KR20190073416A - 신규한 hpv16 hla-비제한적 t-세포 백신, 조성물 및 이의 사용 방법 - Google Patents

신규한 hpv16 hla-비제한적 t-세포 백신, 조성물 및 이의 사용 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR20190073416A
KR20190073416A KR1020197012979A KR20197012979A KR20190073416A KR 20190073416 A KR20190073416 A KR 20190073416A KR 1020197012979 A KR1020197012979 A KR 1020197012979A KR 20197012979 A KR20197012979 A KR 20197012979A KR 20190073416 A KR20190073416 A KR 20190073416A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
peptide
seq
hla
composition
peptides
Prior art date
Application number
KR1020197012979A
Other languages
English (en)
Inventor
프랭크 베두-아도
그렉 콘
마틴 워드
제롤드 우드워드
Original Assignee
피디에스 바이오테크놀러지 코퍼레이션
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 피디에스 바이오테크놀러지 코퍼레이션 filed Critical 피디에스 바이오테크놀러지 코퍼레이션
Publication of KR20190073416A publication Critical patent/KR20190073416A/ko

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Liposomes
    • A61K9/1271—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes, liposomes coated with polymers
    • A61K9/1272—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes, liposomes coated with polymers with substantial amounts of non-phosphatidyl, i.e. non-acylglycerophosphate, surfactants as bilayer-forming substances, e.g. cationic lipids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55555—Liposomes; Vesicles, e.g. nanoparticles; Spheres, e.g. nanospheres; Polymers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/58—Medicinal preparations containing antigens or antibodies raising an immune response against a target which is not the antigen used for immunisation
    • A61K2039/585—Medicinal preparations containing antigens or antibodies raising an immune response against a target which is not the antigen used for immunisation wherein the target is cancer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/20011—Papillomaviridae
    • C12N2710/20022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/20011—Papillomaviridae
    • C12N2710/20034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/20011—Papillomaviridae
    • C12N2710/20071—Demonstrated in vivo effect

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

신규한 인간 파필로마바이러스 면역원성 조성물 및 이의 사용 방법을 제공한다. 조성물은 효과적으로 프로세싱되어 T-세포에 교차-제시되도록 특이적으로 선택되어 디자인된 다중-에피토프 펩티드 서열의 고유한 조합을 포함한다. 조성물에서 이용되는 펩티드는 HLA-수퍼타입과 높은 결합 수준을 나타낸다. 면역원성 조성물은 표적 개체군의 많은 부분에 광범위하게 적용가능하다. 조성물은 보강제 예컨대 양이온성 지질을 포함한다.

