KR20190054243A - 노란목도리담비의 개체식별을 위한 마이크로새틀라이트 마커 및 이를 이용한 개체 식별 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 노란목도리담비(Martes flavigula)의 개체를 식별할 수 있는 마이크로새틀라이트 마커 및 이를 이용한 노란목도리담비의 개체식별 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 효과적인 노란목도리담비의 개체식별을 위해 선발된 마이크로새틀라이트 마커 및 이에 특이적인 프라이머를 이용하여 멀티플렉스 PCR을 수행하는 것을 특징으로 하는 노란목도리담비의 개체식별 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 노란목도리담비의 개체식별을 위한 마커 및 이를 이용한 개체식별 방법을 통해 신속하고 효과적으로 노란목도리담비 개체를 식별할 수 있을 뿐만 아니라 혈통분류가 가능하여 DNA 분석을 통해 과학적이고 객관적인 서식실태결과를 도출할 수 있는 효과가 있다.
본 발명에 따른 노란목도리담비의 개체식별을 위한 마커 및 이를 이용한 개체식별 방법을 통해 신속하고 효과적으로 노란목도리담비 개체를 식별할 수 있을 뿐만 아니라 혈통분류가 가능하여 DNA 분석을 통해 과학적이고 객관적인 서식실태결과를 도출할 수 있는 효과가 있다.
Description
본 발명은 국내에 서식하는 노란목도리담비(Martes flavigula)의 개체를 식별할 수 있는 마이크로새틀라이트 마커 및 이를 이용한 노란목도리담비의 개체식별 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 효과적인 노란목도리담비의 개체식별을 위해 선발된 마이크로새틀라이트 마커 및 이에 특이적인 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하는 것을 특징으로 하는 노란목도리담비의 개체 식별 방법에 관한 것이다.
노란목도리담비(The yellow-throated marten, Martes flavigula)는 아프가니스탄 동부에서 러시아 극동 지역에 이르기까지 광범위한 분포를 갖는 중형 육식 동물로, 말레이시아 반도, 수마트라, 자바 및 보르네오까지 남쪽으로 확장하여 서식하고 있다(Corber, 1978; Corbet and Hill, 1992). 남한에서 노란목도리담비는 주로 삼림 지대에 서식하고, 다른 큰 육식 동물이 사라진 이후로 생태계의 매우 중요한 역할을 수행하는 것으로 알려져 있다. 한반도에서 노란목도리담비의 인구 규모는 상대적으로 안정적인 것으로 알려져 있다. 그러나, 노란목도리담비의 서식지 개발과, 이에 따른 먹이부족으로 인하여 번식력의 저하가 발생하는 것으로 추정되고 있으며, 이는 곧 개체 수 감소로 이어져 앞으로 지속적인 생존과 장기적인 종 보존에 부정적 결과가 초래할 것으로 예상된다. 이에 환경부에서는 노란목도리담비를 멸종위기종으로 지정한 바 있으며, 국제환경협약(IUCN)에서도 관심대상(Least Concern) 동물로 지정하여 적극적으로 보호하고 있다.
그러나, 단순히 노란목도리담비의 개별 개체에 대한 위협요인만을 제거해서는 감소하고 있는 개체수의 자연적인 번식이 어렵고, 보다 근원적이고 적극적인 방안의 마련이 필요하며, 이를 위해서는 보호계획의 기초적 자료를 축적하기 위하여 개체군에 대한 조사가 필요하다.
그러나, 상기와 같은 노란목도리담비의 생태학적 중요성에도 불구하고, 유전적인 연구(Jang and Hwang, 2014; Xu et al., 2013)는 미토콘드리아 게놈이나 종간 계통발생관계(Hosoda et al., 2011) 등에 대하여 제한적으로 이루어졌고, 그 외에는 대부분이 배설물의 분석이나 지역적 분포에 관한 조사에 치우쳐 있으며, 노란목도리담비 개체군의 보전 및 관리를 위한 과학적 자료를 제공하지 못하고 있었다.
이와 같이 노란목도리담비의 생태에 관한 연구가 빈약하고, 노란목도리담비의 서식지 환경을 파악하지 못하는 상황에서 아직까지 노란목도리담비의 보호와 종 보존에 제대로 대처하지 못하고 있는 실정이다. 또한, 지금까지 유전적 다양성과 인구 구조를 이해하기 위한 집단 수준의 연구(population level study)는 수행된 바 없고, 특히, 집단 유전 분석을 위해 빈번하게 사용되는 마이크로세틀라이트와 관련된 연구는 수행된 바 없었다.
이에, 본 발명자들은 먼저 지노믹 DNA 서열을 이용하여 노란목도리담비(Martes flavigula)에 대한 새로운 다형성 마이크로새틀라이트(microsatellite) 마커를 발굴하고, 이를 통해 유전자형 분석(genotyping)의 시간과 비용을 줄일 수 있는 다중 패널을 개발함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 주된 목적은 유전자분석을 통한 흔적조사방식과 조사자의 지식과 경험에 의하여 조사결과가 도출되는 기존의 조사방식에서 탈피하여, 노란목도리담비 개체에 대한 직접적인 접촉 없이 서식지 현장에서 야생동물의 유전자가 포함된 시료를 채집하고, 이것의 DNA 분석을 통해 과학적이고 객관적인 서식실태결과를 도출할 수 있는 노란목도리담비(Martes flavigula)의 개체 식별을 위한 마이크로새틀라이트 마커를 제공하는 데 있다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 야생동물의 시료를 분석하여 노란목도리담비의 개체식별을 할 수 있는 마커를 이용한 개체 식별 방법을 제공하는데 있다.
