BRPI0710238A2 - uso de uma composição - Google Patents

Abstract

<B>USO DE UMA COMPOSIçãO.<D> A presente invenção diz respeito ao uso de uma composição que compreende um ou mais polipeptídeos precoces de papilomavírus humano (HPV)- 16 ou um ácido nucleico que codifica um ou mais polipeptídeos precoces de HPV- 16 para a fabricação de um medicamento para a prevenção ou tratamento de uma infecção ou uma condição patológica causada por pelo menos um outro papilomavírus que não HPV-16. A invenção é de interesse muito especial na imunoterapia, em particular na prevenção ou tratamento de infecções persistentes de I-IIPV que levam possivelmente a neoplasia intraepitelial cervical (CIN) e ultimamente ao câncer cervical.

Description

"USO DE UMA COMPOSIÇÃO"

A presente invenção diz respeito ao uso de uma composiçãoque compreende um ou mais polipeptídeos precoces de papilomavírushumano (HPV)-16 ou um ácido nucleico que codifica um ou maispolipeptídeos precoces de HPV-16 para a fabricação de um medicamento paraa prevenção ou tratamento de uma infecção ou uma condição patológicacausada por pelo menos um outro papilomavírus que não HPV-16. Ainvenção é de interesse muito especial na imunoterapia, em particular naprevenção ou tratamento de infecções persistentes de HPV que levampossivelmente a neoplasia intraepitelial cervical (CIN) e ultimamente aocâncer cervical.

Os papilomavírus são vírus de DNA pequeno que foramidentificados em diversos organismos superiores incluindo seres humanos(ver, por exemplo, Pfister, 1987, in The papovaviridae: The Papillomavirus,Salzman and Howley edition, Plenum Press, New York, ρ 1-38). Estes estãoassociados com condições patológicas que variam de tumores benignos amalignos. Em tumores benignos, o genoma viral é epissomal enquanto emtumores malignos, o DNA DE HPV está integrado nos cromossomos dohospedeiro (Stoler, 2000, Int. J. Gynecol. Path. 19, 16-28).

Os papilomavírus possuem um DNA circular de filamentoduplo de cerca de 7900 pares de base que é circundado por um capsídeo deproteína. O genoma compreende uma região (E) precoce contendo asestruturas de leitura E1-E7 e uma região (L) posterior. A região posteriorcodifica as proteínas Ll e L2 estruturais que formam o capsídeo viral vistoque os genes precoces codificam proteínas reguladoras que são observadaspredominantemente no núcleo. O El codifica duas proteínas importantes namanutenção e replicação do genoma viral. O E2 codifica as proteínasativadoras e repressoras que regulam o promotor viral que direciona atranscrição de E6 e E7 (Bechtold et ai, 2003, J. Virol. 77, 2021-2028). Aproteína codificada por E4 que liga e rompe a rede de queratina citoplásmicae pode desempenhar um papel na maturação viral. O papel para a proteína E5ainda é controverso e sua expressão é freqüentemente perdida durante aintegração viral nos cromossomos do hospedeiro. Produtos genéticoscodificados por E6 e E7 de genótipos de HPV associados com câncer estãoenvolvidos na transformação oncogênica de células infectadas (Kanda et al.,1988, J. Virol. 62, 610-613; Vousden et al., 1988, Oncogene Res. 3, 1-9;Bedell et al., 1987, J. Virol. 61, 3635-3640), que ocorre de maneirapresumível devido à capacidade destas proteínas virais ligarem-se aosprodutos genéticos supressores de tumor celular p53 e retinoblastoma (Rb),respectivamente. Os resíduos de aminoácidos envolvidos na ligação dopolipeptídeo HPV-16 E6 natural ao p53 foi claramente definido a partir dosresíduos 118 a 122 (+1 sendo o primeiro resíduo Met ou a partir dos resíduos111 a 115 a partir do resíduo met preferivelmente usado em segundo lugar)(Crook et al., 1991, Cell 67, 547-556) e aqueles envolvidos na ligação dopolipeptídeo E7 do HPV-16 ao Rb estão localizados a partir dos resíduos 21a26 (Munger et al., 1989, EMBO J. 8, 4099-4105; Heck et al., 1992, Proc.Natl. Acad. Sei. USA 89, 4442-4446).

Correntemente, mais de 100 genótipos de papilomavírushumano (HPV) foram clonados e sequenciados (Stoler, 2000, Int. J. Gynecol.Path 19, 16-28). Apenas 40 genótipos de HPV infectam a mucosa genital comcerca de 15 dos quais colocam a mulher em risco de tumores malignos dotrato genital. Mais especificamente, os dois genótipos mais prevalescentes,HPV-16 e HPV-18, são detectados em mais do que 70 % do carcinomacervical invasivo visto que o HPV-31, HPV-33 e HPV-45 juntos, respondempor 10 % dos casos (Cohen et al., 2005, Science 308, 618-621).

Embora programas de avaliação cervical existam, quase meiomilhão de mulheres no mundo todo são diagnosticas com cânceres cervicaiscada ano e mais do que 270.000 morrem de acordo com os dados daInternational Agency for Research on câncer. Os métodos convencionaispermanecem cirurgia e radioterapia, mas novas estratégias de vacina foramprojetadas nos últimos 15 anos, por exemplo, vacinas com base em peptídeo(Feltkamp et al., 1993, Eur. J. Immunol. 23, 2242-2249), vacinas de partículassemelhantes a vírus (VLP), vacinas de DNA (Osen et al, 2001, Vaccine 19,4276-4286; Smahel et al., 2001, Virology 281, 231-238) e vacinas de vetorviral (EP 462,187, Daemen et al., 2000, Gene Ther. 7: 1859-1866; He et al.,2000, Virology 270, 146-161; Borysiewicz et al., 1996, Lancet 347, 1523-1527).

Conceitualmente, existem dois métodos para Vacinas contraHPV, profilático e terapêutico. O método profilático busca evitar a infecçãoviral, isto é, bloquear o vírus antes deste penetrar nas células hospedeirasprincipalmente através da indução de anticorpos neutralizadores. Usualmente,as vacinas profiláticas alvejam as proteínas capsídicas expressadas nasuperfície viral. A maioria destes contam com os VLPs produzidosrecombinantemente de proteínas de LPl ou mistura de VLPs dos maioria dostipos de HPV prevalescentes. ensaios clínicos de fase III bem sucedidos foramrecentemente relatados por Merck e GlaxoSmithKline (GSK) com eficácia de100 % na prevenção de infecções cervicais do tipo específico. A proteçãocruzada contra genótipos de HPV-31 e HPV-45 oncogênicos foi descritaseguindo a administração de uma mistura de VLPs de HPV-16 e HPV-18(WO 2004/056389). Entretanto, as vacinas preventivas com base em VLP nãosão esperadas induzir a regressão de condições patológicas que desenvolvema seguinte infecção por HPV.

O método terapêutico procura tratar infecções por HPVestabelecidas e induzem a regressão de condições patológicas pré-cancerosase cancerosas associadas com o HPV principalmente através da indução deuma resposta imune celular. Usualmente, a estratégia terapêutica conta com aimunização direcionada a oncoproteínas E6 e/ou E7 que são expressadas pelascélulas tumorais induzidas por HPV. Até agora, a imunidade fornecida pelosantígenos de HPV E6 e E7 é considerada específica do genótipo e as vacinasterapêuticas correntes no desenvolvimento clínico ou pré-clínico focamprincipalmente no HPV-16 oncogênico mais prevalescente e a uma extensãomenor HPV-18.

Entretanto, uma vacina terapêutica ideal deve permitir fornecerproteção não apenas contra os genótipos de HPV mais prevalescentes mastambém contra os outros genótipos menores de HPV envolvido nos 30 %remanescentes de cânceres cervicais. Isto pode ser atingido através dodesenvolvimento de candidatos a vacina alternativos direcionados a cada umdos genótipos oncogênicos de HPV. Entretanto, esta estratégia,provavelmente, não deve ser muito atrativa em consideração do custo dedesenvolvimentos clínicos e pré-clínicos requeridos por autoridadesreguladoras versus o número limitado de pacientes expostos aos genótiposmenores de HPV.

Pode-se esperar que o HPV continuará a ser uma séria ameaçaà saúde global por muito anos devido à natureza persistente e crônica dainfecção, seu predomínio alto e a morbidez significante de cânceres induzidospor HPV. Portanto, existe uma necessidade de desenvolver uma vacina queofereça uma cobertura mais ampla que seja capaz de proteger e/ou tratarcontra genótipos múltiplos de HPV incluindo, além disso, o genótipo deHPV-16 mais prevalescente, outros genótipos menores e potencialmenteoncogênicos de HPV.

Desta maneira, a presente invenção representa um avançosignificante melhorar a prevenção e o tratamento de infecções porpapilomavírus ou lesões malignas ou pré-malignas associadas com opapilomavírus em países industrializados, bem como em países emdesenvolvimento.

Este problema técnico é resolvido pelo fornecimento dasformas de realização como definido nas reivindicações.

Outros aspectos e aspectos adicionais, características evantagens da presente invenção estarão evidentes a partir do seguinte relatóriodescritivo das formas de realização presentemente preferidas da invenção.Estas formas de realização são dadas para o propósito de divulgação.

Conseqüentemente, em um primeiro aspecto, a presenteinvenção fornece o uso de uma composição que compreende um ou maispolipeptídeos precoces de HPV-16 ou um ácido nucleico que codifica um oumais polipeptídeos precoces de HPV-16 para a fabricação de ummedicamento para a prevenção ou tratamento de uma infecção ou umacondição patológica causada por pelo menos um outro papilomavírus que não HPV-16.

Mais particularmente, a presente invenção diz respeito ao usode uma composição que compreende um ou mais polipeptídeos precoces deHPV-16 ou um ácido nucleico que codifica um ou mais polipeptídeosprecoces de HPV-16 para a fabricação de um medicamento para tratar umainfecção ou uma condição patológica causada por pelo menos um outropapilomavírus humano que não HPV-16. A presente invenção também dizrespeito a um método de tratar uma infecção ou uma condição patológicacausada por pelo menos um outro papilomavírus humano que não HPV-16, ométodo compreendendo administrar a um organismo hospedeiro, umacomposição que compreende um ou mais polipeptídeos precoces de HPV-16ou um ácido nucleico que codifica um ou mais polipeptídeos precoces deHPV-16.

Como usado aqui por todo o pedido, os termos "um" e "uma"são usados no sentido de que este significa "pelo menos um", "pelo menos umprimeiro", "um ou mais" ou "uma pluralidade" dos compostos ou etapasreferidos, a não ser que o contexto dite de outra maneira. Por exemplo, otermo "uma célula" inclui uma pluralidade de células incluindo uma misturadestes. Mais especificamente, "pelo menos um" e "um ou mais" significa umnúmero que é um ou maior do que um, com uma preferência especial por um,dois ou três.

O termo "e/ou" usado em qualquer parte deste inclui osignificado de "e", "ou" e "todas ou quaisquer outras combinações doselementos conectados pelo dito termo".

O termo "cerca de" ou "aproximadamente" como usado nestesignifica dentro de 20 %, preferivelmente dentro de 10 % e maispreferivelmente dentro de 5 % de um dado valor ou faixa.

O termo "aminoácidos" e "resíduos" são sinônimos. Estestermos referem-se a aminoácidos naturais, não naturais e/ou sintéticos,incluindo isômeros óticos D ou L, aminoácidos modificados e análogos deaminoácido.

Os termos "polipeptídeo", "peptídeo" e "proteína" são usadosneste de maneira intercambiável para referir-se a polímeros de resíduos deaminoácido que compreendem nove ou mais aminoácidos ligados porintermédio de ligações de peptídeo. O polímero pode ser linear, ramificado oucíclico e pode compreender análogos de ocorrência natural e/ou deaminoácidos e estes podem ser interrompidos por não-aminoácidos. Comouma indicação geral, se o polímero de aminoácido for longo (por exemplo,mais do que 50 resíduos de aminoácido), este é preferivelmente referido comoum polipeptídeo ou uma proteína.