Description

신규한 HPV16 HLA-비제한적 T-세포 백신, 조성물 및 이의 사용 방법
본 개시 내용의 구체예는 일반적으로 신규 HPV16 백신, 특히, HLA-비제한적 T-세포 백신, 조성물 및 이의 사용 방법에 관한 것이다.
HPV E6 및 E7 단백질 항원에 의한 치료적 백신접종은 HPV-유도된 암 예컨대 자궁경부, 항문, 외음부, 질 및 두경부의 암을 비롯하여 전암성 신생물(pre-cancerous neoplasia)을 치료하는 강력한 잠재력을 제공하는 것으로 입증되었다. HPV-특이적 T-세포 반응을 유도하는 항원-교차 제시를 수행하는 제한된 능력으로 인해서, HPV 치료적 백신접종에 대한 초창기 접근법은 짧은 단일 CD8+ 펩티드 에피토프의 내포 및 제시에 의존적이었다. 제한적인 HLA-A2 에피토프로 인해 이들 펩티드-기반 HPV 백신은 평가되고 선택된 HLA-A2 개체군 내에서도 매우 한정적인 적용가능성이 입증되었다. 암 백신의 이러한 결정적인 단점을 극복하려는 보다 최근의 접근법은 다음의 2가지 핵심 접근법 또는 플랫폼에 집중되었다: 1. 생벡터 예컨대 변형된 바이러스 및 박테리아로 코딩되는 HPV 전장 단백질 DNA의 전달. 2. 온전한 전장 HPV16 E6 및 E7 단백질 서열을 포괄하는 다수의 중복되는 긴 다중-에피토프 펩티드의 사용. 두가지 접근법은 모두 광범위한 환자 개체군을 다루기 위해 짧은 단일-에피토프 HLA-2 펩티드를 사용하여 직면한 환자 유전적 제한을 극복하기 위한 것이고, 두가지 접근법은 모두 인간 임상 시험에서 잠재적인 가망성을 보인다.
인-실리코 펩티드 결합 분석은 면역원성 펩티드의 잠재적인 결합 수용능을 이해하는데 효과적으로 사용되어 왔다. 그러나 이러한 기술은 단순하다는 특징을 갖지만 여전히 다양한 유전적 배경을 갖는 광범위한 환자 개체군의 요구를 다루는 잠재성을 갖는 암 백신을 보다 효율적으로 디자인하는데는 사용되지 않았었다.
T 세포는 세포내 병원체, 바이러스-감염 세포 및 종양 세포의 청소를 담당하는 것을 비롯하여, 이식 거부 및 자가면역을 담당하는 것을 포함한 광범위 면역 반응을 매개한다. T 세포 면역계는 외래 세포를 비롯하여 변경된 자기-세포를 인식하여 그들을 신체로부터 제거하도록 적합화된다. 펩티드 항원의 T 세포 인식은 T 세포 수용체 (T cell receptor, TCR)를 통해서 일어난다. 그 과정은 항원 제시 세포 (antigen presenting cell, APC) 예컨대 수지상 세포의 표면 상에 위치하는 주조직 적합성 (major histocompatibility complex, MHC) 분자에 의해 TCR에 펩티드 항원을 제시하는 것이 요구된다. 인간 MHC 분자는 인간 조직적합 백혈구 항원 (human histocompatibility leukocyte antigen, HLA)이라고 한다. 펩티드 항원은 T 세포 수용체가 MHC 분자 및 특이적 펩티드의 조합으로 형성된 고유한 구조를 인식할 수 있게 하는 방식으로 MHC 분자에 부착된다. T 세포 기능성의 제한적인 측면은 MHC 분자의 다형성 (polymorphism)을 비롯하여, MHC와 회합될 수 있는 고유한 펩티드의 광범위 스펙트럼이 다양한 인식 패턴을 초래하여 소정의 MHC-펩티드 조합이 T 세포 클론의 분획에 의해서만 인식된다는 것이다.
항원 제시에 관여되는 MHC 분자는 다음의 2종의 주요한 유형이 존재한다: 클래스 I 및 클래스 II. MHC 클래스 I 분자는 3개 도메인을 비롯하여 막관통 및 세포질 도메인을 갖는 알파 사슬로 구성된다. MHC 클래스 I 분자는 광범위하게 분포되고 모든 유핵 세포 상에 존재한다. MHC 클래스 II 분자는 자가-회합되어 이질이합체 (heterodimer)를 형성하는 알파 사슬 및 베타 사슬로 구성된다. 각각의 사슬은 2개의 세포외 도메인을 비롯하여, 막관통 및 세포내 도메인을 갖는다. MHC 클래스 II 분자는 클래스 I 분자보다 분포가 더 제한적이고, 예를 들어 항원 제시 세포 (APC) 상에 존재한다.
특정한 항원에 대해 특이적으로 활성화된 세포독성 T 림프구 (cytotoxic T lymphocyte, "CTL")는 항원을 함유하거나 또는 발현하는 세포를 사멸시킬 수 있다. CTL의 TCR은 MHC 클래스 I 분자의 환경에서 항원을 인식한다. T 도움 림프구 (T helper lymphocyte "Th 세포")의 중요한 역할은 CTL 반응의 최적 유도이고 그들은 또한 CTL 기억의 유지에서 역할을 할 수 있다. Th 세포의 TCR은 MHC 클래스 II 분자의 환경에서 항원을 인식한다.　
항원-인식 T-세포를 프라이밍하기 위한 치료적 백신접종은 환자의 면역계를 활성화시켜 초기 및 후기 질환 둘 모두를 치료하는 것을 목표로 하는 암의 능동 면역요법에 대한 실현가능한 선택안으로서 입증되었다. 치료적 백신접종에 의해 활성화되는 다양한 기전은 항원-발현 암 세포를 특이적으로 공격 및 파괴하고 정상 세포는 무시한다. 그러므로 치료적 암 백신은 이론적으로 종양 성장의 억제를 비롯하여 통상의 요법, 예컨대 수술, 방사선 및 화학요법에 난치성인 재발성 종양을 치료하는데 효과적일 수 있다. 전립선암을 치료하기 위한 치료적 암 백신은 이미 미국 식품의약국의 승인을 받았다. 이러한 주요한 발전은 개선된 안전성 및 효능을 제공할 수 있는 치료적 백신접종에 대한 신규한 접근법을 위한 길을 마련하였다. 몇몇 이러한 접근법은 현재 전임상 및 임상적으로 평가되고 있다. 일반적으로 건강한 개체에게 투여되는 예방적 항체-유도 백신과 달리, 치료적 암 백신은 암 환자에게 투여되어 환자 자신의 면역 반응, 구체적으로 T-세포 반응을 강화시킴으로써 암 세포를 제거하도록 디자인된다 (Lollini PL, Cavallo F, Nanni P, Forni G. Vaccines for tumour prevention. Nature reviews. Cancer. 2006; 6 :204-216).
치료적 표적으로서 종양-연관 항원
일반적으로 보강제(adjuvant) 또는 면역조정제(immune modulator)와 조합하여 투여되는, 한정된 종양-연관 항원 (tumor-associated antigen, TAA) 유래 단백질을 기반으로 하는 재조합 백신, 또는 TAA로부터 유래된 합성 펩티드 백신은 자기유래 및 DC 백신보다 비용 및 간결성에서 상당한 장점이 존재한다. 환자의 샘플 또는 표본의 이용가능성 및 개별화된 백신을 제조하는 복잡한 절차는 자기유래 암 백신의 광범위 사용을 제한한다. MAGE-1은 T 세포에 의해 인식되는 인간 종양 항원을 코딩하는 것으로 보고된 최초의 유전자 (van der Bruggen P, Traversari C, Chomez P, Lurquin C, De Plaen E, Van den Eynde B, Knuth A, Boon T. A gene encoding an antigen recognized by cytolytic T lymphocytes on a human melanoma. Science. 1991; 254 :1643-1647.)이고, 충분히 연구되어 임상 암 백신에서 사용되고 있다. 몇몇 TAA의 동정은 광범위한 암을 다루도록 다양한 표적화 치료 백신을 개발하고 디자인하는 능력을 제공하였다. 이러한 TAA는 몇몇 주요한 범주로 분류되었다. 암-고환 항원, 예컨대 NY-ESO-1, BAGE, MAGE, 및 SSX-2는 성인 조직에서 전형적으로 침묵되어 있지만 종양 세포에서 전사적으로 재활성화되는 유전자에 의해 코딩된다 (De Smet C, Lurquin C, van der Bruggen P, De Plaen E, Brasseur F, Boon T. Sequence and expression pattern of the human MAGE2 gene. Immunogenetics. 1994; 39 :121-129 ; 　 Gnjatic S, Ritter E, Buchler MW, Giese NA, Brors B, Frei C, Murray A, Halama N, Zornig I, Chen YT, Andrews C, Ritter G, Old LJ, Odunsi K, Jager D. Seromic profiling of ovarian and pancreatic cancer. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 2010; 107 :5088-5093 ; 　 Hofmann O, Caballero OL, Stevenson BJ, Chen YT, Cohen T, Chua R, Maher CA, Panji S, Schaefer U, Kruger A, Lehvaslaiho M, Carninci P, Hayashizaki Y, Jongeneel CV, Simpson AJ, Old LJ, Hide W. Genome-wide analysis of cancer/testis gene expression. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 2008; 105 :20422-20427 ; Karbach J, Neumann A, Atmaca A, Wahle C, Brand K, von Boehmer L, Knuth A, Bender A, Ritter G, Old LJ, Jager E. Efficient in vivo priming by vaccination with recombinant NY-ESO-1 protein and CpG in antigen naive prostate cancer patients. Clinical cancer research: an official journal of the American Association for Cancer Research. 2011; 17 :861-870). 조직 분화 항원은 정상 조직 기원의 항원이고 정상 조직과 종양 둘 모두가 공유하지만, 종양 세포, 예컨대 흑색종 (gp100, Melan-A/Mart-1 및 티로시나제 (tyrosinase)) (Bakker AB, Schreurs MW, de Boer AJ, Kawakami Y, Rosenberg SA, Adema GJ, Figdor CG. Melanocyte lineage-specific antigen gp100 is recognized by melanoma-derived tumor-infiltrating lymphocytes. J Exp Med. 1994; 179 :1005-1009. . Bakker AB, Schreurs MW, de Boer AJ, Kawakami Y, Rosenberg SA, Adema GJ, Figdor CG. Melanocyte lineage-specific antigen gp100 is recognized by melanoma-derived tumor-infiltrating lymphocytes. J Exp Med. 1994; 179 :1005-1009), 전립선암 (PSA, PAP) (Correale P, Walmsley K, Nieroda C, Zaremba S, Zhu M, Schlom J, Tsang KY. In vitro generation of human cytotoxic T lymphocytes specific for peptides derived from prostate-specific antigen. J Natl Cancer Inst. 1997; 89 :293-300 ; 　 Kantoff PW, Higano CS, Shore ND, Berger ER, Small EJ, Penson DF, Redfern CH, Ferrari AC, Dreicer R, Sims RB, Xu Y, Frohlich MW, Schellhammer PF. Sipuleucel-T immunotherapy for castration-resistant prostate cancer. The New England journal of medicine. 2010a; 363 :411-422) 및 유방 암종 (맘마글로빈-A (mammaglobin-A)) (Jaramillo A, Majumder K, Manna PP, Fleming TP, Doherty G, Dipersio JF, Mohanakumar T. Identification of HLA-A3-restricted CD8+ T cell epitopes derived from mammaglobin-A, a tumor-associated antigen of human breast cancer. International journal of cancer. Journal international du cancer. 2002; 102 :499-506)에서 상승된다. 이들 분화-연관 항원과 유사하게, 몇몇 다른 종양 항원, 예컨대 CEA (Tsang KY, Zaremba S, Nieroda CA, Zhu MZ, Hamilton JM, Schlom J. Generation of human cytotoxic T cells specific for human carcinoembryonic antigen epitopes from patients immunized with recombinant vaccinia-CEA vaccine. J Natl Cancer Inst. 1995; 87 :982-990), MUC-1(Finn OJ, Gantt KR, Lepisto AJ, Pejawar-Gaddy S, Xue J, Beatty PL. Importance of MUC1 and spontaneous mouse tumor models for understanding the immunobiology of human adenocarcinomas. Immunologic research. 2011; 50 :261-268), HER2/Neu (Disis ML, Wallace DR, Gooley TA, Dang Y, Slota M, Lu H, Coveler AL, Childs JS, Higgins DM, Fintak PA, dela Rosa C, Tietje K, Link J, Waisman J, Salazar LG. Concurrent trastuzumab and HER2/neu-specific vaccination in patients with metastatic breast cancer. Journal of clinical oncology, official journal of the American Society of Clinical Oncology. 2009;27:4685-4692), 종양 억제 유전자 (p53) (Azuma K, Shichijo S, Maeda Y, Nakatsura T, Nonaka Y, Fujii T, Koike K, Itoh K. Mutated p53 gene encodes a nonmutated epitope recognized by HLA-B*4601-restricted and tumor cell-reactive CTLs at tumor site. Cancer Res. 2003; 63 :854-858), hTERT (Vonderheide RH, Hahn WC, Schultze JL, Nadler LM. The telomerase catalytic subunit is a widely expressed tumor-associated antigen recognized by cytotoxic T lymphocytes. Immunity. 1999; 10 :673-679) 및 일정 항-세포사멸 단백질 (예를 들어, 서바이빈 (survivin)) (Vonderheide RH, Hahn WC, Schultze JL, Nadler LM. The telomerase catalytic subunit is a widely expressed tumor-associated antigen recognized by cytotoxic T lymphocytes. Immunity. 1999; 10 :673-679)이 또한 정상 대응물과 비교하여 종양 조직에서 고도로 상승된다. 고유한 종양-특이적 항원은 종종 돌연변이된 종양유전자 (ras, B-raf)라고 한다 (Brichard VG, Lejeune D. Cancer immunotherapy targeting tumour-specific antigens: towards a new therapy for minimal residual disease. Expert opinion on biological therapy. 2008; 8 :951-968). 신생물적 과정을 구동시키는데 관여되는 이들 종양-특이적 항원의 표적화는 보다 효율적인 잠재성의 면역선택에 대한 내성의 장점을 갖는다. 수많은 이러한 종양-특이적 항원이 동정되어 이용되었지만, 다양한 이유로 추가의 이러한 항원의 동정이 계속 요구되고 있다: 인간 개체군 간에 광범위하게 다양한 유전자 프로파일을 고려하면, 그러한 그룹을 어떻게 동정하였는지, 예를 들어 그 인종 또는 지리적 위치와 무관하게, 특정한 그룹에 대한 특이성이 증가된 항원을 동정하려는 요구가 존재한다. 백신 생산 과정을 보다 정확하고 덜 귀찮게 만들려는 요구가 약학 산업에서 계속 존재하며, 따라서 적절한 면역학적 반응을 유발하는 것과 가장 정확하게 연관된 항원, 단백질 및 펩티드의 단리가 진행중인 목표이다.
단백질/펩티드-기반 백신은 자기유래 또는 개별화된 백신보다 분명한 비용 장점을 갖는다. 그러나, 그들이 TAA의 소수 에피토프 또는 오직 하나의 에피토프만을 표적으로 한다는 사실은 단점으로 여겨질 수 있다. 일반적으로 항원-특이적 CTL 및 항원-특이적 CD4+　도움 T 세포 둘 모두의 유도가 암 백신을 최적으로 효율적이게 하는데 필수적이라고 여겨진다. 일부 폴리펩티드 백신 (예를 들어, Stimuvax®)은 잠재적으로 CD4 및 CD8 에피토프 둘 모두를 함유한다. 자가-항원의 면역원성을 증강시키기 위한 다른 접근법은 더 높은 수준의 T-세포 반응 및/또는 더 높은 결합성 (avidity) T 세포가 야기되도록, MHC 분자 또는 T-세포 수용체에 결합하는 펩티드를 증가시키는, 인핸서 효현제 에피토프를 도입시키기 위해 TAA의 펩티드 서열을 변경시켰다 (Dzutsev AH, Belyakov IM, Isakov DV, Margulies DH, Berzofsky JA. Avidity of CD8 T cells sharpens immunodominance. International immunology. 2007; 19 :497-507 ; 　 Jordan KR, McMahan RH, Kemmler CB, Kappler JW, Slansky JE. Peptide vaccines prevent tumor growth by activating T cells that respond to native tumor antigens. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 2010; 107 :4652-4657 ; Rosenberg SA, Yang JC, Schwartzentruber DJ, Hwu P, Marincola FM, Topalian SL, Restifo NP, Dudley ME, Schwarz SL, Spiess PJ, Wunderlich JR, Parkhurst MR, Kawakami Y, Seipp CA, Einhorn JH, White DE. Immunologic and therapeutic evaluation of a synthetic peptide vaccine for the treatment of patients with metastatic melanoma. Nat Med. 1998; 4 :321-327).
치료적 암 백신접종에 대한 통상의 접근법은 TAA의 서열로부터 유래된 정확한 MHC 인간 백혈구 항원 (HLA) 결합 펩티드로 백신접종 하였다. T 세포는 세포 표면에서 MHC 클래스 I 분자가 제시하는 8-10개 아미노산의 펩티드로서 그들 표적 항원을 인식한다. 이러한 접근법의 주요 단점은 인간이 상이한 펩티드 항원을 인식하여 결합하는 광범위한 HLA 대립유전자를 가져 유전적으로 다양하다는 사실이다. 그 결과로, 짧은 펩티드를 기반으로 하는 암 백신은 매우 제한적인 이용가능성이 입증되었고 최근의 접근법은 타당한 개체군 포괄도를 제공하기 위해서 몇몇 펩티드 때때로 10종 이상의 펩티드의 포함을 요구하였다.
HPV 백신
HPV E6 및 E7 단백질은 모든 HPV 감염된 전암성 세포에서 본질적으로 공발현되고 HPV-관련 자궁경부 암종 세포 유래 생검에서 발견되는 가장 풍부한 바이러스 전사물이다 (K. Seedorf, T. Oltersdorf, G. Krammer, W. Rowekamp, Identification of early proteins of the human papilloma viruses type 16 (HPV 16) and type 18 (HPV 18) in cervical carcinoma cells. EMBO J. 6, 139-144 (1987)). p53 및 망막모세포종 단백질의 상호작용 때문에 (D. Pim, A. Storey, M. Thomas, P. Massimi, L. Banks, Mutational analysis of HPV-18 E6 identifies domains required for p53 degradation in vitro, abolition of p53 transactivation in vivo and immortalisation of primary BMK cells. Oncogene 9, 1869-1876 (1994)), E6 및 E7은 세포의 형질전환을 담당하고 HPV-연관 악성종의 유지에 필요하다 (K. Munger, P. M. Howley, Human papillomavirus immortalization and transformation functions. Virus Res. 89, 213-228 (2002)). 특히, E6- 및 E7-특이적 세포 면역 반응은 HPV16-연관 병변의 퇴행과 연관된다 (S. Peng, C. Trimble, L. Wu, D. Pardoll, R. Roden, C. F. Hung, T. C. Wu, HLA-DQB1*02-restricted HPV-16 E7 peptide-specific CD4+ T-cell immune responses correlate with regression of HPV-16-associated high-grade squamous intraepithelial lesions. Clin. Cancer Res. 13, 2479-2487 (2007)). Farhat 등은 지속성 자궁경부 HPV16 감염 여성과 비교하여, HPV16 E6 및 E7에 대한 양성 효소-연결 면역스폿 (ELISpot) 반응의 백분율이 최근에 해결된 HPV 감염을 갖는 여성 중에서 상당히 증가된다고 보고하였다 (S. Farhat, M. Nakagawa, A. B. Moscicki, Cell-mediated immune responses to HPV-16 E6 and E7 antigens as measured by interferon gamma enzyme-linked immunospot in women with cleared or persistent human papillomavirus infection. Int. J. Gynecol. Cancer 19, 508-512 (2009)). 그러므로, HPV E6 및 E7 항원은 유망한 면역요법적 표적으로 간주된다. 지금까지, 단백질/펩티드-기반 백신을 포함한, 몇몇 유형의 HPV 치료적 백신 (L. Muderspach, S. Wilczynski, L. Roman, L. Bade, J. Felix, L. A. Small, W. M. Kast, G. Fascio, V. Marty, J. Weber, A phase I trial of a human papillomavirus (HPV) peptide vaccine for women with high-grade cervical and vulvar intraepithelial neoplasia who are HPV 16 positive. Clin. Cancer Res. 6, 3406-3416 (2000); W.J. van Driel, M.E. Ressing, G.G. Kenter, R.M.P. Brandt, E.J.T. Krul, A.B. van Rossum, E. Schuuring, R. OVringa, T. Bauknecht, A. Tamm-Hermelink, P.A. van Dam, G.J. Fleuren, W.M. Kast, C.J.M. Melief and J.B. Trimbos, Vaccination with HPV16 Peptides of Patients with Advanced Cervical Carcinoma: Clinical Evaluation of a Phase I-II Trial, Eur J Cancer, Vol. 35, No. 6, pp. 946-952, 1999)이 HPV E6 및 E7-특이적 T 세포의 생산 및 활성화를 자극하는데 집중하여 개발되었다. 그러나, 제한적인 HLA-A2 에피토프로 인하여 이들 펩티드-기반 HPV 백신은 평가되고 선택된 HLA-A2 개체군 내에서도 매우 제한적인 이용가능성이 입증되었다. HPV16 E6 단백질 유래의 13개의 중복 펩티드 및 HPV16 E7 펩티드 유래 4개 중복 펩티드로서, 총 13종의 펩티드를 함유하는 HPV 펩티드 백신이 VIN3을 갖는 비-제한적 환자 개체군에서 실험 시 강건한 항-HPV 반응을 입증했다고 2009년에 보고되었다. 이러한 실험은 HLA-비제한적 개체군에서 HPV 펩티드 백신의 광범위 작용에 관한 최초의 입증을 제공한다 (Gemma G. Kenter, Marij J.P. Welters, A. Rob P.M. Valentijn, Margriet J.G. Lowik, Dorien M.A. Berends-van der Meer, Annelies P.G. Vloon, Farah Essahsah, Lorraine M. Fathers, Rienk Offringa, Jan Wouter Drijfhout, Amon R. Wafelman, Jaap Oostendorp, Gert Jan Fleuren, Sjoerd H. van der Burg, and Cornelis J.M. Melief; Vaccination against HPV-16 Oncoproteins for Vulvar Intraepithelial Neoplasia, N Engl J Med 2009;361:1838-47).