본 발명자들은 국내에 서식하고 있는 노란목도리담비(Martes flavigula)를 대상으로 마이크로새틀라이트 마커를 이용한 대립유전자형 분석에 관한 방법을 연구하던 중, 노란목도리담비에 적용 가능한 마이크로새틀라이트 마커를 선발하고 이에 특이적인 프라이머를 이용하여 멀티플렉스 PCR을 수행하면 신속하고 효과적으로 노란목도리담비 개체를 식별할 수 있음을 발견하였다.
본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 MF305, MF304, MF380, MF385, MF360, MF392, MF337, MF326, MF389, MF341, MF334, MF339, MF394, MF303, MF388, MF393, MF327, MF358, MF227, MF237, MF264, MF233, MF241, MF259, MF239, MF238, MF225, MF258, MF242, MF243, MF236, MF224, 및 MF223 마이크로새틀라이트로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 1종 이상의 노란목도리담비(Martes flavigula)의 개체 식별을 위한 마이크로새틀라이트 마커를 제공한다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 마이크로새틀라이트 마커에 특이적인 서열번호 1 및 2, 3 및 4, 5 및 6, 7 및 8, 9 및 10, 11 및 12, 13 및 14, 15 및 16, 17 및 18, 19 및 20, 21 및 22, 23 및 24 및, 25 및 26, 27 및 28, 29 및 30, 31 및 32, 33 및 34 및, 35 및 36, 37 및 38, 39 및 40, 41 및 42, 43 및 44 및, 45 및 46, 47 및 48, 49 및 50, 51 및 52, 53 및 54 및, 55 및 56, 57 및 58, 59 및 60, 61 및 62, 63 및 64 및, 그리고, 65 및 66의 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머 쌍으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 한 쌍 이상의 프라이머 세트를 제공한다.
본 발명에서, 상기 정방향 프라이머에는 상기 정방향 프라이머의 5' 말단에는 서열번호 67의 염기(5'-GGATAACAATTTCACACAGG-3') 또는 서열번호 68의 염기(5'-TGACCGGCAGCAAAATTG-3')가 추가되는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는 노란목도리담비(Martes flavigula) 개체 식별용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 분석하고자 하는 핵산 시료를 MF305, MF304, MF380, MF385, MF360, MF392, MF337, MF326, MF389, MF341, MF334, MF339, MF394, MF303, MF388, MF393, MF327, MF358, MF227, MF237, MF264, MF233, MF241, MF259, MF239, MF238, MF225, MF258, MF242, MF243, MF236, MF224, 및 MF223 마이크로새틀라이트로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 1종 이상의 마이크로새틀라이트 마커에 특이적인 프라이머를 이용하여 PCR로 증폭하는 단계; 및 (b) 상기 (a) 단계에서 증폭된 산물을 전기영동장치를 통해 검출하여 대립유전자(allele)를 검출하고 유전자형을 결정하는 단계를 포함하는 노란목도리담비(Martes flavigula) 개체의 식별 방법을 제공한다.
본 발명의 노란목도리담비(Martes flavigula) 개체의 식별 방법에서, 상기 (a) 단계의 프라이머는 서열번호 1 및 2, 3 및 4, 5 및 6, 7 및 8, 9 및 10, 11 및 12, 13 및 14, 15 및 16, 17 및 18, 19 및 20, 21 및 22, 23 및 24 및, 25 및 26, 27 및 28, 29 및 30, 31 및 32, 33 및 34 및, 35 및 36, 37 및 38, 39 및 40, 41 및 42, 43 및 44 및, 45 및 46, 47 및 48, 49 및 50, 51 및 52, 53 및 54 및, 55 및 56, 57 및 58, 59 및 60, 61 및 62, 63 및 64, 그리고, 65 및 66의 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머 쌍으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 1쌍 이상의 프라이머인 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명의 노란목도리담비(Martes flavigula) 개체의 식별 방법에서, 상기 정방향 프라이머의 5' 말단에는 서열번호 67의 염기(5'-GGATAACAATTTCACACAGG-3') 또는 서열번호 68의 염기(5'-TGACCGGCAGCAAAATTG-3')가 추가되는 것을 특징으로 한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명하기로 한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "마이크로새틀라이트(Microsatellite)"란 진핵세포(eukaryotes) 유전자 전역에 걸쳐 분포하는 ‘모노-’, ‘디-’, ‘트리-’ 및 ‘테트라-’ 뉴클레오타이드 형태의 짧은 반복 염기서열을 의미한다. 일반적으로 이러한 반복 서열은 염색체 내에서 10 내지 40 번 정도 단순반복(tandem repeat)된 형태로 존재한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "마이크로새틀라이트 마커"란 마이크로새틀라이트를 이용한 DNA 다형 검출 마커를 의미한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "DNA 다형(Polymorphism)"이란 동일종간 생물개체의 특이적 DNA 구조의 다양성을 말한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "프라이머"는 본 발명에서 선발한 마이크로새틀라이트의 핵산서열을 특이적으로 증폭할 수 있는 올리고뉴클레오타이드(oligonucle tide)를 의미하는 것으로, 본 발명에서 선발한 마이크로새틀라이트 마커의 핵산서열을 증폭할 수 있는 것이라면 당업자가 디자인할 수 있는 모든 프라이머가 이에 해당된다.
