(등록 상표) (Kyoritsu Seiyaku Corporation 제조의, 64.8 mg/100mL)을 복강 내에 주사하고, 마취하여 심장으로부터 전혈을 채취하였다. 전혈은 BD Pharm LyseTM Lysing buffer (BD Biosciences 제조)를 사용하여 용해시켰다. 용해 후, 세포를 토끼 항-생쥐 항체를 사용하여 Ly6C-PE 및 Ly6G-PerCP Cy5.5(Biolegend, Inc. 제조)로 염색하였다. 혈액 1 mL 중의 단핵구와 호중구는 각각 Ly6C+ Ly6G- 세포 집단과 Ly6C+ Ly6G+ 세포 집단으로 평가되었다.
(2) 조직검사
마취 하에서 채혈한 후, 생쥐의 허혈성 뒷다리를 절제하고, 4 % 파라포름알데히드로 하룻밤 동안 고정시켰다. 고정된 조직은 조직검사, 골수세포형과산화효소(myeloperoxidase)(MPO) 면역조직화학 염색, 및 헤마톡실린-에오신(hamatoxylin-eosin)(HE) 염색을 위한 병리학 슬라이드 표본을 준비하기 위해, 파라핀으로 임베이드했다. 대상 재생 용액, pH 9.0(DAKO 제조)과 전자 레인지를 사용하여, 98℃에서 15분 동안, 탈 파라핀 시편의 MPO 항원을 재구성하였다. MPO 면역조직화학 염색을 위해, 10 % 정상 염소 혈청/0.25 % 카제인을 함유하는 PBS로 100 배 희석된 토끼 항-MPO 항체(Abcam plc. 제조)를 1차 항체로서 사용하였다. 슬라이드 표본은 4℃에서 일차 항체와 하룻밤 동안 반응시킨 후, PBS로 씻었다. 3 % H2O2-MeOH를 사용하여 실온에서 10 분간 조직의 보체결합 활성(Peroxidase activity)을 차단하였다. 이어서, 슬라이드 표본에 HRP(horse radish peroxidase)-표식 2차 항체(Nichirei Biosciences Inc. 제조의 Hadofine (등록 상표) SimpleStainTM Mouse MAX PO)를 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. 표본을 PBS로 세척한 후 DAB(DAKO 제조의 3,3'-Diaminobenzidine tetrahydrochloride)와 반응시키고, 착색시켜, MPO-양성 세포를 가시화 시켰다. 또한, 표본을 PBS로 세척하고, 핵을 헤마톡실린(hamatoxylin)으로 염색하였다. 염색된 표본은 미리놀(Marinol)로 밀봉되었다. 양성 제어를 위해, 일차 항체로서 500배 희석한 토끼 IgG(DAKO 제조)를 사용하였다. 각 표본은 광학 현미경(Olympus Corporation 제조의 DP73(등록 상표))으로 관찰되었다. MPO-양성 세포는 셀센스(cellSense)(등록 상표)(Olympus Corporation 제조) 소프트웨어를 사용하여 평가하였다.
(3) 통계 분석
모든 데이터는 평균값 또는 평균값 ± SD로 나타내었다. 생체 내 뒷다리 허혈성 실험에서, 크러스칼-윌리스 검사(Kruskal-Wallis test)를 사용하여 그룹 간의 분산 분석을 수행하고 그룹을 비교했다. P < 0.05는 통계적 유의성 차이의 수준으로 사용되었다.
2. 결과
(1) 배트록소빈이 혈액 내의 호중구 수에 미치는 영향
Figure pct00003
표 2에 나타난 바와 같이, 뒷다리 허혈성 모델 준비 후에 1 일차(16 시간)의 백혈구의 총수는 배트록소빈 군에서 5.4×105/mL 이었고, 모델 군에서의 13.5×105/mL보다 작았다. 2 일차(36 시간)에 배트록소빈 군의 총 백혈구 수가 1 일차 모델 군의 수준으로 되돌아 갔다.
유사하게, 뒷다리 허혈성 모델 준비 후에 1 일차(16 시간)에 호중구의 수와 단핵구의 수는 배트록소빈 군에서 모델 군보다 작았다. 특히 호중구 수가 9.59×105/mL에서 3.29×105/mL로 감소하였고, 단핵구의 수가 0.57×105/mL에서 0.32×105/mL로 감소하였다. 2 일차(36 시간)에 배트록소빈 군의 호중구 수와 단핵구 수는 모두 1 일차 모델 군의 수준으로 되돌아갔다.
(2) 허혈성 뒷다리 근육 조직에 대한 호중구 조직 침윤의 배트록소빈의 억제 작용(HE 염색)
도 5는 HE-염색된 허혈성 뒷다리 근육 조직의 이미지를 도시한다.
모델 군(Model group)과 관련하여, 허혈성 뒷다리 근육 조직으로의 호중구 조직 침윤은, 모델 준비 후 2 일차보다 더 컸다.
반면에, 배트록소빈 군(DF-521 군)의 호중구 조직 침윤은 모델 군의 호중구 조직 침윤보다 적었다. 특히, 모델 준비 후 2 일차에, 배트록소빈 군의 호중구 조직 침윤이 모델 군의 호중구 조직 침윤보다 분명히 작았다.
따라서, 생체에 투여되는 배트록소빈은 허혈성 뒷다리 근육 조직으로의 호중구 조직 침윤, 즉 호중구 활성화를 조절할 수 있다.
(3) 허혈성 뒷다리 근육 조직에 대한 호중구 조직 침윤의 배트록소빈의 억제 작용 (MPO 염색)
MPO 면역조직화학 염색-양성 세포로 관찰된 침윤 호중구는 ×40 고배율 시야(HPF)의 광학 현미경을 사용하여 정량화되었다. 그 결과를 도 6에 도시한다.
모델 군(Model group)과 관련하여, 모델 준비 후 2 일차의 호중구 조직 침윤은 1 일차보다 분명히 크고, 1 일차의 3.7 배(93.8/25.3)였다.
반면에, 배트록소빈 군(DF-521 군)에 대해서는 호중구 조직 침윤이 모델 군에 비해 분명히 적었다. 1 일차에, 그 수는 모델 군의 30.8 %이고, 2 일차에, 그 수는 모델 군의 25.8 % (P < 0.001)였다.
따라서, 생체에 투여되는 배트록소빈은 허혈성 뒷다리 근육 조직으로의 호중구 조직 침윤, 즉 호중구 활성화를 조절할 수 있다.
본 발명은 호중구 활성화 조절제로서, 또한 호중구 활성화에 기인하는 각종 질병에 대한 치료제로서 유용하다.