특히 최근에 Kenter 등에 의한 이들 참조 문헌은, 광범위 HLA-포괄도를 제공하는 펩티드 백신의 개발에 대한 최근 접근법과 연관된 주요 단점을 강조한다. 광범위 포괄도를 제공할 수 있는 면역원성 서열을 결정하지 못하는 그들 불능성에 기인하여, 최근 접근법은 항원성 단백질의 전체 서열을 포괄하는 긴 펩티드의 개발에 집중한다. 그 결과로 4가지 주요한 단점이 발생된다: 1. 백신이 복잡하고 많은 수의 펩티드를 함유한다. 예를 들어, Kenter 등은 13종의 펩티드를 사용한다; 2. 백신이 필요보다 더 비싸다; 3. 환자가 치료적 또는 면역원성 이득을 전혀 갖지 않는 불필요한 펩티드를 수용해야만 한다; 그리고 4. 활성 펩티드가 다른 펩티드와 경쟁적 결합을 통해서 불활성화될 수 있다 (이러한 특정 단점은 상기 언급된 Kenter 등이 보고함).
본 발명은 단순하고, 보다 비용 효율적이며, 고도로 효율적이고 광범위한 HLA-포괄 펩티드 백신의 개발을 위한 효율적인 접근법을 보고한다.
단백질/펩티드-기반 백신용 면역자극성 보강제
TAA가 본래 약한 면역원성이라는 것을 고려하면, 면역자극성 보강제가 효과적인 면역 반응의 발생을 위해 일부 경우에 필요할 수 있다. 알루미늄 염 (명반)이 거의 한 세기 동안 매우 성공적으로 보강제로서 사용되었고 보호적 체액성 면역을 촉진하는 데 특히 효과적이었다. 그러나, 명반은 세포-매개 면역이 보호에 요구되는 질환에 대해서는 최적으로 효과적이지 않다. 선천성 면역의 활성화가 적응성 면역 반응을 구동시키는 데 요구된다는 지난 20여년간의 인식은 보강제가 적응성 면역을 어떻게 촉진하는가에 대한 이론을 급진적으로 변경시켰다. 특히, Charles Janeway의 선구적인 작업은 적응성 면역 반응이 미생물 성분에 의해 촉발되는 선천성 면역 수용체가 선행되고 그에 의존적이라는 것을 입증하였다 (Janeway CA., Jr. The immune system evolved to discriminate infectious nonself from noninfectious self. Immunol Today. 1992; 13 :11-16). 패턴 인식 수용체, 예를 들어, toll-유사 수용체 (toll-like receptor, TLR)를 통한 병원체-연관 분자 패턴 (pathogen-associated molecular pattern, PAMP) 또는 병원체와 연관된 보존된 부분(moiety)의 인식에는 미생물 병원체 또는 감염된 세포에 대해 공동 작업하는 선천성 및 적응성 면역이 관여된다 (Kawai T, Akira S. Toll-like receptors and their crosstalk with other innate receptors in infection and immunity. Immunity. 2011; 34 :637-650). 항원-제시 세포, 예를 들어 DC의 TLR-매개 활성화는 이러한 과정의 핵심 단계이다. 실제로, 많은 확립된 실험적 백신은 PAMP를 감염성 질환에 대한 보호를 위해서뿐만 아니라, 또한 암에 대한 치료적 면역화의 일부로서 도입시킨다 (Wille-Reece U, Flynn BJ, Lore K, Koup RA, Miles AP, Saul A, Kedl RM, Mattapallil JJ, Weiss WR, Roederer M, Seder RA. Toll-like receptor agonists influence the magnitude and quality of memory T cell responses after prime-boost immunization in nonhuman primates. J. Exp. Med. 2006; 203 :1249-1258). 보강제로서 이들 분자적 및 기능적으로 한정된 분자의 사용은 백신의 합리적인 디자인을 상당히 촉진한다.
이러한 관점을 뒷받침하기 위해서, 방광 암종의 치료를 위해 장기간-사용된 BCG (바실러스 칼메트-게렝 (Bacillus Calmette-Guerin))는 비교적 효과적이었고 TLR2 및 TLR4를 활성화시키는 것이 확인되었다 (Heldwein KA, Liang MD, Andresen TK, Thomas KE, Marty AM, Cuesta N, Vogel SN, Fenton MJ. TLR2 and TLR4 serve distinct roles in the host immune response against Mycobacterium bovis BCG. Journal of leukocyte biology. 2003; 74 :277-286). TLR4의 천연 리간드인 LPS는 1960년대 초에 항암 특성을 보유한다고 보고되었다 (Mizuno D, Yoshioka O, Akamatu M, Kataoka T. Antitumor effect of intracutaneous injection of bacterial lipopolysaccharide. Cancer research. 1968; 28 :1531-1537). 모노포스포릴 지질 A (Monophosphoryl lipid A, MPL)는 상당히 감소된 독성을 나타내지만, LPS의 대부분의 면역자극성 특성은 유지하는 에스. 미네소타 (S. minnesota) 내독소의 화학적으로 변형된 유도체이다 (Mata-Haro V, Cekic C, Martin M, Chilton PM, Casella CR, Mitchell TC. The vaccine adjuvant monophosphoryl lipid A as a TRIF-biased agonist of TLR4. Science. 2007; 316 :1628-1632). 대량의 연구들은 MPL이 강력하게 바이러스 및 종양-연관 항원에 대한 환자의 면역 반응을 상승시킨다는 것을 보여주었다 (Schwarz TF. Clinical update of the AS04-adjuvanted human papillomavirus-16/18 cervical cancer vacccine, Cervarix. Advances in therapy. 2009; 26 :983-998). FDA는 인간 파필로마바이러스에 대한 예방적 백신으로서 MPL 및 알루미늄 염으로 제제화된 Cervarix 백신을 승인하였다 (Schiffman M, Wacholder S. Success of HPV vaccination is now a matter of coverage. The lancet oncology. 2012; 13 :10-12). 이미퀴모드 (Imiquimod) (TLR7 효현제)는 광선 각화증 및 표피 기저 세포 암종에 대한 인간에서의 사용에 대해 2004년에 FDA에 의해 승인되었다 (Hoffman ES, Smith RE, Renaud RC., Jr. From the analyst's couch: TLR-targeted therapeutics. Nat Rev Drug Discov. 2005; 4 :879-880). 이들 TLR 효현제는 약한 면역원성 TAA의 면역원성을 촉진하는 강력한 잠재력을 갖는다. 실제로, TLR 효현제와 조합된 몇몇 펩티드/단백질-기반 암 백신이 임상 시험에서 시험되고 있고; 이들은 TLR3을 표적화하는 암플리겐 (ampligen) (NCT01355393), TLR3을 표적화하는 히스토놀 (histonol) (NCT00773097, NCT01585350, NCT01437605), TLR4를 표적화하는 MELITAC 12.1 (NCT01585350) 및 TLR9를 표적화하는 레시퀴모드 (resiquimod) (NCT00960752)를 포함한다. PRR의 패밀리가 최근 몇 년간 상당히 확대되었고, 그리하여 보강제 작용 기전을 정의하는 데 있어서 선천성 면역 경로의 역할을 비롯하여, 치료적 암 백신의 보강제 활성에서 다른 PRR (예를 들어, NLR, RLR)의 역할을 조사하기 위해 막대한 노력이 기울여 지고 있다.
병원체-연관 신호를 감지하는 것 이외에도, PRR은 또한 내생성 '알라민', 예컨대 스트레스/열충격 단백질 (heat shock protein, HSP) 및 HMGB-1을 인식한다 (Lotze MT, Zeh HJ, Rubartelli A, Sparvero LJ, Amoscato AA, Washburn NR, Devera ME, Liang X, Tor M, Billiar T. The grateful dead: damage-associated molecular pattern molecules and reduction/oxidation regulate immunity. Immunol Rev. 2007; 220 :60-81 ; 　 Todryk SM, Melcher AA, Dalgleish AG, Vile RG. Heat shock proteins refine the danger theory. Immunology. 2000; 99 :334-337). 세포의 고유하고 고도로 보존된 단백질 성분으로서, 이들 손상-연관 분자 패턴 (damage-associated molecular pattern, DAMP)은 또한 숙주 면역계에게 세포 손상의 규모 및 성질을 전달한다. HSP가 세포내 단백질 품질 제어에 관여하는 분자 샤페론으로서 작용한다고 알려져 있지만 (Calderwood SK, Murshid A, Prince T. The shock of aging: molecular chaperones and the heat shock response in longevity and aging--a mini-review. Gerontology. 2009; 55 :550-558 ; 　 Mayer MP, Bukau B. Hsp70 chaperones: cellular functions and molecular mechanism. Cell Mol Life Sci. 2005; 62 :670-684), 지난 20여년 동안의 연구들은 일정 HSP가 선천성 및 적응성 면역 반응 둘 모두를 통합할 수 있고, 암 면역요법에 대한 면역자극제로서 이용될 수 있다는 개념을 확립하였다 (Mayer MP, Bukau B. Hsp70 chaperones: cellular functions and molecular mechanism. Cell Mol Life Sci. 2005; 62 :670-684 ; 　 Wang XY, Facciponte JG, Subjeck JR. Molecular chaperones and cancer immunotherapy. Handb Exp Pharmacol. 2006b; 172 :305-329).
백신의 합리적인 디자인에 상당한 진보가 이루어졌지만, 예방적 및 치료적 둘 모두의 최적화된 백신의 개발에 대한 계속적인 요구가 지속되고 있다. 대규모 환자 개체군에 대해 광범위한 이용가능성을 갖는 백신의 개발에 대한 요구, 및 이러한 백신이 특이적이고 효과적이어야 한다는 요구가 존재한다.
본 명세서는 경우에 따라 하나 이상의 보강제와 조합된 HPV 펩티드 서열을 포함하는 신규 조성물을 개시하고, 여기서 HPV 펩티드 서열은 HPV16 E6 펩티드 및/또는 HPV16 E7 펩티드에 상응하고 펩티드 서열은 5종의 HLA 수퍼타입과 대략 5,000 nM의 IC50의 결합 친화성을 갖고, 펩티드의 일부는 다중-에피토프 펩티드이다. 일정 구체예에서, 조성물은 양이온성 지질로 이루어진 보강제를 포함하고, 일정 구체예에서, 양이온성 지질은 DDA, R-DOTAP, DOTAP, DOTMA 또는 DOEPC, 이의 변이체 또는 유사체로 이루어진다. 본 명세서에 개시된 신규 조성물은 그들이 일반 개체군의 80 내지 90% 이상에 대해 효과적이라는 점에서 현재 이용 가능한 백신보다 우수하다.
본 명세서는 경우에 따라 보강제와 조합된 HPV 펩티드 서열을 포함하는 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 HPV 감염에 대한 면역 반응을 유도하기 위한 방법을 개시하고, 여기서 HPV 펩티드 서열은 HPV16 E6 펩티드 및/또는 HPV16 E7 펩티드에 상응하고 펩티드 서열은 5종의 HLA 수퍼타입과 대략 5,000 nM의 IC50의 결합 친화성을 갖고, 펩티드의 일부는 다중-에피토프 펩티드이다. 이 방법은 예방적일 수 있거나 또는 치료적일 수 있다.
도 1은 1 mg 및 3 mg R-DOTAP 코호트에 대한 방문 및 대상체에 의한 인터페론-γ 어세이를 통한 항-HPV-16 E6 및 E7 반응을 보여주는 그래프를 제공한다. 약어: Bkg = 기저값 (background)(줄무늬 막대); PBMC =말초 혈액 단핵 세포 (peripheral blood mononuclear cell); R-DOTAP = 1,2-디올레오일-3-트리메틸암모늄-프로판 클로라이드의 R-거울상 이성질체 (R-enantiomer of 1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propane chloride); SFC = SFU = 스팟-형성 유닛 (spot-forming unit); Stim = 자극됨 (simulated)(투명 막대). 데이타는 삼중 웰의 4Х105 PBMC 당 평균 SFU로 나타낸다. 줄무늬 막대는 배지 단독으로 자극된 웰의 기저값 SFU를 나타낸다. 투명 막대는 펩티드 풀로 자극된 웰의 SFU를 나타낸다. 방문 2 = 백신접종 전 1일차; 방문 3 = 15일차, 백신접종 1 이후 14일; 방문 5 = 36일차, 백신접종 2 이후 14일; 방문 7 = 57일차, 백신접종 3 이후 14일; 방문 9 = 133일차, 백신접종 3 이후 90일.
도 2는 10 mg R-DOTAP 코호트에 대한 방문 및 대상체에 의한 인터페론-γ 어세이를 통한 항-HPV-16 E6 및 E7 반응을 보여주는 그래프를 제공한다. 데이타는 삼중 웰의 4Х105 PBMC 당 평균 SFU로 나타낸다. 줄무늬 막대는 배지 단독으로 자극된 웰의 기저값 SFU를 나타낸다. 투명 막대는 펩티드 풀로 자극된 웰의 SFU를 나타낸다. 방문 2 = 백신접종 전 1일차; 방문 = 15일차, 백신접종 1 이후 14일; 방문 5 = 36일차, 백신접종 2 이후 14일; 방문 7 = 57일차, 백신접종 3 이후 14일; 방문 9 = 133일차, 백신접종 3 이후 90일.
도 3은 서열번호 1 (빈 사각형), 서열번호 7, 8, 31 32 및 31 (흑색 단색 원형), 서열번호 7 (빈 원형), 및 서열번호 8 (흑색 단색 삼각형)에 상응하는 펩티드에 대한 종양 이식 후 시간 경과에 따라 측정된 중간 종양 크기에 대한 펩티드의 효과에 관한 결과를 보여주는 샘플 종양 퇴행 그래프를 제공한다. 도 3에서, R-DOTAP 만을 포함하는 조성물은 줄무늬 사각형으로 표시된 그래프 선으로 표시된다.
하기 구체적인 설명은 예시적이고 설명적이며 본 명세서에 기술된 본 개시 내용의 추가적인 설명을 제공하고자 한다. 다른 장점, 및 신규한 특징은 하기 본 개시 내용의 상세한 설명을 통해서 당업자에게 쉽게 분명해질 것이다. 미국 가출원 제62/404,458호를 포함하여, 본 명세서에 언급된 참조문헌은 그들 전문이 참조로 편입된다.
본 명세서는 HLA-A2 인간화 유전자이식 마우스에서 스크리닝 및 입증하였고, 다양한 인간 대상체에서 확증한 바와 같이, T 세포에 대해서 효과적으로 프로세싱되고 교차-제시되도록 디자인된, HPV16 E6 및 E7로부터 유래된 고유한 다중-에피토프 펩티드 서열을 포함하는 고유한 펩티드 서열의 디자인 및 사용을 위한 방법을 개시한다. 일정 구체예에서, 신규한 펩티드 서열을 포함하는 신규한 조성물은 2-8 펩티드 서열, 2-6 펩티드 서열, 또는 4 펩티드 서열로 이루어진다. 펩티드는 면역원성 조성물, 예컨대 백신에 도입될 수 있다. 하기에서 입증하는 바와 같이, 주요 HLA 수퍼타입에 대한 인-실리코 펩티드 결합 분석은 최종 조성물 및 백신이 개체군의 80-90%를 넘게 차지한다는 것을 확증한다. 본 명세서에 기술된 펩티드 조성물의 사용을 포함하는 HLA-비제한적 인간 임상 시험에서, 강력한 T-세포 유도가 모든 대상체에서 확증되었다. 인간화된 유전자이식 마우스에서의 시험과 조합하여 인-실리코 결합 분석의 신규한 접근법의 이용으로, 본 명세서의 발명자는 최초로 단순하고, 효과적이며 광범위하게 적용 가능한 펩티드-기반 HPV16 치료적 암 백신을 개발하였다.
인간에서 CD8+ T 세포 생성 및 반응을 유발하도록 디자인된 펩티드-기반 백신의 디자인에서 중요한 고려 사항은 개체군에서 HLA 클래스 I 분자의 다형성이다. 상이한 HLA 대립유전자가 상이한 펩티드에 결합하기 때문에, 펩티드 백신이 개체군 중 높은 백분율로 면역원성이도록 충분히 상이한 펩티드를 함유하는 것이 중요하다. 본 명세서의 발명자는 인간에서 CD8+ T-세포 에피토프의 올바른 프로세싱 및 제시성을 제공하도록 HPV16 E6 및 E7 단백질의 면역원성 영역을 포괄하기 위해 신규한 다중-펩티드 백신을 디자인하였다: 일 구체예에서, 백신은 그들의 결합성 및 면역원성 활성을 기반으로 선택된 4종의 HPV-관련 펩티드를 포함한다. 실시예에서 상술하는 바와 같이, 본 발명자는 다양한 HPV 펩티드에 결합할 수 있는 잠재적인 HLA 대립유전자를 예측하기 위해서 ELISpot 및 종양 퇴행 실험을 비롯하여, 인-실리코 분석에 착수하였다. 펩티드 에피토프를 제시하고 인식하는 인간 면역계의 능력은 항원-특이적 CD8+ T-세포 반응의 제시, 프로세싱 및 후속 유도를 확증하기 위해 인간화된 유전자이식 마우스에서 실험되었다. 마지막으로, 인간 T-세포 반응을 유도하는 능력은 HLA-비제한적 인간 임상 시험에서 실험되었고, 다양한 HLA 서브타입으로 대상체에서 강력한 T-세포 반응을 유도하는 제제의 능력이 확증되었다.
일 구체예에서, 본 명세서에 기술된 바와 같은 신규한 조성물은 보강제와 조합된 HPV 펩티드 서열을 포함하고, HPV 펩티드 서열은 HPV16 E6 펩티드 및/또는 HPV16 E7 펩티드에 상응하고, 펩티드 서열은 5종의 HLA 수퍼타입과 대략 5,000 nM의 IC50의 결합 친화성을 갖고, 일정 구체예에서, 펩티드는 다중-에피토프 펩티드이다. 펩티드는 서열번호 5, 9, 10 및 11을 포함할 수 있거나, 또는 서열번호 23, 24, 25 및 26을 포함하는 그들의 지질화 형태를 포함할 수 있다. 일 구체예에서, 펩티드는 개별 펩티드로서 조성물에 존재할 수 있거나 또는 그들은 스페이서와 함께 또는 스페이서 없이, (임의 순서로) 서로 접합되어서, 당업자에게 공지된 방법에 따라서 청구된 서열을 포괄하는 단일한 긴 펩티드를 형성할 수 있다. 일정 구체예에서, HLA 수퍼타입은 HLA-A*02:01, HLA-A*03:01, HLA-A*24:02, HLA-B*07:02 및 HLA-B*58:01을 포함한다. 일부 구체예에서 조성물은 인핸서 효현제 에피토프 예컨대 HBV 코어 헬퍼 펩티드 등, 및 또는 제한없이 서열번호 14 또는 서열번호 15에 의해 코딩되는 펩티드를 포함하는 단일-에피토프 펩티드 및 이의 유사체 예컨대 서열번호 27 및 28을 더 포함할 수 있다. 본 명세서에 기술된 조성물은 변형된 펩티드, 펩티드 유사체, 및 이의 활성 단편을 더 포함한다. 일정 구체예에서 펩티드는 효능 및 면역원성을 개선시키기 위해서 산화 (oxidized), 디-술파이드 결합에 의한 가교 (cross-linked by di-sulfide bond), PEG화 (pegylated), 글리코실화 (glycosylated), 인산화 (phosphorylated), 팔미토일화 (palmitoylated), 메틸화 (methylated), 바이오틴화 (biotinylated) 또는 당업자에게 공지된 다른 방법을 통해서 변형될 수 있다. 일 구체예에서, 조성물의 보강제는 양이온성 지질로 이루어지고, 여기서 양이온성 지질은 DOTAP, DDA, DOEPC, DOTMA, R-DOTAP, R-DDA, R-DOEPC, R-DOTMA, S-DOTAP, S-DDA, S-DOEPC, S-DOTMA, 및 이의 변이체 또는 유사체로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 일 구체예에서, 본 개시 내용의 신규한 조성물은 서열번호 5, 9, 10 및 11에 상응하는 펩티드를 포함하고, 보강제는 양이온성 지질을 포함하고 양이온성 지질은 R-DOTAP을 포함한다. 일 구체예에서, 본 개시 내용의 신규한 조성물은 서열번호 23, 24, 25 또는 26에 상응하는 펩티드를 포함하고, 보강제는 양이온성 지질을 포함하고, 여기서 양이온성 지질은 R-DOTAP을 포함한다. 일 구체예에서, 본 개시 내용의 신규한 조성물은 서열번호 5, 9, 10, 11, 23, 24, 25 또는 26에 상응하는 펩티드를 포함하고, 보강제는 양이온성 지질을 포함하고, 여기서 양이온성 지질은 R-DOTAP을 포함한다. 상기 기술된 구체예는 경우에 따라 리포솜에 캡슐화될 수 있다. 상기 기술된 구체예는 경우에 따라 약학적으로 허용가능한 담체 및 부형제 예를 들어 다양한 완충제 예컨대 아세테이트, 포스페이트 및 장성 조정제 (tonicity adjusters), 예컨대 수크로스, 트레할로스 (trehalose) 등, 또는 계면활성제 예컨대 트윈 (tween) 및 당업자에게 공지된 다른 것들과 조합될 수 있다.
