JP2006138776A - 生物学的測定方法 - Google Patents

Abstract

【課題】 生物学的反応を利用しながら、極めて簡便であり、かつ、精度の高い生物学的測定方法を提供する。
【解決手段】 目的とする被検物質と特異的に結合する物質が結合又は吸着した標識粒子と、測定試料とを混合して、測定試料中の被検物質と標識粒子とが結合した反応粒子を生成させる反応工程と、前記反応粒子と、未反応の標識粒子とを性状の違いにより判別し、前記反応粒子のみを捕集するフィルタを用いて反応粒子を捕集する捕集工程と、前記フィルタに捕集された反応粒子を、前記標識粒子の標識をもとに測定する測定工程とを有する生物学的測定方法。
【選択図】 なし

Description

本発明は、生物学的反応を利用しながら、極めて簡便であり、かつ、精度の高い生物学的測定方法に関する。

測定試料中に含有される被検物質を検出する方法としては、例えば、抗原−抗体反応を利用した酵素免疫測定法、蛍光免疫測定法、ラッテクス凝集法、免疫クロマト法等の、生物学的反応を利用した種々の方法が提案されている。なかでも、近年では、簡便かつ迅速であることから、免疫クロマト法が多用されるようになってきている。

免疫クロマト法では、通常、少なくとも２種類の抗体を利用したサンドイッチ法が採用されている。即ち、標識された抗体を含む試薬と測定試料とを反応させ、被検物質と標識抗体とを結合し、これをもう一つの抗体が固定化されたクロマト担体に流すことにより、クロマト担体中に被検物質を捕捉するというものである。このようなサンドイッチ法を採用した免疫クロマト法としては、種々の変法が提案されており、例えば、特許文献１〜６等が開示されている。

このようなサンドイッチ法を採用した免疫クロマト法では、少なくとも２種類以上のモノクローナル抗体が必要であるとともに、その組み合わせが重要である。また、抗体としてポリクローナル抗体を用いる場合には、更にその他に１種類以上のモノクローナル抗体を用いなければならない。このような抗体の組み合わせの選定には、通常、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）を利用して行われるが、多くの組み合わせのなかから最適な組み合わせを選定する作業は煩雑であるうえ、よい組み合わせが見つからない場合には、再度抗体を作製するところから始めなければならないという問題点があった。また、被検物質が、ハプテン等を利用して抗体を作製するような低分子量物質である場合には、サンドイッチ法を適用すること自体が困難であった。

更に、サンドイッチ法を採用した免疫クロマト法では、クロマト担体に固定できる抗体の量自体にも限界があることから、一度に測定可能な測定試料の量にも限界があった。また、担体に結合した抗体量が少ない場合には、測定試料中の被検物質とが接触できる機会が少なくなり、測定感度も減少してしまうという問題点もあった。
このような免疫クロマト法の問題点は、その他の生物学的反応を利用した種々の測定法にも共通するものである。
特開昭６３−１５９７６１ 特開平２−４９１６１ 特表平８−５０８５６９ 特開平１０−７３５９２ 特開平１０−９０２６７

本発明は、上記現状に鑑み、生物学的反応を利用しながら、極めて簡便であり、かつ、精度の高い生物学的測定方法を提供することを目的とする。

本発明は、目的とする被検物質と特異的に結合する物質が結合又は吸着した標識粒子と、測定試料とを混合して、測定試料中の被検物質と標識粒子とが結合した反応粒子を生成さ
せる反応工程と、前記反応粒子と、未反応の標識粒子とを性状の違いにより判別し、前記反応粒子のみを捕集するフィルタにより反応粒子を捕集する捕集工程と、前記フィルタに捕集された反応粒子を、前記標識粒子の標識をもとに測定する測定工程とを有する生物学的測定方法である。
以下に本発明を詳述する。

本発明者らは、鋭意検討の結果、目的とする被検物質と特異的に結合する物質が結合又は吸着した標識粒子と、該標識粒子に被検物質が結合した反応粒子との性状の違いに着目すれば、煩雑なサンドイッチ法によらずとも、容易に反応粒子を選別することができ、この反応粒子に予め標識を付しておけば、この標識をもとに定性的又は定量的な分析が可能であることを見出し、本発明を完成するに至った。