Dentro do contexto da presente invenção, os termos "ácidonucleico", "molécula de ácido nucleico", "polinucleotídeo" e "seqüência denucleotídeo" são usados de maneira intercambiável e definem um polímero dequalquer comprimento de polidesoxiribonucleotídeos (DNA) (por exemplo,cDNA, DNA genômico, plasmídeos, vetores, genomas virais, DNA isolado,sondas, iniciadores e quaisquer misturas destes) ou moléculas depolirribonucleotídeos (RNA) (por exemplo, mRNA, RNA anti-sentido) oupolirribo-polidesoxiribinucleotídeos mistos. Estes abrangem polinucleotídeosde filamento simples ou duplo, linear ou circular, natural ou sintético. Alémdisso, um polinucleotídeo pode compreender nucleotídeos que não ocorremnaturalmente, tais como nucleotídeos metilados e análogos de nucleotídeo(ver US 5.525.711, US 4.711.955 ou EPA 302 175 como exemplos demodificações) e podem ser interrompidos por componentes não-nucleotídeos.Se presente, modificações ao nucleotídeo podem ser comunicadas antes ou após a polimerização.

Como usado neste, o termo "que compreende" quando usadopara definir produtos, composições e métodos, é pretendido significar que osprodutos, composições e métodos incluem os compostos ou etapas referidos,mas não excluindo outros. "Consistindo essencialmente de" deve significarexcluindo outros compostos ou etapas se houver qualquer significânciaessencial. Desta maneira, a composição que consiste essencialmente doscompostos citados não deve excluir contaminantes traço e carregadoresfarmaceuticamente aceitáveis. "Consistindo de" deve significar excluindomais do que elementos traço de outros compostos ou etapas. Por exemplo, umpolipeptídeo "consiste de" uma seqüência de aminoácido quando opolipeptídeo não contém quaisquer aminoácidos mas a seqüência deaminoácido citada. Um polipeptídeo "consiste essencialmente de" umaseqüência de aminoácido quando uma tal seqüência de aminoácido estápresente junto com apenas alguns resíduos de aminoácido adicionais,tipicamente de cerca de 1 a cerca de 50 ou ainda resíduos adicionais. Umpolipeptídeo "compreende" uma seqüência de aminoácido quando a seqüênciade aminoácido é pelo menos parte da seqüência de aminoácido final dopolipeptídeo. Um tal polipeptídeo pode ter de alguns a diversas centenas deresíduos de aminoácidos adicionais. Tais resíduos de aminoácido adicionaispodem desempenhar um papel em tráfego de polipeptídeo, facilitar aprodução ou purificação de polipeptídeo; prolongar a vida média, entre outrascoisas. O mesmo pode ser aplicado às seqüências de nucleotídeo.

Como usado neste, o termo "isolado" refere-se a uma proteína,polipeptídeo, peptídeo ou um ácido nucleico que é purificado ou removido deseu ambiente natural. O termo "purificado" refere-se a uma proteína,polipeptídeo, peptídeo ou um ácido nucleico que é separado de pelo menosum outro componente com o qual este está naturalmente associado.

O termo "célula hospedeira" deve ser entendido amplamentesem qualquer limitação com respeito à organização particular em tecido,órgão ou células isoladas. Tais células podem ser de um tipo único de célulasou um grupo de tipos diferentes de células e abrange linhas celularescultivadas, células primárias e células proliferativas. O termo "organismohospedeiro" refere-se a um vertebrado, particularmente um membro dasespécies de mamíferos e, especialmente, animais domésticos, animaisesportivos e primatas incluindo seres humanos.

"HPV" significa "papilomavírus humano". Sua classificação éfundamentada no grau de relação de seus genomas. Mais do que 100genótipos de HPV foram identificados no presente período e estes foramnumerados seguindo a ordem cronológica de seu isolamento. Por convenção,dois isolados constituem tipos distintos se estes dividirem menos do que 90 %de identidade em torno de cerca da porção longa de 2000 nucleotídeos de seugenoma contendo as estruturas de leitura aberta E6, E7 e LI. Uma árvorefilogenética foi construída a partir do alinhamento da seqüência denucleotídeo disponível (Van Ranst et al., 1992, J. Gen. Virol. 73, 2653; DeVilliers et al., 2004, Virology 324, 17-27).

Como usado neste o termo "polipeptídeo precoce" refere-se auma proteína não estrutural reconhecida na técnica, selecionado dentre ogrupo consistindo de polipeptídeos El, E2, E4, E5, E6 e E7 com umapreferência especial por E6 e E7. No contexto da invenção, os um ou maispolipeptídeos precoces incluídos na composição ou codificados pelo ácidonucleico incluído na composição usada de acordo com a invenção origina-sede HPV-16. O termo "origina-se" significa ser isolado, clonado, derivado ourelacionado. Desta maneira, de acordo com a presente invenção, o um ou maispolipeptídeos de HPV-16 precoces podem originar-se de um polipeptídeo deHPV-16 precoce natural ou um derivado destes. Um "polipeptídeo de HPV-16 precoce natural" refere-se a uma proteína, polipeptídeo ou peptídeo quepode ser encontrada ou isolada de uma fonte na natureza, como diferente deser artificialmente modificada ou alterada pelo homem no laboratório. Taisfontes na natureza incluem amostras biológicas (por exemplo, sangue, plasma,soros, fluidos vaginais e cervicais, seções de tecido, biópsias, amostrascitológicas de pacientes infectados com HPV-16), células cultivadas, bemcomo materiais recombinantes (por exemplo, HPV-16 vírus ou genoma,bibliotecas genômicas ou de cDNA, plasmídeos contendo fragmentos degenoma de HPV-16, polipeptídeo de HPV-16 precoce recombinante e outros).Desta maneira o termo "polipeptídeo de HPV-16 precoce natural" deve incluirpolipeptídeos HPV-16 precoces de ocorrência natural e fragmentos destes.Um fragmento é preferivelmente de pelo menos 9 resíduos de aminoácido ecompreende pelo menos um epítopo imunogênico. O nucleotídeo e asseqüências de aminoácido de Genes precoces de HPV-16 / polipeptídeosforam descritos na literatura e estão disponíveis em bancos de dadosespecializados, por exemplo, em Genbank sob número de acessão NC_01526e K02718, respectivamente. Entretanto, polipeptídeos de HPV-16 precocesnaturais não são limitados a estas seqüência exemplares. De fato, asseqüências de aminoácido podem variar entre isolados de HPV-16 diferentese seu escopo natural de variação genética está incluído dentro do escopo dainvenção. Os Fragmentos adequados para o uso na presente invenção incluemos peptídeos ilustrados na seção de exemplo, especialmente o peptídeo deR9F da SEQ ID NO: 5, o peptídeo E9L de SEQ ID NO: 9, o peptídeo dePolipeptídeo E6 de HPV-16 correspondente ao S9S (SEQ ID NO: 8) e opeptídeo de polipeptídeo E7 de HPV-16 correspondente ao T9L (SEQ ID NO:10). Tais peptídeos podem ser usados independentemente ou em combinação(por exemplo, em fusão).

Um derivado de um polipeptídeo de HPV-16 precoce incluiuma ou mais modificações com respeito ao polipeptídeo de HPV-16 naturalprecoce, tal como aqueles definidos abaixo. As modificações podem sergeradas por meio de mutação e/ou adição de porções químicas (por exemplo,alquilação, acetilação, amidação, fosforilação e outros) ou porções derotulação. A mutação inclui anulação, substituição ou adição de um ou maisresíduos de aminoácido ou quaisquer combinações destas possibilidades.

Quando diversas modificações são consideradas, estes podem dizer respeito aresíduos consecutivos e/ou resíduos não consecutivos. As modificaçõespodem ser feitas em diversas maneiras conhecidas por aqueles habilitados natécnica, tais como mutagênese direcionada ao local (por exemplo, usando-se osistema de mutagênese in vitro Sculptor da Amersham, Les Ullis, France),Mutagênese de PCR e mistura de DNA.

Vantajosamente, um polipeptídeo modificado de HPV-16precoce retém um alto grau de identidade de seqüência de aminoácido com opolipeptídeo de HPV-16 precoce natural correspondente na seqüência deaminoácido de comprimento total ou um fragmento mais curto deste (porexemplo, de pelo menos 9, 20, 30, 40, 50, 100 aminoácidos de comprimento),que é maior do que 75 %, vantajosamente maior do que 80 %, desejavelmentemaior do que 85 %, preferivelmente maior do que 90 %, mais preferivelmentemaior do que 95 %, ainda mais preferivelmente maior do que 97 % (porexemplo, 100 % de identidade de seqüência). A identidade percentual entredois polipeptídeos é uma função do número de posições idênticas divididaspelas seqüências, levando em conta o número de fendas que necessitam serintroduzidas para o alinhamento ótimo e o comprimento de cada fenda. Váriosprogramas de computador e algoritmos matemáticos estão disponíveis natécnica para determinar as identidades de percentagem entre as seqüências deaminoácido, tais como, por exemplo o software W2H HUSAR e o programaBlast (por exemplo, Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25, 3389-3402;Altschul et al., 2005, FEBS J. 272, 5101-5109) disponível em NCBI.

Desejavelmente, o polipeptídeo modificado de HPV-16precoce no uso de acordo com a invenção retêm atividade imunogênica dopolipeptídeo de HPV-16 precoce natural tal como a capacidade de estimularuma resposta imune mediada por célula.

Em uma forma de realização, a composição é usada para tratarinfecção por HPV e/ou condições patológicas, especialmente no tratoanogenital, a pele ou a cavidade oral, causado por pelo menos um outrogenótipo de HPV que não HPV-16. Em um aspecto, o genoma do pelo menosum papilomavírus humano divide menos do que 90 %, vantajosamente menosdo que 87 % e, desejavelmente menos do que 85 % de identidade deseqüência de nucleotídeo com a porção do genoma de HPV-16 que codificaos polipeptídeos E6 ou E7 mas mais do que 50 %, vantajosamente mais doque 55 % e, desej avelmente mais do que 60 % de identidade de seqüência denucleotídeo com a porção do genoma de HPV-16 que codifica ospolipeptídeos E6 ou E7. A identidade percentual entre as porções dosgenomas de HPV é uma função do número de posições idênticas divido pelasduas seqüências, levando em conta o número de fendas que necessitam serintroduzidas para o alinhamento ótimo e o comprimento de cada fenda. Váriosprogramas de computador e algoritmos matemáticos estão disponíveis natécnica para determinar as identidades de percentagem entre seqüências denucleotídeo. Os exemplos representativos de tais genótipos de HPV incluem,sem limitação HPV-2, HPV-6, HPV-11, HPV-13, HPV-18, HPV-30,HPV-31, HPV-32, HPV-33, HPV-35, HPV-39, HPV-40, HPV-42, HPV-44,HPV-45, HPV-51, HPV-52, HPV-56, HPV-58, HPV-59, HPV-61, HPV-64 eHPV-6 8.Preferivelmente, o pelo menos um outro papilomavírushumano que não HPV-16 é selecionado dentre o grupo que consiste de HPV-31, HPV-33, HPV-35, HPV-39, HPV-51, HPV-52, HPV-56, HPV-58, HPV-59 e HPV-68V1 e, especialmente é qualquer um de HPV-31, HPV-33, HPV-35, HPV-52 e HPV-58 ou qualquer combinação possível. Os exemplosrepresentativos de tais combinações incluem HPV-31 e pelo menos um deHPV-33, HPV-35, HPV-52 e HPV-58; HPV-33 e pelo menos um de HPV-31,HPV-35, HPV-52 e HPV-58; HPV-35 e pelo menos um de HPV-31, HPV-33,HPV-52 e HPV-58; HPV-52 e pelo menos um de HPV-31, HPV-33, HPV-35e HPV-58; HPV-58 e pelo menos um de HPV-31, HPV-33, HPV-35 e HPV-52. O nucleotídeo e as seqüências de aminoácido destes genótipos de HPVforam descritos na literatura e estão disponíveis em bancos de dadosespecializados, como ilustrado na Tabela I.