일 구체예에서, 본 명세서의 개시 내용은 서열번호 5, 9, 10, 11 중 하나 이상, 또는 프로모터에 작동적으로 연결된 서열번호 23, 24, 25 또는 26 중 하나 이상을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다. 또한 인핸서 효현제 에피토프 및/또는 단일-에피토프 펩티드를 코딩하는 핵산 분자를 더 포함하는, 프로모터에 작동적으로 연결된 서열번호 23, 24, 25 또는 26 중 하나 이상, 또는 서열번호 5, 9, 10, 11 중 하나 이상을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다. 일 구체예에서, 상기 기술된 벡터는 재조합 아데노바이러스를 포함할 수 있다. 당업자에게 공지된 바와 같이, 핵산 서열은 DNA 합성 및/또는 분자 클로닝 분야에서 사업하는 서비스 회사의 통상적인 절차를 사용하여 수행될 수 있는 DNA 합성에 의해 신규하게 생성되거나, 또는 통상의 분자 생물학 기술을 사용해 클로닝될 수 있다.
일 구체예에서, 본 명세서의 개시 내용은 하나 이상의 보강제와 조합된 HPV 펩티드 서열을 포함하는 신규한 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 HPV 감염에 대해 면역 반응을 유도하기 위한 방법을 제공하고, 여기서 HPV 펩티드 서열은 HPV16 E6 펩티드 및/또는 HPV16 E7 펩티드에 상응하고, 여기서 펩티드 서열은 5종의 HLA 수퍼타입과 대략 5,000 nM의 IC50의 결합 친화성을 갖고, 여기서 펩티드의 일부는 다중-에피토프 펩티드이다. 면역 반응을 유도하기 위한 본 명세서에 개시된 방법은 예방적 또는 치료적 목적을 위해 면역 반응을 유도하는 단계를 포함할 수 있다. 일정 구체예에서, 신규한 조성물에서 사용되는 펩티드는 서열번호 5, 9, 10 11, 23, 24, 25, 26, 31, 32 또는 예를 들어 본 명세서의 표 1-5에 기술된 다른 것들로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 펩티드를 포함할 수 있다. 펩티드는 개별 펩티드로서 존재할 수 있거나, 또는 일정한 선택된 펩티드는 스페이서와 함께 또는 스페이서 없이 (임의 순서로) 서로 접합되어 청구된 서열을 포괄하는 단일한 긴 펩티드를 형성할 수 있다. 방법은 조성물의 사용을 포함할 수 있고 여기서 보강제는 앙이온성 지질로 이루어지고, 예를 들어, 여기서 양이온성 지질은 DOTAP, DDA, DOEPC, DOTMA, R-DOTAP, R-DDA, R-DOEPC, R-DOTMA, S-DOTAP, S-DDA, S-DOEPC, S-DOTMA, 이의 변이체 또는 유사체를 포함할 수 있다. 일 구체예에서, 면역 반응을 유도하기 위한 방법은 서열번호 5, 9, 10 11로 이루어진 펩티드 및 R-DOTAP를 포함하는 조성물, 또는 서열번호 23, 24, 25 또는 26으로 이루어진 펩티드 및 R-DOTAP를 포함하는 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함할 수 있다.
본 명세서에 기술된 바와 같은 방법은 HPV 감염을 갖는 대상체를 치료하기 위한 신규한 HPV 펩티드 조성물의 용도를 포함할 수 있고, 여기서 감염은 제한 없이, 보통 사마귀, 발바닥 사마귀, 편평 사마귀, 생식기 사마귀, 항문생식기 사마귀, 항문 이형성증, 생식기 암 (외음부, 질, 자궁경부, 음경, 항문), 두경부의 암, 사마귀상 표피이상증 (epidermaodysplasia verruciformis), 국소 상피 과형성증, 구강 유두종, 구강인두 암, 사마귀양 낭종 (verrucous cyst), 및 후두 유두종증을 포함하는 증상을 포함한다.
예를 들어, 통상의 분자 생물학 절차를 사용하여, 예를 들어, 아미노산 치환, 결실, 첨가 등을 통해서, 펩티드에 변화를 가할 수 있다는 것을 당업자는 이해하게 될 것이다. 일반적으로, 보존성 아미노산 치환은 폴리펩티드의 기능 또는 면역원성의 상실 없이 적용될 수 있다. 이것은 당업자에게 충분히 공지된 통상의 절차에 따라서 검토될 수 있다.
또한 펩티드, 및 펩티드 단편의 변형이 본 명세서에 기술된 펩티드의 범주에 포함된다. 이러한 변형은 제한 없이, 천연 및 비천연 발생 아미노산을 포함하여, 특별한 부위의 천연 발생 아미노산의 다른 분자로의 치환을 포함한다. 이러한 치환은 펩티드의 생체활성을 변형시킬 수 있고 생물학적 또는 약학적 효현제 또는 길항제를 생산할 수 있다. 이러한 치환은 당업자에게 공지된 보존성 치환, 예컨대 발린 (valine)의 알라닌 (alanine)으로의 치환을 포함할 수 있다. 허용 가능한 치환은 또한 아미노산의 변형, 예컨대 류신 (leucine)에 대한 노르류신 (norleucine)의 변형을 포함할 수 있다. L 아미노산에 대한 D 아미노산의 치환은 본 발명의 범주 내에 포괄된다는 것을 이해해야 한다. 일부 치환은 문헌 [Dictionary of Biochemistry and Molecular Biology, 2"a ed., J. Stenesh, John Wiley & Sons, 1989]에 기술되어 있고, 이 전체가 참조로 본 명세서에 편입된다. 추가의 변형은 방사능 및 비방사능 표지에 의한 표지 잠재성을 증강시키도록 펩티드 또는 이의 단편의 특별한 위치에서 아미노산, 예컨대 티로신 (tyrosine) 또는 다른 아미노산의 첨가, 분자 예컨대 리신 (ricin)의 첨가, 방사능 및/또는 비방사능 표지의 첨가를 포함한다.
더 나아가서, 당업자는 코딩된 서열 내 단일 아미노산 또는 적은 비율 (전형적으로 5% 미만, 보다 전형적으로 1% 미만)의 아미노산이 변경되거나, 첨가되거나 또는 결실된, 개시된 펩티드의 아미노산 서열, 또는 그 펩티드의 아미노산을 코딩하는 뉴클레오티드 서열에서의 개별 치환, 결실 또는 첨가가 보존적으로 변형된 변이라는 것을 인식하게 될 것이고, 여기서 변경은 화학적으로 유사한 아미노산으로 아미노산의 치환을 야기한다. 기능적으로 유사한 아미노산을 제공하는 보존성 치환 표는 당업자에게 충분히 공지되어 있다. 하기의 6개 그룹 각각은 서로에게 보존성 치환인 아미노산을 함유한다:
1) 알라닌 (Alanine, A), 세린 (Serine, S), 트레오닌 (Threonine, T);
2) 아스파르트산 (Aspartic acid, D), 글루탐산 (Glutamic acid, E);
3) 아스파라긴 (Asparagine, N), 글루타민 (Glutamine, Q);
4) 아르기닌 (Arginine, R), 리신 (Lysine, K);
5) 이소류신 (Isoleucine, I), 류신 (Leucine, L), 메티오닌 (Methionine, M); 발린 (Valine, V); 및
6) 페닐알라닌 (Phenylalanine, F), 티로신 (Tyrosine, Y), 트립토판 (Tryptophan, W).
지질 보강제
양이온성 지질은 강력한 면역-자극성 보강제 효과를 갖는다고 보고되었다. 본 발명의 양이온성 지질은 경우에 따라 항원과 혼합되고 양이온성 지질을 단독으로 또는 중성 지질과 조합하여 함유할 수 있는 리포솜을 형성할 수 있다. 적합한 양이온성 지질 종은 3-β[ 4N-(1N, 8-디구아니디노 스퍼미딘)-카바모일] 콜레스테롤 (BGSC); 3-β[N,N-디구아니디노에틸-아미노에탄)-카바모일] 콜레스테롤 (BGTC); N,N1N2N3테트라-메틸테트라팔미틸스퍼민 (cellfectin); N-t-부틸-N'-테트라데실-3-테트라데실-아미노프로피온-아미딘 (CLONfectin); 디메틸디옥타데실 암모늄 브로마이드 (DDAB); 1,2-디미리스틸옥시프로필-3-디메틸-히드록시 에틸 암모늄 브로마이드 (DMRIE); 2,3-디올레오일옥시-N-[2(스퍼민카복사미도)에틸]-N,N-디메틸-1-p-로파나미늄 트리플루오로아세테이트) (DOSPA); 1,3-디올레오일옥시-2-(6-카복시스퍼밀)-프로필 아미드 (DOSPER); 4-(2,3-비스-팔미토일옥시-프로필)-1-메틸-1H-이미다졸 (DPIM) N,N,N',N'-테트라메틸-N,N'-비스(2-히드록시에틸)-2,3 디올레오일옥시-1,4-부탄디암모늄 아이오다이드) (Tfx-50); N-1-(2,3-디올레오일옥시) 프로필-N,N,N-트리메틸 암모늄 클로라이드 (DOTMA) 또는 다른 N-(N,N-1-디알콕시)-알킬-N,N,N-삼중치환된 암모늄 계면활성제; 1,2 디올레오일-3-(4'-트리메틸암모니오) 부탄올-sn-글리세롤 (DOBT) 또는 콜레스테릴 (4'트리메틸암모니아) 부타노에이트 (ChOTB)로서 여기서 트리메틸암모늄 기가 부탄올 스페이서 팔 (arm)을 통해서 이중 사슬 (DOTB 경우) 또는 콜레스테릴 기 (ChOTB 경우)에 연결된 것; WO 93/03709에 개시된 DORI (DL-1,2-디올레오일-3-디메틸아미노프로필-β-히드록시에틸암모늄) 또는 DORIE (DL-1,2-O-디올레오일-3-디메틸아미노프로필-β-히드록시에틸암모늄) (DORIE) 또는 이의 유사체; 1,2-디올레오일-3-숙시닐-sn-글리세롤 콜린 에스테르 (DOSC); 콜레스테릴 헤미숙시네이트 에스테르 (ChOSC); 리포폴리아민 예컨대 디옥타데실아미도글리실스퍼민 (DOGS) 및 디팔미토일 포스파티딜에탄올아밀스퍼민 (DPPES) 또는 미국 특허 제5,283,185호에 개시된 양이온성 지질, 콜레스테릴-3β-카복실-아미도-에틸렌트리메틸암모늄 아이오다이드, 1-디메틸아미노-3-트리메틸암모니오-DL-2-프로필-콜레스테릴 카복실레이트 아이오다이드, 콜레스테릴-3-O-카복시아미도에틸렌아민, 콜레스테릴-3-β-옥시숙신아미도-에틸렌트리메틸암모늄 아이오다이드, 1-디메틸아미노-3-트리메틸암모니오-DL-2-프로필-콜레스테릴-3-β-옥시숙시네이트 아이오다이드, 2-(2-트리메틸암모니오)-에틸메틸아미노 에틸-콜레스테릴-3-β-옥시숙시네이트 아이오다이드, 3-β-N-(N',N'-디메틸아미노에탄) 카바모일 콜레스테롤 (DC-chol), 및 3-β-N-(폴리에틸렌이민)-카바모일콜레스테롤; O,O'-디미리스틸-N-리실 아스파테이트 (DMKE); O,O'-디미리스틸-N-리실-글루타메이트 (DMKD); 1,2-디미리스틸옥시프로필-3-디메틸-히드록시 에틸 암모늄 브로마이드 (DMRIE); 1,2-디라우로일-sn-글리세로-3-에틸포스포콜린 (DLEPC); 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-에틸포스포콜린 (DMEPC); 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-에틸포스포콜린 (DOEPC); 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-에틸포스포콜린 (DPEPC); 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-에틸포스포콜린 (DSEPC); 1,2-디올레오일-3-트리메틸암모늄 프로판 (DOTAP); 디올레오일 디메틸아미노프로판 (DODAP); 1,2-팔미토일-3-트리메틸암모늄 프로판 (DPTAP); 1,2-디스테아로일-3-트리메틸암모늄 프로판 (DSTAP), 1,2-미리스토일-3-트리메틸암모늄 프로판 (DMTAP); 및 나트륨 도데실 설페이트 (SDS)를 포함한다. 본 발명은 본 출원에 개시된 양이온성 지질의 구조적 변이체 및 유도체의 용도를 고려한다.
본 발명의 일정 측면은 하기 식으로 표시되는 구조를 갖는 비-스테로이드 키랄 양이온성 지질을 포함한다:
Figure pct00001
상기 식에서, R1 은 4차 암모늄 기이고, Y1 은 탄화수소 사슬, 에스테르, 케톤 및 펩티드로부터 선택되고, R2 및 R3 은 독립적으로 포화 지방산, 불포화 지방산, 에스테르-연결된 탄화수소, 포스포르-디에스테르 및 이의 조합으로부터 선택된다. DOTAP, DMTAP, DSTAP, DPTAP, DPEPC, DSEPC, DMEPC, DLEPC, DOEPC, DMKE, DMKD, DOSPA, DOTMA는 이러한 일반 구조를 갖는 지질의 예이다.
일 구체예에서, 본 발명의 키랄 양이온성 지질은 친유성 기 및 아미노 기 사이의 결합이 수용액 중에서 안정한 지질이다. 따라서, 본 발명의 복합체의 속성은 저장 동안 그들의 안정성 (즉, 그들 형성 이후에 시간 경과에 따라 작은 직경을 유지하고 생물학적 활성을 보유하는 그들 능력)이다. 양이온성 지질에서 사용되는 이러한 결합은 아미드 결합, 에스테르 결합, 에테르 결합 및 카바모일 결합을 포함한다. 당업자는 하나를 초과하는 양이온성 지질 종을 함유하는 리포솜이 본 발명의 복합체를 생산하는데 사용될 수 있다는 것을 쉽게 이해할 것이다. 예를 들어, 2종의 양이온성 지질 종, 리실-포스파티딜에탄올아민 및 β-알라닐 콜레스테롤 에스테르를 포함하는 리포솜이 일정 약물 전달 적용을 위해 개시되었다 [Brunette, E. et al., Nucl. Acids Res., 20:1151 (1992)].
본 발명에서 사용에 적합하고 경우에 따라 항원과 혼합되는 키랄 양이온성 리포솜을 고려하면, 본 발명의 방법은 상기 인용된 양이온성 지질의 사용에만 제한되는 것이 아니라, 양이온성 리포솜이 생산되고 최종 양이온성 전하 밀도가 면역 반응을 활성화시키고 유도시키는데 충분하다면 임의의 지질 조성물이 사용될 수 있다는 것을 더욱 이해해야 한다.
따라서, 본 발명의 지질은 양이온성 지질 이외에도 다른 지질을 함유할 수 있다. 이들 지질은 제한 없이, 리소포스파티딜콜린 (1-올레오일 리소포스파티딜콜린)이 일례인 리소지질, 콜레스테롤, 또는 디올레오일 포스파티딜 에탄올아민 (DOPE) 또는 디올레오일 포스파티딜콜린 (DOPC)을 포함한 중성 인지질을 비롯하여 Tween-80 및 PEG-PE가 그 예인 폴리에틸린 글리콜 부분(moeity)을 함유하는 다양한 친유성 계면활성제를 포함한다.
본 발명의 양이온성 지질은 또한 음으로 하전된 지질을 비롯하여, 형성된 복합체의 순전하가 양이고/이거나 복합체의 표면이 양으로 하전되면 양이온성 지질을 함유할 수도 있다. 본 발명의 음으로 하전된 지질은 생리학적 pH 또는 그 근처 또는 이들의 조합에서 순 음전하를 갖는 적어도 하나의 지질 종을 포함하는 것이다. 적합한 음으로 하전된 지질 종은 제한 없이, CHEMS (콜레스테릴 헤미숙시네이트), NGPE (N-글루타릴 포스파티딜에탄올아민), 포스파티딜 글리세롤 및 포스파티드산 또는 유사한 인지질 유사체를 포함한다.
본 발명의 약물 전달 복합체를 포함하는 지질의 제조에서 사용되는 리포솜을 제조하기 위한 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 리포솜 제조의 방법론에 관한 고찰은 문헌 [Liposome Technology (CFC Press New York 1984)]; [Liposomes by Ostro (Marcel Dekker, 1987)]; [Methods Biochem Anal. 33:337-462 (1988)] 및 미국 특허 제5,283,185호에서 확인할 수 있다. 이러한 방법은 동결-해동 압출 및 초음파처리를 포함한다. 단층 리포솜 (약 200 nm 미만의 평균 직경) 및 다층 리포솜 (약 300 nm 초과의 평균 직경) 둘 모두가 본 발명의 복합체를 제조하기 위한 출발 성분으로서 사용될 수 있다.
본 발명의 양이온성 지질 백신을 제조하는데 이용되는 양이온성 리포솜에서, 양이온성 지질은 총 리포솜 지질의 약 10 몰% 내지 약 100 몰%, 또는 약 20 몰% 내지 약 80 몰%로 리포솜에 존재한다. 리포솜에 포함될 때, 중성 지질은 총 리포솜 지질의 약 0 몰% 내지 약 90 몰%, 또는 약 20 몰% 내지 약 80 몰%, 또는 40 몰% 내지 80 몰%의 농도로 존재할 수 있다. 리포솜에 포함될 때, 음으로 하전된 지질은 총 리포솜 지질의 약 0 몰% 내지 약 49 몰% 범위, 또는 약 0 몰% 내지 약 40 몰% 범위의 농도로 존재할 수 있다. 일 구체예에서, 리포솜은 양이온성 지질 및 중성 지질을 약 2:8 내지 약 6:4의 비율로 함유한다. 본 발명의 복합체는 복합체를 특정한 조직 또는 세포 유형으로 유도하는 표적화 인자로서 기능하는 변형된 지질, 단백질, 다가양이온 또는 수용체 리간드를 함유할 수 있다는 것을 더욱 이해한다. 표적화 인자의 예는 제한 없이, 아시알로당단백질 (asialoglycoprotein), 인슐린, 저밀도 지단백질 (LDL), 폴레이트 및 세포 표면 분자에 대한 단일클론 및 다클론 항체을 포함한다. 더 나아가서, 복합체의 순환성 반감기를 변형시키기 위해서, 양성 표면 전하는 폴리에틸렌 글리콜 부분(moiety)을 함유하는 친유성 계면활성제를 도입시켜 입체적으로 차폐될 수 있다.
양이온성 지질 백신은 수크로스 농도구배로부터 수집 시 등장성 수크로스 또는 덱스트로스 용액에 저장될 수 있거나 또는 그들은 동결 건조된 후에 사용 전에 등장성 용액에 재구성될 수 있다. 일 구체예에서, 양이온성 지질 복합체는 용액에 저장된다. 본 발명의 양이온성 지질 복합체의 안정성은 저장 시 시간 경과에 따른 양이온성 지질 백신의 물리적 안정성 및 생리학적 활성을 결정하기 위한 특별한 어세이를 통해 측정된다. 양이온성 지질 백신의 물리적 안정성은 예를 들어, 전자 현미경, 겔 여과 크로마토그래피를 포함하는 당업자에게 공지된 방법을 통해서 또는 예를 들어, 실시예에 기술된 바와 같은 Coulter N4SD 입자 크기 분석기를 이용한 준 탄성 광산란법을 통해서 양이온성 지질 복합체의 직경 및 전하를 결정하여 측정된다. 양이온성 지질 복합체의 물리적 안정성은 저장된 양이온성 지질 백신의 직경이 양이온성 지질 백신이 정제되는 시점에 결정되는 양이온성 지질 복합체의 직경보다 100%를 초과하여, 또는 50% 이하, 또는 30% 이하로 증가되지 않을 때 저장시 "실질적으로 변화되지 않는다"
순수한 형태 또는 실질적으로 순수한 형태로 양이온성 지질이 투여되는 것이 가능하지만, 약학 조성물, 제제 또는 조제물로서 존재하는 것이 바람직하다. 본 발명의 키랄 양이온성 지질 복합체를 사용한 약학 제제는 생리적으로 적합한 멸균 완충제, 예컨대, 예를 들어, 포스페이트 완충 식염수, 등장성 식염수 또는 저 이온 강도 완충제 예컨대 아세테이트 또는 Hepes (예시적인 pH는 약 5.0 내지 약 8.0의 범위임)에서 양이온성 지질 백신을 포함할 수 있다. 키랄 양이온성 지질 백신은 종양내, 동맥내, 정맥내, 기관내, 복강내, 피하 및 근육내 투여를 위해 액상 용액으로서 또는 에어로졸로서 투여될 수 있다.
본 발명의 제제는 당분야에 공지된 임의의 안정화제를 도입할 수 있다. 예시적인 안정화제는 콜레스테롤 및 리포솜 이중층을 강성화시키고 이중층의 붕해 또는 탈안정화를 방지하는데 도움을 줄 수 있는 다른 스테롤이다. 또한 폴리에틸렌 글리콜, 다당류 및 단당류와 같은 제제가 리포솜에 도입되어 리포솜 표면을 변형시키고 혈액-성분과의 상호작용에 기인하여 탈안정화되는 것을 방지할 수 있다. 다른 예시적인 안정화제는 그들 자체로 또는 혼합물로 사용될 수 있는 단백질, 당류, 무기산 또는 유기산이다.
다수의 약학적 방법을 적용하여 면역 자극의 지속기간을 제어하거나, 변형시키거나, 또는 연장시킬 수 있다. 제어 방출 조제물은 양이온성 지질을 캡슐화하거나 또는 포획하여 그들을 서서히 방출시키기 위해 중합체 복합체 예컨대 폴리에스테르, 폴리아미노산, 메틸셀룰로스, 폴리비닐, 폴리(락트산) 및 히드로겔의 사용을 통해서 획득될 수 있다. 유사한 중합체가 또한 리포솜을 흡착시키는 데 사용될 수 있다. 리포솜은 자극제의 방출 프로파일을 변경시키기 위해 에멀션 제제에 함유될 수 있다. 대안적으로, 혈액 순환계에서 자극제 존재의 지속기간은 리포솜의 표면을 화합물 예컨대 폴리에틸렌 글리콜 또는 다른 중합체 및 다른 물질 예컨대 리포솜 및 에멀션의 순환 시간 또는 반감기를 증강시킬 수 있는 당류로 코팅시켜 증강시킬 수 있다.
경구 조제물이 필요할 때, 키랄 양이온성 지질은 당분야에 공지된 전형적인 약학 담체, 예컨대, 예를 들어 특히 수크로스, 락토스, 메틸셀룰로스, 카복시메틸 셀룰로스, 또는 아라비아 검과 조합될 수 있다. 양이온성 지질은 또한 전신 전달을 위해 캡슐 또는 정제에 캡슐화될 수 있다.
본 개시 내용의 키랄 양이온성 지질 조성물의 투여는 예방적 또는 치료적 목적을 위한 것일 수 있다. 예방적으로 제공될 때, 양이온성 지질은 병의 임의의 증거 또는 증상에 앞서서 제공된다. 치료적으로 제공될 때, 양이온성 지질은 질환의 개시 시 또는 그 이후에 제공된다. 면역-자극제의 치료적 투여는 질환을 약독화시키거나 또는 치유시키기 위해 제공된다. 양쪽 목적을 위해서, 양이온성 지질은 추가적인 치료제(들) 또는 항원(들)과 투여될 수 있다. 양이온성 지질이 추가적인 치료제 또는 항원과 투여될 때, 예방적 또는 치료적 효과는 예를 들어 HPV에 의해 야기되는 질환 또는 질병을 포함하는, 특이적 질환에 대해 발생될 수 있다.
수의학 및 인간 용도를 위한 본 발명의 제제는 상기 기술된 바와 같은 순수한 키랄 양이온성 지질을 단독으로, R 및 S 거울상 이성질체의 혼합물로서, 하나 이상의 치료적 성분 예컨대 항원(들) 또는 약물 분자(들)와 함께 포함한다. 제제는 편리하게 단위 제형으로 존재할 수 있고 약학 분야에 공지된 임의의 방법으로 제조될 수 있다.
용어
용어 "한" 또는 "하나"는 하나 이상을 의미한다는 것을 주의한다. 이와 같이, 용어 "한" (또는 "하나"), "하나 이상" 및 "적어도 하나"는 본 명세서에서 상호교환적으로 사용된다.
용어 "포함하다", "포함한다" 및 "포함하는"은 배제적이기 보다는 포함적으로 해석되어야 한다. 용어 "이루어지다", "이루어지는" 및 이의 변형은 포함적이기 보다는 배제적으로 해석되어야 한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "약"은 달리 특정하지 않으면, 제공된 참조로부터 10%의 변동성을 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "대상체" 및 "환자"는 상호교환적으로 사용되고 포유동물, 예를 들어, 인간, 마우스, 래트, 기니 피그, 개, 고양이, 말, 소, 돼지 또는 인간 외 영장류, 예컨대 원숭이, 침팬지, 개코원숭이(baboon) 또는 고릴라를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "질환", "질병" 및 "병태"는 대상체의 비정상적인 상태를 의미하기 위해서 상호교환적으로 사용된다.
본 명세서에서 달리 정의하지 않으면, 본 명세서에서 사용된 기술 및 과학 용어는 당업자에게 본 출원에서 사용된 많은 용어에 대한 일반 지침을 제공하는, 공개된 참고서를 참조하여 그리고 당업자가 통상으로 이해하는 바와 같은 의미를 갖는다.