Claims (10)

  1. 트롬빈-유사 효소를 유효 성분으로 구비하는 호중구 활성화 조절제.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 트롬빈-유사 효소는 배트록소빈, 앵크로드, 및 크로타라제로 이루어진 군에서 선택되는, 호중구 활성화 조절제.
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 트롬빈-유사 효소는 배트록소빈인, 호중구 활성화 조절제.
  4. 제 1 항에 있어서,
    호중구 활성화는 호중구 탈과립화를 억제함으로써 조절되는, 호중구 활성화 조절제.
  5. 제 1 항에 있어서,
    호중구 활성화는 호중구 Mac-1 발현을 억제함으로써 조절되는, 호중구 활성화 조절제.
  6. 제 1 항에 있어서,
    호중구 활성화는 호중구 NETs 형성을 억제함으로써 조절되는, 호중구 활성화 조절제.
  7. 제 1 항에 있어서,
    호중구 활성화는 호중구 내피세포 이동을 억제함으로써 조절되는, 호중구 활성화 조절제.
  8. 제 1 항에 있어서,
    호중구 활성화는 호중구 조직 침윤을 억제함으로써 조절되는, 호중구 활성화 조절제.
  9. 호중구 활성화에 기인한 질병에 대한 치료제로서,
    상기 치료제는 제 1 항에 따른 호중구 활성화 조절제를 구비하는, 치료제.
  10. 제 9 항에 있어서,
    상기 호중구 활성화에 기인한 질병은 패혈증, 급성 호흡 곤란 증후군, 급성 췌장염, 및 급성 폐질병으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 치료제.
KR1020197020257A 2017-01-13 2018-01-12 호중구 활성화 조절제 KR20190095372A (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JPJP-P-2017-004219 2017-01-13
JP2017004219 2017-01-13
PCT/JP2018/001470 WO2018131724A1 (en) 2017-01-13 2018-01-12 Neutrophil activation regulator