Tabela I: Números de acessão Genbank

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Em uma outra forma de realização, a composição usada deacordo com a invenção compreende ou codifica um polipeptídeo E6 de HPV-16, um polipeptídeo E7 de HPV-16 ou tanto um polipeptídeo E6 de HPV-16 eum polipeptídeo E7 de HPV-16. Dadas as observações redenominadas acimana energia de transformação do polipeptídeos E6 e E7 de HPV-16,polipeptídeos E6 e E7 de HPV-16 modificados são preferivelmente usadossendo variantes não oncogênicas mutadas na região envolvida na interaçãocom os produtos genéticos supressores de tumor celular p53 e Rbrespectivamente. A presente invenção abrange o uso de qualquer PolipeptídeoE6 de HPV-16 que liga-se ao p53 é alterado ou pelo menos significantementereduzido e/ou o uso de qualquer polipeptídeo E 7 de HPV-16 que liga-se aoRb é alterado ou pelo menos significantemente reduzido (Munger et al., 1989,EMBO J. 8, 4099-4105; Crook et al., 1991, Cell 67, 547-556; Heck et al.,1992, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89, 4442-4446; Phelps et al., 1992, J. Virol.66, 2148-2427). Uma variante de E6 de HPV-16 não oncogênica que é que áadequada para o propósito da presente invenção é anulada de um ou maisresíduos de aminoácido localizados aproximadamente da posição 118aproximadamente da posição 122 (começando do primeiro resíduo demetionina do polipeptídeo HPV-16 E6 natural ou aproximadamente daposição 111 aproximadamente da posição 115 começando do segundo resíduode metionina), com uma preferência especial pela anulação completa dosresíduos 118 a 122 (CPEEK). Variante oncogênica mais preferida dopolipeptídeo E6 de HPV-16 compreende ou, alternativamente, consisteessencialmente de, ou, alternativamente, consiste de uma seqüência deaminoácido que é homóloga ou idêntica à seqüência de aminoácido mostradana SEQ ID NO: 1. Uma variante de E7 de HPV-16 não oncogênica que éadequada para o propósito da presente invenção é anulada de um ou maisresíduos de aminoácido localizados aproximadamente da posição 21aproximadamente da posição 26 (+1 representando o primeiro aminoácido dopolipeptídeo E7 do HPV-16, com uma preferência especial pela anulaçãocompleta dos resíduos 21 a 26 (DLYCYE). A variante oncogênica maispreferida do polipeptídeo E7 de HPV-16 compreende ou, alternativamente,consiste essencialmente de, ou, alternativamente, consiste de uma seqüênciade aminoácido que é homóloga ou idêntica à seqüência de aminoácidomostrada na SEQ ID NO: 2.

Em um aspeto preferido, o um ou mais polipeptídeos de HPV-16 precoces em uso na invenção ainda são modificados a fim de melhorar aapresentação da classe MHC I e/ou classe MHC II e/ou para estimular aimunidade anti-HPV. Os polipeptídeos E6 e E7 de HPV-16 são proteínasnucleares e estas mostraram que a apresentação de membrana permitemelhorar sua eficácia terapêutica (ver, por exemplo, W099/03885). Destamaneira, pode ser desejável modificar pelo menos um dos polipeptídeos deHPV-16 precoces a fim de ser ancorado à membrana celular. A ancoragem demembrana pode ser facilmente atingida pela incorporação no polipeptídeo deHPV-16 precoce de uma seqüência de ancoragem de membrana e se opolipeptídeo natural precisa de uma seqüência secretora (isto é, um peptídeosinalizador). Os polipeptídeos E6 e/ou E7 de HPV-16 e (são) preferivelmentemodificados pela incorporação de uma seqüência de ancoragem de membranae uma seqüência secretora. A ancoragem de membrana e as seqüênciassecretoras são conhecidas na técnica. Resumidamente, seqüências secretorasestão presentes no terminal N da membrana apresentada ou polipeptídeossecretados e iniciam sua passagem no retículo endoplásmico (ER). Estesusualmente compreendem de 15 a 35 aminoácidos essencialmentehidrofóbicos que são então removidas por uma endopeptidase localizada emER específica para dar o polipeptídeo maduro. As seqüências de ancoragemde membrana são, usualmente, altamente hidrofóbicas em estado natural eserve para ancorar os polipeptídeos na membrana celular (ver, por exemplo,Branden and Tooze, 1991, em Introduction to Protein Structure p. 202-214,NY Garland).

A escolha da ancoragem de membrana e seqüências secretorasque podem ser usadas no contexto da presente invenção é vasta. Estes podemser obtidos a partir de qualquer polipeptídeo ancorado na membrana e/ousecretado que compreende (por exemplo, polipeptídeos celulares e/ou virais)tal como a glicoproteína da hidrofobia, da glicoproteína do envelope do vírusHTV ou da proteína F do vírus do sarampo ou pode ser sintético. A ancoragemde membrana e/ou seqüências secretoras inseridas em cada um dospolipeptídeos de HPV-16 precoces usada de acordo com a invenção pode teruma origem comum ou diferente. O local preferido de inserção da seqüênciasecretora é o terminal N a jusante do códon para o início da tradução e aqueleda seqüência de ancoragem de membrana é o terminal C, por exemplo,imediatamente a montante do códon de interrupção. Além disso, um peptídeoligador pode ser usado para conectar a seqüência secretora ao polipeptídeo deHPV-16 precoce em uso na invenção ou para conectar o polipeptídeo deHPV-16 precoce à seqüência de ancoragem de membrana. Os peptídeosligadores são conhecidos na técnica. Tipicamente, estes contém de 2 a 20aminoácidos, estão incluídos alanina, glicina, prolina e/ou serina.

O polipeptídeo E6 de HPV-16 em uso na presente invenção épreferivelmente modificado pela inserção dos sinais secretores e deancoragem de membrana da proteína F do sarampo, com uma preferênciaespecial por um polipeptídeo que compreende ou, alternativamente,consistindo essencialmente de, ou, alternativamente, consistindo de umaseqüência de aminoácido que é homóloga ou idêntica à seqüência deaminoácido mostrada na SEQ ID NO: 3. Opcionalmente ou em combinação, opolipeptídeo E7 de HPV-16 em uso na presente invenção é preferivelmentemodificado pela inserção dos sinais secretores e de ancoragem de membranada glicoproteína da raiva, com uma preferência especial por um polipeptídeoque compreende ou, alternativamente, consistindo essencialmente de, ou,alternativamente, consistindo de uma seqüência de aminoácido que éhomóloga ou idêntica à seqüência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 4.

Em um outro e mais preferido aspecto, a eficácia terapêuticada composição em uso na invenção pode ser melhorada pelo uso de um oumais polipeptídeos imunopotenciadores ou um ou mais ácidos nucleicos quecodificam tais polipeptídeos imunopotenciadores. Por exemplo, pode servantajoso ligar os polipeptídeos de HPV-16 precoces a um polipeptídeo, talcomo calreticulina (Cheng et ai., 2001, J. Clin. Invest. 108, 669-678), proteínade choque por calor de Mycobacterium tuberculosis 70 (HSP70) (Chen et al.,2000, Câncer Res. 60, 1035-1042), ubiquitina (Rodriguez et al., 1997, J.Virol. 71, 8497-8503) ou uma toxina bacteriana, tal como o domínio detranslocação de exotoxina A de Pseudomonas aeruginosa (ETA(dlII)) (Hunget al., 2001 Câncer Res. 61, 3698-3703). Alternativamente, a composição emuso na presente invenção ainda pode compreender uma citocina ou um ácidonucleico que codifica uma citocina. As citocinas adequadas incluem, semlimitação interleucina (IL)-2, IL-7, IL-15, IL-18, IL-21 e IFNg, com umapreferência especial por IL-2.

De acordo com uma outra forma de realização ou preferida, acomposição no uso de acordo com a invenção compreende um ácido nucleicoque codifica um ou mais polipeptídeos de HPV-16 precoces como definidoacima. É preferido um ácido nucleico que codifica pelo menos:

o um polipeptídeo E6 de HPV-16 que compreende ou,alternativamente, consistindo essencialmente de, ou, alternativamente,consistindo de uma seqüência de aminoácido que é homóloga ou idêntica àseqüência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 3 e

O um polipeptídeo E7 de HPV-16 que compreende ou,alternativamente, consistindo essencialmente de, ou, alternativamente,consistindo de uma seqüência de aminoácido que é homóloga ou idêntica àseqüência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4.

Se necessário, a molécula de ácido nucleico em uso nainvenção pode ser otimizada para fornecer expressão de alto nível dospolipeptídeos de HPV-16 precoces em uma célula hospedeira ou organismoparticular, por exemplo, uma célula hospedeira ou organismo humano.Tipicamente, a otimização de códon é realizada pela substituição um ou maiscódon "em estado natural" (por exemplo, HPV) correspondente a um códonusado de maneira não freqüente na célula hospedeira de mamífero por um oumais códons que codificam o mesmo aminoácido que é mais freqüentementeusado. Isto pode ser atingido pela mutagênese convencional ou pelas técnicassintéticas químicas (por exemplo, resultando em um ácido nucleico sintético).Não é necessário substituir todos os códons naturais correspondentes aoscódons usados de maneira não freqüente visto que a expressão aumentadapode ser atingida mesmo cm a substituição parcial. Além disso, algunsdesvios de aderência estritos ao uso de códon otimizado podem ser feitos paraacomodar a introdução de locais de restrição.

Preferivelmente, o ácido nucleico codificador de polipeptídeode HPV-16 precoce em uso na invenção está em uma forma adequada para asua expressão em uma célula hospedeira ou organismo, significando que aseqüência de ácido nucleico que codifica o polipeptídeo E6 e/ou a seqüênciade ácido nucleico que codifica o polipeptídeo E7 são colocados sob o controlede um ou mais elementos reguladores necessários para a expressão na célulahospedeira ou organismo. Como usado neste, o termo "elemento regulador"refere-se a qualquer seqüência que permite, contribui ou modula a expressãodo ácido nucleico em uma dada célula hospedeira, incluindo replicação,duplicação, transcrição, união, tradução, estabilidade e/ou transporte do ácidonucleico ou um de seus derivados (isto é, mRNA) na célula hospedeira, seráestimado por aquele habilitado na técnica que a escolha dos elementosreguladores pode depender de fatores, tais como a célula hospedeira, o vetor eo nível de expressão desejado.

O promotor é de importância especial e a presente invençãoabrange o uso de promotores constitutivos que direcionam a expressão doácido nucleico em muitos tipos de células hospedeiras e aqueles quedirecionam a expressão apenas em certas célula hospedeiras ou em respostaaos eventos específicos os fatores exógenos (por exemplo, por temperatura,aditivo de nutriente, hormônio ou outro ligando). Os promotores adequadossão amplamente descritos na literatura e pode-se citar mais especificamentepromotores virais, tais como RSV (Vírus do Sarcoma de Rous), SV40 (VírusSímio-40), CMY (Citomegalo Vírus) e promotores de MLP (promotor TardioPrincipal). Os promotores preferidos para o uso em um vetor poxviralincluem, sem limitação promotores de vaccinia 7.5K, H5R, TK, p28, pll eKl L, promotores quiméricos entre poxpromotores virais precoces e tardiosbem como promotores sintéticos, tais como aqueles descritos em Chakrabartiet al. (1997, Biotechniques 23, 1094-1097), Hammond et al. (1997, J.Virological Methods 66, 135-138) and Kumar and Boyle (1990, Virology179, 151-158).

Aqueles habilitados na técnica estimarão que os elementosreguladores controlam a expressão do ácido nucleico ainda compreendeelementos adicionais para a iniciação apropriada, regulação e/ou terminaçãoda transcrição (por exemplo, seqüências de terminação de transcrição polyA),transporte de mRNA (por exemplo, seqüências sinalizadoras de localizaçãonuclear), processamento (por exemplo, sinais de união), estabilidade (porexemplo, íntrons e seqüências 5' e 3' não codificadoras) e tradução (porexemplo, seqüências líderes tripartidas, locais de ligação de ribossoma,seqüências de Shine-Dalgamo, etc.) na célula hospedeira ou organismo.