본 명세서에서 사용된 용어 "PCR 반응 혼합물"이란 DNA 폴리머라제 및 완충용액을 포함하여 PCR를 수행하기 위해 사용되는 분자생물학적 시약(molecular biological reagent)을 의미한다.
본 발명자들은 국내 서식 중인 노란목도리담비(Martes flavigula)의 개체 식별용 마이크로새틀라이트 마커를 찾기 위해서 국내에서 수집된 노란목도리담비(Martes flavigula) 29개체에서 수집된 지노믹 DNA를 기반으로 DNA 라이브러리(Illumina compatibility DNA library)를 제작한 후, 노란목도리담비의 다형성 분석용 마이크로새틀라이트에 대하여 프라이머를 제작하고, 이를 통해 총 179개의 마이크로새틀라이트 후보 유전자 좌(DNA loci)를 다형성의 초기 스크리닝을 위해 선택하였다.
시험 된 유전자 좌위를 29개의 개체에 대하여 형광 표지 된 프라이머를 사용하여 유전자 분석을 수행한 결과, 노란목도리담비 종에서 처음으로 34개의 새로운 마이크로새틀라이트 마커를 제시하고, 4개의 PCR 다중 반응 패널을 디자인하였으며, MF305, MF304, MF380, MF385, MF360, MF392, MF337, MF326, MF389, MF341, MF334, MF339, MF394, MF303, MF388, MF393, MF327, MF358, MF227, MF237, MF264, MF233, MF241, MF259, MF239, MF238, MF225, MF258, MF242, MF243, MF236, MF224, 및 MF223의 33종의 마이크로새틀라이트가 노란목도리담비의 DNA와 매칭함을 발견하였다.
따라서 본 발명의 노란목도리담비의 개체 식별을 위한 마커는 MF305, MF304, MF380, MF385, MF360, MF392, MF337, MF326, MF389, MF341, MF334, MF339, MF394, MF303, MF388, MF393, MF327, MF358, MF227, MF237, MF264, MF233, MF241, MF259, MF239, MF238, MF225, MF258, MF242, MF243, MF236, MF224, 및 MF223 마이크로새틀라이트로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 1종 이상의 마이크로새틀라이트 마커이다.
또한 본 발명은 상기 33종의 마이크로새틀라이트 마커에 특이적인 프라이머 쌍들로 구성된 그룹으로부터 선택되는 1쌍 이상의 프라이머 세트를 제공한다. 상기 마이크로새틀라이트 마커에 특이적인 프라이머로는 마이크로새틀라이트 DNA의 5' 또는 3' 부위에 인접한 50 내지 300 bp 부위에 위치한 10 내지 50 bp의 연속된 각 폴리뉴클레오타이드를 포함할 수 있다.
바람직하게는 상기 프라이머 세트는 1 및 2, 3 및 4, 5 및 6, 7 및 8, 9 및 10, 11 및 12, 13 및 14, 15 및 16, 17 및 18, 19 및 20, 21 및 22, 23 및 24 및, 25 및 26, 27 및 28, 29 및 30, 31 및 32, 33 및 34 및, 35 및 36, 37 및 38, 39 및 40, 41 및 42, 43 및 44 및, 45 및 46, 47 및 48, 49 및 50, 51 및 52, 53 및 54 및, 55 및 56, 57 및 58, 59 및 60, 61 및 62, 63 및 64, 그리고, 65 및 66의 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머 쌍으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 1쌍 이상의 프라이머 세트이다.
본 발명의 상기 정방향 프라이머의 5' 말단에는 서열번호 67의 염기(5'-GGATAACAATTTCACACAGG-3') 또는 서열번호 68의 염기(5'-TGACCGGCAGCAAAATTG-3')가 추가된 것일 수 있다.
상기 프라이머의 염기서열의 일부를 다른 염기로 치환, 삭제하거나 일부 염기서열의 위치와 방향이 바뀐 염기서열도 본 발명에 따른 프라이머의 범위에 속한다.
상기 정방향 프라이머의 5' 말단에 서열번호 67 또는 서열번호 68의 특정 염기서열 추가는 스터터 밴드(stutter band)로 인한 증폭산물의 분석 오류를 제거함으로써 신속하고 효과적으로 노란목도리담비 개체를 식별할 수 있도록 해준다.
멀티플렉스 PCR의 경우 PCR 증폭시 여러 개의 프라이머가 사용되므로 각각의 프라이머가 증폭될 때 서로 간에 간섭이 발생하여 각각의 프라이머가 완전하게 아데노신을 합성할 수 없게 하여 완전한 스터터 밴드를 제거한 증폭산물을 획득하기가 어렵다. 그로 인해 개체식별을 위한 유전자형의 결정 단계에서 오류가 발생할 수 있으며, 이 단계에서 오류는 개체식별의 의미를 퇴색시키는 결과를 가져오게 된다.
이에 본 발명자들은 이러한 오류를 최소화하기 위해 상기 마이크로새틀라이트 마커에 특이적인 프라이머 중 정방향 프라이머의 5' 말단에 서열번호 67의 염기서열(5'-GGATAACAATTTCACACAGG-3') 또는 서열번호 68의 염기(5'-TGACCGGCAGCAAAATTG-3')를 추가하였다. 이와 같이 특정 염기서열을 포함한 정방향 프라이머를 사용하는 경우, 피크모양이 안정적이며 스터터 밴드(stutter band)가 제거되어 유전자형 결정에 적합한 모양을 나타낸다.