본 개시 내용의 조성물은 대상체에서 면역원성 반응을 생성시키는데 유효한 HPV 펩티드의 조성물의 양을 포함한다. 특히, 치료적 효과를 획득하기 위한 조성물의 용량은 제제, 조성물의 약리적 역가, 환자의 연령, 체중 및 성별, 치료하려는 병태, 환자 증상의 중증도, 전달 경로, 및 환자의 반응 패턴 등과 같은 인자들에 의존하게 될 것이다. 조성물의 치료 및 용량은 단위 제형으로 투여될 수 있고 당업자는 활성의 상대적 수준을 반영하도록 그에 따라서 단위 제형을 조정하게 된다는 것을 또한 고려한다. 적용하려는 특정 용량 (및 1일 투여 횟수)에 관한 결정은 일반의의 판단에 의하며, 치료적 효과를 발생시키도록 특정한 상황에 대한 용량의 적정을 통해 변화될 수 있다. 더 나아가서, 당업자는 조성물 성분의 변화 또는 희석에 의한 조성물의 유효량의 임의 변화를 계산할 수 있을 것이다. 일 구체예에서, 조성물은 2배로 희석될 수 있다. 다른 구체예에서, 조성물은 4배로 희석될 수 있다. 추가 구체예에서, 조성물은 8배로 희석될 수 있다.
그러므로, 본 명세서에 개시된 조성물의 유효량은 70 ㎏ 포유동물, 예를 들어 인간, 대상체를 기준으로 용량 당 약 1 mg 내지 약 1000 mg 일 수 있다. 다른 구체예에서, 치료적 유효량은 용량 당 약 2 mg 내지 약 250 mg이다. 추가 구체예에서, 치료적 유효량은 약 5 mg 내지 약 100 mg이다. 역시 추가 구체예에서, 치료적 유효량은 약 25 mg 내지 50 mg, 약 20 mg, 약 15 mg, 약 10 mg, 약 5 mg, 약 1 mg, 약 0.1 mg, 약 0.01 mg, 약 0.001 mg이다.
유효량 (치료적으로 투여되면)은 규칙적인 스케줄, 즉 날마다, 매주, 매월, 또는 매년 기반으로, 또는 다양한 투여 일, 주간, 개월 등의 비규칙적 스케줄로 제공될 수 있다. 대안적으로, 투여되는 치료적 유효량은 다양할 수 있다. 일 구체예에서, 제1 용량의 치료적 유효량은 하나 이상의 후속 용량의 치료적 유효량 보다 더 높다. 다른 구체예에서, 제1 용량의 치료적 유효량은 하나 이상의 후속 용량의 치료적 유효량 보다 낮다. 균등한 용량이 제한 없이, 약 2시간 마다, 약 6시간 마다, 약 8시간 마다, 약 12시간 마다, 약 24시간 마다, 약 36시간 마다, 약 48시간 마다, 약 72시간 마다, 약 1주 마다, 약 2주 마다, 약 3주 마다, 약 1개월 마다, 약 2개월 마다, 약 3개월 마다 및 약 6개월 마다를 포함한 다양한 시간 기간 동안 투여될 수 있다. 요법의 완전한 과정에 상응하는 용량의 빈도 및 횟수는 의료진의 판단에 따라서 결정될 것이다.
조성물은 선택된 특별한 병태를 고려하여 임의 경로를 통해 투여될 수 있다. 조성물은 특히 경구로, 주사에 의해, 흡입 (경구, 비내 및 기관내 포함)으로, 안구로, 경피 (단순 수동 확산 제제를 통하거나 또는 예를 들어, 이온영동, 미세바늘에 의한 미세천공, 고주파 절제술 등을 사용한 촉진 전달)로, 혈관내로, 피부로, 피하로, 근육내로, 설하로, 두개내로, 경막외로, 직장으로, 방광내로, 및 질로 전달될 수 있다.
조성물은 투여를 위해 하나 이상의 약학 담체 및/또는 부형제와 함께 또는 순수하게 제제화될 수 있다. 약학 담체(들)의 양은 펩티드의 가용성 및 화학적 성질, 선택된 투여 경로 및 표준 약리학적 관행을 통해 결정된다. 약학 담체(들)는 고형일 수 있거나 또는 액상일 수 있고 고형 및 액상 담체/매트릭스 둘 모두를 유입할 수 있다. 다양한 적합한 액상 담체는 공지되어 있고 당업자가 쉽게 선택할 수 있다. 이러한 담체는 예를 들어, 디메틸설폭시드 (DMSO), 식염수, 완충 식염수, 시클로덱스트린, 히드록시프로필시클로덱스트린 (HPβCD), n-도데실-β-D-말토시드 (DDM) 및 이의 혼합물을 포함할 수 있다. 유사하게, 다양한 고형 (강성 또는 탄성) 담체 및 부형제는 당업자에게 공지되어 있다.
조성물을 단독으로 투여할 수 있지만, 그들은 또한 생리학적으로 상용성인 하나 이상의 약학 담체의 존재 하에서 투여될 수도 있다. 담체는 건조 또는 액상 형태일 수 있고 약학적으로 허용 가능해야만 한다. 액상 약학 조성물은 멸균 용액 또는 현탁액일 수 있다. 액상 담체가 이용될 때, 그들은 멸균 액체일 수 있다. 액상 담체는 용액, 현탁액, 에멀션, 시럽 및 엘릭시르 (elixir)를 제조하는 데 이용될 수 있다. 일 구체예에서, 조성물은 액상 담체에 용해될 수 있다. 다른 구체예에서, 조성물은 액상 담체에 현탁될 수 있다. 제제 분야의 당업자는 투여 경로에 따라서, 적합한 액상 담체를 선택할 수 있을 것이다. 조성물은 대안적으로 고상 담체에 제제화될 수 있다. 일 구체예에서, 조성물은 단위 제형, 특히 정제 또는 캐플렛 (caplet)으로 압축될 수 있다. 다른 구체예에서, 조성물은 단위 제형, 즉 캡슐에 첨가될 수 있다. 추가 구체예에서, 조성물은 분말로서 투여를 위해 제제화될 수 있다. 고상 담체는 다양한 기능을 수행할 수 있는데, 다시 말해서, 하기 기술된 부형제 중 둘 이상의 기능을 수행할 수 있다. 예를 들어, 고상 담체는 또한 향미제, 윤활제, 가용화제, 현탁제, 충전제, 활택제 (glidant), 압축 보조제, 바인더, 붕해제 또는 캡슐화재로서 작용할 수 있다. 일 구체예에서, 고상 담체는 윤활제, 가용화제, 현탁제, 바인더, 붕해제 또는 캡슐화재로서 작용한다. 조성물은 또한 조성물의 적절한 분량을 함유하도록 세분될 수 있다. 예를 들어, 단위 제형은 포장된 조성물, 예를 들어, 포장된 분말, 바이알, 앰풀 (ampoule), 사전충전 시린지 또는 액체 함유 샤세 (sachet)일 수 있다.
일 구체예에서, 조성물은 변형-방출 전달 장치에 의해 투여될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 "변형-방출"은 예를 들어, 적어도 약 8시간 (예를 들어, 연장 전달 ) 내지 적어도 약 12시간 (예를 들어, 지속 전달)의 기간 동안 제어되는 개시된 조성물의 전달을 의미한다. 이러한 장치는 또한 즉시 방출을 가능하게 할 수 있다 (예를 들어, 약 1시간 이내, 또는 약 2시간 이내에 치료적 수준을 달성). 당업자는 적합한 변형-방출 전달 장치를 알고 있다.
본 명세서에 개시된 조성물을 포함하는 키트가 또한 제공된다. 키트는 전달 경로를 위해 제제화된 조성물을 갖는 포장부 또는 용기를 더 포함할 수 있다. 적합하게, 키트는 조성물에 관한 삽입부 및 용량에 대한 지시서를 함유한다.
주기적인 용도를 위해 약학 조성물을 분배하기 위한 많은 패키지 또는 키트가 당분야에 공지되어 있다. 일 구체예에서, 패키지는 각 기간에 대한 표시기를 갖는다. 다른 구체예에서, 패키지는 호일 또는 블리스터 (blister) 패키지, 표지된 앰풀, 바이알 또는 병이다.
키트의 포장 수단은 그 자체가 투여를 위해 가동될 수 있는 것, 예컨대 흡입기, 시린지, 파이펫, 점안기, 카테터, 방광경, 투관침, 캐뉼라 (cannula), 압력 배출 장치, 또는 그로부터 제제가 신체의 영향 받은 영역, 예컨대 폐로 도포될 수 있거나, 대상체에게 주사되거나, 방광 조직에 전달되거나 또는 심지어 키트의 다른 성분에 도포되고 그와 혼합될 수 있는 다른 그러한 장치일 수 있다.
이들 키트의 하나 이상의 성분은 또한 건조되거나 또는 동결 건조된 형태로 제공될 수 있다. 시약 또는 성분이 건조된 형태로 제공될 때, 일반적으로 재구성은 적합한 용매의 첨가에 의한다. 용매가 또한 다른 패키지에 제공될 수 있다는 것을 고려한다. 키트는 바이알을 함유하기 위한 수단 또는 상업 판매를 위한 밀폐된 다른 적합한 포장 수단 예컨대, 예를 들어 바이알을 보유하는 사출 또는 블로우-몰딩된 플라스틱 용기를 포함할 수 있다. 상기 기술된 바와 같이 패키지의 개수 또는 유형과 무관하게, 키트는 또한 동물의 신체 내에서 조성물의 배치 또는 주사/투여를 보조하기 위한 개별 장비와 함께 포장되거나, 또는 그를 포함할 수 있다. 이러한 장비는 흡입기, 시린지, 파이펫, 포셉, 계량 스푼, 점안기, 카테터, 방광경, 투관침, 캐뉼라, 압력-전달 장치 또는 임의의 이러한 의료 승인된 전달 수단을 포함할 수 있다.
용어 "치료하다", "치료하는" 또는 이의 임의 변형은 환자 또는 대상체에서 건강 문제 또는 병태를 낫게 하는데 이용되는 요법을 포함하려는 의미이다. 일 구체예에서, 건강 문제 또는 병태는 영구적으로 또는 단기간 동안 제거될 수 있다. 다른 구체예에서, 건강 문제 또는 병태, 또는 건강 문제 또는 병태의 특징적인 하나 이상의 증상의 중증도는 영구적으로 또는 단기간 동안 축소될 수 있다. 통증 치료의 유효성은 임의의 표준 통증 지수, 예컨대 본 명세서에 기술된 것을 사용하여 결정될 수 있거나, 또는 환자의 주관적인 통증을 기반으로 결정될 수 있다. 환자는 통증의 감소 또는 통증을 유발할 수 있는 자극에 대한 감소된 반응이 보고되면 "치료된"것으로 간주된다.
본 발명은 하기의 실시예를 통해서 더욱 예시하지만, 본 발명의 범주를 한정하려는 임의 방식으로 해석되어서는 안 된다. 반대로, 본 명세서의 설명을 검토 후에, 본 발명의 사상을 벗어나지 않고 당업자에게 제안할 수 있는 다양한 다른 구체예, 변형 및 이의 균등물이 최수 수단이 될 수 있어야 한다는 것을 명확하게 이해해야 한다.
실시예
본 발명의 완전한 이해를 촉진하기 위해 하기에 실시예를 제공한다. 지금까지, 광범위한 환자 포괄도의 펩티드 백신의 개발을 촉진하기 위해서, HPV의 전체 단백질 서열을 포괄하는 15-30개 아미노산의 중복된 펩티드 서열을 함유하도록 백신이 개발되었다. 다양한 HLA 분자와 펩티드 결합을 결정할 수 있는 인-실리코 펩티드 결합 분석의 이용가능성에도 불구하고, 이러한 접근법은 HLA-독립적 백신을 디자인하는 데는 드물게 이용되었는데, MHC 분자에 결합할 수 있는 모든 펩티드가 천연적으로 세포 내에서 프로세싱되는 것이 아니라는 것과, 실제 HLA 포괄도는 예측보다 상당히 낮을 수 있다는 것이 잘 알려져 있기 때문이다.
그러므로, 대량의 펩티드를 이용하지 않고, 백신에 전체 E6 및 E7 단백질 서열을 완전하게 대표할 필요 없이, 광범위한 환자 포괄도를 제공할 수 있는 단순한 HPV 치료적 백신을 성공적으로 개발하기 위해서, 대안적인 접근법이 필요하다. 보다 단순한 제제를 디자인하기 위해서 본 명세서에서 개발한 방법의 제1 단계는 HPV16 E6 및 E7 단백질로부터 펩티드의 몇몇 라이브러리의 디자인이었다. 다음 단계는 특이적 펩티드를 올바르게 프로세싱하고, MHC 클래스 I 및 클래스 II를 통해 정확한 T-세포 에피토프를 각각 CD8+ 및 CD4+ T-세포에게 제시하는 면역계의 능력을 확증하거나 또는 이해하기 위해서 펩티드를 스크리닝하기 위해 대규모 생체 내 실험을 수행하는 것이었다. 이러한 정보를 정확하게 수득하는 유일한 방식은 T-세포 반응을 평가하기 위한 실제 생체 내 실험을 통하는 것이다.
이 실험에서, T-세포 반응은 C57/B6 마우스에서 TC-1 종양 모델을 사용한 종양 퇴행 실험 및 HLA-A2 인간화된 유전자이식 마우스에서 인터페론-감마 ELISPOT 실험을 통해 평가되었다. 다음 단계는 최종 T-세포 면역 반응을 기반으로 적합하거나 또는 바람직한 펩티드의 선택, 및 T-세포 반응을 일으키지 않거나 또는 매우 약한 T-세포 반응을 일으키는 서열의 제거였다. 그 다음으로, 선택된 펩티드는 다양한 HLA 분자와 그들 결합 친화성을 결정하기 위해 인-실리코 결합 분석을 통해 분석되었다. 분석의 종료 시, 생체 내 데이타 및 인-실리코 분석을 조합하였고, 그 다음 목표는 조합하여 사용 시, 인간 개체군의 적어도 90%를 포괄하는 것으로 인-실리코 분석을 통해 예측되는 생체 내 실험으로부터 유래된 활성 펩티드 서열의 최소 수를 선택하는 것이었다. 마지막으로, 선택된 펩티드가 백신 제제에 조합되었다. 이후 이 제제는 결합 부위에 대한 경쟁에 기인하여, 임의의 선택된 서열의 역가가 실질적으로 감소되지 않고 모든 포함된 펩티드에 대한 T-세포 반응이 여전이 수득될 수 있다는 것을 보장하기 위해 T-세포 유도 효능에 대해 시험되었다. 마지막으로, 예측된 포괄 규모는 인간 임상 시험에서 확증되었다.
본 명세서에서 서열 선택은 서열 선택은 C57/B6 마우스에서 종양 퇴행 실험, 및 HLA-A2 인간화된 유전자이식 마우스에서의 인터페론-감마 ELISPOT 실험 둘 모두를 사용해 수행되었다. 종양 퇴행을 사용하여 수행된 펩티드 평가 실험에서, 양성 T-세포 반응은 종양의 퇴행을 야기시키는 T-세포 반응이었다. HLA-A2 마우스 모델 ELISPOT 실험에서, 백 만개 비장세포 당 적어도 20개 스팟이 양성 반응으로 간주되었다.
본 명세서는 양성 또는 음성 T-세포 반응을 보여주는 결과의 요약을 제공한다. 제공된 상세한 설명은 당분야에 친숙한 누구라도 제1 단계로서 생체 내 수단에 의한 펩티드 서열의 대규모 스크리닝의 필요성을 이해할 수 있고 본 발명의 모든 단계를 후속하고 복제할 수 있게 한다.
본 명세서는 또한 인-실리코 결합 분석에 의한 펩티드 HLA-결합 예측을 확증하고 적어도 90% 환자 포괄도에 상응한다는 것을 보여주는 예시를 제공한다. 이들 예시는 당분야의 지식을 갖는 누구라도 먼저 면역원일 수 있는 E6 및 E7 펩티드 서열을 선택하고, 두 번째로 그들을 생체 내에서 시험하여 프로세싱 및 제시성을 확증하는 방법을 정확히 따르도록 할 것이다. 세 번째로 적합하게 면역원성인 것으로 생체 내에서 확인된 선택된 서열을 선택하고 덜 면역원성인 서열은 제거한다. 네 번째로 펩티드를 인-실리코 결합 분석하여 다양한 HLA 유형에 대한 각 펩티드의 결합 친화성을 결정한다. 마지막으로, 적어도 90% 포괄도를 제공하는 것으로 예측되는 펩티드의 조합이 선택된다. 우리의 경우에 인간 임상 실험을 수행하여 그 예측을 시험하고 확증하였다.
하기 실시예는 본 발명을 만들고 실시하는 예시적인 방식을 예시한다. 그러나, 대안적인 방법을 이용하여 유사한 결과를 수득할 수 있기 때문에, 본 발명의 범주가 예시만을 위한 이들 실시예에 개시된 특별한 구체예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명을 예시하는데 사용된 펩티드 서열은 표 1에 제공되어 있다.
생체 내에서 스크리닝된 펩티드 서열의 샘플 및 최종 면역 반응
서열번호 서열 해당부분 면역 반응, 방법
서열번호 1 RAHYNIVTF E7 49-57 양성, 종양 퇴행
서열번호 2* DRAHYNIVTF E7 48-57 음성, 종양 퇴행
서열번호 3 PalmKSS RAHYNIVTF E7 49-57 양성, 종양 퇴행
서열번호 4 KSS RAHYNIVTF E7 49-57 양성, 종양 퇴행
서열번호 5 GQAEPDRAHYNIVTF E7 43-57 양성, 종양 퇴행
서열번호 6* KSS GQAEPDRAHYNIVTF E7 43-57 음성, 종양 퇴행
서열번호 7 PAGQAEPDRAHYNIVTFC E7 41-58 양성, 종양 퇴행
서열번호 8* EPDRAHYNIVTFCCKCDS E7 46-63 음성, 종양 퇴행
서열번호 9 MHGDTPTLHEYMLDLQPETT E7 1-20 양성, EISPOT
서열번호 10 LLMGTLGIVCPICSQKP E7 82-98 양성, ELISPOT
서열번호 11 ELQTTIHDIILECVYCKQQLL E6 25-45 양성, ELISPOT
서열번호 12* KFYSKISEYRHCYYSLYGTTL E7 75-95 음성, ELISPOT
서열번호 13* QQLLRREVYDFAFRDLCIVYR E7 42-62 음성, ELISPOT
서열번호 14 YMLDLQPETT E7 11-20 양성, ELISPOT
서열번호 15 LLMGTLGIV E7 82-90 양성, ELISPOT
서열번호 16 IVCPICSQK E7 89-96 에피토프로서 평가됨
서열번호 17 GTLGIVCPI E7 85-92 에피토프로서 평가됨
서열번호 18 IILECVYCK E6 33-41 에피토프로서 평가됨
서열번호 19 TLHEYMLDL E7 7-15 에피토프로서 평가됨
서열번호 20 TPTLHEYML E7 5-13 에피토프로서 평가됨
서열번호 21 TIHDIILECV E7 29-38 양성, ELISPOT
서열번호 22 TLGIVCPIC E7 86-93 양성, ELISPOT
서열번호 23 PalmKSS ELQTTIHDIILECVYCKQQLL E6 25-45 양성, ELISPOT
서열번호 24 PalmKSS MHGDTPTLHEYMLDLQPETT E7 1-20 양성, ELISPOT
서열번호 25 PalmKSS LLMGTLGIVCPICSQKP E7 82-98 양성, ELISPOT
서열번호 26 PalmKSS GQAEPDRAHYNIVTF E7 43-57 양성 종양 퇴행
서열번호 26 PalmKSS GQAEPDRAHYNIVTF E7 43-57 양성, ELISPOT
서열번호 27 PalmKSS YMLDLQPETT E7 11-20 양성, ELISPOT
서열번호 28 PalmKSS LLMGTLGIV E7 82-90 양성, ELISPOT
서열번호 29 FAFRDLCIV E7 52-60 에피토프로서 평가됨
서열번호 30 KISEYRHCY E7 79-87 에피토프로서 평가됨
서열번호 31 RLCVQ STHVDIRTLEDLL E7 66-83 제제에 대해 평가됨
서열번호 32 CDSTLRLCVQ STHVDIRT E7 61-78 양성, 종양 제제
*결합 실험에서 평가를 위한 선택의 효능 기준을 충족하지 않음
실시예 1
C57/B6 마우스에서 TC-1 종양 퇴행에 의한 펩티드 서열 스크리닝
이 실시예는 HPV-특이적 T-세포 유도 및 후속 종양 퇴행을 야기시키는 핵심 에피토프에 대한 그들의 효과적인 프로세싱 및 제시성에 관한 TC-1 마우스 종양 퇴행 모델에서 몇몇 HPV16 E7 펩티드의 평가 또는 스크리닝을 예시한다.
종양 퇴행 스크리닝 실험에서, 마우스는 0일에 100,000 TC-1 세포가 이식되었다. 7일에, 종양이 충분히 고착되면 마우스에게 특이적 펩티드 서열을 단독으로, 또는 흡수 및 제시를 촉진하도록 양이온성 지질 예컨대 DOTMA, DOEPC 또는 R-DOTAP와 조합하여 제제화하여 백신접종 하였다. 이들 실험에서, 백신은 0.1-3.0 mg/mL 농도의 선택된 펩티드 및 0.2-3.0 mg/mL 농도의 양이온성 리포솜을 함유하였다. 펩티드 서열이 팔미토일 사슬이 부착되어 지질화된 경우에, 펩티드는 백신접종 이전에 양이온 리포솜과 단순 혼합되었다. 비지질화 펩티드의 경우에, 전통적인 박막 리포솜 제조 방법을 통해서 리포솜을 제조하여 펩티드를 캡슐화시켰다 (F Szoka, and D Papahadjopoulos, Comparative Properties and Methods of Preparation of Lipid Vesicles (Liposomes), Annual Review of Biophysics and Bioengineering, Vol. 9:467-508, 1980). 당업자에게 충분히 공지된 다른 방법이 또한 사용될 수 있었다.
서열번호 1 (흑색 사각형), 서열번호 7, 8, 31 32 및 31 (흑색 단색 원형), 서열번호 7 (빈 원형), 및 서열번호 8 (흑색 단색 삼각형)에 상응하는 펩티드에 대한 결과를 도시한 샘플 종양 퇴행 그래프는 도 3에 도시되어 있다. 결과는 일부 HPV E7 서열이 효과적인 종양 퇴행을 일으킨 데 반해서, 아마도 필요한 CD8+ T-세포 에피토프를 제시하는 비효과적인 능력에 기인하여, 나머지는 그렇지 못하였다는 사실을 강조한다. 선택된 결과는 표 1에 요약되어 있다.
실시예 2
HLA-A2 마우스에서 IFN-G ELISPOT 실험에 의한 펩티드 서열 스크리닝
이 실시예는 인간화된 HLA-A2 유전자이식 마우스에서 ELISPOT 실험을 사용하여 T-세포 반응을 평가하기 위한 접근법을 강조한다. 이들 실험에서, 백신은 0.1-3.0 mg/mL 농도의 선택된 펩티드, 및 사용된 경우 0.2-3.0 mg/mL 농도의 양이온성 리포솜을 함유하였다. 인간 항원을 인식할 수 있는 인간 면역계의 성분을 갖는 인간화된 HLA-A2 유전자이식 마우스는 100 ㎕의 백신이 0일 및 7일에 백신접종 되었다. 14일에 마우스를 희생시켰고 HPV-특이적 면역 반응은 마우스 (그룹 당 4-8마리) 유래 비장세포로 표준 접근법을 사용한 인터페론-감마 ELISPOT를 통해 평가되었다. 비장세포는 표 2에 명시된 긴 다중-에피토프 펩티드 또는 명시된 CD8+ T-세포 에피토프 펩티드로 자극되었다. 백 만개 세포 당 IFN-g 스팟의 개수는 명시된 실시예에 대해 열거되었다. 최소 20개 스팟이 적절한 역가, 및 결합 에피토프 결합 실험의 선택에 대한 컷-오프였다. 각각의 긴 다중-에피토프 펩티드를 비롯하여 짧은 단일 에피토프 펩티드로 자극시 T-세포 면역 반응을 성공적으로 발생시키는 인간화된 유전자이식 마우스의 능력 (> 20개 스팟)은 선택된 펩티드가 효과적으로 프로세싱되어 T-세포에 제시된다는 것을 확증한다. 이들 실험에서, 미 자극된 비장세포 및 비관련 펩티드로 자극된 비장세포 둘 모두는 모든 어세이에서 음성 대조군으로서 함께 사용되었다. 어세이의 양성 대조군의 경우 ConA가 사용되었다.
IFN-g ELISPOT 실험의 요약 - 선택된 서열
서열번호 서열 자극성 펩티드로서 사용된 T-세포 에피토프 ELISPOT 결과
Av 스팟/106 세포
서열번호 9 MHGDTPTLHEYMLDLQPETT YMLDLQPETT (서열번호 14) 235
서열번호 10 LLMGTLGIVCPICSQKP TLGIVCPIC (서열번호 22) 27
서열번호 10* LLMGTLGIVCPICSQKP LLMGTLGIV (서열번호 15) 1
서열번호 11 ELQTTIHDIILECVYCKQQLL TIHDIILECV (서열번호 21) 262
서열번호 12* KFYSKISEYRHCYYSLYGTTL KISEYRHCY (서열번호 30) 15
서열번호 13* QQLLRREVYDFAFRDLCIVYR FAFRDLCIV (서열번호 29) 6
서열번호 14 YMLDLQPETT YMLDLQPETT (서열번호 14) 580
서열번호 15 LLMGTLGIV
서열번호 21 TIHDIILECV
서열번호 23 PalmKSS ELQTTIHDIILECVYCKQQLL TIHDIILECV (서열번호 21) 612
서열번호 23* PalmKSS ELQTTIHDIILECVYCKQQLL ELQTTIHDIILECVYCKQQLL (서열번호 13) 8
서열번호 24 PalmKSS MHGDTPTLHEYMLDLQPETT YMLDLQPETT (서열번호 14) 79
서열번호 24 PalmKSS MHGDTPTLHEYMLDLQPETT MHGDTPTLHEYMLDLQPETT (서열번호 9) 284
서열번호 25* PalmKSS LLMGTLGIVCPICSQKP LLMGTLGIV (서열번호 15) 5
서열번호 25 PalmKSS LLMGTLGIVCPICSQKP TLGIVCPIC (서열번호 22) 31
서열번호 25 PalmKSS LLMGTLGIVCPICSQKP LLMGTLGIVCPICSQKP (서열번호 10) 92
서열번호 26 PalmKSS GQAEPDRAHYNIVTF RAHYNIVTF (서열번호 1) 1,552
서열번호 26 PalmKSS GQAEPDRAHYNIVTF GQAEPDRAHYNIVTF (서열번호 5) 1,544
서열번호 27 PalmKSS YMLDLQPETT YMLDLQPETT (서열번호 14) 280
서열번호 28 PalmKSS LLMGTLGIV LLMGTLGIV (서열번호 15) 96
*결합 실험에서 평가를 위한 선택의 효능 기준을 충족하지 않음
실시예 3
HPV16 백신의 면역원성에 대한 선택된 서열의 화학적 변형 예컨대 산화 및 다량체 형성의 효과