De acordo com uma outra forma de realização preferida, oácido nucleico usado de acordo com a presente invenção é compreendido deum vetor. O termo "vetor" como usado neste refere-se a vetores virais bemcomo não virais (por exemplo, DNA de plasmídeo), incluindo vetoresextracromossômico (por exemplo, epissoma), multicópia e integradores (istoé, para ser incorporado nos cromossomos do hospedeiro). Particularmenteimportante no contexto da invenção são os vetores de terapia genética (isto é,que são capazes de liberar o ácido nucleico a um organismo hospedeiro) bemcomo vetores de expressão para o uso em vários sistemas de expressão. Osvetores não virais adequados incluem plasmídeos tais como pREP4, pCEP4(Invitrogene), pCI (Promega), pCDM8 (Seed, 1987, Nature 329, 840), pVAXe pgWiz (Gene Therapy System Inc; Himoudi et al., 2002, J. Virol. 76,12735-12746). Os vetores virais adequados podem ser derivados de umavariedade de vírus diferentes (por exemplo, retrovírus, adenovírus, AAV,poxvírus, vírus do herpes, vírus do sarampo, vírus espumoso e outros). Comousado neste, o termo "vetor viral" abrange o DNA do vetor bem comopartículas virais geradas destes. Os vetores virais podem ser competentes dereplicação ou podem ser geneticamente desabilitados a fim de seremdefeituosos na replicação ou enfraquecidos na replicação. O termo"competentes de replicação" Como usado neste abrange vetores viraisseletivos de replicação e condicionalmente replicadores que são projetadospara replicar melhor ou seletivamente em células hospedeiras específicas (porexemplo, células tumorais).

Em um aspecto, o vetor em uso na invenção é um vetoradenoviral (para uma revisão, ver "Adenoviral vectors for gene therapy",2002, Ed D. Curiel and J. Douglas, Academic Press). Isto pode ser derivado apartir de uma variedade de fontes humanas ou animais e qualquer sorotipopode ser utilizado a partir do serotipos de adenovírus 1 até 51.Particularmente preferidos são adenovírus humanos 2 (Ad2), 5 (Ad5), 6(Ad6), 11 (Adll), 24 (Ad24) e 35 (Ad35). Tais adenovírus estão disponíveisa partir da American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, Md.) eforam o objetivo de publicações numerosas que descrevem sua seqüência,organizações e métodos de produzir, deixando o técnico aplicá-lo (ver, porexemplo, US 6.133.028; US 6.110.735; WO 02/40665; WO 00/50573; EP1016711; Vogels et al., 2003, J. Virol. 77, 8263-8271).

O vetor adenoviral em uso na presente invenção pode sercompetente de replicação. Os exemplos numerosos de competentes de vetoresde replicação adenoviral estão facilmente disponíveis para aqueles habilitadosna técnica (Hernandez-Alcoceba et al., 2000, Human Gene Ther. 11, 2009-2024; Nemunaitis et al., 2001, Gene Ther. 8, 746-759; Alemany et al., 2000,Nature Biotechnology 18, 723-727). Por exemplo, estes podem ser projetadosa partir de um genoma de adenovírus do tipo selvagem pela anulação nodomínio ElA CR2 (por exemplo, W000/24408) e/ou pela substituiçãopromotores El e/ou E4 naturais com tecido, tumor ou promotores específicosdo estado celular (por exemplo, US5,998,205, W099/25860, US5.698.443,WOOO/46355, W000/15820 e W001/36650).

Alternativamente, o vetor adenoviral em uso na invenção édefeituoso na replicação (ver, por exemplo, W094/28152; Lusky et al., 1998,J. Virol 72, 2022-2032). Os defeituosos preferidos nos vetores de replicaçãoadenoviral são defeituosos de El (por exemplo, US 6.136.594 e US6.013.638), com uma anulação de El que se estende aproximadamente dasposições 459 a 3328 ou aproximadamente das posições 459 a 3510 (porreferência à seqüência do adenovírus humano tipo 5 divulgado no GeneBanksob o número de acessão M 73260 e em Chroboczek et al., 1992, Virol. 186,280-285). A capacidade de clonagem ainda pode ser melhorada pela anulaçãodas porções adicionais do genoma adenoviral (toda ou parte da região E3 nãoessencial ou de outras regiões E2, E4 essenciais). A inserção do ácidonucleico pode ser realizada através da recombinação homóloga em qualquerlocalização do genoma adenoviral como descrito em Chartier et al. (1996, J.Virol. 70, 4805-4810). Por exemplo, o ácido nucleico que codifica opolipeptídeo E6 de HPV-16 pode ser inserida na substituição da região Eleoácido nucleico que codifica o polipeptídeo E7 de HPV-16 na substituição daregião E3 ou vice versa.

Em um outro e preferido aspecto, o vetor em uso na invenção éum vetor poxviral (ver, por exemplo, Cox et al. em "Viruses in Human GeneTherapy" Ed J. M. Hos, Carolina Academic Press). Isto pode ser obtido apartir de qualquer membro do poxviridae, em particular vírus canarypox,fowlpox e vaccinia, o último sendo preferido. Os vírus de vaccinia adequadosincluem, sem limitação a cepa Copenhagen (Goebel et al., 1990, Virol. 179,247-266 e 517-563; Johnson et al., 1993, Virol. 196, 381-401), a cepa Wyethe a cepa Ankara altamente atenuada (MVA) (Mayr et al., 1975, Infection 3, 6-16). A determinação da seqüência completa o genoma MVA e a comparaçãocom o genoma de Copenhagen permitiu a identificação precisa de seteanulações (I a VII) que ocorreu no genoma MVA (Antoine et al., 1998,Virology 244, 365-396), qualquer um dos quais. pode ser usado para ainserção do ácido nucleico codificador do polipeptídeo de HPV-16 precoce.

A técnica básica para a inserção do ácido nucleico ereguladores de elemento associado requeridos para a expressão em umgenoma poxviral é descrito em numerosos descritos acessíveis à pessoahabilitada na técnica (Paul et al., 2002, Câncer gene Ther. 9, 470-477; Picciniet al., 1987, Methods of Enzymology 153, 545-563; US 4.769.330; US4.772.848; US 4.603.112; US 5.100.587 e US 5.179.993). Usualmente,procede-se através da recombinação homóloga entre as seqüências desobreposição (isto é, flanqueando o local de inserção desejado) presente tantono genoma viral quanto um plasmídeo que carrega o ácido nucleico parainserção.

O ácido nucleico é preferivelmente inserido em um local nãoessencial do genoma poxviral, a fim de que o poxvírus recombinantepermanece viável e infeccioso. As regiões não essenciais são regiõesintergênicas não codificadoras ou qualquer gene para os quais a inativação ouanulação não prejudica significantemente o desenvolvimento, replicação ouinfecção. Uma pessoa também pode considerar a inserção em um local viralessencial contanto que a função defeituosa seja fornecida in trans durante aprodução de partículas virais, por exemplo, usando-se uma linha celularauxiliar que carrega as seqüências complementares correspondente àquelesanulados no genoma poxviral.

Quando usa-se o vírus vaccinia de Copenhagen, o ácidonucleico codificador do polipeptídeo de HPV-16 precoce é preferivelmenteinserido no gene de timidina cinase (tk) (Hruby et al., 1983, Proc. Natl. Acad.Sci USA 80, 3411-3415; Weir et al., 1983, J. Virol. 46, 530-537). Entretanto,outros locais de inserção também são apropriados, por exemplo, no gene dehemaglutinina (Guo et al., 1989, J. Virol. 63, 4189-4198), no local KIL, nogene u (Zhou et al., 1990, J. Gen. Virol. 71, 2185-2190) ou na extremidadeesquerda do genoma do vírus vaccinia onde uma variedade de anulaçõesespontâneas ou projetadas foram relatados na literatura (Altenburger et al.,1989, Archives Virol. 105, 15-27; Moss et al. 1981, J. Virol. 40, 387-395 ;Panicali et al., 1981, J. Virol. 37, 1000-1010 ; Perkus et al, 1989, J. Virol. 63,3829-3836; Perkus et al, 1990, Virol. 179, 276-286 ; Perkus et al, 1991, Virol.180,406-410).

Quando usa-se MVA, o ácido nucleico codificador depolipeptídeo de HPV-16 precoce pode ser inserida em qualquer uma dasanulações identificadas I a VII bem como no local D4R, mas a inserção naanulação II ou III é preferida (Meyer et al., 1991, J. Gen. Virol. 72, 1031-1038 ; Sutter et al., 1994, Vaccine 12, 1032-1040).

Quando usa-se o vírus fowlpox, embora a inserção dentro dogene de timidina cinase possa ser considerada, o ácido nucleico codificador depolipeptídeo de HPV-16 precoce é preferivelmente introduzido na regiãointergênica situada entre ORFs 7 e 9 (ver, por exemplo, EP 314 569 e US5.180.675).

Como descrito acima, a composição em uso na invenção aindapode compreender um ácido nucleico que expressa citocina. Isto pode serrealizado pelo vetor que codifica o um ou mais polipeptídeos de HPV-16precoces ou por um vetor independente que pode ser da mesma origem oudiferente.

Uma forma de realização preferida da invenção é direcionadaao uso de uma composição que compreende um vetor de MVA que codifica opolipeptídeo E6 de HPV-16 colocado sob o promotor 7,5K, o polipeptídeo E7de HPV-16 colocado sob o promotor 7,5K e o gene IL-2 humano colocadosob o controle do promotor H5R. Preferivelmente, os ácidos nucleicos quecodificam o polipeptídeo E6 de HPV-16, o polipeptídeo E7 de HPV-16 e oIL-2 humanos são inseridos na anulação III do genoma de MVA.

Além disso, a composição em uso na invenção pode incluiruma ou mais substâncias estabilizantes, tais como lipídeos (por exemplo,lipídeos catiônicos, lipossomas, lipídeos como descrito em W098/44143),inibidores de nuclease, hidrogel, hialuronidase (W098/53853), colagenase,polímeros catiônicos, polissacarídeos, agentes de quelação (EP890362), a fimde preservar sua degradação dentro do corpo animal e/ou humano e/oumelhorar a transfecção/infecção do vetor na célula hospedeira ou organismo.Tais substâncias podem ser usadas sozinhas ou em combinação (por exemplo,lipídeos catiônicos ou neutros).

As partículas virais infecciosas que compreendem o ácidonucleico descrito acima ou vetores podem ser produzidas por processo derotina, um processo exemplar compreende as etapas de:

(a) introduzir o vetor viral em uma linha celular adequada,

(b) cultivar a dita linha celular sob condições adequadas a fimde permitir a produção da dita partícula viral infecciosa,

(c) recuperar a partícula viral infecciosa produzida a partir dacultura da dita linha celular e

(d) opcionalmente, purificar a dita partícula viral infecciosarecuperada.

Quando o vetor viral é defeituoso, as partículas infecciosas sãousualmente produzidas em uma linha celular de complementação ou porintermédio de um vírus auxiliar, que fornece in trans os genes virais nãofuncionais. Por exemplo, as linhas celulares adequadas para complementarvetores adenovirais anulados em El incluem as 293 células (Graham et al.,1997, J. Gen. Virol. 36, 59-72) bem como as células PER-C6 (Fallaux et al.,1998, Human Gene Ther. 9, 1909-1917). as células apropriadas para apropagação de poxvírus vetores são célula aviárias e mais preferivelmentefibroblastos de embrião de galinha primários (CEF) preparados a partir deembriões de galinha obtidos a partir de ovos fertilizados.