유전자형 결정시 전기영동상의 피크 값 0.1 차이로 다른 유전자형을 가질 수 있는데 이때 전기영동상의 피크 면적은 유전자형을 결정하는 피크 값에 영향을 미치기 때문에 이는 개체의 고유한 유전자형이 실험 단계에서의 오류로 변형될 수 있다는 것을 의미한다.
본 발명에서는 정방향 프라이머의 5' 말단에 서열번호 67의 염기서열(5'-GGATAACAATTTCACACAGG-3') 또는 서열번호 68의 염기서열(5'-TGACCGGCAGCAAAATTG-3')을 추가함으로써 이러한 오류를 최소화한 것이다.
또한, 본 발명의 프라이머는 생물학적 분석용 형광물질로 표지될 수 있다. 예를 들면 FAM, VIC, NED, PET 등으로 표지될 수 있으나 이에 한정되지는 않는다.
다른 관점에서 본 발명은 노란목도리담비의 개체 식별용 키트를 제공하는데, 상기 키트에는 MF305, MF304, MF380, MF385, MF360, MF392, MF337, MF326, MF389, MF341, MF334, MF339, MF394, MF303, MF388, MF393, MF327, MF358, MF227, MF237, MF264, MF233, MF241, MF259, MF239, MF238, MF225, MF258, MF242, MF243, MF236, MF224, 및 MF223 마이크로새틀라이트 마커에 특이적인 프라이머 세트가 포함된다. 바람직하게는 상기 프라이머 세트는 서열번호 1 및 2, 3 및 4, 5 및 6, 7 및 8, 9 및 10, 11 및 12, 13 및 14, 15 및 16, 17 및 18, 19 및 20, 21 및 22, 23 및 24 및, 25 및 26, 27 및 28, 29 및 30, 31 및 32, 33 및 34 및, 35 및 36, 37 및 38, 39 및 40, 41 및 42, 43 및 44 및, 45 및 46, 47 및 48, 49 및 50, 51 및 52, 53 및 54 및, 55 및 56, 57 및 58, 59 및 60, 61 및 62, 63 및 64, 그리고, 65 및 66의 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머 쌍으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 한 쌍 이상의 프라이머 세트이며, 더욱 바람직하게는 상기 정방향 프라이머의 5`말단에 서열번호 67의 염기서열(5'-GGATAACAATTTCACACAGG-3') 또는 서열번호 68의 염기서열(5'-TGACCGGCAGCAAAATTG-3')이 추가된다.
또 다른 관점에서 본 발명은 (a) 분석하고자 하는 핵산 시료를 MF305, MF304, MF380, MF385, MF360, MF392, MF337, MF326, MF389, MF341, MF334, MF339, MF394, MF303, MF388, MF393, MF327, MF358, MF227, MF237, MF264, MF233, MF241, MF259, MF239, MF238, MF225, MF258, MF242, MF243, MF236, MF224, 및 MF223 마이크로새틀라이트로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 1종 이상의 마이크로새틀라이트 마커에 특이적인 프라이머를 이용하여 PCR로 증폭하는 단계; 및 (b) 상기 (a) 단계에서 증폭된 산물을 전기영동장치를 통해 검출하여 대립유전자(allele)를 검출하고 유전자형을 결정하는 단계를 포함하는 노란목도리담비(Martes flavigula) 개체의 식별 방법을 제공한다.
바람직하게는 상기 (a) 단계의 프라이머는 서열번호 1 및 2, 3 및 4, 5 및 6, 7 및 8, 9 및 10, 11 및 12, 13 및 14, 15 및 16, 17 및 18, 19 및 20, 21 및 22, 23 및 24 및, 25 및 26, 27 및 28, 29 및 30, 31 및 32, 33 및 34 및, 35 및 36, 37 및 38, 39 및 40, 41 및 42, 43 및 44 및, 45 및 46, 47 및 48, 49 및 50, 51 및 52, 53 및 54 및, 55 및 56, 57 및 58, 59 및 60, 61 및 62, 63 및 64, 그리고, 65 및 66의 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머 쌍으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 1쌍 이상의 프라이머 세트이다. 더욱 바람직하게는 상기 정방향 프라이머에는 5`말단에 서열번호 67의 염기서열(5'-GGATAACAATTTCACACAGG-3') 또는 서열번호 68의 염기서열(5'-TGACCGGCAGCAAAATTG-3')이 추가된다.
상기 (a) 단계에서 분석하고자 하는 핵산 시료는 생물학적 시료로부터 분리될 수 있다. 상기 생물학적 시료로는 혈액, 근육조직 및 생물학적 기원의 기타 액상 샘플, 생검 표본, 모발, 모근, 조직 배양과 같은 고형 조직 샘플 또는 이로부터 유래된 세포 및 그 자손이 포함된다. 또한, 상기 샘플들은 시약처리, 가용화된 샘플 또는 배양세포, 세포 상등액 및 세포 용해물도 포함한다.
상술한 생물학적 시료로부터의 핵산의 분리는 당업계에 공지된 방법에 따라 수행할 수 있으며, 본 발명의 일 실시예에서와 같이 시판되는 게놈 DNA 추출 키트를 사용하여 분리하는 것도 가능하다.