본 실험은 면역원성에 대한 선택된 펩티드의 화학적 변형의 효과 및 프로세싱되고, 제시되어 인간 CD8+ HPV-특이적 T-세포 반응을 프라이밍하는 그들의 능력을 평가하기 위해 수행되었다. 서열번호 23 및 25에 상응하는 펩티드는 산화 시에 이량체 및 다른 다량체의 형성을 초래하는 시스테인 (cystein)을 함유한다. 서열번호 23 및 25에 상응하는 펩티드를 함유하는 2종의 백신 제제가 제조되었다.
제제 A의 경우: 양쪽 펩티드는 HPLC 분석으로 확인된 고순도의 단량체였다. 백신은 1.5-1.6 mg/mL의 각 펩티드를 함유하였다.
제제 B의 경우: 양쪽 펩티드의 상당한 산화 및 다량체 형성이 HPLC 분석으로 확인되었다.
2종의 제제는 백신 접종 이전에 5.8 mg/mL의 R-DOTAP과 1:1로 혼합되었다.
펩티드의 면역원성은 CD8+ T-세포를 유도하는 능력을 평가함으로써 제제에 따라 10마리 HLA-A2 마우스에서 상기 실시예에 기술된 바와 같이 비교되었다. ELISPOT 실험은 상기 기술된 대로 수행되었다. 하기 표 3은 ELISPOT 실험 및 스튜던트 T-검정을 사용한 비교의 결과를 도시한다. 통계 분석 결과는 제제 A 및 B 사이의 편차가 유의성을 위한 P < 0.05의 P-값을 충족하지 않는다는 것을 의미한다. 본 실험은 변형 예컨대 산화가 펩티드 서열의 면역원성에 부정적으로 영향을 미치지 않을 것이라는 것을 시사한다.
펩티드의 CD8+ T-세포 면역원성에 대한 펩티드 서열 23 및 25의 화학적 변형 예컨대 산화 및 다량체 형성의 효과
서열번호 서열 자극성 펩티드로서 사용된 T-세포 에피토프 ELISPOT 결과
Av 스팟/106 세포
제제 A
서열번호 23 PalmKSS ELQTTIHDIILECVYCKQQLL TIHDIILECV
(서열번호 21)		 314
서열번호 25 PalmKSS LLMGTLGIVCPICSQKP LLMGTLGIV(서열번호 15) 52
제제 B
서열번호 23 PalmKSS ELQTTIHDIILECVYCKQQLL TIHDIILECV
(서열번호 21)		 158
서열번호 25 PalmKSS LLMGTLGIVCPICSQKP LLMGTLGIV (서열번호 15) 48
서열번호 23: 제제 A 대 B - P=0.08
서열번호 25: 제제 A 대 B - P=0.80
실시예 4
4종의 선택된 펩티드 서열을 함유하는 다중-에피토프 펩티드 백신에 존재하는 HPV 펩티드에 결합할 수 있는 잠재적인 HLA 대립유전자의 인-실리코 분석의 요약
몇몇 HPV16 E6 및 E7 펩티드 서열을 디자인하였고 상기 실시예에 기술된 대로 효과적으로 프로세싱되어 특이적 에피토프를 제시하여 항원-특이적 T-세포를 프라이밍시키는 펩티드의 능력에 대해 인간화된 HLA-A2 마우스에서 생체 내 평가하였다. 당업자에게 분명한 바와 같이, 펩티드 에피토프 상호작용은 입체화학, 보조인자의 존재 및 환경의 생화학적 특성을 포함하는 다양한 인자들에 의존하여 복잡하다. 따라서, 백신에서의 최적 효능을 위해 적절한 펩티드의 선택은 일상적이거나 또는 예측가능한 관행이 아니다. 효과적으로 프로세싱되어 T-세포 에피토프를 제시할 수 있는 적합한 펩티드 서열을 동정하기 위한 대규모 생체 내 실험을 기반으로, 선택된 펩티드는 고착된 종양의 퇴행을 유도하거나 또는 IFN-감마를 유도하는 HPV-특이적 T-세포를 유도하는 그들의 능력을 기반으로 더욱 선택되었고, 이어서 그들 HLA 포괄도를 평가하기 위해 인-실리코 결합 분석을 통해 분석되었다. 다음으로 인간 임상 시험에서 예측도를 확인하였다.
HLA 수퍼타입, HLA-A2는 개체군의 약 42%를 차지한다 (Sette, A. and J. Sidney, Nine major HLA class I supertypes account for the vast preponderance of HLA-A and -B polymorphism. Immunogenetics, 1999. 50(3-4): p. 201-12). HPV16 E6 및 E7은 HLA A2에 의해 제시될 수 있는 실험적으로 검증된 에피토프를 비롯하여, 다른 HLA 유형에 의해 제시될 수도 있는 에피토프를 발현한다.
이를 위해서, 9종의 주요 HLA 수퍼타입 (Sette, A. and J. Sidney, HLA supertypes and supermotifs: a functional perspective on HLA polymorphism. Curr Opin Immunol, 1998. 10(4): p. 478-82)을 대표하는 9종의 상이한 HLA 분자에 대한 펩티드 결합 친화성을 평가하였다. 9종의 주요 HLA 수퍼타입은 인간 개체군의 펩티드 결합 잠재성의 98% 이상을 차지한다 (Sette, A. and J. Sidney, Nine major HLA class I supertypes account for the vast preponderance of HLA-A and -B polymorphism. Immunogenetics, 1999. 50(3-4): p. 201-12). HLA-결합의 평가를 위한 적합한 서열의 동정을 이끄는 대규모 스크리닝 생체-내 실험을 비롯하여, 결합 부위에 대한 경쟁이 백신 제제로 조합 시 특이적 T-세포 에피토프를 프로세싱하고 제시하는 면역계의 능력을 감소시키지 않는다는 것을 보장하기 위한 확인 실험은 본 명세서에서 제공하는 실시예 전반에 기술되어 있다. 본 실험은 펩티드 선택 기술, 및 펩티드 스크리닝 기술을 이용할 수 있더라도, 광범위 적용가능성을 갖는 효과적인 백신을 생성시키는 방법을 최적화하기 위해 펩티드를 동정, 선택 및 조합하는 방법은 일상적이거나 또는 간단한 것이 아니라는 것을 입증한다.
스크리닝 후 4종의 선택된 펩티드 서열에 대한 결합 활성
제제에 존재하는 펩티드 펩티드 CD8+ T-세포 에피토프 서열
HLA
수퍼타입		 IC50 (nM)
서열번호 10 & 25 HLA-A*03:01 IVCPICSQK (서열번호 16) 155
서열번호 10 & 25 HLA-A*02:01 LLMGTLGIV (서열번호 15) 19
서열번호 10 & 25 HLA-A*02:01 GTLGIVCPI (서열번호 17) 155
서열번호 11 & 23 HLA-A*03:01 IILECVYCK (서열번호 18) 126
서열번호 5 & 26 HLA-A*24:02 RAHYNIVTF (서열번호 1) 1699
서열번호 5 & 26 HLA-B*58:01 RAHYNIVTF (서열번호 1) 107
서열번호 9 & 24 HLA-A*02:01 YMLDLQPETT (서열번호 14) 5
서열번호 9 & 24 HLA-A*02:01 TLHEYMLDL (서열번호 19) 48
서열번호 9 & 24 HLA-B*07:02 TPTLHEYML (서열번호 20) 921
표 4는 본 개시 내용의 목적을 위해, 면역 에피토프 데이타베이스 (www.iedb.org)에 존재하는 에피토프 예측 도구를 사용하여 그들 서열에 의해 포괄되는 가능한 에피토프를 비롯하여, T-세포 유도 실험에 의해 동정된 4종의 바람직한 펩티드 서열의 펩티드 결합 분석의 결과를 요약한다. 도구는 특정한 HLA 클래스 I 대립유전자와 펩티드의 예측되는 결합 친화성 (IC50)을 계산한다. 일반적으로 5,000 nM 이하의 IC50은 생물학적으로 관련된 결합성 및 제시성에 충분한 것으로 보고되었고 500 nM 미만의 결합 친화성은 높은 친화성 결합을 나타내는 것으로 간주된다. 현행 분석에서 2,000 nM이 잠재적인 HLA 결합 펩티드를 평가하기 위한 컷오프로서 선택되었다. 표 4에 표시된 바와 같이, 5종의 별개 HLA 수퍼타입을 대표하는 적어도 5종의 상이한 HLA 분자는 서열번호 5, 9, 10 및 11 또는 23-26 내의 상이한 펩티드의 생물학적으로 유의한 결합 및 제시에 대한 잠재성을 갖는 것으로 동정된다. 이들 5종의 수퍼타입은 인종과 무관하게 인간 개체군의 90% 초과를 대표하는 것으로 알려져 있다 [Sette, A. and J. Sidney, Nine major HLA class I supertypes account for the vast preponderance of HLA-A and -B polymorphism. Immunogenetics, 1999. 50(3-4): p. 201-12].
실시예 5
R-DOTAP 이외의 다른 양이온성 지질과 HPV-E6 및 E7 펩티드 서열의 상용성 및 HPV-특이적 T-세포 반응을 유도하는 능력
동정된 긴 HPV16 펩티드가 DOTAP 이외의 다른 양이온성 지질과 상용성인지 여부를 결정하기 위해서, 서열번호 26에 상응하는 펩티드를 2종의 다른 양이온성 지질 DOTMA 및 DOEPC와 조합하여 모델 펩티드로서 사용하였다. 2종의 양이온성 지질의 존재 하에서, 프로세싱 및 제시를 효과적으로 겪는 펩티드의 능력을 평가하기 위해서, ELISPOT 실험을 정상 C57/B6 마우스를 사용해 수행하였다. ELISPOT 실험은 상기 기술된 대로 수행하였고 효과적인 CD8+ T-세포 유도를 결정하는데 이용되었다.
제제 1의 경우에, 1.35 mg/mL의 DOTMA를 1:1 v/v로 0.5 mg/mL의 서열번호 26에 상응하는 펩티드와 혼합하였다.
제제 2의 경우에, 1.67 mg/mL의 DOEPC를 1:1 v/v로 0.5 mg/mL의 서열번호 26에 상응하는 펩티드와 혼합하였다.
각각의 제제를 4마리 마우스에게 0일 및 7일에 백신접종하였다. 14일에, 마우스를 희생시켰고 비장세포를 ELISPOT 실험에서 이용하였다.
다양한 양이온성 지질을 사용한 HPV-펩티드 제제에 대한 ELISPOT 결과
서열번호 서열 자극성 펩티드로서 사용된 T-세포 에피토프 ELISPOT 결과
Av 스팟/106 세포
DOTMA
서열번호 26 PalmKSS GQAEPDRAHYNIVTF RAHYNIVTF
(서열번호 1)		 988
DOEPC
서열번호 26 PalmKSS GQAEPDRAHYNIVTF RAHYNIVTF
(서열번호 1)		 243
실험은 다양한 양이온성 지질이 강력한 HPV-특이적 T-세포 반응을 유도하기 위해서 동정된 HPV E6 및 E7 펩티드와 함께 사용될 수 있다는 것을 입증하였다.
실시예 8
HPV 치료적 백신에서 지질화된 펩티드 (서열번호 23-28) 및 R-DOTAP 양이온성 지질의 사용 및 인간 임상 시험에서 HPV-특이적 T-세포 반응의 평가
생체 내 T-세포 반응 및 펩티드 결합을 기반으로 개체군의 > 90%를 포괄하는 것으로 실시예 1-4에서 추정된 4종 펩티드 (서열번호 23-26), 및 서열번호 24 및 25에 이미 함유된 2종의 추가적인 단일 에피토프 펩티드 (서열번호 27 및 28)를 함유하는 6-펩티드 제제는 인간 임상 시험 (clinical trials.gov # NCT02065973)으로 평가하였다. 제제에 포함된 2종의 단일 에피토프 펩티드는 그들이 이미 포함된 긴 펩티드 서열 중 2종에 함유되어 있으므로 추가적인 포괄도를 제공하지는 않는다.
이러한 탐색 연구에서, 생물학적 시스템 및 인간 반응의 다양한 성질에 기인하여, 백신에 대한 면역 반응은 IFN-γ 및 그랜자임(granzyme)-b ELISPOT 둘 모두를 통해 평가되었다. 각각의 대상체에게 R-DOTAP/펩티드 제제의 3회 백신접종이 제공되었다. 모든 대상체는 3주마다 1회씩, 3회 백신접종을 받았다. 혈액은 백신접종 전 (기준치) 및 각 백신접종 후 14-19일 및 마지막 백신접종 후 90일에 ELISPOT에 의한 면역 모니터링을 위해 채혈되었다. 대상체는 백신의 광범위 포괄도를 확증하기 위해서 HLA-유형에 의해 제한되지 않았다. ELISPOT 분석은 대상체 PBMC를 사용해 수행되었고 6-펩티드 혼합물로 자극시켜 HPV-펩티드의 효과적인 제시 및 T-세포 인식을 결정하였다.
인간 임상 실험의 결과는 하기 표 6에 표시되어 있다. 백신-유도된 반응은 전형적으로 기준치보다 면역 반응의 2배 또는 3배 증가로서 정의된다. 이 실험에서, 면역 반응은 IFN-γ 또는 그랜자임-b 분석에 의해 기준치 샘플과 비교하여 백신접종 후 T-세포 반응의 3배 또는 그 이상의 증가로서 정의된다. 기준치에서 420개의 IFN-g 스팟이 넘는 매우 강력한 T-세포 반응 (면역계가 아마도 이미 최근의 HPV 감염에 반응함)을 갖는 2명의 대상체, 대상체 2 및 5는 이상점으로 간주하였다 (표 6). 모든 대상체는 HLA-유형에 대해 검사되었다. 대상체의 절반은 예상대로 HLA-A2였는데, 이것이 가장 일반적인 HLA-유형이기 때문이다. 그러나, 비-HLA-A2 대상체 (HLA-A1, 30, 3, 74, 80 등)를 포함하는 모든 대상체들은 백신에 대해 강력한 T-세포 반응을 생성시켰다. 실험은 4종의 다중-에피토프 펩티드, 서열번호 23-26의 조합은 유전적 배경이 다양한 환자에 의해 인식될 수 있는 광범위하게 적용 가능한 인간 HPV16 백신을 제공한다.
다양한 HLA 유형을 갖는 인간 대상체에서 INF-감마 및 그랜자임-B ELISPOT를 통해 CD8+ T-세포를 포함하는 항원-특이적 T-세포를 프라이밍하는 양이온성 지질 및 펩티드 (서열번호 23-28)를 함유하는 HPV16 백신 제제의 능력의 평가
400,000 세포 당 스팟의 평균 수
IFN-γ 그랜자임-b
환자 #* HLA-유형 기준치** 기준치 이상 계수 증가*** 기준치** 기준치 이상 계수 증가*** 활성
1 02 6.0 19.7 N/A 있음
2 01, 02 423.0 이상점
3 01 69.5 7.3 5.7 3.0 있음
4 02 22.0 14.8 0.0 10.3 있음
5 29 464.7 이상점
6 03 17.8 32.8 6.7 31.8 있음
7 02, 26 3.0 4.8 51.3 1.2 있음
8 02, 68 1.0 72.7 8.0 7.6 있음
9 03 2.3 10.4 10.0 1.0 있음
10 74, 80 1.0 53.3 1.0 61.3 있음
11 02, 30 9.0 1.4 1.0 35 있음
12 N/A 1.0 10.7 23.3 1.1 있음
평균 반응 22.8 15.2
*기준치는 기저 계측치를 뺀 방문 2 (백신접종 전 방문)임.
**최대 반응은 기저 계측치를 뺀 대상체에서 관찰된 최대 반응 (계측치)임.
***기준치 이상의 계수 증가는 기준 계측치로 나눈 최대 반응임 (계수 ≥ 3은 백신접종으로 인한 면역 반응으로 간주됨4,5)
****기저값을 뺀 계측치로 인한 음의 결과는 0의 값으로 제공되고, 0/0 = 0임.
#활성: IFN-γ 및/또는 그랜자임-b ELISPOT에 의한 ≥3의 기준치 이상의 계수 증가
<110> PDS BIOTECHNOLOGY CORPORATION <120> NOVEL HPV16 NON HLA-RESTRICTED T-CELL VACCINES, COMPOSITIONS AND METHODS OF USE THEREOF <130> 19PC0406 <150> US 62/404,458 <151> 2016-10-05 <160> 32 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 1 Arg Ala His Tyr Asn Ile Val Thr Phe 1 5 <210> 2 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 2 Asp Arg Ala His Tyr Asn Ile Val Thr Phe 1 5 10 <210> 3 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 3 Pro Ala Leu Met Lys Ser Ser Arg Ala His Tyr Asn Ile Val Thr Phe 1 5 10 15 <210> 4 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 4 Lys Ser Ser Arg Ala His Tyr Asn Ile Val Thr Phe 1 5 10 <210> 5 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 5 Gly Gln Ala Glu Pro Asp Arg Ala His Tyr Asn Ile Val Thr Phe 1 5 10 15 <210> 6 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 6 Lys Ser Ser Gly Gln Ala Glu Pro Asp Arg Ala His Tyr Asn Ile Val 1 5 10 15 Thr Phe <210> 7 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 7 Pro Ala Gly Gln Ala Glu Pro Asp Arg Ala His Tyr Asn Ile Val Thr 1 5 10 15 Phe Cys <210> 8 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 8 Glu Pro Asp Arg Ala His Tyr Asn Ile Val Thr Phe Cys Cys Lys Cys 1 5 10 15 Asp Ser <210> 9 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 9 Met His Gly Asp Thr Pro Thr Leu His Glu Tyr Met Leu Asp Leu Gln 1 5 10 15 Pro Glu Thr Thr 20 <210> 10 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 10 Leu Leu Met Gly Thr Leu Gly Ile Val Cys Pro Ile Cys Ser Gln Lys 1 5 10 15 Pro <210> 11 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 11 Glu Leu Gln Thr Thr Ile His Asp Ile Ile Leu Glu Cys Val Tyr Cys 1 5 10 15 Lys Gln Gln Leu Leu 20 <210> 12 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 12 Lys Phe Tyr Ser Lys Ile Ser Glu Tyr Arg His Cys Tyr Tyr Ser Leu 1 5 10 15 Tyr Gly Thr Thr Leu 20 <210> 13 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 13 Gln Gln Leu Leu Arg Arg Glu Val Tyr Asp Phe Ala Phe Arg Asp Leu 1 5 10 15 Cys Ile Val Tyr Arg 20 <210> 14 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 14 Tyr Met Leu Asp Leu Gln Pro Glu Thr Thr 1 5 10 <210> 15 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 15 Leu Leu Met Gly Thr Leu Gly Ile Val 1 5 <210> 16 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 16 Ile Val Cys Pro Ile Cys Ser Gln Lys 1 5 <210> 17 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 17 Gly Thr Leu Gly Ile Val Cys Pro Ile 1 5 <210> 18 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 18 Ile Ile Leu Glu Cys Val Tyr Cys Lys 1 5 <210> 19 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 19 Thr Leu His Glu Tyr Met Leu Asp Leu 1 5 <210> 20 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 20 Thr Pro Thr Leu His Glu Tyr Met Leu 1 5 <210> 21 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 21 Thr Ile His Asp Ile Ile Leu Glu Cys Val 1 5 10 <210> 22 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 22 Thr Leu Gly Ile Val Cys Pro Ile Cys 1 5 <210> 23 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 23 Pro Ala Leu Met Lys Ser Ser Glu Leu Gln Thr Thr Ile His Asp Ile 1 5 10 15 Ile Leu Glu Cys Val Tyr Cys Lys Gln Gln Leu Leu 20 25 <210> 24 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 24 Pro Ala Leu Met Lys Ser Ser Met His Gly Asp Thr Pro Thr Leu His 1 5 10 15 Glu Tyr Met Leu Asp Leu Gln Pro Glu Thr Thr 20 25 <210> 25 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 25 Pro Ala Leu Met Lys Ser Ser Leu Leu Met Gly Thr Leu Gly Ile Val 1 5 10 15 Cys Pro Ile Cys Ser Gln Lys Pro 20 <210> 26 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 26 Pro Ala Leu Met Lys Ser Ser Gly Gln Ala Glu Pro Asp Arg Ala His 1 5 10 15 Tyr Asn Ile Val Thr Phe 20 <210> 27 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 27 Pro Ala Leu Met Lys Ser Ser Tyr Met Leu Asp Leu Gln Pro Glu Thr 1 5 10 15 Thr <210> 28 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 28 Pro Ala Leu Met Lys Ser Ser Leu Leu Met Gly Thr Leu Gly Ile Val 1 5 10 15 <210> 29 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 29 Phe Ala Phe Arg Asp Leu Cys Ile Val 1 5 <210> 30 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 30 Lys Ile Ser Glu Tyr Arg His Cys Tyr 1 5 <210> 31 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 31 Arg Leu Cys Val Gln Ser Thr His Val Asp Ile Arg Thr Leu Glu Asp 1 5 10 15 Leu Leu <210> 32 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 32 Cys Asp Ser Thr Leu Arg Leu Cys Val Gln Ser Thr His Val Asp Ile 1 5 10 15 Arg Thr