As partículas virais infecciosas podem ser recuperadas dosobrenadante de cultura ou a partir das células após a Iise (por exemplo, pormeios químicos, congelamento/descongelamento, choque osmótico, choquemecânico, sonicação e outros). As partículas virais podem ser isoladas porséries consecutivas de purificação de placa e então purificadas usando-se astécnicas da técnica (métodos cromatográficos, ultracentrifugação em cloretode césio ou gradiente de sacarose).

A presente invenção também abrange o uso de vetores oupartículas virais que foram modificadas para permitir o alvejamentopreferencial a uma célula hospedeira alvo particular (ver, por exemplo,Wickam et al., 1997, J. Virol. 71, 8221-8229; Amberg et al., 1997, Virol. 227,239-244; Michael et al., 1995, Gene Therapy 2, 660-668; W094/10323;W002/96939 e EP 1 146 125). Um aspecto particular de vetores e partículasvirais alvejadas é a presença em sua superfície de um ligando capaz dereconhecer e ligar-se a um componente de superfície celular ou exposta talcomo um marcador específico celular (por exemplo, uma célula infectada porHPV), um marcador específico de tecido (por exemplo, um marcadorespecífico cervical), bem como um antígeno viral (por exemplo, HPV). Osexemplos de ligandos adequados incluem anticorpos ou fragmentos destesdirecionados a um domínio antigênico de HPV. O ligando é, usualmente,inserido geneticamente em um polipeptídeo presente na superfície do vírus(por exemplo, fibra adenoviral, penton, pDX ou produto genético pl4 de vaccinia).

A composição em uso na presente invenção pode serproduzida por qualquer método adequado, por exemplo, pelas técnicassensibilizadoras de peptídeo diretas padrão (por exemplo, Bodanszky, 1984em Principies of peptide synthesis, Springer-Verlag) e pela tecnologia deDNA recombinante em células hospedeiras apropriadas. Por exemplo, o ácidonucleico codificando quanto aos polipeptídeos E6 e E7 de HPV-16 podem serisolados diretamente a partir de células contendo HPV (por exemplo, célulasde Cash), cDNA e bibliotecas genômicas, genomas virais ou qualquer vetorda técnica anterior conhecido por incluí-los, por biologia molecularconvencional ou técnicas de PCR. Se necessário, este ainda pode sermodificado pelas técnicas de mutagênese de rotina. Alternativamente, o ácidonucleico em uso na invenção também pode ser gerado pela síntese químicaem processo automatizado (por exemplo, montado a partir deoligonucleotídeos sintéticos de sobreposição como descrito por exemplo emEdge, 1981, Nature 292, 756; Nambair et al., 1984, Science 223, 1299; Jay etal., 1984, J. Biol. Chem. 259, 6311). Aqueles habilitados na técnica estãoinformados sobre os sistemas de expressão numerosos disponíveis para aprodução dos polipeptídeos de HPV-16 precoces em células hospedeirasapropriadas e dos métodos para a produção de um vetor ou de uma partículaviral infecciosa em uma célula hospedeira.

O uso preferido de uma composição de acordo com a invençãoé para o tratamento e uma variedade de doenças e condições patológicas,especialmente aquelas associados com uma infecção por HPV causado porpelo menos um dos genótipos de HPV listados abaixo. Embora a invençãotambém abrange a profilaxia, é especialmente útil para a terapia, por exemplo,para tratamento da infecção persistente de HPV, pré-cancerosas bem comocondições cancerosas que pode desenvolver em pacientes infectados porHPV. Os exemplos de condições cancerosas associadas com HPV incluemcarcinoma cervical, carcinoma anal e câncer oral. As condições pré-cancerosas associados ao HPV estende-se a partir das lesões de alto grau àbaixo grau incluindo neoplasia epitelial intra-cervical (CIN) de grau 1, 2 ou 3.

Preferivelmente, na administração em um organismohospedeiro de acordo com as modalidades descrita neste, a composição dainvenção fornece um benefício terapêutico ao organismo hospedeiro tratado.O benefício terapêutico pode ser evidenciado por diversas maneiras comocomparadas ao tratamento anterior, por exemplo em um nível de populaçãopor uma diminuição da freqüência da infecção por HPVs, por um atraso nodesenvolvimento de uma condição patológica tipicamente associada cominfecção por HPV (por exemplo, atraso no desenvolvimento de lesões CIN oucânceres cervicais) ou no nível individual por uma diminuição de HPVviremia, e/ou uma inibição de expressão de gene viral (por exemplo, umadiminuição de RNAs que expressam HPV E6 ou E7) e/ou por uma melhoriado resultado clínico (por exemplo, estabilização, regressão parcial ou total deuma lesão associada ao HPV) e/ou por uma estimulação do sistema imuneresultante no desenvolvimento de uma resposta anti-HPV intensificadahumoral ou celular ou ambos (por exemplo, produção de anticorpos de anti-HPV e/ou imunidade mediada por células T) e/ou por uma respostamelhorada do organismo hospedeiro por terapias convencionais. Por exemplo,a composição usada de acordo com a invenção fornece um benefício quandoesta administração à mulheres com HPV positivo é seguido por (i) umadetecção de HPV negativo seguinte um ou mais detecções positivas, (ii) umaregressão de lesões CIN2/3 de alto grau por CIN 1 de baixo grau ou (iii) aestabilização ou regressão de um carcinoma cervical invasivo. Umacompanhamento regular dos pacientes após o tratamento é recomendadodurante um mínimo de 6 meses.

A presença de HPV pode ser determinado em fluido biológico(por exemplo, um fluido cervical ou vaginal, sangüíneo, soro, plasma),amostras ginecológicas coletadas usando dispositivo de amostragem cervicalconvencional, seções de tecido, e biópsias. Uma variedade de métodos sãodisponíveis por aqueles habilitados na técnica para avaliar a presença de DNAde HPV e RNA em uma amostra, tal como sistema LiPA (W099/14377; LaboBiomedical produets, Netherlands), Pre Teet HPV Proofer (NorChip AS,Norway), sistema Hybrid Capture II (Digene Corp, USA), sistema Thin Prep(Cytyc Corporate; Marlborough, MA) e sistemas PCR/RT-PCR. Osiniciadores adequados são conhecidos àquela pessoa habilitada ou pode serfacilmente sintetizado na base da seqüência de nucleotídeo do genótipo deHPV de interesse. Um também pode proceder pelos ensaios deimunogenicidade (por exemplo, ELISA) usando anticorpos adequados. Aregressão ou estabilização de uma lesão induzida por HPV pode serdeterminada pela medição do tamanho atual da lesão em um período detempo. A observação direta (por exemplo, colposcopia), métodos devisualização radiológicos, métodos de visualização imunológicos ouultrassom pode ser usado para avaliar o tamanho da lesão durante o período.Além disso, uma variedade de métodos in vitro podem ser usados a fim depredizer a estabilização ou regressão de uma lesão associada ao HPV em umorganismo hospedeiro, tal como análise histológica ou citológica para avaliara presença de células atípicas. A estimulação de uma resposta imune anti-HPV pode ser avaliada por diversas técnicas de rotina tal como aquelasdescritas abaixo em conexão com o uso de uma composição para induzir ouestimular uma resposta imune.

Adequadamente, a composição da invenção ainda compreendeum veículo aceitável farmaceuticamente. Como usado neste, um "veículoaceitável farmaceuticamente" é pretendido para incluir qualquer ou todos oscarregadores, solventes, diluentes, excipientes, adjuvantes, dispersão média,revestimentos, agentes anti-bacterianos ou anti-fungicos, e agentes retardantesde absorção, e outros, compatível com a administração farmacêutica. Oveículo aceitável farmaceuticamente incluído em uma composição tambémdeve permitir preservar esta estabilidade sob as condições de fabricação earmazenagem por longo período (isto é pelo menos um mês) em congelação(por exemplo, -70° C, -20° C), refrigerado (por exemplo, 4°C) outemperatura ambiente (por exemplo, 20° C) ou em um estado liofilizado.

A composição em uso da invenção é adequadamentetamponado a fim de ser apropriado por uso humano em um pH básicolevemente ou fisiológico (por exemplo, entre cerca de pH 7 a cerca de pH 9).Tampões adequados incluem, sem limitação tampão de fosfato (por exemplo,PBS), tampão de bicabornato e/ou tampão de Tris.

Além disso pode compreender um diluente apropriado para ouso animal ou humano. Um tal diluente é preferivelmente isotônico,hipotônico ou hipertônico fracamente e tem uma força iônica relativamentebaixa. Os exemplos representativos incluem água estéril, solução salinafisiológica (por exemplo, cloreto de sódio), solução de Ringers, glicose,trealose ou soluções de sacarose, solução de Hank, e outras soluções salinasbalanceadas fisiologicamente aquosas (ver, por exemplo, a edição maiscorrente de Remington : The Science and Practice of Pharmacy, A. Gennaro,Lippincott, Williams&Wilkins).

A composição também pode conter outros excipientesaceitáveis farmaceuticamente para fornecer propriedades farmacodinâmicasou farmacêuticas desejadas, incluindo por exemplo modificar ou manter aosmolaridade, viscosidade, claridade, cor, esterilidade, estabilidade, taxa dedissolução da formulação, modificar ou manter a liberação ou absorção noorganismo animal ou humano, promover o transporte cruzando a barreirasangüínea ou penetração em um órgão particular (por exemplo, fígado). Osexcipientes adequados incluem aminoácidos.

Além disso, a composição pode ser usada em combinação comadjuvantes convencionais adequados para aplicação sistêmica ou mucosal emhumanos.

A composição pode ser administrada ao organismo hospedeiropor uma variedade de modos de administração, incluindo administraçãolocalizada e tópica, sistêmica. As vias de administração adequadas incluem,sem limitação subcutânea, intradérmica, intramuscular, intravenosa,intraperitoneal, intratumoral, intravascular, e injeção intra-arterial. Asinjeções pode ser feitas com seringas e agulhas convencionais, ou qualqueroutro dispositivo apropriado disponível na técnica. Alternativamente acomposição pode ser administrada por intermédio da via mucosal, tal como avia oral/alimentar, nasal, intra-traqueal, intra-pulmonar, intra-vaginal ou intra-retal. A administração tópica também pode ser realizada usando meiostransdérmicos (por exemplo, emplastro e outros). No contexto da invenção, asadministrações subcutânea e intramuscular constituem as vias preferidas. Aadministração pode acontecer em uma dose simples ou uma dose repetida,uma ou diversas vezes após o intervalo de tempo certo variando a partir do diaao ano. Desejavelmente, os intervalos são uma substância de uma semana aum mês.

A dosagem apropriada pode ser adaptada como uma função devários parâmetros, em particular o modo de administração; a composiçãoutilizada; a idade, saúde, e peso do organismo hospedeiro; a natureza eextensão dos sintomas; tipo de tratamento simultâneo; a freqüência dotratamento; e/ou a necessidade para prevenção ou terapia. O refino adicionaldos cálculos necessários para determinar a dosagem apropriada érotineiramente feito por um médico, na luz das circunstâncias relevantes. Paraorientação geral, a dosagem adequada para uma composição contendo vacinavaria de cerca de IO4 a IO9 pfu (unidades formadoras de placas),desejavelmente de cerca de IO5 e 108 pfu visto que o adenovírus quecompreende a composição varia de cerca de 107 a IO11 iu (unidadesinfecciosas), desejavelmente de cerca de 107 e IO11 iu. Uma composição combase em plasmídeos de vetor podem ser administrados em doses entre 10 μg emg, vantajosamente entre 100 μg e 2 mg. Uma composição de proteínapode ser administrada em doses entre 10 μg e 20 mg, com uma preferênciaespecial por uma dosagem de cerca de 0,1 μg a cerca de 2 mg por Kg de pesocorporal.

Em uma forma de realização preferida, a composição em usoda invenção compreende o vetor MVA descrito acima e é administrado emtrês doses de 5x10 pfu a 5x10 pfu por via subcutânea em intervalossemanais.