상기 (a) 단계에서의 멀티플렉스 PCR은 당업계에 공지된 방법에 따라 각 유전자를 증폭하기에 적합한 조건으로 수행될 수 있고, 어닐링(Annealing) 온도, 증폭산물의 크기 등을 고려하여 수행할 수 있다. 예를 들면 본 발명의 일 실시예에서는 터치다운 PCR 방식으로 수행하였는데, 터치다운 PCR 파라미터(touchdown PCR parameters)는 초기 변성 단계 95℃에서 5분을 처리한 후, 95℃에서 30초, 초기 60℃에서 30초(어닐링 온도는 사이클이 진행됨에 따라 각 1℃ 감소), 및 72℃에서 30초를 1사이클로 하여 첫 10회를 반복하였고, 이후 25회는 95℃ 30초, 55℃ 30초, 및 72℃ 30초 조건으로 수행한 다음 65℃에서 30분간 신장(extension)하고 4℃에서 종료하였다.
상기 (b) 단계에서의 증폭된 PCR 산물의 크기 분석은 증폭된 산물을 자동 유전자 분석 장비를 이용하여 분리하고, 각 좌위별 대립유전자(allele)의 크기를 분석함으로써 수행할 수 있다. 예를 들면, 증폭 산물의 크기는 통상의 방법, 예컨대 아가로즈 젤 또는 아크릴아마이드 젤을 이용한 전기영동으로 실시한 후, 전개된 DNA 단편을 형광 염색 등을 하여 확인가능하다. 예를 들면 Applied Biosystems 사의 염기 서열 분석 장치에 대립유전자분석 모드를 이용하여 전기영동을 실시해 프라이머의 형광물질 및 PCR 산물의 크기별로 분류하는 방법을 통하여 확인할 수 있다. 상기 단계에서의 PCR 산물의 크기 분석 방법은 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자라면 용이하게 실시가능하며, 상기 일예로 설명한 방법 이외에 통상의 모든 방법으로 수행할 수 있다.
이상 설명한 바와 같이, 본 발명에 따른 노란목도리담비의 개체식별을 위한 마이크로새틀라이트 마커 및 이를 이용한 개체 식별 방법은 신속하고 효과적으로 노란목도리담비의 개체를 식별할 수 있을 뿐만 아니라 혈통분류가 가능하여 DNA 분석을 통해 과학적이고 객관적인 서식실태결과를 도출할 수 있는 효과가 있다.
도 1은 노란목도리담비 28개체로부터 채취한 시료를 본 발명의 실시예에 따른 서열번호 63 및 서열번호 64의 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머 쌍으로 시퀀싱하여 나타난 마이크로세틀라이트 유전자 좌위 MF224의 PCR 사진이다.
도 2는 노란목도리담비 28개체로부터 채취한 시료를 본 발명의 실시예에 따른 하기 표 4의 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머 쌍으로 시퀀싱하여 나타난 마이크로세틀라이트 유전자 좌위 MF238(파랑), MF242(초록), MF223(빨강), MF236(검정), MF225(파랑), MF243(초록), MF224(검정), MF258(파랑)의 PCR 사진이다.
도 2는 노란목도리담비 28개체로부터 채취한 시료를 본 발명의 실시예에 따른 하기 표 4의 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머 쌍으로 시퀀싱하여 나타난 마이크로세틀라이트 유전자 좌위 MF238(파랑), MF242(초록), MF223(빨강), MF236(검정), MF225(파랑), MF243(초록), MF224(검정), MF258(파랑)의 PCR 사진이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.
실시예 1. DNA 추출 및 서열분석
노란목도리담비(N = 28 개체) 개체는 한국의 여러 지역에서 수집되었으며, 모든 샘플은 -70℃의 냉동고에서 보존되었다.
28 개체 중 2개체(IN590 및 IN592)에서 샘플을 채취하여 차세대 시퀀싱 분석을 수행하였다. 2개체의 샘플에서 제조원의 프로토콜에 따라 DNeasy Blood & Tissue kit(Qiagen, Valencia, CA, USA)를 사용하여 총 게놈 DNA를 추출하였다. 지노믹 DNA 라이브러리는 NEXT flex Rapid DNA-seq 키트(Bioo Scientific Cor. Austin, TX, USA)를 사용하여 제작하였다. DNA 전단(shearing)은 Q-Sonica 800(QSonica, Newtown, CT, USA)에 의해 500 bp 이하의 스팬 크기(span size)에 대한 장비 안내서의 프로토콜에 따라 수행되었다.
전단된 DNA는 다음의 효소 반응에 의해 제조되었다. 블런트-끝단(Blunt-end)을 리페어하고, 3' 끝단을 아데닐화(adenylated) 한 후, 멀티 플렉스 호환 어댑터(multiplex compatible adapters)와 연결하여 일루미나 호환 DNA 라이브러리(Illumina compatibility DNA library)를 제작하였다.
Agencourt AMPure XP SPRI 비즈(beads)로 300 내지 600bp 크기의 단편을 선택하였다. 이 후, PCR 장비(Bioo Scientific Corp., Austin, TX, USA)를 이용하여 양 말단에 어댑터를 갖는 DNA를 선택적으로 증폭시켰다.
라이브러리 검증은 Agilent 2100 Bioanalyzer 분석기(Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA)를 사용하였고, Quant-iT Picogreen dsDNA HS 분석 키트(Invitrogen, CA, USA) 및 KAPA SYBR FAST qPCR 키트(KAPA Biosystmes, Woburn, MA, USA)로 정량하였다.
시퀀싱을 위해 각 라이브러리의 등몰량(Equimolar amounts)을 10nM으로 채취하였다.