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20190095372A true KR20190095372A (ko) 2019-08-14

Family

ID=62840092

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020197020257A KR20190095372A (ko) 2017-01-13 2018-01-12 호중구 활성화 조절제

Country Status (9)

Country Link
US (1) US20210128699A1 (ko)
EP (1) EP3568153A4 (ko)
JP (1) JP7100854B2 (ko)
KR (1) KR20190095372A (ko)
CN (1) CN110300596A (ko)
CA (1) CA3049856C (ko)
RU (1) RU2742417C1 (ko)
TW (2) TWI739983B (ko)
WO (1) WO2018131724A1 (ko)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2716492C1 (ru) * 2019-05-14 2020-03-12 Федеральное Государственное Бюджетное Научное Учреждение "Федеральный Научно-Клинический Центр Реаниматологии И Реабилитологии" (Фнкц Рр) Способ регулирования активации нейтрофилов в модели in vitro
EP4393507A1 (en) 2021-07-30 2024-07-03 National University Corporation Hokkaido University Pharmaceutical composition for treating peripheral nerve injury

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS587937A (ja) 1981-07-06 1983-01-17 Mitsubishi Electric Corp 信号検出装置
JPH05148249A (ja) 1991-11-28 1993-06-15 Japan Tobacco Inc ベンゾオキサジノン誘導体
JPH07242624A (ja) 1994-02-28 1995-09-19 Japan Tobacco Inc 新規なアゼチジノン誘導体
JP2003502434A (ja) 1999-06-22 2003-01-21 スィーヴィー セラピューティクス インコーポレイテッド チオフェンａ２ａ受容体アゴニスト
JP2003506461A (ja) 1999-06-22 2003-02-18 スィーヴィー セラピューティクス インコーポレイテッド Ｎ−ピラゾールａ２ａ受容体アゴニスト
WO2014168253A1 (ja) 2013-04-09 2014-10-16 国立大学法人東京大学 白血球の細胞外トラップ形成の阻害剤

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB9908647D0 (en) * 1999-04-15 1999-06-09 Smithkline Beecham Plc Novel compounds
IL154306A0 (en) 2003-02-05 2003-09-17 Rimonyx Pharmaceuticals Ltd Pharmaceutical compositions comprising thieno [2,3-c] pyridine derivatives and use thereof
CN101074437A (zh) * 2003-05-13 2007-11-21 锦州奥鸿药业有限责任公司 一种蛇毒血凝酶ⅰ级酶制品及其生产方法
WO2006001523A1 (ja) * 2004-06-24 2006-01-05 Tobishi Pharmaceutical Co., Ltd. Des A フィブリンを含有する悪性腫瘍抑制剤
US20100034803A1 (en) * 2005-09-30 2010-02-11 Tobishi Pharmaceutical Co., Ltd. Activating agent of stem cells and/or progenitor cells
TWI482629B (zh) * 2008-07-01 2015-05-01 Tobishi Pharmaceutical Co 下泌尿道疾病治療劑及下泌尿道症狀改善劑
CN102378763A (zh) * 2009-01-30 2012-03-14 葛兰素集团有限公司 消炎的大环内酯
US20120288474A1 (en) 2009-11-06 2012-11-15 Protaffin Biotechnologie Ag Composition for treatment of cxcl8-mediated lung inflammation
US9822069B2 (en) * 2013-11-28 2017-11-21 Kyorin Pharmaceutical Co., Ltd. Urea derivative or pharmacologically acceptable salt thereof