Se desejado, o uso da invenção pode ser realizado emconjunção com um ou mais modalidades terapêuticas convencionais (porexemplo, radiação, quimioterapia e/ou cirurgia). Os métodos terapêuticosmúltiplos fornece ao paciente com uma intervenção com base mais ampla. Emuma forma de realização, o método da invenção pode ser precedido oupreferivelmente seguido por uma excisão cirúrgica da lesão associada ao HPV(por exemplo, conisação). Em uma outra forma de realização, este pode serprecedido ou seguido pela radioterapia (por exemplo, radiação de gama).Aqueles habilitados na técnica podem rapidamente formular protocolos deterapia de radiação apropriados e parâmetros que podem ser usados (ver, porexemplo, Perez and Brady, 1992, Principies and Practice of RadiationOncology, 2o Ed. JB Lippincott Co; usando adaptações apropriadas emodificações como serão rapidamente evidentes àqueles habilitados nocampo). Ainda em outra forma de realização, o método ou uso da invenção éassociado à quimioterapia com um ou mais medicamentos que são usadosconvencionalmente para tratamento ou prevenção de infecção por HPVs,condições patológicas associadas com HPV.

Em uma outra forma de realização, o uso da invenção érealizada de acordo com o auxílio principal da modalidade terapêutica quecompreende administração seqüencial de um ou mais composições deimprimação e um ou mais composições auxiliares. Tipicamente, ascomposições de imprimação e as auxiliares são veículos diferentes quecompreende ou codifica pelo menos um domínio imunogênico em comum. Acomposição de imprimação é inicialmente administrada ao organismohospedeiro e a composição auxiliares são subseqüentemente administradasapós um período de tempo que varia de um dia a doze meses. Além disso, ascomposições de imprimação e auxiliares podem ser administradas no mesmolocal ou em locais alternativos pela mesma via ou por vias diferentes deadministração. Por exemplo, uma composição de imprimação com base empolipeptídeos de HPV-16 precoces podem ser administradas por uma viamucosal visto que a composição auxiliar com base no vetor de ácido nucleicoé preferivelmente injetado, por exemplo, injeção subcutânea para um vetorMVA, injeção intramuscular para um plasmídeo de DNA e por um vetoradenoviral.

A presente invenção também refere-se ao uso de umacomposição que compreende um ou mais polipeptídeos precoces de HPV-16ou um ácido nucleico que codifica um ou mais polipeptídeos precoces deHPV-16 para induzir ou estimular uma resposta imune contra pelo menos umoutro papilomavírus humano que não HPV-16. A invenção também dizrespeito a um método de indução ou estimulação em uma resposta imune deum mamífero contra pelo menos um outro papilomavírus humano que nãoHPV-16, o método compreendendo administrar ao mamífero uma composiçãoque compreende um ou mais polipeptídeos precoces de HPV-16 ou um ácidonucleico que codifica um ou mais polipeptídeos precoces de HPV-16. Aresposta imune é preferivelmente uma resposta imune celular direcionado aum polipeptídeo precoce HPV, com uma preferência por uma resposta imunemediada por CD4+, um CD8+ ou tanto CD4+ quanto CD8+.

A capacidade para induzir ou estimular uma resposta imuneanti-HPV na administração em um organismo humano ou animal pode seravaliado in vitro ou in vivo usando uma variedade de ensaios que são padrõesna técnica. Para uma descrição geral de técnicas disponíveis para avaliar ocomeço e uma estimulação de uma resposta imune, ver, por exemplo, Coliganet al. (1992 e 1994, Current Protocols in Immunology ; ed J Wiley & SonsInc, National Institute of Health). A medição da imunidade celular pode serrealizada por uma medição da perfis de citocina secretados pelas células deefeitos ativados incluindo aquelas derivadas de células T CD4+ e CD8+ (porexemplo, quantificação de IL-IO ou células que produzem IFNg por ELIspot),pela determinação do estado de ativação de células de efeito imunes (porexemplo, ensaios de proliferação de células T por uma absorção de timidina[3H] clássica), submetendo-se ao ensaio quanto a linfócitos T específicos deantígeno em um paciente sensibilizado (por exemplo, Iise específica depeptídeo em um ensaio de citoxicidade), pela atividade citolítica anti-tumormediada por linfócito determinado por exemplo, por um ensaio de liberação51Cr. A capacidade para estimular uma resposta humoral pode serdeterminado pela ligação de anticorpo e/ou competição em ligação (ver, porexemplo, Harlow, 1989, Antibodies, Cold Spring Harbor Press) ou pelageração in vitro da inibição mediada pelo anticorpo específico de tumor dedesenvolvimento celular (Gazit et al., 1992, Câncer Immunol. Immunother35, 135-144). O método da invenção também ainda pode ser validado emmodelos animais provocados com um agente de indução de tumor apropriado(por exemplo, HPV-16 E6 e células TCl que expressa E7) para determinaratividade anti-tumor, refletindo uma indução ou uma estimulação de umaresposta imune anti-HPV.

A invenção foi descrita em uma maneira ilustrativa, é esta seráentendida que a terminologia que foi usada é pretendida ser na natureza daspalavras da descrição em vez da limitação. Obviamente, muitas modificaçõese variações da presente invenção são possíveis na luz das técnicas acima. Éportanto a ser entendido que dentro do escopo das reivindicações anexadas, ainvenção pode ser praticada em uma maneira diferente a partir do que éespecialmente descrito neste.

Todas as descobertas citadas acima das Patentes, Publicações eEntrada de banco de dados são especialmente incorporadas neste porreferência em sua totalidade à mesma extensão como se cada uma tal Patenteindividual, Publicação ou Entrada foram especificamente e indicadasindividualmente a serem incorporadas por referência.

Legendas das Figuras

Figura 1 ilustra MVATG8042

Figura 2 ilustra o ensaio LFNg ELISPOT especificado porE7/E6 (meios/grupos). Os grupos são definidos pelo imunogênio usado, umMNA N33 (branco) ou MVATG8042 (cinza). Os resultados são apresentadoscomo o intermediário do grupo imunizado.

Os seguintes exemplos servem para ilustrar a presente

invenção.

EXEMPLOS

Materiais e métodos

Vírus

MVATG8042 (Figura 1) é um vírus MVA recombinante queexpressa a membrana ancorada e variantes não oncogênicas de polipeptídeosE6 e E7 de HPV-16 (E6*TMF e E7*TMR) bem como IL-2 humano. OMVATG8042 é descrito em W099/03885 e U.S. 6.884.786. As seqüências degene HPV-16 são ambas colocadas sob o controle do promotor p7,5K vistoque o gene IL-2 é conduzido pelo promotor H5R e todos são inseridos naregião de excisão III do genoma MVA.

As partículas do vírus MVATG8042 são produzidas emcélulas CEF de acordo com as técnicas convencionais. Os estoques de vírusforam mantidos a -80° C até o dia da injeção. A suspensão viral foirapidamente descongelada, e diluída antes da administração em tampãoTG0008 contendo Tris-HCl de 10 mM de pH8, 5% de sacarose (p/v), e 50mM de NaCl, a fim de obter a dose viral de 5x10 pfu em um volume de 100μl.

Modelo de animalOs camundongos C57B1/6 fêmeas saudáveis SPF foramobtidas de Charles River (Les Oncins, France). Os animais foram alojados emum ambiente exclusivo, simples, ar condicionado para fornecer um mínimo de11 mudanças de ar por hora. As faixas de temperatura e umidade relativaforam dentro de 18° C e 22° C e 40 a 70 % respectivamente. A iluminaçãofoi controlada automaticamente para dar um ciclo de 12 horas de luz e 12horas de escuro. Por todo o estudo os animais tiveram acesso ao ad libitumpor RMl de tipo de regime esterilizado (SDS, France). Agua estéril foifornecida ad libitum por intermédio de vidros.

Os camundongos fêmeas C57B1/6 de 7 semanas de idadeforam imunizados subcutaneamente 3 vezes ao dia 0, 7 e 14 com 5x107 pfu deMVATGN33 ou MVATG8042. As injeções subcutâneas foram realizadascada vez em um local diferente do flanco direito dos animais. Os baços foramretirados no dia 21 após a última imunização. As células do baço frescasforam preparadas usando técnicas convencionais na técnica.

Um placa nitrocelulose de 96 reservatórios foi revestido com31 μg/ml de anticorpo IFNg anti-camundongo de rato monoclonal (Clone R4-6A2; Pharmingen, Cat. Número 551216, 100 μl/reservatório) em tampão decarbonato de sódio. As placas foram incubadas durante a noite a 4o C ou 1hora a 37° C. As placas foram lavadas três vezes com DMEM 10 % de FCS esaturadas 2 horas a 37° C com 100 μl de DMEM 10 % de FCS/reservatório.Os esplenócitos foram colocados em uma concentração de IO6 células/100 μl.O IL-2 foi adicionado aos reservatórios em uma concentração de 6U/500reservatório (R&D Systems; lOng/ml). O Concanavalin A foi usado comocontrole positivo (5μg/ml).

Todos os peptídeos foram sintetizados pelo Neosystem. Cadapeptídeo foi dissolvido em DMSO a 10 mg/ml e armazenado a 4o C. Ospeptídeos foram usados em uma concentração de 5μg/ml. As placas foramincubadas 48 horas a 37° C, em 5 % de CO2.A placa foi lavada uma vez com PBS IX e 5 vezes com PBSde 0,05% de Tween. O LFNg anti-camundongo biotinilado (clone XMG1,2,Pharmingen) foi adicionado na concentração de 0,3 μg/100 μΐ/ reservatório eincubado 2 horas a temperatura ambiente sob lenta agitação. A placa foilavada 5 vezes com PBS a 0,05 % de Tween Extravidin AKP (Sigma, St.Louis, MO) diluída a 1/5000 em PBS 0,05% de Tween, 1% de FCS tambémfoi adicionado aos reservatórios (100 μΐ/reservatório). A placa foi incubada 45minutos em temperatura ambiente e então lavada 5 vezes com PBS de 0,05 %de Tween. A secreção de EFNg foi revelada com Biorad Kit. 100μ1 desubstrato (NBT+BCIP) foi adicionado por reservatório e a placa foi levada atemperatura ambiente por 0,5 hora. A placa foi lavada com água e colocadasecar durante a noite em temperatura ambiente. As marcas foram contadasusando um microscópio de dissecação.

RESULTADOS

As seqüências de aminoácido E6 e E7 a partir de genótiposdiferentes de HPV foram alinhados usando programa de alinhamento múltiploHUSAR (CLUSTAL) (https://genius.embnet.dkfzheidelberg.de/menu/cgi-bin/w2h/w2h. start).

Os peptídeos restritos H2b (Db ou Kb restritos) foramidentificados usando a software de ligação de peptídeo BlMAS disponível naInternet (http://bimas.dcrt.nih.gov/molbio/hlabind/). O peptídeo de R9Fpresente na proteína HPV 16-E7 (RAHYNIVTF: SEQ ID NO: 5) foi usadocomo um peptídeo de referência. Foi descrito na técnica como capaz de serreconhecido por CTL específico por E7 e foi identificado no dado BIMAScom uma contagem de ligação de 6. A seqüência de aminoácido de peptídeosHPV-16 E6 e E7 não identificados com contagens iguais ou acima destesvalores foram alinhados com o qual peptídeo correspondente em HPV-16 E6e E7. Os peptídeos que apresentam um ou dois aminoácidos diferentes comrespeito aos polipeptídeos de seqüência de aminoácido E6 e E7 de HPV-16foram escolhidos por esta análise de reatividade cruzada. Seis peptídeosforam testados:

SCVYCKKEL (HPV56 E6 Db): PEPTÍDEO S9L (SEQ ID NO: 6)RCIICQRPL (HPV33, E6 HPV 58 E6 Db): PEPTÍDEO R9L (SEQ IDNO: 7)

SEYRHYQYS (HPV52, E6 Kb): PEPTÍDEO S9S (SEQ ID NO: 8)ECVYCKQQL (HPV 16, E6 Db): PEPTÍDEO E9L (SEQ ID NO: 9)TDLHCYEQL (HPV31, E7 Kb): PEPTÍDEO T9L (SEQ ID NO: 10); eRAHYNTVTF (HPV 16, E7 Db): PEPTÍDEO R9F (SEQ ID NO: 5) comocontrole positivo.