Claims (20)

  1. HPV (Human papillomavirus) 펩티드 서열을 포함하는 조성물로서, HPV 펩티드 서열은 HPV16 E6 펩티드 및/또는 HPV16 E7 펩티드에 상응하고, 펩티드 서열은 5종의 HLA (Human histocompatibility leukocyte antigen) 수퍼타입과 대략 5,000 nM의 IC50의 결합 친화성을 갖고, 펩티드의 일부는 다중-에피토프 펩티드인 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 펩티드는 서열번호 5, 9, 10 및 11, 또는 서열번호 23, 24, 25 및 26으로 이루어진 그들의 지질화된 형태를 포함하는 것인 조성물.
  3. 제2항에 있어서, 펩티드는 개별 펩티드로서 조성물에 존재하는 것인 조성물.
  4. 제2항에 있어서, 펩티드는 청구된 서열을 포괄하는 단일한 긴 펩티드를 형성하도록 스페이서 없이 또는 스페이서와 함께 서로 접합되는 것인 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 보강제 (adjuvent)를 더 포함하는 것인 조성물.
  6. 제5항에 있어서, 보강제는 양이온성 지질로 이루어진 것인 조성물.
  7. 제6항에 있어서, 양이온성 지질은 DOTAP, DDA, DOEPC, DOTMA, R-DOTAP, R-DDA, R-DOEPC, R-DOTMA, S-DOTAP, S-DDA, S-DOEPC, S-DOTMA, 이의 변이체 또는 유사체로 이루어진 것인 조성물.
  8. 제1항에 있어서, HLA 수퍼타입은은 HLA-A*02:01, HLA-A*03:01, HLA-A*24:02, HLA-B*07:02 및 HLA-B*58:01로 이루어진 것인 조성물.
  9. 제1항에 있어서, 인핸서 효현제 (agonist) 에피토프를 더 포함하는 것인 조성물.
  10. 제1항에 있어서, 단일-에피토프 펩티드를 더 포함하는 것인 조성물.
  11. 제10항에 있어서, 단일-에피토프 펩티드는 서열번호 14, 또는 서열번호 15 및 이의 유사체 예컨대 서열번호 27 및 28을 포함하는 것인 조성물.
  12. 제1항에 있어서, 펩티드는 변형된 펩티드, 펩티드 유사체, 및 이의 활성 단편을 포함하는 것인 조성물.
  13. 제12항에 있어서, 펩티드는 산화, 디-술파이드 결합에 의한 가교화, PEG화, 글리코실화, 인산화, 팔미토일화, 메틸화, 또는 바이오틴화되는 것인 조성물.
  14. 제1항에 있어서, 펩티드는 서열번호 5, 9, 10, 11, 23, 24, 25 또는 26으로 이루어지고, 양이온성 지질은 R-DOTAP을 포함하는 것인 조성물.
  15. 제7항에 있어서, 펩티드는 양이온성 지질을 포함하는 리포솜에 캡슐화되는 것인 조성물.
  16. 대상체에게 HPV 펩티드 서열을 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 HPV 감염에 대한 면역 반응을 유도시키는 방법으로서, HPV 펩티드 서열은 HPV16 E6 펩티드 및/또는 HPV16 E7 펩티드에 상응하고, 펩티드 서열은 5종의 HLA 수퍼타입과 대략 5,000 nM의 IC50의 결합 친화성을 갖고, 펩티드의 일부는 다중-에피토프 펩티드인 방법.
  17. 제16항에 있어서, 펩티드는 서열번호 5, 9, 10, 11, 23, 24, 25 또는 26로 이루어진 것인 방법.
  18. 제16항에 있어서, 보강제를 더 포함하는 것인 방법.
  19. 제18항에 있어서, 양이온성 지질은 DOTAP, DDA, DOEPC, DOTMA, R-DOTAP, R-DDA, R-DOEPC, R-DOTMA, S-DOTAP, S-DDA, S-DOEPC, S-DOTMA, 이의 변이체 또는 유사체로 이루어진 것인 방법.
  20. 제19항에 있어서, 펩티드는 서열번호 5, 9, 10, 11, 23, 24, 25 또는 26으로 이루어지고, 양이온성 지질은 R-DOTAP을 포함하는 것인 방법.
KR1020197012979A 2016-10-05 2017-10-04 신규한 hpv16 hla-비제한적 t-세포 백신, 조성물 및 이의 사용 방법 KR20190073416A (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201662404458P 2016-10-05 2016-10-05
US62/404,458 2016-10-05
PCT/US2017/055119 WO2018067689A1 (en) 2016-10-05 2017-10-04 Novel hpv16 non hla-restricted t-cell vaccines, compositions and methods of use thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20190073416A true KR20190073416A (ko) 2019-06-26