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS587937A (ja) 1981-07-06 1983-01-17 Mitsubishi Electric Corp 信号検出装置
JPH05148249A (ja) 1991-11-28 1993-06-15 Japan Tobacco Inc ベンゾオキサジノン誘導体
JPH07242624A (ja) 1994-02-28 1995-09-19 Japan Tobacco Inc 新規なアゼチジノン誘導体
JP2003502434A (ja) 1999-06-22 2003-01-21 スィーヴィー セラピューティクス インコーポレイテッド チオフェンａ２ａ受容体アゴニスト
JP2003506461A (ja) 1999-06-22 2003-02-18 スィーヴィー セラピューティクス インコーポレイテッド Ｎ−ピラゾールａ２ａ受容体アゴニスト
WO2014168253A1 (ja) 2013-04-09 2014-10-16 国立大学法人東京大学 白血球の細胞外トラップ形成の阻害剤

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
브린크만 브이(Brinkmann V) 외: 박테리아를 죽이는 호중구 세포밖 트랩. 사이언스. 303: 1532-1535, 2004.

Also Published As

Publication number Publication date
CN110300596A (zh) 2019-10-01
TW202130362A (zh) 2021-08-16
EP3568153A4 (en) 2020-09-16
US20210128699A1 (en) 2021-05-06
EP3568153A1 (en) 2019-11-20
CA3049856C (en) 2021-10-26
TW201825113A (zh) 2018-07-16
WO2018131724A1 (en) 2018-07-19
TWI739983B (zh) 2021-09-21
RU2742417C1 (ru) 2021-02-05
JP7100854B2 (ja) 2022-07-14
CA3049856A1 (en) 2018-07-19
TWI823085B (zh) 2023-11-21
JP2020514308A (ja) 2020-05-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Danese et al. Platelets trigger a CD40-dependent inflammatory response in the microvasculature of inflammatory bowel disease patients
RU2533253C2 (ru) Фармацевтический препарат, включающий надосадочную жидкость культуры мононуклеарных клеток крови
Herbrig et al. Increased total number but impaired migratory activity and adhesion of endothelial progenitor cells in patients on long-term hemodialysis
JP4819364B2 (ja) 線維細胞形成阻害の検出方法、ならびに線維細胞形成を増強する方法および化合物
Mena et al. Extracellular histones reduce survival and angiogenic responses of late outgrowth progenitor and mature endothelial cells
Mohammadipoor et al. Stanniocalcin-1 attenuates ischemic cardiac injury and response of differentiating monocytes/macrophages to inflammatory stimuli
CN109789163A (zh) 用于在治疗肝损伤中使用的基于巨噬细胞的疗法
Li et al. Impaired angiogenic potency of bone marrow cells from patients with advanced age, anemia, and renal failure
US10905716B2 (en) Modified blood clots
JP5823691B2 (ja) 生着のための細胞を調製するための方法
KR20190095372A (ko) 호중구 활성화 조절제
ES2529183T3 (es) Agente regenerador de tejido biológico y método para preparar y usar el mismo
Mirabelli Inhibitors of corneal inflammation and angiogenesis: Prospectives and challenges
Zhao et al. High mobility group box 1 derived mainly from platelet microparticles exacerbates microvascular obstruction in no reflow
WO2018137701A1 (zh) 靶向cxcr7的药物组合物和方法
Han et al. Mesenchymal stromal cells and alpha-1 antitrypsin have a strong synergy in modulating inflammation and its resolution
Ma et al. Endothelial bioreactor system ameliorates multiple organ dysfunction in septic rats
CN112569338B (zh) Tdfa在制备预防和/或治疗眼表炎症疾病的药物中的应用
Wu Heterodimer of erythropoietin receptor and β common receptor in renal ischemia-reperfusion injury and repair
Antoni CD8+ T cells in the bone marrow and their impact on the differentiation of dendritic cells during polymicrobial sepsis
Seifert The Inflammatory Response Initiated by the Spleen to Ischemic Stroke
Dou ADAM17 AND AGING-RELATED VASCULAR DYSFUNCTION
KR20230002359A (ko) 상처 치유 및 조직 재생에 유용한 혈액 제제
Bertin Leukocytes in venous thrombosis
White Characterisation of microglia's inflammatory response and investigation of the effect of mesenchymal stem cells-conditioned media

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
AMND Amendment
E601 Decision to refuse application
AMND Amendment
X601 Decision of rejection after re-examination