本発明の生物学的測定方法の測定対象となる被検物質としては、生物学的な反応をし得るものであれば特に限定されず、例えば、各種疾病や健康状態等の診断マーカー；農薬や環境ホルモン類等の環境関連物質；食品検査を目的とした化学物質等が挙げられる。なかでも、絨毛性ゴナドトロピン、Ｃ反応性タンパク質、黄体形成ホルモン、成長ホルモン、ガン胎児性抗原、αフェトプロテイン、濾胞刺激ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、黄体形成ホルモン放出ホルモン、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）等の哺乳動物由来のペプチド又はタンパク質；サルモネラ菌、大腸菌、赤痢菌、結核菌等の微生物由来のタンパク質又は微生物菌体自体；ＨＩＶウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、Ｄ型肝炎ウイルス等のウイルス由来のタンパク質又はウイルス粒子自体等の、いわゆる抗原となる物質の検出に本発明の生物学的測定方法は好適に用いることができる。

上記被検物質を含む、本発明の生物学的測定方法の対象となる測定試料としては特に限定されず、例えば、尿、血液、血漿、血清、唾液、乳、汗等の体液及びそれらの分画物等な生体由来の試料；井戸水、地下水、水道水、果汁等の天然由来の試料；土壌、汚泥等を水系媒体で抽出した抽出液；食料品、野菜、肉、卵等の粉砕物を水系媒体に懸濁した試料等が挙げられる。

本発明の生物学的測定方法は、反応工程、捕集工程、及び、測定工程からなる。
上記反応工程においては、目的とする被検物質と特異的に結合する物質が結合又は吸着した標識粒子と、測定試料とを混合して、測定試料中の被検物質と標識粒子とが結合した反応粒子を生成させる。

上記標識粒子としては特に限定されず、例えば、金コロイドやセレニウムコロイド等の金属コロイドを用いることができる。
上記標識粒子は、酵素、色素、蛍光物質、磁性体からなる群より選択される少なくとも１種の標識物質を含有することが好ましい。このような標識物質を含有することにより、後述する測定工程において容易に定性分析又は定量分析を行うことができる。
このような標識物質を含有する標識粒子としては特に限定されず、例えば、酵素を含有する酵素標識粒子、色素を含有する着色粒子、蛍光物質を含有する蛍光粒子、磁性体を含有する磁性体内包粒子等が挙げられる。

上記標識粒子の平均粒子径としては特に限定されないが、好ましい下限は０．０１μｍ、好ましい上限は１０μｍである。０．０１μｍ未満であると、自己凝集しやすくなり水系媒体中に分散させるのが困難となることがあり、１０μｍを超えると、フィルタの透過性が悪くなることがある。より好ましい下限は０．０５μｍ、より好ましい上限は１μｍである。
上記標識粒子の平均粒子径のＣＶ値は、２０％以下であることが好ましい。２０％を超え
ると、定量的な測定を行う場合に誤差を生じることがある。

上記標識粒子には、目的とする被検物質と特異的に結合する物質が結合又は吸着されている。
上記目的とする被検物質と特異的に結合する物質としては、例えば、被検物質が抗原である場合にはこれに対する抗体等が挙げられる。上記抗体としては、モノクローナル抗体であっても、ポリクローナル抗体であってもよく、キメラ抗体、Ｆａｂ抗体、（Ｆａｂ）_２抗体等の形態であってもよい。

上記標識粒子に目的とする被検物質と特異的に結合する物質を結合又は吸着させる方法としては特に限定されず、例えば、標識粒子を構成する樹脂等が官能基を有する場合には、該官能基を介して上記目的とする被検物質と特異的に結合する物質を共有結合する方法等が挙げられる。

上記反応工程においては、測定試料とを混合して、測定試料中の被検物質と標識粒子とが結合した反応粒子を生成させる。このようにして得られた反応粒子は、未反応の標識粒子とは性状の異なるものとなる。例えば、上記標識粒子に目的とする被検物質と特異的に結合する物質としてポリクローナル抗体を用いた場合には、被検物質を中心に標識粒子が凝集し、未反応の標識粒子とは著しく粒子径の異なる反応粒子が生成する。また、被検物質によっては、表面荷電、表面の親水疎水性、後述するフィルタとの親和性等の性状が大きく変化する。