Peptídeo irrelevante: como controle negativoPor exemplo, o peptídeo T9L foi identificado com umacontagem de ligação de 20 em polipeptídeos HPV-31 e HPV-52 E7. Istomostra uma diferença de aminoácido com respeito ao peptídeo HPV-16 E7correspondente (TDLYCYEQL). O peptídeo S9S foi identificado com umacontagem de ligação de 15,8 em polipeptídeo HPV-52 E6 e isto mostra umadiferença de aminoácido com respeito ao peptídeo HPV-16 E6correspondente (SEYRHYCYS).

A reatividade cruzada foi avaliada pelo ensaio IFNg ELISPOTem esplenócitos obtidos de camundongos imunizados com MVATG8042como descrito em Materials and Methods. Os resultados são mostrados naFigura 2. A imunização de camundongos com MVATGN33 nãorecombinantes não induzem qualquer resposta Thl (produção de IFNg abaixodo nível de base). Por outro lado, a imunização com MVATG8042 induz umaresposta de epítopos múltiplos Thl em camundongos. Como esperado, acultura do esplenócito imunizado com peptídeo de R9F estimulam a produçãode IFNg visto que a adição de um peptídeo de Flu irrelevante na cultura doesplenócito não tem efeito significante (produção de IFNg no nível de base).Entretanto, surpreendentemente, os peptídeos do que o peptídeo E7 H2b"restrito conhecido de R9F são reconhecidos pelo CTL tal como os peptídeosS9S, E9L e T9L. Além disso, A estimulação das células T com peptídeosespecíficos HPV31 ou HPV52 parecerão tão potentes quanto gerados com opeptídeo R9F E7 reconhecido por CTL. Estas observações foram feitas nabase das moléculas de classe I MHC. Não deve ser excluído que outrosgenótipos devem ser apresentados por moléulas de classe IIMHC.

Além disso, será notado que a seqüência do peptídeo T9Lespecífico de HPV31 e HPV-52 combina-se com a seqüência do peptídeocorrespondente das seqüências HPV 33, 35, e 58 com a exceção de umaminoácido.

Experimento de estimulação cruzadaUm experimento de estimulação cruzada foi realizado a fim dedeterminar se os esplenócitos de camundongos imunizados MVATG8042devem ser estimulados por peptídeos específicos por outros genótipos deHPV. Para limitar o número de peptídeos a serem testados, as regiões dasproteínas E6 ou E7 com alta probabilidade de associação com moléculas declasse I MHC (Db e Kb) foram identificados usando o software Bimass. Umasérie de peptídeos foram testados que exibem uma, duas ou três diferenças deaminoácidos com respeito ao peptídeo correspondente de HPV-16 E6 ou E7(ver Tabela 1). Todos os peptídeos foram sintetizados pelo Neosystem(France) no nível de imunograu. Cada peptídeo foi dissolvido em DMSO a 10mg/ml e armazenado a 4°C. O número de células que produzem IFNy por 106esplenócitos foram avaliadas nos esplenócitos estimulados por peptídeoretirado do simples ou animais vacinados MVATG8042.

Tabela 1: Lista de peptídeos testados

<table>table see original document page 38</column></row><table><table>table see original document page 39</column></row><table>

Resumidamente, os camundongos fêmeas C57B1/6 foramimunizados três vezes subcutaneamente com 5x10"7 pfu de MVATGN33 (umcamundongo como controle negativo) ou MVATG8042 (três camundongos).As injeções subcutâneas foram realizadas cada vez em um local diferente doflanco direito dos animais. Os baços foram retirados no dia 21 após a últimaimunização e as células do baço frescas foram preparadas usando uma célulaStrainer (BD Falcon). A estimulação cruzada de vários peptídeos comrespeito ao esplenócitos imunizados HPV-16 foram avaliados por Elispotusando o camundongo Mabtech AB EFNy ELISPOTplus kit ou camundongoDL-4 ELISPOTplus kit (Mabtech, France) de acordo com as instruções dofabricante. A placa foi lavada com água e colocada secar durante a noite emtemperatura ambiente. As marcas foram contadas usando o Elispot readerBioreader 4000 Pro-X (BIOSYS-Gmbh; Serlabo France). Para cada peptídeo,o número de pontos representam o meio de duplicar do qual foi subtraído domeio de duplicação de fundo. Os valores de fundo são o número de pontosobtidos com um peptídeo restrito ao Kb irrelevante. Os peptídeos de nãogenótipos HPV-16 foram considerados capazes por esplenócitos deestimulação cruzada de animais imunizados MVATG8042 quando pelomenos 30 pontos foram vistos e que os números foram duas vezes os valoresvisto para o mesmo peptídeo no simples animal.

A reestimulação de peptídeo em animais simples não injetadosnão estimulam qualquer resposta imune celular significante. Em contrastemarcado e como esperado, um número alto de pontos foi observado após areestimulação dos esplenócitos obtidos de camundongos imunizadosMVATG8042 com o peptídeo R9F restrito ao E7 H2b"conhecido. Entretanto,surpreendentemente, outros peptídeos do que os peptídeos de R9F sãoreconhecidos pelo CTL especialmente os peptídeos T9L (HPV-31), T9F(HPV-31), T9S (HPV-35) e T9Y (HPV-52).

Completamente, estes dados fornecem uma direção positivaque a vacinação com polipeptídeos HPV-16 E6 e/ou E7 ou vetores deexpressão (por exemplo, MVATG8042) também devem ser eficazes paratratamento de infecções com o menor e HPV oncogênico de genótipos 31, 33,35, e 52.LISTAGEM DE SEQÜÊNCIAS

<110> TRANSGENE SA

<120> vacina de papilomavírus

<130> TG174

<160> 32

<170> PatentIn versão 3.1

<210> 1

<211> 153

<212> PRT

<213> seqüência artificial

<220>

<223> variante não oncogênica de polipeptídeo E6 de HFV-I6

<400> 1

Met His Gln Lys Arg Thr Ala Met Phe Gln Asp Pro Gln Glu Arg Pro1 5 10 15

Arg Lys Leu Pro Gln Leu Cys Thr Glu Leu Gln Thr Thr Ile His Asp20 25 30

Ile Ile Leu Glu Cys Val Tyr Cys Lys Gln Gln Leu Leu Arg Arg Glu35 40 45

Val Tyr Asp Phe Ala Phe Arg Asp Leu Cys Ile Val Tyr Arg Asp Gly50 55 60

Asn Pro Tyr Ala Val Cys Asp Lys Cys Leu Lys Phe Tyr Ser Lys Ile65 70 75 80

Ser Glu Tyr Arg His Tyr Cys Tyr Ser Leu Tyr Gly Thr Thr Leu Glu85 90 95

Gln Gln Tyr Asn Lys Pro Leu Cys Asp Leu Leu Ile Arg Cys Ile Asn100 105 110

Cys Gln Lys Pro Leu Gln Arg His Leu Asp Lys Lys Gln Arg Phe His115 120 125

Asn Ile Arg Gly Arg Trp Thr Gly Arg Cys Met Ser Cys Cys Arg Ser130 135 140

Ser Arg Thr Arg Arg Glu Thr Gln Leu145 150

<210> 2 <211> 92 <212> PRT <213> seqüência artificial <220><223> variante não oncogênica de polipeptideo E7 de HPV-16

<400> 2

Met His Gly Asp Thr Pro Thr Leu His Glu Tyr Met Leu Asp Leu Gln1 5 10 15

Pro Glu Thr Thr Gln Leu Asn Asp Ser Ser Glu Glu Glu Asp Glu Ile20 25 30

Asp Gly Pro Ala Gly Gln Ala Glu Pro Asp Arg Ala His Tyr Asn Ile35 40 45

Val Thr Phe Cys Cys Lys Cys Asp Ser Thr Leu Arg Leu Cys Val Gln ·50 55 60

Ser Thr His Val Asp Ile Arg Thr Leu Glu Asp Leu Leu Met Gly Thr65 70 75 80

Leu Gly Ile Val Cys Pro Ile Cys Ser Gln Lys Pro85 90

<210> 3 <211> 243 <212> PRT <213> seqüência artificial <220>

<223> variante não oncogênica presente na membrana de polipeptideo E6 de HPV-16

<400> 3

Met Gly Leu Lys Val Asn Val Ser Ala Ile Phe Met Ala Val Leu Leu1 5 10 15

Thr Leu Gln Thr Pro Thr Gly Gln Ile His Trp Gly Met His Gln Lys20 25 30

Arg Thr Ala Met Phe Gln Asp Pro Gln Glu Arg Pro Arg Lys Leu Pro35 40 45

Gln Leu Cys Thr Glu Leu Gln Thr Thr Ile His Asp Ile Ile Leu Glu50 55 60

Cys Val Tyr Cys Lys Gln Gln Leu Leu Arg Arg Glu Val Tyr Asp Phe65 70 75 60

Ala Phe Arg Asp Leu Cys Ile Val Tyr Arg Asp Gly Asn Pro Tyr Ala85 90 95Val Cys Asp Lys Cys Leu Lys Phe Tyr Ser Lys Ile Ser Glu Tyr Arg100 105 110

His Tyr Cys Tyr Ser Leu Tyr Gly Thr Thr Leu Glu Gln Gln Tyr Asn115 120 125

Lys Pro Leu Cys Asp Leu Leu Ile Arg Cys Ile Asn Cys Gln Lys Pro130 135 140

Leu Gln Arg His Leu Asp Lys Lys Gln Arg Phe His Asn Ile Arg Gly145 ~ 150 155 160

Arg Trp Thr Gly Arg Cys Met Ser Cys Cys Arg Ser Ser Arg Thr. Arg165 170 175

Arg Glu Thr Gln Leu Gly Leu Ser Ser Thr Ser Ile Val Tyr Ile Leu180 185 190

Ile Ala Val Cys Leu Gly Gly Leu Ile Gly Ile Pro Ala Leu Ile Cys195 200 205

Cys Cys Arg Gly Arg Cys Asn Lys Lys Gly Glu Gln Val Gly Met Ser210 215 220

Arg Pro Gly Leu Lys Pro Asp Leu Thr Gly Thr Ser Lys Ser Tyr Val225 230 235 240

Arg Ser Leu

<210> 4 <211> 185 <212> PRT <213> seqüência artificial <220><223> variante não oncogênica presente na membrana de polipeptideo E6 de HFV-I6

<400> 4

Met Val Pro Gln Ala Leu Leu Phe Val Pro Leu Leu Val Phe Pro Leu1 5 10 15

Cys Phe Gly Lys Phe Pro Ile Gly Ser Met His Gly Asp Thr Pro Thr20 25 30

Leu His Glu Tyr Met Leu Asp Leu Gln Pro Glu Thr Thr Gln Leu Asn35 40 45Asp Ser Ser Glu Glu Glu Asp Glu Ile Asp Gly Pro Ala Gly Gln Ala50 55 60

Glu Pro Asp Arg Ala His Tyr Asn Ile Val Thr Phe Cys Cys Lys Cys65 70 75 80

Asp Ser Thr Leu Arg Leu Cys Val Gln Ser Thr His Val Asp Ile Arg85 90 95

Thr Leu Glu Asp Leu Leu Met Gly Thr Leu Gly Ile Val Cys Pro Ile100 105 110

Cys Ser Gln Lys Pro Arg Ser Tyr Val Leu Leu Ser Ala Gly Ala Leu115 120 125

Thr Ala Leu Met Leu Ile Ile Phe Leu Met Thr Cys Cys Arg Arg Val130 135 140

Asn Arg Ser Glu Pro Thr Gln His Asn Leu Arg Gly Thr Gly Arg Glu145 150 155 160

Val Ser Val Thr Pro Gln Ser Gly Lys Ile Ile Ser Ser Trp Glu Ser165 170 175

His Lys Ser Gly Gly Glu Thr Arg Leu180 185

<210> 5 <211> 9 <212> PRT <213> seqüência artificial <220><223> peptideo R9F de polipeptideo E7 de HFV-16