Family

ID=61757761

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020197012979A KR20190073416A (ko) 2016-10-05 2017-10-04 신규한 hpv16 hla-비제한적 t-세포 백신, 조성물 및 이의 사용 방법

Country Status (12)

Country Link
US (2) US11401306B2 (ko)
EP (1) EP3522908A4 (ko)
JP (3) JP7165652B2 (ko)
KR (1) KR20190073416A (ko)
CN (1) CN110035765B (ko)
AU (2) AU2017340407A1 (ko)
BR (1) BR112019006831A2 (ko)
CA (1) CA3039211A1 (ko)
IL (1) IL265833A (ko)
MX (1) MX2019003961A (ko)
SG (1) SG11201902988UA (ko)
WO (1) WO2018067689A1 (ko)

Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8877206B2 (en) 2007-03-22 2014-11-04 Pds Biotechnology Corporation Stimulation of an immune response by cationic lipids
CN102137675A (zh) 2008-04-17 2011-07-27 Pds生物科技公司 通过阳离子脂质的对映体刺激免疫应答
US20150250872A1 (en) 2012-09-21 2015-09-10 Frank Bedu-Addo Vaccine compositions and methods of use
US11612652B2 (en) 2015-11-13 2023-03-28 Pds Biotechnology Corporation Lipids as synthetic vectors to enhance antigen processing and presentation ex-vivo in dendritic cell therapy
TW201924722A (zh) * 2017-12-05 2019-07-01 美商Ｐｄｓ生技公司 用於刺激第i型干擾素基因之方法及包含陽離子脂質的組合物
CA3124905A1 (en) * 2019-01-03 2020-07-09 Jens KRINGELUM Vaccines targeting neoepitopes
CN112110995A (zh) * 2019-06-19 2020-12-22 上海交通大学医学院 肿瘤新抗原多肽及其用途
WO2024086169A2 (en) * 2022-10-17 2024-04-25 Pds Biotechnology Corporation Novel non-hla restricted t cell vaccine for tcr gamma alternate reading frame protein (tarp) protein expressing cancers
WO2024086290A2 (en) * 2022-10-19 2024-04-25 Pds Biotechnology Corporation Novel t cell activating immunotherapeutic for treatment of mucin 1 protein expressing human cancers

Family Cites Families (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9266930B1 (en) * 1993-03-05 2016-02-23 Epimmune Inc. Inducing cellular immune responses to Plasmodium falciparum using peptide and nucleic acid compositions
EP2100620A1 (en) 1999-09-16 2009-09-16 Eisai Corporation of North America Nucleic acids encoding polyepitope polypeptides
FR2824326B1 (fr) * 2001-05-04 2004-03-19 Commissariat Energie Atomique Melange de peptides issus des proteines e6 et/ou e7 de papillomavirus et leurs applications
DE60238864D1 (de) 2001-11-07 2011-02-17 Mankind Corp Für epitope von antigenen kodierende expressionsvektoren und verfahren zu deren konzeption
GB0716992D0 (en) 2007-08-31 2007-10-10 Immune Targeting Systems Its L Influenza antigen delivery vectors and constructs
GB0417430D0 (en) * 2004-08-05 2004-09-08 Uc3 A novel HPV vaccine comprising peptides from host cell proteins
BRPI0710238A2 (pt) 2006-04-21 2011-08-09 Transgene Sa uso de uma composição
JP6035503B2 (ja) * 2007-05-31 2016-11-30 アカデミシュ ジーケンハウス ライデン ハー．オー．デー．エン． ルムク ワクチンで使用するための、子宮頸部悪性腫瘍に浸潤するｔ細胞によって標的とされるｈｐｖエピトープ
DK2429585T3 (en) * 2009-05-15 2018-07-30 Irx Therapeutics Inc VACCINE IMMUNOTHERAPY
PL2755680T3 (pl) * 2011-09-12 2019-03-29 Pds Biotechnology Corporation Preparaty szczepionkowe w postaci cząstek
EP2639299A1 (en) * 2012-03-16 2013-09-18 Invectys Universal cancer peptides derived from telomerase
EP3632464A1 (en) * 2012-06-15 2020-04-08 PDS Biotechnology Corporation Cationic lipid vaccine compositions and methods of use
US20150250872A1 (en) * 2012-09-21 2015-09-10 Frank Bedu-Addo Vaccine compositions and methods of use
JP6788500B2 (ja) * 2013-10-23 2020-11-25 アメリカ合衆国 Ｍｕｃ１−ｃ癌タンパク質のｈｌａ−ａ２４アゴニストエピトープ及び組成物及び使用方法
CA2979493A1 (en) * 2015-03-16 2016-09-22 Max-Delbruck-Centrum Fur Molekulare Medizin In Der Helmholtz-Gemeinschaft Method of detecting new immunogenic t cell epitopes and isolating new antigen-specific t cell receptors by means of an mhc cell library

Also Published As

Publication number Publication date
JP7397945B2 (ja) 2023-12-13
US20180094032A1 (en) 2018-04-05
AU2017340407A1 (en) 2019-05-02
US20220332768A1 (en) 2022-10-20
US11401306B2 (en) 2022-08-02
AU2021200200B2 (en) 2024-07-11
JP2022191472A (ja) 2022-12-27
JP2019533658A (ja) 2019-11-21
IL265833A (en) 2019-06-30
AU2021200200A1 (en) 2021-03-18
BR112019006831A2 (pt) 2019-07-30
CN110035765A (zh) 2019-07-19
EP3522908A1 (en) 2019-08-14
MX2019003961A (es) 2019-08-26
CA3039211A1 (en) 2018-04-12
CN110035765B (zh) 2024-04-02
SG11201902988UA (en) 2019-05-30
EP3522908A4 (en) 2020-06-24
JP2024023507A (ja) 2024-02-21
JP7165652B2 (ja) 2022-11-04
WO2018067689A1 (en) 2018-04-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7397945B2 (ja) 新規ｈｐｖ１６非ｈｌａ拘束性ｔ細胞ワクチン、その組成物及び使用方法
JP7190528B2 (ja) 神経膠芽腫を治療するための細胞透過性ペプチド、カーゴ、及びｔｌｒペプチドアゴニストを含む新規複合体
Liu et al. Cancer vaccines as promising immuno-therapeutics: platforms and current progress
JP7060324B2 (ja) ネオ抗原ワクチンによる併用療法
Zwaveling et al. Established human papillomavirus type 16-expressing tumors are effectively eradicated following vaccination with long peptides
US9957301B2 (en) Therapy of cancer based on targeting adaptive, innate and/or regulatory component of the immune response
KR20220163523A (ko) 신생항원 및 이것의 사용 방법
EP2155780B1 (en) P53 peptide vaccine
Yang et al. Prevention and treatment of cervical cancer by a single administration of human papillomavirus peptide vaccine with CpG oligodeoxynucleotides as an adjuvant in vivo
TW201718000A (zh) 用於贅瘤疫苗之調配物及其製備方法
Seo et al. Optimal induction of HPV DNA vaccine-induced CD8+ T cell responses and therapeutic antitumor effect by antigen engineering and electroporation
JP2022046617A (ja) 異種ポリペプチドを含むＣｙａＡベースのキメラタンパク質及び免疫応答の誘導におけるその使用
Reinis et al. Induction of protective immunity against MHC class I-deficient, HPV16-associated tumours with peptide and dendritic cell-based vaccines
WO2017177907A1 (zh) 抗免疫检查点pd-l1和pd-l2肿瘤疫苗
EP4228681A1 (en) Combination of a sting agonist and a complex comprising a cell penetrating peptide, a cargo and a tlr peptide agonist
Qian et al. Prophylactic, therapeutic and anti-metastatic effects of an HPV-16 mE6Δ/mE7/TBhsp70Δ fusion protein vaccine in an animal model
EP2852612A1 (en) Novel melanoma antigen peptide and uses thereof
JP2012523847A (ja) Ｎｇｅｐ抗原の免疫原性エピトープ
WO2024131833A1 (en) Mrna-based hpv+ cancer vaccines, and uses thereof
CN116723853A (zh) Sting激动剂和包含细胞穿膜肽、货物和tlr肽激动剂的复合物的组合
Herrmann Immunotherapy of Prostate Carcinoma with biodegradable PLGA Microspheres

Legal Events

Date Code Title Description
AMND Amendment
E902 Notification of reason for refusal
AMND Amendment
E601 Decision to refuse application
AMND Amendment
E902 Notification of reason for refusal
AMND Amendment
X601 Decision of rejection after re-examination