本発明の生物学的測定方法では、次いで、上記反応粒子と未反応の標識粒子とを性状の違いにより判別し、反応粒子のみを捕集するフィルタを用いて反応粒子を捕集する捕集工程を行う。
上記フィルタとしては、水性媒体からなる測定試料が透過可能であるものであれば特に限定されず、例えば、多孔質担体等を用いることができる。上記多孔質担体としては特に限定されず、例えば、セルロース、ニトロセルロース、ガラス繊維、ろ紙、スチロール樹脂、ビニル系樹脂等からなるものが挙げられる。また、上記多孔質担体の水に対する親和性が低い場合には、界面活性剤を用いる等の従来公知の親水化処理を施してもよい。上記フィルタが多孔質担体からなる場合において、連続した同一の多孔質担体を用いてもよいし、異なる材料を用いてもよい。
上記フィルタの形状としては特に限定されないが、例えば、シート状であることが好ましい。

上記フィルタとしては、未反応の標識粒子は捕捉されず移動できるが、被検物質と反応した反応粒子はクロマト的な移動が阻止され、捕捉されるものを用いる。
このような性能を有するフィルタとしては上記反応粒子と未反応の標識粒子との粒子径、表面荷電量、表面の親水疎水性、フィルタとの親和性等の性状の違いに着目して選択すればよい。例えば、性状の違いが粒子径である場合には、フィルタの孔径を調整することにより、このような性能を発揮し得る。即ち、フィルタの孔径を、標識粒子の平均粒子径の１．２〜３．０倍程度に設定した場合には、未反応の標識粒子は捕捉されずにフィルタを通過する一方で、標識粒子が凝集した反応粒子は、フィルタの孔を通過できずにフィルタに捕集される。

本発明の生物学的測定方法においては、捕集工程において前記フィルタに捕集された反応粒子を、上記標識粒子の標識をもとに測定する測定工程を行う。上記標識粒子が酵素、色素、蛍光物質、磁性体等の標識物質を含有する場合には、極めて容易に定性的又は定量的な分析を行うことができる。

本発明の生物学的測定方法は、必要に応じて、上記反応工程後、捕集工程前に、測定試料のフィルタへの導入速度や導入量等を制御する目的で、試料導入量調整工程を有していてもよい。具体的には、例えば、反応工程後の測定試料をガラス繊維、ろ紙、セルロース等からなる上記フィルタよりも測定試料の通過させやすい試料導入材料を通過させること等が挙げられる。

本発明の生物学的測定方法は、必要に応じて、上記反応工程後、捕集工程前に、測定試料を濃縮する目的で、濃縮工程を有していてもよい。濃縮した試料を用いることにより、更に測定感度を向上させることができる。
上記濃縮の方法としては特に限定されず、例えば、上記標識粒子が磁性体を含有する場合には、上記反応粒子も磁性を帯びることから、反応させた溶液を収容する容器の外部より磁場印加手段を適用すれば、反応粒子は容器の内壁に吸着される。測定試料の溶媒（上清）の大部分を除去し、磁場を取り除いた後、微少量の分散媒（例えば、バッファー）等により容器の内壁を洗浄して反応粒子を回収することにより、反応粒子が高度に濃縮された試料を得ることができる。

本発明の生物学的測定方法は、必要に応じて、上記捕集工程後に、過剰の試料を迅速に吸収する目的で吸水工程を有していてもよい。具体的には、例えば、上記フィルタの後ろに、ガラス繊維ろ紙やセルロース等の優れた吸水力及び給水容量を有する吸水物質を設置すること等が挙げられる。

本発明の生物学的測定方法では、抗体等を担体に固相化させる必要がないことから、固相化するための量的な制限を受けず、従来の測定方法よりも、より大量の測定試料を測定することができる。しかも、抗体等は、担体に物理的に拘束されていないので、従来よりも高い反応性で被検物質と反応し得ることから測定感度も向上する。更に、標識粒子に予め適当な標識物質を含有させることにより、フィルタ上に捕集された反応粒子を分析して、容易に被検物質の存在や量を測定することができる。