대용량 처리 시퀀싱(High-throughput sequencing)은 서울대학교 농생명과학공동기기원(NICEM)의 게놈 분석 센터에서 Illumina HiSeq 2500 플랫폼(Illumina Inc., Sang Diego, CA, USA)을 사용하였고, 실행 모드는 Rapid Pair End 250 사이클이었다.
실시예 2. 지노믹 DNA 서열 분석 및 프라이머 디자인
상기 실시예 1의 DNA 추출 및 서열분석을 통해 샘플에서 각각 42Gb 및 21Gb의 지노믹 DNA를 얻었다.
모든 쌍말단 서열(paired-end sequences)은 싱글 리드((single)^1read)를 만들기 위해 PEAR v0.9.6(Zhang et al., 2014)을 이용하여 평가하였다. 신규 조합(De novo assembly)은 CLC Genomics Workbench(CLCBio) v10.0.0.1 (https://www.qiagenbioinformatics.com)을 이용하여 수행하였다.
2 내지 4 bp 사이즈를 갖는 적어도 4회 반복의 종렬 반복(tandem repeat) 조건을 이용하여 조합되지 않은 싱글톤 리드(singleton reads)를 마이크로새틀라이트 동정에 사용하였다. Primer 3(Rozen and Skaletsky, 2000)을 이용하여 마이크로새틀라이트 후보 마커의 측면 부위에 대한 프라이머를 디자인하였다.
실시예 3. 마이크로새틀라이트 마커의 특성 및 유효성 검증
노란목도리담비의 3개체의 gDNA를 주형으로 하여 상기 실시예 2에서 디자인한 프라이머를 사용하여 PCR 반응을 수행하였다. 다형성의 초기 스크리닝을 위해, 총 179개의 마이크로새틀라이트 후보 유전자 좌(DNA loci)가 선택되었다.
모든 정방향 프라이머는 5'말단에서 6-FAM 라벨된 M13 (5'-GGATAACAATTTCACACAGG-3') 또는 VIC 라벨된 Hill(5'-TGACCGGCAGCAAAATTG-3')로 표지되었다. 상기 스크리닝을 위해서, 10X PCR 완충액, 2.5mM MgCl2, 100uM dNTP, 5' 말단에 M13 또는 Hill로 라벨된 0.04uM 정방향 프라이머, 역방향 프라이머 0.2μM, 각 형광염료 0.2μM, i-start Taq DNA 중합효소 1U 및 20ng의 지노믹 DNA를 포함하는 반응 혼합액 20ul로 PCR 반응을 수행하였다.
PCR 조건은 95℃에서 5분간 처리한 후 95℃에서 1분, 60~51℃에서 1분(어닐링 온도는 사이클이 진행됨에 따라 각 1℃ 감소), 72℃에서 1분을 1사이클로 하여 첫 10회를 반복하였다. 그 후 72℃에서 5분간 신장시킨 후 4℃에서 종료하였고, 이 후 나머지 15사이클의 어닐링 온도는 50℃로 하여 상기 조건과 동일하게 수행하였다. 모든 프라이머 세트를 GeneScan-LIZ500(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)을 사용하여 크기 표준으로 분석하고 Geneious Pro v8.1.9(Biomatters, www.geneious.com, Kearse et al., 2012)로 분석하였다. 필요한 경우, 정확하게 반복하는 모티프(repetitive motif)를 확인하기 위해 PCR 산물을 직접 시퀀싱 하였다. 이러한 시퀀싱은 BigDye Terminator v3.1 Cycle sequencing kit(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)와 ABI 3730xl DNA Analyzer(Applied Biosystems, Foster, CA, USA)를 사용하였다. 생성된 염기서열의 반복적인 모티프 및/또는 프라이머 부위의 돌연변이의 존재 여부에 대해 Genious Pro v8.1.9(Kearse et al., 2012)를 사용하여 조사하였다.
상기와 같은 생물 정보학 도구를 사용하여 후보 마이크로새틀라이트 모티프를 포함하는 총 887 개의 contig(Di : 451, Tri : 156, Tetra : 280)를 얻었다. 이 중 tri-motif와 tetra-motif로 구성된 179 개의 프라이머 쌍을 심플렉스 PCR 반응에서 무작위로 검사하여 예상 크기의 PCR 산물로 73개의 프라이머 쌍으로 구성된 PCR 산물을 획득하였다. 73개의 프라이머 쌍 중 45개의 유전자 좌위는 다형성(polymorphic)이었고, 단일형(monomorphic)인 28 개의 유전자 좌위는 추가 특성분석 과정에서 제외되었다.
결국, 다형성의 정도, 초기 및 다중화 반응 결과의 비교를 이용한 강도 및 일관성에 기초하여 4개의 다중 패널(표 1 내지 4 참고)에 대해 34개의 신규한 마이크로세틀라이트 유전자 좌위가 선택되었다. 하기 표 [1] 내지 [4]에 각각의 좌위의 자세한 정보를 표시하였다.
각 유전자좌위에서 추정되는 단편 크기는 본 발명에서 사용 된 프라이머 테일 서열을 포함하여 169 내지 358bp 사이로 나타났다.
실시예 4. 단편 분석 및 집단 유전학
예비 스크리닝 후, 시험 된 유전자 좌위를 29개의 개체에 대하여 형광 표지 된 프라이머를 사용하여 유전자 분석을 수행하였다. 각각의 정방향 프라이머는 5'범용 프라이머 서열 테일(6-FAM : M13, 5'-GGATAACAATTTCACACAGG-3', VIC : Hill, 5'-TGACCGGCAGCAAAATTG-3 ', NED : T3, 5'-AATTAACCCTCTAAAGGG-3' 또는 PET : 네오 마이신, 5'-AGGTGAGATGACAGGAGATC-3 ', Applied Biosystems)에 연결되었다.