<400> 5

Arg Ala His Tyr Asn Ile Val Thr Phe1 5

<210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> seqüência artificial <220><223> peptideo S9L no polipeptideo E6 de HFV-56

<400> 6

Ser Cys Val Tyr Cys Lys Lys Glu Leu1 5

<210> 7 <211> 9 <212> PRT <213> seqüência artificial <220><223> peptideo R9L no polipeptideo E6 de HPV-33 e HPV-58<400> 7

Arg Cys Ile Ile Cys Gln Arg Pro Leu1 5

<210> 8 <211> 9 <212> PRT <213> seqüência artificial <220><223> peptídeo S9S no polipeptídeo Εβ de HPV-52

<400> 8

Ser Glu Tyr Arg His Tyr Gln Tyr Ser1 5

<210> 9 <211> 9 <212> PRT <213> seqüência artificial <220><223> peptídeo R9L no polipeptídeo E6 de HPV-16

<400> 9

Glu Cys Val Tyr Cys Lys Gln Gln Leu1 5

<210> 10 <211> 9 <212> PRT <213> seqüência artificial <220><223> peptídeo T9L no polipeptídeo E7 de HPV-31

<400> 10

Thr Asp Leu His Cys Tyr Glii Gln Leu1 5

<210> 11 <211> 8 <212> PRT <213> seqüência artificial <220><223> peptídeo D8L-1 no polipeptídeo E7 de HPV-16, HPV-33 e HPV-35

<400> 11

Asp Leu Tyr Cys Tyr Glu Gln Leu1 5

<210> 12 <211> 8 <212> PRT <213> seqüência artificial <220><223> peptídeo D8L-2 no polipeptídeo E7 de HPV-34 e HPV-52

<400> 12

Asp Leu His Cys Tyr Glu Gln Leu1 5

<210> 13 <211> 8 <212> PRT <213> seqüência artificial <220><223> peptídeo D8L-3 no polipeptídeo E7 de HPV-58

<400> 13Asp Leu Phe Cys Tyr Glu Gln Leu1 5

<210> 14 <211> 8 <212> PRT <213> seqüência artificial <220><223> peptideo D8L-4 no polipeptídeo E7 de HPV-18 e HPV-45

<400> 14

Asp Leu Leu Cys Tyr Glu Gln Leu1 5

<210> 15 <211> 8 <212> PRT <213> seqüência artificial <220><223> peptideo L8L-1 no polipeptídeo E7 de HPV-16 e HPV-52

<400> 15

Leu Gln Pro Glu Thr Thr Asp Leu1 5

<210> 16 <211> 8 <212> PRT <213> seqüência artificial <220><223> peptideo L8L-2 no polipeptídeo E7 de HPV-31

<400> 16

Leu Gln Pro Glu Ala Thr Asp Leu1 5

<210> 17 <211> 8 <212> PRT <213> seqüência artificial <220><223> peptideo L8L-3 no polipeptídeo E7 de HPV-35

<400> 17

Leu Glu Pro Glu Ala Thr Asp Leu1 5

<210> 18 <211> 8 <212> PRT <213> seqüência artificial <220><223> peptideo L8L-4 no polipeptídeo E7 de HPV-33

<400> 18

Leu Tyr Pro Glu Pro Thr Asp Leu1 5

<210> 19 <211> 8 <212> PRT <213> seqüência artificial <220><223> peptideo L8L-5 no polipeptídeo E7 de HPV-58

<400> 19

Leu His Pro Glu Pro Thr Asp Leu1 5<210> 20 <211> 8 <212> PRT <213> seqüência artificial <220>

<2Ζ3> peptídeo R8L-1 no polipeptideo Ε6 de HPV-18 e HPV-45

<400> 20

Arg Cys Leu Arg Cys Gln Pro Leu1 5

<210> 21 <211> 8 <212> PRT <213> seqüência artificial <220><223> peptídeo R8L-2 no polipeptideo E6 de HPV-51

<400> 21

Arg Cys His Arg Cys Gln Pro Leu1 5

<210> 22 <211> 9 <212> PRT <213> seqüência artificial <220><223> peptídeo R9L-2 no polipeptideo E6 de HPV-16

<400> 22

Arg Cys Ile Asn Cys Gln Lys Pro Leu1 5

<210> 23 <211> 9 <212> PRT <213> seqüência artificial <220><22 3> peptídeo R9L-3 no polipeptideo E6 de HFV-35

<400> 23

Arg Cys Ile Ile Cys Gln Lys Pro Leu1 5

<210> 24 <211> 9 <212> PRT <213> seqüência artificial <220><223> peptídeo R9L-4 no polipeptideo E6 de HFV-31

<400> 24

Arg Cys Ile Thr Cys Gln Arg Pro Leu1 5

<210> 25 <211> 9 <212> PRT <213> seqüência artificial <220><22 3> peptídeo R9L-5 no polipeptideo E6 de BFV-52

<400> 25

Arg Cys Ile Ile Cys Gln Thr Pro Leu1 5

<210> 26 <211> 9 <212> PRT <213> seqüência artificial<223> peptídeo S9S-2 no polipeptideo E6 de HFV-16

<220><400> 26

Ser Glu Tyr Arg His Tyr Cys Tyr Ser1 5

<210> 27 <211> 9 <212> PRT <213> seqüência artificial <220><223> peptideo S9S-3 no polipeptídeo E6 de HPV-33 e HPV-58

<400> 27

Ser Glu Tyr Arg His Tyr Asn Tyr Ser1 5

<210> 28 <211> 9 <212> PRT <213> seqüência artificial <220><223> peptideo S9S-4 no polipeptídeo E6 de HPV-52

<400> 28

Ser Glu Tyr Arg Trp Tyr Arg Tyr Ser1 5

<210> 29 <211> 9 <212> PRT <213> seqüência artificial <220><223> peptideo S9S-5 no polipeptídeo E6 de HPV-31

<400> 29

Ser Glu Phe Arg Trp Tyr Arg Tyr Ser1 5

<210> 30 <211> 9 <212> PRT <213> seqüência artificial <220><223> peptideo T9F no polipeptídeo E7 de HPV-31

<400> 30

Thr Ser Asn Tyr Asn Ile Val Thr Phe1 5

<210> 31 <211> 9. <212> PRT <213> seqüência artificial <220><223> peptideo T9S no polipeptídeo E7 de HPV-35

<400> 31

Thr Ser Asn Tyr Asn Ile Val Thr Ser1 5

<210> 32 <211> 9 <212> PRT <213> seqüência artificial <220><223> peptideo T9Y no polipeptídeo E7 de HPV-52

<400> 32

Thr Ser Asn Tyr Asn Ile Val Thr Tyr1 5

Claims (25)

1. Uso de uma composição compreendendo um ou maispolipeptídeos precoces de HPV-16 ou um ácido nucleico que codifica um oumais polipeptídeos precoces de HPV-16, caracterizado pelo fato de ser para afabricação de um medicamento para a prevenção ou tratamento de umainfecção ou uma condição patológica causada por pelo menos um outropapilomavírus que não HPV-16.

2. Uso de uma composição compreendendo um ou maispolipeptídeos precoces de HPV-16 ou um ácido nucleico que codifica um oumais polipeptídeos precoces de HPV-16, caracterizado pelo fato de ser para afabricação de um medicamento para tratar uma infecção ou uma condiçãopatológica causada por pelo menos um outro papilomavírus humano que nãoHPV-16.

3. Uso de uma composição compreendendo um ou maispolipeptídeos precoces de HPV-16 ou um ácido nucleico que codifica um oumais polipeptídeos precoces de HPV-16, caracterizado pelo fato de ser parainduzir uma resposta imune contra pelo menos um outro papilomavírushumano que não HPV-16.

4. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a-3, caracterizado pelo fato de que o dito pelo menos um outro papilomavírushumano que não HPV-16 é selecionado dentre o grupo que consiste de HPV--31, HPV-33, HPV-35, HPV-39, HPV-51, HPV-52, HPV-56, HPV-58, HPV--59 e HPV-68V1.

5. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a-4, caracterizado pelo fato de que o dito um ou mais polipeptídeos de HPV-16precoces é um polipeptídeo E6, um polipeptídeo E7 ou tanto um polipeptídeoE6 quanto um polipeptídeo E7.

6. Uso de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelofato de que os ditos polipeptídeos E6 e/ou E7 de HPV-16 e (são) variante(s)não oncogênica(s).

7. Uso de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelofato de que a dita variante não oncogênica do polipeptídeo E6 de HPV-16compreende uma seqüência de aminoácido que é homóloga ou idêntica àseqüência de aminoácido mostrada na SEQID NO: 1.

8. Uso de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelofato de que a dita variante não oncogênica do polipeptídeo E7 de HPV-16compreende uma seqüência de aminoácido que é homóloga ou idêntica àseqüência de aminoácido mostrada na SEQID NO: 2.

9. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações de 5 a-8, caracterizado pelo fato de que os ditos polipeptídeos E6 e/ou E7 de HPV--16 são modificados a fim de serem ancorados à membrana celular pelaincorporação de uma seqüência de ancoragem de membrana e uma seqüênciasecretora.

10. Uso de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelofato de que a dita seqüência de ancoragem de membrana e/ou seqüênciasecretora são obtidas a partir da glicoproteína da raiva, a glicoproteína doenvelope do vírus HIV ou a proteína F do vírus do sarampo.

11. Uso de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelofato de que o dito polipeptídeo E6 de HPV-16 compreende uma seqüência deaminoácido que é homóloga ou idêntica à seqüência de aminoácido mostradana SEQID NO: 3.

12. Uso de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelofato de que o dito polipeptídeo E7 de HPV-16 compreende uma seqüência deaminoácido que é homóloga ou idêntica à seqüência de aminoácido mostradana SEQ ID NO: 4.

13. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a-12, caracterizado pelo fato de que a dita composição adicional compreendeuma citocina ou um ácido nucleico que codifica uma citocina.

14. Uso de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelofato de que a dita citocina é LL-2.

15. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 14, caracterizado pelo fato de que o dito ácido nucleico que codifica um oumais polipeptídeos de HPV-16 precoces é compreendido de um vetor.

16. Uso de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelofato de que o dito vetor viral é um vetor de vaccinia.

17. Uso de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelofato de que o dito vetor de vaccinia é um vetor de MVA.

18. Uso de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelofato de que o dito vetor de MVA compreende um ácido nucleico que codificao polipeptídeo E6 de HPV-16 colocado sob o promotor 7,5K, um ácidonucleico que codifica o polipeptídeo E7 de HPV-16 colocado sob o promotor 7,5K e o gene IL-2 humano colocado sob o controle do promotor H5R.

19. Uso de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelofato de que os ditos ácidos nucleicos que codifica o dito polipeptídeo E6 deHPV-16, o dito polipeptídeo E7 de HPV-16 e o dito gene EL-2 humano sãoinseridos na anulação III do genoma de MVA.

20. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 19, caracterizado pelo fato de que em que a dita condição patológica éinfecção persistente de HPV, uma condição pré-cancerosa ou uma cancerosa.

21. Uso de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelofato de que a dita condição cancerosa associada com HPV é um carcinomacervical, um carcinoma anal ou um câncer oral.

22. Uso de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelofato de que a dita condição pré-cancerosa associada com HPV é umaneoplasia intra-epitelial cervical (CIN) de grau 1, 2 ou 3.

23. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 22, caracterizado pelo fato de que a dita composição é administrada pela viasubcutânea ou intramuscular.

24. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações de 20a 23, caracterizado pelo fato de que a dita composição é administrada emdoses que compreendem de 5x10^5 pfu a 5xl0^7 pfu de vetor de vaccmia.

25. Uso de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelofato de que a dita composição compreende um vetor de MVA como definidona reivindicação 17, 18 ou 19eé administrado em três doses de 5x10^5 pfu a-5x10^7 pfu por via subcutânea em intervalos semanais.