本発明によれば、生物学的反応を利用しながら、極めて簡便であり、かつ、精度の高い生物学的測定方法を提供することができる。

以下に実施例を掲げて本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例のみに限定されるものではない。

（実施例１）
（１）検出粒子：抗ＨＢｓＡｇモノクローナル抗体結合磁性粒子の作製
磁性粒子（積水化学社製、平均粒径２００ｎｍ）１０ｍｇに１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）９ｍＬを加え、１５０００ＲＰＭにて２０分間遠心分離を行った。得られた沈渣に、１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）に抗ＨＢｓＡｇモノクローナル抗体を０．２ｍｇ／ｍＬの濃度になるように溶解した溶液を１ｍＬ加え、充分に混和して、室温にて１時間撹拌した。
未反応の抗ＨＢｓＡｇモノクローナル抗体を除去するため、１５０００ＲＰＭにて２０分間遠心分離を行い、沈渣を１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）２．５ｍＬに懸濁させ、再度遠心分離を行った。その沈渣を１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に牛血清アルブミンを１％（ｗ／ｖ）の濃度になるように溶解した溶液２．５ｍＬに懸濁させ、室温で１時間撹拌し、ブロッキング処理を行った。その後、１５０００ＲＰＭにて２０分間遠心分離を行い、沈渣を１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に牛血清アルブミンを１％（ｗ／ｖ）の濃度になるように溶解し、更にアジ化ナトリウムを０．０１％（ｗ／ｖ）の
濃度になるように溶解した溶液２ｍＬに懸濁させて検出粒子の懸濁液を調製し、使用までこれを冷蔵保存した。

（２）フィルタ試験片の調製
フィルタとしてニトロセルロースメンブレン（ＧＨＨＦ；孔径３００ｎｍ、日本ミリポア株式会社製）を１×１ｃｍに裁断し、２×２ｃｍの吸水用ろ紙（日本ミリポア株式会社製）の上に重ね、裏から透明なテープで固定してフィルタ試験片とした。

（３）ＨＢｓ抗原の測定
１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に検出粒子を０．１％（ｗ／ｖ）の濃度になるように溶解し、更に牛血清アルブミンを１％（ｗ／ｖ）の濃度になるように溶解し、更にアジ化ナトリウムを０．０１％（ｗ／ｖ）の濃度になるように溶解した溶液を作製し、該溶液１０μＬを９６ウェルマイクロプレート（ナルジェヌンクインターナショナル株式会社製）の各ウェルに添加した。

更に、ＨＢｓ抗原標準品（５０ＩＵ／ｍＬ）を所定の濃度になるように１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）で希釈し、各々５０μＬをウェルに添加混合後、キャピラリーを用いてフィルタ試験片の中央部に滴下した。
２０分後、フィルタ試験片の滴下部位に捕捉された検出粒子数に基づく呈色度合を反射吸光度計で測定した。
測定結果を表１に示した。

表１より、抗原濃度に応じて呈色度、即ち検出粒子数が増大することが確認された。また、測定対象物の濃度と呈色度の関係式から、未知検体の測定対象物濃度の定量が可能であることが示唆された。

本発明によれば、生物学的反応を利用しながら、極めて簡便であり、かつ、精度の高い生物学的測定方法を提供することができる。

Claims (6)

1. 目的とする被検物質と特異的に結合する物質が結合又は吸着した標識粒子と、測定試料とを混合して、測定試料中の被検物質と標識粒子とが結合した反応粒子を生成させる反応工程と、
   前記反応粒子と、未反応の標識粒子とを性状の違いにより判別し、前記反応粒子のみを捕集するフィルタを用いて反応粒子を捕集する捕集工程と、
   前記フィルタに捕集された反応粒子を、前記標識粒子の標識をもとに測定する測定工程とを有する
   ことを特徴とする生物学的測定方法。
2. 目的とする被検物質が抗原であって、前記抗原と特異的に結合する物質が抗体であることを特徴とする請求項１記載の生物学的測定方法。
3. 標識粒子は、酵素、色素、蛍光物質、磁性体からなる群より選択される少なくとも１種の標識物質を含有することを特徴とする請求項１又は２記載の生物学的測定方法。
4. 標識粒子は、平均粒子径が０．０５〜１μｍであることを特徴とする請求項１、２又は３記載の生物学的測定方法。
5. 反応粒子と、未反応の標識粒子との性状の違いが、粒子径の違いであることを特徴とする請求項１、２、３又は４記載の生物学的測定方法。
6. フィルタは、標識粒子の平均粒子径の１．２〜３．０倍の孔径を有することを特徴とする請求項５記載の生物学的測定方法。