본 발명자들은 34개의 마이크로새틀라이트 위치에 4개의 멀티플렉스 패널을 설계하였다. 멀티플랙스 PCR 증폭은 Multiplex PCR Master Mix(2X)(HotStarTaq Plus DNA Polymerase, Multiplex PCR Buffer, 3mM MgCl2 포함) 5㎖를 포함하는 반응 볼륨 50㎕에서 Multiplex PCR Master Mix(Qiagen, Valencia, CA, USA)를 이용하여 0.05 내지 0.4mM 프라이머, 1ml의 지노믹 DNA(10ng) 및 RNase 프리 증류수와 함께 수행되었다. 터치다운 PCR 파라미터(touchdown PCR parameters)는 초기 변성 단계 95℃에서 5분을 처리한 후, 95℃에서 30초, 초기 60℃에서 30초(어닐링 온도는 사이클이 진행됨에 따라 각 1℃ 감소), 및 72℃에서 30초를 1사이클로 하여 첫 10회를 반복하였고, 이후 25회는 95℃ 30초, 55℃ 30초, 및 72℃ 30초 조건으로 수행하였다. 각 패널을 ABI 3730xl 시퀀서(Applied Biosystems, Foster, CA, USA)에서 실행하였고, GeneScan-LIZ500(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)으로 길이를 측정하였다. 대립 유전자 크기는 Geneious Pro v8.1.9(Kearse et al., 2012)를 사용하여 측정하였다. 각 마이크로새틀라이트 위치에 대해 Micro-Checker ver.2.2.3(Van Oosterhout et al., 2004)을 사용하여 무효대립인자(null alleles), 대규모 대립형질 탈락(large allele dropout) 및 스코어링 정확도를 저해하는 장애(stuttering)를 평가하였다. 웹상의 Genepop v4.2(Rousset 2008) 프로그램을 각 유전자 좌위에서의 하디-바인베르그 평형(Hardy-Weinberg equilibrium)과 유전자 좌위 쌍 사이의 연관 불균형(linkage disequilibrium)에 대한 이탈을 감지하는데 사용하였다. 노란목도리담비 집단에 대한 마이크로새틀라이트의 변이를 추정하기 위해, 모집단의 대립 유전자 수(NA: number of alleles), 다형성 정보 함량(PIC, polymorphism information content), 고정 지수(FIS: fixation index), 및 관측 또는 기대 이형접합율(observed(HO)/ expected(HE) heterozygosity)을 FSTAT(Goudet, 1995) 및 Excel Microsatellite Toolkit(Park 2001)을 이용하여 측정하였다.
그 결과, 33개의 다형성 마이크로새틀라이트를 동정하였고, 각각의 마이크로새틀라이트의 특성을 하기 [표 5]에 정리하였다.
상기 [표 5]에서 약어 N은 유전형 분석된 노란목도리담비 개체수를, NA는 대립형질의 수를, FIS는 근교 계수(inbreeding coefficient)를, HO는 관측이형접합율(Objectived Heterozygosity)을, HE는 기대이형접합율(Expected Heterozygosity)을 각각 의미하고, PIC(polymorphism information content)는 다형성 정보 함량을 의미하며, pHWD(p-vaule for Hardy-Weinberg equilibrium test)는 하디 바인베르크 평형 테스트 기대 값에 대한 p-value를 의미한다.
상기 [표 5]에서 나타난 바와 같이, 33개의 마이크로세틀라이트 좌위는 다형성을 나타내고 있다. 분석에 사용된 프라이머 테일 서열까지 포함하여 측정된 각각의 좌위에 대한 단편 사이즈는 169bp 내지 358bp로 나타났다.
대립 형질수는 2(MF337, MF326, MF264, MF242, MF237, MF233, MF227) 내지 9(MF327, MF259) 사이에서 관찰되었고, 평균수는 4.3으로 나타났다. 각각의 좌위에 대한 PIC(polymorphism information content) 값은 0.149(MF233) 내지 0.836(MF327) 사이에서 관측되었고, 관측이형접합율(Objectived Heterozygosity)(HO)은 0.107(MF233)에서 0.821(MF339)로, 기대이형접합율(Expected Heterozygosity)(HE)은 0.166(MF233)에서 0.869(MF327) 사이에서 관측되었다. 하디 바인베르크 평형으로부터의 상당히 벗어나는 편차는 33개의 유전자 좌위 중 8개(MF392, MF380, MF334, MF305, MF303, MF242, MF238 및 MF236) 좌위에서 검출되었다. 또한, 전체 528 쌍의 유전자위 간의 비교에서 32쌍의 연관 불균형(linkage disequilibrium)이 관찰되었다.
상기와 같은 결과를 통해, 본 발명의 마이크로새틀라이트 마커를 이용하면 국내 서식 중인 노란목도리 담비의 개체를 효과적으로 식별할 수 있음을 확인할 수 있었다.
본 발명에서는 차세대 시퀀싱 방식에 적용하여 노란목도리담비 종에서 처음으로 33개의 새로운 다형성 마이크로새틀라이트 마커를 제시하였고, 마이크로새틀라이트 마커를 검출할 수 있는 33쌍의 프라이머를 디자인하였다.
향후, 본 발명에서 발굴한 마커는 노란목도리 담비의 유전적 변이 및 개체군에 대한 연구뿐만 아니라, 비침습적 샘플링을 이용한 노란목도리 담비의 현장 외 보전과 생태 모니터링을 통한 노란목도리 담비의 효율적인 관리에도 적용될 수 있을 것으로 사료된다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> National Institute of Biological Resources
NATIONAL INSTITUTE OF ECOLOGY
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agggaacaag cttccagtat tt 22
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<210> 62
<211> 22
<212> DNA
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taggaccatc tagctccaca gt 22
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<211> 22
<212> DNA
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<223> Primer sequence
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tcatataaat tggttaagcg gc 22
<210> 64
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Primer sequence
<400> 64
taactaccca tagcttgcca tt 22
<210> 65
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Primer sequence
<400> 65
cccaccttgc aaaataaaat aa 22
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<400> 66
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer sequence tail
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer sequence tail
<400> 68
tgaccggcag caaaattg 18
Claims (7)
- MF305, MF304, MF380, MF385, MF360, MF392, MF337, MF326, MF389, MF341, MF334, MF339, MF394, MF303, MF388, MF393, MF327, MF358, MF227, MF237, MF264, MF233, MF241, MF259, MF239, MF238, MF225, MF258, MF242, MF243, MF236, MF224, 및 MF223 마이크로새틀라이트로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 1종 이상의 노란목도리담비(Martes flavigula)의 개체 식별을 위한 마이크로새틀라이트 마커.
- 제1항의 마이크로새틀라이트 마커에 특이적인 서열번호 1 및 2, 3 및 4, 5 및 6, 7 및 8, 9 및 10, 11 및 12, 13 및 14, 15 및 16, 17 및 18, 19 및 20, 21 및 22, 23 및 24 및, 25 및 26, 27 및 28, 29 및 30, 31 및 32, 33 및 34 및, 35 및 36, 37 및 38, 39 및 40, 41 및 42, 43 및 44 및, 45 및 46, 47 및 48, 49 및 50, 51 및 52, 53 및 54 및, 55 및 56, 57 및 58, 59 및 60, 61 및 62, 63 및 64, 그리고, 65 및 66의 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머 쌍으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 한 쌍 이상의 프라이머 세트.
- 제2항에 있어서,
상기 정방향 프라이머의 5' 말단에는 서열번호 67의 염기(5'-GGATAACAATTTCACACAGG-3') 또는 서열번호 68의 염기(5'-TGACCGGCAGCAAAATTG-3')가 추가되는 것을 특징으로 하는 프라이머 세트. - 제2항 또는 제3항의 프라이머 세트를 포함하는 노란목도리담비(Martes flavigula) 개체 식별용 키트.
- (a) 분석하고자 하는 핵산 시료를 MF305, MF304, MF380, MF385, MF360, MF392, MF337, MF326, MF389, MF341, MF334, MF339, MF394, MF303, MF388, MF393, MF327, MF358, MF227, MF237, MF264, MF233, MF241, MF259, MF239, MF238, MF225, MF258, MF242, MF243, MF236, MF224, 및 MF223 마이크로새틀라이트로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 1종 이상의 마이크로새틀라이트 마커에 특이적인 프라이머를 이용하여 PCR로 증폭하는 단계; 및
(b) 상기 (a) 단계에서 증폭된 산물을 전기영동장치를 통해 검출하여 대립유전자(allele)를 검출하고 유전자형을 결정하는 단계를 포함하는 노란목도리담비(Martes flavigula) 개체의 식별 방법. - 제5항에 있어서,
상기 (a) 단계의 프라이머는 서열번호 1 및 2, 3 및 4, 5 및 6, 7 및 8, 9 및 10, 11 및 12, 13 및 14, 15 및 16, 17 및 18, 19 및 20, 21 및 22, 23 및 24 및, 25 및 26, 27 및 28, 29 및 30, 31 및 32, 33 및 34 및, 35 및 36, 37 및 38, 39 및 40, 41 및 42, 43 및 44 및, 45 및 46, 47 및 48, 49 및 50, 51 및 52, 53 및 54 및, 55 및 56, 57 및 58, 59 및 60, 61 및 62, 63 및 64, 그리고, 65 및 66의 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머 쌍으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 1쌍 이상의 프라이머인 것을 특징으로 하는 방법. - 제6항에 있어서, 상기 정방향 프라이머의 5' 말단에는 서열번호 67의 염기(5'-GGATAACAATTTCACACAGG-3') 또는 서열번호 68의 염기(5'-TGACCGGCAGCAAAATTG-3')가 추가되는 것을 되는 것을 특징으로 하는 방법.
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| KR1020170150292A KR102061943B1 (ko) | 2017-11-13 | 2017-11-13 | 노란목도리담비의 개체식별을 위한 마이크로새틀라이트 마커 및 이를 이용한 개체 식별 방법 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020170150292A KR102061943B1 (ko) | 2017-11-13 | 2017-11-13 | 노란목도리담비의 개체식별을 위한 마이크로새틀라이트 마커 및 이를 이용한 개체 식별 방법 |
Publications (2)
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ID=66680487
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| KR1020170150292A KR102061943B1 (ko) | 2017-11-13 | 2017-11-13 | 노란목도리담비의 개체식별을 위한 마이크로새틀라이트 마커 및 이를 이용한 개체 식별 방법 |
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2017
- 2017-11-13 KR KR1020170150292A patent/KR102061943B1/ko active IP Right Grant
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